癌の検出に使用するための、約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間のミトコンドリアＤＮＡの欠失
本発明は、癌の予測、診断および測定のための方法に関する。方法は、生物学的試料を得るステップ、試料におけるミトコンドリアＤＮＡ異常を測定するステップ、参照値とｍｔＤＮＡ異常のレベルとを比較するステップを含む。本発明の方法は、新たな治療薬および治療方法を検査するのに有効であり、予防措置または治療措置に対する被験者の反応をモニタリングするのに役立つ可能性がある。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、２００７年１１月９日に出願されたＵＳ特許出願番号６１／００２，６３７の優先権主張出願であり、当該出願の内容は、参照により本願に含まれる。
【０００２】
本発明は、ミトコンドリアゲノミクス分野に関する。具体的には、本発明は、ヒトミトコンドリアゲノムの変異の検出、および癌の指標としてのそれらの使用に関する。
【０００３】
〔発明の背景〕
（診断ツールとしてのミトコンドリアＤＮＡ）
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列のダイナミクスは、重要な診断ツールである。ｍｔＤＮＡ内の変異は、多くの場合、発病の事前的指標であり、核の変異を伴う場合が多い。ｍｔＤＮＡ内の変異は、以下のもののバイオマーカーとして機能する。すなわち、疾病（例えば、喫煙および受動喫煙を原因とする組織損傷および癌などの疾病であるが、これらに限定されない）（Lee et al., 1998; Wei, 1998）；２０歳位から始まり、その後増加するミトコンドリアゲノム突然変異の蓄積による加齢（von Wurmb, 1998）；突然変異、または、発癌物質、突然変異原、紫外線への曝露によって発症する転移性疾患（Birch-Machin, 2000）；変形性関節症、心疾患、アルツハイマー症、パーキンソン病（Shoffner et al., 1993; Sherratt et al., 1997;Zhang et al, 1998）；加齢による難聴（Seidman et al., 1997）；視神経の変性および不整脈（Brown et al., 1997; Wallace et al., 1988）；慢性進行性外眼筋麻痺（Taniike et al., 1992）；アテローム性動脈硬化（Bogliolo et al., 1999）；甲状腺乳頭癌および甲状腺腫瘍（Yeh et al., 2000）；およびその他（例えば、Naviaux, 1997; ChinneryおよびTurnbull, 1999）。
【０００４】
ミトコンドリアゲノムの特定部位における変異が、特定の疾病をもたらす可能性がある。例えば、４２１６、４２１７および４９１７の位置での変異は、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）と関連がある（Mitochondrial Research Society; Huoponen (2001); MitoMap）。ユビキノールシトクロムｃレダクターゼ（錯体III）欠失症を患っている５人の患者のうちの５人において、１５４５２の位置における変異が見出された（Valnot et al.1999）。
【０００５】
具体的には、これらの変異または変性は、点突然変異（転位、転換）、欠失（１塩基〜数千塩基）、逆位、重複（１塩基〜数千塩基）、組換えおよび挿入（１塩基〜数千塩基）を含む。加えて、特定塩基対の変性、欠失またはそれらの組み合わせが、早期の前立腺癌、皮膚癌および肺癌、ならびに加齢に関連すること（例えばPolyak et al., 1998）、早期老化、発癌性物質への曝露に関連すること（Lee et al., 1998）などがわかっている。
【０００６】
（前立腺癌）
前立腺癌は、前立腺上皮に由来する可能性が最も高い固形癌と診断されることが多い（Huang et al. 1999）。１９９７年、約１０００万人のアメリカ人男性が、その有無により前立腺癌を検知する前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検査を受けた（Woodwell, 1999）。実際、初期の直腸指診（ＤＲＥ）の検査を受けた男性の数は、より多い。同年、３１００万人の男性がＤＲＥを受けた（Woodwell, 1999）。さらに、アメリカ合衆国において前立腺癌と新たに診断された年間の件数は、１７９，０００件と推定される（Landis et al., 1999）。カナダ人男性の中では、前立腺癌は、癌の診断数および癌によって死亡する原因の第２位を占める。１９９７年、前立腺癌は、カナダ人男性の中で新たに癌と診断された件数のうちの、１９，８００件を占めた（２８％）（National Cancer Institute of Canada）。４９歳以上の全男性のうち、３０〜４０％が何らかの癌性前立腺細胞を有しており、そのうち２０〜２５％の男性が、臨床的に有意な形態の前立腺癌をもつと推測される（SpringNet - CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm）。前立腺癌は、内生要因および外生要因の両方、すなわち、社会経済状況、食事、地理、ホルモン失調、家系、および遺伝子構成を含む広範な組織学的性質を示す（Konishi et al. 1997; Hayward et al. 1998）。特定のｍｔＤＮＡ変性が前立腺癌に関連付けられてきたが、前立腺癌の検出のためのさらなるマーカーが必要である。
【０００７】
（乳癌）
乳癌は、乳腺組織の癌であり、癌による死亡原因の第５位を占める。２００５年、乳癌によって全世界で５０２，０００人が亡くなった（癌死亡者の７％、全死亡者の１％近く）（世界保健機構 Cancer Fact Sheet No. 297）。世界の女性の中で、乳癌が最も一般的な癌であり、癌による死因の第１位を占める（世界保健機構 Cancer Fact Sheet No. 297）。例えばParrella et al.などは、特定のｍｔＤＮＡ変性が乳癌をもたらすとしたが（Cancer Research: 61, 2001）、乳癌の検出のためにさらなるマーカーが必要である。
【０００８】
上記背景技術の情報は、本発明に関連し得ると出願人が考える周知の情報を提供することを目的とする。よって、下記情報のうちのいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを認めるものではなく、そのように解釈されるべきではない。
【０００９】
〔発明の要約〕
本発明は、癌の検出に使用するミトコンドリアＤＮＡ変異に関する。本発明の一形態によれば、個体における癌の検出方法は、
ａ）個体から生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間にｍｔＤＮＡ配列の欠失を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ、および
ｄ）少なくとも１つの周知の参照値と、欠失を有する試料におけるｍｔＤＮＡの量とを比較するステップ、を含む。
【００１０】
本発明の別の形態によれば、癌の進行に関する個体の測定方法は、
ａ）生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間にｍｔＤＮＡ配列の欠失を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ、および、
ｄ）一定期間にわたってａ）〜ｃ）のステップを繰り返すステップを含み、一定期間を経た後の欠失の増加レベルが癌の指標である。
【００１１】
本発明の別の形態によると、個体における癌の検出方法は、
ａ）個体から生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において配列番号１または配列番号２に記載の配列に対応する配列を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ；および、
ｄ）上記試料において配列番号１または配列番号２に対応するｍｔＤＮＡの量と、少なくとも１つの周知の参照値とを比較するステップを含む。
【００１２】
本発明の別の形態によると、
ａ）１つ以上の生物学的試料を収集するための材料；および、
ｂ）ｍｔＤＮＡ欠失の検出に適したプライマーおよび試薬を含む、本発明の方法を実施するための診断キットを提供する。
【００１３】
〔図面の簡単な説明〕
添付の図面の参照、および下記詳細な説明から、本発明の上記および他の特徴が明らかとなるであろう。
【００１４】
図１は、実施例１のサイクル閾値（cycle threshhold）を示すグラフである。
【００１５】
図２は、本発明の一実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【００１６】
図３は、実施例２に関するサイクル閾値を示すグラフである。
【００１７】
図４は、本発明の別の実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【００１８】
図５は、４ｋｂの欠失の検出に有効なプライマーの設計および配列を示す概略図である。
【００１９】
図６は、本発明の別の実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【００２０】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、癌の予測、診断および検査方法を提供する。当該方法は、１つ以上の生物学的試料を得るステップと、試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップと、試料内のミトコンドリア変異の量を測定するステップと、参照値と試料内の変異の量とを比較するステップとを含む。即ち、方法は、発病を検知する、および個体が癌になる傾向を評価するための総合的ツールを提供する。本方法によって、経時的に個体の危険因子を測定することができ、および／または、治療薬および治療計画への患者の反応を測定することができる。
【００２１】
〔定義〕
特段別に定義されない限りは、本願に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者が共通に理解する意味を有する。
【００２２】
本願にて使用するとき、「約」という用語は、言及した値から妥当な範囲の偏差があることを意図する。本願において提供されたあらゆる既定値は、具体的に示されているか否かに関わらず、このような偏差が常に有するものと解釈されるものである。
【００２３】
本願にて定義するとき、「生物学的試料」とは、ｍｔＤＮＡが得られる細胞を含む組織または体液を意図する。例えば、生物学的試料を、乳房組織または前立腺組織などの組織、または血液、唾液、脳脊髄液、喀痰、尿、粘膜、滑液、腹水、羊水などから抽出することができる。生物学的試料は、外科検体（surgical specimen）または生検検体（biopsy specimen）であってもよい。生物学的試料は、供給源から得られたものをそのまま使用してもよいし、または、前処理を行ってその特性を変更したものであってもよい。したがって、血清、破壊細胞からプラズマまたは血清を調製する、固形原料から液体、希釈粘液、濾液、濃縮液、不活性化干渉要素、添加試薬などを調整することによって、使用前に生物学的試料に前処理を施すことができる。
【００２４】
本願において、「サイクル閾値」（ＣT）という用語は、リアルタイムＰＣＲを用いた目的物の増幅が、蛍光シグナルなどの信号によって示されるときに、バックグラウンドを超えて上昇する点である。ＣTは、検査される配列の量に反比例する。
【００２５】
本願において、「診断」とは、疾病の診断または管理における要素として、変異または変異の組み合わせが存在するか否かを使用することを意図する。変異の検出は、疾病の診断における１つのステップであり得る。
【００２６】
本願において、「欠失」とは、ｍｔＤＮＡの連続した配列から、ｍｔＤＮＡの或る領域が除去されることを意図する。欠失は、１塩基〜数千塩基、またはそれ以上の塩基の大きさに及ぶ。
【００２７】
本願において、「ミトコンドリアＤＮＡ」または「ｍｔＤＮＡ」とは、ミトコンドリア内に存在するＤＮＡである。
【００２８】
本願において、「変異」は、ミトコンドリアＤＮＡ内における、野生型配列からのあらゆる修飾または変化を含む。例えば、点突然変異、転位、挿入、転換、転座、欠失、逆位、重複、組み換え、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。配列の修飾または変化は、一塩基の変化から、ＤＮＡ断片全体の追加または除去までひろく含むものである。
【００２９】
本願において、「感度」とは、本発明の方法を用いて得られる陽性な結果の割合（真陽性率）を意図する。
【００３０】
本願において、「特異性」は、本発明を用いて得られる偽陽性な結果の割合（偽陽性率）を意図する。
【００３１】
「治療」および「処置」は、本願において互いに交換可能に使用され、被験者の状態を改善させることを意図して行われる診療行為を意図する。改善は、主観的または客観的であってよく、病状の緩和、疾病の進行の抑制、または病状を変化させることに関する。したがって、治療および処置という用語は、最も広義に使用され、様々な段階での疾病の防止（予防）、緩和、低減、治癒を含む。被験者の状態の悪化を防ぐことも本用語に含まれる。治療／処置を必要とする被験者は、疾病に既に罹患しているもの、および、疾病の進行の傾向もしくは危険性があるもの、疾病の予防を行うものを含む。
【００３２】
〔癌の予測、診断および測定のための分析〕
（ミトコンドリアの変異を検出するためのアッセイ）
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）ダイナミクスは、重要な診断ツールである。ｍｔＤＮＡ内の変異は、発症の事前的な指標であることが多く、発病に関する危険因子を示すバイオマーカーとして機能する。本願において説明するように、生物学的試料内のミトコンドリアＤＮＡの異常のレベルを測定することによって、１つ以上の癌の存在を検出することが可能であるとともに、１つ以上の癌が患者に及ぼす潜在的リスクまたは素因を特定することが可能である。さらに、定期的にｍｔＤＮＡを測定することによって、健康管理の専門家に、経時的に患者の進行を測定するリアルタイム定量測定ツール、および／または、治療推奨の評価としてのツールを提供することができ、癌予防または治療における有効性の測定が可能になる。
【００３３】
したがって、本発明は、１つ以上の生物学的試料を得るステップ、該試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ、および該試料内のｍｔＤＮＡ異常の量を定量し、参照値と異常レベルとを比較することによって、ミトコンドリアの変異に関して該試料を分析するステップを含む、癌の予測、診断および測定方法を提供する。参照値は、当該方法が癌の予測、診断または測定のいずれを目的としているかに基づくものであることは、当業者には自明であろう。したがって、参照値は、１つ以上の周知の非癌性である生物学的試料、１つ以上の周知の癌性である生物学的試料、および／または、経時的に取られた１つ以上の生物学的試料、から採取されたｍｔＤＮＡに関連していてもよい。これらの参照値は、１つ以上の生物学的試料から採取されたｍｔＤＮＡデータとの比較に使用され、このとき、例えば参照試料と比較される生物学的試料における欠失が同量である、または増加しているとき、癌の兆候または癌の発病を示す。あるいは、経時的な欠失レベルの増加が癌の発病を示す。
【００３４】
本発明の形態によれば、癌の予測、測定および診断方法は、１つ以上のミトコンドリアの変異を検出および測定するための分析を含む。本発明の一実施形態によれば、変異は、ｍｔＤＮＡの欠失である。本発明の別の実施形態によれば、変異は、３９２６ｂｐのｍｔＤＮＡの欠失である（本願において、「４ｋｂ欠失」または「４ｋｂ配列」と称する）。さらなる別の実施形態によれば、変異は、配列番号１または配列番号２に記載された配列を有するｍｔＤＮＡの欠失である。環状形態である場合に、配列番号１と配列番号２とに違いはない。
【００３５】
４ｋｂ欠失は、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７番目のヌクレオチドから１６２５４番目のヌクレオチドの範囲内で発生するものである。本願では、ヒトｍｔＤＮＡゲノムを配列番号３と示す（Genbank accession no. AC_000021）。４ｋｂの欠失は、大きさ１２ｂｐの直接隣接する反復を特徴とし、当該反復は、１２３１７〜１２３２８の位置、および１６２４３〜１６２５４の位置に配置される。反復配列は、5'-TGCAACTCCAAA-3'である。したがって、本発明の一実施形態によれば、上記変異は、ヒトｍｔＤＮＡゲノムにおける約１２３１７残基〜約１６２５４残基の欠失である。
【００３６】
発明者らは、後述する実施例にて示すように、当該欠失が癌、特に前立腺癌および乳癌に関連していることを発見した。したがって、当該欠失が正確なバイオマーカーを提供し、少なくともこれらの組織における癌の検出、診断または測定に有益な手段を提供する。
【００３７】
欠失の結果、２つの欠失モノマーが生成される。１つは４ｋｂの大きさ（小サブリモン（small sublimon））であり、もう１つは約１２．５ｋｂの大きさ（大サブリモン（large sublimon））である。それぞれ４ｋｂまたは１２．５ｋｂの配列である小サブリモンまたは大サブリモンの存在を特定することによって、欠失の発生を検出してもよい。
【００３８】
実施例において、ミトコンドリアの変異を測定する方法の一例を挙げる。試料からのｍｔＤＮＡの抽出は、好適な公知の方法にて行っても良い。ｍｔＤＮＡの抽出後、ミトコンドリアゲノムの全領域または特定の領域を増幅させる。このｍｔＤＮＡの抽出は、公知のまたは、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology （Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2007）に記載されたようなミトコンドリアゲノムの配列解析（sequencing）を含んでいてもよい。同様に、当業者に周知の好適な技術から、ｍｔＤＮＡ内の変異の存在を検出する方法を選択することができる。例えば、ｍｔＤＮＡの分析は、ｍｔＤＮＡの配列解析、ＰＣＲによる増幅、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ウェスタンサウスウェスタンブロット法、変性ＨＰＬＣ、マイクロアレイ、バイオチップまたは遺伝子チップを使用したハイブダイゼーション、分子マーカー分析、バイオセンサ、融解温度プロファイリング、のいずれか、またはこれらを組み合わせて含んでいてもよい。
【００３９】
ミトコンドリアＤＮＡの配列解析を行うために好適な手段を使用してもよい。配列解析の前に、ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅させることが好ましい。ＰＣＲ法は周知技術であり、Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335に記載されているように実施してもよい。ＰＣＲによって得られたものを、直接配列解析してもよく、またはベクター中にてクローンを作成し、当該ベクターを、その後、バクテリアの宿主内に導入する。ＤＮＡ配列解析法は、例えば次に挙げる文献に記載されている。Brumley, R. L. Jr. and Smith, L.M., 1991, Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis, Nucleic Acids Res. 19:4121-4126 および、Luckey, J.A., et al, 1993, High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol. 218: 154-172。ＰＣＲとｍｔＤＮＡの配列解析とを組み合わせた使用について、例えば次に挙げる文献に記載されている。Hopgood, R., et al, 1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products, Biotechniques 13:82-92、および、Tanaka, M. et al, 1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264: 407-421。
【００４０】
下記の実施例にて示すように、リアルタイム定量ＰＣＲ法を、４ｋｂの欠失の有無の検出およびそれを測定するための好適な手段として挙げることができるが、当業者にとって他の方法も周知であり、上述したように利用することができる。さらに、Bio-Rad's Bioplex(TM)システムおよび、サスペンジョンアレイ技術を用いて、欠失の測定を実行することができる。一般的に、当該方法は、何らかのの周知の方法を使用した配列の増幅および測定を必要とする。
【００４１】
下記プライマーは、４ｋｂの欠失の検出に使用されるプライマーの例である。
【００４２】
４フォワード（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基12313-12328/16255-16267に結合）
5'-TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC-3' （配列番号４）；
４リバース（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基16391-16409に結合）
5'-AGGATGGTGGTCAAGGGAC-3' (配列番号５)。
【００４３】
本発明の一実施形態では、４ｋｂの欠失の存在を明示する標的部位を増幅するために、一対の増幅プライマーを使用する。本実施形態では、一対の増幅プライマーのうちの１つは、４ｋｂ配列の欠失が起こり、ｍｔＤＮＡが環状ｍｔＤＮＡ分子として再形成された後で、ｍｔＤＮＡ領域の結合された部位と重複する（たとえば、ｍｔＤＮＡゲノムの１２３２８と１６２５５との間における結合）。したがって、４ｋｂの部位が欠失する場合に限って、重複したプライマーの伸長が生じる。図５は、プライマーの設計および配列を示す概略図である（すなわち、配列番号４）。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、欠失した４ｋｂの配列に関連する標的部位を増幅するために一対の増幅プライマーを使用する。欠失した４ｋｂの配列は、欠失後、環状ｍｔＤＮＡ分子として再形成されてもよい。本実施形態では、一対の増幅プライマーのうちの１つが、４ｋｂの配列の末端の再結合部位に重複する。したがって、試料内で検出される４ｋｂの分子の量の増大が、癌の指標である。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態では、欠失の切断点が不明であるので、プライマー位置について２つの可能性が生じる。本実施形態では、２つの個別のフォワードプライマーは、欠失する４ｋｂの配列に関連する標的部位を増幅させるように設計されていてもよい。下記プライマーは、本願において４ｋｂの欠失の検出に使用され得るプライマーの例である。
【００４６】
（フォワードプライマー）
プライマーＡ（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基12313-12328/16255-16267に結合）
5'-TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC-3'（配列番号４）；
プライマーＢ（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基12302-12316に結合）
5'- CCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAAGCCAC-3'（配列番号６）。
【００４７】
（リバースプライマー）
プライマーＣ（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基16391-16409に結合）
5'-AGGATGGTGGTCAAGGGAC-3'（配列番号５）。
【００４８】
当業者であればわかるように、フォワードプライマーＡまたはＢは、リバースプライマーＣとともに使用され、ｑＰＣＲ分析において有益なＰＣＲ産物を生成する。
【００４９】
（生物学的試料）
本発明は、１つ以上の生物学的試料の獲得および採取を含む診断テストを提供する。本発明では、生物学的試料は、ｍｔＤＮＡが得られる細胞を含む組織または体液を指す。例えば、生物学的試料は下記から得られる組織であるが、これらに限定されるものではない。例えば、乳房、前立腺、神経、筋肉、心臓、腹、結腸細胞などの組織。または、生物学的試料は、例えば、血液、唾液、脳脊髄液、喀痰、尿、粘膜、滑液、腹水、羊水などから得てもよい。生物学的試料は、癌性または非癌性の組織から得られてもよく、外科検体または生検検体であってもよい。
【００５０】
生物学的試料は、供給源から得られたものをそのまま使用してもよいし、または、前処理を行って性質を修正した試料を使用してもよい。したがって、血液からの血清やプラズマの調整、細胞の破壊、固形原料からの液体の調整、粘液の希釈、液体のろ過、液体の上蒸留、液体の濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加などの前処理を使用前に生物学的試料に施すことができる。
【００５１】
当業者であれば、１回につき、１つ以上の試料タイプを分析することができることがわかる（すなわち、１つ以上の癌の検出）。さらに、経時的に試料を採取することが必要な場合には、例えば経時的な危険因子の測定または癌の測定のために、既定の試料を単独または、検査期間中に採取された他の試料と共に診断してもよい。この点に関して、生物学的試料を、１回のみ採取してもよいし、または隔週で１回、１ヶ月に１回、半年に１回、または１年に１回採取してもよい。
【００５２】
当業者であれば、ミトコンドリアのＤＮＡ標的が、核酸標的よりもはるかに豊富であり（約１０００倍多い）、核酸では極端に低い収量しか得られないような量の試料でも、本発明においては、好適に採用できることが理解できよう。
【００５３】
〔癌の予測、診断および観察への応用〕
（癌の診断および観察）
殆どのタイプの組織および年齢層における癌の罹患には、癌の存在を検出するだけでなく、疾病の発病、進行および転移を予防することを意図した予防措置および治療の成功および適否を測定するツールが必要である。１つ以上の個々の生物学的試料におけるミトコンドリアのＤＮＡ欠失のレベルを測定することによって、危険因子、癌、および／または疾病のステージの初期診断を行うことができる。
【００５４】
例えば初期段階にて癌を検出したり、あらゆる組織学的異常が発生する前に癌を検出するために、本発明のシステムおよび方法を使用することができる。さらに、隔週に１回、１ヶ月に１回、半年に１回、または１年に１回など定期的に試料検査を行うことによって、健康管理の専門家に、経時的に疾患の進行を測定するリアルタイム定量モニタリングツール、および／または、癌予防または治療における有効性を測定するための治療推奨の評価としてのツールを提供することができる。
【００５５】
次に実施例を挙げる。本発明のある実施形態によれば、本発明は、前立腺癌および乳癌における潜在的な悪性腫瘍への前癌状態、新生組織形成の有無、および進行を検出するために使用されてもよい。ある形態では、本発明は、癌の検出、診断および／または観察のための４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失の検出および測定を含む。本方法では、生物学的試料（例えば生体組織、または尿、前立腺マッサージ体液（prostate massage fluid）などの体液）からｍｔＤＮＡを抽出する。抽出されたｍｔＤＮＡを検査し、試料における４ｋｂの欠失レベル（すなわち量）を測定する。本願において実行される検査では、癌をもつ被験者から得られた試料における欠失レベルは、癌をもたない被験者から得られた試料と比べて、上昇していることがわかった。下記に示す情報およびデータに基づき、本発明者らは、ヒトｍｔＤＮＡにおける４ｋｂの欠失レベルの上昇が癌の指標であると結論づけた。
【００５６】
別の実施形態では、個体から例えば前立腺組織、前立腺マッサージ体液、尿または乳房組織などを得て、経時的に（例えば数年間）検査をし、癌の発症または進行を測定する。４ｋｂの欠失のレベルの経時的な上昇は、癌の発症および進行の指標となり得る。
【００５７】
当業者であれば、ミトコンドリアのＤＮＡ標的の測定のために、個体に由来する１つ以上の生物学的試料を分析することによって、医療従事者に治療方針の有効性を測定する手段を提供できることがわかる。当業者であれば、医療従事者がｍｔＤＮＡ分析を用いることによって、低質な食事および運動不足などの生活習慣、または周知の発癌性物質（タバコ、汚染物質など）への曝露を招く活動などを特定できる（そして生活習慣について推奨できる）ことがわかる。
【００５８】
本発明の別の形態は、生検試料（例えば前立腺癌、または乳癌）から癌生検テストの結果の適否を判定する方法であって、生検試料から非癌性組織を得るステップ、および無病組織における４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失の量を検出および測定するステップとを有する方法を提供する。
【００５９】
（癌に対する遺伝的素因の測定）
１つ以上の癌の各リスクに対する評価を十分に行うために、医療従事者は、患者の危険因子の理解および伝達を可能にする情報をできるだけ多く得る必要がある。ｍｔＤＮＡ異常のレベルの測定に本願を利用することは、癌に対する個体の感受性を評価するだけでなく、より積極的な観察および治療措置を必要とする可能性がある、より大きいリスクをもつ患者を特定するツールとしても有用である。
【００６０】
この点につき、下記に、癌を患った被験者から得られた試料と癌を患っていない被験者から得られた試料間における、４ｋｂの欠失を有するｍｔＤＮＡの量の違いを示す様々な例を挙げる。４ｋｂの欠失の量は、癌を患った被験者から得られた試料の方が高いことがわかった。既知の癌細胞から得られた試料、および／または既知の非癌細胞から得られた試料における４ｋｂの欠失の量を比較して、測定を行った。
【００６１】
このようにして、発明者らは、１つ以上の癌に対する個体の傾向を特定する上で生物学的試料のスクリーニングが有益であると結論付けた。したがって、本発明の一実施形態によれば、１つ以上の生物学的試料から癌について複数人をスクリーニングする方法であって、１つ以上の試料を得るステップと、該試料における４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失レベルを検出および測定するステップとを含む、方法を提供する。本発明の特定の実施形態によれば、体液または組織試料から前立腺癌または乳癌について複数人をスクリーニングする方法であって、体液または組織試料を得るステップと、体液または組織試料における４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失レベルを検出および測定するステップとを含む、方法を提供する。
【００６２】
加齢に伴って４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失が蓄積すると、中年以上の男性または中年以上の女性において、それぞれ高い確率で前立腺癌または乳癌等にかかりやすくなる。同様に、個体の食生活、運動習慣および周知の発癌性物質への曝露に基づく特定の生活習慣が、４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失の蓄積に関連している可能性もある。したがって、本発明の一形態によれば、経時的に、１つ以上の生物学的試料、例えば、限定するものではないが、乳房組織および前立腺組織、または前立腺マッサージ体液、尿などの体液における４ｋｂの欠失の量を測定することよって定期的に癌スクリーニングを行う構成である方法を提供する。
【００６３】
（治療薬の評価）
癌治療に使用する可能性のある治療薬のスクリーニング、または、当該薬の治療効果の測定に本発明の方法を使用してもよい。本願において例示された癌に関連する様々なバイオマーカーを測定するために本発明の方法を使用してもよい。どの時間点でも生物学的試料のＤＮＡ損傷レベルを評価できるので、個体の健康について、情報量が多いスクリーニングテストを個々に構築することができる。また、既存および新たな治療薬および治療方法の安全性および有効性の評価を行うことができる。さらに、被験者の健康状態の根底を為す具体的な遺伝子的変化を特定することによって、特定の治療薬または治療方法が患者に効くかどうか、およびどの程度効くかを容易に診断できると考えられる。
【００６４】
（キット）
本発明は、臨床環境にて使用するための診断／スクリーニングキットを提供する。当該キットは、１つ以上のサンプリング手段を含むだけでなく、ｍｔＤＮＡの異常の特定に必要な他の材料をも含む。
【００６５】
キットは、診断分析を行うために必要な緩衝剤、塩、検出試薬などの試薬を含んでいてもよい。生物学的試料の隔離および／または治療のための緩衝剤および溶液などの他の成分がキットに含まれていてもよい。キットにおける１つ以上の成分は、凍結乾燥されていてもよく、キットは、凍結乾燥成分の再構成に適した試薬をさらに含んでいてもよい。
【００６６】
適宜、キットが、反応槽、混合槽、および検査試料の調製を促進する他の要素を含んでいてもよい。キットは、使用説明書を有していてもよく、紙媒体、またはディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み取り可能な媒体であってもよい。
【００６７】
本発明の別の形態では、癌診断を行うキットがｍｔＤＮＡの抽出手段、プライマー、試薬、および使用説明書を有する。
【００６８】
本発明の別の形態では、例えば前立腺癌または乳癌などの癌診断のためのキットが、ｍｔＤＮＡの抽出手段、配列番号４および配列番号５に挙げられる核酸配列を有するプライマー、試薬および使用説明書を有する。
【００６９】
本発明の別の形態では、例えば前立腺癌または乳癌などの癌診断のためのキットが、ｍｔＤＮＡの抽出手段、配列番号６および配列番号５に挙げられる核酸配列を有するプライマー、試薬および使用説明書を有する。
【００７０】
本願に記載された発明をよりよく理解するために、下記の実施例について説明する。これらの実施例は、本発明の例示を目的としており、いかなる場合も本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。
【００７１】
〔実施例〕
（実施例１：ヒトｍｔＤＮＡにおける４ｋｂの欠失と前立腺癌との関連）
前立腺癌と診断された５人の患者、および、針生検処置（needle biopsy procedure）を受けて前立腺悪性腫瘍が検出されなかった５人から、尿試料を採取した。前立腺細胞の採取を助ける直腸指針（ＤＲＥ）を行った後で、これらの試料を採取した。
【００７２】
複数の試料を受け取ると直ちに、５ｍｌずつを除去し、２ｍｌの試料を１４，０００ｘｇにて遠心分離して沈殿物を形成させた。上澄液は除去して廃棄した。
【００７３】
２００ｕｌのリン酸緩衝生理食塩水中に沈殿物を再縣濁させた。再縣濁した沈殿物および尿試料全体を、製造者の指示に従って、QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen P/N 51304)を用いてＤＮＡ抽出処理にかけた。そして、NanoDrop ND-1000分光光度計を用いて、得られたＤＮＡ抽出物を測定し、０．１ｎｇ／ｕｌの濃度に調製した。
【００７４】
下記に従って、４ｋｂの欠失に特異的なプライマーを用いて、リアルタイム定量ＰＣＲによって試料を分析した。
【００７５】
1X iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad product no. 170-8880）。
【００７６】
１００ｎｍｏｌのフォワードプライマー（5'- TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC -3'）（配列番号４）。
【００７７】
１００ｎｍｏｌのリバースプライマー（5'- AGGATGGTGGTCAAGGGAC -3'）（配列番号５）。
【００７８】
２５ｕｌ反応液中の１ｎｇのテンプレートＤＮＡ。
【００７９】
下記のプロトコールに従って、Opticon 2 DNA Engine（Bio-Rad Canada）において反応サイクルをおこなった。つまり、
１．９５℃にて３分間
２．９５℃にて３０秒間
３．６９℃にて３０秒間
４．７２℃にて３０秒間
５．プレート読み出し
６．ステップ２〜５を４４回繰り返す
７．７２℃にて１０分間
８．５０℃から１０５℃までの溶解曲線、１℃毎に読み出し、３秒間維持
９．１０℃に保つ。
【００８０】
（結果）
尿沈殿物から得られた結果は、観測平均サイクル閾値または有効なカットオフポイントにおいて大きな違いはなかった。しかし、尿全体の試料から得られた結果には、大きな違いが見られた。
【００８１】
表１および表２、ならびに図１は、前立腺悪性組織を有する被験者から得られた尿試料、および危険率有意水準０．０４の良性組織を有する被験者から得られた尿試料の平均ＣTスコアにおける違いを示す。
【００８２】
表１：ＣTスコアの平均値：尿試料
【００８３】
【表１】
表２：平均ＣTスコアの有意性試験
独立試料検査
【００８４】
【表２】
表３および４、ならびに図２は、３６．２５５のカットオフサイクル閾値を使用するとき、前立腺癌の分析の感度が８６％、特異性が８６％であることを示す。
【００８５】
図２は、尿を検査した場合の、前立腺癌のマーカーとしての４ｋｂ ｍｔＤＮＡの欠失の特異性および感度を示す受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic：ＲＯＣ）曲線である。３６．２５５のカットオフＣTを使用して上記結果を得た。上記ＣTでのマーカーの感度は８６％であり、特異性は８６％である。
【００８６】
表３に、３６．２５５のカットオフＣTの測定結果を示す。表３に記載された結果は、３６．２５５のカットオフＣTが最も高い感度および特異性を提供することを示す。
【００８７】
検査の精度は、前立腺癌を有している群と有していない群とをどれだけ正確に分けられるかによって決まる。ＲＯＣ曲線の下の領域を用いて、精度を測定する。表４は、本実施例における、曲線の下の領域の算出を示す。
【００８８】
表３：特異性および感度の測定
【００８９】
【表３】
a−最小カットオフ値は、最小測定検査値−１であり、最大カットオフ値は、最大測定検査値＋１である。他のカットオフ値の全てが、２つの連続した検査測定値（two consecutive ordered observed test values）の平均である。
【００９０】
表４：ＲＯＣ曲線の下の領域を示す結果
【００９１】
【表４】
【００９２】
〔実施例２：ヒトｍｔＤＮＡにおける４ｋｂ欠失と乳癌との関連〕
悪性腫瘍を有する１０人、良性乳房疾患を有する、または何の異常もない１０人の計２０人の乳房組織試料を採取した。これらの試料を、ホルマリン固定パラフィン包埋し、製造者のプロトコールに従って、QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen P/N 51304)を用いて抽出するために、それぞれ２０ミクロンの部位を個々の試料チューブ内に切断した。Nanodrop ND−１０００を用いてＤＮＡを測定し、２ｎｇ／ｕｌの濃度に調整した。
【００９３】
下記に従って、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて４ｋｂの欠失に特異的なプライマーとともに試料を分析した。
【００９４】
X iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad product no. 170-8880)
175 nmolのフォワードプライマー（5'- TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC -3') (配列番号４)
175 nmolのリバースプライマー(5'- AGGATGGTGGTCAAGGGAC -3') (配列番号５)
25ulの反応液中の20 ngのテンプレートDNA
下記の手法に従って、Opticon 2 DNA Engine（Bio-Rad Canada）において反応液をサイクルさせた。
【００９５】
１．９５℃にて３分間
２．９５℃にて３０秒間
３．７０℃にて３０秒間
４．７２℃にて３０秒間
５．プレート読み出し
６．ステップ２〜５を４４回繰り返す
７．７２℃にて１０分間
８．５０℃から１０５℃までの溶解曲線、１℃毎に読み出し、３秒間維持
９．１０℃に保つ。
【００９６】
表５および６、ならびに図３は、悪性の乳房組織を有する被験者からの乳房組織試料、および０．０６５レベルの良性の乳房組織を有する被験者からの試料についての平均ＣT値における違いを示す。
【００９７】
表５：ＣTスコアの平均値：乳房組織試料
【００９８】
【表５】
表６：平均ＣTスコアの有意性試験
【００９９】
【表６】
表７および８、ならびに図４は、１９．８４５のカットオフサイクル閾値を使用する場合に、乳癌分析の感度が７８％、特異性が７８％であることを示す。
【０１００】
図４は、乳房組織を検査した場合の、乳癌のマーカーとしての４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。１９．８４５のカットオフＣTを使用して上記結果を得た。上記ＣTでのマーカーの感度は７８％であり、特異性は７８％である。
【０１０１】
表７に、１９．８４５のカットオフＣTの測定結果を示す。表７に記載された結果は、１９．８４５のカットオフＣTが最も高い感度および特異性を提供することを示す。
【０１０２】
検査の精度は、乳癌を有している群と有していない群とをどれだけ正確に分けられるかによって決まる。ＲＯＣ曲線の下の領域を用いて精度を測定する。表８は、本例における曲線の下の領域の算出を示す。
【０１０３】
表７：特異性および感度の測定
【０１０４】
【表７】
a−最小カットオフ値は、最小測定検査値−１であり、最大カットオフ値は、最大測定検査値＋１である。他のカットオフ値の全てが、２つの連続した検査測定値の平均である。
【０１０５】
表８：ＲＯＣ曲線の下の領域を示す結果
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
〔実施例３：針生検試料を用いた、ヒトｍｔＤＮＡにおける４ｋｂ欠失と前立腺癌との関連〕
前立腺癌を有しない９人、および前立腺癌を有する１０人の計１９人から前立腺針生検試料を得た。針生検組織は、臨床診断では標準的であるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）とした。各生検の１０ミクロン部位を直接遠心分離管の中に入れ、QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen, p/n 51306)を用いてＤＮＡを抽出した。NanoDrop ND-1000分光光度計を用いて２６０ｎｍの吸光度に基づいてＤＮＡ抽出物を測定した。収率は、３４７ｎｇから７５０ｎｇの範囲内であった。これらの試料を２ｎｇ／ｕｌまで希釈し、表９および下記に従って増幅反応を行った。
【０１０８】
表９：増幅反応のための試薬および濃度
【０１０９】
【表９】
ヌクレアーゼを含まない水を２５ｕｌ体積の最終反応物に加えた。DNA Engine Chromo4 Real Time PCR Instrument (Bio-Rad Laboratories)において、下記サイクル条件にしたがって、増幅を実行した：
１．９５℃にて３分間
２．その後下記３から５を４５サイクル
３．９５℃にて３０秒間
４．６９℃にて３０秒間
５．７２℃にて３０秒間
６．プレート読み出し
そのあと、
７．７２℃にて１０分間
８．５０℃から１０５℃までの溶解曲線、１℃毎に読み出し、３秒間維持
９．４℃に保つ。
【０１１０】
表１０に示された結果は、前立腺癌を有しているヒトのＣT値が、前立腺癌を有していないヒトよりも低く、前立腺組織における４ｋｂの欠失のレベルが高いことを示している。前立腺癌を有している患者の平均ＣT値は３０．７であり、一方、前立腺癌を有していない患者の平均ＣT値は３６．４である。この５．７のＣT差は、前立腺癌を有している群での４ｋｂの欠失レベルが前立腺癌を有していない群の４ｋｂの欠失レベルの１００倍に相当する。
【０１１１】
表１０：患者の診断および関連するＣTスコア
【０１１２】
【表１０】
表１１および１２は、正常な前立腺組織および悪性の前立腺組織を有する患者から得られた前立腺組織試料の平均ＣTスコアにおける違いを示す。
【０１１３】
表１１：ＣTスコアの平均値：前立腺針生検組織
【０１１４】
【表１１】
表１２：平均ＣTスコアの有意性試験
【０１１５】
【表１２】
表１３および図６は、３２．６５のカットオフサイクル閾値ＣTを使用する場合に、これらの患者を正確に診断する感度が８０％、特異性が６７％であることを示す。
【０１１６】
表１３：特異度および感度の測定
【０１１７】
【表１３】
特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、当業者にとっては、添付の請求項に述べられている本発明の本質および範囲から逸脱することなく、様々な変形が可能であることが明らかである。当業者にとって明らかである当該変形の全てが、下記請求項の範囲内に含まれるものとする。本願に引用された全ての文献は、参照することによって本願に組み込まれている。
【０１１８】
〔先行文献〕
Birch-Machin MA, Online Conference Report (Sunburnt DNA), International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, New Scientist, 2000(a)
Birch-Machin MA, Taylor RW, Cochran B, Ackrell BAC, Tumbull DM. Ann Neurol 48: 330-335, 2000(b)
Birch-Machin, M.A. (2000). Mitochondria and skin disease. Clin Exp Dermatol, 25, 141-6.
Brown, M.D., et al., Am J. Humn Genet, 60: 381-387, 1997
Bogliolo, M, et al., Mutagenesis, 14: 77-82, 1999
Chinnery PF and Turnbull DM., Lancet 354 (supplement 1): 17-21, 1999
Huoponen, Kirsi, Leber hereditary optic neuropathy: clinical and molecular genetic findings, Neurogenetics (2001) 3: 119-125.
Hayward SW, Grossfeld GD, Tlsty TD, Cunha GR., Int J Oncol 13:35-47, 1998
Huang GM, Ng WL, Farkas J, He L, Liang HA, Gordon D, Hood R., Genomics 59(2):178-86,1999
Konishi N, Cho M, Yamamoto K, Hiasa Y. Pathol. Int. 47:735-747,1997
Landis SH, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer J. Clin. 49:8-31
Lee HC, Lu CY, Fahn HJ, Wei YHu. Federation of European Biochemical Societies, 441:292-296,1998
Mitochondrial Research Society http://www.mitoresearch.org/diseases.html.
MITOMAP: A human mt genome database (www.gen.emory.edu/mitomap.html)
Naviaux, RK., Mitochondrial Disease- Primary Care Physican's Guide. Psy-Ed. Corp D/B/A Exceptional Parents Guide: 3-10, 1997
Parrella P, Xiao Y, Fliss M, Sanchez-Cespedes M, Mazzarelli P, Rinaldi M, Nicol T, Gabrielson E, Cuomo C, Cohen D, Pandit S, Spencer M, Rabitti C, Fazio VM, Sidransky D: Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates. Cancer Res 2001, 61:7623-7626
Polyak Y, et al., Nature Genet. 20 (3):291-293, 1998
Seidman, M.D. et al., Arch. Otolaryngol Head Neck Surg., 123: 1039-1045, 1997
Sherrat EJ, Thomas AW, Alcolado JC., Clin. Sci. 92:225-235,1997
Shoffner JM, Brown MD, Torroni A, Lott MT, Cabell MF, Mirra SS, Beal MF, Yang C, Gearing M, Salvo R, Watts RL, Juncos JL, Hansen LA, Crain BJ, Fayad M, Reckford CL, and Wallace DC., Genomics 17: 171-184, 1993
SpringNet - CE Connection: Screening, Diagnosis: Improving Primary Care Outcomes. Website: http://www.springnet.com/ce/j803a.htm
Taniike, M. et al., BioChem BioPhys Res Comun, 186: 47-53, 1992
Valnot, Isabelle, et al., A mitochondrial cytochrome b mutation but no mutations of nuclearly encoded subunits in ubiquinol cytochrome c reductase (complex III) deficiency, Human Genetics (1999) 104: 460-466
von Wurmb, N, Oehmichen, M, Meissner, C., Mutat Res. 422:247-254, 1998
Wallace et al., Mitochondiral DNA MUtatio Assoicated with Leber's Hereditary Optic Neuropathy, Science, 1427-1429
Wei YH. Proceedings of the Nat. Sci. Council of the Republic of China April 22(2):5567, 1998
Woodwell DA. National Ambulatory Medical Care Survey: 1997 Summary. Advance data from vital and health statistics; no. 305. Hyattsville, Maryland: National Center for Health Statistics. 1999
Yeh, J.J., et al., Oncogene Journal, 19: 2060-2066, 2000
Zhang et al., Multiple mitochondiral DNA deletions in an elderly human individual, FEBS Lett, 297, 34-38 1992
Zhang, C., et al., BioChem. BioPhys. Res. Comun., 195: 1104-1110, 1993
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】実施例１のサイクル閾値（cycle threshhold）を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【図３】実施例２に関するサイクル閾値を示すグラフである。
【図４】本発明の別の実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【図５】４ｋｂの欠失の検出に有効なプライマーの設計および配列を示す概略図である。
【図６】本発明の別の実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、２００７年１１月９日に出願されたＵＳ特許出願番号６１／００２，６３７の優先権主張出願であり、当該出願の内容は、参照により本願に含まれる。
【０００２】
本発明は、ミトコンドリアゲノミクス分野に関する。具体的には、本発明は、ヒトミトコンドリアゲノムの変異の検出、および癌の指標としてのそれらの使用に関する。
【０００３】
〔発明の背景〕
（診断ツールとしてのミトコンドリアＤＮＡ）
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列のダイナミクスは、重要な診断ツールである。ｍｔＤＮＡ内の変異は、多くの場合、発病の事前的指標であり、核の変異を伴う場合が多い。ｍｔＤＮＡ内の変異は、以下のもののバイオマーカーとして機能する。すなわち、疾病（例えば、喫煙および受動喫煙を原因とする組織損傷および癌などの疾病であるが、これらに限定されない）（Lee et al., 1998; Wei, 1998）；２０歳位から始まり、その後増加するミトコンドリアゲノム突然変異の蓄積による加齢（von Wurmb, 1998）；突然変異、または、発癌物質、突然変異原、紫外線への曝露によって発症する転移性疾患（Birch-Machin, 2000）；変形性関節症、心疾患、アルツハイマー症、パーキンソン病（Shoffner et al., 1993; Sherratt et al., 1997;Zhang et al, 1998）；加齢による難聴（Seidman et al., 1997）；視神経の変性および不整脈（Brown et al., 1997; Wallace et al., 1988）；慢性進行性外眼筋麻痺（Taniike et al., 1992）；アテローム性動脈硬化（Bogliolo et al., 1999）；甲状腺乳頭癌および甲状腺腫瘍（Yeh et al., 2000）；およびその他（例えば、Naviaux, 1997; ChinneryおよびTurnbull, 1999）。
【０００４】
ミトコンドリアゲノムの特定部位における変異が、特定の疾病をもたらす可能性がある。例えば、４２１６、４２１７および４９１７の位置での変異は、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）と関連がある（Mitochondrial Research Society; Huoponen (2001); MitoMap）。ユビキノールシトクロムｃレダクターゼ（錯体III）欠失症を患っている５人の患者のうちの５人において、１５４５２の位置における変異が見出された（Valnot et al.1999）。
【０００５】
具体的には、これらの変異または変性は、点突然変異（転位、転換）、欠失（１塩基〜数千塩基）、逆位、重複（１塩基〜数千塩基）、組換えおよび挿入（１塩基〜数千塩基）を含む。加えて、特定塩基対の変性、欠失またはそれらの組み合わせが、早期の前立腺癌、皮膚癌および肺癌、ならびに加齢に関連すること（例えばPolyak et al., 1998）、早期老化、発癌性物質への曝露に関連すること（Lee et al., 1998）などがわかっている。
【０００６】
（前立腺癌）
前立腺癌は、前立腺上皮に由来する可能性が最も高い固形癌と診断されることが多い（Huang et al. 1999）。１９９７年、約１０００万人のアメリカ人男性が、その有無により前立腺癌を検知する前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検査を受けた（Woodwell, 1999）。実際、初期の直腸指診（ＤＲＥ）の検査を受けた男性の数は、より多い。同年、３１００万人の男性がＤＲＥを受けた（Woodwell, 1999）。さらに、アメリカ合衆国において前立腺癌と新たに診断された年間の件数は、１７９，０００件と推定される（Landis et al., 1999）。カナダ人男性の中では、前立腺癌は、癌の診断数および癌によって死亡する原因の第２位を占める。１９９７年、前立腺癌は、カナダ人男性の中で新たに癌と診断された件数のうちの、１９，８００件を占めた（２８％）（National Cancer Institute of Canada）。４９歳以上の全男性のうち、３０〜４０％が何らかの癌性前立腺細胞を有しており、そのうち２０〜２５％の男性が、臨床的に有意な形態の前立腺癌をもつと推測される（SpringNet - CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm）。前立腺癌は、内生要因および外生要因の両方、すなわち、社会経済状況、食事、地理、ホルモン失調、家系、および遺伝子構成を含む広範な組織学的性質を示す（Konishi et al. 1997; Hayward et al. 1998）。特定のｍｔＤＮＡ変性が前立腺癌に関連付けられてきたが、前立腺癌の検出のためのさらなるマーカーが必要である。
【０００７】
（乳癌）
乳癌は、乳腺組織の癌であり、癌による死亡原因の第５位を占める。２００５年、乳癌によって全世界で５０２，０００人が亡くなった（癌死亡者の７％、全死亡者の１％近く）（世界保健機構 Cancer Fact Sheet No. 297）。世界の女性の中で、乳癌が最も一般的な癌であり、癌による死因の第１位を占める（世界保健機構 Cancer Fact Sheet No. 297）。例えばParrella et al.などは、特定のｍｔＤＮＡ変性が乳癌をもたらすとしたが（Cancer Research: 61, 2001）、乳癌の検出のためにさらなるマーカーが必要である。
【０００８】
上記背景技術の情報は、本発明に関連し得ると出願人が考える周知の情報を提供することを目的とする。よって、下記情報のうちのいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを認めるものではなく、そのように解釈されるべきではない。
【０００９】
〔発明の要約〕
本発明は、癌の検出に使用するミトコンドリアＤＮＡ変異に関する。本発明の一形態によれば、個体における癌の検出方法は、
ａ）個体から生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間にｍｔＤＮＡ配列の欠失を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ、および
ｄ）少なくとも１つの周知の参照値と、欠失を有する試料におけるｍｔＤＮＡの量とを比較するステップ、を含む。
【００１０】
本発明の別の形態によれば、癌の進行に関する個体の測定方法は、
ａ）生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間にｍｔＤＮＡ配列の欠失を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ、および、
ｄ）一定期間にわたってａ）〜ｃ）のステップを繰り返すステップを含み、一定期間を経た後の欠失の増加レベルが癌の指標である。
【００１１】
本発明の別の形態によると、個体における癌の検出方法は、
ａ）個体から生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において配列番号１または配列番号２に記載の配列に対応する配列を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ；および、
ｄ）上記試料において配列番号１または配列番号２に対応するｍｔＤＮＡの量と、少なくとも１つの周知の参照値とを比較するステップを含む。
【００１２】
本発明の別の形態によると、
ａ）１つ以上の生物学的試料を収集するための材料；および、
ｂ）ｍｔＤＮＡ欠失の検出に適したプライマーおよび試薬を含む、本発明の方法を実施するための診断キットを提供する。
【００１３】
〔図面の簡単な説明〕
添付の図面の参照、および下記詳細な説明から、本発明の上記および他の特徴が明らかとなるであろう。
【００１４】
図１は、実施例１のサイクル閾値（cycle threshhold）を示すグラフである。
【００１５】
図２は、本発明の一実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【００１６】
図３は、実施例２に関するサイクル閾値を示すグラフである。
【００１７】
図４は、本発明の別の実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【００１８】
図５は、４ｋｂの欠失の検出に有効なプライマーの設計および配列を示す概略図である。
【００１９】
図６は、本発明の別の実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【００２０】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、癌の予測、診断および検査方法を提供する。当該方法は、１つ以上の生物学的試料を得るステップと、試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップと、試料内のミトコンドリア変異の量を測定するステップと、参照値と試料内の変異の量とを比較するステップとを含む。即ち、方法は、発病を検知する、および個体が癌になる傾向を評価するための総合的ツールを提供する。本方法によって、経時的に個体の危険因子を測定することができ、および／または、治療薬および治療計画への患者の反応を測定することができる。
【００２１】
〔定義〕
特段別に定義されない限りは、本願に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者が共通に理解する意味を有する。
【００２２】
本願にて使用するとき、「約」という用語は、言及した値から妥当な範囲の偏差があることを意図する。本願において提供されたあらゆる既定値は、具体的に示されているか否かに関わらず、このような偏差が常に有するものと解釈されるものである。
【００２３】
本願にて定義するとき、「生物学的試料」とは、ｍｔＤＮＡが得られる細胞を含む組織または体液を意図する。例えば、生物学的試料を、乳房組織または前立腺組織などの組織、または血液、唾液、脳脊髄液、喀痰、尿、粘膜、滑液、腹水、羊水などから抽出することができる。生物学的試料は、外科検体（surgical specimen）または生検検体（biopsy specimen）であってもよい。生物学的試料は、供給源から得られたものをそのまま使用してもよいし、または、前処理を行ってその特性を変更したものであってもよい。したがって、血清、破壊細胞からプラズマまたは血清を調製する、固形原料から液体、希釈粘液、濾液、濃縮液、不活性化干渉要素、添加試薬などを調整することによって、使用前に生物学的試料に前処理を施すことができる。
【００２４】
本願において、「サイクル閾値」（ＣT）という用語は、リアルタイムＰＣＲを用いた目的物の増幅が、蛍光シグナルなどの信号によって示されるときに、バックグラウンドを超えて上昇する点である。ＣTは、検査される配列の量に反比例する。
【００２５】
本願において、「診断」とは、疾病の診断または管理における要素として、変異または変異の組み合わせが存在するか否かを使用することを意図する。変異の検出は、疾病の診断における１つのステップであり得る。
【００２６】
本願において、「欠失」とは、ｍｔＤＮＡの連続した配列から、ｍｔＤＮＡの或る領域が除去されることを意図する。欠失は、１塩基〜数千塩基、またはそれ以上の塩基の大きさに及ぶ。
【００２７】
本願において、「ミトコンドリアＤＮＡ」または「ｍｔＤＮＡ」とは、ミトコンドリア内に存在するＤＮＡである。
【００２８】
本願において、「変異」は、ミトコンドリアＤＮＡ内における、野生型配列からのあらゆる修飾または変化を含む。例えば、点突然変異、転位、挿入、転換、転座、欠失、逆位、重複、組み換え、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。配列の修飾または変化は、一塩基の変化から、ＤＮＡ断片全体の追加または除去までひろく含むものである。
【００２９】
本願において、「感度」とは、本発明の方法を用いて得られる陽性な結果の割合（真陽性率）を意図する。
【００３０】
本願において、「特異性」は、本発明を用いて得られる偽陽性な結果の割合（偽陽性率）を意図する。
【００３１】
「治療」および「処置」は、本願において互いに交換可能に使用され、被験者の状態を改善させることを意図して行われる診療行為を意図する。改善は、主観的または客観的であってよく、病状の緩和、疾病の進行の抑制、または病状を変化させることに関する。したがって、治療および処置という用語は、最も広義に使用され、様々な段階での疾病の防止（予防）、緩和、低減、治癒を含む。被験者の状態の悪化を防ぐことも本用語に含まれる。治療／処置を必要とする被験者は、疾病に既に罹患しているもの、および、疾病の進行の傾向もしくは危険性があるもの、疾病の予防を行うものを含む。
【００３２】
〔癌の予測、診断および測定のための分析〕
（ミトコンドリアの変異を検出するためのアッセイ）
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）ダイナミクスは、重要な診断ツールである。ｍｔＤＮＡ内の変異は、発症の事前的な指標であることが多く、発病に関する危険因子を示すバイオマーカーとして機能する。本願において説明するように、生物学的試料内のミトコンドリアＤＮＡの異常のレベルを測定することによって、１つ以上の癌の存在を検出することが可能であるとともに、１つ以上の癌が患者に及ぼす潜在的リスクまたは素因を特定することが可能である。さらに、定期的にｍｔＤＮＡを測定することによって、健康管理の専門家に、経時的に患者の進行を測定するリアルタイム定量測定ツール、および／または、治療推奨の評価としてのツールを提供することができ、癌予防または治療における有効性の測定が可能になる。
【００３３】
したがって、本発明は、１つ以上の生物学的試料を得るステップ、該試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ、および該試料内のｍｔＤＮＡ異常の量を定量し、参照値と異常レベルとを比較することによって、ミトコンドリアの変異に関して該試料を分析するステップを含む、癌の予測、診断および測定方法を提供する。参照値は、当該方法が癌の予測、診断または測定のいずれを目的としているかに基づくものであることは、当業者には自明であろう。したがって、参照値は、１つ以上の周知の非癌性である生物学的試料、１つ以上の周知の癌性である生物学的試料、および／または、経時的に取られた１つ以上の生物学的試料、から採取されたｍｔＤＮＡに関連していてもよい。これらの参照値は、１つ以上の生物学的試料から採取されたｍｔＤＮＡデータとの比較に使用され、このとき、例えば参照試料と比較される生物学的試料における欠失が同量である、または増加しているとき、癌の兆候または癌の発病を示す。あるいは、経時的な欠失レベルの増加が癌の発病を示す。
【００３４】
本発明の形態によれば、癌の予測、測定および診断方法は、１つ以上のミトコンドリアの変異を検出および測定するための分析を含む。本発明の一実施形態によれば、変異は、ｍｔＤＮＡの欠失である。本発明の別の実施形態によれば、変異は、３９２６ｂｐのｍｔＤＮＡの欠失である（本願において、「４ｋｂ欠失」または「４ｋｂ配列」と称する）。さらなる別の実施形態によれば、変異は、配列番号１または配列番号２に記載された配列を有するｍｔＤＮＡの欠失である。環状形態である場合に、配列番号１と配列番号２とに違いはない。
【００３５】
４ｋｂ欠失は、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７番目のヌクレオチドから１６２５４番目のヌクレオチドの範囲内で発生するものである。本願では、ヒトｍｔＤＮＡゲノムを配列番号３と示す（Genbank accession no. AC_000021）。４ｋｂの欠失は、大きさ１２ｂｐの直接隣接する反復を特徴とし、当該反復は、１２３１７〜１２３２８の位置、および１６２４３〜１６２５４の位置に配置される。反復配列は、5'-TGCAACTCCAAA-3'である。したがって、本発明の一実施形態によれば、上記変異は、ヒトｍｔＤＮＡゲノムにおける約１２３１７残基〜約１６２５４残基の欠失である。
【００３６】
発明者らは、後述する実施例にて示すように、当該欠失が癌、特に前立腺癌および乳癌に関連していることを発見した。したがって、当該欠失が正確なバイオマーカーを提供し、少なくともこれらの組織における癌の検出、診断または測定に有益な手段を提供する。
【００３７】
欠失の結果、２つの欠失モノマーが生成される。１つは４ｋｂの大きさ（小サブリモン（small sublimon））であり、もう１つは約１２．５ｋｂの大きさ（大サブリモン（large sublimon））である。それぞれ４ｋｂまたは１２．５ｋｂの配列である小サブリモンまたは大サブリモンの存在を特定することによって、欠失の発生を検出してもよい。
【００３８】
実施例において、ミトコンドリアの変異を測定する方法の一例を挙げる。試料からのｍｔＤＮＡの抽出は、好適な公知の方法にて行っても良い。ｍｔＤＮＡの抽出後、ミトコンドリアゲノムの全領域または特定の領域を増幅させる。このｍｔＤＮＡの抽出は、公知のまたは、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology （Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2007）に記載されたようなミトコンドリアゲノムの配列解析（sequencing）を含んでいてもよい。同様に、当業者に周知の好適な技術から、ｍｔＤＮＡ内の変異の存在を検出する方法を選択することができる。例えば、ｍｔＤＮＡの分析は、ｍｔＤＮＡの配列解析、ＰＣＲによる増幅、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ウェスタンサウスウェスタンブロット法、変性ＨＰＬＣ、マイクロアレイ、バイオチップまたは遺伝子チップを使用したハイブダイゼーション、分子マーカー分析、バイオセンサ、融解温度プロファイリング、のいずれか、またはこれらを組み合わせて含んでいてもよい。
【００３９】
ミトコンドリアＤＮＡの配列解析を行うために好適な手段を使用してもよい。配列解析の前に、ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅させることが好ましい。ＰＣＲ法は周知技術であり、Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335に記載されているように実施してもよい。ＰＣＲによって得られたものを、直接配列解析してもよく、またはベクター中にてクローンを作成し、当該ベクターを、その後、バクテリアの宿主内に導入する。ＤＮＡ配列解析法は、例えば次に挙げる文献に記載されている。Brumley, R. L. Jr. and Smith, L.M., 1991, Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis, Nucleic Acids Res. 19:4121-4126 および、Luckey, J.A., et al, 1993, High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol. 218: 154-172。ＰＣＲとｍｔＤＮＡの配列解析とを組み合わせた使用について、例えば次に挙げる文献に記載されている。Hopgood, R., et al, 1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products, Biotechniques 13:82-92、および、Tanaka, M. et al, 1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264: 407-421。
【００４０】
下記の実施例にて示すように、リアルタイム定量ＰＣＲ法を、４ｋｂの欠失の有無の検出およびそれを測定するための好適な手段として挙げることができるが、当業者にとって他の方法も周知であり、上述したように利用することができる。さらに、Bio-Rad's Bioplex(TM)システムおよび、サスペンジョンアレイ技術を用いて、欠失の測定を実行することができる。一般的に、当該方法は、何らかのの周知の方法を使用した配列の増幅および測定を必要とする。
【００４１】
下記プライマーは、４ｋｂの欠失の検出に使用されるプライマーの例である。
【００４２】
４フォワード（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基12313-12328/16255-16267に結合）
5'-TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC-3' （配列番号４）；
４リバース（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基16391-16409に結合）
5'-AGGATGGTGGTCAAGGGAC-3' (配列番号５)。
【００４３】
本発明の一実施形態では、４ｋｂの欠失の存在を明示する標的部位を増幅するために、一対の増幅プライマーを使用する。本実施形態では、一対の増幅プライマーのうちの１つは、４ｋｂ配列の欠失が起こり、ｍｔＤＮＡが環状ｍｔＤＮＡ分子として再形成された後で、ｍｔＤＮＡ領域の結合された部位と重複する（たとえば、ｍｔＤＮＡゲノムの１２３２８と１６２５５との間における結合）。したがって、４ｋｂの部位が欠失する場合に限って、重複したプライマーの伸長が生じる。図５は、プライマーの設計および配列を示す概略図である（すなわち、配列番号４）。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、欠失した４ｋｂの配列に関連する標的部位を増幅するために一対の増幅プライマーを使用する。欠失した４ｋｂの配列は、欠失後、環状ｍｔＤＮＡ分子として再形成されてもよい。本実施形態では、一対の増幅プライマーのうちの１つが、４ｋｂの配列の末端の再結合部位に重複する。したがって、試料内で検出される４ｋｂの分子の量の増大が、癌の指標である。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態では、欠失の切断点が不明であるので、プライマー位置について２つの可能性が生じる。本実施形態では、２つの個別のフォワードプライマーは、欠失する４ｋｂの配列に関連する標的部位を増幅させるように設計されていてもよい。下記プライマーは、本願において４ｋｂの欠失の検出に使用され得るプライマーの例である。
【００４６】
（フォワードプライマー）
プライマーＡ（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基12313-12328/16255-16267に結合）
5'-TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC-3'（配列番号４）；
プライマーＢ（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基12302-12316に結合）
5'- CCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAAGCCAC-3'（配列番号６）。
【００４７】
（リバースプライマー）
プライマーＣ（ヒトｍｔＤＮＡゲノムの塩基16391-16409に結合）
5'-AGGATGGTGGTCAAGGGAC-3'（配列番号５）。
【００４８】
当業者であればわかるように、フォワードプライマーＡまたはＢは、リバースプライマーＣとともに使用され、ｑＰＣＲ分析において有益なＰＣＲ産物を生成する。
【００４９】
（生物学的試料）
本発明は、１つ以上の生物学的試料の獲得および採取を含む診断テストを提供する。本発明では、生物学的試料は、ｍｔＤＮＡが得られる細胞を含む組織または体液を指す。例えば、生物学的試料は下記から得られる組織であるが、これらに限定されるものではない。例えば、乳房、前立腺、神経、筋肉、心臓、腹、結腸細胞などの組織。または、生物学的試料は、例えば、血液、唾液、脳脊髄液、喀痰、尿、粘膜、滑液、腹水、羊水などから得てもよい。生物学的試料は、癌性または非癌性の組織から得られてもよく、外科検体または生検検体であってもよい。
【００５０】
生物学的試料は、供給源から得られたものをそのまま使用してもよいし、または、前処理を行って性質を修正した試料を使用してもよい。したがって、血液からの血清やプラズマの調整、細胞の破壊、固形原料からの液体の調整、粘液の希釈、液体のろ過、液体の上蒸留、液体の濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加などの前処理を使用前に生物学的試料に施すことができる。
【００５１】
当業者であれば、１回につき、１つ以上の試料タイプを分析することができることがわかる（すなわち、１つ以上の癌の検出）。さらに、経時的に試料を採取することが必要な場合には、例えば経時的な危険因子の測定または癌の測定のために、既定の試料を単独または、検査期間中に採取された他の試料と共に診断してもよい。この点に関して、生物学的試料を、１回のみ採取してもよいし、または隔週で１回、１ヶ月に１回、半年に１回、または１年に１回採取してもよい。
【００５２】
当業者であれば、ミトコンドリアのＤＮＡ標的が、核酸標的よりもはるかに豊富であり（約１０００倍多い）、核酸では極端に低い収量しか得られないような量の試料でも、本発明においては、好適に採用できることが理解できよう。
【００５３】
〔癌の予測、診断および観察への応用〕
（癌の診断および観察）
殆どのタイプの組織および年齢層における癌の罹患には、癌の存在を検出するだけでなく、疾病の発病、進行および転移を予防することを意図した予防措置および治療の成功および適否を測定するツールが必要である。１つ以上の個々の生物学的試料におけるミトコンドリアのＤＮＡ欠失のレベルを測定することによって、危険因子、癌、および／または疾病のステージの初期診断を行うことができる。
【００５４】
例えば初期段階にて癌を検出したり、あらゆる組織学的異常が発生する前に癌を検出するために、本発明のシステムおよび方法を使用することができる。さらに、隔週に１回、１ヶ月に１回、半年に１回、または１年に１回など定期的に試料検査を行うことによって、健康管理の専門家に、経時的に疾患の進行を測定するリアルタイム定量モニタリングツール、および／または、癌予防または治療における有効性を測定するための治療推奨の評価としてのツールを提供することができる。
【００５５】
次に実施例を挙げる。本発明のある実施形態によれば、本発明は、前立腺癌および乳癌における潜在的な悪性腫瘍への前癌状態、新生組織形成の有無、および進行を検出するために使用されてもよい。ある形態では、本発明は、癌の検出、診断および／または観察のための４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失の検出および測定を含む。本方法では、生物学的試料（例えば生体組織、または尿、前立腺マッサージ体液（prostate massage fluid）などの体液）からｍｔＤＮＡを抽出する。抽出されたｍｔＤＮＡを検査し、試料における４ｋｂの欠失レベル（すなわち量）を測定する。本願において実行される検査では、癌をもつ被験者から得られた試料における欠失レベルは、癌をもたない被験者から得られた試料と比べて、上昇していることがわかった。下記に示す情報およびデータに基づき、本発明者らは、ヒトｍｔＤＮＡにおける４ｋｂの欠失レベルの上昇が癌の指標であると結論づけた。
【００５６】
別の実施形態では、個体から例えば前立腺組織、前立腺マッサージ体液、尿または乳房組織などを得て、経時的に（例えば数年間）検査をし、癌の発症または進行を測定する。４ｋｂの欠失のレベルの経時的な上昇は、癌の発症および進行の指標となり得る。
【００５７】
当業者であれば、ミトコンドリアのＤＮＡ標的の測定のために、個体に由来する１つ以上の生物学的試料を分析することによって、医療従事者に治療方針の有効性を測定する手段を提供できることがわかる。当業者であれば、医療従事者がｍｔＤＮＡ分析を用いることによって、低質な食事および運動不足などの生活習慣、または周知の発癌性物質（タバコ、汚染物質など）への曝露を招く活動などを特定できる（そして生活習慣について推奨できる）ことがわかる。
【００５８】
本発明の別の形態は、生検試料（例えば前立腺癌、または乳癌）から癌生検テストの結果の適否を判定する方法であって、生検試料から非癌性組織を得るステップ、および無病組織における４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失の量を検出および測定するステップとを有する方法を提供する。
【００５９】
（癌に対する遺伝的素因の測定）
１つ以上の癌の各リスクに対する評価を十分に行うために、医療従事者は、患者の危険因子の理解および伝達を可能にする情報をできるだけ多く得る必要がある。ｍｔＤＮＡ異常のレベルの測定に本願を利用することは、癌に対する個体の感受性を評価するだけでなく、より積極的な観察および治療措置を必要とする可能性がある、より大きいリスクをもつ患者を特定するツールとしても有用である。
【００６０】
この点につき、下記に、癌を患った被験者から得られた試料と癌を患っていない被験者から得られた試料間における、４ｋｂの欠失を有するｍｔＤＮＡの量の違いを示す様々な例を挙げる。４ｋｂの欠失の量は、癌を患った被験者から得られた試料の方が高いことがわかった。既知の癌細胞から得られた試料、および／または既知の非癌細胞から得られた試料における４ｋｂの欠失の量を比較して、測定を行った。
【００６１】
このようにして、発明者らは、１つ以上の癌に対する個体の傾向を特定する上で生物学的試料のスクリーニングが有益であると結論付けた。したがって、本発明の一実施形態によれば、１つ以上の生物学的試料から癌について複数人をスクリーニングする方法であって、１つ以上の試料を得るステップと、該試料における４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失レベルを検出および測定するステップとを含む、方法を提供する。本発明の特定の実施形態によれば、体液または組織試料から前立腺癌または乳癌について複数人をスクリーニングする方法であって、体液または組織試料を得るステップと、体液または組織試料における４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失レベルを検出および測定するステップとを含む、方法を提供する。
【００６２】
加齢に伴って４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失が蓄積すると、中年以上の男性または中年以上の女性において、それぞれ高い確率で前立腺癌または乳癌等にかかりやすくなる。同様に、個体の食生活、運動習慣および周知の発癌性物質への曝露に基づく特定の生活習慣が、４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失の蓄積に関連している可能性もある。したがって、本発明の一形態によれば、経時的に、１つ以上の生物学的試料、例えば、限定するものではないが、乳房組織および前立腺組織、または前立腺マッサージ体液、尿などの体液における４ｋｂの欠失の量を測定することよって定期的に癌スクリーニングを行う構成である方法を提供する。
【００６３】
（治療薬の評価）
癌治療に使用する可能性のある治療薬のスクリーニング、または、当該薬の治療効果の測定に本発明の方法を使用してもよい。本願において例示された癌に関連する様々なバイオマーカーを測定するために本発明の方法を使用してもよい。どの時間点でも生物学的試料のＤＮＡ損傷レベルを評価できるので、個体の健康について、情報量が多いスクリーニングテストを個々に構築することができる。また、既存および新たな治療薬および治療方法の安全性および有効性の評価を行うことができる。さらに、被験者の健康状態の根底を為す具体的な遺伝子的変化を特定することによって、特定の治療薬または治療方法が患者に効くかどうか、およびどの程度効くかを容易に診断できると考えられる。
【００６４】
（キット）
本発明は、臨床環境にて使用するための診断／スクリーニングキットを提供する。当該キットは、１つ以上のサンプリング手段を含むだけでなく、ｍｔＤＮＡの異常の特定に必要な他の材料をも含む。
【００６５】
キットは、診断分析を行うために必要な緩衝剤、塩、検出試薬などの試薬を含んでいてもよい。生物学的試料の隔離および／または治療のための緩衝剤および溶液などの他の成分がキットに含まれていてもよい。キットにおける１つ以上の成分は、凍結乾燥されていてもよく、キットは、凍結乾燥成分の再構成に適した試薬をさらに含んでいてもよい。
【００６６】
適宜、キットが、反応槽、混合槽、および検査試料の調製を促進する他の要素を含んでいてもよい。キットは、使用説明書を有していてもよく、紙媒体、またはディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み取り可能な媒体であってもよい。
【００６７】
本発明の別の形態では、癌診断を行うキットがｍｔＤＮＡの抽出手段、プライマー、試薬、および使用説明書を有する。
【００６８】
本発明の別の形態では、例えば前立腺癌または乳癌などの癌診断のためのキットが、ｍｔＤＮＡの抽出手段、配列番号４および配列番号５に挙げられる核酸配列を有するプライマー、試薬および使用説明書を有する。
【００６９】
本発明の別の形態では、例えば前立腺癌または乳癌などの癌診断のためのキットが、ｍｔＤＮＡの抽出手段、配列番号６および配列番号５に挙げられる核酸配列を有するプライマー、試薬および使用説明書を有する。
【００７０】
本願に記載された発明をよりよく理解するために、下記の実施例について説明する。これらの実施例は、本発明の例示を目的としており、いかなる場合も本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。
【００７１】
〔実施例〕
（実施例１：ヒトｍｔＤＮＡにおける４ｋｂの欠失と前立腺癌との関連）
前立腺癌と診断された５人の患者、および、針生検処置（needle biopsy procedure）を受けて前立腺悪性腫瘍が検出されなかった５人から、尿試料を採取した。前立腺細胞の採取を助ける直腸指針（ＤＲＥ）を行った後で、これらの試料を採取した。
【００７２】
複数の試料を受け取ると直ちに、５ｍｌずつを除去し、２ｍｌの試料を１４，０００ｘｇにて遠心分離して沈殿物を形成させた。上澄液は除去して廃棄した。
【００７３】
２００ｕｌのリン酸緩衝生理食塩水中に沈殿物を再縣濁させた。再縣濁した沈殿物および尿試料全体を、製造者の指示に従って、QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen P/N 51304)を用いてＤＮＡ抽出処理にかけた。そして、NanoDrop ND-1000分光光度計を用いて、得られたＤＮＡ抽出物を測定し、０．１ｎｇ／ｕｌの濃度に調製した。
【００７４】
下記に従って、４ｋｂの欠失に特異的なプライマーを用いて、リアルタイム定量ＰＣＲによって試料を分析した。
【００７５】
1X iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad product no. 170-8880）。
【００７６】
１００ｎｍｏｌのフォワードプライマー（5'- TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC -3'）（配列番号４）。
【００７７】
１００ｎｍｏｌのリバースプライマー（5'- AGGATGGTGGTCAAGGGAC -3'）（配列番号５）。
【００７８】
２５ｕｌ反応液中の１ｎｇのテンプレートＤＮＡ。
【００７９】
下記のプロトコールに従って、Opticon 2 DNA Engine（Bio-Rad Canada）において反応サイクルをおこなった。つまり、
１．９５℃にて３分間
２．９５℃にて３０秒間
３．６９℃にて３０秒間
４．７２℃にて３０秒間
５．プレート読み出し
６．ステップ２〜５を４４回繰り返す
７．７２℃にて１０分間
８．５０℃から１０５℃までの溶解曲線、１℃毎に読み出し、３秒間維持
９．１０℃に保つ。
【００８０】
（結果）
尿沈殿物から得られた結果は、観測平均サイクル閾値または有効なカットオフポイントにおいて大きな違いはなかった。しかし、尿全体の試料から得られた結果には、大きな違いが見られた。
【００８１】
表１および表２、ならびに図１は、前立腺悪性組織を有する被験者から得られた尿試料、および危険率有意水準０．０４の良性組織を有する被験者から得られた尿試料の平均ＣTスコアにおける違いを示す。
【００８２】
表１：ＣTスコアの平均値：尿試料
【００８３】
【表１】
表２：平均ＣTスコアの有意性試験
独立試料検査
【００８４】
【表２】
表３および４、ならびに図２は、３６．２５５のカットオフサイクル閾値を使用するとき、前立腺癌の分析の感度が８６％、特異性が８６％であることを示す。
【００８５】
図２は、尿を検査した場合の、前立腺癌のマーカーとしての４ｋｂ ｍｔＤＮＡの欠失の特異性および感度を示す受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic：ＲＯＣ）曲線である。３６．２５５のカットオフＣTを使用して上記結果を得た。上記ＣTでのマーカーの感度は８６％であり、特異性は８６％である。
【００８６】
表３に、３６．２５５のカットオフＣTの測定結果を示す。表３に記載された結果は、３６．２５５のカットオフＣTが最も高い感度および特異性を提供することを示す。
【００８７】
検査の精度は、前立腺癌を有している群と有していない群とをどれだけ正確に分けられるかによって決まる。ＲＯＣ曲線の下の領域を用いて、精度を測定する。表４は、本実施例における、曲線の下の領域の算出を示す。
【００８８】
表３：特異性および感度の測定
【００８９】
【表３】
a−最小カットオフ値は、最小測定検査値−１であり、最大カットオフ値は、最大測定検査値＋１である。他のカットオフ値の全てが、２つの連続した検査測定値（two consecutive ordered observed test values）の平均である。
【００９０】
表４：ＲＯＣ曲線の下の領域を示す結果
【００９１】
【表４】
【００９２】
〔実施例２：ヒトｍｔＤＮＡにおける４ｋｂ欠失と乳癌との関連〕
悪性腫瘍を有する１０人、良性乳房疾患を有する、または何の異常もない１０人の計２０人の乳房組織試料を採取した。これらの試料を、ホルマリン固定パラフィン包埋し、製造者のプロトコールに従って、QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen P/N 51304)を用いて抽出するために、それぞれ２０ミクロンの部位を個々の試料チューブ内に切断した。Nanodrop ND−１０００を用いてＤＮＡを測定し、２ｎｇ／ｕｌの濃度に調整した。
【００９３】
下記に従って、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて４ｋｂの欠失に特異的なプライマーとともに試料を分析した。
【００９４】
X iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad product no. 170-8880)
175 nmolのフォワードプライマー（5'- TTGGTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACC -3') (配列番号４)
175 nmolのリバースプライマー(5'- AGGATGGTGGTCAAGGGAC -3') (配列番号５)
25ulの反応液中の20 ngのテンプレートDNA
下記の手法に従って、Opticon 2 DNA Engine（Bio-Rad Canada）において反応液をサイクルさせた。
【００９５】
１．９５℃にて３分間
２．９５℃にて３０秒間
３．７０℃にて３０秒間
４．７２℃にて３０秒間
５．プレート読み出し
６．ステップ２〜５を４４回繰り返す
７．７２℃にて１０分間
８．５０℃から１０５℃までの溶解曲線、１℃毎に読み出し、３秒間維持
９．１０℃に保つ。
【００９６】
表５および６、ならびに図３は、悪性の乳房組織を有する被験者からの乳房組織試料、および０．０６５レベルの良性の乳房組織を有する被験者からの試料についての平均ＣT値における違いを示す。
【００９７】
表５：ＣTスコアの平均値：乳房組織試料
【００９８】
【表５】
表６：平均ＣTスコアの有意性試験
【００９９】
【表６】
表７および８、ならびに図４は、１９．８４５のカットオフサイクル閾値を使用する場合に、乳癌分析の感度が７８％、特異性が７８％であることを示す。
【０１００】
図４は、乳房組織を検査した場合の、乳癌のマーカーとしての４ｋｂのｍｔＤＮＡの欠失の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。１９．８４５のカットオフＣTを使用して上記結果を得た。上記ＣTでのマーカーの感度は７８％であり、特異性は７８％である。
【０１０１】
表７に、１９．８４５のカットオフＣTの測定結果を示す。表７に記載された結果は、１９．８４５のカットオフＣTが最も高い感度および特異性を提供することを示す。
【０１０２】
検査の精度は、乳癌を有している群と有していない群とをどれだけ正確に分けられるかによって決まる。ＲＯＣ曲線の下の領域を用いて精度を測定する。表８は、本例における曲線の下の領域の算出を示す。
【０１０３】
表７：特異性および感度の測定
【０１０４】
【表７】
a−最小カットオフ値は、最小測定検査値−１であり、最大カットオフ値は、最大測定検査値＋１である。他のカットオフ値の全てが、２つの連続した検査測定値の平均である。
【０１０５】
表８：ＲＯＣ曲線の下の領域を示す結果
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
〔実施例３：針生検試料を用いた、ヒトｍｔＤＮＡにおける４ｋｂ欠失と前立腺癌との関連〕
前立腺癌を有しない９人、および前立腺癌を有する１０人の計１９人から前立腺針生検試料を得た。針生検組織は、臨床診断では標準的であるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）とした。各生検の１０ミクロン部位を直接遠心分離管の中に入れ、QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen, p/n 51306)を用いてＤＮＡを抽出した。NanoDrop ND-1000分光光度計を用いて２６０ｎｍの吸光度に基づいてＤＮＡ抽出物を測定した。収率は、３４７ｎｇから７５０ｎｇの範囲内であった。これらの試料を２ｎｇ／ｕｌまで希釈し、表９および下記に従って増幅反応を行った。
【０１０８】
表９：増幅反応のための試薬および濃度
【０１０９】
【表９】
ヌクレアーゼを含まない水を２５ｕｌ体積の最終反応物に加えた。DNA Engine Chromo4 Real Time PCR Instrument (Bio-Rad Laboratories)において、下記サイクル条件にしたがって、増幅を実行した：
１．９５℃にて３分間
２．その後下記３から５を４５サイクル
３．９５℃にて３０秒間
４．６９℃にて３０秒間
５．７２℃にて３０秒間
６．プレート読み出し
そのあと、
７．７２℃にて１０分間
８．５０℃から１０５℃までの溶解曲線、１℃毎に読み出し、３秒間維持
９．４℃に保つ。
【０１１０】
表１０に示された結果は、前立腺癌を有しているヒトのＣT値が、前立腺癌を有していないヒトよりも低く、前立腺組織における４ｋｂの欠失のレベルが高いことを示している。前立腺癌を有している患者の平均ＣT値は３０．７であり、一方、前立腺癌を有していない患者の平均ＣT値は３６．４である。この５．７のＣT差は、前立腺癌を有している群での４ｋｂの欠失レベルが前立腺癌を有していない群の４ｋｂの欠失レベルの１００倍に相当する。
【０１１１】
表１０：患者の診断および関連するＣTスコア
【０１１２】
【表１０】
表１１および１２は、正常な前立腺組織および悪性の前立腺組織を有する患者から得られた前立腺組織試料の平均ＣTスコアにおける違いを示す。
【０１１３】
表１１：ＣTスコアの平均値：前立腺針生検組織
【０１１４】
【表１１】
表１２：平均ＣTスコアの有意性試験
【０１１５】
【表１２】
表１３および図６は、３２．６５のカットオフサイクル閾値ＣTを使用する場合に、これらの患者を正確に診断する感度が８０％、特異性が６７％であることを示す。
【０１１６】
表１３：特異度および感度の測定
【０１１７】
【表１３】
特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、当業者にとっては、添付の請求項に述べられている本発明の本質および範囲から逸脱することなく、様々な変形が可能であることが明らかである。当業者にとって明らかである当該変形の全てが、下記請求項の範囲内に含まれるものとする。本願に引用された全ての文献は、参照することによって本願に組み込まれている。
【０１１８】
〔先行文献〕
Birch-Machin MA, Online Conference Report (Sunburnt DNA), International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, New Scientist, 2000(a)
Birch-Machin MA, Taylor RW, Cochran B, Ackrell BAC, Tumbull DM. Ann Neurol 48: 330-335, 2000(b)
Birch-Machin, M.A. (2000). Mitochondria and skin disease. Clin Exp Dermatol, 25, 141-6.
Brown, M.D., et al., Am J. Humn Genet, 60: 381-387, 1997
Bogliolo, M, et al., Mutagenesis, 14: 77-82, 1999
Chinnery PF and Turnbull DM., Lancet 354 (supplement 1): 17-21, 1999
Huoponen, Kirsi, Leber hereditary optic neuropathy: clinical and molecular genetic findings, Neurogenetics (2001) 3: 119-125.
Hayward SW, Grossfeld GD, Tlsty TD, Cunha GR., Int J Oncol 13:35-47, 1998
Huang GM, Ng WL, Farkas J, He L, Liang HA, Gordon D, Hood R., Genomics 59(2):178-86,1999
Konishi N, Cho M, Yamamoto K, Hiasa Y. Pathol. Int. 47:735-747,1997
Landis SH, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer J. Clin. 49:8-31
Lee HC, Lu CY, Fahn HJ, Wei YHu. Federation of European Biochemical Societies, 441:292-296,1998
Mitochondrial Research Society http://www.mitoresearch.org/diseases.html.
MITOMAP: A human mt genome database (www.gen.emory.edu/mitomap.html)
Naviaux, RK., Mitochondrial Disease- Primary Care Physican's Guide. Psy-Ed. Corp D/B/A Exceptional Parents Guide: 3-10, 1997
Parrella P, Xiao Y, Fliss M, Sanchez-Cespedes M, Mazzarelli P, Rinaldi M, Nicol T, Gabrielson E, Cuomo C, Cohen D, Pandit S, Spencer M, Rabitti C, Fazio VM, Sidransky D: Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates. Cancer Res 2001, 61:7623-7626
Polyak Y, et al., Nature Genet. 20 (3):291-293, 1998
Seidman, M.D. et al., Arch. Otolaryngol Head Neck Surg., 123: 1039-1045, 1997
Sherrat EJ, Thomas AW, Alcolado JC., Clin. Sci. 92:225-235,1997
Shoffner JM, Brown MD, Torroni A, Lott MT, Cabell MF, Mirra SS, Beal MF, Yang C, Gearing M, Salvo R, Watts RL, Juncos JL, Hansen LA, Crain BJ, Fayad M, Reckford CL, and Wallace DC., Genomics 17: 171-184, 1993
SpringNet - CE Connection: Screening, Diagnosis: Improving Primary Care Outcomes. Website: http://www.springnet.com/ce/j803a.htm
Taniike, M. et al., BioChem BioPhys Res Comun, 186: 47-53, 1992
Valnot, Isabelle, et al., A mitochondrial cytochrome b mutation but no mutations of nuclearly encoded subunits in ubiquinol cytochrome c reductase (complex III) deficiency, Human Genetics (1999) 104: 460-466
von Wurmb, N, Oehmichen, M, Meissner, C., Mutat Res. 422:247-254, 1998
Wallace et al., Mitochondiral DNA MUtatio Assoicated with Leber's Hereditary Optic Neuropathy, Science, 1427-1429
Wei YH. Proceedings of the Nat. Sci. Council of the Republic of China April 22(2):5567, 1998
Woodwell DA. National Ambulatory Medical Care Survey: 1997 Summary. Advance data from vital and health statistics; no. 305. Hyattsville, Maryland: National Center for Health Statistics. 1999
Yeh, J.J., et al., Oncogene Journal, 19: 2060-2066, 2000
Zhang et al., Multiple mitochondiral DNA deletions in an elderly human individual, FEBS Lett, 297, 34-38 1992
Zhang, C., et al., BioChem. BioPhys. Res. Comun., 195: 1104-1110, 1993
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】実施例１のサイクル閾値（cycle threshhold）を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【図３】実施例２に関するサイクル閾値を示すグラフである。
【図４】本発明の別の実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【図５】４ｋｂの欠失の検出に有効なプライマーの設計および配列を示す概略図である。
【図６】本発明の別の実施形態の特異性および感度を示すＲＯＣ曲線である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における癌の検出方法であって、
ａ）上記個体から生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間にｍｔＤＮＡ配列の欠失を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ、および
ｄ）欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、少なくとも１つの既知の参照値と比較するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
上記欠失が、配列番号１または配列番号２に記載された配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記少なくとも１つの参照値が、既知の非癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記参照試料と比較して上記生物学的試料における欠失の量が上昇していることが癌の指標である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、既知の癌性組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量とを比較するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記少なくとも１つの既知の参照値が、既知の癌性である組織または体液からのｍｔＤＮＡの参照試料における上記欠失の量である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記生物学的試料における欠失が、上記参照試料と比較して類似のレベルであることが癌の指標である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、既知の非癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量と比較するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記定量するステップは、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記欠失を定量するステップが、まず、上記欠失の指標となるｍｔＤＮＡの標的部位を増幅させること、および当該増幅された標的部位の上記量を測定すること、を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号４に相当する配列をもつＰＣＲプライマーが、上記標的部位を増幅させる一対の増幅プライマーの一部として使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記癌が前立腺癌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記癌が乳癌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記生物学的試料が、生体組織または体液である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上記生物学的試料が、乳房組織、前立腺組織および尿からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記参照値がサイクル閾値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間にｍｔＤＮＡ配列の欠失を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ、および
ｄ）一定期間にわたって、ａ）〜ｃ）のステップを繰り返すステップ
を含む、癌の進行に関する個体の測定方法であって、
上記一定期間を経た後の欠失の増加レベルが癌の指標である、方法。
【請求項１８】
上記欠失が配列番号１または配列番号２に記載された配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）上記欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、既知の非癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量と比較するステップ；および、
ｂ）上記欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、既知の癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量と比較するステップ
からなる群から選択される少なくとも１つのステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記欠失を定量するステップが、上記欠失の指標となるｍｔＤＮＡの標的部位を増幅させること、および当該増幅された標的部位の量を測定すること、を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
上記定量するステップは、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号２に相当する配列をもつＰＣＲプライマーが、上記標的部位を増幅させる一対の増幅プライマーの一部として使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
上記癌が前立腺癌である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
上記癌が乳癌である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
上記生物学的試料が生体組織または体液である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
上記生物学的試料が、乳房組織、前立腺組織および尿からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記標的部位の増幅が一対の増幅プライマーを用いて行われ、当該一対の増幅プライマーのうちの１つは、上記欠失の反対端のスプライス結合部位と重複する、請求項１０または２０に記載の方法。
【請求項２８】
個体における癌の検出方法であって、
ａ）上記個体から生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、上記配列番号１または配列番号２に記載の配列に対応する配列を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ；および
ｄ）上記試料において、配列番号１または配列番号２に対応するｍｔＤＮＡの量を、少なくとも１つの既知の参照値と比較するステップを含む方法。
【請求項２９】
上記少なくとも１つの既知の参照値が、既知の非癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における配列番号１または配列番号２に対応する配列の量である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記少なくとも１つの既知の参照値が、既知の癌性組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における配列番号１または配列番号２に対応する配列の量である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
上記定量するステップは、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
上記欠失を定量するステップが、まず、上記欠失の指標となるｍｔＤＮＡの標的部位を増幅させること、および当該増幅された標的部位の上記量を測定すること、を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記標的部位の増幅に使用される一対のＰＣＲプライマーのうちの一つが、上記配列が再び環化した後で、配列番号１または配列番号２に対応する上記配列である再結合部位と重複する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記癌が前立腺癌である、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
上記癌が乳癌である、２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
上記生物学的試料が生体組織または体液である、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
上記生物学的試料が、乳房組織、前立腺組織、および尿からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
上記参照値がサイクル閾値である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）１つ以上の生物学的試料を収集する材料；および
ｂ）ｍｔＤＮＡの欠失の検出に適したプライマーおよび試薬を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１】
個体における癌の検出方法であって、
ａ）上記個体から生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間にｍｔＤＮＡ配列の欠失を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ、および
ｄ）欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、少なくとも１つの既知の参照値と比較するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
上記欠失が、配列番号１または配列番号２に記載された配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記少なくとも１つの参照値が、既知の非癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記参照試料と比較して上記生物学的試料における欠失の量が上昇していることが癌の指標である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、既知の癌性組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量とを比較するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記少なくとも１つの既知の参照値が、既知の癌性である組織または体液からのｍｔＤＮＡの参照試料における上記欠失の量である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記生物学的試料における欠失が、上記参照試料と比較して類似のレベルであることが癌の指標である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、既知の非癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量と比較するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記定量するステップは、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記欠失を定量するステップが、まず、上記欠失の指標となるｍｔＤＮＡの標的部位を増幅させること、および当該増幅された標的部位の上記量を測定すること、を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号４に相当する配列をもつＰＣＲプライマーが、上記標的部位を増幅させる一対の増幅プライマーの一部として使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記癌が前立腺癌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記癌が乳癌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記生物学的試料が、生体組織または体液である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上記生物学的試料が、乳房組織、前立腺組織および尿からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記参照値がサイクル閾値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、ヒトｍｔＤＮＡゲノムの約１２３１７残基〜約１６２５４残基の間にｍｔＤＮＡ配列の欠失を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ、および
ｄ）一定期間にわたって、ａ）〜ｃ）のステップを繰り返すステップ
を含む、癌の進行に関する個体の測定方法であって、
上記一定期間を経た後の欠失の増加レベルが癌の指標である、方法。
【請求項１８】
上記欠失が配列番号１または配列番号２に記載された配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）上記欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、既知の非癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量と比較するステップ；および、
ｂ）上記欠失を有する上記試料におけるｍｔＤＮＡの量を、既知の癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における欠失の量と比較するステップ
からなる群から選択される少なくとも１つのステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記欠失を定量するステップが、上記欠失の指標となるｍｔＤＮＡの標的部位を増幅させること、および当該増幅された標的部位の量を測定すること、を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
上記定量するステップは、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号２に相当する配列をもつＰＣＲプライマーが、上記標的部位を増幅させる一対の増幅プライマーの一部として使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
上記癌が前立腺癌である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
上記癌が乳癌である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
上記生物学的試料が生体組織または体液である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
上記生物学的試料が、乳房組織、前立腺組織および尿からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記標的部位の増幅が一対の増幅プライマーを用いて行われ、当該一対の増幅プライマーのうちの１つは、上記欠失の反対端のスプライス結合部位と重複する、請求項１０または２０に記載の方法。
【請求項２８】
個体における癌の検出方法であって、
ａ）上記個体から生物学的試料を得るステップ；
ｂ）上記試料からミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を抽出するステップ；
ｃ）上記試料において、上記配列番号１または配列番号２に記載の配列に対応する配列を有するｍｔＤＮＡの量を定量するステップ；および
ｄ）上記試料において、配列番号１または配列番号２に対応するｍｔＤＮＡの量を、少なくとも１つの既知の参照値と比較するステップを含む方法。
【請求項２９】
上記少なくとも１つの既知の参照値が、既知の非癌性である組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における配列番号１または配列番号２に対応する配列の量である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記少なくとも１つの既知の参照値が、既知の癌性組織または体液から得られたｍｔＤＮＡの参照試料における配列番号１または配列番号２に対応する配列の量である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
上記定量するステップは、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
上記欠失を定量するステップが、まず、上記欠失の指標となるｍｔＤＮＡの標的部位を増幅させること、および当該増幅された標的部位の上記量を測定すること、を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記標的部位の増幅に使用される一対のＰＣＲプライマーのうちの一つが、上記配列が再び環化した後で、配列番号１または配列番号２に対応する上記配列である再結合部位と重複する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記癌が前立腺癌である、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
上記癌が乳癌である、２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
上記生物学的試料が生体組織または体液である、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
上記生物学的試料が、乳房組織、前立腺組織、および尿からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
上記参照値がサイクル閾値である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）１つ以上の生物学的試料を収集する材料；および
ｂ）ｍｔＤＮＡの欠失の検出に適したプライマーおよび試薬を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法を実施するための診断キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５０２４８７（Ｐ２０１１−５０２４８７Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２３９０（Ｐ２０１０−５３２３９０）
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１９５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９４１４
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５１０１００５０８）ミトミクス インコーポレイテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＳＩＳ ＧＥＮＯＭＩＣＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ １０００，２９０ Ｍｕｎｒｏ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｔｈｕｎｄｅｒ Ｂａｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ Ｐ７Ａ ７Ｔ１
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１９５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９４１４
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５１０１００５０８）ミトミクス インコーポレイテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＳＩＳ ＧＥＮＯＭＩＣＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ １０００，２９０ Ｍｕｎｒｏ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｔｈｕｎｄｅｒ Ｂａｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ Ｐ７Ａ ７Ｔ１
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]