癌胎児性抗原融合タンパク質及びその使用
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、該ＣＥＡ融合タンパク質は、免疫増強因子の大部分に融合されている、ＣＥＡタンパク質又はそれらの機能的変異体を含有する。本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物において免疫反応を誘導することができ、好ましい実施形態において、それは、野生型ＣＥＡにより誘導される免疫反応よりも強い。ＣＥＡをコードする遺伝子は、一般に、ヒト癌の発生に関連する。本発明は、ＣＥＡ腫瘍関連抗原により発現されるタンパク質産物に対する、免疫を誘発又は増強する組成物及び方法を提供するが、異常なＣＥＡ発現は、癌又はその発生に関連する。本発明は、具体的に、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアデノウイルスベクター及びプラスミドコンストラクトを提供し、癌を予防し治療するためのワクチン及び医薬組成物におけるそれらの使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に癌の治療に関する。とりわけ、本発明は、少なくとも腫瘍関連ポリペプチド癌胎児性抗原の一部を含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、組み換えベクター及び該ポリヌクレオチドを含有する宿主、精製融合タンパク質及び、本明細書で開示する組成物及び分子を使用した、ＣＥＡに対する免疫反応を促進する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、様々な機能を有するタンパク質をコードする多数の遺伝子からなり、その１つは、細胞間接着である。ＩｇＳＦタンパク質は、適正な細胞間結合相互作用の維持に重要である、少なくとも１つのＩｇ関連ドメインを含有する。このような相互作用はＩｇＳＦメンバーの多岐に渡る生物学的機能に必要なので、多くのＩｇＳＦ接着分子の崩壊又は異常な発現は、多くのヒトの疾患と関連がある。
【０００３】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、ＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）として知られている細胞表面糖タンパク質からなるＩｇスーパーファミリーのサブファミリーに属する。ＣＥＡＣＡＭは、同型及び異型両方の細胞間接着分子として働くことが示されている（Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌら、Ｃｅｌｌ ５７：３２７−３３４（１９８９））。細胞接着に加えて、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５としても知られている。）は、細胞外マトリックスからの細胞の脱離の結果として、細胞死を抑制し、ある一定の癌原遺伝子（Ｂｃｌ２及びＣ−Ｍｙｃなど）に関連する細胞形質転換に寄与し得る（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０（８）：２１９７−２２０７（２００２）を参照のこと。）。ヒトＣＥＡをコードする配列がクローニングされ、特性が調べられた（米国特許第５，２７４，０８７号；米国特許第５，５７１，７１０号；及び米国特許第５，８４３，７６１号。Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２２１−３２３０（１９８７）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９２０−９２４（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（９）：２９６５−６９（１９８７）も参照のこと。）。
【０００４】
ＣＥＡの正常発現は、胎児発生中及び成人の結腸粘膜において検出されている。ＣＥＡ過剰発現は最初に、ヒト結腸腫瘍において３０年以上前に検出され（Ｇｏｌｄ及びＦｒｅｅｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２１：４３９−４６２（１９６５））ほぼ全ての結腸直腸腫瘍において見出されている。さらに、ＣＥＡ過剰発現は、膵臓、肝臓、乳房、卵巣、子宮頸部及び肺の腺癌で高い割合で検出可能である。これらの腫瘍タイプにおいて検出率が高く、正常組織での発現は限られているので、ＣＥＡは、自己腫瘍関連抗原及び能動的及び受動的免疫治療の標的と考えられている。最近の臨床データから、様々なワクチンストラテジーが、ＣＥＡに特異的なヒトＢ及びＴ細胞を生み出すことができることが分かっており、このことから、ＣＥＡが、これらの癌タイプの治療に対して、分子及び免疫的介入の標的である、さらなる証拠が与えられる。
【０００５】
ＣＥＡを標的とする治療アプローチには、抗ＣＥＡ抗体の使用（Ｃｈｅｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ８−Ｓ１２（２０００）を参照のこと。）ならびに、ＣＥＡに基づくワクチン（概説として、Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ、前出、を参照のこと。）が含まれる。外来遺伝子を高レベルで発現させることにおいて困難な点があることから、多くのワクチンの開発及び市販が阻まれてきた。ＤＮＡに基づくワクチンもまた、治療を受ける個体において、十分な大きさの免疫反応を生じさせられないために、成功していない。様々なタンパク質を標的するＤＮＡワクチンもまた開発されてきたが、得られる免疫反応は、従来のワクチンと比較して弱い。
【０００６】
ＤＮＡ操作が簡便であることから、抗原を様々な免疫増強因子に融合させる、遺伝子融合ストラテジーを含むワクチンを開発するチャンスが与えられている。標的抗原に対する免疫反応の促進は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２８８８−９４（２０００）；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６２１８−２６（２００１）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１０３５−４２（２０００））、ＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｙｏｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４５８１−９２（２０００））、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）（Ｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．６２：５０４１−４８（２００２））及び破傷風毒素からのユニバーサルＴｈエピトープ（Ｒｅｎａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１５８８−９５（２００３）；Ｋｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：１２８１−８６（１９９８）；Ｌｕｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：３６５−７６（２００３）；Ｐａｄｕａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９（１１）：１４１３−１７（２００３）；Ｓａｖｅｌｙｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．１９：７６０−６４（２００１）；Ｗａｈｒｅｎら、ＷＯ２００４／０９２２１６）に融合させた抗原をコードするベクターにより、動物モデルで行われてきた。標的抗原に対する免疫反応の促進は特に、腫瘍抗原の免疫原性の制限及び効果的な抗腫瘍効果を与えるために寛容性を乗り越える必要性を考えると、癌ワクチンが適切である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、上述のＣＥＡタンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列が同定されたにもかかわらず、哺乳動物に送達させた際に、野生型全長 ＣＥＡ ｃＤＮＡと比較して、ＣＥＡ特異的免疫反応を促進することができるワクチンを開発することが非常に望まれている。また、ＣＥＡ特異的免疫反応を安全かつ効果的に増強する核酸分子又はタンパク質を利用した、ＣＥＡ関連癌を治療もしくは予防する方法を開発することも望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細菌毒素などの免疫増強因子の大部分に融合させられた腫瘍関連ポリペプチド癌胎児性抗原の一部を少なくとも含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態において、コードされるＣＥＡ融合タンパク質のＣＥＡ部分は、そのＣ末端のアンカードメインに欠失がある。好ましい実施形態において、その免疫増強因子は、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＡもしくはＢサブユニット又はそれらの大部分である。他の好ましい実施形態において、本免疫増強因子は、破傷風毒素断片Ｃ（ＤＯＭ）の最小化ドメイン又はそれらの大部分である。本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含有し、宿主細胞が組み換えベクターを含有する、これらに限定されないがアデノウイルス及びプラスミドベクターを含む、組み換えベクターを提供する。本明細書において、本発明ポリヌクレオチによりコードされる精製融合タンパク質もまた提供する。
【０００９】
本発明はさらに、本明細書に記載のＣＥＡ融合体又はＣＥＡ融合タンパク質を含有する、ワクチン又は医薬組成物を投与することによって、ＣＥＡタンパク質に対する免疫反応を与えることにより哺乳動物における癌の発現を阻害又は予防するための方法を提供する。本明細書中の方法の好ましい実施形態において、野生型ＣＥＡワクチンにより与えられる免疫反応と比較して、免疫反応を促進する。
【００１０】
本明細書を通して、及び添付の請求の範囲において使用される場合、単数体「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明確に示されない限り、複数の意味を含む。
【００１１】
本明細書を通して、及び添付の請求の範囲において使用される場合、次の定義及び略語が適用となる：
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、ＤＮＡ鎖における認識部位を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成し、転写活性を促進する。その複合体は、「エンハンサー」と呼ばれる配列を活性化することにより、又は「サイレンサー」と呼ばれる配列を抑制することにより、修飾され得る。
【００１２】
「カセット」という用語は、例えば、ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードする、ヌクレオチド又は遺伝子配列など、ベクターから発現されるべき、ヌクレオチド又は遺伝子配列を指す。一般に、カセットは、ベクターに挿入され得る遺伝子配列を含有し、いくつかの実施形態において、それは、ヌクレオチド又は遺伝子配列の発現に対する調節配列を与える。他の実施形態において、本ヌクレオチド又は遺伝子配列は、その発現のための調節配列を与える。さらなる実施形態において、本ベクターは、いくつかの調節配列を与え、本ヌクレオチド又は遺伝子配列は、その他の調節配列を与える。例えば、本ベクターは、ヌクレオチド又は遺伝子配列を転写するためのプロモーターを与えることができ、本ヌクレオチド又は遺伝子配列は、転写終結配列を与えることができる。本ベクターにより与えら得る調節配列には、これらに限定されないが、エンハンサー、転写終結配列、スプライシング受容及び供与配列、イントロン、リボソーム結合配列及びポリ（Ａ）付加配列が含まれる。
【００１３】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片が宿主生物又は宿主組織に導入され得るいくつかの手段を指す。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む。）、バクテリオファージ及びコスミドを含む、様々なタイプのベクターがある。
【００１４】
「第一世代」という用語は、アデノウイルスベクターに関して使用される場合、複製欠損型のアデノウイルスベクターを説明するものである。第一世代アデノウイルスベクターは、通常、Ｅ１遺伝子領域を欠くか、又はＥ１遺伝子領域が不活性化されており、好ましくは、Ｅ３遺伝子領域を欠くか、又は不活性化されている。
【００１５】
「ＤＯＭ」という略語は、通常、破傷風トキソイドの断片ＣのＮ末端ドメインを指す。
【００１６】
「ＬＴ」という略語は、通常、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンを指す。「ＬＴ」は、サブユニットＡ及びＢ又はサブユニットＡの大部分もしくはサブユニットＢの大部分を含有する、完全エンテロトキシンを指し得る。「ＬＴＡ」という略語は、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＡサブユニット又はその大部分を指し、Ｃ末端又はＮ末端で末端切断されているが生物学的活性を維持するサブユニットならびに、内部アミノ酸挿入、欠失又は置換を含有するが、生物学的活性を維持するサブユニットを含む。「ＬＴＢ」という略語は、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット又はその大部分を指し、Ｃ末端又はＮ末端で末端切断されているが生物学的活性を維持するサブユニットならびに、内部アミノ酸挿入、欠失又は置換を含有するが、生物学的活性を維持するサブユニットを含む。
【００１７】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、全長コドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列、ならびに最小ｐＵＣ骨格を含む、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す（実施例２参照。）。「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ」という表示は、コンストラクトが、コドン最適化されたヒトＣＥＡ遺伝子の代わりに野生型ヒトＣＥＡ遺伝子を含有することを除き、基本的に上記のようなコンストラクトを指す。
【００１８】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、そのＣ末端でＥ．コリの易熱性エンテロトキシンのＢサブユニットに融合させられた、そのＧＰＩアンカーコード配列を欠くヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列、ならびに最小ｐＵＣ骨格を含有する、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す。
【００１９】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ」という表示は、そのコンストラクトが、野生型ヒトＣＥＡ遺伝子の対応部分の代わりに、そのＧＰＩアンカーコード配列を欠くコドン最適化されたヒトＣＥＡ遺伝子を含有することを除き、基本的にすぐ上で述べたようなコンストラクトを指す。
【００２０】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔ」という表示は、ヒト細胞において高レベルで発現させるためにＣＥＡ配列及びＬＴＢ配列の両方がコドン最適化されていることを除き、基本的にすぐ上で述べたようなプラスミドコンストラクトを指す。
【００２１】
「ｐＶ１Ｊ／ｒｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔ」という表示は、ヒトコドン最適化ＣＥＡ遺伝子が、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されたアカゲザルＣＥＡ遺伝子で置換されていることを除き、基本的に上記のようなコンストラクトを指す。
【００２２】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、そのＣ末端でＥ．コリの易熱性エンテロトキシンのＡサブユニットに融合させられた、ＧＰＩアンカーコード配列を欠くヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列ならびに最小ｐＵＣ骨格を含有する、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す。様々なＣＥＡ−ＬＴ融合体を含有するプラスミドベクターの構築は、実施例２で述べる。
【００２３】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＤＯＭ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、そのＣ末端で破傷風トキソイド（ＤＯＭ）の断片ＣのＮ末端ドメインに融合させられた、そのＧＰＩアンカーコード配列を欠くヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列ならびに最小ｐＵＣ骨格を含有する、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す（実施例２）。
【００２４】
「ｐＶ１Ｊ／ｒｈＣＥＡｏｐｔ−ＤＯＭｏｐｔ」という表示は、ヒトコドン−最適化ＣＥＡ遺伝子が、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されたアカゲザルＣＥＡ遺伝子で置換されていることを除き、基本的に上記のようなコンストラクトを指す。
【００２５】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、そのＣ末端で免疫グロブリンＧ１の定常鎖の重鎖断片に融合させられている、ＧＰＩアンカーコード配列を欠くヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列ならびに最小ｐＵＣ骨格を含有する、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す。（実施例２）。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＦｃＩｇＧｏｐｔは、ＣＥＡ及びＦｃＩｇＧをコードするヌクレオチド配列が、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されていることを除き、基本的に説明したようなコンストラクトを指す。
【００２６】
「Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ」及び「Ａｄ５／ｈＣＥＡ」という表示は、Ｅ１及びＥ３領域で欠損があるＡｄ５アデノウイルスゲノムを含有する、本明細書中で開示される２つのコンストラクトを指す。「Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ」コンストラクトにおいて、Ｅ１領域は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下で、イントロンＡなしで、Ｅ１と平行な向きに、コドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子、次いでウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化シグナルにより置き換えられている。「Ａｄ５／ｈＣＥＡ」コンストラクトは、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域が野生型ヒトＣＥＡ配列で置き換えられていることを除き、基本的に上記のようなものである。「Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ」という表示は、コドン最適化されたヒトＣＥＡ配列がＧＰＩアンカーコード配列を欠いており、そのＣ末端でＥ．コリの易熱性エンテロトキシンのＢサブユニットに融合させられていることを除き、基本的に上記のようなＡｄ５コンストラクトを指す。様々なＣＥＡ−ＬＴ融合体を含有するアデノウイルスベクターの構築は実施例３で述べる。
【００２７】
「免疫増強因子」とは、本発明のＣＥＡ融合タンパク質の、全長野生型ＣＥＡと比較して、関連ＣＥＡタンパク質に対する免疫反応を刺激又は促進することができる部分を指す。本発明の免疫増強因子は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される。「免疫増強因子」という用語は、本明細書中で、「アジュバント」という用語と交換可能に使用される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、一方のポリペプチドが１つのタンパク質配列又はドメイン由来であり、他方のポリペプチドが第二のタンパク質配列又はドメイン由来である、共有結合する少なくとも２個のポリペプチドを有するタンパク質を指す。本発明の融合タンパク質は、ＣＥＡポリペプチドもしくは断片又はそれらの変異体及び第二のポリペプチドを含有し、その第二のポリペプチドは、ある場合においては、細菌性毒素である、免疫増強因子の大部分を含有する。ＣＥＡポリペプチド、断片又はそれらの変異体は、ヒトＣＥＡ又は別の種由来のＣＥＡホモローグであり得る。この融合タンパク質を含有するポリペプチドは、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に連結する。ＣＥＡポリペプチド及び毒素サブユニットは、いかなる順番でも融合され得る。本発明のある実施形態において、図１Ａで例示されるように、ＣＥＡポリペプチドのＣ末端を毒素サブユニットのＮ末端に融合させる。しかし、免疫増強因子がＣＥＡポリペプチドのＮ末端に融合する融合タンパク質もまたもくろまれている。「ＣＥＡ融合タンパク質」という用語は、上述のような融合体を指す一般用語であるものとし、これには、免疫増強因子を含有するポリペプチドに融合させられた、ＣＥＡポリペプチドもしくは断片又はそれらの変異体が含まれる。
【００２９】
「ＣＥＡ−ＬＴ融合体」という用語は、ＣＥＡ遺伝子の少なくとも一部が、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＬＴＡ又はＬＴＢサブユニットのいずれかの大部分と融合させられている、核酸配列を指す。「ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質」という用語は、述べられているようなＣＥＡ−ＬＴ融合体によりコードされているポリペプチドを指す。「ＣＥＡ−ＬＴ融合体」及び「ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質」という用語はまた、１又は複数のアミノ酸が挿入、欠失又は他のアミノ酸で置換されているものなど、それらの断片、それらのホモローグ及びそれらの機能的同等物（まとめて「変異体」と呼ぶ。）を指すと理解されたい。本発明のＣＥＡ−ＬＴ融合体は、ヒトなどの哺乳動物に投与する際、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞障害性Ｔ細胞による免疫反応を刺激することができるか、又は少なくとも「野生型」ＣＥＡ配列と同等に抗体産生を刺激することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡ−ＬＴ融合体は、野生型ＣＥＡと比較して、免疫反応を促進することができる。
【００３０】
「ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体」という用語は、該用語がタンパク質配列を指すと文脈により明確に示されない限り、少なくともＣＥＡ遺伝子の一部が、破傷風毒素断片Ｃの最小化ドメインの大部分に融合させられている、核酸配列を指す。「ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質」という用語は、述べられているようなＣＥＡ−ＤＯＭ融合体によりコードされるポリペプチドを指す。
【００３１】
「ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体」及び「ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質」という用語はまた、１又は複数のアミノ酸が挿入、欠失又は他のアミノ酸で置換されているものなど、それらの断片、それらのホモローグ及びそれらの機能的同等物（まとめて「変異体」と呼ぶ。）を指すと理解されたい。本発明のＣＥＡ−ＤＯＭ融合体は、ヒトなどの哺乳動物に投与する際、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞障害性Ｔ細胞による免疫反応を刺激することができるか、又は少なくとも「野生型」ＣＥＡ配列と同等に抗体産生を刺激することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体は、野生型ＣＥＡと比較して、免疫反応を促進することができる。
【００３２】
「ＡＤ」という略語は、ＣＥＡ遺伝子又はタンパク質のアンカードメインを指す。野生型ヒトＣＥＡのアンカードメインは、配列番号２０のおよそアミノ酸６７９からおよそアミノ酸７０２に位置する。
【００３３】
「処置」という用語は、治療的処置及び予防もしくは防御的手段の両方を指す。処置を必要とするものには、既に疾患に罹患しているもの、ならびにその疾患に罹患しやすいもの又はその疾患を防ぐべきものが含まれる。
【００３４】
「疾患」とは、本明細書中に記載の核酸分子及び該核酸分子によりコードされる融合タンパク質を含む、本発明の分子を用いた治療により利益を受けるあらゆる状態である。問題の疾患に哺乳動物が罹患しやすくなる病的状態を含む、慢性及び急性疾患もしくは疾病は、「疾患」という用語により包含される。本発明の分子は、乳癌、結腸直腸癌及び肺癌を含むがこれらに限定されない、異常な細胞増殖を特徴とする疾患又は状態の処置としての使用を意図するものである。
【００３５】
「有効量」という用語は、免疫反応が起こるように、本ポリペプチドの適切なレベルを得るために十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。当業者は、このレベルが変化し得ることを理解するであろう。
【００３６】
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基の、別の化学的に類似のアミノ酸残基による置換を指す。そのような保存的置換の例は、ある疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）の、別のものへの置換；ある極性残基の、同じ電荷の別の極性残基への置換（例えば、リジンに対してアルギニン；アスパラギン酸に対してグルタミン酸）である。
【００３７】
「ｈＣＥＡ」及び「ｈＣＥＡｏｐｔ」は、ヒト癌胎児性抗原及びヒトコドン最適化癌胎児性抗原をそれぞれ指す。
【００３８】
「ｒｈＣＥＡ」及び「ｒｈＣＥＡｏｐｔ」は、アカゲザル癌胎児性抗原及びアカゲザルコドン最適化癌胎児性抗原をそれぞれ指す。
【００３９】
「実質的に同等」とは、配列について、ある核酸又はアミノ酸配列が、参照配列と、少なくとも、７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の同一性を有することを意味する。本発明において、参照配列は、その文章の文脈により決定されるとおり、野生型ヒトＣＥＡヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の関連部分、又は細菌毒素もしくはそのサブユニットの野生型ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列、例えばＥ．コリの易熱性エンテロトキシンの、ＬＴＢもしくはＬＴＡサブユニット、であり得る。この参照配列はまた、例えば、野生型アカゲザルＣＥＡ配列でもあり得る。したがって、野生型ヒトＣＥＡタンパク質又はその断片に対して「実質的に同等」であるＣＥＡタンパク質配列は、野生型ヒトＣＥＡの関連断片と、その断片に沿って、少なくとも７５％の同一性、好ましくは、８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、さらにより好ましくは９５％の同一性を有する。あるＣＥＡ、ＬＴＢもしくはＬＴＡタンパク質又はヌクレオチド配列が、参照配列に対して「実質的に同等」であるか否かは、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能。）などの、配列解析ソフトウェアを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。このＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により改訂されたような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を利用している。
【００４０】
遺伝子、変異体、断片又はそのサブユニットの「大部分」とは、参照配列の、少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％及びさらにより好ましくは９５％の部分を意味する。
【００４１】
「遺伝子」とは、そのヌクレオチド配列がポリペプチド分子をコードする核酸分子を指す。遺伝子は、ヌクレオチドの連続配列であり得るか、又はそれらは、イントロン、プロモーター領域、スプライシング部位及び反復配列などの中断セグメントを含み得る。遺伝子はＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る。好ましい遺伝子は、本発明のペプチドをコードするものである。
【００４２】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、それらの断片もしくは一部及びプライマーであるものとする。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はゲノムＤＮＡのいずれか、例えばＣＥＡ融合タンパク質をコードする遺伝子、であり得る。
【００４３】
「野生型ＣＥＡ」又は「野生型部分」又は「ｗｔタンパク質」とは、天然に生じるアミノ酸配列もしくはそれらの変異体を含むタンパク質を指す。野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、図７Ｅ（配列番号２０）に示す。野生型アカゲザルＣＥＡのアミノ酸配列は、既に述べられている（ＷＯ２００４／０７２２８７、図７Ａ−７Ｂ参照。）。
【００４４】
「野生型ＣＥＡ遺伝子」とは、ヒト由来のタンパク質又は別の生物（これらに限定されないが、ラット、マウス及びアカゲザルなどの哺乳動物を含む。）から得られたタンパク質を含む、天然に生じるＣＥＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する遺伝子を指す。ヒトＣＥＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、本技術分野（前出）で入手可能である。Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２２１−３２３０（１９８７）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９２０−９２４（１９８７）；及びＴｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（９）：２９６５−６９（１９８７）も参照のこと。野生型アカゲザル遺伝子のヌクレオチド配列は、図７Ｃから７Ｄで示す。
【００４５】
「哺乳動物」という用語は、ヒトを含むあらゆる哺乳動物を指す。
【００４６】
「Ａｇ」という略語は、抗原を指す。
【００４７】
「Ａｂ」及び「ｍＡｂ」という略語は、抗体及びモノクローナル抗体をそれぞれ指す。
【００４８】
「ＯＲＦ」という略語は、遺伝子のオープンリーディングフレームを指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、腺癌の発生に共通して関連している。本発明は、ＣＥＡ腫瘍関連抗原により発現されるタンパク質産物に対する免疫を誘導又は促進するための、組成物及び方法に関する（異常なＣＥＡ発現は、癌腫又はその発生に関与する。）。腫瘍発生時に異常なＣＥＡ発現が存在し得、腫瘍進行の後期には検出できないか、又はその逆であるので、異常なＣＥＡ発現と癌腫との関連には、ＣＥＡタンパク質がその発生の全時間点で腫瘍組織において発現されていることは必要ではない。
【００５０】
このために、本発明は、癌の治療及び／又は予防に対する、ワクチン及び医薬組成物における使用のための、ＣＥＡ配列もしくはそれらの変異体を含有する、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞及びコードされるタンパク質を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、関連ＣＥＡに対する免疫反応を効果的に促進することができる、細菌性エンテロトキシン又はその大部分などの、免疫増強因子の少なくともサブユニットをコードするヌクレオチド配列に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００５１】
本発明のＣＥＡヌクレオチド配列は、ヒト由来のものであり得るか、又は別の種由来のＣＥＡホモローグであり得る。野生型ヒトＣＥＡヌクレオチド配列が報告されている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号；米国特許第５，５７１，７１０号；及び米国特許第５，８４３，７６１号を参照のこと。）。アカゲザルＣＥＡ配列が最近報告された（ＷＯ２００４／０７２２８７）。ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分は、全長であるか、又は哺乳動物においてＣＥＡ特異的免疫反応を誘導するのに十分なあらゆる変異体であり得る。本発明のＣＥＡ変異体には、これらに限定されないが、Ｃ末端又はＮ末端切断型配列、保存的置換がある配列及び内部欠失又は挿入がある配列が含まれる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分は、ヒトＣＥＡ又はその機能的同等物である。他の好ましい実施形態において、このＣＥＡ部分は、アカゲザルＣＥＡ又はその機能的同等物である。
【００５３】
したがって、本発明は、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する合成ポリヌクレオチドに関し、該融合タンパク質は、ＣＥＡタンパク質に対する免疫反応を効果的に促進することができる、免疫増強因子又はそのサブユニットに融合させられている、ＣＥＡタンパク質もしくは生物学的活性断片もしくはＣＥＡタンパク質の突然変異形態を含有する。ＣＥＡタンパク質の該突然変異形態には、これらに限定されないが、保存的アミノ酸置換、アミノ末端切断、カルボキシ末端切断、欠失又は付加が含まれる。あらゆるそのような生物学的活性断片及び／又は突然変異体は、少なくとも実質的に、配列番号２０に記載のＣＥＡタンパク質の免疫学的特性を模倣する、タンパク質又はタンパク質断片のいずれかをコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療又は予防的癌ワクチンの開発において有用であるように、機能的ＣＥＡ融合タンパク質を発現する、ｍＲＮＡ分子をコードする。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態において、コードされるＣＥＡ融合タンパク質のＣＥＡ部分は、ヒトＣＥＡ（配列番号２０）もしくはその機能的同等物、例えば、そのＣ末端アンカードメイン（ＡＤ）が欠失したヒトＣＥＡ（配列番号２３）であり、それは、ヒト全長ＣＥＡの、およそアミノ酸６７９からおよそアミノ酸７０２に位置する。理論にとらわれないが、アンカードメインの欠失により、ＣＥＡ融合タンパク質の分泌が増加し、それにより、ＣＥＡ−ＬＴＢ免疫反応のクロスプライミングが促進される。他の好ましい実施形態において、ＣＥＡ部分は、アカゲザルＣＥＡ（配列番号１８及び１９）又はその機能的同等物である。
【００５５】
本発明のＣＥＡ融合タンパク質の免疫増強因子部分は、関連ＣＥＡタンパク質に対する免疫反応を刺激又は促進することができ、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖の重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分は、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）を含有し、ともに送達される抗原の免疫原性を強力に増強することが示されている。さらなる好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分は、ＬＴのサブユニット又はそれらの大部分を含む。またさらに好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分は、ＦｃＩｇＧの大部分である。
【００５６】
破傷風毒素の単一エピトープ（Ｑ８３０−Ｌ８４４）に融合させられた末端切断型ヒトＣＥＡを含むＣＥＡ融合体が記載されている（Ｌｕｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：３６５−３７６（２００３））。この単一エピトープ融合体とは異なり、本発明のＣＥＡ融合体は、上述のように、免疫増強因子の大部分又はそのサブユニットを含み、それは、ＣＥＡタンパク質又はその変異体の免疫原性を増強することができる。本明細書中に記載されている、組成物及び方法に対して使用される免疫増強因子の大部分には、全長毒素サブユニットの５０％未満のものは含まれない。融合ＣＥＡ配列に対してより大きい免疫反応を確実にするために、全長アジュバントサブユニット又はその大部分を利用する、本明細書中で使用されるストラテジーを用いた。理論にとらわれないが、アジュバントとして選択される細菌性毒素が１個のヘルパーエピトープより大きいものを含む場合、その融合タンパク質の毒素配列を１個のエピトープに制限することにより、おそらく、標的タンパク質の免疫原性に対する効果が低下することになると考えられている。さらに、免疫反応のアジュバント媒介増強が、特異的細胞受容体とのアジュバントの相互作用に依存し、普遍的なエピトープに基づくものでない場合、受容体相互作用は、アジュバント効果を与えるために免疫増強因子の大部分を必要とする、特異的な構造配置に依存し得ると考えられる。このような場合、１個のエピトープを含有する短いアジュバント配列は、免疫反応の増強を媒介するには不十分である。
【００５７】
これらに限定する必要はないが、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端切断及びカルボキシ末端切断を含む、本明細書中に記載の免疫増強因子の変異体又は突然変異体をコードするヌクレオチド配列もまた、本発明における使用がもくろまれる。ある場合において、コードされるタンパク質の毒性を低下又は排除するために、アジュバント又はそのサブユニットをコードするヌクレオチド配列に対して特異的な点突然変異を付加することは、有利であり得る。本発明のこの態様の典型的実施形態において、ＬＴサブユニットは、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ配列に融合させられ、ここでＬＴサブユニットは、そのシグナル配列が末端切断されている。理論にとらわれないが、毒素シグナル配列、例えばＬＴＢシグナル配列を欠失させることにより、ＣＥＡ融合体の翻訳後プロセシングがＣＥＡシグナル配列により駆動されることが確実になる。
【００５８】
免疫増強因子、サブユニット又はその大部分を、ＣＥＡ配列の、アミノ末端又はカルボキシ末端に融合させ得る。さらに、免疫増強因子配列及びＣＥＡ配列を、Ｎ末端からＮ末端、Ｃ末端からＣ末端、Ｃ末端からＮ末端又はＮ末端からＮ末端で融合させることができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡポリペプチドのＣ末端を免疫増強因子のＮ末端に融合させる。
【００５９】
本発明は、新規ＣＥＡ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；例えば配列番号８、１０、１３、１５、４５、４６、５１及び５３に記載のような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する、合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の核酸分子は、実質的にその他の核酸を含まない。
【００６０】
本発明はまた、本願を通して開示される核酸分子を含有する、組み換えベクター及び組み換え宿主細胞（原核及び真核の両方）に関する。本発明の、合成ＤＮＡ分子、関連ベクター及び宿主は、癌ワクチンの開発に有用である。
【００６１】
代表的な本発明の核酸分子は、本発明の代表的なＣＥＡ−ＬＴＡ、ＣＥＡ−ＬＴＢ、ＣＥＡ−ＤＯＭ、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ及びＣＥＡ−ＣＴＢ融合タンパク質をコードする、図２から６、２６から２７、３０から３２で示すような、配列番号７、９、１１、１２、１４、２１、２５、４９、５０及び５２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
本発明はまた、代表的なＣＥＡ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする、配列番号７、９、１１、１２、１４、２１、２５、４９、５０及び５２の、生物学的活性断片又は突然変異体も含む。あらゆるそのような生物学的活性断片及び／又は突然変異体は、少なくとも、これに限定されないが配列番号２０に記載のｈＣＥＡタンパク質を含む、ｈＣＥＡタンパク質の医薬特性を実質的に模倣する、タンパク質又はタンパク質断片のいずれかをコードする。あらゆるそのようなポリヌクレオチドには、これらに限定する必要はないが、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端切断及びカルボキシ末端切断が含まれる。本発明の突然変異は、癌ワクチン開発に有用であるように、真核細胞において機能的ＣＥＡ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００６３】
発現されるタンパク質の究極的な物理的特性を実質的に変化させないＤＮＡ配列における突然変異も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、バリンのロイシンへの置換、アルギニンのリジンへの置換又はアスパラギンのグルタミンへの置換は、そのポリペプチドの機能において変化を生じ得ない。
【００６４】
上述のように、本発明はさらに、本願を通して開示する核酸分子を含有する組み換えベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡから構成され得る。殆どのクローニング目的に対して、ＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターには、プラスミド、改変ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体及び、ＣＥＡ融合タンパク質をコードすることができる、エピソーム性又は統合ＤＮＡのその他の形態が含まれる。
【００６５】
特定の遺伝子導入又はその他の使用に対して適切なベクターを決定することは、当業者の範囲内である。
【００６６】
本願を通して開示する核酸によりコードされる、精製ＣＥＡ融合タンパク質もまた本発明により提供される。本発明のこの態様の代表的な実施形態において、ＣＥＡ融合タンパク質は、配列番号８、１０、１３、１５、４５、４６、５１及び５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６７】
厳格な条件下で配列番号７、９、１１、１２、１４、２１、２５、４９、５０又は５２にハイブリダイズするＤＮＡ配列が、本発明に含まれる。一例として、また限定するものではないが、高ストリンジェンシーの条件を用いる手段は次のとおりである。約６５℃にて、約２時間から一晩、６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で、ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを行う。６５℃にて、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び３２Ｐ標識プローブ ５から２０ｘ１０６ｃｐｍを含有するプレハイブリダイゼーション混合液中で、約１２時間から４８時間、フィルターをハイブリダイズさせる。３７℃にて約１時間、２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中でフィルターを洗浄する。この次に、５０℃にて４５分間、オートラジオグラフィーの前に、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する。高ストリンジェンシーの条件を用いるその他の手段には、約４２℃にて５ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０％ ホルムアミド中で約１２時間から４８時間ハイブリダイゼーション段階を行うか、又は約６５℃にて約３０分間から６０分間、０．２ｘＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ中で洗浄段階を行うかのいずれかが含まれる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを行うための、前述の手段において述べた試薬は、本技術分野で周知である。これらの試薬の組成の詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第二版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第三版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）で見出すことができる。前述のものに加えて、使用し得る高ストリンジェンシーのその他の条件もまた本技術分野で周知である。
【００６８】
組み換え宿主細胞におけるＣＥＡ融合タンパク質の高レベル発現のために、ＣＥＡ融合タンパク質コード核酸分子を含有する発現ベクターを使用し得る。発現ベクターには、これらに限定されないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミド又はウイルスが含まれ得る。様々な細菌性発現ベクターもまた、所望する場合、組み換えＣＥＡ融合体配列を細菌細胞において発現させるために使用し得る。さらに、組み換えＣＥＡ融合体配列を真菌細胞において発現させるために様々な真菌細胞発現ベクターを使用し得る。さらに、組み換えタンパク質を昆虫細胞において発現させるために、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用し得る。
【００６９】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含有するベクターを用いて形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞にも関する。組み換え宿主細胞は、原核又は真核であり得、これらに限定されないが、Ｅ．コリなどの細菌、酵母などの真菌細胞、これらに限定されないがウシ、ブタ、サル及びげっ歯類由来の細胞株を含む哺乳動物細胞；及びこれらに限定されないがハエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びカイコ由来の細胞株を含む昆虫細胞が含まれる。ＣＥＡ融合タンパク質又は生物学的同等形態を生成させるのに適切な条件下でこのような組み換え宿主細胞を培養することができる。本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞はヒトである。本明細書中で定義される場合、「宿主細胞」という用語は、トランスジェニックヒト、ヒト胎児又はヒト胚の身体における宿主細胞を含むものではない。
【００７０】
上述のように、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ融合タンパク質を発現させるために、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用し得る。したがって、本発明の別の態様は、（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を含むベクターを、適切なヒト宿主細胞に導入することと（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、免疫増強因子の大部分又はそのサブユニットに融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し、該免疫増強因子又はそのサブユニットは、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択され；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）前記ヒトＣＥＡ融合タンパク質の発現が可能となる条件下で該宿主細胞を培養することと、を含む、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ融合タンパク質を発現させるためのプロセスである。
【００７１】
本発明のこの態様での使用のための好ましい免疫増強因子は、ＬＴＢ、ＬＴＡ、ＤＯＭ及びＦｃＩｇＧからなる群から選択される。
【００７２】
本発明のこの態様のさらに好ましい実施形態において、前記融合体のＣＥＡ部分のヌクレオチド配列及び／又は前記融合体の免疫増強因子のヌクレオチド配列は、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。
【００７３】
本発明はまた、（ａ）ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を含むベクターを、適切なヒト宿主細胞に導入することと（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＬＴサブユニットの大部分に融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）前記ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質の発現が可能となる条件下で該宿主細胞を培養することと、を含む、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質を発現させるためのプロセスも提供する。
【００７４】
上述のＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質を発現するためのプロセスの好ましい実施形態において、ＬＴサブユニットは、ＬＴＢの大部分であり、ＬＴＢ配列は、そのシグナル配列が欠失している。他の実施形態において、ＬＴサブユニットはＬＴＡ又はその大部分である。
【００７５】
本発明はまた、（ａ）ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を含むベクターを、適切なヒト宿主細胞に導入することと（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、破傷風毒素の断片Ｃ（ＤＯＭ）のＮ末端ドメインの大部分に融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）該ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質の発現が可能となる条件下で該宿主細胞を培養することと、を含む、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質を発現させるためのプロセスも提供する。
【００７６】
上述のＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質を発現させるためのプロセスの好ましい実施形態において、ＤＯＭ部分は、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。他の好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分は、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。またさらに好ましい実施形態において、ＣＥＡ及びＤＯＭ部分の両方が、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。
【００７７】
宿主細胞におけるＣＥＡ融合体の発現の後、活性型でＣＥＡ融合タンパク質を提供するために、ＣＥＡ融合タンパク質を回収し得る。いくつかのタンパク質精製手段を利用することができ、それらは、使用に適切である。塩析による分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの、様々な組合せ、又は個別での使用により、細胞溶解液及び抽出物から組み換えタンパク質を精製し得る。さらに、ＣＥＡタンパク質又はＣＥＡタンパク質のポリペプチド断片に特異的な、モノクローナル又はポリクローナル抗体でできた免疫アフィニティーカラムを用いることにより、他の細胞性タンパク質から、組み換えＣＥＡ融合タンパク質を分離することができる。
【００７８】
ＣＥＡ融合体を含有する核酸分子及びコードされる本発明の融合タンパク質は、ワクチン開発における使用のために、ＣＥＡをコードする全長ｃＤＮＡと比較して、ＣＥＡ特異的免疫反応を促進するように設計した。本発明のＣＥＡ融合体配列の免疫原特性をさらに促進するために、本明細書中に記載のある実施形態において、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、下記のように、宿主細胞におけるさらなる高レベル発現のための最適化コドンを含有する。これらの実施形態において、少なくともＣＥＡ融合体のコドンの一部は、企図される宿主細胞により好まれるコドンを使用するように設計され、好ましい実施形態において、企図される宿主細胞はヒト細胞である。組み換えアデノウイルス又はプラスミドに基づくＤＮＡワクチンの開発のために、最適化ＣＥＡ融合体を使用し得、それにより、中和抗体及び細胞性免疫を介して、ＣＥＡ関連癌に対する効果的な免疫学的予防が行われる。免疫原性組成物として合成分子を使用し得る。本発明は、インビボで、霊長類及びヒトなどの哺乳動物を含む脊椎動物に直接導入された際に、動物内でコードタンパク質の発現を誘導する、コドン最適化されたＣＥＡ融合体ポリヌクレオチドを与える。
【００７９】
上述のように、本発明のある実施形態において、本合成分子は、ヌクレオチド配列を含み、そのヌクレオチドのいくつかは、ヒト細胞により好まれるコドンを使用するように改変されており、したがって、ヒト宿主細胞において融合タンパク質が高レベルに発現されるようになる。例えば、中和抗体及び細胞性免疫を介して、ＣＥＡ関連癌腫に対する効果的な免疫予防を与えるための癌ワクチンにおいて使用され得る、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合タンパク質など、ＣＥＡ融合タンパク質のソースとして、本合成分子を使用し得る。本明細書中で開示される核酸分子も、ＤＮＡに基づく癌ワクチンに対する基礎として働き得る。
【００８０】
４個の可能なヌクレオチドベースの「トリプレット」コドンは、６０種類を超える様々な形態で存在し得る。これらのコドンは２０個のみの異なるアミノ酸（ならびに転写開始及び終結）に対するメッセージを与えるので、アミノ酸の中には複数のコドンによりコードされ得るアミノ酸があるが、これは、コドン重複として知られる現象である。完全には理解されていない理由で、代替的コドンは、様々なタイプの細胞の内在性ＤＮＡにおいて均一に存在していない。実際に、ある一定のタイプの細胞において、ある一定のコドンに対する可変の自然のヒエラルキー又は「優先性」が存在すると思われる。一例として、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ及びＴＴＧを含む６種類のＤＮＡコドンのいずれかにより特定される。微生物に対するゲノムコドン頻度の網羅的分析により、Ｅ．コリの内在性ＤＮＡはＣＴＧのロイシン特定コドンを最もよく含有し、一方、酵母及びスライム（ｓｌｉｍｅ）のＤＮＡは、ＴＴＡロイシン特定コドンを最もよく含有する。このヒエラルキーの観点において、Ｅ．コリ宿主によるロイシンリッチなポリペプチドの高レベル発現を得る可能性は、ある程度コドン使用の頻度に依存すると、一般に考えられる。例えば、ＴＴＡコドンが豊富な遺伝子は、Ｅ．コリにおいてあまり発現されず、一方で、ＣＴＧ豊富な遺伝子はおそらくこの宿主において高いレベルで発現されると思われる。同様に、酵母宿主細胞において、ロイシンが豊富なポリペプチドの発現に対する好ましいコドンはＴＴＡである。
【００８１】
組み換えＤＮＡ技術におけるコドン優先現象により起こるであろう結果は明白であり、この現象により、成功裡に形質転換された宿主生物において外来遺伝子の高レベル発現を達成できなかった以前の多くの失敗が説明され得る−つまり、挿入された遺伝子においてあまり「好ましく」ないコドンが繰り返し存在し得、発現のための宿主細胞機構が効率的に機能し得ない。この現象から、企図される宿主細胞の好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子により、組み換えＤＮＡ技術を実行するための、外来遺伝物質の最適な形態が与えられることが示唆される。このように、本発明のある態様は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化された、ＣＥＡ融合遺伝子である。本発明の好ましい実施形態において、同じタンパク質配列をコードする代替的コドンの使用によりヒト細胞における外来ＣＥＡ融合タンパク質の発現での制約が取り除かれ得ることが見出された。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＣＥＡ融合タンパク質をコードする核酸分子は、Ｌａｔｈｅ、”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ“Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．１８３：１−１２（１９８５）（参照により本明細書中に組込まれる。）により述べられているように、同一の翻訳配列を有するが代替的コドンが使用されるポリヌクレオチド配列に変換される。この方法は、通常、高発現されたヒト遺伝子を伴わない野生型配列においてコドンを同定することと、ヒト細胞での高発現のために、それらを最適のコドンで置換することと、からなる。次に、新規遺伝子配列において、これらのコドン置換により生成した好ましくない配列について調べる（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライシング認識部位の不用意な生成、無用の制限酵素部位など。）。存在するコドンを、同じアミノ酸に対する異なるコドンを用いて置換することにより、好ましくない配列を削除する。次に、発現の向上性について合成遺伝子セグメントを試験する。
【００８３】
ＣＥＡ融合タンパク質をコードする合成遺伝子配列を作製するために、上述の方法を使用し、結果として遺伝子が高レベル発現のために最適化されたコドンを含むようになった。上記の手段により、癌ワクチンにおける使用のためのコドン最適化された遺伝子を設計するための発明者らの方法の要約が与えられるが、一方で、その手段を少し改変することにより、又はその配列を少し改変することにより、同様のワクチン効率又は遺伝子の発現上昇を為し得ることを当業者は理解するであろう。
【００８４】
当業者はまた、ヒト細胞におけるＣＥＡ融合体の高レベル発現のために与えられるさらなる核酸分子が構築され得、そのＤＮＡ分子のコドンの一部のみがコドン最適化されることを認識するであろう。例えば、本発明のあるいくつかの実施形態において、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分を構成するコドンは、ヒト細胞での高レベル発現のために最適化され、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分を構成するコドンは、実質的に野生型アジュバントコードヌクレオチド配列と同様である。本発明の他の実施形態において、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分を構成するコドンは、ヒト細胞での高レベル発現のために最適化され、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分を構成するコドンは、実質的に野生型ＣＥＡ遺伝子と同様である。本発明のさらに他の実施形態において、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ及びアジュバント部分の両方がヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化される。ＣＥＡ融合体のＣＥＡ及び／又はアジュバント部分内でコドンのサブセットのみが最適化されているＣＥＡ融合体もまた、本発明によりもくろまれる。
【００８５】
本発明の核酸を、ヒト細胞において本タンパク質を効率的に発現するように設計された配列を含む発現カセットにまとめ得る。このカセットは、好ましくは、プロモーター及びターミネーター配列など、操作可能に連結された関連転写及び翻訳調節配列とともに、ＣＥＡ融合タンパク質コード遺伝子を含有する。好ましい実施形態において、本プロモーターは、イントロンＡ配列（ＣＭＶ）のないサイトメガロウイルスプロモーターであるが、強力な免疫グロブリン又はその他の真核遺伝子プロモーターなどの、あらゆる多くのその他の公知のプロモーターを使用し得ることを当業者は認識するであろう。好ましい転写ターミネーターは、ウシ成長ホルモンターミネーターであるが、その他の公知の転写ターミネーターも使用し得る。ＣＭＶ−ＢＧＨターミネーターの組合せが特に好ましい。
【００８６】
本発明によると、ＣＥＡ融合体発現カセットがベクターに挿入される。本ベクターは、好ましくは、アデノウイルス又はプラスミドベクターであるが、プロモーターに連結する線状ＤＮＡ又はアデノ関連ウイルスもしくは改変ワクシニアウイルス、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターなどの他のベクターもまた使用し得る。
【００８７】
選択されたベクターがアデノウイルスである場合、そのベクターは、いわゆる第一世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターの特徴は、非機能的Ｅ１遺伝子領域を有し、好ましくはアデノウイルスＥ１遺伝子領域が欠失していることである。あるいくつかの実施形態において、本発現カセットが、アデノウイルス遺伝子が正常に位置する位置に挿入される。さらに、これらのベクターは、場合によっては、非機能的Ｅ３領域を有するか、又はＥ３領域が欠失している。使用されるアデノウイルスゲノムにおいてＥ１及びＥ３領域両方が欠失している（ΔＥ１ΔＥ３）ことが好ましい。このアデノウイルスは、ウイルス性Ｅ１遺伝子を発現する、２９３細胞もしくはＰＥＲＣ．６細胞、又は外来タンパク質を発現するように一時的に、もしくは安定的に形質転換された、２９３細胞もしくはＰＥＲＣ．６細胞由来の細胞株などの、公知の細胞株において複製させることができる。例えば、テトラサイクリン制御可能プロモーター系など、遺伝子発現が調節されるコンストラクトを使用する場合、細胞株は制御系に関与する成分を発現し得る。そのような細胞株の一例は、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３であり；その他のものが本技術分野で公知である。
【００８８】
アデノウイルスベクターの操作における便宜のために、本アデノウイルスは、シャトルプラスミド形態であり得る。本発明はまた、プラスミド部分及び、Ｅ１が欠失しており場合によってはＥ３が欠失しており、ＣＥＡ融合タンパク質コードヌクレオチド配列を含む発現カセットが挿入されているアデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルス部分を含む、シャトルプラスミドベクターに関する。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターを容易に除去できるように、本プラスミドのアデノウイルス部分に隣接する制限部位がある。このシャトルプラスミドは、原核細胞又は真核細胞において複製し得る。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態において、本発現カセットをｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０アデノウイルスプラスミド（参照により本明細書に組込まれる、Ｅｍｉｎｉら、ＷＯ０２／２２０８０を参照のこと。）に挿入する。このプラスミドは、Ｅ１及びＥ３領域が削除されているＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む。最適化ウイルスパッケージングにおいて重要であると分かったエレメントを組み込むために、５’シス−作用パッケージング領域をさらにＥ１遺伝子に拡張することにより、既存のアデノベクターを凌ぐように、ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０プラスミドの設計を改善し、その結果、ウイルス増幅が向上した。有利に、この増強アデノウイルスベクターは、高継代増殖後に遺伝的安定性を維持することができる。
【００９０】
ＤＮＡコンストラクトを調製し精製するための分子生物学の標準的技術により、本発明の、アデノウイルス、シャトルプラスミド及びＤＮＡ免疫原を調製することができる。
【００９１】
本発明によると、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＬＴＡもしくはＬＴＢサブユニットの大部分を含有する、本明細書中に記載のＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質コード分子（例えば配列番号１２）が、対応する野生型ＣＥＡ配列と同等の効率で発現されることが分かった（実施例４参照。）。本明細書中で、プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢがｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡよりも高い抗体反応を誘導することも示されており、このことから、ＣＥＡ特異的免疫反応において、ＬＴサブユニットにより与えられるアジュバント効果が確認される（実施例１１参照のこと。）。したがって、本明細書中に記載のデータから、ＬＴＡ又はＬＴＢ ｃＤＮＡへのＣＥＡコード配列の融合の結果、ＣＥＡ特異的免疫反応が向上することが分かる。ＬＴＢが、ＣＤ＋８Ｔ細胞の優勢な誘導を伴う免疫反応での効果をより大きく増強する一方、ＬＴＡは、顕著なＣＤ４＋反応を誘導すると思われる。
【００９２】
本発明によると、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原特性が向上しているので、全長野生型ＣＥＡ ｃＤＮＡと比較して、ＣＥＡ自己抗原に対する寛容性をより効率的に打破することができることも示された。免疫原特性におけるＬＴＢの増強効果はまた、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の完全にコドン最適化されたｃＤＮＡを担うプラスミドの注入においても観察された。最後に、ＣＥＡ−ＬＴ融合体を担うアデノウイルスベクターを用いた、本明細書中に記載の結果から、ＣＥＡ−ＬＴ融合体の免疫原性を向上させるのは、プラスミドＤＮＡ免疫付与に限定されないことが示される（実施例１３を参照のこと。）。
【００９３】
本発明によると、プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＤＯＭ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧが、ＣＥＡよりも、ＣＥＡ特異的な、細胞性及び液性免疫反応を大きく誘導することがさらに示された（実施例１５を参照のこと。）。本発明によると、ＣＥＡ融合体の免疫原特性が向上しているために、全長野生型ＣＥＡ ｃＤＮＡと比較して、本明細書中に記載の、ＤＯＭ及びＦｃＩｇＧ ＣＥＡ融合体を用いて、ＣＥＡ自己抗原に対する寛容性をより効率的に打破できることも示された。これらの融合タンパク質の免疫原特性の向上は、ＤＮＡ又はＡｄベクターを用いた免疫付与において観察され、このことから、ＣＥＡ−ＬＴ融合体の免疫原性向上が、プラスミドＤＮＡ免疫付与に限定されないことが示される（実施例１６を参照のこと。）。
【００９４】
したがって、異常なＣＥＡ発現を伴う腺癌発生の予防及び／又は存在する癌の治療のための免疫原性組成物及びワクチンにおいて、上述のベクターを使用し得る。本発明のベクターによって、成功裡に形質転換された宿主生物において外来ＣＥＡの高レベル発現を得ることに関する問題を解決することにより、及びヒトなどの哺乳動物に投与した際に免疫反応を増強させることができるＣＥＡ融合タンパク質を提供することにより、ワクチン開発及び市販が実現できるようになる。
【００９５】
このために、本発明のある態様は、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む、ＣＥＡ関連癌を予防又は治療する方法である（ここで、ＣＥＡ融合タンパク質は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される、免疫増強因子の大部分と融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有するＣＥＡ融合タンパク質であり、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）。
【００９６】
本明細書中に記載の方法の好ましい実施形態において、免疫増強因子は、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＤＯＭ及びＦｃＩｇＧからなる群から選択される。
【００９７】
上述の方法によると、これらに限定されないが、肺癌、乳癌及び結腸直腸癌を含む、あらゆる哺乳動物における癌の治療又は予防のために、本ワクチンベクターを投与し得る。本発明の好ましい実施形態において、該哺乳動物はヒトである。
【００９８】
さらに、当業者は、述べられた治療及び予防方法における使用のために何らかのタイプのベクターを選択し得る。好ましくは、このベクターは、アデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである。本発明の好ましい実施形態において、このベクターは、アデノウイルスＥ１領域に欠失がありアデノウイルスＥ１領域に挿入がある、アデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルスベクターであるが、ここで、この挿入は、（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と（該ＣＥＡ融合タンパク質は、免疫増強因子又はその大部分と融合させられているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し、該免疫増強因子は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択され、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する発現カセットを含有する。
【００９９】
本発明はさらに、アデノウイルスＥ１領域に欠失がありアデノウイルスＥ１領域に挿入がある、アデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルスワクチンベクターに関し、ここで本挿入は、（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と（該ＣＥＡ融合タンパク質は、免疫増強因子の大部分と融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し、該免疫増強因子は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択され、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する発現カセットを含有する。
【０１００】
本発明の本態様の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ５ベクターである。
【０１０１】
本発明の別の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ６ベクターである。
【０１０２】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２４ベクターである。
【０１０３】
これらに限定されないが、チンパンジーアデノウイルスベクターを含む、ヒト以外の種に天然に感染するアデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルスワクチンベクターもまた、本発明における使用のためにもくろまれる。本発明のこの態様の好ましい実施形態は、ｃｈｉｍｐ Ａｄ３ワクチンベクターである。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、プラスミド部分と発現カセット部分とを含有するワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される、免疫増強因子又はその大部分と融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する。
【０１０５】
本発明のある実施形態において、免疫反応増強を誘導するために、様々な初回刺激／追加免疫の組合せにおいて、本明細書中で開示される、組み換えアデノウイルス及びプラスミドに基づくポリヌクレオチドワクチンを使用する。この場合、「初回刺激及び追加免疫」法においてこの２種類のベクターを投与する。例えば、第一のタイプのベクターを１又は複数回投与し、次に、所定の時間が経過した後（例えば、２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月又はその他の適切な間隔）、第二のタイプのベクターを１又は複数回投与する。好ましくは、それらのベクターは、同じポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組合せをコードする発現カセットを担う。プラスミドＤＮＡもまた使用される実施形態において、本ベクターが、哺乳動物又は昆虫細胞により認識される、１又は複数のプロモーターを含有することが好ましい。好ましい実施形態において、本プラスミドは、これらに限定されないが、ＣＭＶプロモーターなど、強力なプロモーターを含有し得る。合成ＣＥＡ融合遺伝子又は発現されるべきその他の遺伝子をそのようなプロモーターに連結し得る。そのようなプラスミドの例は、述べられているような、哺乳動物発現プラスミド Ｖ１Ｊｎｓ（Ｊ．Ｓｈｉｖｅｒら、ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍ．Ｌｉｕら編、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８−２０８（１９９６）、これを参照により本明細書に組み込む。）である。
【０１０６】
上述のように、免疫反応を誘導するための、単一の治療計画の一部として、アデノウイルスベクターワクチン及びプラスミドワクチンを脊椎動物に投与し得る。このために、本発明は、（ａ）ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）と；ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する第一のベクターを哺乳動物に導入することと；（ｂ）所定の時間を経過させることと；（ｃ）ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）と；ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する第二のベクターを哺乳動物に導入することと、を含む、哺乳動物をＣＥＡ関連癌から防御する方法に関する。
【０１０７】
上述の防御方法のある実施形態において、この第一のベクターはプラスミドであり、第二のベクターはアデノウイルスベクターである。代替的な実施形態において、この第一のベクターはアデノウイルスベクターであり、第二のベクターはプラスミドである。
【０１０８】
上述の方法において、ベクターの各投与を所定の時間あけて、第一のタイプのベクターを複数回投与し得る。このような第一のタイプのベクターの一連の投与に続き、所定の時間が経過した後、第二のタイプのベクターの投与を複数回、行い得る。第一のタイプのベクターでの処置と同様に、第二のタイプのベクターもまた、１回又は、所定の時間間隔の後、複数回与え得る。
【０１０９】
本発明はさらに、（ａ）ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ及びＬＴからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）と；ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する第一のベクターを哺乳動物に導入することと；（ｂ）所定の時間を経過させることと；（ｃ）ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ及びＬＴからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）と；ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する第二のベクターを哺乳動物に導入することと、を含む、ＣＥＡ関連腺癌に罹患している哺乳動物を治療する方法に関する。
【０１１０】
上述の治療方法のある実施形態において、この第一のベクターはプラスミドであり、第二のベクターはアデノウイルスベクターである。代替的な実施形態において、この第一のベクターはアデノウイルスベクターであり、第二のベクターはプラスミドである。
【０１１１】
上述の方法の好ましい実施形態において、本ベクターは、ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有し、このＣＥＡ融合タンパク質は、ＬＴサブユニットの大部分に融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有する。さらなる好ましい実施形態において、本ベクターは、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。上述の方法のさらなる好ましい実施形態において、本ベクターは、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有し、このＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭサブユニットの大部分に融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有する。またさらに好ましい実施形態において、本ベクターは、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【０１１２】
ワクチン受容者に導入されるべき、発現可能なＤＮＡ又は転写されるＲＮＡの量は、ある程度、使用されるプロモーターの強さ及び発現される遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般に、プラスミドワクチンベクター 約１ｎｇから１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇから３００μｇという免疫学的もしくは予防的有効用量を直接、筋肉組織に投与する。組み換えアデノウイルスの有効用量は、約１０６から１０１２粒子、好ましくは、約１０７から１０１１粒子である。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した印象（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）及び、腹腔内、静脈内、筋肉内又は吸入送達などの投与のその他の様式ももくろまれる。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態において、筋肉内注射を介して受容者にワクチンベクターを導入する。
【０１１４】
本発明のワクチンベクターは、裸のものであり得る、つまり、何らかのタンパク質又は受容者の免疫系に影響を与えるその他の薬剤と組み合わせられていない。この場合、本ワクチンベクターが、これらに限定されないが、滅菌生理食塩水又は滅菌緩衝生理食塩水などの、生理学的に許容可能な溶液中にあることが望ましい。あるいは、これらに限定されないがカルシウムイオンなど、ＤＮＡの細胞取り込みを補助する薬剤を投与することは有利であり得る。これらの薬剤は、一般にトランスフェクション促進剤及び医薬適合性の担体と呼ばれる。当業者は、特定の薬剤又は医薬適合性の担体ならびに適切な投与時間及び投与様式を決定することができる。
【０１１５】
本明細書中で言及した公表物は全て、本発明に関連して使用され得る方法及び材料を説明し開示する目的のために、参照により組込まれる。明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１１６】
添付の図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態を説明してきたが、本発明がまさにその実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、様々な変更及び改変が当業者によりなされ得ることを理解されたい。
【０１１７】
次の実施例は、本発明を説明するが、限定するものではない。
【実施例１】
【０１１８】
ＣＥＡ融合タンパク質の構築
ＣＥＡ融合タンパク質の免疫原性を決定するため、選択されたポリペプチドのパネルに融合されている、ヒトＣＥＡタンパク質の１から６７９番目のアミノ酸（本明細書中で以下、ａａ）をコードする一連のベクターを構築した（実施例２参照）。様々な実験系において示された、これらの配列の報告された免疫増強特性を考慮して、これらの配列を選択した。前記ＧＰＩアンカー配列を欠失したＣＥＡタンパク質のｃＤＮＡを外来ポリペプチドと連結することによって、前記ＣＥＡ融合体を操作した（典型的なコンストラクトは図１８Ａに示される）。この腫瘍抗原をＨＳＰ７０配列、ＦｃＩｇＧ配列又はＬＡＭＰ配列に連結し、抗原の取り込み又はエンドソーム区画への再ターゲティングの増強により免疫反応増強が起こるか否かを調べた。同様に、液性反応及びＣＤ４＋Ｔ細胞の反応を促進するために、破傷風毒素の断片Ｃ（ＦｒＣ）又は有力に競合するＭＨＣクラスＩ結合エピトープを欠失する最小ドメイン（ＤＯＭ、図２９参照）（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３９０８−１３（２００２））に対する融合を構築した。ウィルス性糖タンパク質への融合がＣＥＡの免疫原特性に影響を及ぼすか否かを調べるために、ＣＥＡをまた、ＶＳＶ−Ｇコード配列に連結した。
【０１１９】
これらのＣＥＡ融合体のコード配列を、ベクターｐＶ１Ｊｎｓに対して、ヒトＣＭＶ／イントロンＡプロモーター＋ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルの調節下にクローニングした（実施例２）。プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦＲＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶＩＪ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、及びｐＶＩＪ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０は、指示される外来ポリペプチドのコード配列に融合された、ＣＥＡの野生型ｃＤＮＡを担う。ｈＣＥＡ−ＤＯＭ融合体及びｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体の典型的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、図２６、図２７及び図３０で示す。
【０１２０】
ＣＥＡ免疫原性に及ぼすＥ．コリの易熱性エンテロトキシンのＬＴＡサブユニット及びＬＴＢサブユニットの効果を評価するために、ＬＴＡ（ａａ１８から２５９）コード配列又はＬＴＢ（ａａ２１から１２５）コード配列のいずれかへ融合されるＣＥＡタンパク質のアミノ酸１から６７９をコードする一連のさらなる融合コンストラクトを生成させた。この実験のために開発された典型的なＣＥＡ−ＬＴＡ融合体及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の構造の略図は、図１に示す。ＣＥＡ−ＬＴ融合体の代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、図２から図６に示す。
【０１２１】
前記アンカー配列の欠失したＣＥＡタンパク質のｃＤＮＡを、シグナルペプチドコード配列が除去されたＬＴサブユニットに連結することにより、ＣＥＡ−ＬＴ融合体を操作した。ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）／イントロンＡプロモーター＋ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルの調節下で、前記ＣＥＡ−融合体コード配列をベクターｐＶ１Ｊｎｓにクローニングした。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢは、ＬＴＡ及びＬＴＢのコード配列にそれぞれ融合されたＣＥＡの野生型ｃＤＮＡを担う（実施例２参照）。
【０１２２】
ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体を担うコンストラクトは全て、ｎｔ１から２０３７のＣＥＡｃＤＮＡを、ｎｔ６４から３７５を包含するＬＴＢ ｃＤＮＡ断片と融合することにより生成される。ＬＴＢコード配列は、配列特異的プライマーＬＴＢ−Ｓ１ ５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１）及びＬＴＢ−Ａ１ ５’−ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＴＴＴＣＣＡＴＡＣＴＧＡＴＴＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２）を使用するＥ．コリゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた。増幅されたこのＤＮＡを前記ＣＥＡコード配列生成プラスミドの３’末端に導入した。
【実施例２】
【０１２３】
プラスミドコンストラクト
ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ：これら２つのコンストラクトは、ＣＥＡの、コドン使用の最適化された、及び野生型の、ｃＤＮＡをそれぞれ担う。ＣＥＡコード配列は、サイトメガロウィルスのＣＭＶ／イントロンＡ前初期プロモーターとウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとの間に置かれる。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔを生成させるために、プラスミドｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔをＥｃｏＲＩにより３７℃で１時間消化した。得られた２１５６ｂｐのインサートを精製し、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＢのＥｃｏＲＩ部位へとクローニングした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２（９）：７７７−８３（１９９３））。
【０１２４】
ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡを生成させるために、プラスミドｐＣＩ／ｈＣＥＡ（Ｓｏｎｇら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−１ ｖｅｒｓｕｓ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．（ＤＮＡベースのワクチン接種及び非ウィルス性サイトカイン遺伝子輸送の組み合わせによるＴヘルパー−１活性対Ｔヘルパー−２活性の調節及び腫瘍免疫付与の増強）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４８１−４９２（２０００））をＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１０９ｂｐのインサートをプラスミドｐＶ１ＪｎｓＡのＥｃｏＲＩ部位へとクローニングした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、前出）。
【０１２５】
ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ：ＬＴＢのコドン最適化ｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドのアセンブリーにより合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔベクターにおいてクローニングした（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔを生成させるために、以下のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲによりＬＴＢｏｐｔを増幅した。すなわち、ＬＴＢｏｐｔ−５’ＸｂａＩ（５’末端）５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号３）、及びＬＴＢｏｐｔ−３’ＢｇｌＩＩ（３’末端）５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＴＣＴＧＴＧＣＧＣＣ−３’（配列番号４）である。次に、増幅した産物をプラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔのＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ部位へと挿入した。
【０１２６】
ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ：ａａ１８から２５９をコードするｎｔ５４から７７４に対応するＬＴＡコード配列を、配列特異的プライマーＬＴＡ−Ｓ１ ５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＣＣＧ−３’（配列番号５）、及びＬＴＡ−Ａ１ ５’−ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＡＡＴＴＣＡＴＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴ−３’（配列番号６）を使用して、Ｅ．コリのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡに挿入した。
【０１２７】
ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ：ヒト細胞における高レベルの発現のためにコドン最適化されたアカゲザルＣＥＡｃＤＮＡの３’断片（ｎｔ１６４１から２０２６）を、ｐＶ１Ｊ／ｒｈＣＥＡｏｐｔからＰＣＲにより増幅した。増幅したｃＤＮＡは前記ＧＰＩアンカーコード配列を欠失し、ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ制限部位を有していた。この断片をｐＣＲ−平滑末端化−ｒｈＣＥＡｏｐｔのＰｓｔＩ部位へと挿入し、このように、中間体ｐＣＲ−平滑末端化−ｒｈＣＥＡｏｐｔ ＸｂａＩ／ＢａｌＩＩを得た。ｒｈＣＥＡｏｐｔをＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ断片として抽出し、ｐＶ１Ｊ−ｎｓＢにおける同じ部位においてクローニングして、このように、ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡｏｐｔＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩを得た。５’端及び３’端でＸｂａＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位をそれぞれ付加するｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔ−ＬＴＢｏｐｔから、ＬＴＢｏｐｔをＰＣＲにより増幅し、ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡｏｐｔ ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩにおいてクローニングし、このようにｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔを得た。
【０１２８】
ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ：参照ＣＥＡ融合タンパク質をコードするコンストラクトは全て、ａａ１から６７９（配列番号２３、図２８Ｂ）に対応するｎｔ１から２０３７（配列番号２２、図２８Ａ）のＣＥＡ ｃＤＮＡを、以下に対応するｃＤＮＡ断片と融合することにより生成させた。すなわち、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＣＥＡ−ＦｒＣ、配列番号２４）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＣＥＡ−ＤＯＭ、配列番号２１及び４９)、免疫グロブリンＧ１の定常鎖の重鎖断片（ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、配列番号２５）、リソソーム会合膜タンパク質（ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、配列番号２６）、ヒートショックタンパク質７０（ＣＥＡ−ＨＳＰ７０、配列番号２７）又は水泡性口内炎ウィルス糖タンパク質（ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、配列番号２８）である。
【０１２９】
ＦｒＣコード配列及びＤＯＭコード配列を、Ｒｉｃｅら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３９０８−１３（２００２））において記述されるように、ｐＲｅｐ−ＴｅＴ．ＣプラスミドからＰＣＲ増幅により得た。ヒトＰＢＭＣのトータルＲＮＡからＦｃＩｇＧを得た。ｐ−ＦＡＳＴ−ＶＳＶ−Ｇから、及びプラスミドｐＹ３１１１から、それぞれＶＳＶ−Ｇ及びＨＳＰ７０を得た。遺伝子アセンブリーによりＬＡＭＰ１を得た。以下のプライマーを使用して増幅を行った。すなわち、ＦｒＣセンス（５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＣ−３’（配列番号２９））、ＦｒＣアンチセンス（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号３０））、ＤＯＭセンス（５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＣ−３’（配列番号３１））、ＤＯＭアンチセンス（５’−ＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＣＧＴＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号３２））、ＦｃＩｇＧセンス（５’−ＴＣＴＡＧＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡ−３’（配列番号３３））、ＦｃＩｇＧアンチセンス（５’−ＧＣＣＧＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号３４））、ＬＡＭＰセンス（５’−ＴＣＴＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号３５））、ＬＡＭＰアンチセンス（５’−ＧＧＣＧＴＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号３６））、ＶＳＶ−Ｇセンス（５’−ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＣＡＴＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号３７））、ＶＳＶ−Ｇアンチセンス（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＡＴＣＴＣＴＡＴＧ−３’（配列番号３８））、ＨＳＰ７０センス（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＣＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣＧＡＣＣ−３’（配列番号３９））及びＨＳＰ７０アンチセンス（５’−ＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧ−３’（配列番号４０））である。増幅されたＤＮＡを、ＣＥＡコード配列生成プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇの３’末端に導入した。
【０１３０】
ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ：ＤＯＭ及びＦｃＩｇＧのコドン使用最適化されたｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドアセンブリーにより合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔベクターにおいてクローニングした（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔを生成させるために、以下のプライマーを使用して、ＤＯＭｏｐｔをＰＣＲにより増幅した。すなわち、Ｄｏｍｏｐｔセンス（５’−ＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣ−３’（配列番号４１））、及びＤｏｍｏｐｔリバース（５’−ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＡＴＣＴＣＡＧＧＧＧ−３’（配列番号４２））である。次に増幅産物をプラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔのＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ部位へと挿入した。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔを生成させるため、以下のプライマーを使用してＦｃＩｇＧｏｐｔをＰＣＲにより増幅した。すなわちＦｃＩｇＧｏｐｔセンス（５’−ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号４３））及びＦｃＩｇＧｏｐｔリバース（５’−ＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＧ−３’（配列番号４４））であり、増幅産物をプラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔのＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ部位に挿入した。
【実施例３】
【０１３１】
アデノウィルスベクター
Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ：プラスミドｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔをＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１５６ｂｐインサートを精製し、ｐｏｌｙＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドのＥｃｏＲＩ部位へとクローニングした。
【０１３２】
Ａｄ５／ＣＥＡ：プラスミドｐＤｅ１ｔａ１ｓｐ１Ｂ／ｈＣＥＡをＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＶで消化することにより、Ａｄ５ベクターの生成のためのシャトルプラスミドｐＭＲＫ−ｈＣＥＡを得た。次に、プラスミド ｐｏｌｙＭＲＫからの、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩで制限酵素処理し、Ｋｌｅｎｏｗ処理した、１２７２ｂｐの産物を用いて、この９．５２ｋｂ断片に対してライゲーションを行った。ｈＣＥＡ及びＥ１隣接Ａｄ５領域に対する発現カセットを含有する、ｐＭＲＫ−ｈＣＥＡ及びｐＭＲＫ−ｈＣＥＡｏｐｔからのＰａｃＩ／ＳｔｕＩ断片を、ＢＪ５１８３Ｅ．コリ細胞において、ＣｌａＩにより線状にしたプラスミドｐＡｄ５へ組み換えた。得られたプラスミドはそれぞれｐＡｄ５／ｈＣＥＡ及びｐＡｄ５−ｈＣＥＡｏｐｔであった。両プラスミドをＰａｃＩで切断してＡｄＩＴＲを放出させ、ＰｅｒＣ−６細胞においてトランスフェクションを行った。一連の継代培養によりＡｄ５ベクター増幅を行った。ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ及びＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔを標準的なＣｓＣｌ勾配精製により精製し、Ａ１０５緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％ スクロース、０．００５ Ｔｗｅｅｎ２０）に対してよく透析した。
【０１３３】
Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ：ｐｏｌｙＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドをＳｗａＩで消化し、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩで制限酵素処理しＫｌｅｎｏｗ処理したｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢから生じる２３００ｂｐＤＮＡ断片を用いて、線状化したベクターをライゲーションすることにより、プラスミドｐＭＲＫ−ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを構築した。ｐＭＲＫ−ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを線状化し、Ａｄゲノムへと上述のように組み換えた。
【０１３４】
Ａｄ５／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びＡｄ５／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ：ｐｏｌｙＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドをＳｗａＩで切断することにより、及び線状化したベクターに対して、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔから生じた２．９ｋｂＤＮＡ断片を用いてライゲーションするか、又はＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、Ｋｌｅｎｏｗ処理したｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ１ｏｐｔから生じた２７００ｂｐ ＤＮＡ断片を用いて、線状化したベクターに対してライゲーションすることにより、プラスミドｐＭＲＫ−ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びｐＭＲＫ−ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔを構築した。ｐＭＲＫ−ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ及びｐＭＲＫ−ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔを線状化し、上述のようにＡｄゲノムへと組み換えた。
【実施例４】
【０１３５】
様々なＣＥＡ−ＬＴ融合体コンストラクトの比較発現効率
ウィルス性疾患に対する遺伝子ワクチン接種のためのコドン最適化ｃＤＮＡの使用により、標的タンパク質の発現が増加することに少なくとも部分的に依存する、より大きな免疫反応が誘発されることが示された。各アミノ酸残基に対してヒトにおいて選好的な（ヒト化した）コドンを組み込むように設計されたＣＥＡ ｃＤＮＡの免疫原特性をも、ＬＴＢコード配列が向上させるか否かを検証するため、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢも構築した。最後に、完全にコドン最適化されたＣＥＡ−ＬＴＢ融合体も、ＬＴＢの合成コドン最適化ｃＤＮＡを使用して、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢｏｐｔを生成させるために構築した。
【０１３６】
ＣＥＡ免疫原性に対するＬＴＢ効果がプラスミドＤＮＡ免疫付与に制限されないかどうかを決定するために、ＣＭＶ／イントロンＡプロモーター及びＢＧＨポリアデニル化シグナルに隣接するＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ融合体をコードするアデノウィルス５型ベクターも構築した。プラスミドベクター及びＡｄベクターの両者により発現されるＣＥＡ融合タンパク質の分子量は、ＣＥＡｃＤＮＡの全長型をコードする対応するベクター由来のものと差異はなかった（データ非表示。）。
【０１３７】
ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードするベクターの発現効率及び全長ＣＥＡのｃＤＮＡの発現効率を比較するために、ＨｅＬａ細胞に対して、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢを用いてトランスフェクションを行った。これらのコンストラクトのＣＥＡ発現を、ＣＥＡのｗｔ ｃＤＮＡ、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡを担う、対応するプラスミドのＣＥＡ発現と比較した。同様に、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ発現効率を、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔの発現効率と比較した。トランスフェクションから２日後に、細胞抽出物中のＣＥＡタンパク質の量を測定することによって、これらのコンストラクトの発現効率を調べた。
【０１３８】
プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢのトランスフェクションは、プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ（９１μｇ/ｌ）と比較した場合に、培養上清中で検出されるＣＥＡタンパク質産生量は約２倍高かった（それぞれ１８３μｇ／ｌ及び１３９μｇ／ｌ、図８Ａ）。同様に、コンストラクトｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢの発現効率も同等であった（それぞれ１１３μｇ／ｌ及び１３６μｇ／ｌ、図８Ｂ）。最後に、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢの発現効率も、異なるｍｏｉでＨｅＬａ細胞に感染させることにより比較した。これら２つのベクターのＣＥＡ発現効率は、ｍｏｉ １０００において同等であったが（それぞれ１７９０μｇ／ｌ及び１４００μｇ／ｌ、図９）、一方で、ｍｏｉ １００では、ベクターＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢが産生する量は、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔよりも、培養上清中で検出可能なＣＥＡタンパク質量が約１／４と低かった（それぞれ３９０μｇ／ｌ及び１５００μｇ／ｌ）。
【０１３９】
したがって、これらの結果から、前記ＣＥＡ−ＬＴＡ融合タンパク質及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡが、全長ＣＥＡタンパク質をコードする対応するｃＤＮＡの効率と同程度の効率で発現されることが示される。さらに、これらのｃＤＮＡの同程度のＣＥＡ発現は、それらの送達のために利用される遺伝子送達媒体のタイプにより影響されない。
【実施例５】
【０１４０】
ＣＥＡ発現の検出
プラスミドベクター及びＡｄベクターによるＣＥＡ発現をウェスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡにより調べた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、プラスミドをＨｅＬａ細胞へトランスフェクションした。無血清培地において３７℃で３０分間、ＨｅＬａ細胞のアデノウィルス感染を行い、次に新鮮な培地を添加した。４８時間のインキュベーション後、全細胞溶解液を回収した。細胞溶解液中に存在するＣＥＡタンパク質を、ウサギポリクローナル抗血清を使用するウェスタンブロット分析により検出した。このタンパク質は１８０から２００ｋＤａのバンドとして検出された。Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｌｉｓａ ＣＥＡ Ｋｉｔ（ＤＢＣ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ）を使用して、発現されるＣＥＡの量を細胞溶解液中で検出した。
【０１４１】
トランスフェクションした細胞における融合タンパク質の発現を、ＣＥＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＦｃＩｇＧ、破傷風毒素又はＨＳＰ７０に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析により調べた。ＨｅＬａ細胞を前記示されるプラスミドを用いてトランスフェクションするか、又は選択されるＡｄベクターを感染させた。４８時間のインキュベーション後、全細胞溶解液及び細胞上清を回収した。
【０１４２】
細胞溶解液又は上清におけるＣＥＡ発現も、Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｌｉｓａ ＣＥＡ Ｋｉｔ（ＤＢＣ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ）を使用して調べた。トランスフェクションされた細胞の溶解液中で融合ポリペプチドに特異的な抗体によりＣＥＡタンパク質が検出されたが、その一方、標的抗原の発現は擬似トランスフェクションされた対照試料において観察されなかった（図１８Ｂ）。この融合タンパク質の分子量は、ＣＥＡの分子量とは有意差がなかった。様々なＣＥＡポリペプチド間において明らかに分子量の差がないのは、おそらく、腫瘍抗原の高度のグリコシル化によるものである。
【０１４３】
前記ＣＥＡ融合体をコードするベクターの発現効率をｐＶ１Ｊ／ＣＥＡと比較するために、様々なプラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション２日後に、これらのコンストラクトのＣＥＡ発現をＥＬＩＳＡにより調べた。プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０は、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡと同程度の効率でＣＥＡを発現した（図１９Ａ）。この融合タンパク質のほとんどは、細胞上清において分泌及び検出されたが、ＣＥＡ−ＬＡＭＰはトランスフェクション細胞から放出されず、これは、おそらく、リソソーム区画へのその再ルーティングによるものであった（図１９Ｂ）。したがって、これらの結果から、ＣＥＡ−ＦｒＣ、ＣＥＡ−ＤＯＭ、ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ＣＥＡ−ＨＳＰ７０、及びＣＥＡ−ＬＡＭＰの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡが、全長ＣＥＡタンパク質をコードするｃＤＮＡの発現効率と等価の効率で発現されることが示される。
【実施例６】
【０１４４】
ペプチド
凍結乾燥したｈＣＥＡペプチドをＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓから購入し、ＤＭＳＯ中で４０ｍｇ／ｍｌになるように再懸濁した。１１残基まで重複している１５ａａ長のペプチドのプールを、記述されているように組み合わせた（Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：８６６３−７２（２００４））。最終濃度は以下のとおりであった。すなわち、プールＡ＝１．２ｍｇ／ｍｌ、プールＢ＝０．８９ｍｇ／ｍｌ、プールＣ＝０．８９ｍｇ／ｍｌ、プールＤ＝０．８ｍｇ／ｍｌであった。ペプチドを−８０℃で保存した。ＤＯＭに対する免疫反応を、破傷風トキソイドペプチドｐ３０（Ｆ９４７ＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ９６７（配列番号５４））を使用して測定した（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１５５８−６５（２００１））。
【実施例７】
【０１４５】
マウス免疫付与及び腫瘍負荷試験
動物実験は全て、ＩＲＢＭ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物取り扱い及び使用委員会）により承認された。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌｅｃｃｏ、Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＨＬＡ−Ａ２．１マウス（ＨＨＤ）は、Ｆ．Ｌｅｍｍｏｎｉｅｒ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の厚意により提供された。Ｃ５７ＢＬ／ＤＲ４マウスをＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から購入した。ＣＥＡ．ｔｇマウス（Ｈ−２ｂ）は、Ｊ．Ｐｒｉｍｕｓ（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）より提供され、標準的な条件（Ｃｌａｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：１４６９−７７（１９８８））で維持した。プラスミドＤＮＡ ５０μｇをマウス大腿四頭筋に５０μｌ体積で既に記述されているようにして電気注入した（Ｒｉｚｚｕｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（１１）：６４１７−２２（１９９９））。マウス大腿四頭筋において５０μｌ体積でＡｄ注入を遂行した。液性及び細胞性免疫反応を指示された時間に分析した。
【０１４６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを大腿四頭筋における２回のＤＮＡ注入に供した後、既に記述されているような電気刺激を行った（Ｒｉｚｚｕｔｏら、前出）。３週間間隔で注射を行った。ＣＥＡトランスジェニックマウスを、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／注入）の１週ごとに５回の注入、Ａｄベクター（１ｘ１０９個ウィルス粒子／注入）の２回の注入又は１週ごとに５回の注入とそれに続くＡｄによる追加免疫のいずれかに供した。最後の注入から２週間後、液性及び細胞性免疫反応を分析した。マウスにたいして、また、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射により負荷試験を行った（Ｃｌａｒｋｅら、前出）。１週間間隔でマウスの腫瘍成長を調べた。
【実施例８】
【０１４７】
抗体検出及びタイター
抗体タイター決定のための血清を後眼窩採血により得た。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４）で希釈した、高度に精製されたＣＥＡタンパク質（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）１００ｎｇ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩、既に記述されているようにインキュベーションした（Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅら、前出）。次に、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳを使用して３７℃で１時間プレートをブロッキングした。マウス血清を５％ＢＳＡ含有のＰＢＳで希釈した（抗体陽転率を評価するために、１／５０希釈、タイターを評価するために、１：１０〜１：３１、２１５０希釈）。免疫前血清をバックグラウンドとして使用した。希釈した血清を４℃で一晩インキュベーションした。１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄した。二次抗体（ヤギ抗マウス、ＩｇＧペルオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ）を５％ ＢＳＡ含有のＰＢＳで１／２０００に希釈し、室温にて２時間から３時間、振盪器上でインキュベーションした。洗浄後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてプレートの発色を行った。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液 ２５μｌ／ウェルを用いて反応を停止させ、４５０ｎｍ／６２０ｎｍでプレートの読み取りを行った。同一希釈での自己免疫前血清の吸光よりも、少なくとも３倍を超える吸光を生じる血清の反復限界希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）として抗ＣＥＡ血清タイターを算出した。
【実施例９】
【０１４８】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
既に記述されているように、マウス脾臓細胞及びＣＥＡ特異的ペプチドを使用してアッセイを行った（Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅら、前出）。滅菌済みＰＢＳ中で２．５μｇ／ｍｌに希釈した、精製ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＩｇＧ１、クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１００μｌ／ウェルを使用して、９６穴 ＭＡＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）をコーティングした。ＰＢＳで洗浄後、Ｒ１０培地 ２００μｌ／ウェルを用いて３７℃にて２時間、プレートのブロッキングを行った。
【０１４９】
滅菌状態で、安楽死したマウスから脾臓を摘出し、金属格子上に擦り付けて脾臓を破壊して脾臓細胞を得た。０．１ｘＰＢＳ １ｍｌを前記細胞ペレットに添加し、約１５秒間ボルテックスすることにより浸透圧溶解させ、赤血球細胞を除去した。次に、２ｘＰＢＳ １ｍｌを添加し、１ｘＰＢＳでその体積を４ｍｌにした。１２００ｒｐｍ、室温で１０分間、細胞を遠心分離することにより、ペレットにして、このペレットをＲ１０培地 １ｍｌで再懸濁した。Ｔｕｒｋｓ染色を用いて生細胞を計数した。
【０１５０】
脾臓細胞をウェルあたり５ｘ１０５個の細胞及び２．５ｘ１０５個の細胞で、デュプリケートで播種し、３７℃で２０時間、各ペプチドの懸濁液 １μｇ／ｍｌとともにインキュベーションした。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を各マウスについてのポジティブ内部対照として５μｇ／ｍｌで使用した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄後、アッセイ緩衝液中で１：２５００に希釈したビオチン抱合型ラット抗マウスＩＦＮγ（ＲａｔＩｇＧ１、クローンＸＭＧ１．２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ） ５０μｌ／ウェルとともに、４℃で一晩、プレートをインキュベーションした。よく洗浄した後、スポットの発色がはっきりと見えるまで、５０μｌ／ウェルのＮＢＴ／Ｂ−ＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加することによりプレートを発色させた。蒸留水でプレートを完全に洗浄することにより、反応を停止させた。プレートを風乾させ、次にスポットを自動ＥＬＩＳＰＯＴ読み取り装置を使用して計数した。
【実施例１０】
【０１５１】
細胞内サイトカイン染色
１０％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １ｍｌ中の１００万から２００万個のマウス脾臓細胞又はＰＢＭＣを、ペプチドのプール（各ペプチド ５から６μｇ／ｍｌの最終濃度）及びブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５５０２８／２３００ｋｋ）とともに、３７℃及び５％ＣＯ２にて１２時間から１６時間、既に記述されているようにインキュベーションした（Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅら、前出）。次に、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ ＦＢＳ、０．０１％ ＮａＮ３含有ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ Ｆｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５３１４２）とともに４℃で１５分間インキュベーションした。次に細胞を洗浄し、表面抗体すなわちＣＤ４−ＰＥ抱合型抗マウス抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３０４９）、ＰｅｒｃＰ ＣＤ８抱合型抗マウス抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３０３６）及びＡＰＣ抱合型抗マウスＣＤ３ｅ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３０６６）を用いて、暗所にて室温で３０分間染色した。洗浄後、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５０２８／２３００ｋｋ）を用いて、暗所にて４℃で２０分間、浸透を行った。Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５０２８／２３００ｋｋ）で洗浄した後、ＩＦＮγ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに細胞をインキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳ−ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析した。
【実施例１１】
【０１５２】
ＣＥＡ−ＬＴ融合体の免疫原性
ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードするプラスミドにより誘導される免疫反応を検討するために、１群９匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ 各５０μｇの２回のｉ．ｍ．注射により免疫付与した。さらに、ＣＥＡ−ＬＴＡ融合タンパク質及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合タンパク質の共発現が、ＣＥＡタンパク質の免疫原性に対して相加効果を有し得るか否かを検討するために、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ 各２５μｇを同時注射することにより、１群のマウスに免疫付与した。３週間の間隔で免疫付与を実施した。この特定の手段と関連する形質導入及び免疫原性の増強を考慮して、前記プラスミドＤＮＡをマウス骨格筋に通常どおり電気注入した（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１５９８−１１６０７（２０００）；Ｗｉｄｅｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５−４６４０（２０００））。
【０１５３】
最後の注射の２週間後に、異なるプラスミドにより誘発される細胞性免疫をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。刺激された脾臓細胞からの抗原特異的ＩＦＮγ分泌を、１１ａａまで重複し全ＣＥＡ糖タンパク質を包含する１５マーのペプチドの４つのプールを使用して測定した。プールＡはａａ１から１４７を、プールＢはａａ１３７から２３７を、プールＣはａａ３１７から５０７を、プールＤはａａ４９７から７０３をカバーする。ネガティブ対照として、ＣＥＡペプチドを可溶化するのに利用されるのと同濃度のＤＭＳＯによる脾臓細胞の刺激に対するサイトカイン産生も測定した。
【０１５４】
前記ペプチドプールＡにより検出されるＳＦＣ値が全コンストラクトについてバックグラウンドをわずかに上回っていたため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＤＮＡワクチン接種により誘発される免疫反応は、タンパク質のＣ末領域に主として偏向していた（図１０）。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢワクチン接種法は、ペプチドプールＢ、Ｃ及びＤで検出されるＳＦＣの幾何学的平均値がより高いことによって示されるように（ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ：それぞれ４８２、１４３６及び２０５４ ＳＦＣ／１０６個の脾臓細胞；ｐＶ１Ｊ/ｈＣＥＡ：それぞれ４５、３５０及び２６４ ＳＦＣ／１０６個の脾臓細胞）、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡにより誘発されるものよりも優れていた。同様に、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡも、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡと比較した際、前記ＣＥＡ特異的免疫反応に対する増強効果を有していた。しかし、免疫反応の増強は、ペプチドプールＣ及びＤ（それぞれ９２５及び５２８ ＳＦＣ／１０６個の脾臓細胞）でのみ観察されたのに対し、ペプチドプールＢで測定される免疫反応は低かった（１５ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）。さらに、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢの同時注射は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢで処理した群おいて測定される免疫反応と比較すると、ＣＥＡに対する免疫反応への有意な相乗効果を有さなかったが、むしろ、その結果、ペプチドプールＢ及びＤ（それぞれ２１０及び５２８ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）で検出されるＳＦＣ値が低下した。
【０１５５】
異なるＣＥＡコンストラクトによるワクチン接種に際して誘発されるＴ細胞特異性を定義するために、ペプチドプールＤを使用して、注射したマウス由来のプールした脾臓細胞に対して、ＩＦＮγ細胞内染色を行った。ＣＤ８＋特異的反応は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで検出されたもの（それぞれ０．１４％及び０．８％、図１０Ｂ）よりも、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ（４．５％）を使用して注射されたマウスにおいて優れていることが検出された。対照的に、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＴＡは、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで観察されるもの（それぞれ０．５５％及び０．５８％）よりも大きい、強いＣＤ４＋特異的反応（１．２１％）を誘発した。
【０１５６】
抗原特異的抗体を測定することにより、ＣＥＡに対する液性免疫反応の誘導を検討した（図１１）。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢの両者は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡよりも大きな抗体反応を誘発し、このことから、ＣＥＡ特異的免疫反応に対してＬＴサブユニットにより発揮されるアジュバント効果が確かめられた。したがって、これらのデータから、ＣＥＡコード配列のＬＴＡｃＤＮＡ又はＬＴＢｃＤＮＡへの融合の結果、ＣＥＡ特異的免疫反応が増強されることが示される。しかし、ＬＴＢがＣＤ８＋Ｔ細胞の一般的な誘導による免疫反応に対してより大きな増強効果を有すると思われるのに対し、ＬＴＡは有力なＣＤ４＋反応を誘発する。
【実施例１２】
【０１５７】
異なるマウス系統におけるＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原性
ＣＥＡ特異的免疫反応に及ぼすＬＴサブユニットの増強効果が単一のマウス遺伝的背景に制限されないかどうかを調べるために、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７／ＤＲ４マウス及びＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）マウスにおいてＤＮＡベースの免疫付与を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスはその免疫能力を考慮して選択したが、これは、様々な種類の免疫付与法に非常に反応性のあるマウス系統である。ＨＨＤトランスジェニックマウスは、ヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子を発現する。同様に、Ｃ５７／ＤＲ４トランスジェニックマウスはヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を有する。したがって、これら２種類のトランスジェニックマウス系統は、ヒトＭＨＣクラスＩ及びＩＩハプロタイプとの関連で、ＣＥＡ−ＬＴ融合体の免疫反応性に関する情報を提供し得る。
【０１５８】
最初に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価した。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢによる免疫付与における抗原特異的免疫反応の増強を、ペプチドプールＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄにより検出した（ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ：それぞれ１６６、１３５３、７９６、８９９ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞；ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ：それぞれ５７、３１２、３２７、３１８ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞、図１２）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスで観察されるように、ＣＥＡタンパク質のＮ末領域は、本腫瘍抗原の他のセクションと比較して最小の免疫原性であると思われた。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ免疫付与はまた、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡと比較して、抗原特異的免疫反応を増強させた。この免疫反応の増強は、ペプチドプールＢ、Ｃ及びＤ（それぞれ９３６、７２７及び６５０ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）で検出された。さらに、２種類のプラスミド ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢの同時注射により、有意な相加作用が生じたが、これは、ペプチドプールＣ及びＤ（それぞれ１７８３及び２１４１ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）を使用して主として検出された。
【０１５９】
Ｃ５７／ＤＲ４マウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢによる免疫付与により著しく増強され、これは、ペプチドプールＤでのみ検出された（図１３）。注射したマウスからプールしたＰＢＭＣに対して行ったＩＦＮγ細胞内染色から、ＣＥＡに対するＣＤ８＋反応が、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢにより免疫付与したマウスにおいて最も高く（１５．３２％）、一方、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで処理した群において非常に弱い（０．５％）ことが示された。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＴＡ免疫付与による抗原特異的免疫反応増強は中程度にとどまり（０．４３％）、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードするコンストラクトと同時注射した場合、ＣＥＡ免疫原性をさらに増強することはなかった（１３．４４％）。興味深いことに、有意なＣＤ４＋Ｔ細胞反応は、この免疫付与マウスにおいて検出されなかった（データ非表示。）。
【０１６０】
プールしたＰＢＭＣに対するＩＦＮγ細胞内染色を行うことにより、様々なＣＥＡコードプラスミドにより誘発される免疫反応をＨＨＤマウスにおいて評価した。免疫反応はペプチドプールＢ及びＤでのみ検出され、図１４に示されるように、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢによる免疫付与の結果、標的抗原に対するＣＤ８＋反応が１０倍を超えて増強された。それに対して、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡを単独で使用しても、又はｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢと同時注射しても、免疫反応の増強は検出されなかった。ＣＤ４＋Ｔ細胞反応はこの免疫付与マウスにおいて検出されなかった（データ非表示。）。
【０１６１】
まとめると、これらのデータから、ＣＥＡに対するＬＴＢコード配列の融合の結果、抗原特異的免疫反応が顕著に増強されることが確認される。興味深いことに、この反応は主としてＣＤ８＋特異的であり、様々な系統のマウスにおいて観察でき、したがって、ＬＴサブユニットにより発揮される増強効果は遺伝子型により制限されないことが示される。
【実施例１３】
【０１６２】
トランスジェニックマウスにおけるヒトＣＥＡに対する寛容性
ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原特性の増強がヒトＣＥＡに対する寛容性をより効果的に打破するか否かを調べるために、ｈＣＥＡ又はＣＥＡ−ＬＴＢのいずれかの、全コドンが最適化されたｃＤＮＡを担うベクターを用いてｈＣＥＡトランスジェニックマウスに免疫付与した。これらのトランスジェニックマウスは全ヒトＣＥＡ遺伝子及び隣接配列を有し、腸において、主として盲腸及び結腸において、ｈＣＥＡタンパク質を発現する。したがって、このマウス系統は、この腫瘍自己抗原に対して向けられた免疫療法計画の安全性及び効率性を研究するための有用なモデルである（Ｃｌａｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：１４６９−１４７７（１９９８））。
【０１６３】
ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢｏｐｔによる免疫付与の結果、注射を行ったマウスのＰＢＭＣに対するＩＦＮγ細胞内染色により測定されるＣＥＡ特異的免疫反応が有意に増強された（図１５Ａ）。Ｔ細胞反応の増強がペプチドプールＤで検出され、これは、顕著にＣＤ８＋であった。さらに、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ処理群と比較して、Ａｂタイターの幾何学的平均値が４７倍増強することにより示されるように、ＣＥＡ特異的液性反応もまた、ＣＥＡ−ＬＴＢ処理マウスにおいて増強された（図１５Ｂ）。
【０１６４】
ＣＥＡ特異的免疫反応に対するＬＴＢにより発揮される増強効果がまた、プラスミドＤＮＡ以外のベクターで免疫付与した際に観察され得るか否かを調べるために、１群１２匹のＣＥＡｔｇマウスの群に、Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ及びＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔを、１ｘ１０７、１ｘ１０８及び１ｘ１０９ｖｐの投与量で免疫付与した。２週間あけてマウスに２回の注射を行い、最後の注射から２週間後に、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ細胞内染色により免疫反応を測定した。ペプチドプールＤを使用して免疫反応を評価した。ＣＥＡに対する有意な免疫反応が１ｘ１０８ｖｐ投与量で検出できた一方で、標的抗原に対する寛容性を打破するために、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ １ｘ１０９ｖｐが必要であったため、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢはＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔよりも免疫原性が高かった（図１６）。ＣＤ４＋反応は、この免疫付与マウスのいずれにおいても検出できなかった（データ非表示）。
【０１６５】
これらのデータから、この自己抗原に対する寛容性が、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原特性の増強により、より効率的に打破され得ることが確認される。さらに、ＣＥＡの免疫原特性に対するＬＴＢの増強効果はまた、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の全コドン最適化ｃＤＮＡを担うプラスミドの注射においても観察される。最後に、これらの結果から、ＣＥＡ−ＬＴＢの免疫原性の増強がプラスミドＤＮＡ免疫付与に制限されないことが示される。
【実施例１４】
【０１６６】
ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体で免疫付与されたＣＥＡトランスジェニックマウスにおける腫瘍成長動態
ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原性の増強によっても、腫瘍進行を抑制できる治療効果増強が起こるか否かを解明することが適切であると考えられた。この目的のため、１０匹のＣＥＡ−ｔｇマウスの群に、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ又はｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを１週ごとに５回注射し、次いで、対応するＡｄベクター １ｘ１０１０ｖｐによる最終追加免疫を行った。プラスミドＤＮＡ初回刺激−Ａｄ追加免疫様式を利用することにより、ウィルス抗原及びバクテリア抗原に対して高レベルの細胞免疫を誘導できることを示す最新の報告を考慮して、同じ免疫付与プロトコールを本研究において採用した。最後の免疫付与から２週間後、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ腫瘍細胞を皮下注射することでＣＥＡｔｇマウスに負荷試験を行った。この同質遺伝子的細胞株は、化学的に誘導される結腸癌に由来し、ＣＥＡを発現する。擬似処理マウスにおける腫瘍の発達を負荷試験の２２日後までに検出し、その際全処理マウスにおいて腫瘍が発生していた（図１７Ａ）。さらに、負荷試験から３４日後までに、かなりの体積に達する腫瘍塊の平均的サイズが同時に増加した。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔをコードするベクターでワクチン接種されたマウスは、負荷試験後３４日目で１０匹の処理マウスのうち２匹が腫瘍のないままであったため、腫瘍の発達に対してある程度の抵抗性を示した。この群の腫瘍の平均的サイズは、擬似処理されたマウスにおいて観察されるものよりも小さかった。ＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ融合体をコードするベクターによる免疫付与の結果、腫瘍発達に対する有意な防御効果が得られた。１０匹の処理マウスのうちの５匹が負荷試験後３４日目で腫瘍のないままであり、この群における腫瘍塊の平均的サイズは、前記擬似マウス又はｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ処理マウスにおいて観察されるものよりも有意に小さかった。したがって、これらの結果から、前記ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードするベクターに付随するＣＥＡ特異的免疫反応の増強は、有意な抗腫瘍効果と相関し、その結果、腫瘍成長がある程度防御され、腫瘍塊の成長動態が低下することが示される。
【実施例１５】
【０１６７】
ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体は、ＣＥＡタンパク質の免疫原性を増強する
ＣＥＡ−ＦＲＣ、ＣＥＡ−ＤＯＭ、ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ＣＥＡ−ＨＳＰ７０及びＣＥＡ−ＬＡＭＰの融合体をコードするプラスミドにより誘導される免疫反応を検討するために、１群９匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、各プラスミド ５０μｇ又は５μｇの２回のｉ．ｍ．注射を行い、免疫付与した。この免疫付与は３週間の間隔をあけて行った。エレクトロポレーションを用いて報告される形質導入及び免疫原性の増強を考慮して（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：１１５９８（２０００）、Ｗｉｄｅｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５（２０００））、プラスミドＤＮＡをマウス骨格筋に対して通常通りエレクトロポレーションした（ＤＮＡ−ＥＰ）。
【０１６８】
最後の注射から２週間後に、様々なプラスミドにより誘発される免疫反応をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。刺激した脾臓細胞からの抗原特異的ＩＦＮγ分泌を、１１ａａまで重複し、ＣＥＡのＣ末端領域を包含する１５マーのペプチドのプール（プールＤ、ａａ４９７〜７０３）を使用して測定した（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、前出）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＥＡに対する細胞性免疫反応がこのタンパク質のＣ末領域に向けて主に偏向するため（Ｚｕｃｃｅｌｉら、前出）、ペプチドプールＤを使用してＣＥＡに対する免疫反応の分析を行った。ネガティブ対照として、ＣＥＡペプチドを可溶化するのに利用されるのと同濃度のＤＭＳＯによる脾臓細胞の刺激に対するサイトカイン産生も測定した。
【０１６９】
ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ又はｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−Ｆｃの注射により、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡと比較して、ＣＥＡに対するより大きな免疫反応が誘発された。これら２つの融合タンパク質がより大きな免疫原性を有する結果、１０６個の脾臓細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の幾何学的平均値がより高くなった（図２０Ａ）。プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧは同様の免疫原特性を有し、プラスミドＤＮＡ ５μｇ又は５０μｇを注射した際に、ＣＥＡ特異的免疫反応が３倍から４倍増強された（それぞれｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ：５９０及び１０９８ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ：５１０及び１１６０、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ：１４６及び２６４ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡにより誘発されるＳＦＣ値の間には有意差は示されなかった。ＣＥＡ特異的免疫反応はネガティブ対照試料において検出されなかった。
【０１７０】
ＣＥＡに対する液性反応に及ぼすＣＥＡ融合体の効果を調べるために、精製ＣＥＡタンパク質を基質として用いたＥＬＩＳＡにおいて、免疫付与マウスからの血清を試験した（図２０Ｂ）。ＣＥＡ特異的抗体タイターの向上は、プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０ ５０μｇを注射した際に観察された。対照的に、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇの注射の結果、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡによる免疫付与に際して観察されるのと同程度のＣＥＡ特異的抗体反応が起こった。まとめると、これらのデータから、ＤＯＭ又はＦｃＩｇＧ ｃＤＮＡに対するＣＥＡコード配列の融合の結果、ＣＥＡ特異的細胞性免疫及び液性免疫反応が増強されることが示される。
【実施例１６】
【０１７１】
ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおける標的抗原に対する寛容性を打破する。
【０１７２】
前記標的抗原に対する寛容性は、癌ワクチンが免疫反応を誘発し、効率的な抗腫瘍効果を生じるために克服しなければならないハードルの１つである。したがって、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体の免疫原特性の増強により、ＣＥＡタンパク質よりも効率的にＣＥＡに対する寛容性が打破されるか否かを調べることが適切であると考えられた。この目的のため、ＣＥＡトランスジェニックマウスを利用して比較免疫付与実験を行った。これらのトランスジェニックマウスは全長ヒトＣＥＡ遺伝子及び隣接配列を有し、ＣＥＡタンパク質を腸において、主に盲腸及び結腸において発現する。このマウス系統は、この腫瘍自己抗原に対して向けられる免疫療法計画の安全性及び効率性を研究するための有用なモデルである（Ｃｌａｒｋｅら、前出）。
【０１７３】
ＣＥＡの、コドン使用最適化されたｃＤＮＡ（ｃＤＮＡｏｐｔ）を担うベクターの免疫原特性の増強を考慮して、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体のｃＤＮＡｏｐｔ（ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ）又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体のｃＤＮＡｏｐｔ（ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ）を担わせるために、プラスミドベクター及びアデノウィルスベクターの両者を操作した。ＣＥＡについて観察されるように、ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ ｃＤＮＡ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ ｃＤＮＡは、対応する野生型ｃＤＮＡよりも高い効率で発現され、これによりＣＥＡに対する免疫反応が増強されることが示された（データ非表示）。
【０１７４】
単独又は組み合わせのいずれかで投与されるプラスミドＤＮＡ及びＡｄベクターを使用した一連の免疫付与実験により、これら２つの融合タンパク質の免疫原性をＣＥＡの免疫原性と比較した。ＣＥＡトランスジェニックマウスのコホートを以下の様々な実験計画で免疫付与した。すなわち（ｉ）プラスミドＤＮＡ ５０μｇを１週間間隔で５回注射（ＤＮＡ／ＤＮＡ）、（ｉｉ）１ｘ１０７から１ｘ１０９個の範囲のウィルス粒子（ｖｐ）の投与量で、アデノウィルスを隔週（ｂｉｗｅｅｋｌｙ）で２回注射（Ａｄ／Ａｄ）、又は（ｉｉｉ）１週ごとに５回のプラスミドＤＮＡの注射後に、アデノウィルス １ｘ１０９ｖｐの最後の注射（ＤＮＡ／Ａｄ）、である。プールＤペプチドを用いた各免疫付与マウスのＰＢＭＣ又は脾臓細胞に対する細胞内ＩＦＮγ染色により、免疫反応を分析した。さらに、ＣＥＡ特異的抗体の誘導をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１７５】
ＣＥＡトランスジェニックマウスのＤＮＡ／ＤＮＡ免疫付与により、ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔベクター及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔベクターが、前記標的抗原に対する測定可能なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を与えることが明らかとなった（図２１Ａ）。したがって、両コンストラクトは、これらのマウスにおいてＣＥＡに対する寛容性を打破することができた。ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合タンパク質により誘発される抗原特異的反応は、ＩＦＮγ細胞内染色の平均値によって示されるものと同程度だった（それぞれ０．２２％及び０．３４％）。それにもかかわらず、これら２つのコンストラクトにより誘発される免疫反応は、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔによるワクチン接種において観察されるもの（０．０７％）よりも大きかった。同様に、抗ＣＥＡ液性反応も本融合タンパク質によるワクチン接種においてより大きかった。ＣＥＡ特異的抗体タイターは、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔにより免疫付与したマウス全てにおいて検出され、抗体タイターの平均はそれぞれ５６，１３６及び２４，７２５であった。一方、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔ免疫付与群は、ＣＥＡ特異的抗体の少なくとも７７倍低い（１／７７）平均タイター（３１８）を示した（図２１Ｂ）。
【０１７６】
Ａｄ／Ａｄワクチン接種法により処理したＣＥＡトランスジェニックマウスはまた、Ａｄ−ＣＥＡｏｐｔによるワクチン接種よりも、ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔＡｄベクター及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔＡｄベクターによるワクチン接種に際して、ＣＥＡに対する寛容性を打破する上でより優れた効率を示した。ＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、Ａｄ−ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＡｄ−ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧの１０７ｖｐという少量の注射においてワクチン接種を受けたマウスで観察することができ、ＣＥＡ特異的反応は、前記２つの抗原の間で同程度であり、１０９ｖｐの注射に際して増強された（それぞれ１．５５％及び１．１５％）。一方、有意なＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度を誘発するためには、Ａｄ−ＣＥＡｏｐｔ １０９ｖｐが必要であった（２．１％）（図２１Ｃ）。ＣＥＡ特異的抗体は、Ａｄ−ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びＡｄ−ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔで免疫付与されたマウス全てにおいて検出された。抗体タイターの平均値はそれぞれ１９，６００及び３３，０００であった。Ａｄ−ＣＥＡｏｐｔの注射の結果、処理されたマウスのうちのわずか２匹においてのみ測定可能なＣＥＡ特異的反応が生じ、抗体タイターは有意に低かった（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、前出）（図２１Ｄ）。興味深いことに、ＤＮＡ／Ａｄ免疫付与により、ＣＥＡベクター、ＣＥＡ−ＤＯＭベクター及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度における差が低下することが示された（図２２Ａ）。しかし、ＣＥＡ特異的抗体タイターの平均値は、ＣＥＡを発現するベクターよりも、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧを発現するベクターによるワクチン接種に際して大きかった（それぞれ４１２、３１，２００、２６，１２０）（図２２Ｂ）。
【０１７７】
興味深いことに、前記抗原にもかかわらず、ＣＥＡに対する明らかなＣＤ４＋細胞Ｔｈ１反応は、この３種類のワクチン接種法のいずれにおいても検出されなかった（データ非表示）。しかしながら、ＤＯＭ配列内に存在するヘルパーエピトープｐ３０（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１５５８−６５（２００１））に対する有意なＣＤ４＋細胞Ｔｈ１反応は、ＤＮＡ／ＤＮＡワクチン接種後に検出された（０．４％）（図２３）。
【０１７８】
したがって、これらのデータから、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合タンパク質が、ＣＥＡタンパク質よりも優れた効率でトランスジェニックマウスにおいてＣＥＡに対する寛容性を打破できることが示される。これらの融合タンパク質の免疫原特性の増強は、ＤＮＡ又はＡｄベクターによるワクチン接種に際して観察できる。しかし、ＣＥＡに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発におけるこの２つの融合タンパク質のより優れた能力は、ＤＮＡ／Ａｄワクチン接種療法によって少なくともある程度低下し得る。
【実施例１７】
【０１７９】
Ｔ細胞枯渇実験
免疫付与動物において、記述されているように（Ｐｅｒｒｉｃｏｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７（４）：２７３−８１（２００４）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９３（２−３）：２４７−５３（２００４））、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５ハイブリドーマ）、抗ＣＤ８（Ｌｙｔ２．２ハイブリドーマ）又は抗ＡｓｉａｌｏＧＭ１（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）のｉ．ｐ．注射により、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞の枯渇処理を行った。抗体（１回当たり１００μｌ（腹水で希釈したもの。））を腫瘍負荷に対して７日目に注射し、次に５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ細胞の注射から３週間にわたり、毎週注射した。枯渇条件は、フィコエリトリン抱合型ＭＡｂ 抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗ＮＫ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して末梢血のフローサイトメトリ分析により確認し、関連細胞サブセットの９９％が除去されたのに対し、全ての他のサブセットは通常レベル内にとどまった。
【実施例１８】
【０１８０】
ＣＥＡ−ＤＯＭ免疫付与は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおいて抗腫瘍効果を発揮する
発明者らは、次に、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体の免疫原性の増強によっても、腫瘍進行を防御できるように治療効果が増強されるか否かを確認した。この目的のために、１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に対して、ＣＥＡ−ＤＯＭベクター、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクター又はＣＥＡベクターによる、ＤＮＡ／ＤＮＡ、Ａｄ／Ａｄ又はＤＮＡ／Ａｄの免疫付与法を行った。最後の免疫付与から２週間後、このＣＥＡトランスジェニックマウスに対して、ＣＥＡを発現する同質遺伝子的な腫瘍細胞系である５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ細胞の皮下注射により、負荷試験を行った（Ｃｌａｒｋｅら、前出）。ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＡｄ／Ａｄの様式による免疫付与の結果、注射したベクターにより発現されるタンパク質にかかわらず、有意な抗腫瘍効果は全く得られなかった（図２４）。一方、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質をコードするベクターによるＤＮＡ−ＥＰ／Ａｄ免疫付与の結果、処理マウス１０匹のうちの７匹で、負荷試験後の３４日目まで腫瘍がないという、有意な抗腫瘍効果が得られた。したがって、これらの結果から、ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ ｃＤＮＡに付随するＣＥＡ特異的免疫反応の増強及びＤＮＡ／Ａｄワクチン接種法が、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおける有意な抗腫瘍効果と相関することが示される。
【実施例１９】
【０１８１】
ＣＥＡ−ＤＯＭ抗腫瘍効果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に依存する。
【０１８２】
ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体をコードするベクターによるＤＮＡ−ＥＰ及びＡｄの免疫付与において観察される抗腫瘍効果に関与するエフェクター細胞の特徴を調べた。ＤＮＡ／Ａｄ免疫付与後、腫瘍負荷試験前に、マウスに対して、ＭＡｂによりＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞の枯渇処理を行った。関連するＮＫ細胞サブセット及びＴ細胞サブセットが継続して除去されていることを確実にするために、腫瘍負荷試験の経過の間に抗体を与えた。３種類の細胞タイプ全ての除去を、細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリ分析により調べた（データ非表示）。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞の除去は、免疫付与マウスの生存に負の効果があり、結果として、ワクチン接種した群と比較すると、腫瘍のないマウス数が著しく減少した（図２５）。したがって、これらのデータから、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＥＡ−ＤＯＭワクチン接種により発揮される抗腫瘍効果において重要な役割を果たすことが示される。
【実施例２０】
【０１８３】
統計分析
示される場合、結果は対数格付け又は両側のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により分析した。０．０５未満のｐ値を有意とした。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】図１は、本発明で開発されたベクターの略図を示す。ＣＥＡ−ＬＴＡ及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードする本プラスミド及びＡｄベクターの基本的な性質が示される。Ａｄ５ゲノムの逆方向末端反復（ＩＴＲ）も示す。
【図２Ａ−１】図２は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＡ融合体の、ヌクレオチド（配列番号７、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号８、パネルＢ）を示す。ＬＴＡヌクレオチド配列は太字で示す。
【図２Ａ−２】図２は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＡ融合体の、ヌクレオチド（配列番号７、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号８、パネルＢ）を示す。ＬＴＡヌクレオチド配列は太字で示す。
【図２Ｂ】図２は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＡ融合体の、ヌクレオチド（配列番号７、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号８、パネルＢ）を示す。ＬＴＡヌクレオチド配列は太字で示す。
【図３Ａ−１】図３は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号９、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１０、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図３Ａ−２】図３は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号９、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１０、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図３Ｂ】図３は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号９、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１０、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図４Ａ】図４は、代表的ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図４Ｂ】図４は、代表的ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図５Ａ−１】図５は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔと表示する、代表的な完全最適化ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１２、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１３、パネルＢ）を示す。ＬＴＡＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図５Ａ−２】図５は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔと表示する、代表的な完全最適化ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１２、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１３、パネルＢ）を示す。ＬＴＡＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図５Ｂ】図５は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔと表示する、代表的な完全最適化ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１２、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１３、パネルＢ）を示す。ＬＴＡＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図６Ａ−１】図６は、本明細書中でｒｈＣＥＡｏｐｔＬＴＢｏｐｔと表示する、完全最適化アカゲザルＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号１４、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１５、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図６Ａ−２】図６は、本明細書中でｒｈＣＥＡｏｐｔＬＴＢｏｐｔと表示する、完全最適化アカゲザルＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号１４、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１５、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図６Ｂ】図６は、本明細書中でｒｈＣＥＡｏｐｔＬＴＢｏｐｔと表示する、完全最適化アカゲザルＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号１４、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１５、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図７Ａ−１】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ａ−２】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｂ−１】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｂ−２】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｃ】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｄ】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｅ】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図８Ａ】図８は、様々なＣＥＡコンストラクトを用いてトランスフェクションした細胞におけるＣＥＡ発現効率の比較を示す。パネルＡは、トレーサーとしてプラスミド ｐＶ１Ｊ／ｍＥＰＯ ０．２μｇと組み合わせて、ｈＣＥＡ、ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｈＣＥＡ−ＬＴＢの野生型配列を担うプラスミド ３μｇを用いてトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の発現効率を示す。パネルＢは、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを用いた、同様のトランスフェクション実験からの結果を示す。細胞抽出物中に存在するＣＥＡタンパク質量を測定し、ＥＰＯ発現に対してこの値を正規化することによって、トランスフェクションから３日後に発現効率を調べた。示すデータは、２つの独立したトランスフェクションの平均ＣＥＡ発現値に関する。
【図８Ｂ】図８は、様々なＣＥＡコンストラクトを用いてトランスフェクションした細胞におけるＣＥＡ発現効率の比較を示す。パネルＡは、トレーサーとしてプラスミド ｐＶ１Ｊ／ｍＥＰＯ ０．２μｇと組み合わせて、ｈＣＥＡ、ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｈＣＥＡ−ＬＴＢの野生型配列を担うプラスミド ３μｇを用いてトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の発現効率を示す。パネルＢは、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを用いた、同様のトランスフェクション実験からの結果を示す。細胞抽出物中に存在するＣＥＡタンパク質量を測定し、ＥＰＯ発現に対してこの値を正規化することによって、トランスフェクションから３日後に発現効率を調べた。示すデータは、２つの独立したトランスフェクションの平均ＣＥＡ発現値に関する。
【図９】図９は、ＣＥＡを発現する様々なアデノウイルス組み換えベクターの発現効率の比較を示す。ＨｅＬａ細胞に、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを用いて１００から１０００のｍｏｉで感染処理を行った。トランスフェクションから３日後に細胞抽出物に放出されるＣＥＡタンパク質量を測定することにより、発現効率を調べた。示すデータは、２つの独立したトランスフェクションの平均ＣＥＡ発現値を反映する。
【図１０Ａ】図１０は、ヒトＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘発される細胞性免疫反応の分析を示す。０及び３週に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群に、指示されたプラスミド（ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体又はＣＥＡ−ＬＴＢ融合体）５０μｇを筋肉内に電気注入した。マウスの４番目の群に、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ ２５μｇ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ ２５μｇの混合物を用いて免疫付与を行った。パネルＡ．追加免疫から２週間後、個々のマウス由来の脾臓細胞において、全タンパク質を包含するペプチドプールを用いて、ＣＥＡに特異的な、ＩＦＮγ−分泌Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた（白丸）。幾何平均値（黒菱形）も示す。パネルＢは、免疫マウス由来のプールした脾臓細胞の、ペプチドプールＤを用いた、ＩＦＮγ細胞内染色の結果を示す。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１０Ｂ−１】図１０は、ヒトＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘発される細胞性免疫反応の分析を示す。０及び３週に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群に、指示されたプラスミド（ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体又はＣＥＡ−ＬＴＢ融合体）５０μｇを筋肉内に電気注入した。マウスの４番目の群に、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ ２５μｇ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ ２５μｇの混合物を用いて免疫付与を行った。パネルＡ．追加免疫から２週間後、個々のマウス由来の脾臓細胞において、全タンパク質を包含するペプチドプールを用いて、ＣＥＡに特異的な、ＩＦＮγ−分泌Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた（白丸）。幾何平均値（黒菱形）も示す。パネルＢは、免疫マウス由来のプールした脾臓細胞の、ペプチドプールＤを用いた、ＩＦＮγ細胞内染色の結果を示す。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１０Ｂ−２】図１０は、ヒトＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘発される細胞性免疫反応の分析を示す。０及び３週に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群に、指示されたプラスミド（ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体又はＣＥＡ−ＬＴＢ融合体）５０μｇを筋肉内に電気注入した。マウスの４番目の群に、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ ２５μｇ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ ２５μｇの混合物を用いて免疫付与を行った。パネルＡ．追加免疫から２週間後、個々のマウス由来の脾臓細胞において、全タンパク質を包含するペプチドプールを用いて、ＣＥＡに特異的な、ＩＦＮγ−分泌Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた（白丸）。幾何平均値（黒菱形）も示す。パネルＢは、免疫マウス由来のプールした脾臓細胞の、ペプチドプールＤを用いた、ＩＦＮγ細胞内染色の結果を示す。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１１】図１１は、ＣＥＡをコードするプラスミドＤＮＡベクターを用いて免疫したマウスからの抗体タイターを示す。精製ヒトＣＥＡタンパク質に対する個々のタイターは、プラスミド ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢを用いて免疫付与した個々のマウス由来の血清でのＥＬＩＳＡにより測定した。平均値も示す（黒菱形）。
【図１２】図１２は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導される細胞性免疫反応の分析を示す。４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４）。最後の注入から２週間後、個々のマウス由来の脾臓細胞において、全タンパク質を包含するペプチドプールを用いて、ＣＥＡに特異的な、ＩＦＮγ−分泌Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた（白丸）。幾何平均値（黒菱形）も示す。
【図１３】図１３は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。Ｃ５７／ＤＲ４マウスに、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４参照）。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＤを用いて、免疫したマウス由来のプールした脾臓細胞に対してＩＦＮγ細胞内染色を行った。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１４Ａ】図１４は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。ＨＨＤマウスに、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４参照）。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＢ及びＤを用いて、免疫したマウス由来のプールした脾臓細胞に対してＩＦＮγ細胞内染色を行った。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１４Ｂ】図１４は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。ＨＨＤマウスに、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４参照）。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＢ及びＤを用いて、免疫したマウス由来のプールした脾臓細胞に対してＩＦＮγ細胞内染色を行った。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１４Ｃ】図１４は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。ＨＨＤマウスに、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４参照）。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＢ及びＤを用いて、免疫したマウス由来のプールした脾臓細胞に対してＩＦＮγ細胞内染色を行った。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１５Ａ】図１５は、指示されたプラスミドを１週ごとに５回電気注入することにより免疫された、ＣＥＡトランスジェニックマウス（Ｎ＝９）の細胞性及び液性免疫反応を示す。プラスミドＤＮＡ ５０μｇ総量をｉ．ｍ．で各ワクチン接種において注射した。パネルＡ．最後の注入から２週間後、ＣＥＡ特異的なＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数を、ペプチドプールＤを用いて、個々のマウス由来の脾臓細胞における細胞内染色により調べた（白丸）。幾何平均値（三角）も示す。パネルＢ．プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢを用いて免疫したマウスからの各血清におけるＥＬＩＳＡにより、精製ヒトＣＥＡタンパク質に対する個々のタイターを測定した。幾何平均値（黒菱形）も示す（黒菱形）。これらのデータから、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体がトランスジェニックマウスにおいてＣＥＡに対する寛容性を打破することが示される。
【図１５Ｂ】図１５は、指示されたプラスミドを１週ごとに５回電気注入することにより免疫された、ＣＥＡトランスジェニックマウス（Ｎ＝９）の細胞性及び液性免疫反応を示す。プラスミドＤＮＡ ５０μｇ総量をｉ．ｍ．で各ワクチン接種において注射した。パネルＡ．最後の注入から２週間後、ＣＥＡ特異的なＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数を、ペプチドプールＤを用いて、個々のマウス由来の脾臓細胞における細胞内染色により調べた（白丸）。幾何平均値（三角）も示す。パネルＢ．プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢを用いて免疫したマウスからの各血清におけるＥＬＩＳＡにより、精製ヒトＣＥＡタンパク質に対する個々のタイターを測定した。幾何平均値（黒菱形）も示す（黒菱形）。これらのデータから、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体がトランスジェニックマウスにおいてＣＥＡに対する寛容性を打破することが示される。
【図１６】図１６は、ＣＥＡをコードする様々なアデノウイルスベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。ＣＥＡトランスジェニックマウスに、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びＡｄ／ＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢの様々な用量を用いて、０及び２週に免疫した。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＤを用いて、免疫した各マウス由来のＰＢＭＣのＩＦＮγ細胞内染色を行った（黒丸）。幾何平均値も示す（黒菱形）。各注射群の非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）は、０．０１％以下であった。
【図１７Ａ】図１７は、ＭＣ３８−ＣＥＡ細胞を用いて負荷試験した、免疫ＣＥＡトランスジェニックマウスの腫瘍防御実験の結果を示す。１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、指示されたプラスミドＤＮＡ（５０μｇ／注射）の電気的注入により、１週ごとに５回免疫付与を行った。最後のＤＮＡ注入から２週間後、対応するＡｄベクターの１ｘ１０１０ｖｐの１回の注射により、マウスに対して追加免疫を行った。アデノウイルス追加免疫から１４日後、５ｘ１０５ ＭＣ３８−ＣＥＡ細胞を皮下注射することにより、マウスに負荷試験を行った。パネルＡは、所定の時点での腫瘍のないマウスのパーセンテージを示す。パネルＢは、各免疫群の平均腫瘍体積を報告する。これらのデータから、ＣＥＡ−ＬＴＢを用いたＣＥＡトランスジェニックマウスの免疫付与によりマウスにおける腫瘍成長が抑えられたことが示される。
【図１７Ｂ】図１７は、ＭＣ３８−ＣＥＡ細胞を用いて負荷試験した、免疫ＣＥＡトランスジェニックマウスの腫瘍防御実験の結果を示す。１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、指示されたプラスミドＤＮＡ（５０μｇ／注射）の電気的注入により、１週ごとに５回免疫付与を行った。最後のＤＮＡ注入から２週間後、対応するＡｄベクターの１ｘ１０１０ｖｐの１回の注射により、マウスに対して追加免疫を行った。アデノウイルス追加免疫から１４日後、５ｘ１０５ ＭＣ３８−ＣＥＡ細胞を皮下注射することにより、マウスに負荷試験を行った。パネルＡは、所定の時点での腫瘍のないマウスのパーセンテージを示す。パネルＢは、各免疫群の平均腫瘍体積を報告する。これらのデータから、ＣＥＡ−ＬＴＢを用いたＣＥＡトランスジェニックマウスの免疫付与によりマウスにおける腫瘍成長が抑えられたことが示される。
【図１８Ａ】パネルＡは、本実験で用いられる代表的なＣＥＡ融合タンパク質の略図を示す。ＣＥＡ融合タンパク質を発現するベクターは、実施例２において示すように、プラスミド ｐＶ１Ｊｎｓ由来であった。このコンストラクトは、ＧＰＩアンカー配列に対応する６４ａａの正味の欠失がある、ｎｔ１からｎｔ２０３７までのＣＥＡヌクレオチド配列を含有し、ａａ１からａａ６７９のＣＥＡを発現する。ＣＥＡに融合させられている各タンパク質を統合する配列も示す。パネルＢは、トランスフェクション細胞における、ｐＶ１Ｊ由来のコンストラクトの発現を示す。ＨｅＬａ細胞に、プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ又はｐＶ１Ｊ／ＣＥＡをトランスフェクションし、実施例５で述べるようにして、ウェスタンブロット分析のために処理した。ウェスタンブロットに使用する抗体の特異性を示す。ＣＥＡタンパク質を示す（黒矢印）。分子サイズ標準の位置（キロダルトン）も示す。
【図１８Ｂ】パネルＡは、本実験で用いられる代表的なＣＥＡ融合タンパク質の略図を示す。ＣＥＡ融合タンパク質を発現するベクターは、実施例２において示すように、プラスミド ｐＶ１Ｊｎｓ由来であった。このコンストラクトは、ＧＰＩアンカー配列に対応する６４ａａの正味の欠失がある、ｎｔ１からｎｔ２０３７までのＣＥＡヌクレオチド配列を含有し、ａａ１からａａ６７９のＣＥＡを発現する。ＣＥＡに融合させられている各タンパク質を統合する配列も示す。パネルＢは、トランスフェクション細胞における、ｐＶ１Ｊ由来のコンストラクトの発現を示す。ＨｅＬａ細胞に、プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ又はｐＶ１Ｊ／ＣＥＡをトランスフェクションし、実施例５で述べるようにして、ウェスタンブロット分析のために処理した。ウェスタンブロットに使用する抗体の特異性を示す。ＣＥＡタンパク質を示す（黒矢印）。分子サイズ標準の位置（キロダルトン）も示す。
【図１９Ａ】図１９は、ＣＥＡ融合コンストラクトの発現効率の比較を示す。ＨｅＬａ細胞に、指示されたプラスミドをトランスフェクションし、実施例８で述べるようにして、ＥＬＩＳＡにより、細胞溶解液に存在するＣＥＡ由来タンパク質（Ａ）及び上清（Ｂ）の測定を行った。得られた結果は、２つの独立の実験の代表である。
【図１９Ｂ】図１９は、ＣＥＡ融合コンストラクトの発現効率の比較を示す。ＨｅＬａ細胞に、指示されたプラスミドをトランスフェクションし、実施例８で述べるようにして、ＥＬＩＳＡにより、細胞溶解液に存在するＣＥＡ由来タンパク質（Ａ）及び上清（Ｂ）の測定を行った。得られた結果は、２つの独立の実験の代表である。
【図２０Ａ】図２０は、ＣＥＡ融合タンパク質をコードする様々なコンストラクトの免疫原性の比較を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、指示されたプラスミド ５又は５０μｇ／投与を用いて筋肉内にエレクトロポレーションを行った。第０日及び１４日に注射を行った。パネルＡ 実施例６及び１５で述べるようにして、ａａ４９７−７０３（プールＤ）をカバーするペプチドのプールを用いて、各個別のマウスにおけるＰＢＭＣ中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞数を調べた。ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の平均数も示す（黒丸）。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのＳＦＣ値は、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡのそれと有意差がある。パネルＢ．基質として精製ＣＥＡを用いたＥＬＩＳＡにより、抗体タイターを測定した。指示されたプラスミド ５０μｇ用量で免疫した各コホートの平均値を示す。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡを注射したマウスのタイターと有意差があるタイターに星印を付す。
【図２０Ｂ】図２０は、ＣＥＡ融合タンパク質をコードする様々なコンストラクトの免疫原性の比較を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、指示されたプラスミド ５又は５０μｇ／投与を用いて筋肉内にエレクトロポレーションを行った。第０日及び１４日に注射を行った。パネルＡ 実施例６及び１５で述べるようにして、ａａ４９７−７０３（プールＤ）をカバーするペプチドのプールを用いて、各個別のマウスにおけるＰＢＭＣ中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞数を調べた。ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の平均数も示す（黒丸）。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのＳＦＣ値は、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡのそれと有意差がある。パネルＢ．基質として精製ＣＥＡを用いたＥＬＩＳＡにより、抗体タイターを測定した。指示されたプラスミド ５０μｇ用量で免疫した各コホートの平均値を示す。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡを注射したマウスのタイターと有意差があるタイターに星印を付す。
【図２１Ａ】図２１は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応の誘導を示す。１２匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与 大腿四頭筋に電気的注入）又はアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）を用いて免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）及びＡｄ／Ａｄ（Ｃ）免疫法により誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＡｄ／Ａｄ法により免疫された、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ｂ）又はＡｄ／Ａｄ（Ｄ）免疫付与法でワクチン接種された各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。
【図２１Ｂ】図２１は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応の誘導を示す。１２匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与 大腿四頭筋に電気的注入）又はアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）を用いて免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）及びＡｄ／Ａｄ（Ｃ）免疫法により誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＡｄ／Ａｄ法により免疫された、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ｂ）又はＡｄ／Ａｄ（Ｄ）免疫付与法でワクチン接種された各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。
【図２１Ｃ】図２１は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応の誘導を示す。１２匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与 大腿四頭筋に電気的注入）又はアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）を用いて免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）及びＡｄ／Ａｄ（Ｃ）免疫法により誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＡｄ／Ａｄ法により免疫された、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ｂ）又はＡｄ／Ａｄ（Ｄ）免疫付与法でワクチン接種された各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。
【図２１Ｄ】図２１は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応の誘導を示す。１２匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与 大腿四頭筋に電気的注入）又はアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）を用いて免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）及びＡｄ／Ａｄ（Ｃ）免疫法により誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＡｄ／Ａｄ法により免疫された、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ｂ）又はＡｄ／Ａｄ（Ｄ）免疫付与法でワクチン接種された各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。
【図２２Ａ】図２２は、ＤＮＡ／Ａｄ法の免疫原性を示す。１２のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与）及びアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）で免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した（Ａ）。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｂ）。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。平均値を示す（黒丸）。
【図２２Ｂ】図２２は、ＤＮＡ／Ａｄ法の免疫原性を示す。１２のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与）及びアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）で免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した（Ａ）。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｂ）。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。平均値を示す（黒丸）。
【図２３】図２３は、破傷風トキソイドタンパク質に対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応の検出を示す。実施例１６で述べるようにして、ＣＥＡトランスジェニックマウスに、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔで免疫付与した。ペプチドｐ３０を用いて、免疫マウス由来のプールしたＰＢＭＣにおいて、ＩＦＮγ細胞内染色を行った。全リンパ球のゲーティング及びＣＤ８＋（Ｒ３）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｒ４）に対するゲーティングを示す。
【図２４Ａ】図２４は、コドン最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うベクターを用いたワクチン接種の抗腫瘍効果を示す。実施例１８で述べるようにして、１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）、Ａｄ／Ａｄ（Ｂ）及びＤＮＡ／Ａｄ（Ｃ）のワクチン接種法により、コドン使用最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うプラスミドＤＮＡ及びＡｄベクターを用いて免疫付与した。最後の注射から２週間後、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ腫瘍細胞のｓｃ接種により、マウスに負荷試験を行った。ワクチン接種群における腫瘍のないマウスのパーセンテージを週に１回の間隔で調べ、非処置対照と比較した。ＣＥＡ−ＤＯＭベクター（ＤＮＡ／Ａｄ様式）でワクチン接種したマウスは、対照マウスと有意差があった（ｌｏｇ順位検定 ｐ＜０．０５）。
【図２４Ｂ】図２４は、コドン最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うベクターを用いたワクチン接種の抗腫瘍効果を示す。実施例１８で述べるようにして、１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）、Ａｄ／Ａｄ（Ｂ）及びＤＮＡ／Ａｄ（Ｃ）のワクチン接種法により、コドン使用最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うプラスミドＤＮＡ及びＡｄベクターを用いて免疫付与した。最後の注射から２週間後、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ腫瘍細胞のｓｃ接種により、マウスに負荷試験を行った。ワクチン接種群における腫瘍のないマウスのパーセンテージを週に１回の間隔で調べ、非処置対照と比較した。ＣＥＡ−ＤＯＭベクター（ＤＮＡ／Ａｄ様式）でワクチン接種したマウスは、対照マウスと有意差があった（ｌｏｇ順位検定 ｐ＜０．０５）。
【図２４Ｃ】図２４は、コドン最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うベクターを用いたワクチン接種の抗腫瘍効果を示す。実施例１８で述べるようにして、１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）、Ａｄ／Ａｄ（Ｂ）及びＤＮＡ／Ａｄ（Ｃ）のワクチン接種法により、コドン使用最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うプラスミドＤＮＡ及びＡｄベクターを用いて免疫付与した。最後の注射から２週間後、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ腫瘍細胞のｓｃ接種により、マウスに負荷試験を行った。ワクチン接種群における腫瘍のないマウスのパーセンテージを週に１回の間隔で調べ、非処置対照と比較した。ＣＥＡ−ＤＯＭベクター（ＤＮＡ／Ａｄ様式）でワクチン接種したマウスは、対照マウスと有意差があった（ｌｏｇ順位検定 ｐ＜０．０５）。
【図２５】図２５は、ＣＥＡ−ＤＯＭ ＤＮＡ／Ａｄ免疫付与により誘導される抗腫瘍効果の誘導における、ＣＤ４、ＣＤ８又はＮＫ枯渇の影響を示す。ＣＥＡトランスジェニックマウスに対して、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ ５０μｇを毎週繰り返し注射して免疫付与し、次いで、Ａｄ−ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ １ｘ１０９ｖｐを用いて追加免疫を行った（実施例１９）。最後の注射から１週間後、マウスに対して、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞を枯渇させないか、又は枯渇させた。最後の免疫から２週間後、マウスに対して、５ｘ１０５個のＭＣ３９−ＣＥＡ腫瘍細胞のｓｃ接種により負荷試験を行った。ワクチン接種群における、腫瘍のないマウスのパーセンテージを週に１回の間隔で調べ、非処置対照と比較した。このデータから、ワクチン接種群における腫瘍のないマウスのパーセンテージは、非処置対照及び枯渇コホートと有意差があったことが示される。
【図２６Ａ−１】図２６は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＤＯＭｏｐｔと表示される、代表的な、完全最適化ｈＣＥＡ−ＤＯＭ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。コードされるタンパク質のアミノ酸配列も示す（配列番号４５）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２６Ａ−２】図２６は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＤＯＭｏｐｔと表示される、代表的な、完全最適化ｈＣＥＡ−ＤＯＭ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。コードされるタンパク質のアミノ酸配列も示す（配列番号４５）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２６Ａ−３】図２６は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＤＯＭｏｐｔと表示される、代表的な、完全最適化ｈＣＥＡ−ＤＯＭ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。コードされるタンパク質のアミノ酸配列も示す（配列番号４５）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２７Ａ−１】図２７は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＦｃＩｇＧｏｐｔと表示される、代表的な、ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。コードされるタンパク質の配列も示す（配列番号４６）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＦｃＩｇＧ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２７Ａ−２】図２７は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＦｃＩｇＧｏｐｔと表示される、代表的な、ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。コードされるタンパク質の配列も示す（配列番号４６）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＦｃＩｇＧ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２７Ａ−３】図２７は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＦｃＩｇＧｏｐｔと表示される、代表的な、ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。コードされるタンパク質の配列も示す（配列番号４６）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＦｃＩｇＧ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２８Ａ】図２８は、ａａ１からａａ６７９（配列番号２３、パネルＢ）のｈＣＥＡタンパク質の一部をコードする、ｎｔ１から２０３７ｎｔ（配列番号２２、パネルＡ）の野生型ヒトＣＥＡ ｃＤＮＡの一部のヌクレオチド配列を示す。
【図２８Ｂ】図２８は、ａａ１からａａ６７９（配列番号２３、パネルＢ）のｈＣＥＡタンパク質の一部をコードする、ｎｔ１から２０３７ｎｔ（配列番号２２、パネルＡ）の野生型ヒトＣＥＡ ｃＤＮＡの一部のヌクレオチド配列を示す。
【図２９】図２９は、（配列番号４８）でも示される、ＤＯＭタンパク質をコードする、ｎｔ１からｎｔ８２５（配列番号４７）の破傷風毒素断片Ｃ（ＤＯＭ）ｃＤＮＡの最小化ドメインの非最適化ヌクレオチド配列を示す。
【図３０Ａ−１】図３０は、代表的なヒトＣＥＡ−ＤＯＭ融合体（配列番号４９）の非最適化ヌクレオチド配列を示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなる。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示す。
【図３０Ａ−２】図３０は、代表的なヒトＣＥＡ−ＤＯＭ融合体（配列番号４９）の非最適化ヌクレオチド配列を示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなる。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示す。
【図３１Ａ−１】図３１は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔと表示されるアカゲザルＣＥＡ−ＤＯＭ融合体の代表的なヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す。コードされる融合タンパク質の配列（配列番号５１）も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３１Ａ−２】図３１は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔと表示されるアカゲザルＣＥＡ−ＤＯＭ融合体の代表的なヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す。コードされる融合タンパク質の配列（配列番号５１）も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３１Ｂ】図３１は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔと表示されるアカゲザルＣＥＡ−ＤＯＭ融合体の代表的なヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す。コードされる融合タンパク質の配列（配列番号５１）も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３２Ａ−１】図３２は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＣＴＢｏｐｔと表示される、アカゲザルＣＥＡ−ＣＴＢ融合体の代表的ヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。コードされる融合タンパク質（配列番号５３）の配列も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＣＴＢ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３２Ａ−２】図３２は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＣＴＢｏｐｔと表示される、アカゲザルＣＥＡ−ＣＴＢ融合体の代表的ヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。コードされる融合タンパク質（配列番号５３）の配列も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＣＴＢ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３２Ｂ】図３２は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＣＴＢｏｐｔと表示される、アカゲザルＣＥＡ−ＣＴＢ融合体の代表的ヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。コードされる融合タンパク質（配列番号５３）の配列も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＣＴＢ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に癌の治療に関する。とりわけ、本発明は、少なくとも腫瘍関連ポリペプチド癌胎児性抗原の一部を含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、組み換えベクター及び該ポリヌクレオチドを含有する宿主、精製融合タンパク質及び、本明細書で開示する組成物及び分子を使用した、ＣＥＡに対する免疫反応を促進する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、様々な機能を有するタンパク質をコードする多数の遺伝子からなり、その１つは、細胞間接着である。ＩｇＳＦタンパク質は、適正な細胞間結合相互作用の維持に重要である、少なくとも１つのＩｇ関連ドメインを含有する。このような相互作用はＩｇＳＦメンバーの多岐に渡る生物学的機能に必要なので、多くのＩｇＳＦ接着分子の崩壊又は異常な発現は、多くのヒトの疾患と関連がある。
【０００３】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、ＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）として知られている細胞表面糖タンパク質からなるＩｇスーパーファミリーのサブファミリーに属する。ＣＥＡＣＡＭは、同型及び異型両方の細胞間接着分子として働くことが示されている（Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌら、Ｃｅｌｌ ５７：３２７−３３４（１９８９））。細胞接着に加えて、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５としても知られている。）は、細胞外マトリックスからの細胞の脱離の結果として、細胞死を抑制し、ある一定の癌原遺伝子（Ｂｃｌ２及びＣ−Ｍｙｃなど）に関連する細胞形質転換に寄与し得る（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０（８）：２１９７−２２０７（２００２）を参照のこと。）。ヒトＣＥＡをコードする配列がクローニングされ、特性が調べられた（米国特許第５，２７４，０８７号；米国特許第５，５７１，７１０号；及び米国特許第５，８４３，７６１号。Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２２１−３２３０（１９８７）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９２０−９２４（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（９）：２９６５−６９（１９８７）も参照のこと。）。
【０００４】
ＣＥＡの正常発現は、胎児発生中及び成人の結腸粘膜において検出されている。ＣＥＡ過剰発現は最初に、ヒト結腸腫瘍において３０年以上前に検出され（Ｇｏｌｄ及びＦｒｅｅｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２１：４３９−４６２（１９６５））ほぼ全ての結腸直腸腫瘍において見出されている。さらに、ＣＥＡ過剰発現は、膵臓、肝臓、乳房、卵巣、子宮頸部及び肺の腺癌で高い割合で検出可能である。これらの腫瘍タイプにおいて検出率が高く、正常組織での発現は限られているので、ＣＥＡは、自己腫瘍関連抗原及び能動的及び受動的免疫治療の標的と考えられている。最近の臨床データから、様々なワクチンストラテジーが、ＣＥＡに特異的なヒトＢ及びＴ細胞を生み出すことができることが分かっており、このことから、ＣＥＡが、これらの癌タイプの治療に対して、分子及び免疫的介入の標的である、さらなる証拠が与えられる。
【０００５】
ＣＥＡを標的とする治療アプローチには、抗ＣＥＡ抗体の使用（Ｃｈｅｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ８−Ｓ１２（２０００）を参照のこと。）ならびに、ＣＥＡに基づくワクチン（概説として、Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ、前出、を参照のこと。）が含まれる。外来遺伝子を高レベルで発現させることにおいて困難な点があることから、多くのワクチンの開発及び市販が阻まれてきた。ＤＮＡに基づくワクチンもまた、治療を受ける個体において、十分な大きさの免疫反応を生じさせられないために、成功していない。様々なタンパク質を標的するＤＮＡワクチンもまた開発されてきたが、得られる免疫反応は、従来のワクチンと比較して弱い。
【０００６】
ＤＮＡ操作が簡便であることから、抗原を様々な免疫増強因子に融合させる、遺伝子融合ストラテジーを含むワクチンを開発するチャンスが与えられている。標的抗原に対する免疫反応の促進は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２８８８−９４（２０００）；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６２１８−２６（２００１）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１０３５−４２（２０００））、ＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｙｏｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４５８１−９２（２０００））、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）（Ｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．６２：５０４１−４８（２００２））及び破傷風毒素からのユニバーサルＴｈエピトープ（Ｒｅｎａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１５８８−９５（２００３）；Ｋｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：１２８１−８６（１９９８）；Ｌｕｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：３６５−７６（２００３）；Ｐａｄｕａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９（１１）：１４１３−１７（２００３）；Ｓａｖｅｌｙｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．１９：７６０−６４（２００１）；Ｗａｈｒｅｎら、ＷＯ２００４／０９２２１６）に融合させた抗原をコードするベクターにより、動物モデルで行われてきた。標的抗原に対する免疫反応の促進は特に、腫瘍抗原の免疫原性の制限及び効果的な抗腫瘍効果を与えるために寛容性を乗り越える必要性を考えると、癌ワクチンが適切である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、上述のＣＥＡタンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列が同定されたにもかかわらず、哺乳動物に送達させた際に、野生型全長 ＣＥＡ ｃＤＮＡと比較して、ＣＥＡ特異的免疫反応を促進することができるワクチンを開発することが非常に望まれている。また、ＣＥＡ特異的免疫反応を安全かつ効果的に増強する核酸分子又はタンパク質を利用した、ＣＥＡ関連癌を治療もしくは予防する方法を開発することも望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細菌毒素などの免疫増強因子の大部分に融合させられた腫瘍関連ポリペプチド癌胎児性抗原の一部を少なくとも含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態において、コードされるＣＥＡ融合タンパク質のＣＥＡ部分は、そのＣ末端のアンカードメインに欠失がある。好ましい実施形態において、その免疫増強因子は、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＡもしくはＢサブユニット又はそれらの大部分である。他の好ましい実施形態において、本免疫増強因子は、破傷風毒素断片Ｃ（ＤＯＭ）の最小化ドメイン又はそれらの大部分である。本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含有し、宿主細胞が組み換えベクターを含有する、これらに限定されないがアデノウイルス及びプラスミドベクターを含む、組み換えベクターを提供する。本明細書において、本発明ポリヌクレオチによりコードされる精製融合タンパク質もまた提供する。
【０００９】
本発明はさらに、本明細書に記載のＣＥＡ融合体又はＣＥＡ融合タンパク質を含有する、ワクチン又は医薬組成物を投与することによって、ＣＥＡタンパク質に対する免疫反応を与えることにより哺乳動物における癌の発現を阻害又は予防するための方法を提供する。本明細書中の方法の好ましい実施形態において、野生型ＣＥＡワクチンにより与えられる免疫反応と比較して、免疫反応を促進する。
【００１０】
本明細書を通して、及び添付の請求の範囲において使用される場合、単数体「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明確に示されない限り、複数の意味を含む。
【００１１】
本明細書を通して、及び添付の請求の範囲において使用される場合、次の定義及び略語が適用となる：
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、ＤＮＡ鎖における認識部位を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成し、転写活性を促進する。その複合体は、「エンハンサー」と呼ばれる配列を活性化することにより、又は「サイレンサー」と呼ばれる配列を抑制することにより、修飾され得る。
【００１２】
「カセット」という用語は、例えば、ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードする、ヌクレオチド又は遺伝子配列など、ベクターから発現されるべき、ヌクレオチド又は遺伝子配列を指す。一般に、カセットは、ベクターに挿入され得る遺伝子配列を含有し、いくつかの実施形態において、それは、ヌクレオチド又は遺伝子配列の発現に対する調節配列を与える。他の実施形態において、本ヌクレオチド又は遺伝子配列は、その発現のための調節配列を与える。さらなる実施形態において、本ベクターは、いくつかの調節配列を与え、本ヌクレオチド又は遺伝子配列は、その他の調節配列を与える。例えば、本ベクターは、ヌクレオチド又は遺伝子配列を転写するためのプロモーターを与えることができ、本ヌクレオチド又は遺伝子配列は、転写終結配列を与えることができる。本ベクターにより与えら得る調節配列には、これらに限定されないが、エンハンサー、転写終結配列、スプライシング受容及び供与配列、イントロン、リボソーム結合配列及びポリ（Ａ）付加配列が含まれる。
【００１３】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片が宿主生物又は宿主組織に導入され得るいくつかの手段を指す。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む。）、バクテリオファージ及びコスミドを含む、様々なタイプのベクターがある。
【００１４】
「第一世代」という用語は、アデノウイルスベクターに関して使用される場合、複製欠損型のアデノウイルスベクターを説明するものである。第一世代アデノウイルスベクターは、通常、Ｅ１遺伝子領域を欠くか、又はＥ１遺伝子領域が不活性化されており、好ましくは、Ｅ３遺伝子領域を欠くか、又は不活性化されている。
【００１５】
「ＤＯＭ」という略語は、通常、破傷風トキソイドの断片ＣのＮ末端ドメインを指す。
【００１６】
「ＬＴ」という略語は、通常、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンを指す。「ＬＴ」は、サブユニットＡ及びＢ又はサブユニットＡの大部分もしくはサブユニットＢの大部分を含有する、完全エンテロトキシンを指し得る。「ＬＴＡ」という略語は、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＡサブユニット又はその大部分を指し、Ｃ末端又はＮ末端で末端切断されているが生物学的活性を維持するサブユニットならびに、内部アミノ酸挿入、欠失又は置換を含有するが、生物学的活性を維持するサブユニットを含む。「ＬＴＢ」という略語は、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット又はその大部分を指し、Ｃ末端又はＮ末端で末端切断されているが生物学的活性を維持するサブユニットならびに、内部アミノ酸挿入、欠失又は置換を含有するが、生物学的活性を維持するサブユニットを含む。
【００１７】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、全長コドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列、ならびに最小ｐＵＣ骨格を含む、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す（実施例２参照。）。「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ」という表示は、コンストラクトが、コドン最適化されたヒトＣＥＡ遺伝子の代わりに野生型ヒトＣＥＡ遺伝子を含有することを除き、基本的に上記のようなコンストラクトを指す。
【００１８】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、そのＣ末端でＥ．コリの易熱性エンテロトキシンのＢサブユニットに融合させられた、そのＧＰＩアンカーコード配列を欠くヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列、ならびに最小ｐＵＣ骨格を含有する、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す。
【００１９】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ」という表示は、そのコンストラクトが、野生型ヒトＣＥＡ遺伝子の対応部分の代わりに、そのＧＰＩアンカーコード配列を欠くコドン最適化されたヒトＣＥＡ遺伝子を含有することを除き、基本的にすぐ上で述べたようなコンストラクトを指す。
【００２０】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔ」という表示は、ヒト細胞において高レベルで発現させるためにＣＥＡ配列及びＬＴＢ配列の両方がコドン最適化されていることを除き、基本的にすぐ上で述べたようなプラスミドコンストラクトを指す。
【００２１】
「ｐＶ１Ｊ／ｒｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔ」という表示は、ヒトコドン最適化ＣＥＡ遺伝子が、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されたアカゲザルＣＥＡ遺伝子で置換されていることを除き、基本的に上記のようなコンストラクトを指す。
【００２２】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、そのＣ末端でＥ．コリの易熱性エンテロトキシンのＡサブユニットに融合させられた、ＧＰＩアンカーコード配列を欠くヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列ならびに最小ｐＵＣ骨格を含有する、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す。様々なＣＥＡ−ＬＴ融合体を含有するプラスミドベクターの構築は、実施例２で述べる。
【００２３】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＤＯＭ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、そのＣ末端で破傷風トキソイド（ＤＯＭ）の断片ＣのＮ末端ドメインに融合させられた、そのＧＰＩアンカーコード配列を欠くヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列ならびに最小ｐＵＣ骨格を含有する、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す（実施例２）。
【００２４】
「ｐＶ１Ｊ／ｒｈＣＥＡｏｐｔ−ＤＯＭｏｐｔ」という表示は、ヒトコドン−最適化ＣＥＡ遺伝子が、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されたアカゲザルＣＥＡ遺伝子で置換されていることを除き、基本的に上記のようなコンストラクトを指す。
【００２５】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ」という表示は、イントロンＡを有するＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、そのＣ末端で免疫グロブリンＧ１の定常鎖の重鎖断片に融合させられている、ＧＰＩアンカーコード配列を欠くヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列ならびに最小ｐＵＣ骨格を含有する、本明細書中で開示されるプラスミドコンストラクトを指す。（実施例２）。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＦｃＩｇＧｏｐｔは、ＣＥＡ及びＦｃＩｇＧをコードするヌクレオチド配列が、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されていることを除き、基本的に説明したようなコンストラクトを指す。
【００２６】
「Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ」及び「Ａｄ５／ｈＣＥＡ」という表示は、Ｅ１及びＥ３領域で欠損があるＡｄ５アデノウイルスゲノムを含有する、本明細書中で開示される２つのコンストラクトを指す。「Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ」コンストラクトにおいて、Ｅ１領域は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下で、イントロンＡなしで、Ｅ１と平行な向きに、コドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子、次いでウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化シグナルにより置き換えられている。「Ａｄ５／ｈＣＥＡ」コンストラクトは、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域が野生型ヒトＣＥＡ配列で置き換えられていることを除き、基本的に上記のようなものである。「Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ」という表示は、コドン最適化されたヒトＣＥＡ配列がＧＰＩアンカーコード配列を欠いており、そのＣ末端でＥ．コリの易熱性エンテロトキシンのＢサブユニットに融合させられていることを除き、基本的に上記のようなＡｄ５コンストラクトを指す。様々なＣＥＡ−ＬＴ融合体を含有するアデノウイルスベクターの構築は実施例３で述べる。
【００２７】
「免疫増強因子」とは、本発明のＣＥＡ融合タンパク質の、全長野生型ＣＥＡと比較して、関連ＣＥＡタンパク質に対する免疫反応を刺激又は促進することができる部分を指す。本発明の免疫増強因子は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される。「免疫増強因子」という用語は、本明細書中で、「アジュバント」という用語と交換可能に使用される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、一方のポリペプチドが１つのタンパク質配列又はドメイン由来であり、他方のポリペプチドが第二のタンパク質配列又はドメイン由来である、共有結合する少なくとも２個のポリペプチドを有するタンパク質を指す。本発明の融合タンパク質は、ＣＥＡポリペプチドもしくは断片又はそれらの変異体及び第二のポリペプチドを含有し、その第二のポリペプチドは、ある場合においては、細菌性毒素である、免疫増強因子の大部分を含有する。ＣＥＡポリペプチド、断片又はそれらの変異体は、ヒトＣＥＡ又は別の種由来のＣＥＡホモローグであり得る。この融合タンパク質を含有するポリペプチドは、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に連結する。ＣＥＡポリペプチド及び毒素サブユニットは、いかなる順番でも融合され得る。本発明のある実施形態において、図１Ａで例示されるように、ＣＥＡポリペプチドのＣ末端を毒素サブユニットのＮ末端に融合させる。しかし、免疫増強因子がＣＥＡポリペプチドのＮ末端に融合する融合タンパク質もまたもくろまれている。「ＣＥＡ融合タンパク質」という用語は、上述のような融合体を指す一般用語であるものとし、これには、免疫増強因子を含有するポリペプチドに融合させられた、ＣＥＡポリペプチドもしくは断片又はそれらの変異体が含まれる。
【００２９】
「ＣＥＡ−ＬＴ融合体」という用語は、ＣＥＡ遺伝子の少なくとも一部が、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＬＴＡ又はＬＴＢサブユニットのいずれかの大部分と融合させられている、核酸配列を指す。「ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質」という用語は、述べられているようなＣＥＡ−ＬＴ融合体によりコードされているポリペプチドを指す。「ＣＥＡ−ＬＴ融合体」及び「ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質」という用語はまた、１又は複数のアミノ酸が挿入、欠失又は他のアミノ酸で置換されているものなど、それらの断片、それらのホモローグ及びそれらの機能的同等物（まとめて「変異体」と呼ぶ。）を指すと理解されたい。本発明のＣＥＡ−ＬＴ融合体は、ヒトなどの哺乳動物に投与する際、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞障害性Ｔ細胞による免疫反応を刺激することができるか、又は少なくとも「野生型」ＣＥＡ配列と同等に抗体産生を刺激することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡ−ＬＴ融合体は、野生型ＣＥＡと比較して、免疫反応を促進することができる。
【００３０】
「ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体」という用語は、該用語がタンパク質配列を指すと文脈により明確に示されない限り、少なくともＣＥＡ遺伝子の一部が、破傷風毒素断片Ｃの最小化ドメインの大部分に融合させられている、核酸配列を指す。「ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質」という用語は、述べられているようなＣＥＡ−ＤＯＭ融合体によりコードされるポリペプチドを指す。
【００３１】
「ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体」及び「ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質」という用語はまた、１又は複数のアミノ酸が挿入、欠失又は他のアミノ酸で置換されているものなど、それらの断片、それらのホモローグ及びそれらの機能的同等物（まとめて「変異体」と呼ぶ。）を指すと理解されたい。本発明のＣＥＡ−ＤＯＭ融合体は、ヒトなどの哺乳動物に投与する際、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞障害性Ｔ細胞による免疫反応を刺激することができるか、又は少なくとも「野生型」ＣＥＡ配列と同等に抗体産生を刺激することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体は、野生型ＣＥＡと比較して、免疫反応を促進することができる。
【００３２】
「ＡＤ」という略語は、ＣＥＡ遺伝子又はタンパク質のアンカードメインを指す。野生型ヒトＣＥＡのアンカードメインは、配列番号２０のおよそアミノ酸６７９からおよそアミノ酸７０２に位置する。
【００３３】
「処置」という用語は、治療的処置及び予防もしくは防御的手段の両方を指す。処置を必要とするものには、既に疾患に罹患しているもの、ならびにその疾患に罹患しやすいもの又はその疾患を防ぐべきものが含まれる。
【００３４】
「疾患」とは、本明細書中に記載の核酸分子及び該核酸分子によりコードされる融合タンパク質を含む、本発明の分子を用いた治療により利益を受けるあらゆる状態である。問題の疾患に哺乳動物が罹患しやすくなる病的状態を含む、慢性及び急性疾患もしくは疾病は、「疾患」という用語により包含される。本発明の分子は、乳癌、結腸直腸癌及び肺癌を含むがこれらに限定されない、異常な細胞増殖を特徴とする疾患又は状態の処置としての使用を意図するものである。
【００３５】
「有効量」という用語は、免疫反応が起こるように、本ポリペプチドの適切なレベルを得るために十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。当業者は、このレベルが変化し得ることを理解するであろう。
【００３６】
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基の、別の化学的に類似のアミノ酸残基による置換を指す。そのような保存的置換の例は、ある疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）の、別のものへの置換；ある極性残基の、同じ電荷の別の極性残基への置換（例えば、リジンに対してアルギニン；アスパラギン酸に対してグルタミン酸）である。
【００３７】
「ｈＣＥＡ」及び「ｈＣＥＡｏｐｔ」は、ヒト癌胎児性抗原及びヒトコドン最適化癌胎児性抗原をそれぞれ指す。
【００３８】
「ｒｈＣＥＡ」及び「ｒｈＣＥＡｏｐｔ」は、アカゲザル癌胎児性抗原及びアカゲザルコドン最適化癌胎児性抗原をそれぞれ指す。
【００３９】
「実質的に同等」とは、配列について、ある核酸又はアミノ酸配列が、参照配列と、少なくとも、７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の同一性を有することを意味する。本発明において、参照配列は、その文章の文脈により決定されるとおり、野生型ヒトＣＥＡヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の関連部分、又は細菌毒素もしくはそのサブユニットの野生型ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列、例えばＥ．コリの易熱性エンテロトキシンの、ＬＴＢもしくはＬＴＡサブユニット、であり得る。この参照配列はまた、例えば、野生型アカゲザルＣＥＡ配列でもあり得る。したがって、野生型ヒトＣＥＡタンパク質又はその断片に対して「実質的に同等」であるＣＥＡタンパク質配列は、野生型ヒトＣＥＡの関連断片と、その断片に沿って、少なくとも７５％の同一性、好ましくは、８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、さらにより好ましくは９５％の同一性を有する。あるＣＥＡ、ＬＴＢもしくはＬＴＡタンパク質又はヌクレオチド配列が、参照配列に対して「実質的に同等」であるか否かは、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能。）などの、配列解析ソフトウェアを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。このＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により改訂されたような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を利用している。
【００４０】
遺伝子、変異体、断片又はそのサブユニットの「大部分」とは、参照配列の、少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％及びさらにより好ましくは９５％の部分を意味する。
【００４１】
「遺伝子」とは、そのヌクレオチド配列がポリペプチド分子をコードする核酸分子を指す。遺伝子は、ヌクレオチドの連続配列であり得るか、又はそれらは、イントロン、プロモーター領域、スプライシング部位及び反復配列などの中断セグメントを含み得る。遺伝子はＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る。好ましい遺伝子は、本発明のペプチドをコードするものである。
【００４２】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、それらの断片もしくは一部及びプライマーであるものとする。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はゲノムＤＮＡのいずれか、例えばＣＥＡ融合タンパク質をコードする遺伝子、であり得る。
【００４３】
「野生型ＣＥＡ」又は「野生型部分」又は「ｗｔタンパク質」とは、天然に生じるアミノ酸配列もしくはそれらの変異体を含むタンパク質を指す。野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、図７Ｅ（配列番号２０）に示す。野生型アカゲザルＣＥＡのアミノ酸配列は、既に述べられている（ＷＯ２００４／０７２２８７、図７Ａ−７Ｂ参照。）。
【００４４】
「野生型ＣＥＡ遺伝子」とは、ヒト由来のタンパク質又は別の生物（これらに限定されないが、ラット、マウス及びアカゲザルなどの哺乳動物を含む。）から得られたタンパク質を含む、天然に生じるＣＥＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する遺伝子を指す。ヒトＣＥＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、本技術分野（前出）で入手可能である。Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２２１−３２３０（１９８７）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９２０−９２４（１９８７）；及びＴｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（９）：２９６５−６９（１９８７）も参照のこと。野生型アカゲザル遺伝子のヌクレオチド配列は、図７Ｃから７Ｄで示す。
【００４５】
「哺乳動物」という用語は、ヒトを含むあらゆる哺乳動物を指す。
【００４６】
「Ａｇ」という略語は、抗原を指す。
【００４７】
「Ａｂ」及び「ｍＡｂ」という略語は、抗体及びモノクローナル抗体をそれぞれ指す。
【００４８】
「ＯＲＦ」という略語は、遺伝子のオープンリーディングフレームを指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、腺癌の発生に共通して関連している。本発明は、ＣＥＡ腫瘍関連抗原により発現されるタンパク質産物に対する免疫を誘導又は促進するための、組成物及び方法に関する（異常なＣＥＡ発現は、癌腫又はその発生に関与する。）。腫瘍発生時に異常なＣＥＡ発現が存在し得、腫瘍進行の後期には検出できないか、又はその逆であるので、異常なＣＥＡ発現と癌腫との関連には、ＣＥＡタンパク質がその発生の全時間点で腫瘍組織において発現されていることは必要ではない。
【００５０】
このために、本発明は、癌の治療及び／又は予防に対する、ワクチン及び医薬組成物における使用のための、ＣＥＡ配列もしくはそれらの変異体を含有する、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞及びコードされるタンパク質を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、関連ＣＥＡに対する免疫反応を効果的に促進することができる、細菌性エンテロトキシン又はその大部分などの、免疫増強因子の少なくともサブユニットをコードするヌクレオチド配列に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００５１】
本発明のＣＥＡヌクレオチド配列は、ヒト由来のものであり得るか、又は別の種由来のＣＥＡホモローグであり得る。野生型ヒトＣＥＡヌクレオチド配列が報告されている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号；米国特許第５，５７１，７１０号；及び米国特許第５，８４３，７６１号を参照のこと。）。アカゲザルＣＥＡ配列が最近報告された（ＷＯ２００４／０７２２８７）。ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分は、全長であるか、又は哺乳動物においてＣＥＡ特異的免疫反応を誘導するのに十分なあらゆる変異体であり得る。本発明のＣＥＡ変異体には、これらに限定されないが、Ｃ末端又はＮ末端切断型配列、保存的置換がある配列及び内部欠失又は挿入がある配列が含まれる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分は、ヒトＣＥＡ又はその機能的同等物である。他の好ましい実施形態において、このＣＥＡ部分は、アカゲザルＣＥＡ又はその機能的同等物である。
【００５３】
したがって、本発明は、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する合成ポリヌクレオチドに関し、該融合タンパク質は、ＣＥＡタンパク質に対する免疫反応を効果的に促進することができる、免疫増強因子又はそのサブユニットに融合させられている、ＣＥＡタンパク質もしくは生物学的活性断片もしくはＣＥＡタンパク質の突然変異形態を含有する。ＣＥＡタンパク質の該突然変異形態には、これらに限定されないが、保存的アミノ酸置換、アミノ末端切断、カルボキシ末端切断、欠失又は付加が含まれる。あらゆるそのような生物学的活性断片及び／又は突然変異体は、少なくとも実質的に、配列番号２０に記載のＣＥＡタンパク質の免疫学的特性を模倣する、タンパク質又はタンパク質断片のいずれかをコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療又は予防的癌ワクチンの開発において有用であるように、機能的ＣＥＡ融合タンパク質を発現する、ｍＲＮＡ分子をコードする。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態において、コードされるＣＥＡ融合タンパク質のＣＥＡ部分は、ヒトＣＥＡ（配列番号２０）もしくはその機能的同等物、例えば、そのＣ末端アンカードメイン（ＡＤ）が欠失したヒトＣＥＡ（配列番号２３）であり、それは、ヒト全長ＣＥＡの、およそアミノ酸６７９からおよそアミノ酸７０２に位置する。理論にとらわれないが、アンカードメインの欠失により、ＣＥＡ融合タンパク質の分泌が増加し、それにより、ＣＥＡ−ＬＴＢ免疫反応のクロスプライミングが促進される。他の好ましい実施形態において、ＣＥＡ部分は、アカゲザルＣＥＡ（配列番号１８及び１９）又はその機能的同等物である。
【００５５】
本発明のＣＥＡ融合タンパク質の免疫増強因子部分は、関連ＣＥＡタンパク質に対する免疫反応を刺激又は促進することができ、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖の重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分は、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）を含有し、ともに送達される抗原の免疫原性を強力に増強することが示されている。さらなる好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分は、ＬＴのサブユニット又はそれらの大部分を含む。またさらに好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分は、ＦｃＩｇＧの大部分である。
【００５６】
破傷風毒素の単一エピトープ（Ｑ８３０−Ｌ８４４）に融合させられた末端切断型ヒトＣＥＡを含むＣＥＡ融合体が記載されている（Ｌｕｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：３６５−３７６（２００３））。この単一エピトープ融合体とは異なり、本発明のＣＥＡ融合体は、上述のように、免疫増強因子の大部分又はそのサブユニットを含み、それは、ＣＥＡタンパク質又はその変異体の免疫原性を増強することができる。本明細書中に記載されている、組成物及び方法に対して使用される免疫増強因子の大部分には、全長毒素サブユニットの５０％未満のものは含まれない。融合ＣＥＡ配列に対してより大きい免疫反応を確実にするために、全長アジュバントサブユニット又はその大部分を利用する、本明細書中で使用されるストラテジーを用いた。理論にとらわれないが、アジュバントとして選択される細菌性毒素が１個のヘルパーエピトープより大きいものを含む場合、その融合タンパク質の毒素配列を１個のエピトープに制限することにより、おそらく、標的タンパク質の免疫原性に対する効果が低下することになると考えられている。さらに、免疫反応のアジュバント媒介増強が、特異的細胞受容体とのアジュバントの相互作用に依存し、普遍的なエピトープに基づくものでない場合、受容体相互作用は、アジュバント効果を与えるために免疫増強因子の大部分を必要とする、特異的な構造配置に依存し得ると考えられる。このような場合、１個のエピトープを含有する短いアジュバント配列は、免疫反応の増強を媒介するには不十分である。
【００５７】
これらに限定する必要はないが、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端切断及びカルボキシ末端切断を含む、本明細書中に記載の免疫増強因子の変異体又は突然変異体をコードするヌクレオチド配列もまた、本発明における使用がもくろまれる。ある場合において、コードされるタンパク質の毒性を低下又は排除するために、アジュバント又はそのサブユニットをコードするヌクレオチド配列に対して特異的な点突然変異を付加することは、有利であり得る。本発明のこの態様の典型的実施形態において、ＬＴサブユニットは、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ配列に融合させられ、ここでＬＴサブユニットは、そのシグナル配列が末端切断されている。理論にとらわれないが、毒素シグナル配列、例えばＬＴＢシグナル配列を欠失させることにより、ＣＥＡ融合体の翻訳後プロセシングがＣＥＡシグナル配列により駆動されることが確実になる。
【００５８】
免疫増強因子、サブユニット又はその大部分を、ＣＥＡ配列の、アミノ末端又はカルボキシ末端に融合させ得る。さらに、免疫増強因子配列及びＣＥＡ配列を、Ｎ末端からＮ末端、Ｃ末端からＣ末端、Ｃ末端からＮ末端又はＮ末端からＮ末端で融合させることができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＡポリペプチドのＣ末端を免疫増強因子のＮ末端に融合させる。
【００５９】
本発明は、新規ＣＥＡ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；例えば配列番号８、１０、１３、１５、４５、４６、５１及び５３に記載のような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する、合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の核酸分子は、実質的にその他の核酸を含まない。
【００６０】
本発明はまた、本願を通して開示される核酸分子を含有する、組み換えベクター及び組み換え宿主細胞（原核及び真核の両方）に関する。本発明の、合成ＤＮＡ分子、関連ベクター及び宿主は、癌ワクチンの開発に有用である。
【００６１】
代表的な本発明の核酸分子は、本発明の代表的なＣＥＡ−ＬＴＡ、ＣＥＡ−ＬＴＢ、ＣＥＡ−ＤＯＭ、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ及びＣＥＡ−ＣＴＢ融合タンパク質をコードする、図２から６、２６から２７、３０から３２で示すような、配列番号７、９、１１、１２、１４、２１、２５、４９、５０及び５２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
本発明はまた、代表的なＣＥＡ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする、配列番号７、９、１１、１２、１４、２１、２５、４９、５０及び５２の、生物学的活性断片又は突然変異体も含む。あらゆるそのような生物学的活性断片及び／又は突然変異体は、少なくとも、これに限定されないが配列番号２０に記載のｈＣＥＡタンパク質を含む、ｈＣＥＡタンパク質の医薬特性を実質的に模倣する、タンパク質又はタンパク質断片のいずれかをコードする。あらゆるそのようなポリヌクレオチドには、これらに限定する必要はないが、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端切断及びカルボキシ末端切断が含まれる。本発明の突然変異は、癌ワクチン開発に有用であるように、真核細胞において機能的ＣＥＡ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００６３】
発現されるタンパク質の究極的な物理的特性を実質的に変化させないＤＮＡ配列における突然変異も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、バリンのロイシンへの置換、アルギニンのリジンへの置換又はアスパラギンのグルタミンへの置換は、そのポリペプチドの機能において変化を生じ得ない。
【００６４】
上述のように、本発明はさらに、本願を通して開示する核酸分子を含有する組み換えベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡから構成され得る。殆どのクローニング目的に対して、ＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターには、プラスミド、改変ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体及び、ＣＥＡ融合タンパク質をコードすることができる、エピソーム性又は統合ＤＮＡのその他の形態が含まれる。
【００６５】
特定の遺伝子導入又はその他の使用に対して適切なベクターを決定することは、当業者の範囲内である。
【００６６】
本願を通して開示する核酸によりコードされる、精製ＣＥＡ融合タンパク質もまた本発明により提供される。本発明のこの態様の代表的な実施形態において、ＣＥＡ融合タンパク質は、配列番号８、１０、１３、１５、４５、４６、５１及び５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６７】
厳格な条件下で配列番号７、９、１１、１２、１４、２１、２５、４９、５０又は５２にハイブリダイズするＤＮＡ配列が、本発明に含まれる。一例として、また限定するものではないが、高ストリンジェンシーの条件を用いる手段は次のとおりである。約６５℃にて、約２時間から一晩、６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で、ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを行う。６５℃にて、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び３２Ｐ標識プローブ ５から２０ｘ１０６ｃｐｍを含有するプレハイブリダイゼーション混合液中で、約１２時間から４８時間、フィルターをハイブリダイズさせる。３７℃にて約１時間、２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中でフィルターを洗浄する。この次に、５０℃にて４５分間、オートラジオグラフィーの前に、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する。高ストリンジェンシーの条件を用いるその他の手段には、約４２℃にて５ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０％ ホルムアミド中で約１２時間から４８時間ハイブリダイゼーション段階を行うか、又は約６５℃にて約３０分間から６０分間、０．２ｘＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ中で洗浄段階を行うかのいずれかが含まれる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを行うための、前述の手段において述べた試薬は、本技術分野で周知である。これらの試薬の組成の詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第二版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）又はＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第三版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）で見出すことができる。前述のものに加えて、使用し得る高ストリンジェンシーのその他の条件もまた本技術分野で周知である。
【００６８】
組み換え宿主細胞におけるＣＥＡ融合タンパク質の高レベル発現のために、ＣＥＡ融合タンパク質コード核酸分子を含有する発現ベクターを使用し得る。発現ベクターには、これらに限定されないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミド又はウイルスが含まれ得る。様々な細菌性発現ベクターもまた、所望する場合、組み換えＣＥＡ融合体配列を細菌細胞において発現させるために使用し得る。さらに、組み換えＣＥＡ融合体配列を真菌細胞において発現させるために様々な真菌細胞発現ベクターを使用し得る。さらに、組み換えタンパク質を昆虫細胞において発現させるために、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用し得る。
【００６９】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含有するベクターを用いて形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞にも関する。組み換え宿主細胞は、原核又は真核であり得、これらに限定されないが、Ｅ．コリなどの細菌、酵母などの真菌細胞、これらに限定されないがウシ、ブタ、サル及びげっ歯類由来の細胞株を含む哺乳動物細胞；及びこれらに限定されないがハエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びカイコ由来の細胞株を含む昆虫細胞が含まれる。ＣＥＡ融合タンパク質又は生物学的同等形態を生成させるのに適切な条件下でこのような組み換え宿主細胞を培養することができる。本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞はヒトである。本明細書中で定義される場合、「宿主細胞」という用語は、トランスジェニックヒト、ヒト胎児又はヒト胚の身体における宿主細胞を含むものではない。
【００７０】
上述のように、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ融合タンパク質を発現させるために、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用し得る。したがって、本発明の別の態様は、（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を含むベクターを、適切なヒト宿主細胞に導入することと（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、免疫増強因子の大部分又はそのサブユニットに融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し、該免疫増強因子又はそのサブユニットは、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択され；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）前記ヒトＣＥＡ融合タンパク質の発現が可能となる条件下で該宿主細胞を培養することと、を含む、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ融合タンパク質を発現させるためのプロセスである。
【００７１】
本発明のこの態様での使用のための好ましい免疫増強因子は、ＬＴＢ、ＬＴＡ、ＤＯＭ及びＦｃＩｇＧからなる群から選択される。
【００７２】
本発明のこの態様のさらに好ましい実施形態において、前記融合体のＣＥＡ部分のヌクレオチド配列及び／又は前記融合体の免疫増強因子のヌクレオチド配列は、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。
【００７３】
本発明はまた、（ａ）ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を含むベクターを、適切なヒト宿主細胞に導入することと（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＬＴサブユニットの大部分に融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）前記ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質の発現が可能となる条件下で該宿主細胞を培養することと、を含む、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質を発現させるためのプロセスも提供する。
【００７４】
上述のＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質を発現するためのプロセスの好ましい実施形態において、ＬＴサブユニットは、ＬＴＢの大部分であり、ＬＴＢ配列は、そのシグナル配列が欠失している。他の実施形態において、ＬＴサブユニットはＬＴＡ又はその大部分である。
【００７５】
本発明はまた、（ａ）ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を含むベクターを、適切なヒト宿主細胞に導入することと（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、破傷風毒素の断片Ｃ（ＤＯＭ）のＮ末端ドメインの大部分に融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）該ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質の発現が可能となる条件下で該宿主細胞を培養することと、を含む、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質を発現させるためのプロセスも提供する。
【００７６】
上述のＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質を発現させるためのプロセスの好ましい実施形態において、ＤＯＭ部分は、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。他の好ましい実施形態において、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分は、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。またさらに好ましい実施形態において、ＣＥＡ及びＤＯＭ部分の両方が、ヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。
【００７７】
宿主細胞におけるＣＥＡ融合体の発現の後、活性型でＣＥＡ融合タンパク質を提供するために、ＣＥＡ融合タンパク質を回収し得る。いくつかのタンパク質精製手段を利用することができ、それらは、使用に適切である。塩析による分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの、様々な組合せ、又は個別での使用により、細胞溶解液及び抽出物から組み換えタンパク質を精製し得る。さらに、ＣＥＡタンパク質又はＣＥＡタンパク質のポリペプチド断片に特異的な、モノクローナル又はポリクローナル抗体でできた免疫アフィニティーカラムを用いることにより、他の細胞性タンパク質から、組み換えＣＥＡ融合タンパク質を分離することができる。
【００７８】
ＣＥＡ融合体を含有する核酸分子及びコードされる本発明の融合タンパク質は、ワクチン開発における使用のために、ＣＥＡをコードする全長ｃＤＮＡと比較して、ＣＥＡ特異的免疫反応を促進するように設計した。本発明のＣＥＡ融合体配列の免疫原特性をさらに促進するために、本明細書中に記載のある実施形態において、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、下記のように、宿主細胞におけるさらなる高レベル発現のための最適化コドンを含有する。これらの実施形態において、少なくともＣＥＡ融合体のコドンの一部は、企図される宿主細胞により好まれるコドンを使用するように設計され、好ましい実施形態において、企図される宿主細胞はヒト細胞である。組み換えアデノウイルス又はプラスミドに基づくＤＮＡワクチンの開発のために、最適化ＣＥＡ融合体を使用し得、それにより、中和抗体及び細胞性免疫を介して、ＣＥＡ関連癌に対する効果的な免疫学的予防が行われる。免疫原性組成物として合成分子を使用し得る。本発明は、インビボで、霊長類及びヒトなどの哺乳動物を含む脊椎動物に直接導入された際に、動物内でコードタンパク質の発現を誘導する、コドン最適化されたＣＥＡ融合体ポリヌクレオチドを与える。
【００７９】
上述のように、本発明のある実施形態において、本合成分子は、ヌクレオチド配列を含み、そのヌクレオチドのいくつかは、ヒト細胞により好まれるコドンを使用するように改変されており、したがって、ヒト宿主細胞において融合タンパク質が高レベルに発現されるようになる。例えば、中和抗体及び細胞性免疫を介して、ＣＥＡ関連癌腫に対する効果的な免疫予防を与えるための癌ワクチンにおいて使用され得る、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合タンパク質など、ＣＥＡ融合タンパク質のソースとして、本合成分子を使用し得る。本明細書中で開示される核酸分子も、ＤＮＡに基づく癌ワクチンに対する基礎として働き得る。
【００８０】
４個の可能なヌクレオチドベースの「トリプレット」コドンは、６０種類を超える様々な形態で存在し得る。これらのコドンは２０個のみの異なるアミノ酸（ならびに転写開始及び終結）に対するメッセージを与えるので、アミノ酸の中には複数のコドンによりコードされ得るアミノ酸があるが、これは、コドン重複として知られる現象である。完全には理解されていない理由で、代替的コドンは、様々なタイプの細胞の内在性ＤＮＡにおいて均一に存在していない。実際に、ある一定のタイプの細胞において、ある一定のコドンに対する可変の自然のヒエラルキー又は「優先性」が存在すると思われる。一例として、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ及びＴＴＧを含む６種類のＤＮＡコドンのいずれかにより特定される。微生物に対するゲノムコドン頻度の網羅的分析により、Ｅ．コリの内在性ＤＮＡはＣＴＧのロイシン特定コドンを最もよく含有し、一方、酵母及びスライム（ｓｌｉｍｅ）のＤＮＡは、ＴＴＡロイシン特定コドンを最もよく含有する。このヒエラルキーの観点において、Ｅ．コリ宿主によるロイシンリッチなポリペプチドの高レベル発現を得る可能性は、ある程度コドン使用の頻度に依存すると、一般に考えられる。例えば、ＴＴＡコドンが豊富な遺伝子は、Ｅ．コリにおいてあまり発現されず、一方で、ＣＴＧ豊富な遺伝子はおそらくこの宿主において高いレベルで発現されると思われる。同様に、酵母宿主細胞において、ロイシンが豊富なポリペプチドの発現に対する好ましいコドンはＴＴＡである。
【００８１】
組み換えＤＮＡ技術におけるコドン優先現象により起こるであろう結果は明白であり、この現象により、成功裡に形質転換された宿主生物において外来遺伝子の高レベル発現を達成できなかった以前の多くの失敗が説明され得る−つまり、挿入された遺伝子においてあまり「好ましく」ないコドンが繰り返し存在し得、発現のための宿主細胞機構が効率的に機能し得ない。この現象から、企図される宿主細胞の好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子により、組み換えＤＮＡ技術を実行するための、外来遺伝物質の最適な形態が与えられることが示唆される。このように、本発明のある態様は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化された、ＣＥＡ融合遺伝子である。本発明の好ましい実施形態において、同じタンパク質配列をコードする代替的コドンの使用によりヒト細胞における外来ＣＥＡ融合タンパク質の発現での制約が取り除かれ得ることが見出された。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＣＥＡ融合タンパク質をコードする核酸分子は、Ｌａｔｈｅ、”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ“Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．１８３：１−１２（１９８５）（参照により本明細書中に組込まれる。）により述べられているように、同一の翻訳配列を有するが代替的コドンが使用されるポリヌクレオチド配列に変換される。この方法は、通常、高発現されたヒト遺伝子を伴わない野生型配列においてコドンを同定することと、ヒト細胞での高発現のために、それらを最適のコドンで置換することと、からなる。次に、新規遺伝子配列において、これらのコドン置換により生成した好ましくない配列について調べる（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライシング認識部位の不用意な生成、無用の制限酵素部位など。）。存在するコドンを、同じアミノ酸に対する異なるコドンを用いて置換することにより、好ましくない配列を削除する。次に、発現の向上性について合成遺伝子セグメントを試験する。
【００８３】
ＣＥＡ融合タンパク質をコードする合成遺伝子配列を作製するために、上述の方法を使用し、結果として遺伝子が高レベル発現のために最適化されたコドンを含むようになった。上記の手段により、癌ワクチンにおける使用のためのコドン最適化された遺伝子を設計するための発明者らの方法の要約が与えられるが、一方で、その手段を少し改変することにより、又はその配列を少し改変することにより、同様のワクチン効率又は遺伝子の発現上昇を為し得ることを当業者は理解するであろう。
【００８４】
当業者はまた、ヒト細胞におけるＣＥＡ融合体の高レベル発現のために与えられるさらなる核酸分子が構築され得、そのＤＮＡ分子のコドンの一部のみがコドン最適化されることを認識するであろう。例えば、本発明のあるいくつかの実施形態において、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分を構成するコドンは、ヒト細胞での高レベル発現のために最適化され、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分を構成するコドンは、実質的に野生型アジュバントコードヌクレオチド配列と同様である。本発明の他の実施形態において、ＣＥＡ融合体のアジュバント部分を構成するコドンは、ヒト細胞での高レベル発現のために最適化され、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ部分を構成するコドンは、実質的に野生型ＣＥＡ遺伝子と同様である。本発明のさらに他の実施形態において、ＣＥＡ融合体のＣＥＡ及びアジュバント部分の両方がヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化される。ＣＥＡ融合体のＣＥＡ及び／又はアジュバント部分内でコドンのサブセットのみが最適化されているＣＥＡ融合体もまた、本発明によりもくろまれる。
【００８５】
本発明の核酸を、ヒト細胞において本タンパク質を効率的に発現するように設計された配列を含む発現カセットにまとめ得る。このカセットは、好ましくは、プロモーター及びターミネーター配列など、操作可能に連結された関連転写及び翻訳調節配列とともに、ＣＥＡ融合タンパク質コード遺伝子を含有する。好ましい実施形態において、本プロモーターは、イントロンＡ配列（ＣＭＶ）のないサイトメガロウイルスプロモーターであるが、強力な免疫グロブリン又はその他の真核遺伝子プロモーターなどの、あらゆる多くのその他の公知のプロモーターを使用し得ることを当業者は認識するであろう。好ましい転写ターミネーターは、ウシ成長ホルモンターミネーターであるが、その他の公知の転写ターミネーターも使用し得る。ＣＭＶ−ＢＧＨターミネーターの組合せが特に好ましい。
【００８６】
本発明によると、ＣＥＡ融合体発現カセットがベクターに挿入される。本ベクターは、好ましくは、アデノウイルス又はプラスミドベクターであるが、プロモーターに連結する線状ＤＮＡ又はアデノ関連ウイルスもしくは改変ワクシニアウイルス、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターなどの他のベクターもまた使用し得る。
【００８７】
選択されたベクターがアデノウイルスである場合、そのベクターは、いわゆる第一世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターの特徴は、非機能的Ｅ１遺伝子領域を有し、好ましくはアデノウイルスＥ１遺伝子領域が欠失していることである。あるいくつかの実施形態において、本発現カセットが、アデノウイルス遺伝子が正常に位置する位置に挿入される。さらに、これらのベクターは、場合によっては、非機能的Ｅ３領域を有するか、又はＥ３領域が欠失している。使用されるアデノウイルスゲノムにおいてＥ１及びＥ３領域両方が欠失している（ΔＥ１ΔＥ３）ことが好ましい。このアデノウイルスは、ウイルス性Ｅ１遺伝子を発現する、２９３細胞もしくはＰＥＲＣ．６細胞、又は外来タンパク質を発現するように一時的に、もしくは安定的に形質転換された、２９３細胞もしくはＰＥＲＣ．６細胞由来の細胞株などの、公知の細胞株において複製させることができる。例えば、テトラサイクリン制御可能プロモーター系など、遺伝子発現が調節されるコンストラクトを使用する場合、細胞株は制御系に関与する成分を発現し得る。そのような細胞株の一例は、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３であり；その他のものが本技術分野で公知である。
【００８８】
アデノウイルスベクターの操作における便宜のために、本アデノウイルスは、シャトルプラスミド形態であり得る。本発明はまた、プラスミド部分及び、Ｅ１が欠失しており場合によってはＥ３が欠失しており、ＣＥＡ融合タンパク質コードヌクレオチド配列を含む発現カセットが挿入されているアデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルス部分を含む、シャトルプラスミドベクターに関する。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターを容易に除去できるように、本プラスミドのアデノウイルス部分に隣接する制限部位がある。このシャトルプラスミドは、原核細胞又は真核細胞において複製し得る。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態において、本発現カセットをｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０アデノウイルスプラスミド（参照により本明細書に組込まれる、Ｅｍｉｎｉら、ＷＯ０２／２２０８０を参照のこと。）に挿入する。このプラスミドは、Ｅ１及びＥ３領域が削除されているＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む。最適化ウイルスパッケージングにおいて重要であると分かったエレメントを組み込むために、５’シス−作用パッケージング領域をさらにＥ１遺伝子に拡張することにより、既存のアデノベクターを凌ぐように、ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０プラスミドの設計を改善し、その結果、ウイルス増幅が向上した。有利に、この増強アデノウイルスベクターは、高継代増殖後に遺伝的安定性を維持することができる。
【００９０】
ＤＮＡコンストラクトを調製し精製するための分子生物学の標準的技術により、本発明の、アデノウイルス、シャトルプラスミド及びＤＮＡ免疫原を調製することができる。
【００９１】
本発明によると、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシンのＬＴＡもしくはＬＴＢサブユニットの大部分を含有する、本明細書中に記載のＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質コード分子（例えば配列番号１２）が、対応する野生型ＣＥＡ配列と同等の効率で発現されることが分かった（実施例４参照。）。本明細書中で、プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢがｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡよりも高い抗体反応を誘導することも示されており、このことから、ＣＥＡ特異的免疫反応において、ＬＴサブユニットにより与えられるアジュバント効果が確認される（実施例１１参照のこと。）。したがって、本明細書中に記載のデータから、ＬＴＡ又はＬＴＢ ｃＤＮＡへのＣＥＡコード配列の融合の結果、ＣＥＡ特異的免疫反応が向上することが分かる。ＬＴＢが、ＣＤ＋８Ｔ細胞の優勢な誘導を伴う免疫反応での効果をより大きく増強する一方、ＬＴＡは、顕著なＣＤ４＋反応を誘導すると思われる。
【００９２】
本発明によると、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原特性が向上しているので、全長野生型ＣＥＡ ｃＤＮＡと比較して、ＣＥＡ自己抗原に対する寛容性をより効率的に打破することができることも示された。免疫原特性におけるＬＴＢの増強効果はまた、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の完全にコドン最適化されたｃＤＮＡを担うプラスミドの注入においても観察された。最後に、ＣＥＡ−ＬＴ融合体を担うアデノウイルスベクターを用いた、本明細書中に記載の結果から、ＣＥＡ−ＬＴ融合体の免疫原性を向上させるのは、プラスミドＤＮＡ免疫付与に限定されないことが示される（実施例１３を参照のこと。）。
【００９３】
本発明によると、プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＤＯＭ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧが、ＣＥＡよりも、ＣＥＡ特異的な、細胞性及び液性免疫反応を大きく誘導することがさらに示された（実施例１５を参照のこと。）。本発明によると、ＣＥＡ融合体の免疫原特性が向上しているために、全長野生型ＣＥＡ ｃＤＮＡと比較して、本明細書中に記載の、ＤＯＭ及びＦｃＩｇＧ ＣＥＡ融合体を用いて、ＣＥＡ自己抗原に対する寛容性をより効率的に打破できることも示された。これらの融合タンパク質の免疫原特性の向上は、ＤＮＡ又はＡｄベクターを用いた免疫付与において観察され、このことから、ＣＥＡ−ＬＴ融合体の免疫原性向上が、プラスミドＤＮＡ免疫付与に限定されないことが示される（実施例１６を参照のこと。）。
【００９４】
したがって、異常なＣＥＡ発現を伴う腺癌発生の予防及び／又は存在する癌の治療のための免疫原性組成物及びワクチンにおいて、上述のベクターを使用し得る。本発明のベクターによって、成功裡に形質転換された宿主生物において外来ＣＥＡの高レベル発現を得ることに関する問題を解決することにより、及びヒトなどの哺乳動物に投与した際に免疫反応を増強させることができるＣＥＡ融合タンパク質を提供することにより、ワクチン開発及び市販が実現できるようになる。
【００９５】
このために、本発明のある態様は、ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む、ＣＥＡ関連癌を予防又は治療する方法である（ここで、ＣＥＡ融合タンパク質は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される、免疫増強因子の大部分と融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有するＣＥＡ融合タンパク質であり、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）。
【００９６】
本明細書中に記載の方法の好ましい実施形態において、免疫増強因子は、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＤＯＭ及びＦｃＩｇＧからなる群から選択される。
【００９７】
上述の方法によると、これらに限定されないが、肺癌、乳癌及び結腸直腸癌を含む、あらゆる哺乳動物における癌の治療又は予防のために、本ワクチンベクターを投与し得る。本発明の好ましい実施形態において、該哺乳動物はヒトである。
【００９８】
さらに、当業者は、述べられた治療及び予防方法における使用のために何らかのタイプのベクターを選択し得る。好ましくは、このベクターは、アデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである。本発明の好ましい実施形態において、このベクターは、アデノウイルスＥ１領域に欠失がありアデノウイルスＥ１領域に挿入がある、アデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルスベクターであるが、ここで、この挿入は、（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と（該ＣＥＡ融合タンパク質は、免疫増強因子又はその大部分と融合させられているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し、該免疫増強因子は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム会合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧ１の定常鎖重鎖断片（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）及びＥ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択され、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する発現カセットを含有する。
【００９９】
本発明はさらに、アデノウイルスＥ１領域に欠失がありアデノウイルスＥ１領域に挿入がある、アデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルスワクチンベクターに関し、ここで本挿入は、（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と（該ＣＥＡ融合タンパク質は、免疫増強因子の大部分と融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し、該免疫増強因子は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択され、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する発現カセットを含有する。
【０１００】
本発明の本態様の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ５ベクターである。
【０１０１】
本発明の別の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ６ベクターである。
【０１０２】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２４ベクターである。
【０１０３】
これらに限定されないが、チンパンジーアデノウイルスベクターを含む、ヒト以外の種に天然に感染するアデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルスワクチンベクターもまた、本発明における使用のためにもくろまれる。本発明のこの態様の好ましい実施形態は、ｃｈｉｍｐ Ａｄ３ワクチンベクターである。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、プラスミド部分と発現カセット部分とを含有するワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される、免疫増強因子又はその大部分と融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する。
【０１０５】
本発明のある実施形態において、免疫反応増強を誘導するために、様々な初回刺激／追加免疫の組合せにおいて、本明細書中で開示される、組み換えアデノウイルス及びプラスミドに基づくポリヌクレオチドワクチンを使用する。この場合、「初回刺激及び追加免疫」法においてこの２種類のベクターを投与する。例えば、第一のタイプのベクターを１又は複数回投与し、次に、所定の時間が経過した後（例えば、２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月又はその他の適切な間隔）、第二のタイプのベクターを１又は複数回投与する。好ましくは、それらのベクターは、同じポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組合せをコードする発現カセットを担う。プラスミドＤＮＡもまた使用される実施形態において、本ベクターが、哺乳動物又は昆虫細胞により認識される、１又は複数のプロモーターを含有することが好ましい。好ましい実施形態において、本プラスミドは、これらに限定されないが、ＣＭＶプロモーターなど、強力なプロモーターを含有し得る。合成ＣＥＡ融合遺伝子又は発現されるべきその他の遺伝子をそのようなプロモーターに連結し得る。そのようなプラスミドの例は、述べられているような、哺乳動物発現プラスミド Ｖ１Ｊｎｓ（Ｊ．Ｓｈｉｖｅｒら、ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍ．Ｌｉｕら編、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８−２０８（１９９６）、これを参照により本明細書に組み込む。）である。
【０１０６】
上述のように、免疫反応を誘導するための、単一の治療計画の一部として、アデノウイルスベクターワクチン及びプラスミドワクチンを脊椎動物に投与し得る。このために、本発明は、（ａ）ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）と；ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する第一のベクターを哺乳動物に導入することと；（ｂ）所定の時間を経過させることと；（ｃ）ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）と；ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する第二のベクターを哺乳動物に導入することと、を含む、哺乳動物をＣＥＡ関連癌から防御する方法に関する。
【０１０７】
上述の防御方法のある実施形態において、この第一のベクターはプラスミドであり、第二のベクターはアデノウイルスベクターである。代替的な実施形態において、この第一のベクターはアデノウイルスベクターであり、第二のベクターはプラスミドである。
【０１０８】
上述の方法において、ベクターの各投与を所定の時間あけて、第一のタイプのベクターを複数回投与し得る。このような第一のタイプのベクターの一連の投与に続き、所定の時間が経過した後、第二のタイプのベクターの投与を複数回、行い得る。第一のタイプのベクターでの処置と同様に、第二のタイプのベクターもまた、１回又は、所定の時間間隔の後、複数回与え得る。
【０１０９】
本発明はさらに、（ａ）ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ及びＬＴからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）と；ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する第一のベクターを哺乳動物に導入することと；（ｂ）所定の時間を経過させることと；（ｃ）ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ、ＦｒＣ、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＴ及びＬＴからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられた、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有し；該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）と；ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、を含有する第二のベクターを哺乳動物に導入することと、を含む、ＣＥＡ関連腺癌に罹患している哺乳動物を治療する方法に関する。
【０１１０】
上述の治療方法のある実施形態において、この第一のベクターはプラスミドであり、第二のベクターはアデノウイルスベクターである。代替的な実施形態において、この第一のベクターはアデノウイルスベクターであり、第二のベクターはプラスミドである。
【０１１１】
上述の方法の好ましい実施形態において、本ベクターは、ＣＥＡ−ＬＴ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有し、このＣＥＡ融合タンパク質は、ＬＴサブユニットの大部分に融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有する。さらなる好ましい実施形態において、本ベクターは、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。上述の方法のさらなる好ましい実施形態において、本ベクターは、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有し、このＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭサブユニットの大部分に融合させられている、ＣＥＡタンパク質又はその変異体を含有する。またさらに好ましい実施形態において、本ベクターは、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【０１１２】
ワクチン受容者に導入されるべき、発現可能なＤＮＡ又は転写されるＲＮＡの量は、ある程度、使用されるプロモーターの強さ及び発現される遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般に、プラスミドワクチンベクター 約１ｎｇから１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇから３００μｇという免疫学的もしくは予防的有効用量を直接、筋肉組織に投与する。組み換えアデノウイルスの有効用量は、約１０６から１０１２粒子、好ましくは、約１０７から１０１１粒子である。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した印象（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）及び、腹腔内、静脈内、筋肉内又は吸入送達などの投与のその他の様式ももくろまれる。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態において、筋肉内注射を介して受容者にワクチンベクターを導入する。
【０１１４】
本発明のワクチンベクターは、裸のものであり得る、つまり、何らかのタンパク質又は受容者の免疫系に影響を与えるその他の薬剤と組み合わせられていない。この場合、本ワクチンベクターが、これらに限定されないが、滅菌生理食塩水又は滅菌緩衝生理食塩水などの、生理学的に許容可能な溶液中にあることが望ましい。あるいは、これらに限定されないがカルシウムイオンなど、ＤＮＡの細胞取り込みを補助する薬剤を投与することは有利であり得る。これらの薬剤は、一般にトランスフェクション促進剤及び医薬適合性の担体と呼ばれる。当業者は、特定の薬剤又は医薬適合性の担体ならびに適切な投与時間及び投与様式を決定することができる。
【０１１５】
本明細書中で言及した公表物は全て、本発明に関連して使用され得る方法及び材料を説明し開示する目的のために、参照により組込まれる。明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１１６】
添付の図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態を説明してきたが、本発明がまさにその実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、様々な変更及び改変が当業者によりなされ得ることを理解されたい。
【０１１７】
次の実施例は、本発明を説明するが、限定するものではない。
【実施例１】
【０１１８】
ＣＥＡ融合タンパク質の構築
ＣＥＡ融合タンパク質の免疫原性を決定するため、選択されたポリペプチドのパネルに融合されている、ヒトＣＥＡタンパク質の１から６７９番目のアミノ酸（本明細書中で以下、ａａ）をコードする一連のベクターを構築した（実施例２参照）。様々な実験系において示された、これらの配列の報告された免疫増強特性を考慮して、これらの配列を選択した。前記ＧＰＩアンカー配列を欠失したＣＥＡタンパク質のｃＤＮＡを外来ポリペプチドと連結することによって、前記ＣＥＡ融合体を操作した（典型的なコンストラクトは図１８Ａに示される）。この腫瘍抗原をＨＳＰ７０配列、ＦｃＩｇＧ配列又はＬＡＭＰ配列に連結し、抗原の取り込み又はエンドソーム区画への再ターゲティングの増強により免疫反応増強が起こるか否かを調べた。同様に、液性反応及びＣＤ４＋Ｔ細胞の反応を促進するために、破傷風毒素の断片Ｃ（ＦｒＣ）又は有力に競合するＭＨＣクラスＩ結合エピトープを欠失する最小ドメイン（ＤＯＭ、図２９参照）（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３９０８−１３（２００２））に対する融合を構築した。ウィルス性糖タンパク質への融合がＣＥＡの免疫原特性に影響を及ぼすか否かを調べるために、ＣＥＡをまた、ＶＳＶ−Ｇコード配列に連結した。
【０１１９】
これらのＣＥＡ融合体のコード配列を、ベクターｐＶ１Ｊｎｓに対して、ヒトＣＭＶ／イントロンＡプロモーター＋ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルの調節下にクローニングした（実施例２）。プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦＲＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶＩＪ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、及びｐＶＩＪ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０は、指示される外来ポリペプチドのコード配列に融合された、ＣＥＡの野生型ｃＤＮＡを担う。ｈＣＥＡ−ＤＯＭ融合体及びｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体の典型的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、図２６、図２７及び図３０で示す。
【０１２０】
ＣＥＡ免疫原性に及ぼすＥ．コリの易熱性エンテロトキシンのＬＴＡサブユニット及びＬＴＢサブユニットの効果を評価するために、ＬＴＡ（ａａ１８から２５９）コード配列又はＬＴＢ（ａａ２１から１２５）コード配列のいずれかへ融合されるＣＥＡタンパク質のアミノ酸１から６７９をコードする一連のさらなる融合コンストラクトを生成させた。この実験のために開発された典型的なＣＥＡ−ＬＴＡ融合体及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の構造の略図は、図１に示す。ＣＥＡ−ＬＴ融合体の代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、図２から図６に示す。
【０１２１】
前記アンカー配列の欠失したＣＥＡタンパク質のｃＤＮＡを、シグナルペプチドコード配列が除去されたＬＴサブユニットに連結することにより、ＣＥＡ−ＬＴ融合体を操作した。ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）／イントロンＡプロモーター＋ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルの調節下で、前記ＣＥＡ−融合体コード配列をベクターｐＶ１Ｊｎｓにクローニングした。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢは、ＬＴＡ及びＬＴＢのコード配列にそれぞれ融合されたＣＥＡの野生型ｃＤＮＡを担う（実施例２参照）。
【０１２２】
ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体を担うコンストラクトは全て、ｎｔ１から２０３７のＣＥＡｃＤＮＡを、ｎｔ６４から３７５を包含するＬＴＢ ｃＤＮＡ断片と融合することにより生成される。ＬＴＢコード配列は、配列特異的プライマーＬＴＢ−Ｓ１ ５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１）及びＬＴＢ−Ａ１ ５’−ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＴＴＴＣＣＡＴＡＣＴＧＡＴＴＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２）を使用するＥ．コリゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた。増幅されたこのＤＮＡを前記ＣＥＡコード配列生成プラスミドの３’末端に導入した。
【実施例２】
【０１２３】
プラスミドコンストラクト
ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ：これら２つのコンストラクトは、ＣＥＡの、コドン使用の最適化された、及び野生型の、ｃＤＮＡをそれぞれ担う。ＣＥＡコード配列は、サイトメガロウィルスのＣＭＶ／イントロンＡ前初期プロモーターとウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとの間に置かれる。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔを生成させるために、プラスミドｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔをＥｃｏＲＩにより３７℃で１時間消化した。得られた２１５６ｂｐのインサートを精製し、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＢのＥｃｏＲＩ部位へとクローニングした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２（９）：７７７−８３（１９９３））。
【０１２４】
ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡを生成させるために、プラスミドｐＣＩ／ｈＣＥＡ（Ｓｏｎｇら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−１ ｖｅｒｓｕｓ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．（ＤＮＡベースのワクチン接種及び非ウィルス性サイトカイン遺伝子輸送の組み合わせによるＴヘルパー−１活性対Ｔヘルパー−２活性の調節及び腫瘍免疫付与の増強）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４８１−４９２（２０００））をＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１０９ｂｐのインサートをプラスミドｐＶ１ＪｎｓＡのＥｃｏＲＩ部位へとクローニングした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、前出）。
【０１２５】
ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ：ＬＴＢのコドン最適化ｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドのアセンブリーにより合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔベクターにおいてクローニングした（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔを生成させるために、以下のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲによりＬＴＢｏｐｔを増幅した。すなわち、ＬＴＢｏｐｔ−５’ＸｂａＩ（５’末端）５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号３）、及びＬＴＢｏｐｔ−３’ＢｇｌＩＩ（３’末端）５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＴＣＴＧＴＧＣＧＣＣ−３’（配列番号４）である。次に、増幅した産物をプラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔのＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ部位へと挿入した。
【０１２６】
ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ：ａａ１８から２５９をコードするｎｔ５４から７７４に対応するＬＴＡコード配列を、配列特異的プライマーＬＴＡ−Ｓ１ ５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＣＣＧ−３’（配列番号５）、及びＬＴＡ−Ａ１ ５’−ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＡＡＴＴＣＡＴＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴ−３’（配列番号６）を使用して、Ｅ．コリのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡに挿入した。
【０１２７】
ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ：ヒト細胞における高レベルの発現のためにコドン最適化されたアカゲザルＣＥＡｃＤＮＡの３’断片（ｎｔ１６４１から２０２６）を、ｐＶ１Ｊ／ｒｈＣＥＡｏｐｔからＰＣＲにより増幅した。増幅したｃＤＮＡは前記ＧＰＩアンカーコード配列を欠失し、ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ制限部位を有していた。この断片をｐＣＲ−平滑末端化−ｒｈＣＥＡｏｐｔのＰｓｔＩ部位へと挿入し、このように、中間体ｐＣＲ−平滑末端化−ｒｈＣＥＡｏｐｔ ＸｂａＩ／ＢａｌＩＩを得た。ｒｈＣＥＡｏｐｔをＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ断片として抽出し、ｐＶ１Ｊ−ｎｓＢにおける同じ部位においてクローニングして、このように、ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡｏｐｔＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩを得た。５’端及び３’端でＸｂａＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位をそれぞれ付加するｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔ−ＬＴＢｏｐｔから、ＬＴＢｏｐｔをＰＣＲにより増幅し、ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡｏｐｔ ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩにおいてクローニングし、このようにｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔを得た。
【０１２８】
ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ：参照ＣＥＡ融合タンパク質をコードするコンストラクトは全て、ａａ１から６７９（配列番号２３、図２８Ｂ）に対応するｎｔ１から２０３７（配列番号２２、図２８Ａ）のＣＥＡ ｃＤＮＡを、以下に対応するｃＤＮＡ断片と融合することにより生成させた。すなわち、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＣＥＡ−ＦｒＣ、配列番号２４）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＣＥＡ−ＤＯＭ、配列番号２１及び４９)、免疫グロブリンＧ１の定常鎖の重鎖断片（ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、配列番号２５）、リソソーム会合膜タンパク質（ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、配列番号２６）、ヒートショックタンパク質７０（ＣＥＡ−ＨＳＰ７０、配列番号２７）又は水泡性口内炎ウィルス糖タンパク質（ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、配列番号２８）である。
【０１２９】
ＦｒＣコード配列及びＤＯＭコード配列を、Ｒｉｃｅら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３９０８−１３（２００２））において記述されるように、ｐＲｅｐ−ＴｅＴ．ＣプラスミドからＰＣＲ増幅により得た。ヒトＰＢＭＣのトータルＲＮＡからＦｃＩｇＧを得た。ｐ−ＦＡＳＴ−ＶＳＶ−Ｇから、及びプラスミドｐＹ３１１１から、それぞれＶＳＶ−Ｇ及びＨＳＰ７０を得た。遺伝子アセンブリーによりＬＡＭＰ１を得た。以下のプライマーを使用して増幅を行った。すなわち、ＦｒＣセンス（５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＣ−３’（配列番号２９））、ＦｒＣアンチセンス（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号３０））、ＤＯＭセンス（５’−ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＣ−３’（配列番号３１））、ＤＯＭアンチセンス（５’−ＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＣＧＴＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号３２））、ＦｃＩｇＧセンス（５’−ＴＣＴＡＧＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡ−３’（配列番号３３））、ＦｃＩｇＧアンチセンス（５’−ＧＣＣＧＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号３４））、ＬＡＭＰセンス（５’−ＴＣＴＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号３５））、ＬＡＭＰアンチセンス（５’−ＧＧＣＧＴＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号３６））、ＶＳＶ−Ｇセンス（５’−ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＣＡＴＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号３７））、ＶＳＶ−Ｇアンチセンス（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＡＴＣＴＣＴＡＴＧ−３’（配列番号３８））、ＨＳＰ７０センス（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＣＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣＧＡＣＣ−３’（配列番号３９））及びＨＳＰ７０アンチセンス（５’−ＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧ−３’（配列番号４０））である。増幅されたＤＮＡを、ＣＥＡコード配列生成プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇの３’末端に導入した。
【０１３０】
ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ：ＤＯＭ及びＦｃＩｇＧのコドン使用最適化されたｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドアセンブリーにより合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔベクターにおいてクローニングした（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔを生成させるために、以下のプライマーを使用して、ＤＯＭｏｐｔをＰＣＲにより増幅した。すなわち、Ｄｏｍｏｐｔセンス（５’−ＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣ−３’（配列番号４１））、及びＤｏｍｏｐｔリバース（５’−ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＡＴＣＴＣＡＧＧＧＧ−３’（配列番号４２））である。次に増幅産物をプラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔのＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ部位へと挿入した。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔを生成させるため、以下のプライマーを使用してＦｃＩｇＧｏｐｔをＰＣＲにより増幅した。すなわちＦｃＩｇＧｏｐｔセンス（５’−ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号４３））及びＦｃＩｇＧｏｐｔリバース（５’−ＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＧ−３’（配列番号４４））であり、増幅産物をプラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔのＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ部位に挿入した。
【実施例３】
【０１３１】
アデノウィルスベクター
Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ：プラスミドｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔをＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１５６ｂｐインサートを精製し、ｐｏｌｙＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドのＥｃｏＲＩ部位へとクローニングした。
【０１３２】
Ａｄ５／ＣＥＡ：プラスミドｐＤｅ１ｔａ１ｓｐ１Ｂ／ｈＣＥＡをＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＶで消化することにより、Ａｄ５ベクターの生成のためのシャトルプラスミドｐＭＲＫ−ｈＣＥＡを得た。次に、プラスミド ｐｏｌｙＭＲＫからの、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩで制限酵素処理し、Ｋｌｅｎｏｗ処理した、１２７２ｂｐの産物を用いて、この９．５２ｋｂ断片に対してライゲーションを行った。ｈＣＥＡ及びＥ１隣接Ａｄ５領域に対する発現カセットを含有する、ｐＭＲＫ−ｈＣＥＡ及びｐＭＲＫ−ｈＣＥＡｏｐｔからのＰａｃＩ／ＳｔｕＩ断片を、ＢＪ５１８３Ｅ．コリ細胞において、ＣｌａＩにより線状にしたプラスミドｐＡｄ５へ組み換えた。得られたプラスミドはそれぞれｐＡｄ５／ｈＣＥＡ及びｐＡｄ５−ｈＣＥＡｏｐｔであった。両プラスミドをＰａｃＩで切断してＡｄＩＴＲを放出させ、ＰｅｒＣ−６細胞においてトランスフェクションを行った。一連の継代培養によりＡｄ５ベクター増幅を行った。ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ及びＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔを標準的なＣｓＣｌ勾配精製により精製し、Ａ１０５緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％ スクロース、０．００５ Ｔｗｅｅｎ２０）に対してよく透析した。
【０１３３】
Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ：ｐｏｌｙＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドをＳｗａＩで消化し、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩで制限酵素処理しＫｌｅｎｏｗ処理したｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢから生じる２３００ｂｐＤＮＡ断片を用いて、線状化したベクターをライゲーションすることにより、プラスミドｐＭＲＫ−ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを構築した。ｐＭＲＫ−ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを線状化し、Ａｄゲノムへと上述のように組み換えた。
【０１３４】
Ａｄ５／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びＡｄ５／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ：ｐｏｌｙＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドをＳｗａＩで切断することにより、及び線状化したベクターに対して、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔから生じた２．９ｋｂＤＮＡ断片を用いてライゲーションするか、又はＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、Ｋｌｅｎｏｗ処理したｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ１ｏｐｔから生じた２７００ｂｐ ＤＮＡ断片を用いて、線状化したベクターに対してライゲーションすることにより、プラスミドｐＭＲＫ−ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びｐＭＲＫ−ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔを構築した。ｐＭＲＫ−ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ及びｐＭＲＫ−ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔを線状化し、上述のようにＡｄゲノムへと組み換えた。
【実施例４】
【０１３５】
様々なＣＥＡ−ＬＴ融合体コンストラクトの比較発現効率
ウィルス性疾患に対する遺伝子ワクチン接種のためのコドン最適化ｃＤＮＡの使用により、標的タンパク質の発現が増加することに少なくとも部分的に依存する、より大きな免疫反応が誘発されることが示された。各アミノ酸残基に対してヒトにおいて選好的な（ヒト化した）コドンを組み込むように設計されたＣＥＡ ｃＤＮＡの免疫原特性をも、ＬＴＢコード配列が向上させるか否かを検証するため、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢも構築した。最後に、完全にコドン最適化されたＣＥＡ−ＬＴＢ融合体も、ＬＴＢの合成コドン最適化ｃＤＮＡを使用して、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢｏｐｔを生成させるために構築した。
【０１３６】
ＣＥＡ免疫原性に対するＬＴＢ効果がプラスミドＤＮＡ免疫付与に制限されないかどうかを決定するために、ＣＭＶ／イントロンＡプロモーター及びＢＧＨポリアデニル化シグナルに隣接するＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ融合体をコードするアデノウィルス５型ベクターも構築した。プラスミドベクター及びＡｄベクターの両者により発現されるＣＥＡ融合タンパク質の分子量は、ＣＥＡｃＤＮＡの全長型をコードする対応するベクター由来のものと差異はなかった（データ非表示。）。
【０１３７】
ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードするベクターの発現効率及び全長ＣＥＡのｃＤＮＡの発現効率を比較するために、ＨｅＬａ細胞に対して、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢを用いてトランスフェクションを行った。これらのコンストラクトのＣＥＡ発現を、ＣＥＡのｗｔ ｃＤＮＡ、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡを担う、対応するプラスミドのＣＥＡ発現と比較した。同様に、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ発現効率を、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔの発現効率と比較した。トランスフェクションから２日後に、細胞抽出物中のＣＥＡタンパク質の量を測定することによって、これらのコンストラクトの発現効率を調べた。
【０１３８】
プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢのトランスフェクションは、プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ（９１μｇ/ｌ）と比較した場合に、培養上清中で検出されるＣＥＡタンパク質産生量は約２倍高かった（それぞれ１８３μｇ／ｌ及び１３９μｇ／ｌ、図８Ａ）。同様に、コンストラクトｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢの発現効率も同等であった（それぞれ１１３μｇ／ｌ及び１３６μｇ／ｌ、図８Ｂ）。最後に、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢの発現効率も、異なるｍｏｉでＨｅＬａ細胞に感染させることにより比較した。これら２つのベクターのＣＥＡ発現効率は、ｍｏｉ １０００において同等であったが（それぞれ１７９０μｇ／ｌ及び１４００μｇ／ｌ、図９）、一方で、ｍｏｉ １００では、ベクターＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢが産生する量は、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔよりも、培養上清中で検出可能なＣＥＡタンパク質量が約１／４と低かった（それぞれ３９０μｇ／ｌ及び１５００μｇ／ｌ）。
【０１３９】
したがって、これらの結果から、前記ＣＥＡ−ＬＴＡ融合タンパク質及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡが、全長ＣＥＡタンパク質をコードする対応するｃＤＮＡの効率と同程度の効率で発現されることが示される。さらに、これらのｃＤＮＡの同程度のＣＥＡ発現は、それらの送達のために利用される遺伝子送達媒体のタイプにより影響されない。
【実施例５】
【０１４０】
ＣＥＡ発現の検出
プラスミドベクター及びＡｄベクターによるＣＥＡ発現をウェスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡにより調べた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、プラスミドをＨｅＬａ細胞へトランスフェクションした。無血清培地において３７℃で３０分間、ＨｅＬａ細胞のアデノウィルス感染を行い、次に新鮮な培地を添加した。４８時間のインキュベーション後、全細胞溶解液を回収した。細胞溶解液中に存在するＣＥＡタンパク質を、ウサギポリクローナル抗血清を使用するウェスタンブロット分析により検出した。このタンパク質は１８０から２００ｋＤａのバンドとして検出された。Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｌｉｓａ ＣＥＡ Ｋｉｔ（ＤＢＣ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ）を使用して、発現されるＣＥＡの量を細胞溶解液中で検出した。
【０１４１】
トランスフェクションした細胞における融合タンパク質の発現を、ＣＥＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＦｃＩｇＧ、破傷風毒素又はＨＳＰ７０に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析により調べた。ＨｅＬａ細胞を前記示されるプラスミドを用いてトランスフェクションするか、又は選択されるＡｄベクターを感染させた。４８時間のインキュベーション後、全細胞溶解液及び細胞上清を回収した。
【０１４２】
細胞溶解液又は上清におけるＣＥＡ発現も、Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｌｉｓａ ＣＥＡ Ｋｉｔ（ＤＢＣ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ）を使用して調べた。トランスフェクションされた細胞の溶解液中で融合ポリペプチドに特異的な抗体によりＣＥＡタンパク質が検出されたが、その一方、標的抗原の発現は擬似トランスフェクションされた対照試料において観察されなかった（図１８Ｂ）。この融合タンパク質の分子量は、ＣＥＡの分子量とは有意差がなかった。様々なＣＥＡポリペプチド間において明らかに分子量の差がないのは、おそらく、腫瘍抗原の高度のグリコシル化によるものである。
【０１４３】
前記ＣＥＡ融合体をコードするベクターの発現効率をｐＶ１Ｊ／ＣＥＡと比較するために、様々なプラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション２日後に、これらのコンストラクトのＣＥＡ発現をＥＬＩＳＡにより調べた。プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０は、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡと同程度の効率でＣＥＡを発現した（図１９Ａ）。この融合タンパク質のほとんどは、細胞上清において分泌及び検出されたが、ＣＥＡ−ＬＡＭＰはトランスフェクション細胞から放出されず、これは、おそらく、リソソーム区画へのその再ルーティングによるものであった（図１９Ｂ）。したがって、これらの結果から、ＣＥＡ−ＦｒＣ、ＣＥＡ−ＤＯＭ、ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ＣＥＡ−ＨＳＰ７０、及びＣＥＡ−ＬＡＭＰの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡが、全長ＣＥＡタンパク質をコードするｃＤＮＡの発現効率と等価の効率で発現されることが示される。
【実施例６】
【０１４４】
ペプチド
凍結乾燥したｈＣＥＡペプチドをＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓから購入し、ＤＭＳＯ中で４０ｍｇ／ｍｌになるように再懸濁した。１１残基まで重複している１５ａａ長のペプチドのプールを、記述されているように組み合わせた（Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：８６６３−７２（２００４））。最終濃度は以下のとおりであった。すなわち、プールＡ＝１．２ｍｇ／ｍｌ、プールＢ＝０．８９ｍｇ／ｍｌ、プールＣ＝０．８９ｍｇ／ｍｌ、プールＤ＝０．８ｍｇ／ｍｌであった。ペプチドを−８０℃で保存した。ＤＯＭに対する免疫反応を、破傷風トキソイドペプチドｐ３０（Ｆ９４７ＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ９６７（配列番号５４））を使用して測定した（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１５５８−６５（２００１））。
【実施例７】
【０１４５】
マウス免疫付与及び腫瘍負荷試験
動物実験は全て、ＩＲＢＭ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物取り扱い及び使用委員会）により承認された。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌｅｃｃｏ、Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＨＬＡ−Ａ２．１マウス（ＨＨＤ）は、Ｆ．Ｌｅｍｍｏｎｉｅｒ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の厚意により提供された。Ｃ５７ＢＬ／ＤＲ４マウスをＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から購入した。ＣＥＡ．ｔｇマウス（Ｈ−２ｂ）は、Ｊ．Ｐｒｉｍｕｓ（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）より提供され、標準的な条件（Ｃｌａｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：１４６９−７７（１９８８））で維持した。プラスミドＤＮＡ ５０μｇをマウス大腿四頭筋に５０μｌ体積で既に記述されているようにして電気注入した（Ｒｉｚｚｕｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（１１）：６４１７−２２（１９９９））。マウス大腿四頭筋において５０μｌ体積でＡｄ注入を遂行した。液性及び細胞性免疫反応を指示された時間に分析した。
【０１４６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを大腿四頭筋における２回のＤＮＡ注入に供した後、既に記述されているような電気刺激を行った（Ｒｉｚｚｕｔｏら、前出）。３週間間隔で注射を行った。ＣＥＡトランスジェニックマウスを、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／注入）の１週ごとに５回の注入、Ａｄベクター（１ｘ１０９個ウィルス粒子／注入）の２回の注入又は１週ごとに５回の注入とそれに続くＡｄによる追加免疫のいずれかに供した。最後の注入から２週間後、液性及び細胞性免疫反応を分析した。マウスにたいして、また、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射により負荷試験を行った（Ｃｌａｒｋｅら、前出）。１週間間隔でマウスの腫瘍成長を調べた。
【実施例８】
【０１４７】
抗体検出及びタイター
抗体タイター決定のための血清を後眼窩採血により得た。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４）で希釈した、高度に精製されたＣＥＡタンパク質（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）１００ｎｇ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩、既に記述されているようにインキュベーションした（Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅら、前出）。次に、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳを使用して３７℃で１時間プレートをブロッキングした。マウス血清を５％ＢＳＡ含有のＰＢＳで希釈した（抗体陽転率を評価するために、１／５０希釈、タイターを評価するために、１：１０〜１：３１、２１５０希釈）。免疫前血清をバックグラウンドとして使用した。希釈した血清を４℃で一晩インキュベーションした。１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄した。二次抗体（ヤギ抗マウス、ＩｇＧペルオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ）を５％ ＢＳＡ含有のＰＢＳで１／２０００に希釈し、室温にて２時間から３時間、振盪器上でインキュベーションした。洗浄後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてプレートの発色を行った。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液 ２５μｌ／ウェルを用いて反応を停止させ、４５０ｎｍ／６２０ｎｍでプレートの読み取りを行った。同一希釈での自己免疫前血清の吸光よりも、少なくとも３倍を超える吸光を生じる血清の反復限界希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）として抗ＣＥＡ血清タイターを算出した。
【実施例９】
【０１４８】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
既に記述されているように、マウス脾臓細胞及びＣＥＡ特異的ペプチドを使用してアッセイを行った（Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅら、前出）。滅菌済みＰＢＳ中で２．５μｇ／ｍｌに希釈した、精製ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＩｇＧ１、クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１００μｌ／ウェルを使用して、９６穴 ＭＡＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）をコーティングした。ＰＢＳで洗浄後、Ｒ１０培地 ２００μｌ／ウェルを用いて３７℃にて２時間、プレートのブロッキングを行った。
【０１４９】
滅菌状態で、安楽死したマウスから脾臓を摘出し、金属格子上に擦り付けて脾臓を破壊して脾臓細胞を得た。０．１ｘＰＢＳ １ｍｌを前記細胞ペレットに添加し、約１５秒間ボルテックスすることにより浸透圧溶解させ、赤血球細胞を除去した。次に、２ｘＰＢＳ １ｍｌを添加し、１ｘＰＢＳでその体積を４ｍｌにした。１２００ｒｐｍ、室温で１０分間、細胞を遠心分離することにより、ペレットにして、このペレットをＲ１０培地 １ｍｌで再懸濁した。Ｔｕｒｋｓ染色を用いて生細胞を計数した。
【０１５０】
脾臓細胞をウェルあたり５ｘ１０５個の細胞及び２．５ｘ１０５個の細胞で、デュプリケートで播種し、３７℃で２０時間、各ペプチドの懸濁液 １μｇ／ｍｌとともにインキュベーションした。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を各マウスについてのポジティブ内部対照として５μｇ／ｍｌで使用した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄後、アッセイ緩衝液中で１：２５００に希釈したビオチン抱合型ラット抗マウスＩＦＮγ（ＲａｔＩｇＧ１、クローンＸＭＧ１．２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ） ５０μｌ／ウェルとともに、４℃で一晩、プレートをインキュベーションした。よく洗浄した後、スポットの発色がはっきりと見えるまで、５０μｌ／ウェルのＮＢＴ／Ｂ−ＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加することによりプレートを発色させた。蒸留水でプレートを完全に洗浄することにより、反応を停止させた。プレートを風乾させ、次にスポットを自動ＥＬＩＳＰＯＴ読み取り装置を使用して計数した。
【実施例１０】
【０１５１】
細胞内サイトカイン染色
１０％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １ｍｌ中の１００万から２００万個のマウス脾臓細胞又はＰＢＭＣを、ペプチドのプール（各ペプチド ５から６μｇ／ｍｌの最終濃度）及びブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５５０２８／２３００ｋｋ）とともに、３７℃及び５％ＣＯ２にて１２時間から１６時間、既に記述されているようにインキュベーションした（Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅら、前出）。次に、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ ＦＢＳ、０．０１％ ＮａＮ３含有ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ Ｆｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５３１４２）とともに４℃で１５分間インキュベーションした。次に細胞を洗浄し、表面抗体すなわちＣＤ４−ＰＥ抱合型抗マウス抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３０４９）、ＰｅｒｃＰ ＣＤ８抱合型抗マウス抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３０３６）及びＡＰＣ抱合型抗マウスＣＤ３ｅ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３０６６）を用いて、暗所にて室温で３０分間染色した。洗浄後、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５０２８／２３００ｋｋ）を用いて、暗所にて４℃で２０分間、浸透を行った。Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５０２８／２３００ｋｋ）で洗浄した後、ＩＦＮγ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに細胞をインキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳ−ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析した。
【実施例１１】
【０１５２】
ＣＥＡ−ＬＴ融合体の免疫原性
ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードするプラスミドにより誘導される免疫反応を検討するために、１群９匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ 各５０μｇの２回のｉ．ｍ．注射により免疫付与した。さらに、ＣＥＡ−ＬＴＡ融合タンパク質及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合タンパク質の共発現が、ＣＥＡタンパク質の免疫原性に対して相加効果を有し得るか否かを検討するために、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ 各２５μｇを同時注射することにより、１群のマウスに免疫付与した。３週間の間隔で免疫付与を実施した。この特定の手段と関連する形質導入及び免疫原性の増強を考慮して、前記プラスミドＤＮＡをマウス骨格筋に通常どおり電気注入した（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１５９８−１１６０７（２０００）；Ｗｉｄｅｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５−４６４０（２０００））。
【０１５３】
最後の注射の２週間後に、異なるプラスミドにより誘発される細胞性免疫をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。刺激された脾臓細胞からの抗原特異的ＩＦＮγ分泌を、１１ａａまで重複し全ＣＥＡ糖タンパク質を包含する１５マーのペプチドの４つのプールを使用して測定した。プールＡはａａ１から１４７を、プールＢはａａ１３７から２３７を、プールＣはａａ３１７から５０７を、プールＤはａａ４９７から７０３をカバーする。ネガティブ対照として、ＣＥＡペプチドを可溶化するのに利用されるのと同濃度のＤＭＳＯによる脾臓細胞の刺激に対するサイトカイン産生も測定した。
【０１５４】
前記ペプチドプールＡにより検出されるＳＦＣ値が全コンストラクトについてバックグラウンドをわずかに上回っていたため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＤＮＡワクチン接種により誘発される免疫反応は、タンパク質のＣ末領域に主として偏向していた（図１０）。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢワクチン接種法は、ペプチドプールＢ、Ｃ及びＤで検出されるＳＦＣの幾何学的平均値がより高いことによって示されるように（ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ：それぞれ４８２、１４３６及び２０５４ ＳＦＣ／１０６個の脾臓細胞；ｐＶ１Ｊ/ｈＣＥＡ：それぞれ４５、３５０及び２６４ ＳＦＣ／１０６個の脾臓細胞）、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡにより誘発されるものよりも優れていた。同様に、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡも、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡと比較した際、前記ＣＥＡ特異的免疫反応に対する増強効果を有していた。しかし、免疫反応の増強は、ペプチドプールＣ及びＤ（それぞれ９２５及び５２８ ＳＦＣ／１０６個の脾臓細胞）でのみ観察されたのに対し、ペプチドプールＢで測定される免疫反応は低かった（１５ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）。さらに、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢの同時注射は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢで処理した群おいて測定される免疫反応と比較すると、ＣＥＡに対する免疫反応への有意な相乗効果を有さなかったが、むしろ、その結果、ペプチドプールＢ及びＤ（それぞれ２１０及び５２８ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）で検出されるＳＦＣ値が低下した。
【０１５５】
異なるＣＥＡコンストラクトによるワクチン接種に際して誘発されるＴ細胞特異性を定義するために、ペプチドプールＤを使用して、注射したマウス由来のプールした脾臓細胞に対して、ＩＦＮγ細胞内染色を行った。ＣＤ８＋特異的反応は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで検出されたもの（それぞれ０．１４％及び０．８％、図１０Ｂ）よりも、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ（４．５％）を使用して注射されたマウスにおいて優れていることが検出された。対照的に、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＴＡは、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで観察されるもの（それぞれ０．５５％及び０．５８％）よりも大きい、強いＣＤ４＋特異的反応（１．２１％）を誘発した。
【０１５６】
抗原特異的抗体を測定することにより、ＣＥＡに対する液性免疫反応の誘導を検討した（図１１）。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢの両者は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡよりも大きな抗体反応を誘発し、このことから、ＣＥＡ特異的免疫反応に対してＬＴサブユニットにより発揮されるアジュバント効果が確かめられた。したがって、これらのデータから、ＣＥＡコード配列のＬＴＡｃＤＮＡ又はＬＴＢｃＤＮＡへの融合の結果、ＣＥＡ特異的免疫反応が増強されることが示される。しかし、ＬＴＢがＣＤ８＋Ｔ細胞の一般的な誘導による免疫反応に対してより大きな増強効果を有すると思われるのに対し、ＬＴＡは有力なＣＤ４＋反応を誘発する。
【実施例１２】
【０１５７】
異なるマウス系統におけるＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原性
ＣＥＡ特異的免疫反応に及ぼすＬＴサブユニットの増強効果が単一のマウス遺伝的背景に制限されないかどうかを調べるために、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７／ＤＲ４マウス及びＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）マウスにおいてＤＮＡベースの免疫付与を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスはその免疫能力を考慮して選択したが、これは、様々な種類の免疫付与法に非常に反応性のあるマウス系統である。ＨＨＤトランスジェニックマウスは、ヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子を発現する。同様に、Ｃ５７／ＤＲ４トランスジェニックマウスはヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を有する。したがって、これら２種類のトランスジェニックマウス系統は、ヒトＭＨＣクラスＩ及びＩＩハプロタイプとの関連で、ＣＥＡ−ＬＴ融合体の免疫反応性に関する情報を提供し得る。
【０１５８】
最初に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価した。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢによる免疫付与における抗原特異的免疫反応の増強を、ペプチドプールＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄにより検出した（ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ：それぞれ１６６、１３５３、７９６、８９９ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞；ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ：それぞれ５７、３１２、３２７、３１８ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞、図１２）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスで観察されるように、ＣＥＡタンパク質のＮ末領域は、本腫瘍抗原の他のセクションと比較して最小の免疫原性であると思われた。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ免疫付与はまた、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡと比較して、抗原特異的免疫反応を増強させた。この免疫反応の増強は、ペプチドプールＢ、Ｃ及びＤ（それぞれ９３６、７２７及び６５０ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）で検出された。さらに、２種類のプラスミド ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢの同時注射により、有意な相加作用が生じたが、これは、ペプチドプールＣ及びＤ（それぞれ１７８３及び２１４１ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）を使用して主として検出された。
【０１５９】
Ｃ５７／ＤＲ４マウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢによる免疫付与により著しく増強され、これは、ペプチドプールＤでのみ検出された（図１３）。注射したマウスからプールしたＰＢＭＣに対して行ったＩＦＮγ細胞内染色から、ＣＥＡに対するＣＤ８＋反応が、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢにより免疫付与したマウスにおいて最も高く（１５．３２％）、一方、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで処理した群において非常に弱い（０．５％）ことが示された。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＴＡ免疫付与による抗原特異的免疫反応増強は中程度にとどまり（０．４３％）、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードするコンストラクトと同時注射した場合、ＣＥＡ免疫原性をさらに増強することはなかった（１３．４４％）。興味深いことに、有意なＣＤ４＋Ｔ細胞反応は、この免疫付与マウスにおいて検出されなかった（データ非表示。）。
【０１６０】
プールしたＰＢＭＣに対するＩＦＮγ細胞内染色を行うことにより、様々なＣＥＡコードプラスミドにより誘発される免疫反応をＨＨＤマウスにおいて評価した。免疫反応はペプチドプールＢ及びＤでのみ検出され、図１４に示されるように、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢによる免疫付与の結果、標的抗原に対するＣＤ８＋反応が１０倍を超えて増強された。それに対して、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡを単独で使用しても、又はｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢと同時注射しても、免疫反応の増強は検出されなかった。ＣＤ４＋Ｔ細胞反応はこの免疫付与マウスにおいて検出されなかった（データ非表示。）。
【０１６１】
まとめると、これらのデータから、ＣＥＡに対するＬＴＢコード配列の融合の結果、抗原特異的免疫反応が顕著に増強されることが確認される。興味深いことに、この反応は主としてＣＤ８＋特異的であり、様々な系統のマウスにおいて観察でき、したがって、ＬＴサブユニットにより発揮される増強効果は遺伝子型により制限されないことが示される。
【実施例１３】
【０１６２】
トランスジェニックマウスにおけるヒトＣＥＡに対する寛容性
ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原特性の増強がヒトＣＥＡに対する寛容性をより効果的に打破するか否かを調べるために、ｈＣＥＡ又はＣＥＡ−ＬＴＢのいずれかの、全コドンが最適化されたｃＤＮＡを担うベクターを用いてｈＣＥＡトランスジェニックマウスに免疫付与した。これらのトランスジェニックマウスは全ヒトＣＥＡ遺伝子及び隣接配列を有し、腸において、主として盲腸及び結腸において、ｈＣＥＡタンパク質を発現する。したがって、このマウス系統は、この腫瘍自己抗原に対して向けられた免疫療法計画の安全性及び効率性を研究するための有用なモデルである（Ｃｌａｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：１４６９−１４７７（１９９８））。
【０１６３】
ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢｏｐｔによる免疫付与の結果、注射を行ったマウスのＰＢＭＣに対するＩＦＮγ細胞内染色により測定されるＣＥＡ特異的免疫反応が有意に増強された（図１５Ａ）。Ｔ細胞反応の増強がペプチドプールＤで検出され、これは、顕著にＣＤ８＋であった。さらに、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ処理群と比較して、Ａｂタイターの幾何学的平均値が４７倍増強することにより示されるように、ＣＥＡ特異的液性反応もまた、ＣＥＡ−ＬＴＢ処理マウスにおいて増強された（図１５Ｂ）。
【０１６４】
ＣＥＡ特異的免疫反応に対するＬＴＢにより発揮される増強効果がまた、プラスミドＤＮＡ以外のベクターで免疫付与した際に観察され得るか否かを調べるために、１群１２匹のＣＥＡｔｇマウスの群に、Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ及びＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔを、１ｘ１０７、１ｘ１０８及び１ｘ１０９ｖｐの投与量で免疫付与した。２週間あけてマウスに２回の注射を行い、最後の注射から２週間後に、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ細胞内染色により免疫反応を測定した。ペプチドプールＤを使用して免疫反応を評価した。ＣＥＡに対する有意な免疫反応が１ｘ１０８ｖｐ投与量で検出できた一方で、標的抗原に対する寛容性を打破するために、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ １ｘ１０９ｖｐが必要であったため、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢはＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔよりも免疫原性が高かった（図１６）。ＣＤ４＋反応は、この免疫付与マウスのいずれにおいても検出できなかった（データ非表示）。
【０１６５】
これらのデータから、この自己抗原に対する寛容性が、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原特性の増強により、より効率的に打破され得ることが確認される。さらに、ＣＥＡの免疫原特性に対するＬＴＢの増強効果はまた、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の全コドン最適化ｃＤＮＡを担うプラスミドの注射においても観察される。最後に、これらの結果から、ＣＥＡ−ＬＴＢの免疫原性の増強がプラスミドＤＮＡ免疫付与に制限されないことが示される。
【実施例１４】
【０１６６】
ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体で免疫付与されたＣＥＡトランスジェニックマウスにおける腫瘍成長動態
ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の免疫原性の増強によっても、腫瘍進行を抑制できる治療効果増強が起こるか否かを解明することが適切であると考えられた。この目的のため、１０匹のＣＥＡ−ｔｇマウスの群に、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ又はｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを１週ごとに５回注射し、次いで、対応するＡｄベクター １ｘ１０１０ｖｐによる最終追加免疫を行った。プラスミドＤＮＡ初回刺激−Ａｄ追加免疫様式を利用することにより、ウィルス抗原及びバクテリア抗原に対して高レベルの細胞免疫を誘導できることを示す最新の報告を考慮して、同じ免疫付与プロトコールを本研究において採用した。最後の免疫付与から２週間後、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ腫瘍細胞を皮下注射することでＣＥＡｔｇマウスに負荷試験を行った。この同質遺伝子的細胞株は、化学的に誘導される結腸癌に由来し、ＣＥＡを発現する。擬似処理マウスにおける腫瘍の発達を負荷試験の２２日後までに検出し、その際全処理マウスにおいて腫瘍が発生していた（図１７Ａ）。さらに、負荷試験から３４日後までに、かなりの体積に達する腫瘍塊の平均的サイズが同時に増加した。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔをコードするベクターでワクチン接種されたマウスは、負荷試験後３４日目で１０匹の処理マウスのうち２匹が腫瘍のないままであったため、腫瘍の発達に対してある程度の抵抗性を示した。この群の腫瘍の平均的サイズは、擬似処理されたマウスにおいて観察されるものよりも小さかった。ＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ融合体をコードするベクターによる免疫付与の結果、腫瘍発達に対する有意な防御効果が得られた。１０匹の処理マウスのうちの５匹が負荷試験後３４日目で腫瘍のないままであり、この群における腫瘍塊の平均的サイズは、前記擬似マウス又はｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ処理マウスにおいて観察されるものよりも有意に小さかった。したがって、これらの結果から、前記ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードするベクターに付随するＣＥＡ特異的免疫反応の増強は、有意な抗腫瘍効果と相関し、その結果、腫瘍成長がある程度防御され、腫瘍塊の成長動態が低下することが示される。
【実施例１５】
【０１６７】
ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体は、ＣＥＡタンパク質の免疫原性を増強する
ＣＥＡ−ＦＲＣ、ＣＥＡ−ＤＯＭ、ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ＣＥＡ−ＨＳＰ７０及びＣＥＡ−ＬＡＭＰの融合体をコードするプラスミドにより誘導される免疫反応を検討するために、１群９匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、各プラスミド ５０μｇ又は５μｇの２回のｉ．ｍ．注射を行い、免疫付与した。この免疫付与は３週間の間隔をあけて行った。エレクトロポレーションを用いて報告される形質導入及び免疫原性の増強を考慮して（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：１１５９８（２０００）、Ｗｉｄｅｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５（２０００））、プラスミドＤＮＡをマウス骨格筋に対して通常通りエレクトロポレーションした（ＤＮＡ−ＥＰ）。
【０１６８】
最後の注射から２週間後に、様々なプラスミドにより誘発される免疫反応をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。刺激した脾臓細胞からの抗原特異的ＩＦＮγ分泌を、１１ａａまで重複し、ＣＥＡのＣ末端領域を包含する１５マーのペプチドのプール（プールＤ、ａａ４９７〜７０３）を使用して測定した（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、前出）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＥＡに対する細胞性免疫反応がこのタンパク質のＣ末領域に向けて主に偏向するため（Ｚｕｃｃｅｌｉら、前出）、ペプチドプールＤを使用してＣＥＡに対する免疫反応の分析を行った。ネガティブ対照として、ＣＥＡペプチドを可溶化するのに利用されるのと同濃度のＤＭＳＯによる脾臓細胞の刺激に対するサイトカイン産生も測定した。
【０１６９】
ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ又はｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−Ｆｃの注射により、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡと比較して、ＣＥＡに対するより大きな免疫反応が誘発された。これら２つの融合タンパク質がより大きな免疫原性を有する結果、１０６個の脾臓細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の幾何学的平均値がより高くなった（図２０Ａ）。プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧは同様の免疫原特性を有し、プラスミドＤＮＡ ５μｇ又は５０μｇを注射した際に、ＣＥＡ特異的免疫反応が３倍から４倍増強された（それぞれｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ：５９０及び１０９８ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ：５１０及び１１６０、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ：１４６及び２６４ ＳＦＣ／１０６個脾臓細胞）。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡにより誘発されるＳＦＣ値の間には有意差は示されなかった。ＣＥＡ特異的免疫反応はネガティブ対照試料において検出されなかった。
【０１７０】
ＣＥＡに対する液性反応に及ぼすＣＥＡ融合体の効果を調べるために、精製ＣＥＡタンパク質を基質として用いたＥＬＩＳＡにおいて、免疫付与マウスからの血清を試験した（図２０Ｂ）。ＣＥＡ特異的抗体タイターの向上は、プラスミドｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｒＣ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０ ５０μｇを注射した際に観察された。対照的に、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇの注射の結果、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡによる免疫付与に際して観察されるのと同程度のＣＥＡ特異的抗体反応が起こった。まとめると、これらのデータから、ＤＯＭ又はＦｃＩｇＧ ｃＤＮＡに対するＣＥＡコード配列の融合の結果、ＣＥＡ特異的細胞性免疫及び液性免疫反応が増強されることが示される。
【実施例１６】
【０１７１】
ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおける標的抗原に対する寛容性を打破する。
【０１７２】
前記標的抗原に対する寛容性は、癌ワクチンが免疫反応を誘発し、効率的な抗腫瘍効果を生じるために克服しなければならないハードルの１つである。したがって、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体の免疫原特性の増強により、ＣＥＡタンパク質よりも効率的にＣＥＡに対する寛容性が打破されるか否かを調べることが適切であると考えられた。この目的のため、ＣＥＡトランスジェニックマウスを利用して比較免疫付与実験を行った。これらのトランスジェニックマウスは全長ヒトＣＥＡ遺伝子及び隣接配列を有し、ＣＥＡタンパク質を腸において、主に盲腸及び結腸において発現する。このマウス系統は、この腫瘍自己抗原に対して向けられる免疫療法計画の安全性及び効率性を研究するための有用なモデルである（Ｃｌａｒｋｅら、前出）。
【０１７３】
ＣＥＡの、コドン使用最適化されたｃＤＮＡ（ｃＤＮＡｏｐｔ）を担うベクターの免疫原特性の増強を考慮して、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体のｃＤＮＡｏｐｔ（ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ）又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体のｃＤＮＡｏｐｔ（ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ）を担わせるために、プラスミドベクター及びアデノウィルスベクターの両者を操作した。ＣＥＡについて観察されるように、ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ ｃＤＮＡ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ ｃＤＮＡは、対応する野生型ｃＤＮＡよりも高い効率で発現され、これによりＣＥＡに対する免疫反応が増強されることが示された（データ非表示）。
【０１７４】
単独又は組み合わせのいずれかで投与されるプラスミドＤＮＡ及びＡｄベクターを使用した一連の免疫付与実験により、これら２つの融合タンパク質の免疫原性をＣＥＡの免疫原性と比較した。ＣＥＡトランスジェニックマウスのコホートを以下の様々な実験計画で免疫付与した。すなわち（ｉ）プラスミドＤＮＡ ５０μｇを１週間間隔で５回注射（ＤＮＡ／ＤＮＡ）、（ｉｉ）１ｘ１０７から１ｘ１０９個の範囲のウィルス粒子（ｖｐ）の投与量で、アデノウィルスを隔週（ｂｉｗｅｅｋｌｙ）で２回注射（Ａｄ／Ａｄ）、又は（ｉｉｉ）１週ごとに５回のプラスミドＤＮＡの注射後に、アデノウィルス １ｘ１０９ｖｐの最後の注射（ＤＮＡ／Ａｄ）、である。プールＤペプチドを用いた各免疫付与マウスのＰＢＭＣ又は脾臓細胞に対する細胞内ＩＦＮγ染色により、免疫反応を分析した。さらに、ＣＥＡ特異的抗体の誘導をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１７５】
ＣＥＡトランスジェニックマウスのＤＮＡ／ＤＮＡ免疫付与により、ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔベクター及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔベクターが、前記標的抗原に対する測定可能なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を与えることが明らかとなった（図２１Ａ）。したがって、両コンストラクトは、これらのマウスにおいてＣＥＡに対する寛容性を打破することができた。ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合タンパク質により誘発される抗原特異的反応は、ＩＦＮγ細胞内染色の平均値によって示されるものと同程度だった（それぞれ０．２２％及び０．３４％）。それにもかかわらず、これら２つのコンストラクトにより誘発される免疫反応は、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔによるワクチン接種において観察されるもの（０．０７％）よりも大きかった。同様に、抗ＣＥＡ液性反応も本融合タンパク質によるワクチン接種においてより大きかった。ＣＥＡ特異的抗体タイターは、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔにより免疫付与したマウス全てにおいて検出され、抗体タイターの平均はそれぞれ５６，１３６及び２４，７２５であった。一方、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡｏｐｔ免疫付与群は、ＣＥＡ特異的抗体の少なくとも７７倍低い（１／７７）平均タイター（３１８）を示した（図２１Ｂ）。
【０１７６】
Ａｄ／Ａｄワクチン接種法により処理したＣＥＡトランスジェニックマウスはまた、Ａｄ−ＣＥＡｏｐｔによるワクチン接種よりも、ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔＡｄベクター及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔＡｄベクターによるワクチン接種に際して、ＣＥＡに対する寛容性を打破する上でより優れた効率を示した。ＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、Ａｄ−ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＡｄ−ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧの１０７ｖｐという少量の注射においてワクチン接種を受けたマウスで観察することができ、ＣＥＡ特異的反応は、前記２つの抗原の間で同程度であり、１０９ｖｐの注射に際して増強された（それぞれ１．５５％及び１．１５％）。一方、有意なＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度を誘発するためには、Ａｄ−ＣＥＡｏｐｔ １０９ｖｐが必要であった（２．１％）（図２１Ｃ）。ＣＥＡ特異的抗体は、Ａｄ−ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ及びＡｄ−ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔで免疫付与されたマウス全てにおいて検出された。抗体タイターの平均値はそれぞれ１９，６００及び３３，０００であった。Ａｄ−ＣＥＡｏｐｔの注射の結果、処理されたマウスのうちのわずか２匹においてのみ測定可能なＣＥＡ特異的反応が生じ、抗体タイターは有意に低かった（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、前出）（図２１Ｄ）。興味深いことに、ＤＮＡ／Ａｄ免疫付与により、ＣＥＡベクター、ＣＥＡ−ＤＯＭベクター及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度における差が低下することが示された（図２２Ａ）。しかし、ＣＥＡ特異的抗体タイターの平均値は、ＣＥＡを発現するベクターよりも、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧを発現するベクターによるワクチン接種に際して大きかった（それぞれ４１２、３１，２００、２６，１２０）（図２２Ｂ）。
【０１７７】
興味深いことに、前記抗原にもかかわらず、ＣＥＡに対する明らかなＣＤ４＋細胞Ｔｈ１反応は、この３種類のワクチン接種法のいずれにおいても検出されなかった（データ非表示）。しかしながら、ＤＯＭ配列内に存在するヘルパーエピトープｐ３０（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１５５８−６５（２００１））に対する有意なＣＤ４＋細胞Ｔｈ１反応は、ＤＮＡ／ＤＮＡワクチン接種後に検出された（０．４％）（図２３）。
【０１７８】
したがって、これらのデータから、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合タンパク質が、ＣＥＡタンパク質よりも優れた効率でトランスジェニックマウスにおいてＣＥＡに対する寛容性を打破できることが示される。これらの融合タンパク質の免疫原特性の増強は、ＤＮＡ又はＡｄベクターによるワクチン接種に際して観察できる。しかし、ＣＥＡに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発におけるこの２つの融合タンパク質のより優れた能力は、ＤＮＡ／Ａｄワクチン接種療法によって少なくともある程度低下し得る。
【実施例１７】
【０１７９】
Ｔ細胞枯渇実験
免疫付与動物において、記述されているように（Ｐｅｒｒｉｃｏｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７（４）：２７３−８１（２００４）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９３（２−３）：２４７−５３（２００４））、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５ハイブリドーマ）、抗ＣＤ８（Ｌｙｔ２．２ハイブリドーマ）又は抗ＡｓｉａｌｏＧＭ１（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）のｉ．ｐ．注射により、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞の枯渇処理を行った。抗体（１回当たり１００μｌ（腹水で希釈したもの。））を腫瘍負荷に対して７日目に注射し、次に５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ細胞の注射から３週間にわたり、毎週注射した。枯渇条件は、フィコエリトリン抱合型ＭＡｂ 抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗ＮＫ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して末梢血のフローサイトメトリ分析により確認し、関連細胞サブセットの９９％が除去されたのに対し、全ての他のサブセットは通常レベル内にとどまった。
【実施例１８】
【０１８０】
ＣＥＡ−ＤＯＭ免疫付与は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおいて抗腫瘍効果を発揮する
発明者らは、次に、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ融合体の免疫原性の増強によっても、腫瘍進行を防御できるように治療効果が増強されるか否かを確認した。この目的のために、１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に対して、ＣＥＡ−ＤＯＭベクター、ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクター又はＣＥＡベクターによる、ＤＮＡ／ＤＮＡ、Ａｄ／Ａｄ又はＤＮＡ／Ａｄの免疫付与法を行った。最後の免疫付与から２週間後、このＣＥＡトランスジェニックマウスに対して、ＣＥＡを発現する同質遺伝子的な腫瘍細胞系である５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ細胞の皮下注射により、負荷試験を行った（Ｃｌａｒｋｅら、前出）。ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＡｄ／Ａｄの様式による免疫付与の結果、注射したベクターにより発現されるタンパク質にかかわらず、有意な抗腫瘍効果は全く得られなかった（図２４）。一方、ＣＥＡ−ＤＯＭ融合タンパク質をコードするベクターによるＤＮＡ−ＥＰ／Ａｄ免疫付与の結果、処理マウス１０匹のうちの７匹で、負荷試験後の３４日目まで腫瘍がないという、有意な抗腫瘍効果が得られた。したがって、これらの結果から、ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ ｃＤＮＡに付随するＣＥＡ特異的免疫反応の増強及びＤＮＡ／Ａｄワクチン接種法が、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおける有意な抗腫瘍効果と相関することが示される。
【実施例１９】
【０１８１】
ＣＥＡ−ＤＯＭ抗腫瘍効果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に依存する。
【０１８２】
ＣＥＡ−ＤＯＭ融合体をコードするベクターによるＤＮＡ−ＥＰ及びＡｄの免疫付与において観察される抗腫瘍効果に関与するエフェクター細胞の特徴を調べた。ＤＮＡ／Ａｄ免疫付与後、腫瘍負荷試験前に、マウスに対して、ＭＡｂによりＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞の枯渇処理を行った。関連するＮＫ細胞サブセット及びＴ細胞サブセットが継続して除去されていることを確実にするために、腫瘍負荷試験の経過の間に抗体を与えた。３種類の細胞タイプ全ての除去を、細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリ分析により調べた（データ非表示）。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞の除去は、免疫付与マウスの生存に負の効果があり、結果として、ワクチン接種した群と比較すると、腫瘍のないマウス数が著しく減少した（図２５）。したがって、これらのデータから、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＥＡ−ＤＯＭワクチン接種により発揮される抗腫瘍効果において重要な役割を果たすことが示される。
【実施例２０】
【０１８３】
統計分析
示される場合、結果は対数格付け又は両側のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により分析した。０．０５未満のｐ値を有意とした。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】図１は、本発明で開発されたベクターの略図を示す。ＣＥＡ−ＬＴＡ及びＣＥＡ−ＬＴＢ融合体をコードする本プラスミド及びＡｄベクターの基本的な性質が示される。Ａｄ５ゲノムの逆方向末端反復（ＩＴＲ）も示す。
【図２Ａ−１】図２は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＡ融合体の、ヌクレオチド（配列番号７、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号８、パネルＢ）を示す。ＬＴＡヌクレオチド配列は太字で示す。
【図２Ａ−２】図２は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＡ融合体の、ヌクレオチド（配列番号７、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号８、パネルＢ）を示す。ＬＴＡヌクレオチド配列は太字で示す。
【図２Ｂ】図２は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＡ融合体の、ヌクレオチド（配列番号７、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号８、パネルＢ）を示す。ＬＴＡヌクレオチド配列は太字で示す。
【図３Ａ−１】図３は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号９、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１０、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図３Ａ−２】図３は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号９、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１０、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図３Ｂ】図３は、代表的ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号９、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１０、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図４Ａ】図４は、代表的ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図４Ｂ】図４は、代表的ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。ＬＴＢヌクレオチド配列は太字で示す。
【図５Ａ−１】図５は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔと表示する、代表的な完全最適化ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１２、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１３、パネルＢ）を示す。ＬＴＡＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図５Ａ−２】図５は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔと表示する、代表的な完全最適化ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１２、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１３、パネルＢ）を示す。ＬＴＡＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図５Ｂ】図５は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢｏｐｔと表示する、代表的な完全最適化ｈＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド配列（配列番号１２、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１３、パネルＢ）を示す。ＬＴＡＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図６Ａ−１】図６は、本明細書中でｒｈＣＥＡｏｐｔＬＴＢｏｐｔと表示する、完全最適化アカゲザルＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号１４、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１５、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図６Ａ−２】図６は、本明細書中でｒｈＣＥＡｏｐｔＬＴＢｏｐｔと表示する、完全最適化アカゲザルＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号１４、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１５、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図６Ｂ】図６は、本明細書中でｒｈＣＥＡｏｐｔＬＴＢｏｐｔと表示する、完全最適化アカゲザルＣＥＡ−ＬＴＢ融合体の、ヌクレオチド（配列番号１４、パネルＡ）及びアミノ酸配列（配列番号１５、パネルＢ）を示す。ＬＴＢヌクレオチド及びアミノ酸配列は太字で示す。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部の配列に下線を付す。
【図７Ａ−１】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ａ−２】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｂ−１】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｂ−２】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｃ】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｄ】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７Ｅ】図７は、既に述べられているように（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４７，２０３）、アカゲザルＣＥＡをコードする、野生型遺伝子のヌクレオチド配列（パネルＡ及びＢ、配列番号１６及び１７）及び対応するタンパク質のアミノ酸配列（パネルＣ及びＤ、配列番号１８及び１９）を示す。パネルＥは、既に述べられている（例えば、米国特許第５，２７４，０８７号を参照。）、野生型ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図８Ａ】図８は、様々なＣＥＡコンストラクトを用いてトランスフェクションした細胞におけるＣＥＡ発現効率の比較を示す。パネルＡは、トレーサーとしてプラスミド ｐＶ１Ｊ／ｍＥＰＯ ０．２μｇと組み合わせて、ｈＣＥＡ、ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｈＣＥＡ−ＬＴＢの野生型配列を担うプラスミド ３μｇを用いてトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の発現効率を示す。パネルＢは、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを用いた、同様のトランスフェクション実験からの結果を示す。細胞抽出物中に存在するＣＥＡタンパク質量を測定し、ＥＰＯ発現に対してこの値を正規化することによって、トランスフェクションから３日後に発現効率を調べた。示すデータは、２つの独立したトランスフェクションの平均ＣＥＡ発現値に関する。
【図８Ｂ】図８は、様々なＣＥＡコンストラクトを用いてトランスフェクションした細胞におけるＣＥＡ発現効率の比較を示す。パネルＡは、トレーサーとしてプラスミド ｐＶ１Ｊ／ｍＥＰＯ ０．２μｇと組み合わせて、ｈＣＥＡ、ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｈＣＥＡ−ＬＴＢの野生型配列を担うプラスミド ３μｇを用いてトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の発現効率を示す。パネルＢは、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを用いた、同様のトランスフェクション実験からの結果を示す。細胞抽出物中に存在するＣＥＡタンパク質量を測定し、ＥＰＯ発現に対してこの値を正規化することによって、トランスフェクションから３日後に発現効率を調べた。示すデータは、２つの独立したトランスフェクションの平均ＣＥＡ発現値に関する。
【図９】図９は、ＣＥＡを発現する様々なアデノウイルス組み換えベクターの発現効率の比較を示す。ＨｅＬａ細胞に、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢを用いて１００から１０００のｍｏｉで感染処理を行った。トランスフェクションから３日後に細胞抽出物に放出されるＣＥＡタンパク質量を測定することにより、発現効率を調べた。示すデータは、２つの独立したトランスフェクションの平均ＣＥＡ発現値を反映する。
【図１０Ａ】図１０は、ヒトＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘発される細胞性免疫反応の分析を示す。０及び３週に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群に、指示されたプラスミド（ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体又はＣＥＡ−ＬＴＢ融合体）５０μｇを筋肉内に電気注入した。マウスの４番目の群に、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ ２５μｇ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ ２５μｇの混合物を用いて免疫付与を行った。パネルＡ．追加免疫から２週間後、個々のマウス由来の脾臓細胞において、全タンパク質を包含するペプチドプールを用いて、ＣＥＡに特異的な、ＩＦＮγ−分泌Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた（白丸）。幾何平均値（黒菱形）も示す。パネルＢは、免疫マウス由来のプールした脾臓細胞の、ペプチドプールＤを用いた、ＩＦＮγ細胞内染色の結果を示す。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１０Ｂ−１】図１０は、ヒトＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘発される細胞性免疫反応の分析を示す。０及び３週に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群に、指示されたプラスミド（ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体又はＣＥＡ−ＬＴＢ融合体）５０μｇを筋肉内に電気注入した。マウスの４番目の群に、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ ２５μｇ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ ２５μｇの混合物を用いて免疫付与を行った。パネルＡ．追加免疫から２週間後、個々のマウス由来の脾臓細胞において、全タンパク質を包含するペプチドプールを用いて、ＣＥＡに特異的な、ＩＦＮγ−分泌Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた（白丸）。幾何平均値（黒菱形）も示す。パネルＢは、免疫マウス由来のプールした脾臓細胞の、ペプチドプールＤを用いた、ＩＦＮγ細胞内染色の結果を示す。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１０Ｂ−２】図１０は、ヒトＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘発される細胞性免疫反応の分析を示す。０及び３週に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群に、指示されたプラスミド（ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＬＴＡ融合体又はＣＥＡ−ＬＴＢ融合体）５０μｇを筋肉内に電気注入した。マウスの４番目の群に、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ ２５μｇ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢ ２５μｇの混合物を用いて免疫付与を行った。パネルＡ．追加免疫から２週間後、個々のマウス由来の脾臓細胞において、全タンパク質を包含するペプチドプールを用いて、ＣＥＡに特異的な、ＩＦＮγ−分泌Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた（白丸）。幾何平均値（黒菱形）も示す。パネルＢは、免疫マウス由来のプールした脾臓細胞の、ペプチドプールＤを用いた、ＩＦＮγ細胞内染色の結果を示す。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１１】図１１は、ＣＥＡをコードするプラスミドＤＮＡベクターを用いて免疫したマウスからの抗体タイターを示す。精製ヒトＣＥＡタンパク質に対する個々のタイターは、プラスミド ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＡ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢを用いて免疫付与した個々のマウス由来の血清でのＥＬＩＳＡにより測定した。平均値も示す（黒菱形）。
【図１２】図１２は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導される細胞性免疫反応の分析を示す。４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４）。最後の注入から２週間後、個々のマウス由来の脾臓細胞において、全タンパク質を包含するペプチドプールを用いて、ＣＥＡに特異的な、ＩＦＮγ−分泌Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた（白丸）。幾何平均値（黒菱形）も示す。
【図１３】図１３は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。Ｃ５７／ＤＲ４マウスに、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４参照）。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＤを用いて、免疫したマウス由来のプールした脾臓細胞に対してＩＦＮγ細胞内染色を行った。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１４Ａ】図１４は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。ＨＨＤマウスに、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４参照）。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＢ及びＤを用いて、免疫したマウス由来のプールした脾臓細胞に対してＩＦＮγ細胞内染色を行った。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１４Ｂ】図１４は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。ＨＨＤマウスに、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４参照）。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＢ及びＤを用いて、免疫したマウス由来のプールした脾臓細胞に対してＩＦＮγ細胞内染色を行った。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１４Ｃ】図１４は、ＣＥＡをコードする様々なプラスミドベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。ＨＨＤマウスに、前述のとおり、指示されたプラスミドを電気注入した（図４参照）。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＢ及びＤを用いて、免疫したマウス由来のプールした脾臓細胞に対してＩＦＮγ細胞内染色を行った。非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）を各群に対して示す。
【図１５Ａ】図１５は、指示されたプラスミドを１週ごとに５回電気注入することにより免疫された、ＣＥＡトランスジェニックマウス（Ｎ＝９）の細胞性及び液性免疫反応を示す。プラスミドＤＮＡ ５０μｇ総量をｉ．ｍ．で各ワクチン接種において注射した。パネルＡ．最後の注入から２週間後、ＣＥＡ特異的なＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数を、ペプチドプールＤを用いて、個々のマウス由来の脾臓細胞における細胞内染色により調べた（白丸）。幾何平均値（三角）も示す。パネルＢ．プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢを用いて免疫したマウスからの各血清におけるＥＬＩＳＡにより、精製ヒトＣＥＡタンパク質に対する個々のタイターを測定した。幾何平均値（黒菱形）も示す（黒菱形）。これらのデータから、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体がトランスジェニックマウスにおいてＣＥＡに対する寛容性を打破することが示される。
【図１５Ｂ】図１５は、指示されたプラスミドを１週ごとに５回電気注入することにより免疫された、ＣＥＡトランスジェニックマウス（Ｎ＝９）の細胞性及び液性免疫反応を示す。プラスミドＤＮＡ ５０μｇ総量をｉ．ｍ．で各ワクチン接種において注射した。パネルＡ．最後の注入から２週間後、ＣＥＡ特異的なＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数を、ペプチドプールＤを用いて、個々のマウス由来の脾臓細胞における細胞内染色により調べた（白丸）。幾何平均値（三角）も示す。パネルＢ．プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ−ＬＴＢを用いて免疫したマウスからの各血清におけるＥＬＩＳＡにより、精製ヒトＣＥＡタンパク質に対する個々のタイターを測定した。幾何平均値（黒菱形）も示す（黒菱形）。これらのデータから、ＣＥＡ−ＬＴＢ融合体がトランスジェニックマウスにおいてＣＥＡに対する寛容性を打破することが示される。
【図１６】図１６は、ＣＥＡをコードする様々なアデノウイルスベクターにより誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の分析を示す。ＣＥＡトランスジェニックマウスに、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ及びＡｄ／ＣＥＡｏｐｔ−ＬＴＢの様々な用量を用いて、０及び２週に免疫した。最後の注入から２週間後、ペプチドプールＤを用いて、免疫した各マウス由来のＰＢＭＣのＩＦＮγ細胞内染色を行った（黒丸）。幾何平均値も示す（黒菱形）。各注射群の非特異的ＩＦＮγ産生（ＤＭＳＯ）は、０．０１％以下であった。
【図１７Ａ】図１７は、ＭＣ３８−ＣＥＡ細胞を用いて負荷試験した、免疫ＣＥＡトランスジェニックマウスの腫瘍防御実験の結果を示す。１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、指示されたプラスミドＤＮＡ（５０μｇ／注射）の電気的注入により、１週ごとに５回免疫付与を行った。最後のＤＮＡ注入から２週間後、対応するＡｄベクターの１ｘ１０１０ｖｐの１回の注射により、マウスに対して追加免疫を行った。アデノウイルス追加免疫から１４日後、５ｘ１０５ ＭＣ３８−ＣＥＡ細胞を皮下注射することにより、マウスに負荷試験を行った。パネルＡは、所定の時点での腫瘍のないマウスのパーセンテージを示す。パネルＢは、各免疫群の平均腫瘍体積を報告する。これらのデータから、ＣＥＡ−ＬＴＢを用いたＣＥＡトランスジェニックマウスの免疫付与によりマウスにおける腫瘍成長が抑えられたことが示される。
【図１７Ｂ】図１７は、ＭＣ３８−ＣＥＡ細胞を用いて負荷試験した、免疫ＣＥＡトランスジェニックマウスの腫瘍防御実験の結果を示す。１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、指示されたプラスミドＤＮＡ（５０μｇ／注射）の電気的注入により、１週ごとに５回免疫付与を行った。最後のＤＮＡ注入から２週間後、対応するＡｄベクターの１ｘ１０１０ｖｐの１回の注射により、マウスに対して追加免疫を行った。アデノウイルス追加免疫から１４日後、５ｘ１０５ ＭＣ３８−ＣＥＡ細胞を皮下注射することにより、マウスに負荷試験を行った。パネルＡは、所定の時点での腫瘍のないマウスのパーセンテージを示す。パネルＢは、各免疫群の平均腫瘍体積を報告する。これらのデータから、ＣＥＡ−ＬＴＢを用いたＣＥＡトランスジェニックマウスの免疫付与によりマウスにおける腫瘍成長が抑えられたことが示される。
【図１８Ａ】パネルＡは、本実験で用いられる代表的なＣＥＡ融合タンパク質の略図を示す。ＣＥＡ融合タンパク質を発現するベクターは、実施例２において示すように、プラスミド ｐＶ１Ｊｎｓ由来であった。このコンストラクトは、ＧＰＩアンカー配列に対応する６４ａａの正味の欠失がある、ｎｔ１からｎｔ２０３７までのＣＥＡヌクレオチド配列を含有し、ａａ１からａａ６７９のＣＥＡを発現する。ＣＥＡに融合させられている各タンパク質を統合する配列も示す。パネルＢは、トランスフェクション細胞における、ｐＶ１Ｊ由来のコンストラクトの発現を示す。ＨｅＬａ細胞に、プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ又はｐＶ１Ｊ／ＣＥＡをトランスフェクションし、実施例５で述べるようにして、ウェスタンブロット分析のために処理した。ウェスタンブロットに使用する抗体の特異性を示す。ＣＥＡタンパク質を示す（黒矢印）。分子サイズ標準の位置（キロダルトン）も示す。
【図１８Ｂ】パネルＡは、本実験で用いられる代表的なＣＥＡ融合タンパク質の略図を示す。ＣＥＡ融合タンパク質を発現するベクターは、実施例２において示すように、プラスミド ｐＶ１Ｊｎｓ由来であった。このコンストラクトは、ＧＰＩアンカー配列に対応する６４ａａの正味の欠失がある、ｎｔ１からｎｔ２０３７までのＣＥＡヌクレオチド配列を含有し、ａａ１からａａ６７９のＣＥＡを発現する。ＣＥＡに融合させられている各タンパク質を統合する配列も示す。パネルＢは、トランスフェクション細胞における、ｐＶ１Ｊ由来のコンストラクトの発現を示す。ＨｅＬａ細胞に、プラスミド、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＨＳＰ７０、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＬＡＭＰ又はｐＶ１Ｊ／ＣＥＡをトランスフェクションし、実施例５で述べるようにして、ウェスタンブロット分析のために処理した。ウェスタンブロットに使用する抗体の特異性を示す。ＣＥＡタンパク質を示す（黒矢印）。分子サイズ標準の位置（キロダルトン）も示す。
【図１９Ａ】図１９は、ＣＥＡ融合コンストラクトの発現効率の比較を示す。ＨｅＬａ細胞に、指示されたプラスミドをトランスフェクションし、実施例８で述べるようにして、ＥＬＩＳＡにより、細胞溶解液に存在するＣＥＡ由来タンパク質（Ａ）及び上清（Ｂ）の測定を行った。得られた結果は、２つの独立の実験の代表である。
【図１９Ｂ】図１９は、ＣＥＡ融合コンストラクトの発現効率の比較を示す。ＨｅＬａ細胞に、指示されたプラスミドをトランスフェクションし、実施例８で述べるようにして、ＥＬＩＳＡにより、細胞溶解液に存在するＣＥＡ由来タンパク質（Ａ）及び上清（Ｂ）の測定を行った。得られた結果は、２つの独立の実験の代表である。
【図２０Ａ】図２０は、ＣＥＡ融合タンパク質をコードする様々なコンストラクトの免疫原性の比較を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、指示されたプラスミド ５又は５０μｇ／投与を用いて筋肉内にエレクトロポレーションを行った。第０日及び１４日に注射を行った。パネルＡ 実施例６及び１５で述べるようにして、ａａ４９７−７０３（プールＤ）をカバーするペプチドのプールを用いて、各個別のマウスにおけるＰＢＭＣ中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞数を調べた。ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の平均数も示す（黒丸）。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのＳＦＣ値は、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡのそれと有意差がある。パネルＢ．基質として精製ＣＥＡを用いたＥＬＩＳＡにより、抗体タイターを測定した。指示されたプラスミド ５０μｇ用量で免疫した各コホートの平均値を示す。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡを注射したマウスのタイターと有意差があるタイターに星印を付す。
【図２０Ｂ】図２０は、ＣＥＡ融合タンパク質をコードする様々なコンストラクトの免疫原性の比較を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、指示されたプラスミド ５又は５０μｇ／投与を用いて筋肉内にエレクトロポレーションを行った。第０日及び１４日に注射を行った。パネルＡ 実施例６及び１５で述べるようにして、ａａ４９７−７０３（プールＤ）をカバーするペプチドのプールを用いて、各個別のマウスにおけるＰＢＭＣ中のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞数を調べた。ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の平均数も示す（黒丸）。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭ及びｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのＳＦＣ値は、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡのそれと有意差がある。パネルＢ．基質として精製ＣＥＡを用いたＥＬＩＳＡにより、抗体タイターを測定した。指示されたプラスミド ５０μｇ用量で免疫した各コホートの平均値を示す。ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡを注射したマウスのタイターと有意差があるタイターに星印を付す。
【図２１Ａ】図２１は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応の誘導を示す。１２匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与 大腿四頭筋に電気的注入）又はアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）を用いて免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）及びＡｄ／Ａｄ（Ｃ）免疫法により誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＡｄ／Ａｄ法により免疫された、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ｂ）又はＡｄ／Ａｄ（Ｄ）免疫付与法でワクチン接種された各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。
【図２１Ｂ】図２１は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応の誘導を示す。１２匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与 大腿四頭筋に電気的注入）又はアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）を用いて免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）及びＡｄ／Ａｄ（Ｃ）免疫法により誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＡｄ／Ａｄ法により免疫された、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ｂ）又はＡｄ／Ａｄ（Ｄ）免疫付与法でワクチン接種された各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。
【図２１Ｃ】図２１は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応の誘導を示す。１２匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与 大腿四頭筋に電気的注入）又はアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）を用いて免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）及びＡｄ／Ａｄ（Ｃ）免疫法により誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＡｄ／Ａｄ法により免疫された、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ｂ）又はＡｄ／Ａｄ（Ｄ）免疫付与法でワクチン接種された各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。
【図２１Ｄ】図２１は、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるＣＥＡ特異的免疫反応の誘導を示す。１２匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与 大腿四頭筋に電気的注入）又はアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）を用いて免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）及びＡｄ／Ａｄ（Ｃ）免疫法により誘導されたＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＡｄ／Ａｄ法により免疫された、ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ｂ）又はＡｄ／Ａｄ（Ｄ）免疫付与法でワクチン接種された各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。
【図２２Ａ】図２２は、ＤＮＡ／Ａｄ法の免疫原性を示す。１２のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与）及びアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）で免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した（Ａ）。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｂ）。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。平均値を示す（黒丸）。
【図２２Ｂ】図２２は、ＤＮＡ／Ａｄ法の免疫原性を示す。１２のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのコドン使用最適化ｃＤＮＡを担う、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／投与）及びアデノウイルスベクター（１０９ｖｐ／投与）で免疫付与した。各免疫マウスのＰＢＭＣにおいて、細胞内ＩＦＮγ染色により、ＣＥＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した（Ａ）。各コホートの平均値も示す（黒丸）。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧコホートは、ＣＥＡワクチン接種群と有意差があった。各個別マウスのＣＥＡ特異的抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｂ）。ＣＥＡ−ＤＯＭ及びＣＥＡ−ＦｃＩｇＧベクターにより誘導されるタイターは、ＣＥＡにより誘導されるものと有意差があった。平均値を示す（黒丸）。
【図２３】図２３は、破傷風トキソイドタンパク質に対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応の検出を示す。実施例１６で述べるようにして、ＣＥＡトランスジェニックマウスに、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔで免疫付与した。ペプチドｐ３０を用いて、免疫マウス由来のプールしたＰＢＭＣにおいて、ＩＦＮγ細胞内染色を行った。全リンパ球のゲーティング及びＣＤ８＋（Ｒ３）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｒ４）に対するゲーティングを示す。
【図２４Ａ】図２４は、コドン最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うベクターを用いたワクチン接種の抗腫瘍効果を示す。実施例１８で述べるようにして、１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）、Ａｄ／Ａｄ（Ｂ）及びＤＮＡ／Ａｄ（Ｃ）のワクチン接種法により、コドン使用最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うプラスミドＤＮＡ及びＡｄベクターを用いて免疫付与した。最後の注射から２週間後、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ腫瘍細胞のｓｃ接種により、マウスに負荷試験を行った。ワクチン接種群における腫瘍のないマウスのパーセンテージを週に１回の間隔で調べ、非処置対照と比較した。ＣＥＡ−ＤＯＭベクター（ＤＮＡ／Ａｄ様式）でワクチン接種したマウスは、対照マウスと有意差があった（ｌｏｇ順位検定 ｐ＜０．０５）。
【図２４Ｂ】図２４は、コドン最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うベクターを用いたワクチン接種の抗腫瘍効果を示す。実施例１８で述べるようにして、１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）、Ａｄ／Ａｄ（Ｂ）及びＤＮＡ／Ａｄ（Ｃ）のワクチン接種法により、コドン使用最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うプラスミドＤＮＡ及びＡｄベクターを用いて免疫付与した。最後の注射から２週間後、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ腫瘍細胞のｓｃ接種により、マウスに負荷試験を行った。ワクチン接種群における腫瘍のないマウスのパーセンテージを週に１回の間隔で調べ、非処置対照と比較した。ＣＥＡ−ＤＯＭベクター（ＤＮＡ／Ａｄ様式）でワクチン接種したマウスは、対照マウスと有意差があった（ｌｏｇ順位検定 ｐ＜０．０５）。
【図２４Ｃ】図２４は、コドン最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うベクターを用いたワクチン接種の抗腫瘍効果を示す。実施例１８で述べるようにして、１０匹のＣＥＡトランスジェニックマウスの群に、ＤＮＡ／ＤＮＡ（Ａ）、Ａｄ／Ａｄ（Ｂ）及びＤＮＡ／Ａｄ（Ｃ）のワクチン接種法により、コドン使用最適化された、ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＤＯＭ又はＣＥＡ−ＦｃＩｇＧのｃＤＮＡを担うプラスミドＤＮＡ及びＡｄベクターを用いて免疫付与した。最後の注射から２週間後、５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ腫瘍細胞のｓｃ接種により、マウスに負荷試験を行った。ワクチン接種群における腫瘍のないマウスのパーセンテージを週に１回の間隔で調べ、非処置対照と比較した。ＣＥＡ−ＤＯＭベクター（ＤＮＡ／Ａｄ様式）でワクチン接種したマウスは、対照マウスと有意差があった（ｌｏｇ順位検定 ｐ＜０．０５）。
【図２５】図２５は、ＣＥＡ−ＤＯＭ ＤＮＡ／Ａｄ免疫付与により誘導される抗腫瘍効果の誘導における、ＣＤ４、ＣＤ８又はＮＫ枯渇の影響を示す。ＣＥＡトランスジェニックマウスに対して、ｐＶ１Ｊ／ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ ５０μｇを毎週繰り返し注射して免疫付与し、次いで、Ａｄ−ＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔ １ｘ１０９ｖｐを用いて追加免疫を行った（実施例１９）。最後の注射から１週間後、マウスに対して、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞を枯渇させないか、又は枯渇させた。最後の免疫から２週間後、マウスに対して、５ｘ１０５個のＭＣ３９−ＣＥＡ腫瘍細胞のｓｃ接種により負荷試験を行った。ワクチン接種群における、腫瘍のないマウスのパーセンテージを週に１回の間隔で調べ、非処置対照と比較した。このデータから、ワクチン接種群における腫瘍のないマウスのパーセンテージは、非処置対照及び枯渇コホートと有意差があったことが示される。
【図２６Ａ−１】図２６は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＤＯＭｏｐｔと表示される、代表的な、完全最適化ｈＣＥＡ−ＤＯＭ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。コードされるタンパク質のアミノ酸配列も示す（配列番号４５）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２６Ａ−２】図２６は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＤＯＭｏｐｔと表示される、代表的な、完全最適化ｈＣＥＡ−ＤＯＭ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。コードされるタンパク質のアミノ酸配列も示す（配列番号４５）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２６Ａ−３】図２６は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＤＯＭｏｐｔと表示される、代表的な、完全最適化ｈＣＥＡ−ＤＯＭ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。コードされるタンパク質のアミノ酸配列も示す（配列番号４５）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２７Ａ−１】図２７は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＦｃＩｇＧｏｐｔと表示される、代表的な、ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。コードされるタンパク質の配列も示す（配列番号４６）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＦｃＩｇＧ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２７Ａ−２】図２７は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＦｃＩｇＧｏｐｔと表示される、代表的な、ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。コードされるタンパク質の配列も示す（配列番号４６）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＦｃＩｇＧ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２７Ａ−３】図２７は、本明細書中でｈＣＥＡｏｐｔＦｃＩｇＧｏｐｔと表示される、代表的な、ｈＣＥＡ−ＦｃＩｇＧｏｐｔ融合体のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。コードされるタンパク質の配列も示す（配列番号４６）。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド１から２０３７からなり、これは、ヒト宿主細胞での高レベル発現のために、コドン最適化されている。このヌクレオチド配列のＦｃＩｇＧ部分は太字で示すが、これもヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＣＥＡ及びＬＴＢ配列を融合させるために用いたクローニングストラテジーにより生成された連結部配列に下線を付す。
【図２８Ａ】図２８は、ａａ１からａａ６７９（配列番号２３、パネルＢ）のｈＣＥＡタンパク質の一部をコードする、ｎｔ１から２０３７ｎｔ（配列番号２２、パネルＡ）の野生型ヒトＣＥＡ ｃＤＮＡの一部のヌクレオチド配列を示す。
【図２８Ｂ】図２８は、ａａ１からａａ６７９（配列番号２３、パネルＢ）のｈＣＥＡタンパク質の一部をコードする、ｎｔ１から２０３７ｎｔ（配列番号２２、パネルＡ）の野生型ヒトＣＥＡ ｃＤＮＡの一部のヌクレオチド配列を示す。
【図２９】図２９は、（配列番号４８）でも示される、ＤＯＭタンパク質をコードする、ｎｔ１からｎｔ８２５（配列番号４７）の破傷風毒素断片Ｃ（ＤＯＭ）ｃＤＮＡの最小化ドメインの非最適化ヌクレオチド配列を示す。
【図３０Ａ−１】図３０は、代表的なヒトＣＥＡ−ＤＯＭ融合体（配列番号４９）の非最適化ヌクレオチド配列を示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなる。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示す。
【図３０Ａ−２】図３０は、代表的なヒトＣＥＡ−ＤＯＭ融合体（配列番号４９）の非最適化ヌクレオチド配列を示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなる。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は太字で示す。
【図３１Ａ−１】図３１は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔと表示されるアカゲザルＣＥＡ−ＤＯＭ融合体の代表的なヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す。コードされる融合タンパク質の配列（配列番号５１）も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３１Ａ−２】図３１は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔと表示されるアカゲザルＣＥＡ−ＤＯＭ融合体の代表的なヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す。コードされる融合タンパク質の配列（配列番号５１）も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３１Ｂ】図３１は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＤＯＭｏｐｔと表示されるアカゲザルＣＥＡ−ＤＯＭ融合体の代表的なヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す。コードされる融合タンパク質の配列（配列番号５１）も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＤＯＭ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３２Ａ−１】図３２は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＣＴＢｏｐｔと表示される、アカゲザルＣＥＡ−ＣＴＢ融合体の代表的ヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。コードされる融合タンパク質（配列番号５３）の配列も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＣＴＢ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３２Ａ−２】図３２は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＣＴＢｏｐｔと表示される、アカゲザルＣＥＡ−ＣＴＢ融合体の代表的ヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。コードされる融合タンパク質（配列番号５３）の配列も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＣＴＢ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【図３２Ｂ】図３２は、本明細書中でｒｈＣＥＡ−ＣＴＢｏｐｔと表示される、アカゲザルＣＥＡ−ＣＴＢ融合体の代表的ヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。コードされる融合タンパク質（配列番号５３）の配列も示す。この特定のＣＥＡ融合体のヌクレオチド配列のＣＥＡ部分は、ヌクレオチド １から２０３７からなり、ヒト宿主細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されている。ヌクレオチド配列のＣＴＢ部分は、またヒト細胞での高レベル発現のためにコドン最適化されており、太字で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み、ならびに該融合タンパク質は哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる、核酸分子。
【請求項２】
ＣＥＡタンパク質が、ヒトＣＥＡタンパク質又はその変異体である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ＣＥＡタンパク質が、アカゲザルＣＥＡタンパク質又はその変異体である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
ＣＥＡタンパク質が、Ｃ末端で末端切断されている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
Ｃ末端切断が配列番号２０のアミノ酸 ６７９から７０２を含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
免疫増強因子が、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のサブユニットＡの大部分を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
免疫増強因子が、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のサブユニットＢの大部分を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
ＬＴサブユニットＢはそのシグナル配列が末端切断されている、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
免疫増強因子がＤＯＭ又はＦｃＩｇＧの大部分を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチドの配列が、配列番号７、９、１１、１２、１４、２１、２５、４９、５０及び５２からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
ヌクレオチドの配列が、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１２に記載のヌクレオチドの配列を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該ヌクレオチドの配列が、配列番号１２に記載されている、核酸分子。
【請求項１３】
ＣＥＡタンパク質のＣ末端が、ＬＴサブユニットＢのＮ末端に融合されている、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
ベクターがアデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ベクターが、Ａｄ５ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
ベクターがＡｄ ６ベクター又はＡｄ ２４ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】
ベクターが、ｃｈｉｍｐ Ａｄベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１９】
ベクターが、ｐＶ１ＪｎｓＢである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
（ａ）請求項１に記載の核酸分子を含むベクターを適切な宿主細胞に導入することと；
（ｂ）前記ヒトＣＥＡ融合タンパク質の発現が可能となる条件下で該宿主細胞を培養することと、
を含む、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ融合タンパク質を発現させるためのプロセス。
【請求項２２】
請求項１に記載の核酸分子によりコードされる、精製されたＣＥＡ融合タンパク質。
【請求項２３】
融合タンパク質が、配列番号８、１０、１３、１５、４５、４６、５１及び５３からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む、請求項２２に記載の精製されたＣＥＡ融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む、癌を予防又は治療する方法。
【請求項２５】
哺乳動物がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ベクターが、アデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ベクターが、アデノウイルスＥ１領域に欠失があり、及びアデノウイルスＥ１領域に挿入があるアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、該挿入が、
（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み、；ならびに該融合タンパク質は哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び、
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター
を含む発現カセットを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ベクターが、プラスミド部分と、
（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分と融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び、
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター
を含む発現可能なカセットとを含むプラスミドワクチンベクターである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
Ｅ１領域での欠失及びＥ１領域での挿入を有するアデノウイルスゲノムを含み、該挿入が、
（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター
を含む発現カセットを含む、アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項３０】
Ａｄ５ベクターである、請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３１】
Ａｄ６ベクター又はＡｄ２４ベクターである、請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
プラスミド部分及び発現カセット部分を含み、該発現カセット部分が、
（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び、
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、
を含む、ワクチンプラスミド。
【請求項３３】
（ａ）（ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター
を含む第一のベクターを哺乳動物に導入すること；
（ｂ）所定の時間を経過させることと；及び
（ｃ）（ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドと（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター、
を含む第二のベクターを該哺乳動物に導入すること
を含む、ＣＥＡ関連癌に罹患しているか又は罹患しやすい哺乳動物を処置する方法。
【請求項３４】
第一のベクターがプラスミドであり、第二のベクターがアデノウイルスベクターである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第一のベクターがアデノウイルスベクターであり、第二のベクターがプラスミドである、請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合させられているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み、ならびに該融合タンパク質は哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる、核酸分子。
【請求項２】
ＣＥＡタンパク質が、ヒトＣＥＡタンパク質又はその変異体である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ＣＥＡタンパク質が、アカゲザルＣＥＡタンパク質又はその変異体である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
ＣＥＡタンパク質が、Ｃ末端で末端切断されている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
Ｃ末端切断が配列番号２０のアミノ酸 ６７９から７０２を含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
免疫増強因子が、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のサブユニットＡの大部分を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
免疫増強因子が、Ｅ．コリの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のサブユニットＢの大部分を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
ＬＴサブユニットＢはそのシグナル配列が末端切断されている、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
免疫増強因子がＤＯＭ又はＦｃＩｇＧの大部分を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチドの配列が、配列番号７、９、１１、１２、１４、２１、２５、４９、５０及び５２からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
ヌクレオチドの配列が、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１２に記載のヌクレオチドの配列を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該ヌクレオチドの配列が、配列番号１２に記載されている、核酸分子。
【請求項１３】
ＣＥＡタンパク質のＣ末端が、ＬＴサブユニットＢのＮ末端に融合されている、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
ベクターがアデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ベクターが、Ａｄ５ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
ベクターがＡｄ ６ベクター又はＡｄ ２４ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】
ベクターが、ｃｈｉｍｐ Ａｄベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１９】
ベクターが、ｐＶ１ＪｎｓＢである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
（ａ）請求項１に記載の核酸分子を含むベクターを適切な宿主細胞に導入することと；
（ｂ）前記ヒトＣＥＡ融合タンパク質の発現が可能となる条件下で該宿主細胞を培養することと、
を含む、組み換え宿主細胞においてＣＥＡ融合タンパク質を発現させるためのプロセス。
【請求項２２】
請求項１に記載の核酸分子によりコードされる、精製されたＣＥＡ融合タンパク質。
【請求項２３】
融合タンパク質が、配列番号８、１０、１３、１５、４５、４６、５１及び５３からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む、請求項２２に記載の精製されたＣＥＡ融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む、癌を予防又は治療する方法。
【請求項２５】
哺乳動物がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ベクターが、アデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ベクターが、アデノウイルスＥ１領域に欠失があり、及びアデノウイルスＥ１領域に挿入があるアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、該挿入が、
（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み、；ならびに該融合タンパク質は哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び、
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター
を含む発現カセットを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ベクターが、プラスミド部分と、
（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分と融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び、
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター
を含む発現可能なカセットとを含むプラスミドワクチンベクターである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
Ｅ１領域での欠失及びＥ１領域での挿入を有するアデノウイルスゲノムを含み、該挿入が、
（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター
を含む発現カセットを含む、アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項３０】
Ａｄ５ベクターである、請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３１】
Ａｄ６ベクター又はＡｄ２４ベクターである、請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
プラスミド部分及び発現カセット部分を含み、該発現カセット部分が、
（ａ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び、
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、
を含む、ワクチンプラスミド。
【請求項３３】
（ａ）（ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；及び
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター
を含む第一のベクターを哺乳動物に導入すること；
（ｂ）所定の時間を経過させることと；及び
（ｃ）（ｉ）ＣＥＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドと（ここで、該ＣＥＡ融合タンパク質は、ＤＯＭ、ＦｃＩｇＧ、ＣＴ、ＬＴＡ及びＬＴＢからなる群から選択される免疫増強因子の大部分に融合されているＣＥＡタンパク質又はその変異体を含み；ならびに該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫反応を生じさせることができる。）；
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター、
を含む第二のベクターを該哺乳動物に導入すること
を含む、ＣＥＡ関連癌に罹患しているか又は罹患しやすい哺乳動物を処置する方法。
【請求項３４】
第一のベクターがプラスミドであり、第二のベクターがアデノウイルスベクターである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第一のベクターがアデノウイルスベクターであり、第二のベクターがプラスミドである、請求項３３に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ｂ】
【図３Ａ−１】
【図３Ａ−２】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ−１】
【図５Ａ−２】
【図５Ｂ】
【図６Ａ−１】
【図６Ａ−２】
【図６Ｂ】
【図７Ａ−１】
【図７Ａ−２】
【図７Ｂ−１】
【図７Ｂ−２】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ−１】
【図１０Ｂ−２】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２５】
【図２６Ａ−１】
【図２６Ａ−２】
【図２６Ａ−３】
【図２７Ａ−１】
【図２７Ａ−２】
【図２７Ａ−３】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９】
【図３０Ａ−１】
【図３０Ａ−２】
【図３１Ａ−１】
【図３１Ａ−２】
【図３１Ｂ】
【図３２Ａ−１】
【図３２Ａ−２】
【図３２Ｂ】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ｂ】
【図３Ａ−１】
【図３Ａ−２】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ−１】
【図５Ａ−２】
【図５Ｂ】
【図６Ａ−１】
【図６Ａ−２】
【図６Ｂ】
【図７Ａ−１】
【図７Ａ−２】
【図７Ｂ−１】
【図７Ｂ−２】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ−１】
【図１０Ｂ−２】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２５】
【図２６Ａ−１】
【図２６Ａ−２】
【図２６Ａ−３】
【図２７Ａ−１】
【図２７Ａ−２】
【図２７Ａ−３】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９】
【図３０Ａ−１】
【図３０Ａ−２】
【図３１Ａ−１】
【図３１Ａ−２】
【図３１Ｂ】
【図３２Ａ−１】
【図３２Ａ−２】
【図３２Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５３７７２２（Ｐ２００７−５３７７２２Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５２５１２（Ｐ２００６−５５２５１２）
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１１１４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７９７７
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１１１４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７９７７
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
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