発がん性の評価方法
【課題】被検物質が有する発がん性であって、臓器を特定しない広範囲の発がん性を簡便かつ迅速に評価することができる発がん性の評価方法を提供する。
【解決手段】非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価する発がん性の評価方法であって、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含み、前記複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子であることを特徴とする発がん性の評価方法が提供される。本発明の発がん性の評価方法によれば、肝臓における当該遺伝子の発現量を調べるだけで、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の臓器に対する発がん性を一度に調べることができる。
【解決手段】非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価する発がん性の評価方法であって、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含み、前記複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子であることを特徴とする発がん性の評価方法が提供される。本発明の発がん性の評価方法によれば、肝臓における当該遺伝子の発現量を調べるだけで、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の臓器に対する発がん性を一度に調べることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発がん性の評価方法に関し、さらに詳細には、被検物質が有する発がん性であって、臓器を特定しない広範囲の発がん性を簡便かつ迅速に評価することができる発がん性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢者だけでなく比較的若い年齢層においても癌を発症する人が増加傾向にある。発がんは様々な原因により起こりうるが、日常的に摂取している食品の影響が大きな原因の１つと考えられる。このような現状の下、食品添加物等の化学物質の発がん性の有無を事前に検査することは極めて重要である。
【０００３】
現在行われている発がん性試験は、げっ歯類にその生涯期間に相当する２年間に渡って被検物質を投与し、各臓器に対する発がん性を肉眼や病理的検査をもって調べる試験が基本である。この発がん性試験には膨大な時間・資源が必要とされる。
【０００４】
一方、近年のＤＮＡマイクロアレイ技術の発達によって、大量の遺伝子発現プロファイルを短時間で調べることができるようなってきた。そして、マイクロアレイを用いて被検物質の発がん性を検討している例がある。例えば、特許文献１には、マイクロアレイを用いて選抜された特定の遺伝子の肝臓由来細胞における発現量を指標として、肝臓に対する発がん性（肝臓腫瘍性病変の有無）を検定する方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００６−１１５７９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述のように、現在行われている発がん性試験は膨大な時間・資源が必要とし、時間的・資源的ロスが大きい。また一般に、発がん性物質は生体の様々な臓器に対して発がん作用を示し、また、発がん物質ごとに標的臓器が決まっている場合が多い。しかし、被検物質が有する発がん性の標的臓器は事前には分からないので、当該発がん性試験においては全ての臓器について発がんの有無を調査する必要があり、煩雑である。また、発がんの前段階や微小な発がんについては肉眼や病理的検査では検出できないおそれがあり、見逃される可能性がある。
【０００６】
特許文献１に開示されている方法によれば、遺伝子の発現量を指標とするので操作が簡便であり、多くのサンプルを同時に処理することができる。しかし、この方法は肝臓に対する発がん性を調べるものであり、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の発がん性を調べるものではない。
【０００７】
本発明の目的は、被検物質が有する発がん性であって、臓器を特定しない広範囲の発がん性を簡便かつ迅速に評価することができる発がん性の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、様々な投与経路（経口、皮下、腹腔内など）から投与された物質は必ず門脈を介して先ず肝臓に運ばれることに着目し、被検物質を投与したときの肝臓の状態を詳細に調べることで、肝臓以外の臓器に対する発がん性も評価できる可能性があると考えた。そして、被検物質を投与した非ヒト動物の肝臓における遺伝子発現プロファイルを調べることで、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の臓器に対する発がん性を調べることができることを見出し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価する発がん性の評価方法であって、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含み、前記複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子であることを特徴とする発がん性の評価方法である。
【００１０】
本発明の発がん性の評価方法は、非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価するものであり、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含む。そして、当該複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に、肝臓においてその発現量が変化する遺伝子である。本発明の発がん性の評価方法においては、遺伝子の発現量を指標として被検物質の発がん性を評価するので、被検物質を非ヒト動物に長期に渡って投与する必要がなく、迅速かつ簡便に発がん性の評価が行える。また、遺伝子の発現量を指標とするので、肉眼や病理的検査では検出できない発がんの前段階等をも検出対象とすることができる。さらに、指標とする遺伝子は複数種であり、当該複数種の遺伝子が肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化するものであるので、肝臓における当該遺伝子の発現量を調べるだけで、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の臓器に対する発がん性を一度に調べることができる。
【００１１】
ここで、「肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に、肝臓においてその発現量が変化する遺伝子」における「発現量が変化する遺伝子」とは、「発現量が所定の上限値以上に増加する遺伝子、あるいは所定の下限値以下に減少する遺伝子」と換言することができる。すなわち、「発現量の変化」には発現量の増加と減少の両方が含まれる。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、下記工程（１）〜（４）を含む手順によって前記複数種の遺伝子を選抜することを特徴とする請求項１に記載の発がん性の評価方法である。
（１）非ヒト動物の複数の群を設定し、一方、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する既知の発がん物質を複数種選定し、各群に対して互いに異なる種類の発がん物質を投与する工程、
（２）投与から所定の時間が経過した後、各群の非ヒト動物から肝臓を摘出する工程、
（３）摘出した肝臓から核酸を単離し、核酸に含まれる各遺伝子の発現量を測定する工程、
（４）測定した発現量を元に、発現量が変化した複数種の遺伝子を選抜する工程。
【００１３】
本発明の発がん性の評価方法では、前記複数種の遺伝子、すなわち、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する複数種の遺伝子を、上記（１）〜（４）の工程を含む手順により選抜する。かかる構成により、前記複数種の遺伝子をより確実に選抜することができ、発がん性の評価がより正確に行える。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、工程（４）において、前記発現量と、既知の発がん性物質に代わって既知の非発がん性物質を用いた陰性対照における各遺伝子の発現量とを比較することにより、前記複数種の遺伝子を選抜することを特徴とする請求項２に記載の発がん性の評価方法である。
【００１５】
かかる構成により、前記複数種の遺伝子をさらに確実に選抜することができ、発がん性の評価がさらに正確に行える。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、前記複数種の遺伝子の発現量を指標とする際に、各遺伝子の重要度に応じた重み付けを行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００１７】
本発明の発がん性の評価方法においては、複数種の遺伝子の各々について重要度に応じた重み付けを行うので、重要度がより高い遺伝子の情報が発がん性の評価結果により大きく反映される。その結果、より正確に被検物質の発がん性を評価することができる。
【００１８】
請求項５に記載の発明は、前記複数種の遺伝子の数は１００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００１９】
また請求項６に記載の発明は、前記複数種の遺伝子の数は５００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００２０】
また請求項７に記載の発明は、前記複数種の遺伝子の数は１０００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００２１】
本発明の発がん性の評価方法においては、前記複数種の遺伝子の数が１００個以上、好ましくは５００個以上、より好ましくは１０００個以上であり、多数である。かかる構成により、さらに正確に被検物質の発がん性を評価することができる。
【００２２】
前記非ヒト動物はげっ歯類に属するものである構成が推奨される（請求項８）。
【００２３】
請求項９に記載の発明は、遺伝子の発現量の測定をｍＲＮＡ量を測定することによって行なうことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００２４】
一般に、遺伝子の発現量を評価する場合には、転写レベルと翻訳レベルの２ヶ所で行なうことができる。すなわち、転写レベルで行なう場合には、対応のｍＲＮＡ量を測定することにより発現量を評価することができ、翻訳レベルで行なう場合には、対応のタンパク質量を測定することにより発現量を評価することができる。そして、本発明の発がん性の評価方法では、ｍＲＮＡ量を測定することにより、前記複数種の遺伝子の発現量を測定する。かかる構成により、被検物質の発がん性をより高感度かつ正確に評価することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の発がん性の評価方法によれば、遺伝子の発現量を指標として被検物質の発がん性を評価するので、被検物質を非ヒト動物に長期に渡って投与する必要がなく、迅速かつ簡便に発がん性の評価が行える。また、遺伝子の発現量を指標とするので、肉眼や病理的検査では検出できない発がんの前段階等をも検出対象とすることができる。さらに、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化（増加または減少）する複数種の遺伝子の発現量を指標とするので、肝臓における当該遺伝子の発現量を調べるだけで、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の臓器に対する発がん性を一度に調べることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の発がん性の評価方法は、非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価する発がん性の評価方法であって、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含み、前記複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子であることを特徴とする。
【００２７】
本発明で用いられる非ヒト動物としては特に限定はないが、好ましい実施形態ではげっ歯類に属するものが用いられる。げっ歯類の例としては、マウス、ラット、モルモット等が挙げられる。
【００２８】
非ヒト動物への被検物質の投与方法としては、門脈を経由して肝臓に運ばれるものであれば特に限定はなく、経口、皮下、腹腔内等の経路によって投与することができる。被検物質投与後の非ヒト動物の飼育期間としては、指標とする遺伝子の種類によって適宜選択すればよいが、２４時間以内の短時間で終えることも十分可能である。
【００２９】
本発明の発がん性の評価方法では、被検物質を投与した後の当該非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程を含む。ここで、遺伝子の発現量は、ＲＮＡへの転写レベルとタンパク質への翻訳レベルの２つの段階で測定することができるが、好ましい実施形態では、ＲＮＡへの転写レベルで測定し、具体的には当該複数種の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する。この際の測定試料としては、被検物質を投与した後の非ヒト動物から肝臓を摘出し、当該肝臓のホモジネートから抽出した全核酸、全ＲＮＡ、あるいは全ｍＲＮＡを含む試料を用いることができる。これらの抽出操作は、生化学分野で通常行われている操作をそのまま採用することができる。
【００３０】
測定試料中に含まれる目的の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する方法としては、対応の遺伝子のｍＲＮＡを特異的に定量できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロット等を用いることができる。１から数十個程度の少数の遺伝子について発現量を調べる場合は、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロット等によっても発現量を調べることができる。しかし、１００個、５００個、あるいは１０００個以上といった多数の遺伝子について発現プロファイルという形で調べる場合には、ＤＮＡマイクロアレイ法が特に好ましい。
【００３１】
ＤＮＡマイクロアレイ法に使用するマイクロアレイ（「ＤＮＡチップ」とも呼ぶ）は、用いる非ヒト動物の肝臓における遺伝子の発現を網羅的に解析できるものであれば特に限定はない。マイクロアレイ上のプローブとしては、オリゴヌクレオチドをプローブとしたオリゴヌクレオチドアレイとｃＤＮＡをプローブとしたｃＤＮＡアレイのいずれも使用することができる。オリゴヌクレオチドアレイとしては、例えば、２５ｍｅｒ程度の各種オリゴヌクレオチドをのせた、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（アフィメトリクス社、登録商標）の各種マイクロアレイが使用可能である。ｃＤＮＡアレイを使用する場合は、プローブに用いるｃＤＮＡとしては、完全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）のいずれでもよく、それらはプラスミドに挿入した状態でもよいし、ＰＣＲ等で増幅した断片であってもよい。
【００３２】
ＤＮＡマイクロアレイ法で遺伝子発現を調べる場合には、測定試料に含まれるｍＲＮＡ等の核酸を蛍光標識して用いるのが一般的である。そして、各プローブとのハイブリダイズの有無を蛍光強度をもって検出する。ハイブリダイゼーションの条件としては、目的の遺伝子のｍＲＮＡが目的のプローブに特異的にハイブリダイズする条件であればよく、例えば、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ナトリウム塩，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０中、４５℃にて１６時間、の条件が挙げられる。
【００３３】
一方、ｍＲＮＡ量の測定方法としてＲＴ−ＰＣＲや定量ＰＣＲを用いる場合には、それらに使用するプローブやプライマーは、目的の遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズ又は当該遺伝子のｍＲＮＡを特異的に増幅できるものであれば何でもよい。例えば、適宜の方法で標識されたプローブ又はプライマーを用いることで、ｍＲＮＡ量を測定することができる。
【００３４】
また、タンパク質量の測定によって遺伝子の発現量を測定する場合は、摘出した肝臓の抽出物を測定試料とし、免疫測定、ウエスタンブロッティング、質量分析等の方法で、各遺伝子の翻訳産物を定量すればよい。
【００３５】
本発明の発がん性の評価方法において発現量を測定する複数種の遺伝子は、「肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子」である。当該の「発現量が変化する遺伝子」は、具体的には「発現量が所定の上限値以上に増加する遺伝子、あるいは所定の下限値以下に減少する遺伝子」である。所定の上限値・下限値の設定は適宜行えばよいが、例えば、平常時における発現量を基準として設定することができる。例えば、上限値を平常値の２倍、下限値を平常値の０．５倍に設定することができる。
【００３６】
好ましい実施形態では、下記工程（１）〜（４）：
（１）非ヒト動物の複数の群を設定し、一方、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する既知の発がん物質を複数種選定し、各群に対して互いに異なる種類の発がん物質を投与する工程、
（２）投与から所定の時間が経過した後、各群の非ヒト動物から肝臓を摘出する工程、
（３）摘出した肝臓から核酸を単離し、核酸に含まれる各遺伝子の発現量を測定する工程、
（４）測定した発現量を元に、発現量が変化した複数種の遺伝子を選抜する工程、
を含む手順によって上記複数種の遺伝子を選抜する。本実施形態の工程（１）〜（４）における、非ヒト動物の選択、非ヒト動物への発がん物質の投与、肝臓からのｍＲＮＡ等を含む試料の調製、遺伝子の発現量の測定等は、全て上記した被検物質を投与する場合と同様に行うことができる。
【００３７】
本実施形態の工程（４）において、前記発現量と、既知の発がん性物質に代わって既知の非発がん性物質を用いた陰性対照における各遺伝子の発現量とを比較することにより、前記複数種の遺伝子を選抜することができる。具体的には、例えば、所定の上限値・下限値を元に選抜された複数の遺伝子から、既知の非発がん物質を投与した前記陰性対照においてその発現量が同様に増加または減少する遺伝子を除くことにより、本発明で用いる複数種の遺伝子を選抜することができる。
【００３８】
好ましい実施形態では、前記複数種の遺伝子の発現量を指標とする際に、各遺伝子の重要度に応じた重み付けを行う。すなわち、重要度が高い遺伝子の情報が発がん性の評価結果により大きく反映されるようにする。
【００３９】
本発明の発がん性の評価方法では、肝臓における上記の複数種の遺伝子の発現量を指標として発がん性を評価するが、「指標」の具体例の１つは、遺伝子ごとに基準値を設定し、当該基準値と測定された発現量との比較に基づいて遺伝子ごとに点数を付けることが挙げられる。そして、各遺伝子における点数から総合判断を行い、被検物質の発がん性を評価する。一方、以下に詳述するような「重み付け投票（Weighted Vote）」と「予測スコア（Prediction Score）」を用いる統計学的手法によれば、遺伝子ごとの重み付けが加味されたより正確な発がん性の評価が行える。以下、本手法について説明する。
【００４０】
本手法の流れは、既知の発がん物質を用いた複数の遺伝子の選抜（第１段階）、選抜された各遺伝子についての重み付け投票の算出(第２段階）、並びに、算出された各重み付け投票を用いた予測スコアの算出（第３段階）、の３つの段階からなる。
【００４１】
（第１段階）
肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する既知の発がん物質を２種以上選定する。このとき、できるだけ多様な臓器に対する発がん性がカバーできるように幅広く選定する方がよい。また、肝臓に対する発がん性を有する発がん性物質を含めてもよい。一方、既知の非発がん性物質を１種以上選定する。
【００４２】
各発がん性物質ならびに非発がん性物質の数に相当するマウスの群を設定する。そして、各群のマウスに、選抜した各発がん物質または非発がん物質を投与する。そのまま各群のマウスを飼育する。
【００４３】
所定の時間が経過した後、各群のマウスから肝臓を摘出する。さらに各肝臓からｍＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイ法にて遺伝子発現プロファイルを調べる。そして、無処置マウスと比較して、発現量が２倍以上増加した遺伝子、及び発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子を選抜する。この遺伝子選抜を、発がん物質を投与した群と非発がん物質を投与した群の両方について行う。
【００４４】
次に、発がん物質を投与した群で発現量が増加または減少した遺伝子のうち、非発がん物質を投与した群における発現量と比較して有意に変化した遺伝子を選抜する。これにより、「肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質をマウスに投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する複数の遺伝子」が選抜される。各発がん物質について選抜された各遺伝子の発現量のデータを蓄積し、データベース化しておく。
【００４５】
一方、既知の発がん物質または非発がん物質の代わりに被検物質Ｘを用いて、同様の操作を行う。そして、既知の発がん物質と非発がん物質を用いて選抜された各遺伝子についての発現プロファイルの情報を得る。この操作は発がん物質または非発がん物質を投与する実験と同時並行で行ってもよいし、後日あらためて行ってもよい。
【００４６】
（第２段階）
被検物質Ｘを投与した群において、選抜された各遺伝子について以下の手順で重み付け投票の値を算出する。被検物質Ｘを投与した群における遺伝子ａの重み付け投票Ｖｘａは以下の数式（Ｉ）により算出される。
Ｖｘａ＝Ｓａ｛Ｘａ−（Ｍｃａ＋Ｍｎｃａ）／２｝ （Ｉ）
ここで、Ｘａは被検物質Ｘを投与した群における遺伝子ａの発現量（発現強度）、Ｍｃａは既知の発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の平均値、Ｍｎｃａは既知の非発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の平均値である。
【００４７】
数式（Ｉ）のＳａは遺伝子ａの発現の重みを付与する係数であり、以下の数式（ＩＩ）により算出される。
Ｓａ＝（Ｍｃａ−Ｍｎｃａ）／（ＳＤｃａ＋ＳＤｎｃａ） （ＩＩ）
ここで、ＳＤｃａは既知の発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の標準偏差、ＳＤｎｃａは既知の非発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の標準偏差である。
【００４８】
被検物質Ｘを投与した群において各遺伝子ｉについて重み付け投票Ｖｘｉの値を算出し、重み付け投票の総和ΣＶｉを算出する。ここで、ΣＶｉ≧１であれば被検物質Ｘは発がん物質である可能性が高く、一方、ΣＶｉ＜１であれば被検物質Ｘは発がん物質である可能性が低いと判定できる（１次判定）。
【００４９】
（第３段階）
被検物質Ｘの予測スコア（ＰＳ）は以下の数式（ＩＩＩ）により算出される。
ＰＳ＝｛ＶＸｃ−｜ＶＸｎｃ｜｝／｛ＶＸｃ＋｜ＶＸｎｃ｜｝ （ＩＩＩ）
ここで、ＶＸｃは被検物質Ｘにおいて算出した各々のＶのうち正の値であるＶ（正のＶ）の合計、ＶＸｎｃは被検物質Ｘにおいて算出した各々のＶのうち負の値であるＶ（負のＶ）の合計、｜ＶＸｎｃ｜はＶＸｎｃの絶対値である。
数式（ＩＩＩ）を用いて被検物質ＸについてＰＳの値を算出する。ここで、０＜ＰＳ≦１であれば被検物質Ｘは発がん物質の可能性が高く、−１＜ＰＳ＜０であれば被検物質Ｘは発がん物質の可能性が低いと判定できる（２次判定）。
【００５０】
なお、第１段階の既知の発がん性物質と非発がん性物質を用いた遺伝子の選抜操作、並びに当該遺伝子における発現量のデータ取得（データベース作製）操作については毎回行う必要はなく、当該データベースはその後の実験にも利用できる。また、別の発がん性物質を用いた場合の遺伝子発現データを順次蓄積してデータベースを充実させることにより、さらに正確な発がん性評価を行うことができる。
【００５１】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
１．発がん物質ならびに非発がん物質の選択
マウスに投与するための発がん物質として、以下に示す８種の物質（ＣＡ１〜ＣＡ８）を選択した。物質名の後には、発がん物質の略称、誘発される癌の種類（標的臓器）、投与量、並びに、投与方法を示した。
ＣＡ１：４−ニトロキノリン−１−オキシド（4-Nitroquinoline-1-oxide）；４ＮＱＯ；膵癌、胃と皮膚に乳頭腫；１５ｍｇ／ｋｇ；皮下投与
ＣＡ２：シクロホスファミド（Cyclophosphamide）；Ｃｙｃ；肺腺腫；３０ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＣＡ３：Ｎ，Ｎ−ジエチルニトロソアミン（N,N-Diethylnitrosoamine）；ＤＥＮ；胃癌、肺癌；９０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
ＣＡ４：エチルアクリレート（Ethyl acrylate）；Ｅｔｈｙｌ；前胃扁平上皮癌；２００ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＣＡ５：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロウレス（N-methyl-N-nitroures）；ＭＮＵ；リンパ腫、胃乳頭腫；７５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
ＣＡ６：プロカルバジン（Procarbazine）；Ｐｒｏ；肺癌、脾臓血管肉腫；１２ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
ＣＡ７：チオテパ（Thiotepa）；Ｔｈｉ；肺腺腫、胃乳頭腫、リンパ腫；２ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
ＣＡ８：ウレタン（Urethane）；ＵＲ；肺癌、脾臓血管腫；５００ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
【００５３】
また、マウスに投与するための非発がん物質として、以下の４種の物質（ＮＣＡ１〜ＮＣＡ４）を選択した。物質名の後ろには、略称、投与量、並びに、投与方法を示した。
ＮＣＡ１：α−トコフェロール（α-tocopherol）；Ｔｏｃ；１０ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＮＣＡ２：レバミピド（Rebamipide）；Ｒｅｂａ；３０ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＮＣＡ３：テプレノン（Teprenone）；Ｔｅｐ；２００ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＮＣＡ４：キシレン（Xylene）；Ｘｙｌ；１０００ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
【００５４】
２．各物質のマウスへの投与と肝臓由来ｍＲＮＡの調製
７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを準備し、１群につき６匹ずつ割り当て、１２群に分けた。各群のマウスに対して上記したいずれか１種の発がん物質（ＣＡ１〜ＣＡ８）または非発がん物質（ＮＣＡ１〜ＮＣＡ４）を投与（経口、皮下、または腹腔内）し、各群のマウスの飼育を開始した。飼育開始から３時間経過時ならびに２４時間経過時に、各群からマウスを３匹ずつ取り出し、肝臓を摘出した。各肝臓からｍＲＮＡを抽出し（ｎ＝３）、遺伝子発現解析に供するサンプルとした。
【００５５】
３．マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析
Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０−２ Ａｒｒａｙ（アフィメトリクス社）を用い、各サンプルについて遺伝子発現解析を行った。ハイブリダイゼーションの条件としては、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ナトリウム塩，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０中、４５℃にて１６時間の条件を採用した。データ解析には、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ、アフィメトリクス社）を用い、チップ及び遺伝子ごとの正規化処理、ベースライン補正等を行った後、発現強度が１００以下の遺伝子を排除し、解析対象の遺伝子をピックアップした（各群につき約２００００個）。
【００５６】
各群について、解析対象の遺伝子から、未処理マウスにおける発現強度と比較して２．０倍以上あるいは０．５倍以下の発現強度を示した遺伝子を選抜した。発がん物質を投与した群（第１群〜第８群）の投与３時間後における遺伝子の数を第１表に、非発がん物質を投与した群（第９群〜第１２群）の投与３時間後における遺伝子の数を第２表に示す。発がん物質を投与した群（第１群〜第８群）の投与２４時間後における遺伝子の数を第３表に、非発がん物質を投与した群（第９群〜第１２群）の投与２４時間後における遺伝子の数を第４表に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
次に、３時間目と２４時間目について、発がん物質が投与された群（第１群〜第８群）における遺伝子のうち、非発がん物質が投与された群（第９群〜第１２群）における遺伝子の発現強度と比較して有意に変化していた遺伝子をさらに選抜した。その結果、３時間目において遺伝子の発現量が有意に上昇した遺伝子が１２４７個（遺伝子群Ａ、発現増強遺伝子）、３時間目において遺伝子の発現量が有意に減少した遺伝子が１３８８個（遺伝子群Ｂ、発現抑制遺伝子）、２４時間目において遺伝子の発現量が有意に上昇した遺伝子が１３１９個（遺伝子群Ｃ、発現増強遺伝子）、２４時間目において遺伝子の発現量が有意に減少した遺伝子が１３４５個（遺伝子群Ｄ、発現抑制遺伝子）選抜された。
【００６２】
４．重み付け投票（Weighted Vote）と発がん性の予測スコア（Prediction Score）の算出
上述した数式（Ｉ）（ＩＩ）を用い、投与群ごと（投与した発がん物質ごと）に遺伝子群Ａ〜Ｄに属する各遺伝子について重み付け投票Ｖの値を算出した。このとき、各発がん物質を被検物質と仮定したシミュレーションを行うため、数式（Ｉ）におけるＭｃａ（既知の発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の平均値）については、その発がん物質自身の発現量を抜いて計算した（Leave-one-out-cross-validation）。さらに、発がん性物質ごとに、正のＶの総和ＶＸｃ、負のＶの総和ＶＸｎｃ、及び全てのＶの総和ΣＶｉを算出した。
【００６３】
続いて、上述の数式（ＩＩＩ）を用い、遺伝子群Ａ〜Ｄに分けて各発がん物質のＰＳを算出した。
【００６４】
非発がん物質を投与した群についても同様にして、正のＶの総和ＶＸｃ、負のＶの総和ＶＸｎｃ、及び全てのＶの総和ΣＶｉを算出した。
【００６５】
遺伝子群Ａ（３時間目における発現増強遺伝子）についてのＶとＰＳの計算結果を第５表（発がん物質投与群）と第６表（非発がん物質投与群）に示す。遺伝子群Ｂ（３時間目における発現抑制遺伝子）の計算結果を第７表（発がん物質投与群）と第８表（非発がん物質投与群）に示す。遺伝子群Ｃ（２４時間目における発現増強遺伝子）についてのＶとＰＳの計算結果を第９表（発がん物質投与群）と第１０表（非発がん物質投与群）に示す。遺伝子群Ｄ（２４時間目における発現抑制遺伝子）の計算結果を第１１表（発がん物質投与群）と第１２表（非発がん物質投与群）に示す。表中、「プローブＩＤ」はアフィメトリクス社が付与したプローブＩＤである。なお当該プローブＩＤに対応するＧｅｎＢａｎｋのアクセッションナンバーは、当業者であれば容易に検索できる。また表中の「Ｖ３ｈ 略称」はその略称に相当する物質を投与した群における投与３時間後の各Ｖの値、「Ｖ２４ｈ 略称」はその略称に相当する物質を投与した群における投与２４時間後の各Ｖの値を示す。
【００６６】
【表５】
【００６７】
【表６】
【００６８】
【表７】
【００６９】
【表８】
【００７０】
【表９】
【００７１】
【表１０】
【００７２】
【表１１】
【００７３】
【表１２】
【００７４】
第５表に示すように、遺伝子群Ａにおいて、Ｐｒｏ以外の発がん物質を投与した場合に重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが正の値となった。また第６表に示すように、遺伝子群Ａにおいて、いずれの非発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが負の値となった。一方、第７表に示すように、遺伝子群Ｂにおいて、いずれの発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが正の値となった。また、第８表に示すように、遺伝子群Ｂにおいて、いずれの非発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが負の値となった。これらの結果は、Ｖの総和ΣＶｉが正の数である場合に投与した物質が発がん物質の可能性が高いという知見と一致した。
【００７５】
第５表に示すように、遺伝子群Ａの発現増加遺伝子を指標とした場合、Ｐｒｏを除く発がん物質においてＰＳの値が０以上の値となった。また第６表に示すように、非発がん物質ではいずれも負の値となった。一方、第７表に示すように、遺伝子群Ｂの発現抑制遺伝子を指標とした場合、全ての発がん物質においてＰＳの値が０以上の値となった。また第８表に示すように、非発がん物質ではいずれも負の値となった。以上より、ＰＳの値により被検物質の発がん性を評価できることが示された。
【００７６】
第９表に示すように、遺伝子群Ｃにおいては、発がん物質のうち４ＮＱＯ、ＤＥＮ、ＭＮＵ、またはＵＲを投与した場合に重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが正の値となった。また第１０表に示すように、遺伝子群Ｃにおいて、いずれの非発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが負の値となった。一方、第１１表に示すように、遺伝子群Ｄにおいて、発がん物質のうち４ＮＱＯ、ＤＥＮ、Ｐｒｏ、またはＵＲを投与した場合に重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが正の値となった。また、第１２表に示すように、遺伝子群Ｄにおいて、いずれの非発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが負の値となった。
【００７７】
第９表に示すように、遺伝子群Ｃの発現増加遺伝子を指標とした場合、発がん物質が４ＮＱＯ、ＤＥＮ、ＭＮＵ、またはＵＲの場合においてＰＳの値が０以上の値となった。また第１０表に示すように、非発がん物質ではいずれも負の値となった。一方、第１１表に示すように、遺伝子群Ｄの発現抑制遺伝子を指標とした場合、発がん物質が４ＮＱＯ、ＤＥＮ、Ｐｒｏ、またはＵＲの場合においてＰＳの値が０以上の値となった。また第１２表に示すように、非発がん物質ではいずれも負の値となった。
以上のように、遺伝子群Ｃ，Ｄでは一部の発がん物質を投与した場合にのみΣＶｉとＰＳが正の値となったが、非発がん物質を投与した場合にはいずれもΣＶｉとＰＳが負の値となっており、１次スクリーニング等の目的には十分に使えるもの考えられた。
【００７８】
また、遺伝子群Ａ，Ｂ（投与３時間後）と遺伝子群Ｃ，Ｄ（投与２４時間後）とで結果が完全には一致しなかったことから、マウスから肝臓を摘出するタイミングが重要と考えられた。
【００７９】
本実施例では、ΣＶｉとＰＳをいずれも発現増強遺伝子（遺伝子群Ａ，Ｃ）と発現抑制遺伝子（遺伝子群Ｂ，Ｄ）とに区別して算出したが、これらを区別せずにまとめて算出してもよい。すなわち、遺伝子群ＡとＢ、並びに、遺伝子群ＣとＤをまとめてΣＶｉとＰＳを算出してもよい。
【００８０】
５．第１表〜第４表の相互比較
第１表（発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（４６個）と、第３表（発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（１２個）とで共通の遺伝子は、以下の７種であった。当該７種の遺伝子のプローブＩＤと遺伝子名を示す。
1432517_a_at（nicotinamide N-methyltransferase）
1450788_at（serum amyloid A 1）
1427747_a_at（lipocalin 2）
1419075_s_at（serum amyloid A 1）
1437176_at（expressed sequence AI451557）
1425971_at（reverse transcriptase）
1424850_at（mitogen activated protein kinase kinase kinase 1）
【００８１】
第１表（発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（１２個）と、第３表（発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（６個）とで共通の遺伝子は、以下の２種であった。
1449109_at（suppressor of cytokine signaling 2）
1449463_at（kallikrein 8）
【００８２】
第１表（発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（４６個）から、第２表（非発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（８７個）に属するものを除いた遺伝子は、以下の３６種であった。
1434203_at（cDNA sequence BC055107）
1434202_a_at（cDNA sequence BC055107）
1428942_at（metallothionein 2）
1432517_a_at（nicotinamide N-methyltransferase）
1422557_s_at（metallothionein 1）
1418288_at（lipin 1）
1426516_a_at（lipin 1）
1450788_at（serum amyloid A 1）
1453851_a_at（growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma）
1427747_a_at（lipocalin 2）
1442025_a_at（unknown）
1419075_s_at（serum amyloid A 1）
1445349_at（PREDICTED: hypothetical protein XP_489241 ）
1424937_at（RIKEN cDNA 2310076L09 gene）
1439163_at（zinc finger and BTB domain containing 16）
1448830_at（dual specificity phosphatase 1）
1441915_s_at（RIKEN cDNA 2310076L09 gene）
1436555_at（unknown）
1427425_at（RIKEN cDNA 9130208E07 gene）
1418918_at（insulin-like growth factor binding protein 1）
1425745_a_at（transforming, acidic coiled-coil containing protein 2）
1417268_at（CD14 antigen）
1424401_at（aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1）
1451557_at（tyrosine aminotransferase）
1423233_at（CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), delta）
1435452_at（transmembrane protein 20）
1420965_a_at（ectodermal-neural cortex 1）
1447905_x_at（nucleoporin 62）
1444139_at（DNA-damage-inducible transcript 4-like）
1421681_at（neuregulin 4）
1416953_at（connective tissue growth factor）
1429728_at（RIKEN cDNA 4930429M06Rik）
1440120_at（Guanine nucleotide binding protein (G protein)）
1428306_at（DNA-damage-inducible transcript 4）
1417065_at（early growth response 1）
1456981_at（transmembrane channel-like gene family 7）
【００８３】
第１表（発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（１２個）から、第２表（非発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（３９個）に属するものを除いた遺伝子は、以下の８種であった。
1429285_at（serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 9）
1432105_at（sirtuin 5 (silent mating type information regulation 2 homolog) 5 (S. cerevisiae)）
1434582_at（DNA segment, Chr 14, ERATO Doi 171, expressed）
1443505_at（PREDICTED: RIKEN cDNA A630076J17 gene [Mus musculus], mRNA sequence）
1449109_at（suppressor of cytokine signaling 2）
1458398_at（RIKEN cDNA 1700027F06 gene）
1449463_at（kallikrein 8）
1434152_at（RIKEN cDNA 2210421G13 gene /// hypothetical protein LOC193676）
【００８４】
第３表（発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（１２個）から、第４表（非発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（５１個）に属するものを除いた遺伝子は、以下の２種であった。
1459913_at（Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 (Tnfsf10), mRNA）
1429949_at（RIKEN cDNA 6530415H11 gene）
【００８５】
第３表（発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（６個）から、第４表（非発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（６０個）に属するものを除いた遺伝子は、以下の１種であった。
1449451_at（serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 11）
【技術分野】
【０００１】
本発明は発がん性の評価方法に関し、さらに詳細には、被検物質が有する発がん性であって、臓器を特定しない広範囲の発がん性を簡便かつ迅速に評価することができる発がん性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢者だけでなく比較的若い年齢層においても癌を発症する人が増加傾向にある。発がんは様々な原因により起こりうるが、日常的に摂取している食品の影響が大きな原因の１つと考えられる。このような現状の下、食品添加物等の化学物質の発がん性の有無を事前に検査することは極めて重要である。
【０００３】
現在行われている発がん性試験は、げっ歯類にその生涯期間に相当する２年間に渡って被検物質を投与し、各臓器に対する発がん性を肉眼や病理的検査をもって調べる試験が基本である。この発がん性試験には膨大な時間・資源が必要とされる。
【０００４】
一方、近年のＤＮＡマイクロアレイ技術の発達によって、大量の遺伝子発現プロファイルを短時間で調べることができるようなってきた。そして、マイクロアレイを用いて被検物質の発がん性を検討している例がある。例えば、特許文献１には、マイクロアレイを用いて選抜された特定の遺伝子の肝臓由来細胞における発現量を指標として、肝臓に対する発がん性（肝臓腫瘍性病変の有無）を検定する方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００６−１１５７９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述のように、現在行われている発がん性試験は膨大な時間・資源が必要とし、時間的・資源的ロスが大きい。また一般に、発がん性物質は生体の様々な臓器に対して発がん作用を示し、また、発がん物質ごとに標的臓器が決まっている場合が多い。しかし、被検物質が有する発がん性の標的臓器は事前には分からないので、当該発がん性試験においては全ての臓器について発がんの有無を調査する必要があり、煩雑である。また、発がんの前段階や微小な発がんについては肉眼や病理的検査では検出できないおそれがあり、見逃される可能性がある。
【０００６】
特許文献１に開示されている方法によれば、遺伝子の発現量を指標とするので操作が簡便であり、多くのサンプルを同時に処理することができる。しかし、この方法は肝臓に対する発がん性を調べるものであり、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の発がん性を調べるものではない。
【０００７】
本発明の目的は、被検物質が有する発がん性であって、臓器を特定しない広範囲の発がん性を簡便かつ迅速に評価することができる発がん性の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、様々な投与経路（経口、皮下、腹腔内など）から投与された物質は必ず門脈を介して先ず肝臓に運ばれることに着目し、被検物質を投与したときの肝臓の状態を詳細に調べることで、肝臓以外の臓器に対する発がん性も評価できる可能性があると考えた。そして、被検物質を投与した非ヒト動物の肝臓における遺伝子発現プロファイルを調べることで、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の臓器に対する発がん性を調べることができることを見出し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価する発がん性の評価方法であって、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含み、前記複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子であることを特徴とする発がん性の評価方法である。
【００１０】
本発明の発がん性の評価方法は、非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価するものであり、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含む。そして、当該複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に、肝臓においてその発現量が変化する遺伝子である。本発明の発がん性の評価方法においては、遺伝子の発現量を指標として被検物質の発がん性を評価するので、被検物質を非ヒト動物に長期に渡って投与する必要がなく、迅速かつ簡便に発がん性の評価が行える。また、遺伝子の発現量を指標とするので、肉眼や病理的検査では検出できない発がんの前段階等をも検出対象とすることができる。さらに、指標とする遺伝子は複数種であり、当該複数種の遺伝子が肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化するものであるので、肝臓における当該遺伝子の発現量を調べるだけで、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の臓器に対する発がん性を一度に調べることができる。
【００１１】
ここで、「肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に、肝臓においてその発現量が変化する遺伝子」における「発現量が変化する遺伝子」とは、「発現量が所定の上限値以上に増加する遺伝子、あるいは所定の下限値以下に減少する遺伝子」と換言することができる。すなわち、「発現量の変化」には発現量の増加と減少の両方が含まれる。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、下記工程（１）〜（４）を含む手順によって前記複数種の遺伝子を選抜することを特徴とする請求項１に記載の発がん性の評価方法である。
（１）非ヒト動物の複数の群を設定し、一方、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する既知の発がん物質を複数種選定し、各群に対して互いに異なる種類の発がん物質を投与する工程、
（２）投与から所定の時間が経過した後、各群の非ヒト動物から肝臓を摘出する工程、
（３）摘出した肝臓から核酸を単離し、核酸に含まれる各遺伝子の発現量を測定する工程、
（４）測定した発現量を元に、発現量が変化した複数種の遺伝子を選抜する工程。
【００１３】
本発明の発がん性の評価方法では、前記複数種の遺伝子、すなわち、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する複数種の遺伝子を、上記（１）〜（４）の工程を含む手順により選抜する。かかる構成により、前記複数種の遺伝子をより確実に選抜することができ、発がん性の評価がより正確に行える。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、工程（４）において、前記発現量と、既知の発がん性物質に代わって既知の非発がん性物質を用いた陰性対照における各遺伝子の発現量とを比較することにより、前記複数種の遺伝子を選抜することを特徴とする請求項２に記載の発がん性の評価方法である。
【００１５】
かかる構成により、前記複数種の遺伝子をさらに確実に選抜することができ、発がん性の評価がさらに正確に行える。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、前記複数種の遺伝子の発現量を指標とする際に、各遺伝子の重要度に応じた重み付けを行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００１７】
本発明の発がん性の評価方法においては、複数種の遺伝子の各々について重要度に応じた重み付けを行うので、重要度がより高い遺伝子の情報が発がん性の評価結果により大きく反映される。その結果、より正確に被検物質の発がん性を評価することができる。
【００１８】
請求項５に記載の発明は、前記複数種の遺伝子の数は１００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００１９】
また請求項６に記載の発明は、前記複数種の遺伝子の数は５００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００２０】
また請求項７に記載の発明は、前記複数種の遺伝子の数は１０００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００２１】
本発明の発がん性の評価方法においては、前記複数種の遺伝子の数が１００個以上、好ましくは５００個以上、より好ましくは１０００個以上であり、多数である。かかる構成により、さらに正確に被検物質の発がん性を評価することができる。
【００２２】
前記非ヒト動物はげっ歯類に属するものである構成が推奨される（請求項８）。
【００２３】
請求項９に記載の発明は、遺伝子の発現量の測定をｍＲＮＡ量を測定することによって行なうことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに１項に記載の発がん性の評価方法である。
【００２４】
一般に、遺伝子の発現量を評価する場合には、転写レベルと翻訳レベルの２ヶ所で行なうことができる。すなわち、転写レベルで行なう場合には、対応のｍＲＮＡ量を測定することにより発現量を評価することができ、翻訳レベルで行なう場合には、対応のタンパク質量を測定することにより発現量を評価することができる。そして、本発明の発がん性の評価方法では、ｍＲＮＡ量を測定することにより、前記複数種の遺伝子の発現量を測定する。かかる構成により、被検物質の発がん性をより高感度かつ正確に評価することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の発がん性の評価方法によれば、遺伝子の発現量を指標として被検物質の発がん性を評価するので、被検物質を非ヒト動物に長期に渡って投与する必要がなく、迅速かつ簡便に発がん性の評価が行える。また、遺伝子の発現量を指標とするので、肉眼や病理的検査では検出できない発がんの前段階等をも検出対象とすることができる。さらに、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化（増加または減少）する複数種の遺伝子の発現量を指標とするので、肝臓における当該遺伝子の発現量を調べるだけで、肝臓以外の臓器を含めた広範囲の臓器に対する発がん性を一度に調べることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の発がん性の評価方法は、非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価する発がん性の評価方法であって、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含み、前記複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子であることを特徴とする。
【００２７】
本発明で用いられる非ヒト動物としては特に限定はないが、好ましい実施形態ではげっ歯類に属するものが用いられる。げっ歯類の例としては、マウス、ラット、モルモット等が挙げられる。
【００２８】
非ヒト動物への被検物質の投与方法としては、門脈を経由して肝臓に運ばれるものであれば特に限定はなく、経口、皮下、腹腔内等の経路によって投与することができる。被検物質投与後の非ヒト動物の飼育期間としては、指標とする遺伝子の種類によって適宜選択すればよいが、２４時間以内の短時間で終えることも十分可能である。
【００２９】
本発明の発がん性の評価方法では、被検物質を投与した後の当該非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程を含む。ここで、遺伝子の発現量は、ＲＮＡへの転写レベルとタンパク質への翻訳レベルの２つの段階で測定することができるが、好ましい実施形態では、ＲＮＡへの転写レベルで測定し、具体的には当該複数種の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する。この際の測定試料としては、被検物質を投与した後の非ヒト動物から肝臓を摘出し、当該肝臓のホモジネートから抽出した全核酸、全ＲＮＡ、あるいは全ｍＲＮＡを含む試料を用いることができる。これらの抽出操作は、生化学分野で通常行われている操作をそのまま採用することができる。
【００３０】
測定試料中に含まれる目的の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する方法としては、対応の遺伝子のｍＲＮＡを特異的に定量できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロット等を用いることができる。１から数十個程度の少数の遺伝子について発現量を調べる場合は、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロット等によっても発現量を調べることができる。しかし、１００個、５００個、あるいは１０００個以上といった多数の遺伝子について発現プロファイルという形で調べる場合には、ＤＮＡマイクロアレイ法が特に好ましい。
【００３１】
ＤＮＡマイクロアレイ法に使用するマイクロアレイ（「ＤＮＡチップ」とも呼ぶ）は、用いる非ヒト動物の肝臓における遺伝子の発現を網羅的に解析できるものであれば特に限定はない。マイクロアレイ上のプローブとしては、オリゴヌクレオチドをプローブとしたオリゴヌクレオチドアレイとｃＤＮＡをプローブとしたｃＤＮＡアレイのいずれも使用することができる。オリゴヌクレオチドアレイとしては、例えば、２５ｍｅｒ程度の各種オリゴヌクレオチドをのせた、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（アフィメトリクス社、登録商標）の各種マイクロアレイが使用可能である。ｃＤＮＡアレイを使用する場合は、プローブに用いるｃＤＮＡとしては、完全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）のいずれでもよく、それらはプラスミドに挿入した状態でもよいし、ＰＣＲ等で増幅した断片であってもよい。
【００３２】
ＤＮＡマイクロアレイ法で遺伝子発現を調べる場合には、測定試料に含まれるｍＲＮＡ等の核酸を蛍光標識して用いるのが一般的である。そして、各プローブとのハイブリダイズの有無を蛍光強度をもって検出する。ハイブリダイゼーションの条件としては、目的の遺伝子のｍＲＮＡが目的のプローブに特異的にハイブリダイズする条件であればよく、例えば、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ナトリウム塩，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０中、４５℃にて１６時間、の条件が挙げられる。
【００３３】
一方、ｍＲＮＡ量の測定方法としてＲＴ−ＰＣＲや定量ＰＣＲを用いる場合には、それらに使用するプローブやプライマーは、目的の遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズ又は当該遺伝子のｍＲＮＡを特異的に増幅できるものであれば何でもよい。例えば、適宜の方法で標識されたプローブ又はプライマーを用いることで、ｍＲＮＡ量を測定することができる。
【００３４】
また、タンパク質量の測定によって遺伝子の発現量を測定する場合は、摘出した肝臓の抽出物を測定試料とし、免疫測定、ウエスタンブロッティング、質量分析等の方法で、各遺伝子の翻訳産物を定量すればよい。
【００３５】
本発明の発がん性の評価方法において発現量を測定する複数種の遺伝子は、「肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子」である。当該の「発現量が変化する遺伝子」は、具体的には「発現量が所定の上限値以上に増加する遺伝子、あるいは所定の下限値以下に減少する遺伝子」である。所定の上限値・下限値の設定は適宜行えばよいが、例えば、平常時における発現量を基準として設定することができる。例えば、上限値を平常値の２倍、下限値を平常値の０．５倍に設定することができる。
【００３６】
好ましい実施形態では、下記工程（１）〜（４）：
（１）非ヒト動物の複数の群を設定し、一方、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する既知の発がん物質を複数種選定し、各群に対して互いに異なる種類の発がん物質を投与する工程、
（２）投与から所定の時間が経過した後、各群の非ヒト動物から肝臓を摘出する工程、
（３）摘出した肝臓から核酸を単離し、核酸に含まれる各遺伝子の発現量を測定する工程、
（４）測定した発現量を元に、発現量が変化した複数種の遺伝子を選抜する工程、
を含む手順によって上記複数種の遺伝子を選抜する。本実施形態の工程（１）〜（４）における、非ヒト動物の選択、非ヒト動物への発がん物質の投与、肝臓からのｍＲＮＡ等を含む試料の調製、遺伝子の発現量の測定等は、全て上記した被検物質を投与する場合と同様に行うことができる。
【００３７】
本実施形態の工程（４）において、前記発現量と、既知の発がん性物質に代わって既知の非発がん性物質を用いた陰性対照における各遺伝子の発現量とを比較することにより、前記複数種の遺伝子を選抜することができる。具体的には、例えば、所定の上限値・下限値を元に選抜された複数の遺伝子から、既知の非発がん物質を投与した前記陰性対照においてその発現量が同様に増加または減少する遺伝子を除くことにより、本発明で用いる複数種の遺伝子を選抜することができる。
【００３８】
好ましい実施形態では、前記複数種の遺伝子の発現量を指標とする際に、各遺伝子の重要度に応じた重み付けを行う。すなわち、重要度が高い遺伝子の情報が発がん性の評価結果により大きく反映されるようにする。
【００３９】
本発明の発がん性の評価方法では、肝臓における上記の複数種の遺伝子の発現量を指標として発がん性を評価するが、「指標」の具体例の１つは、遺伝子ごとに基準値を設定し、当該基準値と測定された発現量との比較に基づいて遺伝子ごとに点数を付けることが挙げられる。そして、各遺伝子における点数から総合判断を行い、被検物質の発がん性を評価する。一方、以下に詳述するような「重み付け投票（Weighted Vote）」と「予測スコア（Prediction Score）」を用いる統計学的手法によれば、遺伝子ごとの重み付けが加味されたより正確な発がん性の評価が行える。以下、本手法について説明する。
【００４０】
本手法の流れは、既知の発がん物質を用いた複数の遺伝子の選抜（第１段階）、選抜された各遺伝子についての重み付け投票の算出(第２段階）、並びに、算出された各重み付け投票を用いた予測スコアの算出（第３段階）、の３つの段階からなる。
【００４１】
（第１段階）
肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する既知の発がん物質を２種以上選定する。このとき、できるだけ多様な臓器に対する発がん性がカバーできるように幅広く選定する方がよい。また、肝臓に対する発がん性を有する発がん性物質を含めてもよい。一方、既知の非発がん性物質を１種以上選定する。
【００４２】
各発がん性物質ならびに非発がん性物質の数に相当するマウスの群を設定する。そして、各群のマウスに、選抜した各発がん物質または非発がん物質を投与する。そのまま各群のマウスを飼育する。
【００４３】
所定の時間が経過した後、各群のマウスから肝臓を摘出する。さらに各肝臓からｍＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイ法にて遺伝子発現プロファイルを調べる。そして、無処置マウスと比較して、発現量が２倍以上増加した遺伝子、及び発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子を選抜する。この遺伝子選抜を、発がん物質を投与した群と非発がん物質を投与した群の両方について行う。
【００４４】
次に、発がん物質を投与した群で発現量が増加または減少した遺伝子のうち、非発がん物質を投与した群における発現量と比較して有意に変化した遺伝子を選抜する。これにより、「肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質をマウスに投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する複数の遺伝子」が選抜される。各発がん物質について選抜された各遺伝子の発現量のデータを蓄積し、データベース化しておく。
【００４５】
一方、既知の発がん物質または非発がん物質の代わりに被検物質Ｘを用いて、同様の操作を行う。そして、既知の発がん物質と非発がん物質を用いて選抜された各遺伝子についての発現プロファイルの情報を得る。この操作は発がん物質または非発がん物質を投与する実験と同時並行で行ってもよいし、後日あらためて行ってもよい。
【００４６】
（第２段階）
被検物質Ｘを投与した群において、選抜された各遺伝子について以下の手順で重み付け投票の値を算出する。被検物質Ｘを投与した群における遺伝子ａの重み付け投票Ｖｘａは以下の数式（Ｉ）により算出される。
Ｖｘａ＝Ｓａ｛Ｘａ−（Ｍｃａ＋Ｍｎｃａ）／２｝ （Ｉ）
ここで、Ｘａは被検物質Ｘを投与した群における遺伝子ａの発現量（発現強度）、Ｍｃａは既知の発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の平均値、Ｍｎｃａは既知の非発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の平均値である。
【００４７】
数式（Ｉ）のＳａは遺伝子ａの発現の重みを付与する係数であり、以下の数式（ＩＩ）により算出される。
Ｓａ＝（Ｍｃａ−Ｍｎｃａ）／（ＳＤｃａ＋ＳＤｎｃａ） （ＩＩ）
ここで、ＳＤｃａは既知の発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の標準偏差、ＳＤｎｃａは既知の非発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の標準偏差である。
【００４８】
被検物質Ｘを投与した群において各遺伝子ｉについて重み付け投票Ｖｘｉの値を算出し、重み付け投票の総和ΣＶｉを算出する。ここで、ΣＶｉ≧１であれば被検物質Ｘは発がん物質である可能性が高く、一方、ΣＶｉ＜１であれば被検物質Ｘは発がん物質である可能性が低いと判定できる（１次判定）。
【００４９】
（第３段階）
被検物質Ｘの予測スコア（ＰＳ）は以下の数式（ＩＩＩ）により算出される。
ＰＳ＝｛ＶＸｃ−｜ＶＸｎｃ｜｝／｛ＶＸｃ＋｜ＶＸｎｃ｜｝ （ＩＩＩ）
ここで、ＶＸｃは被検物質Ｘにおいて算出した各々のＶのうち正の値であるＶ（正のＶ）の合計、ＶＸｎｃは被検物質Ｘにおいて算出した各々のＶのうち負の値であるＶ（負のＶ）の合計、｜ＶＸｎｃ｜はＶＸｎｃの絶対値である。
数式（ＩＩＩ）を用いて被検物質ＸについてＰＳの値を算出する。ここで、０＜ＰＳ≦１であれば被検物質Ｘは発がん物質の可能性が高く、−１＜ＰＳ＜０であれば被検物質Ｘは発がん物質の可能性が低いと判定できる（２次判定）。
【００５０】
なお、第１段階の既知の発がん性物質と非発がん性物質を用いた遺伝子の選抜操作、並びに当該遺伝子における発現量のデータ取得（データベース作製）操作については毎回行う必要はなく、当該データベースはその後の実験にも利用できる。また、別の発がん性物質を用いた場合の遺伝子発現データを順次蓄積してデータベースを充実させることにより、さらに正確な発がん性評価を行うことができる。
【００５１】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
１．発がん物質ならびに非発がん物質の選択
マウスに投与するための発がん物質として、以下に示す８種の物質（ＣＡ１〜ＣＡ８）を選択した。物質名の後には、発がん物質の略称、誘発される癌の種類（標的臓器）、投与量、並びに、投与方法を示した。
ＣＡ１：４−ニトロキノリン−１−オキシド（4-Nitroquinoline-1-oxide）；４ＮＱＯ；膵癌、胃と皮膚に乳頭腫；１５ｍｇ／ｋｇ；皮下投与
ＣＡ２：シクロホスファミド（Cyclophosphamide）；Ｃｙｃ；肺腺腫；３０ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＣＡ３：Ｎ，Ｎ−ジエチルニトロソアミン（N,N-Diethylnitrosoamine）；ＤＥＮ；胃癌、肺癌；９０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
ＣＡ４：エチルアクリレート（Ethyl acrylate）；Ｅｔｈｙｌ；前胃扁平上皮癌；２００ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＣＡ５：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロウレス（N-methyl-N-nitroures）；ＭＮＵ；リンパ腫、胃乳頭腫；７５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
ＣＡ６：プロカルバジン（Procarbazine）；Ｐｒｏ；肺癌、脾臓血管肉腫；１２ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
ＣＡ７：チオテパ（Thiotepa）；Ｔｈｉ；肺腺腫、胃乳頭腫、リンパ腫；２ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
ＣＡ８：ウレタン（Urethane）；ＵＲ；肺癌、脾臓血管腫；５００ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与
【００５３】
また、マウスに投与するための非発がん物質として、以下の４種の物質（ＮＣＡ１〜ＮＣＡ４）を選択した。物質名の後ろには、略称、投与量、並びに、投与方法を示した。
ＮＣＡ１：α−トコフェロール（α-tocopherol）；Ｔｏｃ；１０ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＮＣＡ２：レバミピド（Rebamipide）；Ｒｅｂａ；３０ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＮＣＡ３：テプレノン（Teprenone）；Ｔｅｐ；２００ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
ＮＣＡ４：キシレン（Xylene）；Ｘｙｌ；１０００ｍｇ／ｋｇ；強制経口投与
【００５４】
２．各物質のマウスへの投与と肝臓由来ｍＲＮＡの調製
７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを準備し、１群につき６匹ずつ割り当て、１２群に分けた。各群のマウスに対して上記したいずれか１種の発がん物質（ＣＡ１〜ＣＡ８）または非発がん物質（ＮＣＡ１〜ＮＣＡ４）を投与（経口、皮下、または腹腔内）し、各群のマウスの飼育を開始した。飼育開始から３時間経過時ならびに２４時間経過時に、各群からマウスを３匹ずつ取り出し、肝臓を摘出した。各肝臓からｍＲＮＡを抽出し（ｎ＝３）、遺伝子発現解析に供するサンプルとした。
【００５５】
３．マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析
Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０−２ Ａｒｒａｙ（アフィメトリクス社）を用い、各サンプルについて遺伝子発現解析を行った。ハイブリダイゼーションの条件としては、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ナトリウム塩，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０中、４５℃にて１６時間の条件を採用した。データ解析には、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ、アフィメトリクス社）を用い、チップ及び遺伝子ごとの正規化処理、ベースライン補正等を行った後、発現強度が１００以下の遺伝子を排除し、解析対象の遺伝子をピックアップした（各群につき約２００００個）。
【００５６】
各群について、解析対象の遺伝子から、未処理マウスにおける発現強度と比較して２．０倍以上あるいは０．５倍以下の発現強度を示した遺伝子を選抜した。発がん物質を投与した群（第１群〜第８群）の投与３時間後における遺伝子の数を第１表に、非発がん物質を投与した群（第９群〜第１２群）の投与３時間後における遺伝子の数を第２表に示す。発がん物質を投与した群（第１群〜第８群）の投与２４時間後における遺伝子の数を第３表に、非発がん物質を投与した群（第９群〜第１２群）の投与２４時間後における遺伝子の数を第４表に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
次に、３時間目と２４時間目について、発がん物質が投与された群（第１群〜第８群）における遺伝子のうち、非発がん物質が投与された群（第９群〜第１２群）における遺伝子の発現強度と比較して有意に変化していた遺伝子をさらに選抜した。その結果、３時間目において遺伝子の発現量が有意に上昇した遺伝子が１２４７個（遺伝子群Ａ、発現増強遺伝子）、３時間目において遺伝子の発現量が有意に減少した遺伝子が１３８８個（遺伝子群Ｂ、発現抑制遺伝子）、２４時間目において遺伝子の発現量が有意に上昇した遺伝子が１３１９個（遺伝子群Ｃ、発現増強遺伝子）、２４時間目において遺伝子の発現量が有意に減少した遺伝子が１３４５個（遺伝子群Ｄ、発現抑制遺伝子）選抜された。
【００６２】
４．重み付け投票（Weighted Vote）と発がん性の予測スコア（Prediction Score）の算出
上述した数式（Ｉ）（ＩＩ）を用い、投与群ごと（投与した発がん物質ごと）に遺伝子群Ａ〜Ｄに属する各遺伝子について重み付け投票Ｖの値を算出した。このとき、各発がん物質を被検物質と仮定したシミュレーションを行うため、数式（Ｉ）におけるＭｃａ（既知の発がん物質を投与した各群における遺伝子ａの発現量の平均値）については、その発がん物質自身の発現量を抜いて計算した（Leave-one-out-cross-validation）。さらに、発がん性物質ごとに、正のＶの総和ＶＸｃ、負のＶの総和ＶＸｎｃ、及び全てのＶの総和ΣＶｉを算出した。
【００６３】
続いて、上述の数式（ＩＩＩ）を用い、遺伝子群Ａ〜Ｄに分けて各発がん物質のＰＳを算出した。
【００６４】
非発がん物質を投与した群についても同様にして、正のＶの総和ＶＸｃ、負のＶの総和ＶＸｎｃ、及び全てのＶの総和ΣＶｉを算出した。
【００６５】
遺伝子群Ａ（３時間目における発現増強遺伝子）についてのＶとＰＳの計算結果を第５表（発がん物質投与群）と第６表（非発がん物質投与群）に示す。遺伝子群Ｂ（３時間目における発現抑制遺伝子）の計算結果を第７表（発がん物質投与群）と第８表（非発がん物質投与群）に示す。遺伝子群Ｃ（２４時間目における発現増強遺伝子）についてのＶとＰＳの計算結果を第９表（発がん物質投与群）と第１０表（非発がん物質投与群）に示す。遺伝子群Ｄ（２４時間目における発現抑制遺伝子）の計算結果を第１１表（発がん物質投与群）と第１２表（非発がん物質投与群）に示す。表中、「プローブＩＤ」はアフィメトリクス社が付与したプローブＩＤである。なお当該プローブＩＤに対応するＧｅｎＢａｎｋのアクセッションナンバーは、当業者であれば容易に検索できる。また表中の「Ｖ３ｈ 略称」はその略称に相当する物質を投与した群における投与３時間後の各Ｖの値、「Ｖ２４ｈ 略称」はその略称に相当する物質を投与した群における投与２４時間後の各Ｖの値を示す。
【００６６】
【表５】
【００６７】
【表６】
【００６８】
【表７】
【００６９】
【表８】
【００７０】
【表９】
【００７１】
【表１０】
【００７２】
【表１１】
【００７３】
【表１２】
【００７４】
第５表に示すように、遺伝子群Ａにおいて、Ｐｒｏ以外の発がん物質を投与した場合に重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが正の値となった。また第６表に示すように、遺伝子群Ａにおいて、いずれの非発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが負の値となった。一方、第７表に示すように、遺伝子群Ｂにおいて、いずれの発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが正の値となった。また、第８表に示すように、遺伝子群Ｂにおいて、いずれの非発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが負の値となった。これらの結果は、Ｖの総和ΣＶｉが正の数である場合に投与した物質が発がん物質の可能性が高いという知見と一致した。
【００７５】
第５表に示すように、遺伝子群Ａの発現増加遺伝子を指標とした場合、Ｐｒｏを除く発がん物質においてＰＳの値が０以上の値となった。また第６表に示すように、非発がん物質ではいずれも負の値となった。一方、第７表に示すように、遺伝子群Ｂの発現抑制遺伝子を指標とした場合、全ての発がん物質においてＰＳの値が０以上の値となった。また第８表に示すように、非発がん物質ではいずれも負の値となった。以上より、ＰＳの値により被検物質の発がん性を評価できることが示された。
【００７６】
第９表に示すように、遺伝子群Ｃにおいては、発がん物質のうち４ＮＱＯ、ＤＥＮ、ＭＮＵ、またはＵＲを投与した場合に重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが正の値となった。また第１０表に示すように、遺伝子群Ｃにおいて、いずれの非発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが負の値となった。一方、第１１表に示すように、遺伝子群Ｄにおいて、発がん物質のうち４ＮＱＯ、ＤＥＮ、Ｐｒｏ、またはＵＲを投与した場合に重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが正の値となった。また、第１２表に示すように、遺伝子群Ｄにおいて、いずれの非発がん物質を投与した場合も重み付け投票Ｖの総和ΣＶｉが負の値となった。
【００７７】
第９表に示すように、遺伝子群Ｃの発現増加遺伝子を指標とした場合、発がん物質が４ＮＱＯ、ＤＥＮ、ＭＮＵ、またはＵＲの場合においてＰＳの値が０以上の値となった。また第１０表に示すように、非発がん物質ではいずれも負の値となった。一方、第１１表に示すように、遺伝子群Ｄの発現抑制遺伝子を指標とした場合、発がん物質が４ＮＱＯ、ＤＥＮ、Ｐｒｏ、またはＵＲの場合においてＰＳの値が０以上の値となった。また第１２表に示すように、非発がん物質ではいずれも負の値となった。
以上のように、遺伝子群Ｃ，Ｄでは一部の発がん物質を投与した場合にのみΣＶｉとＰＳが正の値となったが、非発がん物質を投与した場合にはいずれもΣＶｉとＰＳが負の値となっており、１次スクリーニング等の目的には十分に使えるもの考えられた。
【００７８】
また、遺伝子群Ａ，Ｂ（投与３時間後）と遺伝子群Ｃ，Ｄ（投与２４時間後）とで結果が完全には一致しなかったことから、マウスから肝臓を摘出するタイミングが重要と考えられた。
【００７９】
本実施例では、ΣＶｉとＰＳをいずれも発現増強遺伝子（遺伝子群Ａ，Ｃ）と発現抑制遺伝子（遺伝子群Ｂ，Ｄ）とに区別して算出したが、これらを区別せずにまとめて算出してもよい。すなわち、遺伝子群ＡとＢ、並びに、遺伝子群ＣとＤをまとめてΣＶｉとＰＳを算出してもよい。
【００８０】
５．第１表〜第４表の相互比較
第１表（発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（４６個）と、第３表（発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（１２個）とで共通の遺伝子は、以下の７種であった。当該７種の遺伝子のプローブＩＤと遺伝子名を示す。
1432517_a_at（nicotinamide N-methyltransferase）
1450788_at（serum amyloid A 1）
1427747_a_at（lipocalin 2）
1419075_s_at（serum amyloid A 1）
1437176_at（expressed sequence AI451557）
1425971_at（reverse transcriptase）
1424850_at（mitogen activated protein kinase kinase kinase 1）
【００８１】
第１表（発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（１２個）と、第３表（発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（６個）とで共通の遺伝子は、以下の２種であった。
1449109_at（suppressor of cytokine signaling 2）
1449463_at（kallikrein 8）
【００８２】
第１表（発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（４６個）から、第２表（非発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（８７個）に属するものを除いた遺伝子は、以下の３６種であった。
1434203_at（cDNA sequence BC055107）
1434202_a_at（cDNA sequence BC055107）
1428942_at（metallothionein 2）
1432517_a_at（nicotinamide N-methyltransferase）
1422557_s_at（metallothionein 1）
1418288_at（lipin 1）
1426516_a_at（lipin 1）
1450788_at（serum amyloid A 1）
1453851_a_at（growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma）
1427747_a_at（lipocalin 2）
1442025_a_at（unknown）
1419075_s_at（serum amyloid A 1）
1445349_at（PREDICTED: hypothetical protein XP_489241 ）
1424937_at（RIKEN cDNA 2310076L09 gene）
1439163_at（zinc finger and BTB domain containing 16）
1448830_at（dual specificity phosphatase 1）
1441915_s_at（RIKEN cDNA 2310076L09 gene）
1436555_at（unknown）
1427425_at（RIKEN cDNA 9130208E07 gene）
1418918_at（insulin-like growth factor binding protein 1）
1425745_a_at（transforming, acidic coiled-coil containing protein 2）
1417268_at（CD14 antigen）
1424401_at（aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1）
1451557_at（tyrosine aminotransferase）
1423233_at（CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), delta）
1435452_at（transmembrane protein 20）
1420965_a_at（ectodermal-neural cortex 1）
1447905_x_at（nucleoporin 62）
1444139_at（DNA-damage-inducible transcript 4-like）
1421681_at（neuregulin 4）
1416953_at（connective tissue growth factor）
1429728_at（RIKEN cDNA 4930429M06Rik）
1440120_at（Guanine nucleotide binding protein (G protein)）
1428306_at（DNA-damage-inducible transcript 4）
1417065_at（early growth response 1）
1456981_at（transmembrane channel-like gene family 7）
【００８３】
第１表（発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（１２個）から、第２表（非発がん物質投与３時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（３９個）に属するものを除いた遺伝子は、以下の８種であった。
1429285_at（serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 9）
1432105_at（sirtuin 5 (silent mating type information regulation 2 homolog) 5 (S. cerevisiae)）
1434582_at（DNA segment, Chr 14, ERATO Doi 171, expressed）
1443505_at（PREDICTED: RIKEN cDNA A630076J17 gene [Mus musculus], mRNA sequence）
1449109_at（suppressor of cytokine signaling 2）
1458398_at（RIKEN cDNA 1700027F06 gene）
1449463_at（kallikrein 8）
1434152_at（RIKEN cDNA 2210421G13 gene /// hypothetical protein LOC193676）
【００８４】
第３表（発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（１２個）から、第４表（非発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が２．０倍以上に増加した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（５１個）に属するものを除いた遺伝子は、以下の２種であった。
1459913_at（Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 (Tnfsf10), mRNA）
1429949_at（RIKEN cDNA 6530415H11 gene）
【００８５】
第３表（発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（６個）から、第４表（非発がん物質投与２４時間後）に示した「発現量が０．５倍以下に減少した遺伝子」のうち「各群に共通」の遺伝子（６０個）に属するものを除いた遺伝子は、以下の１種であった。
1449451_at（serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 11）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価する発がん性の評価方法であって、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含み、前記複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子であることを特徴とする発がん性の評価方法。
【請求項２】
下記工程（１）〜（４）を含む手順によって前記複数種の遺伝子を選抜することを特徴とする請求項１に記載の発がん性の評価方法。
（１）非ヒト動物の複数の群を設定し、一方、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する既知の発がん物質を複数種選定し、各群に対して互いに異なる種類の発がん物質を投与する工程、
（２）投与から所定の時間が経過した後、各群の非ヒト動物から肝臓を摘出する工程、
（３）摘出した肝臓から核酸を単離し、核酸に含まれる各遺伝子の発現量を測定する工程、
（４）測定した発現量を元に、発現量が変化した複数種の遺伝子を選抜する工程。
【請求項３】
工程（４）において、前記発現量と、既知の発がん性物質に代わって既知の非発がん性物質を用いた陰性対照における各遺伝子の発現量とを比較することにより、前記複数種の遺伝子を選抜することを特徴とする請求項２に記載の発がん性の評価方法。
【請求項４】
前記複数種の遺伝子の発現量を指標とする際に、各遺伝子の重要度に応じた重み付けを行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項５】
前記複数種の遺伝子の数は１００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項６】
前記複数種の遺伝子の数は５００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項７】
前記複数種の遺伝子の数は１０００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項８】
前記非ヒト動物はげっ歯類に属するものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項９】
遺伝子の発現量の測定をｍＲＮＡ量を測定することによって行なうことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項１】
非ヒト動物に被検物質を投与して当該被検物質の発がん性を評価する発がん性の評価方法であって、被検物質を投与した後の前記非ヒト動物の肝臓における複数種の遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された当該発現量を指標として前記被検物質の発がん性を評価する工程とを含み、前記複数種の遺伝子は、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する発がん物質を非ヒト動物に投与した場合に肝臓においてその発現量が変化する遺伝子であることを特徴とする発がん性の評価方法。
【請求項２】
下記工程（１）〜（４）を含む手順によって前記複数種の遺伝子を選抜することを特徴とする請求項１に記載の発がん性の評価方法。
（１）非ヒト動物の複数の群を設定し、一方、肝臓以外の臓器に対する発がん性を有する既知の発がん物質を複数種選定し、各群に対して互いに異なる種類の発がん物質を投与する工程、
（２）投与から所定の時間が経過した後、各群の非ヒト動物から肝臓を摘出する工程、
（３）摘出した肝臓から核酸を単離し、核酸に含まれる各遺伝子の発現量を測定する工程、
（４）測定した発現量を元に、発現量が変化した複数種の遺伝子を選抜する工程。
【請求項３】
工程（４）において、前記発現量と、既知の発がん性物質に代わって既知の非発がん性物質を用いた陰性対照における各遺伝子の発現量とを比較することにより、前記複数種の遺伝子を選抜することを特徴とする請求項２に記載の発がん性の評価方法。
【請求項４】
前記複数種の遺伝子の発現量を指標とする際に、各遺伝子の重要度に応じた重み付けを行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項５】
前記複数種の遺伝子の数は１００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項６】
前記複数種の遺伝子の数は５００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項７】
前記複数種の遺伝子の数は１０００個以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項８】
前記非ヒト動物はげっ歯類に属するものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに１項に記載の発がん性の評価方法。
【請求項９】
遺伝子の発現量の測定をｍＲＮＡ量を測定することによって行なうことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに１項に記載の発がん性の評価方法。
【公開番号】特開２００８−７９５５２（Ｐ２００８−７９５５２Ａ）
【公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２６４３０５（Ｐ２００６−２６４３０５）
【出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 財団法人日本消化器病学会発行「日本消化器病学会雑誌・第１０３巻臨時増刊号 第４８回日本消化器病学会大会抄録集」（平成１８年９月１０日発行）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【出願人】（５９６１５６１７４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 財団法人日本消化器病学会発行「日本消化器病学会雑誌・第１０３巻臨時増刊号 第４８回日本消化器病学会大会抄録集」（平成１８年９月１０日発行）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【出願人】（５９６１５６１７４）
【Ｆターム（参考）】
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