発現ベクターおよびその方法
本発明は、組換え可溶性タンパク質の発現のためのベクターおよび化合物に関する。特に、本発明は、組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質の発現のための核酸分子、発現ベクター、および宿主細胞に関する。本発明はさらに、この発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を用いて組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を調製するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え可溶性タンパク質の発現のためのベクターおよび化合物に関する。特に、本発明は、組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質の発現のための核酸分子、発現ベクター、および宿主細胞に関する。本発明はさらに、この発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を用いて組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８６年、米国ＦＤＡは、哺乳動物細胞由来のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）タンパク質を治療目的で使用することを承認した。細胞培養と組換えＤＮＡ技術の進歩により、遺伝子改変細胞を用いて治療的価値または他の経済的価値のある種々の同様のタンパク質を発現させることが容易になった。現在、規制当局による治療使用の承認が得られたモノクローナル抗体が数個あり、様々な開発および承認段階にあるものが数百個ある。ｔＰＡと同様、これらのタンパク質の大半は、不死化チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現されるが、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）などの、他の細胞株も組換えタンパク質産生が承認されている。
【０００３】
高等真核生物供給源から得られる、多くの生物活性治療薬の発現には、下等な真核生物細胞または原核生物細胞では天然に生じない翻訳後修飾が必要とされることが多く、そのため、高等真核生物供給源から得られる細胞を使用することが余儀なくされる。したがって、必要とされる翻訳後修飾が細胞株で同様にうまく行なわれるので、通常、哺乳動物発現系が、大半の治療的タンパク質の製造に好ましい。現在、種々の哺乳動物細胞発現系が、タンパク質の発現に利用可能である。通常、発現ベクターでは、組換え遺伝子の発現を促進するための強力なウイルスまたは細胞プロモーター／エンハンサーが使用される。しかしながら、哺乳動物細胞でこれらの発現ベクター／発現系から得られる組換えタンパク質の発現レベルは、商業的に実現可能なものでない。治療薬の生産中の、対処される必要がある重要な問題が２つあり、それは、（ａ）この物質を提供するのにかかる時間と、（ｂ）特に、発展途上国または開発途上国の大衆が利用できるように、この物質の価格を下げることである。それゆえ、バイオテクノロジー産業は、スケジュールとコストを減らす新しい技術やプロセス開発戦略を検討し続けている。
【０００４】
ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質としても知られる、ＥＮＢＲＥＬ（エタネルセプト）は、ヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ（ｐ７５）の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃドメインとを含む組換え融合タンパク質である。ＥＮＢＲＥＬは、関節リウマチ治療のための重大な科学的進歩であり、これは、多くの患者において、関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および乾癬の兆候や症状を低下させることが示されているほどである。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、正常な炎症応答や免疫応答に関与する天然のサイトカインである。ＴＮＦは、関節リウマチ（ＲＡ）、多関節型若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、および結果として生じる関節病変の炎症過程において重要な役割を果たす。ＴＮＦレベルの上昇は、ＲＡ患者の滑液で見られる。
【０００５】
組換え遺伝子の遺伝的安定性が低いことおよび／または組換え遺伝子がサイレンシングされることが理由で、哺乳動物細胞内でのＴＮＦＲ：Ｆｃなどの組換えタンパク質の産生は難しいことがある。遺伝子サイレンシングを引き起こし得るいくつかの分子メカニズムが報告されており、それには、ほんの一例を挙げれば、ＤＮＡメチル化、負の位置効果、組込み依存的な抑制などが含まれる。
【０００６】
したがって、当該技術分野には、組換え融合タンパク質の大規模産生時の遺伝的安定性がより高い発現系を提供することによって、このようなタンパク質の既知の産生方法の欠陥を克服する必要性がある。細胞培養物からの大量のＴＮＦＲ：Ｆｃの産生を容易にするために、新規の発現ベクターを開発した。この発現ベクターを使用することにより、治療的タンパク質の発現が増加することが示された。ＴＮＦＲ：Ｆｃのクローニング、発現、および精製を本出願で記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、付随する特許請求の範囲に記述された特徴および／または単独でもしくは任意の組合せで特許性のある主題を含み得る以下の特徴の１つ以上を含む。
【０００８】
本発明は、哺乳動物細胞や他の真核生物細胞での組換えタンパク質の発現収量を増加させ、安定化するために使用し得る、新規のスキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列の発見に基づくものである。Ｓ／ＭＡＲ配列は、すぐ近くの転写カセットの遺伝的安定性を増加させ、ＤＮＡメチル化などのメカニズムを妨害することによって遺伝子サイレンシングを阻害する。さらに、Ｓ／ＭＡＲ配列の存在は、位置効果を減少させることによってクローン間の変動を減少させると考えられる。
【０００９】
したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの変異体および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列、または単離された核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を有する単離された核酸に関する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列およびその任意の組合せを運ぶ発現ベクターに関する。Ｓ／ＭＡＲ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール）アルゴリズムのようなマッチング法を用いるペアワイズＤＮＡ配列アラインメントによって決定されるようなそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択されてもよい。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せと、１つ以上の発現制御エレメントに機能的に連結された腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列とを運ぶ発現ベクターに関する。
【００１２】
Ｓ／ＭＡＲ配列は、発現ベクター内の転写プロモーターの上流または下流にあってもよい。さらに、Ｓ／ＭＡＲ配列は、腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列から０〜１０ｋｂ離れたところにあってもよい。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶ発現ベクターの構築方法に関する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶ発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１５】
さらに別の実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶ発現ベクターを用いて組換え発現によって腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法に関する。
【００１６】
またさらなる実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶ発現ベクターによって発現される腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【００１７】
さらに別の実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を運ぶ発現構築物で哺乳動物細胞をトランスフェクトし、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶプラスミドを用いて同じ哺乳動物細胞をコトランスフェクトすることによって、腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法に関する。
【００１８】
またさらなる実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列の生物学的活性に影響を与えるエピジェネティック因子および遺伝的因子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明を、以下の図面を参照してさらに説明する。
【図１】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図２】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ１／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図３】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ２／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図４】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ３／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図５】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ４／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図６】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ５／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図７】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ６／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で使用される「スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）」という用語は、細胞核のタンパク質スキャフォールドまたはマトリックスへの周期的な結合によって、真核生物ゲノムの核ＤＮＡを約６０，０００個のクロマチンドメインに編成する、長さ数百塩基対（ｂｐ）の非コンセンサス様ＡＴリッチＤＮＡエレメントを指す。それらは、通常、フランキング領域、クロマチン境界領域、およびイントロンなどの非コード領域に見出される。
【００２１】
「少なくとも７０％の相同性」により、ヌクレオチド配列が、ＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール）アルゴリズムのようなマッチング法を用いるペアワイズＤＮＡ配列アラインメントによって測定された規定の配列と少なくとも７０％相同であるＤＮＡを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される「配列番号１、２、３、４、５、および６の機能断片」という用語は、発現収量に対する望ましい効果を有するほど大きなサイズの前記配列の断片を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される「フランキング」という用語は、問題になっている配列が、発現ベクターに直接的に接続されているか、またはそのような連結配列がこれらの配列の望ましい効果を妨害しない限り、長さが最大１０ｋｂもしくはそれより長いものであり得る連結ＤＮＡ配列によって接続されているかのいずれかであることを意味する。発現ベクターは、最低でも、目的の遺伝子とそれに機能的に連結された発現制御エレメントとを含む。
【００２４】
発現制御エレメントは、転写プロモーター、転写エンハンサー、転写リプレッサー、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ポリアデニル化部位、翻訳開始シグナル、および翻訳終結シグナルなどの通常の調節エレメントを含み、これは、当業者によって容易に達成され得る。
【００２５】
「相補体」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比較したときに、相補的ヌクレオチド配列と逆方向性とを有する核酸配列を指す。例えば、配列５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’は、５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に相補的である。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「変異体」という用語は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失しているか、置換されているか、または付加されている、特異的に同定された配列とは異なるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を指す。変異体は、天然に生じるアレル変異体であっても、天然には生じない変異体であってもよい。変異体は、同じ種に由来するものであっても、他の種に由来するものであってもよく、ホモログ、パラログ、およびオルソログを包含してもよい。特定の実施形態では、変異体は、問題になっている配列の生物活性と同等または同様の生物活性を有する。
【００２７】
変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、本発明の配列との少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも５２％、より好ましくは少なくとも５３％、より好ましくは少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６１％、より好ましくは少なくとも６２％、より好ましくは少なくとも６３％、より好ましくは少なくとも６４％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも６７％、より好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも６９％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。
【００２８】
本明細書で使用される「配列モチーフ」という用語は、より大きいオリゴヌクレオチド配列中に含まれる少なくとも２ヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列を指す。配列モチーフは、オリゴヌクレオチド配列中に１回現れ得るか、またはそれは何回も現れ得る。例えば、オリゴヌクレオチド５’−ＡＵＣＡＵＣＡＵＧ−３’は、３回現れる５’−ＡＵ−３’という配列モチーフと、２回現れる５’−ＵＣ−３’および５’−ＣＡ−３’という配列モチーフと、１回現れる５’−ＵＧ−３’という配列モチーフとを含む。
【００２９】
本明細書で使用される「エピジェネティック因子」という用語は、操作上、１つの遺伝子または１組の遺伝子の発現に影響を及ぼす任意の外部過程または外部因子を指し、タンパク質、核酸などのような内部因子を含む任意の内部過程または内部因子を指す「遺伝的因子」とは対照的なものを表す。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「ＴＮＦＲ：Ｆｃ受容体タンパク質」または「ＴＮＦＲ：Ｆｃ」という用語は、ヒトＴＮＦＲＩＩ（ｐ７５）タンパク質の細胞外ドメインに類似したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、そのネイティブなリガンドであるＴＮＦ−アルファに結合することができ、それによりＴＮＦ−アルファが細胞膜結合型のＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩＩに結合するのを阻害するタンパク質を指す。存在することが知られているＴＮＦＲの２つの異なる形態のうち、本発明の好ましいＴＮＦＲは、ＴＮＦＲＩＩ（ｐ７５）である。可溶性ＴＮＦＲ構築物は、細胞外への分泌を容易にするために、膜貫通領域を欠いている。細胞外ドメインであるＴＮＦＲＩＩの可溶性部分は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にインフレームで融合されている。本発明の融合タンパク質は生物活性がある、すなわち、それは溶液中でＴＮＦに結合することができる。
【００３１】
本明細書で使用される「生体分子」という用語は、生体環境と関連した物質、化合物、または成分を指し、それには、糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機分子、ハプテン、エピトープ、生体細胞、生体細胞の一部、ビタミン、ホルモンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
「発現系」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質を産生するために使用される任意のインビボまたはインビトロ生体系を指す。
【００３３】
本明細書で使用される「組換え」という用語は、タンパク質が組換え発現系に由来することを意味し、この組換え発現系は、本明細書では、哺乳動物細胞に基づく発現系である。
【００３４】
本明細書で使用される「単離されたＤＮＡ配列」という用語は、独立した断片の形態のまたはより大きいＤＮＡ構築物の一部としてのＤＮＡポリマーを指す。このような配列であれば、発現ベクターにクローニングし、ＤＮＡ断片の同定、操作、および回収のために、この配列を大量に単離することができるであろう。このような配列は、非翻訳ＤＮＡ領域によるまたはイントロンによる中断が全くないオープンリーディングフレームで提供される。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを指す。本発明により提供されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーとから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み合わせて、組換え転写単位で発現させることが可能な合成遺伝子を提供することができる。
【００３６】
「染色体」とは、細胞の内部に見出されるＤＮＡとタンパク質の組織化された構造物のことである。
【００３７】
「クロマチン」とは、真核生物細胞の核の内部に見出されるＤＮＡとタンパク質の複合体のことであり、これによって染色体が構成されている。
【００３８】
「ＤＮＡ」または「デオキシリボ核酸」は遺伝情報を含む。それは、様々なヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣで構成されている。
【００３９】
本明細書で使用される「遺伝子」は、所与の成熟タンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を指す。それは、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーター、またはエンハンサーなどの、非翻訳フランキング領域を含まない。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「転写プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御する核酸配列を指す。プロモーターは、ネイティブな遺伝子に由来していてもよく、または天然に見出される様々なプロモーターに由来する様々なエレメントから構成されていてもよい。プロモーターは、宿主細胞内で転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞にとって同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来していてもよい。好適なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターなどである。
【００４１】
「転写エンハンサー」は、遺伝子の位置または方向性とは無関係に、遺伝子の転写を開始するよう働く遺伝子の配列を指す。
【００４２】
「転写リプレッサー」は、遺伝子の位置または方向性とは無関係に、遺伝子の転写を阻害するよう働く遺伝子の配列を指す。
【００４３】
「シグナルペプチド」という用語は、分泌される成熟タンパク質の前にあるアミノ末端ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは切断されるので、成熟タンパク質中には存在しない。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「タンパク質」という用語は、あるアミノ酸（またはアミノ酸残基）のα−炭素に結合しているカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接するアミノ酸のα−炭素に結合しているアミノ基のアミノ窒素原子と共有結合するようになるときに生じるような、ペプチド結合を介して連結された２つ以上の個々のアミノ酸の任意のポリマー（天然に存在するかどうかを問わない）を指す。これらのペプチド結合連結、ならびにそれらを構成する原子（すなわち、α−炭素原子とカルボキシル炭素原子（およびその置換酸素原子）とアミノ窒素原子（およびその置換水素原子））は、タンパク質の「ポリペプチド骨格」を形成する。さらに、本明細書で使用するとき、「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語（これらは、時に、本明細書で互換的に使用され得る）を含むことが理解される。
【００４５】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を運ぶことができる核酸分子を指す。ベクターは、通常、プラスミドから得られるが、これは、ＤＮＡ断片を宿主細胞内に運搬する「分子キャリア」のように機能する。
【００４６】
ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供し得る任意のベクターであってもよく、ベクターの選択は、それが導入されることになる宿主細胞によって決まることが多い。したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミドであってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されたときに、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。ベクターは、好ましくは、コードＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要とされる追加の部分に機能的に連結されている発現ベクターである。一般に、発現ベクターは、プラスミドもしくはウイルスＤＮＡから得られるか、またはその両方のエレメントを含み得る。「機能的に連結される」という用語は、これらの部分が、その意図された目的のために、例えば、転写がプロモーターの中で開始され、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の中を進むために、協調して働くように配置されていることを示す。
【００４７】
本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、細菌やいくつかの他の生物に見出されるＤＮＡの小環状二本鎖ポリヌクレオチド構造物を指す。プラスミドは、宿主細胞染色体とは無関係に複製することができる。
【００４８】
「複製」という用語は、その鋳型ＤＮＡ鎖からのＤＮＡの合成を指す。
【００４９】
「転写」という用語は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を指す。
【００５０】
「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡからのポリペプチドの合成を指す。
【００５１】
「シス」という用語は、連結された２つ以上のＤＮＡエレメントの同じプラスミド上での配置を指す。
【００５２】
「トランス」という用語は、２つ以上のエレメントの２つ以上の異なるプラスミド上での配置を指す。
【００５３】
「方向性」という用語は、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの順序を指す。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「単離された核酸断片」という用語は、一本鎖または二本鎖であるＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つ以上の部分から構成されていてもよい。
【００５５】
本明細書で使用される「遺伝子増幅」という用語は、他の遺伝子のコピー数を比例的に増加させることなく、特定の遺伝子（単数または複数）を選択的に、繰り返し複製することを指す。遺伝子増幅は、多くの生物における広く普及した重要な発生および進化上の過程である。遺伝子増幅は、（ｉ）ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞で見られるような発生的に調節された遺伝子発現と（ｉｉ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で報告されたｌａｃ領域の増幅のような自然に起こる遺伝子発現の２つのカテゴリーに分類することができる。哺乳動物細胞で最もよく知られている遺伝子増幅は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）である。
【００５６】
「形質転換」という用語は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノム中への核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「形質転換された」生物と呼ばれる。
【００５７】
「真核生物細胞」という用語は、その細胞が内膜や細胞骨格によって複雑な構造に編成されている真核生物に由来する任意の細胞を指す。遺伝子／タンパク質操作に使用することができ、かつ細胞培養条件下で維持し、後でトランスフェクトすることもできる任意の真核生物細胞であれば、本発明に含まれる。特に好ましい細胞型には、幹細胞、胚性幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＢＨＫ２１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、Ｃ２Ｃ１２、ＨＥＫ、ＭＤＣＫ、癌細胞、および初代分化細胞または初代未分化細胞が含まれる。哺乳動物細胞には、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または他の不死化細胞株が含まれ得る。
【００５８】
本明細書で使用するとき、「トランスフェクション」という用語は、任意の転移手段によるＤＮＡのような外来物質の真核生物細胞への導入を指す。様々なトランスフェクション方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクトアミントランスフェクション、およびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
「トランスフェクトされた細胞」という用語は、外来ＤＮＡが真核生物細胞に導入された真核生物細胞を指す。このＤＮＡは、宿主染色体の一部であることができるし、または染色体外エレメントとして複製することができる。
【００６０】
「コトランスフェクション」という用語は、真核生物細胞を、細胞にとって異種となる２つ以上の外因性遺伝子で同時にトランスフェクトする方法を指す。
【００６１】
「一過性遺伝子発現」という用語は、少量のタンパク質の迅速な産生のための好都合な方法を指す。ＣＯＳ細胞は、通常、一過性発現の特徴解析に使用される。
【００６２】
「安定な遺伝子発現」という用語は、宿主染色体中へのプラスミドの安定な組込みによって目的の遺伝子を恒久的に発現する安定細胞株の調製を指す。
【００６３】
腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質活性をコードするＤＮＡを含み、かつ適当な細胞株にトランスフェクトされたときに、ＴＮＦＲ：Ｆｃ活性の発現を促進する、新規の真核生物発現ベクターが構築されている。この新規の発現ベクターを用いて、可溶性ＴＮＦＲ：Ｆｃを産生することができる。組換えにより産生されるＴＮＦＲ：Ｆｃ活性は、関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および乾癬をはじめとする、様々な障害の治療や予防に有用である。
【００６４】
本発明は、増加した量で可溶性ＴＮＦＲ：Ｆｃを産生するために使用される新規の真核生物発現ベクターに関する。
【００６５】
原核生物発現系は、分子生物学における研究ツールの初期のレパートリーの一部であった。原核生物系における組換え真核生物タンパク質のデノボ合成は、真核生物遺伝子産物にいくつかの問題を引き起こした。それらの中で最も重要な２つは、不適切なタンパク質フォールディングおよびアセンブリと、翻訳後修飾、主に、グリコシル化およびリン酸化の欠如であった。原核生物系は、真核生物の構造タンパク質および／または触媒機能タンパク質を産生するための適切なタンパク質合成メカニズムを全て有しているわけではない。それゆえ、必要とされる翻訳後修飾がその細胞系によってその場で対処されるという単純な理由で、通常、哺乳動物発現系が治療的タンパク質の製造に好ましい。現在、種々の哺乳動物発現系が、組換え遺伝子の一過性発現または安定発現のいずれかに利用可能である。通常、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞安定発現系（ＣＨＯ ＳＥＳ）が使用される。さらに、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、マウスＬ−細胞、ならびにＪ５５８ＬおよびＳｐ２／０のような骨髄腫細胞株なども、安定なトランスフェクタントの樹立のための宿主として利用される。
【００６６】
しかしながら、外来ＤＮＡの宿主細胞ゲノム中への組込みは、予測不可能な過程である。トランス遺伝子発現が細胞株によって大きく変動することや、組込みが表現型の予期せぬ変化を引き起こし得ることが十分に立証されている。クローン発現レベルの大きな変動の背後にある理由としては、プラスミドコピー数が異なることや、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）において斑入り位置効果として当初記載された、位置効果として知られる現象が挙げられる。組込みの位置は、少なくとも３つのメカニズム、すなわち、局所的な調節エレメントの活性と、局所的なクロマチン構造と、局所的なＤＮＡメチル化状態とによって、トランス遺伝子発現に影響を与えることができる。２つの一般的なアプローチを用いて、負の位置効果または組込み依存的な抑制からＤＮＡを保護することができる。１つのアプローチは、部位特異的組換え法を用いて、転写活性のある所定の部位にトランス遺伝子を直接組み込むことを含む。もう１つの方法は、組込み部位にかかわらず、遺伝子が周囲のクロマチンの影響から保護されるように、クロマチン境界領域に見出されるＤＮＡ配列エレメントを発現ベクターに組み込むことである。組換えタンパク質発現に関して、クロマチン境界として振る舞い、トランスフェクトされた遺伝子を周囲のクロマチンの影響から保護する配列としては、インスレーター配列およびスキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）が挙げられる。
【００６７】
Ｓ／ＭＡＲは、単離された核スキャフォールドまたは核マトリックスにインビトロで高い親和性で結合するＤＮＡ配列である。発現研究により、トランス遺伝子の両側にインスレーターを置くと、位置効果が低下し、そのため、クローン発現変動が抑制されることが示唆されている。Ｓ／ＭＡＲは、クロマチンループを核マトリックスにつなぎとめる比較的短い（１００〜１０００ｂｐ長）配列である。Ｓ／ＭＡＲは、様々な転写単位を包含するドメインの末端の両側にあることが観察されている。核マトリックスの表面と同じ位置を占める染色体領域中で転写が開始されるように、Ｓ／ＭＡＲが転写活性のあるクロマチン領域を１つにまとめることも示されている。
【００６８】
同様に、周囲を取り囲むシス調節エレメントのみによってドメイン内の遺伝子の発現が制御されるように、Ｓ／ＭＡＲは、独立したクロマチンドメインの境界を規定し得る。Ｓ／ＭＡＲについて、いくつかの考えられる機能が以前に論じられており、それには、クロマチンドメインの境界を形成すること、クロマチン立体構造を変化させること、ＤＮＡ複製の開始に関与すること、および染色体のクロマチン構造を編成することが含まれる。Ｓ／ＭＡＲは、セントロメア関連ＤＮＡやテロメア配列によく見られ、有糸分裂での染色体集合や中期における染色体形状の維持に重要であると思われる。したがって、Ｓ／ＭＡＲは、細胞周期の様々な段階の複数の独立した過程に関与している。
【００６９】
実験的に同定されたＳ／ＭＡＲの解析により、典型的なエレメントが３００塩基対（ｂｐ）程度で、最大数キロ塩基（ｋｂ）長であることが明らかとなった。これらのＳ／ＭＡＲは、ＡＴリッチなヌクレオチドモチーフ（＞７０％Ａ−Ｔ）をはじめとする、いくつかの配列モチーフを含み得る。ほとんどのＭＡＲは、２００ｂｐ以内の２つの個々の配列ＡＡＴＡＡＹＡＡおよびＡＷＷＲＴＡＡＮＮＷＷＧＮＮＮＣからなる二成分配列である、「ＭＡＲ認識シグネチャー」と呼ばれるＭＡＲ特異的配列を含むように思われる。ＭＡＲ配列を示すものであると提案されている、他の配列は、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ（ＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴ）、複製開始タンパク質部位（ＡＴＴＡおよびＡＴＴＴＡ）、ホモオリゴヌクレオチド反復（例えば、Ａ−ボックスＡＡＴＡＡＡＹＡＡＡおよびＴ−ボックスＴＴＷＴＷＴＴＷＴＴ）、ＤＮアーゼＩ超感受性部位、潜在的ヌクレオソーム非存在領域、ポリプリン−ポリピリミジンの連続、ならびに負の超らせんの条件下で非Ｂ型のＤＮＡ立体構造または三重らせん立体構造をとり得る配列である。
【００７０】
Ｓ／ＭＡＲは、それぞれ、ユークロマチンドメインおよびヘテロクロマチンドメインと呼ばれる、遺伝子発現が許容される構造または遺伝子発現が許容されない構造に独立に編成される染色体ドメイン間の遺伝子境界を形成することができると推測された。それゆえ、Ｓ／ＭＡＲエレメントが両側にあるトランス遺伝子は、その発現が隣接した染色体環境とは無関係であり続ける自律的クロマチンドメインを構成し得る。最近、Ｓ／ＭＡＲは、染色体環境中に一緒に挿入されたときに、隣接トランス遺伝子の発現を増加させることが示された。あるいは、Ｓ／ＭＡＲは、その染色体組込み部位付近のクロマチンを活発に再構成し、それにより、例えば、ヒストンの修飾または核内での局在変化を仲介することによって、トランス遺伝子サイレンシングを妨げ得る。
【００７１】
ニワトリリゾチーム（ｃＬｙｓ）遺伝子座の５’末端に接するよく特徴付けられた３ｋｂのＭＡＲエレメント、ショウジョウバエＳｃｓ境界エレメント、ｈｓｐＳＡＰ ＭＡＲ、マウスＴ細胞受容体ＴＣＲａ、およびラットＬＡＰ遺伝子座制御領域は全て、種々の系において、許容されるクロマチン構造をもたらすことが報告されている。これらのエレメントを発現ベクターに導入し、得られたトランス遺伝子発現を、ＣＨＯ細胞の安定的なトランスフェクションによりアッセイした。これらのエレメントの大半は、ＣＨＯ細胞プールでのトランス遺伝子の発現レベルに対する適度の効果を示した。対照的に、ｃＬｙｓＭＡＲは、これらのエレメントの中で２番目に良いものよりも６倍効果的であった。その上、２つのｃＬｙｓＭＡＲエレメントが発現カセットの両側にあるときには、さらに４倍の発現レベルの増加が見られた。
【００７２】
複数コピーのｃＬｙｓＭＡＲは巨大（６ｋｂ）であり、そのため、発現ベクターのサイズを考慮すれば、このようなクロマチンエレメントの一般的使用は制限される。ＭＡＲの多用途性を改善する１つのアプローチは、トランス遺伝子発現カセットと、別のプラスミド上でトランスにある様々な量のｃＬｙｓＭＡＲとをコトランスフェクトすることからなる。これは、１つのｃＬｙｓＭＡＲエレメントしか持たないプラスミドで得られるレベルよりも高いレベルにまで発現を上昇させることが示された。したがって、ＭＡＲを持つプラスミドを、コトランスフェクションの時に、現在の発現ベクターに加えるだけで、発現レベルを著しく増加させることができる。もう１つのアプローチでは、ｃＬｙｓＭＡＲの短い機能エレメントを欠失突然変異導入により規定した。多量体化されたときの、ＭＡＲのこれらの部分は、サイズがずっと小さいにもかかわらず、全長エレメントと同じ活性があることが分かった（Ｐ．−Ａ．Ｇｉｒｏｄ ａｎｄ Ｎ．Ｍｅｒｍｏｄ，未発表データ）。
【００７３】
多量体タンパク質の産生は１つの大きな問題に直面する。すなわち、効率的な産生を得るために、全てのサブユニットを協調的に化学量論的レベルで合成する必要がある。それゆえ、プロモーターや３／−領域などの、同一の発現シグナルを異なる発現カセットで使用した。重鎖および軽鎖の発現カセットをコードし、かつ様々な種類の隣接クロマチンエレメントを有する２つの線状化プラスミドを、ＭＡＲエレメントの存在下または非存在下で、ＣＲＯ細胞に同時にトランスフェクトした。再度、ｃＬｙｓＭＡＲエレメントを加えると、単離されたＣＲＯ細胞クローンの平均生産性と最大生産性が５〜１０倍増加した。
【００７４】
最適設定のうちの１つは、ＭＡＲエレメントを、重鎖および軽鎖発現ベクター上に、シスに、およびトランスフェクション混合液に追加のＭＡＲ含有プラスミドをさらに添加することによって、トランスに、追加することからなっていた。シスおよびトランスのｃＬｙｓＭＡＲのコトランスフェクションにより、安定にコトランスフェクトされた細胞のプールでの平均発現レベルが増加した。さらに、それは、異なるクローンでの発現変動を低下させ、したがって、高い分泌レベルを示すクローンをより高い頻度で単離することが可能になった。
【００７５】
ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲは、様々なクロマチン構造調節エレメントのトランス遺伝子発現に対する影響を比較する研究において最も活性のある配列の１つとして同定された。それは、様々な哺乳動物細胞株での調節されたまたは構成的なトランス遺伝子発現のレベルを増加させることも示された。ｃＬｙｓＭＡＲ配列を含めると、ＣＨＯ細胞株にトランスフェクトしたときに、トランス遺伝子の全体的な発現が増加した。
【００７６】
前述の通り、治療的タンパク質は翻訳後修飾を必要とするので、通常、哺乳動物発現系がその製造に好ましい。現在、種々の哺乳動物細胞発現系が、タンパク質の発現に利用可能である。しかしながら、哺乳動物細胞でこれらの発現ベクター／発現系から得られる組換えタンパク質の発現レベルは、商業的に実現可能なものでない。
【００７７】
ＥＮＢＲＥＬは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合タンパク質である。ＥｎｂｒｅｌのＦｃ成分は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域を含むが、ＣＨ１ドメインを含まない。ＥＮＢＲＥＬは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系で組換えＤＮＡ技術によって産生される。それは９３４アミノ酸からなり、約１５０キロダルトンの見かけの分子量を有する。
【００７８】
ＥＮＢＲＥＬは、関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および乾癬の兆候および症状を低下させることが示されている重大な科学的進歩である。
【００７９】
ＴＮＦは、正常な炎症応答や免疫応答に関与する天然のサイトカインである。ＴＮＦは、関節リウマチ（ＲＡ）、多関節型若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、および結果として生じる関節病変の炎症過程において重要な役割を果たす。ＴＮＦレベルの上昇は、ＲＡ患者の滑液で見られる。ＴＮＦ（ＴＮＦＲ）の２つの異なる受容体である５５キロダルトンタンパク質（ｐ５５）と７５キロダルトンタンパク質（ｐ７５）はもともと、細胞表面に、および可溶性形態で、単量体分子として存在している。
【００８０】
ＴＮＦの生物活性は、どちらかの細胞表面ＴＮＦ受容体への結合に依存する。ＥＮＢＲＥＬのようなタンパク質であれば、競合阻害によってＴＮＦの作用を阻害し、ひいては、ＴＮＦのその細胞受容体への結合を妨げることによってＴＮＦを生物学的に不活性にするであろう。
【００８１】
ＴＮＦＲの細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合すれば、血清滞留時間を増加させることによりタンパク質の最適な薬物動態をもたらす、分子の二量体化が可能になるであろう。融合タンパク質の両方のドメインはヒト起源であるので、このキメラタンパク質であれば、理想としては、免疫応答を誘導せず、そのため、ヒト使用に好適な分子となるであろう。
【００８２】
本発明は、Ｅｎｂｒｅｌをより大量に産生するために上述のＳ／ＭＡＲを用いる新規の発現ベクターに関する。培養培地から単離されたとき、このＤＮＡ配列の発現産物は、ＴＮＦＲ：Ｆｃの生物活性を示す。ベクターの開発、クローニング、およびサブクローニング、トランスフェクション、発酵、ならびに精製の戦略が開示されている。
【００８３】
方法
発現ベクターのクローニングおよび構築
ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにおいて、目的の遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサーによって調節される。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサーは、組換えタンパク質の効率的な、高レベル発現を可能にする。目的の遺伝子であるＴＮＦＲ：Ｆｃを、方向ＴＯＰＯ発現キットを用いて、ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。最初にコロニーＰＣＲで、その後、適当な制限酵素を用いて、陽性の形質転換体を確認した。予想されるパターンを与えるＢａｍＨＩとＸｈｏＩを用いて、この形質転換体を二重消化した。この形質転換体を、制限酵素のＡｐａＩとＳａｃＩＩを用いることによっても確認し、これにより、予想されたパターンがはっきりと示された。その後、このインサートの配列を確認した。
【００８４】
単離されたスキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）（ここでは、Ｓ／ＭＡＲ配列と示す）を、最初にＰＣＲでｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターにクローニングし、適当な制限酵素解析とシークエンシングにより確認した。その後、クローニングしたＳ／ＭＡＲを、制限部位を用いて、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター中のＣＭＶプロモーターの上流に挿入した。このインサートを制限解析により確認した。
【００８５】
組換えＴＮＦＲの発現
組換え発現ベクター（今回の場合は、ｐＣＤＮＡ３．１）を用いて、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させた。組換え発現ベクターは、目的のタンパク質をコードするＤＮＡがその発現を促進する特定の遺伝子エレメントに連結されている複製可能なＤＮＡ構築物である。このような転写単位の集合体は、通常、転写プロモーターまたはエンハンサー、適当な転写および翻訳の開始および終結部位、目的のタンパク質をコードするコード配列、ならびにトランスフェクトされた哺乳動物細胞株クローンとトランスフェクトされていない哺乳動物細胞株クローンの区別を助けることができる選択マーカーから構成される。
【００８６】
哺乳動物細胞での組換えタンパク質の発現が本発明の一部として特に好ましいが、それは、このようなタンパク質が、正しく折り畳まれ、それにより、完全に機能的な立体構造となることが知られているからである。組換え遺伝子発現に使用される細胞株はＣＨＯ−Ｋ１細胞株であり、これは、均一な細胞集団となるものである。組換えタンパク質をコードする安定に組み込まれた転写単位を含むＣＨＯ−Ｋ１のトランスフェクトされたコロニーは、単一培養物である、すなわち、この細胞は、１個の祖先形質転換体の子孫である。
【００８７】
形質転換された宿主細胞は、完全な転写単位を含む発現ベクターでトランスフェクトされる。発現したＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、培地上清中に分泌される。発現産物のレベルの増強は、抗生物質（ネオマイシン）耐性をコードする遺伝子などの選択マーカーを用いて細胞株を選択することにより達成される。
【００８８】
上記の説明を考慮すれば、本発明の多くのバリエーションが当業者の心に浮かぶであろう。そのような明白なバリエーションは、添付の特許請求の範囲の完全に意図された範囲内にある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え可溶性タンパク質の発現のためのベクターおよび化合物に関する。特に、本発明は、組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質の発現のための核酸分子、発現ベクター、および宿主細胞に関する。本発明はさらに、この発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を用いて組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８６年、米国ＦＤＡは、哺乳動物細胞由来のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）タンパク質を治療目的で使用することを承認した。細胞培養と組換えＤＮＡ技術の進歩により、遺伝子改変細胞を用いて治療的価値または他の経済的価値のある種々の同様のタンパク質を発現させることが容易になった。現在、規制当局による治療使用の承認が得られたモノクローナル抗体が数個あり、様々な開発および承認段階にあるものが数百個ある。ｔＰＡと同様、これらのタンパク質の大半は、不死化チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現されるが、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）などの、他の細胞株も組換えタンパク質産生が承認されている。
【０００３】
高等真核生物供給源から得られる、多くの生物活性治療薬の発現には、下等な真核生物細胞または原核生物細胞では天然に生じない翻訳後修飾が必要とされることが多く、そのため、高等真核生物供給源から得られる細胞を使用することが余儀なくされる。したがって、必要とされる翻訳後修飾が細胞株で同様にうまく行なわれるので、通常、哺乳動物発現系が、大半の治療的タンパク質の製造に好ましい。現在、種々の哺乳動物細胞発現系が、タンパク質の発現に利用可能である。通常、発現ベクターでは、組換え遺伝子の発現を促進するための強力なウイルスまたは細胞プロモーター／エンハンサーが使用される。しかしながら、哺乳動物細胞でこれらの発現ベクター／発現系から得られる組換えタンパク質の発現レベルは、商業的に実現可能なものでない。治療薬の生産中の、対処される必要がある重要な問題が２つあり、それは、（ａ）この物質を提供するのにかかる時間と、（ｂ）特に、発展途上国または開発途上国の大衆が利用できるように、この物質の価格を下げることである。それゆえ、バイオテクノロジー産業は、スケジュールとコストを減らす新しい技術やプロセス開発戦略を検討し続けている。
【０００４】
ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質としても知られる、ＥＮＢＲＥＬ（エタネルセプト）は、ヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ（ｐ７５）の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃドメインとを含む組換え融合タンパク質である。ＥＮＢＲＥＬは、関節リウマチ治療のための重大な科学的進歩であり、これは、多くの患者において、関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および乾癬の兆候や症状を低下させることが示されているほどである。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、正常な炎症応答や免疫応答に関与する天然のサイトカインである。ＴＮＦは、関節リウマチ（ＲＡ）、多関節型若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、および結果として生じる関節病変の炎症過程において重要な役割を果たす。ＴＮＦレベルの上昇は、ＲＡ患者の滑液で見られる。
【０００５】
組換え遺伝子の遺伝的安定性が低いことおよび／または組換え遺伝子がサイレンシングされることが理由で、哺乳動物細胞内でのＴＮＦＲ：Ｆｃなどの組換えタンパク質の産生は難しいことがある。遺伝子サイレンシングを引き起こし得るいくつかの分子メカニズムが報告されており、それには、ほんの一例を挙げれば、ＤＮＡメチル化、負の位置効果、組込み依存的な抑制などが含まれる。
【０００６】
したがって、当該技術分野には、組換え融合タンパク質の大規模産生時の遺伝的安定性がより高い発現系を提供することによって、このようなタンパク質の既知の産生方法の欠陥を克服する必要性がある。細胞培養物からの大量のＴＮＦＲ：Ｆｃの産生を容易にするために、新規の発現ベクターを開発した。この発現ベクターを使用することにより、治療的タンパク質の発現が増加することが示された。ＴＮＦＲ：Ｆｃのクローニング、発現、および精製を本出願で記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、付随する特許請求の範囲に記述された特徴および／または単独でもしくは任意の組合せで特許性のある主題を含み得る以下の特徴の１つ以上を含む。
【０００８】
本発明は、哺乳動物細胞や他の真核生物細胞での組換えタンパク質の発現収量を増加させ、安定化するために使用し得る、新規のスキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列の発見に基づくものである。Ｓ／ＭＡＲ配列は、すぐ近くの転写カセットの遺伝的安定性を増加させ、ＤＮＡメチル化などのメカニズムを妨害することによって遺伝子サイレンシングを阻害する。さらに、Ｓ／ＭＡＲ配列の存在は、位置効果を減少させることによってクローン間の変動を減少させると考えられる。
【０００９】
したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの変異体および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列、または単離された核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を有する単離された核酸に関する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列およびその任意の組合せを運ぶ発現ベクターに関する。Ｓ／ＭＡＲ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール）アルゴリズムのようなマッチング法を用いるペアワイズＤＮＡ配列アラインメントによって決定されるようなそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択されてもよい。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せと、１つ以上の発現制御エレメントに機能的に連結された腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列とを運ぶ発現ベクターに関する。
【００１２】
Ｓ／ＭＡＲ配列は、発現ベクター内の転写プロモーターの上流または下流にあってもよい。さらに、Ｓ／ＭＡＲ配列は、腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列から０〜１０ｋｂ離れたところにあってもよい。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶ発現ベクターの構築方法に関する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶ発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１５】
さらに別の実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶ発現ベクターを用いて組換え発現によって腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法に関する。
【００１６】
またさらなる実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶ発現ベクターによって発現される腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【００１７】
さらに別の実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を運ぶ発現構築物で哺乳動物細胞をトランスフェクトし、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列またはその任意の組合せを運ぶプラスミドを用いて同じ哺乳動物細胞をコトランスフェクトすることによって、腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法に関する。
【００１８】
またさらなる実施形態では、本発明は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列の生物学的活性に影響を与えるエピジェネティック因子および遺伝的因子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明を、以下の図面を参照してさらに説明する。
【図１】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図２】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ１／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図３】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ２／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図４】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ３／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図５】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ４／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図６】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ５／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【図７】プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３．１／ＭＡＲ６／ＴＮＦＲ：Ｆｃの構築物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で使用される「スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）」という用語は、細胞核のタンパク質スキャフォールドまたはマトリックスへの周期的な結合によって、真核生物ゲノムの核ＤＮＡを約６０，０００個のクロマチンドメインに編成する、長さ数百塩基対（ｂｐ）の非コンセンサス様ＡＴリッチＤＮＡエレメントを指す。それらは、通常、フランキング領域、クロマチン境界領域、およびイントロンなどの非コード領域に見出される。
【００２１】
「少なくとも７０％の相同性」により、ヌクレオチド配列が、ＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール）アルゴリズムのようなマッチング法を用いるペアワイズＤＮＡ配列アラインメントによって測定された規定の配列と少なくとも７０％相同であるＤＮＡを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される「配列番号１、２、３、４、５、および６の機能断片」という用語は、発現収量に対する望ましい効果を有するほど大きなサイズの前記配列の断片を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される「フランキング」という用語は、問題になっている配列が、発現ベクターに直接的に接続されているか、またはそのような連結配列がこれらの配列の望ましい効果を妨害しない限り、長さが最大１０ｋｂもしくはそれより長いものであり得る連結ＤＮＡ配列によって接続されているかのいずれかであることを意味する。発現ベクターは、最低でも、目的の遺伝子とそれに機能的に連結された発現制御エレメントとを含む。
【００２４】
発現制御エレメントは、転写プロモーター、転写エンハンサー、転写リプレッサー、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ポリアデニル化部位、翻訳開始シグナル、および翻訳終結シグナルなどの通常の調節エレメントを含み、これは、当業者によって容易に達成され得る。
【００２５】
「相補体」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比較したときに、相補的ヌクレオチド配列と逆方向性とを有する核酸配列を指す。例えば、配列５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’は、５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に相補的である。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「変異体」という用語は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失しているか、置換されているか、または付加されている、特異的に同定された配列とは異なるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を指す。変異体は、天然に生じるアレル変異体であっても、天然には生じない変異体であってもよい。変異体は、同じ種に由来するものであっても、他の種に由来するものであってもよく、ホモログ、パラログ、およびオルソログを包含してもよい。特定の実施形態では、変異体は、問題になっている配列の生物活性と同等または同様の生物活性を有する。
【００２７】
変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、本発明の配列との少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも５２％、より好ましくは少なくとも５３％、より好ましくは少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６１％、より好ましくは少なくとも６２％、より好ましくは少なくとも６３％、より好ましくは少なくとも６４％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも６７％、より好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも６９％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。
【００２８】
本明細書で使用される「配列モチーフ」という用語は、より大きいオリゴヌクレオチド配列中に含まれる少なくとも２ヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列を指す。配列モチーフは、オリゴヌクレオチド配列中に１回現れ得るか、またはそれは何回も現れ得る。例えば、オリゴヌクレオチド５’−ＡＵＣＡＵＣＡＵＧ−３’は、３回現れる５’−ＡＵ−３’という配列モチーフと、２回現れる５’−ＵＣ−３’および５’−ＣＡ−３’という配列モチーフと、１回現れる５’−ＵＧ−３’という配列モチーフとを含む。
【００２９】
本明細書で使用される「エピジェネティック因子」という用語は、操作上、１つの遺伝子または１組の遺伝子の発現に影響を及ぼす任意の外部過程または外部因子を指し、タンパク質、核酸などのような内部因子を含む任意の内部過程または内部因子を指す「遺伝的因子」とは対照的なものを表す。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「ＴＮＦＲ：Ｆｃ受容体タンパク質」または「ＴＮＦＲ：Ｆｃ」という用語は、ヒトＴＮＦＲＩＩ（ｐ７５）タンパク質の細胞外ドメインに類似したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、そのネイティブなリガンドであるＴＮＦ−アルファに結合することができ、それによりＴＮＦ−アルファが細胞膜結合型のＴＮＦＲＩまたはＴＮＦＲＩＩに結合するのを阻害するタンパク質を指す。存在することが知られているＴＮＦＲの２つの異なる形態のうち、本発明の好ましいＴＮＦＲは、ＴＮＦＲＩＩ（ｐ７５）である。可溶性ＴＮＦＲ構築物は、細胞外への分泌を容易にするために、膜貫通領域を欠いている。細胞外ドメインであるＴＮＦＲＩＩの可溶性部分は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にインフレームで融合されている。本発明の融合タンパク質は生物活性がある、すなわち、それは溶液中でＴＮＦに結合することができる。
【００３１】
本明細書で使用される「生体分子」という用語は、生体環境と関連した物質、化合物、または成分を指し、それには、糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機分子、ハプテン、エピトープ、生体細胞、生体細胞の一部、ビタミン、ホルモンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
「発現系」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質を産生するために使用される任意のインビボまたはインビトロ生体系を指す。
【００３３】
本明細書で使用される「組換え」という用語は、タンパク質が組換え発現系に由来することを意味し、この組換え発現系は、本明細書では、哺乳動物細胞に基づく発現系である。
【００３４】
本明細書で使用される「単離されたＤＮＡ配列」という用語は、独立した断片の形態のまたはより大きいＤＮＡ構築物の一部としてのＤＮＡポリマーを指す。このような配列であれば、発現ベクターにクローニングし、ＤＮＡ断片の同定、操作、および回収のために、この配列を大量に単離することができるであろう。このような配列は、非翻訳ＤＮＡ領域によるまたはイントロンによる中断が全くないオープンリーディングフレームで提供される。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを指す。本発明により提供されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーとから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み合わせて、組換え転写単位で発現させることが可能な合成遺伝子を提供することができる。
【００３６】
「染色体」とは、細胞の内部に見出されるＤＮＡとタンパク質の組織化された構造物のことである。
【００３７】
「クロマチン」とは、真核生物細胞の核の内部に見出されるＤＮＡとタンパク質の複合体のことであり、これによって染色体が構成されている。
【００３８】
「ＤＮＡ」または「デオキシリボ核酸」は遺伝情報を含む。それは、様々なヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣで構成されている。
【００３９】
本明細書で使用される「遺伝子」は、所与の成熟タンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を指す。それは、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーター、またはエンハンサーなどの、非翻訳フランキング領域を含まない。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「転写プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御する核酸配列を指す。プロモーターは、ネイティブな遺伝子に由来していてもよく、または天然に見出される様々なプロモーターに由来する様々なエレメントから構成されていてもよい。プロモーターは、宿主細胞内で転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞にとって同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来していてもよい。好適なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターなどである。
【００４１】
「転写エンハンサー」は、遺伝子の位置または方向性とは無関係に、遺伝子の転写を開始するよう働く遺伝子の配列を指す。
【００４２】
「転写リプレッサー」は、遺伝子の位置または方向性とは無関係に、遺伝子の転写を阻害するよう働く遺伝子の配列を指す。
【００４３】
「シグナルペプチド」という用語は、分泌される成熟タンパク質の前にあるアミノ末端ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは切断されるので、成熟タンパク質中には存在しない。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「タンパク質」という用語は、あるアミノ酸（またはアミノ酸残基）のα−炭素に結合しているカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接するアミノ酸のα−炭素に結合しているアミノ基のアミノ窒素原子と共有結合するようになるときに生じるような、ペプチド結合を介して連結された２つ以上の個々のアミノ酸の任意のポリマー（天然に存在するかどうかを問わない）を指す。これらのペプチド結合連結、ならびにそれらを構成する原子（すなわち、α−炭素原子とカルボキシル炭素原子（およびその置換酸素原子）とアミノ窒素原子（およびその置換水素原子））は、タンパク質の「ポリペプチド骨格」を形成する。さらに、本明細書で使用するとき、「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語（これらは、時に、本明細書で互換的に使用され得る）を含むことが理解される。
【００４５】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を運ぶことができる核酸分子を指す。ベクターは、通常、プラスミドから得られるが、これは、ＤＮＡ断片を宿主細胞内に運搬する「分子キャリア」のように機能する。
【００４６】
ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供し得る任意のベクターであってもよく、ベクターの選択は、それが導入されることになる宿主細胞によって決まることが多い。したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミドであってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されたときに、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。ベクターは、好ましくは、コードＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要とされる追加の部分に機能的に連結されている発現ベクターである。一般に、発現ベクターは、プラスミドもしくはウイルスＤＮＡから得られるか、またはその両方のエレメントを含み得る。「機能的に連結される」という用語は、これらの部分が、その意図された目的のために、例えば、転写がプロモーターの中で開始され、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の中を進むために、協調して働くように配置されていることを示す。
【００４７】
本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、細菌やいくつかの他の生物に見出されるＤＮＡの小環状二本鎖ポリヌクレオチド構造物を指す。プラスミドは、宿主細胞染色体とは無関係に複製することができる。
【００４８】
「複製」という用語は、その鋳型ＤＮＡ鎖からのＤＮＡの合成を指す。
【００４９】
「転写」という用語は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を指す。
【００５０】
「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡからのポリペプチドの合成を指す。
【００５１】
「シス」という用語は、連結された２つ以上のＤＮＡエレメントの同じプラスミド上での配置を指す。
【００５２】
「トランス」という用語は、２つ以上のエレメントの２つ以上の異なるプラスミド上での配置を指す。
【００５３】
「方向性」という用語は、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの順序を指す。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「単離された核酸断片」という用語は、一本鎖または二本鎖であるＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つ以上の部分から構成されていてもよい。
【００５５】
本明細書で使用される「遺伝子増幅」という用語は、他の遺伝子のコピー数を比例的に増加させることなく、特定の遺伝子（単数または複数）を選択的に、繰り返し複製することを指す。遺伝子増幅は、多くの生物における広く普及した重要な発生および進化上の過程である。遺伝子増幅は、（ｉ）ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞で見られるような発生的に調節された遺伝子発現と（ｉｉ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で報告されたｌａｃ領域の増幅のような自然に起こる遺伝子発現の２つのカテゴリーに分類することができる。哺乳動物細胞で最もよく知られている遺伝子増幅は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）である。
【００５６】
「形質転換」という用語は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノム中への核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「形質転換された」生物と呼ばれる。
【００５７】
「真核生物細胞」という用語は、その細胞が内膜や細胞骨格によって複雑な構造に編成されている真核生物に由来する任意の細胞を指す。遺伝子／タンパク質操作に使用することができ、かつ細胞培養条件下で維持し、後でトランスフェクトすることもできる任意の真核生物細胞であれば、本発明に含まれる。特に好ましい細胞型には、幹細胞、胚性幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＢＨＫ２１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、Ｃ２Ｃ１２、ＨＥＫ、ＭＤＣＫ、癌細胞、および初代分化細胞または初代未分化細胞が含まれる。哺乳動物細胞には、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または他の不死化細胞株が含まれ得る。
【００５８】
本明細書で使用するとき、「トランスフェクション」という用語は、任意の転移手段によるＤＮＡのような外来物質の真核生物細胞への導入を指す。様々なトランスフェクション方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクトアミントランスフェクション、およびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
「トランスフェクトされた細胞」という用語は、外来ＤＮＡが真核生物細胞に導入された真核生物細胞を指す。このＤＮＡは、宿主染色体の一部であることができるし、または染色体外エレメントとして複製することができる。
【００６０】
「コトランスフェクション」という用語は、真核生物細胞を、細胞にとって異種となる２つ以上の外因性遺伝子で同時にトランスフェクトする方法を指す。
【００６１】
「一過性遺伝子発現」という用語は、少量のタンパク質の迅速な産生のための好都合な方法を指す。ＣＯＳ細胞は、通常、一過性発現の特徴解析に使用される。
【００６２】
「安定な遺伝子発現」という用語は、宿主染色体中へのプラスミドの安定な組込みによって目的の遺伝子を恒久的に発現する安定細胞株の調製を指す。
【００６３】
腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質活性をコードするＤＮＡを含み、かつ適当な細胞株にトランスフェクトされたときに、ＴＮＦＲ：Ｆｃ活性の発現を促進する、新規の真核生物発現ベクターが構築されている。この新規の発現ベクターを用いて、可溶性ＴＮＦＲ：Ｆｃを産生することができる。組換えにより産生されるＴＮＦＲ：Ｆｃ活性は、関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および乾癬をはじめとする、様々な障害の治療や予防に有用である。
【００６４】
本発明は、増加した量で可溶性ＴＮＦＲ：Ｆｃを産生するために使用される新規の真核生物発現ベクターに関する。
【００６５】
原核生物発現系は、分子生物学における研究ツールの初期のレパートリーの一部であった。原核生物系における組換え真核生物タンパク質のデノボ合成は、真核生物遺伝子産物にいくつかの問題を引き起こした。それらの中で最も重要な２つは、不適切なタンパク質フォールディングおよびアセンブリと、翻訳後修飾、主に、グリコシル化およびリン酸化の欠如であった。原核生物系は、真核生物の構造タンパク質および／または触媒機能タンパク質を産生するための適切なタンパク質合成メカニズムを全て有しているわけではない。それゆえ、必要とされる翻訳後修飾がその細胞系によってその場で対処されるという単純な理由で、通常、哺乳動物発現系が治療的タンパク質の製造に好ましい。現在、種々の哺乳動物発現系が、組換え遺伝子の一過性発現または安定発現のいずれかに利用可能である。通常、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞安定発現系（ＣＨＯ ＳＥＳ）が使用される。さらに、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、マウスＬ−細胞、ならびにＪ５５８ＬおよびＳｐ２／０のような骨髄腫細胞株なども、安定なトランスフェクタントの樹立のための宿主として利用される。
【００６６】
しかしながら、外来ＤＮＡの宿主細胞ゲノム中への組込みは、予測不可能な過程である。トランス遺伝子発現が細胞株によって大きく変動することや、組込みが表現型の予期せぬ変化を引き起こし得ることが十分に立証されている。クローン発現レベルの大きな変動の背後にある理由としては、プラスミドコピー数が異なることや、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）において斑入り位置効果として当初記載された、位置効果として知られる現象が挙げられる。組込みの位置は、少なくとも３つのメカニズム、すなわち、局所的な調節エレメントの活性と、局所的なクロマチン構造と、局所的なＤＮＡメチル化状態とによって、トランス遺伝子発現に影響を与えることができる。２つの一般的なアプローチを用いて、負の位置効果または組込み依存的な抑制からＤＮＡを保護することができる。１つのアプローチは、部位特異的組換え法を用いて、転写活性のある所定の部位にトランス遺伝子を直接組み込むことを含む。もう１つの方法は、組込み部位にかかわらず、遺伝子が周囲のクロマチンの影響から保護されるように、クロマチン境界領域に見出されるＤＮＡ配列エレメントを発現ベクターに組み込むことである。組換えタンパク質発現に関して、クロマチン境界として振る舞い、トランスフェクトされた遺伝子を周囲のクロマチンの影響から保護する配列としては、インスレーター配列およびスキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）が挙げられる。
【００６７】
Ｓ／ＭＡＲは、単離された核スキャフォールドまたは核マトリックスにインビトロで高い親和性で結合するＤＮＡ配列である。発現研究により、トランス遺伝子の両側にインスレーターを置くと、位置効果が低下し、そのため、クローン発現変動が抑制されることが示唆されている。Ｓ／ＭＡＲは、クロマチンループを核マトリックスにつなぎとめる比較的短い（１００〜１０００ｂｐ長）配列である。Ｓ／ＭＡＲは、様々な転写単位を包含するドメインの末端の両側にあることが観察されている。核マトリックスの表面と同じ位置を占める染色体領域中で転写が開始されるように、Ｓ／ＭＡＲが転写活性のあるクロマチン領域を１つにまとめることも示されている。
【００６８】
同様に、周囲を取り囲むシス調節エレメントのみによってドメイン内の遺伝子の発現が制御されるように、Ｓ／ＭＡＲは、独立したクロマチンドメインの境界を規定し得る。Ｓ／ＭＡＲについて、いくつかの考えられる機能が以前に論じられており、それには、クロマチンドメインの境界を形成すること、クロマチン立体構造を変化させること、ＤＮＡ複製の開始に関与すること、および染色体のクロマチン構造を編成することが含まれる。Ｓ／ＭＡＲは、セントロメア関連ＤＮＡやテロメア配列によく見られ、有糸分裂での染色体集合や中期における染色体形状の維持に重要であると思われる。したがって、Ｓ／ＭＡＲは、細胞周期の様々な段階の複数の独立した過程に関与している。
【００６９】
実験的に同定されたＳ／ＭＡＲの解析により、典型的なエレメントが３００塩基対（ｂｐ）程度で、最大数キロ塩基（ｋｂ）長であることが明らかとなった。これらのＳ／ＭＡＲは、ＡＴリッチなヌクレオチドモチーフ（＞７０％Ａ−Ｔ）をはじめとする、いくつかの配列モチーフを含み得る。ほとんどのＭＡＲは、２００ｂｐ以内の２つの個々の配列ＡＡＴＡＡＹＡＡおよびＡＷＷＲＴＡＡＮＮＷＷＧＮＮＮＣからなる二成分配列である、「ＭＡＲ認識シグネチャー」と呼ばれるＭＡＲ特異的配列を含むように思われる。ＭＡＲ配列を示すものであると提案されている、他の配列は、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ（ＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴ）、複製開始タンパク質部位（ＡＴＴＡおよびＡＴＴＴＡ）、ホモオリゴヌクレオチド反復（例えば、Ａ−ボックスＡＡＴＡＡＡＹＡＡＡおよびＴ−ボックスＴＴＷＴＷＴＴＷＴＴ）、ＤＮアーゼＩ超感受性部位、潜在的ヌクレオソーム非存在領域、ポリプリン−ポリピリミジンの連続、ならびに負の超らせんの条件下で非Ｂ型のＤＮＡ立体構造または三重らせん立体構造をとり得る配列である。
【００７０】
Ｓ／ＭＡＲは、それぞれ、ユークロマチンドメインおよびヘテロクロマチンドメインと呼ばれる、遺伝子発現が許容される構造または遺伝子発現が許容されない構造に独立に編成される染色体ドメイン間の遺伝子境界を形成することができると推測された。それゆえ、Ｓ／ＭＡＲエレメントが両側にあるトランス遺伝子は、その発現が隣接した染色体環境とは無関係であり続ける自律的クロマチンドメインを構成し得る。最近、Ｓ／ＭＡＲは、染色体環境中に一緒に挿入されたときに、隣接トランス遺伝子の発現を増加させることが示された。あるいは、Ｓ／ＭＡＲは、その染色体組込み部位付近のクロマチンを活発に再構成し、それにより、例えば、ヒストンの修飾または核内での局在変化を仲介することによって、トランス遺伝子サイレンシングを妨げ得る。
【００７１】
ニワトリリゾチーム（ｃＬｙｓ）遺伝子座の５’末端に接するよく特徴付けられた３ｋｂのＭＡＲエレメント、ショウジョウバエＳｃｓ境界エレメント、ｈｓｐＳＡＰ ＭＡＲ、マウスＴ細胞受容体ＴＣＲａ、およびラットＬＡＰ遺伝子座制御領域は全て、種々の系において、許容されるクロマチン構造をもたらすことが報告されている。これらのエレメントを発現ベクターに導入し、得られたトランス遺伝子発現を、ＣＨＯ細胞の安定的なトランスフェクションによりアッセイした。これらのエレメントの大半は、ＣＨＯ細胞プールでのトランス遺伝子の発現レベルに対する適度の効果を示した。対照的に、ｃＬｙｓＭＡＲは、これらのエレメントの中で２番目に良いものよりも６倍効果的であった。その上、２つのｃＬｙｓＭＡＲエレメントが発現カセットの両側にあるときには、さらに４倍の発現レベルの増加が見られた。
【００７２】
複数コピーのｃＬｙｓＭＡＲは巨大（６ｋｂ）であり、そのため、発現ベクターのサイズを考慮すれば、このようなクロマチンエレメントの一般的使用は制限される。ＭＡＲの多用途性を改善する１つのアプローチは、トランス遺伝子発現カセットと、別のプラスミド上でトランスにある様々な量のｃＬｙｓＭＡＲとをコトランスフェクトすることからなる。これは、１つのｃＬｙｓＭＡＲエレメントしか持たないプラスミドで得られるレベルよりも高いレベルにまで発現を上昇させることが示された。したがって、ＭＡＲを持つプラスミドを、コトランスフェクションの時に、現在の発現ベクターに加えるだけで、発現レベルを著しく増加させることができる。もう１つのアプローチでは、ｃＬｙｓＭＡＲの短い機能エレメントを欠失突然変異導入により規定した。多量体化されたときの、ＭＡＲのこれらの部分は、サイズがずっと小さいにもかかわらず、全長エレメントと同じ活性があることが分かった（Ｐ．−Ａ．Ｇｉｒｏｄ ａｎｄ Ｎ．Ｍｅｒｍｏｄ，未発表データ）。
【００７３】
多量体タンパク質の産生は１つの大きな問題に直面する。すなわち、効率的な産生を得るために、全てのサブユニットを協調的に化学量論的レベルで合成する必要がある。それゆえ、プロモーターや３／−領域などの、同一の発現シグナルを異なる発現カセットで使用した。重鎖および軽鎖の発現カセットをコードし、かつ様々な種類の隣接クロマチンエレメントを有する２つの線状化プラスミドを、ＭＡＲエレメントの存在下または非存在下で、ＣＲＯ細胞に同時にトランスフェクトした。再度、ｃＬｙｓＭＡＲエレメントを加えると、単離されたＣＲＯ細胞クローンの平均生産性と最大生産性が５〜１０倍増加した。
【００７４】
最適設定のうちの１つは、ＭＡＲエレメントを、重鎖および軽鎖発現ベクター上に、シスに、およびトランスフェクション混合液に追加のＭＡＲ含有プラスミドをさらに添加することによって、トランスに、追加することからなっていた。シスおよびトランスのｃＬｙｓＭＡＲのコトランスフェクションにより、安定にコトランスフェクトされた細胞のプールでの平均発現レベルが増加した。さらに、それは、異なるクローンでの発現変動を低下させ、したがって、高い分泌レベルを示すクローンをより高い頻度で単離することが可能になった。
【００７５】
ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲは、様々なクロマチン構造調節エレメントのトランス遺伝子発現に対する影響を比較する研究において最も活性のある配列の１つとして同定された。それは、様々な哺乳動物細胞株での調節されたまたは構成的なトランス遺伝子発現のレベルを増加させることも示された。ｃＬｙｓＭＡＲ配列を含めると、ＣＨＯ細胞株にトランスフェクトしたときに、トランス遺伝子の全体的な発現が増加した。
【００７６】
前述の通り、治療的タンパク質は翻訳後修飾を必要とするので、通常、哺乳動物発現系がその製造に好ましい。現在、種々の哺乳動物細胞発現系が、タンパク質の発現に利用可能である。しかしながら、哺乳動物細胞でこれらの発現ベクター／発現系から得られる組換えタンパク質の発現レベルは、商業的に実現可能なものでない。
【００７７】
ＥＮＢＲＥＬは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合タンパク質である。ＥｎｂｒｅｌのＦｃ成分は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域を含むが、ＣＨ１ドメインを含まない。ＥＮＢＲＥＬは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系で組換えＤＮＡ技術によって産生される。それは９３４アミノ酸からなり、約１５０キロダルトンの見かけの分子量を有する。
【００７８】
ＥＮＢＲＥＬは、関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および乾癬の兆候および症状を低下させることが示されている重大な科学的進歩である。
【００７９】
ＴＮＦは、正常な炎症応答や免疫応答に関与する天然のサイトカインである。ＴＮＦは、関節リウマチ（ＲＡ）、多関節型若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、および結果として生じる関節病変の炎症過程において重要な役割を果たす。ＴＮＦレベルの上昇は、ＲＡ患者の滑液で見られる。ＴＮＦ（ＴＮＦＲ）の２つの異なる受容体である５５キロダルトンタンパク質（ｐ５５）と７５キロダルトンタンパク質（ｐ７５）はもともと、細胞表面に、および可溶性形態で、単量体分子として存在している。
【００８０】
ＴＮＦの生物活性は、どちらかの細胞表面ＴＮＦ受容体への結合に依存する。ＥＮＢＲＥＬのようなタンパク質であれば、競合阻害によってＴＮＦの作用を阻害し、ひいては、ＴＮＦのその細胞受容体への結合を妨げることによってＴＮＦを生物学的に不活性にするであろう。
【００８１】
ＴＮＦＲの細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合すれば、血清滞留時間を増加させることによりタンパク質の最適な薬物動態をもたらす、分子の二量体化が可能になるであろう。融合タンパク質の両方のドメインはヒト起源であるので、このキメラタンパク質であれば、理想としては、免疫応答を誘導せず、そのため、ヒト使用に好適な分子となるであろう。
【００８２】
本発明は、Ｅｎｂｒｅｌをより大量に産生するために上述のＳ／ＭＡＲを用いる新規の発現ベクターに関する。培養培地から単離されたとき、このＤＮＡ配列の発現産物は、ＴＮＦＲ：Ｆｃの生物活性を示す。ベクターの開発、クローニング、およびサブクローニング、トランスフェクション、発酵、ならびに精製の戦略が開示されている。
【００８３】
方法
発現ベクターのクローニングおよび構築
ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにおいて、目的の遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサーによって調節される。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサーは、組換えタンパク質の効率的な、高レベル発現を可能にする。目的の遺伝子であるＴＮＦＲ：Ｆｃを、方向ＴＯＰＯ発現キットを用いて、ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。最初にコロニーＰＣＲで、その後、適当な制限酵素を用いて、陽性の形質転換体を確認した。予想されるパターンを与えるＢａｍＨＩとＸｈｏＩを用いて、この形質転換体を二重消化した。この形質転換体を、制限酵素のＡｐａＩとＳａｃＩＩを用いることによっても確認し、これにより、予想されたパターンがはっきりと示された。その後、このインサートの配列を確認した。
【００８４】
単離されたスキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）（ここでは、Ｓ／ＭＡＲ配列と示す）を、最初にＰＣＲでｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターにクローニングし、適当な制限酵素解析とシークエンシングにより確認した。その後、クローニングしたＳ／ＭＡＲを、制限部位を用いて、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター中のＣＭＶプロモーターの上流に挿入した。このインサートを制限解析により確認した。
【００８５】
組換えＴＮＦＲの発現
組換え発現ベクター（今回の場合は、ｐＣＤＮＡ３．１）を用いて、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させた。組換え発現ベクターは、目的のタンパク質をコードするＤＮＡがその発現を促進する特定の遺伝子エレメントに連結されている複製可能なＤＮＡ構築物である。このような転写単位の集合体は、通常、転写プロモーターまたはエンハンサー、適当な転写および翻訳の開始および終結部位、目的のタンパク質をコードするコード配列、ならびにトランスフェクトされた哺乳動物細胞株クローンとトランスフェクトされていない哺乳動物細胞株クローンの区別を助けることができる選択マーカーから構成される。
【００８６】
哺乳動物細胞での組換えタンパク質の発現が本発明の一部として特に好ましいが、それは、このようなタンパク質が、正しく折り畳まれ、それにより、完全に機能的な立体構造となることが知られているからである。組換え遺伝子発現に使用される細胞株はＣＨＯ−Ｋ１細胞株であり、これは、均一な細胞集団となるものである。組換えタンパク質をコードする安定に組み込まれた転写単位を含むＣＨＯ−Ｋ１のトランスフェクトされたコロニーは、単一培養物である、すなわち、この細胞は、１個の祖先形質転換体の子孫である。
【００８７】
形質転換された宿主細胞は、完全な転写単位を含む発現ベクターでトランスフェクトされる。発現したＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、培地上清中に分泌される。発現産物のレベルの増強は、抗生物質（ネオマイシン）耐性をコードする遺伝子などの選択マーカーを用いて細胞株を選択することにより達成される。
【００８８】
上記の説明を考慮すれば、本発明の多くのバリエーションが当業者の心に浮かぶであろう。そのような明白なバリエーションは、添付の特許請求の範囲の完全に意図された範囲内にある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
前記１つ以上の配列がＳ／ＭＡＲ配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、前記配列が発現系で使用されたときに、生体分子の発現を増加させる、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、前記発現系における前記配列の方向性に関係なく、前記生体分子の発現を増加させる、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記生体分子がタンパク質である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記生体分子が融合タンパク質である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記融合タンパク質が、組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質である、請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項８】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、１つ以上のヌクレオチド配列モチーフを含む、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記１つ以上のヌクレオチド配列モチーフが、少なくとも１つのＡＴリッチなヌクレオチドモチーフを含む、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
増加した発現効率を有する発現ベクターを構築する方法であって、請求項１に記載の単離された核酸を発現ベクターに挿入することを含む、方法。
【請求項１１】
前記発現ベクターが哺乳動物発現ベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、細菌プラスミド、バクテリオファージベクター、酵母エピソームベクター、人工染色体ベクター、またはウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ベクターが哺乳動物発現ベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１５】
組換え宿主細胞を産生する方法であって、請求項１に記載の単離された核酸または請求項１２に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入することを含む方法。
【請求項１６】
前記単離された核酸または前記発現ベクターがトランスフェクションによって導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離された核酸が、トランスフェクションによって、前記組換え宿主細胞のゲノムと一体化するようになる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法によって産生された宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１８または１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１８または１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
（ａ）１つ以上の発現制御エレメントに機能的に連結されたタンパク質をコードする配列と、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列とを含む核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２３】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記タンパク質が組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質である、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
（ａ）１つ以上の発現制御エレメントに機能的に連結された腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列と、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列とを含む核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記１つ以上の発現制御エレメントが、転写プロモーター、転写エンハンサー、転写リプレッサー、ポリアデニル化部位、複製部位の起点、翻訳開始シグナル、および翻訳終結シグナルのうちの少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が前記転写プロモーターの上流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が前記転写プロモーターの下流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が前記翻訳終結シグナルの下流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、前記転写プロモーターの上流かつ前記翻訳終結シグナルの下流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、前記転写プロモーターの下流かつ前記翻訳終結シグナルの下流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列から０〜１０ＫＢ離れたところにある、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が複製部位の起点から０〜１０ＫＢ離れたところにある、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
前記発現ベクターが腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質の組換え発現に使用される、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
タンパク質を産生するための方法であって、（ａ）哺乳動物細胞を（Ｉ）タンパク質をコードする配列と（ＩＩ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列とを含む発現ベクターでトランスフェクトする工程と、（ｂ）トランスフェクトされた哺乳動物細胞をタンパク質の発現に好適な条件下で培養する工程と、（ｃ）発現したタンパク質を単離する工程とを含む方法。
【請求項４２】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法であって、（ａ）哺乳動物細胞を（Ｉ）腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列と（ＩＩ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列とを含む発現ベクターでトランスフェクトする工程と、（ｂ）トランスフェクトされた哺乳動物細胞を前記融合タンパク質の発現に好適な条件下で培養する工程と、（ｃ）発現した融合タンパク質を単離する工程とを含む方法。
【請求項４５】
前記単離された融合タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法によって産生される腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項４７】
腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法であって、（ａ）哺乳動物細胞を、腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターでトランスフェクトする工程と、（ｂ）前記哺乳動物細胞を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列を含むプラスミドとコトランスフェクトする工程と、（ｃ）トランスフェクトされた哺乳動物細胞を前記融合タンパク質の発現に好適な条件下で培養する工程と、（ｄ）発現した融合タンパク質を単離する工程とを含む方法。
【請求項４８】
前記単離された融合タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法によって産生された腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項５０】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む、１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列の活性に影響を与える因子。
【請求項５１】
前記因子が遺伝的因子、またはエピジェネティック因子のうちの少なくとも１つである、請求項４８に記載の因子。
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
前記１つ以上の配列がＳ／ＭＡＲ配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、前記配列が発現系で使用されたときに、生体分子の発現を増加させる、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、前記発現系における前記配列の方向性に関係なく、前記生体分子の発現を増加させる、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記生体分子がタンパク質である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記生体分子が融合タンパク質である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記融合タンパク質が、組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質である、請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項８】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、１つ以上のヌクレオチド配列モチーフを含む、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記１つ以上のヌクレオチド配列モチーフが、少なくとも１つのＡＴリッチなヌクレオチドモチーフを含む、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
増加した発現効率を有する発現ベクターを構築する方法であって、請求項１に記載の単離された核酸を発現ベクターに挿入することを含む、方法。
【請求項１１】
前記発現ベクターが哺乳動物発現ベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、細菌プラスミド、バクテリオファージベクター、酵母エピソームベクター、人工染色体ベクター、またはウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ベクターが哺乳動物発現ベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１５】
組換え宿主細胞を産生する方法であって、請求項１に記載の単離された核酸または請求項１２に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入することを含む方法。
【請求項１６】
前記単離された核酸または前記発現ベクターがトランスフェクションによって導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離された核酸が、トランスフェクションによって、前記組換え宿主細胞のゲノムと一体化するようになる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法によって産生された宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１８または１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１８または１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
（ａ）１つ以上の発現制御エレメントに機能的に連結されたタンパク質をコードする配列と、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列とを含む核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２３】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記タンパク質が組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質である、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
（ａ）１つ以上の発現制御エレメントに機能的に連結された腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列と、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列とを含む核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記１つ以上の発現制御エレメントが、転写プロモーター、転写エンハンサー、転写リプレッサー、ポリアデニル化部位、複製部位の起点、翻訳開始シグナル、および翻訳終結シグナルのうちの少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が前記転写プロモーターの上流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が前記転写プロモーターの下流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が前記翻訳終結シグナルの下流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、前記転写プロモーターの上流かつ前記翻訳終結シグナルの下流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、前記転写プロモーターの下流かつ前記翻訳終結シグナルの下流にある、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列から０〜１０ＫＢ離れたところにある、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が複製部位の起点から０〜１０ＫＢ離れたところにある、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
前記発現ベクターが腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質の組換え発現に使用される、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
タンパク質を産生するための方法であって、（ａ）哺乳動物細胞を（Ｉ）タンパク質をコードする配列と（ＩＩ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列とを含む発現ベクターでトランスフェクトする工程と、（ｂ）トランスフェクトされた哺乳動物細胞をタンパク質の発現に好適な条件下で培養する工程と、（ｃ）発現したタンパク質を単離する工程とを含む方法。
【請求項４２】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が組換え可溶性腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法であって、（ａ）哺乳動物細胞を（Ｉ）腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列と（ＩＩ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列とを含む発現ベクターでトランスフェクトする工程と、（ｂ）トランスフェクトされた哺乳動物細胞を前記融合タンパク質の発現に好適な条件下で培養する工程と、（ｃ）発現した融合タンパク質を単離する工程とを含む方法。
【請求項４５】
前記単離された融合タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法によって産生される腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項４７】
腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法であって、（ａ）哺乳動物細胞を、腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターでトランスフェクトする工程と、（ｂ）前記哺乳動物細胞を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列を含むプラスミドとコトランスフェクトする工程と、（ｃ）トランスフェクトされた哺乳動物細胞を前記融合タンパク質の発現に好適な条件下で培養する工程と、（ｄ）発現した融合タンパク質を単離する工程とを含む方法。
【請求項４８】
前記単離された融合タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法によって産生された腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦＲ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項５０】
前記１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、それらの相補体、変異体、および機能断片、ならびにそれらと少なくとも７０％相同な配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む、１つ以上のＳ／ＭＡＲ配列の活性に影響を与える因子。
【請求項５１】
前記因子が遺伝的因子、またはエピジェネティック因子のうちの少なくとも１つである、請求項４８に記載の因子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５０６６９４（Ｐ２０１２−５０６６９４Ａ）
【公表日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２２５６２（Ｐ２０１１−５２２５６２）
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００６５１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１８４４４
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５１１０１３５００）アヴェストハゲン リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００６５１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１８４４４
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５１１０１３５００）アヴェストハゲン リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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