白血病阻害因子に由来するレトロ−インベルソなペプチド
【課題】天然ＬＩＦ（白血病阻害因子）と同じ活性を有し、神経栄養活性を有するペプチドを提供する。
【解決手段】１８〜約４０アミノ酸を有する白血病阻害因子（ＬＩＦ）由来のレトロ−インベルソなペプチドであって、特定のアミノ配列を含み、前記ペプチドにおけるＤ−アミノ酸結合のため、in vivoにおいてタンパク質分解にたいして感受性が低く、安定である前記レトロ−インベルソなペプチド。前記レトロ−インベルソなペプチド、及び医薬上容認される担体を含んでなる組成物。前記組成物を哺乳動物に投与する過程を含んでなる、神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための方法。
【解決手段】１８〜約４０アミノ酸を有する白血病阻害因子（ＬＩＦ）由来のレトロ−インベルソなペプチドであって、特定のアミノ配列を含み、前記ペプチドにおけるＤ−アミノ酸結合のため、in vivoにおいてタンパク質分解にたいして感受性が低く、安定である前記レトロ−インベルソなペプチド。前記レトロ−インベルソなペプチド、及び医薬上容認される担体を含んでなる組成物。前記組成物を哺乳動物に投与する過程を含んでなる、神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）に由来するレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）なペプチドに関する。当該ペプチドは、天然の親タンパク質と類似した活性、及びまた神経栄養活性を有する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、自然免疫及び特異的免疫の効果器相の間に生産され、そして免疫及び炎症応答を仲介及び制御するために働くタンパク質である。サイトカインは、その他のポリペプチドホルモンと同様に、標的細胞の表面上の特異的受容体との結合により、その作用を開始する。最も良く知られているサイトカインファミリーの１つは自然免疫を仲介するインターロイキンである。インターロイキンの構造及び機能の詳細に関して、Abbas et al. Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, pp. 225-243, 1991を参照されたい。
【０００３】
分化誘導することにより骨髄性白血病細胞株の増殖を阻害する活性にちなんで命名された白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、ＩＬ−６、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及びカルジオトロフィン−１を含むリガンドファミリーの一員である（Gearing, Adv. Immunol. 53 : 31-58, 1993; Pennica et al., J. Biol. Chem. 270 : 10915-10922, 1995; Patterson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 : 7833-7835, 1994）。これらのサイトカインは、非常に限られた配列相同性しか有さないが、種々の組織に対して非常に類似した効果を発揮する。例えば、ＬＩＦを含むいくつかの前記タンパク質は、肝臓において同一セットの急性相応答タンパク質を誘導し、培養した胚幹細胞の自律再生を支援し、脂質生合成を阻害し、そして培養した運動神経細胞の生存を促進することができる。ＬＩＦは、種々の細胞群、例えばマクロファージ、滑膜細胞及び軟骨細胞により生産される。インビボで末梢神経に適用した場合、ＬＩＦは、逆方向性に輸送され、そして損傷した感覚神経細胞を助ける（Hendry et al., J. Neurosci. 12 : 3427-3434, 1992; Cheema et al., J. Neurosci. Res. 37 : 213-218, 1994)。ＬＩＦはまた骨芽細胞及び内皮細胞の増殖及び分化を制御する。排卵期あたりで小胞内液のＬＩＦレベルが増加することは、ＬＩＦが、排卵、初期胚発生及び着床において役割を果しうることを示す（Senturk et al., Am. J. Reprod. Immunol. 39 : 144-151, 1998; Stewart, Annals N.Y. Acad. Sci. 157-165)。
【０００４】
ニューロトロフィン及び神経栄養因子は、神経細胞群の生存、標的への神経接続及び／又は機能に影響することができるタンパク質又はペプチドである（Barde, Neuron, 2 : 1525-1534, 1989）。インビボ及びインビトロの両方でのニューロトロフィンの効果は十分に報告されている。例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、インビトロでニワトリ胚の毛様体神経節の生存を促進し、そして培養した交感神経細胞、感覚神経細胞及び脊髄運動神経細胞の生存を支援する（Ip et al., J. Physiol. Paris, 85 : 123-130, 1991）。
【０００５】
ペプチドのインビトロでの治療的使用に対する主な障害は、それらがタンパク質分解を受けやすいことである。レトロ−インベルソなペプチドとは、その配列方向が反対であり（レトロ）、かつ各アミノ酸のキラリティー、Ｄ又はＬが逆である（インベルソ）線状ペプチドの異性体のことである。いくつかのペプチド結合だけが反対方向であり、かつその反対方向部分のアミノ酸残基のキラリティーが逆であるという、部分的に改変された線状ペプチドの異性体もまた存在する。この様なペプチドの主な利点は、タンパク質分解に対する耐性の増加により、インビボでの活性が強化されることである（論説として、Chorev et al., Trends Biotech., 13 : 438-445, 1995）。この様なレトロ−インベルソなアナログは、代謝安定性の増加を示すが、その生物活性はしばしば大きく低下する（Guichard et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 91 : 9765-9769, 1994)。
【０００６】
例えば、Richmanら（J. Peptide Protein Res., 25 : 648-662）は、Ｇｌｙ3 −Ｐｈｅ4 のアミド結合が改変された線状及び環状ロイ−エンケファリンアナログは、天然ロイ−エンケファリンの６〜１４％の活性を有することを決定した。Chorevら（前出）は、ビトロネクチンとその受容体との結合を阻害するペプチドのレトロ−インベルソ化により、親異性体よりも５００００倍低い活性を示す１つのペプチド、及び親の環状ペプチドよりも４０００倍高い活性を有するもう１つのペプチドが得られたことを示した。Guichardら（TIBTECH 14, 1996）は、レトロ−インベルソ（全てＤ−レトロ）体の抗原擬態は、ランダムコイル、ループ又は環状構造のペプチドにおいてのみ起こりうることを述べている。「らせん形の」ペプチドの場合、抗原擬態を評価するために用いた溶媒条件下で、そのらせん性が事実上無くなる場合にのみ、適切で機能的な擬態が期待されるであろう。
【発明の概要】
【０００７】
ＬＩＦ由来であり、かつ神経栄養活性を有するペプチドであって、代謝安定性が増加しているが、生物学的な活性が保持されている前記ペプチドが求められている。本発明は、この要求を解決する。
【０００８】
本発明の１つの態様は、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、そして配列番号１に示す配列を含んでいる、単離されたレトロ−インベルソなペプチドである。一つの好ましい態様では、当該配列内の少なくとも１つの塩基性荷電アミノ酸を、異なる塩基性荷電アミノ酸により置換する。別の好ましい態様では、前記配列内の少なくとも１つの酸性荷電アミノ酸を、異なる酸性荷電アミノ酸により置換する。有利には、前記配列内の少なくとも１つの非極性アミノ酸を、異なる非極性アミノ酸により置換する。好ましくは、当該配列内の少なくとも１つの非荷電アミノ酸を異なる非荷電アミノ酸により置換する。別の好ましい態様では、前記配列内の少なくとも１つの芳香族アミノ酸を、異なる芳香族アミノ酸により置換する。有利には、当該ペプチドを、そのアミノ末端、カルボキシ末端、又はそれらの両末端で、ＣＨ3 ＣＯ，ＣＨ3 （ＣＨ2 ）n ＣＯ，Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ＣＯ及びＨ2 Ｎ（ＣＨ2 ）n ＣＯ、ただしｎ＝１〜１０、から成る群から独立に選択される部分により修飾する。好ましくは、当該ペプチドをグリコシル化する。別の好ましい態様では、当該ペプチドの１又は複数のアミド結合を還元する。好ましくは、前記ペプチドの１又は複数の窒素をメチル化する。更に別の好ましい態様では、当該ペプチドの１又は複数のカルボン酸基をエステル化する。好ましくは、当該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明の別の態様は、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、そして配列番号１の配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチド、及び医薬上容認される担体を含んでなる組成物である。
本発明はまた、その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための方法を提供する。この方法は、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるペプチドを含んでなる組成物を、有効量、すなわち神経突起の成長又はミエリン形成を促進する量で、その哺乳動物に投与する過程を含んでなる。好ましくは、当該ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する。有利には、当該哺乳動物は人間である。１つの好ましい態様では、当該投与過程は、直接的な局所注射、全身性、頭蓋内、脳脊髄内、局所的又は経口投与である。
【００１０】
本発明の別の態様は、その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進する際に用いるための、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチドである。好ましくは、当該ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する。有利には、当該哺乳動物は人間である。
本発明はまた、その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための薬剤を調製するための、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチドの使用を提供する。配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項２１のペプチドが有益である。好ましくは、当該哺乳動物は人間である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）に由来するレトロ−インベルソ（ＲＩ）なペプチドであって、天然のＬＩＦに類似する効果、例えば骨芽細胞及び内皮細胞の増殖及び分化の制御、を仲介する前記ペプチドを提供する。前記の用語「由来する」とは、当該ペプチドが、インターロイキン６の活性領域又は下記に定義する通りのそのアナログを含んでいることを意味する。これらのＲＩなＬＩＦ由来ペプチドは、肝臓による急性相応答タンパク質の生産を誘導し、培養した胚幹細胞の自己再生を支援し、脂質生合成を阻害し、培養した運動神経細胞の生存を促進し、そして骨芽細胞及び内皮細胞の増殖及び分化を制御する。ある特定のＬＩＦ由来レトロ−インベルソなペプチドにおける、その親ペプチドに類似する効果を仲介する能力は、標準的なＬＩＦ検査、例えば実施例１０に記載した検査により、当業者により決定することができる。
【００１２】
これらのＲＩなＬＩＦ由来ペプチドはまた、末梢及び中枢の神経系に対する毒による、損傷による、虚血による、変性による傷害、及び遺伝性の傷害の後の機能回復を促進することにおいて治療的に適用される。これらのペプチドはまた、ミエリン形成の増加を促進するために、及び脱髄性疾患の効果を打ち消すために有用である。任意のこの様なペプチドにおける、神経突起の成長及びミエリン形成を刺激する能力、及び神経細胞死を抑制する能力は、実施例１〜９に記載の方法により、当業者により容易に決定することができる。これらのペプチドの使用は、それらが、天然又は組換えのサイトカインのいずれよりも安定であり、かつ合成しやすいので、種々の疾患の治療を促進するであろう。
【００１３】
本発明のある特定のＲＩなＬＩＦ由来ペプチド、及びその由来となる親タンパク質を表１に示す。その対応する天然の（レトロ−インベルソでない）ペプチドは米国特許５，７００，９０９に開示されている。
【００１４】
【表１】
【００１５】
前記の通り、これらのＲＩなＬＩＦ由来ペプチドは、対応する完全長のＬＩＦと同じ活性を有し、かつまた神経栄養的及びミエリン栄養的な活性を有する。本発明の一つの態様は、分化した、又は未分化の神経細胞の神経突起の成長を促進する方法であり、この方法は、１２〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示すＲＩなＬＩＦ由来ペプチドを含んでいるＲＩなペプチド、又は同様の活性を有するそのアナログを、有効量、すなわち神経突起の成長を促進する量で、その細胞に投与することによる。前記のアナログには、例えば、当該ペプチド内で、１又は複数のリシン及び／又はアルギニン残基を、アラニン又は別のアミノ酸で置換したもの；１又は複数のリシン及び／又はアルギニン残基を欠失したもの；１又は複数のチロシン及び／又はフェニルアラニン残基を置換したもの、１又は複数のフェニルアラニン残基を欠失したもの、及び、１又は複数のアミノ酸を保存的置換したものが含まれる。リシン／アルギニン及びチロシン／フェニルアラニン残基の置換又は欠失は、各々、トリプシン及びキモトリプシンによるペプチド分解の感受性を低下させるだろう。
【００１６】
本発明に用いられうるこれらのペプチド配列の更なる変種には、微少な挿入や欠失も考えられる。保存的アミノ酸置換が考えられる。この様な置換は、例えば、側鎖の化学的性質において関連のあるアミノ酸群の中で行なわれる置換である。アミノ酸群には、塩基性荷電アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性荷電アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）；非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）；及び、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）が含まれる。特には、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、又はセリンによるスレオニンの単独置換からなる保存的アミノ酸置換、あるいは構造的に関連するアミノ酸によるあるアミノ酸の同様な保存的置換は、当該ペプチドの特性に重大な影響を与えないであろうことが一般的に容認されている。配列番号１の配列、あるいは挿入、欠失又は置換を有するその配列を含んでなる任意のＲＩなペプチドにおける、神経突起の成長、ミエリン形成を促進し、脱髄を抑制回復し、そして神経細胞死を抑制する能力を、下記実施例に示す検査により決定することができる。
【００１７】
種々の標準的な化学修飾は、当該ペプチドの安定性、生物活性、及び脳血液関門を通過する能力を改善するであろう。その様な修飾の一つは、アミド結合を作るための、脂肪族又は芳香族の酸の誘導体による脂肪族アミノ末端修飾である。前記誘導体には、例えば、ＣＨ3 ＣＯ，ＣＨ3 （ＣＨ2 ）n ＣＯ（ｎ＝１〜１０），Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ＣＯ，Ｈ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n ＣＯ（ｎ＝１〜１０）が含まれる。別の修飾は、アミド／エステル結合を介して当該ペプチドに連結される脂肪族又は芳香族のアミン／アルコールの誘導体によるカルボキシ末端の修飾である。この様な誘導体には前記に列挙したものが含まれる。当該ペプチドはまた、アミノ末端及びカルボキシ末端の両修飾を有してもよく、その場合、当該誘導体は、前記に列挙したものの中から独立に選択される。当該ペプチドはグリコシル化されてもよく、ここでは、アルファアミノ基又はＤ−Ａｓｎのいずれか、あるいは両方がグルコース又はガラクトースにより修飾される。別の考えられる修飾では、選択した骨格のアミド結合を還元する（−ＮＨ−ＣＨ2 ）。その他の修飾には、アミド結合内の選択された窒素のＮ−メチル化、及び当該ペプチド内の酸の基の少なくとも一つを芳香族又は脂肪族エステルとして修飾するというエステル化が含まれる。前記修飾の任意の組み合せもまた考えられる。
【００１８】
細胞増殖培地中におけるＬＩＦ活性又は神経栄養活性のために必要な、本発明のＲＩなペプチドの典型的な最小量は、通常、少なくとも約５ng／mlである。インビトロでの使用のためには、この量又はそれ以上の量の本発明のＲＩなペプチドが考えられる。典型的には、０．１ｇ／ml〜約１０ｇ／mlの濃度の当該ペプチドが用いられるだろう。ある特定の組織における有効量を、実施例１に従って決定することができる。
【００１９】
本発明のＲＩなペプチドを直接細胞に投与することにより、細胞を、インビトロ又はエキソビボで処理することができる。これを、例えば、その特定の細胞タイプに適する増殖培地中で細胞を培養し、次に当該ペプチドをその培地に添加することにより行うことができる。処置する細胞がインビボであり、典型的には脊椎動物、好ましくは哺乳動物内である場合、当該組成物を、いくつかの方法により投与することができる。最も好ましくは、当該組成物を、希望する局所ペプチド濃度を得るために十分な量で血液中に直接注射する。これらのＲＩなペプチドは、そのＤペプチド結合のために、インビボでより長く存在する。リシン及びアルギニン残査を欠失したペプチドでは、そのタンパク質分解が低下する。より小さなペプチド（すなわち５０アミノ酸以下）は、中枢神経系疾患の治療のために、最も良く脳血液関門を通過し、そして中枢神経系に進入するであろう（Banks et al., Peptides, 13 : 1289-1294, 1992）。
【００２０】
神経疾患の治療のために、ニューロトロフィンの希望する局所濃度を得るために十分な量で、頭蓋内への、又は脳脊髄液への直接的な注射を行ってもよい。両方の場合で、医薬上容認される注射可能な担体が用いられる。この様な担体には、例えば、リン酸緩衝食塩水及びリンガー溶液が含まれる。あるいは、当該組成物を、直接的な局所注射により、又は全身性の投与により、末梢神経組織に投与することができる。種々の伝統的な投与方法、例えば静脈内、肺内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬膜上、硬膜下腔内、局所的、及び経口投与、が考えられる。
【００２１】
本発明のペプチド組成物を製剤化して、注射用組成物又は局所製剤などの単位投与剤として、患者に一日に投与される用量に相当する投与量で、あるいは調節的に放出される組成物として投与することができる。ＰＢＳ溶液又は凍結乾燥品のいずれかの形で、当該活性成分の一日の投与量を含んでいる無菌的に密封されたバイアルは、単位投与剤の一つの例である。好ましい態様では、ＬＩＦにより誘導される行程の促進、神経変性疾患又は脱髄疾患の治療のために必要な、脊椎動物の体重に基づく、本発明のＲＩなペプチドの一日の全身投与量は、約０．０１〜約１００００ｇ／kgの範囲である。より好ましくは、一日全身投与量は約０．１〜１０００ｇ／kgである。最も好ましくは、一日全身投与量は約１０〜１００ｇ／kgである。局所投与剤の一日投与量はほぼ一ケタ少ないであろう。胃腸系におけるタンパク質分解に対する当該ペプチドの耐性のために、経口投与は特に好ましい。
【００２２】
本発明の一つの好ましい態様では、当該ペプチドを、移植により、インビボで神経細胞に局所的に投与する。例えば、ポリ乳酸、ポリガラクチック（polygalactic）酸、再生コラーゲン、多薄層性リポソーム及びその他の多くの慣習的な滞留性製剤は、生物学的に活性な神経栄養ペプチド組成物と共に調合することのできる生物侵食性又は生物分解性物質を含んでなる。これらの物質は、移植されると、徐々に分解され、そして活性物質が周囲の組織に放出される。本発明では、生物侵食性、生物分解性及びその他の滞留性製剤が明かに考えられる。注入ポンプ、マトリックス捕捉系、及び経皮的供給装置との組み合せもまた考えられる。当該ペプチドを、移植の前に、米国特許５，５２９，９１４に記載の通りに、ポリエチレングリコールによる構造皮膜内に封入することもできる。
【００２３】
本発明のＲＩなＬＩＦ由来ペプチドをミセル又はリポソーム内に密閉することもできる。リポソーム封入技術は周知である。リポソームを、特定の組織に、例えば神経組織に、その標的組織に結合できる受容体、リガンド又は抗体の使用を介して、標的指向的に供給することができる。これらの組成物の調製は当分野に周知である（Radin et al., Meth. Enzymol., 98 : 613-618, 1983）。
【００２４】
現在、神経系の完全な機能再生及び構造回復を促進することができる利用可能な医薬は存在しない。これは、中枢神経系において特に当てはまる。当該神経栄養因子の使用を介した末梢神経の再生は、本発明の範囲に含まれる。更に、脳内の神経群又は特定の領域の変性に関係する神経変性疾患の治療において、神経栄養因子を治療的に用いることができる。パーキンソン病の主原因は、黒質のドーパミン性神経細胞の変性である。抗プロサポシン（ｐｒｏｓａｐｏｓｉｎ）抗体は、人間の脳切片において黒質のドーパミン性神経細胞を免疫組織化学的に染色することができるので、パーキンソン病の治療において、本発明のＲＩなペプチドは治療上有用であろう。高齢者において視覚喪失を招く眼の神経変性疾患である網膜神経障害もまた、本発明のＲＩなペプチドにより治療されうる。
【００２５】
長い間、神経栄養因子は、脳血液関門を通過しないので、脳内の神経細胞群に到達するために、それを大脳内に投与するべきであろうと信じられていた。米国特許５，５７１，７８７は、サポシン（ｓａｐｏｓｉｎ）Ｃに由来する神経栄養性の１８量体断片のヨード化物が脳血液関門を通過することを開示している。従って、約２２個以下のアミノ酸を有するＲＩなペプチドもまたこの関門を通過するであろう。従ってそれを静脈内に投与することができる。その他の神経細胞群、例えば運動神経細胞を、静脈内注射によっても処置することができる。ただし、代りの経路として、脳脊髄液への直接的な注射も考えられる。
【００２６】
インビボ、エキソビボ又はインビトロで、前記の方法で、ミエリン形成を促進するために、又は脱髄を抑制するために細胞を処置することができる。神経線維の脱髄に至る疾患、例えば、ＭＳ、急性流行性白質脳炎、脳及び／又は脊髄への外傷、進行性多病巣性白質脳炎、異染性白質萎縮症、副腎性白質萎縮症、及び未成熟乳児における白質発達障害（脳室周囲の白質軟化症）を、当該疾患にかかった細胞に、本発明の神経栄養性ペプチドを投与することにより、遅延又は停止することができる。
【００２７】
本発明のＲＩなＬＩＦ由来ペプチドの組成物を、また、培養した胚幹細胞の自己再生を支援するために、培養した運動神経細胞の生存を促進するために、そして神経栄養因子及びミエリン促進性物質の効果を決定するために用いることもできる。しかし、より実際的には、それらは、インビトロで増殖を促進するために、そして神経細胞及び幹細胞を維持するために、研究試薬及び細胞増殖用培地の成分として即座に有用である。
本発明のペプチドを、当分野に周知の自動固相方法により合成する。全てのペプチドを、使用する前に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、約９５％超の程度にまで精製する。
【実施例】
【００２８】
下記実施例を、限定のためでなく、単に説明のために示す。
【００２９】
実施例１：神経突起の成長の刺激
ＮＳ２０Ｙ神経芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ中で培養する。トリプシンにより細胞を取り出し、そして３０mmペトリ皿内のカバーガラス上にまく。２０〜２４時間後、その培地を、０．５％ＦＣＳと、０，０．５，１，２，４又は８ng／mlの、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドとを含有する２mlのＤＭＥＭにより置換する。細胞を更に２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄し、そしてＢｏｕｉｎ溶液（飽和水性ピクリン酸／ホルマリン／酢酸１５：５：１）により３０分間固定した。固定液をＰＢＳにより取り除き、そして位相差顕微鏡下で神経突起の成長を評価した。細胞の直径に等しいか、又はそれより長い明確に特定される神経突起を１又は複数個有する細胞を陽性と評価した。神経突起を有する細胞の割合を決定するために、各皿の異なる部分で、少なくとも２００個の細胞を評価した。検査を２回ずつ行った。
【００３０】
実施例２：細胞死の抑制
ＮＳ２０Ｙ細胞を、実施例１の記載通りにまき、そして８ng／mlの、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドの存在下又は非存在下で、０．５％ウシ胎児血清中で２日間、カバーグラス上で培養する。培地を取り除き、そして各ウエルに、０．２％トリパンブルー／ＰＢＳを加える。倒立顕微鏡上で、各ウエル上の４つの領域において４００個の細胞を計数することにより、青色に染色されている死亡した細胞を、総数に対する割合として評価する。２回測定の平均誤差は５％であった。
【００３１】
実施例３：エキソビボでの神経突起の成長の促進
成熟ラットから後根神経節を取り出し、そしてKuffler et al. J. Neurobiol. 25 : 1267-1282, 1994 の記載通りに、感覚神経細胞を調製した。神経細胞を、０．５ng／mlの、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドにより処理する。処理の３日後に、ミクロメーター格子上で、最長の神経突起の長さを測定する。ＲＩなペプチドにより処理した神経細胞における最長の神経突起は、コントロール（非ＲＩ）ペプチドにより処理した細胞又は未処理のコントロール細胞に比べて約３倍長い。処理の４８時間後には、多数の枝分れが認められるという点で、全ての細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）に対するのと同様に応答する。これらの結果は、当該ＬＩＦ由来ペプチドが感覚神経細胞の分化を促進することを意味する。
【００３２】
実施例５：ラットモデルにおける脱髄の回復
実験上のアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、人間の多発性硬化症（ＭＳ）のラットモデルである。ラットでは、外来タンパク質（モルモット脊髄）の注射によりＥＡＥが誘発され、その結果、１１日後に、白質の炎症と脱髄が生じる。この脱髄症は、活発に脱髄が起きる人間のＭＳ損傷に見られるものに似ている（Liu et al., Multiple Sclerosis 1 : 2-9, 1995）。
Ｌｅｗｉｓ系ラットにおいて、モルモットの脊髄及び完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の乳濁液を注射することにより、ＥＡＥを誘導する。１４日目に、衰弱が明白になってから、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドによる処置を開始し（筋肉内に２００ｇ／kg）、そして８日間毎日この処置を続ける。６匹のラットには担体のみを注射する。筋肉の衰弱の測定として、歩幅の長さを１４日目及び２２日目に評価する。更に、２２日目に、脊髄において１mm2 あたりの脱髄損傷（斑）の数と大きさを評価する。最後に、２２日目に、ミエリン分解のマーカーとして、脳内のコレステロールエステルの量を評価する。
【００３３】
１４日目に、両群の歩幅の長さは減少するが、８日間の処置後には、ＬＩＦ由来ペプチドにより処置した動物は正常に回復し、一方担体により処置した動物は回復しない。ペプチド処置群の脳において、コレステロールエステル含量の有意な低下が認められる。更に、ＬＩＦ由来ペプチドによる１０日間の処置後には、脊髄の損傷数は有意に低下する。最後に、損傷の平均サイズは有意に低下する。コントロール動物と実験動物との間で、体重の喪失の差はない。これらの結果は、ＬＩＦ由来ペプチドによる全身的処置の後における、臨床上、生化学上、及び形態学上有意なＥＡＥの回復を示す。この作用は、ミエリン修復に対して直接的に作用しない現在のＭＳ薬剤の抗炎症性効果とは異なる。
【００３４】
実施例６：エキソビボでのミエリン形成の検査
新生マウスの小脳の外植試料を、Satomi, Zool. Sci. 9 : 127-137, 1992に従って調製する。その培養において２２日間、神経突起の成長及びミエリン形成を観察する。その間には、その新生マウスの小脳は正常に神経細胞分化及びミエリン形成を開始する。１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドを、その外植試料を調製した後２日目に加え（３つのコントロール及び３つの処置外植試料）、そしてビデオカメラ付きの明視野顕微鏡下で、神経突起の成長及びミエリン形成を評価する。約１〜１０ｇ／mlの濃度のサポシンＣを、ポジティブコントロールとして用いる。ＬＩＦ由来ペプチドにより、サポシンＣの場合と同程度にミエリン形成が刺激される。
あるいは、下記の通りに、ミエリンに限局するスルホ脂質への35Ｓの取り込みにより、ミエリン形成を検査してもよい。
【００３５】
実施例７：スルホ脂質への35Ｓの取り込み
ミエリンを形成するシュワン細胞の初代培養細胞を、０．５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する低硫酸培地（ＤＭＥＭ）中でインキュベーションし、次に、35Ｓメチオニン、及び１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドを４８時間添加する。サポシンＣをポジティブコントロールとして用いる。細胞をＰＢＳによりリンスし、採取し、そして１００ｌの蒸留水中で超音波処理する。タンパク質分析のため、一定量の細胞溶解液を取り出し、そして残りを、５mlのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）により抽出する。Hiraiwa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 : 4778-4781の記載通りに、脂質抽出物をクロマトグラフィーにかけ、そして抗スルファチドモノクローナル抗体により免疫染色する。ペプチド及びサポシンＣの処置後に、同様な量のスルファチドが認められる。
【００３６】
実施例８：外傷性虚血性ＣＮＳ損傷の治療におけるＲＩなペプチドの使用
脳又は脊髄に外傷性損傷を有する人間に対して、約１００ｇ／kgの、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドを、無菌塩水溶液の形で全身性の注射により、又は滞留形で与える。感覚神経又は運動神経の機能の増加（すなわち四肢の運動性の向上）により、改善の程度を評価する。更なる改善が認められなくなるまで、治療を続ける。
【００３７】
実施例９：脱髄疾患の治療におけるＲＩなペプチドの使用
初期段階のＭＳであると診断された患者に、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドを、実施例８の記載と同一の投与量を用いて、全身性の注射により与える。投与を毎日又は毎週繰り返し、そして筋肉の強さ、筋骨格の協調及びミエリン形成（ＭＲＩにより決定する）の向上を観察する。慢性的に再発するＭＳを有する患者を、次の再発が起きる時に、同様な方法で治療する。
【００３８】
実施例１０：ＬＩＦによる細胞増殖検査
１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドにおけるＬＩＦ活性を、培養したＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ）とのインキュベーションにより、そしてＴＦ−１細胞の増殖の測定により検査する。ＴＦ−１細胞はヒトのＴ細胞であり、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）の存在下でのその増殖がＬＩＦに応答して阻害される。供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）の２〜３日後にＴＦ−１細胞を洗浄し、そして５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中に１×１０6 細胞／mlの最終濃度に再懸濁する。ＬＩＦによる基準の滴定を容量１００ｌ中で３回ずつ行う。その基準の滴定を１ng／mlから開始し、そして０．１pg／mlまで連続的に２倍ずつ希釈する。ＲＩなＬＩＦ由来ペプチドの適当な希釈を、容量１００ｌ中で３回ずつ行う。培地単独を、ネガティブコントロールとして用いる。
【００３９】
細胞懸濁液（１００ｌ）を各ウエルに加え、そしてそのプレートを、保湿したＣＯ2 インキュベーター内で３７℃で約４４時間インキュベーションする。トリチウム化したチミジン（０．５Ｃｉ）を各ウエルに加え、そしてそのプレートを約４時間インキュベーションする。各ウエルの内容物をフィルターマット上に採取し、そして液体シンチレーション計数により放射性標識の量を決定する。吸光度対基準濃度の標準曲線をプロットする。その標準曲線との比較により、ＲＩなＬＩＦ由来ペプチドのＬＩＦ活性を推定する。
【００４０】
本発明は、詳細な説明に記載した前記実施態様に限定されるものではない。本発明の意図を保持するいずれの態様も、本発明の範囲に含まれる。しかし、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）に由来するレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）なペプチドに関する。当該ペプチドは、天然の親タンパク質と類似した活性、及びまた神経栄養活性を有する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、自然免疫及び特異的免疫の効果器相の間に生産され、そして免疫及び炎症応答を仲介及び制御するために働くタンパク質である。サイトカインは、その他のポリペプチドホルモンと同様に、標的細胞の表面上の特異的受容体との結合により、その作用を開始する。最も良く知られているサイトカインファミリーの１つは自然免疫を仲介するインターロイキンである。インターロイキンの構造及び機能の詳細に関して、Abbas et al. Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, pp. 225-243, 1991を参照されたい。
【０００３】
分化誘導することにより骨髄性白血病細胞株の増殖を阻害する活性にちなんで命名された白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、ＩＬ−６、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及びカルジオトロフィン−１を含むリガンドファミリーの一員である（Gearing, Adv. Immunol. 53 : 31-58, 1993; Pennica et al., J. Biol. Chem. 270 : 10915-10922, 1995; Patterson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 : 7833-7835, 1994）。これらのサイトカインは、非常に限られた配列相同性しか有さないが、種々の組織に対して非常に類似した効果を発揮する。例えば、ＬＩＦを含むいくつかの前記タンパク質は、肝臓において同一セットの急性相応答タンパク質を誘導し、培養した胚幹細胞の自律再生を支援し、脂質生合成を阻害し、そして培養した運動神経細胞の生存を促進することができる。ＬＩＦは、種々の細胞群、例えばマクロファージ、滑膜細胞及び軟骨細胞により生産される。インビボで末梢神経に適用した場合、ＬＩＦは、逆方向性に輸送され、そして損傷した感覚神経細胞を助ける（Hendry et al., J. Neurosci. 12 : 3427-3434, 1992; Cheema et al., J. Neurosci. Res. 37 : 213-218, 1994)。ＬＩＦはまた骨芽細胞及び内皮細胞の増殖及び分化を制御する。排卵期あたりで小胞内液のＬＩＦレベルが増加することは、ＬＩＦが、排卵、初期胚発生及び着床において役割を果しうることを示す（Senturk et al., Am. J. Reprod. Immunol. 39 : 144-151, 1998; Stewart, Annals N.Y. Acad. Sci. 157-165)。
【０００４】
ニューロトロフィン及び神経栄養因子は、神経細胞群の生存、標的への神経接続及び／又は機能に影響することができるタンパク質又はペプチドである（Barde, Neuron, 2 : 1525-1534, 1989）。インビボ及びインビトロの両方でのニューロトロフィンの効果は十分に報告されている。例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、インビトロでニワトリ胚の毛様体神経節の生存を促進し、そして培養した交感神経細胞、感覚神経細胞及び脊髄運動神経細胞の生存を支援する（Ip et al., J. Physiol. Paris, 85 : 123-130, 1991）。
【０００５】
ペプチドのインビトロでの治療的使用に対する主な障害は、それらがタンパク質分解を受けやすいことである。レトロ−インベルソなペプチドとは、その配列方向が反対であり（レトロ）、かつ各アミノ酸のキラリティー、Ｄ又はＬが逆である（インベルソ）線状ペプチドの異性体のことである。いくつかのペプチド結合だけが反対方向であり、かつその反対方向部分のアミノ酸残基のキラリティーが逆であるという、部分的に改変された線状ペプチドの異性体もまた存在する。この様なペプチドの主な利点は、タンパク質分解に対する耐性の増加により、インビボでの活性が強化されることである（論説として、Chorev et al., Trends Biotech., 13 : 438-445, 1995）。この様なレトロ−インベルソなアナログは、代謝安定性の増加を示すが、その生物活性はしばしば大きく低下する（Guichard et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 91 : 9765-9769, 1994)。
【０００６】
例えば、Richmanら（J. Peptide Protein Res., 25 : 648-662）は、Ｇｌｙ3 −Ｐｈｅ4 のアミド結合が改変された線状及び環状ロイ−エンケファリンアナログは、天然ロイ−エンケファリンの６〜１４％の活性を有することを決定した。Chorevら（前出）は、ビトロネクチンとその受容体との結合を阻害するペプチドのレトロ−インベルソ化により、親異性体よりも５００００倍低い活性を示す１つのペプチド、及び親の環状ペプチドよりも４０００倍高い活性を有するもう１つのペプチドが得られたことを示した。Guichardら（TIBTECH 14, 1996）は、レトロ−インベルソ（全てＤ−レトロ）体の抗原擬態は、ランダムコイル、ループ又は環状構造のペプチドにおいてのみ起こりうることを述べている。「らせん形の」ペプチドの場合、抗原擬態を評価するために用いた溶媒条件下で、そのらせん性が事実上無くなる場合にのみ、適切で機能的な擬態が期待されるであろう。
【発明の概要】
【０００７】
ＬＩＦ由来であり、かつ神経栄養活性を有するペプチドであって、代謝安定性が増加しているが、生物学的な活性が保持されている前記ペプチドが求められている。本発明は、この要求を解決する。
【０００８】
本発明の１つの態様は、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、そして配列番号１に示す配列を含んでいる、単離されたレトロ−インベルソなペプチドである。一つの好ましい態様では、当該配列内の少なくとも１つの塩基性荷電アミノ酸を、異なる塩基性荷電アミノ酸により置換する。別の好ましい態様では、前記配列内の少なくとも１つの酸性荷電アミノ酸を、異なる酸性荷電アミノ酸により置換する。有利には、前記配列内の少なくとも１つの非極性アミノ酸を、異なる非極性アミノ酸により置換する。好ましくは、当該配列内の少なくとも１つの非荷電アミノ酸を異なる非荷電アミノ酸により置換する。別の好ましい態様では、前記配列内の少なくとも１つの芳香族アミノ酸を、異なる芳香族アミノ酸により置換する。有利には、当該ペプチドを、そのアミノ末端、カルボキシ末端、又はそれらの両末端で、ＣＨ3 ＣＯ，ＣＨ3 （ＣＨ2 ）n ＣＯ，Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ＣＯ及びＨ2 Ｎ（ＣＨ2 ）n ＣＯ、ただしｎ＝１〜１０、から成る群から独立に選択される部分により修飾する。好ましくは、当該ペプチドをグリコシル化する。別の好ましい態様では、当該ペプチドの１又は複数のアミド結合を還元する。好ましくは、前記ペプチドの１又は複数の窒素をメチル化する。更に別の好ましい態様では、当該ペプチドの１又は複数のカルボン酸基をエステル化する。好ましくは、当該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明の別の態様は、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、そして配列番号１の配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチド、及び医薬上容認される担体を含んでなる組成物である。
本発明はまた、その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための方法を提供する。この方法は、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるペプチドを含んでなる組成物を、有効量、すなわち神経突起の成長又はミエリン形成を促進する量で、その哺乳動物に投与する過程を含んでなる。好ましくは、当該ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する。有利には、当該哺乳動物は人間である。１つの好ましい態様では、当該投与過程は、直接的な局所注射、全身性、頭蓋内、脳脊髄内、局所的又は経口投与である。
【００１０】
本発明の別の態様は、その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進する際に用いるための、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチドである。好ましくは、当該ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する。有利には、当該哺乳動物は人間である。
本発明はまた、その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための薬剤を調製するための、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチドの使用を提供する。配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項２１のペプチドが有益である。好ましくは、当該哺乳動物は人間である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）に由来するレトロ−インベルソ（ＲＩ）なペプチドであって、天然のＬＩＦに類似する効果、例えば骨芽細胞及び内皮細胞の増殖及び分化の制御、を仲介する前記ペプチドを提供する。前記の用語「由来する」とは、当該ペプチドが、インターロイキン６の活性領域又は下記に定義する通りのそのアナログを含んでいることを意味する。これらのＲＩなＬＩＦ由来ペプチドは、肝臓による急性相応答タンパク質の生産を誘導し、培養した胚幹細胞の自己再生を支援し、脂質生合成を阻害し、培養した運動神経細胞の生存を促進し、そして骨芽細胞及び内皮細胞の増殖及び分化を制御する。ある特定のＬＩＦ由来レトロ−インベルソなペプチドにおける、その親ペプチドに類似する効果を仲介する能力は、標準的なＬＩＦ検査、例えば実施例１０に記載した検査により、当業者により決定することができる。
【００１２】
これらのＲＩなＬＩＦ由来ペプチドはまた、末梢及び中枢の神経系に対する毒による、損傷による、虚血による、変性による傷害、及び遺伝性の傷害の後の機能回復を促進することにおいて治療的に適用される。これらのペプチドはまた、ミエリン形成の増加を促進するために、及び脱髄性疾患の効果を打ち消すために有用である。任意のこの様なペプチドにおける、神経突起の成長及びミエリン形成を刺激する能力、及び神経細胞死を抑制する能力は、実施例１〜９に記載の方法により、当業者により容易に決定することができる。これらのペプチドの使用は、それらが、天然又は組換えのサイトカインのいずれよりも安定であり、かつ合成しやすいので、種々の疾患の治療を促進するであろう。
【００１３】
本発明のある特定のＲＩなＬＩＦ由来ペプチド、及びその由来となる親タンパク質を表１に示す。その対応する天然の（レトロ−インベルソでない）ペプチドは米国特許５，７００，９０９に開示されている。
【００１４】
【表１】
【００１５】
前記の通り、これらのＲＩなＬＩＦ由来ペプチドは、対応する完全長のＬＩＦと同じ活性を有し、かつまた神経栄養的及びミエリン栄養的な活性を有する。本発明の一つの態様は、分化した、又は未分化の神経細胞の神経突起の成長を促進する方法であり、この方法は、１２〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示すＲＩなＬＩＦ由来ペプチドを含んでいるＲＩなペプチド、又は同様の活性を有するそのアナログを、有効量、すなわち神経突起の成長を促進する量で、その細胞に投与することによる。前記のアナログには、例えば、当該ペプチド内で、１又は複数のリシン及び／又はアルギニン残基を、アラニン又は別のアミノ酸で置換したもの；１又は複数のリシン及び／又はアルギニン残基を欠失したもの；１又は複数のチロシン及び／又はフェニルアラニン残基を置換したもの、１又は複数のフェニルアラニン残基を欠失したもの、及び、１又は複数のアミノ酸を保存的置換したものが含まれる。リシン／アルギニン及びチロシン／フェニルアラニン残基の置換又は欠失は、各々、トリプシン及びキモトリプシンによるペプチド分解の感受性を低下させるだろう。
【００１６】
本発明に用いられうるこれらのペプチド配列の更なる変種には、微少な挿入や欠失も考えられる。保存的アミノ酸置換が考えられる。この様な置換は、例えば、側鎖の化学的性質において関連のあるアミノ酸群の中で行なわれる置換である。アミノ酸群には、塩基性荷電アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性荷電アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）；非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）；及び、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）が含まれる。特には、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、又はセリンによるスレオニンの単独置換からなる保存的アミノ酸置換、あるいは構造的に関連するアミノ酸によるあるアミノ酸の同様な保存的置換は、当該ペプチドの特性に重大な影響を与えないであろうことが一般的に容認されている。配列番号１の配列、あるいは挿入、欠失又は置換を有するその配列を含んでなる任意のＲＩなペプチドにおける、神経突起の成長、ミエリン形成を促進し、脱髄を抑制回復し、そして神経細胞死を抑制する能力を、下記実施例に示す検査により決定することができる。
【００１７】
種々の標準的な化学修飾は、当該ペプチドの安定性、生物活性、及び脳血液関門を通過する能力を改善するであろう。その様な修飾の一つは、アミド結合を作るための、脂肪族又は芳香族の酸の誘導体による脂肪族アミノ末端修飾である。前記誘導体には、例えば、ＣＨ3 ＣＯ，ＣＨ3 （ＣＨ2 ）n ＣＯ（ｎ＝１〜１０），Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ＣＯ，Ｈ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n ＣＯ（ｎ＝１〜１０）が含まれる。別の修飾は、アミド／エステル結合を介して当該ペプチドに連結される脂肪族又は芳香族のアミン／アルコールの誘導体によるカルボキシ末端の修飾である。この様な誘導体には前記に列挙したものが含まれる。当該ペプチドはまた、アミノ末端及びカルボキシ末端の両修飾を有してもよく、その場合、当該誘導体は、前記に列挙したものの中から独立に選択される。当該ペプチドはグリコシル化されてもよく、ここでは、アルファアミノ基又はＤ−Ａｓｎのいずれか、あるいは両方がグルコース又はガラクトースにより修飾される。別の考えられる修飾では、選択した骨格のアミド結合を還元する（−ＮＨ−ＣＨ2 ）。その他の修飾には、アミド結合内の選択された窒素のＮ−メチル化、及び当該ペプチド内の酸の基の少なくとも一つを芳香族又は脂肪族エステルとして修飾するというエステル化が含まれる。前記修飾の任意の組み合せもまた考えられる。
【００１８】
細胞増殖培地中におけるＬＩＦ活性又は神経栄養活性のために必要な、本発明のＲＩなペプチドの典型的な最小量は、通常、少なくとも約５ng／mlである。インビトロでの使用のためには、この量又はそれ以上の量の本発明のＲＩなペプチドが考えられる。典型的には、０．１ｇ／ml〜約１０ｇ／mlの濃度の当該ペプチドが用いられるだろう。ある特定の組織における有効量を、実施例１に従って決定することができる。
【００１９】
本発明のＲＩなペプチドを直接細胞に投与することにより、細胞を、インビトロ又はエキソビボで処理することができる。これを、例えば、その特定の細胞タイプに適する増殖培地中で細胞を培養し、次に当該ペプチドをその培地に添加することにより行うことができる。処置する細胞がインビボであり、典型的には脊椎動物、好ましくは哺乳動物内である場合、当該組成物を、いくつかの方法により投与することができる。最も好ましくは、当該組成物を、希望する局所ペプチド濃度を得るために十分な量で血液中に直接注射する。これらのＲＩなペプチドは、そのＤペプチド結合のために、インビボでより長く存在する。リシン及びアルギニン残査を欠失したペプチドでは、そのタンパク質分解が低下する。より小さなペプチド（すなわち５０アミノ酸以下）は、中枢神経系疾患の治療のために、最も良く脳血液関門を通過し、そして中枢神経系に進入するであろう（Banks et al., Peptides, 13 : 1289-1294, 1992）。
【００２０】
神経疾患の治療のために、ニューロトロフィンの希望する局所濃度を得るために十分な量で、頭蓋内への、又は脳脊髄液への直接的な注射を行ってもよい。両方の場合で、医薬上容認される注射可能な担体が用いられる。この様な担体には、例えば、リン酸緩衝食塩水及びリンガー溶液が含まれる。あるいは、当該組成物を、直接的な局所注射により、又は全身性の投与により、末梢神経組織に投与することができる。種々の伝統的な投与方法、例えば静脈内、肺内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬膜上、硬膜下腔内、局所的、及び経口投与、が考えられる。
【００２１】
本発明のペプチド組成物を製剤化して、注射用組成物又は局所製剤などの単位投与剤として、患者に一日に投与される用量に相当する投与量で、あるいは調節的に放出される組成物として投与することができる。ＰＢＳ溶液又は凍結乾燥品のいずれかの形で、当該活性成分の一日の投与量を含んでいる無菌的に密封されたバイアルは、単位投与剤の一つの例である。好ましい態様では、ＬＩＦにより誘導される行程の促進、神経変性疾患又は脱髄疾患の治療のために必要な、脊椎動物の体重に基づく、本発明のＲＩなペプチドの一日の全身投与量は、約０．０１〜約１００００ｇ／kgの範囲である。より好ましくは、一日全身投与量は約０．１〜１０００ｇ／kgである。最も好ましくは、一日全身投与量は約１０〜１００ｇ／kgである。局所投与剤の一日投与量はほぼ一ケタ少ないであろう。胃腸系におけるタンパク質分解に対する当該ペプチドの耐性のために、経口投与は特に好ましい。
【００２２】
本発明の一つの好ましい態様では、当該ペプチドを、移植により、インビボで神経細胞に局所的に投与する。例えば、ポリ乳酸、ポリガラクチック（polygalactic）酸、再生コラーゲン、多薄層性リポソーム及びその他の多くの慣習的な滞留性製剤は、生物学的に活性な神経栄養ペプチド組成物と共に調合することのできる生物侵食性又は生物分解性物質を含んでなる。これらの物質は、移植されると、徐々に分解され、そして活性物質が周囲の組織に放出される。本発明では、生物侵食性、生物分解性及びその他の滞留性製剤が明かに考えられる。注入ポンプ、マトリックス捕捉系、及び経皮的供給装置との組み合せもまた考えられる。当該ペプチドを、移植の前に、米国特許５，５２９，９１４に記載の通りに、ポリエチレングリコールによる構造皮膜内に封入することもできる。
【００２３】
本発明のＲＩなＬＩＦ由来ペプチドをミセル又はリポソーム内に密閉することもできる。リポソーム封入技術は周知である。リポソームを、特定の組織に、例えば神経組織に、その標的組織に結合できる受容体、リガンド又は抗体の使用を介して、標的指向的に供給することができる。これらの組成物の調製は当分野に周知である（Radin et al., Meth. Enzymol., 98 : 613-618, 1983）。
【００２４】
現在、神経系の完全な機能再生及び構造回復を促進することができる利用可能な医薬は存在しない。これは、中枢神経系において特に当てはまる。当該神経栄養因子の使用を介した末梢神経の再生は、本発明の範囲に含まれる。更に、脳内の神経群又は特定の領域の変性に関係する神経変性疾患の治療において、神経栄養因子を治療的に用いることができる。パーキンソン病の主原因は、黒質のドーパミン性神経細胞の変性である。抗プロサポシン（ｐｒｏｓａｐｏｓｉｎ）抗体は、人間の脳切片において黒質のドーパミン性神経細胞を免疫組織化学的に染色することができるので、パーキンソン病の治療において、本発明のＲＩなペプチドは治療上有用であろう。高齢者において視覚喪失を招く眼の神経変性疾患である網膜神経障害もまた、本発明のＲＩなペプチドにより治療されうる。
【００２５】
長い間、神経栄養因子は、脳血液関門を通過しないので、脳内の神経細胞群に到達するために、それを大脳内に投与するべきであろうと信じられていた。米国特許５，５７１，７８７は、サポシン（ｓａｐｏｓｉｎ）Ｃに由来する神経栄養性の１８量体断片のヨード化物が脳血液関門を通過することを開示している。従って、約２２個以下のアミノ酸を有するＲＩなペプチドもまたこの関門を通過するであろう。従ってそれを静脈内に投与することができる。その他の神経細胞群、例えば運動神経細胞を、静脈内注射によっても処置することができる。ただし、代りの経路として、脳脊髄液への直接的な注射も考えられる。
【００２６】
インビボ、エキソビボ又はインビトロで、前記の方法で、ミエリン形成を促進するために、又は脱髄を抑制するために細胞を処置することができる。神経線維の脱髄に至る疾患、例えば、ＭＳ、急性流行性白質脳炎、脳及び／又は脊髄への外傷、進行性多病巣性白質脳炎、異染性白質萎縮症、副腎性白質萎縮症、及び未成熟乳児における白質発達障害（脳室周囲の白質軟化症）を、当該疾患にかかった細胞に、本発明の神経栄養性ペプチドを投与することにより、遅延又は停止することができる。
【００２７】
本発明のＲＩなＬＩＦ由来ペプチドの組成物を、また、培養した胚幹細胞の自己再生を支援するために、培養した運動神経細胞の生存を促進するために、そして神経栄養因子及びミエリン促進性物質の効果を決定するために用いることもできる。しかし、より実際的には、それらは、インビトロで増殖を促進するために、そして神経細胞及び幹細胞を維持するために、研究試薬及び細胞増殖用培地の成分として即座に有用である。
本発明のペプチドを、当分野に周知の自動固相方法により合成する。全てのペプチドを、使用する前に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、約９５％超の程度にまで精製する。
【実施例】
【００２８】
下記実施例を、限定のためでなく、単に説明のために示す。
【００２９】
実施例１：神経突起の成長の刺激
ＮＳ２０Ｙ神経芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ中で培養する。トリプシンにより細胞を取り出し、そして３０mmペトリ皿内のカバーガラス上にまく。２０〜２４時間後、その培地を、０．５％ＦＣＳと、０，０．５，１，２，４又は８ng／mlの、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドとを含有する２mlのＤＭＥＭにより置換する。細胞を更に２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄し、そしてＢｏｕｉｎ溶液（飽和水性ピクリン酸／ホルマリン／酢酸１５：５：１）により３０分間固定した。固定液をＰＢＳにより取り除き、そして位相差顕微鏡下で神経突起の成長を評価した。細胞の直径に等しいか、又はそれより長い明確に特定される神経突起を１又は複数個有する細胞を陽性と評価した。神経突起を有する細胞の割合を決定するために、各皿の異なる部分で、少なくとも２００個の細胞を評価した。検査を２回ずつ行った。
【００３０】
実施例２：細胞死の抑制
ＮＳ２０Ｙ細胞を、実施例１の記載通りにまき、そして８ng／mlの、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドの存在下又は非存在下で、０．５％ウシ胎児血清中で２日間、カバーグラス上で培養する。培地を取り除き、そして各ウエルに、０．２％トリパンブルー／ＰＢＳを加える。倒立顕微鏡上で、各ウエル上の４つの領域において４００個の細胞を計数することにより、青色に染色されている死亡した細胞を、総数に対する割合として評価する。２回測定の平均誤差は５％であった。
【００３１】
実施例３：エキソビボでの神経突起の成長の促進
成熟ラットから後根神経節を取り出し、そしてKuffler et al. J. Neurobiol. 25 : 1267-1282, 1994 の記載通りに、感覚神経細胞を調製した。神経細胞を、０．５ng／mlの、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドにより処理する。処理の３日後に、ミクロメーター格子上で、最長の神経突起の長さを測定する。ＲＩなペプチドにより処理した神経細胞における最長の神経突起は、コントロール（非ＲＩ）ペプチドにより処理した細胞又は未処理のコントロール細胞に比べて約３倍長い。処理の４８時間後には、多数の枝分れが認められるという点で、全ての細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）に対するのと同様に応答する。これらの結果は、当該ＬＩＦ由来ペプチドが感覚神経細胞の分化を促進することを意味する。
【００３２】
実施例５：ラットモデルにおける脱髄の回復
実験上のアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、人間の多発性硬化症（ＭＳ）のラットモデルである。ラットでは、外来タンパク質（モルモット脊髄）の注射によりＥＡＥが誘発され、その結果、１１日後に、白質の炎症と脱髄が生じる。この脱髄症は、活発に脱髄が起きる人間のＭＳ損傷に見られるものに似ている（Liu et al., Multiple Sclerosis 1 : 2-9, 1995）。
Ｌｅｗｉｓ系ラットにおいて、モルモットの脊髄及び完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の乳濁液を注射することにより、ＥＡＥを誘導する。１４日目に、衰弱が明白になってから、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドによる処置を開始し（筋肉内に２００ｇ／kg）、そして８日間毎日この処置を続ける。６匹のラットには担体のみを注射する。筋肉の衰弱の測定として、歩幅の長さを１４日目及び２２日目に評価する。更に、２２日目に、脊髄において１mm2 あたりの脱髄損傷（斑）の数と大きさを評価する。最後に、２２日目に、ミエリン分解のマーカーとして、脳内のコレステロールエステルの量を評価する。
【００３３】
１４日目に、両群の歩幅の長さは減少するが、８日間の処置後には、ＬＩＦ由来ペプチドにより処置した動物は正常に回復し、一方担体により処置した動物は回復しない。ペプチド処置群の脳において、コレステロールエステル含量の有意な低下が認められる。更に、ＬＩＦ由来ペプチドによる１０日間の処置後には、脊髄の損傷数は有意に低下する。最後に、損傷の平均サイズは有意に低下する。コントロール動物と実験動物との間で、体重の喪失の差はない。これらの結果は、ＬＩＦ由来ペプチドによる全身的処置の後における、臨床上、生化学上、及び形態学上有意なＥＡＥの回復を示す。この作用は、ミエリン修復に対して直接的に作用しない現在のＭＳ薬剤の抗炎症性効果とは異なる。
【００３４】
実施例６：エキソビボでのミエリン形成の検査
新生マウスの小脳の外植試料を、Satomi, Zool. Sci. 9 : 127-137, 1992に従って調製する。その培養において２２日間、神経突起の成長及びミエリン形成を観察する。その間には、その新生マウスの小脳は正常に神経細胞分化及びミエリン形成を開始する。１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドを、その外植試料を調製した後２日目に加え（３つのコントロール及び３つの処置外植試料）、そしてビデオカメラ付きの明視野顕微鏡下で、神経突起の成長及びミエリン形成を評価する。約１〜１０ｇ／mlの濃度のサポシンＣを、ポジティブコントロールとして用いる。ＬＩＦ由来ペプチドにより、サポシンＣの場合と同程度にミエリン形成が刺激される。
あるいは、下記の通りに、ミエリンに限局するスルホ脂質への35Ｓの取り込みにより、ミエリン形成を検査してもよい。
【００３５】
実施例７：スルホ脂質への35Ｓの取り込み
ミエリンを形成するシュワン細胞の初代培養細胞を、０．５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する低硫酸培地（ＤＭＥＭ）中でインキュベーションし、次に、35Ｓメチオニン、及び１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドを４８時間添加する。サポシンＣをポジティブコントロールとして用いる。細胞をＰＢＳによりリンスし、採取し、そして１００ｌの蒸留水中で超音波処理する。タンパク質分析のため、一定量の細胞溶解液を取り出し、そして残りを、５mlのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）により抽出する。Hiraiwa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 : 4778-4781の記載通りに、脂質抽出物をクロマトグラフィーにかけ、そして抗スルファチドモノクローナル抗体により免疫染色する。ペプチド及びサポシンＣの処置後に、同様な量のスルファチドが認められる。
【００３６】
実施例８：外傷性虚血性ＣＮＳ損傷の治療におけるＲＩなペプチドの使用
脳又は脊髄に外傷性損傷を有する人間に対して、約１００ｇ／kgの、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドを、無菌塩水溶液の形で全身性の注射により、又は滞留形で与える。感覚神経又は運動神経の機能の増加（すなわち四肢の運動性の向上）により、改善の程度を評価する。更なる改善が認められなくなるまで、治療を続ける。
【００３７】
実施例９：脱髄疾患の治療におけるＲＩなペプチドの使用
初期段階のＭＳであると診断された患者に、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドを、実施例８の記載と同一の投与量を用いて、全身性の注射により与える。投与を毎日又は毎週繰り返し、そして筋肉の強さ、筋骨格の協調及びミエリン形成（ＭＲＩにより決定する）の向上を観察する。慢性的に再発するＭＳを有する患者を、次の再発が起きる時に、同様な方法で治療する。
【００３８】
実施例１０：ＬＩＦによる細胞増殖検査
１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１の配列を含んでいるＲＩなペプチドにおけるＬＩＦ活性を、培養したＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ）とのインキュベーションにより、そしてＴＦ−１細胞の増殖の測定により検査する。ＴＦ−１細胞はヒトのＴ細胞であり、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）の存在下でのその増殖がＬＩＦに応答して阻害される。供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）の２〜３日後にＴＦ−１細胞を洗浄し、そして５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中に１×１０6 細胞／mlの最終濃度に再懸濁する。ＬＩＦによる基準の滴定を容量１００ｌ中で３回ずつ行う。その基準の滴定を１ng／mlから開始し、そして０．１pg／mlまで連続的に２倍ずつ希釈する。ＲＩなＬＩＦ由来ペプチドの適当な希釈を、容量１００ｌ中で３回ずつ行う。培地単独を、ネガティブコントロールとして用いる。
【００３９】
細胞懸濁液（１００ｌ）を各ウエルに加え、そしてそのプレートを、保湿したＣＯ2 インキュベーター内で３７℃で約４４時間インキュベーションする。トリチウム化したチミジン（０．５Ｃｉ）を各ウエルに加え、そしてそのプレートを約４時間インキュベーションする。各ウエルの内容物をフィルターマット上に採取し、そして液体シンチレーション計数により放射性標識の量を決定する。吸光度対基準濃度の標準曲線をプロットする。その標準曲線との比較により、ＲＩなＬＩＦ由来ペプチドのＬＩＦ活性を推定する。
【００４０】
本発明は、詳細な説明に記載した前記実施態様に限定されるものではない。本発明の意図を保持するいずれの態様も、本発明の範囲に含まれる。しかし、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１８〜約４０個のアミノ酸を有する単離されたレトロ−インベルソなペプチドであって、配列番号１に示す配列を含んでいる前記ペプチド。
【請求項２】
前記配列内の少なくとも１つの塩基性荷電アミノ酸が、異なる塩基性荷電アミノ酸により置換されている、請求項１のペプチド。
【請求項３】
前記配列内の少なくとも１つの酸性荷電アミノ酸が、異なる酸性荷電アミノ酸により置換されている、請求項１又は２のペプチド。
【請求項４】
前記配列内の少なくとも１つの非極性アミノ酸が、異なる非極性アミノ酸により置換されている、請求項１〜３のいずれかのペプチド。
【請求項５】
前記配列内の少なくとも１つの非荷電アミノ酸が、異なる非荷電アミノ酸により置換されている、請求項１〜４のいずれかのペプチド。
【請求項６】
前記配列内の少なくとも１つの芳香族アミノ酸が、異なる芳香族アミノ酸により置換されている、請求項１〜５のいずれかのペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、そのアミノ末端で、カルボキシ末端で、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の両方で、ＣＨ3ＣＯ，ＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ，Ｃ6Ｈ5ＣＨ2ＣＯ及びＨ2Ｎ（ＣＨ2）nＣＯ、ただしｎ＝１〜１０、から成る群から独立に選択された部分により修飾されている、請求項１〜６のいずれかのペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドがグリコシル化されている、請求項１〜７のいずれかのペプチド。
【請求項９】
前記ペプチド内の１又は複数のアミド結合が還元されている、請求項１〜８のいずれかのペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチド内の１又は複数の窒素がメチル化されている、請求項１〜９のいずれかのペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチド内の１又は複数のカルボン酸基がエステル化されている、請求項１〜１０のいずれかのペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれかのペプチド。
【請求項１３】
１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示す配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチド、及び医薬上容認される担体を含んでなる組成物。
【請求項１４】
その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための方法であって、神経突起の成長又はミエリン形成を促進するために有効な量の、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示す配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチドを含んでなる組成物を前記哺乳動物に投与する過程を含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物が人間である、請求項１４又は１５の方法。
【請求項１７】
前記の投与過程が、直接的な局所注射、全身性、頭蓋内、脳脊髄内、局所及び経口投与からなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進する際に用いるための、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示す配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１８のペプチド。
【請求項２０】
前記哺乳動物が人間である、請求項１８又は１９のペプチド。
【請求項２１】
その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための薬物を調製することにおける、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示す配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチドの使用。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項２１のペプチド。
【請求項２３】
前記哺乳動物が人間である、請求項２１又は２２のペプチド。
【請求項１】
１８〜約４０個のアミノ酸を有する単離されたレトロ−インベルソなペプチドであって、配列番号１に示す配列を含んでいる前記ペプチド。
【請求項２】
前記配列内の少なくとも１つの塩基性荷電アミノ酸が、異なる塩基性荷電アミノ酸により置換されている、請求項１のペプチド。
【請求項３】
前記配列内の少なくとも１つの酸性荷電アミノ酸が、異なる酸性荷電アミノ酸により置換されている、請求項１又は２のペプチド。
【請求項４】
前記配列内の少なくとも１つの非極性アミノ酸が、異なる非極性アミノ酸により置換されている、請求項１〜３のいずれかのペプチド。
【請求項５】
前記配列内の少なくとも１つの非荷電アミノ酸が、異なる非荷電アミノ酸により置換されている、請求項１〜４のいずれかのペプチド。
【請求項６】
前記配列内の少なくとも１つの芳香族アミノ酸が、異なる芳香族アミノ酸により置換されている、請求項１〜５のいずれかのペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、そのアミノ末端で、カルボキシ末端で、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の両方で、ＣＨ3ＣＯ，ＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ，Ｃ6Ｈ5ＣＨ2ＣＯ及びＨ2Ｎ（ＣＨ2）nＣＯ、ただしｎ＝１〜１０、から成る群から独立に選択された部分により修飾されている、請求項１〜６のいずれかのペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドがグリコシル化されている、請求項１〜７のいずれかのペプチド。
【請求項９】
前記ペプチド内の１又は複数のアミド結合が還元されている、請求項１〜８のいずれかのペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチド内の１又は複数の窒素がメチル化されている、請求項１〜９のいずれかのペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチド内の１又は複数のカルボン酸基がエステル化されている、請求項１〜１０のいずれかのペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれかのペプチド。
【請求項１３】
１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示す配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチド、及び医薬上容認される担体を含んでなる組成物。
【請求項１４】
その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための方法であって、神経突起の成長又はミエリン形成を促進するために有効な量の、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示す配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチドを含んでなる組成物を前記哺乳動物に投与する過程を含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物が人間である、請求項１４又は１５の方法。
【請求項１７】
前記の投与過程が、直接的な局所注射、全身性、頭蓋内、脳脊髄内、局所及び経口投与からなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進する際に用いるための、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示す配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１８のペプチド。
【請求項２０】
前記哺乳動物が人間である、請求項１８又は１９のペプチド。
【請求項２１】
その必要のある哺乳動物において神経突起の成長又はミエリン形成を促進するための薬物を調製することにおける、１８〜約４０個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１に示す配列を含んでいるレトロ−インベルソなペプチドの使用。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項２１のペプチド。
【請求項２３】
前記哺乳動物が人間である、請求項２１又は２２のペプチド。
【公開番号】特開２０１１−１４４１８４（Ｐ２０１１−１４４１８４Ａ）
【公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−３３５９４（Ｐ２０１１−３３５９４）
【出願日】平成２３年２月１８日（２０１１．２．１８）
【分割の表示】特願２００１−５０３８８６（Ｐ２００１−５０３８８６）の分割
【原出願日】平成１２年６月１６日（２０００．６．１６）
【出願人】（５０２０３１１１９）マイアロス コーポレイション (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３３５９４（Ｐ２０１１−３３５９４）
【出願日】平成２３年２月１８日（２０１１．２．１８）
【分割の表示】特願２００１−５０３８８６（Ｐ２００１−５０３８８６）の分割
【原出願日】平成１２年６月１６日（２０００．６．１６）
【出願人】（５０２０３１１１９）マイアロス コーポレイション (2)
【Ｆターム（参考）】
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