皮膚における酸化的ストレスの評価および緩和
【課題】哺乳類における酸化的ストレスを評価する方法を提供すること。
【解決手段】かかる方法は、ａ）哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分に曝露するステップと、ｂ）皮膚細胞を外部の攻撃に曝露するステップと、ｃ）易酸化性部分の反応生成物を評価するステップと、を含み、評価ステップ（ｃ）の前に、皮膚細胞は、除去される皮膚細胞が生存可能となるように哺乳類から非侵襲的に除去される。パーソナルケア組成物は、日焼け止め剤を含み、この組成物は、少なくとも約４０％の酸化保護率を有する。
【解決手段】かかる方法は、ａ）哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分に曝露するステップと、ｂ）皮膚細胞を外部の攻撃に曝露するステップと、ｃ）易酸化性部分の反応生成物を評価するステップと、を含み、評価ステップ（ｃ）の前に、皮膚細胞は、除去される皮膚細胞が生存可能となるように哺乳類から非侵襲的に除去される。パーソナルケア組成物は、日焼け止め剤を含み、この組成物は、少なくとも約４０％の酸化保護率を有する。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、皮膚における酸化的ストレスの評価方法、特に、外部の攻撃からの酸化的ストレスを緩和するための局所的組成物の能力を評価する方法に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
生命体は、一般に、その細胞内で、種々の重大な生化学的処理に有益であり、且つ、かかる処理を支持する化学環境を維持するために努力する。外部要因により、生化学的障害を引き起こす場合があり、かつ、細胞の構成要素、例えば脂質およびＤＮＡに損傷を及ぼす過酸化物およびフリーラジカルの生成による毒性作用の原因となる場合がある。特に、外部要因は、いわゆる「酸化的ストレス」と称される、細胞内で通常のレドックス状態の障害を引き起こす場合がある。酸化的ストレスによる特に有害な側面は、反応性酸素種（「ＲＯＳ」）の生成であり、反応性酸素種としては、フリーラジカルおよび過酸化物を含む。かかる種において反応性の低い種の中には、遷移金属との酸化還元反応によって、更に攻撃的なラジカル種に変換され得るものもあり、この攻撃的なラジカル種は広範囲の細胞の損傷を引き起こす場合がある。このような酸素誘導種の殆どは、通常の好気的代謝によって低水準にて生成され、かかる種が引き起こす、細胞に対する損傷は、常に修復される。しかしながら、壊死を引き起こす深刻な水準の酸化的ストレス下では、損傷は、ＡＴＰ枯渇を引き起こし、アポトーシス死の制御を妨害し、そして細胞を簡単に崩壊させる。
【０００３】
酸化的ストレスは、多くの研究における主題であり、そして種々の外部要因は、細胞における酸化的ストレスの水準に影響を及ぼすと仮定されてきた。例えば、紫外線に対する長時間の曝露は、損傷ＲＯＳを形成するきっかけとなるか、または損傷ＲＯＳの形成を際だたせる場合があると考えられている。
【０００４】
体内での酸化的ストレスの水準を検出し、そして低減する方法を見出すことは明らかに望ましい。しかしながら、皮膚に対する酸化的ストレスの作用を評価する従来の方法は、皮膚細胞を採取する（例えば、皮膚生検による）侵襲的方法、コストのかかる臨床研究、または生存細胞を収集する侵襲的方法を必要とする。従来の生体外方法では、種々の方法で得られる「培養された」細胞に対する外部攻撃の作用をシミュレートすることによって酸化的ストレスを評価しようと試み、これにより、完全な生物学的反応を捕捉しない作用を測定する。
【０００５】
更に、従来の方法は、一般に、高価で、且つ、複雑な器械、例えば高速液体クロマトグラフィを使用することによって、除去される細胞における酸化防止剤の含有量、または測定値を定量化しようと試みる。かかる器械は、扱いにくく、簡単に移動されず、高価で、使用するために幅広い訓練を必要とし、そして検出において低い感度を有する。
【０００６】
従って、出願人等は、従来技術の教示が、（ａ）酸化的ストレスから高い水準で保護する局所的組成物、または（ｂ）酸化的ストレスに対して反応する生物系の能力を評価する、単純で、安価で、信頼性が高く、非侵襲的で、かつ／または更に完全な手段を提供しないことに気が付いた。従って、上述した欠点のうち１つ以上を克服することが望ましいであろう。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明の一態様において、哺乳類における酸化的ストレスの評価方法が提供される。かかる方法は、ａ）前記哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分（oxidizable moiety）に曝露するステップと、ｂ）前記皮膚細胞を外部の攻撃に曝露するステップと、ｃ）前記易酸化性部分の反応生成物を評価するステップと、を含み、前記評価ステップ（ｃ）の前に、前記皮膚細胞は、除去される皮膚細胞が生存可能となるように前記哺乳類から非侵襲的に除去される。
【０００８】
本発明の他の態様において、パーソナルケア組成物は、日焼け止め剤を含み、この組成物は、少なくとも約４０％の酸化保護率（oxidation protection factor）を有する。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明白となるであろう。
【００１０】
〔発明の詳細な説明〕
当業者は、本願の明細書の記載に基づき、本発明を最大限に利用することが可能であると考えられる。以下の特定の実施形態は、単に説明しているだけであり、残りの開示部分をいかなる方法でも何ら限定するものではないと解釈されるべきである。
【００１１】
特段定義しない限り、本願明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同一の意味を有する。
【００１２】
本願の明細書で使用されるような、「哺乳類における酸化的ストレスの評価」は、哺乳類の細胞での反応性酸素種生成、および／またはかかる反応性酸素種を生成する能力に関する情報を得ることを意味する。反応性酸素種（ＲＯＳ）は、生物系において非常に反応性であるフリーラジカルを含む。ＲＯＳの例は、過酸化物、例えばスーパーオキシドおよび過酸化水素、ならびに一重項酸素およびペルオキシ亜硝酸である。かかる情報により、例えば、皮膚の現在の健康に対する洞察（例、所定の美容上または製薬上の皮膚治療が必要かどうかを決定するため）、ならびに外部の外傷または治療に対する皮膚の反応に関する洞察を得ることが可能である。
【００１３】
本発明によると、哺乳類の皮膚における酸化的ストレスは、ａ）哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分に曝露し、ｂ）皮膚細胞を外部の攻撃に曝露し、そしてｃ）易酸化性部分の反応生成物を評価する、ことによって評価される。これらのステップは、（ａ）の後に（ｂ）で、その後に（ｃ）の順序にて行われる。更に、評価ステップ（ｃ）の前、すなわち、ステップ（ａ）の前、またはステップ（ａ）と（ｂ）との間、またはステップ（ｂ）と（ｃ）との間に、皮膚細胞は、除去される皮膚細胞が生存可能となるように哺乳類から非侵襲的に除去される。このように、評価ステップ（ｃ）は、除去された、生存可能な皮膚細胞で行われる。
【００１４】
〔生存可能な皮膚細胞の非侵襲的除去〕
本願の明細書で使用されるような、「生存可能な皮膚細胞の非侵襲的除去」は、角質層、および必要により表皮から除去するものの、真皮から除去しないように、被験哺乳類の皮膚から皮膚細胞を分離し、そして収集することを意味する。好ましい実施形態においては、角質層からのみ除去し、表皮からは除去しない。本願の明細書で使用されるような「生存可能な（viable）」は、皮膚細胞が、生き、発達し、または成長することが可能であり、ならびに好ましい条件下で、代謝活性、例えば酵素反応可能であることを意味する。例えば、攻撃的な溶剤に曝露することによって溶解された皮膚細胞は、生存可能ではない。
【００１５】
本発明の一の実施形態において、非侵襲的除去は、表面ストリッピングするステップを含み、すなわち、生存可能な皮膚細胞が、被験者の皮膚の外面から取り除かれる。一の特に好適な実施形態において、皮膚細胞の非侵襲的除去は、哺乳類の皮膚表面を接着剤と接触させるステップであって、接着剤は、基材（substrate）に付着されている、ステップと、皮膚表面から接着剤を強制的に除去し、これにより、皮膚細胞を皮膚表面から分離し、接着剤と結合させるステップとを含む。かかる方法は、「テープストリッピング」と称されるのが一般的であり、皮膚に結合される接着剤を有する可撓性の基材が、除去されるべき皮膚と接触するように置かれる。皮膚からテープを引き離すことにより、皮膚細胞が角質層から除去される。その後、皮膚細胞は、テープから分離され得る。
【００１６】
使用され得る適切なテープの例は、CuDerm Corporation（テキサス州ダラス）から市販されているＤ−ＳＱＵＡＭＥを含む。
【００１７】
〔易酸化性部分に対する皮膚細胞の曝露〕
皮膚上にあるか、または皮膚から除去される皮膚細胞は、最初に易酸化性部分（oxidizable moiety）に曝露される。本願の明細書で使用されるような、「部分（moiety）」は、化合物、元素（element）、ラジカル、またはイオン、またはそれらの一部を意味する。「易酸化性部分」は、反応性酸素種との反応を受けることが可能な部分を意味する。易酸化性部分は、入手可能なＲＯＳとの反応が容易に起こり、そしてＲＯＳが、他の細胞の構成要素とは対照的に、易酸化性部分と優先的に反応するように選択されるのが好ましい。
【００１８】
一の望ましい実施形態において、易酸化性部分に対して皮膚細胞を曝露することにより、易酸化性部分が皮膚細胞に浸透する。本願の明細書で使用されるような、「浸透（penetration）」は、易酸化性部分が皮膚細胞の外側膜を通って、細胞の内部に移動することを意味する。皮膚細胞内への易酸化性部分の移動は、例えば、受動拡散または浸透（osmosis）によって行われても良い。
【００１９】
他の実施形態において、易酸化性部分に対する皮膚細胞の曝露では、皮膚細胞に浸透し、そして皮膚細胞内で１種以上の化学種（例、酵素）と反応する化学種を準備して易酸化性部分を形成するステップを含む。
【００２０】
他の実施形態において、易酸化性部分に対する皮膚細胞の曝露では、易酸化性部分が皮膚細胞に浸透することを必要とせず、むしろ皮膚細胞と流体連通することを必要とする。例えば、易酸化性部分は、皮膚細胞内で生成されるＲＯＳが、細胞膜を通って、または細胞膜に拡散し、次に、易酸化性部分と反応するように皮膚細胞の外側に位置させられても良い。
【００２１】
易酸化性部分を有する特に好適な化合物が、以下に記載される。
【００２２】
〔外部攻撃への曝露〕
次に、皮膚上にあるか、または皮膚から除去される皮膚細胞は、外部攻撃に曝露される。皮膚細胞がある範囲の現実の生化学反応（spectrum of realistic biochemical responses）を経験することを可能とするために、かかるステップで皮膚細胞が生存可能であることが重要である（生きている哺乳類の皮膚上にあるか、または皮膚から除去されたものの、上述したように依然として生存可能である）。例えば、生存可能な皮膚細胞において、天然の酸化防止剤、例えばグルタチオンは、生化学的に不活性化され得るので、その他の方法でＲＯＳと易酸化性部分との間で生じるだろう反応の度合いに影響を与えることが可能である。
【００２３】
外部攻撃の例は、哺乳類の皮膚細胞においてＲＯＳを生成することが可能であるもの、例えば、洗浄剤（例、界面活性剤を含む皮膚および髪の毛の洗浄剤）および化粧；シェービングおよびカッティング；ならびに環境要因、例えばＵＶ光（例、太陽光、またはＵＶランプおよび太陽シミュレータなどの非自然源からのＵＶ光）、オゾン、燃焼から等の排気、汚染物質、塩素および塩素含有化合物、ならびにタバコの煙を含む。一の特に顕著な実施形態において、外部攻撃は、紫外線である。
【００２４】
〔易酸化性部分の反応生成物の評価〕
外部攻撃への皮膚細胞の曝露に応じて、反応（例、化学反応）が、皮膚細胞において易酸化性部分とＲＯＳとの間で起こる。これにより、１種以上の反応生成物が生成される。
【００２５】
易酸化性部分は、「ホスト化合物」における反応性基または部位であっても良い。ホスト化合物は、ＲＯＳと易酸化性部分との間における反応によって生成される少なくとも１種の反応生成物が、例えば、その反応生成物と関連する電磁信号によって検出され得るように選択されるのが好ましい。例えば、電磁放射線は、かかる反応生成物と相互作用させられることが可能であり、この電磁放射線により得られる電磁信号は、検出され、好ましくは定量化されても良い。
【００２６】
従って、一の実施形態において、易酸化性部分の反応生成物の評価は、反応生成物と関連する電磁放射信号を測定するステップを含む。適切な電磁放射信号の例は、蛍光信号および発光用信号、例えば化学発光信号を含む。従って、反応生成物は、蛍光性の反応生成物であっても良い。
【００２７】
特に好適なホスト化合物は、発光用、化学発光用、または蛍光用「プローブ」または「分子プローブ」と一般に称される化合物である。これらのプローブは、当該分野で知られている極めて広範な化合物から選択されても良い。プローブは、過酸化物等のＲＯＳに対して、高い水準の選択率および感度を与えるように選択されるのが望ましい。好適なプローブの一類は、屡々、「インターナルプローブ」と称され、すなわち、かかるプローブは、皮膚細胞内に拡散可能であり、皮膚細胞内でＲＯＳと反応可能である。インターナルプローブの１種は、細胞への拡散時に酵素によって変更されても良く、これにより、プローブは、蛍光信号等の電磁信号を、主としてＲＯＳとの反応時だけ生成可能となる。換言すると、かかるインターナルプローブは、蛍光性の反応生成物を生成するものの、ＲＯＳとの反応前は、蛍光性ではない。
【００２８】
細胞透過性またはインターナルプローブの例は、Richard P. Haugland、およびMichelle T. Z. Spence（Invitrogen Corp. Press 2005）による“The Handbook- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 第10版”に列挙されるプローブを含み、以下のものが含まれる：２’、７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、カルボキシ−２’，７’−ジフルオロジヒドロフルオレセインジアセテート、５−（および６−）クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル、カルセインアセトキシメチルエステル、ジヒドロカルセインアセトキシメチルエステル、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロエチジウム、２，３，４，５，６−ペンタフルオロテトラメチルジヒドロローザミン（dihydroethidium, 2,3,4,5,6-pentafluorotetramethyldihydrorosamine）、ビオチニル化グルタチオンエチルエステル、テトラゾリウム塩、例えばＭＴＴおよびＸＴＴ。特に好適なインターナルプローブは、５−（および６−）クロロメチル−２’，７’−ジクロロヒドロフルオレセインジアセテート、Invitrogen社（カリフォルニア州、カールズバッド）から市販されているアセチルエステル（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）である。
【００２９】
他の好適なプローブは、いわゆる「エクスターナルプローブ」、すなわち、皮膚細胞に浸透可能ではないものの、皮膚細胞から拡散するＲＯＳと依然として反応可能であるプローブを含む。
【００３０】
本発明での使用に好適な場合があるエクスターナルプローブは、Richard P. Haugland、およびMichelle T. Z. Spence（Invitrogen Corp. Press 2005）による“The Handbook- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 第10版”に列挙されるプローブであり、以下のものが含まれる：１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン、３’−（ｐ−アミノフェニル）フルオレセイン、ジフェニル−１−ピレニルホスフィン、Ｒ−フィコエリスリン（R-phycoerythrin）、アロフィコシアニン、フルオレセイン−標識ホスファチジルエタノールアミン、およびヘキサデカノイルアミノフルオレセイン。
【００３１】
一の実施形態によると、１〜１０μモルの濃度のホスト化合物を有する溶液は、非侵襲的に除去される、生存可能な皮膚細胞に曝露される。
【００３２】
〔生存可能な皮膚細胞に対する外部組成物の供給〕
一の実施形態において、外部組成物は、生存可能な皮膚細胞に対して供給される。外部組成物は、細胞内でのＲＯＳの生成、またはＲＯＳを生成する細胞の能力に対する、その組成または成分の作用を測定するために塗布されるのが一般的である。外部組成物は、例えば、酸化防止剤または日焼け止め剤を含んでいても良い。
【００３３】
好適な酸化防止剤は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ベータカロテン、アルファヒドロキシ酸、例えばグリコール酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、アスコルビン酸、アルファヒドロキシ酪酸、アルファヒドロキシイソ酪酸、アルファヒドロキシイソカプロン酸、アトロラクチン酸（attrolactic acid）、アルファヒドロキシイソ吉草酸、ピルビン酸エチル、ガラクツロン酸、グルコヘプトン酸、グルコヘプトノ１，４−ラクトン（glucoheptono 1,4-lactone）、グルコン酸、グルコノラクトン、グルクロン酸、グルクロノラクトン、グリコール酸、イソプロピルピルベート（isopropyl pyruvate）、ピルビン酸メチル、粘液酸、ピルビン酸、糖酸、糖酸１，４−ラクトン、酒石酸、およびタルトロン酸；ベータヒドロキシ酸、例えばベータ−ヒドロキシ酪酸、ベータ−フェニル乳酸、ベータ−フェニルピルビン酸；ポリフェノール；植物性抽出物、例えば緑茶、大豆製品、オオアザミ（milk thistle）、藻類、アロエ、アンゼリカ、ダイダイ、コーヒー、オウレン、グレープフルーツ、ホーレン（hoellen）、スイカズラ、ジュズダマ、ムラサキ属（lithospermum）、桑の木、シャクヤク、プエラルア（puerarua）、ナイス（nice）、ベニバナ、ならびにこれらの混合物を含む。
【００３４】
好適な日焼け止め剤としては、紫外フィルター、例えば、当業者に知られていて、パーソナルケア製品において紫外線を吸収または散乱させるために一般的に使用される無機または有機（油溶性または水溶性）フィルターを含む。非限定例は、無機日焼け止め剤、例えば亜鉛およびチタンの酸化物；有機紫外フィルター、例えばベンジリデンカンファー、４−アミノ安息香酸誘導体、特に４−（ジメチルアミノ）安息香酸−２−エチルヘキシルエステル、４−（ジメチルアミノ）安息香酸−２−オクチルエスエル、および４−（ジメチルアミノ）安息香酸アミルエステル；桂皮酸のエステル（esters of cinnamonic acid）、サリチル酸のエステル、ベンゾフェノンおよびベンゾイルメタンの誘導体、ベンザルマロン酸のエステル（esters of benzalmalonic acid）；トリアジン誘導体；プロパン−１，３−ジオン；ケトトリシクロデカン誘導体（ketotricyclodecane derivatives）；２−フェニルベンズイミダゾール−５−スルホン酸；ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体；３−ベンジリデンカンファーのスルホン酸誘導体；安息香酸２−（４−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシベンゾイル）−安息香酸ヘキシルエステルの誘導体、特に当該分野で既知の有機フィルターを含む。
【００３５】
本発明の特に顕著な実施形態において、外部組成物は、酸化防止剤および日焼け止め剤を含む。
【００３６】
外部組成物は、担体、例えば水、および種々の、パーソナルケア調剤に好適な
他の成分、例えば、界面活性剤、乳化剤、皮膚軟化剤、湿潤剤、ｐＨ調節剤、芳香剤等を含んでいても良い。しかしながら、外部組成物は、重要な反応生成物（reaction product of interest）を評価する（例、定量的に）能力を実質的に妨げるだろう成分を含まないのが望ましい。したがって、方法が、易酸化性部分とＲＯＳとの間における反応生成物の蛍光信号を定量化するステップを含む場合、反応生成物と同一の波長で蛍光を発する成分を除外するのが望ましいであろう。
【００３７】
一の実施形態において、外部組成物は、生存可能な皮膚細胞を非侵襲的に除去する前に、被験者の皮膚に局所的に塗布される。他の実施形態において、外部組成物は、皮膚細胞が皮膚から除去された後に、皮膚細胞に供給される。
【００３８】
〔酸化保護率〕
一の実施形態において、外部組成物は、外部の攻撃に曝露される前に皮膚に対して局所的に塗布される。外部組成物により、外部の攻撃による作用を低下させるのが好ましい。本発明の方法を用いて、かかる外部組成物の酸化保護率（Oxidation Protection Factor）、すなわちＯＰＦが、測定され、そして評価されうる。
【００３９】
例えば、一の実施形態において、外部の攻撃は、ＵＶ放射線であり、反応生成物は、蛍光性の反応生成物であり、そして日焼け止め剤を含む外部組成物は、皮膚を紫外線に曝露する前に、皮膚に対して局所的に塗布される。
【００４０】
外部組成物のＯＰＦ、すなわちＸは、本発明の方法および以下の等式を用いて求められる：
ＯＰＦ＝１００Ｘ（ＳＮ，ＵＶ−ＳＸ，ＵＶ）／（ＳＮ，ＵＶ−ＳＮ，ＮＵＶ）
但し、ＳＮ，ＵＶは、外部組成物が皮膚細胞に塗布されず、その後、紫外線に曝露された場合に得られる蛍光信号を表し；
ＳＮ，ＮＵＶは、外部組成物が皮膚細胞に塗布されず、ＵＶに曝露されなかった場合に得られる蛍光信号を表し；そして
ＳＸ，ＵＶは、外部組成物Ｘが皮膚細胞に塗布され、その後、紫外線に曝露された場合に得られる蛍光信号を表す。
【００４１】
一の実施形態において、日焼け止め剤を含むパーソナルケア組成物は、少なくとも約４０％、好ましくは４５％、更に好ましくは５０％のＯＰＦを有して提供される。かかるパーソナルケア組成物は、上述したように担体および／または他の好適な成分を含んでいても良い。特に、パーソナルケア組成物は、酸化防止剤を含んでいても良い。
【００４２】
以下の非限定的な実施例により、本発明を更に説明する。
【００４３】
〔実施例１〕
種々のニキビ抑制組成物（外部の攻撃）に起因する人体の皮膚における酸化的ストレスに関する一連の評価は、以下の通りに行われた。
【００４４】
各々の場合で、一貫した基準の皮膚面を提供するために、３８０ｍｍ２の表面積を有する２２ｍｍの長さのＤ−ＳＱＵＡＭＥテープが、均一の機械的圧力で、被験者の内側の手のひら側の前腕に貼り付けられ、そして皮膚にて１分間放置された。テープが、鉗子で除去され、そして廃棄された。その後、第２のテープが同じ部位に貼り付けられ、そして、皮膚細胞を表面ストリップするために、上述の貼付および除去処理が繰り返された。この第２のテープが、食塩水（ＨＢＳＳ：ハンクス液（Hanks Blanaced Salt Solution））を含む１２穴の組織培養プレートの底部に置かれた。４回の複製が、各被験者に対して行われた。これらのテープは、番号１Ａ：「生成物無し」と標識され、以下に示すように評価された。
【００４５】
上述の処理が繰り返された。しかしながら、第２のテープを貼り付ける前に、１０重量％の過酸化ベンゾイル（Reckitt Benckiser社（イギリス、スラウ）から市販されているClearasil Maximum Strength Acne Treatment Cream）を含む組成物が、被験者の内側の手のひら側の前腕の別の部位に対して１ｃｍ２あたり４ｍｇの表面濃度で局所的に塗布された。かかるテープが、上述したように収集穴に置かれた。類似の処理が、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）の濃度を変更しただけで繰り返された。
【００４６】
番号１Ｂが、１０％の過酸化ベンゾイルに相当し；番号１Ｃが、５％の過酸化ベンゾイルに相当し（Mentholatum Co.（ニューヨーク州オーチャード・パーク）から市販されているOxy Lotion）；番号１Ｄが、２．２５％の過酸化ベンゾイルに相当していた（L' Oreal社（フランス、パリ）から市販されているAcne Response Step 3 Blemish Fighting Lotion）。
【００４７】
皮膚から除去するとき、テープストリップされた細胞が、早速、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ、すなわち、皮膚細胞内でＤＣＦＨに加水分解され、ＲＯＳとの反応時に蛍光性の反応生成物、すなわちＤＣＦを形成するホスト化合物の５μモル溶液中において３０分間に亘って培養された。
【００４８】
組織培養プレートが濯がれて、過剰のＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを除去した。その後、皮膚テープが、Oriel Corp.（コネティカット州ストラトフォード）から市販されている太陽シミュレータで８２ＫＪ／ｍ２に曝露された。その後、ＤＣＦに関して、以下の通りに評価された。各テープが、蛍光プローブを用いて照射した１時間後に正確に分析され、そしてMolecular Devices社（カリフォルニア州サニーベール）から市販されている、４８５ｎｍの励起波長および３５０ｎｍの放射（検出）波長にて設定される、分光蛍光計のプレートリーダーで読み取られた。同じくMolecular Devices社（カリフォルニア州サニーベール）により供給されるＳＯＦＴＭＡＸソフトウエアを使用して測定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告される結果が、以下の表１に示される。
【表１】
【００４９】
驚くべきことに、これらの結果は、本発明の方法にしたがって蛍光性を測定することによって、異なる外部の攻撃に曝露されることにより形成されるＲＯＳの水準、例えば、皮膚に局所的に塗布される酸化化合物の種々の水準を識別することができることを示している。
【００５０】
〔実施例２〕
日焼け止め剤を含む２種類の局所的組成物に関する酸化保護率、ＯＰＦが、以下の通りに測定され、そして比較された。測定は、実施例１に類似の方法で行われた。１１枚の皮膚テープが、評価される各々のサンプル、ならびに２つの対照（以下に記載）に与えられた。皮膚テープが、２２〜５５歳の範囲の年齢で、ＩＩ〜ＩＩＩ型の肌質の男性および女性の被験者から収集された。皮膚テープが、太陽シミュレータにおいて１１０ＫＪ／ｍ２に曝露された。
【００５１】
比較番号２Ａおよび２Ｂに対しては、外部組成物が塗布されなかった。Schering-Plough社（ニュージャージー州ケニルワース）から市販されている、外部組成物のCoppertone Water Babies Spectra 3 SPF 50が、比較番号２Ｄに対して塗布された。以下の外部組成物が、本発明により番号２Ｃに対して塗布された：
【表２】
【００５２】
外部組成物が、５ｃｍ２のプレートあたり５０μＬの生成物の表面被覆率でポリメチルメタクリレートのプレートに塗布された。外部組成物は、環境条件下に置かれて約５〜１０分間に亘って乾燥された。プレートが、組成物を下にして、皮膚細胞を含む特定の組織培養プレートに置かれ、培養された細胞を完全に覆った。サンプル２Ｂ〜２Ｄの細胞が、培養プレート上のＰＭＭＡプレートと一緒に、ＵＶ線量に対して１５分間曝露された。サンプル２Ａは、ＵＶに対して曝露されなかった。番号２Ｃおよび２ＤのＯＰＦＸが、下式を用いて計算された：
ＯＰＦＸ＝１００Ｘ（ＳＮ，ＵＶ−ＳＸ，ＵＶ）／（ＳＮ，ＵＶ−ＳＮ，ＮＵＶ）
但し、ＳＮ，ＵＶは、外部組成物無しで、ＵＶに曝露した場合の蛍光信号を表し、本実施例の場合には、８４．５５であり；
ＳＮ，ＮＵＶは、外部組成物無しで、ＵＶに曝露しない場合の蛍光信号を表し、本実施例の場合には、２７．９９であり；そして
ＳＸ，ＵＶは、外部組成物Ｘに関し、ＵＶに曝露した場合の蛍光信号を表し、本実施例の場合には、５５．０２または６３．８９であった。
【００５３】
結果が、以下の表２に示される。
【表３】
【００５４】
驚くべきことに、結果は、酸化的ストレス、特に、ＵＶ−誘発ＲＯＳにより生成される酸化的ストレスに耐える／妨げる局所的組成物の能力を評価するために、本発明の方法が使用され得ることを示していた。更に、高いＯＰＦにより明らかにされるように、酸化的ストレスからの高い度合いの保護を有する組成物を提供することが可能であった。特に、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約４５％、更に好ましくは少なくとも約５０％のＯＰＦを有するパーソナルケア組成物を提供することが可能であった。
【００５５】
本発明は、その詳細な説明と共に記載されたが、上述の記載は、本発明を説明する目的であって、添付の特許請求の範囲により定められる、本発明の範囲を限定するものではないと理解されるべきである。他の態様、利点、および変更は、特許請求の範囲内にある。
【００５６】
〔実施の態様〕
（１） 哺乳類における酸化的ストレスを評価する方法において、
ａ）前記哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分に曝露するステップと、
ｂ）前記皮膚細胞を外部の攻撃に曝露するステップと、
ｃ）前記易酸化性部分の反応生成物を評価するステップと、
を含み、
前記評価ステップ（ｃ）の前に、前記皮膚細胞は、除去される前記皮膚細胞が生存可能となるように前記哺乳類から非侵襲的に除去される、方法。
（２） 実施態様１に記載の方法において、
前記評価ステップ（ｃ）は、前記反応生成物と関連する電磁信号を測定するステップを含む、方法。
（３） 実施態様１に記載の方法において、
前記反応生成物は、蛍光性反応生成物である、方法。
（４） 実施態様１に記載の方法において、
前記曝露ステップ（ａ）は、前記易酸化性部分を前記皮膚細胞に浸透させる（causes penetration of said skin cells by said oxidizable moiety）、方法。
（５） 実施態様１に記載の方法において、
前記皮膚細胞に対して外部組成物を提供するステップ、
をさらに含み、
前記外部組成物は、酸化防止剤、日焼け止め剤、またはこれらの組み合わせを含む、方法。
（６） 実施態様５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記曝露ステップ（ｂ）の前に、前記皮膚細胞に対して局所的に前記外部組成物を塗布するステップを含む、方法。
（７） 実施態様５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記皮膚細胞の前記哺乳類からの前記非侵襲的除去の前に行われる、方法。
（８） 実施態様５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記皮膚細胞の前記哺乳類からの前記非侵襲的除去の後に行われる、方法。
（９） 実施態様１に記載の方法において、
前記非侵襲的除去は、前記皮膚細胞の表面ストリッピングを含む、方法。
（１０） 実施態様１に記載の方法において、
前記非侵襲的除去は、
前記哺乳類の皮膚表面を接着剤と接触させるステップであって、前記接着剤は、基材に付着されている、ステップと、
前記皮膚表面から前記接着剤を強制的に除去し、これにより、前記皮膚細胞を前記皮膚表面から分離し、前記接着剤と結合させるステップと、
を含む、方法。
【００５７】
（１１） 実施態様１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、前記皮膚細胞により反応性酸素種を生成する、方法。
（１２） 実施態様１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、紫外線、煙、温度、圧力、化学物質、湿度、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
（１３） 実施態様１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、紫外線である、方法。
（１４） パーソナルケア組成物において、
日焼け止め剤、
を含み、
前記組成物は、少なくとも約４０％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
（１５） 実施態様１３に記載のパーソナルケア組成物において、
前記組成物は、少なくとも約４５％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
（１６） 実施態様１３に記載のパーソナルケア組成物において、
前記組成物は、少なくとも約５０％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
（１７） 実施態様１３に記載のパーソナルケア組成物において、
酸化防止剤、
をさらに含む、パーソナルケア組成物。
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、皮膚における酸化的ストレスの評価方法、特に、外部の攻撃からの酸化的ストレスを緩和するための局所的組成物の能力を評価する方法に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
生命体は、一般に、その細胞内で、種々の重大な生化学的処理に有益であり、且つ、かかる処理を支持する化学環境を維持するために努力する。外部要因により、生化学的障害を引き起こす場合があり、かつ、細胞の構成要素、例えば脂質およびＤＮＡに損傷を及ぼす過酸化物およびフリーラジカルの生成による毒性作用の原因となる場合がある。特に、外部要因は、いわゆる「酸化的ストレス」と称される、細胞内で通常のレドックス状態の障害を引き起こす場合がある。酸化的ストレスによる特に有害な側面は、反応性酸素種（「ＲＯＳ」）の生成であり、反応性酸素種としては、フリーラジカルおよび過酸化物を含む。かかる種において反応性の低い種の中には、遷移金属との酸化還元反応によって、更に攻撃的なラジカル種に変換され得るものもあり、この攻撃的なラジカル種は広範囲の細胞の損傷を引き起こす場合がある。このような酸素誘導種の殆どは、通常の好気的代謝によって低水準にて生成され、かかる種が引き起こす、細胞に対する損傷は、常に修復される。しかしながら、壊死を引き起こす深刻な水準の酸化的ストレス下では、損傷は、ＡＴＰ枯渇を引き起こし、アポトーシス死の制御を妨害し、そして細胞を簡単に崩壊させる。
【０００３】
酸化的ストレスは、多くの研究における主題であり、そして種々の外部要因は、細胞における酸化的ストレスの水準に影響を及ぼすと仮定されてきた。例えば、紫外線に対する長時間の曝露は、損傷ＲＯＳを形成するきっかけとなるか、または損傷ＲＯＳの形成を際だたせる場合があると考えられている。
【０００４】
体内での酸化的ストレスの水準を検出し、そして低減する方法を見出すことは明らかに望ましい。しかしながら、皮膚に対する酸化的ストレスの作用を評価する従来の方法は、皮膚細胞を採取する（例えば、皮膚生検による）侵襲的方法、コストのかかる臨床研究、または生存細胞を収集する侵襲的方法を必要とする。従来の生体外方法では、種々の方法で得られる「培養された」細胞に対する外部攻撃の作用をシミュレートすることによって酸化的ストレスを評価しようと試み、これにより、完全な生物学的反応を捕捉しない作用を測定する。
【０００５】
更に、従来の方法は、一般に、高価で、且つ、複雑な器械、例えば高速液体クロマトグラフィを使用することによって、除去される細胞における酸化防止剤の含有量、または測定値を定量化しようと試みる。かかる器械は、扱いにくく、簡単に移動されず、高価で、使用するために幅広い訓練を必要とし、そして検出において低い感度を有する。
【０００６】
従って、出願人等は、従来技術の教示が、（ａ）酸化的ストレスから高い水準で保護する局所的組成物、または（ｂ）酸化的ストレスに対して反応する生物系の能力を評価する、単純で、安価で、信頼性が高く、非侵襲的で、かつ／または更に完全な手段を提供しないことに気が付いた。従って、上述した欠点のうち１つ以上を克服することが望ましいであろう。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明の一態様において、哺乳類における酸化的ストレスの評価方法が提供される。かかる方法は、ａ）前記哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分（oxidizable moiety）に曝露するステップと、ｂ）前記皮膚細胞を外部の攻撃に曝露するステップと、ｃ）前記易酸化性部分の反応生成物を評価するステップと、を含み、前記評価ステップ（ｃ）の前に、前記皮膚細胞は、除去される皮膚細胞が生存可能となるように前記哺乳類から非侵襲的に除去される。
【０００８】
本発明の他の態様において、パーソナルケア組成物は、日焼け止め剤を含み、この組成物は、少なくとも約４０％の酸化保護率（oxidation protection factor）を有する。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明白となるであろう。
【００１０】
〔発明の詳細な説明〕
当業者は、本願の明細書の記載に基づき、本発明を最大限に利用することが可能であると考えられる。以下の特定の実施形態は、単に説明しているだけであり、残りの開示部分をいかなる方法でも何ら限定するものではないと解釈されるべきである。
【００１１】
特段定義しない限り、本願明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同一の意味を有する。
【００１２】
本願の明細書で使用されるような、「哺乳類における酸化的ストレスの評価」は、哺乳類の細胞での反応性酸素種生成、および／またはかかる反応性酸素種を生成する能力に関する情報を得ることを意味する。反応性酸素種（ＲＯＳ）は、生物系において非常に反応性であるフリーラジカルを含む。ＲＯＳの例は、過酸化物、例えばスーパーオキシドおよび過酸化水素、ならびに一重項酸素およびペルオキシ亜硝酸である。かかる情報により、例えば、皮膚の現在の健康に対する洞察（例、所定の美容上または製薬上の皮膚治療が必要かどうかを決定するため）、ならびに外部の外傷または治療に対する皮膚の反応に関する洞察を得ることが可能である。
【００１３】
本発明によると、哺乳類の皮膚における酸化的ストレスは、ａ）哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分に曝露し、ｂ）皮膚細胞を外部の攻撃に曝露し、そしてｃ）易酸化性部分の反応生成物を評価する、ことによって評価される。これらのステップは、（ａ）の後に（ｂ）で、その後に（ｃ）の順序にて行われる。更に、評価ステップ（ｃ）の前、すなわち、ステップ（ａ）の前、またはステップ（ａ）と（ｂ）との間、またはステップ（ｂ）と（ｃ）との間に、皮膚細胞は、除去される皮膚細胞が生存可能となるように哺乳類から非侵襲的に除去される。このように、評価ステップ（ｃ）は、除去された、生存可能な皮膚細胞で行われる。
【００１４】
〔生存可能な皮膚細胞の非侵襲的除去〕
本願の明細書で使用されるような、「生存可能な皮膚細胞の非侵襲的除去」は、角質層、および必要により表皮から除去するものの、真皮から除去しないように、被験哺乳類の皮膚から皮膚細胞を分離し、そして収集することを意味する。好ましい実施形態においては、角質層からのみ除去し、表皮からは除去しない。本願の明細書で使用されるような「生存可能な（viable）」は、皮膚細胞が、生き、発達し、または成長することが可能であり、ならびに好ましい条件下で、代謝活性、例えば酵素反応可能であることを意味する。例えば、攻撃的な溶剤に曝露することによって溶解された皮膚細胞は、生存可能ではない。
【００１５】
本発明の一の実施形態において、非侵襲的除去は、表面ストリッピングするステップを含み、すなわち、生存可能な皮膚細胞が、被験者の皮膚の外面から取り除かれる。一の特に好適な実施形態において、皮膚細胞の非侵襲的除去は、哺乳類の皮膚表面を接着剤と接触させるステップであって、接着剤は、基材（substrate）に付着されている、ステップと、皮膚表面から接着剤を強制的に除去し、これにより、皮膚細胞を皮膚表面から分離し、接着剤と結合させるステップとを含む。かかる方法は、「テープストリッピング」と称されるのが一般的であり、皮膚に結合される接着剤を有する可撓性の基材が、除去されるべき皮膚と接触するように置かれる。皮膚からテープを引き離すことにより、皮膚細胞が角質層から除去される。その後、皮膚細胞は、テープから分離され得る。
【００１６】
使用され得る適切なテープの例は、CuDerm Corporation（テキサス州ダラス）から市販されているＤ−ＳＱＵＡＭＥを含む。
【００１７】
〔易酸化性部分に対する皮膚細胞の曝露〕
皮膚上にあるか、または皮膚から除去される皮膚細胞は、最初に易酸化性部分（oxidizable moiety）に曝露される。本願の明細書で使用されるような、「部分（moiety）」は、化合物、元素（element）、ラジカル、またはイオン、またはそれらの一部を意味する。「易酸化性部分」は、反応性酸素種との反応を受けることが可能な部分を意味する。易酸化性部分は、入手可能なＲＯＳとの反応が容易に起こり、そしてＲＯＳが、他の細胞の構成要素とは対照的に、易酸化性部分と優先的に反応するように選択されるのが好ましい。
【００１８】
一の望ましい実施形態において、易酸化性部分に対して皮膚細胞を曝露することにより、易酸化性部分が皮膚細胞に浸透する。本願の明細書で使用されるような、「浸透（penetration）」は、易酸化性部分が皮膚細胞の外側膜を通って、細胞の内部に移動することを意味する。皮膚細胞内への易酸化性部分の移動は、例えば、受動拡散または浸透（osmosis）によって行われても良い。
【００１９】
他の実施形態において、易酸化性部分に対する皮膚細胞の曝露では、皮膚細胞に浸透し、そして皮膚細胞内で１種以上の化学種（例、酵素）と反応する化学種を準備して易酸化性部分を形成するステップを含む。
【００２０】
他の実施形態において、易酸化性部分に対する皮膚細胞の曝露では、易酸化性部分が皮膚細胞に浸透することを必要とせず、むしろ皮膚細胞と流体連通することを必要とする。例えば、易酸化性部分は、皮膚細胞内で生成されるＲＯＳが、細胞膜を通って、または細胞膜に拡散し、次に、易酸化性部分と反応するように皮膚細胞の外側に位置させられても良い。
【００２１】
易酸化性部分を有する特に好適な化合物が、以下に記載される。
【００２２】
〔外部攻撃への曝露〕
次に、皮膚上にあるか、または皮膚から除去される皮膚細胞は、外部攻撃に曝露される。皮膚細胞がある範囲の現実の生化学反応（spectrum of realistic biochemical responses）を経験することを可能とするために、かかるステップで皮膚細胞が生存可能であることが重要である（生きている哺乳類の皮膚上にあるか、または皮膚から除去されたものの、上述したように依然として生存可能である）。例えば、生存可能な皮膚細胞において、天然の酸化防止剤、例えばグルタチオンは、生化学的に不活性化され得るので、その他の方法でＲＯＳと易酸化性部分との間で生じるだろう反応の度合いに影響を与えることが可能である。
【００２３】
外部攻撃の例は、哺乳類の皮膚細胞においてＲＯＳを生成することが可能であるもの、例えば、洗浄剤（例、界面活性剤を含む皮膚および髪の毛の洗浄剤）および化粧；シェービングおよびカッティング；ならびに環境要因、例えばＵＶ光（例、太陽光、またはＵＶランプおよび太陽シミュレータなどの非自然源からのＵＶ光）、オゾン、燃焼から等の排気、汚染物質、塩素および塩素含有化合物、ならびにタバコの煙を含む。一の特に顕著な実施形態において、外部攻撃は、紫外線である。
【００２４】
〔易酸化性部分の反応生成物の評価〕
外部攻撃への皮膚細胞の曝露に応じて、反応（例、化学反応）が、皮膚細胞において易酸化性部分とＲＯＳとの間で起こる。これにより、１種以上の反応生成物が生成される。
【００２５】
易酸化性部分は、「ホスト化合物」における反応性基または部位であっても良い。ホスト化合物は、ＲＯＳと易酸化性部分との間における反応によって生成される少なくとも１種の反応生成物が、例えば、その反応生成物と関連する電磁信号によって検出され得るように選択されるのが好ましい。例えば、電磁放射線は、かかる反応生成物と相互作用させられることが可能であり、この電磁放射線により得られる電磁信号は、検出され、好ましくは定量化されても良い。
【００２６】
従って、一の実施形態において、易酸化性部分の反応生成物の評価は、反応生成物と関連する電磁放射信号を測定するステップを含む。適切な電磁放射信号の例は、蛍光信号および発光用信号、例えば化学発光信号を含む。従って、反応生成物は、蛍光性の反応生成物であっても良い。
【００２７】
特に好適なホスト化合物は、発光用、化学発光用、または蛍光用「プローブ」または「分子プローブ」と一般に称される化合物である。これらのプローブは、当該分野で知られている極めて広範な化合物から選択されても良い。プローブは、過酸化物等のＲＯＳに対して、高い水準の選択率および感度を与えるように選択されるのが望ましい。好適なプローブの一類は、屡々、「インターナルプローブ」と称され、すなわち、かかるプローブは、皮膚細胞内に拡散可能であり、皮膚細胞内でＲＯＳと反応可能である。インターナルプローブの１種は、細胞への拡散時に酵素によって変更されても良く、これにより、プローブは、蛍光信号等の電磁信号を、主としてＲＯＳとの反応時だけ生成可能となる。換言すると、かかるインターナルプローブは、蛍光性の反応生成物を生成するものの、ＲＯＳとの反応前は、蛍光性ではない。
【００２８】
細胞透過性またはインターナルプローブの例は、Richard P. Haugland、およびMichelle T. Z. Spence（Invitrogen Corp. Press 2005）による“The Handbook- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 第10版”に列挙されるプローブを含み、以下のものが含まれる：２’、７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、カルボキシ−２’，７’−ジフルオロジヒドロフルオレセインジアセテート、５−（および６−）クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル、カルセインアセトキシメチルエステル、ジヒドロカルセインアセトキシメチルエステル、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロエチジウム、２，３，４，５，６−ペンタフルオロテトラメチルジヒドロローザミン（dihydroethidium, 2,3,4,5,6-pentafluorotetramethyldihydrorosamine）、ビオチニル化グルタチオンエチルエステル、テトラゾリウム塩、例えばＭＴＴおよびＸＴＴ。特に好適なインターナルプローブは、５−（および６−）クロロメチル−２’，７’−ジクロロヒドロフルオレセインジアセテート、Invitrogen社（カリフォルニア州、カールズバッド）から市販されているアセチルエステル（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）である。
【００２９】
他の好適なプローブは、いわゆる「エクスターナルプローブ」、すなわち、皮膚細胞に浸透可能ではないものの、皮膚細胞から拡散するＲＯＳと依然として反応可能であるプローブを含む。
【００３０】
本発明での使用に好適な場合があるエクスターナルプローブは、Richard P. Haugland、およびMichelle T. Z. Spence（Invitrogen Corp. Press 2005）による“The Handbook- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 第10版”に列挙されるプローブであり、以下のものが含まれる：１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン、３’−（ｐ−アミノフェニル）フルオレセイン、ジフェニル−１−ピレニルホスフィン、Ｒ−フィコエリスリン（R-phycoerythrin）、アロフィコシアニン、フルオレセイン−標識ホスファチジルエタノールアミン、およびヘキサデカノイルアミノフルオレセイン。
【００３１】
一の実施形態によると、１〜１０μモルの濃度のホスト化合物を有する溶液は、非侵襲的に除去される、生存可能な皮膚細胞に曝露される。
【００３２】
〔生存可能な皮膚細胞に対する外部組成物の供給〕
一の実施形態において、外部組成物は、生存可能な皮膚細胞に対して供給される。外部組成物は、細胞内でのＲＯＳの生成、またはＲＯＳを生成する細胞の能力に対する、その組成または成分の作用を測定するために塗布されるのが一般的である。外部組成物は、例えば、酸化防止剤または日焼け止め剤を含んでいても良い。
【００３３】
好適な酸化防止剤は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ベータカロテン、アルファヒドロキシ酸、例えばグリコール酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、アスコルビン酸、アルファヒドロキシ酪酸、アルファヒドロキシイソ酪酸、アルファヒドロキシイソカプロン酸、アトロラクチン酸（attrolactic acid）、アルファヒドロキシイソ吉草酸、ピルビン酸エチル、ガラクツロン酸、グルコヘプトン酸、グルコヘプトノ１，４−ラクトン（glucoheptono 1,4-lactone）、グルコン酸、グルコノラクトン、グルクロン酸、グルクロノラクトン、グリコール酸、イソプロピルピルベート（isopropyl pyruvate）、ピルビン酸メチル、粘液酸、ピルビン酸、糖酸、糖酸１，４−ラクトン、酒石酸、およびタルトロン酸；ベータヒドロキシ酸、例えばベータ−ヒドロキシ酪酸、ベータ−フェニル乳酸、ベータ−フェニルピルビン酸；ポリフェノール；植物性抽出物、例えば緑茶、大豆製品、オオアザミ（milk thistle）、藻類、アロエ、アンゼリカ、ダイダイ、コーヒー、オウレン、グレープフルーツ、ホーレン（hoellen）、スイカズラ、ジュズダマ、ムラサキ属（lithospermum）、桑の木、シャクヤク、プエラルア（puerarua）、ナイス（nice）、ベニバナ、ならびにこれらの混合物を含む。
【００３４】
好適な日焼け止め剤としては、紫外フィルター、例えば、当業者に知られていて、パーソナルケア製品において紫外線を吸収または散乱させるために一般的に使用される無機または有機（油溶性または水溶性）フィルターを含む。非限定例は、無機日焼け止め剤、例えば亜鉛およびチタンの酸化物；有機紫外フィルター、例えばベンジリデンカンファー、４−アミノ安息香酸誘導体、特に４−（ジメチルアミノ）安息香酸−２−エチルヘキシルエステル、４−（ジメチルアミノ）安息香酸−２−オクチルエスエル、および４−（ジメチルアミノ）安息香酸アミルエステル；桂皮酸のエステル（esters of cinnamonic acid）、サリチル酸のエステル、ベンゾフェノンおよびベンゾイルメタンの誘導体、ベンザルマロン酸のエステル（esters of benzalmalonic acid）；トリアジン誘導体；プロパン−１，３−ジオン；ケトトリシクロデカン誘導体（ketotricyclodecane derivatives）；２−フェニルベンズイミダゾール−５−スルホン酸；ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体；３−ベンジリデンカンファーのスルホン酸誘導体；安息香酸２−（４−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシベンゾイル）−安息香酸ヘキシルエステルの誘導体、特に当該分野で既知の有機フィルターを含む。
【００３５】
本発明の特に顕著な実施形態において、外部組成物は、酸化防止剤および日焼け止め剤を含む。
【００３６】
外部組成物は、担体、例えば水、および種々の、パーソナルケア調剤に好適な
他の成分、例えば、界面活性剤、乳化剤、皮膚軟化剤、湿潤剤、ｐＨ調節剤、芳香剤等を含んでいても良い。しかしながら、外部組成物は、重要な反応生成物（reaction product of interest）を評価する（例、定量的に）能力を実質的に妨げるだろう成分を含まないのが望ましい。したがって、方法が、易酸化性部分とＲＯＳとの間における反応生成物の蛍光信号を定量化するステップを含む場合、反応生成物と同一の波長で蛍光を発する成分を除外するのが望ましいであろう。
【００３７】
一の実施形態において、外部組成物は、生存可能な皮膚細胞を非侵襲的に除去する前に、被験者の皮膚に局所的に塗布される。他の実施形態において、外部組成物は、皮膚細胞が皮膚から除去された後に、皮膚細胞に供給される。
【００３８】
〔酸化保護率〕
一の実施形態において、外部組成物は、外部の攻撃に曝露される前に皮膚に対して局所的に塗布される。外部組成物により、外部の攻撃による作用を低下させるのが好ましい。本発明の方法を用いて、かかる外部組成物の酸化保護率（Oxidation Protection Factor）、すなわちＯＰＦが、測定され、そして評価されうる。
【００３９】
例えば、一の実施形態において、外部の攻撃は、ＵＶ放射線であり、反応生成物は、蛍光性の反応生成物であり、そして日焼け止め剤を含む外部組成物は、皮膚を紫外線に曝露する前に、皮膚に対して局所的に塗布される。
【００４０】
外部組成物のＯＰＦ、すなわちＸは、本発明の方法および以下の等式を用いて求められる：
ＯＰＦ＝１００Ｘ（ＳＮ，ＵＶ−ＳＸ，ＵＶ）／（ＳＮ，ＵＶ−ＳＮ，ＮＵＶ）
但し、ＳＮ，ＵＶは、外部組成物が皮膚細胞に塗布されず、その後、紫外線に曝露された場合に得られる蛍光信号を表し；
ＳＮ，ＮＵＶは、外部組成物が皮膚細胞に塗布されず、ＵＶに曝露されなかった場合に得られる蛍光信号を表し；そして
ＳＸ，ＵＶは、外部組成物Ｘが皮膚細胞に塗布され、その後、紫外線に曝露された場合に得られる蛍光信号を表す。
【００４１】
一の実施形態において、日焼け止め剤を含むパーソナルケア組成物は、少なくとも約４０％、好ましくは４５％、更に好ましくは５０％のＯＰＦを有して提供される。かかるパーソナルケア組成物は、上述したように担体および／または他の好適な成分を含んでいても良い。特に、パーソナルケア組成物は、酸化防止剤を含んでいても良い。
【００４２】
以下の非限定的な実施例により、本発明を更に説明する。
【００４３】
〔実施例１〕
種々のニキビ抑制組成物（外部の攻撃）に起因する人体の皮膚における酸化的ストレスに関する一連の評価は、以下の通りに行われた。
【００４４】
各々の場合で、一貫した基準の皮膚面を提供するために、３８０ｍｍ２の表面積を有する２２ｍｍの長さのＤ−ＳＱＵＡＭＥテープが、均一の機械的圧力で、被験者の内側の手のひら側の前腕に貼り付けられ、そして皮膚にて１分間放置された。テープが、鉗子で除去され、そして廃棄された。その後、第２のテープが同じ部位に貼り付けられ、そして、皮膚細胞を表面ストリップするために、上述の貼付および除去処理が繰り返された。この第２のテープが、食塩水（ＨＢＳＳ：ハンクス液（Hanks Blanaced Salt Solution））を含む１２穴の組織培養プレートの底部に置かれた。４回の複製が、各被験者に対して行われた。これらのテープは、番号１Ａ：「生成物無し」と標識され、以下に示すように評価された。
【００４５】
上述の処理が繰り返された。しかしながら、第２のテープを貼り付ける前に、１０重量％の過酸化ベンゾイル（Reckitt Benckiser社（イギリス、スラウ）から市販されているClearasil Maximum Strength Acne Treatment Cream）を含む組成物が、被験者の内側の手のひら側の前腕の別の部位に対して１ｃｍ２あたり４ｍｇの表面濃度で局所的に塗布された。かかるテープが、上述したように収集穴に置かれた。類似の処理が、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）の濃度を変更しただけで繰り返された。
【００４６】
番号１Ｂが、１０％の過酸化ベンゾイルに相当し；番号１Ｃが、５％の過酸化ベンゾイルに相当し（Mentholatum Co.（ニューヨーク州オーチャード・パーク）から市販されているOxy Lotion）；番号１Ｄが、２．２５％の過酸化ベンゾイルに相当していた（L' Oreal社（フランス、パリ）から市販されているAcne Response Step 3 Blemish Fighting Lotion）。
【００４７】
皮膚から除去するとき、テープストリップされた細胞が、早速、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ、すなわち、皮膚細胞内でＤＣＦＨに加水分解され、ＲＯＳとの反応時に蛍光性の反応生成物、すなわちＤＣＦを形成するホスト化合物の５μモル溶液中において３０分間に亘って培養された。
【００４８】
組織培養プレートが濯がれて、過剰のＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを除去した。その後、皮膚テープが、Oriel Corp.（コネティカット州ストラトフォード）から市販されている太陽シミュレータで８２ＫＪ／ｍ２に曝露された。その後、ＤＣＦに関して、以下の通りに評価された。各テープが、蛍光プローブを用いて照射した１時間後に正確に分析され、そしてMolecular Devices社（カリフォルニア州サニーベール）から市販されている、４８５ｎｍの励起波長および３５０ｎｍの放射（検出）波長にて設定される、分光蛍光計のプレートリーダーで読み取られた。同じくMolecular Devices社（カリフォルニア州サニーベール）により供給されるＳＯＦＴＭＡＸソフトウエアを使用して測定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告される結果が、以下の表１に示される。
【表１】
【００４９】
驚くべきことに、これらの結果は、本発明の方法にしたがって蛍光性を測定することによって、異なる外部の攻撃に曝露されることにより形成されるＲＯＳの水準、例えば、皮膚に局所的に塗布される酸化化合物の種々の水準を識別することができることを示している。
【００５０】
〔実施例２〕
日焼け止め剤を含む２種類の局所的組成物に関する酸化保護率、ＯＰＦが、以下の通りに測定され、そして比較された。測定は、実施例１に類似の方法で行われた。１１枚の皮膚テープが、評価される各々のサンプル、ならびに２つの対照（以下に記載）に与えられた。皮膚テープが、２２〜５５歳の範囲の年齢で、ＩＩ〜ＩＩＩ型の肌質の男性および女性の被験者から収集された。皮膚テープが、太陽シミュレータにおいて１１０ＫＪ／ｍ２に曝露された。
【００５１】
比較番号２Ａおよび２Ｂに対しては、外部組成物が塗布されなかった。Schering-Plough社（ニュージャージー州ケニルワース）から市販されている、外部組成物のCoppertone Water Babies Spectra 3 SPF 50が、比較番号２Ｄに対して塗布された。以下の外部組成物が、本発明により番号２Ｃに対して塗布された：
【表２】
【００５２】
外部組成物が、５ｃｍ２のプレートあたり５０μＬの生成物の表面被覆率でポリメチルメタクリレートのプレートに塗布された。外部組成物は、環境条件下に置かれて約５〜１０分間に亘って乾燥された。プレートが、組成物を下にして、皮膚細胞を含む特定の組織培養プレートに置かれ、培養された細胞を完全に覆った。サンプル２Ｂ〜２Ｄの細胞が、培養プレート上のＰＭＭＡプレートと一緒に、ＵＶ線量に対して１５分間曝露された。サンプル２Ａは、ＵＶに対して曝露されなかった。番号２Ｃおよび２ＤのＯＰＦＸが、下式を用いて計算された：
ＯＰＦＸ＝１００Ｘ（ＳＮ，ＵＶ−ＳＸ，ＵＶ）／（ＳＮ，ＵＶ−ＳＮ，ＮＵＶ）
但し、ＳＮ，ＵＶは、外部組成物無しで、ＵＶに曝露した場合の蛍光信号を表し、本実施例の場合には、８４．５５であり；
ＳＮ，ＮＵＶは、外部組成物無しで、ＵＶに曝露しない場合の蛍光信号を表し、本実施例の場合には、２７．９９であり；そして
ＳＸ，ＵＶは、外部組成物Ｘに関し、ＵＶに曝露した場合の蛍光信号を表し、本実施例の場合には、５５．０２または６３．８９であった。
【００５３】
結果が、以下の表２に示される。
【表３】
【００５４】
驚くべきことに、結果は、酸化的ストレス、特に、ＵＶ−誘発ＲＯＳにより生成される酸化的ストレスに耐える／妨げる局所的組成物の能力を評価するために、本発明の方法が使用され得ることを示していた。更に、高いＯＰＦにより明らかにされるように、酸化的ストレスからの高い度合いの保護を有する組成物を提供することが可能であった。特に、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約４５％、更に好ましくは少なくとも約５０％のＯＰＦを有するパーソナルケア組成物を提供することが可能であった。
【００５５】
本発明は、その詳細な説明と共に記載されたが、上述の記載は、本発明を説明する目的であって、添付の特許請求の範囲により定められる、本発明の範囲を限定するものではないと理解されるべきである。他の態様、利点、および変更は、特許請求の範囲内にある。
【００５６】
〔実施の態様〕
（１） 哺乳類における酸化的ストレスを評価する方法において、
ａ）前記哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分に曝露するステップと、
ｂ）前記皮膚細胞を外部の攻撃に曝露するステップと、
ｃ）前記易酸化性部分の反応生成物を評価するステップと、
を含み、
前記評価ステップ（ｃ）の前に、前記皮膚細胞は、除去される前記皮膚細胞が生存可能となるように前記哺乳類から非侵襲的に除去される、方法。
（２） 実施態様１に記載の方法において、
前記評価ステップ（ｃ）は、前記反応生成物と関連する電磁信号を測定するステップを含む、方法。
（３） 実施態様１に記載の方法において、
前記反応生成物は、蛍光性反応生成物である、方法。
（４） 実施態様１に記載の方法において、
前記曝露ステップ（ａ）は、前記易酸化性部分を前記皮膚細胞に浸透させる（causes penetration of said skin cells by said oxidizable moiety）、方法。
（５） 実施態様１に記載の方法において、
前記皮膚細胞に対して外部組成物を提供するステップ、
をさらに含み、
前記外部組成物は、酸化防止剤、日焼け止め剤、またはこれらの組み合わせを含む、方法。
（６） 実施態様５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記曝露ステップ（ｂ）の前に、前記皮膚細胞に対して局所的に前記外部組成物を塗布するステップを含む、方法。
（７） 実施態様５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記皮膚細胞の前記哺乳類からの前記非侵襲的除去の前に行われる、方法。
（８） 実施態様５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記皮膚細胞の前記哺乳類からの前記非侵襲的除去の後に行われる、方法。
（９） 実施態様１に記載の方法において、
前記非侵襲的除去は、前記皮膚細胞の表面ストリッピングを含む、方法。
（１０） 実施態様１に記載の方法において、
前記非侵襲的除去は、
前記哺乳類の皮膚表面を接着剤と接触させるステップであって、前記接着剤は、基材に付着されている、ステップと、
前記皮膚表面から前記接着剤を強制的に除去し、これにより、前記皮膚細胞を前記皮膚表面から分離し、前記接着剤と結合させるステップと、
を含む、方法。
【００５７】
（１１） 実施態様１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、前記皮膚細胞により反応性酸素種を生成する、方法。
（１２） 実施態様１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、紫外線、煙、温度、圧力、化学物質、湿度、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
（１３） 実施態様１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、紫外線である、方法。
（１４） パーソナルケア組成物において、
日焼け止め剤、
を含み、
前記組成物は、少なくとも約４０％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
（１５） 実施態様１３に記載のパーソナルケア組成物において、
前記組成物は、少なくとも約４５％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
（１６） 実施態様１３に記載のパーソナルケア組成物において、
前記組成物は、少なくとも約５０％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
（１７） 実施態様１３に記載のパーソナルケア組成物において、
酸化防止剤、
をさらに含む、パーソナルケア組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における酸化的ストレスを評価する方法において、
ａ）前記哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分に曝露するステップと、
ｂ）前記皮膚細胞を外部の攻撃に曝露するステップと、
ｃ）前記易酸化性部分の反応生成物を評価するステップと、
を含み、
前記評価ステップ（ｃ）の前に、前記皮膚細胞は、除去される前記皮膚細胞が生存可能となるように前記哺乳類から非侵襲的に除去される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記評価ステップ（ｃ）は、前記反応生成物と関連する電磁信号を測定するステップを含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記反応生成物は、蛍光性反応生成物である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記曝露ステップ（ａ）は、前記易酸化性部分を前記皮膚細胞に浸透させる、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
前記皮膚細胞に対して外部組成物を提供するステップ、
をさらに含み、
前記外部組成物は、酸化防止剤、日焼け止め剤、またはこれらの組み合わせを含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記曝露ステップ（ｂ）の前に、前記皮膚細胞に対して局所的に前記外部組成物を塗布するステップを含む、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記皮膚細胞の前記哺乳類からの前記非侵襲的除去の前に行われる、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記皮膚細胞の前記哺乳類からの前記非侵襲的除去の後に行われる、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記非侵襲的除去は、前記皮膚細胞の表面ストリッピングを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、
前記非侵襲的除去は、
前記哺乳類の皮膚表面を接着剤と接触させるステップであって、前記接着剤は、基材に付着されている、ステップと、
前記皮膚表面から前記接着剤を強制的に除去し、これにより、前記皮膚細胞を前記皮膚表面から分離し、前記接着剤と結合させるステップと、
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、前記皮膚細胞により反応性酸素種を生成する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、紫外線、煙、温度、圧力、化学物質、湿度、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、紫外線である、方法。
【請求項１４】
パーソナルケア組成物において、
日焼け止め剤、
を含み、
前記組成物は、少なくとも約４０％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のパーソナルケア組成物において、
前記組成物は、少なくとも約４５％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載のパーソナルケア組成物において、
前記組成物は、少なくとも約５０％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
【請求項１７】
請求項１３に記載のパーソナルケア組成物において、
酸化防止剤、
をさらに含む、パーソナルケア組成物。
【請求項１】
哺乳類における酸化的ストレスを評価する方法において、
ａ）前記哺乳類の皮膚細胞を易酸化性部分に曝露するステップと、
ｂ）前記皮膚細胞を外部の攻撃に曝露するステップと、
ｃ）前記易酸化性部分の反応生成物を評価するステップと、
を含み、
前記評価ステップ（ｃ）の前に、前記皮膚細胞は、除去される前記皮膚細胞が生存可能となるように前記哺乳類から非侵襲的に除去される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記評価ステップ（ｃ）は、前記反応生成物と関連する電磁信号を測定するステップを含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記反応生成物は、蛍光性反応生成物である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記曝露ステップ（ａ）は、前記易酸化性部分を前記皮膚細胞に浸透させる、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
前記皮膚細胞に対して外部組成物を提供するステップ、
をさらに含み、
前記外部組成物は、酸化防止剤、日焼け止め剤、またはこれらの組み合わせを含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記曝露ステップ（ｂ）の前に、前記皮膚細胞に対して局所的に前記外部組成物を塗布するステップを含む、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記皮膚細胞の前記哺乳類からの前記非侵襲的除去の前に行われる、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法において、
前記提供ステップは、前記皮膚細胞の前記哺乳類からの前記非侵襲的除去の後に行われる、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記非侵襲的除去は、前記皮膚細胞の表面ストリッピングを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、
前記非侵襲的除去は、
前記哺乳類の皮膚表面を接着剤と接触させるステップであって、前記接着剤は、基材に付着されている、ステップと、
前記皮膚表面から前記接着剤を強制的に除去し、これにより、前記皮膚細胞を前記皮膚表面から分離し、前記接着剤と結合させるステップと、
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、前記皮膚細胞により反応性酸素種を生成する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、紫外線、煙、温度、圧力、化学物質、湿度、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、
前記外部の攻撃は、紫外線である、方法。
【請求項１４】
パーソナルケア組成物において、
日焼け止め剤、
を含み、
前記組成物は、少なくとも約４０％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のパーソナルケア組成物において、
前記組成物は、少なくとも約４５％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載のパーソナルケア組成物において、
前記組成物は、少なくとも約５０％の酸化保護率を有する、パーソナルケア組成物。
【請求項１７】
請求項１３に記載のパーソナルケア組成物において、
酸化防止剤、
をさらに含む、パーソナルケア組成物。
【公開番号】特開２００８−２９２４５２（Ｐ２００８−２９２４５２Ａ）
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−２２５２７（Ｐ２００８−２２５２７）
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（５９８０３９３６７）ジョンソン・アンド・ジョンソン・コンシューマー・カンパニーズ・インコーポレイテッド (79)
【氏名又は名称原語表記】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｎｄｖｉｅｗ Ｒｏａｄ，Ｓｋｉｌｌｍａｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８５５８，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２５２７（Ｐ２００８−２２５２７）
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（５９８０３９３６７）ジョンソン・アンド・ジョンソン・コンシューマー・カンパニーズ・インコーポレイテッド (79)
【氏名又は名称原語表記】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｎｄｖｉｅｗ Ｒｏａｄ，Ｓｋｉｌｌｍａｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８５５８，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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