皮膚リンパ球抗原陽性細胞により仲介される疾患を治療するための方法
本発明は、皮膚リンパ球抗原陽性T細胞で仲介されるかゆみ及び掻痒を患っている患者を治療する方法に関する。特に、接触皮膚炎、薬物誘導遅延型の皮膚アレルギー性反応を含む疾患または障害、中毒性表皮剥離症、皮膚のT細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルス、またはそれらの組み合せを含む疾患または障害は、IL-31アンタゴニストの投与から利益を得るだろう。更に本発明は、治療的に応答的な患者群を予測するための方法も含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
皮膚は免疫系において重要な役割を果たし、複数層から成る。循環Tリンパ球は、正常条件及び炎症条件下で皮膚へ移動する。皮膚のリンパ球抗原(CLA)は、皮膚指向性を有するＴ細胞のホーミング受容体と見なされる。Santamaria-Babi, L., Eur. J. Dermatol. 14:13-18, 2004。CLAは糖鎖構造であり、P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1(PSGL-1)という名前の単一細胞表面タンパク質のエピトープとして記憶T細胞上で発現し、そしてT細胞のE-セレクチン（血管内皮上で発現する誘導性接着分子）への結合を促進する。Fuhlbrigge RC,等., Nature 1997; 389:978-81参照。
【０００２】
アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、薬物誘発性アレルギー反応、皮膚指向性ウィルス、及びウィルス関連掻痒、白斑、皮膚のT細胞リンパ腫、円形脱毛症、酒さ、尋常性座瘡、結節性痒疹、及び水疱性類天疱瘡を含む皮膚のいくつかの疾患は、高レベルでCLA+ T細胞を発現することが知られている。かかる皮膚T細胞仲介疾患を治療するための必要性が存在する。
【０００３】
実証されたサイトカインのin vivo活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト、及びサイトカインアンタゴニストの多大な臨床的な可能性、及びそれらの必要性を明らかにする。本発明はかかる疾患を新たに同定されたサイトカインであるIL-31の働きを妨げることにより処置するための方法を提供することによって、それらの必要性を追求する。IL-31がマウスで過剰発現した時、痒みと皮膚炎様兆候をもたらす。皮膚ホーミングT細胞と表皮ケラチノサイトは、共にヒトにおける皮膚疾患の病変に原因があるとされてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記のためのポリペプチド及び本明細書の教示から当業者が明確に理解し得る使用以外のそれらの使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
１つの観点において、本発明は皮膚のリンパ球抗原陽性T細胞によって特徴付けられる罹患皮膚を有する哺乳動物にアンタゴニスト分子を投与することを含んで成る罹患皮膚を治療するための方法を提供する。当該アンタゴニスト分子は、配列番号：２または配列番号：４で示すようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに特異的に結合するので、アンタゴニスト分子の投与によって、当該罹患皮膚を改善、予防、阻害、または減少させる。ある態様では、患者は接触皮膚炎、薬物誘導遅発型皮膚アレルギー反応、中毒性表皮剥離症、皮膚T細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、 円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスから選定される皮膚疾患を有する。更なる態様では、哺乳動物はヒトである。他の態様では、アンタゴニストは抗体または抗体フラグメントである。更なる態様では、アンタゴニスト分子は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに特異的に結合する。他の態様では、罹患皮膚は掻痒性である。
【０００６】
他の観点では、本発明はアンタゴニスト分子を皮膚のリンパ球抗原陽性T細胞で特徴付けられる掻痒を有する哺乳動物に投与することを含んで成る方法を提供する。当該アンタゴニスト分子は、配列番号：２または配列番号：４で示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合するので、当該アンタゴニスト分子を投与することによって、掻痒を改善、予防、阻害、または減少させる。ある態様では、掻痒は、接触皮膚炎、薬物誘導遅延型皮膚のアレルギー性反応、中毒性表皮剥離症、皮膚のT細胞 リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスから選定される皮膚疾患に付随する。更なる態様では、哺乳動物はヒトである。更なる態様では、アンタゴニストは抗体または抗体スラグメントである。更なる態様では、アンタゴニスト分子は配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。
【０００７】
他の観点では、本発明はIL-31アンタゴニスト治療を必要とする個体におけるIL-31アンタゴニストに対する治療的応答を予測するための方法を提供する。IL-31アンタゴニスト治療とは、患者から生物学的サンプルを得ること、循環皮膚リンパ球陽性T細胞を当該生物学的サンプルから単離すること、及び単離された皮膚リンパ球陽性T細胞からIL-31産生を検出することを含む。ある態様では、IL-31はIL-31アンタゴニストに特異的に結合することによって検出される。更なる態様では、IL-31アンタゴニストは、抗-IL-31抗体または抗体フラグメントである。他の態様では、アンタゴニスト分子は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。他の態様では、IL-31アンタゴニスト治療を必要とする個体は、接触皮膚炎、薬物誘導遅延型皮膚アレルギー反応、中毒性表皮剥離症、皮膚T細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスから選定される皮膚疾患を有する。他の態様では、当該方法は、皮膚リンパ球抗原陽性T細胞を刺激するまたは活性化する更なるステップを含んで成る。更なる態様では、IL-31はIL-31アンタゴニストと特異的に結合することによって検出される。他の態様では、IL-31アンタゴニスト分子は抗-IL-31抗体または抗体フラグメントである。更なる態様では、アンタゴニスト分子は配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明を理解するために役立ち得る以下の用語を定義する：
【０００９】
本明細書で使用される用語"アフィニティータグ"とは、第二のポリペプチドに結合して当該第二のポリペプチドの精製または検出を提供することができる、または当該第二のポリペプチドの基質への結合部位を提供することができるポリペプチドセグメントを意味する。主に、入手できる抗体または他の特異的な結合剤のための任意のペプチドまたはタンパク質は、アフィニティータグとして利用できる。アフィニティータグは、ポリヒスチジントラクト、プロテインA(Nilsson等., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson等., Methods Enzvmol. 198:3, 1991)、グルタチオンSトレンスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988)、Glu-Gluアフィニティータグ(Grussenmeyer等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985)、サブスタンスP、Flag(商標)ペプチド(Hopp等., Biotechnology 6:1204-10, 1988)、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープまたは結合ドメインを含む。一般的に、Ford等., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991を参照。アフィニティータグをコードするDNAは、商業的提供元から入手できる(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ参照)。
【００１０】
本明細書で使用される用語"対立遺伝子多型"とは、同一の染色体座を占める遺伝子の任意の２つ以上の選択的な形態を意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を通じて天然で生じ、且つ個体群中で表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異はサイレント(コードされたポリペプチド中で変化がない)であってよく、または変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。また本明細書で使用される用語、対立遺伝子多型は、遺伝子の対立遺伝子多型によってコードされるタンパク質も意味する。
【００１１】
本明細書で使用される用語"アミノ末端"及び"カルボキシル末端"は、ポリペプチド中の位置を意味する。本明細書では、それらの用語は特定の配列またはポリペプチドの部分への言及で使用され、近位または相対位置を意味することができる。例えば、ポリペプチド中の参照配列に対してカルボキシル末端に位置したある特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するものではない。
【００１２】
用語"相補/アンチ相補対"とは、適宜条件下で、非共有結合的に会合した、安定な対を形成する異質の(non-identical)部位を意味する。例えば、ビオチン及びアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補/アンチ相補対の原型のメンバーである。他の例示的な相補/抗-相補対は、受容体/リガンド対、抗体/抗原(またはハプテンまたはエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対等を含む。相補/アンチ-相補対のその後の解離が所望される場合、相補/アンチ相補対は、好適には＜109 M-1の結合親和性を有する。
【００１３】
用語"ポリヌクレオチド分子の相補体"は、相補的塩基配列及び参照配列と比較して逆方向性を有するポリヌクレオチド分子を意味する。例えば、配列5' ATGCACGGG 3'は、5' CCCGTGCAT 3'に相補性である。
【００１４】
用語"コンティグ"とは、連続した同一のストレッチ(contiguous stretch of identical)または他のヌクレオチドに対する相補配列を有するポリヌクレオチドを意味する。連続配列は"重複(overlap)"と言われ、それらの全体において、またはポリヌクレオチドの部分的なストレッチに沿って、ポリヌクレオチド配列のストレッチを与える。
【００１５】
用語"縮重ヌクレオチド配列"とは、１個以上の縮重コドン(ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較して)を含むヌクレオチド配列を言う。縮重コドンは、ヌクレオチドの多様なトリプレットを含むが、同一のアミノ酸残基をコードする(即ち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【００１６】
使用される用語"発現ベクター"は、直鎖または環状のDNA分子を意味し、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能式に連結される注目のポリペプチドをコードするセグメントを含む。かかる追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を含み、そして１つ以上の複製源、１つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含み得る。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウィルス性DNAから由来し、または両方の要素を含み得る。
【００１７】
用語"単離された"とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から取り除かれることにより、他の外来または所望されないコード配列が存在しなくなり、そして遺伝子操作されたタンパク質産生系の中で使用するために適した形態になることを意味する。かかる単離された分子は、それらの天然の環境から分離されたものであり、且つcDNA及び遺伝子クローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は、通常それらに付随する他の遺伝子は存在しないが、プロモーター及びターミネーター等の天然で発生する5'及び3'非翻訳領域を含み得る。付随領域の同定は、当業者に明白であり得る(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985を参照)。
【００１８】
"単離された"ポリペプチドまたはタンパク質は、血液及び動物組織とは関係なく、その天然環境以外の条件で見出されたポリペプチドまたはタンパク質である。好適な形態では、単離されたポリペプチドは、実質的に他のポリペプチド、詳細には動物起源の他のポリペプチドが存在しない。高純度の形態にある、即ち、純度95％超、より好適には純度99％超のポリペプチドを提供することが好適である。本明細書で使用される場合、用語"単離された"とは、ダイマー等の代替の物理的形態、または代替のグリコシル化または誘導化形態にある同一のポリペプチドの存在を排除しない。
【００１９】
用語"新生物の(neoplastic)"は、細胞について言う場合、新規の増殖及び異常増殖を行う細胞を示す。特に増殖が組織中で非制御且つ進行性である場合、新生物をもたらす。新生細胞は悪性（即ち、侵襲性且つ転移性）または良性のいずれかであり得る。
【００２０】
用語"作用可能式に連結した"とは、DNAセグメントを言う場合、セグメントが一斉にそれらの意図された目的、例えば、転写がプロモーター中で開始し、そしてターミネーターへのコーディングセグメントを介して進行するように機能するために配備されることを示す。
【００２１】
用語"オルソログ"とは、１つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を意味し、ある異なる種から由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的なカウンターパートである。オルソログ中の配列の相違は、種形成の結果である。
【００２２】
"パラログ(Paralogs)"は、有機体によって作られた構造的に関連したタンパク質以外と明確に区別される。パラログは、遺伝子複製を通して起こると考えられている。例えば、α-グロブリン、β-グロブリン、及びミオグロビンは、互いにパラログである。
【００２３】
"ポリヌクレオチド"は、5'から3'末端で解読されるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖、または二重鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNA及びDNAを含み、且つ天然源から単離され；in vitroで合成され、または天然及び合成分子の組み合せから調製され得る。ポリヌクレオチドの大きさは、塩基対(略すと"bp")、ヌクレオチド("nt")、またはキロベース("kb")で表される。本明細書では、後の２つの用語は、単鎖または二重鎖のポリヌクレオチドを表すことができる。当該用語が二重鎖分子に適用される場合、全長を意味するために使用され、そして用語"塩基対"と同等であると理解されるだろう。二重鎖ポリヌクレオチドの二つの鎖は、長さにおいて軽度に異なってよく、そしてそれらの末端は、酵素的開裂の結果として互い違いになってよく；その結果、二重鎖ポリヌクレオチド分子中の全てのヌクレオチドは対にならなくてよいことを当業者は認識するだろう。
【００２４】
"ポリペプチド"は、天然で生産されても、合成的に生産されても、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基のポリマーである。約10個のアミノ酸残基未満のポリペプチドは、通常、"ペプチド"と言われる。
【００２５】
本明細書において使用される用語"プロモーター"は、RNAポリメラーゼの結合と翻訳の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を意味すると当業界において認識されている。プロモーター配列は、常にではないが、一般的に、5'非遺伝子コード領域中に見出される。
【００２６】
"タンパク質"は、１個以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。またタンパク質は糖質基等の非ペプチド成分も含み得る。糖質及び他の非ペプチド性置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加されてよく、そして細胞のタイプにより変化するだろう。タンパク質は、それらのアミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義され；糖質基等の置換基は、一般的に特定されていないが存在し得る。
【００２７】
用語"受容体"は、生物活性分子(即ち、リガンド)に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞に付随するタンパク質を意味する。膜結合受容体は、細胞外リガンド-結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインを含むマルチペプチド構造によって特徴付けられ、それは典型的に情報伝達に関与する。リガンドの受容体への結合は、受容体中の立体配座の変化をもたらし、細胞中のエフェクタードメインと他の分子の間の相互作用の原因となる。この相互作用は、細胞の代謝において次々と変化を導く。受容体-リガンド相互作用に関連する代謝性事象は、遺伝子転写、リン酸化反応、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を含む。一般的に、受容体は膜結合性、細胞質性、または核性；単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、β-アドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、EL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エチスロポエチン受容体及びIL-6受容体)であってよい。
【００２８】
用語"分泌シグナル配列"は、ポリペプチド("分泌ペプチド")をコードするDNA配列を意味し、それは、より大きなポリペプチドの構成部分として、分泌ペプチドが合成される細胞の分泌経路を通って、より大きなポリペプチドを導く。このより大きなポリペプチドは、通常開裂して、分泌経路を通って通過する間に、分泌ペプチドは除去される。
【００２９】
本明細書で使用される用語"スプライス変異体"は、遺伝子からのRNA転写の代替形態を意味する。スプライス変異体は、転写RNA分子中の代替的なスプライス部位の利用を通して天然で起こり、またはまれに独立して転写RNA分子の間も起こり、そして同一の遺伝子から転写された、いくつかのmRNAをもたらし得る。スプライス変異体は変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。また本明細書で使用される用語、スプライス変異体は、ある遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によってコードされるタンパク質を意味する。
【００３０】
不正確な分析方法(例えば、ゲル電気泳動法)によって決定されるポリマーの分子量と長さは、適当な数値であると理解されるだろう。かかる数値が"約"Xまたは"およそ"Xと表現される場合、言及されるXの数値は、正確には±10％であると理解されるだろう。
【００３１】
本明細書で引用される全ての文献は、それらの全体が参考文献によって組み込まれている。
【００３２】
本発明は、疾患、特に皮膚のリンパ球抗原(CLA)陽性T細胞によって仲介される疾患の検出、診断、及び治療において、IL-31ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びアンタゴニストを用いる新規の方法を提供する。本発明は一部が以前に同定されたサイトカインであるIL-31の発見に基づく。IL-31は、皮膚-ホーミングT細胞によって発現するが、腸管-ホーミングT細胞では発現しない。
【００３３】
IL-31は、近年発見された４つの-ヘリックス束サイトカインの構造を有するタンパク質である。このサイトカインは、以前にIL-31として同定され、そして2003年１月２１日付で出願された米国特許出願No. 10/352,554に十分に発表されている。参考文献によって本明細書にその内容の全てが組み込まれた公開された米国特許出願No. 2003-0224487、及びPCT出願WO 03/060090を参照。更にDillon,等., Nature Immunol. 5:752-760、2004を参照。IL-31は、受容体IL-31RA及びオンコスタチンM受容体β(OSMRβ)を含む少なくとも１つの追加のサブユニットに高度に特異性を有するリガンドである。ヒトIL-31に関する天然ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、配列番号：１及び２にそれぞれ示されている。マウスIL-31に関する天然ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、配列番号：３及び４にそれぞれ示されている。ヒトIL-31RAに関する天然のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、配列番号：５及び６にそれぞれ示されている。マウスIL-31RAに関する天然ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、配列番号：７及び８にそれぞれ示されている。ヒトOSMRβに関する天然ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、配列番号：９及び１０にそれぞれ示されている。
【００３４】
IL-31の分泌シグナル配列は、配列番号：２に示すようなアミノ酸残基1(Met)〜23(Ala)を含んで成り、そして成熟ポリペプチドは、アミノ酸残基24(Ser)〜164(Thr)を含んで成る。更に293T細胞から精製されたIL-31のN-末端の配列解析は、配列番号：２で示すようなアミノ酸残基27(Leu)〜164(Thr)を含んで成る成熟ポリペプチドと共に、配列番号：２で示すような残基27(Leu)でN-末端を示した。
【００３５】
上記の通り米国特許公開番号20030224487(参考文献によって本明細書に組み込まれている)で使用される通り本明細書において使用される用語、IL-31はZcytorl71igを意味し、そしてIL-31RA はZcytorl7を意味する。IL-31のためのヘテロダイマー受容体は、2003-0096339(参考文献によって本明細書に組み入れられている)にzcytorl7 (HUGO name、IL-31RA)においても発表されており、それはオンコスタチンM受容体β(OSMRβ)を含む少なくとも１つの追加のサブユニットを形成する。
【００３６】
皮膚ホーミングT細胞及び表皮ケラチノサイトは共にヒトの皮膚疾患の病変に関係があるとされてきた。本明細書で示す通り、IL-31 mRNA及びタンパク質の発現は、アトピー性皮膚炎(AD)患者と正常個体の両方において皮膚ホーミングCLA+ T細胞群を制限するが、免疫組織化学(IHC)によるIL-31、BL-31RAのための受容体の分析は、正常個体と比較してAD罹患由来の皮膚生検中の皮膚のケラチノサイト上に軽度に高いレベルのIL-31RA発現を示唆する。
【００３７】
マウス中で過剰発現したIL-31は、ヒトアトピー性皮膚炎(AD)を象徴する掻痒と皮膚炎の発達もたらす。本明細書で示された免疫組織化学(IHC)試験は、IL-31RAタンパク質が皮膚ケラチノサイトによって発現し、そしてAD患者由来の皮膚生検において浸潤しているマクロファージを見出した。AD患者と正常個体の間の比較は、IL-31RAがADサンプル中の表皮ケラチノサイト上で、高レベルで発現したことを示唆した。正常個体と比較してAD患者の皮膚中でより多くの数で存在した皮膚細胞浸潤物は、IL-31mRNAを発現した。これらの細胞の組織形態学的分析では、IL-31mRNAを発現する皮膚中で皮膚ホーミングT細胞を実証する皮膚リンパ球抗原(CLA)及びCD3に関し、大多数の細胞染色が陽性であるリンパ球系統を示唆した。IL-31に関する末梢血T細胞の分析では、IL-31 mRNA及びタンパク質発現は、AD及び正常ボランティア中のCD45RO+ CLA+ 皮膚ホーミングT細胞に大きく制限される。更にAD患者からの循環CLA+ T細胞は、患者サンプル間に大きなバラツキがあるにもかかわらず、正常個体から由来するCLA+ T細胞と比較して、より高いレベルのIL-31の産生を可能にする。これらの結果は、IL-31発現がADの皮膚炎症及び掻痒の発達に寄与し得ることの強力な証拠を提供する。
【００３８】
本明細書において示す通り、IL-31は、皮膚中で局所的に、且つ皮膚浸潤細胞によって産生される。T細胞による組織中のサイトカインの局所産生は、AD中の病因の主要なメカニズムであると考えられ、そして循環中及び皮膚中で数が増加したT細胞は、疾患と相関すると考えられる。
【００３９】
AD患者及び正常コントロールは共に活性状態にあるIL-31を発現する循環CLA+ T細胞を有するにもかかわらず、AD患者由来のCLA+ T細胞は、正常個体由来の細胞と比較して、より活性化された状態で存在することが報告されている。Akdis M, J Immunol 159:4611-4619,1997参照。結論として、CLA+ T細胞によってIL-31を産生するために要求される刺激の閾値は、皮膚炎患者とコントロール対象で相違し得る。本明細書で示す通り、抗-CD28が存在しない中で、準最適濃度の抗-CD3による刺激の24時間後、AD患者由来の循環CLA+T細胞は、正常個体由来の細胞と比較して、より高いレベルのIL-31を産生する能力を有する。個々のAD患者由来のCLA+ T細胞によって産生されるIL-31レベルのバラツキのせいで、AD個体と正常個体の循環CLA+ T細胞からのIL-31産生の平均値において有意な差が存在しない。それでもなお正常個体と比較して、より多くのCLA+ T細胞がAD患者の皮膚に局在しているので、AD皮膚の微環境中で増加したIL-31活性能が存在する。
【００４０】
実施例8は、少数のAD患者由来の循環CLA+ T細胞は、正常個体由来の細胞と比較して、より高いレベルのIL-31を産生することを実証する。本明細書で提供されるバイオアッセイを用いる、または血中の循環T細胞によって産生されるIL-31を検出するための任意のアッセイによるかかるサブ個体群の患者におけるIL-31の検出は、IL-31アンタゴニストが炎症を引き起こすIL-31が存在する疾患の治療に有用であるかどうかを決定するために有用であり得る。
【００４１】
他の成長因子が存在しない中で生存及び成長するための経路につながるOSMRβ及びIL-31RAに依存する細胞株は、IL-31の活性を測定するために使用され得る。かかる成長因子依存性細胞株は、BaF3、FDC-Pl、及びMO7eを含む。BaF3細胞株についての情報は、Palacios及びSteinmetz(Cell 41: 727-734, 1985)及びMathey-Prevot等., (Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986)を参照する。FDC-Pl細胞株に関する情報は、Hapel等. (Blood 64: 786-790, 1984)を参照する。MO7e細胞株に関する情報は、Kiss等., (Leukemia 7: 235- 240, 1993)を参照する。
【００４２】
OSMRのアミノ酸配列、及びクラスIサイトカイン受容体サブファミリーに属するコードされた受容体を示すIL-31RA受容体は、制限されずにIL-2、IL-4、IL-7、Lif、IL-12、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF及びG-CSFの受容体を含む(Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" Cytokine 5(2): 95-106, 1993参照)。IL-31RA受容体は、PCT特許出願No.US01/20484 (WIPO公開No. WO 02/00721)に完全に発表されている。IL-31RA受容体のmRNAの組織分布の分析は、活性化CD4+及びCD8+ T-細胞サブセット、CD 14+ 単球における発現、及びCD19+ B-細胞におけるより弱い発現を明らかにした。更に、mRNAは静止したまたは活性化単球細胞株THP-I(ATCC No. TIB-202)、U937 (ATCC No. CRL-1593.2)及びHL60 (ATCC No. CCL-240)の両方において存在した。
【００４３】
IL-31は４つの-αヘリックス構造とみなされている。配列番号：２で見られるヒトIL-31アミノ酸配列について言えば、IL-31ヘリックスAは、アミノ酸残基38-52で定義され；ヘリックスBはアミノ酸残基83-98で定義され；ヘリックスCはアミノ酸残基104-117で定義され；及びヘリックスDはアミノ酸残基137-152で定義され、且つIL-31中で保存されたシステイン残基は、本明細書に記載された配列番号２のアミノ酸残基72、133、及び147に相当し；及び配列番号８のアミノ酸残基74、137、及び151に相当する。またIL-31中で高度に保存されるのは、配列番号：２に示される残基４３のGIu残基である。
【００４４】
すでに同定されているマウスオルソログのIL-31に関するポリヌクレオチド配列は配列番号：３に示され、そして対応のアミノ酸配列は配列番号：４に示されている。配列番号：４のIL-31マウスサイトカインアミノ酸配列については、ヘリックスAがアミノ酸残基38-52で定義され；ヘリックスBがアミノ酸残基85-98で定義され；ヘリックスCがアミノ酸残基104-118で定義され；そしてヘリックスDが141-157のアミノ酸配列で定義される。マウスIL-31に関する成熟配列は、配列番号：４に示される通り、推測上Met1で始まり、それはヒト配列の配列番号：２に示されるMet1に相当する。組織分析は、マウスIL-31の発現が睾丸、脳、CD90+ 細胞、前立腺細胞、唾液腺及び皮膚において見出されることを明らかにした。更に293T細胞由来の精製IL-31のN-末端配列解析は、アミノ酸残基31(Ala)〜163(Cys)を含む成熟ポリペプチドを有する配列番号：４に示される残基31 (Ala)でN-末端を示した。
【００４５】
IL-31は、染色体12の12q24.31領域に位置する。従って、本発明は診断的適用における用途が見出される試薬も提供する。例えば、IL-31遺伝子、IL-31 DNAまたはRNAを含むプローブまたはそれらのサブ配列は、IL-31遺伝子が染色体12等のヒト染色体上に存在するかどうか、または遺伝子突然変異が生じたかどうかを測定するために使用することができる。IL-31遺伝子座で検出可能な染色体異常は、制限されずに、異数性、遺伝子複製数の変化、ヘテロ接合性の消失(LOH)、転座、挿入、欠失、制限部位の変化及び再配列を含む。かかる異常は、PCR技術、及び他の遺伝子連鎖解析技術を用いる当業界において公知の制限断片長多型(RFLP)解析、短縦列反復(STR)解析等の分子遺伝学的技術を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る(Sambrook等, ibid.；Ausubel等, ibid.；Marian, Chest .108:255-65, 1995)。染色体異常の検出は、密接に関連する皮膚のリンパ球抗原を有する疾患のために特に重要であり得る。従って、本発明は、IL-31遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを含むIL-13遺伝子における変化を検出するための方法を含む。
【００４６】
本発明に係るタンパク質(またはそれらのポリペプチドフラグメント)は、他の生物活性分子、特に他のサイトカインに結合し、多機能性分子を提供することができる。例えば、IL-31由来の１以上のらせんは、他のサイトカインと結合し、それらの生物学的特質または産生能を増強させることができる。
【００４７】
更に本発明は、CLA陽性T細胞によって仲介される疾患において、本発明において開示されたIL-31ポリペプチドのエピトープ担持部分を含むポリペプチドフラグメントまたはペプチドを検出するための用途を提供する。かかるフラグメントまたはペプチドは、タンパク質全体が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の部分である"免疫原性エピトープ"を含み得る。免疫原性のエピトープ担持ペプチドは、標準的な方法を用いて同定され得る(例えば、Geysen等.. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)参照)。
【００４８】
対照的に、ポリペプチドフラグメントまたはペプチドは、抗体が特異的に結合し得るタンパク質分子領域である"抗原エピトープ"を含み得る。所定のエピトープは直鎖またはアミノ酸の連続的なストレッチ(contiguous stretch)から成り、及びかかるエピトープの抗原性は、変性剤によって崩壊しない。タンパク質のエピトープを真似ることができる比較的に短い合成ペプチドを使用して、このタンパク質に対する抗体の産生を刺激することができることは、当業界において公知である(例えば、Sutcliffe等., Science 219:660 (1983)を参照)。従って、本発明の抗原性エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、本明細書で発表したポリペプチドと結合する抗体を発生させるのに有用である(例えば、抗体を中和する)。Hopp/Woods親水性プロファイルは、最大の抗原能を有する領域を決定するために使用され得る(Hopp等., 1981, ibid, 及びHopp, 1986, ibid)。例えば、ヒトIL-31における親水性領域は、配列番号：２のアミノ酸残基54-59、配列番号：２のアミノ酸残基129-134、配列番号：２のアミノ酸残基53-58、配列番号：２のアミノ酸残基35-40、及び配列番号：２のアミノ酸残基33-38を含む。例えば、マウスIL-31において、親水性領域は配列番号：４のアミノ酸残基34-39、配列番号：４のアミノ酸残基46-51、配列番号：４のアミノ酸残基131-136、配列番号：４のアミノ酸残基158-163、及び配列番号：４のアミノ酸残基157-162を含む。
【００４９】
抗原性エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、好適には、配列番号：２または配列番号：４の少なくとも４〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜１４個のアミノ酸、または約１４〜約３０個のアミノ酸を含む。かかるエピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、本明細書で発表されるように、IL-31ポリペプチドを寸断することによって、または化学的ペプチド合成によって産生され得る。更に、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイによって選択され得る(例えば、Lane及びStephen. Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993);及びCortese等, Cure. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)参照)。エピトープを含む小ペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を産生するための標準化方法は、例えば、Moleによる"エピトープマッピング"方法 Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), ページ105-116 (The Humana Press, Inc. 1992)；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," Monoclonal Antibodies：Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter及びLadyman (eds.),ページ60-84 (Cambridge University Press 1995)、及びColigan等. (eds.), Current Protocols in Immunology, ページ9.3.1-9.3.5及びページ9.4.1-9.4.11(John Wiley & Sons 1997)に発表されている。
【００５０】
本発明のIL-31ポリペプチドは、全長ポリペプチド、機能的フラグメント、及び融合ポリペプチドを含み、当業界において周知の方法及び米国特許出願No. 2003-0224487、及びPCT出願WO 03/060090に発表された方法によって産生、精製及びリフォールドされ得る。本発明のポリペプチドの好適な純度は、純度≧80％、より好適には純度≧90％、更により好適には純度≧95％であり、そして特に好適には医薬的に純粋な状態であり、それは混入している巨大分子、特に他のタンパク質及び核酸に関し、且つ感染性物質及び発熱性物質が存在しない、純度99.9％超である。好適には、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチドが実質的に存在せず、特に動物起源の他のポリペプチドが存在しない。
【００５１】
本発明は、細胞微環境中の炎症を減少、阻害、または予防するための抗-IL-31抗体を含むIL-13アンタゴニストを用いる方法を提供する。ここでの微環境中の１個以上の細胞はT細胞であり、皮膚リンパ球抗原に陽性である。更に本発明は、細胞微環境中のかゆみ及び掻痒を減少、阻害、または予防するための抗-IL-31抗体を含むIL-31アンタゴニストを使用するための方法を提供する。ここでの微環境中の1個以上の細胞はT細胞であり、皮膚リンパ球抗原に陽性である。
【００５２】
単離及び精製することができるIL-31抗原による動物への予防接種によって産生される免疫応答由来の抗体は、当業界において公知であり、本明細書で発表される。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製及び単離するための方法は、当業界において周知である。例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan,等. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook等., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989；及びHurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982参照。
【００５３】
本明細書で使用される用語"抗体"は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合フラグメント、例えばF(ab')2及びFabタンパク質分解性フラグメント等を含む。遺伝子操作されたインタクト抗体またはフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフラグメント、単鎖抗体等、また合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた含まれる。非ヒト抗体は、非ヒトCDRをヒトフレームワーク上及び不変領域に移植することによって、または全非ヒト可変ドメインを導入することによってヒト化され得る(任意に曝された残基を置換することによって、ヒト様表面を有するものを"クローキング(cloaking)"する。ここでの結果物は"ベニア化(veneered)"抗体である)。いくつかの例では、ヒト化抗体は、ヒト可変領域フレームワークドメイン中に非ヒト残基を保持し、適度な結合特質を増強し得る。ヒト化抗体を通して、生物学的半減期は増加されてよく、そしてヒトへの投与による有害な免疫反応の可能性は減少される。更にヒト抗体は、WIPO公報No. WO 98/24893において開示された通り、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック、非ヒト動物において産生され得る。これらの動物における内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同組換え体等によって不活性化または失効されることが好適である。
【００５４】
抗体は、1) それらが結合活性の閾値を示す場合、且つ2) それらが関連のポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合に、特異的に結合すると見なされる。結合の閾値は、本明細書における抗-IL-31抗体が、IL-31ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープと、少なくともコントロール（非IL-13）ポリペプチドと比べて10倍超の親和性で結合する場合に測定される。当該抗体は好ましくは106M-1以上、好適には107M-1以上、より好適には108M-1以上、そして最適には109M-1以上の結合親和性(Ka)を示す。抗体の結合親和性は、通常の当業者によって、例えば、Scatchard analysis (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949）を用いて容易に決定され得る。
【００５５】
IL-31に対する抗体は；親和性精製によってIL-31を単離するため；IL-31ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのため；内在する病変または疾患のマーカーとして可溶性IL-31を検出するためまたは定量するため；FACSを採用する分析法において；発現ライブラリーをスクリーニングするため；抗-イディオタイプ抗体を産生するため；及びin vitro及びin vivoでIL-31の活性を遮断するための中和抗体として、またはアンタゴニストとして、IL-31を発現する標識細胞に使用され得る。適切な直接標識またはラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等を含み；間接標識またはラベルは、中間体としてのビオチン-アビジンまたは他の相補/抗-相補対の使用を特色とし得る。また本明細書における抗体は、薬物、毒素、放射性核種等に直接的または間接的に接合され、そしてこれらの接合体は診断的または治療的適用に利用され得る。更にIL-31 またはそれらのフラグメントに対する抗体は、例えばウェスタンブロットまたは他の当業界において公知のアッセイ等のアッセイにおいて、in vitroで変性したIL-31またはそれらのフラグメントを検出するために使用され得る。
【００５６】
適切な検出可能な分子は、ポリペプチドまたは抗体に直接的にまたは間接的に付着させることができ、そして放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等を含む。適切な細胞毒性分子は、当該ポリペプチドまたは抗体に直接的にまたは間接的に付着させることができ、そして細菌毒性または植物毒性(例えば、ジフテリア、毒素、サポリン(saporin)、緑膿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、リシン、アブリン等)、またヨウ素-131、レニウム-188またはイットリウム-90等の治療的放射性核種を含み、当該ポリペプチド又は抗体に直接的または間接的に付着させる（当該ポリペプチドまたは抗体に直接付着されるか、または例えばキレート部分を介して間接的に付着させる）。またポリペプチドまたは抗体は、アドリアマイシン等の細胞毒性剤にも接合され得る。検出可能な分子または細胞毒性分子を間接的に付着させるために、当該ポリペプチドまたは抗体部分に結合される他の部材に検出可能な分子または細胞毒性分子を相補/抗相補対の部材と接合させることができる。これらの目的のためのビオチン/ストレプトアビジンは、例示的な相補対/抗相補対である。
【００５７】
結合ポリペプチドはIL-31 "アンタゴニスト"としても作用するので、in vitro 及びin vivoにおいてIL-31結合及びシグナル伝達を遮断することができる。これらの抗-IL-31結合ポリペプチドは、IL-31活性またはタンパク質結合を阻害するのに有用であり得る。
【００５８】
皮膚ホーミングT細胞及び表皮ケラチノサイトは共にヒトの皮膚疾患の病変に関与するとされてきた。T細胞サブセットについて本明細書の実施例１に示す通り、IL-31 mRNA 及びタンパク質発現は、ヒト中の皮膚ホーミングCLA+ T細胞集団に限定される。抗体または受容体アンタゴニストを含むIL-31に対するアンタゴニスト自体は、CLA + T細胞によって仲介される皮膚及び表皮性疾患の治療において有用であるだろう。かかる疾患は、例えば、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬、薬物誘導アレルギー反応、皮膚指向性ウィルス及びウィルスに関連した掻痒、白斑、皮膚のT細胞リンパ腫、円形脱毛症、酒さ、尋常性座瘡、結節性痒疹、及び水疱性類天疱瘡を含む。
【００５９】
アトピー性皮膚炎
アトピー性皮膚炎(AD)は、慢性的に再燃する炎症性皮膚疾患であり、過去数十年間に渡り劇的に増加している事象である。臨床的にはADは、高度に掻痒性でありしばしば剥離されたプラークによって特徴付けられ、そしてプラークは慢性的な再燃経過を示す。ADの診断は、主に大きな臨床的発見及び小さな臨床的発見に基づく。Hanifin J.M., Arch Dermatol: 135, 1551 (1999)を参照。組織病理学では、急性病変における海綿状態、高度且つ局所的錯角化を示すが、顕著で高度な表皮過形成及び角化症、アカントーシス/顆粒層肥厚及びリンパ球による皮膚の血管周囲の浸潤及び豊富な肥満細胞は、慢性病変の顕著な特徴である。
【００６０】
T細胞は組織中の局所免疫応答の開始において中心的な役割を果たし、そしてエビデンスは特に皮膚湿潤性T細胞が、皮膚中の脱制御された免疫応答の開始及び維持において主要な役割を果たし得ることを示唆する。皮膚の炎症性部位において約90％の湿潤T細胞は、表皮上の誘導性接着分子であるE-セレクチンと結合する皮膚のリンパ球関連Ag (CLA+)を発現する(概説Santamaria-Babi L.F.,等., Eur J Dermatol: 14, 13, (2004))。コントロール個体と比べてAD患者での循環CLA+ T細胞の有意な増加は実証され(Teraki Y.,等., Br J Dermatol: 143, 373 (2000)を参照)、他にもAD患者由来の記憶CLA+ T細胞がCLA-個体群と比較して優先的にアレルゲン抽出物に応答することが実証された(Santamaria- Babi, L.F.,等., J Exp Med: 181, 1935, (1995)参照)。ヒトにおいて、皮膚の指向性疾患の病変は、増加したレベルのTh-2-タイプのサイトカイン様IL-5及びIL-13 9、10を発現するCLA+ T細胞の増加と関連してきた。Akdis M.,等., Eur J Immunol: 30, 3533 (2000);及びHamid Q.,等., J Allergy Clin Immunol：98, 225 (1996)を参照。
【００６１】
NC/Ngaマウスは、非-特定病原体不存在(非-SPF)条件で飼育した場合、約6〜8週齢で、経過及びサイン、組織病理学及び免疫病理学を含む多くの観点においてヒトADと同等にAD-様病変を自発的に発達させる。対照的に、SPF条件下で保持したNC/Ngaマウスは、皮膚病変を発達させない。しかしながら、自然発症の皮膚病変の開始とスクラッチング挙動(scratching behaviour)は、SPF施設中で飼育したNC/Ngaマウスにおいて、毎週の粗イエダニ抗原の皮内注入によって同期化され得る。Matsuoka H.,等., Allergy: 58, 139 (2003)を参照。従って、NC/NgaにおけるADの発達は、ADの新規治療を評価するための有用なモデルである。
【００６２】
自然発症ADのNC/Ngaモデルに加え、OVAを用いるマウスの皮膚感作は、感作マウスの皮膚中に浸潤する単核細胞により抗原依存性の表皮及び真皮肥厚を誘導するためのモデルとしても使用することもできる。これは通常、総IgE及び特異的IgEの上昇した血清レベルと一致するが、しかしながら皮膚バリア機能不全または掻痒は、このモデル中で正常に発症しない。Spergel J.M.,等., J Clin Invest, 101: 1614, (1998)を参照。このプロトコールは、OVAを有するDOl1.10 OVA TCRトランスジェニックマウスを感作することによって皮膚バリア脱制御と掻痒を誘導するために改良され得る。感作抗原を認識できる抗原特異的T細胞の数の増加は、皮膚中の炎症レベルを増加させて、明らかなスクラッチング挙動及び皮膚の苔蘚化/スケーリングを誘導し得る。
【００６３】
NC/Nga自然発症ADモデル及びOVA皮膚のDOl1.10モデルは、共にADにおけるIL-31及びIL-31RAの発現を調査するために使用される。実施例3を参照。
【００６４】
1L-31中和アンタゴニストは、アトピー性皮膚炎反応を阻害し、減少し、最小化し、または予防するために有効であり得る。
【００６５】
接触皮膚炎
アレルギー性接触皮膚炎は、皮膚に接触する抗原に対するT細胞仲介免疫反応として定義される。CLA+ T細胞集団は、アレルゲン依存性T細胞応答がCLA+細胞集団に大いに制限されるので、皮膚炎の開始に関与すると見なされる(Santamaria-Babi, L.F.,等., J Exp Med:l81, 1935, (1995)参照)。近年のデータでは、CD8+ T細胞ではなく、記憶(CD45RO+) CD4+ CLA+T細胞のみが増殖し、そして通常の接触過敏性アレルゲンであるニッケルに対する応答においてタイプ-1(IFN-γ)及びタイプ-2(IL-5)サイトカインの両方を産生することが見出された。更に、CD4、CD45RO(記憶)またはCD69との組み合せにあるCLAを発現する細胞は、ニッケル特異的刺激の後に増加し、そしてケモカイン受容体CXCR3、CCR4、CCRlOを発現するが、CCR6は発現しない。Moed H.,等., Br J Dermatol:5l, 32, (2004)を参照。
【００６６】
動物モデルでは、アレルギー性接触皮膚炎がT-細胞依存性であること、及びアレルギー性-応答性T細胞がアレグゲン適用部位に移動することが実証されてきた。一般的に：Engeman T.M.,等., J Immunol: 164, 5207, (2000)；Ferguson T.A. & Kupper T.S. J Immunol: 150, 1172, (1993)；及びGorbachev A. V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol: 21, 451(2001)を参照。CLA+ T細胞はIL-31を産生し、そして皮膚ケラチノサイトのIL-31刺激は、炎症性のケモカインを誘導することができるので、IL-31は接触皮膚炎の病態生理学に関与し得る。実施例2の接触皮膚炎のin vivoモデルを参照。
【００６７】
IL-31中和アンタゴニストは、接触皮膚炎反応を阻害し、減少し、最小化し、または予防することにおいて有効であった。
【００６８】
薬物誘導遅延型皮膚アレルギー性反応
薬物誘導遅延型皮膚アレルギー性反応は非常に雑多であり、且つ多くの明らかな病態生理学的事象を反映し得る。Brockow K.,等., Allergy: 57, 45 (2002)参照。これらの反応に関与する免疫学的メカニズムは、抗体または細胞の介在のいずれかとして示されている。即時薬物アレルギーにおいて、IgEで仲介される抗体反応は、陽性皮膚プリック及び/または皮内試験によって20分後に実証することができるが、薬物に対する非-即時反応は、最後に薬物摂取後、１時間超で発生し得、且つしばしばT細胞で仲介される。非-即時性T-細胞仲介遅延型反応は、例えばペニシリンに対する薬物副作用を有する患者において発生し得る。ペニシリンに対する増殖性T細胞応答は、ペニシリンアレルーギー患者由来の記憶(CD45RO+) CLA+ T細胞の亜集団に限り示されてきたが、CD45RO+ CLA-サブセットは増殖反応がないことを示す。Blanca M., Leyva L.,等., Blood Cells MoI Dis:31, 75 (2003)参照。遅延型過敏性(DTH)反応は、マウスにおいて人工的に再生することができ、DTH応答の開始及び永続化に関与し得る因子の評価を可能にする。IL-31中和アンタゴニストは、遅延型過敏反応を阻害、減少、最小化、または予防するために有用であり得る。DTHのin vivoモデルに関する実施例4を参照。
【００６９】
中毒性表皮剥離症(TEN)は非常に稀だが、極度に重篤な薬物反応は、広範囲な発疹を有する表皮の広範囲に渡るアポトーシスによって特徴付けられる。研究では、リンパ球浸潤性の水膨れはCLA+ T細胞であり、そして表皮ケラチノサイトへの細胞毒性を示し得ることが示された。Leyva L.,等.,. J Allergy Clin Immunol: 105, 157 (2000)；及びNassif A., Bensussan A., 等., J Allergy Clin Immunol:ll4, 1209 2004)参照。OVAがマウスの表皮濾胞ケラチノサイト及び毛髪濾胞ケラチノサイト中のケラチン-5 (K5)プロモーターの制御下で発現するトランスジェニックマウス系は、TENの動物モデルを確立するために作製された。OVA 特異的CD8+ T細胞は、K5-OVAマウスに適合移植される場合、K5-0VAマウスの皮膚脱水リンパ節及び標的皮膚中で活性化及び増殖し、TENに結び付く皮膚病変の発達をもたらす。Azukizawa H.,等., Eur J Immunol: 33, 1879 (2003)参照。IL-31中和アンタゴニストは、TEN反応を阻害し、減少し、最小化し、または予防するために有効であり得る。
【００７０】
水疱性類天疱瘡
水疱性類天疱瘡は、好中球及び好酸球の皮膚浸潤による表皮下水泡として現れる表皮下疾患である。診断は、表皮及び真皮−上皮接合部の特異的接着タンパク質に対する抗原特異的抗体の存在によって特徴付けられる。Jordon R.E.,等., JAMA: 200, 751 (1967)参照。PBL及び皮膚水膨れT細胞を分析することによる水疱性類天疱瘡の発症におけるT細胞の役割を分析するための研究では、増加したレベルのTh2-サイトカイン様IL-4及びIL-13を発現するCLA+ T細胞の優位性が見出された。Teraki Y.,等., J Invest Dermatol: 117, 1097 (2001)参照。水疱性類天疱瘡患者における全身性コルチコステロイドでの治療後のインターロイキン-13-産生細胞はCLA+の頻度が有意に減少するが、CLA-の頻度は減少しない。コルチコステロイド治療後のCLA+細胞の減少は、臨床的な改善に付随する。Teraki, ibid参照。IL-31の中和は、水泡性の類天疱瘡の臨床的予後を改善し得る。IL-31中和アンタゴニストは、水疱性類天疱瘡を阻害し、減じ、最小化し、または予防するために有効であり得る。
【００７１】
円形脱毛症
円形脱毛症(AA)は、毛髪毛包の組織限定自己免疫性疾患と見なされ、毛包活性は、リンパ球浸潤物の継続された活性のせいで阻まれる。無毛の領域でさえ毛包の実際の損失は起こらないが、AAは身体上のどこでも、ところどころに完全な脱毛をもたらす。炎症の臨床サインが存在しないもかかわらず、活動性疾患部位由来の皮膚生検は、CD8+ 毛包内浸潤物と共に、主にCD4+細胞の毛包周囲のリンパ球炎症を示す。Kalish R.S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003)参照。
【００７２】
研究では、頭皮浸潤性のCD4+またはCD8+ リンパ球がCLAを示し、且つAAを有する個体の末梢血中のCLA+ CD4+ またはCD8+ リンパ球のパーセントは、正常コントロールよりも有意に高いことが見出された。更に、重篤または進行性のAAを有する患者は、当該疾患から回復した患者と比較してより高いCLA-陽性を示し、且つCLA+細胞パーセントの減少は、良好な臨床経過に並行する。Yano S.,等., Acta Derm Venereol: 82, 82 (2002)参照。従って、これらの研究は、CLA+ リンパ球がAAで重要な役割を果たすことを示唆する。異種移植モデルは活性化T細胞がAAの発症において役割を果たすことを実証した。ヌードマウスに移植したAA患者由来の病巣の頭皮は、移植片由来の浸潤リンパ球の欠失に対応して、毛髪を再生する。また活性化した病変T細胞のSCIDマウスへの移植は、SCIDマウス上のヒト頭皮外植片に脱毛を移すことができる。Kalish R.S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003)参照。
【００７３】
多様な免疫賦活療法は、この疾患の通常の治療の一環であるが、これらの治療はその効果において一貫性がない。Tang L.,等., J Invest Dermatol: 120, 400 (2003); Tang L.,等., (2004)；及びTang L.,等., J Am Acad Dermatol: 49, 1013 (2003)参照。中和抗-IL-31抗体は、AA発達の効果を制限し、減じ、阻害し、または予防するために有効であり得る。
【００７４】
尋常性座瘡/酒さ
毛嚢脂腺器の疾患である尋常性座瘡は、最も一般的な青年期の皮膚の問題である。毛包性(follicular)角質化における異常は、座瘡病変を生み出すと考えられている。酒さは、赤色丘疹、吹出物、嚢胞、及び広範囲な毛細血管拡張症の存在によって尋常性座瘡から識別されるが、面皰(白にきび)は存在しない。脂腺からの増加した皮脂排出は、尋常性座瘡の病態生理学における主要因子である。また座瘡患者の健常であるように見える腺の周辺の神経末端中で発現する皮脂の炎症性脂質；局所的に産生する多様なサイトカイン；腺周囲のペプチド及び神経ペプチド（脂腺細胞によって産生されるコルチコトロフィン放出ホルモン等）；及びサブスタンスPを含む他の脂腺機能は、座瘡の発達にも付随する。Zouboulis CC. Clin Dermatol: 22, 360 (2004)参照。
【００７５】
尋常性座瘡及び酒さの病態生理学は未知のままであるが、臨床的な観察と組織病理学試験は、毛嚢脂腺の毛包の炎症が酒さ及び尋常性座瘡の発症の中心と成り得ることを示唆する。酒さ病変を浸潤するT細胞サブセットの分析に関する初期の研究は、大部分のT細胞がCD4を発現することを示した。Rufli T. & Buchner S.A. Dermatologica: 169, 1 (1984)参照。
【００７６】
CD4+ T細胞はIL-31を産生し、そしてIL-31発現に関する皮膚のIHC分析は、IL-31が皮脂腺及び汗腺において発現することを示唆する。表皮ケラチノサイトのIL-31刺激は、IL-31が皮膚における炎症性応答に寄与し得ることを示唆する細胞浸潤をもたらすと思われるケモカインの発現を導く。従ってIL-31は酒さ及び尋常性座瘡の病態生理学に寄与し得る。IL-31の中和は、尋常性座瘡及び酒さの臨床的な成果を改善し得る。IL-31中和アンタゴニストは、尋常性座瘡及び酒さを阻害、減少、最小化、または予防するために有効であり得る。
【００７７】
結節性痒疹
結節性痒疹は、難治性の掻痒によって引き起こされる苔癬化したまたは剥離化した結節の発疹であり、その治療は困難である。また慢性的な摩擦は、苔蘚化、及び直線状のすりむきのひっかき傷をもたらし、それらの痒く、ヒリヒリするような皮膚がつつき、えぐられた個体は、痒疹結節として知られる、顕著に肥厚化した丘疹を生み出す傾向にある。結節性痒疹はアトピー性皮膚炎に特異的ではないが、これらの結節を有する多くの患者は、アトピー性反応も有し、それはアレルギー性鼻炎、喘息、または食物アレルギーとして現れる。T細胞は痒疹病変において大多数の浸潤細胞を示し、そしてそれらの病変はしばしばアトピー患者において最も痒い皮膚病変を示す。
【００７８】
小さな知覚皮膚神経中の神経ペプチド様サブスタンスPの枯渇によって掻痒及び疼痛の知覚を妨げるカプサイシン、抗-掻痒性アルカノイドによる結節性痒疹の局所治療は、皮膚病変の除去をもたらす有効且つ安全な投与計画であることが証明された。Stander S.,等., J Am Acad Dermatol:44, 471(2001)参照。カプサイシン治療を用いるNC/Ngaマウスにおけるかゆみ応答の試験は、皮膚炎病変の自然的な発達がほとんど完全に予防されたことを示した。更に血清IgEレベルの上昇は有意に抑制され、且つカプサイシン処理マウスの病変皮膚中の浸潤好酸球数及び肥満細胞数は減少した。Mihara K.,等., Br J Dermatol: 151, 335 (2004)参照。この群からの観察は、スクラッチング挙動が多様な免疫応答を増強することによって皮膚炎の発達に寄与し得ることを示唆するので、かゆみ感及び/またはかゆみに関連したスクラッチング挙動を妨げることがADの治療に有効であり得ることを暗示している。Mihara K., 等., Br J Dermatol: 151, 335 (2004)参照。
【００７９】
IL-31の慢性的な送達は、マウスにおいて掻痒及び脱毛症を導き、その後、皮膚炎に似ている皮膚病変の発達を導き、IL-31が掻痒を導くことを示唆する。Dillon S.R.,等., Nat Immunol: 5, 752 (2004)参照。掻痒及び脱毛症を予防するためにIL-31で処理されたマウスのIL-31の中和は、実施例10で試験された。IL-31の中和は、結節性痒疹の臨床的予後を改善し得る。IL-31中和アンタゴニストは、結節性痒疹を阻害、減少、最小化または予防するのに有用であり得る。
【００８０】
皮膚指向性ウィルス及びウィルス関連掻痒
末梢血中の単純ヘルペスウィルス(HSV)-特異的CD8+ T細胞及びヘルペス病変から回収したHSV-特異的CD8+ T細胞は、高いレベルのCLAを発現するが、非-皮膚-指向性ヘルペスウィルス-特異的CD8+ T細胞はCLA発現を欠く。Koelle D.M.,等., J CHn Invest: 110, 537 (2002)参照。HSV-2反応性CD4+ Tリンパ球もCLAを発現するが、CD8+ T リンパ球で以前に観察されたレベルよりも低いレベルであった。Gonzalez J.C.,等., J Infect Dis: 191, 243 (2005)参照。掻痒は、ヘルペスウィルス感染にも付随してきたが(Hung K. Y.,等., Blood Purif: 16, 147 (1998)参照）、HIV等の他のウィルス性疾患もまた掻痒性の皮膚病変に付随してきた。いくつかの難治性の掻痒は、しばしば紅斑性丘疹の皮膚病変及び高度な好酸球増多症に付随し、いくつかの非アトピー性、HIV-感染患者36人において観察された症状である。Singh F. & Rudikoff D, Am J Clin Dermatol; 4, 177 (2003)；及びMilazzo F., Piconi S.,等., Allergy: 54, 266 (1999)参照。
【００８１】
掻痒を有する皮膚指向性ウィルスとCLA+ T細胞の関連性は、IL-31産生T細胞が、ウィルス性感染の病態生理学に関与し得ることを示唆する。従って、IL-31中和アンタゴニストは、ウィルス関連掻痒を阻害し、減じ、最小化し、または予防するために有効であり、そしてIL-31の中和は、ウィルス関連掻痒の臨床的予後を改善し得る。
【００８２】
IL-31は、GROα、(CXCLl)、TARC (CC117)、MIP3β、(CCL19)、MDC (CCL22)、MIP-3 (CCL23)、MIP-Iβ(CCL4)、及び1-309をコードする遺伝子を含む正常のヒト表皮ケラチノサイト(NHEK)においていくつかのケモカイン及びサイトカイン遺伝子を導くことが示されてきた。。Dillon S.R.,等., Nat Immunol: 5, 752 (2004)参照。TARC及びMDCはCCR4（Th2-型T細胞と関連し、そして末梢血においてCLA+ T細胞によって優位に発現されるケモカイン受容体）と結合する。両ケモカインは、T細胞のAD患者の皮膚への動員に関係があるとされ、これらのケモカインがADの発症に付随した炎症過程に寄与することが示唆されている。IL-31アンタゴニストを投与することによってCLA+ T細胞を介した疾患におけるTARC及びMDCレベルの減少を測定するためのモデルに関する実施例9を参照。
【００８３】
乾癬は、7百万人超のアメリカ人が罹患する慢性的な皮膚状態である。乾癬は新しい皮膚細胞が異常に成長する時に発症し、古い皮膚が十分の速さで剥がれ落ちない場所で、炎症し、膨張し、及び皮膚の鱗屑状斑をもたらす。最も一般的な形態であるプラーク乾癬は、銀白色の鱗を上に乗せた皮膚の炎症斑("病変")によって特徴付けられる。 乾癬はいくつかのプラークに限定され、または広範な皮膚領域に中程度に関与し、最も一般的には頭皮、ひざ、ひじ及び胴体に現れる。それは非常に目立つが、乾癬は接触伝染性の疾患ではない。当該疾患の発症は、罹患組織の慢性的な炎症に伴う。本発明のIL-31RAポリペプチド、溶解性ヘテロ二量体性及び多量体性受容体ポリペプチド、または抗-IL-31抗体または結合パートナー等は、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚及び粘膜性アレルギー、並びに関連疾患における炎症性及び病理学的な影響を減じるための価値のある治療法として供され得る。
【００８４】
乾癬は皮膚のT-細胞仲介炎症性疾患であり、相当な不快症状を引き起こし得る。治療法は存在せず、且つ全ての年齢の人々に影響を与える疾患である。乾癬はヨーロッパ及び北米の人口のおよそ２パーセントが罹患する。軽度な乾癬を有する個体はしばしば局所剤でその疾患を制御することができるが、世界中で百万人を超える患者は、紫外線または全身性免疫抑制療法を要求する。あいにく、紫外線放射の不都合及びリスク並びに多くの治療の毒性がそれらの長期使用を制限する。更に、患者は一般的に乾癬の再発を有し、そしていくつかの場合では、免疫抑制療法を止めた後、すぐにリバウンドする。
【００８５】
当業者は、当業界で公知の方法及び本明細書で開示された方法を使用して、CLA+ T細胞と高い相関を有する疾患中のIL-31を検出することができる。かかる方法は、患者から血液、唾液、または生検等の生物学的サンプルを採取することを必要とし、そしてそれを正常のコントロールサンプルと比較する。組織学的、細胞学的、流動細胞的、生化学的等の方法は、正常コントロールと比較した患者サンプル中のIL-31の相対レベルまたは局在化、或いはIL-31を発現する細胞、すなわち単球を決定するために使用され得る。IL-31発現のレベルの変化(増加または減少)、または単球の数の変化もしくは局在性(例えば、単球細胞が正常に存在しない組織中の単球細胞の増加または浸潤 )は、コントロールと比較して、疾患の指標となるだろう。かかる診断方法は、例えばTARC及びMDCを測定することも含むことができる。かかる方法は、当業者に周知であり、本明細書において開示されている。
【００８６】
IL-31RA受容体ポリペプチド、及びそれらに対する抗体と結合するIL-31ポリペプチドは、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、薬物誘導遅延型皮膚アレルギー反応、中毒性表皮剥離症、皮膚のT細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスの治療において、IL-3IRA含有受容体を介するシグナル伝達を拮抗または遮断するのに有用である。
【００８７】
またIL-31はCLA+ T細胞によって仲介されるリガンドの循環レベルを検出するための診断システム、及びその疾患の検出においても使用され得る。またIL-31はCLA+ T細胞に高い相関を有するリガンドの循環レベルを検出するための診断システム 、及びその疾患の検出においても使用され得る。関連の態様ではIL-31に特異的に結合する抗体または他の物質は、循環IL-31 ポリペプチドを検出するために使用することができ；逆に、IL-31それ自体は、循環または局所的に作用する受容体ポリペプチドを検出ために使用することができる。上昇または低下したレベルのリガンドまたは受容体ポリペプチドは、炎症及び掻痒を含む病理学的条件の指標と成り得る。
【００８８】
一般的に、IL-31抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的健康状態及び過去の病歴のような因子に依存して変化するだろう。当業者は、当業界で公知の方法を用いてかかる投与量、及びそれらの調整を用意に決定することができる。
【００８９】
抗-IL-31抗体の対象への投与は、吸入、 静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、として、局所カテーテルを介するかん流によって、または直接的な病巣注入によって局所的、皮内で可能である。治療用タンパク質を注入によって投与する場合、当該投与は、継続注入または単回もしくは複数回のボーラスによってよい。
【００９０】
更なる投与経路は、経口、経粘膜、経肺、及び経皮を含む。経口送達は、ポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、プロテノイドマイクロスフェア、ポリシアノアクリレートマイクロスフェア、及び脂質基礎系に適している(例えば、DiBase及びMorrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), ページ255-288 (Plenum Press 1997)を参照)。鼻腔内送達の実施可能性は、インスリン投与の様式等によって例示される(例えば、Hinchcliffe及びIllium, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)参照)。IL-31を含む乾燥または液体粒子が調製され、乾燥パウダー分散剤、液体エアロゾル発生器、または噴霧器の補助により吸入され得る(例えば、Pettit及びGombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton等, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999))。このアプローチは、肺にエアロゾル化したインスリンを運搬する持ち運びできる電子吸入器であるAERX糖尿病管理システムによって説明される。試験は、48,000 kDaもの大きさのタンパク質が、低周波の超音波の助けにより、治療濃度で皮膚を介して運搬されたことを示し、それは経皮投与の実行可能性を説明する(Mitragotri等, Science 269:850 (1995))。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、IL-31結合活性を有する分子を投与するための他の手段を提供する(Potts等, Pharm. Biotechnol. .10:213 (1997))。
【００９１】
タンパク質、ポリペプチド、またはIL-31結合活性を有するペプチドを含む医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従い製剤化され得る。それによって、治療用タンパク質は、医薬的に許容され得る担体と共に混合物中に組み合される。組成物はその投与が受容する患者によって耐性であり得るならば、"医薬的に許容され得る担体"であると言われる。殺菌リン酸緩衝生理食塩水は、医薬的に許容され得る担体の一例である。他の適切な担体は、当業者に周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)参照。
【００９２】
治療の目的にために、IL-31結合活性を有する分子及び医薬的に許容され得る担体は、治療有効量で患者に投与される。IL-31結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、及び医薬的に許容され得る担体の組み合せは、投与される量が生理学的に有意であるならば、"治療有効量"で投与されると言われる。ある薬剤の存在が受容患者の生理機能に検出可能な変化をもたらす場合、その薬剤は生理的に有意である。例えば炎症を治療するために使用される薬剤は、その薬剤の存在が免疫応答の少なくとも一部分を軽減する場合、生理学的に有意である。同様に、CLA+ T細胞に仲介される疾患、または CLA+ T細胞に高い相関を有する疾患に付随するかゆみ及び掻痒を治療するために使用される薬剤は、その存在が掻痒またはかゆみ応答の少なくとも１部分を軽減する場合、生理学的に有意である。
【００９３】
IL-31抗体を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で供され得る。液体形態は、注入可能溶液、エアロゾル、液滴、位相溶液及び経口懸濁物によって説明される。例示的な固体形態は、カプセル剤、錠剤、及び徐放形態を含む。後者の形態は、ミニ浸透圧ポンプ及びインプラントによって説明される(Bremer等, Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery,"、Drug Delivery Systems, Ranade及びHollinger (eds.),ページ95-123 (CRC Press 1995); Bremer等, "Protein Delivery with Infusion Pumps,"Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.),ページ239-254 (Plenum Press 1997); Yewey等, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,"Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.),ページ93-117 (Plenum Press 1997))。他の固体形態は、クリーム、ペースト、他の位相適用等を含む。
【００９４】
IL-31結合活性を有するポリペプチドは、タンパク質マイクロカプセル化の標準技術を用いてリポソーム中に封入され得る(例えば、Anderson等, Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson等, Cancer Res. 50:1853 (1990),及びCohen等, Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving等 "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," Liposome Technology, 2nd Edition, Vol.III , Gregoriadis (ed.), ページ317 (CRC Press 1993), Wassef等, Meth. Enzymol 149:124 (1987)を参照)。上記のような治療的に有用なリポソームは、多様な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen等, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【００９５】
他の投与形態は、例えば、Ansel及びPopovichによる、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.)、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、及びRanade及びHollingerによる、Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)に示す通り、当業者によって考え出され得る。本発明は、以下の限定的はない実施例によって更に説明される。
【実施例１】
【００９６】
刺激によりIL-31を発現するヒト一次T細胞型の決定
A. 試験対象と生検の選定
ADを有する12人の患者(中等度から重度な疾患；年齢の中央値は32歳であり、5〜45％の皮膚浸潤を有する)、乾癬を有する6人の患者(年齢の中央値は56歳であり、10〜65％の皮膚浸潤を有する)及び12人の健常人(年齢の中央値は34歳)をインフォームドコンセントの後、A試験に含めた。任意の全身性コルチコステロイドを以前に受けていた患者はいない。全ての患者は、彼らの皮膚生検または採血を行う前の一週間は局所性コルチコステロイドを絶った。２mmのパンチ生検を1)発症から３日未満の急性紅斑AD病変、2)２週間を超える慢性、苔癬化AD病変、3)慢性乾癬病変、及び4)正常皮膚から採取した。この皮膚サンプルを免疫組織化学またはウェスタン及びイムノドットブロッティングのために-70℃で素早く凍結した。
【００９７】
B. 一次ヒトT細胞サブセットの単離及び活性化：
多様なT細胞サブセットを単離するために、ドナー由来のヒトPBMCsを標準のFicoll 勾配遠心分離を用いて単離した。そして全てのT細胞を、製造業者の指示に従いT細胞単離キットII (Miltenyi Biotec)を用いて単離した。分離効率は、標準のフローサイトメトリーを用いて評価し、そして＞95％のT細胞があることを決定した。CD45RO+ "記憶" T細胞からCD45RA+ "未感作"T細胞を分離するために、全てのT細胞集団を抗-CD45ROマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)と共に、15分間、+4℃で培養し、そして製造業者の指示に従い磁気的に分離した。未感作及び記憶T細胞集団をフローサイトメトリーにより＞90％の純度であることを測定した。
【００９８】
CD45RO+記憶T細胞はしばしば組織特異的であり、そして皮膚のリンパ球抗原(CLA)は皮膚ホーミングT細胞を、表面でα4/β7を発現している腸管ホーミングT細胞から識別するために使用される。IL-31を産生する細胞の型を決定するために、CLA+ T細胞を全てのT細胞から単離し、活性化及び条件化した培地をIL-31バイオアッセイのために収集した。これを行うために、全てのT細胞を単離し、その後、氷上で、20分間、1 mL の抗-CLA-FITC抗体(PharMingen)の1：50希釈物中で培養した。その後細胞を洗浄し、MACS緩衝剤中で再懸濁し、そして抗-FTTCマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)と共に、15分間、+4℃で培養した。その後、細胞を洗浄し、再懸濁し、そしてLSカラムで、製造業者の指示に従い、磁気的に分離した。ラベル化したT細胞を、後に＞80％の純度であることを測定したが、CLAが枯渇したT細胞は、＞98％がCLA-であった。CLA+及びCLA- T細胞は、共に収集され、そして同時に培養された。
【００９９】
CD45RA+及びCD45RO+ T細胞サブセットを活性化するために、細胞を、一晩、2.0 μg/mLの抗-CD3抗体(Southern Biotechnology)であらかじめ処理した24ウェル組織培養プレート中で培養した。細胞を2.5x106細胞/mLの濃度で、組織培養培地(RPMI、5％ウシ胎仔血清、L-グルタミン及びピルビン酸ナトリウム(全てGibco))中に播種し、2.0μg/mLの抗-CD28(Southern Biotechnology)を補充し、そして＋37℃の培養器に置いた。４時間後、ウェルの半数を採取し、細胞をペレット化し、そしてIL-31バイオアッセイの時まで、培地を-20℃に凍結する条件にした。
【０１００】
CLA+及びCLA- T細胞サブセットは、2.0μg/mL抗-CD3 抗体(Southern Biotechnology)で予め処理した48ウェル組織培養プレート中で同様に活性化した。細胞を16時間または24時間、+37℃の培養器中で、6.25x105細胞/mLの濃度で活性化した。サンプルを採取し、細胞をペレット化し、そしてIL-31バイオアッセイの時まで-20℃で凍結する培地に条件化した。準最適な活性化のために、CLA+ T細胞を、0.5 μg/mlの抗-CD3抗体で予め処理したプレート中で培養した。
【０１０１】
C. ヒトIL-31バイオアッセイプロトコール：
hIL-31RA、hOSMRB、及びKZ134(転写活性化ルシフェラーゼレポーターの単一のトランスディーサー及びアクチベーター)でトランスフェクトしたBAF3細胞を、5x105及び1x106細胞/mLに育てた。細胞をアッセイ培地で洗浄し(RPMI 1640、10% FBS, L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、及びPen/Strep(全てGibco))、そしてアッセイ培地中で、3x105細胞/mLで再懸濁した。96ウェル不透明プレート(opaque plate)中で、100μL/ウェルを介するアッセイ培地の1：2の連続希釈において、hIL-31標準品を 600 pg/mL〜9.38 pg/mLの複製(duplicate) 中で滴定した。品質コントロール標準品を100μL 中の350 pg/mL及び35 pg/mLでのプレートに対する複製の中に付加した。試験サンプルを1：2または1：4に頻繁に希釈し、そして同一のサンプルウェルに対する複製中に付加した。その後、3x104細胞/ウェルの最終濃度にするために、100 μLの洗浄したBAF3細胞を個々のウェルに付加した。その後、当該プレートを、16-24時間、+37℃で、5％のCO2培養器中で培養した。その後、プレートを1200RPMで、５分間遠心し、培地をはじき飛ばし、そして25μL/ウェルの溶解緩衝剤(Promega)を各ウェルに付加した。10分後、当該プレートを照度計(Berthold)上で読んだ。照度計は、40μL/ウェルのルシフェラーゼ基質混合(Promega)を付加され、そして4秒間発光をまとめた。発光値は１mLの容量ごとに106個の細胞ごとに解析されて、そしてIL-31がピコグラムに変換される集計表に運ばれた。データは表１に要約されている。
【０１０２】
D. IL-31バイオアッセイの結果：
CD45RA+及びCD45RO+ T細胞サンプルからの結果は、1L-31が活性化CD45RO+ 記憶T細胞によって一次的に産生されたことを明らかにした。両ドナー由来のCD45RA+ 及びCD45RO+ T細胞は、刺激されなければ、検出可能なIL-31を産生しなかった。しかしながら、両ドナー#3及び#4由来のCD45RO+ サンプルは、プレートに結合した抗-CD3及び溶解性の抗-CD28(それぞれ110.4pg/106細胞/mL及び145.6 pg/106細胞/mL)により24時間活性化した後、有意なレベルのIL-31を産生した。反対に、ドナー#3及び#4からのCD45RA+ T細胞が抗-CD3及び抗-CD28により活性化された場合、それらは、非常に低い量のIL-31（それぞれ13.1 pg/106細胞/mL及び12.7 pg/106細胞/mL）を産した。
【０１０３】
CLA+及びCLA- T細胞サンプルは、IL-31が活性化CLA+ T細胞によってほとんど完全に作られるようだということを明らかにした。両ドナーのCLA-個体群のT細胞(未感作T細胞、α4/β7 腸管ホーミング記憶T細胞、及び組織中立T細胞を含む)は、時点または活性化状態でも、検出可能なレベルのIL-13を産生しなかった。一方、当該CLA+ T細胞は、 2.0μg/mLのプレートに結合した抗-CD3抗体により刺激した場合、非常に高いレベルのIL-31を産生した。ドナー#5は、1385.7 pg/106細胞/mLのIL-31を16時間で産生し、そして＞1920 pg/106細胞/mLのIL-31を24時間で産生した。ドナー#6は、121.3 pg/106細胞/mLのIL-31を16時間で産生し、そして328.9 pg/106細胞/mLのIL-31を24時間で産生した。T細胞サブセットについてのこれらの結果は、IL-31が標準的な活性化条件下にある皮膚の(CLA+)T細胞によって特異的に作られるようであることを明確に実証する。
【０１０４】
【表１】
【実施例２】
【０１０５】
接触過敏症の発症と永続化におけるIL-31の関与
A. 方法I
アセトン：オリーブオイル(4：1)溶液中に溶解した25μlの0.5％DNFB(2,4, ジニトロ-フルオロ-ベンゼン, Sigma, St. Louis MO)を、分注器を用いて、BALB/cマウスの毛を剃った中央背部に塗布した。ビヒクルコントロール群は、25μlのアセトン：オリーブオイルのみを受けた。5日後、マウスを吸入チャンバー中でイソフルオラン麻酔にかけ、そして実験動物及びコントロール動物の耳介を、技術者用のマイクロメーター(Mitutoyo)で計測し、評価基準を得る。その後、全てのマウスのそれぞれの耳の両側部をアセトン：オリーブオイル(4:1)中の10 μlの0.25% DNFBに適用させることを試みる。接触過敏症は、後に、24時間及び48時間で右耳(変化した)及び左耳(変化しない)の違いとして測定する。全ての測定は、技術者用のマイクロメーターで行われる。基準値は、未感作マウスの変化した耳及び未変化の耳の間の耳の脹れの違いで決定される。
【０１０６】
FACS及び/またはELISA分析のための全血及び血清は殺す前に集め、そして耳は組織学用に収集される。
【０１０７】
方法II(Th2応答の誘導)
1：1のアセトン/フタル酸ジブチル(MSDS入手可能)の溶液中の100μlの0.5% FTTC (フルオレセインイソチオシアネート)を、分注器を用いて、1、2及び8日目に、BALB/cマウスの毛を剃った中央背部に塗布する。13日目にマウスに吸入チャンバー中でイソフルオラン麻酔をかけ、そして実験動物及びコントロール動物の耳介を、技術者用のマイクロメーター(Mitutoyo)で計測し、評価基準を得る。マウスのそれぞれの耳の背面部を0.5% FTTC（1：1のアセトン/フタル酸ジブチル)に適用させることを試みる。接触過敏症は、後に、24時間及び48時間で右耳(変化した)及び左耳(変化しない)の違いとして測定する。全ての測定は、技術者用のマイクロメーターで行われる。基準値は、未感作マウスの変化した耳及び未変化の耳の間の耳の脹れの違いで決定される。FACS及び/またはELISA分析のための全血及び血清は殺す前に集め、そして耳は組織学用に収集される。
【０１０８】
方法III (ThI応答の誘導)
25μlの2％のオキサザロン(oxazalone)(4：1のアセトン/オリーブオイル中)を、分注器を用いて、BALB/cマウスの毛を剃った中央背部に塗布する。7日目にマウスに吸入チャンバー中でイソフルオラン麻酔をかけ、そして実験動物及びコントロール動物の耳介を、技術者用のマイクロメーター(Mitutoyo)で計測し、評価基準を得る。マウスのそれぞれの耳の背面部を８μlのオキサザロンに適用させることを試みる。接触過敏症は、後に、24時間及び48時間で右耳(変化した)及び左耳(変化しない)の違いとして測定する。全ての測定は、技術者用のマイクロメーターで行われる。基準値は、未感作マウスの変化した耳及び未変化の耳の間の耳の脹れの違いで決定される。FACS及び/またはELISA分析のための全血及び血清は殺す前に集め、そして耳は組織学用に収集される。
【０１０９】
接触過敏症の発症及び永続性におけるIL-31の関与は、実験の感作段階及び試行段階の両方でIL-31に対する抗体を中和することを用いて試験される。
【実施例３】
【０１１０】
アトピー性皮膚炎におけるIL-31の関与
A. 方法I(NC/Ngaマウスの感作)
雄性NC/NgaマウスをCharles River Laboratories,日本から購入した。当該マウスは、購入時に4週齢であり、そしてSPF隔離条件で、4週間飼育して順応させた。当該マウスがおよそ10〜11週齢になったら抗原感作を開始した。マウスをイソフルオランで麻酔し、そして背中を電気バリカンで剃った。およそ10μgのヤケチョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)(Dp)(Indoor Biotechnologies, Charlottesville, Virginia,特注)抽出物を、５〜６週間ごとに３回、マウスの皮膚病変が発達するまで、首筋に皮下注入した。コントロール動物は、週に３回、皮内に10μlのPBSを受けた。Dp抽出物はMatsuoka等による方法に従い調製されたMatsuoka H.,等., Allergy: 58, 139 (2003)。簡単には、595mgのDp凍結乾燥スペント培養抽出物を、12mLの殺菌PBS(Gibco)に溶解させた。Dpを50mLのFalcon管中のシェーキングロッカー上で30分間混合した。当該抽出物を10分間、2000rpmで回転させ、そして浮遊物を収集し、そして1mLの冷凍バイアル管の中に分量し、そして−20℃で貯蔵した。
【０１１１】
B. 方法II(DOl1.10マウスの感作)
DO11.10トランスジェニックマウスを室内のコロニーで繁殖し、そして9.5〜14週齢で抗原感作を開始した。皮膚感作する前の24時間、マウスをイソフルオランで麻酔し、そして マウスの胴体全て(背中と腹部)を電気バリカンで剃った。その後、当該マウスの背中を、エラスチン外科手術用テープ(Johnson and Johnson)でテープストラップした。1cm2殺菌ガーゼパッチを500μgのオボアルブミン(Calbiochem 32467)または殺菌PBS(Gibco)のいずれかで湿らせ、そしてマウスの左背面にDuoDerm Extra Thin Dressing(ConvaTec 187932)と共に付着させた。その後、当該パッチとドレッシングは、エラスチン外科手術用テープを体にラップし覆うことで、マウスがパッチを取り除いたり、または破壊することができなくした。パッチは7日間付けられ、そして取り除かれた。当該マウスを、皮膚感作の他のラウンドを有す前に、２週間休息させた。マウスは１週間、計３回の感作を受けた。
【０１１２】
結果：
イエダニ感作NC/Nga及びOVA感作DO11.10動物由来の病変及び非病変皮膚におけるIL-31RA発現の免疫組織化学的分析は、IL-31RAがマウスにおける表皮ケラチノサイトによって発現することを示したが、本試験の抗原感作動物とPBS感作動物の間に発現レベルに有意な差異は見出されなかった。
【実施例４】
【０１１３】
遅延型過敏症のIL-31の関与
A. 方法
DTH応答を生み出すために、0日目に、尾基底で、完全なFreund'sアジュバント(CFA、50〜100μlの総容量)中の100 μgの オボアルブミン(OVA)により皮下を免疫化することによってマウスを抗原に対して感作した。1週間後、マウスを吸入チャンバー中でイソフルオラン麻酔にかけ、そして実験動物及びコントロール動物の耳介を、技術者用のマイクロメーター(Mitutoyo)で計測し、評価基準を得た。いかなる静脈にもぶつからずちょうど皮膚の下のマウスの左耳介へPBS中の10μgのOVAを、10μlの総容量で、経皮投与することを試みた。コントロールとしてのマウスも右耳介に10μlのPBSの注入を受けた。 いくつかの場合では、耳にOVAの皮内注入を受けた別のコントロール群は、更に反応を阻害するための陽性コントロールとして局所コルチコステロイドでも処理され得る。試行後の24時間及び48時間に、マウスに麻酔をかけ、そして耳の厚さを測定した。結果は、特異的な耳の脹れ＝実験対象の耳について(24時間目測定−0時間目測定)−ネガティブコントロールの耳について(24時間目測定−0時間目測定)として表した。DTHの特質である硬結(induration)は、感作抗原注入後18時間で検出され、そして24〜48 時間で最大となった。明白な硬結の発症における遅れは、"遅延型"の応答と言われる由縁である。
【０１１４】
B. 結果
IL-31トランスジェニックマウスをDTHについて試験したが、未試行のIL-31トランスジェニック動物における耳の厚さの上昇のせいで、当該試験ではIL-31トランスジェニック動物と野生型のコントロールとの間の比較において、DTHの統計学的に有意な差異を認めることができなかった。IL-31受容体ノックアウト動物も、DTH応答において試験され、そしてDTH応答について、受容体ノックアウト動物と野生型動物の間に有意な差異が観察されなかった。
【実施例５】
【０１１５】
乾癬性及びアトピー性皮膚炎とは関係ない皮膚病変におけるIL-31の免疫組織化学的(IHC)染色
乾癬性、アトピー性とは関係ない皮膚炎及び正常皮膚を、IHCによりIL-31リガンドについて試験した。BHK細胞から成る陽性コントロール細胞を、IL-31でトランスフェクトした。陰性コントロールは(1)非トランスフェクトBHK細胞、(2)典型的な組織及び細胞を正常ウサギ血清を精製したタンパク質Aで染色し、そして通常通り抗体の結合を検出すること、を含んで実施された。抗体試薬は、E5758(ウサギ抗-huIL-31 CEE, Aff. 1.0 mg/mlで精製された)であった。コントロール細胞は、C02-6020：zcytorl7 Lig hu-CEE/21を発現するBHK細胞、及びBHK野生型を含んだ。試験された組織は、急性アトピー性皮膚炎皮膚サンプル、慢性アトピー性皮膚炎皮膚サンプル、影響されていない領域の皮膚サンプル、及び正常のコントロール皮膚サンプル及び他の室内コントロールサンプルを含んだ。
【０１１６】
上記の細胞及び組織は、一晩、10％のNBFで固定され、そして標準的な技術を用いてパラフィンに包埋された。
【０１１７】
組織接着のために、5μMのセクションを61℃で、30分間焼いた。その後、スライドをキシレン中で3X5'に脱ろうし、そして以下の順番で段階的なアルコールを通して再度水分を補給した：100% EtOH 中に2X2'、X95% EtOH中に2x2'、70% EtOH 中に1x2'。スライドをdH20中ですすぎ、その後、熱誘導エピトープ回復(HIER)を20分間蒸気下で行い、その後、20分間、10mM Tris、1mM EDTA、pH 9.0の中で、室温に冷却した。
【０１１８】
スライドをDakoCytomation Autostainer上にのせた。スライドをTBS/Tween緩衝液(TBST)ですすぎ、製造業者により薦められる通りに調製した。内因性のビオチンは、アビジン溶液中で10分間培養することで遮断し、TBST中で洗浄し、その後、ビオチン溶液中で10 分間培養した。スライドをTBST中で洗浄した。タンパク質遮断剤(PBSB)(PBS 中に0.5%の遮断パウダー, Perkin Elmer NEL700001KT)を30分間適用し、そしてスライドをすすいだ。一次抗体を500ng/mlに希釈し、そしてChemMate抗体希釈緩衝剤(part# ADB250, Ventana Medical systems)を60分間適用した。
【０１１９】
組織をTBST中で２回洗浄し、その後、PBSB(カタログ#BA-1000, Vector Labs)中のビオチン化ヤギ抗-ウサギAb、750ng/ml中で45分培養した。スライドをTBST中で2回洗浄した。Vectastain Elite ABC試薬(カタログ#PK-7100, Vector Labs)を45分間培養した。スライドをTBST中で２回洗浄した。シグナルをDAB+ (カタログ#K-3468, DakoCytomation)で10分間、室温で発達させた。その後、組織スライドをヘマトキシリン(カタログ#H-3401 Vector Labs)中で対比染色し、脱水し、そしてVectorMount (カタログ#H-5000, Vector Labs)中でカバースリップした。
【０１２０】
結果：
1)細胞制御：
IL-31でトランスフェクトしたBHK細胞を、IL-31抗体E5758で陽性染色し、他方トランスフェクトしていない細胞はこの抗体に対して陰性であった。同様にトランスフェクトした細胞とトランスフェクトしていない細胞は抗ウサギ血清で陰性であった。
【０１２１】
2) アトピー性皮膚炎皮膚分析：
AD皮膚サンプル中のIL31の染色パターンは、乾癬皮膚について以前に報告されたものと等しく：ケラチノサイト及びCD3陽性T細胞は、IL31に対して陰性に染色された。弱いが汗腺の分泌部分中に上皮細胞の同一染色が存在するが、強力なシグナルは管部分中の内側上皮層においてで観察された。脂腺はIL31に陽性であった。ADと正常皮膚のIL31染色の間に差異は存在しなかった。
【０１２２】
乾癬性、アトピー性とは無関係の皮膚炎及び正常皮膚の免疫組織化学(IHC)染色は、脂腺のホロクリン分泌 においIL-31の強い染色を示した。IL31トランスジェニックマウスの表現型を考えれば、脂腺が毛包の外毛根鞘から上皮芽として作り出されることが興味深い。弱いながら脂腺が観察されたことに加えて、IL-31の単一の染色が汗腺の分泌部分中の上皮細胞中で観察され、そして内側の上皮層中の強いシグナルが汗腺の管の部分において観察された。
【実施例６】
【０１２３】
乾癬性及びアトピー性とは関係ない皮膚炎におけるIL-31RAの免疫組織化学(IHC)染色
乾癬性、アトピー性とは関係ない皮膚炎及び正常皮膚をIHCによりIL-31RAについて試験した。陽性コントロール細胞はIL-31RA及びOSMRで二重にトランスフェクトされたBHK細胞から成る。陰性コントロールは(1)非トランスフェクトBHK細胞、(2)典型的な組織及び細胞を正常ウサギ血清を精製したタンパク質Aで染色し、そして通常通り抗体の結合を検出すること、を含んで実施された。抗体試薬は、E6292(ウサギ抗-huIL-3 IRAs-CEE v.4、1.33 mg/ml)であった。コントロール細胞は、ヒトIL-31RAを発現するC02-5117 BHK細胞、及びヒトOSMR(ペレットにおける総細胞数：3.9 xl06、バイタリティーは＞90％であった)及びC04-1587：BHK野生型(ペレットにおける総細胞数：5 xl06)を含んだ。他の試験された組織は、5の急性アトピー性皮膚炎皮膚サンプル、10の慢性アトピー性皮膚炎皮膚サンプル、10の影響されていない領域の皮膚サンプル、及び正常のコントロール皮膚サンプル及び他の室内コントロールサンプルを含んだ。
【０１２４】
上記の細胞及び組織は、一晩、10％のNBFで固定され、そして標準的な技術を用いてパラフィンに包埋された。
【０１２５】
組織接着のために、5μMのセクションを61℃で、30分間焼いた。その後、スライドをキシレン中で3X5'に脱ろうし、そして以下のように段階的なアルコールを通して再度水分を補給した：100% EtOH 中に2X2'、X95% EtOH中に2x2'、70% EtOH 中に1x2'。スライドをdH20中ですすぎ、その後、熱誘導エピトープ回復(HIER)を、蒸気下で20分間行い、その後、20分間、10mM Tris、1mM EDTA、pH 9.0の中で、室温に冷却した。
【０１２６】
スライドをDakoCytomation Autostainer上にのせた。スライドをTBS/Tween緩衝液(TBST)ですすぎ、製造業者により薦められる通りに調製した。内因性のビオチンは、アビジン溶液中で10分間培養することで遮断し、TBST中で洗浄し、その後、ビオチン溶液中で10 分間培養した。スライドをTBST中で洗浄した。タンパク質遮断剤(PBSB)(PBS 中に0.5%の遮断パウダー, Perkin Elmer NEL700001KT)を30分間適用し、そしてスライドをすすいだ。665ng/ml〜1330 ng/mlに希釈されたIL31RA に関する一次抗体を60分間、ChemMate抗体希釈緩衝剤(part# ADB250, Ventana Medical systems)中に適用した。
【０１２７】
組織をTBST中で２回洗浄し、その後、PBSB(カタログ#BA-1000, Vector Labs)中のビオチン化ヤギ抗-ウサギAb、750ng/ml中で45分培養した。スライドをTBST中で2回洗浄した。Vectastain Elite ABC試薬(カタログ#PK-7100, Vector Labs)を45分間培養した。スライドをTBST中で２回洗浄した。シグナルをDAB+ (カタログ#K-3468, DakoCytomation)で10分間、室温で発達させた。その後、組織スライドをヘマトキシリン(カタログ#H-3401 Vector Labs)中で対比染色し、脱水し、そしてVectorMount (カタログ#H-5000, Vector Labs)中でカバースリップした。
【０１２８】
結果は表２に示す。
表２：ADに関係のある患者及びADに関係のない患者由来の皮膚生検標本の健常ボランティアと比較したIL-31RA に関するIHCの結果
【表２】
【０１２９】
ADの表皮皮膚サンプルではIL31RAのアップレギュレーションはなかった。おそらく、低いパーセンテージのCD3陽性T細胞は、AD皮膚中のIL31RAに陽性であった。試験された全ての皮膚サンプルにおいてCLA陽性細胞が存在した。AD皮膚は、正常またはUADサンプルよりもより多くのCLAが陽性の細胞を有し得る。
【０１３０】
IL-31、IL-31RAの受容体は、管部分と比較して、わずかに高いレベルのIL-31RAタンパク質を実証するエクリン腺の分泌部分に立方体の上皮細胞を有するエクリン汗腺の上皮細胞でも発現した。
【０１３１】
まとめると、これらのデータはIL-31RAがコントロールボランティアとAD患者の両方から由来する上皮ケラチノサイトによって発現することを実証する。しかしながら、AD皮膚生検由来のケラチノサイト上で発現したIL-31RAのレベルは、正常コントロール由来の皮膚生検において観察されたレベルよりも高く、ADに関してはIL-31に対して増加した反応性の可能性を示す。
【０１３２】
IL-31RAは、AD患者由来の皮膚生検中には存在するが、コントロール皮膚生検中には存在しない血管周囲の浸潤細胞のサブセットに発現することも見出された。これらのIL-31RA+細胞は、組織マクロファージマーカーCD68に特異的な抗体によって認識され、これらの細胞は皮膚浸潤組織マクロファージであることを示す。
【実施例７】
【０１３３】
レーザーキャプチャー顕微鏡及びRT-PCRによるIL-31MRNA 解析による皮膚浸潤細胞の単離
AD患者由来の皮膚生検中の皮膚浸潤T細胞の存在は、正常個体と比較して識別される特徴である。IL-31はT細胞関連サイトカインであるので、AD患者由来の組織生検中の皮膚浸潤T細胞におけるIL-31の発現を調査した。まず、正常個体と比較して、AD患者由来の皮膚組織生検中の増加した数のCD3+ T細胞の存在は、IHCによって確認された。表2参照。次に、レーザーキャプチャー顕微鏡は、RT-PCRによりIL-31 mRNAを分析するために、皮膚浸潤細胞を特異的に単離するために使用された。IL-31 mRNAは、急性AD患者由来の皮膚浸潤細胞によって発現した。正常組織では、浸潤細胞は正常に見出されないため、試験できなかった。しかしながら、AD及び正常皮膚の両方に存在する上皮ケラチノサイト層をIL-31 mRNA発現について分析し、そしてより低レベルのIL-31 mRNAが、ADサンプルの上皮ケラチノサイト層と比較して正常サンプルにおいて見出された。内部制御遺伝子(HPRT)と比較したIL-31 mRNA発現の半定量分析は、IL-31 mRNAレベルがADと正常サンプルの間において有意に異ならなかったが、AD患者由来の皮膚により高いIL-31発現への傾向が存在することを示した。
【実施例８】
【０１３４】
IL-31は皮膚ホーミング表現型を有する記憶T細胞によって産生する。
皮膚生検の分析では、IL-31 mRNAを発現する皮膚中の浸潤CD3+ T細胞が、皮膚ホーミングマーカーである皮膚のリンパ球抗原(CLA)を発現することを確認した。正常ヒト皮膚末梢血における総T細胞集団のIL-31発現は、CD45RA+ 天然T細胞集団とは反対にCD45RO+ 記憶/エフェクター細胞に大きく制限されることを見出した。
【０１３５】
IL-31産生がCLA+ 皮膚ホーミングT細胞に付随するか否かを決定するために、CLA+ 及びCLA- T細胞をADと診断された患者及びコントロールボランティアの末梢血から単離し、そしてIL-31 mRNAと抗-CD3プラス抗-CD28刺激によるタンパク質レベルを比較した。我々の結果は、IL-31 mRNAがAD及び正常個体から由来するCLA+ T細胞で、共に有意に上昇（刺激後4時間(AD及び正常は、CLA-と比べてCLA+がそれぞれ、p0.0087及びp0.0022)及び刺激後24時間(AD及び正常サンプルは、共にCLA-と比べてCLA+がp0.0022）したことを示す。培養上澄み中のIL-31タンパク質レベルの分析は、AD及びコントロール個体から由来するCLA-T細胞由来の培養上澄みにおいて検出可能なIL-31が存在しなかったように、IL-31がCLA+ T細胞によって優位に産生されることを確認した。AD患者及び正常人の間のIL-31のレベルの有意な差異は存在しなかった。我々は、更に正常ボランティア由来の腸管特異的ホーミングマーカーα4β7等の他の組織特異的ホーミングマーカーを発現する末梢血T細胞によるIL-31の産生を分析した。CLA+ T細胞とα4β7+ 細胞により産生されるIL-31レベルの比較では、CLA+ T細胞がα4β7+細胞と比較して優先的にIL-31を産生することが実証された(それぞれの平均は34.5 pg/ml及び14.42 pg/mlのIL-31).
【０１３６】
AD患者と正常コントロールは、活性化状態にあるIL-31を発現する循環CLA+ T細胞を有するが、AD患者からのCLA+ T細胞は、正常個体由来の細胞と比較してより活性化状態で存在すると報告されている。そのため、CLA+ T細胞によりIL-31の産生を要求する刺激閾値は、皮膚炎患者とコントロール対象の間で相違し得る。この仮説を検証するために、我々は、抗-CD28が存在しない中で、準最適化濃度の抗-CD3によりAD患者及びコントロール個体から由来するCLA+ T細胞を刺激し、そして刺激後24時間で、培養上澄み中のIL-31の産生を分析した。我々の結果では、数人のAD患者からの循環CLA+ T細胞が、正常個体由来の細胞と比較して、より高いレベルのIL-31を産生することを実証する（本試験では最高レベルは1200 pg/mLに到達する）。他方、正常のCLA+ 上澄みにおける最高検出レベルはほんの400 pg/mlであり、そして乾癬患者の最高検出レベルは、抗-CD3 刺激の準最適濃度で、73 pg/mlであった。１１人中５人のAD患者は、我々のアッセイの検出限界未満のIL-31レベルを示し、IL-31が低いレベルで産生されるAD患者のサブセットが存在し得ることを示唆する。これは我々の研究個体群の疾患段階のバリエーションを反映し得る。それでもなお乾癬患者と正常個体と比較して、抗-CD3での準最適の刺激によってAD患者の半数超がより高いIL-31レベルに向かう傾向を示した。正常個体と比較してより多くのCLA+ T細胞がAD患者の皮膚に局在するので、我々の研究は、AD皮膚の微小環境中で、IL-31活性の増加した能力が存在することを示唆する。従って、本研究は、IL-31を産生するより活性化したCLA+ T細胞を有するAD患者のサブ個体群を示唆し得る。
【実施例９】
【０１３７】
ADマウスモデルにおける抗-IL-31抗体に対する応答におけるTARC及びMDCの減少
方法I
６週齢の雄性NC/Ngaマウス(CRL日本)を50μg のイエダニ抽出物(D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies)で、１週間に３回、背中に皮下感作し、そしてAD-様病変をスコア化した。感作の5週間後、当該マウスを安楽死させ、そして右耳を切除し、そしてRPMI+2%FBS(GIBCO Invitrogen)を補充した48ウェルの培養皿(Corning)の単一のウェル中に置いた。プレートを5％のCO2湿度制御培養器中に置いた。上澄みを24時間後に収集し、そして更なる分析まで−20℃で凍結した。
【０１３８】
方法II
１２週齢の雌性NC/Ngaマウス(CRL日本)を10μg SEB (Toxin Technology)で、１週間に３回、耳の中と背中に皮下感作した。当該マウスをAD様病変についてスコア化した。感作５週間後、当該マウスを安楽死させ、そして6mmの生検パンチをそれぞれのマウスの注入した耳から採取し、そしてRPMI+2%FBSを補充した48ウェルの培養皿の単一ウェル中に置いた。プレートを5％のCO2湿度制御培養器中に置いた。24時間後に上澄みを収集し、そして更なる分析まで−20℃で凍結した。
【０１３９】
両試験におけるマウスの群は、感作後１〜２週から、毎週腹腔内に２回、ラット抗マウスIL-31モノクローナル抗体を10mg/kgで、またはビヒクルで処理した。
【０１４０】
24時間の上澄みサンプルのTARC及びMDC濃度は、慣用のELISA (R&D Systems)によって計測した。
【０１４１】
両試験におけるTARC及びMDCの濃度は、コントロールと比較して抗-ＩL-31処理マウス由来の耳の上澄みにおいて低かったが、これらの結果はANOVAによって分析した場合は、おそらくサンプルサイズのせいで統計学的に有意ではなかった。両実験からのデータが組み合されて分析される場合、処理群間の差異は統計学的に有意である。
【実施例１０】
【０１４２】
IL-31中和抗体の投与
およそ8〜12週齢の正常の雌性BALB/cマウス(CRL)の皮下に、１日にlμgのmIL-31を送達する14日間浸透圧ポンプ(Alzet, #2002)を移植した。マウスの群は、IL-31送達の１週間前から、ラット抗-マウスIL-31モノクローナル抗体10mg/kg (200μg/マウス)の腹腔内(i.p.)注入を、週に２回受けた。コントロール群のマウスは、同一の投与スケジュールでビヒクル(PBS/0.1%BSA)をi.p.注入で受けた。マウスは、以下の基準を用いて脱毛症と掻痒について毎日スコア化された：0＝スクラッチングがなく、動物が正常であることを示す、1＝狭い領域で覆いが薄くなり、スクラッチングに気付く、2＝軽度の脱毛(小さなパッチ)、スクラッチング、3＝中等度の脱毛、スクラッチング、及び4＝重度の脱毛、過剰なスクラッチング。
【０１４３】
全ての実験では、ラット抗-mIL-31 mAbで処理されたマウスは、およそ5〜7日間の兆候の開始の遅延を有し、且つ脱毛症及び掻痒の全てのスコアが低かった。mAb処理したマウスの全ての群(投与頻度または投与濃度に関係なく)は、コントロールマウスと同様に、試験１３日で、脱毛症及び掻痒を発達させた。これらのデータはIL-31の中和は、IL-31により誘導されるスクラッチ/脱毛応答の発症を遅らせることができることを示唆する。
【０１４４】
上記の本発明の特定の態様は、説明の目的のために本明細書で発表されるが、多様な改変が本発明の精神と範囲から逸脱することなく成され得ることが理解されるだろう。従って、当該発明は添付の特許請求の範囲を除くように限定されない。
【背景技術】
【０００１】
皮膚は免疫系において重要な役割を果たし、複数層から成る。循環Tリンパ球は、正常条件及び炎症条件下で皮膚へ移動する。皮膚のリンパ球抗原(CLA)は、皮膚指向性を有するＴ細胞のホーミング受容体と見なされる。Santamaria-Babi, L., Eur. J. Dermatol. 14:13-18, 2004。CLAは糖鎖構造であり、P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1(PSGL-1)という名前の単一細胞表面タンパク質のエピトープとして記憶T細胞上で発現し、そしてT細胞のE-セレクチン（血管内皮上で発現する誘導性接着分子）への結合を促進する。Fuhlbrigge RC,等., Nature 1997; 389:978-81参照。
【０００２】
アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、薬物誘発性アレルギー反応、皮膚指向性ウィルス、及びウィルス関連掻痒、白斑、皮膚のT細胞リンパ腫、円形脱毛症、酒さ、尋常性座瘡、結節性痒疹、及び水疱性類天疱瘡を含む皮膚のいくつかの疾患は、高レベルでCLA+ T細胞を発現することが知られている。かかる皮膚T細胞仲介疾患を治療するための必要性が存在する。
【０００３】
実証されたサイトカインのin vivo活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト、及びサイトカインアンタゴニストの多大な臨床的な可能性、及びそれらの必要性を明らかにする。本発明はかかる疾患を新たに同定されたサイトカインであるIL-31の働きを妨げることにより処置するための方法を提供することによって、それらの必要性を追求する。IL-31がマウスで過剰発現した時、痒みと皮膚炎様兆候をもたらす。皮膚ホーミングT細胞と表皮ケラチノサイトは、共にヒトにおける皮膚疾患の病変に原因があるとされてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記のためのポリペプチド及び本明細書の教示から当業者が明確に理解し得る使用以外のそれらの使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
１つの観点において、本発明は皮膚のリンパ球抗原陽性T細胞によって特徴付けられる罹患皮膚を有する哺乳動物にアンタゴニスト分子を投与することを含んで成る罹患皮膚を治療するための方法を提供する。当該アンタゴニスト分子は、配列番号：２または配列番号：４で示すようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに特異的に結合するので、アンタゴニスト分子の投与によって、当該罹患皮膚を改善、予防、阻害、または減少させる。ある態様では、患者は接触皮膚炎、薬物誘導遅発型皮膚アレルギー反応、中毒性表皮剥離症、皮膚T細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、 円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスから選定される皮膚疾患を有する。更なる態様では、哺乳動物はヒトである。他の態様では、アンタゴニストは抗体または抗体フラグメントである。更なる態様では、アンタゴニスト分子は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに特異的に結合する。他の態様では、罹患皮膚は掻痒性である。
【０００６】
他の観点では、本発明はアンタゴニスト分子を皮膚のリンパ球抗原陽性T細胞で特徴付けられる掻痒を有する哺乳動物に投与することを含んで成る方法を提供する。当該アンタゴニスト分子は、配列番号：２または配列番号：４で示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合するので、当該アンタゴニスト分子を投与することによって、掻痒を改善、予防、阻害、または減少させる。ある態様では、掻痒は、接触皮膚炎、薬物誘導遅延型皮膚のアレルギー性反応、中毒性表皮剥離症、皮膚のT細胞 リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスから選定される皮膚疾患に付随する。更なる態様では、哺乳動物はヒトである。更なる態様では、アンタゴニストは抗体または抗体スラグメントである。更なる態様では、アンタゴニスト分子は配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。
【０００７】
他の観点では、本発明はIL-31アンタゴニスト治療を必要とする個体におけるIL-31アンタゴニストに対する治療的応答を予測するための方法を提供する。IL-31アンタゴニスト治療とは、患者から生物学的サンプルを得ること、循環皮膚リンパ球陽性T細胞を当該生物学的サンプルから単離すること、及び単離された皮膚リンパ球陽性T細胞からIL-31産生を検出することを含む。ある態様では、IL-31はIL-31アンタゴニストに特異的に結合することによって検出される。更なる態様では、IL-31アンタゴニストは、抗-IL-31抗体または抗体フラグメントである。他の態様では、アンタゴニスト分子は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。他の態様では、IL-31アンタゴニスト治療を必要とする個体は、接触皮膚炎、薬物誘導遅延型皮膚アレルギー反応、中毒性表皮剥離症、皮膚T細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスから選定される皮膚疾患を有する。他の態様では、当該方法は、皮膚リンパ球抗原陽性T細胞を刺激するまたは活性化する更なるステップを含んで成る。更なる態様では、IL-31はIL-31アンタゴニストと特異的に結合することによって検出される。他の態様では、IL-31アンタゴニスト分子は抗-IL-31抗体または抗体フラグメントである。更なる態様では、アンタゴニスト分子は配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明を理解するために役立ち得る以下の用語を定義する：
【０００９】
本明細書で使用される用語"アフィニティータグ"とは、第二のポリペプチドに結合して当該第二のポリペプチドの精製または検出を提供することができる、または当該第二のポリペプチドの基質への結合部位を提供することができるポリペプチドセグメントを意味する。主に、入手できる抗体または他の特異的な結合剤のための任意のペプチドまたはタンパク質は、アフィニティータグとして利用できる。アフィニティータグは、ポリヒスチジントラクト、プロテインA(Nilsson等., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson等., Methods Enzvmol. 198:3, 1991)、グルタチオンSトレンスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988)、Glu-Gluアフィニティータグ(Grussenmeyer等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985)、サブスタンスP、Flag(商標)ペプチド(Hopp等., Biotechnology 6:1204-10, 1988)、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープまたは結合ドメインを含む。一般的に、Ford等., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991を参照。アフィニティータグをコードするDNAは、商業的提供元から入手できる(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ参照)。
【００１０】
本明細書で使用される用語"対立遺伝子多型"とは、同一の染色体座を占める遺伝子の任意の２つ以上の選択的な形態を意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を通じて天然で生じ、且つ個体群中で表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異はサイレント(コードされたポリペプチド中で変化がない)であってよく、または変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。また本明細書で使用される用語、対立遺伝子多型は、遺伝子の対立遺伝子多型によってコードされるタンパク質も意味する。
【００１１】
本明細書で使用される用語"アミノ末端"及び"カルボキシル末端"は、ポリペプチド中の位置を意味する。本明細書では、それらの用語は特定の配列またはポリペプチドの部分への言及で使用され、近位または相対位置を意味することができる。例えば、ポリペプチド中の参照配列に対してカルボキシル末端に位置したある特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するものではない。
【００１２】
用語"相補/アンチ相補対"とは、適宜条件下で、非共有結合的に会合した、安定な対を形成する異質の(non-identical)部位を意味する。例えば、ビオチン及びアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補/アンチ相補対の原型のメンバーである。他の例示的な相補/抗-相補対は、受容体/リガンド対、抗体/抗原(またはハプテンまたはエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対等を含む。相補/アンチ-相補対のその後の解離が所望される場合、相補/アンチ相補対は、好適には＜109 M-1の結合親和性を有する。
【００１３】
用語"ポリヌクレオチド分子の相補体"は、相補的塩基配列及び参照配列と比較して逆方向性を有するポリヌクレオチド分子を意味する。例えば、配列5' ATGCACGGG 3'は、5' CCCGTGCAT 3'に相補性である。
【００１４】
用語"コンティグ"とは、連続した同一のストレッチ(contiguous stretch of identical)または他のヌクレオチドに対する相補配列を有するポリヌクレオチドを意味する。連続配列は"重複(overlap)"と言われ、それらの全体において、またはポリヌクレオチドの部分的なストレッチに沿って、ポリヌクレオチド配列のストレッチを与える。
【００１５】
用語"縮重ヌクレオチド配列"とは、１個以上の縮重コドン(ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較して)を含むヌクレオチド配列を言う。縮重コドンは、ヌクレオチドの多様なトリプレットを含むが、同一のアミノ酸残基をコードする(即ち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【００１６】
使用される用語"発現ベクター"は、直鎖または環状のDNA分子を意味し、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能式に連結される注目のポリペプチドをコードするセグメントを含む。かかる追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を含み、そして１つ以上の複製源、１つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含み得る。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウィルス性DNAから由来し、または両方の要素を含み得る。
【００１７】
用語"単離された"とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から取り除かれることにより、他の外来または所望されないコード配列が存在しなくなり、そして遺伝子操作されたタンパク質産生系の中で使用するために適した形態になることを意味する。かかる単離された分子は、それらの天然の環境から分離されたものであり、且つcDNA及び遺伝子クローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は、通常それらに付随する他の遺伝子は存在しないが、プロモーター及びターミネーター等の天然で発生する5'及び3'非翻訳領域を含み得る。付随領域の同定は、当業者に明白であり得る(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985を参照)。
【００１８】
"単離された"ポリペプチドまたはタンパク質は、血液及び動物組織とは関係なく、その天然環境以外の条件で見出されたポリペプチドまたはタンパク質である。好適な形態では、単離されたポリペプチドは、実質的に他のポリペプチド、詳細には動物起源の他のポリペプチドが存在しない。高純度の形態にある、即ち、純度95％超、より好適には純度99％超のポリペプチドを提供することが好適である。本明細書で使用される場合、用語"単離された"とは、ダイマー等の代替の物理的形態、または代替のグリコシル化または誘導化形態にある同一のポリペプチドの存在を排除しない。
【００１９】
用語"新生物の(neoplastic)"は、細胞について言う場合、新規の増殖及び異常増殖を行う細胞を示す。特に増殖が組織中で非制御且つ進行性である場合、新生物をもたらす。新生細胞は悪性（即ち、侵襲性且つ転移性）または良性のいずれかであり得る。
【００２０】
用語"作用可能式に連結した"とは、DNAセグメントを言う場合、セグメントが一斉にそれらの意図された目的、例えば、転写がプロモーター中で開始し、そしてターミネーターへのコーディングセグメントを介して進行するように機能するために配備されることを示す。
【００２１】
用語"オルソログ"とは、１つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を意味し、ある異なる種から由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的なカウンターパートである。オルソログ中の配列の相違は、種形成の結果である。
【００２２】
"パラログ(Paralogs)"は、有機体によって作られた構造的に関連したタンパク質以外と明確に区別される。パラログは、遺伝子複製を通して起こると考えられている。例えば、α-グロブリン、β-グロブリン、及びミオグロビンは、互いにパラログである。
【００２３】
"ポリヌクレオチド"は、5'から3'末端で解読されるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖、または二重鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNA及びDNAを含み、且つ天然源から単離され；in vitroで合成され、または天然及び合成分子の組み合せから調製され得る。ポリヌクレオチドの大きさは、塩基対(略すと"bp")、ヌクレオチド("nt")、またはキロベース("kb")で表される。本明細書では、後の２つの用語は、単鎖または二重鎖のポリヌクレオチドを表すことができる。当該用語が二重鎖分子に適用される場合、全長を意味するために使用され、そして用語"塩基対"と同等であると理解されるだろう。二重鎖ポリヌクレオチドの二つの鎖は、長さにおいて軽度に異なってよく、そしてそれらの末端は、酵素的開裂の結果として互い違いになってよく；その結果、二重鎖ポリヌクレオチド分子中の全てのヌクレオチドは対にならなくてよいことを当業者は認識するだろう。
【００２４】
"ポリペプチド"は、天然で生産されても、合成的に生産されても、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基のポリマーである。約10個のアミノ酸残基未満のポリペプチドは、通常、"ペプチド"と言われる。
【００２５】
本明細書において使用される用語"プロモーター"は、RNAポリメラーゼの結合と翻訳の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を意味すると当業界において認識されている。プロモーター配列は、常にではないが、一般的に、5'非遺伝子コード領域中に見出される。
【００２６】
"タンパク質"は、１個以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。またタンパク質は糖質基等の非ペプチド成分も含み得る。糖質及び他の非ペプチド性置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加されてよく、そして細胞のタイプにより変化するだろう。タンパク質は、それらのアミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義され；糖質基等の置換基は、一般的に特定されていないが存在し得る。
【００２７】
用語"受容体"は、生物活性分子(即ち、リガンド)に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞に付随するタンパク質を意味する。膜結合受容体は、細胞外リガンド-結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインを含むマルチペプチド構造によって特徴付けられ、それは典型的に情報伝達に関与する。リガンドの受容体への結合は、受容体中の立体配座の変化をもたらし、細胞中のエフェクタードメインと他の分子の間の相互作用の原因となる。この相互作用は、細胞の代謝において次々と変化を導く。受容体-リガンド相互作用に関連する代謝性事象は、遺伝子転写、リン酸化反応、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を含む。一般的に、受容体は膜結合性、細胞質性、または核性；単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、β-アドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、EL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エチスロポエチン受容体及びIL-6受容体)であってよい。
【００２８】
用語"分泌シグナル配列"は、ポリペプチド("分泌ペプチド")をコードするDNA配列を意味し、それは、より大きなポリペプチドの構成部分として、分泌ペプチドが合成される細胞の分泌経路を通って、より大きなポリペプチドを導く。このより大きなポリペプチドは、通常開裂して、分泌経路を通って通過する間に、分泌ペプチドは除去される。
【００２９】
本明細書で使用される用語"スプライス変異体"は、遺伝子からのRNA転写の代替形態を意味する。スプライス変異体は、転写RNA分子中の代替的なスプライス部位の利用を通して天然で起こり、またはまれに独立して転写RNA分子の間も起こり、そして同一の遺伝子から転写された、いくつかのmRNAをもたらし得る。スプライス変異体は変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。また本明細書で使用される用語、スプライス変異体は、ある遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によってコードされるタンパク質を意味する。
【００３０】
不正確な分析方法(例えば、ゲル電気泳動法)によって決定されるポリマーの分子量と長さは、適当な数値であると理解されるだろう。かかる数値が"約"Xまたは"およそ"Xと表現される場合、言及されるXの数値は、正確には±10％であると理解されるだろう。
【００３１】
本明細書で引用される全ての文献は、それらの全体が参考文献によって組み込まれている。
【００３２】
本発明は、疾患、特に皮膚のリンパ球抗原(CLA)陽性T細胞によって仲介される疾患の検出、診断、及び治療において、IL-31ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びアンタゴニストを用いる新規の方法を提供する。本発明は一部が以前に同定されたサイトカインであるIL-31の発見に基づく。IL-31は、皮膚-ホーミングT細胞によって発現するが、腸管-ホーミングT細胞では発現しない。
【００３３】
IL-31は、近年発見された４つの-ヘリックス束サイトカインの構造を有するタンパク質である。このサイトカインは、以前にIL-31として同定され、そして2003年１月２１日付で出願された米国特許出願No. 10/352,554に十分に発表されている。参考文献によって本明細書にその内容の全てが組み込まれた公開された米国特許出願No. 2003-0224487、及びPCT出願WO 03/060090を参照。更にDillon,等., Nature Immunol. 5:752-760、2004を参照。IL-31は、受容体IL-31RA及びオンコスタチンM受容体β(OSMRβ)を含む少なくとも１つの追加のサブユニットに高度に特異性を有するリガンドである。ヒトIL-31に関する天然ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、配列番号：１及び２にそれぞれ示されている。マウスIL-31に関する天然ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、配列番号：３及び４にそれぞれ示されている。ヒトIL-31RAに関する天然のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、配列番号：５及び６にそれぞれ示されている。マウスIL-31RAに関する天然ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、配列番号：７及び８にそれぞれ示されている。ヒトOSMRβに関する天然ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、配列番号：９及び１０にそれぞれ示されている。
【００３４】
IL-31の分泌シグナル配列は、配列番号：２に示すようなアミノ酸残基1(Met)〜23(Ala)を含んで成り、そして成熟ポリペプチドは、アミノ酸残基24(Ser)〜164(Thr)を含んで成る。更に293T細胞から精製されたIL-31のN-末端の配列解析は、配列番号：２で示すようなアミノ酸残基27(Leu)〜164(Thr)を含んで成る成熟ポリペプチドと共に、配列番号：２で示すような残基27(Leu)でN-末端を示した。
【００３５】
上記の通り米国特許公開番号20030224487(参考文献によって本明細書に組み込まれている)で使用される通り本明細書において使用される用語、IL-31はZcytorl71igを意味し、そしてIL-31RA はZcytorl7を意味する。IL-31のためのヘテロダイマー受容体は、2003-0096339(参考文献によって本明細書に組み入れられている)にzcytorl7 (HUGO name、IL-31RA)においても発表されており、それはオンコスタチンM受容体β(OSMRβ)を含む少なくとも１つの追加のサブユニットを形成する。
【００３６】
皮膚ホーミングT細胞及び表皮ケラチノサイトは共にヒトの皮膚疾患の病変に関係があるとされてきた。本明細書で示す通り、IL-31 mRNA及びタンパク質の発現は、アトピー性皮膚炎(AD)患者と正常個体の両方において皮膚ホーミングCLA+ T細胞群を制限するが、免疫組織化学(IHC)によるIL-31、BL-31RAのための受容体の分析は、正常個体と比較してAD罹患由来の皮膚生検中の皮膚のケラチノサイト上に軽度に高いレベルのIL-31RA発現を示唆する。
【００３７】
マウス中で過剰発現したIL-31は、ヒトアトピー性皮膚炎(AD)を象徴する掻痒と皮膚炎の発達もたらす。本明細書で示された免疫組織化学(IHC)試験は、IL-31RAタンパク質が皮膚ケラチノサイトによって発現し、そしてAD患者由来の皮膚生検において浸潤しているマクロファージを見出した。AD患者と正常個体の間の比較は、IL-31RAがADサンプル中の表皮ケラチノサイト上で、高レベルで発現したことを示唆した。正常個体と比較してAD患者の皮膚中でより多くの数で存在した皮膚細胞浸潤物は、IL-31mRNAを発現した。これらの細胞の組織形態学的分析では、IL-31mRNAを発現する皮膚中で皮膚ホーミングT細胞を実証する皮膚リンパ球抗原(CLA)及びCD3に関し、大多数の細胞染色が陽性であるリンパ球系統を示唆した。IL-31に関する末梢血T細胞の分析では、IL-31 mRNA及びタンパク質発現は、AD及び正常ボランティア中のCD45RO+ CLA+ 皮膚ホーミングT細胞に大きく制限される。更にAD患者からの循環CLA+ T細胞は、患者サンプル間に大きなバラツキがあるにもかかわらず、正常個体から由来するCLA+ T細胞と比較して、より高いレベルのIL-31の産生を可能にする。これらの結果は、IL-31発現がADの皮膚炎症及び掻痒の発達に寄与し得ることの強力な証拠を提供する。
【００３８】
本明細書において示す通り、IL-31は、皮膚中で局所的に、且つ皮膚浸潤細胞によって産生される。T細胞による組織中のサイトカインの局所産生は、AD中の病因の主要なメカニズムであると考えられ、そして循環中及び皮膚中で数が増加したT細胞は、疾患と相関すると考えられる。
【００３９】
AD患者及び正常コントロールは共に活性状態にあるIL-31を発現する循環CLA+ T細胞を有するにもかかわらず、AD患者由来のCLA+ T細胞は、正常個体由来の細胞と比較して、より活性化された状態で存在することが報告されている。Akdis M, J Immunol 159:4611-4619,1997参照。結論として、CLA+ T細胞によってIL-31を産生するために要求される刺激の閾値は、皮膚炎患者とコントロール対象で相違し得る。本明細書で示す通り、抗-CD28が存在しない中で、準最適濃度の抗-CD3による刺激の24時間後、AD患者由来の循環CLA+T細胞は、正常個体由来の細胞と比較して、より高いレベルのIL-31を産生する能力を有する。個々のAD患者由来のCLA+ T細胞によって産生されるIL-31レベルのバラツキのせいで、AD個体と正常個体の循環CLA+ T細胞からのIL-31産生の平均値において有意な差が存在しない。それでもなお正常個体と比較して、より多くのCLA+ T細胞がAD患者の皮膚に局在しているので、AD皮膚の微環境中で増加したIL-31活性能が存在する。
【００４０】
実施例8は、少数のAD患者由来の循環CLA+ T細胞は、正常個体由来の細胞と比較して、より高いレベルのIL-31を産生することを実証する。本明細書で提供されるバイオアッセイを用いる、または血中の循環T細胞によって産生されるIL-31を検出するための任意のアッセイによるかかるサブ個体群の患者におけるIL-31の検出は、IL-31アンタゴニストが炎症を引き起こすIL-31が存在する疾患の治療に有用であるかどうかを決定するために有用であり得る。
【００４１】
他の成長因子が存在しない中で生存及び成長するための経路につながるOSMRβ及びIL-31RAに依存する細胞株は、IL-31の活性を測定するために使用され得る。かかる成長因子依存性細胞株は、BaF3、FDC-Pl、及びMO7eを含む。BaF3細胞株についての情報は、Palacios及びSteinmetz(Cell 41: 727-734, 1985)及びMathey-Prevot等., (Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986)を参照する。FDC-Pl細胞株に関する情報は、Hapel等. (Blood 64: 786-790, 1984)を参照する。MO7e細胞株に関する情報は、Kiss等., (Leukemia 7: 235- 240, 1993)を参照する。
【００４２】
OSMRのアミノ酸配列、及びクラスIサイトカイン受容体サブファミリーに属するコードされた受容体を示すIL-31RA受容体は、制限されずにIL-2、IL-4、IL-7、Lif、IL-12、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF及びG-CSFの受容体を含む(Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" Cytokine 5(2): 95-106, 1993参照)。IL-31RA受容体は、PCT特許出願No.US01/20484 (WIPO公開No. WO 02/00721)に完全に発表されている。IL-31RA受容体のmRNAの組織分布の分析は、活性化CD4+及びCD8+ T-細胞サブセット、CD 14+ 単球における発現、及びCD19+ B-細胞におけるより弱い発現を明らかにした。更に、mRNAは静止したまたは活性化単球細胞株THP-I(ATCC No. TIB-202)、U937 (ATCC No. CRL-1593.2)及びHL60 (ATCC No. CCL-240)の両方において存在した。
【００４３】
IL-31は４つの-αヘリックス構造とみなされている。配列番号：２で見られるヒトIL-31アミノ酸配列について言えば、IL-31ヘリックスAは、アミノ酸残基38-52で定義され；ヘリックスBはアミノ酸残基83-98で定義され；ヘリックスCはアミノ酸残基104-117で定義され；及びヘリックスDはアミノ酸残基137-152で定義され、且つIL-31中で保存されたシステイン残基は、本明細書に記載された配列番号２のアミノ酸残基72、133、及び147に相当し；及び配列番号８のアミノ酸残基74、137、及び151に相当する。またIL-31中で高度に保存されるのは、配列番号：２に示される残基４３のGIu残基である。
【００４４】
すでに同定されているマウスオルソログのIL-31に関するポリヌクレオチド配列は配列番号：３に示され、そして対応のアミノ酸配列は配列番号：４に示されている。配列番号：４のIL-31マウスサイトカインアミノ酸配列については、ヘリックスAがアミノ酸残基38-52で定義され；ヘリックスBがアミノ酸残基85-98で定義され；ヘリックスCがアミノ酸残基104-118で定義され；そしてヘリックスDが141-157のアミノ酸配列で定義される。マウスIL-31に関する成熟配列は、配列番号：４に示される通り、推測上Met1で始まり、それはヒト配列の配列番号：２に示されるMet1に相当する。組織分析は、マウスIL-31の発現が睾丸、脳、CD90+ 細胞、前立腺細胞、唾液腺及び皮膚において見出されることを明らかにした。更に293T細胞由来の精製IL-31のN-末端配列解析は、アミノ酸残基31(Ala)〜163(Cys)を含む成熟ポリペプチドを有する配列番号：４に示される残基31 (Ala)でN-末端を示した。
【００４５】
IL-31は、染色体12の12q24.31領域に位置する。従って、本発明は診断的適用における用途が見出される試薬も提供する。例えば、IL-31遺伝子、IL-31 DNAまたはRNAを含むプローブまたはそれらのサブ配列は、IL-31遺伝子が染色体12等のヒト染色体上に存在するかどうか、または遺伝子突然変異が生じたかどうかを測定するために使用することができる。IL-31遺伝子座で検出可能な染色体異常は、制限されずに、異数性、遺伝子複製数の変化、ヘテロ接合性の消失(LOH)、転座、挿入、欠失、制限部位の変化及び再配列を含む。かかる異常は、PCR技術、及び他の遺伝子連鎖解析技術を用いる当業界において公知の制限断片長多型(RFLP)解析、短縦列反復(STR)解析等の分子遺伝学的技術を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る(Sambrook等, ibid.；Ausubel等, ibid.；Marian, Chest .108:255-65, 1995)。染色体異常の検出は、密接に関連する皮膚のリンパ球抗原を有する疾患のために特に重要であり得る。従って、本発明は、IL-31遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを含むIL-13遺伝子における変化を検出するための方法を含む。
【００４６】
本発明に係るタンパク質(またはそれらのポリペプチドフラグメント)は、他の生物活性分子、特に他のサイトカインに結合し、多機能性分子を提供することができる。例えば、IL-31由来の１以上のらせんは、他のサイトカインと結合し、それらの生物学的特質または産生能を増強させることができる。
【００４７】
更に本発明は、CLA陽性T細胞によって仲介される疾患において、本発明において開示されたIL-31ポリペプチドのエピトープ担持部分を含むポリペプチドフラグメントまたはペプチドを検出するための用途を提供する。かかるフラグメントまたはペプチドは、タンパク質全体が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の部分である"免疫原性エピトープ"を含み得る。免疫原性のエピトープ担持ペプチドは、標準的な方法を用いて同定され得る(例えば、Geysen等.. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)参照)。
【００４８】
対照的に、ポリペプチドフラグメントまたはペプチドは、抗体が特異的に結合し得るタンパク質分子領域である"抗原エピトープ"を含み得る。所定のエピトープは直鎖またはアミノ酸の連続的なストレッチ(contiguous stretch)から成り、及びかかるエピトープの抗原性は、変性剤によって崩壊しない。タンパク質のエピトープを真似ることができる比較的に短い合成ペプチドを使用して、このタンパク質に対する抗体の産生を刺激することができることは、当業界において公知である(例えば、Sutcliffe等., Science 219:660 (1983)を参照)。従って、本発明の抗原性エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、本明細書で発表したポリペプチドと結合する抗体を発生させるのに有用である(例えば、抗体を中和する)。Hopp/Woods親水性プロファイルは、最大の抗原能を有する領域を決定するために使用され得る(Hopp等., 1981, ibid, 及びHopp, 1986, ibid)。例えば、ヒトIL-31における親水性領域は、配列番号：２のアミノ酸残基54-59、配列番号：２のアミノ酸残基129-134、配列番号：２のアミノ酸残基53-58、配列番号：２のアミノ酸残基35-40、及び配列番号：２のアミノ酸残基33-38を含む。例えば、マウスIL-31において、親水性領域は配列番号：４のアミノ酸残基34-39、配列番号：４のアミノ酸残基46-51、配列番号：４のアミノ酸残基131-136、配列番号：４のアミノ酸残基158-163、及び配列番号：４のアミノ酸残基157-162を含む。
【００４９】
抗原性エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、好適には、配列番号：２または配列番号：４の少なくとも４〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜１４個のアミノ酸、または約１４〜約３０個のアミノ酸を含む。かかるエピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、本明細書で発表されるように、IL-31ポリペプチドを寸断することによって、または化学的ペプチド合成によって産生され得る。更に、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイによって選択され得る(例えば、Lane及びStephen. Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993);及びCortese等, Cure. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)参照)。エピトープを含む小ペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を産生するための標準化方法は、例えば、Moleによる"エピトープマッピング"方法 Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), ページ105-116 (The Humana Press, Inc. 1992)；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," Monoclonal Antibodies：Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter及びLadyman (eds.),ページ60-84 (Cambridge University Press 1995)、及びColigan等. (eds.), Current Protocols in Immunology, ページ9.3.1-9.3.5及びページ9.4.1-9.4.11(John Wiley & Sons 1997)に発表されている。
【００５０】
本発明のIL-31ポリペプチドは、全長ポリペプチド、機能的フラグメント、及び融合ポリペプチドを含み、当業界において周知の方法及び米国特許出願No. 2003-0224487、及びPCT出願WO 03/060090に発表された方法によって産生、精製及びリフォールドされ得る。本発明のポリペプチドの好適な純度は、純度≧80％、より好適には純度≧90％、更により好適には純度≧95％であり、そして特に好適には医薬的に純粋な状態であり、それは混入している巨大分子、特に他のタンパク質及び核酸に関し、且つ感染性物質及び発熱性物質が存在しない、純度99.9％超である。好適には、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチドが実質的に存在せず、特に動物起源の他のポリペプチドが存在しない。
【００５１】
本発明は、細胞微環境中の炎症を減少、阻害、または予防するための抗-IL-31抗体を含むIL-13アンタゴニストを用いる方法を提供する。ここでの微環境中の１個以上の細胞はT細胞であり、皮膚リンパ球抗原に陽性である。更に本発明は、細胞微環境中のかゆみ及び掻痒を減少、阻害、または予防するための抗-IL-31抗体を含むIL-31アンタゴニストを使用するための方法を提供する。ここでの微環境中の1個以上の細胞はT細胞であり、皮膚リンパ球抗原に陽性である。
【００５２】
単離及び精製することができるIL-31抗原による動物への予防接種によって産生される免疫応答由来の抗体は、当業界において公知であり、本明細書で発表される。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製及び単離するための方法は、当業界において周知である。例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan,等. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook等., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989；及びHurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982参照。
【００５３】
本明細書で使用される用語"抗体"は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合フラグメント、例えばF(ab')2及びFabタンパク質分解性フラグメント等を含む。遺伝子操作されたインタクト抗体またはフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフラグメント、単鎖抗体等、また合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた含まれる。非ヒト抗体は、非ヒトCDRをヒトフレームワーク上及び不変領域に移植することによって、または全非ヒト可変ドメインを導入することによってヒト化され得る(任意に曝された残基を置換することによって、ヒト様表面を有するものを"クローキング(cloaking)"する。ここでの結果物は"ベニア化(veneered)"抗体である)。いくつかの例では、ヒト化抗体は、ヒト可変領域フレームワークドメイン中に非ヒト残基を保持し、適度な結合特質を増強し得る。ヒト化抗体を通して、生物学的半減期は増加されてよく、そしてヒトへの投与による有害な免疫反応の可能性は減少される。更にヒト抗体は、WIPO公報No. WO 98/24893において開示された通り、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック、非ヒト動物において産生され得る。これらの動物における内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同組換え体等によって不活性化または失効されることが好適である。
【００５４】
抗体は、1) それらが結合活性の閾値を示す場合、且つ2) それらが関連のポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合に、特異的に結合すると見なされる。結合の閾値は、本明細書における抗-IL-31抗体が、IL-31ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープと、少なくともコントロール（非IL-13）ポリペプチドと比べて10倍超の親和性で結合する場合に測定される。当該抗体は好ましくは106M-1以上、好適には107M-1以上、より好適には108M-1以上、そして最適には109M-1以上の結合親和性(Ka)を示す。抗体の結合親和性は、通常の当業者によって、例えば、Scatchard analysis (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949）を用いて容易に決定され得る。
【００５５】
IL-31に対する抗体は；親和性精製によってIL-31を単離するため；IL-31ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのため；内在する病変または疾患のマーカーとして可溶性IL-31を検出するためまたは定量するため；FACSを採用する分析法において；発現ライブラリーをスクリーニングするため；抗-イディオタイプ抗体を産生するため；及びin vitro及びin vivoでIL-31の活性を遮断するための中和抗体として、またはアンタゴニストとして、IL-31を発現する標識細胞に使用され得る。適切な直接標識またはラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等を含み；間接標識またはラベルは、中間体としてのビオチン-アビジンまたは他の相補/抗-相補対の使用を特色とし得る。また本明細書における抗体は、薬物、毒素、放射性核種等に直接的または間接的に接合され、そしてこれらの接合体は診断的または治療的適用に利用され得る。更にIL-31 またはそれらのフラグメントに対する抗体は、例えばウェスタンブロットまたは他の当業界において公知のアッセイ等のアッセイにおいて、in vitroで変性したIL-31またはそれらのフラグメントを検出するために使用され得る。
【００５６】
適切な検出可能な分子は、ポリペプチドまたは抗体に直接的にまたは間接的に付着させることができ、そして放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等を含む。適切な細胞毒性分子は、当該ポリペプチドまたは抗体に直接的にまたは間接的に付着させることができ、そして細菌毒性または植物毒性(例えば、ジフテリア、毒素、サポリン(saporin)、緑膿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、リシン、アブリン等)、またヨウ素-131、レニウム-188またはイットリウム-90等の治療的放射性核種を含み、当該ポリペプチド又は抗体に直接的または間接的に付着させる（当該ポリペプチドまたは抗体に直接付着されるか、または例えばキレート部分を介して間接的に付着させる）。またポリペプチドまたは抗体は、アドリアマイシン等の細胞毒性剤にも接合され得る。検出可能な分子または細胞毒性分子を間接的に付着させるために、当該ポリペプチドまたは抗体部分に結合される他の部材に検出可能な分子または細胞毒性分子を相補/抗相補対の部材と接合させることができる。これらの目的のためのビオチン/ストレプトアビジンは、例示的な相補対/抗相補対である。
【００５７】
結合ポリペプチドはIL-31 "アンタゴニスト"としても作用するので、in vitro 及びin vivoにおいてIL-31結合及びシグナル伝達を遮断することができる。これらの抗-IL-31結合ポリペプチドは、IL-31活性またはタンパク質結合を阻害するのに有用であり得る。
【００５８】
皮膚ホーミングT細胞及び表皮ケラチノサイトは共にヒトの皮膚疾患の病変に関与するとされてきた。T細胞サブセットについて本明細書の実施例１に示す通り、IL-31 mRNA 及びタンパク質発現は、ヒト中の皮膚ホーミングCLA+ T細胞集団に限定される。抗体または受容体アンタゴニストを含むIL-31に対するアンタゴニスト自体は、CLA + T細胞によって仲介される皮膚及び表皮性疾患の治療において有用であるだろう。かかる疾患は、例えば、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬、薬物誘導アレルギー反応、皮膚指向性ウィルス及びウィルスに関連した掻痒、白斑、皮膚のT細胞リンパ腫、円形脱毛症、酒さ、尋常性座瘡、結節性痒疹、及び水疱性類天疱瘡を含む。
【００５９】
アトピー性皮膚炎
アトピー性皮膚炎(AD)は、慢性的に再燃する炎症性皮膚疾患であり、過去数十年間に渡り劇的に増加している事象である。臨床的にはADは、高度に掻痒性でありしばしば剥離されたプラークによって特徴付けられ、そしてプラークは慢性的な再燃経過を示す。ADの診断は、主に大きな臨床的発見及び小さな臨床的発見に基づく。Hanifin J.M., Arch Dermatol: 135, 1551 (1999)を参照。組織病理学では、急性病変における海綿状態、高度且つ局所的錯角化を示すが、顕著で高度な表皮過形成及び角化症、アカントーシス/顆粒層肥厚及びリンパ球による皮膚の血管周囲の浸潤及び豊富な肥満細胞は、慢性病変の顕著な特徴である。
【００６０】
T細胞は組織中の局所免疫応答の開始において中心的な役割を果たし、そしてエビデンスは特に皮膚湿潤性T細胞が、皮膚中の脱制御された免疫応答の開始及び維持において主要な役割を果たし得ることを示唆する。皮膚の炎症性部位において約90％の湿潤T細胞は、表皮上の誘導性接着分子であるE-セレクチンと結合する皮膚のリンパ球関連Ag (CLA+)を発現する(概説Santamaria-Babi L.F.,等., Eur J Dermatol: 14, 13, (2004))。コントロール個体と比べてAD患者での循環CLA+ T細胞の有意な増加は実証され(Teraki Y.,等., Br J Dermatol: 143, 373 (2000)を参照)、他にもAD患者由来の記憶CLA+ T細胞がCLA-個体群と比較して優先的にアレルゲン抽出物に応答することが実証された(Santamaria- Babi, L.F.,等., J Exp Med: 181, 1935, (1995)参照)。ヒトにおいて、皮膚の指向性疾患の病変は、増加したレベルのTh-2-タイプのサイトカイン様IL-5及びIL-13 9、10を発現するCLA+ T細胞の増加と関連してきた。Akdis M.,等., Eur J Immunol: 30, 3533 (2000);及びHamid Q.,等., J Allergy Clin Immunol：98, 225 (1996)を参照。
【００６１】
NC/Ngaマウスは、非-特定病原体不存在(非-SPF)条件で飼育した場合、約6〜8週齢で、経過及びサイン、組織病理学及び免疫病理学を含む多くの観点においてヒトADと同等にAD-様病変を自発的に発達させる。対照的に、SPF条件下で保持したNC/Ngaマウスは、皮膚病変を発達させない。しかしながら、自然発症の皮膚病変の開始とスクラッチング挙動(scratching behaviour)は、SPF施設中で飼育したNC/Ngaマウスにおいて、毎週の粗イエダニ抗原の皮内注入によって同期化され得る。Matsuoka H.,等., Allergy: 58, 139 (2003)を参照。従って、NC/NgaにおけるADの発達は、ADの新規治療を評価するための有用なモデルである。
【００６２】
自然発症ADのNC/Ngaモデルに加え、OVAを用いるマウスの皮膚感作は、感作マウスの皮膚中に浸潤する単核細胞により抗原依存性の表皮及び真皮肥厚を誘導するためのモデルとしても使用することもできる。これは通常、総IgE及び特異的IgEの上昇した血清レベルと一致するが、しかしながら皮膚バリア機能不全または掻痒は、このモデル中で正常に発症しない。Spergel J.M.,等., J Clin Invest, 101: 1614, (1998)を参照。このプロトコールは、OVAを有するDOl1.10 OVA TCRトランスジェニックマウスを感作することによって皮膚バリア脱制御と掻痒を誘導するために改良され得る。感作抗原を認識できる抗原特異的T細胞の数の増加は、皮膚中の炎症レベルを増加させて、明らかなスクラッチング挙動及び皮膚の苔蘚化/スケーリングを誘導し得る。
【００６３】
NC/Nga自然発症ADモデル及びOVA皮膚のDOl1.10モデルは、共にADにおけるIL-31及びIL-31RAの発現を調査するために使用される。実施例3を参照。
【００６４】
1L-31中和アンタゴニストは、アトピー性皮膚炎反応を阻害し、減少し、最小化し、または予防するために有効であり得る。
【００６５】
接触皮膚炎
アレルギー性接触皮膚炎は、皮膚に接触する抗原に対するT細胞仲介免疫反応として定義される。CLA+ T細胞集団は、アレルゲン依存性T細胞応答がCLA+細胞集団に大いに制限されるので、皮膚炎の開始に関与すると見なされる(Santamaria-Babi, L.F.,等., J Exp Med:l81, 1935, (1995)参照)。近年のデータでは、CD8+ T細胞ではなく、記憶(CD45RO+) CD4+ CLA+T細胞のみが増殖し、そして通常の接触過敏性アレルゲンであるニッケルに対する応答においてタイプ-1(IFN-γ)及びタイプ-2(IL-5)サイトカインの両方を産生することが見出された。更に、CD4、CD45RO(記憶)またはCD69との組み合せにあるCLAを発現する細胞は、ニッケル特異的刺激の後に増加し、そしてケモカイン受容体CXCR3、CCR4、CCRlOを発現するが、CCR6は発現しない。Moed H.,等., Br J Dermatol:5l, 32, (2004)を参照。
【００６６】
動物モデルでは、アレルギー性接触皮膚炎がT-細胞依存性であること、及びアレルギー性-応答性T細胞がアレグゲン適用部位に移動することが実証されてきた。一般的に：Engeman T.M.,等., J Immunol: 164, 5207, (2000)；Ferguson T.A. & Kupper T.S. J Immunol: 150, 1172, (1993)；及びGorbachev A. V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol: 21, 451(2001)を参照。CLA+ T細胞はIL-31を産生し、そして皮膚ケラチノサイトのIL-31刺激は、炎症性のケモカインを誘導することができるので、IL-31は接触皮膚炎の病態生理学に関与し得る。実施例2の接触皮膚炎のin vivoモデルを参照。
【００６７】
IL-31中和アンタゴニストは、接触皮膚炎反応を阻害し、減少し、最小化し、または予防することにおいて有効であった。
【００６８】
薬物誘導遅延型皮膚アレルギー性反応
薬物誘導遅延型皮膚アレルギー性反応は非常に雑多であり、且つ多くの明らかな病態生理学的事象を反映し得る。Brockow K.,等., Allergy: 57, 45 (2002)参照。これらの反応に関与する免疫学的メカニズムは、抗体または細胞の介在のいずれかとして示されている。即時薬物アレルギーにおいて、IgEで仲介される抗体反応は、陽性皮膚プリック及び/または皮内試験によって20分後に実証することができるが、薬物に対する非-即時反応は、最後に薬物摂取後、１時間超で発生し得、且つしばしばT細胞で仲介される。非-即時性T-細胞仲介遅延型反応は、例えばペニシリンに対する薬物副作用を有する患者において発生し得る。ペニシリンに対する増殖性T細胞応答は、ペニシリンアレルーギー患者由来の記憶(CD45RO+) CLA+ T細胞の亜集団に限り示されてきたが、CD45RO+ CLA-サブセットは増殖反応がないことを示す。Blanca M., Leyva L.,等., Blood Cells MoI Dis:31, 75 (2003)参照。遅延型過敏性(DTH)反応は、マウスにおいて人工的に再生することができ、DTH応答の開始及び永続化に関与し得る因子の評価を可能にする。IL-31中和アンタゴニストは、遅延型過敏反応を阻害、減少、最小化、または予防するために有用であり得る。DTHのin vivoモデルに関する実施例4を参照。
【００６９】
中毒性表皮剥離症(TEN)は非常に稀だが、極度に重篤な薬物反応は、広範囲な発疹を有する表皮の広範囲に渡るアポトーシスによって特徴付けられる。研究では、リンパ球浸潤性の水膨れはCLA+ T細胞であり、そして表皮ケラチノサイトへの細胞毒性を示し得ることが示された。Leyva L.,等.,. J Allergy Clin Immunol: 105, 157 (2000)；及びNassif A., Bensussan A., 等., J Allergy Clin Immunol:ll4, 1209 2004)参照。OVAがマウスの表皮濾胞ケラチノサイト及び毛髪濾胞ケラチノサイト中のケラチン-5 (K5)プロモーターの制御下で発現するトランスジェニックマウス系は、TENの動物モデルを確立するために作製された。OVA 特異的CD8+ T細胞は、K5-OVAマウスに適合移植される場合、K5-0VAマウスの皮膚脱水リンパ節及び標的皮膚中で活性化及び増殖し、TENに結び付く皮膚病変の発達をもたらす。Azukizawa H.,等., Eur J Immunol: 33, 1879 (2003)参照。IL-31中和アンタゴニストは、TEN反応を阻害し、減少し、最小化し、または予防するために有効であり得る。
【００７０】
水疱性類天疱瘡
水疱性類天疱瘡は、好中球及び好酸球の皮膚浸潤による表皮下水泡として現れる表皮下疾患である。診断は、表皮及び真皮−上皮接合部の特異的接着タンパク質に対する抗原特異的抗体の存在によって特徴付けられる。Jordon R.E.,等., JAMA: 200, 751 (1967)参照。PBL及び皮膚水膨れT細胞を分析することによる水疱性類天疱瘡の発症におけるT細胞の役割を分析するための研究では、増加したレベルのTh2-サイトカイン様IL-4及びIL-13を発現するCLA+ T細胞の優位性が見出された。Teraki Y.,等., J Invest Dermatol: 117, 1097 (2001)参照。水疱性類天疱瘡患者における全身性コルチコステロイドでの治療後のインターロイキン-13-産生細胞はCLA+の頻度が有意に減少するが、CLA-の頻度は減少しない。コルチコステロイド治療後のCLA+細胞の減少は、臨床的な改善に付随する。Teraki, ibid参照。IL-31の中和は、水泡性の類天疱瘡の臨床的予後を改善し得る。IL-31中和アンタゴニストは、水疱性類天疱瘡を阻害し、減じ、最小化し、または予防するために有効であり得る。
【００７１】
円形脱毛症
円形脱毛症(AA)は、毛髪毛包の組織限定自己免疫性疾患と見なされ、毛包活性は、リンパ球浸潤物の継続された活性のせいで阻まれる。無毛の領域でさえ毛包の実際の損失は起こらないが、AAは身体上のどこでも、ところどころに完全な脱毛をもたらす。炎症の臨床サインが存在しないもかかわらず、活動性疾患部位由来の皮膚生検は、CD8+ 毛包内浸潤物と共に、主にCD4+細胞の毛包周囲のリンパ球炎症を示す。Kalish R.S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003)参照。
【００７２】
研究では、頭皮浸潤性のCD4+またはCD8+ リンパ球がCLAを示し、且つAAを有する個体の末梢血中のCLA+ CD4+ またはCD8+ リンパ球のパーセントは、正常コントロールよりも有意に高いことが見出された。更に、重篤または進行性のAAを有する患者は、当該疾患から回復した患者と比較してより高いCLA-陽性を示し、且つCLA+細胞パーセントの減少は、良好な臨床経過に並行する。Yano S.,等., Acta Derm Venereol: 82, 82 (2002)参照。従って、これらの研究は、CLA+ リンパ球がAAで重要な役割を果たすことを示唆する。異種移植モデルは活性化T細胞がAAの発症において役割を果たすことを実証した。ヌードマウスに移植したAA患者由来の病巣の頭皮は、移植片由来の浸潤リンパ球の欠失に対応して、毛髪を再生する。また活性化した病変T細胞のSCIDマウスへの移植は、SCIDマウス上のヒト頭皮外植片に脱毛を移すことができる。Kalish R.S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003)参照。
【００７３】
多様な免疫賦活療法は、この疾患の通常の治療の一環であるが、これらの治療はその効果において一貫性がない。Tang L.,等., J Invest Dermatol: 120, 400 (2003); Tang L.,等., (2004)；及びTang L.,等., J Am Acad Dermatol: 49, 1013 (2003)参照。中和抗-IL-31抗体は、AA発達の効果を制限し、減じ、阻害し、または予防するために有効であり得る。
【００７４】
尋常性座瘡/酒さ
毛嚢脂腺器の疾患である尋常性座瘡は、最も一般的な青年期の皮膚の問題である。毛包性(follicular)角質化における異常は、座瘡病変を生み出すと考えられている。酒さは、赤色丘疹、吹出物、嚢胞、及び広範囲な毛細血管拡張症の存在によって尋常性座瘡から識別されるが、面皰(白にきび)は存在しない。脂腺からの増加した皮脂排出は、尋常性座瘡の病態生理学における主要因子である。また座瘡患者の健常であるように見える腺の周辺の神経末端中で発現する皮脂の炎症性脂質；局所的に産生する多様なサイトカイン；腺周囲のペプチド及び神経ペプチド（脂腺細胞によって産生されるコルチコトロフィン放出ホルモン等）；及びサブスタンスPを含む他の脂腺機能は、座瘡の発達にも付随する。Zouboulis CC. Clin Dermatol: 22, 360 (2004)参照。
【００７５】
尋常性座瘡及び酒さの病態生理学は未知のままであるが、臨床的な観察と組織病理学試験は、毛嚢脂腺の毛包の炎症が酒さ及び尋常性座瘡の発症の中心と成り得ることを示唆する。酒さ病変を浸潤するT細胞サブセットの分析に関する初期の研究は、大部分のT細胞がCD4を発現することを示した。Rufli T. & Buchner S.A. Dermatologica: 169, 1 (1984)参照。
【００７６】
CD4+ T細胞はIL-31を産生し、そしてIL-31発現に関する皮膚のIHC分析は、IL-31が皮脂腺及び汗腺において発現することを示唆する。表皮ケラチノサイトのIL-31刺激は、IL-31が皮膚における炎症性応答に寄与し得ることを示唆する細胞浸潤をもたらすと思われるケモカインの発現を導く。従ってIL-31は酒さ及び尋常性座瘡の病態生理学に寄与し得る。IL-31の中和は、尋常性座瘡及び酒さの臨床的な成果を改善し得る。IL-31中和アンタゴニストは、尋常性座瘡及び酒さを阻害、減少、最小化、または予防するために有効であり得る。
【００７７】
結節性痒疹
結節性痒疹は、難治性の掻痒によって引き起こされる苔癬化したまたは剥離化した結節の発疹であり、その治療は困難である。また慢性的な摩擦は、苔蘚化、及び直線状のすりむきのひっかき傷をもたらし、それらの痒く、ヒリヒリするような皮膚がつつき、えぐられた個体は、痒疹結節として知られる、顕著に肥厚化した丘疹を生み出す傾向にある。結節性痒疹はアトピー性皮膚炎に特異的ではないが、これらの結節を有する多くの患者は、アトピー性反応も有し、それはアレルギー性鼻炎、喘息、または食物アレルギーとして現れる。T細胞は痒疹病変において大多数の浸潤細胞を示し、そしてそれらの病変はしばしばアトピー患者において最も痒い皮膚病変を示す。
【００７８】
小さな知覚皮膚神経中の神経ペプチド様サブスタンスPの枯渇によって掻痒及び疼痛の知覚を妨げるカプサイシン、抗-掻痒性アルカノイドによる結節性痒疹の局所治療は、皮膚病変の除去をもたらす有効且つ安全な投与計画であることが証明された。Stander S.,等., J Am Acad Dermatol:44, 471(2001)参照。カプサイシン治療を用いるNC/Ngaマウスにおけるかゆみ応答の試験は、皮膚炎病変の自然的な発達がほとんど完全に予防されたことを示した。更に血清IgEレベルの上昇は有意に抑制され、且つカプサイシン処理マウスの病変皮膚中の浸潤好酸球数及び肥満細胞数は減少した。Mihara K.,等., Br J Dermatol: 151, 335 (2004)参照。この群からの観察は、スクラッチング挙動が多様な免疫応答を増強することによって皮膚炎の発達に寄与し得ることを示唆するので、かゆみ感及び/またはかゆみに関連したスクラッチング挙動を妨げることがADの治療に有効であり得ることを暗示している。Mihara K., 等., Br J Dermatol: 151, 335 (2004)参照。
【００７９】
IL-31の慢性的な送達は、マウスにおいて掻痒及び脱毛症を導き、その後、皮膚炎に似ている皮膚病変の発達を導き、IL-31が掻痒を導くことを示唆する。Dillon S.R.,等., Nat Immunol: 5, 752 (2004)参照。掻痒及び脱毛症を予防するためにIL-31で処理されたマウスのIL-31の中和は、実施例10で試験された。IL-31の中和は、結節性痒疹の臨床的予後を改善し得る。IL-31中和アンタゴニストは、結節性痒疹を阻害、減少、最小化または予防するのに有用であり得る。
【００８０】
皮膚指向性ウィルス及びウィルス関連掻痒
末梢血中の単純ヘルペスウィルス(HSV)-特異的CD8+ T細胞及びヘルペス病変から回収したHSV-特異的CD8+ T細胞は、高いレベルのCLAを発現するが、非-皮膚-指向性ヘルペスウィルス-特異的CD8+ T細胞はCLA発現を欠く。Koelle D.M.,等., J CHn Invest: 110, 537 (2002)参照。HSV-2反応性CD4+ Tリンパ球もCLAを発現するが、CD8+ T リンパ球で以前に観察されたレベルよりも低いレベルであった。Gonzalez J.C.,等., J Infect Dis: 191, 243 (2005)参照。掻痒は、ヘルペスウィルス感染にも付随してきたが(Hung K. Y.,等., Blood Purif: 16, 147 (1998)参照）、HIV等の他のウィルス性疾患もまた掻痒性の皮膚病変に付随してきた。いくつかの難治性の掻痒は、しばしば紅斑性丘疹の皮膚病変及び高度な好酸球増多症に付随し、いくつかの非アトピー性、HIV-感染患者36人において観察された症状である。Singh F. & Rudikoff D, Am J Clin Dermatol; 4, 177 (2003)；及びMilazzo F., Piconi S.,等., Allergy: 54, 266 (1999)参照。
【００８１】
掻痒を有する皮膚指向性ウィルスとCLA+ T細胞の関連性は、IL-31産生T細胞が、ウィルス性感染の病態生理学に関与し得ることを示唆する。従って、IL-31中和アンタゴニストは、ウィルス関連掻痒を阻害し、減じ、最小化し、または予防するために有効であり、そしてIL-31の中和は、ウィルス関連掻痒の臨床的予後を改善し得る。
【００８２】
IL-31は、GROα、(CXCLl)、TARC (CC117)、MIP3β、(CCL19)、MDC (CCL22)、MIP-3 (CCL23)、MIP-Iβ(CCL4)、及び1-309をコードする遺伝子を含む正常のヒト表皮ケラチノサイト(NHEK)においていくつかのケモカイン及びサイトカイン遺伝子を導くことが示されてきた。。Dillon S.R.,等., Nat Immunol: 5, 752 (2004)参照。TARC及びMDCはCCR4（Th2-型T細胞と関連し、そして末梢血においてCLA+ T細胞によって優位に発現されるケモカイン受容体）と結合する。両ケモカインは、T細胞のAD患者の皮膚への動員に関係があるとされ、これらのケモカインがADの発症に付随した炎症過程に寄与することが示唆されている。IL-31アンタゴニストを投与することによってCLA+ T細胞を介した疾患におけるTARC及びMDCレベルの減少を測定するためのモデルに関する実施例9を参照。
【００８３】
乾癬は、7百万人超のアメリカ人が罹患する慢性的な皮膚状態である。乾癬は新しい皮膚細胞が異常に成長する時に発症し、古い皮膚が十分の速さで剥がれ落ちない場所で、炎症し、膨張し、及び皮膚の鱗屑状斑をもたらす。最も一般的な形態であるプラーク乾癬は、銀白色の鱗を上に乗せた皮膚の炎症斑("病変")によって特徴付けられる。 乾癬はいくつかのプラークに限定され、または広範な皮膚領域に中程度に関与し、最も一般的には頭皮、ひざ、ひじ及び胴体に現れる。それは非常に目立つが、乾癬は接触伝染性の疾患ではない。当該疾患の発症は、罹患組織の慢性的な炎症に伴う。本発明のIL-31RAポリペプチド、溶解性ヘテロ二量体性及び多量体性受容体ポリペプチド、または抗-IL-31抗体または結合パートナー等は、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚及び粘膜性アレルギー、並びに関連疾患における炎症性及び病理学的な影響を減じるための価値のある治療法として供され得る。
【００８４】
乾癬は皮膚のT-細胞仲介炎症性疾患であり、相当な不快症状を引き起こし得る。治療法は存在せず、且つ全ての年齢の人々に影響を与える疾患である。乾癬はヨーロッパ及び北米の人口のおよそ２パーセントが罹患する。軽度な乾癬を有する個体はしばしば局所剤でその疾患を制御することができるが、世界中で百万人を超える患者は、紫外線または全身性免疫抑制療法を要求する。あいにく、紫外線放射の不都合及びリスク並びに多くの治療の毒性がそれらの長期使用を制限する。更に、患者は一般的に乾癬の再発を有し、そしていくつかの場合では、免疫抑制療法を止めた後、すぐにリバウンドする。
【００８５】
当業者は、当業界で公知の方法及び本明細書で開示された方法を使用して、CLA+ T細胞と高い相関を有する疾患中のIL-31を検出することができる。かかる方法は、患者から血液、唾液、または生検等の生物学的サンプルを採取することを必要とし、そしてそれを正常のコントロールサンプルと比較する。組織学的、細胞学的、流動細胞的、生化学的等の方法は、正常コントロールと比較した患者サンプル中のIL-31の相対レベルまたは局在化、或いはIL-31を発現する細胞、すなわち単球を決定するために使用され得る。IL-31発現のレベルの変化(増加または減少)、または単球の数の変化もしくは局在性(例えば、単球細胞が正常に存在しない組織中の単球細胞の増加または浸潤 )は、コントロールと比較して、疾患の指標となるだろう。かかる診断方法は、例えばTARC及びMDCを測定することも含むことができる。かかる方法は、当業者に周知であり、本明細書において開示されている。
【００８６】
IL-31RA受容体ポリペプチド、及びそれらに対する抗体と結合するIL-31ポリペプチドは、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、薬物誘導遅延型皮膚アレルギー反応、中毒性表皮剥離症、皮膚のT細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスの治療において、IL-3IRA含有受容体を介するシグナル伝達を拮抗または遮断するのに有用である。
【００８７】
またIL-31はCLA+ T細胞によって仲介されるリガンドの循環レベルを検出するための診断システム、及びその疾患の検出においても使用され得る。またIL-31はCLA+ T細胞に高い相関を有するリガンドの循環レベルを検出するための診断システム 、及びその疾患の検出においても使用され得る。関連の態様ではIL-31に特異的に結合する抗体または他の物質は、循環IL-31 ポリペプチドを検出するために使用することができ；逆に、IL-31それ自体は、循環または局所的に作用する受容体ポリペプチドを検出ために使用することができる。上昇または低下したレベルのリガンドまたは受容体ポリペプチドは、炎症及び掻痒を含む病理学的条件の指標と成り得る。
【００８８】
一般的に、IL-31抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的健康状態及び過去の病歴のような因子に依存して変化するだろう。当業者は、当業界で公知の方法を用いてかかる投与量、及びそれらの調整を用意に決定することができる。
【００８９】
抗-IL-31抗体の対象への投与は、吸入、 静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、として、局所カテーテルを介するかん流によって、または直接的な病巣注入によって局所的、皮内で可能である。治療用タンパク質を注入によって投与する場合、当該投与は、継続注入または単回もしくは複数回のボーラスによってよい。
【００９０】
更なる投与経路は、経口、経粘膜、経肺、及び経皮を含む。経口送達は、ポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、プロテノイドマイクロスフェア、ポリシアノアクリレートマイクロスフェア、及び脂質基礎系に適している(例えば、DiBase及びMorrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), ページ255-288 (Plenum Press 1997)を参照)。鼻腔内送達の実施可能性は、インスリン投与の様式等によって例示される(例えば、Hinchcliffe及びIllium, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)参照)。IL-31を含む乾燥または液体粒子が調製され、乾燥パウダー分散剤、液体エアロゾル発生器、または噴霧器の補助により吸入され得る(例えば、Pettit及びGombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton等, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999))。このアプローチは、肺にエアロゾル化したインスリンを運搬する持ち運びできる電子吸入器であるAERX糖尿病管理システムによって説明される。試験は、48,000 kDaもの大きさのタンパク質が、低周波の超音波の助けにより、治療濃度で皮膚を介して運搬されたことを示し、それは経皮投与の実行可能性を説明する(Mitragotri等, Science 269:850 (1995))。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、IL-31結合活性を有する分子を投与するための他の手段を提供する(Potts等, Pharm. Biotechnol. .10:213 (1997))。
【００９１】
タンパク質、ポリペプチド、またはIL-31結合活性を有するペプチドを含む医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従い製剤化され得る。それによって、治療用タンパク質は、医薬的に許容され得る担体と共に混合物中に組み合される。組成物はその投与が受容する患者によって耐性であり得るならば、"医薬的に許容され得る担体"であると言われる。殺菌リン酸緩衝生理食塩水は、医薬的に許容され得る担体の一例である。他の適切な担体は、当業者に周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)参照。
【００９２】
治療の目的にために、IL-31結合活性を有する分子及び医薬的に許容され得る担体は、治療有効量で患者に投与される。IL-31結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、及び医薬的に許容され得る担体の組み合せは、投与される量が生理学的に有意であるならば、"治療有効量"で投与されると言われる。ある薬剤の存在が受容患者の生理機能に検出可能な変化をもたらす場合、その薬剤は生理的に有意である。例えば炎症を治療するために使用される薬剤は、その薬剤の存在が免疫応答の少なくとも一部分を軽減する場合、生理学的に有意である。同様に、CLA+ T細胞に仲介される疾患、または CLA+ T細胞に高い相関を有する疾患に付随するかゆみ及び掻痒を治療するために使用される薬剤は、その存在が掻痒またはかゆみ応答の少なくとも１部分を軽減する場合、生理学的に有意である。
【００９３】
IL-31抗体を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で供され得る。液体形態は、注入可能溶液、エアロゾル、液滴、位相溶液及び経口懸濁物によって説明される。例示的な固体形態は、カプセル剤、錠剤、及び徐放形態を含む。後者の形態は、ミニ浸透圧ポンプ及びインプラントによって説明される(Bremer等, Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery,"、Drug Delivery Systems, Ranade及びHollinger (eds.),ページ95-123 (CRC Press 1995); Bremer等, "Protein Delivery with Infusion Pumps,"Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.),ページ239-254 (Plenum Press 1997); Yewey等, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,"Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.),ページ93-117 (Plenum Press 1997))。他の固体形態は、クリーム、ペースト、他の位相適用等を含む。
【００９４】
IL-31結合活性を有するポリペプチドは、タンパク質マイクロカプセル化の標準技術を用いてリポソーム中に封入され得る(例えば、Anderson等, Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson等, Cancer Res. 50:1853 (1990),及びCohen等, Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving等 "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," Liposome Technology, 2nd Edition, Vol.III , Gregoriadis (ed.), ページ317 (CRC Press 1993), Wassef等, Meth. Enzymol 149:124 (1987)を参照)。上記のような治療的に有用なリポソームは、多様な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen等, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【００９５】
他の投与形態は、例えば、Ansel及びPopovichによる、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.)、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、及びRanade及びHollingerによる、Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)に示す通り、当業者によって考え出され得る。本発明は、以下の限定的はない実施例によって更に説明される。
【実施例１】
【００９６】
刺激によりIL-31を発現するヒト一次T細胞型の決定
A. 試験対象と生検の選定
ADを有する12人の患者(中等度から重度な疾患；年齢の中央値は32歳であり、5〜45％の皮膚浸潤を有する)、乾癬を有する6人の患者(年齢の中央値は56歳であり、10〜65％の皮膚浸潤を有する)及び12人の健常人(年齢の中央値は34歳)をインフォームドコンセントの後、A試験に含めた。任意の全身性コルチコステロイドを以前に受けていた患者はいない。全ての患者は、彼らの皮膚生検または採血を行う前の一週間は局所性コルチコステロイドを絶った。２mmのパンチ生検を1)発症から３日未満の急性紅斑AD病変、2)２週間を超える慢性、苔癬化AD病変、3)慢性乾癬病変、及び4)正常皮膚から採取した。この皮膚サンプルを免疫組織化学またはウェスタン及びイムノドットブロッティングのために-70℃で素早く凍結した。
【００９７】
B. 一次ヒトT細胞サブセットの単離及び活性化：
多様なT細胞サブセットを単離するために、ドナー由来のヒトPBMCsを標準のFicoll 勾配遠心分離を用いて単離した。そして全てのT細胞を、製造業者の指示に従いT細胞単離キットII (Miltenyi Biotec)を用いて単離した。分離効率は、標準のフローサイトメトリーを用いて評価し、そして＞95％のT細胞があることを決定した。CD45RO+ "記憶" T細胞からCD45RA+ "未感作"T細胞を分離するために、全てのT細胞集団を抗-CD45ROマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)と共に、15分間、+4℃で培養し、そして製造業者の指示に従い磁気的に分離した。未感作及び記憶T細胞集団をフローサイトメトリーにより＞90％の純度であることを測定した。
【００９８】
CD45RO+記憶T細胞はしばしば組織特異的であり、そして皮膚のリンパ球抗原(CLA)は皮膚ホーミングT細胞を、表面でα4/β7を発現している腸管ホーミングT細胞から識別するために使用される。IL-31を産生する細胞の型を決定するために、CLA+ T細胞を全てのT細胞から単離し、活性化及び条件化した培地をIL-31バイオアッセイのために収集した。これを行うために、全てのT細胞を単離し、その後、氷上で、20分間、1 mL の抗-CLA-FITC抗体(PharMingen)の1：50希釈物中で培養した。その後細胞を洗浄し、MACS緩衝剤中で再懸濁し、そして抗-FTTCマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)と共に、15分間、+4℃で培養した。その後、細胞を洗浄し、再懸濁し、そしてLSカラムで、製造業者の指示に従い、磁気的に分離した。ラベル化したT細胞を、後に＞80％の純度であることを測定したが、CLAが枯渇したT細胞は、＞98％がCLA-であった。CLA+及びCLA- T細胞は、共に収集され、そして同時に培養された。
【００９９】
CD45RA+及びCD45RO+ T細胞サブセットを活性化するために、細胞を、一晩、2.0 μg/mLの抗-CD3抗体(Southern Biotechnology)であらかじめ処理した24ウェル組織培養プレート中で培養した。細胞を2.5x106細胞/mLの濃度で、組織培養培地(RPMI、5％ウシ胎仔血清、L-グルタミン及びピルビン酸ナトリウム(全てGibco))中に播種し、2.0μg/mLの抗-CD28(Southern Biotechnology)を補充し、そして＋37℃の培養器に置いた。４時間後、ウェルの半数を採取し、細胞をペレット化し、そしてIL-31バイオアッセイの時まで、培地を-20℃に凍結する条件にした。
【０１００】
CLA+及びCLA- T細胞サブセットは、2.0μg/mL抗-CD3 抗体(Southern Biotechnology)で予め処理した48ウェル組織培養プレート中で同様に活性化した。細胞を16時間または24時間、+37℃の培養器中で、6.25x105細胞/mLの濃度で活性化した。サンプルを採取し、細胞をペレット化し、そしてIL-31バイオアッセイの時まで-20℃で凍結する培地に条件化した。準最適な活性化のために、CLA+ T細胞を、0.5 μg/mlの抗-CD3抗体で予め処理したプレート中で培養した。
【０１０１】
C. ヒトIL-31バイオアッセイプロトコール：
hIL-31RA、hOSMRB、及びKZ134(転写活性化ルシフェラーゼレポーターの単一のトランスディーサー及びアクチベーター)でトランスフェクトしたBAF3細胞を、5x105及び1x106細胞/mLに育てた。細胞をアッセイ培地で洗浄し(RPMI 1640、10% FBS, L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、及びPen/Strep(全てGibco))、そしてアッセイ培地中で、3x105細胞/mLで再懸濁した。96ウェル不透明プレート(opaque plate)中で、100μL/ウェルを介するアッセイ培地の1：2の連続希釈において、hIL-31標準品を 600 pg/mL〜9.38 pg/mLの複製(duplicate) 中で滴定した。品質コントロール標準品を100μL 中の350 pg/mL及び35 pg/mLでのプレートに対する複製の中に付加した。試験サンプルを1：2または1：4に頻繁に希釈し、そして同一のサンプルウェルに対する複製中に付加した。その後、3x104細胞/ウェルの最終濃度にするために、100 μLの洗浄したBAF3細胞を個々のウェルに付加した。その後、当該プレートを、16-24時間、+37℃で、5％のCO2培養器中で培養した。その後、プレートを1200RPMで、５分間遠心し、培地をはじき飛ばし、そして25μL/ウェルの溶解緩衝剤(Promega)を各ウェルに付加した。10分後、当該プレートを照度計(Berthold)上で読んだ。照度計は、40μL/ウェルのルシフェラーゼ基質混合(Promega)を付加され、そして4秒間発光をまとめた。発光値は１mLの容量ごとに106個の細胞ごとに解析されて、そしてIL-31がピコグラムに変換される集計表に運ばれた。データは表１に要約されている。
【０１０２】
D. IL-31バイオアッセイの結果：
CD45RA+及びCD45RO+ T細胞サンプルからの結果は、1L-31が活性化CD45RO+ 記憶T細胞によって一次的に産生されたことを明らかにした。両ドナー由来のCD45RA+ 及びCD45RO+ T細胞は、刺激されなければ、検出可能なIL-31を産生しなかった。しかしながら、両ドナー#3及び#4由来のCD45RO+ サンプルは、プレートに結合した抗-CD3及び溶解性の抗-CD28(それぞれ110.4pg/106細胞/mL及び145.6 pg/106細胞/mL)により24時間活性化した後、有意なレベルのIL-31を産生した。反対に、ドナー#3及び#4からのCD45RA+ T細胞が抗-CD3及び抗-CD28により活性化された場合、それらは、非常に低い量のIL-31（それぞれ13.1 pg/106細胞/mL及び12.7 pg/106細胞/mL）を産した。
【０１０３】
CLA+及びCLA- T細胞サンプルは、IL-31が活性化CLA+ T細胞によってほとんど完全に作られるようだということを明らかにした。両ドナーのCLA-個体群のT細胞(未感作T細胞、α4/β7 腸管ホーミング記憶T細胞、及び組織中立T細胞を含む)は、時点または活性化状態でも、検出可能なレベルのIL-13を産生しなかった。一方、当該CLA+ T細胞は、 2.0μg/mLのプレートに結合した抗-CD3抗体により刺激した場合、非常に高いレベルのIL-31を産生した。ドナー#5は、1385.7 pg/106細胞/mLのIL-31を16時間で産生し、そして＞1920 pg/106細胞/mLのIL-31を24時間で産生した。ドナー#6は、121.3 pg/106細胞/mLのIL-31を16時間で産生し、そして328.9 pg/106細胞/mLのIL-31を24時間で産生した。T細胞サブセットについてのこれらの結果は、IL-31が標準的な活性化条件下にある皮膚の(CLA+)T細胞によって特異的に作られるようであることを明確に実証する。
【０１０４】
【表１】
【実施例２】
【０１０５】
接触過敏症の発症と永続化におけるIL-31の関与
A. 方法I
アセトン：オリーブオイル(4：1)溶液中に溶解した25μlの0.5％DNFB(2,4, ジニトロ-フルオロ-ベンゼン, Sigma, St. Louis MO)を、分注器を用いて、BALB/cマウスの毛を剃った中央背部に塗布した。ビヒクルコントロール群は、25μlのアセトン：オリーブオイルのみを受けた。5日後、マウスを吸入チャンバー中でイソフルオラン麻酔にかけ、そして実験動物及びコントロール動物の耳介を、技術者用のマイクロメーター(Mitutoyo)で計測し、評価基準を得る。その後、全てのマウスのそれぞれの耳の両側部をアセトン：オリーブオイル(4:1)中の10 μlの0.25% DNFBに適用させることを試みる。接触過敏症は、後に、24時間及び48時間で右耳(変化した)及び左耳(変化しない)の違いとして測定する。全ての測定は、技術者用のマイクロメーターで行われる。基準値は、未感作マウスの変化した耳及び未変化の耳の間の耳の脹れの違いで決定される。
【０１０６】
FACS及び/またはELISA分析のための全血及び血清は殺す前に集め、そして耳は組織学用に収集される。
【０１０７】
方法II(Th2応答の誘導)
1：1のアセトン/フタル酸ジブチル(MSDS入手可能)の溶液中の100μlの0.5% FTTC (フルオレセインイソチオシアネート)を、分注器を用いて、1、2及び8日目に、BALB/cマウスの毛を剃った中央背部に塗布する。13日目にマウスに吸入チャンバー中でイソフルオラン麻酔をかけ、そして実験動物及びコントロール動物の耳介を、技術者用のマイクロメーター(Mitutoyo)で計測し、評価基準を得る。マウスのそれぞれの耳の背面部を0.5% FTTC（1：1のアセトン/フタル酸ジブチル)に適用させることを試みる。接触過敏症は、後に、24時間及び48時間で右耳(変化した)及び左耳(変化しない)の違いとして測定する。全ての測定は、技術者用のマイクロメーターで行われる。基準値は、未感作マウスの変化した耳及び未変化の耳の間の耳の脹れの違いで決定される。FACS及び/またはELISA分析のための全血及び血清は殺す前に集め、そして耳は組織学用に収集される。
【０１０８】
方法III (ThI応答の誘導)
25μlの2％のオキサザロン(oxazalone)(4：1のアセトン/オリーブオイル中)を、分注器を用いて、BALB/cマウスの毛を剃った中央背部に塗布する。7日目にマウスに吸入チャンバー中でイソフルオラン麻酔をかけ、そして実験動物及びコントロール動物の耳介を、技術者用のマイクロメーター(Mitutoyo)で計測し、評価基準を得る。マウスのそれぞれの耳の背面部を８μlのオキサザロンに適用させることを試みる。接触過敏症は、後に、24時間及び48時間で右耳(変化した)及び左耳(変化しない)の違いとして測定する。全ての測定は、技術者用のマイクロメーターで行われる。基準値は、未感作マウスの変化した耳及び未変化の耳の間の耳の脹れの違いで決定される。FACS及び/またはELISA分析のための全血及び血清は殺す前に集め、そして耳は組織学用に収集される。
【０１０９】
接触過敏症の発症及び永続性におけるIL-31の関与は、実験の感作段階及び試行段階の両方でIL-31に対する抗体を中和することを用いて試験される。
【実施例３】
【０１１０】
アトピー性皮膚炎におけるIL-31の関与
A. 方法I(NC/Ngaマウスの感作)
雄性NC/NgaマウスをCharles River Laboratories,日本から購入した。当該マウスは、購入時に4週齢であり、そしてSPF隔離条件で、4週間飼育して順応させた。当該マウスがおよそ10〜11週齢になったら抗原感作を開始した。マウスをイソフルオランで麻酔し、そして背中を電気バリカンで剃った。およそ10μgのヤケチョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)(Dp)(Indoor Biotechnologies, Charlottesville, Virginia,特注)抽出物を、５〜６週間ごとに３回、マウスの皮膚病変が発達するまで、首筋に皮下注入した。コントロール動物は、週に３回、皮内に10μlのPBSを受けた。Dp抽出物はMatsuoka等による方法に従い調製されたMatsuoka H.,等., Allergy: 58, 139 (2003)。簡単には、595mgのDp凍結乾燥スペント培養抽出物を、12mLの殺菌PBS(Gibco)に溶解させた。Dpを50mLのFalcon管中のシェーキングロッカー上で30分間混合した。当該抽出物を10分間、2000rpmで回転させ、そして浮遊物を収集し、そして1mLの冷凍バイアル管の中に分量し、そして−20℃で貯蔵した。
【０１１１】
B. 方法II(DOl1.10マウスの感作)
DO11.10トランスジェニックマウスを室内のコロニーで繁殖し、そして9.5〜14週齢で抗原感作を開始した。皮膚感作する前の24時間、マウスをイソフルオランで麻酔し、そして マウスの胴体全て(背中と腹部)を電気バリカンで剃った。その後、当該マウスの背中を、エラスチン外科手術用テープ(Johnson and Johnson)でテープストラップした。1cm2殺菌ガーゼパッチを500μgのオボアルブミン(Calbiochem 32467)または殺菌PBS(Gibco)のいずれかで湿らせ、そしてマウスの左背面にDuoDerm Extra Thin Dressing(ConvaTec 187932)と共に付着させた。その後、当該パッチとドレッシングは、エラスチン外科手術用テープを体にラップし覆うことで、マウスがパッチを取り除いたり、または破壊することができなくした。パッチは7日間付けられ、そして取り除かれた。当該マウスを、皮膚感作の他のラウンドを有す前に、２週間休息させた。マウスは１週間、計３回の感作を受けた。
【０１１２】
結果：
イエダニ感作NC/Nga及びOVA感作DO11.10動物由来の病変及び非病変皮膚におけるIL-31RA発現の免疫組織化学的分析は、IL-31RAがマウスにおける表皮ケラチノサイトによって発現することを示したが、本試験の抗原感作動物とPBS感作動物の間に発現レベルに有意な差異は見出されなかった。
【実施例４】
【０１１３】
遅延型過敏症のIL-31の関与
A. 方法
DTH応答を生み出すために、0日目に、尾基底で、完全なFreund'sアジュバント(CFA、50〜100μlの総容量)中の100 μgの オボアルブミン(OVA)により皮下を免疫化することによってマウスを抗原に対して感作した。1週間後、マウスを吸入チャンバー中でイソフルオラン麻酔にかけ、そして実験動物及びコントロール動物の耳介を、技術者用のマイクロメーター(Mitutoyo)で計測し、評価基準を得た。いかなる静脈にもぶつからずちょうど皮膚の下のマウスの左耳介へPBS中の10μgのOVAを、10μlの総容量で、経皮投与することを試みた。コントロールとしてのマウスも右耳介に10μlのPBSの注入を受けた。 いくつかの場合では、耳にOVAの皮内注入を受けた別のコントロール群は、更に反応を阻害するための陽性コントロールとして局所コルチコステロイドでも処理され得る。試行後の24時間及び48時間に、マウスに麻酔をかけ、そして耳の厚さを測定した。結果は、特異的な耳の脹れ＝実験対象の耳について(24時間目測定−0時間目測定)−ネガティブコントロールの耳について(24時間目測定−0時間目測定)として表した。DTHの特質である硬結(induration)は、感作抗原注入後18時間で検出され、そして24〜48 時間で最大となった。明白な硬結の発症における遅れは、"遅延型"の応答と言われる由縁である。
【０１１４】
B. 結果
IL-31トランスジェニックマウスをDTHについて試験したが、未試行のIL-31トランスジェニック動物における耳の厚さの上昇のせいで、当該試験ではIL-31トランスジェニック動物と野生型のコントロールとの間の比較において、DTHの統計学的に有意な差異を認めることができなかった。IL-31受容体ノックアウト動物も、DTH応答において試験され、そしてDTH応答について、受容体ノックアウト動物と野生型動物の間に有意な差異が観察されなかった。
【実施例５】
【０１１５】
乾癬性及びアトピー性皮膚炎とは関係ない皮膚病変におけるIL-31の免疫組織化学的(IHC)染色
乾癬性、アトピー性とは関係ない皮膚炎及び正常皮膚を、IHCによりIL-31リガンドについて試験した。BHK細胞から成る陽性コントロール細胞を、IL-31でトランスフェクトした。陰性コントロールは(1)非トランスフェクトBHK細胞、(2)典型的な組織及び細胞を正常ウサギ血清を精製したタンパク質Aで染色し、そして通常通り抗体の結合を検出すること、を含んで実施された。抗体試薬は、E5758(ウサギ抗-huIL-31 CEE, Aff. 1.0 mg/mlで精製された)であった。コントロール細胞は、C02-6020：zcytorl7 Lig hu-CEE/21を発現するBHK細胞、及びBHK野生型を含んだ。試験された組織は、急性アトピー性皮膚炎皮膚サンプル、慢性アトピー性皮膚炎皮膚サンプル、影響されていない領域の皮膚サンプル、及び正常のコントロール皮膚サンプル及び他の室内コントロールサンプルを含んだ。
【０１１６】
上記の細胞及び組織は、一晩、10％のNBFで固定され、そして標準的な技術を用いてパラフィンに包埋された。
【０１１７】
組織接着のために、5μMのセクションを61℃で、30分間焼いた。その後、スライドをキシレン中で3X5'に脱ろうし、そして以下の順番で段階的なアルコールを通して再度水分を補給した：100% EtOH 中に2X2'、X95% EtOH中に2x2'、70% EtOH 中に1x2'。スライドをdH20中ですすぎ、その後、熱誘導エピトープ回復(HIER)を20分間蒸気下で行い、その後、20分間、10mM Tris、1mM EDTA、pH 9.0の中で、室温に冷却した。
【０１１８】
スライドをDakoCytomation Autostainer上にのせた。スライドをTBS/Tween緩衝液(TBST)ですすぎ、製造業者により薦められる通りに調製した。内因性のビオチンは、アビジン溶液中で10分間培養することで遮断し、TBST中で洗浄し、その後、ビオチン溶液中で10 分間培養した。スライドをTBST中で洗浄した。タンパク質遮断剤(PBSB)(PBS 中に0.5%の遮断パウダー, Perkin Elmer NEL700001KT)を30分間適用し、そしてスライドをすすいだ。一次抗体を500ng/mlに希釈し、そしてChemMate抗体希釈緩衝剤(part# ADB250, Ventana Medical systems)を60分間適用した。
【０１１９】
組織をTBST中で２回洗浄し、その後、PBSB(カタログ#BA-1000, Vector Labs)中のビオチン化ヤギ抗-ウサギAb、750ng/ml中で45分培養した。スライドをTBST中で2回洗浄した。Vectastain Elite ABC試薬(カタログ#PK-7100, Vector Labs)を45分間培養した。スライドをTBST中で２回洗浄した。シグナルをDAB+ (カタログ#K-3468, DakoCytomation)で10分間、室温で発達させた。その後、組織スライドをヘマトキシリン(カタログ#H-3401 Vector Labs)中で対比染色し、脱水し、そしてVectorMount (カタログ#H-5000, Vector Labs)中でカバースリップした。
【０１２０】
結果：
1)細胞制御：
IL-31でトランスフェクトしたBHK細胞を、IL-31抗体E5758で陽性染色し、他方トランスフェクトしていない細胞はこの抗体に対して陰性であった。同様にトランスフェクトした細胞とトランスフェクトしていない細胞は抗ウサギ血清で陰性であった。
【０１２１】
2) アトピー性皮膚炎皮膚分析：
AD皮膚サンプル中のIL31の染色パターンは、乾癬皮膚について以前に報告されたものと等しく：ケラチノサイト及びCD3陽性T細胞は、IL31に対して陰性に染色された。弱いが汗腺の分泌部分中に上皮細胞の同一染色が存在するが、強力なシグナルは管部分中の内側上皮層においてで観察された。脂腺はIL31に陽性であった。ADと正常皮膚のIL31染色の間に差異は存在しなかった。
【０１２２】
乾癬性、アトピー性とは無関係の皮膚炎及び正常皮膚の免疫組織化学(IHC)染色は、脂腺のホロクリン分泌 においIL-31の強い染色を示した。IL31トランスジェニックマウスの表現型を考えれば、脂腺が毛包の外毛根鞘から上皮芽として作り出されることが興味深い。弱いながら脂腺が観察されたことに加えて、IL-31の単一の染色が汗腺の分泌部分中の上皮細胞中で観察され、そして内側の上皮層中の強いシグナルが汗腺の管の部分において観察された。
【実施例６】
【０１２３】
乾癬性及びアトピー性とは関係ない皮膚炎におけるIL-31RAの免疫組織化学(IHC)染色
乾癬性、アトピー性とは関係ない皮膚炎及び正常皮膚をIHCによりIL-31RAについて試験した。陽性コントロール細胞はIL-31RA及びOSMRで二重にトランスフェクトされたBHK細胞から成る。陰性コントロールは(1)非トランスフェクトBHK細胞、(2)典型的な組織及び細胞を正常ウサギ血清を精製したタンパク質Aで染色し、そして通常通り抗体の結合を検出すること、を含んで実施された。抗体試薬は、E6292(ウサギ抗-huIL-3 IRAs-CEE v.4、1.33 mg/ml)であった。コントロール細胞は、ヒトIL-31RAを発現するC02-5117 BHK細胞、及びヒトOSMR(ペレットにおける総細胞数：3.9 xl06、バイタリティーは＞90％であった)及びC04-1587：BHK野生型(ペレットにおける総細胞数：5 xl06)を含んだ。他の試験された組織は、5の急性アトピー性皮膚炎皮膚サンプル、10の慢性アトピー性皮膚炎皮膚サンプル、10の影響されていない領域の皮膚サンプル、及び正常のコントロール皮膚サンプル及び他の室内コントロールサンプルを含んだ。
【０１２４】
上記の細胞及び組織は、一晩、10％のNBFで固定され、そして標準的な技術を用いてパラフィンに包埋された。
【０１２５】
組織接着のために、5μMのセクションを61℃で、30分間焼いた。その後、スライドをキシレン中で3X5'に脱ろうし、そして以下のように段階的なアルコールを通して再度水分を補給した：100% EtOH 中に2X2'、X95% EtOH中に2x2'、70% EtOH 中に1x2'。スライドをdH20中ですすぎ、その後、熱誘導エピトープ回復(HIER)を、蒸気下で20分間行い、その後、20分間、10mM Tris、1mM EDTA、pH 9.0の中で、室温に冷却した。
【０１２６】
スライドをDakoCytomation Autostainer上にのせた。スライドをTBS/Tween緩衝液(TBST)ですすぎ、製造業者により薦められる通りに調製した。内因性のビオチンは、アビジン溶液中で10分間培養することで遮断し、TBST中で洗浄し、その後、ビオチン溶液中で10 分間培養した。スライドをTBST中で洗浄した。タンパク質遮断剤(PBSB)(PBS 中に0.5%の遮断パウダー, Perkin Elmer NEL700001KT)を30分間適用し、そしてスライドをすすいだ。665ng/ml〜1330 ng/mlに希釈されたIL31RA に関する一次抗体を60分間、ChemMate抗体希釈緩衝剤(part# ADB250, Ventana Medical systems)中に適用した。
【０１２７】
組織をTBST中で２回洗浄し、その後、PBSB(カタログ#BA-1000, Vector Labs)中のビオチン化ヤギ抗-ウサギAb、750ng/ml中で45分培養した。スライドをTBST中で2回洗浄した。Vectastain Elite ABC試薬(カタログ#PK-7100, Vector Labs)を45分間培養した。スライドをTBST中で２回洗浄した。シグナルをDAB+ (カタログ#K-3468, DakoCytomation)で10分間、室温で発達させた。その後、組織スライドをヘマトキシリン(カタログ#H-3401 Vector Labs)中で対比染色し、脱水し、そしてVectorMount (カタログ#H-5000, Vector Labs)中でカバースリップした。
【０１２８】
結果は表２に示す。
表２：ADに関係のある患者及びADに関係のない患者由来の皮膚生検標本の健常ボランティアと比較したIL-31RA に関するIHCの結果
【表２】
【０１２９】
ADの表皮皮膚サンプルではIL31RAのアップレギュレーションはなかった。おそらく、低いパーセンテージのCD3陽性T細胞は、AD皮膚中のIL31RAに陽性であった。試験された全ての皮膚サンプルにおいてCLA陽性細胞が存在した。AD皮膚は、正常またはUADサンプルよりもより多くのCLAが陽性の細胞を有し得る。
【０１３０】
IL-31、IL-31RAの受容体は、管部分と比較して、わずかに高いレベルのIL-31RAタンパク質を実証するエクリン腺の分泌部分に立方体の上皮細胞を有するエクリン汗腺の上皮細胞でも発現した。
【０１３１】
まとめると、これらのデータはIL-31RAがコントロールボランティアとAD患者の両方から由来する上皮ケラチノサイトによって発現することを実証する。しかしながら、AD皮膚生検由来のケラチノサイト上で発現したIL-31RAのレベルは、正常コントロール由来の皮膚生検において観察されたレベルよりも高く、ADに関してはIL-31に対して増加した反応性の可能性を示す。
【０１３２】
IL-31RAは、AD患者由来の皮膚生検中には存在するが、コントロール皮膚生検中には存在しない血管周囲の浸潤細胞のサブセットに発現することも見出された。これらのIL-31RA+細胞は、組織マクロファージマーカーCD68に特異的な抗体によって認識され、これらの細胞は皮膚浸潤組織マクロファージであることを示す。
【実施例７】
【０１３３】
レーザーキャプチャー顕微鏡及びRT-PCRによるIL-31MRNA 解析による皮膚浸潤細胞の単離
AD患者由来の皮膚生検中の皮膚浸潤T細胞の存在は、正常個体と比較して識別される特徴である。IL-31はT細胞関連サイトカインであるので、AD患者由来の組織生検中の皮膚浸潤T細胞におけるIL-31の発現を調査した。まず、正常個体と比較して、AD患者由来の皮膚組織生検中の増加した数のCD3+ T細胞の存在は、IHCによって確認された。表2参照。次に、レーザーキャプチャー顕微鏡は、RT-PCRによりIL-31 mRNAを分析するために、皮膚浸潤細胞を特異的に単離するために使用された。IL-31 mRNAは、急性AD患者由来の皮膚浸潤細胞によって発現した。正常組織では、浸潤細胞は正常に見出されないため、試験できなかった。しかしながら、AD及び正常皮膚の両方に存在する上皮ケラチノサイト層をIL-31 mRNA発現について分析し、そしてより低レベルのIL-31 mRNAが、ADサンプルの上皮ケラチノサイト層と比較して正常サンプルにおいて見出された。内部制御遺伝子(HPRT)と比較したIL-31 mRNA発現の半定量分析は、IL-31 mRNAレベルがADと正常サンプルの間において有意に異ならなかったが、AD患者由来の皮膚により高いIL-31発現への傾向が存在することを示した。
【実施例８】
【０１３４】
IL-31は皮膚ホーミング表現型を有する記憶T細胞によって産生する。
皮膚生検の分析では、IL-31 mRNAを発現する皮膚中の浸潤CD3+ T細胞が、皮膚ホーミングマーカーである皮膚のリンパ球抗原(CLA)を発現することを確認した。正常ヒト皮膚末梢血における総T細胞集団のIL-31発現は、CD45RA+ 天然T細胞集団とは反対にCD45RO+ 記憶/エフェクター細胞に大きく制限されることを見出した。
【０１３５】
IL-31産生がCLA+ 皮膚ホーミングT細胞に付随するか否かを決定するために、CLA+ 及びCLA- T細胞をADと診断された患者及びコントロールボランティアの末梢血から単離し、そしてIL-31 mRNAと抗-CD3プラス抗-CD28刺激によるタンパク質レベルを比較した。我々の結果は、IL-31 mRNAがAD及び正常個体から由来するCLA+ T細胞で、共に有意に上昇（刺激後4時間(AD及び正常は、CLA-と比べてCLA+がそれぞれ、p0.0087及びp0.0022)及び刺激後24時間(AD及び正常サンプルは、共にCLA-と比べてCLA+がp0.0022）したことを示す。培養上澄み中のIL-31タンパク質レベルの分析は、AD及びコントロール個体から由来するCLA-T細胞由来の培養上澄みにおいて検出可能なIL-31が存在しなかったように、IL-31がCLA+ T細胞によって優位に産生されることを確認した。AD患者及び正常人の間のIL-31のレベルの有意な差異は存在しなかった。我々は、更に正常ボランティア由来の腸管特異的ホーミングマーカーα4β7等の他の組織特異的ホーミングマーカーを発現する末梢血T細胞によるIL-31の産生を分析した。CLA+ T細胞とα4β7+ 細胞により産生されるIL-31レベルの比較では、CLA+ T細胞がα4β7+細胞と比較して優先的にIL-31を産生することが実証された(それぞれの平均は34.5 pg/ml及び14.42 pg/mlのIL-31).
【０１３６】
AD患者と正常コントロールは、活性化状態にあるIL-31を発現する循環CLA+ T細胞を有するが、AD患者からのCLA+ T細胞は、正常個体由来の細胞と比較してより活性化状態で存在すると報告されている。そのため、CLA+ T細胞によりIL-31の産生を要求する刺激閾値は、皮膚炎患者とコントロール対象の間で相違し得る。この仮説を検証するために、我々は、抗-CD28が存在しない中で、準最適化濃度の抗-CD3によりAD患者及びコントロール個体から由来するCLA+ T細胞を刺激し、そして刺激後24時間で、培養上澄み中のIL-31の産生を分析した。我々の結果では、数人のAD患者からの循環CLA+ T細胞が、正常個体由来の細胞と比較して、より高いレベルのIL-31を産生することを実証する（本試験では最高レベルは1200 pg/mLに到達する）。他方、正常のCLA+ 上澄みにおける最高検出レベルはほんの400 pg/mlであり、そして乾癬患者の最高検出レベルは、抗-CD3 刺激の準最適濃度で、73 pg/mlであった。１１人中５人のAD患者は、我々のアッセイの検出限界未満のIL-31レベルを示し、IL-31が低いレベルで産生されるAD患者のサブセットが存在し得ることを示唆する。これは我々の研究個体群の疾患段階のバリエーションを反映し得る。それでもなお乾癬患者と正常個体と比較して、抗-CD3での準最適の刺激によってAD患者の半数超がより高いIL-31レベルに向かう傾向を示した。正常個体と比較してより多くのCLA+ T細胞がAD患者の皮膚に局在するので、我々の研究は、AD皮膚の微小環境中で、IL-31活性の増加した能力が存在することを示唆する。従って、本研究は、IL-31を産生するより活性化したCLA+ T細胞を有するAD患者のサブ個体群を示唆し得る。
【実施例９】
【０１３７】
ADマウスモデルにおける抗-IL-31抗体に対する応答におけるTARC及びMDCの減少
方法I
６週齢の雄性NC/Ngaマウス(CRL日本)を50μg のイエダニ抽出物(D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies)で、１週間に３回、背中に皮下感作し、そしてAD-様病変をスコア化した。感作の5週間後、当該マウスを安楽死させ、そして右耳を切除し、そしてRPMI+2%FBS(GIBCO Invitrogen)を補充した48ウェルの培養皿(Corning)の単一のウェル中に置いた。プレートを5％のCO2湿度制御培養器中に置いた。上澄みを24時間後に収集し、そして更なる分析まで−20℃で凍結した。
【０１３８】
方法II
１２週齢の雌性NC/Ngaマウス(CRL日本)を10μg SEB (Toxin Technology)で、１週間に３回、耳の中と背中に皮下感作した。当該マウスをAD様病変についてスコア化した。感作５週間後、当該マウスを安楽死させ、そして6mmの生検パンチをそれぞれのマウスの注入した耳から採取し、そしてRPMI+2%FBSを補充した48ウェルの培養皿の単一ウェル中に置いた。プレートを5％のCO2湿度制御培養器中に置いた。24時間後に上澄みを収集し、そして更なる分析まで−20℃で凍結した。
【０１３９】
両試験におけるマウスの群は、感作後１〜２週から、毎週腹腔内に２回、ラット抗マウスIL-31モノクローナル抗体を10mg/kgで、またはビヒクルで処理した。
【０１４０】
24時間の上澄みサンプルのTARC及びMDC濃度は、慣用のELISA (R&D Systems)によって計測した。
【０１４１】
両試験におけるTARC及びMDCの濃度は、コントロールと比較して抗-ＩL-31処理マウス由来の耳の上澄みにおいて低かったが、これらの結果はANOVAによって分析した場合は、おそらくサンプルサイズのせいで統計学的に有意ではなかった。両実験からのデータが組み合されて分析される場合、処理群間の差異は統計学的に有意である。
【実施例１０】
【０１４２】
IL-31中和抗体の投与
およそ8〜12週齢の正常の雌性BALB/cマウス(CRL)の皮下に、１日にlμgのmIL-31を送達する14日間浸透圧ポンプ(Alzet, #2002)を移植した。マウスの群は、IL-31送達の１週間前から、ラット抗-マウスIL-31モノクローナル抗体10mg/kg (200μg/マウス)の腹腔内(i.p.)注入を、週に２回受けた。コントロール群のマウスは、同一の投与スケジュールでビヒクル(PBS/0.1%BSA)をi.p.注入で受けた。マウスは、以下の基準を用いて脱毛症と掻痒について毎日スコア化された：0＝スクラッチングがなく、動物が正常であることを示す、1＝狭い領域で覆いが薄くなり、スクラッチングに気付く、2＝軽度の脱毛(小さなパッチ)、スクラッチング、3＝中等度の脱毛、スクラッチング、及び4＝重度の脱毛、過剰なスクラッチング。
【０１４３】
全ての実験では、ラット抗-mIL-31 mAbで処理されたマウスは、およそ5〜7日間の兆候の開始の遅延を有し、且つ脱毛症及び掻痒の全てのスコアが低かった。mAb処理したマウスの全ての群(投与頻度または投与濃度に関係なく)は、コントロールマウスと同様に、試験１３日で、脱毛症及び掻痒を発達させた。これらのデータはIL-31の中和は、IL-31により誘導されるスクラッチ/脱毛応答の発症を遅らせることができることを示唆する。
【０１４４】
上記の本発明の特定の態様は、説明の目的のために本明細書で発表されるが、多様な改変が本発明の精神と範囲から逸脱することなく成され得ることが理解されるだろう。従って、当該発明は添付の特許請求の範囲を除くように限定されない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
罹患皮膚を治療する方法であって、該罹患皮膚を有する哺乳動物にアンタゴニスト分子を投与することを含んで成り、該罹患皮膚が皮膚リンパ球抗原陽性T細胞によって特徴付けられ、且つ該アンタゴニスト分子が配列番号：２または配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合することによって、該アンタゴニスト分子の投与が該罹患皮膚を改善し、予防し、阻害し、または減少させる方法。
【請求項２】
掻痒を処置するための方法であって、掻痒を有する哺乳動物にアンタゴニスト分子を投与することを含んで成り、該掻痒が皮膚リンパ球抗原陽性T細胞によって特徴付けられ、且つ該アンタゴニスト分子が配列番号：２または配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合することによって、該アンタゴニスト分子の投与が該掻痒を改善し、予防し、阻害し、または減少させる方法。
【請求項３】
IL-31アンタゴニスト治療を必要とする個体におけるIL-31アンタゴニストに対する治療的応答を予測するための方法であって、患者から生物学的サンプルを得て、循環皮膚リンパ球陽性T細胞を該生物学的サンプルから単離し、そして該単離した皮膚リンパ球陽性T細胞からのIL-31産生を検出すること、を含んで成る方法。
【請求項４】
前記皮膚リンパ球抗原陽性T細胞を刺激または活性化する追加のステップを含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が接触皮膚炎、薬物誘導遅延型皮膚アレルギー性反応、中毒性表皮剥離症、皮膚T細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスから選定される皮膚疾患を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アンタゴニスト分子が配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記罹患皮膚が掻痒である、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
罹患皮膚を治療する方法であって、該罹患皮膚を有する哺乳動物にアンタゴニスト分子を投与することを含んで成り、該罹患皮膚が皮膚リンパ球抗原陽性T細胞によって特徴付けられ、且つ該アンタゴニスト分子が配列番号：２または配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合することによって、該アンタゴニスト分子の投与が該罹患皮膚を改善し、予防し、阻害し、または減少させる方法。
【請求項２】
掻痒を処置するための方法であって、掻痒を有する哺乳動物にアンタゴニスト分子を投与することを含んで成り、該掻痒が皮膚リンパ球抗原陽性T細胞によって特徴付けられ、且つ該アンタゴニスト分子が配列番号：２または配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合することによって、該アンタゴニスト分子の投与が該掻痒を改善し、予防し、阻害し、または減少させる方法。
【請求項３】
IL-31アンタゴニスト治療を必要とする個体におけるIL-31アンタゴニストに対する治療的応答を予測するための方法であって、患者から生物学的サンプルを得て、循環皮膚リンパ球陽性T細胞を該生物学的サンプルから単離し、そして該単離した皮膚リンパ球陽性T細胞からのIL-31産生を検出すること、を含んで成る方法。
【請求項４】
前記皮膚リンパ球抗原陽性T細胞を刺激または活性化する追加のステップを含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が接触皮膚炎、薬物誘導遅延型皮膚アレルギー性反応、中毒性表皮剥離症、皮膚T細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ、結節性痒疹、及び単純ヘルペスウィルスから選定される皮膚疾患を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アンタゴニスト分子が配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記罹患皮膚が掻痒である、請求項１に記載の方法。
【公表番号】特表２００８−５３０１３７（Ｐ２００８−５３０１３７Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５５３６９（Ｐ２００７−５５５３６９）
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５３２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８８９５５
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０００４９８３１）ザイモジェネティクス，インコーポレイティド (37)
【出願人】（５０１２９２８５４）ナショナル・ジュウィッシュ・メディカル・アンド・リサーチ・センター (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５３２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８８９５５
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０００４９８３１）ザイモジェネティクス，インコーポレイティド (37)
【出願人】（５０１２９２８５４）ナショナル・ジュウィッシュ・メディカル・アンド・リサーチ・センター (5)
【Ｆターム（参考）】
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