目的物質精製用タグおよび精製用タグを用いた目的物質の精製方法
【課題】本発明は、非特異吸着が少なく、取扱いが容易な大きさのペプチドからなる、目的物質精製用タグおよび該精製用タグを用いた精製方法を提供することを課題とする。
【解決手段】ＮＨＥ１のＣＨＰとの結合ドメインを含むペプチドを精製用タグとする。さらに該精製用タグを付加した目的物質をＣＨＰと反応させて精製することにより、目的物質を効果的に精製しうる。例えば、ＮＨＥ１のＣＨＰとの結合ドメインを含むペプチドを精製用タグとし、精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させることによる
【解決手段】ＮＨＥ１のＣＨＰとの結合ドメインを含むペプチドを精製用タグとする。さらに該精製用タグを付加した目的物質をＣＨＰと反応させて精製することにより、目的物質を効果的に精製しうる。例えば、ＮＨＥ１のＣＨＰとの結合ドメインを含むペプチドを精製用タグとし、精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させることによる
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便かつ効率よく目的物質を精製するための新規精製用タグおよび該タグを用いた新規精製方法に関する。より詳しくは、Na+/H+交換輸送体（Na+/H+ Exchangers：ＮＨＥ）が、Calcineurin B homologous protein（ＣＨＰ）というCa2+結合タンパク質と強固に相互作用を有する性質を利用した、ＮＨＥ１由来のペプチドによる精製用タグに関する。さらに、該精製用タグを所望の目的物質に標識し、ＣＨＰ２の部分タンパク質を含む担体と相互作用させることにより、目的物質を精製するための精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフサイエンス研究は、いまやポストゲノム時代からポストストラクチャー時代に入っている。タンパク質の結晶構造解析あるいはプロテオーム解析などでは、タンパク質を大量に発現・精製することが、大変重要である。従来、このようなタンパク質の精製は、アフィニティタグが固定された担体を用い、目的物質とそれ以外の物質を含む液を接触させて担体に目的物質を吸着させて、液と担体を分離し、さらに担体から目的物質を脱離させることにより、目的物質を濃縮、精製する方法が知られている。
【０００３】
上記アフィニティタグに使用可能なタグとして、例えばヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ 、Ｔ７タグ、Ｓタグ、Ｎｕｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＬＡＧタグなどが挙げられる。特に代表的なものとしてヒスチジンタグ（以下、単に「Ｈｉｓタグ」ともいう。）が挙げられる。
【０００４】
Ｈｉｓタグは、アミノ酸であるヒスチジンを連結したオリゴペプチドであり、Ni2+イオンなどに対して特異的な親和性があるため、目的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に該Ｈｉｓタグで標識して発現させ、ニッケル親和性カラムを用いて目的物質を精製する方法が一般的に広く行われてきた。しかし、該Ｈｉｓタグを用いる精製法では、目的物質とするタンパク質の発現量が少ない場合、１回のカラム操作では精製することができず、その後数回のカラム操作が必要となることがしばしばである。また、該Ｈｉｓタグを用いる精製法では、非特異的な吸着の問題もあった。該Ｈｉｓタグにおいて、ヒスチジンとヒスチジンの間に他のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を挟むことで、Ni2+イオンとより高い親和性が得られることを確認し、新規なタグおよび該タグを用いた精製方法について報告がある（特許文献１）。
【０００５】
また、他のタグとして、例えばＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）タグ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグ等が挙げられる（特許文献２）が、これらのタグに使用されるタンパク質は大きすぎるため、取扱いが不便である。
【０００６】
Na+/H+交換輸送体（Na+/H+ Exchangers：ＮＨＥ）は、細胞内pH、Na+濃度、細胞容積の制御、および腎臓・小腸などの上皮細胞におけるNa+・HCO3-吸収に関わる主要な輸送体ファミリーである。ＮＨＥは、Calcineurin B homologous protein（ＣＨＰ）というCa2+結合タンパク質と強固に相互作用を有する。決定されたＣＨＰ（ＣＨＰ２アイソフォーム）とＮＨＥ（ＮＨＥ１アイソフォーム）側の結合ドメインとの複合体の結晶構造については報告されている（非特許文献１）（図１参照）。しかし、これらのタンパク質または部分ペプチドを用いたタンパク質精製用タグの利用については、全く報告がない。
【特許文献１】特開2005-291836号公報
【特許文献２】特開2006-266919号公報
【非特許文献１】EMBO J. 25(11):2315-2325, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、非特異吸着が少なく、取扱いが容易な大きさのペプチドからなる、目的物質精製用タグおよび該精製用タグを用いた精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＣＨＰとＮＨＥ側の結合ドメインとの結合性に着目し、ＮＨＥ由来の部分ペプチドを目的物質精製用タグとし、さらに該精製用タグで標識した目的物質をＣＨＰと反応させて精製することにより、目的物質を効果的に精製しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ＮＨＥ１の部分ペプチドからなる精製用タグ。
２．ＮＨＥ１の部分ペプチドが、ＣＨＰとの結合ドメインを含む、前項１に記載の精製用タグ。
３．ＣＨＰとの結合ドメインが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分である、前項２に記載の精製用タグ。
４．前項１〜３のいずれかに記載の精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させることによる、目的物質の精製方法。
５．以下の工程を含む目的物質の精製方法：
１）前項１〜３のいずれかに記載の精製用タグを目的物質に標識する工程；
２）前記精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させる工程；
３）前記接触させる工程において、Ca2+の存在下で、試料と担体とを相互作用させる工程；
４）前記相互作用させた後に、Ca2+の非存在下で、目的物質を溶出する工程。
６．ＣＨＰ２の部分タンパク質が、ＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質である、前項４または５に記載の精製方法。
７．少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質が、ＣＨＰ２の部分タンパク質とＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異させたペプチドを結合して構成される物質である、前項４〜６にいずれかに記載の精製方法。
８．ＮＨＥ１の部分ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチドであり、該ペプチドの一部のアミノ酸の変異が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸の変異である、前項７に記載の精製方法。
９．ＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸の変異が、イソロイシンからリジンに変異されていることを特徴とする前項８に記載の精製方法。
１０．前項４〜９のいずれかに記載の精製方法に使用し、前記精製方法において使用する担体に担持する物質であり、ＣＨＰ２の部分タンパク質とＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異したペプチドを結合して構成されることを特徴とする融合タンパク質。
１１．ＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質と、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチド、を含む融合タンパク質であり、該ペプチドの一部のアミノ酸の変異が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸がイソロイシンからリジンへ変異されていることを特徴とする融合タンパク質。
１２．前項１〜３のいずれかに記載の精製用タグを含む目的物質の精製、濃縮および／または検出用キット。
１３．さらに、前項１０もしくは１１に記載の融合タンパク質または該融合タンパク質を担持する担体を含む、前項１２に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の精製用タグは、ＮＨＥ１由来であり、本発明の精製方法に用いられるＣＨＰ２と強い相互作用を有するため、非特異吸着反応が軽減化される。本発明の精製方法に用いられるＣＨＰ２に、さらにＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異したペプチドを結合させることによって、ＣＨＰ２の構造変化により、目的物質を溶出することができる。
【００１１】
ＮＨＥ１とＣＨＰ２は、Ca2+の存在により相互作用を有するので、精製用タグで標識した目的物質を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させ、Ca2+を含む緩衝液を用いて洗浄した後にCa2+を除去することで、目的物質を溶出することができる。
【００１２】
本発明の精製用タグを使用することにより、目的物質として、タンパク質、ペプチド、核酸等を精製するのみならず、これらを濃縮や検出することができる。また、生体中に微量しか存在しない、特定タンパク質の検出や選択的濃縮を効率的に行うことができる。特に本発明の精製用タグに蛍光物質、ラジオアイソトープ等の標識物質を付加することで、複雑な試料中に存在する微量の目的物質を濃縮して、高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の精製用タグは、ＮＨＥ１の部分ペプチドからなる。ここにおいて、ＮＨＥ１をコードする遺伝子は、例えばGenBank Accession No. NM_003047（配列番号１）に示され、ＮＨＥ１は配列番号１および２に示される８１５個のアミノ酸配列からなる。本発明の精製用タグに使用するＮＨＥ１の部分ペプチドは、ＮＨＥ１を構成するアミノ酸配列のうち、ＣＨＰ２に結合しうる部分を含んでいればよく、特に限定されない。ＮＨＥ１の部分ペプチドは、例えばＣＨＰとの結合ドメインを含むものであればよい。また、ＣＨＰ２と結合するのであれば、ＮＨＥ１におけるＣＨＰとの結合ドメインのアミノ酸配列は、１〜複数個のアミノ酸を、置換、欠失、挿入または付加したものであってもよい。さらに、ＣＨＰ２と相互作用を有するのであれば、精製用タグを構成するアミノ酸は、人工的に作製されたアミノ酸誘導体を含んでいても良い。
【００１４】
本発明の精製用タグに含まれるＣＨＰとの結合ドメインのアミノ酸配列は、具体的には配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分であり、２６残基のアミノ酸から構成される（配列番号３）。精製用タグとしては、ＣＨＰ２と相互作用を有するのであれば、前記具体的なアミノ酸配列から、１〜複数個のアミノ酸を、置換、欠失、挿入または付加したものであってもよい。さらに、ＣＨＰ２と相互作用を有するのであれば、人工的に作製されたアミノ酸誘導体を含んでいても良い。
【００１５】
本発明は、上記の精製用タグを用いた目的物質の精製方法にも及ぶ。ここで、目的物質としては特に限定されないが、好適にはタンパク質、ペプチド、核酸等が挙げられ、より好適には微生物、培養細胞やトランスジェニック動物等で発現させたタンパク質、ペプチド、核酸等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の目的物質の精製方法は、上記の精製用タグで標識した目的物質を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させることによる。ここにおいてＣＨＰ２は、例えばGenBank Accession No. O43745（配列番号４）に示さる１９６個のアミノ酸配列からなる。
【００１７】
目的物質の具体的な精製方法として、以下の工程を含む方法が例示される（図５参照）。以下の精製工程において、試料と担体の接触はバッチ法またはカラム法のいずれを採用してもよく、処理する試料の性質や量に応じて、適宜選択することができる。
１）上記精製用タグを目的物質に標識する工程；
２）前記精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させる工程；
３）前記接触させる工程において、Ca2+の存在下で、試料と担体とを相互作用させる工程；
４）前記相互作用させた後に、Ca2+の非存在下で、目的物質を溶出する工程。
【００１８】
ここにおいて、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質は、ＣＨＰ２やその部分タンパク質そのものであっても良いし、ＣＨＰ２やその部分タンパク質に、ペプチドや化合物などを付加したものであってもよい。ＣＨＰ２の部分タンパク質は、例えばＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質が挙げられ、好適には１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質が挙げられる。
【００１９】
ＣＨＰ２は、構造上の特徴である疎水性の溝を有するため、取扱いが困難であった（図１Ｂ参照）。例えば大腸菌等の微生物でＣＨＰ２を発現させたときに、発現タンパク質の精製過程で、その疎水性の溝のために微生物由来のタンパク質とＣＨＰ２が凝集してしまい、精製が困難であった。そこで、ＣＨＰ２やその部分タンパク質に付加するものは、ＣＨＰ２に存在する該疎水性溝を埋めるものであれば良く、そのような物質であれば、ペプチドや化合物等、特に限定されない。
【００２０】
上記付加するものは、例えばＮＨＥ１由来のペプチドが挙げられる。しかしながら、ＮＨＥ１由来ペプチドそのものは、ＣＨＰ２に存在する該疎水性溝を埋めることができるものの、ＮＨＥ１由来ペプチドとＣＨＰ２の親和性が高いために、本発明の精製用タグを精製に用いることができない。そこで、精製用タグよりも親和性が低く、かつＣＨＰ２に存在する該疎水性溝を埋めることができるものが好適である。そのようなものとしてＣＨＰ２と相互作用を有するＮＨＥ１由来のペプチドで、一部のアミノ酸を置換、欠失、導入および／または付加等したＮＨＥ１の部分ペプチド、すなわち一部のアミノ酸を変異させたＮＨＥ１の部分ペプチドで、精製用タグよりも親和性の低いものに改変したものが挙げられる。具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチドにおいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸を変異させたものが挙げられる。アミノ酸の変異は、具体的にはイソロイシンからリジンへ変異されているものが好適である。
【００２１】
ＣＨＰ２やその部分タンパク質に上記のペプチド等を付加することにより、担体に担持するＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を容易に発現、精製することができる。さらに、ＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体を用いて目的物質を精製する際にも、ＣＨＰ２やその部分タンパク質に上記のペプチド等を付加することにより、ＣＨＰ２の構造変化がなされ、目的物質が溶出される。
【００２２】
ＣＨＰ２やその部分タンパク質に上述のペプチドや化合物を付加する際に、ＣＨＰ２とペプチドまたは化合物の間に適当なリンカーを設けても良い（図２参照）。例えば、３残基のグリシンが挙げられる。さらに、部分タンパク質に上述のペプチドを付加した融合タンパク質を大腸菌等の微生物で発現させた場合の精製を容易にするために、融合タンパク質を本発明の精製用タグとは異なる精製用タグで標識することができる。一般的なものとして、Ｈｉｓタグ 、Ｔ７タグ、Ｓタグ、Ｎｕｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＨＳＶタグ、ＦＬＡＧタグなどを挙げることができ、特に代表的なものとしてＨｉｓタグが挙げられる。
【００２３】
本発明は、担体に担持される物質、すなわち上記の融合タンパク質も含まれる（図３参照）。また、担体としては、タンパク質等の精製や濃縮に用いられる自体公知の担体が挙げられ、具体的にはセルロース、アガロース、ラテックス、磁気ビーズなどの固相担体が挙げられる。また、目的物質の精製や濃縮の目的以外に適用する場合、例えば目的物質の検出の場合には、固相プレートに本発明の融合タンパク質を固定することで、精製用タグで標識した目的物質を検出することができる。固相担体の大きさや量は、目的物質の性質、量や、あるいは精製や検出等の目的により適宜選択することができる。
【００２４】
本発明は、上記精製用タグを含む目的物質の精製、濃縮および／または検出用キットも含まれる。さらに、キットの構成物として、本発明の融合タンパク質または該融合タンパク質を担持した担体を含んでいても良い。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の理解を深めるために実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００２６】
（実施例１）精製用タグ
ＮＨＥ１タンパク質を構成するアミノ酸配列は、GenBank Accession No. NM_003047（配列番号２）に示される。本実施例において、精製用タグとして、以下の配列番号５に示すペプチドを精製しようとする目的タンパク質のＣ末端に付加した。具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、第５１６−５４１位に示されるＣＨＰ２結合領域である２６個のアミノ酸残基（配列番号３）を含む、第５１６−５４５位の領域からなるペプチドである。
RSINEEIHTQFLDHLLTGIEDIAGHYGHHH（配列番号５）
【００２７】
（実施例２）精製用タグで標識したＧＦＰタンパク質発現用大腸菌の構築
ヒトＮＨＥ１遺伝子はヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。ベクターpEGFP-C1を用いて、ＰＣＲ法により、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、ＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子のＣ末端側に結合し、さらに全体を大腸菌発現用ベクターpET11aにクローニングした。また、対照コントロール（比較例）として、本発明の精製用タグのかわりに、６残基のヒスチジンを結合したＧＦＰについても同様に、pET11aを用いて構築した。
【００２８】
（実施例３）融合タンパク質のコンストラクションと精製
本実施例では、精製用担体に担持するＣＨＰ２−ＮＨＥ１ペプチド融合タンパク質のコンストラクションと該融合タンパク質の大腸菌からの精製について説明する。
【００２９】
ヒトＣＨＰ２遺伝子およびヒトＮＨＥ１遺伝子はヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。プラスミドコンストラクションは、これらのｃＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲ法により行った。具体的には、配列番号５に示すヒトＣＨＰ２（１９６アミノ酸残基）のうちＣ末端側の１０残基を欠失させ、リンカーとしてグリシン（３残基）をつなぎ、配列番号２のうち第５１６−５４２位に示される２７個のアミノ酸残基のうち、配列番号２の第５３４位のアミノ酸をイソロイシンからリジンに変異導入(Ile534→Lys)したペプチド（配列番号６、図２参照）とを含む融合タンパク質（配列番号７、図２参照）にＨｉｓタグ（ヒスチジン６残基）を標識したタンパク質をコードするＤＮＡを作製し、常法に従いpET11aへ導入した。このプラスミドを導入した大腸菌を培養し、IPTG(isopropyl thio-β-galactoside) の添加により、１８℃で上記融合タンパク質を誘導し、発現させた。融合タンパク質を含む可溶性画分をニッケル親和性樹脂に結合させ、pH4.7の低いpH溶液により非特異的吸着タンパク質を除いた後、イミダゾールを含む溶液で融合タンパク質を溶出し、精製した（図３、４）。
【００３０】
（実施例４）親和性樹脂の作製
本実施例では、実施例３で作製した融合タンパク質を、精製用担体に担持した親和性樹脂の作製について説明する。
【００３１】
常法に従い、実施例３で作製したＣＨＰ２−ＮＨＥ１ペプチド融合タンパク質（１００ｍｇ）をＣＮＢｒ−活性化セファロース（２ｇ）に結合させ、親和性樹脂を作製した。
【００３２】
（実施例５）親和性樹脂を用いた目的物質の精製
本実施例では、実施例４で作製した親和性樹脂を用いて、実施例２で構築したコンストラクションにより産生した精製用タグで標識したＧＦＰタンパク質および対照コントロールを精製した。
【００３３】
実施例２で構築した精製用タグで標識したＧＦＰタンパク質および対照コントロール発現用大腸菌１００ｍｌを、吸光度OD600が約1.0になるまで３７℃で培養し、１ｍＭのIPTGを加えて１８℃でさらに一晩培養した。培養液を遠心分離して大腸菌を回収し、１０ｍｌのＰＢＳ溶液を加えて１０分間超音波処理し、菌体を破壊した。さらに遠心分離により得られた上清を試料とした。
【００３４】
得られた試料を上記親和性樹脂１００μｌに加え、４℃で２時間インキュベーションした後、親和性樹脂を１．５ｍｌのチューブに回収した。回収した親和性樹脂を、１ｍｌのＰＢＳ溶液を用いて５回洗浄した。なお、本実施例で用いる親和性樹脂におけるＣＨＰ２のCa2+の親和性は、Ｋｄ＝２ｎＭであり、試料に含まれる少量のCa2+濃度（１μＭ程度）で、精製用タグとＣＨＰ２の相互作用が十分維持できる。従って、本実施例では精製用タグとＣＨＰ２の相互作用のために、新たにCa2+を加えた緩衝液を用いる必要はなかった。本実施例ではバッチ法を採用したが、図５に示すカラム法により精製することもできる。
【００３５】
試料と親和性樹脂を相互作用させた後、ＰＢＳ溶液を廃棄し、５０ｍＭのＥＧＴＡを含むＰＢＳ溶液を０．５ｍｌ加え、４℃で１時間インキュベートした。その結果、溶出液中に精製用タグ（ＮＨＥタグ）で標識した蛍光標識されたＧＦＰタンパク質が確認された（図６）。対照コントロールは、Ｈｉｓタグで標識したＧＦＰタンパク質を、Ni2+カラムで精製した。本発明の精製用タグで標識したＧＦＰタンパク質および対照コントロールのＨｉｓタグで標識したＧＦＰタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果、対照コントロールにくらべ、精製用タグ（ＮＨＥタグ）で標識したＧＦＰタンパク質は明らかに非特異反応が低く、高度に精製されていることが確認された（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上説明したように、本発明の精製用タグは多くの応用が可能である。例えば大腸菌等の微生物のみならず、培養細胞やトランスジェニック動物で発現した目的物質である目的タンパク質を精製するのみならず、既知のタンパク質の新規結合タンパク質を網羅的に解析するような場合にも応用することができる。
【００３７】
本発明の精製用タグを使用することにより、タンパク質、ペプチド、核酸等の目的物質を精製するのみならず、濃縮や検出することもできる。また、生体中に微量しか存在しない、特定タンパク質の検出や選択的濃縮を効率的に行うことができる。特に、本発明の精製用タグに蛍光物質、ラジオアイソトープなどの標識物質を付加することにより、複雑な試料中に存在する微量の目的物質を濃縮して、高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】（Ａ）動物細胞ＮＨＥ１と必須サブユニットＣＨＰの相互作用を示す図である。（Ｂ）ＣＨＰ２とＮＨＥ１側の結合ドメイン複合体の結晶構造を示す図である。ＮＨＥ１ペプチドは、ＣＨＰ２の疎水性の溝に充填されている様子が示されている。
【図２】ＣＨＰ２とＮＨＥ１ペプチドとの融合タンパク質のコンストラクションを示す図である。ＣＨＰ２のＣ末端のアミノ酸１０残基を除去し、３残基のグリシンをリンカーとして加えた後、ヒトＮＨＥ１（配列番号２）のアミノ酸残基第５１６−５４２位部分のペプチドを加え、さらにＣ末端にＨｉｓタグ（６残基のヒスチジン）で標識した。さらに、ＣＨＰ２とＮＨＥ１との相互作用を弱めるために、第５３４位のイソロイシンをリジンに置換した。
【図３】ＣＨＰ２とＮＨＥ１ペプチドとの融合タンパク質の立体構造を示す図である（一部はモデル）。
【図４】ＣＨＰ２とＮＨＥ１ペプチドとの融合タンパク質を大腸菌で発現したものを精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動した結果を示す図である。
【図５】ＧＦＰタンパク質を目的物質としたときの本発明の精製方法を示す図である。（実施例５）
【図６】ＧＦＰタンパク質を本発明の精製方法により精製したときに得られた精製物を示す図である。ＧＦＰが濃縮、精製され蛍光を発している。
【図７】本発明の精製用タグ（ＮＨＥ１タグ）と対照コントロール（Ｈｉｓタグ）で標識したＧＦＰタンパク質を精製したときの精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動した結果を示す図である。（実施例６）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便かつ効率よく目的物質を精製するための新規精製用タグおよび該タグを用いた新規精製方法に関する。より詳しくは、Na+/H+交換輸送体（Na+/H+ Exchangers：ＮＨＥ）が、Calcineurin B homologous protein（ＣＨＰ）というCa2+結合タンパク質と強固に相互作用を有する性質を利用した、ＮＨＥ１由来のペプチドによる精製用タグに関する。さらに、該精製用タグを所望の目的物質に標識し、ＣＨＰ２の部分タンパク質を含む担体と相互作用させることにより、目的物質を精製するための精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフサイエンス研究は、いまやポストゲノム時代からポストストラクチャー時代に入っている。タンパク質の結晶構造解析あるいはプロテオーム解析などでは、タンパク質を大量に発現・精製することが、大変重要である。従来、このようなタンパク質の精製は、アフィニティタグが固定された担体を用い、目的物質とそれ以外の物質を含む液を接触させて担体に目的物質を吸着させて、液と担体を分離し、さらに担体から目的物質を脱離させることにより、目的物質を濃縮、精製する方法が知られている。
【０００３】
上記アフィニティタグに使用可能なタグとして、例えばヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ 、Ｔ７タグ、Ｓタグ、Ｎｕｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＬＡＧタグなどが挙げられる。特に代表的なものとしてヒスチジンタグ（以下、単に「Ｈｉｓタグ」ともいう。）が挙げられる。
【０００４】
Ｈｉｓタグは、アミノ酸であるヒスチジンを連結したオリゴペプチドであり、Ni2+イオンなどに対して特異的な親和性があるため、目的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に該Ｈｉｓタグで標識して発現させ、ニッケル親和性カラムを用いて目的物質を精製する方法が一般的に広く行われてきた。しかし、該Ｈｉｓタグを用いる精製法では、目的物質とするタンパク質の発現量が少ない場合、１回のカラム操作では精製することができず、その後数回のカラム操作が必要となることがしばしばである。また、該Ｈｉｓタグを用いる精製法では、非特異的な吸着の問題もあった。該Ｈｉｓタグにおいて、ヒスチジンとヒスチジンの間に他のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を挟むことで、Ni2+イオンとより高い親和性が得られることを確認し、新規なタグおよび該タグを用いた精製方法について報告がある（特許文献１）。
【０００５】
また、他のタグとして、例えばＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）タグ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグ等が挙げられる（特許文献２）が、これらのタグに使用されるタンパク質は大きすぎるため、取扱いが不便である。
【０００６】
Na+/H+交換輸送体（Na+/H+ Exchangers：ＮＨＥ）は、細胞内pH、Na+濃度、細胞容積の制御、および腎臓・小腸などの上皮細胞におけるNa+・HCO3-吸収に関わる主要な輸送体ファミリーである。ＮＨＥは、Calcineurin B homologous protein（ＣＨＰ）というCa2+結合タンパク質と強固に相互作用を有する。決定されたＣＨＰ（ＣＨＰ２アイソフォーム）とＮＨＥ（ＮＨＥ１アイソフォーム）側の結合ドメインとの複合体の結晶構造については報告されている（非特許文献１）（図１参照）。しかし、これらのタンパク質または部分ペプチドを用いたタンパク質精製用タグの利用については、全く報告がない。
【特許文献１】特開2005-291836号公報
【特許文献２】特開2006-266919号公報
【非特許文献１】EMBO J. 25(11):2315-2325, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、非特異吸着が少なく、取扱いが容易な大きさのペプチドからなる、目的物質精製用タグおよび該精製用タグを用いた精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＣＨＰとＮＨＥ側の結合ドメインとの結合性に着目し、ＮＨＥ由来の部分ペプチドを目的物質精製用タグとし、さらに該精製用タグで標識した目的物質をＣＨＰと反応させて精製することにより、目的物質を効果的に精製しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ＮＨＥ１の部分ペプチドからなる精製用タグ。
２．ＮＨＥ１の部分ペプチドが、ＣＨＰとの結合ドメインを含む、前項１に記載の精製用タグ。
３．ＣＨＰとの結合ドメインが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分である、前項２に記載の精製用タグ。
４．前項１〜３のいずれかに記載の精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させることによる、目的物質の精製方法。
５．以下の工程を含む目的物質の精製方法：
１）前項１〜３のいずれかに記載の精製用タグを目的物質に標識する工程；
２）前記精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させる工程；
３）前記接触させる工程において、Ca2+の存在下で、試料と担体とを相互作用させる工程；
４）前記相互作用させた後に、Ca2+の非存在下で、目的物質を溶出する工程。
６．ＣＨＰ２の部分タンパク質が、ＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質である、前項４または５に記載の精製方法。
７．少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質が、ＣＨＰ２の部分タンパク質とＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異させたペプチドを結合して構成される物質である、前項４〜６にいずれかに記載の精製方法。
８．ＮＨＥ１の部分ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチドであり、該ペプチドの一部のアミノ酸の変異が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸の変異である、前項７に記載の精製方法。
９．ＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸の変異が、イソロイシンからリジンに変異されていることを特徴とする前項８に記載の精製方法。
１０．前項４〜９のいずれかに記載の精製方法に使用し、前記精製方法において使用する担体に担持する物質であり、ＣＨＰ２の部分タンパク質とＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異したペプチドを結合して構成されることを特徴とする融合タンパク質。
１１．ＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質と、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチド、を含む融合タンパク質であり、該ペプチドの一部のアミノ酸の変異が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸がイソロイシンからリジンへ変異されていることを特徴とする融合タンパク質。
１２．前項１〜３のいずれかに記載の精製用タグを含む目的物質の精製、濃縮および／または検出用キット。
１３．さらに、前項１０もしくは１１に記載の融合タンパク質または該融合タンパク質を担持する担体を含む、前項１２に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の精製用タグは、ＮＨＥ１由来であり、本発明の精製方法に用いられるＣＨＰ２と強い相互作用を有するため、非特異吸着反応が軽減化される。本発明の精製方法に用いられるＣＨＰ２に、さらにＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異したペプチドを結合させることによって、ＣＨＰ２の構造変化により、目的物質を溶出することができる。
【００１１】
ＮＨＥ１とＣＨＰ２は、Ca2+の存在により相互作用を有するので、精製用タグで標識した目的物質を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させ、Ca2+を含む緩衝液を用いて洗浄した後にCa2+を除去することで、目的物質を溶出することができる。
【００１２】
本発明の精製用タグを使用することにより、目的物質として、タンパク質、ペプチド、核酸等を精製するのみならず、これらを濃縮や検出することができる。また、生体中に微量しか存在しない、特定タンパク質の検出や選択的濃縮を効率的に行うことができる。特に本発明の精製用タグに蛍光物質、ラジオアイソトープ等の標識物質を付加することで、複雑な試料中に存在する微量の目的物質を濃縮して、高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の精製用タグは、ＮＨＥ１の部分ペプチドからなる。ここにおいて、ＮＨＥ１をコードする遺伝子は、例えばGenBank Accession No. NM_003047（配列番号１）に示され、ＮＨＥ１は配列番号１および２に示される８１５個のアミノ酸配列からなる。本発明の精製用タグに使用するＮＨＥ１の部分ペプチドは、ＮＨＥ１を構成するアミノ酸配列のうち、ＣＨＰ２に結合しうる部分を含んでいればよく、特に限定されない。ＮＨＥ１の部分ペプチドは、例えばＣＨＰとの結合ドメインを含むものであればよい。また、ＣＨＰ２と結合するのであれば、ＮＨＥ１におけるＣＨＰとの結合ドメインのアミノ酸配列は、１〜複数個のアミノ酸を、置換、欠失、挿入または付加したものであってもよい。さらに、ＣＨＰ２と相互作用を有するのであれば、精製用タグを構成するアミノ酸は、人工的に作製されたアミノ酸誘導体を含んでいても良い。
【００１４】
本発明の精製用タグに含まれるＣＨＰとの結合ドメインのアミノ酸配列は、具体的には配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分であり、２６残基のアミノ酸から構成される（配列番号３）。精製用タグとしては、ＣＨＰ２と相互作用を有するのであれば、前記具体的なアミノ酸配列から、１〜複数個のアミノ酸を、置換、欠失、挿入または付加したものであってもよい。さらに、ＣＨＰ２と相互作用を有するのであれば、人工的に作製されたアミノ酸誘導体を含んでいても良い。
【００１５】
本発明は、上記の精製用タグを用いた目的物質の精製方法にも及ぶ。ここで、目的物質としては特に限定されないが、好適にはタンパク質、ペプチド、核酸等が挙げられ、より好適には微生物、培養細胞やトランスジェニック動物等で発現させたタンパク質、ペプチド、核酸等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の目的物質の精製方法は、上記の精製用タグで標識した目的物質を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させることによる。ここにおいてＣＨＰ２は、例えばGenBank Accession No. O43745（配列番号４）に示さる１９６個のアミノ酸配列からなる。
【００１７】
目的物質の具体的な精製方法として、以下の工程を含む方法が例示される（図５参照）。以下の精製工程において、試料と担体の接触はバッチ法またはカラム法のいずれを採用してもよく、処理する試料の性質や量に応じて、適宜選択することができる。
１）上記精製用タグを目的物質に標識する工程；
２）前記精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させる工程；
３）前記接触させる工程において、Ca2+の存在下で、試料と担体とを相互作用させる工程；
４）前記相互作用させた後に、Ca2+の非存在下で、目的物質を溶出する工程。
【００１８】
ここにおいて、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質は、ＣＨＰ２やその部分タンパク質そのものであっても良いし、ＣＨＰ２やその部分タンパク質に、ペプチドや化合物などを付加したものであってもよい。ＣＨＰ２の部分タンパク質は、例えばＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質が挙げられ、好適には１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質が挙げられる。
【００１９】
ＣＨＰ２は、構造上の特徴である疎水性の溝を有するため、取扱いが困難であった（図１Ｂ参照）。例えば大腸菌等の微生物でＣＨＰ２を発現させたときに、発現タンパク質の精製過程で、その疎水性の溝のために微生物由来のタンパク質とＣＨＰ２が凝集してしまい、精製が困難であった。そこで、ＣＨＰ２やその部分タンパク質に付加するものは、ＣＨＰ２に存在する該疎水性溝を埋めるものであれば良く、そのような物質であれば、ペプチドや化合物等、特に限定されない。
【００２０】
上記付加するものは、例えばＮＨＥ１由来のペプチドが挙げられる。しかしながら、ＮＨＥ１由来ペプチドそのものは、ＣＨＰ２に存在する該疎水性溝を埋めることができるものの、ＮＨＥ１由来ペプチドとＣＨＰ２の親和性が高いために、本発明の精製用タグを精製に用いることができない。そこで、精製用タグよりも親和性が低く、かつＣＨＰ２に存在する該疎水性溝を埋めることができるものが好適である。そのようなものとしてＣＨＰ２と相互作用を有するＮＨＥ１由来のペプチドで、一部のアミノ酸を置換、欠失、導入および／または付加等したＮＨＥ１の部分ペプチド、すなわち一部のアミノ酸を変異させたＮＨＥ１の部分ペプチドで、精製用タグよりも親和性の低いものに改変したものが挙げられる。具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチドにおいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸を変異させたものが挙げられる。アミノ酸の変異は、具体的にはイソロイシンからリジンへ変異されているものが好適である。
【００２１】
ＣＨＰ２やその部分タンパク質に上記のペプチド等を付加することにより、担体に担持するＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を容易に発現、精製することができる。さらに、ＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体を用いて目的物質を精製する際にも、ＣＨＰ２やその部分タンパク質に上記のペプチド等を付加することにより、ＣＨＰ２の構造変化がなされ、目的物質が溶出される。
【００２２】
ＣＨＰ２やその部分タンパク質に上述のペプチドや化合物を付加する際に、ＣＨＰ２とペプチドまたは化合物の間に適当なリンカーを設けても良い（図２参照）。例えば、３残基のグリシンが挙げられる。さらに、部分タンパク質に上述のペプチドを付加した融合タンパク質を大腸菌等の微生物で発現させた場合の精製を容易にするために、融合タンパク質を本発明の精製用タグとは異なる精製用タグで標識することができる。一般的なものとして、Ｈｉｓタグ 、Ｔ７タグ、Ｓタグ、Ｎｕｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＨＳＶタグ、ＦＬＡＧタグなどを挙げることができ、特に代表的なものとしてＨｉｓタグが挙げられる。
【００２３】
本発明は、担体に担持される物質、すなわち上記の融合タンパク質も含まれる（図３参照）。また、担体としては、タンパク質等の精製や濃縮に用いられる自体公知の担体が挙げられ、具体的にはセルロース、アガロース、ラテックス、磁気ビーズなどの固相担体が挙げられる。また、目的物質の精製や濃縮の目的以外に適用する場合、例えば目的物質の検出の場合には、固相プレートに本発明の融合タンパク質を固定することで、精製用タグで標識した目的物質を検出することができる。固相担体の大きさや量は、目的物質の性質、量や、あるいは精製や検出等の目的により適宜選択することができる。
【００２４】
本発明は、上記精製用タグを含む目的物質の精製、濃縮および／または検出用キットも含まれる。さらに、キットの構成物として、本発明の融合タンパク質または該融合タンパク質を担持した担体を含んでいても良い。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の理解を深めるために実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００２６】
（実施例１）精製用タグ
ＮＨＥ１タンパク質を構成するアミノ酸配列は、GenBank Accession No. NM_003047（配列番号２）に示される。本実施例において、精製用タグとして、以下の配列番号５に示すペプチドを精製しようとする目的タンパク質のＣ末端に付加した。具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、第５１６−５４１位に示されるＣＨＰ２結合領域である２６個のアミノ酸残基（配列番号３）を含む、第５１６−５４５位の領域からなるペプチドである。
RSINEEIHTQFLDHLLTGIEDIAGHYGHHH（配列番号５）
【００２７】
（実施例２）精製用タグで標識したＧＦＰタンパク質発現用大腸菌の構築
ヒトＮＨＥ１遺伝子はヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。ベクターpEGFP-C1を用いて、ＰＣＲ法により、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、ＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子のＣ末端側に結合し、さらに全体を大腸菌発現用ベクターpET11aにクローニングした。また、対照コントロール（比較例）として、本発明の精製用タグのかわりに、６残基のヒスチジンを結合したＧＦＰについても同様に、pET11aを用いて構築した。
【００２８】
（実施例３）融合タンパク質のコンストラクションと精製
本実施例では、精製用担体に担持するＣＨＰ２−ＮＨＥ１ペプチド融合タンパク質のコンストラクションと該融合タンパク質の大腸菌からの精製について説明する。
【００２９】
ヒトＣＨＰ２遺伝子およびヒトＮＨＥ１遺伝子はヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。プラスミドコンストラクションは、これらのｃＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲ法により行った。具体的には、配列番号５に示すヒトＣＨＰ２（１９６アミノ酸残基）のうちＣ末端側の１０残基を欠失させ、リンカーとしてグリシン（３残基）をつなぎ、配列番号２のうち第５１６−５４２位に示される２７個のアミノ酸残基のうち、配列番号２の第５３４位のアミノ酸をイソロイシンからリジンに変異導入(Ile534→Lys)したペプチド（配列番号６、図２参照）とを含む融合タンパク質（配列番号７、図２参照）にＨｉｓタグ（ヒスチジン６残基）を標識したタンパク質をコードするＤＮＡを作製し、常法に従いpET11aへ導入した。このプラスミドを導入した大腸菌を培養し、IPTG(isopropyl thio-β-galactoside) の添加により、１８℃で上記融合タンパク質を誘導し、発現させた。融合タンパク質を含む可溶性画分をニッケル親和性樹脂に結合させ、pH4.7の低いpH溶液により非特異的吸着タンパク質を除いた後、イミダゾールを含む溶液で融合タンパク質を溶出し、精製した（図３、４）。
【００３０】
（実施例４）親和性樹脂の作製
本実施例では、実施例３で作製した融合タンパク質を、精製用担体に担持した親和性樹脂の作製について説明する。
【００３１】
常法に従い、実施例３で作製したＣＨＰ２−ＮＨＥ１ペプチド融合タンパク質（１００ｍｇ）をＣＮＢｒ−活性化セファロース（２ｇ）に結合させ、親和性樹脂を作製した。
【００３２】
（実施例５）親和性樹脂を用いた目的物質の精製
本実施例では、実施例４で作製した親和性樹脂を用いて、実施例２で構築したコンストラクションにより産生した精製用タグで標識したＧＦＰタンパク質および対照コントロールを精製した。
【００３３】
実施例２で構築した精製用タグで標識したＧＦＰタンパク質および対照コントロール発現用大腸菌１００ｍｌを、吸光度OD600が約1.0になるまで３７℃で培養し、１ｍＭのIPTGを加えて１８℃でさらに一晩培養した。培養液を遠心分離して大腸菌を回収し、１０ｍｌのＰＢＳ溶液を加えて１０分間超音波処理し、菌体を破壊した。さらに遠心分離により得られた上清を試料とした。
【００３４】
得られた試料を上記親和性樹脂１００μｌに加え、４℃で２時間インキュベーションした後、親和性樹脂を１．５ｍｌのチューブに回収した。回収した親和性樹脂を、１ｍｌのＰＢＳ溶液を用いて５回洗浄した。なお、本実施例で用いる親和性樹脂におけるＣＨＰ２のCa2+の親和性は、Ｋｄ＝２ｎＭであり、試料に含まれる少量のCa2+濃度（１μＭ程度）で、精製用タグとＣＨＰ２の相互作用が十分維持できる。従って、本実施例では精製用タグとＣＨＰ２の相互作用のために、新たにCa2+を加えた緩衝液を用いる必要はなかった。本実施例ではバッチ法を採用したが、図５に示すカラム法により精製することもできる。
【００３５】
試料と親和性樹脂を相互作用させた後、ＰＢＳ溶液を廃棄し、５０ｍＭのＥＧＴＡを含むＰＢＳ溶液を０．５ｍｌ加え、４℃で１時間インキュベートした。その結果、溶出液中に精製用タグ（ＮＨＥタグ）で標識した蛍光標識されたＧＦＰタンパク質が確認された（図６）。対照コントロールは、Ｈｉｓタグで標識したＧＦＰタンパク質を、Ni2+カラムで精製した。本発明の精製用タグで標識したＧＦＰタンパク質および対照コントロールのＨｉｓタグで標識したＧＦＰタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果、対照コントロールにくらべ、精製用タグ（ＮＨＥタグ）で標識したＧＦＰタンパク質は明らかに非特異反応が低く、高度に精製されていることが確認された（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上説明したように、本発明の精製用タグは多くの応用が可能である。例えば大腸菌等の微生物のみならず、培養細胞やトランスジェニック動物で発現した目的物質である目的タンパク質を精製するのみならず、既知のタンパク質の新規結合タンパク質を網羅的に解析するような場合にも応用することができる。
【００３７】
本発明の精製用タグを使用することにより、タンパク質、ペプチド、核酸等の目的物質を精製するのみならず、濃縮や検出することもできる。また、生体中に微量しか存在しない、特定タンパク質の検出や選択的濃縮を効率的に行うことができる。特に、本発明の精製用タグに蛍光物質、ラジオアイソトープなどの標識物質を付加することにより、複雑な試料中に存在する微量の目的物質を濃縮して、高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】（Ａ）動物細胞ＮＨＥ１と必須サブユニットＣＨＰの相互作用を示す図である。（Ｂ）ＣＨＰ２とＮＨＥ１側の結合ドメイン複合体の結晶構造を示す図である。ＮＨＥ１ペプチドは、ＣＨＰ２の疎水性の溝に充填されている様子が示されている。
【図２】ＣＨＰ２とＮＨＥ１ペプチドとの融合タンパク質のコンストラクションを示す図である。ＣＨＰ２のＣ末端のアミノ酸１０残基を除去し、３残基のグリシンをリンカーとして加えた後、ヒトＮＨＥ１（配列番号２）のアミノ酸残基第５１６−５４２位部分のペプチドを加え、さらにＣ末端にＨｉｓタグ（６残基のヒスチジン）で標識した。さらに、ＣＨＰ２とＮＨＥ１との相互作用を弱めるために、第５３４位のイソロイシンをリジンに置換した。
【図３】ＣＨＰ２とＮＨＥ１ペプチドとの融合タンパク質の立体構造を示す図である（一部はモデル）。
【図４】ＣＨＰ２とＮＨＥ１ペプチドとの融合タンパク質を大腸菌で発現したものを精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動した結果を示す図である。
【図５】ＧＦＰタンパク質を目的物質としたときの本発明の精製方法を示す図である。（実施例５）
【図６】ＧＦＰタンパク質を本発明の精製方法により精製したときに得られた精製物を示す図である。ＧＦＰが濃縮、精製され蛍光を発している。
【図７】本発明の精製用タグ（ＮＨＥ１タグ）と対照コントロール（Ｈｉｓタグ）で標識したＧＦＰタンパク質を精製したときの精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動した結果を示す図である。（実施例６）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＨＥ１の部分ペプチドからなる精製用タグ。
【請求項２】
ＮＨＥ１の部分ペプチドが、ＣＨＰとの結合ドメインを含む、請求項１に記載の精製用タグ。
【請求項３】
ＣＨＰとの結合ドメインが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分である、請求項２に記載の精製用タグ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させることによる、目的物質の精製方法。
【請求項５】
以下の工程を含む目的物質の精製方法：
１）請求項１〜３のいずれかに記載の精製用タグを目的物質に標識する工程；
２）前記精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させる工程；
３）前記接触させる工程において、Ca2+の存在下で、試料と担体とを相互作用させる工程；
４）前記相互作用させた後に、Ca2+の非存在下で、目的物質を溶出する工程。
【請求項６】
ＣＨＰ２の部分タンパク質が、ＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質である、請求項４または５に記載の精製方法。
【請求項７】
少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質が、ＣＨＰ２の部分タンパク質とＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異させたペプチドを結合して構成される物質である、請求項４〜６にいずれかに記載の精製方法。
【請求項８】
ＮＨＥ１の部分ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチドであり、該ペプチドのアミノ酸変異が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸の変異である、請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
ＮＨＥ１の部分ペプチドのアミノ酸変異が、イソロイシンからリジンに変異されていることを特徴とする請求項８に記載の精製方法。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれかに記載の精製方法に使用し、前記精製方法において使用する担体に担持する物質であり、ＣＨＰ２の部分タンパク質とＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異したペプチドを結合して構成されることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項１１】
ＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質と、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチド、を含む融合タンパク質であり、該ペプチドの一部のアミノ酸の変異が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸がイソロイシンからリジンへ変異されていることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載の精製用タグを含む目的物質の精製、濃縮および／または検出用キット。
【請求項１３】
さらに、請求項１０もしくは１１に記載の融合タンパク質または該融合タンパク質を担持する担体を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１】
ＮＨＥ１の部分ペプチドからなる精製用タグ。
【請求項２】
ＮＨＥ１の部分ペプチドが、ＣＨＰとの結合ドメインを含む、請求項１に記載の精製用タグ。
【請求項３】
ＣＨＰとの結合ドメインが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分である、請求項２に記載の精製用タグ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させることによる、目的物質の精製方法。
【請求項５】
以下の工程を含む目的物質の精製方法：
１）請求項１〜３のいずれかに記載の精製用タグを目的物質に標識する工程；
２）前記精製用タグで標識した目的物質を含む試料を、少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質を担持する担体と接触させる工程；
３）前記接触させる工程において、Ca2+の存在下で、試料と担体とを相互作用させる工程；
４）前記相互作用させた後に、Ca2+の非存在下で、目的物質を溶出する工程。
【請求項６】
ＣＨＰ２の部分タンパク質が、ＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質である、請求項４または５に記載の精製方法。
【請求項７】
少なくともＣＨＰ２の部分タンパク質を含む物質が、ＣＨＰ２の部分タンパク質とＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異させたペプチドを結合して構成される物質である、請求項４〜６にいずれかに記載の精製方法。
【請求項８】
ＮＨＥ１の部分ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチドであり、該ペプチドのアミノ酸変異が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸の変異である、請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
ＮＨＥ１の部分ペプチドのアミノ酸変異が、イソロイシンからリジンに変異されていることを特徴とする請求項８に記載の精製方法。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれかに記載の精製方法に使用し、前記精製方法において使用する担体に担持する物質であり、ＣＨＰ２の部分タンパク質とＮＨＥ１の部分ペプチドの一部のアミノ酸を変異したペプチドを結合して構成されることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項１１】
ＣＨＰ２のＣ末端から１〜１０個のアミノ酸残基が欠失されているタンパク質と、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５１６−５４１位のアミノ酸に該当する部分を含むペプチド、を含む融合タンパク質であり、該ペプチドの一部のアミノ酸の変異が、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち第５３４位のアミノ酸がイソロイシンからリジンへ変異されていることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載の精製用タグを含む目的物質の精製、濃縮および／または検出用キット。
【請求項１３】
さらに、請求項１０もしくは１１に記載の融合タンパク質または該融合タンパク質を担持する担体を含む、請求項１２に記載のキット。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２８５４２８（Ｐ２００８−２８５４２８Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３０２３９（Ｐ２００７−１３０２３９）
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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