移動度シフトアッセイ干渉の低減
【課題】本発明は例えば移動度シフトアッセイにおける非特異的結合サンプル成分の干渉を低減するための方法及び組成物を提供する。
【解決手段】例えば成分をヘパリン硫酸等の荷電ポリマーと結合することにより、サンプル成分とアフィニティー物質（例えばアフィニティー分子又はアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子とのコンジュゲート）の非特異的結合に起因する干渉を防止する。本発明は対象分析物を高濃度に濃縮し、分析物を高感度で検出し、更に分析物を容易に濃縮できるように反応条件を最適化するための方法も提供する。本発明のこのような目的は例えばサンプル中の分析物をＤＮＡ等の荷電キャリヤー分子と結合したアフィニティー分子に接触させることにより形成される分析物とコンジュゲートとの複合体を濃縮することにより達成される。
【解決手段】例えば成分をヘパリン硫酸等の荷電ポリマーと結合することにより、サンプル成分とアフィニティー物質（例えばアフィニティー分子又はアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子とのコンジュゲート）の非特異的結合に起因する干渉を防止する。本発明は対象分析物を高濃度に濃縮し、分析物を高感度で検出し、更に分析物を容易に濃縮できるように反応条件を最適化するための方法も提供する。本発明のこのような目的は例えばサンプル中の分析物をＤＮＡ等の荷電キャリヤー分子と結合したアフィニティー分子に接触させることにより形成される分析物とコンジュゲートとの複合体を濃縮することにより達成される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の対象分析物の検出又は同定方法であって、
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーの存在下に分析物に対して親和性をもつアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルを接触させて分析物と１個以上のコンジュゲートの複合体を形成する段階と；
（ｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の濃縮チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルを使用することにより、ポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体を濃縮する段階と；
（ｉｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の分離チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルを使用することにより、ポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体と未結合コンジュゲートを分離する段階と；
（ｉｖ）複合体を検出して分析物の存在を同定するか又はサンプル中の分析物の量を測定する段階を含み、
荷電キャリヤー分子は１個以上のアフィニティー分子を介して分析物と結合して分析物とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより分析物の分離特性に変化を生じさせるものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである前記方法。
【請求項２】
ポリアニオン性ポリマーが多糖類、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、合成高分子化合物、セラミック及びそれらの複合体からなる群から選択されるポリアニオン性ポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリアニオン性ポリマーが、ｐｏｌｙ−ｄＩｄＣ、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ポリタングステン酸、ポリアネトールスルホン酸、ポリビニル硫酸、ポリアクリレート、コンドロイチン硫酸、プラスミドＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、セルロースに結合したＤＮＡ、ガラス粒子、コロイドガラス、及び乳白ガラスからなる群から選択されるポリアニオン性ポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリアニオン性ポリマーがヘパリン又はヘパリン硫酸を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１個以上のアフィニティー分子の少なくとも１個が検出マーカーで標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複合体を形成する段階（ｉ）が、１個以上のコンジュゲートを形成していないアフィニティー分子とサンプルを接触させて分析物と１個以上のコンジュゲートと１個以上のコンジュゲートを形成していないアフィニティー分子との複合体を形成する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アフィニティー分子が蛋白質−蛋白質相互作用、蛋白質−化学物質相互作用又は化学物質−化学物質相互作用により分析物と結合する分子である請求項１又は６に記載の方法。
【請求項８】
アフィニティー分子が抗原−抗体相互作用、糖鎖−レクチン相互作用、酵素−インヒビター相互作用、蛋白質−ペプチド鎖相互作用、染色体もしくは核酸鎖−核酸鎖相互作用、ヌクレオチド−リガンド相互作用又は受容体−リガンド相互作用により分析物と結合する分子である請求項１又は６に記載の方法。
【請求項９】
アフィニティー分子が、抗体、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ’フラグメント、抗体可変領域、レクチン、アビジン、受容体、アフィニティーペプチド、アプタマー、及びＤＮＡ結合蛋白質からなる群から選択される請求項１又は６に記載の方法。
【請求項１０】
荷電キャリヤー分子がアニオン性分子である請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
荷電キャリヤー分子が核酸鎖又はスルホン化ポリペプチドを含むアニオン性分子である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
荷電キャリヤー分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はスルホン化ポリペプチドを含む請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
荷電キャリヤー分子が１種以上の合成配列を含むＤＮＡを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１種以上の合成配列がリンカー基又はリンカー反応性基を含む１種以上のヌクレオチド類似体を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リンカー基又はリンカー反応性基がアミノ基、チオール、カルボキシル基、イミダゾール基、又はスクシンイミド基を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
更に、検出マーカーをリンカー基又はリンカー反応性基に共有結合させる段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１個のアフィニティー分子が検出マーカーで標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１個のコンジュゲート又はコンジュゲートを形成していない少なくとも１個のアフィニティー分子が検出マーカーで標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
コンジュゲートが検出マーカーで標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
コンジュゲートの荷電キャリヤー分子が検出マーカーで標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
コンジュゲートのアフィニティー分子が検出マーカーで標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
検出マーカーが蛍光色素、発光色素、燐光色素、蛍光蛋白質、発光蛋白質もしくは粒子、放射性トレーサー、化学発光化合物、レドックスメディエーター、起電性化合物、酵素、金コロイド粒子、又は銀粒子である請求項５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
分離が分離チャネル中の分離媒体によるコンジュゲート又は複合体の電気泳動分離を含む請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
分離媒体がサイズ排除樹脂、ポリアクリルアミドゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、スクロースとエピクロロヒドリンのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ｐＤＭＡ）、又はアガロースゲルを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
分離媒体が更にポリアニオン性ポリマーを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ポリアニオン性ポリマーが分離媒体中に約０．０１〜５％の濃度で存在する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ポリアニオン性ポリマーが分離媒体中に約０．０５〜２％の濃度で存在する請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
更に、サンプルを含有するバッファーにポリアニオン性ポリマーを導入する段階を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ポリアニオン性ポリマーがサンプルバッファー中に約０．００１〜２％の濃度で存在する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
分離チャネルが約０．１〜２００ミクロンの少なくとも１個の横断面マイクロスケール寸法をもつ請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
段階（ｉ）がアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートの少なくとも１個が検出マーカーで標識された、１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、分析物と検出マーカーで標識されたコンジュゲートとを含む複合体を形成させる段階を含み；
段階（ｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体を濃縮する段階を含み；
段階（ｉｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体の形成に関与しない検出マーカーで標識された少なくとも１個のコンジュゲートから複合体を分離する段階を含み；
段階（ｉｖ）が、
（ａ）分離された複合体の量を測定するか又は分離された複合体の存在を検出する段階と；
（ｂ）測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定するか又は検出された存在に基づいてサンプル中の分析物の存在を同定する段階を含み；
コンジュゲートのアフィニティー分子が分析物と結合することが可能な性質を有するものであって、２個以上のコンジュゲートを使用する場合には、コンジュゲートの各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なる分析物上の位置で分析物と結合することが可能な性質を有し、荷電キャリヤー分子がアフィニティー分子を介して分析物と結合して分析物とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより分析物の分離特性に変化を生じさせることが可能な性質を有するものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
段階（ｉ）がアフィニティー分子の少なくとも１個又はコンジュゲートの少なくとも１個が検出マーカーで標識されたものであり、１個以上のアフィニティー分子及びアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、分析物とアフィニティー分子とコンジュゲートを含む複合体を形成させる段階を含み；
段階（ｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体を濃縮する段階を含み；
段階（ｉｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体の形成に関与しない検出マーカーで標識された遊離のアフィニティー分子又は検出マーカーで標識されたコンジュゲートから複合体を分離する段階を含み；
段階（ｉｖ）が、
（ａ）分離された複合体の量を測定するか又は分離された複合体の存在を検出する段階と；
（ｂ）測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定するか又は検出された存在に基づいてサンプル中の分析物の存在を同定する段階を含み；
アフィニティー分子及びコンジュゲートのアフィニティー分子が分析物と結合することが可能な性質を有するものであって、各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なる分析物上の位置で分析物と結合することが可能な性質を有し、荷電キャリヤー分子がアフィニティー分子を介して分析物と結合して分析物とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより分析物の分離特性に変化を生じることが可能な性質を有するものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである請求項６に記載の方法。
【請求項３３】
サンプル中の分析物の測定方法であって、
（ｉ）検出マーカーで標識された分析物又は検出マーカーで標識された分析物の類似体及びアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、サンプル中の分析物とコンジュゲートとの第１の複合体及び標識分析物又は標識類似体とコンジュゲートとの第２の複合体を形成させる段階と；
（ｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の濃縮チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルを使用することにより、ポリアニオン性ポリマーの存在下に第２の複合体を濃縮する段階と；
（ｉｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の分離チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルを使用することによりマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に第２の複合体の形成に関与しない遊離の標識分析物又は遊離の標識類似体から第２の複合体を分離する段階と；
（ｉｖ）分離された第２の複合体の量又は分離された遊離の標識分析物もしくは分離された遊離の標識類似体の量を測定する段階と；
（ｖ）測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定する段階を含み；
コンジュゲート中のアフィニティー分子がサンプル中の分析物及び標識分析物と結合することが可能な性質又はサンプル中の分析物及び標識類似体と結合することが可能な性質を有するものであって、２個以上のコンジュゲートを使用する場合には、コンジュゲート中の各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び標識分析物上の位置でサンプル中の分析物及び標識分析物と結合することが可能な性質を有するか、又はコンジュゲート中の各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び標識類似体上の位置でサンプル中の分析物及び標識類似体と結合することが可能な性質を有するものであり、荷電キャリヤー分子は１個以上のアフィニティー分子を介して標識分析物又は標識類似体と結合して標識分析物又は標識類似体とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより標識分析物又は標識類似体の分離特性に変化を生じさせるものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである前記方法。
【請求項３４】
段階（ｉ）が検出マーカーで標識された分析物又は検出マーカーで標識された分析物の類似体、１個以上のアフィニティー分子、アフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、サンプル中の分析物とアフィニティー分子とコンジュゲートとの第１の複合体及び標識分析物又は標識類似体とアフィニティー分子とコンジュゲートとの第２の複合体を形成させる段階を含み；
段階（ｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に第２の複合体を濃縮する段階を含み；
段階（ｉｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に第２の複合体の形成に関与しない遊離の標識分析物又は標識類似体から第２の複合体を分離する段階を含み；
段階（ｉｖ）が分離された第２の複合体の量又は分離された遊離の標識分析物もしくは分離された遊離の標識類似体の量を測定する段階を含み；
段階（ｖ）が測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定する段階を含み；
アフィニティー分子及びコンジュゲートのアフィニティー分子がサンプル中の分析物及び標識分析物又はサンプル中の分析物及び標識類似体と結合することが可能な性質を有するものであって、各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び標識分析物上の位置でサンプル中の分析物及び標識分析物と結合することが可能な性質を有するか、又は各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の各分析物上の位置及び標識類似体上の位置でサンプル中の分析物及び標識類似体と結合することが可能な性質を有し、荷電キャリヤー分子がアフィニティー分子を介して標識分析物又は標識類似体と結合して標識分析物又は標識類似体とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより標識分析物又は標識類似体の分離特性に変化を生じることが可能な性質を有するものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
サンプル中の分析物の測定方法であって、
（ｉ）荷電キャリヤー分子と結合した分析物又は荷電キャリヤー分子と結合した分析物の類似体及び検出マーカーで標識された１個以上のアフィニティー分子に分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、荷電キャリヤー分子と結合した分析物又は荷電キャリヤー分子と結合した類似体と標識アフィニティー分子との第１の複合体及びサンプル中の分析物と標識アフィニティー分子との第２の複合体を形成させる段階と；
（ｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の濃縮チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルを使用することにより、ポリアニオン性ポリマーの存在下に第１の複合体を濃縮する段階と；
（ｉｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の分離チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルを使用することにより、マイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に第１の複合体を第２の複合体から分離する段階と；
（ｉｖ）分離された第１の複合体の量又は第２の複合体の量を測定する段階と；
（ｖ）測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定する段階を含み；
アフィニティー分子がサンプル中の分析物及び荷電キャリヤー分子と結合した分析物又はサンプル中の分析物及び荷電キャリヤー分子と結合した類似体と結合することが可能な性質を有するものであって、２個以上のアフィニティー分子を使用する場合には、各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び荷電キャリヤー分子と結合した分析物上の位置でサンプル中の分析物及び荷電キャリヤー分子と結合した分析物と結合することが可能な性質を有するか、又は各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び荷電キャリヤー分子と結合した類似体上の位置でサンプル中の分析物及び荷電キャリヤー分子と結合した類似体と結合することが可能な性質を有し、荷電キャリヤー分子が分析物又は類似体と結合して分析物とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより第１の複合体の分離特性に変化を生じさせることが可能な性質を有するものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである前記方法。
【請求項３６】
サンプルが血清、血漿、全血、組織抽出物、細胞抽出物、核抽出物、培地、微生物培養抽出物、分子ライブラリーのメンバー、臨床サンプル、唾液検体、大便検体、脳髄液、尿サンプル、尿道−性器スワブ、咽喉スワブ、又は環境サンプルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
分析物がＡＦＰ、ｈＣＧ、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、インターロイキン、Ｆａｓリガンド、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＨＢｓＡｇ、抗ＨＩＶ抗体、又はＴ４を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中のノイズ成分の濃度が低いか又はゼロである領域に複合体を移動させてこの領域で濃縮する請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
アフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルを接触させて分析物とコンジュゲートとの複合体を形成させる段階が約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法を有する濃縮チャネルに流体的に接続されたマイクロチャネルで実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
複合体を濃縮する段階が濃縮チャネルでバッファーを使用することにより実施され、バッファーが濃縮段階（ｉｉ）で適用される複合体を含有する溶液中の複合体の電気泳動移動度よりも濃縮チャネルにおけるバッファー中の複合体の電気泳動移動度を遅くさせる性質をもつ請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
複合体を濃縮する段階が荷電キャリヤー分子の電荷に基づいて複合体とノイズ成分の電気泳動移動度の差を利用することにより実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
複合体を濃縮する段階が荷電キャリヤー分子の電荷に基づいて複合体とノイズ成分の吸着性の差を利用することにより実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
複合体を濃縮する段階が電場増幅サンプルスタッキング法（ＦＡＳＳ）、電場増幅サンプル注入法（ＦＡＳＩ）、等速電気泳動法（ＩＴＰ）、等電点電気泳動法（ＩＦ）及び固相抽出法（ＳＰＥ）からなる群から選択される濃縮法により実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
複合体を濃縮する段階が電場増幅サンプルスタッキング法（ＦＡＳＳ）及び等速電気泳動法（ＩＴＰ）からなる群から選択される濃縮法により実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
１種以上の合成配列がヌクレオチドのホスホロチオエート類似体、酸素の代わりにメチレン基をリボース環に含むヌクレオチド、又は２’−糖デオキシ置換基を２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２−Ｏ−アルコキシル−及び２’−Ｏ−アリル修飾で置換したヌクレオチドから構成される群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項４６】
濃縮段階が濃縮チャネル中の濃縮媒体によるコンジュゲート又は複合体の電気泳動濃縮を含む請求項１又は１０に記載の方法。
【請求項４７】
濃縮媒体がサイズ排除樹脂、ポリアクリルアミドゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、スクロースとエピクロロヒドリンのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ｐＤＭＡ）、又はアガロースゲルを含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
濃縮媒体が更にポリアニオン性ポリマーを含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ポリアニオン性ポリマーが濃縮媒体中に約０．０１〜５％の濃度で存在する請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ポリアニオン性ポリマーが濃縮媒体中に約０．０５〜２％の濃度で存在する請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
更に、サンプルを含有するバッファーにポリアニオン性ポリマーを導入する段階を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
ポリアニオン性ポリマーがサンプルバッファー中に約０．００１〜２％の濃度で存在するヘパリン又はヘパリン硫酸を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
濃縮チャネルが約０．１〜２００ミクロンの少なくとも１個の横断面マイクロスケール寸法をもつ請求項１に記載の方法。
【請求項１】
サンプル中の対象分析物の検出又は同定方法であって、
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーの存在下に分析物に対して親和性をもつアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルを接触させて分析物と１個以上のコンジュゲートの複合体を形成する段階と；
（ｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の濃縮チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルを使用することにより、ポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体を濃縮する段階と；
（ｉｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の分離チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルを使用することにより、ポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体と未結合コンジュゲートを分離する段階と；
（ｉｖ）複合体を検出して分析物の存在を同定するか又はサンプル中の分析物の量を測定する段階を含み、
荷電キャリヤー分子は１個以上のアフィニティー分子を介して分析物と結合して分析物とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより分析物の分離特性に変化を生じさせるものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである前記方法。
【請求項２】
ポリアニオン性ポリマーが多糖類、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、合成高分子化合物、セラミック及びそれらの複合体からなる群から選択されるポリアニオン性ポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリアニオン性ポリマーが、ｐｏｌｙ−ｄＩｄＣ、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ポリタングステン酸、ポリアネトールスルホン酸、ポリビニル硫酸、ポリアクリレート、コンドロイチン硫酸、プラスミドＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、セルロースに結合したＤＮＡ、ガラス粒子、コロイドガラス、及び乳白ガラスからなる群から選択されるポリアニオン性ポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリアニオン性ポリマーがヘパリン又はヘパリン硫酸を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１個以上のアフィニティー分子の少なくとも１個が検出マーカーで標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複合体を形成する段階（ｉ）が、１個以上のコンジュゲートを形成していないアフィニティー分子とサンプルを接触させて分析物と１個以上のコンジュゲートと１個以上のコンジュゲートを形成していないアフィニティー分子との複合体を形成する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アフィニティー分子が蛋白質−蛋白質相互作用、蛋白質−化学物質相互作用又は化学物質−化学物質相互作用により分析物と結合する分子である請求項１又は６に記載の方法。
【請求項８】
アフィニティー分子が抗原−抗体相互作用、糖鎖−レクチン相互作用、酵素−インヒビター相互作用、蛋白質−ペプチド鎖相互作用、染色体もしくは核酸鎖−核酸鎖相互作用、ヌクレオチド−リガンド相互作用又は受容体−リガンド相互作用により分析物と結合する分子である請求項１又は６に記載の方法。
【請求項９】
アフィニティー分子が、抗体、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ’フラグメント、抗体可変領域、レクチン、アビジン、受容体、アフィニティーペプチド、アプタマー、及びＤＮＡ結合蛋白質からなる群から選択される請求項１又は６に記載の方法。
【請求項１０】
荷電キャリヤー分子がアニオン性分子である請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
荷電キャリヤー分子が核酸鎖又はスルホン化ポリペプチドを含むアニオン性分子である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
荷電キャリヤー分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はスルホン化ポリペプチドを含む請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
荷電キャリヤー分子が１種以上の合成配列を含むＤＮＡを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１種以上の合成配列がリンカー基又はリンカー反応性基を含む１種以上のヌクレオチド類似体を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リンカー基又はリンカー反応性基がアミノ基、チオール、カルボキシル基、イミダゾール基、又はスクシンイミド基を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
更に、検出マーカーをリンカー基又はリンカー反応性基に共有結合させる段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１個のアフィニティー分子が検出マーカーで標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１個のコンジュゲート又はコンジュゲートを形成していない少なくとも１個のアフィニティー分子が検出マーカーで標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
コンジュゲートが検出マーカーで標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
コンジュゲートの荷電キャリヤー分子が検出マーカーで標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
コンジュゲートのアフィニティー分子が検出マーカーで標識されている請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
検出マーカーが蛍光色素、発光色素、燐光色素、蛍光蛋白質、発光蛋白質もしくは粒子、放射性トレーサー、化学発光化合物、レドックスメディエーター、起電性化合物、酵素、金コロイド粒子、又は銀粒子である請求項５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
分離が分離チャネル中の分離媒体によるコンジュゲート又は複合体の電気泳動分離を含む請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
分離媒体がサイズ排除樹脂、ポリアクリルアミドゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、スクロースとエピクロロヒドリンのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ｐＤＭＡ）、又はアガロースゲルを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
分離媒体が更にポリアニオン性ポリマーを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ポリアニオン性ポリマーが分離媒体中に約０．０１〜５％の濃度で存在する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ポリアニオン性ポリマーが分離媒体中に約０．０５〜２％の濃度で存在する請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
更に、サンプルを含有するバッファーにポリアニオン性ポリマーを導入する段階を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ポリアニオン性ポリマーがサンプルバッファー中に約０．００１〜２％の濃度で存在する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
分離チャネルが約０．１〜２００ミクロンの少なくとも１個の横断面マイクロスケール寸法をもつ請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
段階（ｉ）がアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートの少なくとも１個が検出マーカーで標識された、１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、分析物と検出マーカーで標識されたコンジュゲートとを含む複合体を形成させる段階を含み；
段階（ｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体を濃縮する段階を含み；
段階（ｉｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体の形成に関与しない検出マーカーで標識された少なくとも１個のコンジュゲートから複合体を分離する段階を含み；
段階（ｉｖ）が、
（ａ）分離された複合体の量を測定するか又は分離された複合体の存在を検出する段階と；
（ｂ）測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定するか又は検出された存在に基づいてサンプル中の分析物の存在を同定する段階を含み；
コンジュゲートのアフィニティー分子が分析物と結合することが可能な性質を有するものであって、２個以上のコンジュゲートを使用する場合には、コンジュゲートの各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なる分析物上の位置で分析物と結合することが可能な性質を有し、荷電キャリヤー分子がアフィニティー分子を介して分析物と結合して分析物とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより分析物の分離特性に変化を生じさせることが可能な性質を有するものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
段階（ｉ）がアフィニティー分子の少なくとも１個又はコンジュゲートの少なくとも１個が検出マーカーで標識されたものであり、１個以上のアフィニティー分子及びアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、分析物とアフィニティー分子とコンジュゲートを含む複合体を形成させる段階を含み；
段階（ｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体を濃縮する段階を含み；
段階（ｉｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に複合体の形成に関与しない検出マーカーで標識された遊離のアフィニティー分子又は検出マーカーで標識されたコンジュゲートから複合体を分離する段階を含み；
段階（ｉｖ）が、
（ａ）分離された複合体の量を測定するか又は分離された複合体の存在を検出する段階と；
（ｂ）測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定するか又は検出された存在に基づいてサンプル中の分析物の存在を同定する段階を含み；
アフィニティー分子及びコンジュゲートのアフィニティー分子が分析物と結合することが可能な性質を有するものであって、各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なる分析物上の位置で分析物と結合することが可能な性質を有し、荷電キャリヤー分子がアフィニティー分子を介して分析物と結合して分析物とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより分析物の分離特性に変化を生じることが可能な性質を有するものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである請求項６に記載の方法。
【請求項３３】
サンプル中の分析物の測定方法であって、
（ｉ）検出マーカーで標識された分析物又は検出マーカーで標識された分析物の類似体及びアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、サンプル中の分析物とコンジュゲートとの第１の複合体及び標識分析物又は標識類似体とコンジュゲートとの第２の複合体を形成させる段階と；
（ｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の濃縮チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルを使用することにより、ポリアニオン性ポリマーの存在下に第２の複合体を濃縮する段階と；
（ｉｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の分離チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルを使用することによりマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に第２の複合体の形成に関与しない遊離の標識分析物又は遊離の標識類似体から第２の複合体を分離する段階と；
（ｉｖ）分離された第２の複合体の量又は分離された遊離の標識分析物もしくは分離された遊離の標識類似体の量を測定する段階と；
（ｖ）測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定する段階を含み；
コンジュゲート中のアフィニティー分子がサンプル中の分析物及び標識分析物と結合することが可能な性質又はサンプル中の分析物及び標識類似体と結合することが可能な性質を有するものであって、２個以上のコンジュゲートを使用する場合には、コンジュゲート中の各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び標識分析物上の位置でサンプル中の分析物及び標識分析物と結合することが可能な性質を有するか、又はコンジュゲート中の各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び標識類似体上の位置でサンプル中の分析物及び標識類似体と結合することが可能な性質を有するものであり、荷電キャリヤー分子は１個以上のアフィニティー分子を介して標識分析物又は標識類似体と結合して標識分析物又は標識類似体とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより標識分析物又は標識類似体の分離特性に変化を生じさせるものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである前記方法。
【請求項３４】
段階（ｉ）が検出マーカーで標識された分析物又は検出マーカーで標識された分析物の類似体、１個以上のアフィニティー分子、アフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、サンプル中の分析物とアフィニティー分子とコンジュゲートとの第１の複合体及び標識分析物又は標識類似体とアフィニティー分子とコンジュゲートとの第２の複合体を形成させる段階を含み；
段階（ｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に第２の複合体を濃縮する段階を含み；
段階（ｉｉｉ）がマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に第２の複合体の形成に関与しない遊離の標識分析物又は標識類似体から第２の複合体を分離する段階を含み；
段階（ｉｖ）が分離された第２の複合体の量又は分離された遊離の標識分析物もしくは分離された遊離の標識類似体の量を測定する段階を含み；
段階（ｖ）が測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定する段階を含み；
アフィニティー分子及びコンジュゲートのアフィニティー分子がサンプル中の分析物及び標識分析物又はサンプル中の分析物及び標識類似体と結合することが可能な性質を有するものであって、各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び標識分析物上の位置でサンプル中の分析物及び標識分析物と結合することが可能な性質を有するか、又は各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の各分析物上の位置及び標識類似体上の位置でサンプル中の分析物及び標識類似体と結合することが可能な性質を有し、荷電キャリヤー分子がアフィニティー分子を介して標識分析物又は標識類似体と結合して標識分析物又は標識類似体とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより標識分析物又は標識類似体の分離特性に変化を生じることが可能な性質を有するものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
サンプル中の分析物の測定方法であって、
（ｉ）荷電キャリヤー分子と結合した分析物又は荷電キャリヤー分子と結合した分析物の類似体及び検出マーカーで標識された１個以上のアフィニティー分子に分析物を含有するサンプルをポリアニオン性ポリマーの存在下に接触させ、荷電キャリヤー分子と結合した分析物又は荷電キャリヤー分子と結合した類似体と標識アフィニティー分子との第１の複合体及びサンプル中の分析物と標識アフィニティー分子との第２の複合体を形成させる段階と；
（ｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の濃縮チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの濃縮チャネルを使用することにより、ポリアニオン性ポリマーの存在下に第１の複合体を濃縮する段階と；
（ｉｉｉ）約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法をもつ少なくとも１個の分離チャネルを含むマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルを使用することにより、マイクロフルイディックデバイスの分離チャネルでポリアニオン性ポリマーの存在下に第１の複合体を第２の複合体から分離する段階と；
（ｉｖ）分離された第１の複合体の量又は第２の複合体の量を測定する段階と；
（ｖ）測定量に基づいてサンプル中の分析物の量を決定する段階を含み；
アフィニティー分子がサンプル中の分析物及び荷電キャリヤー分子と結合した分析物又はサンプル中の分析物及び荷電キャリヤー分子と結合した類似体と結合することが可能な性質を有するものであって、２個以上のアフィニティー分子を使用する場合には、各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び荷電キャリヤー分子と結合した分析物上の位置でサンプル中の分析物及び荷電キャリヤー分子と結合した分析物と結合することが可能な性質を有するか、又は各アフィニティー分子が他の全アフィニティー分子と異なるサンプル中の分析物上の位置及び荷電キャリヤー分子と結合した類似体上の位置でサンプル中の分析物及び荷電キャリヤー分子と結合した類似体と結合することが可能な性質を有し、荷電キャリヤー分子が分析物又は類似体と結合して分析物とアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子の複合体を形成することにより第１の複合体の分離特性に変化を生じさせることが可能な性質を有するものであり、また、ポリアニオン性ポリマーと荷電キャリヤー分子は同じ負の正味電荷をもつものである前記方法。
【請求項３６】
サンプルが血清、血漿、全血、組織抽出物、細胞抽出物、核抽出物、培地、微生物培養抽出物、分子ライブラリーのメンバー、臨床サンプル、唾液検体、大便検体、脳髄液、尿サンプル、尿道−性器スワブ、咽喉スワブ、又は環境サンプルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
分析物がＡＦＰ、ｈＣＧ、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、インターロイキン、Ｆａｓリガンド、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＨＢｓＡｇ、抗ＨＩＶ抗体、又はＴ４を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中のノイズ成分の濃度が低いか又はゼロである領域に複合体を移動させてこの領域で濃縮する請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
アフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との１個以上のコンジュゲートに分析物を含有するサンプルを接触させて分析物とコンジュゲートとの複合体を形成させる段階が約０．１〜５００ミクロンの少なくとも１個のマイクロスケール寸法を有する濃縮チャネルに流体的に接続されたマイクロチャネルで実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
複合体を濃縮する段階が濃縮チャネルでバッファーを使用することにより実施され、バッファーが濃縮段階（ｉｉ）で適用される複合体を含有する溶液中の複合体の電気泳動移動度よりも濃縮チャネルにおけるバッファー中の複合体の電気泳動移動度を遅くさせる性質をもつ請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
複合体を濃縮する段階が荷電キャリヤー分子の電荷に基づいて複合体とノイズ成分の電気泳動移動度の差を利用することにより実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
複合体を濃縮する段階が荷電キャリヤー分子の電荷に基づいて複合体とノイズ成分の吸着性の差を利用することにより実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
複合体を濃縮する段階が電場増幅サンプルスタッキング法（ＦＡＳＳ）、電場増幅サンプル注入法（ＦＡＳＩ）、等速電気泳動法（ＩＴＰ）、等電点電気泳動法（ＩＦ）及び固相抽出法（ＳＰＥ）からなる群から選択される濃縮法により実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
複合体を濃縮する段階が電場増幅サンプルスタッキング法（ＦＡＳＳ）及び等速電気泳動法（ＩＴＰ）からなる群から選択される濃縮法により実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
１種以上の合成配列がヌクレオチドのホスホロチオエート類似体、酸素の代わりにメチレン基をリボース環に含むヌクレオチド、又は２’−糖デオキシ置換基を２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２−Ｏ−アルコキシル−及び２’−Ｏ−アリル修飾で置換したヌクレオチドから構成される群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項４６】
濃縮段階が濃縮チャネル中の濃縮媒体によるコンジュゲート又は複合体の電気泳動濃縮を含む請求項１又は１０に記載の方法。
【請求項４７】
濃縮媒体がサイズ排除樹脂、ポリアクリルアミドゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、スクロースとエピクロロヒドリンのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ｐＤＭＡ）、又はアガロースゲルを含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
濃縮媒体が更にポリアニオン性ポリマーを含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ポリアニオン性ポリマーが濃縮媒体中に約０．０１〜５％の濃度で存在する請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ポリアニオン性ポリマーが濃縮媒体中に約０．０５〜２％の濃度で存在する請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
更に、サンプルを含有するバッファーにポリアニオン性ポリマーを導入する段階を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
ポリアニオン性ポリマーがサンプルバッファー中に約０．００１〜２％の濃度で存在するヘパリン又はヘパリン硫酸を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
濃縮チャネルが約０．１〜２００ミクロンの少なくとも１個の横断面マイクロスケール寸法をもつ請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−８１０１１（Ｐ２０１１−８１０１１Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７７６３０（Ｐ２０１０−２７７６３０）
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【分割の表示】特願２００６−５０１２６０（Ｐ２００６−５０１２６０）の分割
【原出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【出願人】（５０５３８４４２７）和光純薬工業株式会社 (2)
【出願人】（５０５３５９３３３）カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． (4)
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【分割の表示】特願２００６−５０１２６０（Ｐ２００６−５０１２６０）の分割
【原出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【出願人】（５０５３８４４２７）和光純薬工業株式会社 (2)
【出願人】（５０５３５９３３３）カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． (4)
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