移植片対宿主病の治療
本願は、クローン骨髄幹細胞（ｃＭＳＣ）を活性成分として用いる、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤について記載するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤に関する。本発明はまた、間充織幹細胞を活性成分として含有する、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／９４０，３４９号明細書（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権の利益を主張するものである。
【０００３】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）とは、患者身体が同種移植において注射されるドナーの末梢血又は骨髄のＴリンパ球に対して免疫反応を有する疾患を称する。すなわち、移植片対宿主病は、肝機能障害、皮膚病変、黄疸、下痢、発熱、汎血球減少症等、及び深刻な場合には患者の死亡を招く免疫反応の原因となる、輸注した生リンパ球により誘発される疾患である。
【０００４】
移植片対宿主病は、急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）と慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）とに大別することができる。ｃＧＶＨＤは、血液及び骨髄前駆細胞の移植後１００日間生存する患者の２０％〜７０％に起こる主要且つ一般的な副作用であり、移植後の死亡の主な原因である。ｃＧＶＨＤとａＧＶＨＤとは連続した疾患ではなく、ａＧＶＨＤは異なったアプローチを必要とする。また、ｃＧＶＨＤは血液及び骨髄前駆細胞の移植による治療法の発展のために、より大きな問題となっている。
【０００５】
ｃＧＶＨＤは同種移植の場合、通常は移植後４ヶ月〜６ヶ月に起こり、８０日以内又は１年以降の発生は稀である。したがって、同種反応がｃＧＶＨＤを引き起こすための主な要件であり、ｃＧＶＨＤの発病機序は長いインキュベート期間を経過するか、又は標的器官への影響が徐々に現れると見なすことができる。ｃＧＶＨＤでは、胸腺の機能における様々な問題が発見されており、移植前の治療、又は末梢機構からの同種抗原／自己抗原により引き起こされる損傷のために正常な胸腺を除去しない場合、病的移植片Ｔ細胞が反応により増加するが、この種の病的ＣＤ陽性Ｔ細胞は、Ｔｈ２免疫反応により、細胞傷害性攻撃、炎症性線維症サイトカインの分泌、Ｂ細胞活性化、及び自己抗体の形成による標的器官の損傷を含む、自己免疫疾患と同様の免疫不全を引き起こすと考えられる。
【０００６】
ｃＧＶＨＤの臨床症状には紅斑、乾燥、そう痒、色素変化、及び斑点状丘疹等の皮膚における変化、薄毛及び脱毛等の毛髪における変化、並びに歯肉炎、粘膜炎、及び唇萎縮等の口における変化が含まれる。これの他に眼、生殖器官、肝臓、肺、胃腸管、筋膜、骨格系、漿膜等に現れる様々な病変が挙げられる。
【０００７】
ｃＧＶＨＤは概して、骨髄移植後１００日以降に起こるＧＶＨＤと定義されるが、その発症時期よりも病状（manifested conditions）が診断に重要である。症状の発症時期に応じて、ｃＧＶＨＤの発症に移行するまでａＧＶＨＤが治癒しない進行性の発症、ａＧＶＨＤが完全に治癒した後にｃＧＶＨＤが現れる静止性の発症、及び先のａＧＶＨＤの発現なく起こる新たな発症に分類することができる。罹患率及び死亡率は進行性の発症が最も高く、次が静止性の発症であり、新たな発症の場合が最も低い。病状としては、多くの場合、皮膚及び口腔の粘膜層における苔癬性発疹が最初の症状であるが、ａＧＶＨＤと同一部位に現れることもあり、病変は丘疹状（papulous）、浸潤性で、白色鱗屑で覆われている。病理組織学的観点からａＧＶＨＤと比較すると、多くの衛星細胞の壊死が依然として見られるが、リンパ球浸潤は過度の硬化帯域（consolidated band）を示す。これとは別に、胆嚢管が縮小し、胆汁の滞留が見られることもあるが、投薬又はウイルス性肝炎と関連する病変（legions）と混ざっている場合もあり得るため、ｃＧＶＨＤと区別するのが困難な場合もあり得る。
【０００８】
ｃＧＶＨＤの場合、免疫機能が既に低下しているため、治療中の重症感染の恐れがあり、治療による副作用のほとんどない新たな有効な治療が切実に必要とされている。これに関して、間充織幹細胞に多くの器官の細胞に分化する能力があり、Ｔ細胞を抑制することにより移植片対宿主（graft-versus-hot）反応を改善することができると述べる多くの研究が報告されている。
【０００９】
間充織幹細胞は元の中胚葉の始原細胞のように未分化状態で増殖することができ、骨髄、脂肪組織、肝臓、腱、滑膜、及び臍帯等の様々な器官から分離することができるが、それを間充織幹細胞であると正確に規定する単一のマーカーは存在しない。しかし、ＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５が骨髄に対するマーカーとして知られており、ＳＨ−２（ＣＤ１０５）、ＳＨ−３（ＣＤ７３）、ＳＨ−４、及びＴｈ７−１が間葉に対するマーカーとして知られている。間充織幹細胞又は間充織間質細胞（ＭＳＣ）は主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス１を発現し、ＭＨＣクラス１はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）により症状を誘導し得るが、ＭＳＣはＦＡＳ又はＦＡＳ Ｌ（ＣＤ４０）型副刺激分子を示さないため、免疫反応を誘導せず、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による細胞崩壊は起こらない。また、間充織幹細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）時の密度に依存してＴ細胞の増殖を抑制し、Ｂ細胞の増殖及び免疫グロブリンの形成を抑制するが、ＭＨＣ適合性はＭＳＣ免疫抑制に必要ではないことが知られている。また、５０回分裂した場合もＭＳＣの核型又はテロメラーゼの活性に変化はないことが知られている。
【００１０】
しかし、体内に存在するＭＳＣは非常に稀であるので、単離技術の発展が重要である。現在、密度勾配遠心分離、Ｓｃａ−１又はＳＴＲＯ−１に特異的なモノクローナル抗体を用いた方法、及び細胞サイズによる分離方法がＭＳＣの分離方法として知られている。本発明者らは以前、特定の機械装置又は試薬を必要としない有効なＭＳＣ分離方法（韓国特許第１０−０８０２０１１号明細書）を開発したが、該方法は、個体から採取した骨髄を培養し、培養液の上方を新たな容器に繰り返し取ることによりさらに培養することを特徴とする。
【００１１】
ｃＧＶＨＤに対する治療方法に関して、米国特許第６，５４４，５０６号明細書は、臓器移植患者に非同種反応性抗細胞傷害性リンパ球を注射することで、細胞傷害性Ｔリンパ球を除去するという顕著な特徴を有するＧＶＨＤの予防及び治療の方法を提示している。米国特許第６，９３６，２８１号明細書は、間充織幹細胞を用いるＧＶＨＤ治療方法を記載している。米国特許第７，１７３，０１６号明細書は、アデノシンデアミナーゼ阻害剤を注射する工程を含むＧＶＨＤ治療方法を記載している。米国特許第６，３２８，９６０号明細書は、標的臓器移植患者の同種抗原に対するエフェクター細胞の免疫反応を軽減するために、標的臓器移植患者の抗原に対するエフェクター細胞の免疫反応を軽減することのできる量で、間充織幹細胞を注射するという顕著な特徴を有するＧＶＨＤ治療方法を記載している。米国特許第６，３６８，６３６号明細書は、エフェクター細胞を、同種抗原に対する免疫反応を低減することのできる注射量で間充織幹細胞の上清（upper liquid）と接触させる工程を含む、エフェクター細胞により引き起こされる免疫反応を軽減する方法を記載している。
【００１２】
これまで、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を用いてｃＧＶＨＤの治療が成功した症例は報告されていない。したがって、本発明者らはｃＧＶＨＤの治療を試み、亜分画培養法を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞がｃＧＶＨＤを効果的に治療することを臨床的に検証することによって、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】韓国特許第１０−０８０２０１１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５４４，５０６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，９３６，２８１号明細書
【特許文献４】米国特許第７，１７３，０１６号明細書
【特許文献５】米国特許第６，３２８，９６０号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３６８，６３６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の一目的は、急性又は慢性の移植片対宿主病に対する治療剤を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、急性又は慢性の移植片対宿主病に対する治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を含む、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤を提供する。
【００１７】
また、本発明は、急性又は慢性の移植片対宿主病の患者において、有効な用量の間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を注射する工程を含む、移植片対宿主病を治療する方法も含む。
【００１８】
一態様では、本発明は、移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、ドナー骨髄由来のＴ細胞の活性を阻害する方法であって、それを必要とする被験者に、治療的に有効な量の同種クローン骨髄幹細胞集団を投与することを含む、方法に関する。幹細胞の投与量は、１回の投与につき１×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重であり得る。幹細胞は亜分画培養法を用いて単離され得る。幹細胞はＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しないものであり得る。幹細胞はＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しないものであり得る。同種クローン骨髄幹細胞は、インターロイキン−１０を少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で分泌し得る。
【００１９】
別の態様では、本発明は、移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、移植片対宿主病の症状を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療的に有効な量の同種クローン骨髄幹細胞集団を投与することを含む、方法に関する。移植片対宿主病の症状は、胃腸管症状、皮膚硬化、経口摂取の制限、目の乾燥、肝症状、息切れ、又は腕若しくは脚の緊張であり得る。胃腸症状は１日糞便量の増加又は大腸炎症であり得る。肝症状は血清中アルカリホスファターゼ値の上昇であり得る。
【００２０】
別の態様では、本発明は、移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、ドナー骨髄由来のＴ細胞の活性を阻害する方法であって、（Ａ）骨髄細胞の生体サンプルを操作することであって、（ｉ）細胞サンプルを容器に定着させること、（ｉｉ）上清を容器から別の容器に移すこと、及び（ｉｉｉ）サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を上清から単離し、同種クローン骨髄幹細胞集団を得る、単離することを含む、操作すること、並びに（Ｂ）それを必要とする被験者に、（Ａ）で得られる同種クローン骨髄幹細胞集団を治療的に有効な量投与することを含む、方法に関する。上記方法において、容器をコーティングにより処理してもよい。コーティングはコラーゲン、ポリリジン、フィブリノーゲン、又はゼラチンであり得る。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、移植片対宿主病の症状を治療する方法であって、（Ａ）骨髄細胞の生体サンプルを操作することであって、（ｉ）細胞サンプルを容器に定着させること、（ｉｉ）上清を容器から別の容器に移すこと、及び（ｉｉｉ）サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を上清から単離し、同種クローン骨髄幹細胞集団を得る、単離することを含む、操作すること、並びに（Ｂ）それを必要とする被験者に、（Ａ）で得られる同種クローン骨髄幹細胞集団を治療的に有効な量投与することを含む、方法に関する。
【００２２】
幹細胞の投与量は、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０８細胞／ｋｇであり得る。細胞はＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しないものであり得る。細胞はＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しないものであり得る。細胞集団は、インターロイキン−１０を少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で分泌し得る。
【００２３】
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の本発明の説明、本明細書に添付した参照図面、及び本明細書に添付した特許請求の範囲より、さらに十分に理解される。
【００２４】
本発明は、本明細書中の以下に示す詳細な説明、及び実例としてのみ示し、したがって、本発明を限定するものではない添付図面により、さらに十分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明において用いられる亜分画培養法によって、クローン骨髄幹細胞又は間充織間質細胞を単離する手順の流れ図を示す。
【図２】亜分画培養法により単離され、ＧＶＨＤ患者の治療に使用されるクローン骨髄幹細胞上の細胞表面エピトープのＦＡＣＳ表現型検査結果を示す図である。
【図３】Ａ：ＧＶＨＤ患者の治療に使用されるクローン骨髄幹細胞（ｃＭＳＣ−１５）から分泌されるＴＧＦ−β、及び従来の密度勾配遠心分離法により単離される対照間充織幹細胞の量のグラフを示す。 Ｂ：ＧＶＨＤ患者の治療に使用されるクローン骨髄幹細胞（ｃＭＳＣ−１５）から分泌されるＩＬ−１０、及び従来の密度勾配遠心分離法により単離される対照間充織幹細胞の量のグラフを示す。
【図４】ＧＶＨＤ患者における、クローン骨髄幹細胞の投与後の１日糞便量及びアルカリホスファターゼ活性の変化のグラフを示す。
【図５】Ａ：クローン骨髄幹細胞を注射されたＧＶＨＤ患者の、治療前の大腸内視鏡検査写真を示す。 Ｂ：クローン骨髄幹細胞を注射されたＧＶＨＤ患者の、治療の１０日後に撮影した大腸内視鏡検査写真を示す。 Ｃ：クローン骨髄幹細胞を注射されたＧＶＨＤ患者の、治療の１ヶ月後に撮影した大腸内視鏡検査写真を示す。 Ｄ：クローン骨髄幹細胞を注射されたＧＶＨＤ患者の、治療の３ヶ月後に撮影した大腸内視鏡検査写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本願において、「１つの（"a" and "an"）」は、物の単数及び複数の両方に言及するために用いる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「身体サンプル」は、単一種の細胞を単離することが望まれる哺乳類から得られる任意のサンプルを指す。かかる身体サンプルとしては、骨髄サンプル、末梢血、臍帯血、脂肪組織サンプル、及びサイトカインで活性化された末梢血が挙げられる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「クローン骨髄幹細胞」は、単一幹細胞に由来する細胞を指す。この表現は、亜分画培養法により得られる「多分化性幹細胞」と交換可能に用いられる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、細胞の「同種」集団とは通常、同一の種類の細胞が集団内に存在することを示す。実質的に同種とは、約８０％の同種性、又は約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、若しくは９９．９％の同種性を意味し得る。特に、細胞の同種性は単一の細胞起源からの細胞の増殖によるものである。現在利用可能なＭＳＣ特異的抗原はなく、したがって利用可能なＭＳＣ特異的抗体もない。理論上は、１００％同種のＭＳＣ集団を得るための唯一の方法は、後にその分化能及び増殖能を特性化することでＭＳＣと確認される単一細胞を増殖させることである。「幹細胞の同種集団」は、後にかかる特性研究により幹細胞と確認される単一細胞に由来する幹細胞を指す。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「低密度細胞」は、サンプル中の他のものよりも密度の低く、単離の対象となる細胞を指す。低密度細胞としては、多分化性幹細胞、前駆細胞、及び他の骨髄間質細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、細胞の起源及び治療を考察する目的での「哺乳類」は、ヒト、家畜（domestic and farm animals）、及び動物園、スポーツ、又は愛玩用の動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ等を含む哺乳類に分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「ＭＬＳＣ」は、多分化性幹細胞を指す。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ＭＬＳＣ／ＰＣ」は、多分化性幹細胞又は前駆細胞を指す。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「ＭＳＣ」は、骨髄間質細胞、又は間充織幹細胞、又は骨髄幹細胞を指し、これらの用語は交換可能に用いられる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「細胞サンプル」は、骨髄サンプル、末梢血、臍帯血、脂肪組織サンプル、及びサイトカインで活性化された末梢血を含む、異なる種類の細胞の混合物を含有する任意のサンプルを指す。
【００３６】
亜分画培養法
移植片対宿主病の治療に使用される細胞を得るのに好ましい方法は、ＭＳＣ、ＭＬＳＣ、又はＭＬＳＣ／ＰＣを単離する任意の特定の方法にとらわれるものではなく、ヒト骨髄等の身体サンプル又は起源から同種性の高いクローン骨髄幹細胞集団又は多分化性幹細胞（ＭＬＳＣ）を単離するために使用される方法である、「亜分画培養法」によるものである。その手順は、米国特許出願公開第２００６／０２８６６６９号明細書（米国特許出願第１１／４７１，６８４号明細書、２００６年６月１９日出願）「多分化性幹細胞の単離（Isolation of Multi-Lineage Stem Cells）」（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００３７】
骨髄ＭＳＣは、造血細胞を混入させることなく単離することが困難であることが知られている。臨床応用のためには、免疫原性の問題を回避し、臨床効果を正確に評価する目的で、ＭＳＣの同種集団を得ることが重要である。従来、ＭＳＣの同種集団の単離は、ＭＳＣに特異的な抗体カラムによる精製により行なわれていた。しかし、このように完全にＭＳＣに特異的な抗体が未だに利用可能でないため、この方法は好適ではない。
【００３８】
重いか、又は密度の高い細胞のほとんどは、最初に２回行われる２時間のインキュベート工程において除去され得るため、亜分画培養法の実施において、赤血球又は白血球等の任意の種類の細胞をサンプルから予め取り出すために、いかなる種類の遠心分離も行う必要がない。このように、本発明のシステムの利点の１つは、細胞培養液中にＰｉｃｏｌｌ、Ｆｉｃｏｌｌ、又はＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ等の混入をもたらすおそれのある、従来用いられる密度勾配遠心分離工程及び単核細胞分画工程を避けることができることである。したがって、本発明の亜分画培養法は、身体サンプル、好ましくは骨髄サンプルから同種性の高いＭＬＳＣを単離するための、単純且つ効果的で、経済的なプロトコルである。
【００３９】
代替的には、従来の密度勾配遠心分離によるＭＳＣの単離法により単離／分画された単核細胞も、単一細胞に由来するコロニーを得て、その後幹細胞又は前駆細胞の同種集団を単離するために、Ｄ１皿に供することができる（図１）。したがって、亜分画培養法は、従来の密度勾配遠心分離法により分画された単核細胞について用いることができる。
【００４０】
本願は、生体サンプル、特に骨髄サンプル中に存在する多分化性幹細胞又は前駆細胞には、例示するように幾つか異なる種類があることを示す、単離される単一細胞に由来する幹細胞系の細胞表面タンパク質の発現における特徴の多様性について記載する。単離したＭＬＳＣは通常、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３１、ＣＤ１６６、ＨＬＡクラスＩに対しては陰性又はわずかに陽性であり、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１０５に対しては非常に陽性であった。しかし、Ｄ４皿及びＤ５皿より得られる幾つかの細胞系は、顕著なレベルの表面タンパク質を示したが、このことは、骨髄中には幾つか異なる種類の多分化性幹細胞又は前駆細胞が存在し得ることを示している（図１）。これらの異なる表面マーカーを有するＭＳＣは、異なる細胞分化能を示し得る。したがって、亜分画培養法による単一細胞に由来する同種幹細胞の単離により、これらの細胞群が骨髄又は他の特異的に単離した身体サンプル中に存在し、且つ培養条件により細胞増殖中にこれらの能力が変化しない限りは、組織特異的な幹細胞又は関係する前駆細胞の単離が可能になる。ＭＳＣによる治療及び細胞移植処理の安全性及び有効性は、本願に示すように、特定の性質を有する細胞の亜集団を特徴付けることができることにより向上する。
【００４１】
密度勾配遠心分離工程及び単核細胞分画工程を省くことにより、且つ幹細胞の分離に抗体又は特定の酵素を用いることを必要とせずに、亜分画培養法により、単純且つ効率的で経済的な手順で、より同種なＭＳＣ又はＭＬＳＣの集団ができ、治療状況に対してより安全な適用がなされる。
【００４２】
本発明の実施においては、好ましくは骨髄幹細胞は上記の亜分画培養法を用いて得ることができるが、これに限定されない。さらに、得られるＭＳＣがＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原のいずれか又は全てを発現するのが好ましい。ＭＳＣにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原のいずれか又は全てが発現されないのも好ましい。より好ましくは、ＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原のいずれか又は全てがＭＳＣにおいて発現され、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、及びＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原のいずれか又は全てがＭＳＣにおいて発現されない。
【００４３】
好ましくは、本発明に使用されるＭＳＣは、インターロイキン（Interlukin）−１０（ＩＬ−１０）を発現する。好ましくは、ＩＬ−１０は培養後、治療の時点で５ｎｇ／ｍｌ超又は１０ｎｇ／ｍｌ超発現される。
【００４４】
一態様において、本発明は、１）個体から骨髄を得る工程、２）骨髄を培養する工程、３）２）の上清のみを新たな容器に移すと共に、培養する工程、及び４）３）の上清のみを分離すると共に、任意でコーティング処理した培養容器において繰り返して培養する工程を含む、亜分画培養法により得られる細胞の使用に関する。
【００４５】
上記の亜分画培養法に関して、上記工程４）の繰り返しの培養は、任意の特定の時間量に限定されるものではないが、３７℃で約１時間〜４時間、次に約２回〜３回繰り返して３７℃で約１２時間〜３６時間、次に３７℃で約２４時間〜７２時間、毎回上清を新たな培養容器に移しながら行われ得る。
【００４６】
別の態様では、より接着性の高い幹細胞を得るために、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、又はポリリジンでコーティングされた培養皿が用いられた。本出願人は、電荷を有する任意の培養表面は、正電荷及び負電荷のいずれであっても、コーティングしていない皿の表面に比べ、幹細胞の表面への接着を促進することを発見した。コラーゲン又はポリリジンでコーティングした培養皿には、コーティングしていない皿よりも、それぞれ約２倍〜３倍の細胞が付着した（データは示さない）。
【００４７】
このように、一実施形態では、培養皿の底面は、幹細胞又は前駆細胞が皿の底面により良好に接着するのを促進するために、ポリリジン、ポリアルギニン等の正電荷を有するアミノ酸、若しくはポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩等の負電荷を有するアミノ酸、又はこれらの組み合わせでコーティングすることができる。
【００４８】
培養容器をコーティング処理するのが好ましく、細胞の容器への接着を向上することのできる（than can）任意の物質が使用され得るが、コラーゲン、ポリリジン、フィブリノーゲン、又はゼラチンを使用するのが特に好ましい。より好ましくは、コラーゲン又はポリリジンが使用され得る。さらにより好ましくは、コラーゲンが使用され得る。また、細胞をコラーゲンで処理した培養容器中で約３回〜６回繰り返して培養するのが望ましく、細胞を約４回〜５回繰り返して培養するのがさらにより望ましい。
【００４９】
治療剤の医薬品は、当業界における従来の知識を用いて製造することができる。例えば、治療剤は水又は薬学的に許容可能な滅菌溶液、並びに注射用懸濁液中の非経口剤型で使用することができる。例えば、薬学的に許容可能な担体又は媒体、具体的には滅菌水又は生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、ビヒクル、保存剤、結合剤等と組み合わせて、必要に応じて薬学的応用において一般に認められている単位量形態（unit capacity format）でブレンドした医薬品を挙げることができる。また、注射用の滅菌合成物を、既知の薬学的応用に基づき、注射用蒸留水等の支持液体を用いて処方することができる。
【００５０】
併用することのできる注射用の水性溶液の例としては、生理食塩水、グルコース、又はＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール（D-manitol）、塩化物、若しくはナトリウム等の支持薬物を含む等張液を挙げることができる。適切な液化支持剤の例としては、アルコール、具体的にはエタノール、又はプロピレングリコール等の多価アルコール、又はポリソルベート８０（商標）若しくはＨＣＯ−５０等の非電離界面活性剤を挙げることができる。
【００５１】
油剤としては、ゴマ油又はダイズ油を挙げることができ、安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと併用することができる。また、油剤はリン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝剤、又はノボカイン等の鎮痛溶液、又はベンジルアルコール、フェノール等の安定化剤、又は抗酸化剤と組み合わせることができる。調製した注射液体は一般に認められた適切なアンプル中に入れることができる。
【００５２】
患者の体内への投与は非経口的であるのが望ましく、より具体的には、静脈に１回又は３回投与するのが基本であるが、それ以上の注射も許容可能である。さらに、投与期間は短期間であっても、又は長期間であってもよい。より具体的には、注射式又は経皮式の投与を挙げることができる。注射式の例としては、静脈注射、動脈注射、選択的動脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、脳室内注射（intracerebral injection）、脳内注射（cerebral injection）、又は骨髄注射により投与することができるが、静脈注射が望ましい。静脈注射の場合、一般的な輸血を用いた移植方法が可能であるため、患者の外科手術は必要なく、さらに局所麻酔が必要ないことから、患者及び医師の負担は軽い。救急医療の今後の発展を考慮すると、緊急輸送中、又は現場（critical site）での投与を考えることができる。
【００５３】
また、本発明は、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を治療に有効な用量で、上記の移植片対宿主病を患う患者に投与する工程を含む、移植片対宿主病の患者を治療する方法を提供する。
【００５４】
哺乳類、特にヒトにおけるＧＶＨＤ又はＧＶＨＤの症状の治療のためのクローン骨髄細胞の単回注射当たりの有効量は、１×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０７細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０７細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜３×１０６細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜３×１０６細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜２×１０６細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜２×１０６細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０６細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０６細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０５細胞／ｋｇ体重、又は２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０５細胞／ｋｇ体重であり得る。
【００５５】
任意の特定の投与方法に限定されるものではないが、非経口投与方法が好ましい。全身又は局所（partial body）投与が可能であるが、全身投与が好ましく、静脈注射が最も好ましい。
【００５６】
移植片対宿主病の治療
本発明者らは、治療に反応を示さなかった急性又は慢性の移植片対宿主病患者の状態を、米国特許出願公開第２００６／０２８６６６９号明細書（２００６年６月１９日出願）「多分化性幹細胞の単離（Isolation of Multi-Lineage Stem Cells）」（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）に記載される方法（図１）を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を投与することで改善することができた。
【００５７】
ＧＶＨＤの兆候又は症状に関しては、皮膚硬化、経口摂取の制限、目の乾燥、嚥下障害、食欲不振、嘔気、嘔吐、腹痛、若しくは下痢等の胃腸（ＧＩ）管症状、ビリルビン値の上昇、アルカリホスファターゼ値の上昇、及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（aminotranferease）（ＡＬＴ）／アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）比（ＡＳＴ／ＡＬＴ）の上昇により現れる肝症状、息切れ、及び／又は腕若しくは脚の緊張が挙げられる。
【００５８】
被験者は、移植片対宿主病に冒された組織に応じて複数の症状を示し得る。４つ〜５つの症状を有する患者もいれば、１つ〜２つの症状を有する患者もいる。したがって、本発明は、被験者の任意の組織に現れる、ＧＶＨＤに関連する症状のいずれか又は全てを治療することに関する。兆候又は症状を治療することにより、ＧＶＨＤ疾患自体も治療されると考えられる。
【００５９】
以下の記載は、亜分画培養法の適用、及びそれにより得られる同種クローン骨髄幹細胞を、ＧＶＨＤの症状を患っていることが確認された個体に投与するために使用することの詳細を提供する。理論に束縛されるものではないが、投与した幹細胞が被験者においてＩＬ−１０を分泌し、これがドナーのＴ細胞の悪影響を中和又は不活性化することにより、ＧＶＨＤ及びＧＶＨＤの症状が治療されると考えられる。
【００６０】
間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を、慢性移植片対宿主病を患う上記患者の母親から亜分画培養法を用いて分離し、モノクローナル起源の細胞系として樹立した後、これをｃＭＳＣ−１５と命名した。細胞表面抗原分析を柔組織細胞分析により行なって、上記細胞系が実際に間充織幹細胞又は骨髄幹細胞であるか否かを求めた（図２）。この結果、ＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原が発現し、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、及びＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原が発現しないことが示されたため、これが間充織幹細胞又は骨髄幹細胞であり、造血幹細胞ではないことが確認された。ＣＤ１３３及びＳＴＲＯ−１発現は弱陽性であった。したがって、上記細胞系の特性をより具体的に検証するために、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０の発現の程度をＥＬＩＳＡ法を用いて検証した（図３）。ＴＧＦ−β発現の場合、対照である従来の密度勾配遠心分離法により得られる間充織幹細胞との大きな違いはなかった。しかし、ＩＬ−１０は、対照と比較して少なくとも５倍の発現の増加を示した。
【００６１】
したがって、本発明者らは、上記の樹立した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を治療に十分な量となるまで培養した後、慢性移植片対宿主病の発症により生命が危険な状況にある患者の治療に適用した。具体的には、上記患者は急性骨髄性白血病であると診断され、導入療法により寛解に到達した後、同種骨髄移植を受けた１８歳の女性であった。６ヶ月間の免疫抑制剤の投与を停止して１ヶ月後、慢性移植片対宿主病が発症し、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、及びステロイドを用いて治療したが、継続的な血便、ビリルビン値の上昇、並びに皮膚、口、及び眼の乾燥により患者の状態は悪化し、治療の副作用のためサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が活性化し、ＢＫウイルスの感染により尿及び血液中でもＢＫウイルスが見られたため、Ｃｉｄｅｆｏｒｖｉｒを用いた治療を開始した。
【００６２】
本発明者らは、上記の培養した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を、韓国食品医薬品安全庁の応急臨床許可を受けた後、静脈注射により１回投与した。投与中又は投与後に有害／陰性反応は観察されず、患者の症状は１回目の投与後から徐々に改善され、２回目の投与は３週間後に行なった。その後、患者の症状は改善され、２回目の投与の３４日後に、患者はステロイドの服用を止め、免疫抑制剤のみ服用している状態で退院した。
【００６３】
この治療の病的影響を検証するために、本発明者らは、移植片対宿主病の主要な指標である糞便量及び血中アルカリホスファターゼの活性を測定した（図４）。糞便量は大幅に減少し、血清学的指標である血中アルカリホスファターゼの活性も正常値（６０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌ）まで低下した。また、大腸内視鏡検査分析を行ない、症状が改善されているかを検証した（図５）。図５に示すように、本発明における間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の投与後の時間の経過に伴い、潰瘍は大腸内視鏡検査データよりもさらに改善された。
【００６４】
上記のように、本発明者らは、本発明の亜分画培養法を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞が、慢性移植片対宿主病の治療に有効であることを臨床試験により検証した。
【００６５】
本発明の範囲は、本明細書中に記載される特定の実施形態に限定されない。実際に、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の様々な変更形態が、上述の記載及び添付の図面から当業者に明らかである。かかる変更形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。以下の実施例は本発明を例示する目的で提示され、限定を目的とするものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１−亜分画培養法を用いた間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の分離
骨髄提供者（治療標的の慢性移植片対宿主病患者の母親）の臀部に局所麻酔を適用した後、注射針を寛骨に挿入して骨髄を抽出した。２０％ＦＢＳ、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び上記の骨髄提供者から抽出した骨髄２ｍｌを含む１５ｍｌのＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、GIBCO-BRL, Life-technologies、MD、USA）を１００ｍｍの培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養器内で２時間培養した。培養の後、底部に付着した細胞が落ちないように培養容器を少し傾けて、培養容器内の培養液の上層を最大の量で新たな容器に移した。
【００６７】
同一の手順をもう１度繰り返した後、採取した培養液を培養容器（Becton Dickinson）に移し、３７℃で２時間培養した。培養液を再度新たな容器に移し、２４時間後に別の新たな容器に移し、２４時間後に再度新たな容器に移した。最後に、４８時間後、新たな容器に移した後に残った細胞は培養容器の底部に付着し、増殖したことを目視で検証した。幾度かの層分離を経て、この工程に達することのできる細胞は、他の細胞より小さい細胞であると推測することができる。約３時間〜５時間の経過後には、細胞は単一クローンを形成する。この単一クローンをトリプシンで処理し、分離して、１ウェル当たり１０２〜６×１０２の細胞数で６ウェル培養容器に移した。３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養器で４日〜５日間培養した後、細胞が８０％増殖した時点で細胞を０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ（GIBCO-BRL）で処理し、集めた後、７５ｃｍ２の培養容器に移し、続いて培養した。モノクローナル起源を有する細胞系を上記のように得て、ｃＭＳＣ−１５と命名した。
【００６８】
上記細胞の形状を顕微鏡下で観察した結果、初期段階の細胞は線維芽細胞と同様の形状を有し、連続培養の第５段階まで形状の大きな変化は見られないことが明らかとなった。細胞が倍になるのにかかる時間は、２４時間〜３６時間であることが観察され、線維芽細胞と大差なかった。
【００６９】
実施例２−分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の検証
実施例２．１−フローサイトメトリーを用いた間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の特性の分析
上記実施例１の方法を用いて骨髄から分離したｃＭＳＣ−１５細胞が間充織幹細胞又は骨髄幹細胞であるかを検証するために、フローサイトメトリー（BD Biosciences）を使用して、細胞表面抗原が幹細胞特性を有するかを調べた。
【００７０】
７５ｃｍ２の培養容器内で６日〜７日間連続培養した幹細胞を、０．２５％トリプシンで処理し、細胞を集めた。細胞を１×ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡで２回洗浄し、トリプシン及び培養液を除去した。細胞を遠心分離を用いて回収し、細胞数を測定した後、１×１０６個の細胞を１．５ｍｌ容試験管に集め、ヤギ血清（Vector）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ブロッキングが完了した後、細胞を１×ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡで２回洗浄し、フィコエリスリン（ＰＥ）標識（attached）抗ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１１９、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡクラス１及びＳＴＲＯ−１抗体（Serotec Ltd、Kidington、OX、UK）の各々で処理し、４℃で４０分間反応させた。細胞を１×ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡで２回洗浄した後、０．５ｍｌの１×ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡ中に懸濁し、フローサイトメトリーに入れ、分析した。
【００７１】
間充織幹細胞に特異的なインテグリン抗原であるＣＤ２９、並びに同様に間充織幹細胞に特異的なマトリックス受容体抗原であるＣＤ４４及びＣＤ１０５は、陽性反応を示した。ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１６６細胞表面抗原、及びＨＬＡクラス１細胞表面抗原は発現したが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、並びにＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しなかった。これとは別に、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、及びＳＴＲＯ−１の場合、発現レベルは弱陽性であった（図２）。かかる細胞表面抗原の発現は、６連続の培養を受けた細胞において維持されていた。このことは、分離細胞は連続培養しても、間充織幹細胞に特異的な抗原を継続して発現することを示す。
【００７２】
実施例２．２−間充織幹細胞の免疫抑制に関連するサイトカイン分泌状態の分析
本発明者らは、本発明における亜分画培養法を用いて単離した間充織幹細胞の特性についてさらに調べるために、免疫抑制関連サイトカインの発現レベルを分析した。
【００７３】
具体的には、同一の骨髄提供者から採取し、現行の密度勾配遠心分離法を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞（対照群）、及び実施例１に記載した上記の方法を用いて分離した本発明におけるｃＭＳＣ−１５を培養した後、培養液において分泌されるＴＧＦ−β及びＩＬ−１０の発現量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて分析した。正確な分析のために、上記２つの細胞系は無血清バッチを用いて培養し、上記ＥＬＩＳＡはともにR&D systems（USA）製のキットを使用し、メーカーの使用説明書に従って行なった。
【００７４】
分析の結果、ＴＧＦ−βでは対照群との違いはほとんど示されなかったが、ＩＬ−１０の場合、亜分画培養法を用いて得られたｃＭＳＣ−１５細胞は、対照群と比較して５倍を超える発現の増加を示した（図３）。このことは、移植片対宿主病の治療効果と、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞のＩＬ−１０発現レベルとの間に相関があることを示す。
【００７５】
実施例３−単離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の臨床適用
実施例３．１−間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の投与
患者は急性骨髄性白血病であると診断され、導入療法により寛解に到達した後、同種骨髄移植を受けた１８歳の女性であった。６ヶ月間の免疫抑制剤の投与を停止して１ヶ月後、慢性移植片対宿主病が発症し、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、及びステロイドを用いて治療したが、継続的な血便、ビリルビン値の上昇、並びに皮膚、口、及び眼の乾燥により患者の状態は悪化し、治療の副作用のためＣＭＶが活性化し、ＢＫウイルスの感染により尿及び血液中でもＢＫウイルスが見られたため、Ｃｉｄｅｆｏｒｖｉｒを用いた治療を開始した。韓国食品医薬品安全庁の応急臨床許可を受けた後、実施例１に記載のように単離した患者の母親の間充織幹細胞又は骨髄幹細胞をＧＭＰ施設において培養し、静脈注射を用いて患者に投与した。投与中又は投与後に有害／陰性反応は観察されず、患者の症状は１回目の投与後から徐々に改善され、２回目の投与は１回目と同一の量で３週間後に行なった。その後、患者の症状は大幅に改善され、２回目の投与の３４日後に、患者はステロイドの服用を止め、免疫抑制剤としてＭＭＦのみを１．５ｇ／日で服用している状態で退院した。
【００７６】
実施例３．２−治療後の疾患の指標の変化
本発明における亜分画培養法を用いて単離された間充織幹細胞又は骨髄幹細胞が治療に有効であるかを検証するために、本発明者らは、糞便量及び主な指標である血中アルカリホスファターゼの活性を測定した（図４）。血中アルカリホスファターゼの活性化は、市販のキット（Sigma Chemical Company、USA）を用いて行なった。
【００７７】
結果として、慢性移植片対宿主病の主な指標である糞便量は大幅に減少し、血清学的指標である血中アルカリホスファターゼの活性も正常値（６０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌ）まで低下した。また、大腸内視鏡検査分析を行ない、症状が改善されているかを検証した（図５）。結果として、間充織幹細胞の投与から３ヶ月後の大腸内視鏡検査による見解は、潰瘍が非常に改善されているというものであった。上述したように、本発明者らは、本発明における亜分画培養法を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞が慢性移植片対宿主病の治療に有効であることを臨床試験により検証した。
【００７８】
本発明は、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を活性成分として含む、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤に関するものであるが、本発明における治療剤により、治療が非常に困難であった移植片対宿主病、特に骨髄移植外科手術の後、副作用として頻繁に起こる致命的な急性又は慢性の移植片対宿主病を非常に効果的に治療することができる。
【００７９】
本明細書中で引用した参考文献の全ての内容は、参照により本明細書中に援用される。
【００８０】
当業者であれば、単なる日常実験により、本明細書中に具体的に記載の具体的実施形態の多くの均等物を理解するであろうし、又は確認することができる。かかる均等物も、特許請求の範囲内に含まれるように意図されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤に関する。本発明はまた、間充織幹細胞を活性成分として含有する、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／９４０，３４９号明細書（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権の利益を主張するものである。
【０００３】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）とは、患者身体が同種移植において注射されるドナーの末梢血又は骨髄のＴリンパ球に対して免疫反応を有する疾患を称する。すなわち、移植片対宿主病は、肝機能障害、皮膚病変、黄疸、下痢、発熱、汎血球減少症等、及び深刻な場合には患者の死亡を招く免疫反応の原因となる、輸注した生リンパ球により誘発される疾患である。
【０００４】
移植片対宿主病は、急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）と慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）とに大別することができる。ｃＧＶＨＤは、血液及び骨髄前駆細胞の移植後１００日間生存する患者の２０％〜７０％に起こる主要且つ一般的な副作用であり、移植後の死亡の主な原因である。ｃＧＶＨＤとａＧＶＨＤとは連続した疾患ではなく、ａＧＶＨＤは異なったアプローチを必要とする。また、ｃＧＶＨＤは血液及び骨髄前駆細胞の移植による治療法の発展のために、より大きな問題となっている。
【０００５】
ｃＧＶＨＤは同種移植の場合、通常は移植後４ヶ月〜６ヶ月に起こり、８０日以内又は１年以降の発生は稀である。したがって、同種反応がｃＧＶＨＤを引き起こすための主な要件であり、ｃＧＶＨＤの発病機序は長いインキュベート期間を経過するか、又は標的器官への影響が徐々に現れると見なすことができる。ｃＧＶＨＤでは、胸腺の機能における様々な問題が発見されており、移植前の治療、又は末梢機構からの同種抗原／自己抗原により引き起こされる損傷のために正常な胸腺を除去しない場合、病的移植片Ｔ細胞が反応により増加するが、この種の病的ＣＤ陽性Ｔ細胞は、Ｔｈ２免疫反応により、細胞傷害性攻撃、炎症性線維症サイトカインの分泌、Ｂ細胞活性化、及び自己抗体の形成による標的器官の損傷を含む、自己免疫疾患と同様の免疫不全を引き起こすと考えられる。
【０００６】
ｃＧＶＨＤの臨床症状には紅斑、乾燥、そう痒、色素変化、及び斑点状丘疹等の皮膚における変化、薄毛及び脱毛等の毛髪における変化、並びに歯肉炎、粘膜炎、及び唇萎縮等の口における変化が含まれる。これの他に眼、生殖器官、肝臓、肺、胃腸管、筋膜、骨格系、漿膜等に現れる様々な病変が挙げられる。
【０００７】
ｃＧＶＨＤは概して、骨髄移植後１００日以降に起こるＧＶＨＤと定義されるが、その発症時期よりも病状（manifested conditions）が診断に重要である。症状の発症時期に応じて、ｃＧＶＨＤの発症に移行するまでａＧＶＨＤが治癒しない進行性の発症、ａＧＶＨＤが完全に治癒した後にｃＧＶＨＤが現れる静止性の発症、及び先のａＧＶＨＤの発現なく起こる新たな発症に分類することができる。罹患率及び死亡率は進行性の発症が最も高く、次が静止性の発症であり、新たな発症の場合が最も低い。病状としては、多くの場合、皮膚及び口腔の粘膜層における苔癬性発疹が最初の症状であるが、ａＧＶＨＤと同一部位に現れることもあり、病変は丘疹状（papulous）、浸潤性で、白色鱗屑で覆われている。病理組織学的観点からａＧＶＨＤと比較すると、多くの衛星細胞の壊死が依然として見られるが、リンパ球浸潤は過度の硬化帯域（consolidated band）を示す。これとは別に、胆嚢管が縮小し、胆汁の滞留が見られることもあるが、投薬又はウイルス性肝炎と関連する病変（legions）と混ざっている場合もあり得るため、ｃＧＶＨＤと区別するのが困難な場合もあり得る。
【０００８】
ｃＧＶＨＤの場合、免疫機能が既に低下しているため、治療中の重症感染の恐れがあり、治療による副作用のほとんどない新たな有効な治療が切実に必要とされている。これに関して、間充織幹細胞に多くの器官の細胞に分化する能力があり、Ｔ細胞を抑制することにより移植片対宿主（graft-versus-hot）反応を改善することができると述べる多くの研究が報告されている。
【０００９】
間充織幹細胞は元の中胚葉の始原細胞のように未分化状態で増殖することができ、骨髄、脂肪組織、肝臓、腱、滑膜、及び臍帯等の様々な器官から分離することができるが、それを間充織幹細胞であると正確に規定する単一のマーカーは存在しない。しかし、ＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５が骨髄に対するマーカーとして知られており、ＳＨ−２（ＣＤ１０５）、ＳＨ−３（ＣＤ７３）、ＳＨ−４、及びＴｈ７−１が間葉に対するマーカーとして知られている。間充織幹細胞又は間充織間質細胞（ＭＳＣ）は主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス１を発現し、ＭＨＣクラス１はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）により症状を誘導し得るが、ＭＳＣはＦＡＳ又はＦＡＳ Ｌ（ＣＤ４０）型副刺激分子を示さないため、免疫反応を誘導せず、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による細胞崩壊は起こらない。また、間充織幹細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）時の密度に依存してＴ細胞の増殖を抑制し、Ｂ細胞の増殖及び免疫グロブリンの形成を抑制するが、ＭＨＣ適合性はＭＳＣ免疫抑制に必要ではないことが知られている。また、５０回分裂した場合もＭＳＣの核型又はテロメラーゼの活性に変化はないことが知られている。
【００１０】
しかし、体内に存在するＭＳＣは非常に稀であるので、単離技術の発展が重要である。現在、密度勾配遠心分離、Ｓｃａ−１又はＳＴＲＯ−１に特異的なモノクローナル抗体を用いた方法、及び細胞サイズによる分離方法がＭＳＣの分離方法として知られている。本発明者らは以前、特定の機械装置又は試薬を必要としない有効なＭＳＣ分離方法（韓国特許第１０−０８０２０１１号明細書）を開発したが、該方法は、個体から採取した骨髄を培養し、培養液の上方を新たな容器に繰り返し取ることによりさらに培養することを特徴とする。
【００１１】
ｃＧＶＨＤに対する治療方法に関して、米国特許第６，５４４，５０６号明細書は、臓器移植患者に非同種反応性抗細胞傷害性リンパ球を注射することで、細胞傷害性Ｔリンパ球を除去するという顕著な特徴を有するＧＶＨＤの予防及び治療の方法を提示している。米国特許第６，９３６，２８１号明細書は、間充織幹細胞を用いるＧＶＨＤ治療方法を記載している。米国特許第７，１７３，０１６号明細書は、アデノシンデアミナーゼ阻害剤を注射する工程を含むＧＶＨＤ治療方法を記載している。米国特許第６，３２８，９６０号明細書は、標的臓器移植患者の同種抗原に対するエフェクター細胞の免疫反応を軽減するために、標的臓器移植患者の抗原に対するエフェクター細胞の免疫反応を軽減することのできる量で、間充織幹細胞を注射するという顕著な特徴を有するＧＶＨＤ治療方法を記載している。米国特許第６，３６８，６３６号明細書は、エフェクター細胞を、同種抗原に対する免疫反応を低減することのできる注射量で間充織幹細胞の上清（upper liquid）と接触させる工程を含む、エフェクター細胞により引き起こされる免疫反応を軽減する方法を記載している。
【００１２】
これまで、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を用いてｃＧＶＨＤの治療が成功した症例は報告されていない。したがって、本発明者らはｃＧＶＨＤの治療を試み、亜分画培養法を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞がｃＧＶＨＤを効果的に治療することを臨床的に検証することによって、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】韓国特許第１０−０８０２０１１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５４４，５０６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，９３６，２８１号明細書
【特許文献４】米国特許第７，１７３，０１６号明細書
【特許文献５】米国特許第６，３２８，９６０号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３６８，６３６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の一目的は、急性又は慢性の移植片対宿主病に対する治療剤を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、急性又は慢性の移植片対宿主病に対する治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を含む、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤を提供する。
【００１７】
また、本発明は、急性又は慢性の移植片対宿主病の患者において、有効な用量の間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を注射する工程を含む、移植片対宿主病を治療する方法も含む。
【００１８】
一態様では、本発明は、移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、ドナー骨髄由来のＴ細胞の活性を阻害する方法であって、それを必要とする被験者に、治療的に有効な量の同種クローン骨髄幹細胞集団を投与することを含む、方法に関する。幹細胞の投与量は、１回の投与につき１×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重であり得る。幹細胞は亜分画培養法を用いて単離され得る。幹細胞はＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しないものであり得る。幹細胞はＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しないものであり得る。同種クローン骨髄幹細胞は、インターロイキン−１０を少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で分泌し得る。
【００１９】
別の態様では、本発明は、移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、移植片対宿主病の症状を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療的に有効な量の同種クローン骨髄幹細胞集団を投与することを含む、方法に関する。移植片対宿主病の症状は、胃腸管症状、皮膚硬化、経口摂取の制限、目の乾燥、肝症状、息切れ、又は腕若しくは脚の緊張であり得る。胃腸症状は１日糞便量の増加又は大腸炎症であり得る。肝症状は血清中アルカリホスファターゼ値の上昇であり得る。
【００２０】
別の態様では、本発明は、移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、ドナー骨髄由来のＴ細胞の活性を阻害する方法であって、（Ａ）骨髄細胞の生体サンプルを操作することであって、（ｉ）細胞サンプルを容器に定着させること、（ｉｉ）上清を容器から別の容器に移すこと、及び（ｉｉｉ）サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を上清から単離し、同種クローン骨髄幹細胞集団を得る、単離することを含む、操作すること、並びに（Ｂ）それを必要とする被験者に、（Ａ）で得られる同種クローン骨髄幹細胞集団を治療的に有効な量投与することを含む、方法に関する。上記方法において、容器をコーティングにより処理してもよい。コーティングはコラーゲン、ポリリジン、フィブリノーゲン、又はゼラチンであり得る。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、移植片対宿主病の症状を治療する方法であって、（Ａ）骨髄細胞の生体サンプルを操作することであって、（ｉ）細胞サンプルを容器に定着させること、（ｉｉ）上清を容器から別の容器に移すこと、及び（ｉｉｉ）サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を上清から単離し、同種クローン骨髄幹細胞集団を得る、単離することを含む、操作すること、並びに（Ｂ）それを必要とする被験者に、（Ａ）で得られる同種クローン骨髄幹細胞集団を治療的に有効な量投与することを含む、方法に関する。
【００２２】
幹細胞の投与量は、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０８細胞／ｋｇであり得る。細胞はＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しないものであり得る。細胞はＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しないものであり得る。細胞集団は、インターロイキン−１０を少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で分泌し得る。
【００２３】
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の本発明の説明、本明細書に添付した参照図面、及び本明細書に添付した特許請求の範囲より、さらに十分に理解される。
【００２４】
本発明は、本明細書中の以下に示す詳細な説明、及び実例としてのみ示し、したがって、本発明を限定するものではない添付図面により、さらに十分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明において用いられる亜分画培養法によって、クローン骨髄幹細胞又は間充織間質細胞を単離する手順の流れ図を示す。
【図２】亜分画培養法により単離され、ＧＶＨＤ患者の治療に使用されるクローン骨髄幹細胞上の細胞表面エピトープのＦＡＣＳ表現型検査結果を示す図である。
【図３】Ａ：ＧＶＨＤ患者の治療に使用されるクローン骨髄幹細胞（ｃＭＳＣ−１５）から分泌されるＴＧＦ−β、及び従来の密度勾配遠心分離法により単離される対照間充織幹細胞の量のグラフを示す。 Ｂ：ＧＶＨＤ患者の治療に使用されるクローン骨髄幹細胞（ｃＭＳＣ−１５）から分泌されるＩＬ−１０、及び従来の密度勾配遠心分離法により単離される対照間充織幹細胞の量のグラフを示す。
【図４】ＧＶＨＤ患者における、クローン骨髄幹細胞の投与後の１日糞便量及びアルカリホスファターゼ活性の変化のグラフを示す。
【図５】Ａ：クローン骨髄幹細胞を注射されたＧＶＨＤ患者の、治療前の大腸内視鏡検査写真を示す。 Ｂ：クローン骨髄幹細胞を注射されたＧＶＨＤ患者の、治療の１０日後に撮影した大腸内視鏡検査写真を示す。 Ｃ：クローン骨髄幹細胞を注射されたＧＶＨＤ患者の、治療の１ヶ月後に撮影した大腸内視鏡検査写真を示す。 Ｄ：クローン骨髄幹細胞を注射されたＧＶＨＤ患者の、治療の３ヶ月後に撮影した大腸内視鏡検査写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本願において、「１つの（"a" and "an"）」は、物の単数及び複数の両方に言及するために用いる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「身体サンプル」は、単一種の細胞を単離することが望まれる哺乳類から得られる任意のサンプルを指す。かかる身体サンプルとしては、骨髄サンプル、末梢血、臍帯血、脂肪組織サンプル、及びサイトカインで活性化された末梢血が挙げられる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「クローン骨髄幹細胞」は、単一幹細胞に由来する細胞を指す。この表現は、亜分画培養法により得られる「多分化性幹細胞」と交換可能に用いられる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、細胞の「同種」集団とは通常、同一の種類の細胞が集団内に存在することを示す。実質的に同種とは、約８０％の同種性、又は約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、若しくは９９．９％の同種性を意味し得る。特に、細胞の同種性は単一の細胞起源からの細胞の増殖によるものである。現在利用可能なＭＳＣ特異的抗原はなく、したがって利用可能なＭＳＣ特異的抗体もない。理論上は、１００％同種のＭＳＣ集団を得るための唯一の方法は、後にその分化能及び増殖能を特性化することでＭＳＣと確認される単一細胞を増殖させることである。「幹細胞の同種集団」は、後にかかる特性研究により幹細胞と確認される単一細胞に由来する幹細胞を指す。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「低密度細胞」は、サンプル中の他のものよりも密度の低く、単離の対象となる細胞を指す。低密度細胞としては、多分化性幹細胞、前駆細胞、及び他の骨髄間質細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、細胞の起源及び治療を考察する目的での「哺乳類」は、ヒト、家畜（domestic and farm animals）、及び動物園、スポーツ、又は愛玩用の動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ等を含む哺乳類に分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「ＭＬＳＣ」は、多分化性幹細胞を指す。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ＭＬＳＣ／ＰＣ」は、多分化性幹細胞又は前駆細胞を指す。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「ＭＳＣ」は、骨髄間質細胞、又は間充織幹細胞、又は骨髄幹細胞を指し、これらの用語は交換可能に用いられる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「細胞サンプル」は、骨髄サンプル、末梢血、臍帯血、脂肪組織サンプル、及びサイトカインで活性化された末梢血を含む、異なる種類の細胞の混合物を含有する任意のサンプルを指す。
【００３６】
亜分画培養法
移植片対宿主病の治療に使用される細胞を得るのに好ましい方法は、ＭＳＣ、ＭＬＳＣ、又はＭＬＳＣ／ＰＣを単離する任意の特定の方法にとらわれるものではなく、ヒト骨髄等の身体サンプル又は起源から同種性の高いクローン骨髄幹細胞集団又は多分化性幹細胞（ＭＬＳＣ）を単離するために使用される方法である、「亜分画培養法」によるものである。その手順は、米国特許出願公開第２００６／０２８６６６９号明細書（米国特許出願第１１／４７１，６８４号明細書、２００６年６月１９日出願）「多分化性幹細胞の単離（Isolation of Multi-Lineage Stem Cells）」（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００３７】
骨髄ＭＳＣは、造血細胞を混入させることなく単離することが困難であることが知られている。臨床応用のためには、免疫原性の問題を回避し、臨床効果を正確に評価する目的で、ＭＳＣの同種集団を得ることが重要である。従来、ＭＳＣの同種集団の単離は、ＭＳＣに特異的な抗体カラムによる精製により行なわれていた。しかし、このように完全にＭＳＣに特異的な抗体が未だに利用可能でないため、この方法は好適ではない。
【００３８】
重いか、又は密度の高い細胞のほとんどは、最初に２回行われる２時間のインキュベート工程において除去され得るため、亜分画培養法の実施において、赤血球又は白血球等の任意の種類の細胞をサンプルから予め取り出すために、いかなる種類の遠心分離も行う必要がない。このように、本発明のシステムの利点の１つは、細胞培養液中にＰｉｃｏｌｌ、Ｆｉｃｏｌｌ、又はＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ等の混入をもたらすおそれのある、従来用いられる密度勾配遠心分離工程及び単核細胞分画工程を避けることができることである。したがって、本発明の亜分画培養法は、身体サンプル、好ましくは骨髄サンプルから同種性の高いＭＬＳＣを単離するための、単純且つ効果的で、経済的なプロトコルである。
【００３９】
代替的には、従来の密度勾配遠心分離によるＭＳＣの単離法により単離／分画された単核細胞も、単一細胞に由来するコロニーを得て、その後幹細胞又は前駆細胞の同種集団を単離するために、Ｄ１皿に供することができる（図１）。したがって、亜分画培養法は、従来の密度勾配遠心分離法により分画された単核細胞について用いることができる。
【００４０】
本願は、生体サンプル、特に骨髄サンプル中に存在する多分化性幹細胞又は前駆細胞には、例示するように幾つか異なる種類があることを示す、単離される単一細胞に由来する幹細胞系の細胞表面タンパク質の発現における特徴の多様性について記載する。単離したＭＬＳＣは通常、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３１、ＣＤ１６６、ＨＬＡクラスＩに対しては陰性又はわずかに陽性であり、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１０５に対しては非常に陽性であった。しかし、Ｄ４皿及びＤ５皿より得られる幾つかの細胞系は、顕著なレベルの表面タンパク質を示したが、このことは、骨髄中には幾つか異なる種類の多分化性幹細胞又は前駆細胞が存在し得ることを示している（図１）。これらの異なる表面マーカーを有するＭＳＣは、異なる細胞分化能を示し得る。したがって、亜分画培養法による単一細胞に由来する同種幹細胞の単離により、これらの細胞群が骨髄又は他の特異的に単離した身体サンプル中に存在し、且つ培養条件により細胞増殖中にこれらの能力が変化しない限りは、組織特異的な幹細胞又は関係する前駆細胞の単離が可能になる。ＭＳＣによる治療及び細胞移植処理の安全性及び有効性は、本願に示すように、特定の性質を有する細胞の亜集団を特徴付けることができることにより向上する。
【００４１】
密度勾配遠心分離工程及び単核細胞分画工程を省くことにより、且つ幹細胞の分離に抗体又は特定の酵素を用いることを必要とせずに、亜分画培養法により、単純且つ効率的で経済的な手順で、より同種なＭＳＣ又はＭＬＳＣの集団ができ、治療状況に対してより安全な適用がなされる。
【００４２】
本発明の実施においては、好ましくは骨髄幹細胞は上記の亜分画培養法を用いて得ることができるが、これに限定されない。さらに、得られるＭＳＣがＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原のいずれか又は全てを発現するのが好ましい。ＭＳＣにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原のいずれか又は全てが発現されないのも好ましい。より好ましくは、ＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原のいずれか又は全てがＭＳＣにおいて発現され、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、及びＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原のいずれか又は全てがＭＳＣにおいて発現されない。
【００４３】
好ましくは、本発明に使用されるＭＳＣは、インターロイキン（Interlukin）−１０（ＩＬ−１０）を発現する。好ましくは、ＩＬ−１０は培養後、治療の時点で５ｎｇ／ｍｌ超又は１０ｎｇ／ｍｌ超発現される。
【００４４】
一態様において、本発明は、１）個体から骨髄を得る工程、２）骨髄を培養する工程、３）２）の上清のみを新たな容器に移すと共に、培養する工程、及び４）３）の上清のみを分離すると共に、任意でコーティング処理した培養容器において繰り返して培養する工程を含む、亜分画培養法により得られる細胞の使用に関する。
【００４５】
上記の亜分画培養法に関して、上記工程４）の繰り返しの培養は、任意の特定の時間量に限定されるものではないが、３７℃で約１時間〜４時間、次に約２回〜３回繰り返して３７℃で約１２時間〜３６時間、次に３７℃で約２４時間〜７２時間、毎回上清を新たな培養容器に移しながら行われ得る。
【００４６】
別の態様では、より接着性の高い幹細胞を得るために、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、又はポリリジンでコーティングされた培養皿が用いられた。本出願人は、電荷を有する任意の培養表面は、正電荷及び負電荷のいずれであっても、コーティングしていない皿の表面に比べ、幹細胞の表面への接着を促進することを発見した。コラーゲン又はポリリジンでコーティングした培養皿には、コーティングしていない皿よりも、それぞれ約２倍〜３倍の細胞が付着した（データは示さない）。
【００４７】
このように、一実施形態では、培養皿の底面は、幹細胞又は前駆細胞が皿の底面により良好に接着するのを促進するために、ポリリジン、ポリアルギニン等の正電荷を有するアミノ酸、若しくはポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩等の負電荷を有するアミノ酸、又はこれらの組み合わせでコーティングすることができる。
【００４８】
培養容器をコーティング処理するのが好ましく、細胞の容器への接着を向上することのできる（than can）任意の物質が使用され得るが、コラーゲン、ポリリジン、フィブリノーゲン、又はゼラチンを使用するのが特に好ましい。より好ましくは、コラーゲン又はポリリジンが使用され得る。さらにより好ましくは、コラーゲンが使用され得る。また、細胞をコラーゲンで処理した培養容器中で約３回〜６回繰り返して培養するのが望ましく、細胞を約４回〜５回繰り返して培養するのがさらにより望ましい。
【００４９】
治療剤の医薬品は、当業界における従来の知識を用いて製造することができる。例えば、治療剤は水又は薬学的に許容可能な滅菌溶液、並びに注射用懸濁液中の非経口剤型で使用することができる。例えば、薬学的に許容可能な担体又は媒体、具体的には滅菌水又は生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、ビヒクル、保存剤、結合剤等と組み合わせて、必要に応じて薬学的応用において一般に認められている単位量形態（unit capacity format）でブレンドした医薬品を挙げることができる。また、注射用の滅菌合成物を、既知の薬学的応用に基づき、注射用蒸留水等の支持液体を用いて処方することができる。
【００５０】
併用することのできる注射用の水性溶液の例としては、生理食塩水、グルコース、又はＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール（D-manitol）、塩化物、若しくはナトリウム等の支持薬物を含む等張液を挙げることができる。適切な液化支持剤の例としては、アルコール、具体的にはエタノール、又はプロピレングリコール等の多価アルコール、又はポリソルベート８０（商標）若しくはＨＣＯ−５０等の非電離界面活性剤を挙げることができる。
【００５１】
油剤としては、ゴマ油又はダイズ油を挙げることができ、安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと併用することができる。また、油剤はリン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝剤、又はノボカイン等の鎮痛溶液、又はベンジルアルコール、フェノール等の安定化剤、又は抗酸化剤と組み合わせることができる。調製した注射液体は一般に認められた適切なアンプル中に入れることができる。
【００５２】
患者の体内への投与は非経口的であるのが望ましく、より具体的には、静脈に１回又は３回投与するのが基本であるが、それ以上の注射も許容可能である。さらに、投与期間は短期間であっても、又は長期間であってもよい。より具体的には、注射式又は経皮式の投与を挙げることができる。注射式の例としては、静脈注射、動脈注射、選択的動脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、脳室内注射（intracerebral injection）、脳内注射（cerebral injection）、又は骨髄注射により投与することができるが、静脈注射が望ましい。静脈注射の場合、一般的な輸血を用いた移植方法が可能であるため、患者の外科手術は必要なく、さらに局所麻酔が必要ないことから、患者及び医師の負担は軽い。救急医療の今後の発展を考慮すると、緊急輸送中、又は現場（critical site）での投与を考えることができる。
【００５３】
また、本発明は、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を治療に有効な用量で、上記の移植片対宿主病を患う患者に投与する工程を含む、移植片対宿主病の患者を治療する方法を提供する。
【００５４】
哺乳類、特にヒトにおけるＧＶＨＤ又はＧＶＨＤの症状の治療のためのクローン骨髄細胞の単回注射当たりの有効量は、１×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０７細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０７細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜３×１０６細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜３×１０６細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜２×１０６細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜２×１０６細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０６細胞／ｋｇ体重、２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０６細胞／ｋｇ体重、２×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０５細胞／ｋｇ体重、又は２．５×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０５細胞／ｋｇ体重であり得る。
【００５５】
任意の特定の投与方法に限定されるものではないが、非経口投与方法が好ましい。全身又は局所（partial body）投与が可能であるが、全身投与が好ましく、静脈注射が最も好ましい。
【００５６】
移植片対宿主病の治療
本発明者らは、治療に反応を示さなかった急性又は慢性の移植片対宿主病患者の状態を、米国特許出願公開第２００６／０２８６６６９号明細書（２００６年６月１９日出願）「多分化性幹細胞の単離（Isolation of Multi-Lineage Stem Cells）」（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）に記載される方法（図１）を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を投与することで改善することができた。
【００５７】
ＧＶＨＤの兆候又は症状に関しては、皮膚硬化、経口摂取の制限、目の乾燥、嚥下障害、食欲不振、嘔気、嘔吐、腹痛、若しくは下痢等の胃腸（ＧＩ）管症状、ビリルビン値の上昇、アルカリホスファターゼ値の上昇、及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（aminotranferease）（ＡＬＴ）／アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）比（ＡＳＴ／ＡＬＴ）の上昇により現れる肝症状、息切れ、及び／又は腕若しくは脚の緊張が挙げられる。
【００５８】
被験者は、移植片対宿主病に冒された組織に応じて複数の症状を示し得る。４つ〜５つの症状を有する患者もいれば、１つ〜２つの症状を有する患者もいる。したがって、本発明は、被験者の任意の組織に現れる、ＧＶＨＤに関連する症状のいずれか又は全てを治療することに関する。兆候又は症状を治療することにより、ＧＶＨＤ疾患自体も治療されると考えられる。
【００５９】
以下の記載は、亜分画培養法の適用、及びそれにより得られる同種クローン骨髄幹細胞を、ＧＶＨＤの症状を患っていることが確認された個体に投与するために使用することの詳細を提供する。理論に束縛されるものではないが、投与した幹細胞が被験者においてＩＬ−１０を分泌し、これがドナーのＴ細胞の悪影響を中和又は不活性化することにより、ＧＶＨＤ及びＧＶＨＤの症状が治療されると考えられる。
【００６０】
間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を、慢性移植片対宿主病を患う上記患者の母親から亜分画培養法を用いて分離し、モノクローナル起源の細胞系として樹立した後、これをｃＭＳＣ−１５と命名した。細胞表面抗原分析を柔組織細胞分析により行なって、上記細胞系が実際に間充織幹細胞又は骨髄幹細胞であるか否かを求めた（図２）。この結果、ＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原が発現し、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、及びＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原が発現しないことが示されたため、これが間充織幹細胞又は骨髄幹細胞であり、造血幹細胞ではないことが確認された。ＣＤ１３３及びＳＴＲＯ−１発現は弱陽性であった。したがって、上記細胞系の特性をより具体的に検証するために、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０の発現の程度をＥＬＩＳＡ法を用いて検証した（図３）。ＴＧＦ−β発現の場合、対照である従来の密度勾配遠心分離法により得られる間充織幹細胞との大きな違いはなかった。しかし、ＩＬ−１０は、対照と比較して少なくとも５倍の発現の増加を示した。
【００６１】
したがって、本発明者らは、上記の樹立した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を治療に十分な量となるまで培養した後、慢性移植片対宿主病の発症により生命が危険な状況にある患者の治療に適用した。具体的には、上記患者は急性骨髄性白血病であると診断され、導入療法により寛解に到達した後、同種骨髄移植を受けた１８歳の女性であった。６ヶ月間の免疫抑制剤の投与を停止して１ヶ月後、慢性移植片対宿主病が発症し、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、及びステロイドを用いて治療したが、継続的な血便、ビリルビン値の上昇、並びに皮膚、口、及び眼の乾燥により患者の状態は悪化し、治療の副作用のためサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が活性化し、ＢＫウイルスの感染により尿及び血液中でもＢＫウイルスが見られたため、Ｃｉｄｅｆｏｒｖｉｒを用いた治療を開始した。
【００６２】
本発明者らは、上記の培養した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を、韓国食品医薬品安全庁の応急臨床許可を受けた後、静脈注射により１回投与した。投与中又は投与後に有害／陰性反応は観察されず、患者の症状は１回目の投与後から徐々に改善され、２回目の投与は３週間後に行なった。その後、患者の症状は改善され、２回目の投与の３４日後に、患者はステロイドの服用を止め、免疫抑制剤のみ服用している状態で退院した。
【００６３】
この治療の病的影響を検証するために、本発明者らは、移植片対宿主病の主要な指標である糞便量及び血中アルカリホスファターゼの活性を測定した（図４）。糞便量は大幅に減少し、血清学的指標である血中アルカリホスファターゼの活性も正常値（６０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌ）まで低下した。また、大腸内視鏡検査分析を行ない、症状が改善されているかを検証した（図５）。図５に示すように、本発明における間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の投与後の時間の経過に伴い、潰瘍は大腸内視鏡検査データよりもさらに改善された。
【００６４】
上記のように、本発明者らは、本発明の亜分画培養法を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞が、慢性移植片対宿主病の治療に有効であることを臨床試験により検証した。
【００６５】
本発明の範囲は、本明細書中に記載される特定の実施形態に限定されない。実際に、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の様々な変更形態が、上述の記載及び添付の図面から当業者に明らかである。かかる変更形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。以下の実施例は本発明を例示する目的で提示され、限定を目的とするものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１−亜分画培養法を用いた間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の分離
骨髄提供者（治療標的の慢性移植片対宿主病患者の母親）の臀部に局所麻酔を適用した後、注射針を寛骨に挿入して骨髄を抽出した。２０％ＦＢＳ、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び上記の骨髄提供者から抽出した骨髄２ｍｌを含む１５ｍｌのＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、GIBCO-BRL, Life-technologies、MD、USA）を１００ｍｍの培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養器内で２時間培養した。培養の後、底部に付着した細胞が落ちないように培養容器を少し傾けて、培養容器内の培養液の上層を最大の量で新たな容器に移した。
【００６７】
同一の手順をもう１度繰り返した後、採取した培養液を培養容器（Becton Dickinson）に移し、３７℃で２時間培養した。培養液を再度新たな容器に移し、２４時間後に別の新たな容器に移し、２４時間後に再度新たな容器に移した。最後に、４８時間後、新たな容器に移した後に残った細胞は培養容器の底部に付着し、増殖したことを目視で検証した。幾度かの層分離を経て、この工程に達することのできる細胞は、他の細胞より小さい細胞であると推測することができる。約３時間〜５時間の経過後には、細胞は単一クローンを形成する。この単一クローンをトリプシンで処理し、分離して、１ウェル当たり１０２〜６×１０２の細胞数で６ウェル培養容器に移した。３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養器で４日〜５日間培養した後、細胞が８０％増殖した時点で細胞を０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ（GIBCO-BRL）で処理し、集めた後、７５ｃｍ２の培養容器に移し、続いて培養した。モノクローナル起源を有する細胞系を上記のように得て、ｃＭＳＣ−１５と命名した。
【００６８】
上記細胞の形状を顕微鏡下で観察した結果、初期段階の細胞は線維芽細胞と同様の形状を有し、連続培養の第５段階まで形状の大きな変化は見られないことが明らかとなった。細胞が倍になるのにかかる時間は、２４時間〜３６時間であることが観察され、線維芽細胞と大差なかった。
【００６９】
実施例２−分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の検証
実施例２．１−フローサイトメトリーを用いた間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の特性の分析
上記実施例１の方法を用いて骨髄から分離したｃＭＳＣ−１５細胞が間充織幹細胞又は骨髄幹細胞であるかを検証するために、フローサイトメトリー（BD Biosciences）を使用して、細胞表面抗原が幹細胞特性を有するかを調べた。
【００７０】
７５ｃｍ２の培養容器内で６日〜７日間連続培養した幹細胞を、０．２５％トリプシンで処理し、細胞を集めた。細胞を１×ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡで２回洗浄し、トリプシン及び培養液を除去した。細胞を遠心分離を用いて回収し、細胞数を測定した後、１×１０６個の細胞を１．５ｍｌ容試験管に集め、ヤギ血清（Vector）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ブロッキングが完了した後、細胞を１×ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡで２回洗浄し、フィコエリスリン（ＰＥ）標識（attached）抗ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１１９、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡクラス１及びＳＴＲＯ−１抗体（Serotec Ltd、Kidington、OX、UK）の各々で処理し、４℃で４０分間反応させた。細胞を１×ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡで２回洗浄した後、０．５ｍｌの１×ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡ中に懸濁し、フローサイトメトリーに入れ、分析した。
【００７１】
間充織幹細胞に特異的なインテグリン抗原であるＣＤ２９、並びに同様に間充織幹細胞に特異的なマトリックス受容体抗原であるＣＤ４４及びＣＤ１０５は、陽性反応を示した。ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１６６細胞表面抗原、及びＨＬＡクラス１細胞表面抗原は発現したが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、並びにＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しなかった。これとは別に、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、及びＳＴＲＯ−１の場合、発現レベルは弱陽性であった（図２）。かかる細胞表面抗原の発現は、６連続の培養を受けた細胞において維持されていた。このことは、分離細胞は連続培養しても、間充織幹細胞に特異的な抗原を継続して発現することを示す。
【００７２】
実施例２．２−間充織幹細胞の免疫抑制に関連するサイトカイン分泌状態の分析
本発明者らは、本発明における亜分画培養法を用いて単離した間充織幹細胞の特性についてさらに調べるために、免疫抑制関連サイトカインの発現レベルを分析した。
【００７３】
具体的には、同一の骨髄提供者から採取し、現行の密度勾配遠心分離法を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞（対照群）、及び実施例１に記載した上記の方法を用いて分離した本発明におけるｃＭＳＣ−１５を培養した後、培養液において分泌されるＴＧＦ−β及びＩＬ−１０の発現量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて分析した。正確な分析のために、上記２つの細胞系は無血清バッチを用いて培養し、上記ＥＬＩＳＡはともにR&D systems（USA）製のキットを使用し、メーカーの使用説明書に従って行なった。
【００７４】
分析の結果、ＴＧＦ−βでは対照群との違いはほとんど示されなかったが、ＩＬ−１０の場合、亜分画培養法を用いて得られたｃＭＳＣ−１５細胞は、対照群と比較して５倍を超える発現の増加を示した（図３）。このことは、移植片対宿主病の治療効果と、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞のＩＬ−１０発現レベルとの間に相関があることを示す。
【００７５】
実施例３−単離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の臨床適用
実施例３．１−間充織幹細胞又は骨髄幹細胞の投与
患者は急性骨髄性白血病であると診断され、導入療法により寛解に到達した後、同種骨髄移植を受けた１８歳の女性であった。６ヶ月間の免疫抑制剤の投与を停止して１ヶ月後、慢性移植片対宿主病が発症し、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、及びステロイドを用いて治療したが、継続的な血便、ビリルビン値の上昇、並びに皮膚、口、及び眼の乾燥により患者の状態は悪化し、治療の副作用のためＣＭＶが活性化し、ＢＫウイルスの感染により尿及び血液中でもＢＫウイルスが見られたため、Ｃｉｄｅｆｏｒｖｉｒを用いた治療を開始した。韓国食品医薬品安全庁の応急臨床許可を受けた後、実施例１に記載のように単離した患者の母親の間充織幹細胞又は骨髄幹細胞をＧＭＰ施設において培養し、静脈注射を用いて患者に投与した。投与中又は投与後に有害／陰性反応は観察されず、患者の症状は１回目の投与後から徐々に改善され、２回目の投与は１回目と同一の量で３週間後に行なった。その後、患者の症状は大幅に改善され、２回目の投与の３４日後に、患者はステロイドの服用を止め、免疫抑制剤としてＭＭＦのみを１．５ｇ／日で服用している状態で退院した。
【００７６】
実施例３．２−治療後の疾患の指標の変化
本発明における亜分画培養法を用いて単離された間充織幹細胞又は骨髄幹細胞が治療に有効であるかを検証するために、本発明者らは、糞便量及び主な指標である血中アルカリホスファターゼの活性を測定した（図４）。血中アルカリホスファターゼの活性化は、市販のキット（Sigma Chemical Company、USA）を用いて行なった。
【００７７】
結果として、慢性移植片対宿主病の主な指標である糞便量は大幅に減少し、血清学的指標である血中アルカリホスファターゼの活性も正常値（６０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌ）まで低下した。また、大腸内視鏡検査分析を行ない、症状が改善されているかを検証した（図５）。結果として、間充織幹細胞の投与から３ヶ月後の大腸内視鏡検査による見解は、潰瘍が非常に改善されているというものであった。上述したように、本発明者らは、本発明における亜分画培養法を用いて分離した間充織幹細胞又は骨髄幹細胞が慢性移植片対宿主病の治療に有効であることを臨床試験により検証した。
【００７８】
本発明は、間充織幹細胞又は骨髄幹細胞を活性成分として含む、急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤に関するものであるが、本発明における治療剤により、治療が非常に困難であった移植片対宿主病、特に骨髄移植外科手術の後、副作用として頻繁に起こる致命的な急性又は慢性の移植片対宿主病を非常に効果的に治療することができる。
【００７９】
本明細書中で引用した参考文献の全ての内容は、参照により本明細書中に援用される。
【００８０】
当業者であれば、単なる日常実験により、本明細書中に具体的に記載の具体的実施形態の多くの均等物を理解するであろうし、又は確認することができる。かかる均等物も、特許請求の範囲内に含まれるように意図されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、ドナー骨髄由来のＴ細胞の活性を阻害する方法であって、それを必要とする被験者に、治療的に有効な量の同種クローン骨髄幹細胞集団を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記幹細胞の投与量が、１回の投与につき１×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞を亜分画培養法を用いて単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記同種クローン骨髄幹細胞が、インターロイキン−１０を少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で分泌する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、移植片対宿主病の症状を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療的に有効な量の同種クローン骨髄幹細胞集団を投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記移植片対宿主病の症状が、胃腸管症状、皮膚硬化、経口摂取の制限、目の乾燥、肝症状、息切れ、又は腕若しくは脚の緊張である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記胃腸症状が１日糞便量の増加である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記胃腸症状が大腸炎症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記肝症状が血清中アルカリホスファターゼ値の上昇である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、ドナー骨髄由来のＴ細胞の活性を阻害する方法であって、
（Ａ）骨髄細胞の生体サンプルを操作することであって、
（ｉ）前記細胞サンプルを容器に定着させること、
（ｉｉ）上清を前記容器から別の容器に移すこと、及び
（ｉｉｉ）前記サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を前記上清から単離し、同種クローン骨髄幹細胞集団を得る、単離することを含む、操作すること、並びに
（Ｂ）それを必要とする前記被験者に、（Ａ）で得られる同種クローン骨髄幹細胞集団を治療的に有効な量投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記容器をコーティングにより処理する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記コーティングがコラーゲン、ポリリジン、フィブリノーゲン、又はゼラチンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、移植片対宿主病の症状を治療する方法であって、
（Ａ）骨髄細胞の生体サンプルを操作することであって、
（ｉ）前記細胞サンプルを容器に定着させること、
（ｉｉ）上清を前記容器から別の容器に移すこと、及び
（ｉｉｉ）前記サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を前記上清から単離し、同種クローン骨髄幹細胞集団を得る、単離することを含む、操作すること、並びに
（Ｂ）それを必要とする前記被験者に、（Ａ）で得られる同種クローン骨髄幹細胞集団を治療的に有効な量投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記細胞の投与量が、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０８細胞／ｋｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞集団が、インターロイキン−１０を少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で分泌する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤であって、活性成分として同種クローン骨髄幹細胞集団を含む、治療剤。
【請求項２１】
前記細胞が、亜分画培養法を用いて単離される、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２２】
前記細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２３】
前記細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２４】
前記細胞が少なくとも約５ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を分泌する、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２５】
前記細胞が、密度勾配遠心分離法を用いて単離される細胞の少なくとも約５倍のＩＬ−１０を分泌する、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２６】
密度勾配遠心分離法を用いて単離される細胞の少なくとも約５倍のＩＬ−１０を発現する、同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項２７】
密度勾配遠心分離法を用いて単離される細胞の少なくとも約５倍のＩＬ−１０を発現する、同種クローン骨髄幹細胞集団であって、
（ｉ）骨髄細胞のサンプルを容器に定着させること、
（ｉｉ）上清を前記容器から別の容器に移すこと、及び
（ｉｉｉ）前記サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を前記上清から単離することにより得られる、同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項２８】
前記骨髄細胞を３７℃で約１時間〜３時間、次に約２回〜３回繰り返して３７℃で約１２時間〜３６時間、次に３７℃で約２４時間〜７２時間、毎回培養上清の上方を新たな培養容器に移しながらインキュベートする、請求項２７に記載の同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項２９】
前記容器をコーティングにより処理する、請求項２７に記載の同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項３０】
前記コーティングがコラーゲン、ポリリジン、フィブリノーゲン、又はゼラチンである、請求項２９に記載の同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項３１】
前記繰り返しのインキュベーションを約４回〜５回行なう、請求項２８に記載の同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項１】
移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、ドナー骨髄由来のＴ細胞の活性を阻害する方法であって、それを必要とする被験者に、治療的に有効な量の同種クローン骨髄幹細胞集団を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記幹細胞の投与量が、１回の投与につき１×１０４細胞／ｋｇ体重〜１×１０８細胞／ｋｇ体重である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞を亜分画培養法を用いて単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記同種クローン骨髄幹細胞が、インターロイキン−１０を少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で分泌する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、移植片対宿主病の症状を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療的に有効な量の同種クローン骨髄幹細胞集団を投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記移植片対宿主病の症状が、胃腸管症状、皮膚硬化、経口摂取の制限、目の乾燥、肝症状、息切れ、又は腕若しくは脚の緊張である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記胃腸症状が１日糞便量の増加である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記胃腸症状が大腸炎症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記肝症状が血清中アルカリホスファターゼ値の上昇である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、ドナー骨髄由来のＴ細胞の活性を阻害する方法であって、
（Ａ）骨髄細胞の生体サンプルを操作することであって、
（ｉ）前記細胞サンプルを容器に定着させること、
（ｉｉ）上清を前記容器から別の容器に移すこと、及び
（ｉｉｉ）前記サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を前記上清から単離し、同種クローン骨髄幹細胞集団を得る、単離することを含む、操作すること、並びに
（Ｂ）それを必要とする前記被験者に、（Ａ）で得られる同種クローン骨髄幹細胞集団を治療的に有効な量投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記容器をコーティングにより処理する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記コーティングがコラーゲン、ポリリジン、フィブリノーゲン、又はゼラチンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
移植片対宿主病を患っていることが確認された被験者において、移植片対宿主病の症状を治療する方法であって、
（Ａ）骨髄細胞の生体サンプルを操作することであって、
（ｉ）前記細胞サンプルを容器に定着させること、
（ｉｉ）上清を前記容器から別の容器に移すこと、及び
（ｉｉｉ）前記サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を前記上清から単離し、同種クローン骨髄幹細胞集団を得る、単離することを含む、操作すること、並びに
（Ｂ）それを必要とする前記被験者に、（Ａ）で得られる同種クローン骨髄幹細胞集団を治療的に有効な量投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記細胞の投与量が、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０８細胞／ｋｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞集団が、インターロイキン−１０を少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で分泌する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
急性又は慢性の移植片対宿主病を治療するための治療剤であって、活性成分として同種クローン骨髄幹細胞集団を含む、治療剤。
【請求項２１】
前記細胞が、亜分画培養法を用いて単離される、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２２】
前記細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、及びＣＤ１０５細胞表面抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２３】
前記細胞がＣＤ２９細胞表面抗原、ＣＤ４４細胞表面抗原、ＣＤ７３細胞表面抗原、ＣＤ９０細胞表面抗原、ＣＤ１０５細胞表面抗原、及びＣＤ１６６細胞表面抗原を発現するが、ＣＤ１０６細胞表面抗原、ＣＤ１１９細胞表面抗原、又はＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原は発現しない、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２４】
前記細胞が少なくとも約５ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を分泌する、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２５】
前記細胞が、密度勾配遠心分離法を用いて単離される細胞の少なくとも約５倍のＩＬ−１０を分泌する、請求項２０に記載の治療剤。
【請求項２６】
密度勾配遠心分離法を用いて単離される細胞の少なくとも約５倍のＩＬ−１０を発現する、同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項２７】
密度勾配遠心分離法を用いて単離される細胞の少なくとも約５倍のＩＬ−１０を発現する、同種クローン骨髄幹細胞集団であって、
（ｉ）骨髄細胞のサンプルを容器に定着させること、
（ｉｉ）上清を前記容器から別の容器に移すこと、及び
（ｉｉｉ）前記サンプルにおいて比較的低い密度を有する細胞を前記上清から単離することにより得られる、同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項２８】
前記骨髄細胞を３７℃で約１時間〜３時間、次に約２回〜３回繰り返して３７℃で約１２時間〜３６時間、次に３７℃で約２４時間〜７２時間、毎回培養上清の上方を新たな培養容器に移しながらインキュベートする、請求項２７に記載の同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項２９】
前記容器をコーティングにより処理する、請求項２７に記載の同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項３０】
前記コーティングがコラーゲン、ポリリジン、フィブリノーゲン、又はゼラチンである、請求項２９に記載の同種クローン骨髄幹細胞集団。
【請求項３１】
前記繰り返しのインキュベーションを約４回〜５回行なう、請求項２８に記載の同種クローン骨髄幹細胞集団。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５２７９８８（Ｐ２０１０−５２７９８８Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８９３２（Ｐ２０１０−５０８９３２）
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３００５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４０６６６
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（３１０００９５２４）ホメオ セラピー カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３００５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４０６６６
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（３１０００９５２４）ホメオ セラピー カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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