種子貯蔵タンパク質高含有形質転換ダイズ植物
【課題】形質転換ダイズ植物を用いた内在性種子貯蔵タンパク質の生産方法を提供する。
【解決手段】不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入され、種子中で該遺伝子が発現している形質転換ダイズ植物であって、種子中での内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加している形質転換ダイズ植物を提供する。
【解決手段】不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入され、種子中で該遺伝子が発現している形質転換ダイズ植物であって、種子中での内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加している形質転換ダイズ植物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子中の内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加した形質転換ダイズ植物に関する。また、本発明は、該形質転換ダイズ植物を用いた種子中での内在性種子貯蔵タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイズは胚乳を持たず、子葉に当たる胚にその養分を蓄積する無胚乳種子であり、種子重量全体の約４０％が貯蔵タンパク質で占められる。そのため、ダイズ種子は、胚乳に主要な貯蔵物質としてデンプンを蓄積するイネやトウモロコシ等の種子とは貯蔵組織としての性質を異にしており、ダイズはタンパク質を生産し蓄積させるのに適した作物である。ダイズの主要な種子貯蔵タンパク質は１１Sグロブリン（グリシニン）と７Sグロブリン（β−コングリシニン）である。これらの種子貯蔵タンパク質の立体構造や細胞内での蓄積機構は解明されてきており、これらをコードする遺伝子には、可変領域と呼ばれる、外来の遺伝子を挿入しても３次元構造を維持することができ、貯蔵タンパク質の特性に影響を及ぼさないと考えられる部位が存在することが知られている。
【０００３】
一方、イネの主要な種子貯蔵タンパク質のひとつであるプロラミンは、不溶性かつ難消化性のタンパク質で、分子量の異なる数種類（１０K、１３K、１６Kなど）のプロラミンが存在することが知られている。プロラミンは、イネ胚乳において液胞由来でないタンパク顆粒PB-I に蓄積する。
【０００４】
ダイズのタンパク質は、ヒト体内において、中性脂肪の燃焼を促進する働き、体脂肪の蓄積を抑制する働き、血中コレステロール濃度を低下させる働き、さらには血圧上昇作用を有するホルモンであるアンジオテンシンの合成に関与する酵素の活性を阻害して、血圧上昇を抑制する働きがあることが知られており、ダイズのタンパク質を摂取することが動脈硬化や心筋梗塞、心臓病の予防につながることが知られている。
【０００５】
一方で、種子中にタンパク質を蓄積する形質転換植物として、ダイズグリシニンを種子中に発現する形質転換イネ（特許文献１）、ペプチドをタンパク質顆粒として種子中に蓄積する形質転換イネ（特許文献２）が知られており、また、種子中のグリシニンとβ−コングリシニン含量が減少した形質転換ダイズ（特許文献３、４）も知られている。
しかしながら、種子中でのタンパク質の蓄積量が増加した形質転換ダイズ植物はこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−５０８７１号公報
【特許文献２】特開２００３−３３４０８０号公報
【特許文献３】特許第３９２８８４８号公報
【特許文献４】特許第３９２８８１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、種子中で内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加した形質転換ダイズ植物を提供することである。また、本発明の他の目的は、該形質転換ダイズ植物を用いた、内在性種子貯蔵タンパク質の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。
その結果、不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換ダイズ植物において、内在性種子貯蔵タンパク質の種子中での蓄積量が増加することを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、
［１］
不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入され、種子中で該遺伝子が発現している形質転換ダイズ植物であって、種子中での内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加している、形質転換ダイズ植物、
［２］
外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が、ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターの下流に連結されて導入された、［１］に記載の形質転換ダイズ植物、
［３］
外来性種子貯蔵タンパク質がイネのプロラミンである、［１］又は［２］に記載の形質転換ダイズ植物、
［４］
内在性種子貯蔵タンパク質が、ダイズ１１Ｓグロブリン及び／又はダイズ７Ｓグロブリンである、［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物、
［５］
内在性種子貯蔵タンパク質が、ダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニットである、［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物、
［６］
ダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニットをコードする遺伝子の可変領域に、外来性タンパク質をコードする遺伝子がフレームシフトを生じないように挿入された、改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子がさらに導入された、［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物、
［７］
改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターの下流に連結されて導入された、［６］に記載の形質転換ダイズ植物、
［８］
［１］〜［７］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物の細胞、
［９］
［１］〜［７］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物の種子、
［１０］
［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物を用いて、その種子中で内在性種子貯蔵タンパク質を生産する方法、
［１１］
［６］又は［７］に記載の形質転換ダイズ植物を用いて、その種子中で改変型の内在性種子貯蔵タンパク質を生産する方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の形質転換ダイズ植物は、その種子に内在性種子貯蔵タンパク質を高度に蓄積させることができるので、該形質転換ダイズ植物を用いて、１１Sグロブリン又はダイズ７Sグロブリン等を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プロラミンタンパク質（１０Ｋ）をコードする遺伝子をダイズ植物に導入するために使用したプラスミドｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＲＰ１０及びｐＵＨＧＡｒｃ５ＰＲＰ１０並びにコントロールプラスミド（ｐＵＨＲＳＫ）の構造を示した模式図である。
【図２】プロラミンタンパク質（１０Ｋ）をコードする遺伝子を導入した形質転換ダイズ種子中の各種タンパク質の蓄積をSDS電気泳動後のＣＢＢ染色で検出した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
１．不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質
本発明における不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質とは、ダイズに由来しない不溶性の種子貯蔵タンパク質をいう。
ここで、「不溶性」とは水又は生理的塩溶液に溶解しないことをいう。生理的塩溶液の組成としては、例えば、１５０mＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３５）、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）などの、塩濃度が０．０５〜０．２Ｍ、p Hが６〜９の溶液であって、尿素などの可溶化剤、界面活性剤、還元剤を含まない溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明における不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質としては、イネのプロラミン１０K、イネのプロラミン１３K、イネのプロラミン１６Kなどのダイズ以外の作物の種子貯蔵タンパク質が挙げられるが、イネのプロラミン１０Ｋであることが好ましい。
【００１５】
イネのプロラミン１０Kとして、配列番号２のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
ここで、「アミノ酸配列の同一性（％）」とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｋｓ ２．５．１ソフトウェア（（株）帝人システムテクノロジー）、ＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発（株））等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００１６】
２．不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子
本発明における不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子としては、イネのプロラミン１０Kをコードする遺伝子、イネのプロラミン１３Kをコードする遺伝子、イネのプロラミン１６Kをコードする遺伝子などのダイズ以外の作物の種子貯蔵タンパク質コードする遺伝子、又はこれらのタンパク質の断片をコードする遺伝子が挙げられるが、イネのプロラミン１０Kをコードする遺伝子であることが好ましい。
ここで、不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の一部とは、不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の断片であり、外来性種子貯蔵タンパク質のアミノ酸配列長の５０％以上１００％未満、好ましくは７０％以上１００％未満、より好ましくは８０％以上１００％未満、さらに好ましくは９０％以上１００％未満のアミノ酸配列長を有するタンパク質をいう。
【００１７】
イネのプロラミン１０Kをコードする遺伝子として、配列番号１の第５１番目〜第４５５番目の塩基配列を含む遺伝子、又は該塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。
ここで、「塩基配列の同一性（％）」とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｋｓ ２．５．１ソフトウェア（（株）帝人システムテクノロジー）、ＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発（株））等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００１８】
３．内在性種子貯蔵タンパク質
本発明において種子中で蓄積量が増加する内在性種子貯蔵タンパク質には、ダイズが本来的に有している種子貯蔵タンパク質、すなわち、外部から導入された遺伝子の発現産物でない種子貯蔵タンパク質をいう。
【００１９】
ダイズが本来的に有している種子貯蔵タンパク質には、ダイズ１１Ｓグロブリンやダイズ７Ｓグロブリンの他、ダイズ１１Ｓグロブリンやダイズ７Ｓグロブリンを構成する各サブユニット自体も含まれる。このようなサブユニットとして、ダイズ１１SグロブリンのＡ１ａＢ１ｂサブユニット、ダイズ７Ｓグロブリンのαサブユニット、α’サブユニット及びβサブユニット等が挙げられる。
【００２０】
本発明における内在性種子貯蔵タンパク質は、外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入されて種子中で該遺伝子が発現している形質転換ダイズ植物において、種子中での蓄積量が増加する。ここで、「種子中での蓄積量が増加する」とは、外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入されていないダイズ植物の種子中での蓄積量に比べて蓄積量が増加していることを意味する。
【００２１】
４．改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子
本発明において、改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子とは、ダイズに由来する種子貯蔵タンパク質と外来性タンパク質との融合タンパク質をいう。ここで、外来性タンパク質とは、融合される内在性種子貯蔵タンパク質と異なるタンパク質であれば、ダイズに由来するタンパク質やその断片であっても、ダイズに由来しないタンパク質やその断片であってもよく、また、人工的に作製したタンパク質やその断片であってもよい。外来性タンパク質の例として、家畜等の動物やヒトに投与するための抗体やワクチン、インターフェロン、成長ホルモン、インスリン、ＦＧＦ成長因子、血圧降下ペプチド等が挙げられる。
【００２２】
改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子は、種々の既知の方法で作製することができるが、内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の可変領域に外来性タンパク質をコードする遺伝子をフレームシフトが生じないように挿入して作製することが好ましい。
ここで、「可変領域」とは、その中に外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された場合であっても、フレームシフトを生じないように挿入されていれば、その遺伝子発現産物であるタンパク質が、内在性種子貯蔵タンパク質と同等の安定した３次元構造を維持することができ、それにより内在性種子貯蔵タンパク質の特性を維持することができる領域をいう。
【００２３】
また、「フレームシフトを生じないように挿入された」とは、内在性種子貯蔵タンパク質の可変領域に、内在性種子貯蔵タンパク質のアミノ酸配列に対応するトリプレットの並びを維持した状態で外来性タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたことをいう。尚、可変領域が終止コドンを含む場合であって、当該可変領域に外来性タンパク質を挿入する場合には、挿入された外来性タンパク質よりも、５’側のトリプレットの並びが維持されていればよく、挿入された外来性タンパク質よりも３’側は取り除かれてもよい。
【００２４】
外来性タンパク質は、ペプチドリンカー等のリンカーを介して内在性種子貯蔵タンパク質と融合させてもよく、このような方法は当業者に周知である。
【００２５】
可変領域を有する内在性種子貯蔵タンパク質として、１１SグロブリンのＡ１ａＢ１ｂサブユニットやダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニット等が挙げられる。
【００２６】
内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に複数の可変領域が存在する場合には、１つ又は複数の可変領域に外来性タンパク質をコードする遺伝子を挿入することで、改変型の種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。
【００２７】
内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の可変領域に外来性タンパク質をコードする遺伝子がフレームシフトを生じないように挿入された遺伝子から、内在性種子貯蔵タンパク質の内部に外来性タンパク質が融合した改変型の内在性種子貯蔵タンパク質を発現させることができる。
【００２８】
外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入された形質転換ダイズ植物に、さらに改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子を導入することによって、外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入されていない形質転換ダイズ植物に改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子を導入した場合よりも、導入された改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現産物を、より高いレベルで種子中に蓄積することが可能になる。
【００２９】
５．形質転換されるダイズ植物
本発明において形質転換され得るダイズ植物に特に制限はなく、一般に食用、飼料、油用として利用されている品種が含まれる。具体的にはJack、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２、エンレイ、スズユタカ、フクユタカ、トヨムスメ等が挙げられる。形質転換されるダイズ植物は、これらの品種が形質転換されたものであってもよい。
【００３０】
６．形質転換ダイズ植物の作製
本発明においては、ダイズ植物に導入する遺伝子を種子で発現させる必要があるが、該遺伝子の上流にダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターを連結した構造を有するベクターをダイズ植物に導入することでこの目的を達成することができる。さらに、該遺伝子の下流にターミネーターを連結させた構造を有するベクターを導入することもできる。
【００３１】
ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターとしては、例えばインゲンマメのアルセリンのプロモーター、ダイズの１１Ｓグロブリンのプロモーター等が挙げられ、ターミネーターとしては、インゲンマメのアルセリンのターミネーター、ダイズの１１Ｓグロブリンのターミネーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５ＳのターミネーターやＮＯＳターミネーター等が挙げられる。
【００３２】
前記ベクターには、組換え体を選抜するための選抜マーカー遺伝子や導入された遺伝子の発現を確認するためのレポーター遺伝子を挿入することができる。選抜マーカー遺伝子としては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、ホスフィノスリシン耐性遺伝子等が挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子や、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。
前記ベクターは、種子特異的な発現を誘導するプロモーターと、その下流に連結された目的の遺伝子と、さらにその下流に連結されたターミネーターを含むＤＮＡ断片を、前記選抜マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を含むベクターに挿入して得ることもできる。
【００３３】
本発明の形質転換ダイズ植物を作製するための材料としては、例えば、上記ダイズ植物の品種の根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、不定胚、プロトプラスト等の培養細胞等を用いることができる。
上記材料への外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子や、野生型又は改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の導入は、すでに報告され、確立されている種々の方法により行うことができるが、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイスカー超音波法などを用いて前記ベクターを導入することが好ましい。
【００３４】
遺伝子導入操作が行われた材料の中から、選抜マーカー遺伝子によってもたらされる耐性効果を指標に、形質転換ダイズ植物の細胞を選抜することができる。選抜した細胞から、既に報告されている周知の植物体を再生させる工程を経て、形質転換ダイズ植物体を得ることができる。
こうして得られた形質転換ダイズ植物体の栽培を行い、種子を稔実させることで、本発明に係る形質転換ダイズ植物の種子を得ることができ、種子中に目的とする内在性種子貯蔵タンパク質又は改変型の内在性種子貯蔵タンパク質を得ることができる。
【００３５】
ダイズ植物に目的の遺伝子が導入されているか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウエスタンブロッティング法などによって行うことができる。また、形質転換ダイズ植物の種子中に存在する内在性種子貯蔵タンパク質の含量を測定する方法は、ＳＤＳ電気泳動法、ウエスタンブロッティング法などによって行うことができる。例えば、形質転換ダイズ植物体の種子からタンパク質を抽出し、ＳＤＳ電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色などで染色を行うことにより蓄積量を確認することができる。
【００３６】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例で行われる実験操作の手順は、特に記述しない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」 第２版 (Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， １９８９年発行)に記載される方法に従っている。
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
［実施例１］
ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーター及びターミネーターの単離
（１）インゲンマメ野生種のゲノミックＤＮＡの調製
インゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ１２８６６）の生葉１ｇからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノミックＤＮＡ５０μｇを抽出した。
【００３９】
（２）インゲンマメ野生種からのアルセリン２遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡの単離
以下の記載されるアルセリン２遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域を含むＤＮＡの単離操作は、制限酵素処理を施したゲノミックＤＮＡ断片にアダプターを結合させ、既知配列とアダプター配列に基づいてプライマーを設計し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い未知の領域をクローニングするための市販されたキットである、株式会社ベックス製のＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTMを用いて実施した。
【００４０】
（i）第一回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＳａｕIIIＡIで消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。その後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−１アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、アルセリン２遺伝子の上流域のＤＮＡを単離するためのＰＣＲの鋳型とした。
【００４１】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号３及び配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＳＰ１及びプライマーＳＰ２と命名）を、株式会社ファスマックのカスタム合成受託サービスを利用して作製した。以降、特に記述がない限りプライマーの合成は、同社を利用して行った。
【００４２】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃、２分で１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを６５℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００４３】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
【００４４】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００４５】
この反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（i）とし、株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンシングサービスを用いて塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子の開始コドンの上流８４４ｂｐの新規な領域を含むことを確認した。以降、特に記述がない限り塩基配列の決定は同社のシーケンシングサービスを用いて行った。
次に、さらに上流域を単離するため、新たなプライマーを作製し第二回目となる伸長反応を行った。
【００４６】
（ii）第二回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＢｇｌIIで消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−１アダプターと連結反応を行い、プロモーター単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００４７】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ１と命名）を、また第一回伸長反応で得られた開始コドンの上流８４４ｂｐの塩基配列に基づき配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ２と命名）を作製した。
【００４８】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、上記（i）の第一回伸長反応と同条件で行った。
【００４９】
反応終了後、上記ＰＣＲ液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件である。
【００５０】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００５１】
反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（ii）とし塩基配列を決定した。その結果、Ａｒｃ２Ｐ（i）の上流１９７ｂｐ（合計１０４１ｂｐ）の新規な領域を含むことを確認した。次に、さらに上流域を単離するため、新たなプライマーを作製し第三回目となる伸長反応を行った。
【００５２】
（iii）第三回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＸｂａIで消化した後、ｄＣＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−２アダプターと連結反応を行い、プロモーター単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００５３】
次に、第二回伸長反応で得られた１９７ｂｐの塩基配列に基づき、配列番号７及び配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーｔｈｉｒｄＳＰ１及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ２と命名）を作製した。
【００５４】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、上記(i)の第一回伸長反応と同条件で行った。
【００５５】
反応終了後、上記反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件である。
【００５６】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００５７】
この反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（iii）とし、塩基配列を決定した。その結果、Ａｒｃ２Ｐ（ii）の上流２８１９ｂｐ（合計３８６０ｂｐ）の新規な領域を含むことを確認した。以上、三回の伸長反応によってアルセリン２遺伝子の開始コドンの上流５′側非翻訳領域を含む３８６０ｂｐの新規なプロモーター配列を含むＤＮＡを取得することができた（配列番号９）。アルセリン２遺伝子と相同性を有する公知の遺伝子であるアルセリン１（GenBank accession No.M68913）、アルセリン３（GenBank accession No.AX463292）、アルセリン４（GenBank accession No.AX463293）及びアルセリン５−１（GenBank accession No.Z50202）のプロモーター配列との相同性を調べた結果、いずれとの比較においても相同性は５５．４％以下であり、配列番号１に記載のＤＮＡは新規なアルセリンプロモーター配列を含むＤＮＡであることが明らかとなった。
【００５８】
（３）インゲンマメ野生種からのアルセリン２遺伝子のターミネーター配列を含むＤＮＡの単離
上記実施例１（１）で抽出したゲノミックＤＮＡ２８０ｎｇを制限酵素ＮｈｅIで消化した後、ｄＣＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−２アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、ターミネーター遺伝子の単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００５９】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号１０及び配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＳＰ３及びプライマーＳＰ４と命名）を作製した。
【００６０】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及プライマーＳＰ３を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを６５℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液は２００μMのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００６１】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その1μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＳＰ４を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
【００６２】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００６３】
反応産物を、Ａｒｃ２Ｔとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子の３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流７９５ｂｐの新規な領域を含むことを確認した（配列番号１２）。公知のアルセリン２遺伝子と相同な遺伝子であるアルセリン１（GenBank accession No.M68913）及びアルセリン５−１（GenBank accession No.Z50202）のターミネーター領域と相同性について検索した結果、いずれとの比較においても相同性は４９．１％以下であり、配列番号１２に記載のＤＮＡは新規なターミネーター配列を含むＤＮＡであることが明らかとなった。
【００６４】
［実施例２］
イネプロラミンの種子特異的発現ベクターの構築
（１）アルセリン２ゲノム遺伝子に相当するＤＮＡの合成と単離
上記実施例１（１）で抽出したゲノミックＤＮＡ８０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。配列番号９及び配列番号１２に記載された塩基配列に基づき、配列番号１３及び配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ２Ｐ及びプライマーＡｒｃ２Ｔと命名）を作製した。
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で４分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００６５】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００６６】
反応産物を、Ａｒｃ２ＰＣＴとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子、及びその５’側非翻訳領域を含む開始コドンの上流２４６１ｂｐのプロモーター領域を含み、且つ３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流７９５ｂｐの新規な領域を含むことを確認した（配列番号１５）。こうして得られた組換えベクターＡｒｃ２ＰＣＴを導入した大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ株式会社製）は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α/Ａｒｃ２ＰＣＴと命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2008年7月30日より、受託番号P-21624 として寄託されている。
【００６７】
（２）アルセリン２プロモーターを含む発現ベクターの作製
公知のイネの１０Ｋ（１０ｋDa）プロラミンであるＲＰ１０をコードする遺伝子を種子特異的に発現させるため、ＲＰ１０をコードする遺伝子と、上記実施例１で得られたＡｒｃ２ＰおよびＡｒｃ２Ｔを連結した発現プラスミドの構築を行った。
【００６８】
上記のＡｒｃ２ＰＣＴの１０ｎｇを鋳型として、プロモーター、ターミネーター及びベクター部分（アルセリン２遺伝子以外の部分）を増幅するＰＣＲを行った。配列番号１５の塩基配列に基づき、配列番号１６及び配列番号１７のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ２Ｐ３及びプライマーＡｒｃ２Ｔ５と命名）を作製した。
【００６９】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で６分３０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、1ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、アルセリン２遺伝子のプロモーター２４６１ｂｐとターミネーター７９５ｂｐ及びそれらの間にベクターの配列を含むＤＮＡ断片Ａｒｃ２ＰＴを得た。
【００７０】
次に、イネの１０ＫプロラミンであるＲＰ１０をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ０９７８２）（配列番号２）のｃＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）のＳｍａＩサイトにクローニングされている、プラスミドｐＢＳＫ−ＲＰ１０（独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、北海道農業研究センター保有）を鋳型として、ＲＰ１０をコードするＤＮＡ断片を得るため配列番号１８及び配列番号１９からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
【００７１】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μｌの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒及び伸長反応を６８℃で１分を１サイクルとして２５サイクル行った。こうして、ＲＰ１０をコードするＤＮＡ断片を得た。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００７２】
ＲＰ１０遺伝子断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、上記Ａｒｃ２ＰＴと連結反応を行った。こうして、ＲＰ１０遺伝子の上流にアルセリン２遺伝子のプロモーター２４６１ｂｐ及び下流にターミネーター７９５ｂｐを含む、種子特異的発現ベクターＡｒｃ２ＰＲＰ１０を作製した。
【００７３】
（３）アルセリン５プロモーターを含む発現ベクターの作製
イネの１０ＫプロラミンのＲＰ１０をコードする遺伝子を種子特異的に発現させるため、ＲＰ１０をコードする遺伝子と、種子特異的発現が認められている、公知のアルセリン５プロモーター及びターミネーター（国際公開ＷＯ０２／５０２９５号パンフレット）を連結した発現プラスミドの構築を行った。
【００７４】
インゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ０２７７１）の生葉１ｇからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノミックＤＮＡ５０μｇを抽出した。該ゲノミックＤＮＡ８０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。公知のインゲンマメアルセリン５−１遺伝子（GenBank accession No.Z50202）の塩基配列に基づき、配列番号２０及び配列番号２１の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ５Ｐ及びプライマーＡｒｃ５Ｔと命名）を作製した。
【００７５】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃３０秒、アニーリングを５７℃３０秒及び伸長反応６８℃４分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００７６】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。反応産物を、Ａｒｃ５ＰＣＴとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン５遺伝子、及びその５’側非翻訳領域を含む開始コドンの上流１８１８ｂｐのプロモーター領域を含み、且つ３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流１１９２ｂｐの領域を含むことを確認した。
【００７７】
上記で得たＡｒｃ５ＰＣＴの１０ｎｇを鋳型として、プロモーター、ターミネーター及びベクター部分（アルセリン５遺伝子以外の部分）を増幅するＰＣＲを行った。公知のアルセリン５−１遺伝子の塩基配列より、配列番号２２及び配列番号２３の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ５Ｐ３及びプライマーＡｒｃ５Ｔ５と命名）を作製した。
【００７８】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で６分３０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、1ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、アルセリン５遺伝子のプロモーター１８１８ｂｐ及びターミネーター１１９２ｂｐを含む遺伝子断片Ａｒｃ５ＰＴを得た。
【００７９】
これに、上記のリン酸化反応済みＲＰ１０遺伝子断片を連結して、ＲＰ１０遺伝子の上流にアルセリン５遺伝子のプロモーター１８１８ｂｐ及び下流にターミネーター１１９２ｂｐを含む、種子特異的発現ベクターＡｒｃ５ＰＲＰ１０を作製した。
【００８０】
（４）植物形質転換ベクターの構築
上記(２)、(３)で得られた、Ａｒｃ２ＰＲＰ１０およびＡｒｃ５ＰＲＰ１０を公知のｐＵＨＧベクター（ｐＵＨＧプラスミド）（Ｙ． Ｋｉｔａ，Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｍ. Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ． （２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｌｉｎｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２６：４３９−４４７）に連結し、植物形質転換ベクターの構築を行った。
【００８１】
Ａｒｃ２ＰＲＰ１０およびＡｒｃ５ＰＲＰ１０を制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで切断を行い、ｐＵＨＧベクターのＳｐｅＩ、ＳａｌＩサイトに連結反応を行い、植物形質転換ベクターｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＲＰ１０、ｐＵＨＧＡｒｃ５ＰＲＰ１０を作製した。すなわち、種子特異的発現ベクターＡｒｃ２ＰＲＰ１０およびＡｒｃ５ＰＲＰ１０の２μｇを制限酵素ＳｐｅＩ、ＳａｌＩの２０単位で３７℃、２時間切断した後、アガロース電気泳動を行い、Ａｒｃ２ＰＲＰ１０において約３．７ｋｂ、Ａｒｃ５ＰＲＰ１０において約３．４ｋｂの断片のみを切り出し、ジーンクリーンにより精製した。一方ｐＵＨＧプラスミド２μｇをＳｐｅＩ、ＳａｌＩ２０単位で３７℃、２時間切断した後、ジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）により精製した。夫々のＤＮＡフラグメントを、ＴａｋａｒａＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔにて、１６℃、３時間反応させた。
【００８２】
このようにしてプラスミドｐＵＨＧのＳｐｅＩ、ＳａｌＩ切断ＤＮＡフラグメントに、Ａｒｃ２ＰＲＰ１０由来の約３．７ｋｂのＳｐｅＩ、ＳａｌＩ切断フラグメントを、また同様にプラスミドｐＵＨＧのＳｐｅＩ、ＳａｌＩ切断ＤＮＡフラグメントに、Ａｒｃ５ＰＲＰ１０由来の約３．４ｋｂのＳｐｅＩ、ＳａｌＩ切断フラグメントを各々組み込んだ植物形質転換ベクターｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＲＰ１０及びｐＵＨＧＡｒｃ５ＰＲＰ１０（図１）を作製した。
また、ベクターコントロール区として公知のプラスミドｐＵＨＲＳＫ（Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ． Ｋｉｔａ， Ｍ. Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ．
（２００６）Ａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲｅｄ２，ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５：１３５５−１３６１）を用いた。
【００８３】
［実施例３］
植物形質転換ベクターのダイズへの導入及び形質転換ダイズ植物の作出
公知の方法（Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ， Ｙ． Ｋｉｔａ， Ｍ． Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ． （２００６） Ａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＤｓＲｅｄ２， ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５：１３５５−１３６１）により、ダイズ品種Ｊａｃｋの未熟種子から誘導された不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を１．５ｍｌ用のチューブに加え、ウイスカー超音波法（特許第３３１２８６7号）により遺伝子導入操作を行った。
【００８４】
チタン酸カリウム製ウイスカーＬＳ２０（チタン工業社製）５ｍｇを１．５ｍｌ容のチューブに入れ、１時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカーを得た。このウイスカーの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、良く攪拌した。ウイスカーと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカーを洗浄した。このウイスカー洗浄操作を３回行った。その後、同チューブに公知のＭＳ液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカー懸濁液を得た。
【００８５】
上記で得られたウイスカー懸濁液の入ったチューブに、上記の不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を入れて攪拌した後、混合物を１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、不定胚塊とウイスカーを沈殿させ、上清を捨て、不定胚塊とウイスカーの混合物を得た。
【００８６】
この混合物を入れたチューブに、ｐＵＨＧＡｒｃ５ＰＲＰ１０を２０μｌ（２０μg）加え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。
【００８７】
次にこの均一な混合物の入ったチューブを１８０００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３回反復した。
【００８８】
上記のようにして得られた、不定胚塊と、ウイスカーと、ベクターを収容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５Ｗ／ｃｍ2で１分間照射した。照射後、１０分間、４℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記のＭＳ液体培地で洗浄した。
【００８９】
処理後の不定胚塊を公知の不定胚増殖液体培地で1週間回転振とう培養し（１００ｒｐｍ）、その後にハイグロマイシンB（１５ｍｇ／ｌ）（ロッシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）を含んでいる新鮮な不定胚増殖液体培地で１週間培養した。さらに３０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンBを含んでいる不定胚増殖液体培地で４週間培養（毎週培地を交換する）した後、４５ｍｇ／ｌのハイグロマイシンBを含んだ不定胚増殖液体培地で1週間選抜培養を行った。なお、遺伝子導入は各ベクターごとにマイクロチューブ１２本の処理を行った。
【００９０】
ハイグロマイシン耐性の不定胚塊を公知の不定胚成熟液体培地へ移し、４週間振とう培養（１００ｒｐｍ）を継続し不定胚を成熟させた。成熟した不定胚を滅菌シャーレ中に３から５日間置き乾燥させた後、公知の発芽固体培地に移した。７から１０日間発芽培養を行った後、公知の発根培地に移し、発芽している幼植物体を成長させた。根と芽が伸びた後に、土壌を含んでいるポットへ植物を移し、順化するまで高湿度に維持した。
【００９１】
このようにしてＪａｃｋ品種にＡｒｃ５ＰＲＰ１０を導入した形質転換ダイズ植物を４系統作出した。
これらの形質転換ダイズの植物体は環境湿度に適応させた後、１００００ｌuｘ、１６時間日長の環境下で栽培を継続し、すべての個体から種子を収穫した。こうして、形質転換ダイズ植物のＴ１世代の種子を得た。
【００９２】
［実施例４］
（１）形質転換ダイズ種子における種子貯蔵タンパク質含量の評価
上記実施例３で得た形質転換ダイズ４系統から採取した種子より全タンパク質を抽出し、SDS電気泳動により各種子貯蔵タンパク質の分離を行い、CBB染色により各々の種子貯蔵タンパク質含量を評価した。
その結果、形質転換ダイズ種子の各系統にダイズの種子貯蔵タンパク質の７Sタンパク質のβ、α、α‘サブユニットおよび１１Sタンパク質のA鎖、B鎖の蓄積が確認できた。そのうち７Sタンパク質のβ、α、α’サブユニットが明らかに対照区Jack品種の蓄積量よりも高かった（図２）。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明により、形質転換ダイズ種子に内在性種子貯蔵タンパク質を効率的に生産、蓄積させることが可能になるので、ダイズの種子貯蔵タンパク質を大量に供給することが可能になる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子中の内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加した形質転換ダイズ植物に関する。また、本発明は、該形質転換ダイズ植物を用いた種子中での内在性種子貯蔵タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイズは胚乳を持たず、子葉に当たる胚にその養分を蓄積する無胚乳種子であり、種子重量全体の約４０％が貯蔵タンパク質で占められる。そのため、ダイズ種子は、胚乳に主要な貯蔵物質としてデンプンを蓄積するイネやトウモロコシ等の種子とは貯蔵組織としての性質を異にしており、ダイズはタンパク質を生産し蓄積させるのに適した作物である。ダイズの主要な種子貯蔵タンパク質は１１Sグロブリン（グリシニン）と７Sグロブリン（β−コングリシニン）である。これらの種子貯蔵タンパク質の立体構造や細胞内での蓄積機構は解明されてきており、これらをコードする遺伝子には、可変領域と呼ばれる、外来の遺伝子を挿入しても３次元構造を維持することができ、貯蔵タンパク質の特性に影響を及ぼさないと考えられる部位が存在することが知られている。
【０００３】
一方、イネの主要な種子貯蔵タンパク質のひとつであるプロラミンは、不溶性かつ難消化性のタンパク質で、分子量の異なる数種類（１０K、１３K、１６Kなど）のプロラミンが存在することが知られている。プロラミンは、イネ胚乳において液胞由来でないタンパク顆粒PB-I に蓄積する。
【０００４】
ダイズのタンパク質は、ヒト体内において、中性脂肪の燃焼を促進する働き、体脂肪の蓄積を抑制する働き、血中コレステロール濃度を低下させる働き、さらには血圧上昇作用を有するホルモンであるアンジオテンシンの合成に関与する酵素の活性を阻害して、血圧上昇を抑制する働きがあることが知られており、ダイズのタンパク質を摂取することが動脈硬化や心筋梗塞、心臓病の予防につながることが知られている。
【０００５】
一方で、種子中にタンパク質を蓄積する形質転換植物として、ダイズグリシニンを種子中に発現する形質転換イネ（特許文献１）、ペプチドをタンパク質顆粒として種子中に蓄積する形質転換イネ（特許文献２）が知られており、また、種子中のグリシニンとβ−コングリシニン含量が減少した形質転換ダイズ（特許文献３、４）も知られている。
しかしながら、種子中でのタンパク質の蓄積量が増加した形質転換ダイズ植物はこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−５０８７１号公報
【特許文献２】特開２００３−３３４０８０号公報
【特許文献３】特許第３９２８８４８号公報
【特許文献４】特許第３９２８８１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、種子中で内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加した形質転換ダイズ植物を提供することである。また、本発明の他の目的は、該形質転換ダイズ植物を用いた、内在性種子貯蔵タンパク質の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。
その結果、不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換ダイズ植物において、内在性種子貯蔵タンパク質の種子中での蓄積量が増加することを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、
［１］
不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入され、種子中で該遺伝子が発現している形質転換ダイズ植物であって、種子中での内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加している、形質転換ダイズ植物、
［２］
外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が、ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターの下流に連結されて導入された、［１］に記載の形質転換ダイズ植物、
［３］
外来性種子貯蔵タンパク質がイネのプロラミンである、［１］又は［２］に記載の形質転換ダイズ植物、
［４］
内在性種子貯蔵タンパク質が、ダイズ１１Ｓグロブリン及び／又はダイズ７Ｓグロブリンである、［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物、
［５］
内在性種子貯蔵タンパク質が、ダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニットである、［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物、
［６］
ダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニットをコードする遺伝子の可変領域に、外来性タンパク質をコードする遺伝子がフレームシフトを生じないように挿入された、改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子がさらに導入された、［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物、
［７］
改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターの下流に連結されて導入された、［６］に記載の形質転換ダイズ植物、
［８］
［１］〜［７］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物の細胞、
［９］
［１］〜［７］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物の種子、
［１０］
［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換ダイズ植物を用いて、その種子中で内在性種子貯蔵タンパク質を生産する方法、
［１１］
［６］又は［７］に記載の形質転換ダイズ植物を用いて、その種子中で改変型の内在性種子貯蔵タンパク質を生産する方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の形質転換ダイズ植物は、その種子に内在性種子貯蔵タンパク質を高度に蓄積させることができるので、該形質転換ダイズ植物を用いて、１１Sグロブリン又はダイズ７Sグロブリン等を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プロラミンタンパク質（１０Ｋ）をコードする遺伝子をダイズ植物に導入するために使用したプラスミドｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＲＰ１０及びｐＵＨＧＡｒｃ５ＰＲＰ１０並びにコントロールプラスミド（ｐＵＨＲＳＫ）の構造を示した模式図である。
【図２】プロラミンタンパク質（１０Ｋ）をコードする遺伝子を導入した形質転換ダイズ種子中の各種タンパク質の蓄積をSDS電気泳動後のＣＢＢ染色で検出した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
１．不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質
本発明における不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質とは、ダイズに由来しない不溶性の種子貯蔵タンパク質をいう。
ここで、「不溶性」とは水又は生理的塩溶液に溶解しないことをいう。生理的塩溶液の組成としては、例えば、１５０mＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３５）、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）などの、塩濃度が０．０５〜０．２Ｍ、p Hが６〜９の溶液であって、尿素などの可溶化剤、界面活性剤、還元剤を含まない溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明における不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質としては、イネのプロラミン１０K、イネのプロラミン１３K、イネのプロラミン１６Kなどのダイズ以外の作物の種子貯蔵タンパク質が挙げられるが、イネのプロラミン１０Ｋであることが好ましい。
【００１５】
イネのプロラミン１０Kとして、配列番号２のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
ここで、「アミノ酸配列の同一性（％）」とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｋｓ ２．５．１ソフトウェア（（株）帝人システムテクノロジー）、ＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発（株））等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００１６】
２．不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子
本発明における不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子としては、イネのプロラミン１０Kをコードする遺伝子、イネのプロラミン１３Kをコードする遺伝子、イネのプロラミン１６Kをコードする遺伝子などのダイズ以外の作物の種子貯蔵タンパク質コードする遺伝子、又はこれらのタンパク質の断片をコードする遺伝子が挙げられるが、イネのプロラミン１０Kをコードする遺伝子であることが好ましい。
ここで、不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の一部とは、不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の断片であり、外来性種子貯蔵タンパク質のアミノ酸配列長の５０％以上１００％未満、好ましくは７０％以上１００％未満、より好ましくは８０％以上１００％未満、さらに好ましくは９０％以上１００％未満のアミノ酸配列長を有するタンパク質をいう。
【００１７】
イネのプロラミン１０Kをコードする遺伝子として、配列番号１の第５１番目〜第４５５番目の塩基配列を含む遺伝子、又は該塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。
ここで、「塩基配列の同一性（％）」とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｋｓ ２．５．１ソフトウェア（（株）帝人システムテクノロジー）、ＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発（株））等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００１８】
３．内在性種子貯蔵タンパク質
本発明において種子中で蓄積量が増加する内在性種子貯蔵タンパク質には、ダイズが本来的に有している種子貯蔵タンパク質、すなわち、外部から導入された遺伝子の発現産物でない種子貯蔵タンパク質をいう。
【００１９】
ダイズが本来的に有している種子貯蔵タンパク質には、ダイズ１１Ｓグロブリンやダイズ７Ｓグロブリンの他、ダイズ１１Ｓグロブリンやダイズ７Ｓグロブリンを構成する各サブユニット自体も含まれる。このようなサブユニットとして、ダイズ１１SグロブリンのＡ１ａＢ１ｂサブユニット、ダイズ７Ｓグロブリンのαサブユニット、α’サブユニット及びβサブユニット等が挙げられる。
【００２０】
本発明における内在性種子貯蔵タンパク質は、外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入されて種子中で該遺伝子が発現している形質転換ダイズ植物において、種子中での蓄積量が増加する。ここで、「種子中での蓄積量が増加する」とは、外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入されていないダイズ植物の種子中での蓄積量に比べて蓄積量が増加していることを意味する。
【００２１】
４．改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子
本発明において、改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子とは、ダイズに由来する種子貯蔵タンパク質と外来性タンパク質との融合タンパク質をいう。ここで、外来性タンパク質とは、融合される内在性種子貯蔵タンパク質と異なるタンパク質であれば、ダイズに由来するタンパク質やその断片であっても、ダイズに由来しないタンパク質やその断片であってもよく、また、人工的に作製したタンパク質やその断片であってもよい。外来性タンパク質の例として、家畜等の動物やヒトに投与するための抗体やワクチン、インターフェロン、成長ホルモン、インスリン、ＦＧＦ成長因子、血圧降下ペプチド等が挙げられる。
【００２２】
改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子は、種々の既知の方法で作製することができるが、内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の可変領域に外来性タンパク質をコードする遺伝子をフレームシフトが生じないように挿入して作製することが好ましい。
ここで、「可変領域」とは、その中に外来タンパク質をコードする遺伝子が挿入された場合であっても、フレームシフトを生じないように挿入されていれば、その遺伝子発現産物であるタンパク質が、内在性種子貯蔵タンパク質と同等の安定した３次元構造を維持することができ、それにより内在性種子貯蔵タンパク質の特性を維持することができる領域をいう。
【００２３】
また、「フレームシフトを生じないように挿入された」とは、内在性種子貯蔵タンパク質の可変領域に、内在性種子貯蔵タンパク質のアミノ酸配列に対応するトリプレットの並びを維持した状態で外来性タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたことをいう。尚、可変領域が終止コドンを含む場合であって、当該可変領域に外来性タンパク質を挿入する場合には、挿入された外来性タンパク質よりも、５’側のトリプレットの並びが維持されていればよく、挿入された外来性タンパク質よりも３’側は取り除かれてもよい。
【００２４】
外来性タンパク質は、ペプチドリンカー等のリンカーを介して内在性種子貯蔵タンパク質と融合させてもよく、このような方法は当業者に周知である。
【００２５】
可変領域を有する内在性種子貯蔵タンパク質として、１１SグロブリンのＡ１ａＢ１ｂサブユニットやダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニット等が挙げられる。
【００２６】
内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に複数の可変領域が存在する場合には、１つ又は複数の可変領域に外来性タンパク質をコードする遺伝子を挿入することで、改変型の種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。
【００２７】
内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の可変領域に外来性タンパク質をコードする遺伝子がフレームシフトを生じないように挿入された遺伝子から、内在性種子貯蔵タンパク質の内部に外来性タンパク質が融合した改変型の内在性種子貯蔵タンパク質を発現させることができる。
【００２８】
外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入された形質転換ダイズ植物に、さらに改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子を導入することによって、外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入されていない形質転換ダイズ植物に改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子を導入した場合よりも、導入された改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現産物を、より高いレベルで種子中に蓄積することが可能になる。
【００２９】
５．形質転換されるダイズ植物
本発明において形質転換され得るダイズ植物に特に制限はなく、一般に食用、飼料、油用として利用されている品種が含まれる。具体的にはJack、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２、エンレイ、スズユタカ、フクユタカ、トヨムスメ等が挙げられる。形質転換されるダイズ植物は、これらの品種が形質転換されたものであってもよい。
【００３０】
６．形質転換ダイズ植物の作製
本発明においては、ダイズ植物に導入する遺伝子を種子で発現させる必要があるが、該遺伝子の上流にダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターを連結した構造を有するベクターをダイズ植物に導入することでこの目的を達成することができる。さらに、該遺伝子の下流にターミネーターを連結させた構造を有するベクターを導入することもできる。
【００３１】
ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターとしては、例えばインゲンマメのアルセリンのプロモーター、ダイズの１１Ｓグロブリンのプロモーター等が挙げられ、ターミネーターとしては、インゲンマメのアルセリンのターミネーター、ダイズの１１Ｓグロブリンのターミネーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５ＳのターミネーターやＮＯＳターミネーター等が挙げられる。
【００３２】
前記ベクターには、組換え体を選抜するための選抜マーカー遺伝子や導入された遺伝子の発現を確認するためのレポーター遺伝子を挿入することができる。選抜マーカー遺伝子としては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、ホスフィノスリシン耐性遺伝子等が挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子や、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。
前記ベクターは、種子特異的な発現を誘導するプロモーターと、その下流に連結された目的の遺伝子と、さらにその下流に連結されたターミネーターを含むＤＮＡ断片を、前記選抜マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を含むベクターに挿入して得ることもできる。
【００３３】
本発明の形質転換ダイズ植物を作製するための材料としては、例えば、上記ダイズ植物の品種の根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、不定胚、プロトプラスト等の培養細胞等を用いることができる。
上記材料への外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子や、野生型又は改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の導入は、すでに報告され、確立されている種々の方法により行うことができるが、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイスカー超音波法などを用いて前記ベクターを導入することが好ましい。
【００３４】
遺伝子導入操作が行われた材料の中から、選抜マーカー遺伝子によってもたらされる耐性効果を指標に、形質転換ダイズ植物の細胞を選抜することができる。選抜した細胞から、既に報告されている周知の植物体を再生させる工程を経て、形質転換ダイズ植物体を得ることができる。
こうして得られた形質転換ダイズ植物体の栽培を行い、種子を稔実させることで、本発明に係る形質転換ダイズ植物の種子を得ることができ、種子中に目的とする内在性種子貯蔵タンパク質又は改変型の内在性種子貯蔵タンパク質を得ることができる。
【００３５】
ダイズ植物に目的の遺伝子が導入されているか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウエスタンブロッティング法などによって行うことができる。また、形質転換ダイズ植物の種子中に存在する内在性種子貯蔵タンパク質の含量を測定する方法は、ＳＤＳ電気泳動法、ウエスタンブロッティング法などによって行うことができる。例えば、形質転換ダイズ植物体の種子からタンパク質を抽出し、ＳＤＳ電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色などで染色を行うことにより蓄積量を確認することができる。
【００３６】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例で行われる実験操作の手順は、特に記述しない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」 第２版 (Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， １９８９年発行)に記載される方法に従っている。
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
［実施例１］
ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーター及びターミネーターの単離
（１）インゲンマメ野生種のゲノミックＤＮＡの調製
インゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ１２８６６）の生葉１ｇからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノミックＤＮＡ５０μｇを抽出した。
【００３９】
（２）インゲンマメ野生種からのアルセリン２遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡの単離
以下の記載されるアルセリン２遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域を含むＤＮＡの単離操作は、制限酵素処理を施したゲノミックＤＮＡ断片にアダプターを結合させ、既知配列とアダプター配列に基づいてプライマーを設計し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い未知の領域をクローニングするための市販されたキットである、株式会社ベックス製のＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTMを用いて実施した。
【００４０】
（i）第一回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＳａｕIIIＡIで消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。その後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−１アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、アルセリン２遺伝子の上流域のＤＮＡを単離するためのＰＣＲの鋳型とした。
【００４１】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号３及び配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＳＰ１及びプライマーＳＰ２と命名）を、株式会社ファスマックのカスタム合成受託サービスを利用して作製した。以降、特に記述がない限りプライマーの合成は、同社を利用して行った。
【００４２】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃、２分で１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを６５℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００４３】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
【００４４】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００４５】
この反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（i）とし、株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンシングサービスを用いて塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子の開始コドンの上流８４４ｂｐの新規な領域を含むことを確認した。以降、特に記述がない限り塩基配列の決定は同社のシーケンシングサービスを用いて行った。
次に、さらに上流域を単離するため、新たなプライマーを作製し第二回目となる伸長反応を行った。
【００４６】
（ii）第二回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＢｇｌIIで消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−１アダプターと連結反応を行い、プロモーター単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００４７】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ１と命名）を、また第一回伸長反応で得られた開始コドンの上流８４４ｂｐの塩基配列に基づき配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ２と命名）を作製した。
【００４８】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、上記（i）の第一回伸長反応と同条件で行った。
【００４９】
反応終了後、上記ＰＣＲ液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件である。
【００５０】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００５１】
反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（ii）とし塩基配列を決定した。その結果、Ａｒｃ２Ｐ（i）の上流１９７ｂｐ（合計１０４１ｂｐ）の新規な領域を含むことを確認した。次に、さらに上流域を単離するため、新たなプライマーを作製し第三回目となる伸長反応を行った。
【００５２】
（iii）第三回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＸｂａIで消化した後、ｄＣＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−２アダプターと連結反応を行い、プロモーター単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００５３】
次に、第二回伸長反応で得られた１９７ｂｐの塩基配列に基づき、配列番号７及び配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーｔｈｉｒｄＳＰ１及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ２と命名）を作製した。
【００５４】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、上記(i)の第一回伸長反応と同条件で行った。
【００５５】
反応終了後、上記反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件である。
【００５６】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００５７】
この反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（iii）とし、塩基配列を決定した。その結果、Ａｒｃ２Ｐ（ii）の上流２８１９ｂｐ（合計３８６０ｂｐ）の新規な領域を含むことを確認した。以上、三回の伸長反応によってアルセリン２遺伝子の開始コドンの上流５′側非翻訳領域を含む３８６０ｂｐの新規なプロモーター配列を含むＤＮＡを取得することができた（配列番号９）。アルセリン２遺伝子と相同性を有する公知の遺伝子であるアルセリン１（GenBank accession No.M68913）、アルセリン３（GenBank accession No.AX463292）、アルセリン４（GenBank accession No.AX463293）及びアルセリン５−１（GenBank accession No.Z50202）のプロモーター配列との相同性を調べた結果、いずれとの比較においても相同性は５５．４％以下であり、配列番号１に記載のＤＮＡは新規なアルセリンプロモーター配列を含むＤＮＡであることが明らかとなった。
【００５８】
（３）インゲンマメ野生種からのアルセリン２遺伝子のターミネーター配列を含むＤＮＡの単離
上記実施例１（１）で抽出したゲノミックＤＮＡ２８０ｎｇを制限酵素ＮｈｅIで消化した後、ｄＣＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−２アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、ターミネーター遺伝子の単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００５９】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号１０及び配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＳＰ３及びプライマーＳＰ４と命名）を作製した。
【００６０】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及プライマーＳＰ３を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを６５℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液は２００μMのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００６１】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その1μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＳＰ４を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
【００６２】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００６３】
反応産物を、Ａｒｃ２Ｔとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子の３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流７９５ｂｐの新規な領域を含むことを確認した（配列番号１２）。公知のアルセリン２遺伝子と相同な遺伝子であるアルセリン１（GenBank accession No.M68913）及びアルセリン５−１（GenBank accession No.Z50202）のターミネーター領域と相同性について検索した結果、いずれとの比較においても相同性は４９．１％以下であり、配列番号１２に記載のＤＮＡは新規なターミネーター配列を含むＤＮＡであることが明らかとなった。
【００６４】
［実施例２］
イネプロラミンの種子特異的発現ベクターの構築
（１）アルセリン２ゲノム遺伝子に相当するＤＮＡの合成と単離
上記実施例１（１）で抽出したゲノミックＤＮＡ８０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。配列番号９及び配列番号１２に記載された塩基配列に基づき、配列番号１３及び配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ２Ｐ及びプライマーＡｒｃ２Ｔと命名）を作製した。
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で４分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００６５】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００６６】
反応産物を、Ａｒｃ２ＰＣＴとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子、及びその５’側非翻訳領域を含む開始コドンの上流２４６１ｂｐのプロモーター領域を含み、且つ３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流７９５ｂｐの新規な領域を含むことを確認した（配列番号１５）。こうして得られた組換えベクターＡｒｃ２ＰＣＴを導入した大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ株式会社製）は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α/Ａｒｃ２ＰＣＴと命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2008年7月30日より、受託番号P-21624 として寄託されている。
【００６７】
（２）アルセリン２プロモーターを含む発現ベクターの作製
公知のイネの１０Ｋ（１０ｋDa）プロラミンであるＲＰ１０をコードする遺伝子を種子特異的に発現させるため、ＲＰ１０をコードする遺伝子と、上記実施例１で得られたＡｒｃ２ＰおよびＡｒｃ２Ｔを連結した発現プラスミドの構築を行った。
【００６８】
上記のＡｒｃ２ＰＣＴの１０ｎｇを鋳型として、プロモーター、ターミネーター及びベクター部分（アルセリン２遺伝子以外の部分）を増幅するＰＣＲを行った。配列番号１５の塩基配列に基づき、配列番号１６及び配列番号１７のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ２Ｐ３及びプライマーＡｒｃ２Ｔ５と命名）を作製した。
【００６９】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で６分３０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、1ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、アルセリン２遺伝子のプロモーター２４６１ｂｐとターミネーター７９５ｂｐ及びそれらの間にベクターの配列を含むＤＮＡ断片Ａｒｃ２ＰＴを得た。
【００７０】
次に、イネの１０ＫプロラミンであるＲＰ１０をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ０９７８２）（配列番号２）のｃＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）のＳｍａＩサイトにクローニングされている、プラスミドｐＢＳＫ−ＲＰ１０（独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、北海道農業研究センター保有）を鋳型として、ＲＰ１０をコードするＤＮＡ断片を得るため配列番号１８及び配列番号１９からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
【００７１】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μｌの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒及び伸長反応を６８℃で１分を１サイクルとして２５サイクル行った。こうして、ＲＰ１０をコードするＤＮＡ断片を得た。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００７２】
ＲＰ１０遺伝子断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、上記Ａｒｃ２ＰＴと連結反応を行った。こうして、ＲＰ１０遺伝子の上流にアルセリン２遺伝子のプロモーター２４６１ｂｐ及び下流にターミネーター７９５ｂｐを含む、種子特異的発現ベクターＡｒｃ２ＰＲＰ１０を作製した。
【００７３】
（３）アルセリン５プロモーターを含む発現ベクターの作製
イネの１０ＫプロラミンのＲＰ１０をコードする遺伝子を種子特異的に発現させるため、ＲＰ１０をコードする遺伝子と、種子特異的発現が認められている、公知のアルセリン５プロモーター及びターミネーター（国際公開ＷＯ０２／５０２９５号パンフレット）を連結した発現プラスミドの構築を行った。
【００７４】
インゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ０２７７１）の生葉１ｇからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノミックＤＮＡ５０μｇを抽出した。該ゲノミックＤＮＡ８０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。公知のインゲンマメアルセリン５−１遺伝子（GenBank accession No.Z50202）の塩基配列に基づき、配列番号２０及び配列番号２１の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ５Ｐ及びプライマーＡｒｃ５Ｔと命名）を作製した。
【００７５】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃３０秒、アニーリングを５７℃３０秒及び伸長反応６８℃４分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００７６】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。反応産物を、Ａｒｃ５ＰＣＴとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン５遺伝子、及びその５’側非翻訳領域を含む開始コドンの上流１８１８ｂｐのプロモーター領域を含み、且つ３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流１１９２ｂｐの領域を含むことを確認した。
【００７７】
上記で得たＡｒｃ５ＰＣＴの１０ｎｇを鋳型として、プロモーター、ターミネーター及びベクター部分（アルセリン５遺伝子以外の部分）を増幅するＰＣＲを行った。公知のアルセリン５−１遺伝子の塩基配列より、配列番号２２及び配列番号２３の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ５Ｐ３及びプライマーＡｒｃ５Ｔ５と命名）を作製した。
【００７８】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で６分３０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、1ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、アルセリン５遺伝子のプロモーター１８１８ｂｐ及びターミネーター１１９２ｂｐを含む遺伝子断片Ａｒｃ５ＰＴを得た。
【００７９】
これに、上記のリン酸化反応済みＲＰ１０遺伝子断片を連結して、ＲＰ１０遺伝子の上流にアルセリン５遺伝子のプロモーター１８１８ｂｐ及び下流にターミネーター１１９２ｂｐを含む、種子特異的発現ベクターＡｒｃ５ＰＲＰ１０を作製した。
【００８０】
（４）植物形質転換ベクターの構築
上記(２)、(３)で得られた、Ａｒｃ２ＰＲＰ１０およびＡｒｃ５ＰＲＰ１０を公知のｐＵＨＧベクター（ｐＵＨＧプラスミド）（Ｙ． Ｋｉｔａ，Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｍ. Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ． （２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｌｉｎｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２６：４３９−４４７）に連結し、植物形質転換ベクターの構築を行った。
【００８１】
Ａｒｃ２ＰＲＰ１０およびＡｒｃ５ＰＲＰ１０を制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで切断を行い、ｐＵＨＧベクターのＳｐｅＩ、ＳａｌＩサイトに連結反応を行い、植物形質転換ベクターｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＲＰ１０、ｐＵＨＧＡｒｃ５ＰＲＰ１０を作製した。すなわち、種子特異的発現ベクターＡｒｃ２ＰＲＰ１０およびＡｒｃ５ＰＲＰ１０の２μｇを制限酵素ＳｐｅＩ、ＳａｌＩの２０単位で３７℃、２時間切断した後、アガロース電気泳動を行い、Ａｒｃ２ＰＲＰ１０において約３．７ｋｂ、Ａｒｃ５ＰＲＰ１０において約３．４ｋｂの断片のみを切り出し、ジーンクリーンにより精製した。一方ｐＵＨＧプラスミド２μｇをＳｐｅＩ、ＳａｌＩ２０単位で３７℃、２時間切断した後、ジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）により精製した。夫々のＤＮＡフラグメントを、ＴａｋａｒａＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔにて、１６℃、３時間反応させた。
【００８２】
このようにしてプラスミドｐＵＨＧのＳｐｅＩ、ＳａｌＩ切断ＤＮＡフラグメントに、Ａｒｃ２ＰＲＰ１０由来の約３．７ｋｂのＳｐｅＩ、ＳａｌＩ切断フラグメントを、また同様にプラスミドｐＵＨＧのＳｐｅＩ、ＳａｌＩ切断ＤＮＡフラグメントに、Ａｒｃ５ＰＲＰ１０由来の約３．４ｋｂのＳｐｅＩ、ＳａｌＩ切断フラグメントを各々組み込んだ植物形質転換ベクターｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＲＰ１０及びｐＵＨＧＡｒｃ５ＰＲＰ１０（図１）を作製した。
また、ベクターコントロール区として公知のプラスミドｐＵＨＲＳＫ（Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ． Ｋｉｔａ， Ｍ. Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ．
（２００６）Ａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲｅｄ２，ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５：１３５５−１３６１）を用いた。
【００８３】
［実施例３］
植物形質転換ベクターのダイズへの導入及び形質転換ダイズ植物の作出
公知の方法（Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ， Ｙ． Ｋｉｔａ， Ｍ． Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ． （２００６） Ａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＤｓＲｅｄ２， ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５：１３５５−１３６１）により、ダイズ品種Ｊａｃｋの未熟種子から誘導された不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を１．５ｍｌ用のチューブに加え、ウイスカー超音波法（特許第３３１２８６7号）により遺伝子導入操作を行った。
【００８４】
チタン酸カリウム製ウイスカーＬＳ２０（チタン工業社製）５ｍｇを１．５ｍｌ容のチューブに入れ、１時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカーを得た。このウイスカーの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、良く攪拌した。ウイスカーと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカーを洗浄した。このウイスカー洗浄操作を３回行った。その後、同チューブに公知のＭＳ液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカー懸濁液を得た。
【００８５】
上記で得られたウイスカー懸濁液の入ったチューブに、上記の不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を入れて攪拌した後、混合物を１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、不定胚塊とウイスカーを沈殿させ、上清を捨て、不定胚塊とウイスカーの混合物を得た。
【００８６】
この混合物を入れたチューブに、ｐＵＨＧＡｒｃ５ＰＲＰ１０を２０μｌ（２０μg）加え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。
【００８７】
次にこの均一な混合物の入ったチューブを１８０００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３回反復した。
【００８８】
上記のようにして得られた、不定胚塊と、ウイスカーと、ベクターを収容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５Ｗ／ｃｍ2で１分間照射した。照射後、１０分間、４℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記のＭＳ液体培地で洗浄した。
【００８９】
処理後の不定胚塊を公知の不定胚増殖液体培地で1週間回転振とう培養し（１００ｒｐｍ）、その後にハイグロマイシンB（１５ｍｇ／ｌ）（ロッシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）を含んでいる新鮮な不定胚増殖液体培地で１週間培養した。さらに３０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンBを含んでいる不定胚増殖液体培地で４週間培養（毎週培地を交換する）した後、４５ｍｇ／ｌのハイグロマイシンBを含んだ不定胚増殖液体培地で1週間選抜培養を行った。なお、遺伝子導入は各ベクターごとにマイクロチューブ１２本の処理を行った。
【００９０】
ハイグロマイシン耐性の不定胚塊を公知の不定胚成熟液体培地へ移し、４週間振とう培養（１００ｒｐｍ）を継続し不定胚を成熟させた。成熟した不定胚を滅菌シャーレ中に３から５日間置き乾燥させた後、公知の発芽固体培地に移した。７から１０日間発芽培養を行った後、公知の発根培地に移し、発芽している幼植物体を成長させた。根と芽が伸びた後に、土壌を含んでいるポットへ植物を移し、順化するまで高湿度に維持した。
【００９１】
このようにしてＪａｃｋ品種にＡｒｃ５ＰＲＰ１０を導入した形質転換ダイズ植物を４系統作出した。
これらの形質転換ダイズの植物体は環境湿度に適応させた後、１００００ｌuｘ、１６時間日長の環境下で栽培を継続し、すべての個体から種子を収穫した。こうして、形質転換ダイズ植物のＴ１世代の種子を得た。
【００９２】
［実施例４］
（１）形質転換ダイズ種子における種子貯蔵タンパク質含量の評価
上記実施例３で得た形質転換ダイズ４系統から採取した種子より全タンパク質を抽出し、SDS電気泳動により各種子貯蔵タンパク質の分離を行い、CBB染色により各々の種子貯蔵タンパク質含量を評価した。
その結果、形質転換ダイズ種子の各系統にダイズの種子貯蔵タンパク質の７Sタンパク質のβ、α、α‘サブユニットおよび１１Sタンパク質のA鎖、B鎖の蓄積が確認できた。そのうち７Sタンパク質のβ、α、α’サブユニットが明らかに対照区Jack品種の蓄積量よりも高かった（図２）。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明により、形質転換ダイズ種子に内在性種子貯蔵タンパク質を効率的に生産、蓄積させることが可能になるので、ダイズの種子貯蔵タンパク質を大量に供給することが可能になる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入され、種子中で該遺伝子が発現している形質転換ダイズ植物であって、種子中での内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加している、形質転換ダイズ植物。
【請求項２】
外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が、ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターの下流に連結されて導入された、請求項１に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項３】
外来性種子貯蔵タンパク質がイネのプロラミンである、請求項１又は２に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項４】
内在性種子貯蔵タンパク質が、ダイズ１１Ｓグロブリン及び／又はダイズ７Ｓグロブリンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項５】
内在性種子貯蔵タンパク質が、ダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニットである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項６】
ダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニットをコードする遺伝子の可変領域に、外来性タンパク質をコードする遺伝子がフレームシフトを生じないように挿入された、改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子がさらに導入された、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項７】
改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターの下流に連結されて導入された、請求項６に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物の細胞。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物の種子。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物を用いて、その種子中で内在性種子貯蔵タンパク質を生産する方法。
【請求項１１】
請求項６又は７に記載の形質転換ダイズ植物を用いて、その種子中で改変型の内在性種子貯蔵タンパク質を生産する方法。
【請求項１】
不溶性の外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が導入され、種子中で該遺伝子が発現している形質転換ダイズ植物であって、種子中での内在性種子貯蔵タンパク質の蓄積量が増加している、形質転換ダイズ植物。
【請求項２】
外来性種子貯蔵タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子が、ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターの下流に連結されて導入された、請求項１に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項３】
外来性種子貯蔵タンパク質がイネのプロラミンである、請求項１又は２に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項４】
内在性種子貯蔵タンパク質が、ダイズ１１Ｓグロブリン及び／又はダイズ７Ｓグロブリンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項５】
内在性種子貯蔵タンパク質が、ダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニットである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項６】
ダイズ７Ｓグロブリンのβサブユニットをコードする遺伝子の可変領域に、外来性タンパク質をコードする遺伝子がフレームシフトを生じないように挿入された、改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子がさらに導入された、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項７】
改変型の内在性種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が、ダイズ種子特異的な発現を誘導するプロモーターの下流に連結されて導入された、請求項６に記載の形質転換ダイズ植物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物の細胞。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物の種子。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換ダイズ植物を用いて、その種子中で内在性種子貯蔵タンパク質を生産する方法。
【請求項１１】
請求項６又は７に記載の形質転換ダイズ植物を用いて、その種子中で改変型の内在性種子貯蔵タンパク質を生産する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−５５８０７（Ｐ２０１１−５５８０７Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１２３０４（Ｐ２００９−２１２３０４）
【出願日】平成２１年９月１４日（２００９．９．１４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、経済産業省、植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物利用高付加価値物質製造基盤技術開発委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１４日（２００９．９．１４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、経済産業省、植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物利用高付加価値物質製造基盤技術開発委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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