本明細書には、第７因子を減少させ、その必要がある個体における血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、または炎症状態を処置または予防するための、アンチセンス化合物および方法が開示される。第７因子を標的とするアンチセンス化合物の投与によって改善されうる病状の例には、血栓症、塞栓症、および血栓塞栓症、例えば深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、がん、慢性関節リウマチ、および線維症が含まれる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［配列表］
本願は電子形式の配列表と共に出願される。配列表は２００８年１１月５日に作成されたサイズ１８０Ｋｂのファイル（ファイル名：ＢＩＯＬ００９９ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔ）として提出される。配列表の電子形式での情報は参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明の実施形態は、動物における第７因子ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を減少させるための方法、化合物、および組成物を提供する。そのような方法、化合物および組成物は、血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、および炎症状態を処置し、予防し、または改善するのに役立つ。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
循環系は、不適切な血管内閉塞に対抗する機序だけでなく、失血を予防する機序も必要とする。一般に凝固は、結果として可溶性フィブリノゲンを不溶性フィブリンゲルに変換することになる反応のカスケードを含む。カスケードの各ステップでは、不活性なチモーゲンが活性化された酵素に変換される。そして、その活性酵素が、カスケード中の次のステップを触媒する。
【０００４】
凝固カスケード
凝固カスケードは、２つの分枝、すなわち主要経路である組織因子経路（「外因性経路」ともいう）と接触活性化経路（「内因性経路」ともいう）によって開始されうる。
【０００５】
組織因子経路は、細胞表面受容体である組織因子（ＴＦ、第ＩＩＩ因子ともいう）によって開始され、この受容体は、血管外細胞（周皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、およびケラチノサイト）によって構成的に発現され、炎症性サイトカインまたはエンドトキシンによる誘導時には、血管の単球および内皮細胞によって発現される（非特許文献１）。ＴＦは凝固第ＶＩＩａ因子（セリンプロテアーゼ）に対する高アフィニティ細胞受容体である。ＴＦが存在しない場合、ＶＩＩａの触媒活性は極めて低く、アロステリック機序によってＶＩＩａを機能的にするには、ＴＦへの結合が必要である（非特許文献１）。ＴＦ−ＶＩＩａ複合体は第Ｘ因子をＸａに活性化する。次にＸａはその補助因子である第Ｖａ因子と会合してプロトロンビナーゼ複合体を形成し、それが今度はプロトロンビン（第ＩＩ因子または第２因子とも呼ばれている）をトロンビン（第ＩＩａ因子または第２ａ因子とも呼ばれている）に活性化する。トロンビンは血小板を活性化し、フィブリノゲンをフィブリンに変換し、第ＸＩＩＩ因子を活性化することによってフィブリン架橋を促進し、そうすることで、ＴＦが血管外細胞に曝露された部位で安定な栓を形成させる。さらにトロンビンは、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子を活性化することにより、凝固カスケード応答を補強する。
【０００６】
接触活性化経路は、第ＸＩＩ因子が第ＸＩＩａ因子に活性化されることによってトリガーされる。第ＸＩＩａ因子はＸＩをＸＩａに変換し、ＸＩａはＩＸをＩＸａに変換する。ＩＸａは、その補助因子ＶＩＩＩａと会合して、ＸをＸａに変換する。第Ｘａ因子は第Ｖａ因子と会合してプロトロンビン（第ＩＩ因子）をトロンビン（第ＩＩａ因子）に活性化するので、２つの経路はこの点で集束する。
【０００７】
凝固の阻害
少なくとも３つの機序、すなわち、活性化プロテインＣ、アンチトロンビン、および組織因子経路インヒビターの作用が、凝固カスケードを抑制している。活性化プロテインＣは、補助因子ＶａおよびＶＩＩＩａを分解するセリンプロテアーゼである。プロテインＣはトロンビンとトロンボモジュリンの組み合わせによって活性化され、機能するには補酵素プロテインＳを必要とする。アンチトロンビンは、セリンプロテアーゼであるトロンビン、Ｘａ、ＸＩＩａ、ＸＩａおよびＩＸａを阻害するセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）である。組織因子経路インヒビターは、ＸａおよびＴＦ−ＶＩＩａ複合体の作用を阻害する（非特許文献２）。
【０００８】
疾患
血栓症は凝血塊の病的発生であり、塞栓症は凝血塊が身体の別の部分に移動して臓器機能を妨害する際に起こる。血栓塞栓症は、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中などの状態を引き起こしうる。重要なことに、血栓塞栓症は毎年２００万人を超えるアメリカ人を冒す主要な罹病原因である（非特許文献３）。血栓症の大半の症例は後天的な外因性の問題、例えば手術、がん、不動などによるものであるが、一部の症例は遺伝的素因、例えば抗リン脂質抗体症候群および常染色体優性異常、第Ｖ因子ライデンなどによるものである（非特許文献４）。
【０００９】
処置
最もよく使用される抗凝固剤であるワルファリン、ヘパリン、および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）はいずれも重大な短所を持っている。
【００１０】
ワルファリンは心房細動を患う患者を処置するために典型的に使用される。この薬物はビタミンＫ依存性凝固因子と相互作用し、これには第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子が含まれる。抗凝固プロテインＣおよびＳもワルファリンによって阻害される。ワルファリンを使った薬物治療は、ワルファリンが他の投薬、例えば心房細動の処置に使用されるアミオダロンなどの薬物と相互作用するという事実によって、さらにややこしくなる。ワルファリンによる治療は予測が困難であるので、異常出血の徴候を見逃さないように、患者を注意深く監視しなければならない。
【００１１】
ヘパリンは、トロンビンと第Ｘ因子の両方を阻害するアンチトロンビンを活性化することによって機能する（非特許文献５）。ヘパリンによる処置は、血小板を血管内で凝集させる免疫反応を引き起こす場合があり、それは血栓症につながりうる。この副作用はヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と呼ばれており、患者のモニタリングを必要とする。ヘパリンによる長期間にわたる処置は骨粗鬆症にもつながりうる。ＬＭＷＨは第２因子も阻害するが、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）ほどではない。ＬＭＷＨはＨＩＴの発生に関連づけられている。
【００１２】
このように現在の抗凝固剤は予測可能性および特異性を欠き、出血合併症などの有害副作用を予防するために注意深い患者のモニタリングを必要とする。内因性経路または外因性経路だけを標的とする抗凝固剤は、今のところない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｒａｋｅら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９８９，１３４：１０８７−１０９７
【非特許文献２】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＡＬら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ．１９９７；７：２３４−２３９
【非特許文献３】Ａｄｃｏｃｋら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１９９７；１０８：４３４−４９
【非特許文献４】Ｂｅｒｔｉｎａ ＲＭら，Ｎａｔｕｒｅ １９９４；３６９：６４−６７
【非特許文献５】Ｂｊｏｒｋ Ｉ，Ｌｉｎｄａｈｌ Ｕ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８２ ４８：１６１−１８２
【発明の概要】
【００１４】
［発明の概要］
ここでは、凝固障害を処置および予防するためのアンチセンス化合物、組成物、および方法が提供される。
【００１５】
本明細書に記載するアンチセンス化合物は、第７因子核酸を標的とする１２〜３０個のヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドを含みうる。ある実施形態において、第７因子核酸は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１９６１６．２、およびＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＤＢ１８４１４１．１に記載されている配列のどれであってもよい。
【００１６】
アンチセンス化合物は一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンス化合物は、第７因子核酸に１００、９５、９０、８５、８０、７５、または７０％相補的であってもよい。
【００１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合になるように修飾することができる。ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であってもよい。
【００１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含むように修飾することができる。修飾糖は二環式糖であってもよい。修飾糖は２’−Ｏ−メトキシエチルであってもよい。
【００１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含むように修飾することができる。修飾核酸塩基は５−メチルシトシンであってもよい。
【００２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは５−１０−５ＭＯＥギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなりうる。
【００２１】
本明細書に記載する組成物は、第７因子核酸を標的とする１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドまたはその塩と、医薬上許容される担体または希釈剤とを含みうる。
【００２２】
本組成物は一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２３】
本明細書に記載する方法は、第７因子核酸を標的とする１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドを含む化合物を、動物に投与することを含みうる。
【００２４】
化合物の投与は凝固を遅らせ、または停止させうる。本化合物は、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、およびワルファリンのどれとでも、併用投与することができる。本化合物と第２薬物の投与は同時に行うことができる。
【００２５】
本化合物および／または第２薬物の投与は非経口投与によって行うことができる。非経口投与は皮下投与または静脈内投与のいずれであってもよい。
【００２６】
もう１つの実施形態において、本明細書に記載する方法は、凝固障害を有するヒトを同定し、第７因子核酸を標的とする１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドを含む化合物の治療有効量をヒトに投与することも含みうる。
【００２７】
また、第７因子核酸をコードする配列番号１の核酸塩基１１４７〜１２２７、９１６９〜９２７８、１０９８２〜１１０５８、１１０７５〜１１１１７、１２０８４〜１２１１７、１２３８７〜１３７９６、１３８４７〜１３９０７、１４０１７〜１４０５１、１４０９３〜１４１３４、１４１７２〜１４２８７、１４３３１〜１４４０２、１４６６４〜１４７４６、１５０９８〜１５５７０、１５６０９〜１５８１９、１５８９９〜１５９０５、または１５９５７〜１５９８２の範囲内で結合するであろう１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む化合物も記載する。
【００２８】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは第７因子核酸をコードする配列番号１に９０、９５または１００％相補的であってもよい。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号１に完全に相補的であってもよい。
【００２９】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、もっぱら、第７因子核酸をコードする配列番号１の核酸塩基１１４７〜１２２７、９１６９〜９２７８、１０９８２〜１１０５８、１１０７５〜１１１１７、１２０８４〜１２１１７、１２３８７〜１３７９６、１３８４７〜１３９０７、１４０１７〜１４０５１、１４０９３〜１４１３４、１４１７２〜１４２８７、１４３３１〜１４４０２、１４６６４〜１４７４６、１５０９８〜１５５７０、１５６０９〜１５８１９、１５８９９〜１５９０５、または１５９５７〜１５９８２の範囲内でハイブリダイズしてもよい。
【００３０】
第７因子核酸をコードする配列番号２の核酸塩基１０２〜１３１または６５２〜６８２の範囲内で結合するであろう１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む化合物も記載する。
【００３１】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは第７因子核酸をコードする配列番号２に９０、９５、または１００％相補的であってもよい。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号２に完全に相補的であってもよい。
【００３２】
本化合物は、もっぱら、第７因子核酸をコードする配列番号２の核酸塩基１０２〜１３１または６５２〜６８２の範囲内でハイブリダイズしてもよい。
【００３３】
本発明の実施形態は、配列番号４〜１５９および１６８〜６１１の核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【００３４】
ある実施形態では、核酸塩基配列が配列番号５３である。
【００３５】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号１６７のいずれかの核酸塩基配列に、少なくとも８０％相補的である。
【００３６】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号１６７のいずれかの核酸塩基配列に、少なくとも９０％相補的である。
【００３７】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号１６７のいずれかの核酸塩基配列に、１００％相補的である。
【００３８】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップ（ｇａｐ）セグメント；
（ｉｉ）連結されたヌクレオシドからなる５’ウイング（ｗｉｎｇ）セグメント；
（ｉｉｉ）連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。
【００３９】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
（ｉｉ）５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
（ｉｉｉ）５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
【００４０】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが
（ｉ）１４個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
（ｉｉ）３個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
（ｉｉｉ）３個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
【００４１】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが
（ｉ）１３個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
（ｉｉ）２個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
（ｉｉｉ）５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
【００４２】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが
（ｉ）１２個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
（ｉｉ）２個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
（ｉｉｉ）２個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、ギャップセグメントが５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【００４３】
本発明の実施形態は、配列番号４〜１５９および１６８〜６１１のいずれかの核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドまたはその塩と、医薬上許容される担体または希釈剤とを含む組成物を提供する。
【００４４】
ある実施形態では、核酸塩基配列が配列番号５３である。
【００４５】
本発明の実施形態は、配列番号４〜１５９および１６８〜６１１のいずれかの核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを動物に投与することを含む方法を提供する。
【００４６】
ある実施形態では、核酸塩基配列が配列番号５３である。
【００４７】
ある実施形態では、動物がヒトである。
【００４８】
ある実施形態では、投与により、深部静脈血栓症が予防される。
【００４９】
ある実施形態では、投与により、肺塞栓症が予防される。
【００５０】
ある実施形態では、投与により、過剰増殖性障害が処置される。
【００５１】
ある実施形態では、投与により、炎症状態が処置される。
【００５２】
本発明の実施形態は、血栓塞栓性合併症を有するリスクがある動物を同定し、そのリスクがある動物に、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物の有効量を投与することを含み、その修飾オリゴヌクレオチドが第７因子核酸に相補的である方法を提供する。
【００５３】
ある実施形態では、血栓塞栓性合併症が深部静脈血栓症、肺塞栓症、またはそれらの組み合わせである。
【００５４】
本発明の実施形態は、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、その核酸塩基配列が、配列番号１のヌクレオチド１５１２８〜１５２２３の同じ数の核酸塩基に相補的な少なくとも１２個の連続する核酸塩基部分を含み、その修飾オリゴヌクレオチドが配列番号１に少なくとも８０％相補的である化合物を提供する。
【００５５】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが配列番号５３の核酸塩基配列を有する。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
［発明の詳細な説明］
上記の一般的説明および下記の詳細な説明はどちらも例示および解説に過ぎず、特許請求する発明を限定するものではないと理解すべきである。本明細書において、単数形の使用には、別段の明記がない限り、複数形が含まれる。本明細書で使用される「または（ｏｒ）」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらにまた、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに他の語形（「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」など）の使用は、限定ではないものとする。また、「エレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「コンポーネント（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、別段の明記がない限り、１つのユニットを含むエレメントおよびコンポーネントと、２つ以上のサブユニットを含むエレメントおよびコンポーネントを、どちらも包含する。
【００５７】
本明細書で使用するセクション見出しには構成上の目的しかなく、記載されている主題をセクション見出しが限定すると解釈してはならない。本願で言及されるすべての文書または文書の一部、例えば限定するわけではないが、特許、特許出願、論文、本、および専門書などは、その文書の本明細書で議論された部分について、ならびにそのすべてが、この一文をもって明白に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００５８】
定義
個別の定義を下さない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して使用される命名法ならびにその手順および技法は、当技術分野でよく知られ、よく使用されるものである。化学合成および化学分析には標準的な技法を使用することができる。可能である場合は、すべての特許、出願、出願公開および他の刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号および国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）などのデータベースから得ることができる関連する配列情報、ならびに本明細書の全体を通して言及される他のデータは、その文書の本明細書で議論された部分について、ならびにそのすべてが、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
別段の表示がない限り、以下の用語は次に挙げる意味を持つ。
【００６０】
「２’−Ｏ−メトキシエチル」（２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３ともいう）は、フロシル（ｆｕｒｏｓｙｌ）環の２’位のＯ−メトキシ−エチル修飾を指す。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。
【００６１】
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖成分を含むヌクレオチドを意味する。
【００６２】
「５−メチルシトシン」は、５’位に結合されたメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
【００６３】
「活性アンチセンス化合物」は、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
【００６４】
「同時に投与される」とは、両方の薬理学的効果が患者において同時に認められるような任意の方法による、２つの薬剤の併用投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を指す。同時投与（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、両方の薬剤が単一の医薬組成物、同じ剤形、または同じ投与経路で投与されることを必要としない。両方の薬剤の効果が同時に現われる必要はない。効果はある期間にわたって重複しているだけでよく、同一の広がりを持つ必要はない。
【００６５】
「投与する」とは、医薬剤を個体に与えることを意味し、例えば医療従事者による投与および自己投与が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６６】
「改善」とは、関連する疾患、障害、または状態の少なくとも１つの指標、徴候、または症状の減少を指す。指標の重症度は、当業者に知られている主観的尺度または客観的尺度によって決定することができる。
【００６７】
「動物」とは、ヒトまたは非ヒト動物を指し、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、および非ヒト霊長類（限定するわけではないが、サルおよびチンパンジーを含む）が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６８】
「解毒化合物」とは、何らかのアンチセンス活性の強さまたは持続期間を減少させる能力を有する化合物を指す。
【００６９】
「解毒オリゴヌクレオチド」とは、アンチセンス化合物に相補的であってそれとハイブリダイズする能力を有するオリゴヌクレオチドを含む解毒化合物を意味する。
【００７０】
「解毒タンパク質」とは、ペプチドを含む解毒化合物を意味する。
【００７１】
「抗体」とは、何らかの方法で抗原と特異的に反応することを特徴とする分子を指し、抗体と抗原は互いに他方との関係において定義される。抗体とは、完全な抗体分子またはその任意のフラグメントもしくは領域、例えば重鎖、軽鎖、Ｆａｂ領域、およびＦｃ領域を指しうる。
【００７２】
「アンチセンス活性」とは、アンチセンス化合物のその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因すると考えられる、任意の検出可能または測定可能な活性を意味する。ある実施形態では、アンチセンス活性が、標的核酸またはそのような標的核酸によってコードされるタンパク質の量または発現の減少である。
【００７３】
「アンチセンス化合物」とは、水素結合による標的核酸へのハイブリダイゼーションを起こす能力を有するオリゴマー化合物を意味する。
【００７４】
「アンチセンス阻害」とは、アンチセンス化合物の非存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比較した、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の存在下での、標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの減少を意味する。
【００７５】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸の対応する領域またはセグメントへのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００７６】
「二環式糖」とは、２つの非ジェミナル環原子の架橋によって修飾されたフロシル環を意味する。二環式糖は修飾糖である。
【００７７】
「二環式核酸」または「ＢＮＡ」または「二環式ヌクレオシド」または「二環式ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース部分がフラノース環上の２つの炭素原子を連結する架橋を含み、その結果、二環式の環系を形成しているヌクレオシドまたはヌクレオチドを指す。本明細書で使用する用語「メチレンオキシＢＮＡ」は、別段の表示がない限り、それだけで、β−Ｄ−メチレンオキシＢＮＡを指す。
【００７８】
「キャップ構造」または「末端キャップ成分」とは、アンチセンス化合物のどちらかの末端に組み込まれている化学修飾を意味する。
【００７９】
「化学的に異なる領域」とは、同じアンチセンス化合物の別の領域とは何らかの形で化学的に相違している、アンチセンス化合物の領域を指す。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴わないヌクレオチドを有する領域とは、化学的に異なる。
【００８０】
「キメラアンチセンス化合物」とは、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有し、それぞれの位置が複数のサブユニットを有する、アンチセンス化合物を意味する。
【００８１】
「併用投与」とは、１つの個体に２つ以上の医薬剤を投与することを意味する。それら２つ以上の医薬剤は単一の医薬組成物中にあってもよいし、別々の医薬組成物中にあってもよい。２つ以上の医薬剤のそれぞれは、同じ経路または異なる経路で投与することができる。併用投与は並行投与または逐次投与を包含する。
【００８２】
「凝固因子」とは、血液凝固カスケード中の第Ｉ因子、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第ＩＶ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、または第ＸＩＩＩ因子のいずれかを意味する。「凝固因子核酸」とは、凝固因子をコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある実施形態では、凝固因子核酸として、凝固因子をコードするＤＮＡ配列（イントロンおよびエキソンを含むゲノムＤＮＡを含む）、凝固因子をコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ配列、および凝固因子をコードするｍＲＮＡ配列が挙げられるが、これらに限るわけではない。「凝固因子ｍＲＮＡ」とは、凝固因子タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００８３】
「相補性」とは、第１核酸と第２核酸の核酸塩基間で対を形成する能力を意味する。
【００８４】
「連続核酸塩基」とは、互いに直接隣接している核酸塩基を意味する。
【００８５】
「希釈剤」とは、薬理学的活性は持たないが、薬学的に必要または望ましい組成物中の構成要素を意味する。例えば、注射される薬物において、希釈剤は液体、例えば食塩溶液であることができる。
【００８６】
「用量」とは、１回の投与で与えられる、または指定された期間内に与えられる、医薬剤の指定された量を意味する。ある実施形態では、ある用量を、１つ、２つ、またはそれ以上のボーラス（ｂｏｌｕｓｅ）、錠剤、または注射剤として投与することができる。例えば、皮下投与が望まれるいくつかの実施形態では、所望する用量が１回の注射では容易に対応できない体積を要求するので、所望する用量を達成するために２回以上の注射を使用することができる。ある実施形態では、医薬剤が、長期間にわたる注入、または持続注入によって投与される。用量は、１時間、１日、１週間、または１ヶ月あたりの医薬剤の量として指定することができる。
【００８７】
「効力」とは、所望の効果を生じさせる能力を意味する。「有効量」とは、その薬剤を必要とする個体において所望の生理学的帰結をもたらすのに十分な、活性医薬剤の量を意味する。有効量は、処置される個体の健康状態および身体状態、処置される個体の分類群、組成物の処方、その個体の医学的状態の評価、および他の関連因子に依存して、個体間で変動しうる。
【００８８】
「第７因子核酸」または「第ＶＩＩ因子核酸」とは、第７因子をコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある実施形態では、第７因子核酸として、第７因子をコードするＤＮＡ配列、第７因子をコードするＤＮＡ（イントロンおよびエキソンを含むゲノムＤＮＡを含む）から転写されたＲＮＡ配列、および第７因子をコードするｍＲＮＡ配列が挙げられるが、これらに限るわけではない。「第７因子ｍＲＮＡ」とは、第７因子タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００８９】
「第７因子特異的インヒビター」とは、第７因子ｍＲＮＡおよび／または第７因子タンパク質の発現を分子レベルで特異的に阻害する能力を有する任意の薬剤を指す。例えば、第７因子特異的インヒビターには、第７因子ｍＲＮＡおよび／または第７因子タンパク質の発現を阻害する能力を有する核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、その他の薬剤が含まれる。ある実施形態では、第７因子特異的インヒビターは、第７因子ｍＲＮＡ発現および／または第７因子タンパク質発現を特異的に調節することにより、凝固カスケードの、下流コンポーネントを含む他のコンポーネントに影響を及ぼしうる。同様に、ある実施形態では、第７因子特異的インヒビターが、動物における他の分子プロセスに影響を及ぼしうる。
【００９０】
「第７因子特異的インヒビター解毒剤」とは、第７因子特異的インヒビターの効果を減少させる能力を有する化合物を意味する。ある実施形態では、第７因子特異的インヒビター解毒剤が、第７因子ペプチド、第７因子解毒オリゴヌクレオチド（第７因子アンチセンス化合物に相補的な第７因子解毒化合物を含む）；および内因性または外因性凝固系路に影響を及ぼす任意の化合物またはタンパク質から選択される。
【００９１】
「完全に相補的」または「１００％相補的」とは、第１核酸の各核酸塩基が第２核酸中に相補的核酸塩基を有することを意味する。ある実施形態では、第１核酸がアンチセンス化合物であり、標的核酸が第２核酸である。そのような実施形態のいくつかでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが第１核酸であり、標的核酸が第２核酸である。
【００９２】
「ギャップマー」とは、ＲＮａｓｅＨ切断をサポートする複数のヌクレオチドを有する内部位置が、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる１つ以上のヌクレオチドを有する外側領域の間に配置される、アンチセンス化合物である。「ギャップセグメント」とは、ギャップマーの内部領域を構成する複数のヌクレオチドを意味する。「ウイングセグメント」とは、ギャップマーの外側領域を意味する。
【００９３】
「ギャップ拡大型（ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）」とは、１〜６個のヌクレオシドを有する５’および３’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置する１２個以上の連続２’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有する、キメラアンチセンス化合物を意味する。
【００９４】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。ある実施形態では、相補的核酸分子としてアンチセンス化合物と標的核酸が挙げられるが、これらに限るわけではない。そのような実施形態のいくつかでは、相補的核酸分子として、アンチセンスオリゴヌクレオチドと核酸標的が挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００９５】
「過剰増殖性障害」とは、細胞の異常な増殖または病的な増殖を特徴とする障害、例えば、がん、乾癬、過形成などを指す。
【００９６】
「血栓塞栓性合併症のリスクがある動物を同定する」とは、血栓塞栓性合併症と診断された動物を同定すること、または血栓塞栓性合併症を発生させる素因がある動物を同定することを意味する。血栓塞栓性合併症を発生させる素因がある個体には、不動、手術（特に整形外科）、悪性病変、妊娠、高齢、経口避妊薬の使用、および先天性または後天性の血栓形成促進性凝固障害を含む血栓塞栓性合併症のリスク因子を１つ以上有するものが含まれる。そのような同定は、個体の病歴の評価および標準的臨床検査または臨床的評価を含む任意の方法によって達成することができる。
【００９７】
「直接隣接」とは、直接隣接するエレメント間に介在エレメントが存在しないことを意味する。
【００９８】
「個体」とは、処置または治療のために選択されるヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００９９】
「その必要がある個体」とは、処置または治療のために選択される、そのような処置または治療を必要とするヒトまたは非ヒト動物を指す。
【０１００】
「炎症状態」とは、炎症をもたらす疾患、病状、症候群、または他の状態を指す。例えば、慢性関節リウマチおよび肝線維症は炎症状態である。炎症状態の他の例として、敗血症、心筋虚血／再灌流傷害、成人呼吸窮迫症候群、腎炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、動脈硬化、および血管炎が挙げられる。
【０１０１】
「ヌクレオシド間結合」とは、ヌクレオシド間の化学結合を指す。
【０１０２】
「連結されたヌクレオシド」とは、互いに結合された隣接ヌクレオシドを意味する。
【０１０３】
「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」とは、第２核酸または標的核酸の対応する核酸塩基と対を形成する能力を持たない第１核酸の核酸塩基を意味する。
【０１０４】
「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然のヌクレオシド間結合（すなわちホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換および／または何らかの変化を指す。
【０１０５】
「修飾核酸塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外の任意の核酸塩基を指す。「非修飾核酸塩基」とは、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。
【０１０６】
「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖成分、修飾ヌクレオシド間結合、または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖成分または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。
【０１０７】
「修飾オリゴヌクレオチド」とは、修飾ヌクレオシド間結合、修飾糖、および／または修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１０８】
「修飾糖」とは、天然糖からの置換および／または何らかの変化を指す。「修飾糖成分」とは、天然糖成分からの何らかの置換および／または変化を有する糖成分を意味する。
【０１０９】
「モチーフ」とは、アンチセンス化合物における非修飾ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドのパターン、すなわちアンチセンス化合物における化学的に異なる領域のパターンを意味する。
【０１１０】
「天然のヌクレオシド間結合」とは、３’→５’ホスホジエステル結合を意味する。
【０１１１】
「天然糖成分」とは、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）に見いだされる糖を意味する。
【０１１２】
「核酸」とは、ヌクレオチド単量体で構成された分子を指す。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。
【０１１３】
「核酸塩基」とは、もう１つの核酸の塩基と対を形成する能力を有する複素環式成分を意味する。
【０１１４】
「核酸塩基配列」とは、糖、結合、および／または核酸塩基修飾にはかまわず、連続核酸塩基の順序を意味する。
【０１１５】
「ヌクレオシド」とは、糖に連結された核酸塩基を意味する。
【０１１６】
「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
【０１１７】
「オリゴマー化合物」または「オリゴマー」とは、核酸分子の少なくとも一領域にハイブリダイズする能力を有する、連結されたモノマーサブユニットを含むポリマーを意味する。
【０１１８】
「オリゴヌクレオチド」とは、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味し、ヌクレオシドのそれぞれは、互いに独立して、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。
【０１１９】
「非経口投与」とは、注射または注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば髄腔内もしくは脳室内投与が含まれるが、これらに限るわけではない。「皮下投与」とは、皮膚のすぐ下への投与を意味する。「静脈内投与」とは、静脈中への投与を意味する。
【０１２０】
「ペプチド」とは、少なくとも２つのアミノ酸をアミド結合で連結することによって形成される分子を意味する。ペプチドとはポリペプチドおよびタンパク質を指す。
【０１２１】
「医薬剤」とは、個体に投与された時に治療上の利益をもたらす物質を意味する。例えば、ある実施形態では、第７因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが医薬剤である。「活性医薬剤」とは、所望の効果をもたらす、医薬組成物中の１または複数の物質を意味する。
【０１２２】
「医薬組成物」とは、個体に投与するのに適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドと滅菌された水性溶液を含みうる。
【０１２３】
「医薬上許容される塩」とは、アンチセンス化合物の生理上および医薬上許容される塩、すなわち親オリゴヌクレオチドの望ましい生物学的活性を保っており、それに望ましくない毒性効果を付与しない塩を意味する。
【０１２４】
「ホスホロチオエート結合」とは、非架橋酸素原子の１つを硫黄原子で置き換えることによってホスホジエステル結合が修飾されているヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は修飾ヌクレオシド間結合である。
【０１２５】
「部分」とは、ある核酸の所定の数の連続（すなわち連結された）核酸塩基を意味する。ある実施形態では、部分が、標的核酸の所定の数の連続核酸塩基である。ある実施形態では、部分が、アンチセンス化合物の所定の数の連続核酸塩基である。
【０１２６】
「予防」とは、疾患、障害または状態の発症または発生を、数分から無期限までの期間、遅延させまたは未然に防ぐことを指す。「予防」とは、疾患、障害、または状態が発生するリスクを低下させることも意味する。
【０１２７】
「プロドラッグ」とは、内在性酵素もしくは他の化学物質の作用または状態により、体内またはその細胞内で、活性型（すなわち薬物）に変換されるような不活性型として製造される、治療剤を意味する。
【０１２８】
「副作用」とは、処置に起因すると考えられる、所望の効果以外の生理学的応答を意味する。ある実施形態では、副作用として、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、ミオパシー、および倦怠感が挙げられるが、これらに限るわけではない。例えば血清中のアミノトランスフェラーゼレベルの増加は肝毒性または肝機能異常を示しうる。例えばビリルビンの増加は、肝毒性または肝機能異常を示しうる。
【０１２９】
「一本鎖オリゴヌクレオチド」とは、相補鎖にハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを意味する。「一本鎖修飾オリゴヌクレオチド」とは、相補鎖にハイブリダイズしていない修飾オリゴヌクレオチドを意味する。
【０１３０】
「特異的にハイブリダイズ可能な」とは、標的核酸にハイブリダイズして所望の効果を誘発する一方、非標的核酸にはごくわずかな効果しか示さないか、全く効果を示さない、アンチセンス化合物を意味する。例えば、特異的にハイブリダイズ可能なとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に所望の効果を誘発するのに十分な相補性度を有する一方、特異的結合が望まれる条件下で、すなわちインビボアッセイおよび治療的処置の場合であれば生理的条件下で、非標的核酸にはごくわずかな効果しか示さないか、または全く効果を示さない、アンチセンス化合物を指す。
【０１３１】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、アンチセンス化合物などの核酸分子が、標的核酸配列にハイブリダイズするが、それ以外は、ごくわずかな数の配列にしかハイブリダイズしないような条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況が異なれば異なるだろう。本発明の場合、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズするストリンジェントな条件は、オリゴマー化合物の性質および組成、ならびにそれらを調べようとしているアッセイによって決まる。
【０１３２】
「標的とする」または「を標的とする」とは、アンチセンス化合物が標的核酸に特異的にハイブリダイズして所望の効果を誘発することが可能になるような核酸塩基配列を有することを意味する。ある実施形態では、所望の効果が、標的核酸の減少である。ある実施形態では、所望の効果が第７因子ｍＲＮＡの減少である。
【０１３３】
「標的化」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズして所望の効果を誘発するようなアンチセンス化合物の設計と選択のプロセスを意味する。
【０１３４】
「標的核酸」「標的ＲＮＡ」「標的ＲＮＡ転写物」および「核酸標的」とは、いずれも、アンチセンス化合物によって標的とされうる核酸を意味する。
【０１３５】
「標的セグメント」とは、アンチセンス化合物が標的とする標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。
【０１３６】
「標的領域」または「活性標的領域」とは、１つ以上のアンチセンス化合物が標的とする、標的核酸の部分を意味する。
【０１３７】
「治療有効量」とは、個体に治療上の利益をもたらす医薬剤の量を意味する。
【０１３８】
「血栓塞栓性合併症」とは、血栓によって引き起こされる塞栓症が関わる任意の疾患、障害、または状態を意味する。そのような疾患、障害、および状態の例には、血栓症、塞栓症、および血栓塞栓症のカテゴリーが含まれる。ある実施形態では、そのような疾患障害、および状態には、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中が含まれる。
【０１３９】
「処置する」とは、疾患、障害、または状態の変化または改善が達成されるように医薬組成物を投与することを指す。
【０１４０】
「非修飾ヌクレオチド」とは、天然の核酸塩基、糖成分、およびヌクレオシド間結合で構成されたヌクレオチドを意味する。ある実施形態では、非修飾ヌクレオチドがＲＮＡヌクレオチド（すなわちβ−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわちβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
【０１４１】
いくつかの実施形態
本発明の実施形態は、第７因子ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節するための方法、化合物、および組成物を提供する。ある実施形態では、第７因子ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を減少させる。ある実施形態では、第７因子特異的インヒビターが、第７因子ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節する。ある実施形態では、第７因子特異的インヒビターが核酸、タンパク質、または小分子である。
【０１４２】
ある実施形態では、調節が細胞内または組織内で起こりうる。ある実施形態では、その細胞または組織が動物中にある。ある実施形態では、その動物がヒトである。ある実施形態では、第７因子ｍＲＮＡレベルを低下させる。ある実施形態では、第７因子タンパク質レベルを低下させる。そのような低下は時間依存的または用量依存的に起こりうる。
【０１４３】
本発明の実施形態は、その必要がある個体における第７因子に関連する疾患、障害、および状態を処置し、予防し、または改善するための方法、化合物、および組成物を提供する。ある実施形態では、そのような疾患、障害、および状態が血栓塞栓性合併症である。そのような血栓塞栓性合併症には、血栓症、塞栓症、および血栓塞栓症のカテゴリーが含まれる。ある実施形態では、そのような血栓塞栓性合併症に、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中が含まれる。
【０１４４】
そのような疾患、障害、および状態は、１つ以上のリスク因子、原因、または帰結を、共通して有しうる。血栓塞栓性合併症の発生に関するいくつかのリスク因子および原因には、不動、手術（特に整形外科）、悪性病変、妊娠、高齢、経口避妊薬の使用、心房細動、血栓塞栓性合併症の既往、慢性炎症性疾患、および先天性または後天性の血栓形成促進性凝固障害が含まれる。血栓塞栓性合併症の発生に関連するいくつかの帰結には、患部血管を通過する血流量の減少、組織の死、および個体の死が含まれる。過剰増殖性障害の発生に関するいくつかのリスク因子および原因には、先天性であっても先天性でなくてもよい遺伝因子、例えば遺伝子突然変異および染色体異常、ならびに環境因子（これには、既知の突然変異原、例えば放射性元素からの高エネルギー放射線、Ｘ線、γ線、マイクロ波、および紫外線；ある種の工業用化学薬品；タバコの煙などの汚染物質；ある種の農薬；薬物、およびウイルスなどへの曝露が含まれるが、これに限るわけではない）が含まれる。過剰増殖性障害の発生に関連するいくつかの帰結には、個体における非悪性腫瘍、前悪性腫瘍および悪性組織が含まれる。炎症状態の発生に関するいくつかのリスク因子および原因には、基礎をなす病態生理学的状態に対する細胞応答を引き起こす任意の侵害刺激が含まれ、これには、細菌感染およびウイルス感染、ならびにアレルゲンが含まれるが、これらに限るわけではない。炎症は、宿主のマクロファージ、Ｔリンパ球、内皮細胞が分泌するサイトカインによって媒介される。炎症状態の発生に関連するいくつかの帰結には、患部区域における発赤、疼痛、膨潤、機能の喪失、個体の罹病および死亡が含まれる。
【０１４５】
ある実施形態では、処置の方法が、その必要がある個体に第７因子特異的インヒビターを投与することを含む。
【０１４６】
ある実施形態では、本発明は、第７因子に関連する疾患、障害、または状態を処置し、予防し、または改善するための医薬品を製造するための方法および化合物を提供する。第７因子関連疾患、障害、および状態には、血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、および炎症状態が含まれる。血栓塞栓性合併症には、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中が含まれる。過剰増殖性障害にはがんが含まれる。炎症状態には慢性関節リウマチおよび線維症が含まれる。
【０１４７】
本発明の実施形態は、第７因子関連疾患の処置、予防、または改善に使用するための第７因子特異的インヒビターを提供する。ある実施形態では、第７因子特異的インヒビターが、第７因子ｍＲＮＡおよび／または第７因子タンパク質の発現を阻害する能力を有する核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、および他の薬剤である。
【０１４８】
本発明の実施形態は、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中などの血栓塞栓性合併症の処置、予防または改善に使用するための、本明細書に記載する第７因子特異的インヒビターを提供する。
【０１４９】
本発明の実施形態は、本明細書に記載する追加の薬剤または治療との併用療法によって、本明細書に記載する血栓塞栓性合併症を処置し、予防し、または改善する際に使用するための、本明細書に記載する第７因子特異的インヒビターを提供する。薬剤または治療は、併用投与または同時投与することができる。
【０１５０】
本発明の実施形態は、本明細書に記載する追加の薬剤または治療との併用療法によって、本明細書に記載する血栓塞栓性合併症を処置し、予防し、または改善する際に使用するための医薬品の製造における、本明細書に記載する第７因子特異的インヒビターの使用を提供する。薬剤または治療は、併用投与または同時投与することができる。
【０１５１】
本発明の実施形態は、本明細書に記載する追加の薬剤または治療が引き続いて投与される患者における本明細書に記載する血栓塞栓性合併症を処置し、予防し、または改善するための医薬品の製造における、本明細書に記載する第７因子特異的インヒビターの使用を提供する。
【０１５２】
本発明の実施形態は、本明細書に記載する血栓塞栓性合併症を処置し、予防し、または改善するためのキットであって、
（ｉ）本明細書に記載する第７因子特異的インヒビター；または
（ｉｉ）本明細書に記載する追加の薬剤または治療
を含むキットを提供する。
【０１５３】
本発明のキットは、さらに、本明細書に記載する血栓塞栓性合併症を本明細書に記載する併用療法によって処置し、予防し、または改善するために本キットを使用するための説明書を含みうる。
【０１５４】
本発明の実施形態は、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物を提供する。ある実施形態では、ヒト第７因子核酸が、１２５５０００〜１２７３０００で切り取られたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６（本明細書には配列番号１として組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０１９６１６．２（本明細書には配列番号２として組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＤＢ１８４１４１．１（本明細書には配列番号３として組み込まれる）、およびＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００１３１．３（本明細書には配列番号１６７として組み込まれる）に記載されている配列のいずれかである。ある実施形態では、アカゲザル第７因子核酸が、ヌクレオチド６９１０００〜７０６０００で切り取られたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＷ＿００１１０４５０７．１（本明細書には配列番号１６２として組み込まれる）およびＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号３３６０＿０６１＿Ｂ（本明細書には配列番号１６３として組み込まれる）に記載されている配列のいずれかである。ある実施形態では、マウス第７因子核酸が、ヌクレオチド１００２４０００〜１００３７０００で切り取られたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０３９４５５．６（本明細書には配列番号１６０として組み込まれる）に記載されている配列である。
【０１５５】
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチドミメティック、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡが含まれるが、これらに限るわけではない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であることができる。すなわち、水素結合を介した標的核酸へのハイブリダイゼーションを起こす能力を有する。
【０１５６】
ある実施形態では、アンチセンス化合物が、５’→３’方向に記載した場合に、それが標的とする標的核酸の標的セグメントの逆相補的配列を含む核酸塩基配列を有する。そのような実施形態のいくつかでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’→３’方向に記載した場合に、それが標的とする標的核酸の標的セグメントの逆相補的配列を含む核酸塩基配列を有する。
【０１５７】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が、１２〜３０サブユニット長である。言い換えると、アンチセンス化合物は１２〜３０個の連結されたサブユニットである。別の実施形態では、アンチセンス化合物が８〜８０、１２〜５０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、または２０個の連結されたサブユニットである。そのような実施形態のいくつかでは、アンチセンス化合物が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０連結サブユニット長であるか、上記の値の任意の２つによって規定される範囲である。いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、連結されたサブユニットがヌクレオチドである。
【０１５８】
ある実施形態において、第７因子核酸を標的とする短縮型または切断型アンチセンス化合物では、５’端（５’トランケーション）または３’端（３’トランケーション）から１個のサブユニットが削除されている。第７因子核酸を標的とする短縮型または切断型アンチセンス化合物では、アンチセンス化合物の５’端から２つのサブユニットが削除されているか、あるいはアンチセンス化合物の３’端から２つのサブユニットが削除されていてもよい。あるいは、例えば５’端から１個のヌクレオシドが削除され、３’端から１個のヌクレオシドが削除されているアンチセンス化合物のように、削除されるヌクレオシドがアンチセンス化合物の全体に分散していてもよい。
【０１５９】
延長型アンチセンス化合物に１個の追加サブユニットが存在する場合、その追加サブユニットは、アンチセンス化合物の５’端または３’端に位置することができる。２つ以上の追加サブユニットが存在する場合、追加されるサブユニットは、例えばアンチセンス化合物の５’端（５’付加）または３’端（３’付加）に２個のサブユニットが付加されているアンチセンス化合物のように、互いに隣接していてもよい。あるいは、追加されるサブユニットは、例えば５’端に付加された１個のサブユニットと３’端に付加された１個のサブユニットとを有するアンチセンス化合物のように、アンチセンス化合物の全体にわたって分散していてもよい。
【０１６０】
活性を排除することなく、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物の長さを増加または減少させること、および／またはミスマッチ塩基を導入することが可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７３０５−７３０９，１９９２）では、１３〜２５核酸塩基長の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、卵母細胞注入モデルにおいて標的ＲＮＡの切断を誘発するその能力について試験された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端近くに８個または１１個のミスマッチ塩基を有する２５核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも程度は低いものの、標的ｍＲＮＡの特異的切断を指示することができた。同様に、１３核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド（１個または３個のミスマッチを有するものを含む）を使って、標的特異的切断が達成された。
【０１６１】
Ｇａｕｔｓｃｈｉら（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１，Ｍａｒｃｈ ２００１）は、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに対して１００％の相補性を有し、かつｂｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡに対して３個のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが、インビトロおよびインビボで、ｂｌｃ−２とｂｃｌ−ｘＬの両方の発現を減少させうることを証明した。さらにまた、このオリゴヌクレオチドは、インビボで強力な抗腫瘍活性を示した。
【０１６２】
ＭａｈｅｒおよびＤｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８）は、一連のタンデム１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれ２個または３個のタンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列で構成される２８および４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ウサギ網状赤血球アッセイでヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させるその能力について試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれは、２８または４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも控えめなレベルではあるものの、それだけで翻訳を阻害することができた。
【０１６３】
アンチセンス化合物モチーフ
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が、アンチセンス化合物に、阻害活性の強化、標的核酸に対する結合アフィニティの増加、またはインビボでのヌクレアーゼによる分解に対する耐性などの性質を付与するようなパターンまたはモチーフで配置された、化学修飾されたサブユニットを有する。
【０１６４】
キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、標的核酸に対する結合アフィニティの増加、および／または阻害活性の増加が付与されるように修飾された、少なくとも１つの領域を含有する。キメラアンチセンス化合物の第２の領域は、場合によっては、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅＨの基質として役立ちうる。
【０１６５】
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物はキメラアンチセンス化合物であるとみなされる。ギャップマーでは、ＲＮａｓｅＨ切断をサポートする複数のヌクレオチドを有する内部領域が、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外側領域の間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは標的核酸の切断をサポートし、一方、ウイングセグメントは安定性、アフィニティ、およびエキソヌクレアーゼ耐性を強化するための修飾ヌクレオシドを含む。ある実施形態では、ギャップマーの領域が、異なる領域のそれぞれを構成する糖成分のタイプによって区別される。ギャップマーの領域を区別するために用いられる糖成分のタイプとして、いくつかの実施形態では、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（そのような２’−修飾ヌクレオシドとして、例えば２’−ＭＯＥ、および２’−Ｏ−ＣＨ_３などを挙げることができる）、および二環式糖修飾ヌクレオシド（そのような二環式糖修飾ヌクレオシドとして、例えば４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎ＝１またはｎ＝２）を有するものを挙げることができる）を挙げることができる。好ましくは、異なる領域のそれぞれは一様な糖成分を含む。ウイング−ギャップ−ウイングモチーフはしばしば「Ｘ−Ｙ−Ｚ」という形で記載されるが、その場合、「Ｘ」は５’ウイング領域の長さを表し、「Ｙ」はギャップ領域の長さを表し、「Ｚ」は３’ウイング領域の長さを表す。本明細書において「Ｘ−Ｙ−Ｚ」という形で記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントのそれぞれに直接隣接して位置するような構成を有する。したがって、５’ウイングセグメントとギャップセグメントの間またはギャップセグメントと３’ウイングセグメントの間には、介在ヌクレオチドが存在しない。本明細書に記載するアンチセンス化合物はいずれもギャップマーモチーフを有することができる。いくつかの実施形態ではＸとＺが同じであり、別の実施形態ではそれらが異なる。好ましい一実施形態では、Ｙが８〜１５ヌクレオチドである。Ｘ、ＹまたはＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０ヌクレオチド、またはそれ以上のいずれであってもよい。したがって、本発明のギャップマーには、例えば５−１０−５、４−８−４、４−１２−３、４−１２−４、３−１４−３、２−１３−５、２−１６−２、１−１８−１、３−１０−３、２−１０−２、１−１０−１または２−８−２が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１６６】
ある実施形態では、アンチセンス化合物が、ウイング−ギャップまたはギャップ−ウイング構成（すなわちギャップマー構成に関して上述したＸ−ＹまたはＹ−Ｚの構成）を有する「ウイングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）」モチーフを有する。したがって、本発明のウイングマー構成には、例えば５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、または５−１３が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１６７】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が５−１０−５ギャップマーモチーフを有する。
【０１６８】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が３−１４−３ギャップマーモチーフを有する。
【０１６９】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が２−１３−５ギャップマーモチーフを有する。
【０１７０】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が２−１２−２ギャップマーモチーフを有する。
【０１７１】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物がギャップ拡大型モチーフを有する。
【０１７２】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするギャップ拡大型アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３個の化学修飾ヌクレオシドからなるウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置する１４個の２’−デオキシリボヌクレオチドからなるギャップセグメントを有する。ある実施形態では、化学修飾が２’−糖修飾を含む。もう１つの実施形態では、化学修飾が２’−ＭＯＥ糖修飾を含む。
【０１７３】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするギャップ拡大型アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２個の化学修飾ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメントと５個の化学修飾ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置する１３個の２’−デオキシリボヌクレオチドからなるギャップセグメントを有する。ある実施形態では、化学修飾が２’−糖修飾を含む。もう１つの実施形態では、化学修飾が２’−ＭＯＥ糖修飾を含む。
【０１７４】
標的核酸、標的領域およびヌクレオチド配列
第７因子遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列には、以下に挙げる配列が含まれるが、これらに限るわけではない：１２５５０００〜１２７３０００で切り取られたＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）には２００１年７月１７日に初めて登録され、本明細書には配列番号１として組み込まれる；ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０１９６１６．２、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）には２０００年１０月３日に初めて登録され、本明細書には配列番号２として組み込まれる；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＤＢ１８４１４１．１、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）には２００５年１１月１１日に初めて登録され、本明細書には配列番号３として組み込まれる；ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０００１３１．３、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）には１９９９年３月２４日に初めて登録され、本明細書には配列番号１６７として組み込まれる；ヌクレオチド１００２４０００〜１００３７０００で切り取られたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０３９４５５．６、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）には２００３年２月２４日に初めて登録され、本明細書には配列番号１６０として組み込まれる；ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＷ＿００１０４５０７．１、本明細書には配列番号１６２として組み込まれる；およびＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号３３６０＿０６１＿Ｂ、本明細書には配列番号１６３として組み込まれる。
【０１７５】
本明細書に含まれる実施例において、各配列番号に記載される配列は、糖成分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基へのどのような修飾も問題にしないと理解される。したがって、ある配列番号によって規定されるアンチセンス化合物は、独立して、糖成分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基への修飾を１つ以上含みうる。アイシス番号（Ｉｓｉｓ Ｎｏ．）で記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列とモチーフの組み合わせを示す。
【０１７６】
ある実施形態では、標的領域が、標的核酸の構造的に定義された領域である。例えば標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エキソン、イントロン、イントロン、エキソン／イントロン接合部、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の定義付けられた核酸領域を包含しうる。第７因子遺伝子配列の構造的に定義された領域は、ＮＣＢＩなどの配列データベースからアクセッション番号によって入手することができ、そのような情報は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、標的領域は、標的領域内のある標的セグメントの５’標的部位から、標的領域内のもう１つの標的セグメントの３’標的部位までの配列を包含しうる。
【０１７７】
標的化には、アンチセンス化合物がハイブリダイズして所望の効果を生じるような、少なくとも１つの標的セグメントの決定が含まれる。ある実施形態では、所望の効果がｍＲＮＡ標的核酸レベルの減少である。ある実施形態では、所望の効果が、標的核酸によってコードされるタンパク質または標的核酸に関連する表現型変化のレベルの減少である。
【０１７８】
標的領域は１つ以上の標的セグメントを含有しうる。標的領域内の複数の標的セグメントはオーバーラップしていてもよい。あるいは、それらはオーバーラップしていなくてもよい。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントが、約３００以下のヌクレオシドで隔てられる。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントが、標的核酸上の２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０個のヌクレオチドで、またはそれ以下の数のヌクレオチドで、またはおよそそれ以下の数のヌクレオチドで、または上述した値の任意の２つによって規定される範囲の数のヌクレオチドで隔てられる。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントが、標的核酸上の５個以下のヌクレオチドで、または約５個以下のヌクレオチドで隔てられる。ある実施形態では、標的セグメントが連続している。本明細書に列挙する５’標的部位または３’標的部位のいずれかである開始核酸を有する範囲によって定義される標的領域が考えられる。
【０１７９】
適切な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コーディング領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エキソン、またはエキソン／イントロン接合部内に見いだすことができる。開始コドンまたは終止コドンを含有する標的セグメントも、適切な標的セグメントである。適切な標的セグメントは、一定の構造的に定義された領域、例えば開始コドンまたは終止コドンを、特に除外することもできる。
【０１８０】
適切な標的セグメントの決定には、標的核酸の配列と、ゲノム全体にわたる他の配列との比較が含まれうる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使って、異なる核酸の間で類似性を有する領域を同定することができる。この比較により、選択した標的核酸以外の配列（すなわち非標的配列または非特異的な配列）に非特異的にハイブリダイズしうるアンチセンス化合物配列の選択を防止することができる。
【０１８１】
活性標的領域内でのアンチセンス化合物の活性（例えば標的核酸レベルの減少率によって定義されるもの）には、ばらつきがありうる。ある実施形態では、第７因子ｍＲＮＡレベルの減少が、第７因子発現の減少を示す。第７因子タンパク質のレベルの減少も、標的ｍＲＮＡ発現の阻害を示す。さらに、表現型変化も第７因子発現の阻害を示す。例えば、ＰＴ時間の延長は、第７因子発現の阻害を示しうる。もう１つの例として、ａＰＴＴ時間の延長は、ＰＴ時間の延長と合わせて、第７因子発現の阻害を示しうる。もう１つの例として、血小板因子４（ＰＦ−４）発現レベルの低下は、第７因子発現の阻害を示しうる。もう１つの例として、血栓形成の減少または血栓形成に要する時間の増加は、第７因子発現の阻害を示しうる。
【０１８２】
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するアンチセンス化合物と第７因子核酸との間でハイブリダイゼーションが起こる。最も一般的なハイブリダイゼーションの機序には、核酸分子の相補的核酸塩基間の水素結合形成（例えばワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合形成）が関わる。
【０１８３】
ハイブリダイゼーションはさまざまな条件下で起こりうる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、ハイブリダイズさせようとする核酸分子の性質および組成によって決まる。
【０１８４】
ある配列が標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるかどうかを決定する方法は、当技術分野ではよく知られている。ある実施形態では、本明細書に記載するアンチセンス化合物が、第７因子核酸と特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１８５】
相補性
アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の効果（例えば第７因子核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害）が生じるような形で、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるのであれば、そのアンチセンス化合物と標的核酸は互いに相補的である。
【０１８６】
アンチセンス化合物と第７因子核酸の間の非相補的核酸塩基は、アンチセンス化合物が依然として標的核酸に特異的にハイブリダイズできるのであれば、認容されうる。さらにまた、アンチセンス化合物は、第７因子核酸の１つ以上のセグメントにわたって、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないような形で、ハイブリダイズしうる（例えばループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）。
【０１８７】
ある実施形態では、本明細書に記載するアンチセンス化合物、またはその指定した部分が、第７因子核酸、その標的領域、標的セグメント、または指定した部分に対して、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的であるか、または少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的である。アンチセンス化合物と標的核酸との相補性率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）は常法を使って決定することができる。
【０１８８】
例えば、アンチセンス化合物の２０個の核酸塩基のうち１８個が標的領域に相補的であり、それゆえに特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス化合物は、９０％の相補性を表すだろう。この例の場合、残りの非相補的核酸塩基は、集まっていてもよいし、相補的核酸塩基の間に散在していてもよく、互いにまたは相補的核酸塩基に連続している必要はない。したがって、標的核酸塩基と完全に相補的な２つの領域に挟まれた４個の非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長のアンチセンス化合物は、標的核酸と７７．８％の総相補性を有し、したがって本発明の範囲に包含されるだろう。アンチセンス化合物と標的核酸のある領域との相補性率は、常法により、当技術分野で知られるＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使って決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）。相同性率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、配列一致率または相補性率は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）を用いるＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、ウィスコンシン州マディソン）により、デフォルト設定を使って決定することができる。
【０１８９】
ある実施形態では、本明細書に記載するアンチセンス化合物またはその指定した部分が、標的核酸またはその指定した部分に、完全に相補的（すなわち１００％相補的）である。例えばアンチセンス化合物は、第７因子核酸、またはその標的領域、もしくは標的セグメントもしくは標的配列に、完全に相補的であることができる。本明細書にいう「完全に相補的」とは、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確な塩基対形成をする能力を有することを意味する。例えば、２０核酸塩基のアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物に完全に相補的な対応する２０核酸塩基部分が標的核酸に存在する限り、４００核酸塩基長の標的配列に完全に相補的である。完全に相補的という用語は、第１および／または第２核酸の指定した部分についても使用することができる。例えば、３０核酸塩基のアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長の標的配列に「完全に相補的」であることができる。３０核酸塩基のオリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は、各核酸塩基がそのアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分のそれぞれの核酸塩基に相補的であるような対応する２０核酸塩基部分を標的配列が有するのであれば、標的配列に対して完全に相補的である。同時に、３０核酸塩基のアンチセンス化合物全体は、そのアンチセンス化合物の残りの１０核酸塩基も標的配列に相補的であるかどうかに依存して、標的配列に対して完全に相補的である場合も、完全には相補的でない場合もありうる。
【０１９０】
非相補的核酸塩基の位置は、アンチセンス化合物の５’端または３’端であることができる。あるいは、１つまたは複数の非相補的核酸塩基が、アンチセンス化合物の内部部分にあってもよい。２個以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは連続して（すなわち連結されて）いてもよいし、非連続であってもよい。一実施形態では、非相補的核酸塩基がギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウイングセグメント中に位置する。
【０１９１】
ある実施形態では、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０核酸塩基長であるアンチセンス核酸、または最大で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０核酸塩基であるアンチセンス核酸が、第７因子核酸などの標的核酸またはその指定した部分に対して、４個を超えない、３個を超えない、２個を超えない、または１個を超えない非相補的核酸塩基を含む。
【０１９２】
ある実施形態では、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０核酸塩基長であるアンチセンス化合物、または最大で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０核酸塩基長であるアンチセンス化合物が、第７因子核酸などの標的核酸またはその指定した部分に対して、６個を超えない、５個を超えない、４個を超えない、３個を超えない、２個を超えない、または１個を超えない非相補的核酸塩基を含む。
【０１９３】
本明細書に記載するアンチセンス化合物には、標的核酸の一部分に相補的であるものも含まれる。本明細書にいう「部分」とは、標的核酸のある領域またはセグメント内の所定の数の連続（すなわち連結された）核酸塩基を指す。「部分」はアンチセンス化合物の所定の数の連続核酸塩基も指すことができる。ある実施形態では、アンチセンス化合物が標的セグメントの少なくとも８核酸塩基部分に相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物が標的セグメントの少なくとも１２核酸塩基部分に相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物が標的セグメントの少なくとも１５核酸塩基部分に相補的である。標的セグメントの少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個もしくはそれ以上、またはこれらの値の任意の２つによって定義される範囲の核酸塩基部分に相補的であるアンチセンス化合物も考えられる。
【０１９４】
同一性
本明細書に記載するアンチセンス化合物は、特定のヌクレオチド配列、配列番号、もしくは特定のアイシス番号で表される化合物、またはその一部分に対して、所定の一致率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有しうる。本明細書では、あるアンチセンス化合物が同じ核酸塩基対形成能を有するのであれば、そのアンチセンス化合物は本明細書に開示する配列と同一であるという。例えば、開示されたＤＮＡ配列中のチミジンの代わりにウラシルを含有するＲＮＡは、そのＤＮＡ配列と同一であるとみなされるだろう。というのも、ウラシルとチミジンはどちらもアデニンと対を形成するからである。本明細書に記載するアンチセンス化合物の短縮型または延長型、ならびに本明細書に記載するアンチセンス化合物と比較して非同一塩基を有する化合物も考えられる。非同一塩基は、互いに隣接していてもよいし、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の一致率は、比較対象である配列と比較して同一の塩基対形成を有する塩基の数に応じて算出される。
【０１９５】
ある実施形態では、アンチセンス化合物またはその一部分は、本明細書に開示するアンチセンス化合物もしくは配列番号、またはその一部分の１つ以上と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１９６】
修飾
ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基とも呼ばれている）部分は通常は複素環式塩基成分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は糖の２’、３’または５’ヒドロキシル成分に連結することができる。オリゴヌクレオチドは隣接するヌクレオシドが互いに共有結合されて線状のポリマー状オリゴヌクレオチドを形成することによって形成される。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成すると言われる。
【０１９７】
アンチセンス化合物に対する修飾には、ヌクレオシド間結合、糖成分、または核酸塩基に対する置換または改変が包含される。修飾アンチセンス化合物は、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的に対するアフィニティの強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、または阻害活性の増加など、望ましい性質を有するため、天然型より好ましいことが多い。
【０１９８】
化学修飾ヌクレオシドは、短縮型または切断型アンチセンスオリゴヌクレオチドの、その標的核酸に対する結合アフィニティを増加させるためにも使用することができる。したがって、そのような化学修飾ヌクレオシドを有する場合は短いアンチセンス化合物でも、しばしば比較に値する結果を得ることができる。
【０１９９】
修飾ヌクレオシド間結合
ＲＮＡおよびＤＮＡの天然のヌクレオシド間結合は３’→５’ホスホジエステル結合である。天然のヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物よりも、１つ以上の修飾された、すなわち非天然の、ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物が、しばしば選択される。それが、例えば、細胞取り込みの強化、標的核酸に対するアフィニティの強化、およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増加など、望ましい性質を有するからである。
【０２００】
修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保っているヌクレオシド間結合ならびにリン原子を持たないヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、例えばホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、およびホスホロチオエートが含まれる。リン含有結合および非リン含有結合の製造方法はよく知られている。
【０２０１】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。ある実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２０２】
修飾糖成分
本発明のアンチセンス化合物は、場合によっては、糖基が修飾されているヌクレオシドを１つ以上含有することができる。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合アフィニティの増加または他の何らかの有益な生物学的性質を、アンチセンス化合物に付与しうる。ある実施形態では、ヌクレオシドが化学修飾リボフラノース環成分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、置換基の付加（５’および２’置換基、非ジェミナル環原子の架橋による二環式核酸（ＢＮＡ）の形成、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ）２（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたは保護基）による置き換え）およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限るわけではない。化学修飾糖の例には、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（他の開示された５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについてはＰＣＴ国際出願ＷＯ２００８／１０１１５７（公開日２００８年８月２１日）参照）、またはリボシル環酸素原子の「Ｓ」による置き換えおよび２’位におけるさらなる置換（米国特許出願ＵＳ２００５−０１３０９２３（公開日２００５年６月１６日）参照）、あるいはＢＮＡの５’−置換（ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／１３４１８１（公開日２００７年１１月２２日）参照；ここでは、ＬＮＡが例えば５’−メチル基または５’−ビニル基で置換される）が含まれる。
【０２０３】
修飾糖成分を有するヌクレオシドの例には、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ_３および２’−Ｏ（ＣＨ_２）２ＯＣＨ_３置換基を含むヌクレオシドが含まれるが、これらに限るわけではない。２’位の置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ_３、Ｏ（ＣＨ_２）２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択することもでき、ここで、各ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈまたは置換されたもしくは無置換のＣ１−Ｃ１０アルキルである。
【０２０４】
二環式核酸（ＢＮＡ）の例には、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが含まれるが、これらに限るわけではない。ある実施形態では、本明細書に記載するアンチセンス化合物が、１つ以上のＢＮＡヌクレオシドを含み、その架橋は次に挙げる式の１つを含む：４’−（ＣＨ_２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ_２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ_２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−Ｃ（ＣＨ_３）_２−Ｏ−２’（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２参照）；４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’および４’−ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）−Ｏ−２’（米国特許第７，３９９，８４５号（発行日２００８年７月１５日）参照）；４’−ＣＨ_２−Ｎ（ＯＣＨ_３）−２’（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１参照）；４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−２’（米国特許出願ＵＳ２００４−０１７１５７０（公開日２００４年９月２日）参照）；４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（米国特許第７，４２７，６７２号（発行日２００８年９月２３日）参照）；４’−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−２’および４’−ＣＨ_２−Ｃ−（＝ＣＨ_２）−２’（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４参照）；ここでＲは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または保護基である。上述のＢＮＡのそれぞれは、例えばα−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースなど、さまざまな立体化学的糖コンフィギュレーションを含む（ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３（ＷＯ９９／１４２２６として１９９９年３月２５日に公開）参照）。
【０２０５】
ある実施形態では、リボシル環を糖代替物で置き換えることによって、ヌクレオシドが修飾される。そのような修飾には、代用環系、例えばモルホリノ環、シクロヘキセニル環、シクロヘキシル環またはテトラヒドロピラニル環、例えば式：の１つを有するものなどによるリボシル環の置き換え（ＤＮＡ類似体という場合もある）が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０２０６】
アンチセンス化合物に組み込むためのヌクレオシドを修飾するために使用することができるビシクロおよびトリシクロ糖代用環系は、他にも数多く、当技術分野では知られている（例えば総説：Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｊ．参照）。そのような環系は、活性を強化するために、さまざまな追加の置換を受けることができる。
【０２０７】
修飾糖を製造するための方法は当業者にはよく知られている。
【０２０８】
修飾糖成分を有するヌクレオチドでは、核酸塩基成分（天然、修飾またはその組み合わせ）が、適当な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【０２０９】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が、修飾糖成分を有するヌクレオチドを１つ以上含む。ある実施形態では、修飾糖成分が２’−ＭＯＥである。ある実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドがギャップマーモチーフ中に配置される。
【０２１０】
修飾核酸塩基
核酸塩基（または塩基）修飾または置換は、天然のまたは合成の非修飾核酸塩基とは構造的に識別可能であるが、機能的には交換可能である。天然核酸塩基と修飾核酸塩基はどちらも、水素結合に参加する能力を有する。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合アフィニティまたは他の何らかの有益な生物学的性質を、アンチセンス化合物に付与することができる。修飾核酸塩基には、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）などの合成および天然核酸塩基が含まれる。５−メチルシトシン置換を含むいくつかの核酸塩基置換は、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合アフィニティを増加させるのに、特に有用である。例えば、５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ボカラトン、１９９３、ｐｐ．２７６−２７８）。
【０２１１】
他の非修飾核酸塩基には、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどがある。
【０２１２】
複素環式塩基成分には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置き換えられているものも含めることができる。アンチセンス化合物の結合アフィニティを増加させるのにとりわけ有用な核酸塩基には、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。
【０２１３】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするギャップ拡大型アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある実施形態では、修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである。ある実施形態では、各シトシンが５−メチルシトシンである。
【０２１４】
医薬組成物を製剤するための組成物および方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または医薬製剤を製造するために、医薬上許容される活性または不活性物質と混合することができる。医薬組成物を製剤するための組成物および方法は、限定するわけではないが、投与経路、疾患の程度、または投与されるべき用量など、いくつかの基準に依存する。
【０２１５】
第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物を適切な医薬上許容される希釈剤または担体と混合することにより、医薬組成物において利用することができる。医薬上許容される希釈剤には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。ＰＢＳは、非経口的に送達するための組成物における使用に適した希釈剤である。したがって、一実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物と医薬上許容される希釈剤とを含む医薬組成物が、本明細書に記載する方法において使用される。ある実施形態では、医薬上許容される希釈剤がＰＢＳである。ある実施形態では、アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２１６】
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、ヒトを含む動物に投与された時に、生物学的に活性な代謝産物またはその残基を（直接または間接的に）与える能力を有する、任意の医薬上許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または他の任意のオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、例えば、本開示は、アンチセンス化合物の医薬上許容される塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの医薬上許容される塩、および他の生物学的等価物（ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）にも向けられる。適切な医薬上許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０２１７】
プロドラッグは、体内で内在性ヌクレアーゼによって切断されて活性なアンチセンス化合物を形成させる追加ヌクレオシドの、アンチセンス化合物の一端または両端への組み込みを含むことができる。
【０２１８】
コンジュゲート化アンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを強化する１つ以上の成分またはコンジュゲートに共有結合することができる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール成分および脂質成分が含まれる。他のコンジュゲート基には、糖質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、および色素が含まれる。
【０２１９】
アンチセンス化合物は、例えば、ヌクレアーゼ安定性などの性質を強化するために、一般にアンチセンス化合物の一端または両端に取付けられる１つ以上の安定化基を有するように修飾することもできる。安定化基にはキャップ構造が含まれる。これらの末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物を、エキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達および／または局在化を助けることができる。キャップは５’末端（５’−キャップ）または３’−末端（３’−キャップ）に存在するか、両末端に存在することができる。キャップ構造は当技術分野ではよく知られており、例えば逆デオキシ脱塩基キャップ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｘｏｙ ａｂａｓｉｃ ｃａｐ）が含まれる。アンチセンス化合物の一端または両端をキャッピングしてヌクレアーゼ安定性を付与するために使用することができる他の３’および５’−安定化基には、ＷＯ０３／００４６０２（公開日２００３年１月１６日）に開示されているものが含まれる。
【０２２０】
細胞培養およびアンチセンス化合物処理
第７因子核酸のレベル、活性または発現に対するアンチセンス化合物の効果は、さまざまな細胞タイプにおいて、インビトロで試験することができる。そのような分析に使用される細胞タイプは供給業者（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナッサス；Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ウォーカーズビル）から入手することができ、細胞は、市販の試薬（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を使って、供給者の指示に従って培養される。例示的細胞タイプには、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅｐＢ３細胞、および初代肝細胞が含まれる。
【０２２１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ試験
ここでは、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理するための方法を説明する。この方法は、他のアンチセンス化合物による処理のために、適当に変更することができる。
【０２２２】
一般に細胞は、細胞が培養時に約６０〜８０％コンフルエントに達したら、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。
【０２２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するためによく使用される試薬の１つに、カチオン性脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）と混合して、所望の最終アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度および典型的には１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり２〜１２μｇ／ｍＬの範囲であるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）濃度にする。
【０２２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用されるもう１つの試薬に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）と混合して、所望の最終アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度および典型的には１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり２〜１２μｇ／ｍＬの範囲であるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）濃度にする。
【０２２５】
培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用されるもう１つの技法にエレクトロポレーションがある。
【０２２６】
細胞を常法によりアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。細胞を典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に収集し、その時点で、標的核酸のＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを当技術分野で知られ本明細書でも説明する方法によって測定する。一般に、処理が複数のレプリケートで行なわれる場合は、データをレプリケート処理の平均として表す。
【０２２７】
使用されるアンチオリゴヌクレオチドの濃度は細胞株ごとに異なる。特定の細胞株について最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定するための方法は、当技術分野ではよく知られている。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を使ってトランスフェクトされる場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の濃度で使用される。エレクトロポレーションを使ってトランスフェクトされる場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、より高い、６２５〜２０，０００ｎＭの範囲の濃度で使用される。
【０２２８】
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ分析は全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡに対して行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は当技術分野ではよく知られている。ＲＮＡは当技術分野で周知の方法を使って、例えばＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用し、製造者が推奨するプロトコールに従って、調製される。
【０２２９】
標的レベルまたは標的発現の阻害の分析
第７因子核酸のレベルまたは発現の阻害は、当技術分野で知られるさまざまな方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、ノーザンブロット分析、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、または定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどによって定量することができる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡに対して行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は当技術分野ではよく知られている。ノーザンブロット分析も当技術分野では常法である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）から入手することができる市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを、製造者の指示に従って使用することにより、便利に達成することができる。
【０２３０】
標的ＲＮＡレベルの定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
標的ＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用し、製造者の指示に従って、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで達成することができる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの方法は当技術分野ではよく知られている。
【０２３１】
リアルタイムＰＣＲに先だって、単離されたＲＮＡは逆転写酵素（ＲＴ）反応に付される。それにより、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成するので、それをリアルタイムＰＣＲ増幅の基質として使用する。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ反応は、同じ試料ウェル内で逐次的に行なわれる。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド）から入手する。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に周知の方法によって行なわれる。
【０２３２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られる遺伝子（またはＲＮＡ）標的量は、発現量が一定な遺伝子（例えばシクロフィリンＡ）の発現レベルを使って標準化するか、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）を使って全ＲＮＡを定量することによって標準化される。シクロフィリンＡ発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、標的と同時に、マルチプレックスに、または別個に行うことによって定量される。全ＲＮＡはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン）を使って定量される。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によるＲＮＡ定量の方法はＪｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４）に教示されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）４０００装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使ってＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）蛍光を測定する。
【０２３３】
プローブおよびプライマーは第７因子核酸にハイブリダイズするように設計される。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲプローブおよびプライマーを設計するための方法は当技術分野ではよく知られており、これには、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）などのソフトウェアの使用が含まれうる。
【０２３４】
タンパク質レベルの分析
第７因子核酸のアンチセンス阻害は、第７因子タンパク質レベルを測定することによって評価することができる。第７因子のタンパク質レベルは、当技術分野で周知のさまざまな方法、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロット法）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、定量タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えばカスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で評価または定量することができる。標的に対する抗体はＭＳＲＳ抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州バーミンガム）などのさまざまな供給源から同定し、入手するか、当技術分野でよく知られる従来のモノクローナルまたはポリクローナル抗体作製方法によって製造することができる。ヒトおよびマウス第７因子の検出に役立つ抗体は市販されている。
【０２３５】
アンチセンス化合物のインビボ試験
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第７因子の発現を阻害して、例えばＰＴの延長、ａＰＴＴ時間の延長、血小板因子４（ＰＦ−４）量の減少、血栓形成の減少または血栓形成に要する時間の増加、および細胞増殖の減少などといった表現型の変化をもたらすその能力について評価するために、動物中で試験される。試験は正常な動物で行なうか、実験的疾患モデルで行うことができる。動物への投与のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは医薬上許容される希釈剤、例えばリン酸緩衝食塩水中に製剤される。投与には、非経口投与経路、例えば腹腔内、静脈内、および皮下が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投薬量および投薬頻度の計算は当業者の技量の範囲内であり、投与経路および動物の体重などの因子に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理期間に続いて、ＲＮＡを肝臓組織から単離し、第７因子核酸配列の変化を測定する。第７因子タンパク質レベルの変化も、トロンビン生成アッセイを使って測定される。また、凝固時間、例えばＰＴおよびａＰＴＴに対する効果も、処置された動物から得た血漿を使って決定される。
【０２３６】
いくつかの適応症
ある実施形態では、本発明は、１つ以上の本発明の医薬組成物を投与することを含む、個体を処置する方法を提供する。ある実施形態では、個体は血栓塞栓性合併症を有する。ある実施形態では、個体が、血液凝固障害、例えば限定するわけではないが、梗塞、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、例えば深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中のリスクにさらされている。これには、血栓症のリスクにつながる後天的な問題、疾患、または障害、例えば手術、がん、不動、敗血症、アテローム性動脈硬化、心房細動を有する個体、ならびに遺伝的素因、例えば抗リン脂質抗体症候群および常染色体優性異常、第Ｖ因子ライデンを有する個体が含まれる。ある実施形態では、個体が抗凝固治療の必要があると同定された個体である。そのような個体の例には、大きな整形外科手術（例えば人工股／膝関節置換術または股関節骨折手術）を受けた個体、および慢性期処置を必要とする患者、例えば心房細動を患っている患者（脳卒中を予防するため）が含まれるが、これらに限るわけではない。ある実施形態において、本発明は、個体における第７因子発現を予防的に減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態は、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の治療有効量を個体に投与することによって、その必要がある個体を処置することを含む。
【０２３７】
ある実施形態では、第７因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が、血栓塞栓性合併症を患っているか血栓塞栓性合併症に罹りやすい患者を処置するための医薬品の製造に使用される。
【０２３８】
ある実施形態では、第７因子と組織因子との結合による組織因子−第７ａ因子複合体の形成が、炎症状態、例えば肝線維症、慢性関節リウマチ、ならびに腫瘍成長および腫瘍転移につながりうる。
【０２３９】
ある実施形態では、個体が、線維症合併症につながる炎症状態を有する。ある実施形態では、個体が、過剰なコラーゲン沈着および線維症障害、例えば限定するわけではないが、肝線維症、動脈硬化、慢性糸球体腎炎、皮膚ケロイド形成、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、肝線維症、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性移植片対宿主病、強皮症（局所性および全身性）、ペイロニー病、陰茎線維症、膀胱鏡を使った検査後の尿道狭窄、手術後の体内癒着、骨髄線維症、特発性腹膜後線維症などのリスクにさらされている。ある実施形態では、個体が、抗線維症治療の必要があると同定された個体である。これには、線維症のリスクにつながる遺伝的または後天的な問題、疾患、または障害、例えばα１−アンチトリプシン欠損症、銅蓄積症（ウィルソン病）、フルクトース血症、ガラクトース血症、グリコーゲン蓄積症（例えばＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型、ＩＸ型、およびＸ型）、鉄過剰症候群（例えばヘモクロマトーシス）、脂質異常（例えばゴーシェ病）、ペルオキシソーム障害（例えばツェルウェガー症候群）、チロシン血症（Ｔｙｒｓｏｎｉｎｅｍｉａ）、先天性肝線維症、細菌感染症（例えばブルセラ症）、寄生虫感染症（例えばエキノコックス症）、ウイルス感染症（例えば慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎）、肝血流に影響を及ぼす障害（例えばバッド・キアリ症候群、心不全、肝静脈閉塞性疾患、および門脈血栓症）、アルコール、および薬物（例えばアミオダロン、クロルプロマジン、イソニアジド、メトトレキサート、メチルドーパ、オキシフェニサチン、およびトルブタミド）などを有する個体が含まれる。ある実施形態では、個体が、抗線維症治療が必要であると同定された個体である。そのような実施形態では、組織因子−第７ａ因子（ＴＦ／Ｆ７ａ）複合体が、線維症において主要な凝固促進物質活性を有すると同定される。ある実施形態において、本発明は、個体における第７因子発現を予防的に減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態は、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の治療有効量を個体に投与することによって、その必要がある個体を処置することを含む。
【０２４０】
ある実施形態では、第７因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が、線維症合併症を患っているか、または線維症合併症に罹りやすい患者を処置するための医薬品の製造に使用される。
【０２４１】
ある実施形態では、個体が炎症性慢性関節リウマチ合併症を有する。ある実施形態では、個体が、関節部の炎症および慢性関節リウマチのリスクにさらされている。そのような実施形態では、個体が関節部の疼痛、腫脹および圧痛、疲労、食欲減退、微熱、筋肉痛および筋硬直を患う。ある実施形態では、個体が、抗炎症性関節炎治療の必要があると同定された個体である。これには、慢性関節リウマチ、反応性関節炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、強直性脊柱炎、および炎症性腸疾患に関連する関節炎を患う個体が含まれる。ある実施形態では、個体が、抗炎症治療を必要とすると同定された個体である。そのような実施形態では、組織因子−第７ａ因子（ＴＦ／Ｆ７ａ）複合体が、関節炎の誘発において主要な凝固促進物質活性を有すると同定される。ある実施形態において、本発明は、個体における第７因子発現を予防的に減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態は、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の治療有効量を個体に投与することによって、その必要がある個体を処置することを含む。
【０２４２】
ある実施形態では、第７因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が、炎症性関節炎合併症を患っているか、または炎症性関節炎合併症に罹りやすい患者を処置するための医薬品の製造に使用される。
【０２４３】
ある実施形態では、個体が悪性合併症を有する。ある実施形態では、個体が、腫瘍成長、血管新生および転移のリスクにさらされている。そのような実施形態では、播種性血管内血液凝固および静脈血栓塞栓症などの止血異常を患う個体が、原発性および転移性腫瘍成長などのさらなる合併症を患いうる。そのような実施形態では、腫瘍転移の播種は凝固依存的過程である。そのような実施形態では、組織因子−第７ａ因子（ＴＦ／Ｆ７ａ）複合体は、がんにおいて主要な凝固促進物質活性を有すると同定される。ある実施形態では、個体が、抗ＴＦ／Ｆ７ａ治療の必要があると同定された個体である。ある実施形態において、本発明は、個体における第７因子発現を予防的に減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態は、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の治療有効量を個体に投与することによって、その必要がある個体を処置することを含む。
【０２４４】
ある実施形態では、第７因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が、悪性合併症を患っているか、または悪性合併症に罹りやすい患者を処置するための医薬品の製造に使用される。
【０２４５】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の治療有効量の投与が、個体の血清中の第７因子レベルをモニターして、そのアンチセンス化合物の投与に対する個体の応答を決定することを伴う。医師はアンチセンス化合物の投与に対する個体の応答を使って、治療的介入の量および持続期間を決定する。
【０２４６】
ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与が、第７因子発現を、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって規定される範囲で、減少させる。ある実施形態では、第７因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与が、例えば限定するわけではないが、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）検査、プロトロンビン時間（ＰＴ）検査、トロンビン時間（ＴＣＴ）、出血時間、またはＤ−ダイマーなどの標準的検査によって測定される凝血の測定値を変化させる。ある実施形態では、第７因子アンチセンス化合物の投与が、測定値を、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって規定される範囲で増加させる。いくつかの実施形態では、第７因子アンチセンス化合物の投与が、測定値を、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって規定される範囲で減少させる。
【０２４７】
ある実施形態では、第７因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が、血栓塞栓性合併症を患っているか血栓塞栓性合併症に罹りやすい患者を処置するための医薬品の製造に使用される。
【０２４８】
いくつかの併用療法
ある実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物が、１つ以上の他の医薬剤と併用投与される。ある実施形態では、そのような１つ以上の他の医薬剤が、当該本発明の１つ以上の医薬組成物と同じ疾患、障害、または状態を処置するための医薬剤である。ある実施形態では、そのような１つ以上の他の医薬剤が、当該本発明の１つ以上の医薬組成物とは異なる疾患、障害、または状態を処置するための医薬剤である。ある実施形態では、そのような１つ以上の他の医薬剤が、本発明の１つ以上の医薬組成物の望ましくない副作用を処置するための医薬剤である。ある実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物が、もう１つの医薬剤と、当該他の医薬剤の望ましくない効果を処置するために、併用投与される。ある実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物がもう１つの医薬剤と併用投与されて、複合的効果を生じる。ある実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物がもう１つの医薬剤と併用投与されて相乗効果を生じる。
【０２４９】
ある実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物と１つ以上の他の医薬剤とが、同時に投与される。ある実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物と１つ以上の他の医薬剤とが異なる時点で投与される。ある実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物と１つ以上の他の医薬剤とが、単一の製剤中に一緒に調製される。ある実施形態では、本発明の１つ以上の医薬組成物と１つ以上の他の医薬剤とが、別々に調製される。
【０２５０】
ある実施形態において、本発明の医薬組成物と併用投与することができる医薬剤には、抗凝固剤または抗血小板剤が含まれる。ある実施形態では、本発明の医薬組成物と併用投与することができる医薬剤として、限定するわけではないが、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、チクロピジン、ワルファリン（および関連クマリン類）、ヘパリン、直接トロンビンインヒビター（例えばレピルジン、ビバリルジン）、アピキサバン、ラブノックス、および特定凝固因子の酵素作用を直接妨害する小分子化合物（例えば第Ｘａ因子を妨害するリバロキサバン）を挙げることができる。ある実施形態では、抗凝固剤または抗血小板剤が、本発明の医薬組成物の投与に先だって投与される。ある実施形態では、抗凝固剤または抗血小板剤が、本発明の医薬組成物の投与後に投与される。ある実施形態では、抗凝固剤または抗血小板剤が、本発明の医薬組成物と同時に投与される。ある実施形態では、併用投与される抗凝固剤または抗血小板剤の用量が、その抗凝固剤または抗血小板剤を単独で投与するとすれば投与されるであろう用量と同じである。ある実施形態では、併用投与される抗凝固剤または抗血小板剤の用量が、その抗凝固剤または抗血小板剤を単独で投与するとすれば投与されるであろう用量よりも少ない。ある実施形態では、併用投与される抗凝固剤または抗血小板剤の用量が、その抗凝固剤または抗血小板剤を単独で投与するとすれば投与されるであろう用量よりも多い。
【０２５１】
ある実施形態では、第２化合物の併用投与が第１化合物の抗凝固効果を強化して、化合物の併用投与が、第１化合物だけの投与の効果よりも高い抗凝固効果をもたらす。別の実施形態では、併用投与が、単独で投与した場合の化合物の効果の相乗作用であるような抗凝固効果をもたらす。ある実施形態では、併用投与が、単独で投与した場合の化合物の効果の和を上回るような抗凝固効果をもたらす。ある実施形態では、第１化合物がアンチセンス化合物である。ある実施形態では、第２化合物がアンチセンス化合物である。
【０２５２】
ある実施形態では、第７因子特異的インヒビターの投与後の任意の時点で、解毒剤が投与される。ある実施形態では、第７因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の任意の時点で、解毒剤が投与される。ある実施形態では、第７因子を標的とするアンチセンス化合物の投与の数分後、数時間後、数日後、数週間後、または数ヶ月後に、解毒剤が投与される。ある実施形態では、解毒剤が、第７因子を標的とするアンチセンス化合物に対する相補体（例えばセンス鎖）である。ある実施形態では、解毒剤が第７因子または第７ａ因子タンパク質である。ある実施形態では、第７因子または第７ａ因子タンパク質がヒト第７因子またはヒト第７ａ因子タンパク質である。
【０２５３】
［実施例］
限定でない開示および参照による組み込み
本明細書に記載するいくつかの化合物、組成物および方法をいくつかの実施形態に従って具体的に説明したが、以下の実施例は本明細書に記載する化合物の例示を目的とするにすぎず、それを限定しようとするものではない。本願において言及する参考文献はそれぞれ参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
【０２５４】
（実施例１）
ＨｅｐＢ３細胞におけるヒト第７因子ｍＲＮＡのアンチセンス阻害
第７因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、インビトロでの第７因子ｍＲＮＡに対するそれらの効果について試験した。リポフェクチン試薬を使って、１ウェルあたり４，０００細胞の密度の培養ＨｅｐＢ３細胞を、５０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処理期間後に、細胞からＲＮＡを単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第７因子の阻害百分率として表す。
【０２５５】
表１のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。これらのギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。表１に列挙する各ギャップマーは、ヒト遺伝子配列、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）、配列番号２（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０１９６１６．２）、または配列番号３（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＤＢ１８４１４１．１）を標的とする。「ヒト標的開始部位」は、指定したヒト遺伝子配列中でギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「ヒト標的終止部位」は、指定したヒト遺伝子配列中でギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。
［表１］
配列番号１、配列番号２、および配列番号３を標的とする５−１０−５ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第７因子ｍＲＮＡレベルの阻害
【表１−１】

【表１−２】

【表１−３】

【表１−４】

【表１−５】

【０２５６】
表１に記載するギャップマーのいくつかは、アカゲザルゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＷ＿００１０４５０７．１のヌクレオチド６９１０００〜７０６０００；本明細書には配列番号１６２として組み込まれる）またはアカゲザルｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＫＢＡＮＫアクセッション番号３３６０＿０６１＿Ｂ；本明細書には配列番号１６３として組み込まれる）に１００％相同である。表２に、アカゲザルと相同な表１記載のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。ギャップマーをヒト標的開始部位順に並べる。
［表２］
５−１０−５ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するヒト／アカゲザル交差反応性キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド
【表２−１】

【表２−２】

【表２−３】

【表２−４】

【０２５７】
（実施例２）
ＨｅｐＢ３細胞におけるヒト第７因子の用量依存的アンチセンス阻害
ヒト第７因子の少なくとも８０％のインビトロ阻害を示す、実施例１に記載したいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（表１参照）を、ＨｅｐＢ３細胞において、さまざまな用量で試験した。細胞を１ウェルあたり４，０００細胞の密度でプレーティングし、リポフェクチン試薬を使って、表３に示すように、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。約１６時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。ヒト第７因子プライマープローブセットＲＴＳ２９２７（フォワード配列：ＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴ、本明細書には配列番号１６４として組み込まれる；リバース配列：ＣＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＣＧＡＡＡＣＡ、本明細書には配列番号１６５として組み込まれる；プローブ配列：ＴＧＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＸ、本明細書には配列番号１６６として組み込まれる）を使って、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第７因子の阻害百分率として表す。表３に示すように、第７因子ｍＲＮＡレベルは用量依存的に減少した。
【表３】

【０２５８】
（実施例３）
ＨｅｐＢ３細胞におけるヒト第７因子のアンチセンス阻害
第７因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、インビトロでの第７因子ｍＲＮＡに対するそれらの効果を試験した。表３に記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかも、インビトロでの第７因子ｍＲＮＡに対するそれらの効果について再試験した。１ウェルあたり４，０００細胞の密度の培養ＨｅｐＢ３細胞を、リポフェクチン試薬を使って、５０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。ヒト第７因子プライマープローブセットＲＴＳ２９２７を使ってｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照と比較した第７因子の阻害百分率として表す。
【０２５９】
表４のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。これらのギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。表４に列挙した最初の７つのギャップマーは表３に記載したものであり、これらをアステリスク（＊）で示す。「ヒト標的開始部位」は、指定したヒト遺伝子配列中でギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「ヒト標的終止部位」は、指定したヒト遺伝子配列中でギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表４に列挙する各ギャップマーは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）、配列番号２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１９６１６．２）、または配列番号１６７（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００１３１．３）を標的とする。
［表４］
配列番号１、配列番号２、および配列番号１６７を標的とする５−１０−５ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第７因子ｍＲＮＡレベルの阻害
【表４−１】

【表４−２】

【表４−３】

【表４−４】

【０２６０】
表４に記載するギャップマーのいくつかは、アカゲザルゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＷ＿００１０４５０７．１のヌクレオチド６９１０００〜７０６０００；本明細書には配列番号１６２として組み込まれる）またはアカゲザルｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＫＢＡＮＫアクセッション番号３３６０＿０６１＿Ｂ；本明細書には配列番号１６３として組み込まれる）に１００％相同である。表５に、アカゲザルと相同な表４記載のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。
［表５］
５−１０−５ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するヒト／アカゲザル交差反応性キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド
【表５−１】

【表５−２】

【表５−３】

【表５−４】

【０２６１】
（実施例４）
ＨｅｐＢ３細胞におけるヒト第７因子のアンチセンス阻害
第７因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、インビトロでの第７因子ｍＲＮＡに対するそれらの効果を試験した。１ウェルあたり４，０００細胞の密度の培養ＨｅｐＢ３細胞を、リポフェクチン試薬を使って、５０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。ヒト第７因子プライマープローブセットＲＴＳ２９２７を使ってｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照と比較した第７因子の阻害百分率として表す。
【０２６２】
表６のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを５−１０−５ＭＯＥ、３−１４−３ＭＯＥ、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。５−１０−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。３−１４−３ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１４個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。２−１３−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１３個の２’−デオキシヌクレオチドで構成される。中央のギャップは、５’端には２個のヌクレオチドを含むウイングが隣接し、３’端には５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接する。これらのモチーフ（５−１０−５、３−１４−３、および２−１３−５）のそれぞれについて、５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表６に列挙する各ギャップマーは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）を標的とする。
［表６］
配列番号１を標的とするキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第７因子ｍＲＮＡレベルの阻害
【表６−１】

【表６−２】

【０２６３】
（実施例５）
ＨｅｐＢ３細胞におけるヒト凝固第７因子の用量依存的アンチセンス阻害
第７因子のインビトロ阻害を示すギャップマー（上記表１〜６に記載のもの）を選択し、ＨｅｐＢ３細胞において、さまざまな用量で試験した。細胞を１ウェルあたり４，０００細胞の密度でプレーティングし、リポフェクチン試薬を使って、表７に示すように、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、および１００．０ｎＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。ヒト第７因子プライマープローブセットＲＴＳ２９２７を使ってｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第７因子の阻害百分率として表す。表７に示すように、第７因子ｍＲＮＡレベルは用量依存的に減少した。
【表７】

【０２６４】
（実施例６）
マイクロウォーク（ｍｉｃｒｏｗａｌｋ）によって設計されたオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＢ３細胞におけるヒト第７因子のアンチセンス阻害
さらなるギャップマーを、表７に記載のギャップマーに基づいて設計した。これらのギャップマーは、表７に記載する元のギャップマーの上流および下流にわずかにシフトさせたギャップマーを作製すること（すなわち「マイクロウォーク」）によって設計された。５−１０−５ＭＯＥ、３−１４−３ＭＯＥ、および２−１３−５ＭＯＥなど、さまざまなモチーフを有するギャップマーも作製した。これらのギャップマーをインビトロで試験した。１ウェルあたり４，０００細胞の密度の培養ＨｅｐＢ３細胞を、リポフェクチン試薬を使って、５０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第７因子の阻害百分率として表す。
【０２６５】
次に、マイクロウォークによって設計されたギャップマーに関するインビトロ阻害データを、表８、９、１０、１１、１２、および１３に示すように、表７に記載のギャップマーに関するインビトロ阻害データと比較した。オリゴヌクレオチドを、それらが位置するヒト遺伝子配列上の領域に従って表示する。
【０２６６】
表８のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥ、３−１４−３ＭＯＥ、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。表８に挙げた最初のギャップマーは、残りのギャップマーをマイクロウォークによって設計する際の出発点とした元のギャップマー（表７参照）であり、これをアステリスク（＊）で示す。５−１０−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。３−１４−３ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１４個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。２−１３−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１３個の２’−デオキシヌクレオチドで構成される。中央のギャップは、５’端には２個のヌクレオチドを含むウイングが隣接し、３’端には５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接する。これらのモチーフ（５−１０−５、３−１４−３、および２−１３−５）のそれぞれについて、５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表８に列挙する各ギャップマーは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）を標的とする。
【０２６７】
表８に示すように、配列番号１の標的開始部位４８６８で始まり標的終止部位４８９９で終わる標的領域（すなわち核酸塩基４８６８〜４８９９）を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー、３−１４−３ＭＯＥギャップマー、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーはいずれも、第７因子ｍＲＮＡを少なくとも４８％阻害した。
【０２６８】
この標的領域（すなわち核酸塩基４８６８〜４８９９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６５０８、４２２１３８、４２２２１３、４２２２９０、４２２１３９、４２２２１４、４２２２９１、４２２１４０、４２２２１５、４２２２９２、４２２１４１、４２２２１６、４２２２９３、４２２１４２、４２２２１７、４２２２９４、４２２２１８、４２２２９５、４２２１４３、４２２２１９、４２２２９６、４２２１４４、４２２２２０、４２２２９７、４２２１４５、４２２２２１、４２２２９８、４２２１４６、４２２２２２、４２２２９９、４２２１４７、４２２２２３、４２２３００、４２２１４８、４２２２２４、４２２３０１、４１６５０９、４２２２２５、および４２２３０２は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも４０％阻害した。
【０２６９】
この標的領域（すなわち核酸塩基４８６８〜４８９９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６５０８、４２２１３８、４２２２１３、４２２２９０、４２２１３９、４２２２１４、４２２２９１、４２２１４０、４２２２１５、４２２２９２、４２２１４１、４２２２１６、４２２２９３、４２２１４２、４２２２１７、４２２２９４、４２２２１８、４２２２９５、４２２１４３、４２２２１９、４２２２９６、４２２１４４、４２２２２０、４２２２９７、４２２１４５、４２２２２１、４２２２９８、４２２１４６、４２２２２２、４２２２９９、４２２１４７、４２２３００、４２２１４８、４２２２２４、４２２３０１、４１６５０９、４２２２２５、および４２２３０２は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも５０％阻害した。
【０２７０】
この標的領域（すなわち核酸塩基４８６８〜４８９９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６５０８、４２２１３８、４２２２１３、４２２１３９、４２２１４０、４２２２１５、４２２２９２、４２２１４１、４２２２１６、４２２２９３、４２２１４２、４２２２１７、４２２２９４、４２２２１８、４２２２９５、４２２１４３、４２２２１９、４２２２９６、４２２２９７、４２２２９８、４２２２９９、４２２１４７、４２２３００、４２２２２４、４２２３０１、４１６５０９、および４２２３０２は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも６０％阻害した。
【０２７１】
この標的領域（すなわち核酸塩基４８６８〜４８９９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４２２１３８、４２２１４０、４２２２１５、４２２２９２、４２２１４２、４２２２１７、４２２２９４、４２２２１８、４２２２９５、４２２１４３、および４２２２９６は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも７０％阻害した。
［表８］
配列番号１の核酸塩基４８６８〜４８９９を標的とするキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第７因子ｍＲＮＡレベルの阻害
【表８−１】

【表８−２】

【０２７２】
表９のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥ、３−１４−３ＭＯＥ、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。表９に挙げた最初のギャップマーは、残りのギャップマーをマイクロウォークによって設計する際の出発点とした元のギャップマー（表７参照）であり、これをアステリスク（＊）で示す。５−１０−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。３−１４−３ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１４個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。２−１３−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１３個の２’−デオキシヌクレオチドで構成される。中央のギャップは、５’端には２個のヌクレオチドを含むウイングが隣接し、３’端には５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接する。これらのモチーフ（５−１０−５、３−１４−３、および２−１３−５）のそれぞれについて、５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表７に列挙する各ギャップマーは配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）を標的とする。
【０２７３】
表９に示すように、配列番号１の標的開始部位１１８３０で始まり標的終止部位１１８６９で終わる標的領域（すなわち核酸塩基１１８３０〜１１８６９）を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー、３−１４−３ＭＯＥギャップマー、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーの大半は、第７因子ｍＲＮＡを少なくとも４０％阻害した。
【０２７４】
この標的領域（すなわち核酸塩基１１８３０〜１１８６９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６５４９、４２２１５４、４２２２３１、４２２０８９、４２２１５５、４２２２３２、４２２０９０、４２２１５６、４２２２３３、４２２０９１、４２２１５７、４２２２３４、４２２０９２、４２２１５８、４２２２３５、４２２０９３、４２２１５９、４２２２３６、４２２０９４、４２２１６０、４２２２３７、４２２０９５、４２２１６１、４２２２３８、４２２１６２、４２２２３９、４２２０９６、４２２１６３、４２２２４０、４２２０９７、４２２１６４、４２２２４１、４２２０９８、４２２１６５、４２２２４２、４２２０９９、４２２１６６、４２２２４３、４２２１００、４２２１６７、４２２２４４、４２２１０１、４２２１６８、４２２２４５、４２２１０２、４２２１６９、４２２２４６、４２２１０３、４２２１７０、４２２２４７、４２２１０４、４２２１７１、４２２２４８、４２２１０５、４２２１７２、４２２２４９、４２２１０６、４２２１７３、４２２２５０、４２２１０７、４２２１７４、および４２２２５１は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも２０％阻害した。
【０２７５】
この標的領域（すなわち核酸塩基１１８３０〜１１８６９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６５４９、４２２１５４、４２２１５５、４２２２３２、４２２０９０、４２２１５６、４２２２３３、４２２０９１、４２２１５７、４２２２３４、４２２０９２、４２２１５８、４２２２３５、４２２０９３、４２２１５９、４２２２３６、４２２０９４、４２２１６０、４２２２３７、４２２０９５、４２２１６１、４２２２３８、４２２１６２、４２２２３９、４２２０９６、４２２１６３、４２２２４０、４２２０９７、４２２１６４、４２２２４１、４２２０９８、４２２１６５、４２２２４２、４２２０９９、４２２１６６、４２２２４３、４２２１００、４２２１６７、４２２２４４、４２２１０１、４２２１６８、４２２１０２、４２２１６９、４２２２４６、４２２１０３、４２２２４７、４２２１０４、４２２１７１、４２２２４８、４２２１０５、４２２１７２、４２２２４９、４２２１０６、４２２１７３、４２２２５０、４２２１０７、４２２１７４、および４２２２５１は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも３０％阻害した。
【０２７６】
この標的領域（すなわち核酸塩基１１８３０〜１１８６９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６５４９、４２２２３２、４２２０９０、４２２２３３、４２２０９１、４２２１５７、４２２２３４、４２２１５８、４２２２３５、４２２０９３、４２２１５９、４２２２３６、４２２０９４、４２２１６０、４２２２３７、４２２０９５、４２２１６１、４２２２３８、４２２１６２、４２２２３９、４２２０９６、４２２１６３、４２２２４０、４２２０９７、４２２１６４、４２２２４１、４２２０９８、４２２１６５、４２２２４２、４２２０９９、４２２１６６、４２２２４３、４２２１００、４２２１６７、４２２２４４、４２２１０１、４２２１０２、４２２１６９、４２２２４６、４２２１０４、４２２１７１、４２２２４８、４２２１０５、４２２２４９、４２２１７３、４２２２５０、および４２２１７４は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも４０％阻害した。
【０２７７】
この標的領域（すなわち核酸塩基１１８３０〜１１８６９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６５４９、４２２２３４、４２２２３５、４２２２３７、４２２０９５、４２２１６１、４２２２３８、４２２１６２、４２２２３９、４２２０９６、４２２１６３、４２２２４０、４２２０９７、４２２１６４、４２２２４１、４２２０９８、４２２１６５、４２２２４２、４２２１６６、４２２２４３、４２２１００、４２２１６７、４２２２４４、４２２１０２、４２２１６９、４２２１０４、４２２１７１、４２２２４８、４２２１０５、４２２２４９、４２２１７３、４２２２５０、および４２２１７４は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも５０％阻害した。
【０２７８】
この標的領域（すなわち核酸塩基１１８３０〜１１８６９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６５４９、４２２２３４、４２２０９５、４２２２３８、４２２２３９、４２２０９６、４２２２４０、４２２１６４、４２２２４１、４２２２４２、４２２１６６、４２２２４３、４２２１０２、４２２１７１、４２２２４８、および４２２１０５は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも６０％阻害した。
【０２７９】
この標的領域（すなわち核酸塩基１１８３０〜１１８６９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４２２０９６は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも７０％阻害した。
［表９］
配列番号１の核酸塩基１１８３０〜１１８６９を標的とするキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第７因子ｍＲＮＡレベルの阻害
【表９−１】

【表９−２】

【表９−３】

【０２８０】
表１０のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥ、３−１４−３ＭＯＥ、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。表１０に挙げた最初のギャップマーは、残りのギャップマーをマイクロウォークによって設計する際の出発点とした元のギャップマー（表７参照）であり、これをアステリスク（＊）で示す。５−１０−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。３−１４−３ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１４個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。２−１３−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１３個の２’−デオキシヌクレオチドで構成される。中央のギャップは、５’端には２個のヌクレオチドを含むウイングが隣接し、３’端には５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接する。これらのモチーフ（５−１０−５、３−１４−３、および２−１３−５）のそれぞれについて、５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表１０に列挙する各ギャップマーは配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）を標的とする。
【０２８１】
表１０に示すように、配列番号１の標的開始部位１３７６０で始まり標的終止部位１３７８９で終わる標的領域（すなわち核酸塩基１３７６０〜１３７８９）を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー、３−１４−３ＭＯＥギャップマー、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーの大半は、第７因子ｍＲＮＡを少なくとも３０％阻害した。
【０２８２】
この標的領域（すなわち核酸塩基１３７６０〜１３７８９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６４５５、４２２１７５、４２２２５２、４２２１０８、４２２１７６、４２２２５３、４２２１０９、４２２１７７、４２２２５４、４２２１１０、４２２１７８、４２２２５５、４２２１１１、４２２１７９、４２２２５６、４２２１１２、４２２１８０、４２２２５７、４２２１１３、４２２１８１、４２２２５８、４２２１１４、４２２２５９、４２２１１５、４２２１８３、４２２２６０、４２２１１６、４２２１８４、４２２２６１、４１６４５６、および４２２１８５は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも２０％阻害した。
【０２８３】
この標的領域（すなわち核酸塩基１３７６０〜１３７８９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６４５５、４２２１７５、４２２２５２、４２２１０８、４２２１７６、４２２２５３、４２２１０９、４２２１７７、４２２２５４、４２２１１０、４２２１７８、４２２２５５、４２２１１１、４２２１７９、４２２１１２、４２２１８０、４２２２５７、４２２１１３、４２２１８１、４２２２５８、４２２１１４、４２２２５９、４２２１１５、４２２１８３、４２２２６０、４２２１１６、４２２１８４、４２２２６１、４１６４５６、および４２２１８５は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも３０％阻害した。
【０２８４】
この標的領域（すなわち核酸塩基１３７６０〜１３７８９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６４５５、４２２１７５、４２２２５２、４２２１０８、４２２１７６、４２２２５３、４２２１０９、４２２１７７、４２２２５４、４２２１１０、４２２１７９、４２２１１２、４２２１８０、４２２２５７、４２２１１３、４２２１８１、４２２２５８、４２２１１４、４２２２５９、４２２１１５、４２２１８３、４２２２６０、４２２１１６、４２２１８４、４２２２６１、４１６４５６、および４２２１８５は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも４０％阻害した。
【０２８５】
この標的領域（すなわち核酸塩基１３７６０〜１３７８９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６４５５、４２２１７５、４２２２５２、４２２１０８、４２２１７６、４２２２５３、４２２１０９、４２２１７７、４２２１１０、４２２１１２、４２２１８０、４２２２５７、４２２１１３、４２２１８１、４２２２５８、４２２１１４、４２２２５９、４２２１１５、４２２１８３、４２２２６０、４２２１１６、４２２１８４、４２２２６１、および４１６４５６は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも５０％阻害した。
【０２８６】
この標的領域（すなわち核酸塩基１３７６０〜１３７８９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４２２１７５、４２２２５２、４２２１０８、４２２２５３、４２２１０９、４２２１７７、４２２１１２、４２２２５７、４２２１１３、４２２１８１、４２２２５８、４２２２５９、４２２１１５、４２２１８３、および４２２２６１は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも６０％阻害した。
【０２８７】
この標的領域（すなわち核酸塩基１３７６０〜１３７８９）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４２２２５２、４２２１７７、４２２１８３、および４２２２６１は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも７０％阻害した。
【表１０】

【０２８８】
表１１のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥ、３−１４−３ＭＯＥ、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。表１１に挙げた最初のギャップマーは、残りのギャップマーをマイクロウォークによって設計する際の出発点とした元のギャップマー（表７参照）であり、これをアステリスク（＊）で示す。５−１０−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。３−１４−３ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１４個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。２−１３−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１３個の２’−デオキシヌクレオチドで構成される。中央のギャップは、５’端には２個のヌクレオチドを含むウイングが隣接し、３’端には５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接する。これらのモチーフ（５−１０−５、３−１４−３、および２−１３−５）のそれぞれについて、５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表１１に列挙する各ギャップマーは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）を標的とする。
【０２８９】
表１１に示すように、配列番号１の標的開始部位１４７０７で始まり標的終止部位１４７３２で終わる標的領域（すなわち核酸塩基１４７０７〜１４７３２）を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー、３−１４−３ＭＯＥギャップマー、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーはいずれも、第７因子ｍＲＮＡを少なくとも４８％阻害した。
【０２９０】
この標的領域（すなわち核酸塩基１４７０７〜１４７３２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６４７７、４０７６４１、４２２２００、４２２２７７、４２２１３０、４２２２０１、４２２２７８、４２２１３１、４２２２０２、４２２２７９、４２２２０３、４２２２８０、４２２１３２、４２２２０４、４２２２８１、４２２１３３、４２２２０５、４２２２８２、４０７６４２、４２２２０６、および４２２２８３は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも４０％阻害した。
【０２９１】
この標的領域（すなわち核酸塩基１４７０７〜１４７３２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６４７７、４０７６４１、４２２２００、４２２２７７、４２２１３０、４２２２０１、４２２２７８、４２２１３１、４２２２７９、４２２２０３、４２２２８０、４２２１３２、４２２２０４、４２２２８１、４２２１３３、４２２２０５、４０７６４２、４２２２０６、および４２２２８３は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも５０％阻害した。
【０２９２】
この標的領域（すなわち核酸塩基１４７０７〜１４７３２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６４７７、４０７６４１、４２２１３０、４２２２０１、４２２２７８、４２２１３１、４２２２０４、４２２１３３、４２２２０５、４０７６４２、および４２２２０６は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも６０％阻害した。
【０２９３】
この標的領域（すなわち核酸塩基１４７０７〜１４７３２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４１６４７７、４２２１３０、４２２２０１、および４２２２０４は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも７０％阻害した。
【表１１】

【０２９４】
表１２のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥ、３−１４−３ＭＯＥ、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。表１２に挙げた最初のギャップマーは、残りのギャップマーをマイクロウォークによって設計する際の出発点とした元のギャップマー（表７参照）であり、これをアステリスク（＊）で示す。５−１０−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。３−１４−３ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１４個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。２−１３−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１３個の２’−デオキシヌクレオチドで構成される。中央のギャップは、５’端には２個のヌクレオチドを含むウイングが隣接し、３’端には５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接する。これらのモチーフ（５−１０−５、３−１４−３、および２−１３−５）のそれぞれについて、５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表１０に列挙する各ギャップマーは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）を標的とする。
【０２９５】
表１２に示すように、配列番号１の標的開始部位１５０９８で始まり標的終止部位１５１２２で終わる標的領域（すなわち核酸塩基１５０９８〜１５１２２）を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー、３−１４−３ＭＯＥギャップマー、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーはいずれも、第７因子ｍＲＮＡを少なくとも２５％阻害した。
【０２９６】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５０９８〜１５１２２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７６４３、４２２２０７、４２２２８４、４２２１３４、４２２２０８、４２２２８５、４２２１３５、４２２２０９、４２２２８６、４２２１３６、４２２２１０、４２２２８７、４２２１３７、４２２２１１、４２２２８８、４１６４７９、４２２２１２、および４２２２８９は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも２０％阻害した。
【０２９７】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５０９８〜１５１２２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７６４３、４２２２０７、４２２２８４、４２２１３４、４２２２０８、４２２２８５、４２２１３５、４２２２０９、４２２２８６、４２２１３６、４２２２８７、４２２１３７、４２２２１１、４２２２８８、４１６４７９、４２２２１２、および４２２２８９は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも３０％阻害した。
【０２９８】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５０９８〜１５１２２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７６４３、４２２２０７、４２２２８４、４２２１３４、４２２２０８、４２２１３５、４２２２０９、４２２２８６、４２２１３６、４２２２８７、４２２１３７、４２２２１１、４２２２８８、および４１６４７９は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも４０％阻害した。
【０２９９】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５０９８〜１５１２２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７６４３、４２２１３４、４２２２０８、４２２１３５、４２２２８６、および４２２１３６は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも５０％阻害した。
【０３００】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５０９８〜１５１２２）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７６４３および４２２１３４は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも６０％阻害した。
【表１２】

【０３０１】
表１３のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥ、３−１４−３ＭＯＥ、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。表１３に挙げた最初のギャップマーは、残りのギャップマーをマイクロウォークによって設計する際の出発点とした元のギャップマー（表７参照）であり、これをアステリスク（＊）で示す。５−１０−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。３−１４−３ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１４個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。２−１３−５ギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１３個の２’−デオキシヌクレオチドで構成される。中央のギャップは、５’端には２個のヌクレオチドを含むウイングが隣接し、３’端には５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接する。これらのモチーフ（５−１０−５、３−１４−３、および２−１３−５）のそれぞれについて、５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。表１１に記載の各ギャップマーは配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）を標的とする。
【０３０２】
表１３に示すように、配列番号１の標的開始部位１５１８８で始まり標的終止部位１５２１１で終わる標的領域（すなわち核酸塩基１５１８８−１５２１１）を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー、３−１４−３ＭＯＥギャップマー、および２−１３−５ＭＯＥギャップマーはいずれも、第７因子ｍＲＮＡを少なくとも４１％阻害した。
【０３０３】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５１８８〜１５２１１）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７９３５、４１６４８２、４２２１４９、４２２２２６、４２２０８５、４２２１５０、４２２２２７、４２２０８６、４２２１５１、４２２２２８、４２２１５２、４２２２２９、４２２０８７、４２２１５３、および４２２２３０は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも４０％阻害した。
【０３０４】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５１８８〜１５２１１）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７９３５、４１６４８２、４２２１４９、４２２０８５、４２２１５０、４２２２２７、４２２０８６、４２２１５１、４２２２２８、４２２１５２、４２２２２９、４２２０８７、４２２１５３、および４２２２３０は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも５０％阻害した。
【０３０５】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５１８８〜１５２１１）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７９３５、４１６４８２、４２２１４９、４２２０８５、４２２１５０、４２２２２７、４２２０８６、４２２１５１、４２２２２８、４２２１５２、４２２２２９、４２２０８７、４２２１５３、および４２２２３０は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも６０％阻害した。
【０３０６】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５１８８〜１５２１１）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４０７９３５、４２２０８５、４２２１５０、４２２０８６、４２２２２８、４２２１５２、４２２２２９、および４２２０８７は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも７０％阻害した。
【０３０７】
この標的領域（すなわち核酸塩基１５１８８〜１５２１１）内のギャップマーのいくつか、例えばＩＳＩＳ番号４２２０８６および４２２０８７は、第７因子ｍＲＮＡ発現を少なくとも８０％阻害した。
【表１３】

【０３０８】
（実施例７）
ＨｅｐＢ３細胞におけるヒト第７因子の用量応答アンチセンス阻害
ヒト第７因子のインビトロ阻害を示す実施例５および６のギャップマー（表７、８、９、１０、１１、１２、および１３参照）を、ＨｅｐＢ３細胞において、さまざまな用量で試験した。細胞を１ウェルあたり４，０００細胞の密度でプレーティングし、リポフェクチン試薬を使って、表１４に指定するように、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒト第７因子プライマープローブセットＲＴＳ２９２７を使ってｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第７因子の阻害百分率として表す。表１４に示すように、第７因子ｍＲＮＡレベルは用量依存的に減少した。
【表１４】

【０３０９】
これらのギャップマーをエレクトロポレーションでもトランスフェクトし、それらによるヒト第７因子ｍＲＮＡの用量依存的阻害を測定した。細胞を１ウェルあたり２０，０００細胞の密度でプレーティングし、表１５に指定するように、３．１２５μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。約１６時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒト第７因子プライマープローブセットＲＴＳ２９２７を使ってｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第７因子の阻害百分率として表す。表１５に示すように、第７因子ｍＲＮＡレベルは用量依存的に減少した。
【表１５】

【０３１０】
（実施例８）
ＨｅｐＢ３細胞におけるヒト第７因子の効果的な用量依存的アンチセンス阻害の選択および確認
実施例７でヒト第７因子のインビトロ阻害を示したギャップマーを選択し、ＨｅｐＢ３細胞において、さまざまな用量で試験した。細胞を１ウェルあたり２０，０００細胞の密度でプレーティングし、表１６に指定するように、３．１２５μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。約１６時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、ヒト第７因子ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒト第７因子プライマープローブセットＲＴＳ２９２７を使ってｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第７因子の阻害百分率として表す。表１６に示すように、第７因子ｍＲＮＡレベルは用量依存的に減少した。
【表１６】

【０３１１】
（実施例９）
短い（１４マー）オリゴヌクレオチドによるヒト第７因子のアンチセンス阻害
第７因子核酸を標的とするように短いアンチセンスオリゴヌクレオチド（ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ））を設計した。表１７のショートマーを２−１０−２ＭＯＥギャップマーとして設計した。これらのギャップマーは１４ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ２個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５−メチルシチジンである。
【０３１２】
ショートマーを、ＨｅｐＢ３細胞におけるヒト第７因子ｍＲＮＡを減少させるその能力について評価し、表１６に記載する５−１０−５キメラオリゴヌクレオチドの１つ、ＩＳＩＳ４０７９３９と比較した。９６穴プレート中、１ウェルあたり２０，０００細胞の密度のＨｅｐＢ３細胞を、エレクトロポレーションにより、１，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処理期間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第７因子ｍＲＮＡの阻害百分率として、表１７に記載する。ＩＳＩＳ４０７９３９は、ショートマーの比較対象とした表１８中の最初のオリゴヌクレオチドであり、これにはアステリスク（＊）を付す。
【０３１３】
表１７に列挙する各ギャップマーは、ヒト遺伝子配列である配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００〜１２７３０００）または配列番号２（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０１９６１６．２）を標的とする。「標的開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でギャップマーが標的とする最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でギャップマーが標的とする最も３’側のヌクレオチドを示す。
［表１７］
配列番号１または配列番号２を標的とする２−１０−２ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第７因子ｍＲＮＡレベルの阻害
【表１７−１】

【表１７−２】

【表１７−３】

【表１７−４】

【表１７−５】

【表１７−６】

【０３１４】
（実施例１０）
インビトロでのマウス第７因子のアンチセンス阻害
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを５−１０−５ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップとして、マウス第７因子（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０３９４５５．６のヌクレオチド１００２４０００〜１００３７０００；本明細書には配列番号１６０として組み込まれる）を標的とするように設計した。これらのギャップマーは２０ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側（５’方向および３’方向）に、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。各ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて５’メチルシチジンである。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、初代マウス肝細胞におけるマウス第７因子ｍＲＮＡを減少させるその能力について評価した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、初代マウス肝細胞における第７因子ｍＲＮＡを減少させるその能力について評価した。
【０３１５】
初代マウス肝細胞を６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで約２４時間にわたって処理した。ＲＮＡを細胞から単離し、第７因子ｍＲＮＡレベルを、本明細書で説明するように、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。マウス第７因子プライマープローブセットＲＴＳ２８５５（フォワード配列ＡＡＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＡ、配列番号６１２；リバース配列ＴＧＴＡＡＡＣＡＡＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧＧＴ、配列番号６１３；プローブ配列ＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＸ、配列番号６１４）を使って、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される全ＲＮＡ含有量に応じて、第７因子ｍＲＮＡレベルを調節した。いくつかのマウスアンチセンスオリゴヌクレオチドが、第７因子ｍＲＮＡレベルを用量依存的に減少させた。
【０３１６】
（実施例１１）
インビボでのマウス第７因子のアンチセンス阻害
インビトロ試験で有意な用量依存的阻害を示す４つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１０参照）を、インビボで第７因子ｍＲＮＡを減少させるその能力について評価した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、マウス第７因子ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０３９４５５．６のヌクレオチド１００２４０００〜１００３７０００；配列番号１６０）を標的とする。それら４つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的開始部位は次のとおりである：１１３２６、１１３３６、１１６１３、および１１７６６。
【０３１７】
処置
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＩＳＩＳ４０３１０２（ＣＣＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧ、標的部位１１３３６、本明細書には配列番号１６１として組み込まれる）で処置した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を、週に２回、３週間にわたって皮下注射した。対照マウス群には、ＰＢＳを週に２回、３週間にわたって皮下注射した。処置期間後に、肝臓全体をＲＮＡ分析およびタンパク質分析のために集め、血漿を凝固分析（ＰＴ／ａＰＴＴ）のために集めた。
【０３１８】
ＲＮＡ分析
第７因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析用にＲＮＡを肝臓組織から抽出した。表１８に示すように、ＩＳＩＳ４０３１０２は、ＰＢＳ対照と比較して、マウス第７因子の用量依存的減少を達成した。結果を、対照と比較した第７因子の阻害百分率として表す。
【表１８】

【０３１９】
タンパク質分析
第７因子発色アッセイ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ）を使って血漿第７因子タンパク質を測定した。表１９に示すように、ＩＳＩＳ４０３１０２は、ＰＢＳ対照と比較してマウス第７因子タンパク質の用量依存的減少を達成した。結果を、対照と比較した第７因子の阻害百分率として表す。
【表１９】

【０３２０】
凝固分析
ＩＳＩＳ４０３１０２で処置したマウスから得た乏血小板血漿（ＰＰＰ）を使って、プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定した。表２０に記載するＰＴ値およびａＰＴＴ値は、国際標準化比（ＩＮＲ）値として報告する。ＰＴおよびａＰＴＴに関するＩＮＲ値を決定するために、実験群に関するＰＴ値またはａＰＴＴ値をＰＢＳ処置群に関するＰＴまたはａＰＴＴで割った。次に、この比を、使用した組織因子の国際感受性指標（ＩＳＩ）で累乗した。表２０に示すように、ＰＴは、対照と比較して、ＩＳＩＳ４０３１０２で処置されたマウスでは、有意に延長された。ａＰＴＴはＩＳＩＳ４０３１０２で処置されたマウスではわずかに延長された。これらのデータは、ＩＳＩＳ４０３１０２が血液凝固の内因性経路よりも血液凝固の外因性経路に対して、より大きな影響を有することを示唆している。
【表２０】

【０３２１】
（実施例１２）
ＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与薬物動態アッセイ
処置
マウスにおけるＩＳＩＳ４０３１０２の作用の半減期および持続期間を評価した。２７匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる群に、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を注射した。ＩＳＩＳ４０３１０２を単回投与した後、１、２、３、４、６、８、１２、２４、および５６日目に、この群のマウス３匹を屠殺した。３匹のマウスからなる対照群にはＰＢＳを単回投与し、この群のマウスは１日目に屠殺した。すべての群のマウスを、１０ｍｇ／ｋｇキシラジンと混合した１５０ｍｇ／ｋｇケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した後、頸椎脱臼によって屠殺した。肝臓をＲＮＡ分析用に収集し、血漿を凝固分析（ＰＴおよびａＰＴＴ）用に集めた。
【０３２２】
ＲＮＡ分析
第７因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析用に、ＲＮＡを肝臓組織から抽出した。結果を、ＰＢＳ対照と比較した第７因子の阻害百分率として記載する。表２１に示すように、ＩＳＩＳ４０３１０２による処置は４日目までに第７因子ｍＲＮＡの９２％阻害をもたらし、その後、ＩＳＩＳ４０３１０２の効果は徐々に減少し、２４日目までには１１％まで低下した。５６日目までに、ＩＳＩＳ４０３１０２処置マウスにおける第７因子ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ対照のレベルと等しくなる。結果を、対照と比較した第７因子の阻害百分率として表す。これらのデータは、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与のピーク効果が４日目付近で起こり、作用の持続期間が少なくとも２４日間は続くことを示している。
【表２１】

【０３２３】
ＰＴおよびａＰＴＴアッセイ
ＩＳＩＳ４０３１０２で処置したマウスから得た乏血小板血漿（ＰＰＰ）を使ってプロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定した。表２２に記載するＰＴ値およびａＰＴＴ値は、国際標準化比（ＩＮＲ）値として報告する。ＰＴおよびａＰＴＴに関するＩＮＲ値を決定するために、実験群（すなわち５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ４０３１０２による処置）に関するＰＴ値またはａＰＴＴ値をＰＢＳ処置群に関するＰＴまたはａＰＴＴで割った。次に、この比を、使用した組織因子の国際感受性指標（ＩＳＩ）で累乗した。
【０３２４】
表２２に示すように、ＰＴは１日目の１．１１から４日目の１．９７まで増加した。ＰＴは、４日目の後、５６日目にＰＴが１．１０に達するまで、徐々に減少した。ａＰＴＴは１．００から４日目の１．２４まで増加した。ａＰＴＴは、４日目の後、ａＰＴＴが５６日目に０．９７に達するまで、徐々に減少した。ｍＲＮＡ発現データ（上記）と合致して、これらのデータは、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与のピーク効果が４日目付近で起こり、作用の持続期間が少なくとも２４日間は続くことを示している。
【表２２】

【０３２５】
（実施例１３）
ＩＳＩＳ４０３１０２の複数回投与薬物動態アッセイ
処置
マウス第７因子のアンチセンス阻害および凝固時間に対するＩＳＩＳ４０３１０２の複数回投与の作用の持続期間を評価した。第１のマウス群では、２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を単回投与として皮下注射した。第１群のマウスは単回投与後の１日目および３日目に屠殺した。第２のマウス群では、２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を、週に２回、１週間にわたって皮下投与した。第２群のマウスは、ＩＳＩＳ４０３１０２の最後の投与を行った後、３日目に屠殺した。第３のマウス群では、２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を週に２回、２週間にわたって皮下投与した。第３群のマウスは、ＩＳＩＳ４０３１０２の最後の投与を行った後、３日目に屠殺した。第４のマウス群では、２５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を、週に２回、３週間にわたって皮下投与した。第４群のマウスは、ＩＳＩＳ４０３１０２の最後の投与を行った後、２、７、１４、２８、４２、および５６日目に屠殺した。３匹のマウスからなる対照群には、ＰＢＳを単回投与として注射した。対照群のマウスは、１日後に屠殺した。すべての群のマウスを、１０ｍｇ／ｋｇキシラジンと混合した１５０ｍｇ／ｋｇケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した後、頸椎脱臼によって屠殺した。すべての群のマウスについて、肝臓をＲＮＡ分析用に収集し、血漿を凝固分析（ＰＴおよびａＰＴＴ）用に集めた。
【０３２６】
ＲＮＡ分析
第７因子の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、ＲＮＡを肝臓組織から抽出した。結果を、ＰＢＳ対照と比較した第７因子の阻害百分率として記載する。表２３に示すように、ＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与処置は、早くも１日目には、第７因子の阻害をもたらした。単回投与処置群では、阻害は３日目まで増加した。２回のＩＳＩＳ４０３１０２投与は、３日目に、ＩＳＩＳ４０３１０２の１回投与と比較して増加した阻害をもたらした。阻害は、２回投与処置群では、３日目まで増加した。ＩＳＩＳ４０３１０２の４回投与は、３日目に、２回投与処置群と比較して増加した阻害をもたらした。
【０３２７】
ＩＳＩＳ４０３１０２の６回投与は、７日目に、ＩＳＩＳ４０３１０２の６回投与における２日目と比較して増加した阻害をもたらした。ＩＳＩＳ４０３１０２の６回投与で処置されたマウスでは、第７因子阻害が、１４、２８、４２、および５６日目には、次第に低下した。
【表２３】

【０３２８】
ＰＴおよびａＰＴＴアッセイ
ＩＳＩＳ４０３１０２で処置したマウスから得た乏血小板血漿（ＰＰＰ）を使ってプロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定した。表２４に記載するＰＴ値およびａＰＴＴ値は、国際標準化比（ＩＮＲ）値として報告する。ＰＴおよびａＰＴＴに関するＩＮＲ値を決定するために、実験群（すなわち５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ４０３１０２による処置）に関するＰＴ値またはａＰＴＴ値をＰＢＳ処置群に関するＰＴまたはａＰＴＴで割った。次に、この比を、使用した組織因子の国際感受性指標（ＩＳＩ）で累乗した。
【０３２９】
表２４に示すように、ＰＴは、ＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与で処置されたマウスの３日目では、ＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与で処置されたマウスの１日目と比較して増加した。３日目に、ＩＳＩＳ４０３１０２の２回投与で処置されたマウスでは、ＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与で処置されたマウスと比較して、ＰＴが増加した。ＩＳＩＳ４０３１０２の４回投与で処置されたマウスでは、ＰＴが、３日目に、ＩＳＩＳ４０３１０２の２回投与で処置されたマウスと比較して増加した。ＩＳＩＳ４０３１０２の６回投与を受けたマウスでは、ＰＴが、７日目から５６日目まで減少した。
【０３３０】
ＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与で処置されたマウスでは、３日目に、ＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与で処置されたマウスの３日目と比較して、ａＰＴＴが、わずかに増加した。３日目に、ＩＳＩＳ４０３１０２の２回投与で処置されたマウスでは、ＩＳＩＳ４０３１０２の単回投与で処置されたマウスと比較して、ａＰＴＴが増加した。３日目に、ＩＳＩＳ４０３１０２の４回投与で処置されたマウスでは、ＩＳＩＳ４０３１０２の２回投与で処置されたマウスと比較して、ａＰＴＴが増加した。ＩＳＩＳ４０３１０２の６回投与を受けたマウスでは、ａＰＴＴが７日目から５６日目まで減少した。
【表２４】

【０３３１】
（実施例１４）
ＦｅＣｌ_３誘発静脈血栓症（ＶＴ）モデルにおけるＩＳＩＳ４０３１０２による第７因子のアンチセンス阻害のインビボ効果
処置
３つのＢＡＬＢ／ｃマウス群に、２５ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を、皮下投与により、週に２回、３週間にわたって注射した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの２つの対照群はＰＢＳで、皮下投与により、週に２回、３週間にわたって処置した。マウスの半分ではＦｅＣｌ_３によって血栓形成を誘発させ、残りのマウスは尾出血についてアッセイした。ＩＳＩＳ４０３１０２またはＰＢＳの最後の投与を受けた２日後に、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇキシラジンと混合した１５０ｍｇ／ｋｇケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。第１対照群を除くすべてのＶＴマウス群において、血栓形成をＦｅＣｌ_３で誘発した。
【０３３２】
ＦｅＣｌ_３処置を受けるマウスでは、１０％ＦｅＣｌ_３溶液で前もって飽和させた一片の濾紙（２×４ｍｍ）を大静脈上に直接適用することによって、血栓形成を誘発した。曝露の３分後に、濾紙を取り除いた。濾紙適用の３０分後に、血栓を含有する一定の長さの静脈を、血小板分析用に切離した。肝臓をＲＮＡ分析用に集めた。
【０３３３】
ＲＮＡ分析
第７因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析用に、ＲＮＡを肝臓組織から抽出した。結果を、ＰＢＳ対照と比較した第７因子の阻害百分率として記載する。表２５に示すように、ＩＳＩＳ４０３１０２による処置は、ＰＢＳ対照と比較して、第７因子ｍＲＮＡの有意な用量依存的低下をもたらした。これらのデータは、第７因子の発現を阻害するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用できることを示している。
【表２５】

【０３３４】
血小板組成の定量
血栓形成の尺度として、大静脈中の血小板を定量するために、血小板因子４（ＰＦ−４）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量を使用した。結果を、２つのＰＢＳ処置対照群と比較した、ＩＳＩＳ４０３１０２群におけるＰＦ−４の百分率として記載する。表２６に示すように、ＩＳＩＳ４０３１０２による処置は、ＰＢＳ対照と比較して、ＰＦ−４の減少をもたらした。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血栓および血塊形成を阻害するのに役立つ。
【表２６】

【０３３５】
尾出血アッセイ
ＦｅＣｌ_３溶液による処置を受けていないマウスを尾採血チャンバーで評価した。ＩＳＩＳ４０３１０２またはＰＢＳの最終処置の２日後にマウスを採血チャンバーに入れた。イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を使ってマウスをチャンバー内で麻酔し、尾の小片（先端から約４ｍｍ）を滅菌した鋏で切断した。切断した尾を直ちに、３７℃に温めた約１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌバッファー溶液を充填した１５ｍＬファルコンチューブに入れた。血液を４０分間にわたって集めた。その食塩水充填チューブの重量を採血の前後に計測した。結果を表２７に記載する。
【０３３６】
２５ｍｇ／ｋｇおよび３７．５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２による処置は、ＰＢＳ処置マウスと比較して、出血量のわずかな減少を引き起こした。出血は、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２で処置したマウスとＰＢＳで処置したマウスでは、同じだった。これらのデータは、ＩＳＩＳ４０３１０２による処置が出血傾向を増加させないことを示唆している。
【表２７】

【０３３７】
（実施例１５）
ワルファリンと比較したＩＳＩＳ４０３１０２によるマウス第７因子のインビボアンチセンス阻害
処置
ＩＳＩＳ４０３１０２およびワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ（登録商標））をＢＡＬＢ／ｃマウスで評価した。４つのＢＡＬＢ／ｃマウス群を、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２の皮下投与により、週に２回、３週間にわたって処置した。最後のＩＳＩＳ４０３１０２の投与を行った２日後に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇキシラジンと混合した１５０ｍｇ／ｋｇケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。５番目のＢＡＬＢ／ｃマウス群は３ｍｇ／ｋｇのワルファリンの腹腔内投与により、６日間にわたって毎日処置した。ワルファリンの最後の投与の４時間後に、マウスを屠殺した。対照ＢＡＬＢ／ｃマウス群は、ＰＢＳの皮下投与により、週に２回、３週間にわたって処置した。ＰＢＳの最後の投与の２日後に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇキシラジンと混合した１５０ｍｇ／ｋｇケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。第１対照群を除くマウス群では、ＦｅＣｌ_３を使って血栓形成を誘発した。
【０３３８】
ＦｅＣｌ_３処置を受けるマウスでは、１０％ＦｅＣｌ_３溶液で前もって飽和させた一片の濾紙（２×４ｍｍ）を大静脈上に直接適用することによって、血栓形成を誘発した。曝露の３分後に、濾紙を取り除いた。濾紙適用の３０分後に、血栓を含有する一定の長さの静脈を、血小板分析用に切離した。肝臓をＲＮＡ分析用に集めた。
【０３３９】
ＲＮＡ分析
第７因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析用に、ＲＮＡを肝臓組織から抽出した。結果を、ＰＢＳ対照と比較した第７因子の阻害百分率として記載する。表２８に示すように、ＩＳＩＳ４０３１０２による処置は、ＰＢＳ対照と比較して、第７因子ｍＲＮＡの有意な用量依存的減少をもたらした。逆に、ワルファリンによる処理は、ＰＢＳ対照と比較して第７因子の有意な減少をもたらさなかった。
【表２８】

【０３４０】
（実施例１６）
ワルファリンと比較したＦｅＣｌ_３誘発静脈血栓症（ＶＴ）モデルに対するマウス第７因子の用量依存的アンチセンス阻害の効果
処置
ＩＳＩＳ４０３１０２およびワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ（登録商標））をＢＡＬＢ／ｃマウスで評価した。４つのＢＡＬＢ／ｃマウス群を、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２の皮下投与により、週に２回、３週間にわたって処置した。ＩＳＩＳ４０３１０２の最後の投与を行った２日後に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇキシラジンと混合した１５０ｍｇ／ｋｇケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。さらに６つのＢＡＬＢ／ｃマウス群を、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ．ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇのワルファリンの腹腔内投与により、６日間、毎日処置した。最後のワルファリン投与の４時間後に、マウスを屠殺した。対照ＢＡＬＢ／ｃマウス群は、ＰＢＳの皮下投与により、週に２回、３週間にわたって処置した。最後のＰＢＳ投与の２日後に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇキシラジンと混合した１５０ｍｇ／ｋｇケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。第１対照群を除くマウス群では、ＦｅＣｌ_３を使って血栓形成を誘発した。
【０３４１】
ＦｅＣｌ_３処置を受けるマウスでは、１０％ＦｅＣｌ_３溶液で前もって飽和させた一片の濾紙（２×４ｍｍ）を大静脈上に直接適用することによって、血栓形成を誘発した。曝露の３分後に、濾紙を取り除いた。濾紙適用の３０分後に、血栓を含有する一定の長さの静脈を、血小板分析用に切離した。肝臓をＲＮＡ分析用に集めた。
【０３４２】
血小板組成の定量
血栓形成の尺度として、大静脈中の血小板を定量するために、血小板因子４（ＰＦ−４）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量を使用した。結果を、２つのＰＢＳ処置対照群と比較した、ＩＳＩＳ４０３１０２処置マウスまたはワルファリン処置マウスにおけるＰＦ−４の百分率として記載する。表２９に示すように、ＩＳＩＳ４０３１０２による処置は、５ｍｇ／ｋｇ以上の投薬量については、ＰＢＳ対照と比較して、ＰＦ−４の用量依存的減少をもたらした。ワルファリンによる処置は、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、ＰＢＳ対照と比較してＰＦ−４の減少をもたらした。したがって、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血栓および血塊形成を阻害するのに役立つ。
【表２９】

【０３４３】
（実施例１７）
ワルファリンと比較した尾出血アッセイにおけるマウス第７因子のアンチセンス阻害の効果
処置
ＩＳＩＳ４０３１０２またはワルファリンによる処置がマウスにおいて内出血を引き起こすかどうかを観察するために、尾出血を測定した。ＩＳＩＳ４０３１０２およびワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ（登録商標））を尾出血アッセイで評価した。６つのＢＡＬＢ／ｃマウス群を、１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２の皮下投与により、週に２回、３週間にわたって処置した。さらに６つのＢＡＬＢ／ｃマウス群を、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇのワルファリンの腹腔内投与により、６日間にわたって毎日処置した。別の対照ＢＡＬＢ／ｃマウス群をＰＢＳの皮下投与により、週に２回、３週間にわたって処置した。
【０３４４】
尾出血アッセイ
ＩＳＩＳ４０３１０２、ワルファリン、またはＰＢＳの最終処置の２日後に、マウスを尾採血チャンバーに入れた。イソフルオランを使ってマウスをチャンバー内で麻酔し、尾の小片（先端から約４ｍｍ）を滅菌した鋏で切断した。切断した尾を直ちに、３７℃に温めた約１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌバッファー溶液を充填した１５ｍＬファルコンチューブに入れた。血液を４０分間にわたって集めた。その食塩水充填チューブの重量を採血の前後に計測した。結果を表３０に記載する。
【０３４５】
ＩＳＩＳ４０３１０２による処置は、ＰＢＳ対照マウスと比較して、出血に有意な影響を及ぼさなかった。しかしワルファリンは、ＰＢＳ対照マウスと比較して、マウスにおける出血を増加させた。ワルファリン用量の増加は、失血の増加と正に相関した。これらのデータは、ＩＳＩＳ４０３１０２の出血傾向が、特にワルファリンと比較して低いことを示唆している。
【表３０】

【０３４６】
（実施例１８）
アピキサバンと比較した尾出血アッセイにおけるマウス第７因子のアンチセンス阻害の効果
処置
ＩＳＩＳ４０３１０２およびアピキサバンをＢＡＬＢ／ｃマウスで評価した。第１のＢＡＬＢ／ｃマウス群では、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を、週に２回、３週間にわたって皮下投与した。さらに３つのＢＡＬＢ／ｃマウス群を、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのアピキサバンの単回腹腔内投与、ならびに１０ｍｇ／ｋｇのアピキサバンの単回皮下投与によって処置した。対照ＢＡＬＢ／ｃマウス群は、ＰＢＳの皮下投与により、週に２回、３週間にわたって処置した。
【０３４７】
尾出血アッセイ
ＩＳＩＳ４０３１０２またはＰＢＳの最終処置の２日後に、マウスを尾採血チャンバーに入れた。アピキサバンで処置した群のマウスは単回投与の３０分後に分析した。イソフルオランを使ってマウスをチャンバー内で麻酔し、尾の小片（先端から約４ｍｍ）を滅菌した鋏で切断した。切断した尾を直ちに、３７℃に温めた約１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌバッファー溶液を充填した１５ｍＬファルコンチューブに入れた。血液を４０分間にわたって集めた。その食塩水充填チューブの重量を採血の前後に計測した。結果を表３１に記載する。
【０３４８】
ＩＳＩＳ４０３１０２で処置したマウスは、ＰＢＳ処置マウスより出血が少なかった。５ｍｇ／ｋｇのアピキサバンの腹腔内注射によって処置したマウスは、ＰＢＳ処置マウスと同じ出血量だった。１０ｍｇ／ｋｇのアピキサバンの腹腔内注射によって処置したマウスでは、ＰＢＳ処置マウスと比較して、出血が増加した。１０ｍｇ／ｋｇのアピキサバンの皮下注射によって処置したマウスは、ＰＢＳマウスよりも出血が少なかった。これらのデータは、ＩＳＩＳ４０３１０２の出血傾向が低いことを示唆している。
【表３１】

【０３４９】
（実施例１９）
がん転移に対するマウス第７因子のアンチセンス阻害のインビボ効果
ＩＳＩＳ４０３１０２による第７因子の阻害が組織因子−第７因子複合体の形成および転移時のがん細胞の管外遊出におけるその役割に及ぼす効果を評価する。２つの重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス群を、２０ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回、３週間にわたって注射されるＩＳＩＳ４０３１０２で処置する。対照マウス群にはＰＢＳを週に２回、３週間にわたって注射する。ＩＳＩＳ４０３１０２またはＰＢＳの最後の投与の２日後に、ＩＳＩＳ４０３１０２処置群の１つと対照群には、５０×１０^６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、静脈内注射する。
【０３５０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を注射した２週間後に、マウスを屠殺する。肺を収集し、ヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行う。結果をマウスシクロフィリンＡ ｍＲＮＡレベルで標準化する。ＩＳＩＳ４０３１０２およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞で処置した群におけるヒトＧＡＰＤＨレベルを、他の２つのマウス群におけるヒトＧＡＰＤＨレベルと比較する。この実験は、第７因子の阻害が、肺における転移の発生に及ぼす効果を評価するために計画される。
【０３５１】
（実施例２０）
肝線維症に対するマウス第７因子のアンチセンス阻害のインビボ効果
ＩＳＩＳ４０３１０２による第７因子の阻害が実験的肝線維症に及ぼす効果を四塩化炭素肝傷害モデルで評価する。
【０３５２】
処置
第１のＢＡＬＢ／ｃマウス群では、２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を週に２回、８週間にわたって皮下注射する。第２のマウス群では、ＰＢＳを週に２回、８週間にわたって皮下注射する。ＩＳＩＳ４０３１０２またはＰＢＳによる最初の処置の２週間後に、両方のマウス群に、９５μｌの鉱油に溶解した５μｌの四塩化炭素（ＣＣｌ_４）を、週に２回、５週間にわたって腹腔内投与する。第３のマウス群には、１００μｌの鉱油だけを注射する。マウスをイソフルオランによる麻酔後に、頸椎脱臼によって屠殺する。肝臓組織をすべてのマウスから収集する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使って、１型コラーゲン、α−平滑筋アクチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）３、ＴＧＦ−β、Ｔｉｍｐ１およびＴｉｍｐ２（ＭＭＰインヒビター）を含む線維症関連遺伝子の発現を決定する。実験群におけるレベルを対照マウスにおけるレベルと比較して、第７因子の阻害が肝線維症の発生に及ぼす効果を評価する。
【０３５３】
（実施例２１）
コラーゲン誘発関節炎に対するマウス第７因子のアンチセンス阻害のインビボ効果
ＩＳＩＳ４０３１０２による第７因子の阻害が、組織因子−第７因子複合体の形成ならびに関節炎および慢性関節リウマチにつながる関節中のフィブリン蓄積におけるその役割に及ぼす効果を、コラーゲン誘発関節炎モデルで評価する。
【０３５４】
処置
第１のＤＢＡ／１Ｊマウス群では、２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４０３１０２を、週に２回、８週間にわたって皮下注射する。２つのマウス群には、ＰＢＳを週に２回、８週間にわたって注射する。最初のＩＳＩＳ４０３１０２処置の２週間後に、ＩＩ型ウシコラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）を完全フロイントアジュバントと混合し、氷上でホモジナイズし、１００μｇのコラーゲンを含有するそのエマルションを実験群および第１対照群に皮下注射する。１回目のコラーゲン注射の７日後に、これらの群の両方に、１００μｇのＩＩ型コラーゲンが不完全フロイントアジュバントに入っているブースター注射剤を皮下注射する。
【０３５５】
すべての群のマウスを、１回目のコラーゲン注射後の１８日目から、末梢関節における関節炎の外観について、毎日検査する。関節炎の臨床的重症度を次のようにスコア化する：親指を除く各指の腫脹に対して１ポイント（最大４ポイント）、足根または手根関節に対して１ポイント、および足根中足または手根中手関節に対して１ポイントで、最大スコアは後肢については６、前肢については５。各足に個別に等級をつけて、マウス１匹あたりの累積関節炎スコアは最大２２ポイントに達する。実験群における関節炎を、対照群と比較して、第７因子の阻害が関節における関節炎の発生に及ぼす効果を評価する。
【０３５６】
最初のコラーゲン注射の６週間後に、最大レベルの関節炎が誘発されるだろう。マウスをイソフルオランで麻酔し、血漿を集めた後、マウスを頸椎脱臼によって屠殺する。第７因子ｍＲＮＡのＲＮＡ分析用に、肝臓を収集する。３つの群のすべてから集めた血漿を凝固時間（ＰＴおよびａＰＴＴ）について分析する。血漿中のトロンビン−アンチトロンビン（ＴＡＴ）複合体の測定もＥＬＩＳＡによって行う。実験群の結果を対照群と比較して、第７因子の阻害が、凝固時間およびＴＡＴ複合体の形成に及ぼす効果を評価する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、その核酸塩基配列が、配列番号１のヌクレオチド１５１２８〜１５２２３の同じ数の核酸塩基に相補的な少なくとも１２個の連続する核酸塩基部分を含み、その修飾オリゴヌクレオチドが配列番号１に少なくとも８０％相補的である化合物。
【請求項２】
一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる請求項１の化合物。
【請求項３】
修飾オリゴヌクレオチドが配列番号５３の核酸塩基配列を有する、請求項２の化合物。
【請求項４】
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号１６７のいずれかの核酸塩基配列に少なくとも８０％相補的である、請求項２の化合物。
【請求項５】
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号１６７のいずれかの核酸塩基配列に少なくとも９０％相補的である、請求項２の化合物。
【請求項６】
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号１６７のいずれかの核酸塩基配列に１００％相補的である、請求項２の化合物。
【請求項７】
少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項２の化合物。
【請求項８】
各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項７の化合物。
【請求項９】
少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項２の化合物。
【請求項１０】
少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である、請求項９の化合物。
【請求項１１】
少なくとも１つの修飾糖が２’−Ｏ−メトキシエチルを含む、請求項９の化合物。
【請求項１２】
少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項２の化合物。
【請求項１３】
修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項１２の化合物。
【請求項１４】
修飾オリゴヌクレオチドが、
連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項２の化合物。
【請求項１５】
修飾オリゴヌクレオチドが、
１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１４の化合物。
【請求項１６】
修飾オリゴヌクレオチドが、
１４個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
３個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
３個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１４の化合物。
【請求項１７】
修飾オリゴヌクレオチドが、
１３個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
２個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１４の化合物。
【請求項１８】
修飾オリゴヌクレオチドが、
１２個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
２個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；
２個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１３の化合物。
【請求項１９】
配列番号５３の核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドまたはその塩と、医薬上許容される担体または希釈剤とを含む組成物。
【請求項２０】
修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる、請求項１９の組成物。
【請求項２１】
修飾オリゴヌクレオチドが２０個の連結されたヌクレオシドからなる、請求項１９の組成物。
【請求項２２】
配列番号５３の核酸塩基配列の少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを動物に投与することを含む方法。
【請求項２３】
動物がヒトである、請求項２２の方法。
【請求項２４】
投与により深部静脈血栓症が予防される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
投与により肺塞栓症が予防される、請求項２３の方法。
【請求項２６】
投与により過剰増殖性障害が処置される、請求項２３の方法。
【請求項２７】
投与により炎症状態が処置される、請求項２３の方法。
【請求項２８】
前記化合物と、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、およびラブノックスから選択される群のいずれかとを併用投与することを含む、請求項２３の方法。
【請求項２９】
前記化合物と、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、およびラブノックスから選択される群のいずれかとが、同時に投与される、請求項２３の方法。
【請求項３０】
投与が非経口投与である、請求項２３の方法。
【請求項３１】
非経口投与が皮下投与または静脈内投与のいずれかである、請求項３０の方法。
【請求項３２】
血栓塞栓性合併症を有するリスクがある動物を同定すること、および
そのリスクがある動物に、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物の治療有効量を投与すること
を含む方法であって、その修飾オリゴヌクレオチドが第９因子核酸に相補的である方法。
【請求項３３】
血栓塞栓性合併症が深部静脈血栓症、肺塞栓症、またはそれらの組み合わせである、請求項３２の方法。

【公表番号】特表２０１１−５０２５１４（Ｐ２０１１−５０２５１４Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３３２２０（Ｐ２０１０−５３３２２０）
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６１８５１
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０５４２２０２８）アイシス　ファーマシューティカルズ　インコーポレイティッド (16)
【Ｆターム（参考）】