米品種判別用プライマー及びそれを用いた米品種判別方法
【課題】米品種の判別及び混米の有無を、簡便な操作で、短時間で効率的に、かつ安価で視認性に優れ、特別な装置や専門知識を必要とすることなく判別できる技術を提供する。
【解決手段】米品種の判別及び混米有無の判定に有用である米のゲノム配列における特定の領域を増幅しうるプライマーセットを用いた核酸増幅処理により得られる増幅産物の電気泳動による検出、及び該増幅産物と捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッド形成の検出による米品種の判別及び混米の有無を判定する。
【解決手段】米品種の判別及び混米有無の判定に有用である米のゲノム配列における特定の領域を増幅しうるプライマーセットを用いた核酸増幅処理により得られる増幅産物の電気泳動による検出、及び該増幅産物と捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッド形成の検出による米品種の判別及び混米の有無を判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米の品種の判別及びコシヒカリへの混米の有無を判定するためのプライマー及び捕獲オリゴヌクレオチド、これらを用いた米の品種を判別するための方法及びコシヒカリへの混米の有無を判定するための方法、並びに当該方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、現在２００種を超えるコメの品種が栽培されているが、改正ＪＡＳ法の施行により米の品種名の表示が義務づけられている。しかし、表示品種以外の米を混米しながら、表示を偽って販売する不正混米が一部で行われている。近年の消費者の良食味志向を受けてコシヒカリなどの良食味品種が高価格で取引される現状や、食品の情報公開への関心の高まりを考慮すると、米の品種名の表示の正確さは、行政的にも産業的にも重要な課題であり、混米による不正を防止する必要性等から、簡易で精度が高く、実用性の高い米の品種判別技術の開発が求められている。しかしながら、日本で栽培されている殆どの米品種は、数種の在来品種をベースとする極近縁種間の交配によって育成されてきた経緯により、これらは極めて類縁しており、形態学的に米の品種を判別することは非常に困難である。一方で、近年、米のゲノム配列の解析が進み、米の品種間で差異を示す遺伝的多型を利用した米の品種の判別が試みられている。このような手法として、ＳＴＳ法、ＤＮＡアレイを用いた検出法、ＳＮＰｓ法が用いられている。
【０００３】
ＳＴＳ法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅ）法は、精米からＤＮＡを抽出し、品種間で相違を示すプライマーを用いて核酸増幅反応（以下、単にＰＣＲともいう）を行い、核酸増幅の有無及び核酸増幅産物の大きさにより多型を判別する技術である。ＳＴＳ法を用いて米品種を判別する場合、判別する米品種により使用するプライマー対を選択する必要があり、米品種が不明な場合、使用するプライマー対の決定が困難であり実用的ではないという問題がある（特許文献１）。また、複数種のプライマー対を用いて複数品種の米を複数の判別グループに分類することもできるが、品種不明の米を試料とする場合に複数回のＰＣＲを行う必要があり操作が煩雑である（特許文献２）。また、特定品種への他品種の混米を確認する為には、複数種のプライマー対から調べたい品種に対応するプライマー対を検索する必要があり、混米の判定用プライマー対とは異なるプライマー対が米品種判別用のプライマー対として必要となり、操作が複雑である（特許文献２）。
【０００４】
また、ＳＴＳ法により米品種を判別する方法に用いるキットがいくつか市販されている。このようなキットとして、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」、ＴａＫａＲａ社製「平成１７年１８年産コシヒカリＢＬ判別用ＰＣＲキット」、ビジョンバイオ社製「品種判別用キット「お米鑑定団」」がある。しかし、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」は、コシヒカリに他品種のコメが混入しているか否かを確認する為に、１検体につきＫｉｔ I（ポジティブ検出）とＫｉｔ II（ネガティブ検出）の２回のＰＣＲが必要である為操作が煩雑である。また、品種の特定が出来ず、コシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）が混米と判定されることとなり、コシヒカリと判別できない。ＴａＫａＲａ社製「平成１７年１８年産コシヒカリＢＬ判別用ＰＣＲキット」は、上記の「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」で判別できなかったものについて再検査をする為に用いるものである。しかし、複数の米粒を一度に検査することは出来ず、米１粒１粒を検査しなければならないため、非常に煩雑である。また、ビジョンバイオ社製「品種判別用キット「お米鑑定団」」はコシヒカリと上位２０品種の判別を６種類のプライマーセットを用いて行うキットであるが、１検体を判別する為に６回のＰＣＲが必要となり簡便ではない。
【０００５】
ＤＮＡアレイを用いた検出法は、多数の捕獲オリゴヌクレオチドを支持体上に固定化し（以下、これをＤＮＡアレイ、または、単にアレイという）、標識ターゲット核酸を捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて捕獲し、ターゲット核酸の有無を解析する技術である。しかし、ＤＮＡアレイを用いて米品種を判別する場合、複数品種の米を判別する為のターゲット（ＰＣＲ産物）を作製するために複数種のマルチプレックスプライマーセットが必要となり、１検体につき複数回ＰＣＲを行う必要があり検査に手間がかかるという問題がある（特許文献３）。また、蛍光標識したＰＣＲ産物を検出し、蛍光強度を数値化して品種の判別を行うためには高価な装置が必要である（特許文献３及び４）。更に、限られた数の米品種は簡便に判別できるが、他の方法と比べて判別できる品種が少ないという問題もある（特許文献４）。
【０００６】
ＳＮＰｓ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法は、ＳＮＰ部位の１塩基手前までに対合するプライマーを用い、蛍光標識したヌクレオチドを一塩基だけ取り込ませる反応を行った後、各蛍光の偏光度を測定して取り込まれた塩基種を特定して多型を判定する技術である。ＳＮＰｓ法で米の品種を判別するには、判別する米品種によって、使用するプライマー対を選択する必要があり、米品種が不明の場合、使用するプライマー対の決定が困難であり実用的でないという問題がある（特許文献５）。また、特許文献５に基づいて、コシヒカリ１００％と表示されているコメが本当にコシヒカリ１００％であるかどうかを判別する「コメ奉行シリーズ「コシヒカリ判別キット」」（植物ゲノムセンター社製）というキットが市販されているが、コシヒカリに他の品種（８５品種）が混米している場合と、コシヒカリ純米の特定にのみ有効であり、米品種の判別はできない。
【０００７】
上述の通り、米の品種を判別するためにゲノム配列の遺伝的多型を利用した種々の方法が開発されている。しかし、上述の方法は、操作が複雑であって時間を要し、効率が悪いという欠点があった。したがって、米の品種判別検査に対する需要が高まり、被検米試料の数が急増している状況下、数多くの米品種を一括して、より簡便で高効率かつ正確に判別できる技術が求められている。
【特許文献１】特許第３６８５４７８号公報
【特許文献２】特開２００５−７３６５５号公報
【特許文献３】特開２００５−２４５２４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１５８２５３号公報
【特許文献５】特開２００６−１７４７１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、米試料の品種及び混米の有無を、簡便な操作で、かつ安価で視認性に優れ、短時間で効率的に判別及び判定できる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討した結果、米のゲノム配列における特定の領域が米品種の判別及び混米有無の判定に有用であること、及び該領域を検出しうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、ＰＣＲ産物の電気泳動パターンの差を指標として、及び／又は、ＰＣＲ産物とハイブリッド形成効率の差を指標として、該領域を効率よく検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の（１）〜（５）から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１〜１１のいずれか１つに表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対。
（１）下記の（ａ）〜（ｋ）から選択されるいずれか１つの組み合わせを構成する２種の塩基配列
（ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３
（ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４
（ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５
（ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６
（ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７
（ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８
（ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９
（ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０
（ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１
（ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２
（ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３
（２）前記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列
（３）前記（１）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）前記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
２．前項１に記載のプライマー対を少なくとも２種以上含むプライマーセット。
３．配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうる少なくとも１１種のプライマー対を含む前項２に記載のプライマーセット。
４．配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうるプライマー対が、以下の（Ａ）〜（Ｋ)のプライマー対である前項３に記載のプライマーセット。
（Ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
５．以下の（１）〜（５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択され、配列番号１〜１１のいずれか１つに表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（１）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列
（２）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列
（３）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち1ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
６．前項５に記載の捕獲オリゴヌクレオチドを少なくとも２種以上含む捕獲オリゴヌクレオチド群。
７．配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれ検出しうる少なくとも１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む前項６に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群。
８．配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれ検出しうる捕獲オリゴヌクレオチドが、以下の（I）〜（XIII）の捕獲オリゴヌクレオチドである前項７に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群
（I）配列番号３４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（II）配列番号３５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（III）配列番号３６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IV）配列番号３７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（V）配列番号３８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VI）配列番号３９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VII）配列番号４０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VIII）配列番号４１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IX）配列番号４２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（X）配列番号４３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XI）配列番号４４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XII）配列番号４５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XIII）配列番号４６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
９．以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とする米品種の判別方法。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、前項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
１０．更に、以下の（iii）及び/又は、（iv）の工程を行うことを特徴とする前項９に記載の米品種の判別方法。
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と前項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッド形成を検出する検出工程
１１．以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とするコシヒカリへの混米の有無を判定する方法。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、前項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
１２．更に、以下の（iii）及び/又は（iv）の工程を行うことを特徴とする前項１１に記載のコシヒカリへの混米の有無を判定する方法。
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と前項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッドを検出する検出工程
１３．前項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む米品種判別キット、又はコシヒカリへの混米判定キット。
１４．更に前項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群を含む前項１３に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のプライマーセットを用いれば、１回のＰＣＲによる増幅産物を電気泳動することにより、１５種以上の米品種の判別、コシヒカリ純米への他の１１８品種の混米の有無の判定、及びコシヒカリとコシヒカリＢＬとの判別が可能となる。更に、本発明の捕獲オリゴヌクレオチドによれば、本発明のプライマーによる核酸増幅産物と当該オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることにより、１１９品種もの米品種の判別、コシヒカリ純米への他の１１８品種の混米の有無の判定、及びコシヒカリとコシヒカリＢＬとの判別が可能となる。
【００１２】
したがって、本発明のプライマー及び本発明の捕獲オリゴヌクレオチドを用いる本発明の米品種の判別及び混米の有無の判定方法は、視認性に優れており、正確且つ簡便に米の品種を判別し、コシヒカリ純米への混米を判定できる。また、本発明の混米の判定方法は、ＰＣＲに供する試料のゲノムＤＮＡ量が０．０２５ｎｇ/２０μｌであっても混米の判定が可能である。更に、混米率が１％であれば確実に混米を判定できるという利点を有する。その上、当該被検米試料が炊飯米であっても、混米の有無の判定が可能であるという利点をも有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の米品種の判別方法及びコシヒカリへの混米の有無の判定方法は、以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とする。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、前記プライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
以下、各工程について説明する。
【００１４】
（i）核酸調製工程
核酸調製工程とは、被検米試料中から米の核酸を抽出・調製する工程である。被検米試料からの核酸の調製法は公知の核酸調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ Ｍ．Ｇ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｗ．Ｆ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，ｐ．４３２１−４３２５）、酵素法、アルカリＳＤＳ法等にしたがって調製することができる。これらの方法は植物のゲノムＤＮＡを抽出する標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを用いてもかまわない。また、例えば、Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ） Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の市販されているＤＮＡ抽出キットを使用して調製することができる。
【００１５】
前記被検米試料は、食用とする種子（米粒）のほか、苗も含む。また、種子としては、食用として市場に流通する精米、玄米などのほか、精米粉、玄米粉、更には、米飯、餅なども含まれる。ここで、米飯とは、精米や玄米を通常の電気炊飯器、ガス炊飯器、蒸気調理システム等によって炊飯して得られたものを指し、単に炊飯米ともいう。被検米試料は米由来の試料であれば特に限定されることはないが、好ましくは形態学的な品種の判別がより困難な、より好ましくは形態学的又は生化学的な品種の判別がさらに困難になる精米あるいは玄米あるいはそれらの加工品であるほうが、本発明の効果が顕著に発揮される。
【００１６】
（ii）核酸増幅工程
核酸増幅工程とは、工程（i）で調製した核酸を鋳型として、配列番号１〜１１で表される塩基配列のいずれか１つからなる核酸を増幅しうるプライマー対を含むプライマーセットを用いて、核酸増幅処理する工程である。
【００１７】
（プライマー）
本発明のプライマー対は、配列番号１〜１１で表される塩基配列のいずれか１つからなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対が好ましく、具体的には以下の（１）〜（５）から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなる。
（１）以下の（ａ）〜（ｋ）から選択されるいずれか１つの組み合わせを構成する塩基配列
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＴＣＴＡＴＡＣＡＴＧＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＴ−３´（配列番号１２）
リバースプライマー：５´−ＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴ−３´（配列番号２３）
（ｂ）配列番号２に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＣＣＣＧＣＡＧＴＴＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴＡＧＡＡ−３´（配列番号１３）
リバースプライマー：５´−ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＧＴＡＡＧ−３´（配列番号２４）
（ｃ）配列番号３に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＡＧＧＣＣＡＴＴＣＧＴＡＧＣＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＧ−３´（配列番号１４）
リバースプライマー：５´−ＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡ−３´（配列番号２５）
（ｄ）配列番号４に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＴ−３´（配列番号１５）
リバースプライマー：５´−ＣＡＣＣＴＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＴＴＧＴ−３´（配列番号２６）
（ｅ）配列番号５に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＴＧＴＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡ−３´（配列番号１６）
リバースプライマー：５´−ＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＴ−３´（配列番号２７）
（ｆ）配列番号６に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＣＴＣＡＡＣＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＡＣＡＣＡ-３´（配列番号１７）
リバースプライマー：５´−ＣＡＴＧＣＣＡＡＡＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＴＴ-３´（配列番号２８）
（ｇ）配列番号７に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＴＴＧＡ−３´（配列番号１８）
リバースプライマー：５´−ＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡ−３´（配列番号２９）
（ｈ）配列番号８に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＣＧＡＣＴＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＧＴＴ−３´（配列番号１９）
リバースプライマー：５´−ＡＧＣＴＴＴＣＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＣＧＴ−３´（配列番号３０）
（ｉ）配列番号９に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＴＣＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＣＴＣＡＧ−３´（配列番号２０）
リバースプライマー：５´−ＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＧＣＧ−３´（配列番号３１）
（ｊ）配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＧＣＴＡＡＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴ−３´（配列番号２１）
リバースプライマー：５´−ＣＴＡＣＧＴＧＧＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＡ−３´（配列番号３２）
（ｋ）配列番号１１に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧＣ−３´（配列番号２２）
リバースプライマー：５´−ＣＡＴＣＣＧＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＡＡ−３´（配列番号３３）
（２）前記（１）で選択された塩基配列と相補的な塩基配列
（３）前記（１）で選択された塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）前記（１）で選択された塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
【００１８】
本発明のプライマー対は、少なくとも２種以上の該プライマー対を含むプライマーセットとして使用することが好ましく、また、配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうる少なくとも１１種のプライマー対を含むプライマーセットとして使用することがより好ましい。
【００１９】
前記配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうるプライマー対としては、以下のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）が好適に挙げられる。
（Ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
【００２０】
本発明の配列番号１〜１１に表される塩基配列が由来する米の品種は、日本晴である。また、当該配列番号１〜１１における多型の有無などの情報は、Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍにて公開されているイネゲノム配列及びＲＦＬＰマーカー情報、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列などを基に見出したもの、ジェネティックアイディー株式会社、及び日本たばこ産業株式会社が独自に見出したものである。
【００２１】
前記配列番号１〜１１に表される塩基配列に多型が存在する場合、当該多型部位を含有する核酸を増幅しうることが好ましく、当該多型部位が挿入、欠失等により置換されていた場合に、核酸増幅処理による核酸増幅産物が得られにくいプライマーを設計することがより好ましい。ここで、米由来の核酸中に存在する多型とは、比較対象となる米同士での塩基配列の差異を意味し、１塩基〜数百塩基の置換、欠失、挿入、付加を含む概念である。
【００２２】
例えば、配列番号６に表される塩基配列の２１位、及び２８位に相当する位置、配列番号７に表される塩基配列の１４５位に相当する位置には多型が存在する。したがって、配列番号６、及び配列番号７に表される塩基配列からなる核酸増幅用のプライマーは、当該多型部位を含む塩基配列、当該多型部位に隣接する塩基配列等からなるプライマーが好ましい。
【００２３】
具体的には、例えば、配列番号６に表される塩基配列からなる核酸増幅用である上記プライマー対（Ｆ）を構成するフォワードプライマーは、塩基配列６に表される塩基配列の２1位における多型部位を含む塩基配列（配列番号１７）からなる配列が好ましい。また、配列番号７に表される塩基配列からなる核酸増幅用である上記プライマー対（Ｇ）を構成するリバースプライマーは、配列番号７の多型部位に隣接する部位の塩基配列（配列番号２９）からなる配列が好ましい。
【００２４】
上記配列における多型の位置はその位置よりも上流における配列中のヌクレオチドの挿入、欠失等によって変化しうる。上記の「相当する位置」とは、このように、遺伝子配列中の絶対的位置が変わった場合、配列番号１〜１１に表される基準配列中の相当位置を示す。すなわち、本発明における多型は、配列番号１〜１１で表される塩基配列と、識別対象となりうる被検米由来の核酸の塩基配列を比較することにより、配列番号１〜１１で表される塩基配列における多型に相当すると理解される多型を含む。
【００２５】
本発明の方法に使用するプライマーは、後の検出工程を考慮して、標識物質を含むこともできる。標識物質としては、当該技術分野においてよく知られる放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等を用いることができる。
【００２６】
本発明のプライマー又は後述する本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとしての機能を有するオリゴヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸などが含まれるが、ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましく、ＤＮＡがより好ましい。本発明に使用するオリゴヌクレオチドは遺伝子工学的手法、又は合成的方法により作製することができる。合成的方法としては、例えば、通常の固相合成法が挙げられる。当該方法による合成は、市販のＤＮＡ合成機を用いることにより合成することができる。
【００２７】
本発明のプライマー又は後述する本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとしての機能を有するオリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基を置換、欠失、挿入もしくは付加するといった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ，ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術［Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６］を利用することができる。
【００２８】
ここにおいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができ、その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）溶液、５０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ溶液中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ溶液で二次洗浄といった条件があげられる。
【００２９】
本工程において核酸増幅処理する方法については特に限定はなく、検出しようとする核酸断片が増幅可能であるような種々の核酸増幅方法を使用することができる。具体的にはＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などが用いられるが、中でもＰＣＲ法が好適に用いられる。この場合、本発明の上記プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の１１対のプライマー対を別々の反応系で個々に作用させて、それぞれの増幅産物を得てもよい。この場合はその後にこれらを１つの溶液となるよう混合することができる。また、上記プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）から選んだ複数のプライマー対を予め所定量ずつ一つの反応系に混合しておき、増幅反応を行ってもよい（以下この方法を「マルチプレックス法」という）。この場合は、最終的に上記プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全ての増幅産物が存在するような組合わせで増幅産物を混合し、一つの溶液を調製することができる。特にこのマルチプレックス法の中でも、上記プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全てを所定量ずつ混合した反応系で一度に増幅反応を行うことが簡便で効率的であることから最も好適である。このようなマルチプレックス法においてはマルチプレックスＰＣＲ法が好ましく用いられる。
【００３０】
上記のようにプライマー対が１１対ある場合には、通常、マルチプレックス法により増幅を行うと各プライマーごとの増幅効率のバランスが崩れ、特定の核酸が極端に増幅されてしまうという欠点がある。しかし本発明のプライマー対であれば、所定の仕込み量比で調製しておくことにより、一度のマルチプレックスＰＣＲでバランスよく各プライマー対に対応する増幅産物を得ることができる。
【００３１】
前記プライマー対の配合量比の具体例として、例えばプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）のＰＣＲ反応系への添加量（モル比）をプライマー対（Ａ）：プライマー対（Ｂ）：プライマー対（Ｃ）：プライマー対（Ｄ）：プライマー対（Ｅ）：プライマー対（Ｆ）：プライマー対（Ｇ）：プライマー対（Ｈ）：プライマー対（Ｉ）：プライマー対（Ｊ）：プライマー対（Ｋ）を、２：２：２：２：２：４：４：１：２：２：２とすることにより、一度のマルチプレックスＰＣＲでバランスよく核酸を増幅することができ、効率的な米品種及び混米の有無の判定が可能となる。
【００３２】
本発明の米品種の判別方法及びコシヒカリへの混米の有無の判定方法は、（i）核酸調製工程、及び、（ii）核酸増幅工程にくわえて、以下の（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程、及び／又は、（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出する検出工程を行ってもよい。
【００３３】
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
上記核酸増幅工程（ii）で得られた核酸増幅産物をゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などの慣用の電気泳動法により分離して検出し、得られた核酸増幅産物の長さに基づいて、被検試料中に含まれる米品種の判別、及びコシヒカリへの混米の有無を判定することができる。電気泳動に供する核酸増幅産物の量は、ゲル電気泳動の場合には、好ましくは１０〜１００ｎｇ、より好ましくは３０〜６０ｎｇの範囲内とする。
【００３４】
核酸増幅産物を電気泳動により検出して米の品種を判別する場合には、検出すべき米の品種によって得られる核酸増幅産物の長さが異なるようにプライマーセットを設計する。また、核酸増幅産物を電気泳動により検出してコシヒカリへの混米の有無を判定する場合、上記したプライマー対から選択される、少なくとも配列番号２、６、更には９及び／又は１０で表される塩基配列からなる核酸を増幅しうるプライマー対［例えば前記プライマー対（Ｂ）、（Ｆ）、更には（Ｉ）及び／又は（Ｊ）］を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。また、米の品種の判別及びコシヒカリへの混米の有無について、電気泳動によりさらに細かく判別する場合には、上記した本発明プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全１１種のプライマー対を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。
【００３５】
更に、核酸増幅産物を電気泳動により検出してコシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）とコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、上記したプライマー対から選択される、少なくとも配列番号２、７、９、１０で表される塩基配列からなる核酸を増幅しうるプライマー対［例えば前記プライマー対（Ｂ）、（Ｇ）、（Ｉ）、（Ｊ）］を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。また、コシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）とコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、電気泳動によりさらに細かく判別する場合には、上記した本発明プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全１１種のプライマー対を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。
【００３６】
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出する検出工程
上記核酸増幅工程（ii）により得られた核酸増幅産物と支持体上に固定した本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションシグナルの有無を検出することにより、米の品種判別及びコシヒカリへの混米の有無を判定することができる。
【００３７】
ＤＮＡアレイに供する核酸増幅産物の量は、好ましくは３５〜２５０ｎｇ、より好ましくは７０〜２００ｎｇの範囲内とする。また、核酸増幅産物は、捕獲オリゴヌクレオチドと当該核酸増幅産物とのハイブリッド形成を検出するために、標識されていることが好ましい。
【００３８】
核酸の標識方法は、ハイブリッド形成を阻害しない方法であれば特に制限されないが、このような方法としては、標識物質を用いて、ターゲット核酸の増幅に使用するプライマーを予め標識しておく方法、ターゲット核酸の作製中に標識する方法、及び、ターゲット核酸の作製後に標識する方法が例示できる。
【００３９】
上記標識物質は通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができ、特に限定されるものではないが、例えば、このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられ、蛍光物質としては具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしては具体的にはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００４０】
核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出して米の品種を判別する場合には、検出すべき米の品種によってハイブリダイゼーションシグナルの有無に差異が出現するようにプライマーセットを設計する。また、核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をＤＮＡアレイにより検出してコシヒカリへの混米の有無を判定する場合、上記したプライマー対から選択される、少なくとも配列番号２、６、更には９及び／又は１０で表される塩基配列からなる核酸を増幅しうるプライマー対［例えば前記プライマー対（Ｂ）、（Ｆ）、更には（Ｉ）及び／又は（Ｊ）］を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。また、米の品種の判別及びコシヒカリへの混米の有無の判定について、核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出してさらに細かく判別する場合には、上記した本発明のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全１１種のプライマー対を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。
【００４１】
更に、核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出してコシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）とコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、上記したプライマー対から選択される、少なくとも配列番号２、７、９、１０で表される塩基配列からなる核酸を増幅しうるプライマー対［例えば（Ｂ）、（Ｇ）、（Ｉ）、（Ｊ）］を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。また、コシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）とコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によりさらに細かく判別する場合には、上記した本発明のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全１１種のプライマー対を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。
【００４２】
（捕獲オリゴヌクレオチド）
本発明の捕獲オリゴヌクレオチドは、前記配列番号１〜１１で表される塩基配列を検出しうる１０〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドが好ましく、具体的には以下の（I）〜（XIII）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択される。
（I）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＡＴＧ−３´（配列番号３４）
（II）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＡＴＧ−３´（配列番号３５）
（III）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＧＡＣＡＡＣＴＡＴＣＴＡＣＣＡ−３´（配列番号３６）
（IV)配列番号４で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＧＧ−３´（配列番号３７）
（V）配列番号５で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＧ−３´（配列番号３８）
（VI）配列番号６で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＡＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＡＧＴ−３´（配列番号３９）
（VII）配列番号７で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＣＣＡ−３´（配列番号４０）
（VIII）配列番号８で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣ−３´（配列番号４１）
（IX）配列番号９で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＡＣＴＣＣＴＡＧＡＴＧＣＧＴＡ−３´（配列番号４２）
（X）配列番号９で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＴＡＴＡＴＡＣＧＣＡＴＣＴＡＧ−３´（配列番号４３）
（XI）配列番号１０で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＴＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＣＴＣＡ−３´（配列番号４４）
（XII）配列番号１０で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＡＧＣＣＡＴＴＣＴＡＴＡＧＧＡ−３´（配列番号４５）
（XIII）配列番号１１で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＧＧＴＴＡ−３´（配列番号４６）
【００４３】
本発明の捕獲オリゴヌクレオチドは、（１）上記配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列のほか、以下の（２）〜（５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択され、配列番号１〜１１で表される塩基配列のいずれか１つからなる核酸を検出しうるオリゴヌクレオチドを含む。
（２）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列
（３）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列
【００４４】
本発明の捕獲オリゴヌクレオチドは、該捕獲オリゴヌクレオチドを少なくとも２種以上含むオリゴヌクレオチド群として使用することが好ましく、配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれに検出しうる１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを少なくとも含む捕獲オリゴヌクレオチド群として使用することが好ましい。
【００４５】
前記配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれに検出しうる捕獲オリゴヌクレオチドとしては、以下の（I）〜（XIII）の捕獲オリゴヌクレオチドが好適に挙げられる。
（I）配列番号３４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（II）配列番号３５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（III）配列番号３６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IV）配列番号３７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（V）配列番号３８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VI）配列番号３９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VII）配列番号４０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VIII）配列番号４１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IX）配列番号４２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（X）配列番号４３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XI）配列番号４４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XII）配列番号４５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XIII）配列番号４６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
【００４６】
前記配列番号１〜１１で表される塩基配列において多型部位が存在する場合、捕獲オリゴヌクレオチドは該多型部位を含む塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列からなることが好ましい。また、配列番号１〜１１の塩基配列において、塩基が置換、欠失及び／又は付加された場合も、当該多型部位を含む塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列からなる捕獲オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００４７】
具体的には、配列番号９に表される塩基配列の５５位に相当する位置には多型が存在する。したがって、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸検出用の捕獲オリゴヌクレオチドは、当該多型部位を含む塩基配列からなることが好ましい。具体的には、例えば、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸検出用の上記捕獲オリゴヌクレオチド（IX）は、配列番号９に表される塩基配列の５５位における多型部位を含む塩基配列（配列番号４２）からなることが好ましい。
【００４８】
また、前記配列番号１〜１１に表される塩基配列において、品種による欠失、挿入等の差異が高頻度で生じる部位がある場合、当該部位を含む塩基配列及び当該部位を含まない塩基配列からなる２種の捕獲オリゴヌクレオチドを併用することが好ましい。例えば、配列番号９の３８〜４５位、配列番号１０の３５〜４４位の塩基配列は、米品種により欠失する部位である。したがって、配列番号９及び１０に表される塩基配列からなる核酸検出用の捕獲オリゴヌクレオチドは、当該欠失部位を含む塩基配列及び当該欠失部位を含まない塩基配列からなることが好ましい。
【００４９】
具体的には、例えば、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸検出用の上記捕獲オリゴヌクレオチド（IX）は、配列番号９に表される塩基配列における上記欠失部位を一部含む塩基配列（配列番号４２）からなり、捕獲オリゴヌクレオチド（X）は、当該欠失部位を含まない塩基配列（配列番号４３）からなることが好ましい。また、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸検出用の上記捕獲オリゴヌクレオチド（XI）は、配列番号１０に表される塩基配列における上記欠失部位を含む領域の塩基配列であり、当該欠失部位を含まない配列（配列番号４４）からなり、捕獲オリゴヌクレオチド（XII）は上記欠失部位を含む領域の塩基配列であり、かつ、当該欠失部位を含む配列（配列番号４５）からなることが好ましい。
【００５０】
核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出し、コシヒカリへの混米の有無を判定する場合、配列番号２、６、９、１０に表される塩基配列を検出できる捕獲オリゴヌクレオチド［例えば上記捕獲オリゴヌクレオチド（II）、（VI）、（IX）、（X）、（XI）、（XII）］を少なくとも用いることが好ましい。また、ＤＮＡアレイにより核酸増幅産物を検出し、コシヒカリＢＬとコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリを判別する場合、配列番号２、７、９、１０に表される塩基配列を検出できる捕獲オリゴヌクレオチド［例えば上記捕獲オリゴヌクレオチド（II）、（VII）、（IX）、（X）、（XI）、（XII）］を少なくとも用いることが好ましい。また、コシヒカリへの混米の有無の判定及び／又はコシヒカリＢＬとコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出してさらに細かく判別する場合には、上記した本発明の捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）の全１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む捕獲オリゴヌクレオチド群を用いることが好ましい。
【００５１】
核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出し、米の品種を判別する場合、支持体に固定する捕獲オリゴヌクレオチドは、単数でも複数でもよいが、品種をより正確に特定するためには、複数の捕獲オリゴヌクレオチドを含む捕獲オリゴヌクレオチド群を用いることが好ましく、上記した本発明の捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）の全１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む捕獲オリゴヌクレオチド群を用いることがより好ましい。ここで、複数用いる場合の捕獲オリゴヌクレオチドの選択は、当該捕獲オリゴヌクレオチドが判別することができる米の品種と判別したい米の品種、判別したい米の品種、判別したい米が該当する可能性のある米の品種の情報を参酌することにより、適宜設計する。また、極めて近縁の品種を確実に判別するために、同一の支持体上で複数、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは１５以上の多型を網羅的に検出することが、操作の簡便性及び識別の正確性と迅速性の観点から好ましい。
【００５２】
（支持体）
捕獲オリゴヌクレオチドを固定する支持体は、捕獲オリゴヌクレオチドを安定して固定することができ、被検米試料に由来する核酸とのハイブリッド形成及び、ハイブリッドの検出に必要な反応工程に耐え得るものであれば、その材質は特に制限されず、例えばスライドガラス、有機高分子、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等を使用することができる。
【００５３】
前記有機高分子としては、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビリニデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等が挙げられる。また、無機高分子としては、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及び、グラファイト等が挙げられる。また、金属としては、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット等が挙げられる。また、天然高分子としては、ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及び、それらの誘導体等が挙げられる。また、セラミックとしては、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び、炭化ホウ素等が挙げられる。
【００５４】
支持体の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、板状、フィルム状、膜状、粒子状等の支持体を好適に用いることが出来るが、板状のものが好ましい。
【００５５】
本発明においては、担体を支持体に担持させて、担体を介して捕獲オリゴヌクレオチドを支持体に固定化してもよい。担体としては、担体自体が捕獲オリゴヌクレオチドに結合性を有してもよく、捕獲オリゴヌクレオチドに結合性を有するリンカーを介して捕獲オリゴヌクレオチドを固定化できるものであってもよい。ここで「担持」とは、捕獲オリゴヌクレオチドの支持体上担体への固定化、及び、当該支持体によるハイブリダイゼーションシグナル検出等の際に、洗浄等の目的で使用される水溶性溶剤や有機溶剤等の各種溶剤によって、上記担体が支持体から実質的に脱離しないことを意味する。
【００５６】
前記担体は、上記支持体上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、支持体上の全面において担持されていても、また、その一部において担持されていてもよい。
【００５７】
前記担体としては、有機低分子、有機高分子、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙げられる。ここで、有機低分子としては、例えば、カルボジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、アミノ基含有化合物等が挙げられる。また、有機高分子、無機高分子、金属、セラミックは、前記したものと同様のものを使用することができる。本発明において特に好ましい担体は、カルボジイミド基含有化合物又はイソシアネート基含有化合物である。
【００５８】
（捕獲オリゴヌクレオチドの支持体への固定）
捕獲オリゴヌクレオチドを支持体に固定する手段は、米品種の判別又は混米の有無の判定ができれば特に制限されるものでなく、公知の方法を適宜選択して用いれば良い。例えば、単に物理的な接着性を利用して固定されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して固定されていてもよい。また、紫外線等の電磁波を照射することによって固定することもできる。更に、捕獲オリゴヌクレオチドとカルボジイミド樹脂、窒素イペリット、ポリアミノ酸、ニトロセルロース等の公知の化合物を化学的に結合又は物理的に結合した状態で、これら混合物と担体を接触させ固定させても良く、また、このとき適宜紫外線等の電磁波を照射して固定を行うこともできる。ここで、支持体において上記捕獲オリゴヌクレオチドを固定する場所については、支持体の全面であっても、また、その一部にであってもよい。
【００５９】
また、捕獲オリゴヌクレオチドを支持体上に固定化する際、固定化されたオリゴヌクレオチドが占める場所の形状は、被検米試料に由来する核酸とのハイブリッド形成に影響を及ぼさず、また、検出が困難にならなければ特にその形状は制限されないが、例えば、円形、四角形などが挙げられる。
【００６０】
固定化に用いられる具体的な手段としては、分注機器を用いる方法、ピン式スポット機器を用いる方法、インクジェット式スポット機器を用いる方法などが例示でき、これらにより捕獲オリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形の形状にて支持体の一部分に固定化できる。
【００６１】
支持体上へ各捕獲オリゴヌクレオチドが固定化される部位のサイズは、直径１０μｍ〜１,０００μｍのサイズに固定されることが好ましい。これより小さいと検出が困難になり、また、これより大きいと配置された捕獲オリゴヌクレオチド全体の占める面積が大きくなり、操作性が悪くなるという問題が生じることがある。
【００６２】
各捕獲オリゴヌクレオチドの支持体上への配置は、米品種の判別または混米の有無の判定が出来れば特に制限されないが、これらの判別または判定を容易にするために捕獲オリゴヌクレオチドを１区画にまとめるか、あるいは一列に並べるなどして配置することが好ましい。
【００６３】
なお、担体を支持体に担持させて、担体を介して捕獲オリゴヌクレオチドを支持体に固定する場合、捕獲オリゴヌクレオチドの固定は、担体に直接担持させる方法のほか、捕獲オリゴヌクレオチドに担体との結合性を有するリンカーを介して担体に担持させる方法により行うことができる。ここで、リンカーとしては、例えばカルボジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物及びアミノ基含有化合物等が挙げられ、より具体的には核酸ホモポリマーを有するリンカー（ＤＮａｔｔａｃｈＴＭ、日清紡績株式会社製）が挙げられる。
【００６４】
（ハイブリッド形成）
核酸増幅産物と捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は上記捕獲オリゴヌクレオチドを固定した例えば核酸検出用メンブレン上などで実施することもできるが、前述した捕獲オリゴヌクレオチドを固定した支持体を用いることが好ましい。当該支持体を用いることにより、極近縁な関係にある米の品種も迅速、簡便且つ正確に、視認性に優れた識別を行うことが可能になる。ハイブリダイゼーションに用いる方法としては特に限定されるものではなく、公知の核酸ハイブリイド形成方法を適宜採用して用いることができる。以下に具体的なハイブリダイゼーション方法の一態様を示す。
【００６５】
Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）などの緩衝塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的吸着の阻害剤、及びハイブリダイゼーション反応促進のための添加剤を含む混合溶液に予め標識を施した核酸増幅産物を加える。当該核酸増幅産物が２本鎖を形成する場合は、加熱等による変性を施す。捕獲オリゴヌクレオチドが固定された支持体上に上述の標識した核酸増幅産物を含む混合溶液を適量、好ましくは２０〜１００μｌ添加した後、通常適当な温度、好ましくは３０℃〜８０℃の熱を数時間加え、支持体上に固定されている捕獲オリゴヌクレオチドと核酸増幅産物との塩基配列に特異的なハイブリッドを形成させる。次いで、前出混合溶液を取り除き、支持体上に５×ＳＳＣ溶液又は３Ｍテトラメチルクロライド溶液等の溶液を加えて適温、好ましくは３０℃〜８０℃で加熱し、非特異的なハイブリッドを形成している核酸増幅産物を支持体上から剥離させ、特異的なハイブリッドのみを選択的に支持体上に残存させる。
【００６６】
（ハイブリッド形成の検出）
ハイブリッド形成の検出は、ハイブリダイゼーションシグナルにより検出することができる。ハイブリダイゼーションシグナルの検出は、通常上記ハイブリダイゼーションと連続的に行われる。ハイブリッドの検出に用いる方法は、上記の核酸増幅産物を標識した物質に依存する。すなわち、ハイブリッドの検出には、ターゲット核酸の標識に用いられた蛍光物質やハプテン等の標識物質を使用する。従って、当該標識物質を検出できる公知の方法を適宜選択して使用すればよい。例えば、蛍光物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いてハイブリダイズした核酸増幅産物に標識された蛍光を検出する。他方、ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパク質又はそれに結合する別のタンパクと、アルカリフォスファターゼ又はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲートと呼ぶ）を含む溶液を支持体上に加え、例えば、室温で数１０分間反応させる。
【００６７】
ハイブリッドの視覚化は、ハプテンと酵素コンジュゲートとの結合体が存在する場合にのみ不溶化合物が形成されるような色素化合物を添加することにより行うことができる。その不溶性化合物の生成は酵素反応によって増幅され、ハイブリッドが形成されている捕獲オリゴヌクレオチドの固定化部位が色素によって可視化される。添加される化合物としては、酵素コンジュゲートの酵素部分がアルカリフォスファターゼで構成される場合には、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐ−トルイジン塩が挙げられ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで構成される場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンなどが挙げられる。
【００６８】
捕獲オリゴヌクレオチドを固定化した位置におけるハイブリッドの色素沈着又は蛍光発色等の有無を判定して、核酸増幅処理により得られた増幅産物の有無を決定し、被検試料中に含まれる米品種の判別又は混米の有無の判定を行うことができる。すなわち、ハイブリッドを検出した場合には、当該色素沈着等が存在する位置に固定化された捕獲オリゴヌクレオチドに対応する品種が、被検試料中に含まれていることを意味する。
【００６９】
本発明の米品種判別キット又はコシヒカリへの混米の有無判定キットは、上述の米の品種判別方法又はコシヒカリへの混米の有無判定方法を実施するためのキットであり、上記プライマーセット、上記捕獲オリゴヌクレオチド群、上記ハイブリダイゼーション及びハイブリッドの検出に使用する試薬、器具を含むものである。
【００７０】
ハイブリダイゼーションにおいて用いる試薬としては、例えばＳｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）などの緩衝塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的吸着の阻害剤、及びハイブリダイゼーション反応促進のための添加剤などを挙げることができる。
【００７１】
ハイブリッドの検出に用いる試薬としては、例えばハプテンを認識するタンパク質と酵素との結合体（酵素コンジュゲート）や、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐ−トルイジン塩、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン等の試薬を挙げることができる。
【００７２】
なお、例示したハイブリダイゼーション及びハイブリッド検出に使用する試薬は、これらに限定されるものではなく、目的に見合う適切な試薬を適宜選択してキットの構成とすれば良い。
【００７３】
更に、上記キットは、上記核酸試料の調製に使用する試薬、及び／又は上記の核酸増幅産物の調製に使用する試薬を含むものが好ましい。
【００７４】
核酸増幅産物の調製に使用する試薬としては、例えばＰＣＲ用の緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸混合溶液等が挙げられ、核酸調製工程で使用する試薬としては、ＤＮＡ抽出用の緩衝液等を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく目的に見合う適切な試薬を適宜選択してキットの構成とすれば良い。また、ターゲット核酸を作製するためのプライマーもキットに含めることができる。
【００７５】
本発明の米の品種判別方法及びコシヒカリへの混米の有無判定方法、並びに米の品種判別キット及びコシヒカリへの混米の有無判定キットは、米の品種判別及びコシヒカリへの混米の有無の判定が必要な用途全てに用いることができる。具体的には、例えば、播種時における米の種子の判別、苗の判別、収穫時における米の判別、米の流通段階で品種を判別するかあるいは混米の有無を判定する必要がある場合、米の種子の品種を管理する場合、更には炊飯後の米の品種を判別するかあるいは混米の有無を判定する必要がある場合等に好適に用いられる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００７７】
［実施例１］
（１）プライマーの設計
本発明を実施するにあたり、配列番号１〜１１の多型を含む基準の配列の核酸を増幅しうるフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計した。表１に本実施例において使用した多型を含む基準配列番号、プライマー及びプライマー対の関係を示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
（２）プライマーの合成
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、表１に示すプライマー（配列番号１２〜３３）について、未修飾のプライマー、または５´末端にビオチン修飾したプライマーを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。その後、Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて溶解し、２ｐｍｏｌ/μＬのプライマー溶液をそれぞれ調製した。
【００８０】
（３）プライマーセットの調製
マルチプレックスＰＣＲを実施するために、上記（２）で調製した各プライマー溶液を混合し、１１種のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを調製した。表２に、調製したプライマーセットの配合を示す。なお、ビオチン修飾プライマー及び未修飾プライマーも同様に配合し、プライマーセットを調製した。
【００８１】
【表２】
【００８２】
（４）鋳型ＤＮＡの抽出
被検米試料からのＤＮＡ抽出は、Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ） Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて行い、マルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。被検米試料は平成１５年度の作付面積上位２０品種であるコシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、きらら３９７、キヌヒカリ、はえぬき、ほしのゆめ、つがるロマン、ササニシキ、ゆめあかり、日本晴、ハナエチゼン、夢つくし、あいちのかおり、むつほまれ、あさひの夢、ハツシモ、ななつぼし、ふさおとめの玄米を一粒ずつ被検試料とした純米試料（表３、検体番号１〜２０）、及び、コシヒカリ１９粒に対して上記ひとめぼれからふさおとめ（表３、検体番号２〜２０）まで計１９品種の玄米をそれぞれ各１粒混合させて２０粒とした混米試料を用いた（表３、検体番号Ｋｂ２〜Ｋｂ２０）。
【００８３】
【表３】
【００８４】
（５）マルチプレックスＰＣＲ
上記（４）で抽出した米由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、マルチプレックスＰＣＲにより核酸増幅産物を調製した。具体的なＰＣＲの反応組成及び反応条件を表４に示す。
【００８５】
【表４】
【００８６】
（６）電気泳動
マルチプレックスＰＣＲによって得られた増幅産物溶液を純米の場合は２μｌ、混米の場合は５μｌを８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により各ＤＮＡを分離後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で染色し、紫外線照射により識別バンドの電気泳動パターンを観察した。なお、ＤＮＡ分子量マーカーには、２０ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）を使用した。
【００８７】
（７）結果
図１に、純米検出のために、１１種のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、単一品種の被検米試料２０粒より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す。図１中のレーン番号は、表３に記載の検体番号に対応する。
【００８８】
なお、４００ｂｐ付近に確認されるバンドは、互いに異なるマーカーのフォワードプライマーとリバースプライマーによって増幅したＰＣＲ産物であるため、本発明における増幅目的のＰＣＲ産物ではない。よって、３０１ｂｐ以下のバンドを識別バンドとして用いた（以下、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いた実施例においても同様とした）。
【００８９】
図２に、混米の有無を判定するために、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、コシヒカリ１９粒に対し表３に示した検体番号２から検体番号２０の品種１粒を混米させた被検試料より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す。図２中、レーン１はコシヒカリ純米の結果を示し、レーン２〜２０は表３に記載の検体番号（Ｋｂ２〜Ｋｂ２０）に対応する５％混米の電気泳動パターンを示す。
【００９０】
表５に、図１における各純米品種の電気泳動による識別バンドの判定表を示す。表５中の＋及び−は、それぞれ識別バンドの有及び無を示す。なお、プライマー対番号Ｉ及びプライマー対番号Ｊにおいて、マルチプレックスＰＣＲの際に、鋳型となる米品種により増幅するＰＣＲ産物の鎖長に違いが生じる。これら鎖長の相違を、表５中において、ａあるいはｂで示す。コシヒカリを例にとると、プライマー対番号Ｉにおいてはａ（１００ｂｐ）、プライマー対番号Ｊにおいてはａ（８７ｂｐ）が識別され、それ以外の識別バンドは無いことが分かった。
【００９１】
また、表５中において、プライマー対番号Ｉによって得られる識別バンドａ及びｂ、またプライマー対番号Ｊによって得られる識別バンドａ及びｂは、得られるＰＣＲ産物それぞれの分子量が極めて近く、実際の電気泳動写真上では重なって観察された。それゆえ、図１及び図２における純米品種判別及び５％混米の有無の判定には、表５を用いて行った。
【００９２】
【表５】
【００９３】
（８）考察
コシヒカリ純米の場合は得られた識別バンドは２本であったが(図１及び図２のレーン１)、それ以外の純米の場合(図１)、及び混米ありの場合(図２)には３本以上の識別バンドが検出された。このことから、１１種のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の電気泳動により検出される識別バンド数を調べることによって、コシヒカリ純米か否かを判別できることが分かった。また、被検試料が純米である場合には、識別バンド数の違い及び識別バンドの鎖長の違いにより、表３に示す検体番号１〜２０の品種のうち少なくとも１５品種以上の米品種を判別できることが分かった。
【００９４】
［実施例２］
（１）捕獲オリゴヌクレオチドの設計
ＤＮＡアレイを使用して、米の品種判別、及びコシヒカリへの混米の有無の判定を行うために捕獲オリゴヌクレオチドを設計した。設計した１３種の捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）の配列番号（配列３４〜４６）、プライマー及びプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の関係を表６に示す。配列番号４２〜４５に表される塩基配列からなる捕獲オリゴヌクレオチド（IX）〜（XII）は、米の品種に特異的又は米の品種間で高頻に差異を示す特徴的な塩基配列を含む捕獲オリゴヌクレオチドであり、また、配列番号３４〜４１及び配列番号４６に表される塩基配列からなる捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（VIII）および（XIII）は、米の品種に特異的な増幅の有無を検出する捕獲オリゴヌクレオチドである。
【００９５】
【表６】
【００９６】
（２）捕獲オリゴヌクレオチドの合成
ポリカルボジイミド樹脂をコートしたスライドガラス「カルボステーション（商標登録第４５７４９７４号、日清紡績株式会社製）」に捕獲オリゴヌクレオチドを固定化する場合は、捕獲オリゴヌクレオチドの５´末端にアミノリンカーを付加し、また、表面未処理のポリカーボネート樹脂製スライド（帝人株式会社製）に捕獲オリゴヌクレオチドを固定化する場合は、捕獲オリゴヌクレオチドの５´末端に核酸ホモポリマーを有するリンカー（ＤＮａｔｔａｃｈＴＭ、日清紡績株式会社製）を付加して、実施例１と同様に定法に従い合成した。
【００９７】
（３）支持体への捕獲オリゴヌクレオチドの固定化：ＤＮＡアレイの作製
捕獲オリゴヌクレオチド溶液１０μｌに対してマイクロスポッティング溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）を１０μｌ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．製）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置に表面未処理のポリカーボネート樹脂製スライド（帝人株式会社製）又は、ポリカルボジイミド樹脂で表面を処理したスライドグラス「カルボステーション（商標登録第４５７４９７４号、日清紡績株式会社製）」を配置し、スポッティングマシンを作動させ、表７に示したスポットの並びとなるようにスライドグラス上に捕獲オリゴヌクレオチド溶液をスポッティングした。
【００９８】
スポッティング終了後、紫外線を６００ｍＪ照射したものを３％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ X−１００に３０分間浸し、ブロッキングした。その後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。最後に滅菌水でリンスし、スライドグラスを乾燥させ、使用するまで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
【００９９】
支持体上の各スポットに固定化されている捕獲オリゴヌクレオチドの配置を表７に示す。表７中の番号は表６に示した捕獲オリゴヌクレオチドの配列番号を示し、ビオチンは位置を知る目印、及び発色操作に問題が無いことを確認する為にスポットしているビオチン化オリゴマーを示す。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
（４）マルチプレックスＰＣＲとハイブリダイゼーション工程
実施例１と同様に、被検米試料からのゲノムＤＮＡの抽出、及びマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をターゲット核酸とした。ただし、プライマーセットは５´ビオチン化プライマーを用いて調製したものを使用した。マルチプレックスＰＣＲにより得たターゲット核酸溶液１４μｌを０．５ｍｌ容チューブに取り、９５℃で３分間加熱処理を行った後、氷中に３分間浸した。これを室温に戻し、ＡｒｒａｙＩｔ Ｕｎｉｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）３６μｌを加えて混合し、プローブ核酸溶液とした。プローブ核酸溶液を全量とり、上記（３）で作製したＤＮＡアレイにのせ、その上にカバーフィルムをのせた。これを保湿箱に入れ、さらに５０℃に設定した恒温器に入れて６０分間静置した。アレイを取り出し、すばやく室温下で２×ＳＳＣ溶液（２×ＳＳＣ：０．０３３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３３Ｍ クエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去し、アレイを室温下で２×ＳＳＣ溶液に５分間浸した。
【０１０２】
（５）ハイブリダイゼーションシグナルの検出
ＤＮＡアレイ上の２×ＳＳＣ溶液を軽く取り払い、次にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いてアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を調製したものをアレイ上に１．０ｍｌ滴下し、室温下で３０分間静置した。その後、アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を軽く振り払い、ＴＢＳＴ溶液中［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０］にて室温下で５分間の洗浄を２回繰り返した。ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ fｏｒ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ(ＶＥＣＴＯＲ社製)を用いて発色溶液を調製したものをアレイ上に１．０ｍｌ滴下し、室温下で３０分間静置して、酵素反応により発色させた。アレイを蒸留水で洗浄して酵素反応を停止させ、青色に発色したことを確認した。
【０１０３】
（６）判定
発色したスポットを目視で確認して結果を判定した。また、ＯＡ用スキャナー（ＧＴ−８７００Ｆ、ＥＰＳＯＮ社製)を用いて６００ｄｐｉの画像密度でＤＮＡアレイをスキャンして結果の保存を行った。
【０１０４】
（７）結果
コシヒカリ２０粒（検体番号１）、及び実施例１の表３に示した混米試料（検体番号Ｋｂ２〜Ｋｂ２０）に対する捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションシグナルの有無を表８に、ＤＮＡアレイの発色画像を図３に示す。なお、表８中の＋は、ハイブリッドが形成され発色反応によりハイブリダイゼーションシグナルが検出されたことを示し、−はハイブリッドが形成されず、ハイブリダイゼーションシグナル検出されなかったことを示す。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
（８）考察
図３及び表８から分かるように、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットによるマルチプレックスＰＣＲと、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイにより、コシヒカリへの混米を確認できることが分かった。また、陰性コントロールへの発色も見られなかったことから、非特異的増幅は無かったことが分かった。
【０１０７】
［実施例３］
実施例２で作製したＤＮＡアレイを使用し、実施例１の表３に示した作付面積上位２０品種及び表９に示したそれ以外の品種、それぞれ２０粒（純米）より抽出したゲノムＤＮＡの品種判別を実施した。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
（１）方法
被検米試料からのＤＮＡ抽出は、実施例１と同様に行い、マルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。マルチプレックスＰＣＲ、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイゼーションシグナルの検出及びその判定は実施例２と同様に実施した。
【０１１０】
（２）結果
図４〜８に、実施例１の表３及び上記表９に示した米品種それぞれ各２０粒を被検試料とした場合のＤＮＡアレイによる検出結果を示す。また、表１０〜１２に、１１９品種に対しての捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの有無を示す。なお、表１０〜１２中の＋は、ハイブリッドが形成されハイブリダイゼーションシグナルが検出されたことを示し、−はハイブリッドが形成されず、ハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかったことを示す。
【０１１１】
【表１０】
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
【表１２】
【０１１４】
（３）考察
表１０〜１２及び図４〜８から分かるように、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットによるマルチプレックスＰＣＲの増幅産物を捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイにより検出した結果、表３及び表９に示した全１１９品種について全て異なるシグナルパターンが得られた。すなわち、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動及び捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによれば、表３及び表９に示した全１１９品種を１回のＰＣＲで判別出来ることが分かった。
【０１１５】
［実施例４］
検出限界となるゲノム濃度について、市販のコメ品種判別用ＰＣＲキットである、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を使用した場合（比較例）と、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用した場合（実施例）とを比較した。
【０１１６】
（１）マルチプレックスＰＣＲ
実施例１で抽出した米のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用してマルチプレックスＰＣＲを行った。ＴａＫａＲａ社製のコメ品種判別用ＰＣＲキットは、Ｋｉｔ I及びＫｉｔ IIをセットで使うため、１度の試験に２回のＰＣＲが必要になる。具体的なＰＣＲの反応組成及び反応条件については、説明書に示されている通りに行った。被検米試料及びゲノム濃度の詳細は、表１３及び表１５に示す。なお、ＤＮＡ量はＵＶで測定した。
【０１１７】
一方、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットにおいては、実施例１で抽出した米のゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の条件でマルチプレックスＰＣＲを行った。ただし、当該プライマーセットは、５´ビオチン化及び/又は未修飾プライマーを用いて調製したものを使用した。被検米試料及びゲノム濃度の詳細は、表１４及び表１６に示す。なお、ＤＮＡ量はＵＶで測定した。
【０１１８】
（２）電気泳動
ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用して得られたＰＣＲ産物溶液５μｌを２％アガロースゲルで電気泳動により増幅産物を分離後、臭化エチジウム（以下エチジウムブロマイド又はＥｔＢｒ）、及び、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎI）にて染色し、その後、紫外線照射によりＰＣＲ産物の電気泳動パターンを観察した。
【０１１９】
一方、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットにおいては、当該プライマーセットを使用して得られたＰＣＲ産物溶液５μｌを８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により増幅産物を分離後、エチジウムブロマイド、及び、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIにて染色し、その後、紫外線照射によりＰＣＲ産物の電気泳動パターンを観察した。
【０１２０】
（３）電気泳動の結果
図９に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を使用して、単一品種の米コシヒカリより抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図９の左図はエチジウムブロマイドによる染色、図９の右図はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIによる染色結果を示す。図９のレーン１から１０については表１３に記載の検体番号を示す。また、表１３に、図９の各レーン番号に対応する被検米試料の説明、及び、電気泳動における判別の可否を示す。なお、コシヒカリ１とコシヒカリ２はサンプルの入手先が異なることを示す。
【０１２１】
図１０に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、単一品種の米コシヒカリより抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図１０の左図はエチジウムブロマイドによる染色、右図はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIによる染色結果を示す。図１０のレーン１から１３については表１４に記載の検体番号を示す。また、表１４に、各レーン番号に対応する被検米試料の説明、及び、電気泳動における判別の可否、ハイブリダイゼーションでの判別可否を示す。なお、コシヒカリ１とコシヒカリ２はサンプルの入手先が異なることを示す。
【０１２２】
図１１に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を使用し、混米の有無の判定のために、コシヒカリ１９粒に対しあいちのかおり１粒を混米させた試料より抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図１１の左図はエチジウムブロマイドによる染色、図１１の右図はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIによる染色結果を示す。図１１のレーン１から１２については表１５に記載の検体番号を示す。また、表１５に各レーン番号に対応する被検米試料の説明、及び、電気泳動における判別の可否を示す。なお、コシヒカリ１とコシヒカリ２、及び、あいちのかおり１とあいちのかおり２、はそれぞれサンプルの入手先が異なることを示す。
【０１２３】
図１２に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、混米の有無の判定のために、コシヒカリ１９粒に対しあいちのかおり１粒を混米させた試料より抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図１２の左図はエチジウムブロマイドによる染色、図１２の右図はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIによる染色結果を示す。図１２のレーン１から１３については表１６に記載の検体番号を示す。また、表１６に、各レーン番号に対応する被検米試料の説明、及び、電気泳動における判別の可否、ハイブリダイゼーションでの判別可否を示す。なお、コシヒカリ１とコシヒカリ２はサンプルの入手先が異なることを示す。
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
【表１６】
【０１２８】
（４）捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションシグナルの検出
上記（１）で得られたプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物について、実施例２で作製したＤＮＡアレイを使用し、実施例３と同様に、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションシグナルの形成を確認した。被検米試料及びゲノム濃度の詳細は、表１４及び表１６に示す。
【０１２９】
（５）ハイブリダイゼーションの結果
上記（４）の検出結果について、表１４に対応する検出結果を図１３に、表１６に対応する結果を図１４に示す。
【０１３０】
（６）考察
・コシヒカリ純米での感度試験
図９及び表１３から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」において、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のコシヒカリゲノムを０．５ｎｇ投入し、ＰＣＲ産物を電気泳動で検出した場合、３本あるはずの識別バンドの確認ができない場合があることが分かった（図９、レーン７）。
【０１３１】
一方、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用した場合、図１０及び表１４から分かるように、ＰＣＲ産物を電気泳動で検出することにより、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノムＤＮＡ量が０．５ｎｇ、０．１ｎｇであっても識別バンドが確認できることが分かった（図１０、レーン６、７、１１、１２）。
【０１３２】
また、図１３及び表１４から分かるように、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイにより上記ＰＣＲ産物を検出することにより、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のコシヒカリゲノム量が０．１ｎｇでも識別バンドが確認できることが分かった。
【０１３３】
・５％混米での感度試験
図１１及び表１５から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ ＫｉｔII（コシヒカリネガキット）」によるＰＣＲ産物の電気泳動により混米の有無を検出したところ、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノム量が５ｎｇ（ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIでは１ｎｇ）までは、５％の混米を確認できたが、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノム量が０．５ｎｇとした場合は増幅産物が確認できなかった。
【０１３４】
一方、図１２、及び表１６から分かるように、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットによるＰＣＲ産物の電気泳動により混米を検出すれば、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノム量が０．５ｎｇ、０．１ｎｇであっても混米の有無を判定することが可能であることが分かった。また、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIではさらに少ないゲノム量（０．０２５ｎｇ）でも混米であることが確認できた（図１２、レーン７）。
【０１３５】
また、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物と捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションシグナルを検出することにより、表１６に示したようにＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノム量が０．０２５ｎｇの場合でも混米であることが確認できることが分かった。すなわち、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動、及び捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイにより、少ないゲノム量の検体であっても混米の有無を判定できることが分かった。
【０１３６】
［実施例５］
千葉県産コシヒカリと新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）とを判別するため、実施例２で作製したＤＮＡアレイを使用し、各２０粒より抽出したゲノムを用いて、電気泳動及びＤＮＡアレイによる判別を行った。
【０１３７】
（１）方法
実施例１と同様に、被検米試料からゲノムＤＮＡを抽出し、これをマルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。また、実施例２と同様にマルチプレックスＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。
電気泳動による判別は実施例１と同様に、またＤＮＡアレイの作製、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーション工程、及びハイブリダイゼーションシグナルの検出による判別は実施例２と同様に行った。
【０１３８】
（２）結果
図１５に千葉県産コシヒカリと新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動で検出した結果（図１５左図）、及びＤＮＡアレイにより検出した結果（図１５右図）を示す。電気泳動の結果、千葉県産コシヒカリは２本の識別バンドが、新潟産のコシヒカリでは３本の識別バンドが検出された（図１５左図）。また、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションシグナルは千葉県産コシヒカリでは２スポット、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）では３スポット検出された（図１５右図）。
【０１３９】
（３）考察
図１５左図に示す電気泳動により検出された３本の識別バンド（３０１ｂｐ以下のバンドを識別バンドとして用いる）は、コシヒカリＢＬを示唆するものであった。したがって、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動により、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）と新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）以外のコシヒカリとを判別できることが分かった。
【０１４０】
また、図１５右図に示したように、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションシグナルは千葉県産コシヒカリでは２スポット、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）では３スポット検出され、ハイブリダイゼーションシグナルのパターンが明らかに異なっていた。更に、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）によるハイブリダイゼーションシグナルのパターン（図１５右図）は実施例３（図４〜８）に示した１１９品種のどのパターンとも異なっていた。これらの結果から、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによれば、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）と新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）以外のコシヒカリとを判別できることが分かった。
【０１４１】
［実施例６］
検出限界となる混米のパーセンテージについて、市販のコメ判別用ＰＣＲキットである、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を使用した場合（比較例）と、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いた場合（実施例）とを比較した。
【０１４２】
（１）方法
被検米試料及びゲノム濃度の詳細は、表１７に示したように行い、マルチプレックスＰＣＲ、電気泳動、ハイブリダイゼーションは実施例４と同様に行った。ただし、表１７のレーン１８及びレーン１９は、図１８及び図１９でのみ使用している。
【０１４３】
【表１７】
【０１４４】
（２）結果
図１６に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を使用し、表１７に示した被検米試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩに用いて染色した結果を示す。図１６の左図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡ量を投入した場合、図１６の右図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に１０ｎｇのゲノムＤＮＡ量を投入した場合の結果を示す。また、図１６のレーン１からレーン１７については表１７に記載の検体番号を示す。
【０１４５】
図１７に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用し、表１７に示した被検米試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを用いて染色した結果を示す。図１７の左図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡを投入した場合、図１７の右図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に１０ｎｇのゲノムＤＮＡを投入した場合の結果を示す。図１７のレーン１からレーン１７については表１７に記載の検体番号を示す。
【０１４６】
図１６及び図１７において、ゲノムＤＮＡ量を０．５ｎｇ又は１０ｎｇとした場合の混米判定可否を表１８に示す。
【０１４７】
【表１８】
【０１４８】
図１８に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、表１７に示した被検米試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを用いて染色した結果を示す。図１８のレーン１からレーン１９については表１７に記載の検体番号を示す。なお、マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡ量を投入して行った。また、図１８のレーン１からレーン１９については表１７に記載の検体番号を示す。
【０１４９】
図１９に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、表１７に示した被検米試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物と捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションを行った結果を示す。なお、マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡ量を投入して行った。また、図１９の番号は表１７に記載の検体番号に対応する。
【０１５０】
図１８及び１９の結果に基づき、電気泳動による検出及びＤＮＡアレイ（による混米判定可否をまとめた結果を表１９に示す。
【０１５１】
【表１９】
【０１５２】
（３）考察
図１６及び表１８から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ ｋｉｔI」を使用した場合、ＰＣＲ反応液２０μｌ中にゲノムＤＮＡ０．５ｎｇを投入した場合、９５％以上は存在するはずのコシヒカリの検出が困難であった。ＰＣＲ反応液２０μｌ中にゲノムＤＮＡを１０ｎｇ投入した場合も同様であった。また、図１７及び表１８から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用した場合、ＰＣＲ反応液２０μｌ中にゲノムＤＮＡ０．５ｎｇを投入した場合でも１０ｎｇを投入した場合でも、混米しているにも関わらず、きらら３９７を５％混入させた場合のみ薄い識別バンドが検出できた以外に増幅産物の識別バンドは検出出来なかった。
【０１５３】
一方、図１８及び表１９から分かるように、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いた場合、ＰＣＲ反応液２０μｌ中にゲノムＤＮＡ０．５ｎｇを投入した場合、図１８のレーン１７（コシヒカリ純米）で検出される識別バンド以外の識別バンドが検出できた。この結果から、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物を電気泳動で検出することにより、１％の混米は確実に検出でき、品種によっては０．１％の混米でも検出できることが分かった。また、図１９及び表１９から分かるように、ＤＮＡアレイによる結果も良好であり、５％混米の場合混ざっている米品種まで判別でき、１％混米の場合では混ざっている米品種は不明なものの混米の有無は検出可能であった。この結果から、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによれば、少ない量のゲノムＤＮＡを鋳型として、たとえ混米率が１％であっても検出可能であることが分かった。
【０１５４】
［実施例７］
炊飯米によるゲノムを検出しうるかについて、市販のコメ判別用ＰＣＲキットである、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用した場合（比較例）と、本発明プライマーセットを用いた場合（実施例）とにおいて検討した。
【０１５５】
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
市販のあきたこまちを家庭用炊飯器（タイガー社製）で２合炊飯したもの、及び、市販の真空パック詰めコシヒカリ炊飯米、それぞれ２０粒から、Ｆａｓｔ ＩＤ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ＩＤ社製）のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１５６】
（２）マルチプレックスＰＣＲ
上記（１）で抽出した炊飯米のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を使用してマルチプレックスＰＣＲを行った。具体的なＰＣＲの反応組成及び反応条件については、説明書に示されている通りに行った。ＤＮＡ量はＵＶで測定し、０．５ｎｇ、及び、１０ｎｇをＰＣＲ反応液に用いた。
【０１５７】
プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットによるマルチプレックスＰＣＲは、実施例１と同様に行った。ただし、当該プライマーセットは、５´ビオチン化及び/又は未修飾プライマーを用いて調製したものを使用した。ＤＮＡ量はＵＶで測定し、０．５ｎｇをＰＣＲ反応液に用いた。なお、精米より抽出したゲノムＤＮＡをコントロールとして用いた。
【０１５８】
（３）電気泳動
ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用したマルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物溶液５μｌを２％アガロースゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIにて染色後、紫外線照射により識別バンドの電気泳動パターンを観察した。
【０１５９】
また、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセット使用したマルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物溶液５μｌを８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIにて染色後、紫外線照射により識別バンドの電気泳動パターンを観察した。
【０１６０】
（４）電気泳動の結果
図２０に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用したマルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物における電気泳動の結果を示す。図１７の左図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡを投入した場合、図１７の右図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に１０ｎｇのゲノムＤＮＡを投入した場合の結果を示す。図２０のレーン１から１６については表２０に記載の検体番号を示す。
【０１６１】
【表２０】
【０１６２】
図２１に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用したマルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図２１のレーン１から９については表２１に記載の検体番号を示す。
【０１６３】
【表２１】
【０１６４】
（４）ＤＮＡアレイ
実施例２、３に示した方法と同様に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い得られたＰＣＲ産物を使用して、ＤＮＡアレイによりハイブリッド形成を検出した。
【０１６５】
（５）ハイブリダイゼーションの結果
被検米試料の説明において、表２１に対応する結果を図２２に示す。
【０１６６】
（６）考察
図２０及び表２０から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、炊飯米及び精米より抽出したゲノム量０．５ｎｇを投入した場合においては、１００％コシヒカリ、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米のいずれも検出出来なかった（図２０、レーン２〜７）。
【０１６７】
また、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、炊飯米より抽出したゲノム量１０ｎｇを投入した場合においては、１００％コシヒカリは検出が困難であった（図２０右、レーン２）が、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米では、コシヒカリとは異なる電気泳動パターンが検出された（図２０右レーン３及び４）ことから、コシヒカリ以外の品種である可能性が示された。なお、精米より抽出したゲノム量１０ｎｇを投入した場合は、１００％コシヒカリである電気泳動パターン、及び、それ以外の電気泳動パターンも検出された（図２０右、レーン５〜７）。
【０１６８】
図２０及び表２０から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ ＫｉｔII（コシヒカリネガキット）」を用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、炊飯米及び精米より抽出したゲノム量０．５ｎｇ、及び、１０ｎｇを投入した場合、いずれにおいても、１００％コシヒカリは識別バンドが元々検出されないので問題なかった（図２０左及び右、レーン８）が、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米は検出されなかった（図２０左及び右、レーン９及び１０）。
【０１６９】
また、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、精米より抽出したゲノム量０．５ｎｇを投入した場合は、１００％あきたこまちのみ検出され（図２０左、レーン１２）、ゲノム量１０ｎｇを投入した場合には、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米ともに検出された（図２０右、レーン１２及び１３）。このことより、コシヒカリ以外の品種である可能性が示された。
【０１７０】
以上の結果から、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」においては、炊飯米による混米判定検査が適さないことが分かった。
【０１７１】
一方、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、炊飯米、及び、精米ともに、１００％コシヒカリ、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米であることが判定可能であることが示された。
【０１７２】
炊飯米１００％コシヒカリ（図２１、レーン２）、及び、精米１００％コシヒカリ（図２１、レーン５）を比較したところ、炊飯米１００％コシヒカリ（図２１、レーン２）において高鎖長側に見られるバンドが消失することが分かった。この高鎖長側のバンドの消失は、市販の炊飯米に含まれている酸味料などの添加物による影響や、炊飯時のゲノムが切断されることに起因していると考えられた。
【０１７３】
また、図２２から分かるように、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションにおいても、炊飯米、及び、精米ともに結果が良好であった。
【０１７４】
すなわち、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動、及び、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによれば、被検米試料が炊飯米であっても品種を判別出来ることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】本発明のプライマーセットを使用し、単一品種の米試料２０粒より抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例１）
【図２】混米の有無判定のために、本発明のプライマーセットでマルチプレックスＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例１）
【図３】ＤＮＡアレイによる混米の検出結果の例を示した図である。（実施例２）
【図４】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図５】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図６】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図７】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図８】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図９】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を使用し、単一品種の米コシヒカリより抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例４）
【図１０】本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例４）
【図１１】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」 を用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例４）
【図１２】本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例４）
【図１３】ＤＮＡアレイによる検出結果を示した図である。（実施例４）
【図１４】ＤＮＡアレイによる検出結果を示した図である。（実施例４）
【図１５】ＤＮＡアレイ及び電気泳動により新潟産コシヒカリ（ＢＬ）と千葉県産コシヒカリを解析した結果を示す。（実施例５）
【図１６】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例６）
【図１７】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」 を用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例６）
【図１８】本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例６）
【図１９】ＤＮＡアレイによる検出結果を示した図である。（実施例６）
【図２０】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を用いて、マルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例７）
【図２１】本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例７）
【図２２】ＤＮＡアレイによる検出結果を示した図である。（実施例７）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米の品種の判別及びコシヒカリへの混米の有無を判定するためのプライマー及び捕獲オリゴヌクレオチド、これらを用いた米の品種を判別するための方法及びコシヒカリへの混米の有無を判定するための方法、並びに当該方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、現在２００種を超えるコメの品種が栽培されているが、改正ＪＡＳ法の施行により米の品種名の表示が義務づけられている。しかし、表示品種以外の米を混米しながら、表示を偽って販売する不正混米が一部で行われている。近年の消費者の良食味志向を受けてコシヒカリなどの良食味品種が高価格で取引される現状や、食品の情報公開への関心の高まりを考慮すると、米の品種名の表示の正確さは、行政的にも産業的にも重要な課題であり、混米による不正を防止する必要性等から、簡易で精度が高く、実用性の高い米の品種判別技術の開発が求められている。しかしながら、日本で栽培されている殆どの米品種は、数種の在来品種をベースとする極近縁種間の交配によって育成されてきた経緯により、これらは極めて類縁しており、形態学的に米の品種を判別することは非常に困難である。一方で、近年、米のゲノム配列の解析が進み、米の品種間で差異を示す遺伝的多型を利用した米の品種の判別が試みられている。このような手法として、ＳＴＳ法、ＤＮＡアレイを用いた検出法、ＳＮＰｓ法が用いられている。
【０００３】
ＳＴＳ法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅ）法は、精米からＤＮＡを抽出し、品種間で相違を示すプライマーを用いて核酸増幅反応（以下、単にＰＣＲともいう）を行い、核酸増幅の有無及び核酸増幅産物の大きさにより多型を判別する技術である。ＳＴＳ法を用いて米品種を判別する場合、判別する米品種により使用するプライマー対を選択する必要があり、米品種が不明な場合、使用するプライマー対の決定が困難であり実用的ではないという問題がある（特許文献１）。また、複数種のプライマー対を用いて複数品種の米を複数の判別グループに分類することもできるが、品種不明の米を試料とする場合に複数回のＰＣＲを行う必要があり操作が煩雑である（特許文献２）。また、特定品種への他品種の混米を確認する為には、複数種のプライマー対から調べたい品種に対応するプライマー対を検索する必要があり、混米の判定用プライマー対とは異なるプライマー対が米品種判別用のプライマー対として必要となり、操作が複雑である（特許文献２）。
【０００４】
また、ＳＴＳ法により米品種を判別する方法に用いるキットがいくつか市販されている。このようなキットとして、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」、ＴａＫａＲａ社製「平成１７年１８年産コシヒカリＢＬ判別用ＰＣＲキット」、ビジョンバイオ社製「品種判別用キット「お米鑑定団」」がある。しかし、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」は、コシヒカリに他品種のコメが混入しているか否かを確認する為に、１検体につきＫｉｔ I（ポジティブ検出）とＫｉｔ II（ネガティブ検出）の２回のＰＣＲが必要である為操作が煩雑である。また、品種の特定が出来ず、コシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）が混米と判定されることとなり、コシヒカリと判別できない。ＴａＫａＲａ社製「平成１７年１８年産コシヒカリＢＬ判別用ＰＣＲキット」は、上記の「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」で判別できなかったものについて再検査をする為に用いるものである。しかし、複数の米粒を一度に検査することは出来ず、米１粒１粒を検査しなければならないため、非常に煩雑である。また、ビジョンバイオ社製「品種判別用キット「お米鑑定団」」はコシヒカリと上位２０品種の判別を６種類のプライマーセットを用いて行うキットであるが、１検体を判別する為に６回のＰＣＲが必要となり簡便ではない。
【０００５】
ＤＮＡアレイを用いた検出法は、多数の捕獲オリゴヌクレオチドを支持体上に固定化し（以下、これをＤＮＡアレイ、または、単にアレイという）、標識ターゲット核酸を捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて捕獲し、ターゲット核酸の有無を解析する技術である。しかし、ＤＮＡアレイを用いて米品種を判別する場合、複数品種の米を判別する為のターゲット（ＰＣＲ産物）を作製するために複数種のマルチプレックスプライマーセットが必要となり、１検体につき複数回ＰＣＲを行う必要があり検査に手間がかかるという問題がある（特許文献３）。また、蛍光標識したＰＣＲ産物を検出し、蛍光強度を数値化して品種の判別を行うためには高価な装置が必要である（特許文献３及び４）。更に、限られた数の米品種は簡便に判別できるが、他の方法と比べて判別できる品種が少ないという問題もある（特許文献４）。
【０００６】
ＳＮＰｓ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法は、ＳＮＰ部位の１塩基手前までに対合するプライマーを用い、蛍光標識したヌクレオチドを一塩基だけ取り込ませる反応を行った後、各蛍光の偏光度を測定して取り込まれた塩基種を特定して多型を判定する技術である。ＳＮＰｓ法で米の品種を判別するには、判別する米品種によって、使用するプライマー対を選択する必要があり、米品種が不明の場合、使用するプライマー対の決定が困難であり実用的でないという問題がある（特許文献５）。また、特許文献５に基づいて、コシヒカリ１００％と表示されているコメが本当にコシヒカリ１００％であるかどうかを判別する「コメ奉行シリーズ「コシヒカリ判別キット」」（植物ゲノムセンター社製）というキットが市販されているが、コシヒカリに他の品種（８５品種）が混米している場合と、コシヒカリ純米の特定にのみ有効であり、米品種の判別はできない。
【０００７】
上述の通り、米の品種を判別するためにゲノム配列の遺伝的多型を利用した種々の方法が開発されている。しかし、上述の方法は、操作が複雑であって時間を要し、効率が悪いという欠点があった。したがって、米の品種判別検査に対する需要が高まり、被検米試料の数が急増している状況下、数多くの米品種を一括して、より簡便で高効率かつ正確に判別できる技術が求められている。
【特許文献１】特許第３６８５４７８号公報
【特許文献２】特開２００５−７３６５５号公報
【特許文献３】特開２００５−２４５２４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１５８２５３号公報
【特許文献５】特開２００６−１７４７１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、米試料の品種及び混米の有無を、簡便な操作で、かつ安価で視認性に優れ、短時間で効率的に判別及び判定できる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討した結果、米のゲノム配列における特定の領域が米品種の判別及び混米有無の判定に有用であること、及び該領域を検出しうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、ＰＣＲ産物の電気泳動パターンの差を指標として、及び／又は、ＰＣＲ産物とハイブリッド形成効率の差を指標として、該領域を効率よく検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の（１）〜（５）から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１〜１１のいずれか１つに表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対。
（１）下記の（ａ）〜（ｋ）から選択されるいずれか１つの組み合わせを構成する２種の塩基配列
（ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３
（ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４
（ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５
（ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６
（ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７
（ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８
（ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９
（ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０
（ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１
（ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２
（ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３
（２）前記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列
（３）前記（１）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）前記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
２．前項１に記載のプライマー対を少なくとも２種以上含むプライマーセット。
３．配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうる少なくとも１１種のプライマー対を含む前項２に記載のプライマーセット。
４．配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうるプライマー対が、以下の（Ａ）〜（Ｋ)のプライマー対である前項３に記載のプライマーセット。
（Ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
５．以下の（１）〜（５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択され、配列番号１〜１１のいずれか１つに表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（１）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列
（２）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列
（３）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち1ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
６．前項５に記載の捕獲オリゴヌクレオチドを少なくとも２種以上含む捕獲オリゴヌクレオチド群。
７．配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれ検出しうる少なくとも１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む前項６に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群。
８．配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれ検出しうる捕獲オリゴヌクレオチドが、以下の（I）〜（XIII）の捕獲オリゴヌクレオチドである前項７に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群
（I）配列番号３４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（II）配列番号３５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（III）配列番号３６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IV）配列番号３７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（V）配列番号３８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VI）配列番号３９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VII）配列番号４０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VIII）配列番号４１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IX）配列番号４２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（X）配列番号４３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XI）配列番号４４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XII）配列番号４５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XIII）配列番号４６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
９．以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とする米品種の判別方法。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、前項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
１０．更に、以下の（iii）及び/又は、（iv）の工程を行うことを特徴とする前項９に記載の米品種の判別方法。
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と前項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッド形成を検出する検出工程
１１．以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とするコシヒカリへの混米の有無を判定する方法。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、前項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
１２．更に、以下の（iii）及び/又は（iv）の工程を行うことを特徴とする前項１１に記載のコシヒカリへの混米の有無を判定する方法。
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と前項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッドを検出する検出工程
１３．前項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む米品種判別キット、又はコシヒカリへの混米判定キット。
１４．更に前項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群を含む前項１３に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のプライマーセットを用いれば、１回のＰＣＲによる増幅産物を電気泳動することにより、１５種以上の米品種の判別、コシヒカリ純米への他の１１８品種の混米の有無の判定、及びコシヒカリとコシヒカリＢＬとの判別が可能となる。更に、本発明の捕獲オリゴヌクレオチドによれば、本発明のプライマーによる核酸増幅産物と当該オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることにより、１１９品種もの米品種の判別、コシヒカリ純米への他の１１８品種の混米の有無の判定、及びコシヒカリとコシヒカリＢＬとの判別が可能となる。
【００１２】
したがって、本発明のプライマー及び本発明の捕獲オリゴヌクレオチドを用いる本発明の米品種の判別及び混米の有無の判定方法は、視認性に優れており、正確且つ簡便に米の品種を判別し、コシヒカリ純米への混米を判定できる。また、本発明の混米の判定方法は、ＰＣＲに供する試料のゲノムＤＮＡ量が０．０２５ｎｇ/２０μｌであっても混米の判定が可能である。更に、混米率が１％であれば確実に混米を判定できるという利点を有する。その上、当該被検米試料が炊飯米であっても、混米の有無の判定が可能であるという利点をも有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の米品種の判別方法及びコシヒカリへの混米の有無の判定方法は、以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とする。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、前記プライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
以下、各工程について説明する。
【００１４】
（i）核酸調製工程
核酸調製工程とは、被検米試料中から米の核酸を抽出・調製する工程である。被検米試料からの核酸の調製法は公知の核酸調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ Ｍ．Ｇ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｗ．Ｆ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，ｐ．４３２１−４３２５）、酵素法、アルカリＳＤＳ法等にしたがって調製することができる。これらの方法は植物のゲノムＤＮＡを抽出する標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを用いてもかまわない。また、例えば、Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ） Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の市販されているＤＮＡ抽出キットを使用して調製することができる。
【００１５】
前記被検米試料は、食用とする種子（米粒）のほか、苗も含む。また、種子としては、食用として市場に流通する精米、玄米などのほか、精米粉、玄米粉、更には、米飯、餅なども含まれる。ここで、米飯とは、精米や玄米を通常の電気炊飯器、ガス炊飯器、蒸気調理システム等によって炊飯して得られたものを指し、単に炊飯米ともいう。被検米試料は米由来の試料であれば特に限定されることはないが、好ましくは形態学的な品種の判別がより困難な、より好ましくは形態学的又は生化学的な品種の判別がさらに困難になる精米あるいは玄米あるいはそれらの加工品であるほうが、本発明の効果が顕著に発揮される。
【００１６】
（ii）核酸増幅工程
核酸増幅工程とは、工程（i）で調製した核酸を鋳型として、配列番号１〜１１で表される塩基配列のいずれか１つからなる核酸を増幅しうるプライマー対を含むプライマーセットを用いて、核酸増幅処理する工程である。
【００１７】
（プライマー）
本発明のプライマー対は、配列番号１〜１１で表される塩基配列のいずれか１つからなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対が好ましく、具体的には以下の（１）〜（５）から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなる。
（１）以下の（ａ）〜（ｋ）から選択されるいずれか１つの組み合わせを構成する塩基配列
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＴＣＴＡＴＡＣＡＴＧＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＴ−３´（配列番号１２）
リバースプライマー：５´−ＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴ−３´（配列番号２３）
（ｂ）配列番号２に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＣＣＣＧＣＡＧＴＴＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴＡＧＡＡ−３´（配列番号１３）
リバースプライマー：５´−ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＧＴＡＡＧ−３´（配列番号２４）
（ｃ）配列番号３に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＡＧＧＣＣＡＴＴＣＧＴＡＧＣＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＧ−３´（配列番号１４）
リバースプライマー：５´−ＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡ−３´（配列番号２５）
（ｄ）配列番号４に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＴ−３´（配列番号１５）
リバースプライマー：５´−ＣＡＣＣＴＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＴＴＧＴ−３´（配列番号２６）
（ｅ）配列番号５に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＴＧＴＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡ−３´（配列番号１６）
リバースプライマー：５´−ＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＴ−３´（配列番号２７）
（ｆ）配列番号６に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＣＴＣＡＡＣＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＡＣＡＣＡ-３´（配列番号１７）
リバースプライマー：５´−ＣＡＴＧＣＣＡＡＡＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＴＴ-３´（配列番号２８）
（ｇ）配列番号７に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＴＴＧＡ−３´（配列番号１８）
リバースプライマー：５´−ＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡ−３´（配列番号２９）
（ｈ）配列番号８に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＣＧＡＣＴＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＧＴＴ−３´（配列番号１９）
リバースプライマー：５´−ＡＧＣＴＴＴＣＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＣＧＴ−３´（配列番号３０）
（ｉ）配列番号９に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＴＣＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＣＴＣＡＧ−３´（配列番号２０）
リバースプライマー：５´−ＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＧＣＧ−３´（配列番号３１）
（ｊ）配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＧＣＴＡＡＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴ−３´（配列番号２１）
リバースプライマー：５´−ＣＴＡＣＧＴＧＧＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＡ−３´（配列番号３２）
（ｋ）配列番号１１に表される塩基配列からなる核酸増幅用
フォワードプライマー：５´−ＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧＣ−３´（配列番号２２）
リバースプライマー：５´−ＣＡＴＣＣＧＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＡＡ−３´（配列番号３３）
（２）前記（１）で選択された塩基配列と相補的な塩基配列
（３）前記（１）で選択された塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）前記（１）で選択された塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
【００１８】
本発明のプライマー対は、少なくとも２種以上の該プライマー対を含むプライマーセットとして使用することが好ましく、また、配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうる少なくとも１１種のプライマー対を含むプライマーセットとして使用することがより好ましい。
【００１９】
前記配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうるプライマー対としては、以下のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）が好適に挙げられる。
（Ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
【００２０】
本発明の配列番号１〜１１に表される塩基配列が由来する米の品種は、日本晴である。また、当該配列番号１〜１１における多型の有無などの情報は、Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍにて公開されているイネゲノム配列及びＲＦＬＰマーカー情報、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列などを基に見出したもの、ジェネティックアイディー株式会社、及び日本たばこ産業株式会社が独自に見出したものである。
【００２１】
前記配列番号１〜１１に表される塩基配列に多型が存在する場合、当該多型部位を含有する核酸を増幅しうることが好ましく、当該多型部位が挿入、欠失等により置換されていた場合に、核酸増幅処理による核酸増幅産物が得られにくいプライマーを設計することがより好ましい。ここで、米由来の核酸中に存在する多型とは、比較対象となる米同士での塩基配列の差異を意味し、１塩基〜数百塩基の置換、欠失、挿入、付加を含む概念である。
【００２２】
例えば、配列番号６に表される塩基配列の２１位、及び２８位に相当する位置、配列番号７に表される塩基配列の１４５位に相当する位置には多型が存在する。したがって、配列番号６、及び配列番号７に表される塩基配列からなる核酸増幅用のプライマーは、当該多型部位を含む塩基配列、当該多型部位に隣接する塩基配列等からなるプライマーが好ましい。
【００２３】
具体的には、例えば、配列番号６に表される塩基配列からなる核酸増幅用である上記プライマー対（Ｆ）を構成するフォワードプライマーは、塩基配列６に表される塩基配列の２1位における多型部位を含む塩基配列（配列番号１７）からなる配列が好ましい。また、配列番号７に表される塩基配列からなる核酸増幅用である上記プライマー対（Ｇ）を構成するリバースプライマーは、配列番号７の多型部位に隣接する部位の塩基配列（配列番号２９）からなる配列が好ましい。
【００２４】
上記配列における多型の位置はその位置よりも上流における配列中のヌクレオチドの挿入、欠失等によって変化しうる。上記の「相当する位置」とは、このように、遺伝子配列中の絶対的位置が変わった場合、配列番号１〜１１に表される基準配列中の相当位置を示す。すなわち、本発明における多型は、配列番号１〜１１で表される塩基配列と、識別対象となりうる被検米由来の核酸の塩基配列を比較することにより、配列番号１〜１１で表される塩基配列における多型に相当すると理解される多型を含む。
【００２５】
本発明の方法に使用するプライマーは、後の検出工程を考慮して、標識物質を含むこともできる。標識物質としては、当該技術分野においてよく知られる放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等を用いることができる。
【００２６】
本発明のプライマー又は後述する本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとしての機能を有するオリゴヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸などが含まれるが、ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましく、ＤＮＡがより好ましい。本発明に使用するオリゴヌクレオチドは遺伝子工学的手法、又は合成的方法により作製することができる。合成的方法としては、例えば、通常の固相合成法が挙げられる。当該方法による合成は、市販のＤＮＡ合成機を用いることにより合成することができる。
【００２７】
本発明のプライマー又は後述する本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとしての機能を有するオリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基を置換、欠失、挿入もしくは付加するといった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ，ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術［Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６］を利用することができる。
【００２８】
ここにおいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができ、その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）溶液、５０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ溶液中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ溶液で二次洗浄といった条件があげられる。
【００２９】
本工程において核酸増幅処理する方法については特に限定はなく、検出しようとする核酸断片が増幅可能であるような種々の核酸増幅方法を使用することができる。具体的にはＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などが用いられるが、中でもＰＣＲ法が好適に用いられる。この場合、本発明の上記プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の１１対のプライマー対を別々の反応系で個々に作用させて、それぞれの増幅産物を得てもよい。この場合はその後にこれらを１つの溶液となるよう混合することができる。また、上記プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）から選んだ複数のプライマー対を予め所定量ずつ一つの反応系に混合しておき、増幅反応を行ってもよい（以下この方法を「マルチプレックス法」という）。この場合は、最終的に上記プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全ての増幅産物が存在するような組合わせで増幅産物を混合し、一つの溶液を調製することができる。特にこのマルチプレックス法の中でも、上記プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全てを所定量ずつ混合した反応系で一度に増幅反応を行うことが簡便で効率的であることから最も好適である。このようなマルチプレックス法においてはマルチプレックスＰＣＲ法が好ましく用いられる。
【００３０】
上記のようにプライマー対が１１対ある場合には、通常、マルチプレックス法により増幅を行うと各プライマーごとの増幅効率のバランスが崩れ、特定の核酸が極端に増幅されてしまうという欠点がある。しかし本発明のプライマー対であれば、所定の仕込み量比で調製しておくことにより、一度のマルチプレックスＰＣＲでバランスよく各プライマー対に対応する増幅産物を得ることができる。
【００３１】
前記プライマー対の配合量比の具体例として、例えばプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）のＰＣＲ反応系への添加量（モル比）をプライマー対（Ａ）：プライマー対（Ｂ）：プライマー対（Ｃ）：プライマー対（Ｄ）：プライマー対（Ｅ）：プライマー対（Ｆ）：プライマー対（Ｇ）：プライマー対（Ｈ）：プライマー対（Ｉ）：プライマー対（Ｊ）：プライマー対（Ｋ）を、２：２：２：２：２：４：４：１：２：２：２とすることにより、一度のマルチプレックスＰＣＲでバランスよく核酸を増幅することができ、効率的な米品種及び混米の有無の判定が可能となる。
【００３２】
本発明の米品種の判別方法及びコシヒカリへの混米の有無の判定方法は、（i）核酸調製工程、及び、（ii）核酸増幅工程にくわえて、以下の（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程、及び／又は、（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出する検出工程を行ってもよい。
【００３３】
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
上記核酸増幅工程（ii）で得られた核酸増幅産物をゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などの慣用の電気泳動法により分離して検出し、得られた核酸増幅産物の長さに基づいて、被検試料中に含まれる米品種の判別、及びコシヒカリへの混米の有無を判定することができる。電気泳動に供する核酸増幅産物の量は、ゲル電気泳動の場合には、好ましくは１０〜１００ｎｇ、より好ましくは３０〜６０ｎｇの範囲内とする。
【００３４】
核酸増幅産物を電気泳動により検出して米の品種を判別する場合には、検出すべき米の品種によって得られる核酸増幅産物の長さが異なるようにプライマーセットを設計する。また、核酸増幅産物を電気泳動により検出してコシヒカリへの混米の有無を判定する場合、上記したプライマー対から選択される、少なくとも配列番号２、６、更には９及び／又は１０で表される塩基配列からなる核酸を増幅しうるプライマー対［例えば前記プライマー対（Ｂ）、（Ｆ）、更には（Ｉ）及び／又は（Ｊ）］を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。また、米の品種の判別及びコシヒカリへの混米の有無について、電気泳動によりさらに細かく判別する場合には、上記した本発明プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全１１種のプライマー対を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。
【００３５】
更に、核酸増幅産物を電気泳動により検出してコシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）とコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、上記したプライマー対から選択される、少なくとも配列番号２、７、９、１０で表される塩基配列からなる核酸を増幅しうるプライマー対［例えば前記プライマー対（Ｂ）、（Ｇ）、（Ｉ）、（Ｊ）］を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。また、コシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）とコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、電気泳動によりさらに細かく判別する場合には、上記した本発明プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全１１種のプライマー対を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。
【００３６】
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出する検出工程
上記核酸増幅工程（ii）により得られた核酸増幅産物と支持体上に固定した本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションシグナルの有無を検出することにより、米の品種判別及びコシヒカリへの混米の有無を判定することができる。
【００３７】
ＤＮＡアレイに供する核酸増幅産物の量は、好ましくは３５〜２５０ｎｇ、より好ましくは７０〜２００ｎｇの範囲内とする。また、核酸増幅産物は、捕獲オリゴヌクレオチドと当該核酸増幅産物とのハイブリッド形成を検出するために、標識されていることが好ましい。
【００３８】
核酸の標識方法は、ハイブリッド形成を阻害しない方法であれば特に制限されないが、このような方法としては、標識物質を用いて、ターゲット核酸の増幅に使用するプライマーを予め標識しておく方法、ターゲット核酸の作製中に標識する方法、及び、ターゲット核酸の作製後に標識する方法が例示できる。
【００３９】
上記標識物質は通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができ、特に限定されるものではないが、例えば、このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられ、蛍光物質としては具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしては具体的にはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００４０】
核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出して米の品種を判別する場合には、検出すべき米の品種によってハイブリダイゼーションシグナルの有無に差異が出現するようにプライマーセットを設計する。また、核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をＤＮＡアレイにより検出してコシヒカリへの混米の有無を判定する場合、上記したプライマー対から選択される、少なくとも配列番号２、６、更には９及び／又は１０で表される塩基配列からなる核酸を増幅しうるプライマー対［例えば前記プライマー対（Ｂ）、（Ｆ）、更には（Ｉ）及び／又は（Ｊ）］を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。また、米の品種の判別及びコシヒカリへの混米の有無の判定について、核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出してさらに細かく判別する場合には、上記した本発明のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全１１種のプライマー対を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。
【００４１】
更に、核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出してコシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）とコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、上記したプライマー対から選択される、少なくとも配列番号２、７、９、１０で表される塩基配列からなる核酸を増幅しうるプライマー対［例えば（Ｂ）、（Ｇ）、（Ｉ）、（Ｊ）］を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。また、コシヒカリＢＬ（新潟産コシヒカリ）とコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によりさらに細かく判別する場合には、上記した本発明のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の全１１種のプライマー対を含むプライマーセットを用いて核酸増幅処理することが好ましい。
【００４２】
（捕獲オリゴヌクレオチド）
本発明の捕獲オリゴヌクレオチドは、前記配列番号１〜１１で表される塩基配列を検出しうる１０〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドが好ましく、具体的には以下の（I）〜（XIII）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択される。
（I）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＡＴＧ−３´（配列番号３４）
（II）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＡＴＧ−３´（配列番号３５）
（III）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＧＡＣＡＡＣＴＡＴＣＴＡＣＣＡ−３´（配列番号３６）
（IV)配列番号４で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＧＧ−３´（配列番号３７）
（V）配列番号５で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＧ−３´（配列番号３８）
（VI）配列番号６で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＡＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＡＧＴ−３´（配列番号３９）
（VII）配列番号７で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＣＣＡ−３´（配列番号４０）
（VIII）配列番号８で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣ−３´（配列番号４１）
（IX）配列番号９で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＡＣＴＣＣＴＡＧＡＴＧＣＧＴＡ−３´（配列番号４２）
（X）配列番号９で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＴＡＴＡＴＡＣＧＣＡＴＣＴＡＧ−３´（配列番号４３）
（XI）配列番号１０で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＴＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＣＴＣＡ−３´（配列番号４４）
（XII）配列番号１０で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＡＧＣＣＡＴＴＣＴＡＴＡＧＧＡ−３´（配列番号４５）
（XIII）配列番号１１で表される塩基配列からなる核酸検出用
５´−ＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＧＧＴＴＡ−３´（配列番号４６）
【００４３】
本発明の捕獲オリゴヌクレオチドは、（１）上記配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列のほか、以下の（２）〜（５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択され、配列番号１〜１１で表される塩基配列のいずれか１つからなる核酸を検出しうるオリゴヌクレオチドを含む。
（２）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列
（３）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列
【００４４】
本発明の捕獲オリゴヌクレオチドは、該捕獲オリゴヌクレオチドを少なくとも２種以上含むオリゴヌクレオチド群として使用することが好ましく、配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれに検出しうる１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを少なくとも含む捕獲オリゴヌクレオチド群として使用することが好ましい。
【００４５】
前記配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれに検出しうる捕獲オリゴヌクレオチドとしては、以下の（I）〜（XIII）の捕獲オリゴヌクレオチドが好適に挙げられる。
（I）配列番号３４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（II）配列番号３５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（III）配列番号３６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IV）配列番号３７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（V）配列番号３８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VI）配列番号３９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VII）配列番号４０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VIII）配列番号４１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IX）配列番号４２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（X）配列番号４３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XI）配列番号４４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XII）配列番号４５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XIII）配列番号４６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
【００４６】
前記配列番号１〜１１で表される塩基配列において多型部位が存在する場合、捕獲オリゴヌクレオチドは該多型部位を含む塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列からなることが好ましい。また、配列番号１〜１１の塩基配列において、塩基が置換、欠失及び／又は付加された場合も、当該多型部位を含む塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列からなる捕獲オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００４７】
具体的には、配列番号９に表される塩基配列の５５位に相当する位置には多型が存在する。したがって、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸検出用の捕獲オリゴヌクレオチドは、当該多型部位を含む塩基配列からなることが好ましい。具体的には、例えば、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸検出用の上記捕獲オリゴヌクレオチド（IX）は、配列番号９に表される塩基配列の５５位における多型部位を含む塩基配列（配列番号４２）からなることが好ましい。
【００４８】
また、前記配列番号１〜１１に表される塩基配列において、品種による欠失、挿入等の差異が高頻度で生じる部位がある場合、当該部位を含む塩基配列及び当該部位を含まない塩基配列からなる２種の捕獲オリゴヌクレオチドを併用することが好ましい。例えば、配列番号９の３８〜４５位、配列番号１０の３５〜４４位の塩基配列は、米品種により欠失する部位である。したがって、配列番号９及び１０に表される塩基配列からなる核酸検出用の捕獲オリゴヌクレオチドは、当該欠失部位を含む塩基配列及び当該欠失部位を含まない塩基配列からなることが好ましい。
【００４９】
具体的には、例えば、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸検出用の上記捕獲オリゴヌクレオチド（IX）は、配列番号９に表される塩基配列における上記欠失部位を一部含む塩基配列（配列番号４２）からなり、捕獲オリゴヌクレオチド（X）は、当該欠失部位を含まない塩基配列（配列番号４３）からなることが好ましい。また、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸検出用の上記捕獲オリゴヌクレオチド（XI）は、配列番号１０に表される塩基配列における上記欠失部位を含む領域の塩基配列であり、当該欠失部位を含まない配列（配列番号４４）からなり、捕獲オリゴヌクレオチド（XII）は上記欠失部位を含む領域の塩基配列であり、かつ、当該欠失部位を含む配列（配列番号４５）からなることが好ましい。
【００５０】
核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出し、コシヒカリへの混米の有無を判定する場合、配列番号２、６、９、１０に表される塩基配列を検出できる捕獲オリゴヌクレオチド［例えば上記捕獲オリゴヌクレオチド（II）、（VI）、（IX）、（X）、（XI）、（XII）］を少なくとも用いることが好ましい。また、ＤＮＡアレイにより核酸増幅産物を検出し、コシヒカリＢＬとコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリを判別する場合、配列番号２、７、９、１０に表される塩基配列を検出できる捕獲オリゴヌクレオチド［例えば上記捕獲オリゴヌクレオチド（II）、（VII）、（IX）、（X）、（XI）、（XII）］を少なくとも用いることが好ましい。また、コシヒカリへの混米の有無の判定及び／又はコシヒカリＢＬとコシヒカリＢＬ以外のコシヒカリとを判別する場合、核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出してさらに細かく判別する場合には、上記した本発明の捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）の全１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む捕獲オリゴヌクレオチド群を用いることが好ましい。
【００５１】
核酸増幅産物と本発明の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を検出し、米の品種を判別する場合、支持体に固定する捕獲オリゴヌクレオチドは、単数でも複数でもよいが、品種をより正確に特定するためには、複数の捕獲オリゴヌクレオチドを含む捕獲オリゴヌクレオチド群を用いることが好ましく、上記した本発明の捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）の全１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む捕獲オリゴヌクレオチド群を用いることがより好ましい。ここで、複数用いる場合の捕獲オリゴヌクレオチドの選択は、当該捕獲オリゴヌクレオチドが判別することができる米の品種と判別したい米の品種、判別したい米の品種、判別したい米が該当する可能性のある米の品種の情報を参酌することにより、適宜設計する。また、極めて近縁の品種を確実に判別するために、同一の支持体上で複数、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは１５以上の多型を網羅的に検出することが、操作の簡便性及び識別の正確性と迅速性の観点から好ましい。
【００５２】
（支持体）
捕獲オリゴヌクレオチドを固定する支持体は、捕獲オリゴヌクレオチドを安定して固定することができ、被検米試料に由来する核酸とのハイブリッド形成及び、ハイブリッドの検出に必要な反応工程に耐え得るものであれば、その材質は特に制限されず、例えばスライドガラス、有機高分子、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等を使用することができる。
【００５３】
前記有機高分子としては、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビリニデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等が挙げられる。また、無機高分子としては、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及び、グラファイト等が挙げられる。また、金属としては、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット等が挙げられる。また、天然高分子としては、ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及び、それらの誘導体等が挙げられる。また、セラミックとしては、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び、炭化ホウ素等が挙げられる。
【００５４】
支持体の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、板状、フィルム状、膜状、粒子状等の支持体を好適に用いることが出来るが、板状のものが好ましい。
【００５５】
本発明においては、担体を支持体に担持させて、担体を介して捕獲オリゴヌクレオチドを支持体に固定化してもよい。担体としては、担体自体が捕獲オリゴヌクレオチドに結合性を有してもよく、捕獲オリゴヌクレオチドに結合性を有するリンカーを介して捕獲オリゴヌクレオチドを固定化できるものであってもよい。ここで「担持」とは、捕獲オリゴヌクレオチドの支持体上担体への固定化、及び、当該支持体によるハイブリダイゼーションシグナル検出等の際に、洗浄等の目的で使用される水溶性溶剤や有機溶剤等の各種溶剤によって、上記担体が支持体から実質的に脱離しないことを意味する。
【００５６】
前記担体は、上記支持体上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、支持体上の全面において担持されていても、また、その一部において担持されていてもよい。
【００５７】
前記担体としては、有機低分子、有機高分子、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙げられる。ここで、有機低分子としては、例えば、カルボジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、アミノ基含有化合物等が挙げられる。また、有機高分子、無機高分子、金属、セラミックは、前記したものと同様のものを使用することができる。本発明において特に好ましい担体は、カルボジイミド基含有化合物又はイソシアネート基含有化合物である。
【００５８】
（捕獲オリゴヌクレオチドの支持体への固定）
捕獲オリゴヌクレオチドを支持体に固定する手段は、米品種の判別又は混米の有無の判定ができれば特に制限されるものでなく、公知の方法を適宜選択して用いれば良い。例えば、単に物理的な接着性を利用して固定されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して固定されていてもよい。また、紫外線等の電磁波を照射することによって固定することもできる。更に、捕獲オリゴヌクレオチドとカルボジイミド樹脂、窒素イペリット、ポリアミノ酸、ニトロセルロース等の公知の化合物を化学的に結合又は物理的に結合した状態で、これら混合物と担体を接触させ固定させても良く、また、このとき適宜紫外線等の電磁波を照射して固定を行うこともできる。ここで、支持体において上記捕獲オリゴヌクレオチドを固定する場所については、支持体の全面であっても、また、その一部にであってもよい。
【００５９】
また、捕獲オリゴヌクレオチドを支持体上に固定化する際、固定化されたオリゴヌクレオチドが占める場所の形状は、被検米試料に由来する核酸とのハイブリッド形成に影響を及ぼさず、また、検出が困難にならなければ特にその形状は制限されないが、例えば、円形、四角形などが挙げられる。
【００６０】
固定化に用いられる具体的な手段としては、分注機器を用いる方法、ピン式スポット機器を用いる方法、インクジェット式スポット機器を用いる方法などが例示でき、これらにより捕獲オリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形の形状にて支持体の一部分に固定化できる。
【００６１】
支持体上へ各捕獲オリゴヌクレオチドが固定化される部位のサイズは、直径１０μｍ〜１,０００μｍのサイズに固定されることが好ましい。これより小さいと検出が困難になり、また、これより大きいと配置された捕獲オリゴヌクレオチド全体の占める面積が大きくなり、操作性が悪くなるという問題が生じることがある。
【００６２】
各捕獲オリゴヌクレオチドの支持体上への配置は、米品種の判別または混米の有無の判定が出来れば特に制限されないが、これらの判別または判定を容易にするために捕獲オリゴヌクレオチドを１区画にまとめるか、あるいは一列に並べるなどして配置することが好ましい。
【００６３】
なお、担体を支持体に担持させて、担体を介して捕獲オリゴヌクレオチドを支持体に固定する場合、捕獲オリゴヌクレオチドの固定は、担体に直接担持させる方法のほか、捕獲オリゴヌクレオチドに担体との結合性を有するリンカーを介して担体に担持させる方法により行うことができる。ここで、リンカーとしては、例えばカルボジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物及びアミノ基含有化合物等が挙げられ、より具体的には核酸ホモポリマーを有するリンカー（ＤＮａｔｔａｃｈＴＭ、日清紡績株式会社製）が挙げられる。
【００６４】
（ハイブリッド形成）
核酸増幅産物と捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は上記捕獲オリゴヌクレオチドを固定した例えば核酸検出用メンブレン上などで実施することもできるが、前述した捕獲オリゴヌクレオチドを固定した支持体を用いることが好ましい。当該支持体を用いることにより、極近縁な関係にある米の品種も迅速、簡便且つ正確に、視認性に優れた識別を行うことが可能になる。ハイブリダイゼーションに用いる方法としては特に限定されるものではなく、公知の核酸ハイブリイド形成方法を適宜採用して用いることができる。以下に具体的なハイブリダイゼーション方法の一態様を示す。
【００６５】
Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）などの緩衝塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的吸着の阻害剤、及びハイブリダイゼーション反応促進のための添加剤を含む混合溶液に予め標識を施した核酸増幅産物を加える。当該核酸増幅産物が２本鎖を形成する場合は、加熱等による変性を施す。捕獲オリゴヌクレオチドが固定された支持体上に上述の標識した核酸増幅産物を含む混合溶液を適量、好ましくは２０〜１００μｌ添加した後、通常適当な温度、好ましくは３０℃〜８０℃の熱を数時間加え、支持体上に固定されている捕獲オリゴヌクレオチドと核酸増幅産物との塩基配列に特異的なハイブリッドを形成させる。次いで、前出混合溶液を取り除き、支持体上に５×ＳＳＣ溶液又は３Ｍテトラメチルクロライド溶液等の溶液を加えて適温、好ましくは３０℃〜８０℃で加熱し、非特異的なハイブリッドを形成している核酸増幅産物を支持体上から剥離させ、特異的なハイブリッドのみを選択的に支持体上に残存させる。
【００６６】
（ハイブリッド形成の検出）
ハイブリッド形成の検出は、ハイブリダイゼーションシグナルにより検出することができる。ハイブリダイゼーションシグナルの検出は、通常上記ハイブリダイゼーションと連続的に行われる。ハイブリッドの検出に用いる方法は、上記の核酸増幅産物を標識した物質に依存する。すなわち、ハイブリッドの検出には、ターゲット核酸の標識に用いられた蛍光物質やハプテン等の標識物質を使用する。従って、当該標識物質を検出できる公知の方法を適宜選択して使用すればよい。例えば、蛍光物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いてハイブリダイズした核酸増幅産物に標識された蛍光を検出する。他方、ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパク質又はそれに結合する別のタンパクと、アルカリフォスファターゼ又はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲートと呼ぶ）を含む溶液を支持体上に加え、例えば、室温で数１０分間反応させる。
【００６７】
ハイブリッドの視覚化は、ハプテンと酵素コンジュゲートとの結合体が存在する場合にのみ不溶化合物が形成されるような色素化合物を添加することにより行うことができる。その不溶性化合物の生成は酵素反応によって増幅され、ハイブリッドが形成されている捕獲オリゴヌクレオチドの固定化部位が色素によって可視化される。添加される化合物としては、酵素コンジュゲートの酵素部分がアルカリフォスファターゼで構成される場合には、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐ−トルイジン塩が挙げられ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで構成される場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンなどが挙げられる。
【００６８】
捕獲オリゴヌクレオチドを固定化した位置におけるハイブリッドの色素沈着又は蛍光発色等の有無を判定して、核酸増幅処理により得られた増幅産物の有無を決定し、被検試料中に含まれる米品種の判別又は混米の有無の判定を行うことができる。すなわち、ハイブリッドを検出した場合には、当該色素沈着等が存在する位置に固定化された捕獲オリゴヌクレオチドに対応する品種が、被検試料中に含まれていることを意味する。
【００６９】
本発明の米品種判別キット又はコシヒカリへの混米の有無判定キットは、上述の米の品種判別方法又はコシヒカリへの混米の有無判定方法を実施するためのキットであり、上記プライマーセット、上記捕獲オリゴヌクレオチド群、上記ハイブリダイゼーション及びハイブリッドの検出に使用する試薬、器具を含むものである。
【００７０】
ハイブリダイゼーションにおいて用いる試薬としては、例えばＳｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）などの緩衝塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的吸着の阻害剤、及びハイブリダイゼーション反応促進のための添加剤などを挙げることができる。
【００７１】
ハイブリッドの検出に用いる試薬としては、例えばハプテンを認識するタンパク質と酵素との結合体（酵素コンジュゲート）や、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐ−トルイジン塩、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン等の試薬を挙げることができる。
【００７２】
なお、例示したハイブリダイゼーション及びハイブリッド検出に使用する試薬は、これらに限定されるものではなく、目的に見合う適切な試薬を適宜選択してキットの構成とすれば良い。
【００７３】
更に、上記キットは、上記核酸試料の調製に使用する試薬、及び／又は上記の核酸増幅産物の調製に使用する試薬を含むものが好ましい。
【００７４】
核酸増幅産物の調製に使用する試薬としては、例えばＰＣＲ用の緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸混合溶液等が挙げられ、核酸調製工程で使用する試薬としては、ＤＮＡ抽出用の緩衝液等を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく目的に見合う適切な試薬を適宜選択してキットの構成とすれば良い。また、ターゲット核酸を作製するためのプライマーもキットに含めることができる。
【００７５】
本発明の米の品種判別方法及びコシヒカリへの混米の有無判定方法、並びに米の品種判別キット及びコシヒカリへの混米の有無判定キットは、米の品種判別及びコシヒカリへの混米の有無の判定が必要な用途全てに用いることができる。具体的には、例えば、播種時における米の種子の判別、苗の判別、収穫時における米の判別、米の流通段階で品種を判別するかあるいは混米の有無を判定する必要がある場合、米の種子の品種を管理する場合、更には炊飯後の米の品種を判別するかあるいは混米の有無を判定する必要がある場合等に好適に用いられる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００７７】
［実施例１］
（１）プライマーの設計
本発明を実施するにあたり、配列番号１〜１１の多型を含む基準の配列の核酸を増幅しうるフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計した。表１に本実施例において使用した多型を含む基準配列番号、プライマー及びプライマー対の関係を示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
（２）プライマーの合成
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、表１に示すプライマー（配列番号１２〜３３）について、未修飾のプライマー、または５´末端にビオチン修飾したプライマーを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。その後、Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて溶解し、２ｐｍｏｌ/μＬのプライマー溶液をそれぞれ調製した。
【００８０】
（３）プライマーセットの調製
マルチプレックスＰＣＲを実施するために、上記（２）で調製した各プライマー溶液を混合し、１１種のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを調製した。表２に、調製したプライマーセットの配合を示す。なお、ビオチン修飾プライマー及び未修飾プライマーも同様に配合し、プライマーセットを調製した。
【００８１】
【表２】
【００８２】
（４）鋳型ＤＮＡの抽出
被検米試料からのＤＮＡ抽出は、Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ） Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて行い、マルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。被検米試料は平成１５年度の作付面積上位２０品種であるコシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、きらら３９７、キヌヒカリ、はえぬき、ほしのゆめ、つがるロマン、ササニシキ、ゆめあかり、日本晴、ハナエチゼン、夢つくし、あいちのかおり、むつほまれ、あさひの夢、ハツシモ、ななつぼし、ふさおとめの玄米を一粒ずつ被検試料とした純米試料（表３、検体番号１〜２０）、及び、コシヒカリ１９粒に対して上記ひとめぼれからふさおとめ（表３、検体番号２〜２０）まで計１９品種の玄米をそれぞれ各１粒混合させて２０粒とした混米試料を用いた（表３、検体番号Ｋｂ２〜Ｋｂ２０）。
【００８３】
【表３】
【００８４】
（５）マルチプレックスＰＣＲ
上記（４）で抽出した米由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、マルチプレックスＰＣＲにより核酸増幅産物を調製した。具体的なＰＣＲの反応組成及び反応条件を表４に示す。
【００８５】
【表４】
【００８６】
（６）電気泳動
マルチプレックスＰＣＲによって得られた増幅産物溶液を純米の場合は２μｌ、混米の場合は５μｌを８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により各ＤＮＡを分離後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で染色し、紫外線照射により識別バンドの電気泳動パターンを観察した。なお、ＤＮＡ分子量マーカーには、２０ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）を使用した。
【００８７】
（７）結果
図１に、純米検出のために、１１種のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、単一品種の被検米試料２０粒より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す。図１中のレーン番号は、表３に記載の検体番号に対応する。
【００８８】
なお、４００ｂｐ付近に確認されるバンドは、互いに異なるマーカーのフォワードプライマーとリバースプライマーによって増幅したＰＣＲ産物であるため、本発明における増幅目的のＰＣＲ産物ではない。よって、３０１ｂｐ以下のバンドを識別バンドとして用いた（以下、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いた実施例においても同様とした）。
【００８９】
図２に、混米の有無を判定するために、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、コシヒカリ１９粒に対し表３に示した検体番号２から検体番号２０の品種１粒を混米させた被検試料より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す。図２中、レーン１はコシヒカリ純米の結果を示し、レーン２〜２０は表３に記載の検体番号（Ｋｂ２〜Ｋｂ２０）に対応する５％混米の電気泳動パターンを示す。
【００９０】
表５に、図１における各純米品種の電気泳動による識別バンドの判定表を示す。表５中の＋及び−は、それぞれ識別バンドの有及び無を示す。なお、プライマー対番号Ｉ及びプライマー対番号Ｊにおいて、マルチプレックスＰＣＲの際に、鋳型となる米品種により増幅するＰＣＲ産物の鎖長に違いが生じる。これら鎖長の相違を、表５中において、ａあるいはｂで示す。コシヒカリを例にとると、プライマー対番号Ｉにおいてはａ（１００ｂｐ）、プライマー対番号Ｊにおいてはａ（８７ｂｐ）が識別され、それ以外の識別バンドは無いことが分かった。
【００９１】
また、表５中において、プライマー対番号Ｉによって得られる識別バンドａ及びｂ、またプライマー対番号Ｊによって得られる識別バンドａ及びｂは、得られるＰＣＲ産物それぞれの分子量が極めて近く、実際の電気泳動写真上では重なって観察された。それゆえ、図１及び図２における純米品種判別及び５％混米の有無の判定には、表５を用いて行った。
【００９２】
【表５】
【００９３】
（８）考察
コシヒカリ純米の場合は得られた識別バンドは２本であったが(図１及び図２のレーン１)、それ以外の純米の場合(図１)、及び混米ありの場合(図２)には３本以上の識別バンドが検出された。このことから、１１種のプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の電気泳動により検出される識別バンド数を調べることによって、コシヒカリ純米か否かを判別できることが分かった。また、被検試料が純米である場合には、識別バンド数の違い及び識別バンドの鎖長の違いにより、表３に示す検体番号１〜２０の品種のうち少なくとも１５品種以上の米品種を判別できることが分かった。
【００９４】
［実施例２］
（１）捕獲オリゴヌクレオチドの設計
ＤＮＡアレイを使用して、米の品種判別、及びコシヒカリへの混米の有無の判定を行うために捕獲オリゴヌクレオチドを設計した。設計した１３種の捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）の配列番号（配列３４〜４６）、プライマー及びプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）の関係を表６に示す。配列番号４２〜４５に表される塩基配列からなる捕獲オリゴヌクレオチド（IX）〜（XII）は、米の品種に特異的又は米の品種間で高頻に差異を示す特徴的な塩基配列を含む捕獲オリゴヌクレオチドであり、また、配列番号３４〜４１及び配列番号４６に表される塩基配列からなる捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（VIII）および（XIII）は、米の品種に特異的な増幅の有無を検出する捕獲オリゴヌクレオチドである。
【００９５】
【表６】
【００９６】
（２）捕獲オリゴヌクレオチドの合成
ポリカルボジイミド樹脂をコートしたスライドガラス「カルボステーション（商標登録第４５７４９７４号、日清紡績株式会社製）」に捕獲オリゴヌクレオチドを固定化する場合は、捕獲オリゴヌクレオチドの５´末端にアミノリンカーを付加し、また、表面未処理のポリカーボネート樹脂製スライド（帝人株式会社製）に捕獲オリゴヌクレオチドを固定化する場合は、捕獲オリゴヌクレオチドの５´末端に核酸ホモポリマーを有するリンカー（ＤＮａｔｔａｃｈＴＭ、日清紡績株式会社製）を付加して、実施例１と同様に定法に従い合成した。
【００９７】
（３）支持体への捕獲オリゴヌクレオチドの固定化：ＤＮＡアレイの作製
捕獲オリゴヌクレオチド溶液１０μｌに対してマイクロスポッティング溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）を１０μｌ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．製）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置に表面未処理のポリカーボネート樹脂製スライド（帝人株式会社製）又は、ポリカルボジイミド樹脂で表面を処理したスライドグラス「カルボステーション（商標登録第４５７４９７４号、日清紡績株式会社製）」を配置し、スポッティングマシンを作動させ、表７に示したスポットの並びとなるようにスライドグラス上に捕獲オリゴヌクレオチド溶液をスポッティングした。
【００９８】
スポッティング終了後、紫外線を６００ｍＪ照射したものを３％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ X−１００に３０分間浸し、ブロッキングした。その後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。最後に滅菌水でリンスし、スライドグラスを乾燥させ、使用するまで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
【００９９】
支持体上の各スポットに固定化されている捕獲オリゴヌクレオチドの配置を表７に示す。表７中の番号は表６に示した捕獲オリゴヌクレオチドの配列番号を示し、ビオチンは位置を知る目印、及び発色操作に問題が無いことを確認する為にスポットしているビオチン化オリゴマーを示す。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
（４）マルチプレックスＰＣＲとハイブリダイゼーション工程
実施例１と同様に、被検米試料からのゲノムＤＮＡの抽出、及びマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をターゲット核酸とした。ただし、プライマーセットは５´ビオチン化プライマーを用いて調製したものを使用した。マルチプレックスＰＣＲにより得たターゲット核酸溶液１４μｌを０．５ｍｌ容チューブに取り、９５℃で３分間加熱処理を行った後、氷中に３分間浸した。これを室温に戻し、ＡｒｒａｙＩｔ Ｕｎｉｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）３６μｌを加えて混合し、プローブ核酸溶液とした。プローブ核酸溶液を全量とり、上記（３）で作製したＤＮＡアレイにのせ、その上にカバーフィルムをのせた。これを保湿箱に入れ、さらに５０℃に設定した恒温器に入れて６０分間静置した。アレイを取り出し、すばやく室温下で２×ＳＳＣ溶液（２×ＳＳＣ：０．０３３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３３Ｍ クエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去し、アレイを室温下で２×ＳＳＣ溶液に５分間浸した。
【０１０２】
（５）ハイブリダイゼーションシグナルの検出
ＤＮＡアレイ上の２×ＳＳＣ溶液を軽く取り払い、次にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いてアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を調製したものをアレイ上に１．０ｍｌ滴下し、室温下で３０分間静置した。その後、アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を軽く振り払い、ＴＢＳＴ溶液中［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０］にて室温下で５分間の洗浄を２回繰り返した。ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ fｏｒ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ(ＶＥＣＴＯＲ社製)を用いて発色溶液を調製したものをアレイ上に１．０ｍｌ滴下し、室温下で３０分間静置して、酵素反応により発色させた。アレイを蒸留水で洗浄して酵素反応を停止させ、青色に発色したことを確認した。
【０１０３】
（６）判定
発色したスポットを目視で確認して結果を判定した。また、ＯＡ用スキャナー（ＧＴ−８７００Ｆ、ＥＰＳＯＮ社製)を用いて６００ｄｐｉの画像密度でＤＮＡアレイをスキャンして結果の保存を行った。
【０１０４】
（７）結果
コシヒカリ２０粒（検体番号１）、及び実施例１の表３に示した混米試料（検体番号Ｋｂ２〜Ｋｂ２０）に対する捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションシグナルの有無を表８に、ＤＮＡアレイの発色画像を図３に示す。なお、表８中の＋は、ハイブリッドが形成され発色反応によりハイブリダイゼーションシグナルが検出されたことを示し、−はハイブリッドが形成されず、ハイブリダイゼーションシグナル検出されなかったことを示す。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
（８）考察
図３及び表８から分かるように、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットによるマルチプレックスＰＣＲと、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイにより、コシヒカリへの混米を確認できることが分かった。また、陰性コントロールへの発色も見られなかったことから、非特異的増幅は無かったことが分かった。
【０１０７】
［実施例３］
実施例２で作製したＤＮＡアレイを使用し、実施例１の表３に示した作付面積上位２０品種及び表９に示したそれ以外の品種、それぞれ２０粒（純米）より抽出したゲノムＤＮＡの品種判別を実施した。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
（１）方法
被検米試料からのＤＮＡ抽出は、実施例１と同様に行い、マルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。マルチプレックスＰＣＲ、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイゼーションシグナルの検出及びその判定は実施例２と同様に実施した。
【０１１０】
（２）結果
図４〜８に、実施例１の表３及び上記表９に示した米品種それぞれ各２０粒を被検試料とした場合のＤＮＡアレイによる検出結果を示す。また、表１０〜１２に、１１９品種に対しての捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの有無を示す。なお、表１０〜１２中の＋は、ハイブリッドが形成されハイブリダイゼーションシグナルが検出されたことを示し、−はハイブリッドが形成されず、ハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかったことを示す。
【０１１１】
【表１０】
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
【表１２】
【０１１４】
（３）考察
表１０〜１２及び図４〜８から分かるように、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットによるマルチプレックスＰＣＲの増幅産物を捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイにより検出した結果、表３及び表９に示した全１１９品種について全て異なるシグナルパターンが得られた。すなわち、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動及び捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによれば、表３及び表９に示した全１１９品種を１回のＰＣＲで判別出来ることが分かった。
【０１１５】
［実施例４］
検出限界となるゲノム濃度について、市販のコメ品種判別用ＰＣＲキットである、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を使用した場合（比較例）と、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用した場合（実施例）とを比較した。
【０１１６】
（１）マルチプレックスＰＣＲ
実施例１で抽出した米のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用してマルチプレックスＰＣＲを行った。ＴａＫａＲａ社製のコメ品種判別用ＰＣＲキットは、Ｋｉｔ I及びＫｉｔ IIをセットで使うため、１度の試験に２回のＰＣＲが必要になる。具体的なＰＣＲの反応組成及び反応条件については、説明書に示されている通りに行った。被検米試料及びゲノム濃度の詳細は、表１３及び表１５に示す。なお、ＤＮＡ量はＵＶで測定した。
【０１１７】
一方、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットにおいては、実施例１で抽出した米のゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の条件でマルチプレックスＰＣＲを行った。ただし、当該プライマーセットは、５´ビオチン化及び/又は未修飾プライマーを用いて調製したものを使用した。被検米試料及びゲノム濃度の詳細は、表１４及び表１６に示す。なお、ＤＮＡ量はＵＶで測定した。
【０１１８】
（２）電気泳動
ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用して得られたＰＣＲ産物溶液５μｌを２％アガロースゲルで電気泳動により増幅産物を分離後、臭化エチジウム（以下エチジウムブロマイド又はＥｔＢｒ）、及び、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎI）にて染色し、その後、紫外線照射によりＰＣＲ産物の電気泳動パターンを観察した。
【０１１９】
一方、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットにおいては、当該プライマーセットを使用して得られたＰＣＲ産物溶液５μｌを８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により増幅産物を分離後、エチジウムブロマイド、及び、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIにて染色し、その後、紫外線照射によりＰＣＲ産物の電気泳動パターンを観察した。
【０１２０】
（３）電気泳動の結果
図９に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を使用して、単一品種の米コシヒカリより抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図９の左図はエチジウムブロマイドによる染色、図９の右図はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIによる染色結果を示す。図９のレーン１から１０については表１３に記載の検体番号を示す。また、表１３に、図９の各レーン番号に対応する被検米試料の説明、及び、電気泳動における判別の可否を示す。なお、コシヒカリ１とコシヒカリ２はサンプルの入手先が異なることを示す。
【０１２１】
図１０に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、単一品種の米コシヒカリより抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図１０の左図はエチジウムブロマイドによる染色、右図はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIによる染色結果を示す。図１０のレーン１から１３については表１４に記載の検体番号を示す。また、表１４に、各レーン番号に対応する被検米試料の説明、及び、電気泳動における判別の可否、ハイブリダイゼーションでの判別可否を示す。なお、コシヒカリ１とコシヒカリ２はサンプルの入手先が異なることを示す。
【０１２２】
図１１に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を使用し、混米の有無の判定のために、コシヒカリ１９粒に対しあいちのかおり１粒を混米させた試料より抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図１１の左図はエチジウムブロマイドによる染色、図１１の右図はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIによる染色結果を示す。図１１のレーン１から１２については表１５に記載の検体番号を示す。また、表１５に各レーン番号に対応する被検米試料の説明、及び、電気泳動における判別の可否を示す。なお、コシヒカリ１とコシヒカリ２、及び、あいちのかおり１とあいちのかおり２、はそれぞれサンプルの入手先が異なることを示す。
【０１２３】
図１２に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、混米の有無の判定のために、コシヒカリ１９粒に対しあいちのかおり１粒を混米させた試料より抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図１２の左図はエチジウムブロマイドによる染色、図１２の右図はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIによる染色結果を示す。図１２のレーン１から１３については表１６に記載の検体番号を示す。また、表１６に、各レーン番号に対応する被検米試料の説明、及び、電気泳動における判別の可否、ハイブリダイゼーションでの判別可否を示す。なお、コシヒカリ１とコシヒカリ２はサンプルの入手先が異なることを示す。
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
【表１６】
【０１２８】
（４）捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションシグナルの検出
上記（１）で得られたプライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物について、実施例２で作製したＤＮＡアレイを使用し、実施例３と同様に、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションシグナルの形成を確認した。被検米試料及びゲノム濃度の詳細は、表１４及び表１６に示す。
【０１２９】
（５）ハイブリダイゼーションの結果
上記（４）の検出結果について、表１４に対応する検出結果を図１３に、表１６に対応する結果を図１４に示す。
【０１３０】
（６）考察
・コシヒカリ純米での感度試験
図９及び表１３から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」において、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のコシヒカリゲノムを０．５ｎｇ投入し、ＰＣＲ産物を電気泳動で検出した場合、３本あるはずの識別バンドの確認ができない場合があることが分かった（図９、レーン７）。
【０１３１】
一方、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用した場合、図１０及び表１４から分かるように、ＰＣＲ産物を電気泳動で検出することにより、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノムＤＮＡ量が０．５ｎｇ、０．１ｎｇであっても識別バンドが確認できることが分かった（図１０、レーン６、７、１１、１２）。
【０１３２】
また、図１３及び表１４から分かるように、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイにより上記ＰＣＲ産物を検出することにより、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のコシヒカリゲノム量が０．１ｎｇでも識別バンドが確認できることが分かった。
【０１３３】
・５％混米での感度試験
図１１及び表１５から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ ＫｉｔII（コシヒカリネガキット）」によるＰＣＲ産物の電気泳動により混米の有無を検出したところ、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノム量が５ｎｇ（ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIでは１ｎｇ）までは、５％の混米を確認できたが、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノム量が０．５ｎｇとした場合は増幅産物が確認できなかった。
【０１３４】
一方、図１２、及び表１６から分かるように、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットによるＰＣＲ産物の電気泳動により混米を検出すれば、ＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノム量が０．５ｎｇ、０．１ｎｇであっても混米の有無を判定することが可能であることが分かった。また、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIではさらに少ないゲノム量（０．０２５ｎｇ）でも混米であることが確認できた（図１２、レーン７）。
【０１３５】
また、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物と捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションシグナルを検出することにより、表１６に示したようにＰＣＲ反応液２０μｌ中のゲノム量が０．０２５ｎｇの場合でも混米であることが確認できることが分かった。すなわち、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動、及び捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイにより、少ないゲノム量の検体であっても混米の有無を判定できることが分かった。
【０１３６】
［実施例５］
千葉県産コシヒカリと新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）とを判別するため、実施例２で作製したＤＮＡアレイを使用し、各２０粒より抽出したゲノムを用いて、電気泳動及びＤＮＡアレイによる判別を行った。
【０１３７】
（１）方法
実施例１と同様に、被検米試料からゲノムＤＮＡを抽出し、これをマルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。また、実施例２と同様にマルチプレックスＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。
電気泳動による判別は実施例１と同様に、またＤＮＡアレイの作製、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーション工程、及びハイブリダイゼーションシグナルの検出による判別は実施例２と同様に行った。
【０１３８】
（２）結果
図１５に千葉県産コシヒカリと新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動で検出した結果（図１５左図）、及びＤＮＡアレイにより検出した結果（図１５右図）を示す。電気泳動の結果、千葉県産コシヒカリは２本の識別バンドが、新潟産のコシヒカリでは３本の識別バンドが検出された（図１５左図）。また、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションシグナルは千葉県産コシヒカリでは２スポット、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）では３スポット検出された（図１５右図）。
【０１３９】
（３）考察
図１５左図に示す電気泳動により検出された３本の識別バンド（３０１ｂｐ以下のバンドを識別バンドとして用いる）は、コシヒカリＢＬを示唆するものであった。したがって、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動により、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）と新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）以外のコシヒカリとを判別できることが分かった。
【０１４０】
また、図１５右図に示したように、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションシグナルは千葉県産コシヒカリでは２スポット、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）では３スポット検出され、ハイブリダイゼーションシグナルのパターンが明らかに異なっていた。更に、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）によるハイブリダイゼーションシグナルのパターン（図１５右図）は実施例３（図４〜８）に示した１１９品種のどのパターンとも異なっていた。これらの結果から、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによれば、新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）と新潟県産コシヒカリ（ＢＬ）以外のコシヒカリとを判別できることが分かった。
【０１４１】
［実施例６］
検出限界となる混米のパーセンテージについて、市販のコメ判別用ＰＣＲキットである、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を使用した場合（比較例）と、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いた場合（実施例）とを比較した。
【０１４２】
（１）方法
被検米試料及びゲノム濃度の詳細は、表１７に示したように行い、マルチプレックスＰＣＲ、電気泳動、ハイブリダイゼーションは実施例４と同様に行った。ただし、表１７のレーン１８及びレーン１９は、図１８及び図１９でのみ使用している。
【０１４３】
【表１７】
【０１４４】
（２）結果
図１６に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を使用し、表１７に示した被検米試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩに用いて染色した結果を示す。図１６の左図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡ量を投入した場合、図１６の右図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に１０ｎｇのゲノムＤＮＡ量を投入した場合の結果を示す。また、図１６のレーン１からレーン１７については表１７に記載の検体番号を示す。
【０１４５】
図１７に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用し、表１７に示した被検米試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを用いて染色した結果を示す。図１７の左図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡを投入した場合、図１７の右図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に１０ｎｇのゲノムＤＮＡを投入した場合の結果を示す。図１７のレーン１からレーン１７については表１７に記載の検体番号を示す。
【０１４６】
図１６及び図１７において、ゲノムＤＮＡ量を０．５ｎｇ又は１０ｎｇとした場合の混米判定可否を表１８に示す。
【０１４７】
【表１８】
【０１４８】
図１８に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、表１７に示した被検米試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを用いて染色した結果を示す。図１８のレーン１からレーン１９については表１７に記載の検体番号を示す。なお、マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡ量を投入して行った。また、図１８のレーン１からレーン１９については表１７に記載の検体番号を示す。
【０１４９】
図１９に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用し、表１７に示した被検米試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物と捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションを行った結果を示す。なお、マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡ量を投入して行った。また、図１９の番号は表１７に記載の検体番号に対応する。
【０１５０】
図１８及び１９の結果に基づき、電気泳動による検出及びＤＮＡアレイ（による混米判定可否をまとめた結果を表１９に示す。
【０１５１】
【表１９】
【０１５２】
（３）考察
図１６及び表１８から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ ｋｉｔI」を使用した場合、ＰＣＲ反応液２０μｌ中にゲノムＤＮＡ０．５ｎｇを投入した場合、９５％以上は存在するはずのコシヒカリの検出が困難であった。ＰＣＲ反応液２０μｌ中にゲノムＤＮＡを１０ｎｇ投入した場合も同様であった。また、図１７及び表１８から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用した場合、ＰＣＲ反応液２０μｌ中にゲノムＤＮＡ０．５ｎｇを投入した場合でも１０ｎｇを投入した場合でも、混米しているにも関わらず、きらら３９７を５％混入させた場合のみ薄い識別バンドが検出できた以外に増幅産物の識別バンドは検出出来なかった。
【０１５３】
一方、図１８及び表１９から分かるように、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いた場合、ＰＣＲ反応液２０μｌ中にゲノムＤＮＡ０．５ｎｇを投入した場合、図１８のレーン１７（コシヒカリ純米）で検出される識別バンド以外の識別バンドが検出できた。この結果から、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物を電気泳動で検出することにより、１％の混米は確実に検出でき、品種によっては０．１％の混米でも検出できることが分かった。また、図１９及び表１９から分かるように、ＤＮＡアレイによる結果も良好であり、５％混米の場合混ざっている米品種まで判別でき、１％混米の場合では混ざっている米品種は不明なものの混米の有無は検出可能であった。この結果から、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによれば、少ない量のゲノムＤＮＡを鋳型として、たとえ混米率が１％であっても検出可能であることが分かった。
【０１５４】
［実施例７］
炊飯米によるゲノムを検出しうるかについて、市販のコメ判別用ＰＣＲキットである、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用した場合（比較例）と、本発明プライマーセットを用いた場合（実施例）とにおいて検討した。
【０１５５】
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
市販のあきたこまちを家庭用炊飯器（タイガー社製）で２合炊飯したもの、及び、市販の真空パック詰めコシヒカリ炊飯米、それぞれ２０粒から、Ｆａｓｔ ＩＤ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ＩＤ社製）のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１５６】
（２）マルチプレックスＰＣＲ
上記（１）で抽出した炊飯米のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を使用してマルチプレックスＰＣＲを行った。具体的なＰＣＲの反応組成及び反応条件については、説明書に示されている通りに行った。ＤＮＡ量はＵＶで測定し、０．５ｎｇ、及び、１０ｎｇをＰＣＲ反応液に用いた。
【０１５７】
プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットによるマルチプレックスＰＣＲは、実施例１と同様に行った。ただし、当該プライマーセットは、５´ビオチン化及び/又は未修飾プライマーを用いて調製したものを使用した。ＤＮＡ量はＵＶで測定し、０．５ｎｇをＰＣＲ反応液に用いた。なお、精米より抽出したゲノムＤＮＡをコントロールとして用いた。
【０１５８】
（３）電気泳動
ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用したマルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物溶液５μｌを２％アガロースゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIにて染色後、紫外線照射により識別バンドの電気泳動パターンを観察した。
【０１５９】
また、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセット使用したマルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物溶液５μｌを８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIにて染色後、紫外線照射により識別バンドの電気泳動パターンを観察した。
【０１６０】
（４）電気泳動の結果
図２０に、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を使用したマルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物における電気泳動の結果を示す。図１７の左図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に０．５ｎｇのゲノムＤＮＡを投入した場合、図１７の右図はＰＣＲ反応液２０μｌ中に１０ｎｇのゲノムＤＮＡを投入した場合の結果を示す。図２０のレーン１から１６については表２０に記載の検体番号を示す。
【０１６１】
【表２０】
【０１６２】
図２１に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを使用したマルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。図２１のレーン１から９については表２１に記載の検体番号を示す。
【０１６３】
【表２１】
【０１６４】
（４）ＤＮＡアレイ
実施例２、３に示した方法と同様に、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い得られたＰＣＲ産物を使用して、ＤＮＡアレイによりハイブリッド形成を検出した。
【０１６５】
（５）ハイブリダイゼーションの結果
被検米試料の説明において、表２１に対応する結果を図２２に示す。
【０１６６】
（６）考察
図２０及び表２０から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、炊飯米及び精米より抽出したゲノム量０．５ｎｇを投入した場合においては、１００％コシヒカリ、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米のいずれも検出出来なかった（図２０、レーン２〜７）。
【０１６７】
また、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、炊飯米より抽出したゲノム量１０ｎｇを投入した場合においては、１００％コシヒカリは検出が困難であった（図２０右、レーン２）が、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米では、コシヒカリとは異なる電気泳動パターンが検出された（図２０右レーン３及び４）ことから、コシヒカリ以外の品種である可能性が示された。なお、精米より抽出したゲノム量１０ｎｇを投入した場合は、１００％コシヒカリである電気泳動パターン、及び、それ以外の電気泳動パターンも検出された（図２０右、レーン５〜７）。
【０１６８】
図２０及び表２０から分かるように、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ ＫｉｔII（コシヒカリネガキット）」を用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、炊飯米及び精米より抽出したゲノム量０．５ｎｇ、及び、１０ｎｇを投入した場合、いずれにおいても、１００％コシヒカリは識別バンドが元々検出されないので問題なかった（図２０左及び右、レーン８）が、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米は検出されなかった（図２０左及び右、レーン９及び１０）。
【０１６９】
また、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II（コシヒカリネガキット）」を用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、精米より抽出したゲノム量０．５ｎｇを投入した場合は、１００％あきたこまちのみ検出され（図２０左、レーン１２）、ゲノム量１０ｎｇを投入した場合には、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米ともに検出された（図２０右、レーン１２及び１３）。このことより、コシヒカリ以外の品種である可能性が示された。
【０１７０】
以上の結果から、ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」においては、炊飯米による混米判定検査が適さないことが分かった。
【０１７１】
一方、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果、炊飯米、及び、精米ともに、１００％コシヒカリ、１００％あきたこまち、及び、５％あきたこまち混米であることが判定可能であることが示された。
【０１７２】
炊飯米１００％コシヒカリ（図２１、レーン２）、及び、精米１００％コシヒカリ（図２１、レーン５）を比較したところ、炊飯米１００％コシヒカリ（図２１、レーン２）において高鎖長側に見られるバンドが消失することが分かった。この高鎖長側のバンドの消失は、市販の炊飯米に含まれている酸味料などの添加物による影響や、炊飯時のゲノムが切断されることに起因していると考えられた。
【０１７３】
また、図２２から分かるように、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションにおいても、炊飯米、及び、精米ともに結果が良好であった。
【０１７４】
すなわち、プライマー対（Ａ）〜（Ｋ）を含むプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動、及び、捕獲オリゴヌクレオチド（I）〜（XIII）を用いたＤＮＡアレイによれば、被検米試料が炊飯米であっても品種を判別出来ることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】本発明のプライマーセットを使用し、単一品種の米試料２０粒より抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例１）
【図２】混米の有無判定のために、本発明のプライマーセットでマルチプレックスＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例１）
【図３】ＤＮＡアレイによる混米の検出結果の例を示した図である。（実施例２）
【図４】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図５】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図６】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図７】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図８】ＤＮＡアレイによる検出結果の例を示した図である。（実施例３）
【図９】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を使用し、単一品種の米コシヒカリより抽出したゲノムＤＮＡを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例４）
【図１０】本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例４）
【図１１】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」 を用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例４）
【図１２】本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例４）
【図１３】ＤＮＡアレイによる検出結果を示した図である。（実施例４）
【図１４】ＤＮＡアレイによる検出結果を示した図である。（実施例４）
【図１５】ＤＮＡアレイ及び電気泳動により新潟産コシヒカリ（ＢＬ）と千葉県産コシヒカリを解析した結果を示す。（実施例５）
【図１６】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」を用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例６）
【図１７】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」 を用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例６）
【図１８】本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例６）
【図１９】ＤＮＡアレイによる検出結果を示した図である。（実施例６）
【図２０】ＴａＫａＲａ社製「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ I」、及び「コメ判別用ＰＣＲ Ｋｉｔ II(コシヒカリネガキット)」を用いて、マルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例７）
【図２１】本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。（実施例７）
【図２２】ＤＮＡアレイによる検出結果を示した図である。（実施例７）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（５）から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１〜１１のいずれか１つに表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対。
（１）下記の（ａ）〜（ｋ）から選択されるいずれか１つの組み合わせを構成する２種の塩基配列
（ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３
（ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４
（ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５
（ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６
（ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７
（ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８
（ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９
（ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０
（ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１
（ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２
（ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３
（２）前記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列
（３）前記（１）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）前記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
【請求項２】
請求項１に記載のプライマー対を少なくとも２種以上含むプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうる少なくとも１１種のプライマー対を含む請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうるプライマー対が、以下の（Ａ）〜（Ｋ)のプライマー対である請求項３に記載のプライマーセット。
（Ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
【請求項５】
以下の（１）〜（５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択され、配列番号１〜１１のいずれか１つに表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（１）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列
（２）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列
（３）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
【請求項６】
請求項５に記載の捕獲オリゴヌクレオチドを少なくとも２種以上含む捕獲オリゴヌクレオチド群。
【請求項７】
配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれ検出しうる少なくとも１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む請求項６に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群。
【請求項８】
配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれ検出しうる捕獲オリゴヌクレオチドが、以下の（I）〜（XIII）の捕獲オリゴヌクレオチドである請求項７に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群
（I）配列番号３４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（II）配列番号３５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（III）配列番号３６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IV）配列番号３７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（V）配列番号３８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VI）配列番号３９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VII）配列番号４０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VIII）配列番号４１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IX）配列番号４２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（X）配列番号４３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XI）配列番号４４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XII）配列番号４５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XIII）配列番号４６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
【請求項９】
以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とする米品種の判別方法。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
【請求項１０】
更に、以下の（iii）及び/又は、（iv）の工程を行うことを特徴とする請求項９に記載の米品種の判別方法。
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と請求項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッド形成を検出する検出工程
【請求項１１】
以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とするコシヒカリへの混米の有無を判定する方法。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
【請求項１２】
更に、以下の（iii）及び/又は、（iv）の工程を行うことを特徴とする請求項１１に記載のコシヒカリへの混米の有無を判定する方法。
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と請求項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッド形成を検出する検出工程
【請求項１３】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む米品種判別キット、又はコシヒカリへの混米判定キット。
【請求項１４】
更に請求項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群を含む請求項１３に記載のキット。
【請求項１】
以下の（１）〜（５）から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１〜１１のいずれか１つに表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対。
（１）下記の（ａ）〜（ｋ）から選択されるいずれか１つの組み合わせを構成する２種の塩基配列
（ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３
（ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４
（ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５
（ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６
（ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７
（ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８
（ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９
（ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０
（ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１
（ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２
（ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３
（２）前記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列
（３）前記（１）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）前記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
【請求項２】
請求項１に記載のプライマー対を少なくとも２種以上含むプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうる少なくとも１１種のプライマー対を含む請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１〜１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸をそれぞれ増幅しうるプライマー対が、以下の（Ａ）〜（Ｋ)のプライマー対である請求項３に記載のプライマーセット。
（Ａ）配列番号１２、及び、配列番号２３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｂ）配列番号１３、及び、配列番号２４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｃ）配列番号１４、及び、配列番号２５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｄ）配列番号１５、及び、配列番号２６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｅ）配列番号１６、及び、配列番号２７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｆ）配列番号１７、及び、配列番号２８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｇ）配列番号１８、及び、配列番号２９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｈ）配列番号１９、及び、配列番号３０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｉ）配列番号２０、及び、配列番号３１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｊ）配列番号２１、及び、配列番号３２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
（Ｋ）配列番号２２、及び、配列番号３３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択される２種の塩基配列からなる２種のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる８０塩基以上の核酸を増幅しうるプライマー対
【請求項５】
以下の（１）〜（５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選択され、配列番号１〜１１のいずれか１つに表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（１）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列
（２）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列
（３）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（４）配列番号３４〜４６のいずれか１つに表される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列
（５）前記（１）〜（４）の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列
【請求項６】
請求項５に記載の捕獲オリゴヌクレオチドを少なくとも２種以上含む捕獲オリゴヌクレオチド群。
【請求項７】
配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれ検出しうる少なくとも１３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む請求項６に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群。
【請求項８】
配列番号１〜１１に記載の塩基配列からなる核酸をそれぞれ検出しうる捕獲オリゴヌクレオチドが、以下の（I）〜（XIII）の捕獲オリゴヌクレオチドである請求項７に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群
（I）配列番号３４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（II）配列番号３５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（III）配列番号３６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IV）配列番号３７に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号４に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（V）配列番号３８に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号５に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VI）配列番号３９に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号６に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VII）配列番号４０に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号７に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（VIII）配列番号４１に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号８に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（IX）配列番号４２に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（X）配列番号４３に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号９に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XI）配列番号４４に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XII）配列番号４５に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１０に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
（XIII）配列番号４６に表される塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列；該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；該塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列；これらの塩基配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１１に表される塩基配列からなる核酸を検出しうる捕獲オリゴヌクレオチド
【請求項９】
以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とする米品種の判別方法。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
【請求項１０】
更に、以下の（iii）及び/又は、（iv）の工程を行うことを特徴とする請求項９に記載の米品種の判別方法。
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と請求項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッド形成を検出する検出工程
【請求項１１】
以下の（i）、及び、（ii）の工程を行うことを特徴とするコシヒカリへの混米の有無を判定する方法。
（i）被検米試料中の米の核酸を調製する核酸調製工程
（ii）工程（i）で調製した核酸を鋳型として、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅処理することにより核酸増幅産物を得る核酸増幅工程
【請求項１２】
更に、以下の（iii）及び/又は、（iv）の工程を行うことを特徴とする請求項１１に記載のコシヒカリへの混米の有無を判定する方法。
（iii）工程（ii）で得られた核酸増幅産物を電気泳動により検出する検出工程
（iv）工程（ii）で得られた核酸増幅産物と請求項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群とのハイブリッド形成を検出する検出工程
【請求項１３】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む米品種判別キット、又はコシヒカリへの混米判定キット。
【請求項１４】
更に請求項６〜８のいずれか１項に記載の捕獲オリゴヌクレオチド群を含む請求項１３に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
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【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２００８−２５９４６９（Ｐ２００８−２５９４６９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０６００１（Ｐ２００７−１０６００１）
【出願日】平成１９年４月１３日（２００７．４．１３）
【出願人】（０００００４５６９）日本たばこ産業株式会社 (406)
【出願人】（５０２４４４８２５）ジェネティックアイディー株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１３日（２００７．４．１３）
【出願人】（０００００４５６９）日本たばこ産業株式会社 (406)
【出願人】（５０２４４４８２５）ジェネティックアイディー株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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