粒子含有試料の固有特性決定方法
【課題】
観測体積内で光子を放出、散乱、及び／又は反射する少なくとも１つの化学種の粒子を含む試料の固有特性を決定する。
【解決手段】
１）式（４）で表される観測時間Ｔ内の各時間間隔Δｔｉにおいて記録される光子イベント（photon event）の数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）分布関数ｐ（ｎ）と、濃度ｃと、予め設定された時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎについての単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）と、有効体積Ｖｅｆｆとの間の理論的関係を使用して、Ｐ１（ｎ）、Ｖｅｆｆ、濃度ｃ、及び／又は、これらの特性値を測定されたｐ（ｎ）にフィッティングすることによりＶｅｆｆ及び／又はＰ１（ｎ）から決定される他の固有特性値を決定する。
観測体積内で光子を放出、散乱、及び／又は反射する少なくとも１つの化学種の粒子を含む試料の固有特性を決定する。
【解決手段】
１）式（４）で表される観測時間Ｔ内の各時間間隔Δｔｉにおいて記録される光子イベント（photon event）の数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）分布関数ｐ（ｎ）と、濃度ｃと、予め設定された時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎについての単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）と、有効体積Ｖｅｆｆとの間の理論的関係を使用して、Ｐ１（ｎ）、Ｖｅｆｆ、濃度ｃ、及び／又は、これらの特性値を測定されたｐ（ｎ）にフィッティングすることによりＶｅｆｆ及び／又はＰ１（ｎ）から決定される他の固有特性値を決定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一定の連続時間内において、観測体積（observation volume）内で光子を放出、散乱、及び／又は反射する少なくとも１つの化学種の粒子を含む試料についてその固有の特性（characteristic property）を決定する方法に関する。さらに、本発明は、異なる連続時間内において同様の粒子を含む試料についてその固有の特性を決定するように拡張し得る。
【背景技術】
【０００２】
上記の方法は、広範な適用分野、特に生物物理学及び生化学における標準的な方法として確立されている蛍光揺らぎ分光法（FFS：fluorescence fluctuation spectroscopy）［非特許文献１参照］に基づいている。
高スループットのふるい分け及びオンライン解析で利用するために開発された理論及び具体的手法が蛍光強度分布解析法（FIDA：fluorescence−intensity distribution analysis）として知られている（特許文献１、非特許文献２参照）。
【０００３】
単一分子実験においては、状況は以下の通りである。
小さな観測体積Ｖ内の分子から放出された光子は、光子用の検出器に衝突する。離散時間点ｔｉ，ｉ＝０，１，２…は、観測時間を一定の時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ］（ｉ＝１，２，３…Ｎ）に分割する。
時間間隔Δｔｉ内でカウントされた光子の数は、数列｛ｎ１，ｎ２，ｎ３，…｝を提示する。完全な測定は、有限の数の計数率（counting rate）ｎ１，ｎ２，…ｎＮを与える。ｎ個の光子がカウントされる時間間隔の数（＃ｋ）は、光子計数分布（photon counting distribution）（＃ｋ（ｎ））を与える。
【０００４】
列＃ｋ（ｎ）の各要素を、式（１）で定義される間隔の総数Ｎで除算することで、式（２）のように実数ｐＮ（ｎ）が得られ、この実数は、少なくとも測定された「非常に多い」時間間隔の極限では、時間間隔Δｔにおいてｎ個の光子を測定する確率として解釈することができる。
また、対応する物理的確率分布ｐ（ｎ）は式（３）のように表される。
【０００５】
【数１】
【０００６】
簡単化のため、すべての光子は、対象分子によって生成されると仮定し、例えば検出器ハードウェア又は散乱光によって生成される背景雑音は、すべて無視する。背景雑音を組み込むことは容易であり、ｐ（ｎ）に対するその影響が後で説明される。
【０００７】
ＦＦＳにおいて試料の固有特性を決定する方法は、２つの基本ステップを含んで、
１）式（４）で表される観測時間Ｔ内の各時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ］（ｉ＝１，２，３…Ｎ）において記録される光子イベント（photon event）の数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）所与の理論モデルが測定されたｐ（ｎ）の結果を最適な一致（optimal agreement）（以下「フィッティング（fitting）」と呼ばれる）で説明するように、１つ又は複数の対象の特性を決定する。
なお、観測時間は式（４）で表される。
【０００８】
【数２】
【０００９】
ｐ（ｎ）から取り出すことができる典型的な特性は、
１．純粋溶液における分子の濃度
２．混合物における分子の濃度
３．分子間結合過程（intermolecular binding process）の動力学
４．分子間解離過程（intermolecular dissociation process）の運動速度
５．分子内共形変化（intramolecular conformal change）の運動速度
６．分子の拡散速度
７．分子輝度（molecular brightness）
８．光学セットアップの空間輝度関数（spatial brightness function）
９．分子に特有な一重項状態（singlet state）の存続時間
１０．検出器のアフターパルス・レート（after−pulse rate）を含む。
【００１０】
ＦＩＤＡにおいては、理論的な光子カウント分布ｐ（ｎ）は、式（５）に示す母関数（generating function）Ｇ（ξ）により計算される。
Ｇ（ξ）は、いわゆる空間輝度関数Ｂに依存する関数上での空間積分の指数関数として表現される。空間輝度関数は、試料内の粒子の座標の正規化関数としての、励起光強度と光学機器による蛍光光の透過係数（transmission coefficient）との積である。
【００１１】
【数３】
【００１２】
光学機器を特徴付けるために、空間輝度関数Ｂの単純なモデルが適用され、その調整パラメータは、単一の化学種での実験によって決定される。未知のモデル・パラメータ、濃度ｃ及び特定の輝度値ｑは、非線形フィッティング手順によって、又は正則化法を用いる逆変換によって決定される。ただし、ＦＩＤＡの難点は、以下の点にある。
１．母関数手法は、理論モデルをあまり直観的なものにせず、より複雑な応用のために方法を拡張することが難しい。
２．モデルは、未知パラメータｃ及びｑについて非線形の度合いが高く、これらのパラメータの決定は複雑である。
３．各分子の輝度は、すべての化学種に共通な空間輝度関数と、化学種ごとに特徴的な値を有する特定の輝度との積として表現される。化学種が異なれば三重項状態ポピュレーション（triplet state population）は著しく異なるので、すべての測定において、この仮定はある程度は違反される。
４．分子の座標は、計数時間間隔（ビン幅（bin width））の間は変化しないと仮定される。数μｓの範囲の非常に短い時間間隔であっても、これは粗雑な近似でしかない。さらに、分子の拡散運動に対するｐ（ｎ）の依存性は、モデルからは取り出すことができない有用な情報を有している。
【００１３】
ＦＩＤＡへの半経験的な補正係数の導入によって、いわゆる多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA：fluorescence intensity multiple distribution analysis）が、拡散時間及び分子輝度の同時決定のために開発された［非特許文献３参照］。ＦＩＤＡと比較すると、マスタ方程式（Master equation）を介した光子カウント分布の直接計算は、著しく改善されたフィット品質を示す。しかし、そのような数値シミュレーションは非常に遅く、高スループットの応用例には適していない［非特許文献３参照］。
【００１４】
ＦＩＤＡ及びその後継の代替方法は、光子カウント・ヒストグラム（photon count histogram）ＰＣＨアルゴリズムに基づいている［非特許文献５、非特許文献６、http：//www.lfd.uiuc.edu/staff/grattonにおいて入手可能な非特許文献７、及び非特許文献８参照］。
これらの方法は、技術的詳細がＦＩＤＡと異なるだけであり、空間レーザ輝度分布の異なる形状を仮定している。ＰＣＨ法は、商業的用途では僅かな役割しか演じていない。ＰＣＨ手法では、検出体積をかなり恣意的に選択しなければならない。寄与分子の平均数及び単一分子の光子確率分布などの特性は、どのような物理的意味ももたない抽象的な特性となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ98／16814
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】L.Mandel：Fluctuations of photon beams and their correlations、Proc. Phys. Soc. 72、1037〜1048頁、（1958）
【非特許文献２】Peet Kask、Kaupo Palo、Dirk Ullmann、Karsten Gall：Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96、13765〜13761頁、（1999）
【非特許文献３】Kaopo Palo、Ulo Mets、Stefan Jager、Peet Kask、Karsten Gall：Fluorescence intensity multiple distribution analysis：Concurrent determination of diffusion times and molecular brightness、Biophysical J.79、2858〜2866頁、（2000）
【非特許文献４】Kaopo Palo、Ulo Mets、Vello Loorits、Peet Kask：Calculation of photon count number distributions via master equatons、Biophysical J.90、2179〜2191頁、（2006）
【非特許文献５】Yan Cheng、D.Muller Joachi、Peter T．C．So、Enrico Gratton：The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopie、Biophysical J.77、553〜557頁、（1999）
【非特許文献６】Yan Cheng：Analysis and applications of fluorescence fluctuation spectroscopy．PhD thesis、University of Illinois at Urbana-Champain、Urbana、Illinois、（1999）
【非特許文献７】Thomas D.Perroud、Bo Huang、Richard N.Zare：Effect on bin time on the photon counting histogram for one-photon excitation、ChemPhysChem 6、905-912頁、（2005）
【非特許文献８】Y．Cheng、M．Tekmen、L．Hillesheim、J．Skinner、B．Wu、J．Muller：Dual-color photon counting histogram、Biophysical J．88、2177〜2192頁、（2005）
【非特許文献９】Lars Kastrup、Hans Blom、Christian Eggeling、Stefan W．Hell：Fluorescence fluctuation spectroscopy in subdiffraction focal volume、Phys．Rev．Lett．94、（2005）
【非特許文献１０】Yan Cheng、Joachim D．Muller、Peter T．C．So、Enrico Gratton：The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopie、Biophysical J．77、553〜557頁、（1999）
【非特許文献１１】Bo Huang、Zhomas D．Perroud、Richard N．Zare、Photon counting histogram：One-photon excitation、ChemPhysChem 5、1323〜1331頁、（2004）
【非特許文献１２】Bruno Klahn、Werner A．Bingel：The convergence of the Raleigh-Ritｚ Method in Quantum Chemistry、Theoret．Chim．Acta 44、9〜43頁、（1977）
【非特許文献１３】H．P．Dikshit、Charles A．Michelli編：Advances in Computational Mathematics、World Scientific Publishing Co., Inc．（1993）に所収のP.Deuflhard、J.Ackermann：Adaptive Discrete Galerkin Methods FOR Macromolecular Processes
【非特許文献１４】J.Ackermann、M.Wulkow：MACRON-A Program Package FOR Macromolecular Reaction Kinectics、Konrad-Zuse-Zentrum、Preprint SC-90-14、（1990）
【非特許文献１５】M.Wulkow、J.Ackermann：Numerical Simulation of Macromolecular Kinetics − Recent Developments、IU-PAC Working Party、Macro group、（1990）
【非特許文献１６】M.Wulkow、J.Ackermann：The Treatmeant of Macromolecular Processes with Chain-Length-Dependent Reaction Coefficients − An Example from Soot Formation、Konrad-Zuse-Zentrum Berlin、Preprint-91−18、（1991）
【非特許文献１７】U.Budde、M.Wulkow：Computation of molecular weight distributions FOR free radical polymerization systems、Chem．Ing．Sci．46、497〜508頁、（1991）
【非特許文献１８】M.Wulkow：Numerical Treatment of Countable Systems of Ordinary Differential Equations、Thesis and Technical Report-90-8、Konrad-Zuse-Zentrum Berlin、（1990）
【非特許文献１９】M.Wulkow：Adaptive Treatment of Polyreactions in Weighted Sequence Spaces、IMPACT Comput. Sci. Engrg. 4、152〜193頁、（1992）
【非特許文献２０】E.Van Craenenbroeck、G.Matthys、J.Beirlant、Y.Engelborghs：“A statistical analysis of fluorescence correlation data”：Journal of Fluorescence、9、325〜331頁、1999
【非特許文献２１】Jerker Widengren、Ulo Mets、Rudolf Rigler：Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet States in Solution：A Theoretical and Experimental Study、Journal of Physical Chemistry、99、13368〜13379頁、（1995）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、光子計数ヒストグラムの事前予測のための改良された理論的プラットフォームを提供することである。本発明のさらなる目的は、ＦＦＳに対するより深遠な物理的洞察を提供し、ＰＣＨ手法を複雑な実験課題に対して直観的に拡張できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の上記の目的は、請求項１に記載の特徴を有する方法によって解決される。
【００１９】
有効体積Ｖｅｆｆは、光学セットアップによって容易に記述されず、考察される粒子化学種の特性にも依存する。粒子は、それが計数率に寄与する場合に限って、特定の時間間隔の間、この体積の「内部に」存在すると定義される。計数率に寄与する確率は、どの空間位置に見出される粒子についても非ゼロである。したがって、有効体積Ｖｅｆｆは、物理的な空間境界によって決定することはできない。それにも関わらず、この体積「に入る」／「から出る」過程は、小さな物理的体積への／からの拡散過程と同様に、確率過程である。誘導放出抑制（ＳＴＥＤ：stimulated emission depletion）などの技法［非特許文献９参照］は、有効体積を著しく減少させることが可能であることに留意されたい。
【００２０】
定義によって、有効体積内部の「単一粒子」は、ゼロの計数率を生じさせることができない。その結果、有効体積内部に「単一粒子」を有するという言葉は、任意の空間体積内に「単一粒子」を有するのとは概念的に非常に異なる。物理的に、確率分布Ｐ１（ｎ）は、時間間隔Δｔｉの間のすべての光子イベントがもっぱら単一粒子から生じる、非ゼロ計数率だけを考察することによる思考実験において測定することができる。いくつかの粒子から生じる信号の重ね合わせは、無視されなければならない。
【００２１】
本発明によれば、粒子化学種、例えば分子化学種は、所与の実験セットアップについて、２つの量、すなわち、有効体積Ｖｅｆｆ及び単一粒子分布Ｐ１（ｎ）によって特徴付けられる。２つの量はともに、上述されたような、定義された物理的意味を有する。単一粒子分布Ｐ１（ｎ）は、その特有の特性Ｐ１（ｎ＝０）＝０によって、ＦＩＤＡ及びＰＣＨ手法における同じ名前を付された単一粒子分布と区別することができる。
【００２２】
Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）の知識は、１つ又は複数の化学種（混合物）の分子を含む試料における分子濃度の迅速かつ頑健な決定のために利用することができる。方法は、例えば、アフター・パルシング、分子拡散、又はこれまでのすべての方法、例えば、ＦＩＤＡ、ＦＩＭＤＡ、もしくはＰＣＨアルゴリズムなどの適用性を制限する一重項状態励起のような、妨害の影響に対して頑健である。本発明による方法は、ＦＩＤＡ又はＰＣＨアルゴリズムのように、ビン幅を短くすることに限定されない。本発明による方法は、例えば、流動、微細構造、細胞、小胞、エマルジョン、又はゲルのような任意の分子環境に適用可能である（これまでのところ実験的に検証されていない）。
【００２３】
本発明による方法は、これまでのすべての方法よりも単純である。技法的に、本発明による方法は、例えば、非線形フィット、母関数、又はモーメント法（method of moments）のような、標準的なフィッティング法と組み合わせることができる。技法的具現化に応じて、本発明による方法は、オンライン診断に適した非常に迅速な方法となる。
【００２４】
ＦＩＤＡにおいては、ある種の分子は、実数値によって与えられる特定の分子輝度によって特徴付けられる。本発明によれば、ある種の分子は、Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）によって完全に特徴付けられる。
【００２５】
特性Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）は、例えば、実験セットアップに関係する拡散率又は一重項状態励起確率のような、すべての情報をそれらが含むという意味で豊富である。原理上は、例えば分子などの粒子を特徴付けるすべての情報は、Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）から取り出すことができる。しかし、この情報を取得するには、特定の理論モデルが適用されなければならない。
特性Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）は、いくつかの粒子の同時寄与のためにどのような実験にも存在する平均化プロセスを伴わずに、それらが単一粒子の特性を特徴付けるという意味で純粋である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ポリスチレン微小球含有試料の光強度トレースを示すグラフ。
【図２】図１の100トレースにわたって平均された自己相関カーブを示すグラフ。
【図３】ビン幅Δｔ＝0.1msecについて光子カウント分布ｐ（ｎ，ｃ）を示すグラフ。
【図４】本発明方法によって取得された分子数を示すグラフ。
【図５】輝度値μｍａｘ−ビン時間Δｔの関係を示すグラフ。
【図６】直径100μｍ及び75μｍのピンホールを用いた場合の輝度関数を示すグラフ。
【図７】ビン時間ΔＴ１に対する各成分の輝度値を示すグラフ。
【図８】フェード・アウト時間τμと輝度値の関係を示す表。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態では、マルコフ過程の理論に基づいて、単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）は、式（６）で与えられる。
【００２８】
【数４】
【００２９】
所与のビン幅Δｔｉについての光子計数率ｎｉは、空間的に変化するレーザ強度及び光学セットアップの光子収集特性（photon collection property）のために、レーザ焦点に対するすべての分子の位置に強く依存する。レーザ焦点に近い分子は、光子計数率に大きく寄与する一方で、レーザ焦点から遠く離れた分子は、僅かな寄与しかせず、又はまったく寄与しない。
単一分子の寄与は、表面（例えばガラス表面）上又はマトリックス（例えばゲル）内の所与の位置ｒ’においてそれを固定化することによって、測定することができる。このセットアップについて記録される光子カウントｎｉの列は、確率分布ｐ（ｎ）を与える。そのようにして測定された光子カウントの平均値〈ｎ〉は位置（ｒ’）における分子輝度μと呼ばれ、式（７）で表される。
【００３０】
【数５】
【００３１】
分子輝度μ（ｒ’）の測定は、任意の位置ｒ’について可能であり、μ（ｒ’）の関数形式は、分子の様々な位置についてこの手順を繰り返すことによって、例えば、等距離空間メッシュ上のすべての位置ｒ’についてμを測定し、メッシュ点の間ではμ（ｒ’）を補間することによって、測定することができる。
分子輝度関数μ（ｒ’）の測定は時間を消費し、高価であるので、それは通常、分子蛍光分光法（molecular fluorescence spectroscopy）の理論に基づいたモデルと、空間レーザ光強度の所与のモデルによって近似される。
これに関連して、分子輝度μ（ｒ’）は、例えば、ビン幅Δｔ、励起波長（λ）における光の空間的分布及び強度、光学セットアップの収集効率関数、検出器の量子効率（ｑ）、横断面（σ）、ならびに所与のタイプの分子の蛍光量子収量（fluorescence quantum yield）（φｆ）のような、パラメータに依存する。三重項状態励起及び検出器のアフター・パルシングのような効果も同様に、重要な役割を演じることが示された。
【００３２】
分子輝度μ（ｒ’）の知識は、実験的光子カウント分布のどのようなアブ・イニシオ予測（ab initio prediction）のためにも必須である。ＦＩＤＡ及びＰＣＨにおいては、μ（ｒ’）についての理論モデルが適用される。これらのモデルにおける自由パラメータは、単一化学種における実験によって決定される。
【００３３】
分子輝度関数μ（ｒ’）が、直接測定又は理論モデルによる近似によって分かると仮定した場合、個別分子からｎ個の光子を測定する確率Ｐ１（ｎ）は、マンデルの古典公式（Mandel’s classical formula）［非特許文献１参照］により式（８）のように記述される。
【００３４】
【数６】
【００３５】
残念なことに、確率Ｐ１（ｎ）についての式（８）は、無限に大きな積分体積Ｖの極限で、単純解Ｐ１（ｎ）＝δ０ｎをもたらす。これは、有限体積内の個別分子は、ゼロ濃度に対応し、光子カウント・イベントを生じさせることができないという物理的事実を反映している。一般的な実践は、大きいが有限の体積Ｖを導入することによって、この難点を回避することであり、例えば、非特許文献１０の説明を参照されたい。
【００３６】
本発明によれば、ＰＣＨアルゴリズムについての上述の問題は、有効体積Ｖｅｆｆ内での「単一分子」の定義をマンデルの公式に適用することによって回避され、その場合、マンデルの公式は、式（９）で表される。
【００３７】
【数７】
【００３８】
この式は、Ｐ１（ｎ）、Ｖｅｆｆ及びμ（ｒ’）の間の関係を確立し、これらの固有特性のどれか１つを決定するために使用することができる。
【００３９】
さらに、マルコフ過程の理論に基づいたポアソン近似は、〈ｍ〉及びＶｅｆｆについての以下の公式をもたらす。
【００４０】
現実の物理状況における非ゼロ濃度ｃを考慮する場合、各計数率に寄与する分子の平均数〈ｍ〉は、式（１０）によって与えられる。
【００４１】
【数８】
【００４２】
Ｖｅｆｆ：＝〈ｍ〉／ｃの関係より、式（１１）が得られる。
【００４３】
【数９】
【００４４】
上記の式は、〈ｍ〉、μ（ｒ’）及びｃの間の理論的関係、ならびにＶｅｆｆ及びμ（ｒ’）の間の理論的関係をそれぞれ確立し、これらの固有特性のどれか１つを決定するために使用することができる。
【００４５】
ＦＦＳのほとんどの応用例では、同じ化学種の粒子（分子）は、蛍光性であるか、又は蛍光標識を付され、粒子を励起するために、レーザ・ビームが使用される。
輝度関数μ（ｒ’）の最大値は、式（１２）で表される分布関数の１次モーメントによって定義される。
【００４６】
【数１０】
【００４７】
非線形フィット手順の代替手順としてのモーメント法の意義が、以下でさらに考察される。
雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅが考慮される場合、輝度関数μ（ｒ’）の最大値は、異なる輝度関数の重ね合わせとして式（１３）でモデル化される。
【００４８】
【数１１】
【００４９】
代替として、輝度関数μ（ｒ’）は異なる輝度関数の重ね合わせとして式（１４）でモデル化される。
【００５０】
【数１２】
ａｊ：パラメータ
異なる輝度関数μｊ（ｒ’）（ｊ＝１，２，…,Ｋ）
【００５１】
各輝度関数μｊ（ｒ’）（ｊ＝１，２，…,Ｋ）は、Ｍ個の特性パラメータμｊｋ（ｋ＝１，２，…，Ｍ）によって決定される。
【００５２】
輝度関数のポピュラなモデルは、式（１５）に表される空間ガウス分布（spatial Gaussian profile）である。
【００５３】
【数１３】
【００５４】
かなり複雑な３次元空間輝度関数を考慮したそのような大胆な近似の限界が、いくつかのグループによって示されており、非特許文献１１及び同文献中に記載の文献を参照されたい。
この選択が説明例として正当なものであることを簡単に述べておくのが適当である。
第１に、本発明の我々の手法は、任意の空間輝度関数に適用することができる。
第２に、ガウス関数による近似は、通常は扱いが容易であり、ガウス関数の収縮（contraction）は、積分可能空間関数に収束することが証明されている［非特許文献１２参照］。これが、数十年間、それらが現代量子化学において広く利用されてきた１つの理由である。
【００５５】
ガウス分布を有効体積及び単一分子関数の定義にそれぞれ挿入すると、座標変換ｒ→μ、及び回転対称上での積分は、式（１６）〜（１９）で表される。
【００５６】
【数１４】
【００５７】
関数Ｆ及びＱを計算するために、数値ロンバーグ積分（Numerical Romberg integration）が利用できる。Ｑは、ｎ≧１の場合に限って有限であり、ｎ＝０の場合は発散することに留意されたい。
ガウス形状のμ（ｒ’）に関し、有効体積Ｖｅｆｆは、Ｆ（μｍａｘ）＝√（２π）におけるＦＣＳの対応検出体積Ｖｆｃｓ＝π３／２ａ３と一致する。
すなわち、μｍａｘのある値について、Ｐ１（ｎ）は、μｍａｘについて数値的に安定かつ高速な方法で計算することができ、定義された物理的意味を有する。
【００５８】
輝度関数μ（ｒ’）のより正確なモデル化は、式（２０）によるガウス分布の重ね合わせにより実行される。
【００５９】
【数１５】
【００６０】
特性パラメータμｊｋ（ｊ＝１，２，…，Ｋ；ｋ＝１，２，…，Ｍ）は、標準的なデコンボリューション法（deconvolution method）によって決定される。
特性パラメータμｊｋ（ｊ＝１，２，…，Ｋ；ｋ＝１，２，…，Ｍ）は、反復リチャードソン−ルーシ・デコンボリューション・アルゴリズム（interative Richardson-Lucy deconvolution algorithm）によっても決定することができる。
【００６１】
上述されたような単一分子関数Ｐ１（ｎ）及びＶｅｆｆの理論的計算は、古典マンデル公式に基づいている。しかし、この公式は、ある限界を有する。光子計数率の分布は、光子生成率が時間間隔Δｔの間に変化し得るので、ポアソン分布Ｐｏｉ（ｎ，μ（ｒ’））から逸脱することがある。
いくつかの影響が、光子生成率のそのような変化を引き起こし得る。単一分子は、時点ｔに位置ｒ’から動き始め、時間間隔Δｔの間に他の位置まで行くことがある。
空間レーザ強度は変化するので、この拡散過程は、例えば、著しく非一定の光子生成率と、マンデル公式の適用不能（break down）をもたらし得る。そのような場合、マンデルの公式の中のポアソン分布は、より一般的な分布ｐ（ｎ、r’）によって式（２１）のように置き換えられなければならない。
【００６２】
【数１６】
【００６３】
分布ｐ（ｎ、r’）の計算は一般に、理論的課題である。分子の拡散運動を考慮するため、分布ｐ（ｎ、r’）は、形式的に式（２２）のように書くことができる。
【００６４】
【数１７】
【００６５】
遅い拡散の極限Ｄ→０においては、従来のマンデル公式は、式（１８）により得られる。この例は、上で導入された単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）の概念を、どのようにしたら複雑な測定条件に容易に拡張できるかを示している。しかし、Ｐ１（ｎ）及びＶｅｆｆは、理論的考察によって獲得可能でない場合、実験的に決定できることに留意されたい。
【００６６】
【数１８】
【００６７】
単一粒子確率分布Ｐ１（ｎ）から開始して、Ｐ１（ｎ）と、測定された分布関数ｐ（ｎ）の間の関係は、以下のようにして得られる。
【００６８】
現実の物理的状況では、平均数の〈ｍ〉＝ｃＶｅｆｆ個の粒子が、同時に信号に寄与する。マルコフ過程の理論を使用して、所与の濃度ｃについての確率分布ｐ（ｎ，ｃ）は、ｍ個の粒子すべての寄与を合計することによって、式（２４）によって決定される。
【００６９】
【数１９】
【００７０】
一方、ｐ（ｎ，ｃ）は、次の漸化式（２５）により計算することができる。
【００７１】
【数２０】
【００７２】
背景雑音を無視すると、粒子の濃度は、計数率をゼロにする確率によって、式（２６）で完全に決定される。
【００７３】
【数２１】
【００７４】
背景雑音を考慮する場合、粒子の濃度ｃは、計数率をゼロにする確率と、雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅによって、式（２７）のように決定される。
【００７５】
【数２２】
【００７６】
粒子の平均数〈ｍ〉は、計数率をゼロにする確率によって、式（２８）のように決定される。
【００７７】
【数２３】
【００７８】
雑音寄与を考慮する場合、粒子の平均数〈ｍ〉は、式（２９）のように決定される。
【００７９】
【数２４】
【００８０】
単一粒子確率分布関数Ｐ１（ｎ）は、次の漸化式（３０）で計算することができる。
【００８１】
【数２５】
【００８２】
分布ｐ（ｎ，ｃ）は、付加的な背景信号（例えばハードウェアのランダム雑音）を考慮するために、式（３１）のように、ポアソン分布Ｐｏｉ（ｎ，〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ）とのコンボリューションを行わなければならないことがある。
【００８３】
【数２６】
【００８４】
上記の理論的考察によれば、蛍光粒子（例えば分子）を含む試料は、所与の実験セットアップについて、濃度ｃ、輝度関数μ（ｒ’）、有効体積Ｖｅｆｆ、及び単一粒子分布Ｐ１（ｎ）によって特徴付けられる。ほとんどの実験セットアップにおいて、雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅは無視することができないので、それも同様に考察しなければならない。ＦＩＤＡ及びＰＣＨアルゴリズムにおいて説明される規約に従って、これらのパラメータは、例えばマルカード−レーベンバーグ・アルゴリズム（Marquard−Levenberg algorithm）などの非線形マルチパラメータ・フィット手順、又はこの作業に適した他の標準的な数値フィット法によって決定することができる。したがって、輝度関数μ（ｒ’）は、多くの調整可能パラメータを有する解析関数によって近似されなければならない。
μ（ｒ’）の解析形式は、上記の例のようなガウス関数、いくつかのガウス関数の収縮、又は他の任意の適切な形状関数として選択することができる。
【００８５】
濃度ｃ及び雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅばかりでなく、μ（ｒ’）のすべての調整可能パラメータも、測定された分布ｐ（ｎ）に対する理論的モデルの非線形フィットによって決定されなければならない。有効体積Ｖｅｆｆ及び単一粒子分布Ｐ１（ｎ）は、上述されたようにμ（ｒ’）を積分することによって直接導かれる。
【００８６】
非線形フィット手順の代替手順は、の調整可能パラメータ、濃度ｃ、及び雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅの値の任意の組について予想されるモーメントの事前計算リストを利用するモーメント法である。そのようなリストは、パラメータの適切な範囲について事前に計算して保存しておくことができるので、これは、オンライン・アプリケーションのための最高速の可能な手順である。分布ｐ（ｎ）のモーメントは、式（３２）で定義される。
【００８７】
【数２７】
【００８８】
ａｉ、ｉ＝１，２，…，ｋが、決定されるｋ個のパラメータを表すとする。パラメータａｉの値の適切な範囲内で、予想モーメントνｉ、ｉ＝１，２，…，ｌが計算できる。パラメータ値ａｉ、ｉ＝１，２，…，ｋのすべての可能な組についてのｌ個の１次モーメントνの事前計算は、写像
（ａ１，ａ２，…，ａｋ）→（ν１，ν２，…，νｌ）
をもたらす。
【００８９】
離散パラメータ値のグリッドは、計算労力を低減するが、このグリッド上にないパラメータ値の予想モーメントは、例えばスプライン外挿によって外挿されなければならない。モーメントの数ｌは、可能な限り小さいが、上記の写像が全単射関数（bijective function）となることを保証するように十分大きく選択される。その場合、写像は、
（ν１，ν２，…，νｌ）→（ａ１，ａ２，…，ａｋ）
に逆転することができ、これは、測定されたモーメントμｉ, ｉ＝１，２，…，lの任意の組に対する要求パラメータを与える。
【００９０】
単一粒子確率分布関数のモーメントは、次の漸化式（３３）により計算される。
【００９１】
【数２８】
【００９２】
雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅは、蛍光粒子を含まない試料の媒液を使用することによって、実験セットアップについて、直接計算することができる。試料の媒液は、同一又は類似の（光学）特性を有する液によって置き換えることもできる。事前に〈ｎ〉ｎｏｉｓｅを決定することで、このパラメータは、非線形フィット手順及びモーメント法において一定に維持することができる。このようにして、これらの手順において要求されるパラメータの数は、１だけ減らされる。
【００９３】
上記の考察は、単一化学種の粒子の試料に関係する。
【００９４】
本発明は、Ｎ個の異なる化学種の粒子（粒子化学種の混合物）を含む試料にも容易に適用される。
【００９５】
粒子化学種の混合物の場合、各化学種の濃度の決定は、多段階手順で行われる。最初に、有効体積Ｖｅｆｆ（ｓ）及び単一粒子分布Ｐ１（ｓ）（ｎ）が、混合物及び所与の実験セットアップ内に存在する各化学種ｓについて測定されなければならない。これは、上述の手順の１つによって行われる。
【００９６】
決定された特性Ｖｅｆｆ（ｓ）、Ｐ１（ｓ）（ｎ）に基づいて、予想される全分布ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）は、単一化学種寄与ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）、ｓ＝１，２，…，Ｎのコンボリューションによって、式（３４）のように表される。
【００９７】
【数２９】
【００９８】
決定されるパラメータは、濃度ｃｓ、ｓ＝１，２，…，Ｎと、雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅである。
【００９９】
要求されるパラメータは、理論的モデルに対する測定データの非線形フィットを使用することによって決定することができる。上述された非線形フィット手順と同様に、標準的な数値技法が適用できる。場合によっては、母関数手順は、ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）の計算を高速化することができる。
【０１００】
非線形フィッティングの代替として、パラメータは、上述されたモーメント法によって決定することができる。この手順は、ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）のモーメントが、ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）、ｓ＝１，２，…，Ｎのモーメントの積として表現できるという事実によって技法的に簡単化される。
【０１０１】
Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）の測定は、分子の輝度関数についてのモデル又は知識がなくても可能である。これらの特性は、測定された分布ｐ（ｎ，ｃ）の解析によって直接決定することができる。測定された分布は雑音のあるデータであるので、誤差伝播の影響が、Ｐ１（ｎ）を取り出すための数値的な方法を不安定化することがあり得る。
【０１０２】
この理由で、Ｐ１（ｎ）のグローバル表現が有利である。強力な方法は、式（３５）の形式のいわゆる離散ガレルキン近似（discrete Galerkin approximation）である。
【０１０３】
【数３０】
【０１０４】
パラメータｐ及びλは、Ｐ１（ｎ）の１次モーメントによって決定される。そのような誤差制御ガレルキン射影（error controlled Galerkin projection）は、数値数学においてよく研究されている方法であり、通常は高分子化学に適用される［非特許文献１３〜１９参照］。
この近似のパラメータは、フィッティング手順（上述の非線形マルチパラメータ・フィット手順を参照）又は上述のモーメント法に類似したモーメント法によって、ｐ（ｎ，ｃ）から取得することができる。
【０１０５】
これに関連した有用な特性は、式（３６）により定義されるｎ個の光子を生成する平均分子輝度である。
【０１０６】
【数３１】
【０１０７】
〈μ〉ｎは、有効光子生成率の観点から空間輝度μ（ｒ’）を特徴付け、式（３７）のように確率分布Ｐ１（ｎ）に結び付けられる。
【０１０８】
【数３２】
【０１０９】
一般に、分子輝度は、計数率ｎが低い場合は、〈μ〉ｎ≒ｎのように線形に増大し、励起光焦点の中心において、１つの分子の最大分子輝度にある定数になる。この特性は、〈μ〉ｎ＝定数という一定の分布を与えるランダム雑音信号から単一分子信号をよく区別できるようにする。
【０１１０】
本発明の上記及び他の目的、態様、及び利点は、ポリスチレン微小球懸濁液系列（polystyrene micro spheres suspension series）、色素ローダミン６Ｇ希釈系列（dye Rhodamine 6G dilution series）、ならびにポリスチレン微小球及びローダミン６Ｇ色素の混合物が解析される以下の３つの実施例に基づいて、より良く理解されよう。５０μＷの強度で５３２ｎｍ励起光を放出する光源、組み込み高感度光電子増倍管、ならびにデジタル相関器を備える従来技術の蛍光分光法ユニットが、実験データを収集するために利用された。使用された蛍光分光法ユニットは、３０ｎｓｅｃの反応時間を有する。データ収集は、２つの連続する光子記録の間のクロック・パルスをカウントすることによって達成された。そのような収集データに基づいて、いくつかの光強度トレースが、異なるビン幅Δｔについて計算できる。
【実施例１】
【０１１１】
＜微小球懸濁液系列＞
第１の実施例として、蛍光ポリスチレン微小球懸濁液系列の解析が実行された。
図１は、モル濃度がｃＭ≒1.9Ｅ−10Mol/Lのポリスチレン微小球（小球）を含む試料について3.2secにわたって記録された、典型的な光強度トレースを示している。
図２は、（図１に示される3.2secあたり100トレースにわたって平均された）自己相関カーブを示している。
図３は、ビン幅Δｔ＝0.1msecについて、対応する光子カウント分布ｐ（ｎ，ｃ）を示している。
図４は、様々な試料について、本発明による方法によって取得された分子の数（実線）、及び蛍光相関分光法（ＦＣＳ：fluorescence correlation spectroscopy）によって取得された分子の数（破線）を示している。参考として、理論的な下降勾配（線で結ばれていない四角）も示されている。
【０１１２】
図１は、モル濃度がｃＭ≒1.9Ｅ−10Mol/Lであることが知られている0.014μｍの小球を含む試料について記録された、典型的な光強度トレースを示している。ビン時間は、１msecに調整された。強度ピークは、共焦点ＦＣＳ体積（confocal FCS volume）を通過する分子の移動を示している。
【０１１３】
図２は、（3.2secあたり100ループにわたって平均された）対応する自己相関カーブを示している。フィットは、τ＝1.74msecの拡散時間と、共焦点ＦＣＳ体積におけるｎ＝0.1529の小球をもたらす。いくつかのＦＣＳ測定にわたって平均された拡散時間は、τ＝1.91±0.33msecを与える。この拡散時間は、小球が共焦点ＦＣＳ体積を通過するのに必要とする時間を決定する。製造業者の情報によれば、利用された蛍光分光法ユニットは、ＶＦＣＳ≒１フェムト・リットル（ｆＬ）のＦＣＳ体積を有する。
【０１１４】
図３は、ビン幅Δｔ＝0.1msecについて、対応する光子カウント分布ｐ（ｎ，ｃ）を示している。確率ｐ（ｎ＝０，ｃ）＝0.79976は、図１のすべての光子カウントの約８０％がゼロであることを意味する。純水を用いた測定は、〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ＝0.0230642の背景雑音レベルを与える。
【０１１５】
本発明によれば、有効体積Ｖｅｆｆ内の分子の平均数〈ｍ〉は、式２４により、
ｃＶｅｆｆ＝〈ｍ〉＝−ｌｎ（ｐ（ｎ＝０，ｃ））−〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ＝0.20038
で表される。
【０１１６】
結果として、本発明による有効体積Ｖｅｆｆは、
Ｖｅｆｆ＝〈ｍ〉／（ｃＭＮＡ）≒1.75ｆＬ
で表され、（ｃＭ＝1.9E−10Mol／L、ＮＡ＝6.022E23）の大きさのオーダとなることが分かり、したがって、共焦点ＦＣＳ体積より僅かに大きい。
データは示されていないが、Ｖｅｆｆの値は、ビン幅Δｔ又は励起光強度を減少（増大）させることによって、減少（増大）させ得ることに留意されたい。一般に、Ｖｅｆｆは、分子パラメータばかりでなく、装置パラメータにも依存する。
【０１１７】
図４には、様々な試料について、標準的なＦＣＳ解析によって取得された分子の数（破線）が示されている。各試料について、２つの測定が実行され、各測定は、それぞれ黒丸（測定Ｉ）及び星印（測定ＩＩ）によって示されている。一連の測定は、所定のｃＭ＝2.44Ｅ−８Mol/Lの初期溶液で開始する（段階１）。
【０１１８】
この初期溶液は、「混合分割（mix and split）」法によって１２段階で希釈される。５０μＬの試料が、５０μＬの水で希釈され、結果の１００μＬの半分が、測定用に利用され、残りの半分は、次の「混合分割」段階のための試料として使われる。理想的には、微小球の濃度は、各希釈段階によって２分の１ずつ低下する。段階１３において、ｃＭ＝3E−12Mol/Lとなる微小球の最低濃度に達する。図４の対数目盛りでは、標準的なＦＣＳによって取得される小球の数は、線で結ばれていない四角によって示されるように、線形に低下する。
【０１１９】
この理論的挙動からの小さな逸脱は、一連の「混合分割」段階の間の小体積の取り扱いにおける不確実性からもたらされ得る。しかし、標準的なＦＣＳによって行われた同じ試料の２つの測定の結果が、１０％から５０％の間で異なっていることは明白である。このばらつきは、決定された小球の数、及びＦＣＳによって取得された濃度の同様な不確実性についてのかなり大きな統計誤差を表す。しかし、濃度が低い場合、ＦＣＳの挙動はより激しい。ｃＭ＝3.8E−10Mより低い濃度の場合、ＦＣＳ法は、正確な濃度を決定することができず、誤った高い値を与える。希釈段階１３における試料の場合、ＦＣＳは、２桁分高い値を与える。上述されたＦＣＳのこの挙動は、よく知られており、特に濃度が低い場合に、ＦＣＳ法の深刻な限界を提示する。
【０１２０】
以下では、本発明の方法が、従来技術のＦＣＳ法と比較して、蛍光粒子の数についてはるかに正確な決定をもたらすことが理解されよう。本発明によれば、蛍光粒子の濃度、すなわちＶｅｆｆ内の粒子の数〈ｍ〉は、ｐ（ｎ＝０，ｃ）によって決定することができる（上述を参照）。ｐ（ｎ＝０，ｃ）は、低濃度状況において高い統計精度で測定できることに留意されたい。対応する分子の数が、図４に示されている（実線）。
【０１２１】
本発明の方法は、ＦＣＳ法によって使用されたのと同じ収集データ記録に適用された。したがって、これらの結果を本発明の方法によって取得するために、追加の測定は実行されなかった。ＦＣＳによって得られた値と比較すると、〈ｍ〉の統計的ばらつきははるかに小さい（濃度が約ｃＭ＝5E−10Mol/Lの場合の１％から最低濃度ｃＭ＝3E−12Mの場合の１０％の間）。より重要なこととして、測定された濃度は、正確な理論的線形低下勾配に従っており、ｃＭ＝3E−12Mの濃度を下回っても、検出限界は見られない。
【実施例２】
【０１２２】
＜色素ローダミン６Ｇの希釈系列＞
同様の結果が、（上記の実施例１と同じ条件で）色素ローダミン６Ｇの希釈系列についても得られた。ここでは、ＦＣＳの検出限界が、装置の感度によって決定され、それはｃＭ＝３Ｅ−９Ｍｏｌ／Ｌのオーダにある。データは示されていないが、本発明は、ＦＣＳの検出限界を下回っても、２％の精度で濃度の測定を可能にすることが分かった。ローダミン６Ｇの場合、有効体積の値は、蛍光分光法ユニットの所与の装置パラメータについて、Ｖｅｆｆ≒０．２ｆＬに減少する。
【０１２３】
蛍光粒子によって生成される光子カウント信号の統計的有意性を高めるには、かなり大きなビン幅を選択するのが有利なことがある。標準的な解析法及びそれらの後継と比較して、本発明は、優れた簡潔性及び精度で、非常に低い濃度の決定を可能にする。
【実施例３】
【０１２４】
＜小球とローダミン６Ｇの混合物＞
小球と色素ローダミン６Ｇ（Ｒｈ６Ｇ）を含む試料の測定は、有効体積における粒子の平均数〈ｍ〉＝2.2を与える（上記の実験条件）。この値は、〈ｍ〉ＦＣＳ＝2.35のＦＣＳ値に類似している。しかし、パラメータが２つのＦＣＳは、各化学種の濃度を別々に決定することができない。本発明によれば、小球及びＲｈ６Ｇの濃度は、様々な方法によって決定することができる。１つの方法は、モーメント法を利用するものである。
【０１２５】
小球及びＲｈ６Ｇについての単一分子分布の１次モーメントは、
ν１（Ｐ１（ｂｅａｄｓ））＝1.55
ν１（Ｐ１（Ｒｈ６Ｇ））＝1.06
で表され、上記の例１及び例２において説明された測定からそれぞれ計算される。
したがって、測定された分布の１次モーメントν１（ｐｔｏｔ）と単一分子分布のモーメントν１（Ｐ１）の間の関係
ν１（ｐｔｏｔ）＝〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ＋〈ｍ〉ν１（Ｐ１）
が適用される。
ν１（Ｐ１（ｂｅａｄｓ））及びν１（Ｐ１（Ｒｈ６Ｇ））の値は、各化学種をその実際の濃度とは独立に特徴付けることに留意されたい。
混合物について取得された単一分子信号の１次モーメントは、
ν１（Ｐ１（ｂｅａｄｓ＋Ｒｈ６Ｇ））＝1.30
で表され、小球のモーメントとも、色素のモーメントともフィットしない。
ν１（Ｐ１（ｂｅａｄｓ＋Ｒｈ６Ｇ））を計算するため、式（３８）が適用される。
【０１２６】
【数３３】
【０１２７】
混合物における信号に対する小球寄与の部分ｘは、
ｘ：＝〈ｍ〉（ｂｅａｄｓ）／〈ｍ〉（ｂｅａｄｓ）＋〈ｍ〉（Ｒｈ６Ｇ）
は、式（３９）に示す関係によって容易に決定される。
【０１２８】
【数３４】
【０１２９】
〈ｍ〉ｂｅａｄｓ＝Ｘ*〈ｍ〉＝0.95
〈ｍ〉Ｒｈ６Ｇ＝（１−Ｘ）*〈ｍ〉＝1.25
が得られる。
結果の濃度（単位：ｍｏｌ／Ｌ）は、
ｃＭ（beads）＝〈ｍ〉ｂｅａｄｓ／（Ｖｅｆｆ（beads）＊ＮＡ）≒1E−9Mol/L
ｃＭ（Rh6G）＝〈ｍ〉Ｒｈ６Ｇ／（Ｖｅｆｆ（Rh6G）＊ＮＡ）≒1E−8Mol／L
である。
【０１３０】
データは示されていないが、この試料の希釈系列について測定された濃度は、両方の化学種について正確な濃度低下を再現する。
【０１３１】
比ｘを決定するための代替方法は、小球、Ｒｈ６Ｇ、及び混合物それぞれの単一分子分布の第１の非ゼロ成分Ｐ１（ｎ＝１）の比較である。
測定されたｐｔｏｔ（ｎ＝１）から単一分子分布Ｐ１（１）を取得するために、式（４０）の関係が適用された。
【０１３２】
【数３５】
【０１３３】
また、比ｘは、式（４１）で決定され、ｘ≒0.36±0.15の値をもたらす。上述の方法はどちらも、純粋溶液から混合物を区別すること、及び混合物内の各化学種の濃度のオーダを決定することを可能にする。
【０１３４】
【数３６】
【０１３５】
上述の方法及び実施例は、粒子を含む試料の固有特性を決定するために、固定ビン時間Δｔに適用される。これらの特性は、所与のビン時間にわたって記録された光強度トレースから取り出すことができる分子化学種の光物理的属性に依存する。したがって、ビン幅Δｔの選択は、上述された方法によって取得される結果に影響を及ぼす。
【０１３６】
本発明は、適切又は最適なビン幅を決定するため、及び１つの化学種の粒子又はいくつかの異なる化学種の粒子の混合物を含む試料の固有特性Ｅ１，…ＥＬをΔｔの関数として決定するための、さらなる方法に拡張される。
【０１３７】
ビン幅Δｔに対する方法の依存性は、分子化学種を、例えば拡散時間など、その動的特性によって特徴付けるために利用することができる。
【０１３８】
拡散時間の測定のための標準的な方法は、光トレースの時間挙動を利用するが、化学種の異なる光物理的属性は無視する、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）である。結果として、異なる輝度の分子化学種が試料中に存在する場合、ＦＣＳ法の適用は困難になる［非特許文献２０参照］。ＰＣＨ手法のパラメータに対するビン時間の影響［非特許文献７参照］及びＦＩＤＡのパラメータに対するビン時間の影響［非特許文献３参照］が文献において説明されている。
これらの手法は、時間依存光子計数多重ヒストグラム（ＰＣＭＨ：photon counting multiple histograms）及び蛍光強度多重分布解析（ＦＩＭＤＡ：fluorescence intensity multiple distribution analysis）とそれぞれ呼ばれる。ＰＣＭＨとＦＩＭＤＡは、分子化学種の拡散時間及び分子輝度を同時に測定するために適用された。混合物から濃度を決定するため、及びタンパク質−リガンド相互作用（protein-ligand interaction）の結合定数を決定するための、ＦＩＭＤＡの適用が示された。
【０１３９】
ＦＩＭＤＡの適用及びＰＣＭＨの適用は、いくつかの難点を有する。
１．各ビン幅についての分子輝度の決定は、複雑で時間を要する数値的に非安定な非線形フィッティング手順を必要とする。
２．どちらの方法も、ビン幅に対するモデル・パラメータの依存性を記述するために、複雑な式に依存する。
３．さらに、これらの式は、保存されないその場限りの仮定に基づいている。
【０１４０】
本発明によるさらなる方法は、本発明による上記の第１の方法によって説明されたような粒子を含む試料の固有特性を、一連の異なる時間幅Δｔについて決定することに関する。本明細書では、固定ビン幅について決定される固有特性は、ビン幅Δｔの関数として理解される。
【０１４１】
したがって、本発明のさらなる方法は、以下のステップ、すなわち、
１）式４２であらわされる観測時間Ｔの引き続く所定の時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ）（ｉ＝１，…，Ｎ）において記録される光子イベントの数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）本発明による上述の第１の方法の他のステップを実行し、また更なるステップとして、
４）異なる時間間隔Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）についてステップ１）からステップ３）をＫ回繰り返し、これらのステップの各組によって同じ固有特性Ｅ１，…ＥＬを決定し、
５）Δｔｋに対する特性Ｅ１，…ＥＬの依存性を決定し、
６）ステップ５）によって測定された依存性から、適切もしくは最適なΔｔ、又は粒子の他の固有特性を決定するようにした。
【０１４２】
【数３７】
【０１４３】
ビン時間Δｔの関数としての固有特性の知識は、
１．上述された本発明による第１の方法のビン時間について１つの適切又は最適な値を選択するため、
２．分子化学種を特徴付けるため、
３．測定された依存性に所与の解析関数をフィッティングすることによって別の固有特性を取得するため、
４．混合物中の分子化学種を同定し、それらの濃度を計算するため、に利用することができる。
【０１４４】
時間間隔（ビン幅）Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）は、１０−６秒から数秒の間で選択することができる。
【０１４５】
固有特性の一例は、ビン幅が短いと高く、ビン幅が長くなると低下する（実施例４を参照）、単一分子の有効輝度である。輝度のこの低下は、レーザ焦点から遠ざかる可視分子の拡散から生じる。したがって、輝度の最大レベル及び輝度の勾配は、分子化学種を特徴付ける。
【０１４６】
個々のビン幅は、例えば、ｋ＝０，…，７２として、Δｔｋ＝０．８ｋｓｅｃのように、対数目盛り上で等距離になるように選択することができる。
【０１４７】
ビン幅に対する最大輝度μｍａｘの依存性は、特定の化学種の分子の輝度及びサイズに特徴的な、実験的なダイイング・アウト関数（dying-out function）をもたらす。測定された依存性を用いたそのような関数の計算は、高速で（数秒以内に）実行することができる。原理的に、ビン幅Δｔに対するそのような依存性は、本発明の第１の方法によって上で説明された、単一化学種の粒子のすべての特性について決定することができる。
【０１４８】
所与の解析関数は、標準的なフィッティング手順によって、ビン幅Δｔに対する固有特性の測定された依存性にフィットさせることができる。
【０１４９】
固有特性は、測定される試料中の分子の特定の化学種とすることができる。
【０１５０】
さらに、固有特性は、試料中のいくつかの化学種の分子の、混合物内における部分濃度とすることもできる。
【０１５１】
測定された依存性は、分子の特定の化学種を同定するため、又は試料中の分子の部分濃度を特定するために、すでに測定された依存性又は理論的関数と比較することができる。
【０１５２】
ビン幅Δｔに対する固有特性の測定された依存性は、試料中の分子の部分濃度のために、分子の特定の化学種を決定するための非線形フィット手順によって、すでに測定された依存性又は理論的関数の重ね合わせと一致させることができる。
【０１５３】
本発明による方法の特定の応用では、分布関数ｐ（ｎｋ，Δｔｋ）（ｋ＝１，…，Ｋ）が測定され、最大輝度μｍａｘ（Δｔｋ）が、適切なフィッティング手順を用いて、ｐ（ｕｋ，Δｔｋ）から固有特性として決定される。
【０１５４】
上記の方法は、時間極限Δｔ→０におけるμｍａｘ（Δｔ）、拡散運動、拡散時間τＤ、及び／又は装置の構造パラメータＳＰを、適切なフィッティング関数によって、μｍａｘ（Δｔ）から決定することをさらに含むことができる。
【０１５５】
さらなるステップとして、試料中の特定の化学種の粒子のフェード・アウト時間（fade-out time）τμ及び／又は分率が、μｍａｘ（Δｔ）から決定できる。
【０１５６】
本発明による方法のさらなる実施例では、いくつかの化学種の粒子を含む試料が測定でき、その場合、μｍａｘ（Δｔ）が決定され、試料中の化学種ｓのモル分率Ｘｓは、先に測定又は他の方法で決定されたμｍａｘ，ｓ（Δｔ）によって式（４３）で決定される。
【０１５７】
【数３８】
【０１５８】
代替として、μｍａｘ，ｓ（Δｔ）が決定でき、試料中の化学種のモル分率Ｘｓが、式（４４）を境界条件とするパラメータ０≦Ｘｓ≦１（ｓ＝１，…，Ｓ）を有する非線形フィットによって決定される。
【０１５９】
【数３９】
【０１６０】
以下のさらなる実施例４及び５では、ビン幅Δｔの値に対する特性の依存性が説明される。
【実施例４】
【０１６１】
固有特性のための説明的な一例は、式（４５）によって計算される輝度値μｍａｘである。
【０１６２】
【数４０】
【０１６３】
上式において、高輝度、すなわちν１（ｐ）≫〈ｎ〉ｎｏｉｓｅである場合、雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅは、無視することができる。上記の式によって計算されるこの輝度値μｍａｘは、ガウス分布μ（ｒ’）：＝μｍａｘexp（−２ｒ２／ａ２）を示す輝度関数μ（ｒ’）の最大値であるが、同様に他の分布タイプのための固有輝度値でもある。
モル濃度がｃ＝56E−10Mである色素ATTO 532（ATTO TEC、ジーゲン、ドイツ）を含む試料が、ConSense検出システム（FluIT Biosystems、ザンクト・アウグステン、ドイツ、http：//www.fluit-biosystems.de）において測定された。
蛍光光強度のトレースが、３分間にわたって記録され、Virtual Labソフトウェア（FluIT Biosystems）によって解析された。確率分布ｐ（ｎ，ｃ）が、１ｓから数μｓ（10−６ｓ）の範囲の様々なビン時間について構成された。具体的には、Δｔｎ＝Δｔ０0.8ｎ、ｎ＝１，２，３，…，７２、Δｔ０＝１ｓという別個のビン時間を選択する。各ビン時間及び対応する確率分布ｐ（ｎ，ｃ）について、輝度値μｍａｘが、ｐ（ｎ，ｃ）の１次及び２次モーメントを介して計算された（上記の式を参照）。μｍａｘの取得された値は、適用されたビン時間に依存し、図５においては、μｍａｘが、Δｔに対してプロットされている。結果として、固有特性μｍａｘは、Δｔの関数として理解され、この関数は、以下ではμｍａｘ（Δｔ）によって表される。
【０１６４】
最大輝度μｍａｘは、レーザ焦点の中心における単一分子の輝度として解釈することができる。拡散によって、中心に見出された単一分子は、中心から遠ざかり、（カウント毎秒ｃｐｓを単位とする）その輝度は減少する。結果として、ビン時間Δｔが長くなると、測定される有効最大輝度μｍａｘ（Δｔ）は低下する。ビン時間が短い場合、有効最大輝度は大きくなる。
【０１６５】
化学種の（有効）輝度の値は、ビン幅Δｔに依存する。図５においてプロットされたカーブは、式（４６）で表される解析関数にフィットすることができる。
【０１６６】
【数４１】
【０１６７】
パラメータμｍａｘ（Δｔ＝０）、τμ、及びＳＰは、短いビン時間の極限における最大輝度、フェード・アウト時間、及び光学セットアップの構造パラメータをそれぞれ表す。フィットは、輝度値μｍａｘ（Δｔ＝０）＝15.1kcps、フェード・アウト時間τμ＝0.731ms、及び構造パラメータ２を与える。
【０１６８】
輝度値μｍａｘ（Δｔ＝０）及びフェード・アウト時間τμは、所与の光学セットアップにおける分子化学種についての固有特性である。輝度値μｍａｘ（Δｔ＝０）は、分子の光物理的特性と、最大局所レーザ光強度に依存する。フェード・アウト時間τμは、分子の拡散定数、すなわち分子の流体力学的半径（hydro-dynamical radius）と、共焦点検出体積（confocal detection volume）に比例する。
【０１６９】
光学セットアップの影響を説明するため、モル濃度が3.0・10−１１Ｍの色素ATTOを含む試料が、２回測定された。１回目は、背景雑音を低減するために、直径100μｍのピンホールが利用され、試料の蛍光光強度のトレースが、ConSense検出システムを用いて、３分間にわたって記録された。２回目のセットアップでは、同一の試料が、直径75μｍのピンホールを代わりに用いて、30ｓにわたって測定された。蛍光光強度のトレースはどちらも、上述されたように解析され、両セットアップについて取得された輝度関数が、図６に示されている。ピンホール直径の100μｍから75μｍへの直径の減少は、フェード・アウト時間τμの0.567ｍｓから0.343ｍｓへの低下ももたらす。より小さなピンホール直径は、より小さな検出体積寸法をもたらし、したがって、フェード・アウト時間の減少をもたらす。
【実施例５】
【０１７０】
試料中の異なる分子化学種を区別するため、ビン時間に対する固有特性の依存性が利用できる。第１のステップにおいて、固有特性と、ビン時間に対するそれらの依存性が、すべての可能な分子化学種についてプローブ内で測定されなければならない。典型的な状況が、図７及び図８（Ｔａｂｌｅ １）に略述されている。
【０１７１】
輝度関数μｍａｘ（Δｔ）が、蛍光色素について測定され、パラメータμｍａｘ（Δｔ＝０）及びτμが、実施例４において説明されたような非線形フィットによって決定された。抗体が、この色素によって標識付けされた。抗体は色素よりはるかに大きいので、標識付けされた抗体について測定されたフェード・アウト時間τμ＝２５５μｓは、純粋色素について測定されたフェード・アウト時間τμ＝３３μｓよりはるかに長い。標識付けされた抗体は、フェード・アウト時間ばかりでなく、より高い輝度値によっても色素から区別可能である。大抵、各抗体分子は２つの色素分子によって標識付けられるが、このことは、抗体の高い輝度値μｍａｘ（Δｔ＝０）によって示される。
【０１７２】
他方、抗体は、タンパク質に結合することができる。抗体＋タンパク質の複合体を特徴付けるため、タンパク質が、試料に過剰に与えられた。タンパク質分子は標識付けされておらず、蛍光抗体に結合されていない場合は暗いことに留意されたい。より長いフェード・アウト時間τμ＝６６３μｓは、複合体の増大した直径に対応する。タンパク質の結合は、抗体分子の輝度値を減少させ、それは、タンパク質が２つの色素分子の一方に取って代わったことを示す。
【０１７３】
タンパク質は、重合体に結合することができる。溶液に重合体を過剰に追加することで、抗体＋タンパク質＋重合体の複合体（及び暗い分子）だけを含む試料がもたらされる。その長いフェード・アウト時間τμ＝１６１１μｓによって示されるように、この複合体は、かなり大きい。輝度値の減少は、電子三重項状態における分子のかなり高いポピュレーションによって説明することができる。三重項存続期間及びポピュレーションは、非特許文献２１において説明されるように、輝度に対する三重項状態の影響をモデル化し、非線形フィッティング法を適用することによって、取得することができる。
【０１７４】
１つのビン時間において異なる複合体を区別するために、適切又は最適なビン時間Δｔを選択することができる。したがって、各化学種の輝度値が互いによく分離されるビン時間が、選択されなければならない。すべての成分が異なる輝度値を有するΔＴ１による一例が、図７に示されている。図７を見ると、悪い選択はΔＴ２であり、その理由は、このビン時間では、抗体＋タンパク質＋重合体の複合体及び色素が同じ輝度を有するからである。
【０１７５】
抗体とタンパク質と重合体の混合物では、図８（Ｔａｂｌｅ １）に列挙された複合体が出現し得る。混合物内のこれらの複合体の各々のモル濃度を決定するために、ビン時間に対する単一分子の固有特性の依存性を利用することができる。標準的な希釈系列による結合定数の測定にとって、これは特に重要である。所定の個別輝度関数μｍａｘ，ｓ（Δｔ）、ｓ＝１，２，…，Ｓを有するＳ個の異なる化学種の混合物を含む試料の輝度カーブは式（４７）で与えられる。
【０１７６】
【数４２】
【０１７７】
パラメータＸｓ、ｓ＝１，２，…，Ｓは、非線形フィットにより決定され、式（４８）のように成分ｓの相対モル分率を表す。
【０１７８】
【数４３】
【０１７９】
本例では、成分の数は４である（図８（Ｔａｂｌｅ １）参照）。非線形フィッティング・アルゴリズムによって対応するモル分率Ｘｓ、ｓ＝１，２，３，４を取得するために、図７に示された４つの輝度関数が適用されなければならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一定の連続時間内において、観測体積（observation volume）内で光子を放出、散乱、及び／又は反射する少なくとも１つの化学種の粒子を含む試料についてその固有の特性（characteristic property）を決定する方法に関する。さらに、本発明は、異なる連続時間内において同様の粒子を含む試料についてその固有の特性を決定するように拡張し得る。
【背景技術】
【０００２】
上記の方法は、広範な適用分野、特に生物物理学及び生化学における標準的な方法として確立されている蛍光揺らぎ分光法（FFS：fluorescence fluctuation spectroscopy）［非特許文献１参照］に基づいている。
高スループットのふるい分け及びオンライン解析で利用するために開発された理論及び具体的手法が蛍光強度分布解析法（FIDA：fluorescence−intensity distribution analysis）として知られている（特許文献１、非特許文献２参照）。
【０００３】
単一分子実験においては、状況は以下の通りである。
小さな観測体積Ｖ内の分子から放出された光子は、光子用の検出器に衝突する。離散時間点ｔｉ，ｉ＝０，１，２…は、観測時間を一定の時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ］（ｉ＝１，２，３…Ｎ）に分割する。
時間間隔Δｔｉ内でカウントされた光子の数は、数列｛ｎ１，ｎ２，ｎ３，…｝を提示する。完全な測定は、有限の数の計数率（counting rate）ｎ１，ｎ２，…ｎＮを与える。ｎ個の光子がカウントされる時間間隔の数（＃ｋ）は、光子計数分布（photon counting distribution）（＃ｋ（ｎ））を与える。
【０００４】
列＃ｋ（ｎ）の各要素を、式（１）で定義される間隔の総数Ｎで除算することで、式（２）のように実数ｐＮ（ｎ）が得られ、この実数は、少なくとも測定された「非常に多い」時間間隔の極限では、時間間隔Δｔにおいてｎ個の光子を測定する確率として解釈することができる。
また、対応する物理的確率分布ｐ（ｎ）は式（３）のように表される。
【０００５】
【数１】
【０００６】
簡単化のため、すべての光子は、対象分子によって生成されると仮定し、例えば検出器ハードウェア又は散乱光によって生成される背景雑音は、すべて無視する。背景雑音を組み込むことは容易であり、ｐ（ｎ）に対するその影響が後で説明される。
【０００７】
ＦＦＳにおいて試料の固有特性を決定する方法は、２つの基本ステップを含んで、
１）式（４）で表される観測時間Ｔ内の各時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ］（ｉ＝１，２，３…Ｎ）において記録される光子イベント（photon event）の数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）所与の理論モデルが測定されたｐ（ｎ）の結果を最適な一致（optimal agreement）（以下「フィッティング（fitting）」と呼ばれる）で説明するように、１つ又は複数の対象の特性を決定する。
なお、観測時間は式（４）で表される。
【０００８】
【数２】
【０００９】
ｐ（ｎ）から取り出すことができる典型的な特性は、
１．純粋溶液における分子の濃度
２．混合物における分子の濃度
３．分子間結合過程（intermolecular binding process）の動力学
４．分子間解離過程（intermolecular dissociation process）の運動速度
５．分子内共形変化（intramolecular conformal change）の運動速度
６．分子の拡散速度
７．分子輝度（molecular brightness）
８．光学セットアップの空間輝度関数（spatial brightness function）
９．分子に特有な一重項状態（singlet state）の存続時間
１０．検出器のアフターパルス・レート（after−pulse rate）を含む。
【００１０】
ＦＩＤＡにおいては、理論的な光子カウント分布ｐ（ｎ）は、式（５）に示す母関数（generating function）Ｇ（ξ）により計算される。
Ｇ（ξ）は、いわゆる空間輝度関数Ｂに依存する関数上での空間積分の指数関数として表現される。空間輝度関数は、試料内の粒子の座標の正規化関数としての、励起光強度と光学機器による蛍光光の透過係数（transmission coefficient）との積である。
【００１１】
【数３】
【００１２】
光学機器を特徴付けるために、空間輝度関数Ｂの単純なモデルが適用され、その調整パラメータは、単一の化学種での実験によって決定される。未知のモデル・パラメータ、濃度ｃ及び特定の輝度値ｑは、非線形フィッティング手順によって、又は正則化法を用いる逆変換によって決定される。ただし、ＦＩＤＡの難点は、以下の点にある。
１．母関数手法は、理論モデルをあまり直観的なものにせず、より複雑な応用のために方法を拡張することが難しい。
２．モデルは、未知パラメータｃ及びｑについて非線形の度合いが高く、これらのパラメータの決定は複雑である。
３．各分子の輝度は、すべての化学種に共通な空間輝度関数と、化学種ごとに特徴的な値を有する特定の輝度との積として表現される。化学種が異なれば三重項状態ポピュレーション（triplet state population）は著しく異なるので、すべての測定において、この仮定はある程度は違反される。
４．分子の座標は、計数時間間隔（ビン幅（bin width））の間は変化しないと仮定される。数μｓの範囲の非常に短い時間間隔であっても、これは粗雑な近似でしかない。さらに、分子の拡散運動に対するｐ（ｎ）の依存性は、モデルからは取り出すことができない有用な情報を有している。
【００１３】
ＦＩＤＡへの半経験的な補正係数の導入によって、いわゆる多項目蛍光強度分布解析法（FIMDA：fluorescence intensity multiple distribution analysis）が、拡散時間及び分子輝度の同時決定のために開発された［非特許文献３参照］。ＦＩＤＡと比較すると、マスタ方程式（Master equation）を介した光子カウント分布の直接計算は、著しく改善されたフィット品質を示す。しかし、そのような数値シミュレーションは非常に遅く、高スループットの応用例には適していない［非特許文献３参照］。
【００１４】
ＦＩＤＡ及びその後継の代替方法は、光子カウント・ヒストグラム（photon count histogram）ＰＣＨアルゴリズムに基づいている［非特許文献５、非特許文献６、http：//www.lfd.uiuc.edu/staff/grattonにおいて入手可能な非特許文献７、及び非特許文献８参照］。
これらの方法は、技術的詳細がＦＩＤＡと異なるだけであり、空間レーザ輝度分布の異なる形状を仮定している。ＰＣＨ法は、商業的用途では僅かな役割しか演じていない。ＰＣＨ手法では、検出体積をかなり恣意的に選択しなければならない。寄与分子の平均数及び単一分子の光子確率分布などの特性は、どのような物理的意味ももたない抽象的な特性となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ98／16814
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】L.Mandel：Fluctuations of photon beams and their correlations、Proc. Phys. Soc. 72、1037〜1048頁、（1958）
【非特許文献２】Peet Kask、Kaupo Palo、Dirk Ullmann、Karsten Gall：Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96、13765〜13761頁、（1999）
【非特許文献３】Kaopo Palo、Ulo Mets、Stefan Jager、Peet Kask、Karsten Gall：Fluorescence intensity multiple distribution analysis：Concurrent determination of diffusion times and molecular brightness、Biophysical J.79、2858〜2866頁、（2000）
【非特許文献４】Kaopo Palo、Ulo Mets、Vello Loorits、Peet Kask：Calculation of photon count number distributions via master equatons、Biophysical J.90、2179〜2191頁、（2006）
【非特許文献５】Yan Cheng、D.Muller Joachi、Peter T．C．So、Enrico Gratton：The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopie、Biophysical J.77、553〜557頁、（1999）
【非特許文献６】Yan Cheng：Analysis and applications of fluorescence fluctuation spectroscopy．PhD thesis、University of Illinois at Urbana-Champain、Urbana、Illinois、（1999）
【非特許文献７】Thomas D.Perroud、Bo Huang、Richard N.Zare：Effect on bin time on the photon counting histogram for one-photon excitation、ChemPhysChem 6、905-912頁、（2005）
【非特許文献８】Y．Cheng、M．Tekmen、L．Hillesheim、J．Skinner、B．Wu、J．Muller：Dual-color photon counting histogram、Biophysical J．88、2177〜2192頁、（2005）
【非特許文献９】Lars Kastrup、Hans Blom、Christian Eggeling、Stefan W．Hell：Fluorescence fluctuation spectroscopy in subdiffraction focal volume、Phys．Rev．Lett．94、（2005）
【非特許文献１０】Yan Cheng、Joachim D．Muller、Peter T．C．So、Enrico Gratton：The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopie、Biophysical J．77、553〜557頁、（1999）
【非特許文献１１】Bo Huang、Zhomas D．Perroud、Richard N．Zare、Photon counting histogram：One-photon excitation、ChemPhysChem 5、1323〜1331頁、（2004）
【非特許文献１２】Bruno Klahn、Werner A．Bingel：The convergence of the Raleigh-Ritｚ Method in Quantum Chemistry、Theoret．Chim．Acta 44、9〜43頁、（1977）
【非特許文献１３】H．P．Dikshit、Charles A．Michelli編：Advances in Computational Mathematics、World Scientific Publishing Co., Inc．（1993）に所収のP.Deuflhard、J.Ackermann：Adaptive Discrete Galerkin Methods FOR Macromolecular Processes
【非特許文献１４】J.Ackermann、M.Wulkow：MACRON-A Program Package FOR Macromolecular Reaction Kinectics、Konrad-Zuse-Zentrum、Preprint SC-90-14、（1990）
【非特許文献１５】M.Wulkow、J.Ackermann：Numerical Simulation of Macromolecular Kinetics − Recent Developments、IU-PAC Working Party、Macro group、（1990）
【非特許文献１６】M.Wulkow、J.Ackermann：The Treatmeant of Macromolecular Processes with Chain-Length-Dependent Reaction Coefficients − An Example from Soot Formation、Konrad-Zuse-Zentrum Berlin、Preprint-91−18、（1991）
【非特許文献１７】U.Budde、M.Wulkow：Computation of molecular weight distributions FOR free radical polymerization systems、Chem．Ing．Sci．46、497〜508頁、（1991）
【非特許文献１８】M.Wulkow：Numerical Treatment of Countable Systems of Ordinary Differential Equations、Thesis and Technical Report-90-8、Konrad-Zuse-Zentrum Berlin、（1990）
【非特許文献１９】M.Wulkow：Adaptive Treatment of Polyreactions in Weighted Sequence Spaces、IMPACT Comput. Sci. Engrg. 4、152〜193頁、（1992）
【非特許文献２０】E.Van Craenenbroeck、G.Matthys、J.Beirlant、Y.Engelborghs：“A statistical analysis of fluorescence correlation data”：Journal of Fluorescence、9、325〜331頁、1999
【非特許文献２１】Jerker Widengren、Ulo Mets、Rudolf Rigler：Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet States in Solution：A Theoretical and Experimental Study、Journal of Physical Chemistry、99、13368〜13379頁、（1995）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、光子計数ヒストグラムの事前予測のための改良された理論的プラットフォームを提供することである。本発明のさらなる目的は、ＦＦＳに対するより深遠な物理的洞察を提供し、ＰＣＨ手法を複雑な実験課題に対して直観的に拡張できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の上記の目的は、請求項１に記載の特徴を有する方法によって解決される。
【００１９】
有効体積Ｖｅｆｆは、光学セットアップによって容易に記述されず、考察される粒子化学種の特性にも依存する。粒子は、それが計数率に寄与する場合に限って、特定の時間間隔の間、この体積の「内部に」存在すると定義される。計数率に寄与する確率は、どの空間位置に見出される粒子についても非ゼロである。したがって、有効体積Ｖｅｆｆは、物理的な空間境界によって決定することはできない。それにも関わらず、この体積「に入る」／「から出る」過程は、小さな物理的体積への／からの拡散過程と同様に、確率過程である。誘導放出抑制（ＳＴＥＤ：stimulated emission depletion）などの技法［非特許文献９参照］は、有効体積を著しく減少させることが可能であることに留意されたい。
【００２０】
定義によって、有効体積内部の「単一粒子」は、ゼロの計数率を生じさせることができない。その結果、有効体積内部に「単一粒子」を有するという言葉は、任意の空間体積内に「単一粒子」を有するのとは概念的に非常に異なる。物理的に、確率分布Ｐ１（ｎ）は、時間間隔Δｔｉの間のすべての光子イベントがもっぱら単一粒子から生じる、非ゼロ計数率だけを考察することによる思考実験において測定することができる。いくつかの粒子から生じる信号の重ね合わせは、無視されなければならない。
【００２１】
本発明によれば、粒子化学種、例えば分子化学種は、所与の実験セットアップについて、２つの量、すなわち、有効体積Ｖｅｆｆ及び単一粒子分布Ｐ１（ｎ）によって特徴付けられる。２つの量はともに、上述されたような、定義された物理的意味を有する。単一粒子分布Ｐ１（ｎ）は、その特有の特性Ｐ１（ｎ＝０）＝０によって、ＦＩＤＡ及びＰＣＨ手法における同じ名前を付された単一粒子分布と区別することができる。
【００２２】
Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）の知識は、１つ又は複数の化学種（混合物）の分子を含む試料における分子濃度の迅速かつ頑健な決定のために利用することができる。方法は、例えば、アフター・パルシング、分子拡散、又はこれまでのすべての方法、例えば、ＦＩＤＡ、ＦＩＭＤＡ、もしくはＰＣＨアルゴリズムなどの適用性を制限する一重項状態励起のような、妨害の影響に対して頑健である。本発明による方法は、ＦＩＤＡ又はＰＣＨアルゴリズムのように、ビン幅を短くすることに限定されない。本発明による方法は、例えば、流動、微細構造、細胞、小胞、エマルジョン、又はゲルのような任意の分子環境に適用可能である（これまでのところ実験的に検証されていない）。
【００２３】
本発明による方法は、これまでのすべての方法よりも単純である。技法的に、本発明による方法は、例えば、非線形フィット、母関数、又はモーメント法（method of moments）のような、標準的なフィッティング法と組み合わせることができる。技法的具現化に応じて、本発明による方法は、オンライン診断に適した非常に迅速な方法となる。
【００２４】
ＦＩＤＡにおいては、ある種の分子は、実数値によって与えられる特定の分子輝度によって特徴付けられる。本発明によれば、ある種の分子は、Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）によって完全に特徴付けられる。
【００２５】
特性Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）は、例えば、実験セットアップに関係する拡散率又は一重項状態励起確率のような、すべての情報をそれらが含むという意味で豊富である。原理上は、例えば分子などの粒子を特徴付けるすべての情報は、Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）から取り出すことができる。しかし、この情報を取得するには、特定の理論モデルが適用されなければならない。
特性Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）は、いくつかの粒子の同時寄与のためにどのような実験にも存在する平均化プロセスを伴わずに、それらが単一粒子の特性を特徴付けるという意味で純粋である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ポリスチレン微小球含有試料の光強度トレースを示すグラフ。
【図２】図１の100トレースにわたって平均された自己相関カーブを示すグラフ。
【図３】ビン幅Δｔ＝0.1msecについて光子カウント分布ｐ（ｎ，ｃ）を示すグラフ。
【図４】本発明方法によって取得された分子数を示すグラフ。
【図５】輝度値μｍａｘ−ビン時間Δｔの関係を示すグラフ。
【図６】直径100μｍ及び75μｍのピンホールを用いた場合の輝度関数を示すグラフ。
【図７】ビン時間ΔＴ１に対する各成分の輝度値を示すグラフ。
【図８】フェード・アウト時間τμと輝度値の関係を示す表。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態では、マルコフ過程の理論に基づいて、単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）は、式（６）で与えられる。
【００２８】
【数４】
【００２９】
所与のビン幅Δｔｉについての光子計数率ｎｉは、空間的に変化するレーザ強度及び光学セットアップの光子収集特性（photon collection property）のために、レーザ焦点に対するすべての分子の位置に強く依存する。レーザ焦点に近い分子は、光子計数率に大きく寄与する一方で、レーザ焦点から遠く離れた分子は、僅かな寄与しかせず、又はまったく寄与しない。
単一分子の寄与は、表面（例えばガラス表面）上又はマトリックス（例えばゲル）内の所与の位置ｒ’においてそれを固定化することによって、測定することができる。このセットアップについて記録される光子カウントｎｉの列は、確率分布ｐ（ｎ）を与える。そのようにして測定された光子カウントの平均値〈ｎ〉は位置（ｒ’）における分子輝度μと呼ばれ、式（７）で表される。
【００３０】
【数５】
【００３１】
分子輝度μ（ｒ’）の測定は、任意の位置ｒ’について可能であり、μ（ｒ’）の関数形式は、分子の様々な位置についてこの手順を繰り返すことによって、例えば、等距離空間メッシュ上のすべての位置ｒ’についてμを測定し、メッシュ点の間ではμ（ｒ’）を補間することによって、測定することができる。
分子輝度関数μ（ｒ’）の測定は時間を消費し、高価であるので、それは通常、分子蛍光分光法（molecular fluorescence spectroscopy）の理論に基づいたモデルと、空間レーザ光強度の所与のモデルによって近似される。
これに関連して、分子輝度μ（ｒ’）は、例えば、ビン幅Δｔ、励起波長（λ）における光の空間的分布及び強度、光学セットアップの収集効率関数、検出器の量子効率（ｑ）、横断面（σ）、ならびに所与のタイプの分子の蛍光量子収量（fluorescence quantum yield）（φｆ）のような、パラメータに依存する。三重項状態励起及び検出器のアフター・パルシングのような効果も同様に、重要な役割を演じることが示された。
【００３２】
分子輝度μ（ｒ’）の知識は、実験的光子カウント分布のどのようなアブ・イニシオ予測（ab initio prediction）のためにも必須である。ＦＩＤＡ及びＰＣＨにおいては、μ（ｒ’）についての理論モデルが適用される。これらのモデルにおける自由パラメータは、単一化学種における実験によって決定される。
【００３３】
分子輝度関数μ（ｒ’）が、直接測定又は理論モデルによる近似によって分かると仮定した場合、個別分子からｎ個の光子を測定する確率Ｐ１（ｎ）は、マンデルの古典公式（Mandel’s classical formula）［非特許文献１参照］により式（８）のように記述される。
【００３４】
【数６】
【００３５】
残念なことに、確率Ｐ１（ｎ）についての式（８）は、無限に大きな積分体積Ｖの極限で、単純解Ｐ１（ｎ）＝δ０ｎをもたらす。これは、有限体積内の個別分子は、ゼロ濃度に対応し、光子カウント・イベントを生じさせることができないという物理的事実を反映している。一般的な実践は、大きいが有限の体積Ｖを導入することによって、この難点を回避することであり、例えば、非特許文献１０の説明を参照されたい。
【００３６】
本発明によれば、ＰＣＨアルゴリズムについての上述の問題は、有効体積Ｖｅｆｆ内での「単一分子」の定義をマンデルの公式に適用することによって回避され、その場合、マンデルの公式は、式（９）で表される。
【００３７】
【数７】
【００３８】
この式は、Ｐ１（ｎ）、Ｖｅｆｆ及びμ（ｒ’）の間の関係を確立し、これらの固有特性のどれか１つを決定するために使用することができる。
【００３９】
さらに、マルコフ過程の理論に基づいたポアソン近似は、〈ｍ〉及びＶｅｆｆについての以下の公式をもたらす。
【００４０】
現実の物理状況における非ゼロ濃度ｃを考慮する場合、各計数率に寄与する分子の平均数〈ｍ〉は、式（１０）によって与えられる。
【００４１】
【数８】
【００４２】
Ｖｅｆｆ：＝〈ｍ〉／ｃの関係より、式（１１）が得られる。
【００４３】
【数９】
【００４４】
上記の式は、〈ｍ〉、μ（ｒ’）及びｃの間の理論的関係、ならびにＶｅｆｆ及びμ（ｒ’）の間の理論的関係をそれぞれ確立し、これらの固有特性のどれか１つを決定するために使用することができる。
【００４５】
ＦＦＳのほとんどの応用例では、同じ化学種の粒子（分子）は、蛍光性であるか、又は蛍光標識を付され、粒子を励起するために、レーザ・ビームが使用される。
輝度関数μ（ｒ’）の最大値は、式（１２）で表される分布関数の１次モーメントによって定義される。
【００４６】
【数１０】
【００４７】
非線形フィット手順の代替手順としてのモーメント法の意義が、以下でさらに考察される。
雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅが考慮される場合、輝度関数μ（ｒ’）の最大値は、異なる輝度関数の重ね合わせとして式（１３）でモデル化される。
【００４８】
【数１１】
【００４９】
代替として、輝度関数μ（ｒ’）は異なる輝度関数の重ね合わせとして式（１４）でモデル化される。
【００５０】
【数１２】
ａｊ：パラメータ
異なる輝度関数μｊ（ｒ’）（ｊ＝１，２，…,Ｋ）
【００５１】
各輝度関数μｊ（ｒ’）（ｊ＝１，２，…,Ｋ）は、Ｍ個の特性パラメータμｊｋ（ｋ＝１，２，…，Ｍ）によって決定される。
【００５２】
輝度関数のポピュラなモデルは、式（１５）に表される空間ガウス分布（spatial Gaussian profile）である。
【００５３】
【数１３】
【００５４】
かなり複雑な３次元空間輝度関数を考慮したそのような大胆な近似の限界が、いくつかのグループによって示されており、非特許文献１１及び同文献中に記載の文献を参照されたい。
この選択が説明例として正当なものであることを簡単に述べておくのが適当である。
第１に、本発明の我々の手法は、任意の空間輝度関数に適用することができる。
第２に、ガウス関数による近似は、通常は扱いが容易であり、ガウス関数の収縮（contraction）は、積分可能空間関数に収束することが証明されている［非特許文献１２参照］。これが、数十年間、それらが現代量子化学において広く利用されてきた１つの理由である。
【００５５】
ガウス分布を有効体積及び単一分子関数の定義にそれぞれ挿入すると、座標変換ｒ→μ、及び回転対称上での積分は、式（１６）〜（１９）で表される。
【００５６】
【数１４】
【００５７】
関数Ｆ及びＱを計算するために、数値ロンバーグ積分（Numerical Romberg integration）が利用できる。Ｑは、ｎ≧１の場合に限って有限であり、ｎ＝０の場合は発散することに留意されたい。
ガウス形状のμ（ｒ’）に関し、有効体積Ｖｅｆｆは、Ｆ（μｍａｘ）＝√（２π）におけるＦＣＳの対応検出体積Ｖｆｃｓ＝π３／２ａ３と一致する。
すなわち、μｍａｘのある値について、Ｐ１（ｎ）は、μｍａｘについて数値的に安定かつ高速な方法で計算することができ、定義された物理的意味を有する。
【００５８】
輝度関数μ（ｒ’）のより正確なモデル化は、式（２０）によるガウス分布の重ね合わせにより実行される。
【００５９】
【数１５】
【００６０】
特性パラメータμｊｋ（ｊ＝１，２，…，Ｋ；ｋ＝１，２，…，Ｍ）は、標準的なデコンボリューション法（deconvolution method）によって決定される。
特性パラメータμｊｋ（ｊ＝１，２，…，Ｋ；ｋ＝１，２，…，Ｍ）は、反復リチャードソン−ルーシ・デコンボリューション・アルゴリズム（interative Richardson-Lucy deconvolution algorithm）によっても決定することができる。
【００６１】
上述されたような単一分子関数Ｐ１（ｎ）及びＶｅｆｆの理論的計算は、古典マンデル公式に基づいている。しかし、この公式は、ある限界を有する。光子計数率の分布は、光子生成率が時間間隔Δｔの間に変化し得るので、ポアソン分布Ｐｏｉ（ｎ，μ（ｒ’））から逸脱することがある。
いくつかの影響が、光子生成率のそのような変化を引き起こし得る。単一分子は、時点ｔに位置ｒ’から動き始め、時間間隔Δｔの間に他の位置まで行くことがある。
空間レーザ強度は変化するので、この拡散過程は、例えば、著しく非一定の光子生成率と、マンデル公式の適用不能（break down）をもたらし得る。そのような場合、マンデルの公式の中のポアソン分布は、より一般的な分布ｐ（ｎ、r’）によって式（２１）のように置き換えられなければならない。
【００６２】
【数１６】
【００６３】
分布ｐ（ｎ、r’）の計算は一般に、理論的課題である。分子の拡散運動を考慮するため、分布ｐ（ｎ、r’）は、形式的に式（２２）のように書くことができる。
【００６４】
【数１７】
【００６５】
遅い拡散の極限Ｄ→０においては、従来のマンデル公式は、式（１８）により得られる。この例は、上で導入された単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）の概念を、どのようにしたら複雑な測定条件に容易に拡張できるかを示している。しかし、Ｐ１（ｎ）及びＶｅｆｆは、理論的考察によって獲得可能でない場合、実験的に決定できることに留意されたい。
【００６６】
【数１８】
【００６７】
単一粒子確率分布Ｐ１（ｎ）から開始して、Ｐ１（ｎ）と、測定された分布関数ｐ（ｎ）の間の関係は、以下のようにして得られる。
【００６８】
現実の物理的状況では、平均数の〈ｍ〉＝ｃＶｅｆｆ個の粒子が、同時に信号に寄与する。マルコフ過程の理論を使用して、所与の濃度ｃについての確率分布ｐ（ｎ，ｃ）は、ｍ個の粒子すべての寄与を合計することによって、式（２４）によって決定される。
【００６９】
【数１９】
【００７０】
一方、ｐ（ｎ，ｃ）は、次の漸化式（２５）により計算することができる。
【００７１】
【数２０】
【００７２】
背景雑音を無視すると、粒子の濃度は、計数率をゼロにする確率によって、式（２６）で完全に決定される。
【００７３】
【数２１】
【００７４】
背景雑音を考慮する場合、粒子の濃度ｃは、計数率をゼロにする確率と、雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅによって、式（２７）のように決定される。
【００７５】
【数２２】
【００７６】
粒子の平均数〈ｍ〉は、計数率をゼロにする確率によって、式（２８）のように決定される。
【００７７】
【数２３】
【００７８】
雑音寄与を考慮する場合、粒子の平均数〈ｍ〉は、式（２９）のように決定される。
【００７９】
【数２４】
【００８０】
単一粒子確率分布関数Ｐ１（ｎ）は、次の漸化式（３０）で計算することができる。
【００８１】
【数２５】
【００８２】
分布ｐ（ｎ，ｃ）は、付加的な背景信号（例えばハードウェアのランダム雑音）を考慮するために、式（３１）のように、ポアソン分布Ｐｏｉ（ｎ，〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ）とのコンボリューションを行わなければならないことがある。
【００８３】
【数２６】
【００８４】
上記の理論的考察によれば、蛍光粒子（例えば分子）を含む試料は、所与の実験セットアップについて、濃度ｃ、輝度関数μ（ｒ’）、有効体積Ｖｅｆｆ、及び単一粒子分布Ｐ１（ｎ）によって特徴付けられる。ほとんどの実験セットアップにおいて、雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅは無視することができないので、それも同様に考察しなければならない。ＦＩＤＡ及びＰＣＨアルゴリズムにおいて説明される規約に従って、これらのパラメータは、例えばマルカード−レーベンバーグ・アルゴリズム（Marquard−Levenberg algorithm）などの非線形マルチパラメータ・フィット手順、又はこの作業に適した他の標準的な数値フィット法によって決定することができる。したがって、輝度関数μ（ｒ’）は、多くの調整可能パラメータを有する解析関数によって近似されなければならない。
μ（ｒ’）の解析形式は、上記の例のようなガウス関数、いくつかのガウス関数の収縮、又は他の任意の適切な形状関数として選択することができる。
【００８５】
濃度ｃ及び雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅばかりでなく、μ（ｒ’）のすべての調整可能パラメータも、測定された分布ｐ（ｎ）に対する理論的モデルの非線形フィットによって決定されなければならない。有効体積Ｖｅｆｆ及び単一粒子分布Ｐ１（ｎ）は、上述されたようにμ（ｒ’）を積分することによって直接導かれる。
【００８６】
非線形フィット手順の代替手順は、の調整可能パラメータ、濃度ｃ、及び雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅの値の任意の組について予想されるモーメントの事前計算リストを利用するモーメント法である。そのようなリストは、パラメータの適切な範囲について事前に計算して保存しておくことができるので、これは、オンライン・アプリケーションのための最高速の可能な手順である。分布ｐ（ｎ）のモーメントは、式（３２）で定義される。
【００８７】
【数２７】
【００８８】
ａｉ、ｉ＝１，２，…，ｋが、決定されるｋ個のパラメータを表すとする。パラメータａｉの値の適切な範囲内で、予想モーメントνｉ、ｉ＝１，２，…，ｌが計算できる。パラメータ値ａｉ、ｉ＝１，２，…，ｋのすべての可能な組についてのｌ個の１次モーメントνの事前計算は、写像
（ａ１，ａ２，…，ａｋ）→（ν１，ν２，…，νｌ）
をもたらす。
【００８９】
離散パラメータ値のグリッドは、計算労力を低減するが、このグリッド上にないパラメータ値の予想モーメントは、例えばスプライン外挿によって外挿されなければならない。モーメントの数ｌは、可能な限り小さいが、上記の写像が全単射関数（bijective function）となることを保証するように十分大きく選択される。その場合、写像は、
（ν１，ν２，…，νｌ）→（ａ１，ａ２，…，ａｋ）
に逆転することができ、これは、測定されたモーメントμｉ, ｉ＝１，２，…，lの任意の組に対する要求パラメータを与える。
【００９０】
単一粒子確率分布関数のモーメントは、次の漸化式（３３）により計算される。
【００９１】
【数２８】
【００９２】
雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅは、蛍光粒子を含まない試料の媒液を使用することによって、実験セットアップについて、直接計算することができる。試料の媒液は、同一又は類似の（光学）特性を有する液によって置き換えることもできる。事前に〈ｎ〉ｎｏｉｓｅを決定することで、このパラメータは、非線形フィット手順及びモーメント法において一定に維持することができる。このようにして、これらの手順において要求されるパラメータの数は、１だけ減らされる。
【００９３】
上記の考察は、単一化学種の粒子の試料に関係する。
【００９４】
本発明は、Ｎ個の異なる化学種の粒子（粒子化学種の混合物）を含む試料にも容易に適用される。
【００９５】
粒子化学種の混合物の場合、各化学種の濃度の決定は、多段階手順で行われる。最初に、有効体積Ｖｅｆｆ（ｓ）及び単一粒子分布Ｐ１（ｓ）（ｎ）が、混合物及び所与の実験セットアップ内に存在する各化学種ｓについて測定されなければならない。これは、上述の手順の１つによって行われる。
【００９６】
決定された特性Ｖｅｆｆ（ｓ）、Ｐ１（ｓ）（ｎ）に基づいて、予想される全分布ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）は、単一化学種寄与ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）、ｓ＝１，２，…，Ｎのコンボリューションによって、式（３４）のように表される。
【００９７】
【数２９】
【００９８】
決定されるパラメータは、濃度ｃｓ、ｓ＝１，２，…，Ｎと、雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅである。
【００９９】
要求されるパラメータは、理論的モデルに対する測定データの非線形フィットを使用することによって決定することができる。上述された非線形フィット手順と同様に、標準的な数値技法が適用できる。場合によっては、母関数手順は、ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）の計算を高速化することができる。
【０１００】
非線形フィッティングの代替として、パラメータは、上述されたモーメント法によって決定することができる。この手順は、ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）のモーメントが、ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）、ｓ＝１，２，…，Ｎのモーメントの積として表現できるという事実によって技法的に簡単化される。
【０１０１】
Ｖｅｆｆ及びＰ１（ｎ）の測定は、分子の輝度関数についてのモデル又は知識がなくても可能である。これらの特性は、測定された分布ｐ（ｎ，ｃ）の解析によって直接決定することができる。測定された分布は雑音のあるデータであるので、誤差伝播の影響が、Ｐ１（ｎ）を取り出すための数値的な方法を不安定化することがあり得る。
【０１０２】
この理由で、Ｐ１（ｎ）のグローバル表現が有利である。強力な方法は、式（３５）の形式のいわゆる離散ガレルキン近似（discrete Galerkin approximation）である。
【０１０３】
【数３０】
【０１０４】
パラメータｐ及びλは、Ｐ１（ｎ）の１次モーメントによって決定される。そのような誤差制御ガレルキン射影（error controlled Galerkin projection）は、数値数学においてよく研究されている方法であり、通常は高分子化学に適用される［非特許文献１３〜１９参照］。
この近似のパラメータは、フィッティング手順（上述の非線形マルチパラメータ・フィット手順を参照）又は上述のモーメント法に類似したモーメント法によって、ｐ（ｎ，ｃ）から取得することができる。
【０１０５】
これに関連した有用な特性は、式（３６）により定義されるｎ個の光子を生成する平均分子輝度である。
【０１０６】
【数３１】
【０１０７】
〈μ〉ｎは、有効光子生成率の観点から空間輝度μ（ｒ’）を特徴付け、式（３７）のように確率分布Ｐ１（ｎ）に結び付けられる。
【０１０８】
【数３２】
【０１０９】
一般に、分子輝度は、計数率ｎが低い場合は、〈μ〉ｎ≒ｎのように線形に増大し、励起光焦点の中心において、１つの分子の最大分子輝度にある定数になる。この特性は、〈μ〉ｎ＝定数という一定の分布を与えるランダム雑音信号から単一分子信号をよく区別できるようにする。
【０１１０】
本発明の上記及び他の目的、態様、及び利点は、ポリスチレン微小球懸濁液系列（polystyrene micro spheres suspension series）、色素ローダミン６Ｇ希釈系列（dye Rhodamine 6G dilution series）、ならびにポリスチレン微小球及びローダミン６Ｇ色素の混合物が解析される以下の３つの実施例に基づいて、より良く理解されよう。５０μＷの強度で５３２ｎｍ励起光を放出する光源、組み込み高感度光電子増倍管、ならびにデジタル相関器を備える従来技術の蛍光分光法ユニットが、実験データを収集するために利用された。使用された蛍光分光法ユニットは、３０ｎｓｅｃの反応時間を有する。データ収集は、２つの連続する光子記録の間のクロック・パルスをカウントすることによって達成された。そのような収集データに基づいて、いくつかの光強度トレースが、異なるビン幅Δｔについて計算できる。
【実施例１】
【０１１１】
＜微小球懸濁液系列＞
第１の実施例として、蛍光ポリスチレン微小球懸濁液系列の解析が実行された。
図１は、モル濃度がｃＭ≒1.9Ｅ−10Mol/Lのポリスチレン微小球（小球）を含む試料について3.2secにわたって記録された、典型的な光強度トレースを示している。
図２は、（図１に示される3.2secあたり100トレースにわたって平均された）自己相関カーブを示している。
図３は、ビン幅Δｔ＝0.1msecについて、対応する光子カウント分布ｐ（ｎ，ｃ）を示している。
図４は、様々な試料について、本発明による方法によって取得された分子の数（実線）、及び蛍光相関分光法（ＦＣＳ：fluorescence correlation spectroscopy）によって取得された分子の数（破線）を示している。参考として、理論的な下降勾配（線で結ばれていない四角）も示されている。
【０１１２】
図１は、モル濃度がｃＭ≒1.9Ｅ−10Mol/Lであることが知られている0.014μｍの小球を含む試料について記録された、典型的な光強度トレースを示している。ビン時間は、１msecに調整された。強度ピークは、共焦点ＦＣＳ体積（confocal FCS volume）を通過する分子の移動を示している。
【０１１３】
図２は、（3.2secあたり100ループにわたって平均された）対応する自己相関カーブを示している。フィットは、τ＝1.74msecの拡散時間と、共焦点ＦＣＳ体積におけるｎ＝0.1529の小球をもたらす。いくつかのＦＣＳ測定にわたって平均された拡散時間は、τ＝1.91±0.33msecを与える。この拡散時間は、小球が共焦点ＦＣＳ体積を通過するのに必要とする時間を決定する。製造業者の情報によれば、利用された蛍光分光法ユニットは、ＶＦＣＳ≒１フェムト・リットル（ｆＬ）のＦＣＳ体積を有する。
【０１１４】
図３は、ビン幅Δｔ＝0.1msecについて、対応する光子カウント分布ｐ（ｎ，ｃ）を示している。確率ｐ（ｎ＝０，ｃ）＝0.79976は、図１のすべての光子カウントの約８０％がゼロであることを意味する。純水を用いた測定は、〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ＝0.0230642の背景雑音レベルを与える。
【０１１５】
本発明によれば、有効体積Ｖｅｆｆ内の分子の平均数〈ｍ〉は、式２４により、
ｃＶｅｆｆ＝〈ｍ〉＝−ｌｎ（ｐ（ｎ＝０，ｃ））−〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ＝0.20038
で表される。
【０１１６】
結果として、本発明による有効体積Ｖｅｆｆは、
Ｖｅｆｆ＝〈ｍ〉／（ｃＭＮＡ）≒1.75ｆＬ
で表され、（ｃＭ＝1.9E−10Mol／L、ＮＡ＝6.022E23）の大きさのオーダとなることが分かり、したがって、共焦点ＦＣＳ体積より僅かに大きい。
データは示されていないが、Ｖｅｆｆの値は、ビン幅Δｔ又は励起光強度を減少（増大）させることによって、減少（増大）させ得ることに留意されたい。一般に、Ｖｅｆｆは、分子パラメータばかりでなく、装置パラメータにも依存する。
【０１１７】
図４には、様々な試料について、標準的なＦＣＳ解析によって取得された分子の数（破線）が示されている。各試料について、２つの測定が実行され、各測定は、それぞれ黒丸（測定Ｉ）及び星印（測定ＩＩ）によって示されている。一連の測定は、所定のｃＭ＝2.44Ｅ−８Mol/Lの初期溶液で開始する（段階１）。
【０１１８】
この初期溶液は、「混合分割（mix and split）」法によって１２段階で希釈される。５０μＬの試料が、５０μＬの水で希釈され、結果の１００μＬの半分が、測定用に利用され、残りの半分は、次の「混合分割」段階のための試料として使われる。理想的には、微小球の濃度は、各希釈段階によって２分の１ずつ低下する。段階１３において、ｃＭ＝3E−12Mol/Lとなる微小球の最低濃度に達する。図４の対数目盛りでは、標準的なＦＣＳによって取得される小球の数は、線で結ばれていない四角によって示されるように、線形に低下する。
【０１１９】
この理論的挙動からの小さな逸脱は、一連の「混合分割」段階の間の小体積の取り扱いにおける不確実性からもたらされ得る。しかし、標準的なＦＣＳによって行われた同じ試料の２つの測定の結果が、１０％から５０％の間で異なっていることは明白である。このばらつきは、決定された小球の数、及びＦＣＳによって取得された濃度の同様な不確実性についてのかなり大きな統計誤差を表す。しかし、濃度が低い場合、ＦＣＳの挙動はより激しい。ｃＭ＝3.8E−10Mより低い濃度の場合、ＦＣＳ法は、正確な濃度を決定することができず、誤った高い値を与える。希釈段階１３における試料の場合、ＦＣＳは、２桁分高い値を与える。上述されたＦＣＳのこの挙動は、よく知られており、特に濃度が低い場合に、ＦＣＳ法の深刻な限界を提示する。
【０１２０】
以下では、本発明の方法が、従来技術のＦＣＳ法と比較して、蛍光粒子の数についてはるかに正確な決定をもたらすことが理解されよう。本発明によれば、蛍光粒子の濃度、すなわちＶｅｆｆ内の粒子の数〈ｍ〉は、ｐ（ｎ＝０，ｃ）によって決定することができる（上述を参照）。ｐ（ｎ＝０，ｃ）は、低濃度状況において高い統計精度で測定できることに留意されたい。対応する分子の数が、図４に示されている（実線）。
【０１２１】
本発明の方法は、ＦＣＳ法によって使用されたのと同じ収集データ記録に適用された。したがって、これらの結果を本発明の方法によって取得するために、追加の測定は実行されなかった。ＦＣＳによって得られた値と比較すると、〈ｍ〉の統計的ばらつきははるかに小さい（濃度が約ｃＭ＝5E−10Mol/Lの場合の１％から最低濃度ｃＭ＝3E−12Mの場合の１０％の間）。より重要なこととして、測定された濃度は、正確な理論的線形低下勾配に従っており、ｃＭ＝3E−12Mの濃度を下回っても、検出限界は見られない。
【実施例２】
【０１２２】
＜色素ローダミン６Ｇの希釈系列＞
同様の結果が、（上記の実施例１と同じ条件で）色素ローダミン６Ｇの希釈系列についても得られた。ここでは、ＦＣＳの検出限界が、装置の感度によって決定され、それはｃＭ＝３Ｅ−９Ｍｏｌ／Ｌのオーダにある。データは示されていないが、本発明は、ＦＣＳの検出限界を下回っても、２％の精度で濃度の測定を可能にすることが分かった。ローダミン６Ｇの場合、有効体積の値は、蛍光分光法ユニットの所与の装置パラメータについて、Ｖｅｆｆ≒０．２ｆＬに減少する。
【０１２３】
蛍光粒子によって生成される光子カウント信号の統計的有意性を高めるには、かなり大きなビン幅を選択するのが有利なことがある。標準的な解析法及びそれらの後継と比較して、本発明は、優れた簡潔性及び精度で、非常に低い濃度の決定を可能にする。
【実施例３】
【０１２４】
＜小球とローダミン６Ｇの混合物＞
小球と色素ローダミン６Ｇ（Ｒｈ６Ｇ）を含む試料の測定は、有効体積における粒子の平均数〈ｍ〉＝2.2を与える（上記の実験条件）。この値は、〈ｍ〉ＦＣＳ＝2.35のＦＣＳ値に類似している。しかし、パラメータが２つのＦＣＳは、各化学種の濃度を別々に決定することができない。本発明によれば、小球及びＲｈ６Ｇの濃度は、様々な方法によって決定することができる。１つの方法は、モーメント法を利用するものである。
【０１２５】
小球及びＲｈ６Ｇについての単一分子分布の１次モーメントは、
ν１（Ｐ１（ｂｅａｄｓ））＝1.55
ν１（Ｐ１（Ｒｈ６Ｇ））＝1.06
で表され、上記の例１及び例２において説明された測定からそれぞれ計算される。
したがって、測定された分布の１次モーメントν１（ｐｔｏｔ）と単一分子分布のモーメントν１（Ｐ１）の間の関係
ν１（ｐｔｏｔ）＝〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ＋〈ｍ〉ν１（Ｐ１）
が適用される。
ν１（Ｐ１（ｂｅａｄｓ））及びν１（Ｐ１（Ｒｈ６Ｇ））の値は、各化学種をその実際の濃度とは独立に特徴付けることに留意されたい。
混合物について取得された単一分子信号の１次モーメントは、
ν１（Ｐ１（ｂｅａｄｓ＋Ｒｈ６Ｇ））＝1.30
で表され、小球のモーメントとも、色素のモーメントともフィットしない。
ν１（Ｐ１（ｂｅａｄｓ＋Ｒｈ６Ｇ））を計算するため、式（３８）が適用される。
【０１２６】
【数３３】
【０１２７】
混合物における信号に対する小球寄与の部分ｘは、
ｘ：＝〈ｍ〉（ｂｅａｄｓ）／〈ｍ〉（ｂｅａｄｓ）＋〈ｍ〉（Ｒｈ６Ｇ）
は、式（３９）に示す関係によって容易に決定される。
【０１２８】
【数３４】
【０１２９】
〈ｍ〉ｂｅａｄｓ＝Ｘ*〈ｍ〉＝0.95
〈ｍ〉Ｒｈ６Ｇ＝（１−Ｘ）*〈ｍ〉＝1.25
が得られる。
結果の濃度（単位：ｍｏｌ／Ｌ）は、
ｃＭ（beads）＝〈ｍ〉ｂｅａｄｓ／（Ｖｅｆｆ（beads）＊ＮＡ）≒1E−9Mol/L
ｃＭ（Rh6G）＝〈ｍ〉Ｒｈ６Ｇ／（Ｖｅｆｆ（Rh6G）＊ＮＡ）≒1E−8Mol／L
である。
【０１３０】
データは示されていないが、この試料の希釈系列について測定された濃度は、両方の化学種について正確な濃度低下を再現する。
【０１３１】
比ｘを決定するための代替方法は、小球、Ｒｈ６Ｇ、及び混合物それぞれの単一分子分布の第１の非ゼロ成分Ｐ１（ｎ＝１）の比較である。
測定されたｐｔｏｔ（ｎ＝１）から単一分子分布Ｐ１（１）を取得するために、式（４０）の関係が適用された。
【０１３２】
【数３５】
【０１３３】
また、比ｘは、式（４１）で決定され、ｘ≒0.36±0.15の値をもたらす。上述の方法はどちらも、純粋溶液から混合物を区別すること、及び混合物内の各化学種の濃度のオーダを決定することを可能にする。
【０１３４】
【数３６】
【０１３５】
上述の方法及び実施例は、粒子を含む試料の固有特性を決定するために、固定ビン時間Δｔに適用される。これらの特性は、所与のビン時間にわたって記録された光強度トレースから取り出すことができる分子化学種の光物理的属性に依存する。したがって、ビン幅Δｔの選択は、上述された方法によって取得される結果に影響を及ぼす。
【０１３６】
本発明は、適切又は最適なビン幅を決定するため、及び１つの化学種の粒子又はいくつかの異なる化学種の粒子の混合物を含む試料の固有特性Ｅ１，…ＥＬをΔｔの関数として決定するための、さらなる方法に拡張される。
【０１３７】
ビン幅Δｔに対する方法の依存性は、分子化学種を、例えば拡散時間など、その動的特性によって特徴付けるために利用することができる。
【０１３８】
拡散時間の測定のための標準的な方法は、光トレースの時間挙動を利用するが、化学種の異なる光物理的属性は無視する、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）である。結果として、異なる輝度の分子化学種が試料中に存在する場合、ＦＣＳ法の適用は困難になる［非特許文献２０参照］。ＰＣＨ手法のパラメータに対するビン時間の影響［非特許文献７参照］及びＦＩＤＡのパラメータに対するビン時間の影響［非特許文献３参照］が文献において説明されている。
これらの手法は、時間依存光子計数多重ヒストグラム（ＰＣＭＨ：photon counting multiple histograms）及び蛍光強度多重分布解析（ＦＩＭＤＡ：fluorescence intensity multiple distribution analysis）とそれぞれ呼ばれる。ＰＣＭＨとＦＩＭＤＡは、分子化学種の拡散時間及び分子輝度を同時に測定するために適用された。混合物から濃度を決定するため、及びタンパク質−リガンド相互作用（protein-ligand interaction）の結合定数を決定するための、ＦＩＭＤＡの適用が示された。
【０１３９】
ＦＩＭＤＡの適用及びＰＣＭＨの適用は、いくつかの難点を有する。
１．各ビン幅についての分子輝度の決定は、複雑で時間を要する数値的に非安定な非線形フィッティング手順を必要とする。
２．どちらの方法も、ビン幅に対するモデル・パラメータの依存性を記述するために、複雑な式に依存する。
３．さらに、これらの式は、保存されないその場限りの仮定に基づいている。
【０１４０】
本発明によるさらなる方法は、本発明による上記の第１の方法によって説明されたような粒子を含む試料の固有特性を、一連の異なる時間幅Δｔについて決定することに関する。本明細書では、固定ビン幅について決定される固有特性は、ビン幅Δｔの関数として理解される。
【０１４１】
したがって、本発明のさらなる方法は、以下のステップ、すなわち、
１）式４２であらわされる観測時間Ｔの引き続く所定の時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ）（ｉ＝１，…，Ｎ）において記録される光子イベントの数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）本発明による上述の第１の方法の他のステップを実行し、また更なるステップとして、
４）異なる時間間隔Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）についてステップ１）からステップ３）をＫ回繰り返し、これらのステップの各組によって同じ固有特性Ｅ１，…ＥＬを決定し、
５）Δｔｋに対する特性Ｅ１，…ＥＬの依存性を決定し、
６）ステップ５）によって測定された依存性から、適切もしくは最適なΔｔ、又は粒子の他の固有特性を決定するようにした。
【０１４２】
【数３７】
【０１４３】
ビン時間Δｔの関数としての固有特性の知識は、
１．上述された本発明による第１の方法のビン時間について１つの適切又は最適な値を選択するため、
２．分子化学種を特徴付けるため、
３．測定された依存性に所与の解析関数をフィッティングすることによって別の固有特性を取得するため、
４．混合物中の分子化学種を同定し、それらの濃度を計算するため、に利用することができる。
【０１４４】
時間間隔（ビン幅）Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）は、１０−６秒から数秒の間で選択することができる。
【０１４５】
固有特性の一例は、ビン幅が短いと高く、ビン幅が長くなると低下する（実施例４を参照）、単一分子の有効輝度である。輝度のこの低下は、レーザ焦点から遠ざかる可視分子の拡散から生じる。したがって、輝度の最大レベル及び輝度の勾配は、分子化学種を特徴付ける。
【０１４６】
個々のビン幅は、例えば、ｋ＝０，…，７２として、Δｔｋ＝０．８ｋｓｅｃのように、対数目盛り上で等距離になるように選択することができる。
【０１４７】
ビン幅に対する最大輝度μｍａｘの依存性は、特定の化学種の分子の輝度及びサイズに特徴的な、実験的なダイイング・アウト関数（dying-out function）をもたらす。測定された依存性を用いたそのような関数の計算は、高速で（数秒以内に）実行することができる。原理的に、ビン幅Δｔに対するそのような依存性は、本発明の第１の方法によって上で説明された、単一化学種の粒子のすべての特性について決定することができる。
【０１４８】
所与の解析関数は、標準的なフィッティング手順によって、ビン幅Δｔに対する固有特性の測定された依存性にフィットさせることができる。
【０１４９】
固有特性は、測定される試料中の分子の特定の化学種とすることができる。
【０１５０】
さらに、固有特性は、試料中のいくつかの化学種の分子の、混合物内における部分濃度とすることもできる。
【０１５１】
測定された依存性は、分子の特定の化学種を同定するため、又は試料中の分子の部分濃度を特定するために、すでに測定された依存性又は理論的関数と比較することができる。
【０１５２】
ビン幅Δｔに対する固有特性の測定された依存性は、試料中の分子の部分濃度のために、分子の特定の化学種を決定するための非線形フィット手順によって、すでに測定された依存性又は理論的関数の重ね合わせと一致させることができる。
【０１５３】
本発明による方法の特定の応用では、分布関数ｐ（ｎｋ，Δｔｋ）（ｋ＝１，…，Ｋ）が測定され、最大輝度μｍａｘ（Δｔｋ）が、適切なフィッティング手順を用いて、ｐ（ｕｋ，Δｔｋ）から固有特性として決定される。
【０１５４】
上記の方法は、時間極限Δｔ→０におけるμｍａｘ（Δｔ）、拡散運動、拡散時間τＤ、及び／又は装置の構造パラメータＳＰを、適切なフィッティング関数によって、μｍａｘ（Δｔ）から決定することをさらに含むことができる。
【０１５５】
さらなるステップとして、試料中の特定の化学種の粒子のフェード・アウト時間（fade-out time）τμ及び／又は分率が、μｍａｘ（Δｔ）から決定できる。
【０１５６】
本発明による方法のさらなる実施例では、いくつかの化学種の粒子を含む試料が測定でき、その場合、μｍａｘ（Δｔ）が決定され、試料中の化学種ｓのモル分率Ｘｓは、先に測定又は他の方法で決定されたμｍａｘ，ｓ（Δｔ）によって式（４３）で決定される。
【０１５７】
【数３８】
【０１５８】
代替として、μｍａｘ，ｓ（Δｔ）が決定でき、試料中の化学種のモル分率Ｘｓが、式（４４）を境界条件とするパラメータ０≦Ｘｓ≦１（ｓ＝１，…，Ｓ）を有する非線形フィットによって決定される。
【０１５９】
【数３９】
【０１６０】
以下のさらなる実施例４及び５では、ビン幅Δｔの値に対する特性の依存性が説明される。
【実施例４】
【０１６１】
固有特性のための説明的な一例は、式（４５）によって計算される輝度値μｍａｘである。
【０１６２】
【数４０】
【０１６３】
上式において、高輝度、すなわちν１（ｐ）≫〈ｎ〉ｎｏｉｓｅである場合、雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅは、無視することができる。上記の式によって計算されるこの輝度値μｍａｘは、ガウス分布μ（ｒ’）：＝μｍａｘexp（−２ｒ２／ａ２）を示す輝度関数μ（ｒ’）の最大値であるが、同様に他の分布タイプのための固有輝度値でもある。
モル濃度がｃ＝56E−10Mである色素ATTO 532（ATTO TEC、ジーゲン、ドイツ）を含む試料が、ConSense検出システム（FluIT Biosystems、ザンクト・アウグステン、ドイツ、http：//www.fluit-biosystems.de）において測定された。
蛍光光強度のトレースが、３分間にわたって記録され、Virtual Labソフトウェア（FluIT Biosystems）によって解析された。確率分布ｐ（ｎ，ｃ）が、１ｓから数μｓ（10−６ｓ）の範囲の様々なビン時間について構成された。具体的には、Δｔｎ＝Δｔ０0.8ｎ、ｎ＝１，２，３，…，７２、Δｔ０＝１ｓという別個のビン時間を選択する。各ビン時間及び対応する確率分布ｐ（ｎ，ｃ）について、輝度値μｍａｘが、ｐ（ｎ，ｃ）の１次及び２次モーメントを介して計算された（上記の式を参照）。μｍａｘの取得された値は、適用されたビン時間に依存し、図５においては、μｍａｘが、Δｔに対してプロットされている。結果として、固有特性μｍａｘは、Δｔの関数として理解され、この関数は、以下ではμｍａｘ（Δｔ）によって表される。
【０１６４】
最大輝度μｍａｘは、レーザ焦点の中心における単一分子の輝度として解釈することができる。拡散によって、中心に見出された単一分子は、中心から遠ざかり、（カウント毎秒ｃｐｓを単位とする）その輝度は減少する。結果として、ビン時間Δｔが長くなると、測定される有効最大輝度μｍａｘ（Δｔ）は低下する。ビン時間が短い場合、有効最大輝度は大きくなる。
【０１６５】
化学種の（有効）輝度の値は、ビン幅Δｔに依存する。図５においてプロットされたカーブは、式（４６）で表される解析関数にフィットすることができる。
【０１６６】
【数４１】
【０１６７】
パラメータμｍａｘ（Δｔ＝０）、τμ、及びＳＰは、短いビン時間の極限における最大輝度、フェード・アウト時間、及び光学セットアップの構造パラメータをそれぞれ表す。フィットは、輝度値μｍａｘ（Δｔ＝０）＝15.1kcps、フェード・アウト時間τμ＝0.731ms、及び構造パラメータ２を与える。
【０１６８】
輝度値μｍａｘ（Δｔ＝０）及びフェード・アウト時間τμは、所与の光学セットアップにおける分子化学種についての固有特性である。輝度値μｍａｘ（Δｔ＝０）は、分子の光物理的特性と、最大局所レーザ光強度に依存する。フェード・アウト時間τμは、分子の拡散定数、すなわち分子の流体力学的半径（hydro-dynamical radius）と、共焦点検出体積（confocal detection volume）に比例する。
【０１６９】
光学セットアップの影響を説明するため、モル濃度が3.0・10−１１Ｍの色素ATTOを含む試料が、２回測定された。１回目は、背景雑音を低減するために、直径100μｍのピンホールが利用され、試料の蛍光光強度のトレースが、ConSense検出システムを用いて、３分間にわたって記録された。２回目のセットアップでは、同一の試料が、直径75μｍのピンホールを代わりに用いて、30ｓにわたって測定された。蛍光光強度のトレースはどちらも、上述されたように解析され、両セットアップについて取得された輝度関数が、図６に示されている。ピンホール直径の100μｍから75μｍへの直径の減少は、フェード・アウト時間τμの0.567ｍｓから0.343ｍｓへの低下ももたらす。より小さなピンホール直径は、より小さな検出体積寸法をもたらし、したがって、フェード・アウト時間の減少をもたらす。
【実施例５】
【０１７０】
試料中の異なる分子化学種を区別するため、ビン時間に対する固有特性の依存性が利用できる。第１のステップにおいて、固有特性と、ビン時間に対するそれらの依存性が、すべての可能な分子化学種についてプローブ内で測定されなければならない。典型的な状況が、図７及び図８（Ｔａｂｌｅ １）に略述されている。
【０１７１】
輝度関数μｍａｘ（Δｔ）が、蛍光色素について測定され、パラメータμｍａｘ（Δｔ＝０）及びτμが、実施例４において説明されたような非線形フィットによって決定された。抗体が、この色素によって標識付けされた。抗体は色素よりはるかに大きいので、標識付けされた抗体について測定されたフェード・アウト時間τμ＝２５５μｓは、純粋色素について測定されたフェード・アウト時間τμ＝３３μｓよりはるかに長い。標識付けされた抗体は、フェード・アウト時間ばかりでなく、より高い輝度値によっても色素から区別可能である。大抵、各抗体分子は２つの色素分子によって標識付けられるが、このことは、抗体の高い輝度値μｍａｘ（Δｔ＝０）によって示される。
【０１７２】
他方、抗体は、タンパク質に結合することができる。抗体＋タンパク質の複合体を特徴付けるため、タンパク質が、試料に過剰に与えられた。タンパク質分子は標識付けされておらず、蛍光抗体に結合されていない場合は暗いことに留意されたい。より長いフェード・アウト時間τμ＝６６３μｓは、複合体の増大した直径に対応する。タンパク質の結合は、抗体分子の輝度値を減少させ、それは、タンパク質が２つの色素分子の一方に取って代わったことを示す。
【０１７３】
タンパク質は、重合体に結合することができる。溶液に重合体を過剰に追加することで、抗体＋タンパク質＋重合体の複合体（及び暗い分子）だけを含む試料がもたらされる。その長いフェード・アウト時間τμ＝１６１１μｓによって示されるように、この複合体は、かなり大きい。輝度値の減少は、電子三重項状態における分子のかなり高いポピュレーションによって説明することができる。三重項存続期間及びポピュレーションは、非特許文献２１において説明されるように、輝度に対する三重項状態の影響をモデル化し、非線形フィッティング法を適用することによって、取得することができる。
【０１７４】
１つのビン時間において異なる複合体を区別するために、適切又は最適なビン時間Δｔを選択することができる。したがって、各化学種の輝度値が互いによく分離されるビン時間が、選択されなければならない。すべての成分が異なる輝度値を有するΔＴ１による一例が、図７に示されている。図７を見ると、悪い選択はΔＴ２であり、その理由は、このビン時間では、抗体＋タンパク質＋重合体の複合体及び色素が同じ輝度を有するからである。
【０１７５】
抗体とタンパク質と重合体の混合物では、図８（Ｔａｂｌｅ １）に列挙された複合体が出現し得る。混合物内のこれらの複合体の各々のモル濃度を決定するために、ビン時間に対する単一分子の固有特性の依存性を利用することができる。標準的な希釈系列による結合定数の測定にとって、これは特に重要である。所定の個別輝度関数μｍａｘ，ｓ（Δｔ）、ｓ＝１，２，…，Ｓを有するＳ個の異なる化学種の混合物を含む試料の輝度カーブは式（４７）で与えられる。
【０１７６】
【数４２】
【０１７７】
パラメータＸｓ、ｓ＝１，２，…，Ｓは、非線形フィットにより決定され、式（４８）のように成分ｓの相対モル分率を表す。
【０１７８】
【数４３】
【０１７９】
本例では、成分の数は４である（図８（Ｔａｂｌｅ １）参照）。非線形フィッティング・アルゴリズムによって対応するモル分率Ｘｓ、ｓ＝１，２，３，４を取得するために、図７に示された４つの輝度関数が適用されなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観測体積内で光子を放出、散乱、及び／又は反射する少なくとも１つの化学種の粒子を含む試料の固有特性を決定する方法であって、
１）式（４）で表される観測時間Ｔの引き続く時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ）（ｉ＝１，２，３…）において記録される光子イベントの数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）前記分布関数ｐ（ｎ）と、前記濃度ｃと、思考実験で予想される予め設定された時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎについての単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）と、有効体積Ｖｅｆｆ：＝〈ｍ〉／ｃ（〈ｍ〉は各計数率に対する粒子寄与の平均数）との間の理論的関係を使用して、Ｐ１（ｎ）、Ｖｅｆｆ、濃度ｃ、及び／又は、これらの特性値を測定されたｐ（ｎ）にフィッティングすることによりＶｅｆｆ及び／又はＰ１（ｎ）から決定される他の固有特性値を決定する
ことを特徴とする粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２】
【請求項２】
請求項１記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、前記単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）が、マルコフ過程の理論に基づいて、式（６）によって与えられ、
μ（ｒ’）が位置ｒ’における単一粒子による光子イベントの平均値によって定義される粒子の輝度関数を表し、ポアソン分布は、Ｐｏｉ（ｎ，μ）＝exp（−μ）μｎ／ｎ！である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数４】
【請求項３】
請求項１又は２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、前記輝度関数μ（ｒ’）が、複数の位置ｒ’についてμを測定し、これらの位置の間ではμを補間することによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、前記輝度関数μ（ｒ’）が、分子蛍光分光法の理論に基づいたモデルと、空間レーザ光強度の所与のモデルによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
Ｐ１（ｎ）が、前記輝度関数μ（ｒ’）によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
Ｖｅｆｆが、前記輝度関数μ（ｒ’）によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項７】
請求項１又は２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）が、Ｐ１（ｎ）又はＶｅｆｆによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項８】
請求項７記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
Ｐ１（ｎ）又はＶｅｆｆが、直接測定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
同じ化学種の粒子は、蛍光性であるか、又は蛍光標識を付され、レーザ・ビームによって励起される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項１０】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）の最大値が、前記分布関数の１次モーメントによって、式（１２）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１０】
【請求項１１】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）の最大値が、前記分布関数の１次モーメントと、雑音寄与によって、式（４５）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数４０】
【請求項１２】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
輝度関数μ（ｒ’）が異なる輝度関数の重ね合わせによって式（１３）のようにモデル化される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１１】
【請求項１３】
請求項１２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
各輝度関数μｊ（ｒ’）が、所与の数のＭ個の特性パラメータμｊｋ（ｋ＝１，２，…，Ｍ）によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項１４】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）が、空間ガウス分布によって式（１５）のようにモデル化される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１３】
【請求項１５】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）がガウス分布の重ね合わせによって、式（２０）のようにモデル化される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１５】
【請求項１６】
請求項１３記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記特性パラメータμｊｋ（ｊ＝１，２，…，Ｋ；ｋ＝１，２，…，Ｍ）が、標準的なデコンボリューション法によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項１７】
請求項１３記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記特性パラメータμｊｋ（ｊ＝１，２，…，Ｋ；ｋ＝１，２，…，Ｍ）が、反復リチャードソン−ルーシ・デコンボリューション・アルゴリズムによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項１８】
請求項１記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）が式（２１）で与えられる粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１６】
【請求項１９】
請求項１〜１８いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
マルコフ過程の理論に基づいて、確率分布関数ｐ（ｎ，ｃ）と前記単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）の間の以下の理論的関係式（２４）が使用される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１９】
【請求項２０】
請求項１〜１９いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記確率分布関数ｐ（ｎ，ｃ）が次の漸化式（２５）により計算される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２０】
【請求項２１】
請求項１〜２０いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
粒子の前記濃度ｃが、前記計数率をゼロにする確率によって式（２６）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２１】
【請求項２２】
請求項１〜２１いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
粒子の前記濃度ｃが、前記計数率をゼロにする確率と、前記雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅによって式（２７）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２２】
【請求項２３】
請求項１〜２２いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
粒子の前記平均数〈ｍ〉が、前記計数率をゼロにする確率によって式（２８）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２３】
【請求項２４】
請求項１〜２２いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
粒子の前記平均数〈ｍ〉が、前記計数率をゼロにする確率ｐ（ｎ＝０，ｃ）と前記雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅによって式（２９）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２４】
【請求項２５】
請求項１〜２４いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記単一粒子確率分布関数Ｐ１（ｎ）が、次の漸化式（３０）により計算される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２５】
【請求項２６】
請求項１〜２５いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記分布関数ｐ（ｎ，ｃ）が、付加的な背景信号（例えばハードウェアのランダム雑音）を考慮するために、ポアソン分布Ｐｏｉ（ｎ，〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ）とのコンボリューションを通して式（３１）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２６】
【請求項２７】
請求項１〜２６いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
請求項１のステップ（３）による前記固有特性が、標準的な非線形マルチパラメータ・フィット手順によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項２８】
請求項１〜２６いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
請求項１のステップ（３）による前記固有特性が、標準的なモーメント法によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項２９】
請求項２８いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記単一粒子確率分布関数のモーメントが、漸化式（３３）により計算される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２８】
【請求項３０】
請求項２４，２６、２９いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅが、請求項１のステップ（３）において〈ｎ〉ｎｏｉｓｅを一定に維持するため、前記化学種の粒子を含まない試料の媒液を使用することによって、又は試料として同一もしくは類似の特性を有する液を使用することによって直接測定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３１】
観測体積内で光子を放出、散乱、及び／又は反射するＮ個の異なる化学種の粒子の混合物を含む試料の固有特性を決定する粒子含有試料の固有特性決定方法であって、単一化学種寄与ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）が、請求項１〜３０のいずれかに従って、前記混合物内に存在する各化学種ｓについての所定の有効体積Ｖｅｆｆ（Ｓ）及び単一粒子分布Ｐ１（Ｓ）（ｎ）ならびに所与の実験セットアップによって決定されることによって、前記混合物の全体的な分布関数ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）が、前記単一化学種寄与ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）、ｓ＝１，２，…，Ｎのコンボリューションによって、式（３４）で決定される、粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２９】
【請求項３２】
請求項３１記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記パラメータｃｓ、ｓ＝１，２，…，Ｎ及び前記雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅが、理論的モデルに対する前記所定のパラメータの非線形フィットを使用することによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３３】
請求項３１又は３２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）の計算が、母関数手順によって高速化される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３４】
請求項３１又は３２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）のモーメントが、ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）、ｓ＝１，２，…，Ｎのモーメントの積として表現されることによって、要求されるパラメータが、モーメント法によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３５】
観測体積内で光子を放出、散乱、及び／又は反射する少なくとも１つの化学種の粒子を含む試料の固有特性Ｅ１，…ＥＬを決定する粒子含有試料の固有特性決定方法であって、
１）式（４２）で表される観測時間Ｔの引き続く所定の時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ）（ｉ＝１，…，Ｎ）において記録される光子イベントの数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）前記所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）請求項１〜３４いずれか記載の他のステップを実行し、
さらなるステップとして、
４）異なる時間間隔Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）について前記ステップ１）からステップ３）をＫ回繰り返し、これらのステップの各組によって同じ固有特性Ｅ１，…ＥＬを決定し、
５）Δｔｋに対する前記特性Ｅ１，…ＥＬの依存性を決定し、
６）ステップ５）によって測定された前記依存性から、最適なΔｔ又は前記粒子の他の固有特性を決定する
ことを含む粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数３７】
【請求項３６】
請求項３５記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記時間間隔Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）が、１０−６秒から１秒の間である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３７】
請求項３５又は３６記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記時間間隔Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）が、対数目盛り上で等距離になるように選択される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
Δｔｋ＝0.8ｋsec（ｋ＝０，…，７２）である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３９】
請求項３５〜３８いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
所与の解析関数が、標準的なフィッティング手順によって、ステップ５）によって測定された前記依存性にフィットさせられる粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４０】
請求項３５〜３９いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ステップ４）及び５）による前記固有特性Ｅ１，…ＥＬの１つが、前記試料中の前記粒子の特定の化学種である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４１】
請求項３５〜４０いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ステップ４）及び５）による前記固有特性Ｅ１，…ＥＬの少なくともいくつかが、前記試料中のいくつかの化学種の粒子の、混合物内における部分濃度である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４２】
請求項３５〜４１いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ステップ５）によって測定された前記依存性が、粒子の特定の化学種を同定するため、又は前記試料中の特定の化学種の粒子の部分濃度を特定するために、すでに測定された依存性又は理論的関数と比較される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４３】
請求項３９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記測定された依存性が、粒子の特定の化学種又は前記試料中の特定の化学種の粒子の部分濃度を決定するための非線形フィッティングによって、すでに測定された依存性又は理論的関数の重ね合わせと一致させられる粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４４】
請求項４２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
適切なフィッティング手順を用いることによりｐ（ｕｋ，Δｔｋ）から固有特性として、前記分布関数ｐ（ｎｋ，Δｔｋ）（ｋ＝１，…，Ｋ）が測定されると共に、最大輝度μｍａｘ（Δｔｋ）が決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４５】
請求項４４記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
さらなるステップとして、極限Δｔ→０におけるμｍａｘ（Δｔ）、拡散運動、拡散時間τＤ、及び／又は装置の構造パラメータＳＰが、適切なフィッティング関数によって、μｍａｘ（Δｔ）から決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４６】
請求項４４又は４５記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
さらなるステップとして、前記試料中の特定の化学種の粒子のフェード・アウト時間τμ及び／又は分率が、μｍａｘ（Δｔ）から決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４７】
請求項４４記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
いくつかの化学種の粒子を含む試料を用いた場合に、先に測定され又は他の方法で決定されたμｍａｘ，ｓ（Δｔ）を用いて、式（４３）に基づき、μｍａｘ（Δｔ）が決定され、前記試料中の化学種ｓのモル分率Ｘｓが決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数３８】
【請求項４８】
請求項４４記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
いくつかの化学種ｓの粒子を含む試料を用いた場合に、式（４４）で表される境界条件においてパラメータ０≦Ｘｓ≦１（ｓ＝１，．．．，Ｓ）としたときの非線形フィットによって、μｍａｘ（Δｔ）が決定され、前記試料中の前記化学種のモル分率Ｘｓが決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数３９】
【請求項１】
観測体積内で光子を放出、散乱、及び／又は反射する少なくとも１つの化学種の粒子を含む試料の固有特性を決定する方法であって、
１）式（４）で表される観測時間Ｔの引き続く時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ）（ｉ＝１，２，３…）において記録される光子イベントの数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）前記分布関数ｐ（ｎ）と、前記濃度ｃと、思考実験で予想される予め設定された時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎについての単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）と、有効体積Ｖｅｆｆ：＝〈ｍ〉／ｃ（〈ｍ〉は各計数率に対する粒子寄与の平均数）との間の理論的関係を使用して、Ｐ１（ｎ）、Ｖｅｆｆ、濃度ｃ、及び／又は、これらの特性値を測定されたｐ（ｎ）にフィッティングすることによりＶｅｆｆ及び／又はＰ１（ｎ）から決定される他の固有特性値を決定する
ことを特徴とする粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２】
【請求項２】
請求項１記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、前記単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）が、マルコフ過程の理論に基づいて、式（６）によって与えられ、
μ（ｒ’）が位置ｒ’における単一粒子による光子イベントの平均値によって定義される粒子の輝度関数を表し、ポアソン分布は、Ｐｏｉ（ｎ，μ）＝exp（−μ）μｎ／ｎ！である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数４】
【請求項３】
請求項１又は２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、前記輝度関数μ（ｒ’）が、複数の位置ｒ’についてμを測定し、これらの位置の間ではμを補間することによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、前記輝度関数μ（ｒ’）が、分子蛍光分光法の理論に基づいたモデルと、空間レーザ光強度の所与のモデルによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
Ｐ１（ｎ）が、前記輝度関数μ（ｒ’）によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
Ｖｅｆｆが、前記輝度関数μ（ｒ’）によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項７】
請求項１又は２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）が、Ｐ１（ｎ）又はＶｅｆｆによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項８】
請求項７記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
Ｐ１（ｎ）又はＶｅｆｆが、直接測定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
同じ化学種の粒子は、蛍光性であるか、又は蛍光標識を付され、レーザ・ビームによって励起される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項１０】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）の最大値が、前記分布関数の１次モーメントによって、式（１２）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１０】
【請求項１１】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）の最大値が、前記分布関数の１次モーメントと、雑音寄与によって、式（４５）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数４０】
【請求項１２】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
輝度関数μ（ｒ’）が異なる輝度関数の重ね合わせによって式（１３）のようにモデル化される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１１】
【請求項１３】
請求項１２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
各輝度関数μｊ（ｒ’）が、所与の数のＭ個の特性パラメータμｊｋ（ｋ＝１，２，…，Ｍ）によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項１４】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）が、空間ガウス分布によって式（１５）のようにモデル化される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１３】
【請求項１５】
請求項９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記輝度関数μ（ｒ’）がガウス分布の重ね合わせによって、式（２０）のようにモデル化される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１５】
【請求項１６】
請求項１３記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記特性パラメータμｊｋ（ｊ＝１，２，…，Ｋ；ｋ＝１，２，…，Ｍ）が、標準的なデコンボリューション法によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項１７】
請求項１３記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記特性パラメータμｊｋ（ｊ＝１，２，…，Ｋ；ｋ＝１，２，…，Ｍ）が、反復リチャードソン−ルーシ・デコンボリューション・アルゴリズムによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項１８】
請求項１記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）が式（２１）で与えられる粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１６】
【請求項１９】
請求項１〜１８いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
マルコフ過程の理論に基づいて、確率分布関数ｐ（ｎ，ｃ）と前記単一粒子分布関数Ｐ１（ｎ）の間の以下の理論的関係式（２４）が使用される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数１９】
【請求項２０】
請求項１〜１９いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記確率分布関数ｐ（ｎ，ｃ）が次の漸化式（２５）により計算される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２０】
【請求項２１】
請求項１〜２０いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
粒子の前記濃度ｃが、前記計数率をゼロにする確率によって式（２６）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２１】
【請求項２２】
請求項１〜２１いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
粒子の前記濃度ｃが、前記計数率をゼロにする確率と、前記雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅによって式（２７）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２２】
【請求項２３】
請求項１〜２２いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
粒子の前記平均数〈ｍ〉が、前記計数率をゼロにする確率によって式（２８）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２３】
【請求項２４】
請求項１〜２２いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
粒子の前記平均数〈ｍ〉が、前記計数率をゼロにする確率ｐ（ｎ＝０，ｃ）と前記雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅによって式（２９）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２４】
【請求項２５】
請求項１〜２４いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記単一粒子確率分布関数Ｐ１（ｎ）が、次の漸化式（３０）により計算される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２５】
【請求項２６】
請求項１〜２５いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記分布関数ｐ（ｎ，ｃ）が、付加的な背景信号（例えばハードウェアのランダム雑音）を考慮するために、ポアソン分布Ｐｏｉ（ｎ，〈ｎ〉ｎｏｉｓｅ）とのコンボリューションを通して式（３１）で決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２６】
【請求項２７】
請求項１〜２６いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
請求項１のステップ（３）による前記固有特性が、標準的な非線形マルチパラメータ・フィット手順によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項２８】
請求項１〜２６いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
請求項１のステップ（３）による前記固有特性が、標準的なモーメント法によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項２９】
請求項２８いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記単一粒子確率分布関数のモーメントが、漸化式（３３）により計算される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２８】
【請求項３０】
請求項２４，２６、２９いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅが、請求項１のステップ（３）において〈ｎ〉ｎｏｉｓｅを一定に維持するため、前記化学種の粒子を含まない試料の媒液を使用することによって、又は試料として同一もしくは類似の特性を有する液を使用することによって直接測定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３１】
観測体積内で光子を放出、散乱、及び／又は反射するＮ個の異なる化学種の粒子の混合物を含む試料の固有特性を決定する粒子含有試料の固有特性決定方法であって、単一化学種寄与ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）が、請求項１〜３０のいずれかに従って、前記混合物内に存在する各化学種ｓについての所定の有効体積Ｖｅｆｆ（Ｓ）及び単一粒子分布Ｐ１（Ｓ）（ｎ）ならびに所与の実験セットアップによって決定されることによって、前記混合物の全体的な分布関数ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）が、前記単一化学種寄与ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）、ｓ＝１，２，…，Ｎのコンボリューションによって、式（３４）で決定される、粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数２９】
【請求項３２】
請求項３１記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記パラメータｃｓ、ｓ＝１，２，…，Ｎ及び前記雑音寄与〈ｎ〉ｎｏｉｓｅが、理論的モデルに対する前記所定のパラメータの非線形フィットを使用することによって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３３】
請求項３１又は３２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）の計算が、母関数手順によって高速化される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３４】
請求項３１又は３２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ｐ（ｎ；ｃ１，ｃ２，…，ｃＮ）のモーメントが、ｐ（ｓ）（ｎ；ｃｓ）、ｓ＝１，２，…，Ｎのモーメントの積として表現されることによって、要求されるパラメータが、モーメント法によって決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３５】
観測体積内で光子を放出、散乱、及び／又は反射する少なくとも１つの化学種の粒子を含む試料の固有特性Ｅ１，…ＥＬを決定する粒子含有試料の固有特性決定方法であって、
１）式（４２）で表される観測時間Ｔの引き続く所定の時間間隔Δｔｉ＝［ｔｉ−１，ｔｉ）（ｉ＝１，…，Ｎ）において記録される光子イベントの数ｎｉ（計数率）を記録及びカウントし、
２）前記所定の時間間隔Δｔにおける光子イベントの数ｎの分布関数ｐ（ｎ）を決定し、
３）請求項１〜３４いずれか記載の他のステップを実行し、
さらなるステップとして、
４）異なる時間間隔Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）について前記ステップ１）からステップ３）をＫ回繰り返し、これらのステップの各組によって同じ固有特性Ｅ１，…ＥＬを決定し、
５）Δｔｋに対する前記特性Ｅ１，…ＥＬの依存性を決定し、
６）ステップ５）によって測定された前記依存性から、最適なΔｔ又は前記粒子の他の固有特性を決定する
ことを含む粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数３７】
【請求項３６】
請求項３５記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記時間間隔Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）が、１０−６秒から１秒の間である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３７】
請求項３５又は３６記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記時間間隔Δｔｋ（ｋ＝１，…，Ｋ）が、対数目盛り上で等距離になるように選択される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
Δｔｋ＝0.8ｋsec（ｋ＝０，…，７２）である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項３９】
請求項３５〜３８いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
所与の解析関数が、標準的なフィッティング手順によって、ステップ５）によって測定された前記依存性にフィットさせられる粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４０】
請求項３５〜３９いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ステップ４）及び５）による前記固有特性Ｅ１，…ＥＬの１つが、前記試料中の前記粒子の特定の化学種である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４１】
請求項３５〜４０いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ステップ４）及び５）による前記固有特性Ｅ１，…ＥＬの少なくともいくつかが、前記試料中のいくつかの化学種の粒子の、混合物内における部分濃度である粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４２】
請求項３５〜４１いずれか記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
ステップ５）によって測定された前記依存性が、粒子の特定の化学種を同定するため、又は前記試料中の特定の化学種の粒子の部分濃度を特定するために、すでに測定された依存性又は理論的関数と比較される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４３】
請求項３９記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
前記測定された依存性が、粒子の特定の化学種又は前記試料中の特定の化学種の粒子の部分濃度を決定するための非線形フィッティングによって、すでに測定された依存性又は理論的関数の重ね合わせと一致させられる粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４４】
請求項４２記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
適切なフィッティング手順を用いることによりｐ（ｕｋ，Δｔｋ）から固有特性として、前記分布関数ｐ（ｎｋ，Δｔｋ）（ｋ＝１，…，Ｋ）が測定されると共に、最大輝度μｍａｘ（Δｔｋ）が決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４５】
請求項４４記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
さらなるステップとして、極限Δｔ→０におけるμｍａｘ（Δｔ）、拡散運動、拡散時間τＤ、及び／又は装置の構造パラメータＳＰが、適切なフィッティング関数によって、μｍａｘ（Δｔ）から決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４６】
請求項４４又は４５記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
さらなるステップとして、前記試料中の特定の化学種の粒子のフェード・アウト時間τμ及び／又は分率が、μｍａｘ（Δｔ）から決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【請求項４７】
請求項４４記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
いくつかの化学種の粒子を含む試料を用いた場合に、先に測定され又は他の方法で決定されたμｍａｘ，ｓ（Δｔ）を用いて、式（４３）に基づき、μｍａｘ（Δｔ）が決定され、前記試料中の化学種ｓのモル分率Ｘｓが決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数３８】
【請求項４８】
請求項４４記載の粒子含有試料の固有特性決定方法において、
いくつかの化学種ｓの粒子を含む試料を用いた場合に、式（４４）で表される境界条件においてパラメータ０≦Ｘｓ≦１（ｓ＝１，．．．，Ｓ）としたときの非線形フィットによって、μｍａｘ（Δｔ）が決定され、前記試料中の前記化学種のモル分率Ｘｓが決定される粒子含有試料の固有特性決定方法。
【数３９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５１５０３１（Ｐ２０１０−５１５０３１Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４３３９６（Ｐ２００９−５４３３９６）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０１１４４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８０６１２
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０９１８１６５５）フルイトバイオシステムズ ゲゼルシャフトミットベシュレンクターハフトゥング (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０１１４４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８０６１２
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０９１８１６５５）フルイトバイオシステムズ ゲゼルシャフトミットベシュレンクターハフトゥング (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]