糖尿病の診断バイオマーカー
糖尿病前症状態及び顕性ＩＩ型糖尿病であると診断された患者のＰＢＭＣにおいて示差的に発現される遺伝子セットの同定のための方法が開示される。患者における糖尿病状態を正確に予測するために、３つの遺伝子及び１０個の遺伝子サインを示す。本出願はまた、ポイントオブケア施設における糖尿病状態の迅速な診断のためのキットも記載する。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔出願の分野〕
本出願は、医療診断の分野に関し、患者における糖尿病状態のポイントオブケア診断のための方法及びキットを記述する。
【０００２】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国特許仮出願第６０／９８７，５４０号（２００７年１１月１３日出願）からの優先権を主張し、これにより本出願にその全体が組み込まれる。
【０００３】
〔発明の背景〕
糖尿病は、インスリン産生、インスリン活性、又はその両方における欠陥の結果による高濃度の血中グルコースによって特徴付けられる一群の病気である。未処置のまま放置されると、低血糖症、ケトアシドーシス又は非ケトン性高浸透圧性昏睡の症状を含む多くの重篤な短期合併症を生じる恐れがある。長期では、糖尿病は、動脈硬化症、慢性腎不全、網膜障害（失明など）、神経損傷及び微小血管損傷の危険性の増加を引き起こすことが知られている。
【０００４】
発展しつつある世界における糖尿病の流行的広がりは、米国におけるヘルスケアシステムに重大な影響を及ぼすと予想される。米国疾病管理予防センター（the Center for Disease Control and Prevention）による近年の研究は、米国において過去１０年間でほぼ２倍の新規糖尿病症例が発生していることを示している。２００７年時点で、米国内で少なくとも５７００万人が糖尿病前症を有する。既に糖尿病にかかっているほぼ２４００万人と合わせると、これは、米国人口の２５％超をこの病気からの更なる合併症に対する危険性にさらすことになる。米国糖尿病学会によれば、２００７年における米国内の糖尿病の推定コストは、１７４０億ドルにのぼり、直接医療コストはほぼ１１６０億ドルである。
【０００５】
糖尿病の原因は、本来は多因子であると思われるが、増えつつある実験的証拠は、肥満、特に腹部肥満の発症が免疫及び代謝ホメオスタシスを乱し、最終的に広範な炎症反応に導くことを示唆している。ＴＮＦ−αなどの、脂肪組織における炎症性サイトカインの産生は、その後、免疫反応、及び、細胞のインスリンに対して反応する能力を調節解除する。それゆえに、単球及びマクロファージなどの循環している免疫細胞の転写プロファイルの変化の検出は、グルコース不耐性の更に顕著な兆候が明らかになる前に、疾患を診断し、その進行をモニターするための便利な手段を提供する。
【０００６】
このような理由から、糖尿病の進行の危険性にさらされている患者の診断及びモニタリングのための迅速かつ正確な診断アッセイに対して、未達成の必要性が存在する。特に、早期発症型糖尿病に関する患者のルーチンスクリーニングのためのポイントオブケア施設において容易に使用できるキットフォーマットでの診断アッセイに対して、未達成の必要性が存在する。
【０００７】
〔出願の概要〕
糖尿病前症及び糖尿病状態の特徴である遺伝子サイン発現プロファイルの判定のための方法が記載される。本開示は、更に、患者の血液試料における遺伝子サイン発現プロファイルの迅速な測定のための試薬を含む診断キットに関する。このキットフォーマットは、費用対効果に優れ、ポイントオブケア施設での使用に便利である。
【０００８】
１つの実施形態では、患者における真性糖尿病の診断のための方法が記載され、この方法は、（ａ）患者から採取された試験試料を提供する工程、（ｂ）ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）遺伝子発現プロファイルを遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程、（ｄ）遺伝子発現プロファイルと診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態を判定する工程と、（ｅ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む。
【０００９】
判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行することができる。判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含むことができる。
【００１０】
遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子又は３つ全ての遺伝子を含むことができる。１つの実施形態では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含むことができる。
【００１１】
患者は、正常なＢＭＩを有し得る。糖尿病状態は、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態であり得る。
【００１２】
試験試料は、血液試料、又は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００１３】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００１４】
別の実施形態では、患者における真性糖尿病の診断のための方法が記載され、この方法は、（ａ）患者から採取された試験試料を提供する工程、（ｂ）ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）遺伝子発現プロファイルを遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程、（ｄ）遺伝子発現プロファイルと診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態を判定する工程と、（ｅ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む。
【００１５】
判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行することができる。判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含むことができる。
【００１６】
遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子又は任意の３つの遺伝子を含むことができる。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される少なくとも１つの遺伝子に加えて、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００１７】
患者は、正常なＢＭＩを有し得る。糖尿病状態は、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態であり得る。
【００１８】
試験試料は、血液試料、又は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００１９】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００２０】
１つの実施形態では、患者における真性糖尿病の診断のための方法が記載され、この方法は、（ａ）患者から採取された試験試料を提供する工程、（ｂ）ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）遺伝子発現プロファイルを遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程、（ｄ）遺伝子発現プロファイルと診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態を判定する工程と、（ｅ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む。
【００２１】
判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行することができる。判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析も含むことができる。
【００２２】
遺伝子サインは、ＴＣＦ７Ｌ２又はＣＬＣのいずれかの遺伝子を含むことができる。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＣＦ７Ｌ２又はＣＬＣ遺伝子の１つ以上の変異型を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＣＦ７Ｌ２又はＣＬＣのいずれかの遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００２３】
患者は、正常なＢＭＩを有し得る。糖尿病状態は、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態であり得る。
【００２４】
試験試料は、血液試料、又は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００２５】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００２６】
１つの実施形態では、（ａ）第一時点で患者から採取された第一試験試料を準備する工程、（ｂ）第一試験試料におけるＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される遺伝子を含む遺伝子サインの第一発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）第二時点で患者から採取された第二試験試料を提供する工程、（ｄ）第二試験試料における遺伝子サインの第二発現プロファイルを測定する工程、（ｅ）第一発現プロファイルを第二発現プロファイルと比較する工程、（ｆ）第一遺伝子発現プロファイルと第二遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な差異に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態の変化を判定する工程と、（ｇ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、患者の糖尿病状態における変化を診断するための方法が記載される。
【００２７】
１つの態様では、判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行される。別の態様では、判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析も含む。
【００２８】
遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子を含むことができる。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される１つの遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００２９】
１つの態様では、第一時点と第二時点との間の期間は、０〜２年又は１／４〜２年又は１／２〜２年又は２〜５年又は５〜１０年若しくはそれ以上である。
【００３０】
糖尿病状態における変化は、糖尿病前症状態又はＩＩ型糖尿病状態への進行を示すことができる。１つの態様では、第一時点の患者は、正常なＢＭＩを有する。
【００３１】
第一及び第二試験試料は、血液試料であり得る。１つの態様では、第一及び第二試験試料は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００３２】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００３３】
１つの実施形態では、（ａ）第一時点で患者から採取された第一試験試料を提供する工程、（ｂ）第一試験試料におけるＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される遺伝子を含む遺伝子サインの第一発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）第二時点で患者から採取された第二試験試料を準備する工程、（ｄ）第二試験試料における遺伝子サインの第二発現プロファイルを測定する工程、（ｅ）第一発現プロファイルを第二発現プロファイルと比較する工程、（ｆ）第一遺伝子発現プロファイルと第二遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な差異に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態の変化を判定する工程と、（ｇ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、患者の糖尿病状態における変化を診断するための方法が記載される。
【００３４】
１つの態様では、判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行される。別の態様では、判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む。
【００３５】
遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子を含むことができる。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される任意の３つの遺伝子を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００３６】
１つの態様では、第一時点と第二時点との間の期間は、０〜２年又は１／４〜２年又は１／２〜２年又は２〜５年又は５〜１０年又はそれ以上である。
【００３７】
糖尿病状態における変化は、糖尿病前症状態又はＩＩ型糖尿病状態への進行を示すことができる。１つの態様では、第一時点の患者は、正常なＢＭＩを有する。
【００３８】
第一及び第二試験試料は、血液試料であり得る。１つの態様では、第一及び第二試験試料は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００３９】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００４０】
別の実施形態では、患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットが記載され、この査定は、試験装置により行われる。このキットは、（ａ）患者から試験試料を回収するための試薬と、（ｂ）患者の試験試料におけるＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子又はこれらの変異型を含む遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、を含む。
【００４１】
工程（ａ）及び（ｂ）の試薬は、複数回の試験に十分である。患者から試験試料を回収するための試薬は、滅菌容器の内にパッケージ化することができる。
【００４２】
遺伝子サインは、ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６の列挙から選択される１つ以上の遺伝子と、を含むことができる。
【００４３】
試験試料は、血液試料であり得る。
【００４４】
キットはまた、ＰＢＭＣの単離のための試薬、又は、ＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞の単離のための試薬、又は、ＣＤ１４＋単球の単離のための試薬、を含むことができる。遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬は、リアルタイムＰＣＲ試薬、免疫化学的アッセイ試薬又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション用であり得る。
【００４５】
別の実施形態では、患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットが記載され、この査定は、試験装置により行われる。このキットは、（ａ）患者から試験試料を回収するための試薬と、（ｂ）患者の試験試料におけるＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子又はこれらの変異型を含む遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、を含む。
【００４６】
遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子を含むことができる。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子を含む。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６の遺伝子の列挙から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００４７】
工程（ａ）及び（ｂ）の試薬は、複数回の試験に十分である。患者から試験試料を回収するための試薬は、滅菌容器の内にパッケージ化することができる。
【００４８】
試験試料は、血液試料であり得る。
【００４９】
キットはまた、ＰＢＭＣの単離のための試薬、又は、ＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞の単離のための試薬、又は、ＣＤ１４＋単球の単離のための試薬、を含むことができる。遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬は、リアルタイムＰＣＲ試薬、免疫化学的アッセイ試薬又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション用であり得る。
【００５０】
別の実施形態では、患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットが記載され、この査定は、試験装置により行われる。このキットは、（ａ）患者から試験試料を回収するための試薬と、（ｂ）患者の試験試料におけるＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される遺伝子又はこれらの変異型の遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、を含む。
【００５１】
１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される２つ以上の遺伝子を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される３つ以上の遺伝子を含む。
【００５２】
工程（ａ）及び（ｂ）の試薬は、複数回の試験に十分である。患者から試験試料を回収するための試薬は、滅菌容器の内にパッケージ化することができる。
【００５３】
遺伝子サインはまた、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６の遺伝子の列挙から選択される１つ以上の遺伝子と、を含むことができる。
【００５４】
試験試料は、血液試料であり得る。
【００５５】
キットはまた、ＰＢＭＣの単離のための試薬、又は、ＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞の単離のための試薬、又は、ＣＤ１４＋単球の単離のための試薬、を含むことができる。遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬は、リアルタイムＰＣＲ試薬、免疫化学的アッセイ試薬又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション用であり得る。
【００５６】
本出願は、この概要に開示される実施形態に限定されず、この分野における当業者の範囲内にある修正形態及び変形形態並びに「特許請求の範囲」により定義されるものを有効範囲とするという意図が、理解されるべきである。
【００５７】
糖尿病前症状態の早期診断のため及び糖尿病の進行の危険性にさらされている患者又は既に糖尿病にかかっている患者のモニタリングのための新規遺伝子サインなどの、前述した実施形態は、多くの利点を有する。本開示はまた、ポイントオブケア施設での医療関係者による血液試料の費用対効果に優れかつ迅速な試験のための試薬及び使用説明書を有するキットも記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】第一の実施形態による、ＯＧＴＴと比較したＣＬＣ遺伝子のＲＯＣ曲線解析。
【図２Ａ】第二の実施形態による、ＯＧＴＴと比較したＴＣＦ７Ｌ２のセット１のＲＯＣ曲線解析。
【図２Ｂ】第三の実施形態による、ＦＰＧに対する、ＯＧＴＴ ｖｓ．ＦＰＧと比較したＴＣＦ７Ｌ２のセット１のＲＯＣ曲線解析。
【図３】第四の実施形態による、ＣＤＫＮ１Ｃ遺伝子のＲＯＣ曲線解析。
【図４Ａ】第五の実施形態による、ＯＧＴＴと比較した３つの遺伝子サインのＲＯＣ曲線解析。
【図４Ｂ】第六の実施形態による、ＦＰＧ ｖｓ．ＯＧＴＴと比較した３つの遺伝子サインのＲＯＣ曲線解析。
【図４Ｃ】第七の実施形態による、３つの遺伝子サインの平均発現の棒グラフ。
【図５Ａ】第八の実施形態による、ＯＧＴＴと比較した１０個の遺伝子サインのＲＯＣ曲線解析。
【図５Ｂ】第九の実施形態による、ＦＰＧ ｖｓ．ＯＧＴＴと比較した１０個の遺伝子サインのＲＯＣ曲線解析。
【図５Ｃ】第十の実施形態による、１０個の遺伝子サインの平均発現の棒グラフ。
【００５９】
〔詳細な説明〕
別段の規定がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。以下の定義は、本開示及び本出願の特許請求の範囲を解釈するのを助けるために提供される。このセクションでの定義と他所での定義とが一致しない場合には、このセクションに記載の定義が制御する。
【００６０】
更には、本発明の実践は、特に指示がない限り、当該技術分野の範囲内で、従来の分子生物学的及び免疫学的技術を採用する。このような技術は、当業者に周知であり、文献で詳細に説明されている。例えば、コリガン（Colignan）、ダン（Dunn）、プロー（Ploegh）、スパイヘル（Speicher）及びウィングフィールド（Wingfield）「タンパク質科学の最新プロトコル（Current protocols in Protein Science）」（１９９９〜２００８年、第Ｉ及びＩＩ巻、全ての補足も含む、ジョン・ワイリー＆サンズ社（John Wiley & Sons Inc.））、並びに、ベイリー，Ｊ．Ｅ．（Bailey, J. E.）及びオリス，Ｄ．Ｆ．（Ollis, D. F.）「生物化学工学の基礎（Biochemical Engineering Fundamentals）」（マグローヒル・ブック社（McGraw-Hill Book Company）、ニューヨーク、１９８６年）、アウスベル（Ausubel）ら編「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８７〜２００８年、全ての補足も含む）、サムブルック（Sambrook）ら編「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」（第二版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、１９８９年）、並びに、ハーロウ（Harlow）及びレイン（Lane）「抗体、実験室マニュアル（Antibodies, a Laboratory Manual）」（コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）を参照されたい。ＲＯＣ解析は、トム・フォーセット（Tom Fawcett）による「ＲＯＣ解析総論（An Introduction to ROC Analysis）」（パターン・レコグニション・レターズ（Pattern Recognition Letters）２７巻、２００６年、８６１〜８７４頁）にレビューされている。
【００６１】
本明細書で使用するとき、「真性糖尿病」とは、高濃度の血中グルコース（高血糖症）により特徴付けられるあらゆる病気を指す。真性糖尿病は、以下のいずれか１つを実証することにより、診断される。１２６ｍｇ／ｄＬ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の空腹時血漿グルコース濃度、又は、グルコース負荷試験若しくは高血糖症の症状などで７５ｇの経口グルコース負荷の２時間後における２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の血漿グルコース、並びに、２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の随時血漿グルコース。
【００６２】
本明細書で使用するとき、糖尿病とは、小児期発症型糖尿病、若年型糖尿病及びインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られる「１型糖尿病」、又は、成人型糖尿病、肥満関連糖尿病及びインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られる「２型糖尿病」、又は、妊娠糖尿病、インスリン抵抗性１型糖尿病（すなわち「二重糖尿病」）、成人性潜伏型自己免疫性糖尿病（すなわち、ＬＡＤＡ）、及び、３０歳前に２型糖尿病として存在する強い家族歴を有する一群のいくつかの１つの遺伝子の（一遺伝子性）障害である若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）が挙げられる他の形態の糖尿病を指す。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「糖尿病状態」とは、糖尿病前症状態、糖尿病前症状態よりも進行した病気の段階により特徴付けられる糖尿病中間状態、及び、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病などの本明細書に定義されるような顕性糖尿病を特徴付ける病気状態を指す。
【００６４】
本明細書で使用するとき、「糖尿病前症状態」は、患者が空腹時グルコース濃度異常及びグルコース耐性異常を有するものである。空腹時グルコース異常は、１００〜１２５ｍｇ／ｄＬ（６．１及び７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）の血中グルコース濃度として定義される、すなわち空腹時グルコース異常である。７５ｇの経口グルコース負荷の２時間後に、１４０ｍｇ／ｄＬすなわち７．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるが、２００を超えない血漿グルコースを有する患者は、グルコース耐性異常を有すると考えられる。
【００６５】
本明細書で使用するとき、「医療専門家」は、内科医又は訓練された医療技術者又はポイントオブケア施設における看護士である。
【００６６】
「ポイントオブケア」施設は、病院内などの入院患者のいる所（inpatient location）、又は、診療所若しく立ち入り型クリニックなどの外来患者のいる所（outpatient location）であり得る。１つの実施形態では、診断アッセイは、血液試料における遺伝子サイン発現プロファイルの分析のための器具と共に、消費者に対して商業的なキットとして、流通させてもよい。別の実施形態では、商業的なキットは、血中グルコース濃度のモニタリングのための器具及び試薬と組み合わせてもよい。
【００６７】
用語「血中グルコース濃度」とは、血中のグルコースの濃度を指す。正常血中グルコース濃度（正常血糖）は、およそ１２０ｍｇ／ｄｌである。この値は、糖尿病でない場合には、最大３０ｍｇ／ｄｌで変動する。
【００６８】
「高血糖症」（高血糖）の状況は、血中グルコース濃度が高過ぎる状況である。典型的には、高血糖症は、血中グルコース濃度が上昇して１８０ｍｇ／ｄｌを超えるときに生じる。
【００６９】
本明細書で使用するとき、「試験試料」は、糖尿病状態に反応して遺伝子を示差的に発現する細胞を含有する患者からの任意の生体試料である。この生体試料は、ヒトなどのアトピー性又は非アトピー性哺乳動物から単離される任意の生体材料であり得、血液、骨髄、血漿、血清、リンパ、脳脊髄液、又は、涙液、唾液若しくは乳液などの他の分泌液、組織若しくは器官の生検試料、又は培養細胞、の細胞構成成分が挙げられる。好ましくは、生体試料は、最小限の処置で患者から回収できる細胞試料である。好ましい実施形態では、試験試料は、血液試料、又は、ＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）若しくはＣＤ１４＋単球若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＥｍｒ＋細胞の調製物である。
【００７０】
哺乳動物はヒトであってもよく、あるいは、家畜、コンパニオンアニマル又は動物園動物であってもよい。本明細書で記載される診断ツールは、ヒトの医療処置での使用に好適であることが特に想到されるが、これらはまた、イヌ及びネコなどのコンパニオンアニマル、ウマ、ウシ及びヒツジなどの家畜、又は、非ヒト霊長類、ネコ科動物、イヌ科動物、ウシ科動物及び有蹄動物などの動物園動物、の獣医学的処置にも適用可能である。
【００７１】
本明細書で記載するとき、用語「遺伝子発現」とは、遺伝子にコード化されている遺伝子情報を遺伝子の「転写」を通じて（例えば、ＲＮＡポリメラーゼの酵素反応を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｓｎＲＮＡ）に、タンパク質に関してはコード化遺伝子をｍＲＮＡの「翻訳」を通じてタンパク質に、変換するプロセスを指す。
【００７２】
「遺伝子発現プロファイル」とは、生体試料において発現した少なくとも１つのヌクレオチド又はタンパク質の同定された発現レベルを指す。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」とは、自然に発生する（例えば、制限断片として）か又は合成的に産生されたかのいずれかのオリゴヌクレオチドを指し、これは、ヌクレオチドと、ＤＮＡ依存性及びＲＮＡ依存性ポリメラーゼなどの、核酸重合のための作用剤とが存在する中で好適な条件下（例えば、緩衝液、塩、温度及びｐＨ）に置かれたときに、核酸ストランド（鋳型又は標的配列）に相補的であるプライマー伸長生成物の合成開始点として作用することができる。プライマーは、重合のための作用剤の存在する中で、伸長生成物の合成を準備刺激するのに十分に長くなければならない。典型的なプライマーは、標的配列に対して実質的に相補的な又は相同の配列の少なくとも約１０ヌクレオチドの長さを含有するが、いくらかより長いプライマーが好ましい。通常のプライマーは、約１５〜２６ヌクレオチドを含有する。
【００７４】
本明細書で使用するとき、「遺伝子サイン」とは、生体試料の一意的な識別子を提供する選択された遺伝子セットの遺伝子発現のパターンを指す。遺伝子サインは、選択された遺伝子セットの遺伝子発現のパターンが、糖尿病状態を有する患者から採取された参照試料における遺伝子サインに対する実質的な一致であるならば、糖尿病状態の特徴である。この出願の目的に関して、「遺伝子サイン」は、（遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子であるならば）核酸又はポリペプチド配列の所定の組み合わせであり得る。遺伝子サインは、未知の機能を有する遺伝子、又は、ｒＲＮＡ、ＵｓｎＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｔＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されないオープンリーディングフレームを有さない遺伝子を含み得る。
【００７５】
本明細書で使用するとき、「診断用遺伝子発現プロファイル」とは、特定の病気状態と診断された患者から採取された生体試料における遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを指す。病気状態は、糖尿病状態又は非糖尿病状態であり得る。患者からの試験遺伝子発現プロファイルと糖尿病状態を特徴付ける診断用遺伝子発現プロファイルとの間の「実質的な一致」は、患者が糖尿病状態を有することを示す。あるいは、患者からの試験遺伝子発現プロファイルと非糖尿病状態を特徴付ける診断用遺伝子発現プロファイルとの間の「実質的な一致」は、患者が糖尿病状態を有さないことを示す。
【００７６】
本明細書で使用するとき、遺伝子の「変異型」とは、これらのＤＮＡ配列が一般的な野生型遺伝子の核酸配列と比較されるときに、その遺伝子に少なくとも約７５％同一、より好ましくは、少なくとも約８５％同一、最も好ましくは、少なくとも９０％同一、更に好ましくは少なくとも約９５〜９９％同一、である遺伝子配列を意味する。１つの実施形態では、遺伝子の変異型は、点変異若しくは単一ヌクレオチド多型、欠損、挿入、再構成、スプライス供与若しくは受容部位変異、及び偽遺伝子の特徴を示す遺伝子変異が挙げられるが、これらに限定されない遺伝子のＤＮＡは配列における１つ以上の変異を有する遺伝子である。本出願を通して、遺伝子は、暗黙的に、本明細書で記載されているように遺伝子の野生型及び変異型形態の両方を含む。
【００７７】
本明細書で使用するとき、「実質的な一致」とは、定義された病気状態を有する患者から採取された参照試料における遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルとの、試験試料における遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルの比較を指す。発現プロファイルは、試験試料及び参照試料における遺伝子サインの発現が実質的に同一のレベルである、すなわち、試料の正規化後に試料間に統計的有意差が存在しない、ならば、「実質的に一致する」。１つの実施形態では、実質的に一致している発現プロファイルの信頼区間は、少なくとも約５０％、又は約５０％〜約７５％、又は約７５％〜約８０％、又は約８０％〜約８５％、又は約８５％〜約９０％、又は約９０％〜約９５％である。好ましい実施形態では、実質的に一致している発現プロファイルの信頼区間は、約９５％〜約１００％である。別の好ましい実施形態では、実質的に一致している発現プロファイルの信頼区間は、約９５％〜約１００％の間の任意の数である。別の好ましい実施形態では、実質的に一致している発現プロファイルの信頼区間は、約９５％又は約９６％又は約９７％又は約９８％又は約９９％又は約９９．９％である。
【００７８】
本明細書で使用するとき、「実質的な差異」とは、ある時点での遺伝子の遺伝子発現プロファイルと第二時点での同一の遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルとにおける差異を指す。発現プロファイルは、第一及び第二時点での遺伝子サインの発現が異なるレベルにある、すなわち、試料の正規化後に試料間に統計的有意差が存在する、ならば、「実質的に異なる」。１つの実施形態では、発現プロファイルは、第一及び第二時点での遺伝子サインの発現が計算された信頼区間の外側にあるならば、「実質的に異なる」。１つの実施形態では、実質的に異なる発現プロファイルの信頼区間は、約５０％未満、又は約７５％未満、又は約８０％未満、又は約８５％未満、又は約９０％未満、又は約９５％未満である。
【００７９】
９５％信頼区間ＣＩは、ＡＵＣ＋１．９６×ＡＵＣの標準誤差に等しい（式中、ＡＵＣは、ＲＯＣ曲線の下の面積である）。
【００８０】
本明細書で使用するとき、「ＲＯＣ」とは、受信者動作特性、又は単にＲＯＣ曲線を指し、これは、識別閾値が変動するような二元識別系のための、（１−特異度）に対する感度のグラフ表示である。
【００８１】
本明細書で使用するとき、用語「診断」又は「診断する」とは、１つの糖尿病状態を別の糖尿病状態から区別する、又は、糖尿病状態が「正常」若しくは「非糖尿病」（非アトピー性）状態と比較して患者（アトピー性）に存在するかどうかを判定する、及び／又は、糖尿病状態の性質を判定する方法を指す。
【００８２】
本明細書で使用するとき、「糖尿病状態を判定する」とは、糖尿病状態若しくは状況で患者を診断するのに、及び／又は、病気を分類するのに、有用である情報全ての統合を指す。この情報には、家族歴、ヒト遺伝子データ、ＢＭＩ、身体活動性、代謝病プロファイル、及び、患者から採取された試験試料における１つ以上の遺伝子サインの発現プロファイルの統計分析の結果が挙げられるが、これらに限定されない。ポイントオブケア環境において、この情報は、適切なデータ解析ソフトウェアを有するコンピュータシステムにより解析され、表示される。臨床データの統合は、主治医に、患者が糖尿病状況を有するかどうかを判定するのに必要な情報、糖尿病の性質又は分類に関連する情報、並びに、予後に関連する情報、及び／又は、適切な処置を選択するのに有用な情報を提供する。１つの実施形態では、本明細書で記載される診断アッセイは、医療専門家に、指示された医療処置の有効性の判定を提供する。
【００８３】
本明細書で使用するとき、「代謝病プロファイル」とは、任意の数の標準的な代謝測定値、及び、空腹時血漿グルコース、インスリン、プロインスリン、ｃ−ペプチド、インタクトインスリン、ＢＭＩ、胴囲、ＧＬＰ−１、アディポネクチン、ＰＡＩ−１、ヘモグロビンＡ１ｃ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トリグリセリド、遊離脂肪酸が挙げられるがこれらに限定されない糖尿病状態の特徴であり得る他の危険因子を指す。代謝病プロファイルを使用して、２時間ＯＧＴＴについての分類等価性に関する優れたモデルを作ることができる。
【００８４】
グルコース負荷試験は、どれだけ迅速にグルコースが血液から一掃されるかを判定するための、グルコースの投与である。この試験は、通常、糖尿病、インスリン耐性について、及び時に反応性低血糖症についての試験に使用される。グルコースは、ほとんどの場合、経口で与えられ、それゆえに、一般的な試験は技術的に、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）である。
【００８５】
空腹時血漿グルコース試験（ＦＰＧ）は、絶食後に血漿又は血中グルコース濃度を測定する炭水化物代謝試験である。絶食の刺激により、グルカゴンというホルモンが放出され、これは、今度は血漿グルコース濃度を上昇させる。糖尿病にかかっていない人々の場合、体は、インスリンを産生及び処理して、グルコース濃度の上昇を相殺する。糖尿病にかかっている人々の場合、これが生じず、試験されたグルコース濃度は高いままである。
【００８６】
本明細書で使用するとき、ボディマス指数（ＢＭＩ）又はケトレー指数は、ヒトの体重と身長とを比較する統計的測定値である。その測定及び計算の容易さに起因して、これは肥満度を同定するのに最も広く使用されている診断ツールである。
【００８７】
本明細書で使用するとき、ＮＧＴとはグルコース耐性正常を意味し、ＩＧＴとはグルコース耐性異常を意味し、Ｔ２Ｄとは２型糖尿病を意味する。
【００８８】
本明細書で使用するとき、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋及びＥｍｒ＋は、ヒト単球／マクロファージ及び骨髄細胞及びこれらの前駆体の細胞表面マーカーである。マウスで最も一般的に使用される単球／マクロファージ及び骨髄細胞表面マーカーは、Ｆ４／８０及びＣＤ１１ｂであるが、Ｆ４／８０及びＣＤ１１ｂ抗体は、それぞれ、好酸球並びに樹状細胞並びにＮＫ及び他のＴ及びＢ細胞亜型と反応することが報告されている（グエン（Nguyen）ら（２００７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J Biol Chem）２８２巻、３５２７９〜３５２９２頁、パチョーリ（Patsouris）ら（２００８）セル・メタボリズム（Cell Metab.）８巻、３０１〜３０９頁）。マウスにおけるＦ４／８０遺伝子は、ヒトＥｍｒ１遺伝子についてのオルソログである。マウスＣＤ１１ｃ遺伝子についてのヒトオルソログは、ＩＴＧＡＸであり、また、インテグリン、αＸ（補体成分３受容体４サブユニット）、ＳＬＥＢ６、ＯＴＴＨＵＭＰ０００００１６３２９９；ｌｅｕ Ｍ５、αサブユニット；白血球表面抗原ｐ１５０、９５、αサブユニット；骨髄膜抗原、αサブユニット；ｐ１５０ ９５インテグリンα鎖（染色体：１６；位置：１６ｐ１１．２アノテーション：染色体１６、ＮＣ＿００００１６．８（３１２７４０１０．．３１３０１８１９）ＭＩＭ：１５１５１０、遺伝子ＩＤ：３６８７）とも呼ばれる。マウスＣＤ１１ｂ遺伝子についてのヒトオルソログは、ＩＴＧＡＭ又はインテグリン、αＭ（補体成分３受容体３サブユニット）であり、また、ＣＤ１１Ｂ、ＣＲ３Ａ、ＭＡＣ−１、ＭＡＣ１Ａ、ＭＧＣ１１７０４４、ＭＯ１Ａ、ＳＬＥＢ６、マクロファージ抗原αポリペプチド；好中球接着因子受容体α−Ｍサブユニット（染色体：１６；位置：１６ｐ１１．２染色体１６、ＮＣ＿００００１６．８（３１１７８７８９．．３１２５１７１４）、ＭＩＭ：１２０９８０、遺伝子ＩＤ：３６８４）とも呼ばれる。ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋及びＥｍｒ＋並びにＣＤ１４＋細胞を、適切なヒト血液細胞単離キット（ステムセル・テクノロジーズ（StemCell Technologies））を使用するポジティブセレクションにより、ＰＢＭＣから純化することができる。次に、単離された細胞集団の純度（＞８５％）は、適切な細胞表面マーカーに対する、蛍光剤を結合させた抗体（バイオレジェンド（BioLegend））でのフローサイトメトリー染色により確認される。
【００８９】
本明細書で使用するとき、「リアルタイムＰＣＲ」とは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を指し、また、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ／ｑＰＣＲ）又は速度論的ポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれる。リアルタイムＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく実験技術であり、これは、標的ＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量するために使用される。これにより、ＤＮＡ試料内の特定の配列の検出及び定量（インプットされたＤＮＡに対して正規化されるとき又は遺伝子の追加的な正規化の際に、コピー又は相対量の絶対数として）の両方を可能にする。
【００９０】
本明細書で使用するとき、免疫化学的アッセイは、抗体の、その抗原に対する反応を使用して、細胞抽出物中の物質の濃度を測定する生化学的試験である。本開示では、抗原は、遺伝子サインを含む、タンパク質をコードする遺伝子のいずれかにより発現されるタンパク質である。好ましい実施形態では、免疫化学的アッセイは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）である。
【００９１】
本明細書で使用するとき、「特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション」とは、チップなどの固体担体上のプローブ配列と患者の試験試料内の転写産物から生じたｃＤＮＡ配列との間でのハイブリダイゼーションを指す。この２つの核酸配列が実質的に相補的であれば、ハイブリダイゼーションは生じ、これは試験試料中のｃＤＮＡ配列の量に正比例する。次に、ハイブリダイゼーションの検出が、当該技術分野において周知の技術を使用して達成される。数多くの要因が、２つの核酸のハイブリダイゼーションの効率性及び選択性、例えば、標的核酸配列に対してのアレイ上の核酸メンバーに影響する。これらの要因には、核酸メンバーの長さ、ヌクレオチド配列及び／又は組成、ハイブリダイゼーション温度、緩衝組成物、並びに、核酸メンバーがハイブリッド化に必要とされる領域での立体障害についての可能性が挙げられる。正の相関関係が、核酸メンバーの長さと、核酸メンバーが標的配列をアニーリングする効率性及び選択性の両方との間に存在する。特に、より長い配列は、より短いものよりも高い融解温度（ＴＭ）を有し、所与の標的配列内で繰り返されにくく、これにより乱交雑ハイブリダイゼーションを最小化する。ハイブリダイゼーション温度は、核酸メンバーアニーリング効率性に反比例して変動し、ハイブリダイゼーション混合物中に含まれ得る有機溶媒、例えば、ホルムアミドの濃度も同様であるが、一方で塩濃度における増加は、結合を促進する。厳密なハイブリダイゼーション条件下でより長い核酸は、より短いものよりも効率的にハイブリッド化し、これはより許容的な条件下でも十分である。
【００９２】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含み、インタクトな分子、これらの断片（Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２断片など）、あるいは、インタクトな分子及び／又は断片の多量体又は凝集体であり得、例えば、免疫付与、合成又は遺伝子工学により、事実上生じ得るか又は産生される。
【００９３】
本明細書で使用するとき、表１、７、８、９、１０Ａ及び１０Ｂにおけるプローブについての全ての参照は、ジェネチップ・ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイ（the GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array）に提示されているプローブセットを指す。
【００９４】
以下の説明は、本出願の特定の実施形態、及び、患者における糖尿病を診断するための特定の方法に関する。特に、本出願は、糖尿病状態に関与すると従来は考えられていなかったいくつかを含む、多数の遺伝子が、糖尿病状態を有さない患者と比較して、糖尿病又は糖尿病前症状態を有する患者からの末梢血単核球細胞（ＰＭＢＣ）において示差的に発現されることを開示する。
【００９５】
１つの実施形態では、ＮＧＴ及びＴ２ＤのＰＢＭＣにおいて示差的に発現される遺伝子は、マイクロアレイ分析を使用して同定される。ＮＧＴ及びＴ２Ｄ患者（本実施例では、１０７人の患者のコホート）のＰＢＭＣからの転写産物は、アフィメトリクス・ヒトゲノムＨＧ−Ｕ１３３プラス２チップ（the Affymetrix Human Genome HG-U133Plus2 chip）を製造者の教示に従って使用して、最初にスクリーニングされる。およそ２００の示差的に発現される遺伝子が選択され、これはマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）プログラムを使用して、ＮＧＴとＴ２Ｄとの間で、フォールス・ディスカバリー・レート（False Discovery Rate）、ＦＤＲ＜２０％、倍率変化＞１．７を有した（表１を参照されたい）。
【００９６】
ここで、糖尿病分類の方法は、最初のマイクロアレイスクリーンで同定された糖尿病感受性遺伝子の異なる組み合わせの示差的な発現を判定することにより、記述される（表１２Ａを参照されたい）。表１２Ａはまた、選択された遺伝子のそれぞれのジェンバンクアクセス番号（Genbank Accession Number）も含む。
【００９７】
糖尿病感受性遺伝子の遺伝子発現は、多数の異なる技術を使用して生体試料において測定され得る。例えば、種々のｍＲＮＡの混合物内での糖尿病関連遺伝子からのｍＲＮＡの同定は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及び検出可能部分で標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの使用により都合よく達成される。
【００９８】
まず、試験試料が患者から回収される。良質なＲＮＡを得るためには、細胞溶解中に遊離するＲＮアーゼの活性を最小化することが必要である。これは、通常、組織を破壊し、同時にＲＮアーゼを不活性化又は抑制する単離法により達成される。内因性リボヌクレアーゼが少ない試料に対して、単離プロトコルは、一般に、膜を可溶化するための洗浄剤と、胎盤リボヌクレアーゼ抑制剤又はバナジル−リボヌクレオシド複合体などのＲＮアーゼの抑制剤とを含有する抽出緩衝液を使用する。内因性リボヌクレアーゼに富むインタクトな組織又は細胞などのより困難な試料からのＲＮＡ単離は、より積極的なアプローチを必要とする。これらの場合、組織又は細胞は、強力なタンパク質変性剤（通常、グアニジンイソチオシアネート）の中で迅速にホモジナイズされて、ヌクレアーゼを不可逆的に不活性化し、細胞膜を可溶化する。組織試料を直ちにホモジナイズすることができないならば、液体窒素中での浸漬により迅速に凍結させ、−８０℃で保存しなければならない。このやり方で凍結させた試料は、ＲＮＡ単離に先立って決して解凍させてはならず、そうでないと、このＲＮＡは、凍結時に生じる細胞溶解中に遊離したＲＮアーゼにより迅速に分解される。この組織は、液体窒素のプール内に浸漬され、乳鉢及び乳棒を使用して微細な粉末に粉砕されなければならない。いったん粉末化されたら、依然として凍結している組織は、ＲＮＡ抽出緩衝液中でホモジナイズされる。ＲＮＡ単離用の多数のキットが、現在、市販されている（アンビオン（Ambion）、キアゲン（Quiagen））。
【００９９】
当該技術分野において周知であるように、ｃＤＮＡは、まず、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーを使用して、鋳型ｍＲＮＡからｃＤＮＡの第一ストランドを第一に逆転写することにより生じる。本出願による有用な逆転写酵素には、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ及び他のレトロウィルスからの逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない（レビューに関しては、例えば、レビン（Levin）、１９９７年、セル（Cell）８８巻：５〜８頁、バーマ（Verma）、１９７７年、バイオケミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）４７３巻：１〜３８頁、ウー（Wu）ら、１９７５年、ＣＲＣクリティカル・レビューズ・イン・バイオケミストリー（CRC Crit. Rev. Biochem.）３巻：２８９〜３４７頁を参照されたい）。より最近では、多数のキットが、熱安定性逆転写酵素を使用するＲＴ−ＰＣＲ反応のために現在、市販され、例えば、ジェンアンプ（GeneAmp）（登録商標）熱安定性ｒＴｔｈ逆転写酵素ＲＮＡ ＰＣＲキット（Thermostable rTth Reverse Transcriptase RNA PCR Kit）（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））が挙げられる。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号（その内容は、それらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるようなインビトロでの所望のヌクレオチド配列の増幅のための方法を通常指す。ＰＣＲ反応は、繰り返される一連の温度サイクルを伴い、典型的には、１０〜１００μＬの体積で行われる。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４つのデオキシヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのそれぞれ）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ及び核酸鋳型を含む。ＰＣＲ反応は、第一プライマーが核酸鋳型配列の１つのストランド内のある領域に相補的な配列を含有して相補的なＤＮＡストランドの合成を準備刺激し、第二プライマーが標的核酸配列の第二ストランド内のある領域に相補的な配列を含有して相補的なＤＮＡストランドの合成を準備刺激するポリヌクレオチドプライマーのセットを準備することと、（ｉ）鋳型配列内に含有される標的核酸配列に対しての増幅に必要とされるプライマーのアニーリング工程、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成するプライマーを伸長する工程の、ＰＣＲサイクル工程に対して許容的である条件下で、鋳型依存性重合剤として核酸ポリメラーゼを採用する核酸鋳型配列を増幅することと、を含む。
【０１０１】
増幅の他の方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチドに特異的に基づく増幅（ＮＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
プライマーは、核酸関心領域に関わる当業者により、容易に設計及び合成することができる。本出願に使用するのに好適なプライマーは、任意の好適な方法を使用して設計できることが理解される。ＰＣＲのためのプライマー選択は、例えば、米国特許第６，８９８，５３１号（２００５年５月２４日発行、表題「プライマー対の選択のためのアルゴリズム（Algorithms for Selection of Primer Pairs）」）及び米国特許出願第１０／２３６，４８０号（２００２年９月５日出願）に記載されており、短範囲ＰＣＲ（short-range PCR）については、米国特許出願第１０／３４１，８３２号（２００３年１月１４日出願）がプライマー選択に関してのガイダンスを提供している。また、「オリゴ（Oligo）」、レーザージーン（LASERGENE）（登録商標）、プライマー・プレミア（primer premier）５（プレミア・バイオソフト（Premier Biosoft）社のウェブサイトにおいて入手可能）及びプライマー（primer）３（ホワイトヘッド・インスティトゥート・フォー・バイオメディカル・リサーチ（Whitehead Institute for Biomedical Research）（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Cambridge））のウェブサイトにおいて入手可能）などの公に入手可能なプログラムが存在する。プライマー設計は、使用されるハイブリダイゼーション条件に最適な融解温度（Ｔｍ）及びオリゴヌクレオチドプローブの所望の長さなどの多数のパラメータに基づく。更に、オリゴヌクレオチド設計は、ヘアピン構造及びプローブ間のダイマーなどの、分子が含有し得る潜在的な第二の構造を最小化するように試行し、目標は、ハイブリダイゼーションのために得られるプローブの入手可能性を最大化することである。好ましい実施形態では、ＰＣＲ法で使用されるプライマーは、ｃＤＮＡ鋳型内のヌクレオチド配列に相補的であり、好ましくはエクソン−イントロン境界領域を横断する。
【０１０３】
１つの実施形態では、ＰＣＲ反応は、ネステッドＰＣＲプライマーを使用することができる。
【０１０４】
１つの実施形態では、検出可能な標識が、増幅反応に含まれ得る。好適な標識には、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド（Texas Red）、フィリコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシカルボキシフルオセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレスセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレスセイン（５−ＦＡＭ）又はＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射能活性標識、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、並びに、他のものが挙げられる。標識は、二段階システムであってもよく、このシステムでは、増幅されたＤＮＡが、例えば、アビジン、特定の抗体などの高親和性結合パートナーを有するビオチン、ヘプテン、又は同類のものに結合され、この結合パートナーは検出可能な標識に結合される。標識は、プライマーの一方又は両方に結合され得る。あるいは、増幅に使用されるヌクレオチドのプールが、標識を増幅産物に組み込むために標識される。
【０１０５】
特に好ましい実施形態では、本出願は、米国特許第６，１４０，０５４号及び同第６，１７４，６７０号（これらも参照により全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているようなＦＲＥＴプローブの使用などのアッセイシステムを利用するために、ＰＣＲとハイブリダイゼーションプローブを組み合わせたシステムを利用する。その最も単純な構成の１つでは、ＦＲＥＴ、すなわち「蛍光共鳴エネルギー移動」アプローチは、増幅される核酸の同一のストランド上で近接部位を結合する２つのオリゴヌクレオチドを採用する。一方のオリゴヌクレオチドは、第一波長の光を吸収し、それに応じて光を放出するドナー蛍光色素分子で標識され、第二のものは、第一のドナーの発光に応じて蛍光発光できる（しかしながら、実質的には第一のドナーを励起する光源によるのではなく、また、その放出は第一蛍光色素分子のものとは識別することができる）アクセプター蛍光色素分子で標識される。この構成では、第二すなわちアクセプター蛍光色素分子は、２つのオリゴヌクレオチドが、これらが増幅される核酸上の近接部位に対してハイブリッド化する場合、例えば、ＰＣＲのアニーリング局面において、ごく近接するようになる際に生じるような、それが第一すなわちドナー蛍光色素分子にごく近接しているときに、蛍光発生複合体を形成して、蛍光発光の実質的な増加を示す。より多くの増幅される核酸が累積するにつれて、それだけ多くの蛍光発生複合体が形成され得、アクセプタープローブからの蛍光発光の増加が見られ、これは測定することができる。したがって、この方法により、形成される際の産物の量の検出が可能になる。
【０１０６】
増幅の検出が当該技術分野における多数の手段を使用して、例えば、ＰＣＲ反応でタックマン（TaqMan）（商標）ハイブリダイゼーションプローブを、いったん十分な増幅が生じたら標的拡散に特異的な蛍光発光の測定を使用して実施できることが、当業者により理解される。タックマン・リアルタイムＰＣＲは、従来のＰＣＲでのような終点でよりも、むしろ指数関数的段階の間に、蛍光色素分子を介して産物の累積を測定する。産物の指数関数的増大を使用して、閾値サイクル、ＣＴ、すなわち、ＰＣＲサイクルの数を測定し、この数で蛍光発光の有意な指数関数的増大が検出され、この数は、反応において存在するＤＮＡ鋳型のコピーの数に直接相互に関連付けられる。
【０１０７】
しかしながら、タックマンのアプローチに基づくもの（米国特許第５，５３８，８４８号及び同第５，６９１，１４６号（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、蛍光偏光アッセイ（例えば、ギブソン（Gibson）ら、１９９７年、クリニカル・ケミストリー（Clin Chem.）４３巻：１３３６〜１３４１頁）及びインベーダーアッセイ（例えば、アガーワル（Agarwal）ら、ダイアグノスティック・モルキュラー・パソロジー（Diagnostic）、２０００年９月、９巻（３号）：１５８〜１６４頁、ライアン，Ｄ（Ryan D）ら、モルキュラー・ダイアグノシス（Mol Diagn）、１９９９年６月、４巻（２号）：１３５〜１４４頁）などの他の同様な定量的「リアルタイム」及び均一核酸増幅／検出システムが存在することに当業者であれば気付くであろう。このようなシステムもまた、この記載されている出願での使用に適応可能であり、核酸増幅のリアルタイムモニタリングを可能にする。
【０１０８】
本出願の別の実施形態では、マトリックス又はマイクロチップは、それぞれが既知の配列のオリゴヌクレオチドを含有する遺伝子座のアレイを含有するように作製される。本開示では、各遺伝子座は、糖尿病感受性遺伝子の所望の部分に対して相補的な配列を含有するように合成されたモル過剰の選択された固定化合成オリゴマーを含有する。ＰＢＭＣ中に存在する糖尿病感受性遺伝子の転写産物は、本明細書に記載されているように、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅され、標識される。次に、マイクロチップ上のオリゴマーは、標識されたＲＴ−ＰＣＲ増幅糖尿病感受性遺伝子核酸でハイブリッド化される。ハイブリダイゼーションは、マイクロチップ中に埋め込まれた配列と標的配列との間の完全な又はほぼ完全な一致がハイブリダイゼーション中に生じることを確実にするための厳密な条件下で生じる。各遺伝子座で得られる蛍光発光は、ＰＢＭＣ中の１つ以上の糖尿病感受性遺伝子の発現レベルに比例する。
【０１０９】
本出願の他の実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子サイン発現プロファイルは、例えば、ＥＬＩＳＡ若しくは放射免疫アッセイなどの抗体に基づく結合アッセイ、又は、本明細書で定義されているような予め定められたサインの中の遺伝子のタンパク質産物を目的とするタンパク質アレイ含有抗体が挙げられる免疫化学の当該技術分野において周知の技術を使用して、測定される。
【０１１０】
１つの実施形態では、ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子の発現プロファイルが、グルコース耐性正常と２型糖尿病の患者からの末梢血単核球細胞において分析された。
【０１１１】
ヒトシャルコー・ライデン結晶タンパク質遺伝子は、主に好酸球において発現される。ＣＬＣは、ＮＧＴのＰＢＭＣ中、ＩＧＴのＰＢＭＣ中、Ｔ２ＤのＰＢＭＣ中の順に、下方制御される。１０７人の患者のコホートにおけるその発現の平均シグナル強度は、下記の表２に列挙されている。受信者動作特性（ＲＯＣ）解析は、ＣＬＣ遺伝子発現レベルがＩＧＴ／Ｔ２ＤからＮＧＴを分離するために使用できることを示した。
【表１】
【０１１２】
臨床状態の予測におけるＣＬＣ遺伝子の機能は、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を使用して、更に調査された。ＲＯＣ曲線は、感度と特異度との間の関係を示す。すなわち、感度の増加は、特異度の減少を伴う。曲線が左の軸に、それゆえにＲＯＣ空き領域の上端に、より近接して沿うにつれて、試験はより正確になる。逆に、曲線がＲＯＣグラフの４５°対角線に、より近接するようになるにつれて、試験はより不正確になる。ＲＯＣの下の面積は、試験の正確性の尺度である。試験の正確性は、その試験が、試験される集団を問題の病気を有するものと有さないものとに、どれだけよく分類するかに依存する。曲線の下の面積（「ＡＵＣ」と呼ぶ）＝１は完璧な試験を示し、一方で、面積＝０．５はより有用でない試験を示す。それゆえに、本出願の好ましい遺伝子及び診断方法は、０．５０を超えるＡＵＣを有し、より好ましい試験は０．６０を超えるＡＵＣを有し、更に好ましい試験は０．７０を超えるＡＵＣを有する。
【０１１３】
曲線の下の面積（ＡＵＣ）は、患者の状態の予測において、ＣＬＣ遺伝子の機能の尺度として計算された。ＣＬＣ遺伝子状態の受信者動作特性（ＲＯＣ）解析は、ＣＬＣ遺伝子発現レベルがＩＧＴ／Ｔ２ＤからＮＧＴを分離するために使用できることを示した（図１を参照されたい）。
【０１１４】
転写因子７様２（ＴＣＦ７Ｌ２）をコード化する遺伝的変異型は、２型糖尿病及びβ細胞インスリン機能異常の進行の危険性に強く関連している（米国特許出願公開第２００６／０２８６５８８号（その内容はこれにより本明細書にその全体が組み込まれる）を参照されたい）。ゲノムワイド関連研究は、ＴＣＦ７Ｌ２内のＳＮＰが、ＣＤＫＡＬ１、ＣＤＫＮ２Ａ／２Ｂ、ＦＴＯ、ＩＧＦ２ＢＰ２及びＳＬＣ３０Ａ８などの他のマーカー遺伝子中のＳＮＰ（リスクスコアの範囲は１．１２〜１．２０）に比較して、２型糖尿病進行の予測に関する最高の生涯リスクスコアを与えることを示唆する。ＴＣＦ７Ｌ２は広く発現し、この転写因子は、ＷｎＴファミリーのタンパク質のメンバーからの発生シグナルに反応することが知られている。機能的及び遺伝学的研究は、腸の発達及び腸内分泌細胞中のプログルカゴン遺伝子発現においてＴＣＦ７Ｌ２が果たす決定的な役割を指摘する。
【０１１５】
ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子が、単独で若しくは組み合わせてのいずれかで糖尿病の診断マーカーとなるかどうかを確かめるために、インスティトゥート・フォー・クリニカル・リサーチ＆ディブロップメント（Clinical Research & Development）（ＩＫＦＥ）（ドイツ、マインツ（Mainz））の協力でドイツ人の母集団から１８０人の被験者を募集した。患者試料回収に先立って、適切なＩＲＢ承認を得た。採用基準は、糖尿病の診断歴を有さない１８〜７５歳及びボディマス指数（ＢＭＩ）≧３０の患者、法的能力、並びに臨床研究及び必要とされる手順の性質と範囲とを理解する能力からなった。除外基準は、最近３０日以内の献血、インスリン依存型真性糖尿病、授乳期若しくは妊娠中の女性、研究の途中で妊娠する予定のある女性、避妊を行っていない性的に活発な女性、重度／複合アレルギーの病歴、ドラッグ若しくはアルコールの濫用、研究要件遵守の欠落からなった。７５ｇ経口グルコース負荷試験結果（ＯＧＴＴ）を含む全ての臨床測定値を、標準的な手順を使用して得た。
【０１１６】
血液試料を、静脈穿刺によりＣＰＴチューブ（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences））の中に吸引した。ＰＢＭＣを、製造者のプロトコルに従って単離し、最終的な細胞沈殿物を１ｍＬのトリゾール（Trizol）（インビトロジェン（Invitrogen））中に再懸濁し、−８０℃で保存した。続いて、全ＲＮＡを、製造者のプロトコルに従って純化し、ＤＥＰＣ処理したｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＲＮＡの定量及び品質を、ＮＤ−１０００分光光度計（Spectrophotometer）（ナノドロップ（NanoDrop））を使用して行い、リボグリーン（RiboGreen）キット（モルキュラー・プローブス（Molecular Probes））での分光光度的定量化により再確認した。ＲＮＡ鋳型の品質を、バイオアナライザー（Bioanalyzer）２１００（アジレント・テクノロジー（Agilent Technologies））を使用することにより、測定した。
【０１１７】
第一ストランドｃＤＮＡ合成を、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（High Capacity cDNA Reverse Transcription kit）（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を用い、各患者ＰＢＭＣ試料からの全ＲＮＡ２００ｎｇを使用して、行った。その後、反応混合物をｄｄＨ２Ｏで１０倍に希釈し、４μＬを、ＡＢＩプリズム７９００ＨＴ（ABI Prism 7900HT）配列検出システム上で１０μＬのタックマン（Taqman）ＰＣＲ反応中で鋳型として使用した。反応成分は、２ＸタックマンＰＣＲマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ）、０．９μＭの各プライマー、及び０．２５μＭの蛍光標識されたプローブ（バイオサーチ・テクノロジーズ（Biosearch Technologies））からなった。ＲＴ−ＰＣＲタックマンアッセイにおいて使用されるプライマー／プローブセットについての配列は、表３に示される。
【０１１８】
逆転写工程のためのサイクル条件は以下の通りである：
【表２】
【表３】
【０１１９】
ＴＣＦ７Ｌ２に特異的な２つの異なるプライマー／プローブの組み合わせ及びＣＬＣのための１つのプライム／プローブを使用するタックマンアッセイによる定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、それぞれの患者からのＰＢＭＣから単離したＲＮＡについて行った。ＰＣＲ工程についての熱サイクルプロファイルは、以下のように、９５℃を１０分、続いて、９５℃（１５秒）及び６０℃（１分）を４０サイクルであった。Ｃｔ値を、０．２〜０．３の閾値設定でＳＤＳバージョン２．１ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ）を使用して、生データから計算した。ピアソン相関によるＲｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎの再現性は、上記マーカーについて、Ｒ２＝０．９６〜０．９８であった。ΔＣｔ（サイクル閾値）の値を、目的のマーカーのＣｔからハウスキーピングβ−アクチン遺伝子のＣｔを減ずること、例えば、ＴＣＦ７Ｌ２の場合は、Ｃｔ ＴＣＦ７Ｌ２−Ｃｔアクチン、により計算した。［２−（ΔＣｔ）×１０００］の値を使用して、β−アクチンに対するＴＣＦ７Ｌ２の発現を表した。ＯＧＴＴの結果を、真の臨床状態として使用した。スチューデントのＴ検定を、正規化されたＣｔ値を使用して遺伝子マーカーの発現レベル間の統計的有意性を決定するために使用した。
【０１２０】
２時間ＯＧＴＴ測定及び現行のＡＤＡガイドラインに基づいて、研究に参加した１８０人の患者のうち、１０４人の患者をＮＧＴ（グルコース耐性正常）として、４９人の患者をＩＧＴ（グルコース耐性異常）として、分類し、２７人の患者はＴ２Ｄ（２型糖尿病）と考えられた。このＴ２Ｄ被験者は本研究で初めて糖尿病と診断されたので、各患者の病気の持続時間、及び、どれだけの期間ＰＢＭＣが高血糖微小環境に維持されていたかは、分からなかった。
【０１２１】
各患者に関し、β−アクチンに対して正規化されたＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣの発現レベルについてのｔ検定解析を、プライマー／プローブセットの値に基づき、グルコース耐性により分類して、表４に記す。ＮＧＴ及びＩＧＴにＴ２Ｄを加えた患者集団は、スチューデントのｔ検定による発現レベル間に統計的有意差を有し、それぞれｐ値＝０．００４（ＴＣＦ７Ｌ２セット１）、０．０２１（ＴＣＦ７Ｌ２セット３）及び０．０２２（ＣＬＣ）であった。これらの結果は、ＮＧＴに対する、糖尿病前症（ＩＧＴ）患者の、又は、糖尿病前症及びＴ２Ｄ患者を一緒にした組み合わせの、ＰＢＭＣにおけるＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子の示差的発現を示す。
【表４】
【０１２２】
次に、正常又は糖尿病前症／糖尿病として患者を分類するための診断ツールとしてＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣタックマンアッセイの機能を、２時間ＯＧＴＴと比較して、評価した。各ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣプライマー／プローブセットの正規化ΔＣｔ値について、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作製した（表５、図２Ａ及び２Ｂ）。ＴＣＦ７Ｌ２セット１及びＣＬＣのＰＣＲアッセイについてのＡＵＣ値はそれぞれ０．６３及び０．６１であった。２時間ＯＧＴＴ分類に比較して、ＰＢＭＣからのＴＣＦ７Ｌ２セット１の発現は、正常であるか又は糖尿病前症／糖尿病であるかに患者を正しく分類することができ、ＦＰＧ試験と共に使用したとき、ＡＵＣ＝０．７３であった（図２Ａ及び２Ｂ）。ＣＬＣは、ＴＣＦ７Ｌ２セット１に添加値を有さず、診断アルゴリズムとして考えられなかった。更に、ＦＰＧ≧１２６ｍｇ／ｄＬ（糖尿病とも考えられる）を有する１４人の患者を除外しても、アッセイの機能に変化は生じなかった。
【表５】
【０１２３】
１つの実施形態では、マイクロアレイ分析で選択されたか各遺伝子（表１を参照されたい）は、２時間ＯＧＴＴの結果とより近接して一致するように、ＴＣＦ７Ｌ２セット１の機能と組み合わされてもよい。
【０１２４】
別の実施形態では、２型糖尿病の危険性と強く関連する遺伝子（表６を参照されたい）もまた、２時間ＯＧＴＴの結果とより近接して一致するように、ＴＣＦ７Ｌ２セット１の機能と組み合わされてもよい。別の実施形態では、表１の１つ以上の遺伝子と組み合わせた表６の遺伝子を、糖尿病状態の診断に関する遺伝子サインについて本明細書に記載しているように試験することができる。
【表６】
【０１２５】
別の実施形態では、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーのメンバー、の発現もまた、ＮＧＴ及びＴ２ＤからＰＢＭＣにおいて示差的に発現された。
【０１２６】
ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーは、３つのメンバー、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ及びＣＤＫＮ１Ｃ、からなる。３つのメンバーの全ては、哺乳類細胞周期の制御において中心的な役割を果たすＣＤＫ４の活性を抑制することができる。膵島β細胞の複製は、β細胞の量的ホメオスタシスの維持おいて本質的な役割を果たす。ＣＤＫ４が体重及び膵臓β細胞増殖の制御において重要な役割を有することが知られている。マウスでは、ＣＤＫ４遺伝子の欠損はβ細胞量の減少に起因してインスリン欠乏性糖尿病を生じたが、一方で、ＣＤＫ４の活性化は、β膵島細胞の過形成を引き起こした。最近、２型糖尿病のゲノムワイド関連研究が、ＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子近傍のヌクレオチド変異が２型糖尿病の危険性に関連することを明らかにした。更に、ＣＤＫＮ２Ａの過剰発現は、老齢マウスにおいて膵島増殖の減少を導き、ＣＤＫＮ２Ｂの過剰発現は、マウスモデルにおける膵島過形成及び糖尿病に関連する。ＣＤＫＮ１Ｃは、染色体１１ｐ１５．５上に位置する母系発現遺伝子であり、ベックウィズ−ヴィードマン症候群（ＢＷＳ）、新生児高インスリン性低血糖症、並びに、出生前及び後の過成長に特徴付けられる疾患の病理発生に関わる。最近の研究はまた、ＣＤＫＮ１Ｃはインスリンにより下方制御され、ＣＤＫＮ１Ｃの変異型は２型糖尿病患者の出生時体重の増加に関連し得ることを示した。細胞周期の制御に加えて、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーは、アポトーシス、転写制御、分化及び細胞移動などの他の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。１０７人の患者コホートにおけるこの３つの遺伝子の発現を分析した。ＣＤＫＮ１Ｃのみが、ＮＧＴ、ＩＧＴ及びＴ２Ｄの間で示差的な発現を表した（表７を参照されたい）。ＨＧ−Ｕ１３３プラス２ジーンチップ（HG-U133Plus2 GeneChip）上でＣＤＫＮ１ＣをＰＢＭＣにおいて発現する５つのプローブが存在する。これらのそれぞれが、ＮＧＴとＩＧＴ／Ｔ２Ｄとの間で示差的な発現を表した（表７）。ＲＯＣ解析は、５つのプローブの発現レベルを使用して、Ｔ２ＤからＮＧＴを分類できることを示した（図３）。
【表７】
【０１２７】
当業者であれば、記載されている実施形態が糖尿病の診断ツールとして遺伝子サインを調査するという前提を与えていることを認識するであろう。正常な被験者と、糖尿病前症及び糖尿病の患者との間の根底にある生物学的プロセスを調査するために、経路解析を実施した。すなわち、ＨＧ−Ｕ１３３プラス２チップ上のプローブを、ユー（Yu）ら、ＢＭＣキャンサー（BMC Cancer）７巻：１８２ページ（２００７年）に記載されているような遺伝子オントロジー生物学的プロセス（Gene Ontology Biological Process）（ＧＯＢＰ）にマッピングした。非常に低い発現を有する遺伝子は、より高い変異を有する傾向があるので、データセットにおいて平均強度が２００未満である遺伝子を経路解析から除外した。結果として、２１２４７個のプローブを確保した。糖尿病前症又は糖尿病の進行と有意な関連を有する経路を同定するために、大域的検定プログラム（global test program）を、ＮＧＴ ｖｓ．ＩＧＴ、ＮＧＴ ｖｓ．Ｔ２Ｄ、又はＮＧＴ ｖｓ．ＩＧＴ＋Ｔ２Ｄを比較することにより、行った。少なくとも１０個のプローブ及び有意なｐ値（ｐ＜０．０５）を有する経路を各比較について同定した。３つの比較を通して患者の結果について一貫した相関を有する３つの経路が存在した。これらは、Ｂ細胞活性化（ＧＯ００４２１１３）、体液性免疫反応（ＧＯ０００６９５９）、及び複製時のＤＮＡの巻き戻し（ＧＯ０００６２６８）である。３つの経路の中で、Ｂ細胞活性化及び体液性免疫反応は、主に、糖尿病との負の相関を有し（ＩＧＴ／Ｔ２Ｄにおいてより低い発現）、一方で、複製時のＤＮＡの巻き戻しは、糖尿病との正の相関を有した（ＩＧＴ／Ｔ２Ｄにおいてより高い発現）。
【０１２８】
３つの鍵となる経路から経路に基づく遺伝子サインを構築するために、ｐ＜０．０５である遺伝子をプールし、これらの統計的有意性（大域的検定からのｚスコア）に基づいて分類した。遺伝子がリスト内の１つを超えるプローブを有し、これらの挙動が一致するならば、最高の有意性を有するものが確保された。遺伝子がリスト内の１つを超えるプローブを有し、これらの挙動が反対であるならば、この遺伝子の全てのプローブは除去された。結果として、１４個の特異的な遺伝子を得た（以下の表８を参照されたい）。
【表８】
【０１２９】
比較的高い変異を有する遺伝子を使用するサインを構築するために、ＣＶ＞０．２５である１０個の遺伝子を確保した。サインに最適な数の遺伝子を決定するために、上位２〜１０遺伝子の組み合わせをデータセット内で調査した。結果は、上位３遺伝子が患者の結果の予測に最良の機能を与えることを示した。この３つの遺伝子、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１は以下の表９にある。
【表９】
【表１０】
【０１３０】
１０７人の患者のコホートにおける３つの遺伝子サインのＲＯＣ分析（図４Ａ及び４Ｂ）は、このサインがＩＧＴ／Ｔ２ＤからＮＧＴを分類できることを表す。遺伝子の平均発現を表すヒストグラムを図４Ｃに示す。
【０１３１】
非情報提供性遺伝子を除去し、コホート内で１０以上のプレゼンスコール（presence call）を有する遺伝子のみを確保した。次に、１０７人の患者のコホートを５４人のトレーニングセットと５３人の試験セットとに分けた。ＯＧＴＴ分類に基づいて、トレーニングセットには２８人のＮＧＴ、１７人のＩＧＴ及び９人のＴ２Ｄが存在するが、一方で、試験セットには２９人のＮＧＴ、１６人のＩＧＴ及び８人のＴ２Ｄが存在する。ＮＧＴと、ＩＧＴ＋Ｔ２Ｄ患者との間で示差的な発現を有する遺伝子を同定するために、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）プログラムを行った。フォールス・ディスカバリー・レート（ＦＤＲ）が２０％未満であれば、遺伝子を選択した。結果として、２３５個の遺伝子を選択した。更に遺伝子リストを絞るために、２つの集団間で１．５よりも大きな倍率変化を有し、データセットの平均強度が２００よりも大きい遺伝子を確保した。結果として、１７個のプローブを確保した。これらの中で、４つは、ヘモグロビン遺伝子を発現するプローブであった。ヘモグロビンが赤血球においてきわめて高い発現を有することを考慮して、生じ得る混入を排除するためにこの４つのプローブを除外した。サインとしての遺伝子の最適な数を決定するために、上位の遺伝子の組み合わせの機能をトレーニングセットの２〜１３で調査した。結果は、上位１０遺伝子が曲線の下の面積（ＡＵＣ）に基づいて最良の機能を与えることを示した（表１０を参照されたい）。
【表１１】
【表１２】
【０１３２】
遺伝子サインを更に評価するために、試験セットにおける患者の結果を判定した。空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）レベルを使用する糖尿病前症及び糖尿病の予測もまた調査した。遺伝子サインとＦＰＧレベルとの間の相補的な効果を調査するために、これら２つの予測因子の組み合わせを使用して患者の結果を予測した。試験セットでＦＰＧ又は１０個の遺伝子サイン、あるいはＦＰＧと１０個の遺伝子サインとの組み合わせを使用する中でのＲＯＣ解析の比較を図５に示す。これは、１０個の遺伝子サインがＩＧＴ／Ｔ２ＤからＮＴＧを独立に分けることができ、ＦＰＧ及び１０個の遺伝子サインがより良好な予測のために相補的であることを表す（図５Ａ及び５Ｂを参照されたい）。１０７人の患者のコホートにおける１０個の遺伝子の平均発現シグナルを図５Ｃの一覧表及び棒グラフに示す。
【０１３３】
臨床データの統計分析は、ＮＧＴとＴ２Ｄとで示差的に発現される３個の遺伝子及び１０個のサインを同定した。
【０１３４】
別の実施形態では、診断アッセイは、糖尿病前症／糖尿病に対する正常のポイントオブケア分類について、又は、定義された期間、例えば、１／２〜２年、若しくは２〜５年、若しくは５〜１０年、若しくはそれ以上、にわたっての糖尿病前症／糖尿病の進行の予測について記載される。
【０１３５】
あるいは、遺伝子発現プロファイルは、例えば、ＥＬＩＳＡ又はプロテオミクスアレイ（proteomic array）を使用して、ｍＲＮＡによりコード化されたタンパク質の検出によって、決定される。これらの方法のすべては、当該技術分野において周知である。
【０１３６】
本明細書の開示はまた、患者における糖尿病状態の診断のための１つ以上の試薬を有するパッケージユニットを含むキットフォーマットも提供する。このキットは、以下の品目のうち１つ以上を含有し得る：緩衝液、使用説明書、及び、正又は負の対照。キットは、本明細書で記載されている方法を行うのに好適な比率で一緒に混合された試薬の容器を含み得る。試薬容器は好ましくは、本方法を行うときに計量工程を不要にする単位量で試薬を含有する。
【０１３７】
キットは、滅菌針、及び、患者の血液を回収するためのチューブ／容器を含み得る。回収チューブは典型的には、血液凝固を抑制するために、特定の添加剤、例えば、ヘパリン、を含有する。
【０１３８】
キットはまた、患者の試料における遺伝子サイン発現プロファイルの測定のための試薬を含有し得る。本明細書で開示されているように、遺伝子サイン発現プロファイルは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、マイクロチップを使用するオリゴヌクレオチドアッセイ、又は、ＥＬＩＳＡアッセイなどのタンパク質に基づくアッセイを当該技術分野において既知の種々の方法によって測定され得る。
【０１３９】
好ましい実施形態では、遺伝子サイン発現プロファイルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定される。
【０１４０】
増幅の１つの実施形態では、キットは、患者の血液試料における遺伝子サイン発現の増幅及び検出のプライマーを含む。プライマーは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４、ＳＴＡＰ１、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ、ＮＯＧ遺伝子などの本明細書に記載されているような糖尿病感受性遺伝子のいずれか、又は表１若しくは６に列挙されている遺伝子のいずれかに相補的である配列を有する。
【０１４１】
糖尿病感受性遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために使用されるプライマー配列の例は、表１２及び１２Ｃに開示される。
【０１４２】
好ましい実施形態では、キット試薬は、ＦＤＡのインビトロ診断オフィス（FDA's Office of In Vitro Diagnostics）（ＦＤＡ−ＯＩＶＤ）により是認されたＰＣＲに基づく技術であるアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）による７５００ファストＤｘリアルタイムＰＣＲインストルメント（7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument）で機能するように設計される。
【０１４３】
更に別の実施形態では、キットは、３つの遺伝子（ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１）又は１０個の遺伝子（ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ）サインのハイブリダイゼーションプローブのアレイを含むマイクロチップを含む。別の態様では、マイクロチップは更に、表１又は６に列挙されている１つ以上の遺伝子のための１つ以上のハイブリダイゼーションプローブのアレイを含み得る。
【０１４４】
好ましい実施形態では、マイクロチップは、１〜５５，０００超のｍＲＮＡの遺伝子発現を平行して測定できるアフィメトリックス・ジーンチップＤｘ（Affymetrix GeneChipDx）技術で機能するように設計される。ＦＤＡ−ＯＩＶＤ、これはロシュ・モルキュラー・ダイアグノスティック（Roche Molecular Diagnostics）からのアンプリチップ（AmpliChip）Ｐ４５０製品及び経路診断組織起源試験（Pathwork Diagnostics Tissue of Origin test）での使用に関するプラットフォーム。
【表１３−１】
【表１３−２】
【表１３−３】
【表１３−４】
【表１３−５】
【表１３−６】
【表１３−７】
【表１３−８】
【表１４】
【表１５】
【表１６−１】
【表１６−２】
【表１６−３】
【表１６−４】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【０１４５】
〔実施の態様〕
（１） 患者における真性糖尿病を診断する方法において、
ａ．患者から採取された試験試料を提供する工程と、
ｂ．ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程と、
ｃ．前記遺伝子発現プロファイルを前記遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程と、
ｄ．前記遺伝子発現プロファイルと前記診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて前記患者における糖尿病状態を判定する工程と、
ｅ．前記判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、方法。
（２） 前記判定工程がコンピュータシステムにより遂行され、前記コンピュータシステムが、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）からなる群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行する、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記判定工程が、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む、実施態様２に記載の方法。
（４） 前記遺伝子サインが、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記糖尿病状態が、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態である、実施態様１に記載の方法。
（６） 前記試験試料が、血液試料である、実施態様１に記載の方法。
（７） 前記試験試料が、ＰＢＭＣ又はＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含む、実施態様１に記載の方法。
（８） 前記測定工程が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ若しくは特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴う、実施態様１に記載の方法。
（９） 患者における真性糖尿病を診断する方法において、
ａ．患者から採取された試験試料を提供する工程と、
ｂ．前記試験試料において、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程と、
ｃ．前記遺伝子発現プロファイルを前記遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程と、
ｄ．前記遺伝子発現プロファイルと前記診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて前記患者における糖尿病状態を判定する工程と、
ｅ．前記判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、方法。
（１０） 遺伝子サインの前記遺伝子発現プロファイルが、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む、実施態様９に記載の方法。
【０１４６】
（１１） 前記判定工程がコンピュータシステムにより遂行され、前記コンピュータシステムが、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）からなる群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行する、実施態様１０に記載の方法。
（１２） 前記判定工程が、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む、実施態様９に記載の方法。
（１３） 前記糖尿病状態が、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態である、実施態様９に記載の方法。
（１４） 前記試験試料が血液試料である、実施態様９に記載の方法。
（１５） 前記試験試料が、ＰＢＭＣ又はＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含む、実施態様９に記載の方法。
（１６） 前記測定工程が、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴う、実施態様９に記載の方法。
（１７） 患者における真性糖尿病を診断する方法において、
ａ．患者から採取された試験試料を提供する工程と、
ｂ．前記試験試料において、ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程と、
ｃ．前記遺伝子発現プロファイルを前記遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程と、
ｄ．前記遺伝子発現プロファイルと前記診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて前記患者における糖尿病状態を判定する工程と、
ｅ．前記判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、方法。
（１８） 前記判定工程がコンピュータシステムにより遂行され、前記コンピュータシステムが、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）からなる群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行する、実施態様１７に記載の方法。
（１９） 前記判定工程が、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む、実施態様１８に記載の方法。
（２０） 前記遺伝子サインが、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子を更に含む、実施態様１７に記載の方法。
【０１４７】
（２１） 前記糖尿病状態が、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態である、実施態様１７に記載の方法。
（２２） 前記試験試料が、血液試料である、実施態様１７に記載の方法。
（２３） 前記試験試料が、ＰＢＭＣ又はＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含む、実施態様１７に記載の方法。
（２４） 前記測定工程が、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴う、実施態様１７に記載の方法。
（２５） 患者の糖尿病状態における変化を診断する方法において、
ａ．第一時点で患者から採取された第一試験試料を提供する工程と、
ｂ．前記第一試験試料における遺伝子サインの第一発現プロファイルを測定する工程であって、前記遺伝子サインが、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む遺伝子の第一の群から、又は、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む遺伝子の第二の群から選択される、測定する工程と、
ｃ．第二時点で前記患者から採取された第二試験試料を提供する工程と、
ｄ．前記第二試験試料における前記遺伝子サインの第二発現プロファイルを測定する工程と、
ｅ．前記第一発現プロファイルを前記第二発現プロファイルと比較する工程と、
ｆ．前記第一遺伝子発現プロファイルと前記第二遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な差異に少なくとも部分的に基づいて前記患者における糖尿病状態の変化を判定する工程と、
ｇ．前記判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、方法。
（２６） 前記判定工程がコンピュータシステムにより遂行され、前記コンピュータシステムが、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）からなる群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行する、実施態様２５に記載の方法。
（２７） 前記判定工程が、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む、実施態様２５に記載の方法。
（２８） 前記第一時点と前記第二時点との間の期間が、０〜２年又は１／４〜２年又は１／２〜２年又は２〜５年又は５〜１０年又は若しくはそれ以上である、実施態様２５に記載の方法。
（２９） 前記糖尿病状態が糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態である、実施態様２５に記載の方法。
（３０） 前記第一及び第二試験試料が血液試料である、実施態様２５に記載の方法。
【０１４８】
（３１） 前記測定工程が、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴う、実施態様２５に記載の方法。
（３２） 患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子又はこれらの変異型を含む遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
（３３） 試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、実施態様３２に記載のキット。
（３４） 遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、実施態様３２に記載のキット。
（３５） 患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
（３６） 試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、実施態様３５に記載のキット。
（３７） 遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、実施態様３５に記載のキット。
（３８） 患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
（３９） 試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、実施態様３８に記載のキット。
（４０） 遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、実施態様３８に記載のキット。
【開示の内容】
【０００１】
〔出願の分野〕
本出願は、医療診断の分野に関し、患者における糖尿病状態のポイントオブケア診断のための方法及びキットを記述する。
【０００２】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国特許仮出願第６０／９８７，５４０号（２００７年１１月１３日出願）からの優先権を主張し、これにより本出願にその全体が組み込まれる。
【０００３】
〔発明の背景〕
糖尿病は、インスリン産生、インスリン活性、又はその両方における欠陥の結果による高濃度の血中グルコースによって特徴付けられる一群の病気である。未処置のまま放置されると、低血糖症、ケトアシドーシス又は非ケトン性高浸透圧性昏睡の症状を含む多くの重篤な短期合併症を生じる恐れがある。長期では、糖尿病は、動脈硬化症、慢性腎不全、網膜障害（失明など）、神経損傷及び微小血管損傷の危険性の増加を引き起こすことが知られている。
【０００４】
発展しつつある世界における糖尿病の流行的広がりは、米国におけるヘルスケアシステムに重大な影響を及ぼすと予想される。米国疾病管理予防センター（the Center for Disease Control and Prevention）による近年の研究は、米国において過去１０年間でほぼ２倍の新規糖尿病症例が発生していることを示している。２００７年時点で、米国内で少なくとも５７００万人が糖尿病前症を有する。既に糖尿病にかかっているほぼ２４００万人と合わせると、これは、米国人口の２５％超をこの病気からの更なる合併症に対する危険性にさらすことになる。米国糖尿病学会によれば、２００７年における米国内の糖尿病の推定コストは、１７４０億ドルにのぼり、直接医療コストはほぼ１１６０億ドルである。
【０００５】
糖尿病の原因は、本来は多因子であると思われるが、増えつつある実験的証拠は、肥満、特に腹部肥満の発症が免疫及び代謝ホメオスタシスを乱し、最終的に広範な炎症反応に導くことを示唆している。ＴＮＦ−αなどの、脂肪組織における炎症性サイトカインの産生は、その後、免疫反応、及び、細胞のインスリンに対して反応する能力を調節解除する。それゆえに、単球及びマクロファージなどの循環している免疫細胞の転写プロファイルの変化の検出は、グルコース不耐性の更に顕著な兆候が明らかになる前に、疾患を診断し、その進行をモニターするための便利な手段を提供する。
【０００６】
このような理由から、糖尿病の進行の危険性にさらされている患者の診断及びモニタリングのための迅速かつ正確な診断アッセイに対して、未達成の必要性が存在する。特に、早期発症型糖尿病に関する患者のルーチンスクリーニングのためのポイントオブケア施設において容易に使用できるキットフォーマットでの診断アッセイに対して、未達成の必要性が存在する。
【０００７】
〔出願の概要〕
糖尿病前症及び糖尿病状態の特徴である遺伝子サイン発現プロファイルの判定のための方法が記載される。本開示は、更に、患者の血液試料における遺伝子サイン発現プロファイルの迅速な測定のための試薬を含む診断キットに関する。このキットフォーマットは、費用対効果に優れ、ポイントオブケア施設での使用に便利である。
【０００８】
１つの実施形態では、患者における真性糖尿病の診断のための方法が記載され、この方法は、（ａ）患者から採取された試験試料を提供する工程、（ｂ）ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）遺伝子発現プロファイルを遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程、（ｄ）遺伝子発現プロファイルと診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態を判定する工程と、（ｅ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む。
【０００９】
判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行することができる。判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含むことができる。
【００１０】
遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子又は３つ全ての遺伝子を含むことができる。１つの実施形態では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含むことができる。
【００１１】
患者は、正常なＢＭＩを有し得る。糖尿病状態は、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態であり得る。
【００１２】
試験試料は、血液試料、又は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００１３】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００１４】
別の実施形態では、患者における真性糖尿病の診断のための方法が記載され、この方法は、（ａ）患者から採取された試験試料を提供する工程、（ｂ）ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）遺伝子発現プロファイルを遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程、（ｄ）遺伝子発現プロファイルと診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態を判定する工程と、（ｅ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む。
【００１５】
判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行することができる。判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含むことができる。
【００１６】
遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子又は任意の３つの遺伝子を含むことができる。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される少なくとも１つの遺伝子に加えて、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００１７】
患者は、正常なＢＭＩを有し得る。糖尿病状態は、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態であり得る。
【００１８】
試験試料は、血液試料、又は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００１９】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００２０】
１つの実施形態では、患者における真性糖尿病の診断のための方法が記載され、この方法は、（ａ）患者から採取された試験試料を提供する工程、（ｂ）ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）遺伝子発現プロファイルを遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程、（ｄ）遺伝子発現プロファイルと診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態を判定する工程と、（ｅ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む。
【００２１】
判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行することができる。判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析も含むことができる。
【００２２】
遺伝子サインは、ＴＣＦ７Ｌ２又はＣＬＣのいずれかの遺伝子を含むことができる。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＣＦ７Ｌ２又はＣＬＣ遺伝子の１つ以上の変異型を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＣＦ７Ｌ２又はＣＬＣのいずれかの遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００２３】
患者は、正常なＢＭＩを有し得る。糖尿病状態は、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態であり得る。
【００２４】
試験試料は、血液試料、又は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００２５】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００２６】
１つの実施形態では、（ａ）第一時点で患者から採取された第一試験試料を準備する工程、（ｂ）第一試験試料におけるＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される遺伝子を含む遺伝子サインの第一発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）第二時点で患者から採取された第二試験試料を提供する工程、（ｄ）第二試験試料における遺伝子サインの第二発現プロファイルを測定する工程、（ｅ）第一発現プロファイルを第二発現プロファイルと比較する工程、（ｆ）第一遺伝子発現プロファイルと第二遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な差異に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態の変化を判定する工程と、（ｇ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、患者の糖尿病状態における変化を診断するための方法が記載される。
【００２７】
１つの態様では、判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行される。別の態様では、判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析も含む。
【００２８】
遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子を含むことができる。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される１つの遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００２９】
１つの態様では、第一時点と第二時点との間の期間は、０〜２年又は１／４〜２年又は１／２〜２年又は２〜５年又は５〜１０年若しくはそれ以上である。
【００３０】
糖尿病状態における変化は、糖尿病前症状態又はＩＩ型糖尿病状態への進行を示すことができる。１つの態様では、第一時点の患者は、正常なＢＭＩを有する。
【００３１】
第一及び第二試験試料は、血液試料であり得る。１つの態様では、第一及び第二試験試料は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００３２】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００３３】
１つの実施形態では、（ａ）第一時点で患者から採取された第一試験試料を提供する工程、（ｂ）第一試験試料におけるＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される遺伝子を含む遺伝子サインの第一発現プロファイルを測定する工程、（ｃ）第二時点で患者から採取された第二試験試料を準備する工程、（ｄ）第二試験試料における遺伝子サインの第二発現プロファイルを測定する工程、（ｅ）第一発現プロファイルを第二発現プロファイルと比較する工程、（ｆ）第一遺伝子発現プロファイルと第二遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な差異に少なくとも部分的に基づいて患者における糖尿病状態の変化を判定する工程と、（ｇ）判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、患者の糖尿病状態における変化を診断するための方法が記載される。
【００３４】
１つの態様では、判定工程は、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）の群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行するコンピュータシステムにより、遂行される。別の態様では、判定工程はまた、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む。
【００３５】
遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子を含むことができる。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される任意の３つの遺伝子を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００３６】
１つの態様では、第一時点と第二時点との間の期間は、０〜２年又は１／４〜２年又は１／２〜２年又は２〜５年又は５〜１０年又はそれ以上である。
【００３７】
糖尿病状態における変化は、糖尿病前症状態又はＩＩ型糖尿病状態への進行を示すことができる。１つの態様では、第一時点の患者は、正常なＢＭＩを有する。
【００３８】
第一及び第二試験試料は、血液試料であり得る。１つの態様では、第一及び第二試験試料は、ＰＢＭＣ若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含有する試験試料であり得る。
【００３９】
測定工程は、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴うことができる。
【００４０】
別の実施形態では、患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットが記載され、この査定は、試験装置により行われる。このキットは、（ａ）患者から試験試料を回収するための試薬と、（ｂ）患者の試験試料におけるＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子又はこれらの変異型を含む遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、を含む。
【００４１】
工程（ａ）及び（ｂ）の試薬は、複数回の試験に十分である。患者から試験試料を回収するための試薬は、滅菌容器の内にパッケージ化することができる。
【００４２】
遺伝子サインは、ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６の列挙から選択される１つ以上の遺伝子と、を含むことができる。
【００４３】
試験試料は、血液試料であり得る。
【００４４】
キットはまた、ＰＢＭＣの単離のための試薬、又は、ＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞の単離のための試薬、又は、ＣＤ１４＋単球の単離のための試薬、を含むことができる。遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬は、リアルタイムＰＣＲ試薬、免疫化学的アッセイ試薬又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション用であり得る。
【００４５】
別の実施形態では、患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットが記載され、この査定は、試験装置により行われる。このキットは、（ａ）患者から試験試料を回収するための試薬と、（ｂ）患者の試験試料におけるＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子又はこれらの変異型を含む遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、を含む。
【００４６】
遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される任意の２つの遺伝子を含むことができる。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子を含む。別の態様では、遺伝子サインは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６の遺伝子の列挙から選択される１つ以上の遺伝子と、を含む。
【００４７】
工程（ａ）及び（ｂ）の試薬は、複数回の試験に十分である。患者から試験試料を回収するための試薬は、滅菌容器の内にパッケージ化することができる。
【００４８】
試験試料は、血液試料であり得る。
【００４９】
キットはまた、ＰＢＭＣの単離のための試薬、又は、ＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞の単離のための試薬、又は、ＣＤ１４＋単球の単離のための試薬、を含むことができる。遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬は、リアルタイムＰＣＲ試薬、免疫化学的アッセイ試薬又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション用であり得る。
【００５０】
別の実施形態では、患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットが記載され、この査定は、試験装置により行われる。このキットは、（ａ）患者から試験試料を回収するための試薬と、（ｂ）患者の試験試料におけるＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される遺伝子又はこれらの変異型の遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、を含む。
【００５１】
１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される２つ以上の遺伝子を含む。１つの態様では、遺伝子サインは、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される３つ以上の遺伝子を含む。
【００５２】
工程（ａ）及び（ｂ）の試薬は、複数回の試験に十分である。患者から試験試料を回収するための試薬は、滅菌容器の内にパッケージ化することができる。
【００５３】
遺伝子サインはまた、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子と、表１又は６の遺伝子の列挙から選択される１つ以上の遺伝子と、を含むことができる。
【００５４】
試験試料は、血液試料であり得る。
【００５５】
キットはまた、ＰＢＭＣの単離のための試薬、又は、ＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞の単離のための試薬、又は、ＣＤ１４＋単球の単離のための試薬、を含むことができる。遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬は、リアルタイムＰＣＲ試薬、免疫化学的アッセイ試薬又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション用であり得る。
【００５６】
本出願は、この概要に開示される実施形態に限定されず、この分野における当業者の範囲内にある修正形態及び変形形態並びに「特許請求の範囲」により定義されるものを有効範囲とするという意図が、理解されるべきである。
【００５７】
糖尿病前症状態の早期診断のため及び糖尿病の進行の危険性にさらされている患者又は既に糖尿病にかかっている患者のモニタリングのための新規遺伝子サインなどの、前述した実施形態は、多くの利点を有する。本開示はまた、ポイントオブケア施設での医療関係者による血液試料の費用対効果に優れかつ迅速な試験のための試薬及び使用説明書を有するキットも記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】第一の実施形態による、ＯＧＴＴと比較したＣＬＣ遺伝子のＲＯＣ曲線解析。
【図２Ａ】第二の実施形態による、ＯＧＴＴと比較したＴＣＦ７Ｌ２のセット１のＲＯＣ曲線解析。
【図２Ｂ】第三の実施形態による、ＦＰＧに対する、ＯＧＴＴ ｖｓ．ＦＰＧと比較したＴＣＦ７Ｌ２のセット１のＲＯＣ曲線解析。
【図３】第四の実施形態による、ＣＤＫＮ１Ｃ遺伝子のＲＯＣ曲線解析。
【図４Ａ】第五の実施形態による、ＯＧＴＴと比較した３つの遺伝子サインのＲＯＣ曲線解析。
【図４Ｂ】第六の実施形態による、ＦＰＧ ｖｓ．ＯＧＴＴと比較した３つの遺伝子サインのＲＯＣ曲線解析。
【図４Ｃ】第七の実施形態による、３つの遺伝子サインの平均発現の棒グラフ。
【図５Ａ】第八の実施形態による、ＯＧＴＴと比較した１０個の遺伝子サインのＲＯＣ曲線解析。
【図５Ｂ】第九の実施形態による、ＦＰＧ ｖｓ．ＯＧＴＴと比較した１０個の遺伝子サインのＲＯＣ曲線解析。
【図５Ｃ】第十の実施形態による、１０個の遺伝子サインの平均発現の棒グラフ。
【００５９】
〔詳細な説明〕
別段の規定がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。以下の定義は、本開示及び本出願の特許請求の範囲を解釈するのを助けるために提供される。このセクションでの定義と他所での定義とが一致しない場合には、このセクションに記載の定義が制御する。
【００６０】
更には、本発明の実践は、特に指示がない限り、当該技術分野の範囲内で、従来の分子生物学的及び免疫学的技術を採用する。このような技術は、当業者に周知であり、文献で詳細に説明されている。例えば、コリガン（Colignan）、ダン（Dunn）、プロー（Ploegh）、スパイヘル（Speicher）及びウィングフィールド（Wingfield）「タンパク質科学の最新プロトコル（Current protocols in Protein Science）」（１９９９〜２００８年、第Ｉ及びＩＩ巻、全ての補足も含む、ジョン・ワイリー＆サンズ社（John Wiley & Sons Inc.））、並びに、ベイリー，Ｊ．Ｅ．（Bailey, J. E.）及びオリス，Ｄ．Ｆ．（Ollis, D. F.）「生物化学工学の基礎（Biochemical Engineering Fundamentals）」（マグローヒル・ブック社（McGraw-Hill Book Company）、ニューヨーク、１９８６年）、アウスベル（Ausubel）ら編「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８７〜２００８年、全ての補足も含む）、サムブルック（Sambrook）ら編「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」（第二版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、１９８９年）、並びに、ハーロウ（Harlow）及びレイン（Lane）「抗体、実験室マニュアル（Antibodies, a Laboratory Manual）」（コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）を参照されたい。ＲＯＣ解析は、トム・フォーセット（Tom Fawcett）による「ＲＯＣ解析総論（An Introduction to ROC Analysis）」（パターン・レコグニション・レターズ（Pattern Recognition Letters）２７巻、２００６年、８６１〜８７４頁）にレビューされている。
【００６１】
本明細書で使用するとき、「真性糖尿病」とは、高濃度の血中グルコース（高血糖症）により特徴付けられるあらゆる病気を指す。真性糖尿病は、以下のいずれか１つを実証することにより、診断される。１２６ｍｇ／ｄＬ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の空腹時血漿グルコース濃度、又は、グルコース負荷試験若しくは高血糖症の症状などで７５ｇの経口グルコース負荷の２時間後における２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の血漿グルコース、並びに、２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の随時血漿グルコース。
【００６２】
本明細書で使用するとき、糖尿病とは、小児期発症型糖尿病、若年型糖尿病及びインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られる「１型糖尿病」、又は、成人型糖尿病、肥満関連糖尿病及びインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られる「２型糖尿病」、又は、妊娠糖尿病、インスリン抵抗性１型糖尿病（すなわち「二重糖尿病」）、成人性潜伏型自己免疫性糖尿病（すなわち、ＬＡＤＡ）、及び、３０歳前に２型糖尿病として存在する強い家族歴を有する一群のいくつかの１つの遺伝子の（一遺伝子性）障害である若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）が挙げられる他の形態の糖尿病を指す。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「糖尿病状態」とは、糖尿病前症状態、糖尿病前症状態よりも進行した病気の段階により特徴付けられる糖尿病中間状態、及び、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病などの本明細書に定義されるような顕性糖尿病を特徴付ける病気状態を指す。
【００６４】
本明細書で使用するとき、「糖尿病前症状態」は、患者が空腹時グルコース濃度異常及びグルコース耐性異常を有するものである。空腹時グルコース異常は、１００〜１２５ｍｇ／ｄＬ（６．１及び７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）の血中グルコース濃度として定義される、すなわち空腹時グルコース異常である。７５ｇの経口グルコース負荷の２時間後に、１４０ｍｇ／ｄＬすなわち７．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるが、２００を超えない血漿グルコースを有する患者は、グルコース耐性異常を有すると考えられる。
【００６５】
本明細書で使用するとき、「医療専門家」は、内科医又は訓練された医療技術者又はポイントオブケア施設における看護士である。
【００６６】
「ポイントオブケア」施設は、病院内などの入院患者のいる所（inpatient location）、又は、診療所若しく立ち入り型クリニックなどの外来患者のいる所（outpatient location）であり得る。１つの実施形態では、診断アッセイは、血液試料における遺伝子サイン発現プロファイルの分析のための器具と共に、消費者に対して商業的なキットとして、流通させてもよい。別の実施形態では、商業的なキットは、血中グルコース濃度のモニタリングのための器具及び試薬と組み合わせてもよい。
【００６７】
用語「血中グルコース濃度」とは、血中のグルコースの濃度を指す。正常血中グルコース濃度（正常血糖）は、およそ１２０ｍｇ／ｄｌである。この値は、糖尿病でない場合には、最大３０ｍｇ／ｄｌで変動する。
【００６８】
「高血糖症」（高血糖）の状況は、血中グルコース濃度が高過ぎる状況である。典型的には、高血糖症は、血中グルコース濃度が上昇して１８０ｍｇ／ｄｌを超えるときに生じる。
【００６９】
本明細書で使用するとき、「試験試料」は、糖尿病状態に反応して遺伝子を示差的に発現する細胞を含有する患者からの任意の生体試料である。この生体試料は、ヒトなどのアトピー性又は非アトピー性哺乳動物から単離される任意の生体材料であり得、血液、骨髄、血漿、血清、リンパ、脳脊髄液、又は、涙液、唾液若しくは乳液などの他の分泌液、組織若しくは器官の生検試料、又は培養細胞、の細胞構成成分が挙げられる。好ましくは、生体試料は、最小限の処置で患者から回収できる細胞試料である。好ましい実施形態では、試験試料は、血液試料、又は、ＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）若しくはＣＤ１４＋単球若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＣＤ１１ｃ＋若しくはＥｍｒ＋細胞の調製物である。
【００７０】
哺乳動物はヒトであってもよく、あるいは、家畜、コンパニオンアニマル又は動物園動物であってもよい。本明細書で記載される診断ツールは、ヒトの医療処置での使用に好適であることが特に想到されるが、これらはまた、イヌ及びネコなどのコンパニオンアニマル、ウマ、ウシ及びヒツジなどの家畜、又は、非ヒト霊長類、ネコ科動物、イヌ科動物、ウシ科動物及び有蹄動物などの動物園動物、の獣医学的処置にも適用可能である。
【００７１】
本明細書で記載するとき、用語「遺伝子発現」とは、遺伝子にコード化されている遺伝子情報を遺伝子の「転写」を通じて（例えば、ＲＮＡポリメラーゼの酵素反応を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｓｎＲＮＡ）に、タンパク質に関してはコード化遺伝子をｍＲＮＡの「翻訳」を通じてタンパク質に、変換するプロセスを指す。
【００７２】
「遺伝子発現プロファイル」とは、生体試料において発現した少なくとも１つのヌクレオチド又はタンパク質の同定された発現レベルを指す。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」とは、自然に発生する（例えば、制限断片として）か又は合成的に産生されたかのいずれかのオリゴヌクレオチドを指し、これは、ヌクレオチドと、ＤＮＡ依存性及びＲＮＡ依存性ポリメラーゼなどの、核酸重合のための作用剤とが存在する中で好適な条件下（例えば、緩衝液、塩、温度及びｐＨ）に置かれたときに、核酸ストランド（鋳型又は標的配列）に相補的であるプライマー伸長生成物の合成開始点として作用することができる。プライマーは、重合のための作用剤の存在する中で、伸長生成物の合成を準備刺激するのに十分に長くなければならない。典型的なプライマーは、標的配列に対して実質的に相補的な又は相同の配列の少なくとも約１０ヌクレオチドの長さを含有するが、いくらかより長いプライマーが好ましい。通常のプライマーは、約１５〜２６ヌクレオチドを含有する。
【００７４】
本明細書で使用するとき、「遺伝子サイン」とは、生体試料の一意的な識別子を提供する選択された遺伝子セットの遺伝子発現のパターンを指す。遺伝子サインは、選択された遺伝子セットの遺伝子発現のパターンが、糖尿病状態を有する患者から採取された参照試料における遺伝子サインに対する実質的な一致であるならば、糖尿病状態の特徴である。この出願の目的に関して、「遺伝子サイン」は、（遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子であるならば）核酸又はポリペプチド配列の所定の組み合わせであり得る。遺伝子サインは、未知の機能を有する遺伝子、又は、ｒＲＮＡ、ＵｓｎＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｔＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されないオープンリーディングフレームを有さない遺伝子を含み得る。
【００７５】
本明細書で使用するとき、「診断用遺伝子発現プロファイル」とは、特定の病気状態と診断された患者から採取された生体試料における遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを指す。病気状態は、糖尿病状態又は非糖尿病状態であり得る。患者からの試験遺伝子発現プロファイルと糖尿病状態を特徴付ける診断用遺伝子発現プロファイルとの間の「実質的な一致」は、患者が糖尿病状態を有することを示す。あるいは、患者からの試験遺伝子発現プロファイルと非糖尿病状態を特徴付ける診断用遺伝子発現プロファイルとの間の「実質的な一致」は、患者が糖尿病状態を有さないことを示す。
【００７６】
本明細書で使用するとき、遺伝子の「変異型」とは、これらのＤＮＡ配列が一般的な野生型遺伝子の核酸配列と比較されるときに、その遺伝子に少なくとも約７５％同一、より好ましくは、少なくとも約８５％同一、最も好ましくは、少なくとも９０％同一、更に好ましくは少なくとも約９５〜９９％同一、である遺伝子配列を意味する。１つの実施形態では、遺伝子の変異型は、点変異若しくは単一ヌクレオチド多型、欠損、挿入、再構成、スプライス供与若しくは受容部位変異、及び偽遺伝子の特徴を示す遺伝子変異が挙げられるが、これらに限定されない遺伝子のＤＮＡは配列における１つ以上の変異を有する遺伝子である。本出願を通して、遺伝子は、暗黙的に、本明細書で記載されているように遺伝子の野生型及び変異型形態の両方を含む。
【００７７】
本明細書で使用するとき、「実質的な一致」とは、定義された病気状態を有する患者から採取された参照試料における遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルとの、試験試料における遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルの比較を指す。発現プロファイルは、試験試料及び参照試料における遺伝子サインの発現が実質的に同一のレベルである、すなわち、試料の正規化後に試料間に統計的有意差が存在しない、ならば、「実質的に一致する」。１つの実施形態では、実質的に一致している発現プロファイルの信頼区間は、少なくとも約５０％、又は約５０％〜約７５％、又は約７５％〜約８０％、又は約８０％〜約８５％、又は約８５％〜約９０％、又は約９０％〜約９５％である。好ましい実施形態では、実質的に一致している発現プロファイルの信頼区間は、約９５％〜約１００％である。別の好ましい実施形態では、実質的に一致している発現プロファイルの信頼区間は、約９５％〜約１００％の間の任意の数である。別の好ましい実施形態では、実質的に一致している発現プロファイルの信頼区間は、約９５％又は約９６％又は約９７％又は約９８％又は約９９％又は約９９．９％である。
【００７８】
本明細書で使用するとき、「実質的な差異」とは、ある時点での遺伝子の遺伝子発現プロファイルと第二時点での同一の遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルとにおける差異を指す。発現プロファイルは、第一及び第二時点での遺伝子サインの発現が異なるレベルにある、すなわち、試料の正規化後に試料間に統計的有意差が存在する、ならば、「実質的に異なる」。１つの実施形態では、発現プロファイルは、第一及び第二時点での遺伝子サインの発現が計算された信頼区間の外側にあるならば、「実質的に異なる」。１つの実施形態では、実質的に異なる発現プロファイルの信頼区間は、約５０％未満、又は約７５％未満、又は約８０％未満、又は約８５％未満、又は約９０％未満、又は約９５％未満である。
【００７９】
９５％信頼区間ＣＩは、ＡＵＣ＋１．９６×ＡＵＣの標準誤差に等しい（式中、ＡＵＣは、ＲＯＣ曲線の下の面積である）。
【００８０】
本明細書で使用するとき、「ＲＯＣ」とは、受信者動作特性、又は単にＲＯＣ曲線を指し、これは、識別閾値が変動するような二元識別系のための、（１−特異度）に対する感度のグラフ表示である。
【００８１】
本明細書で使用するとき、用語「診断」又は「診断する」とは、１つの糖尿病状態を別の糖尿病状態から区別する、又は、糖尿病状態が「正常」若しくは「非糖尿病」（非アトピー性）状態と比較して患者（アトピー性）に存在するかどうかを判定する、及び／又は、糖尿病状態の性質を判定する方法を指す。
【００８２】
本明細書で使用するとき、「糖尿病状態を判定する」とは、糖尿病状態若しくは状況で患者を診断するのに、及び／又は、病気を分類するのに、有用である情報全ての統合を指す。この情報には、家族歴、ヒト遺伝子データ、ＢＭＩ、身体活動性、代謝病プロファイル、及び、患者から採取された試験試料における１つ以上の遺伝子サインの発現プロファイルの統計分析の結果が挙げられるが、これらに限定されない。ポイントオブケア環境において、この情報は、適切なデータ解析ソフトウェアを有するコンピュータシステムにより解析され、表示される。臨床データの統合は、主治医に、患者が糖尿病状況を有するかどうかを判定するのに必要な情報、糖尿病の性質又は分類に関連する情報、並びに、予後に関連する情報、及び／又は、適切な処置を選択するのに有用な情報を提供する。１つの実施形態では、本明細書で記載される診断アッセイは、医療専門家に、指示された医療処置の有効性の判定を提供する。
【００８３】
本明細書で使用するとき、「代謝病プロファイル」とは、任意の数の標準的な代謝測定値、及び、空腹時血漿グルコース、インスリン、プロインスリン、ｃ−ペプチド、インタクトインスリン、ＢＭＩ、胴囲、ＧＬＰ−１、アディポネクチン、ＰＡＩ−１、ヘモグロビンＡ１ｃ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トリグリセリド、遊離脂肪酸が挙げられるがこれらに限定されない糖尿病状態の特徴であり得る他の危険因子を指す。代謝病プロファイルを使用して、２時間ＯＧＴＴについての分類等価性に関する優れたモデルを作ることができる。
【００８４】
グルコース負荷試験は、どれだけ迅速にグルコースが血液から一掃されるかを判定するための、グルコースの投与である。この試験は、通常、糖尿病、インスリン耐性について、及び時に反応性低血糖症についての試験に使用される。グルコースは、ほとんどの場合、経口で与えられ、それゆえに、一般的な試験は技術的に、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）である。
【００８５】
空腹時血漿グルコース試験（ＦＰＧ）は、絶食後に血漿又は血中グルコース濃度を測定する炭水化物代謝試験である。絶食の刺激により、グルカゴンというホルモンが放出され、これは、今度は血漿グルコース濃度を上昇させる。糖尿病にかかっていない人々の場合、体は、インスリンを産生及び処理して、グルコース濃度の上昇を相殺する。糖尿病にかかっている人々の場合、これが生じず、試験されたグルコース濃度は高いままである。
【００８６】
本明細書で使用するとき、ボディマス指数（ＢＭＩ）又はケトレー指数は、ヒトの体重と身長とを比較する統計的測定値である。その測定及び計算の容易さに起因して、これは肥満度を同定するのに最も広く使用されている診断ツールである。
【００８７】
本明細書で使用するとき、ＮＧＴとはグルコース耐性正常を意味し、ＩＧＴとはグルコース耐性異常を意味し、Ｔ２Ｄとは２型糖尿病を意味する。
【００８８】
本明細書で使用するとき、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋及びＥｍｒ＋は、ヒト単球／マクロファージ及び骨髄細胞及びこれらの前駆体の細胞表面マーカーである。マウスで最も一般的に使用される単球／マクロファージ及び骨髄細胞表面マーカーは、Ｆ４／８０及びＣＤ１１ｂであるが、Ｆ４／８０及びＣＤ１１ｂ抗体は、それぞれ、好酸球並びに樹状細胞並びにＮＫ及び他のＴ及びＢ細胞亜型と反応することが報告されている（グエン（Nguyen）ら（２００７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J Biol Chem）２８２巻、３５２７９〜３５２９２頁、パチョーリ（Patsouris）ら（２００８）セル・メタボリズム（Cell Metab.）８巻、３０１〜３０９頁）。マウスにおけるＦ４／８０遺伝子は、ヒトＥｍｒ１遺伝子についてのオルソログである。マウスＣＤ１１ｃ遺伝子についてのヒトオルソログは、ＩＴＧＡＸであり、また、インテグリン、αＸ（補体成分３受容体４サブユニット）、ＳＬＥＢ６、ＯＴＴＨＵＭＰ０００００１６３２９９；ｌｅｕ Ｍ５、αサブユニット；白血球表面抗原ｐ１５０、９５、αサブユニット；骨髄膜抗原、αサブユニット；ｐ１５０ ９５インテグリンα鎖（染色体：１６；位置：１６ｐ１１．２アノテーション：染色体１６、ＮＣ＿００００１６．８（３１２７４０１０．．３１３０１８１９）ＭＩＭ：１５１５１０、遺伝子ＩＤ：３６８７）とも呼ばれる。マウスＣＤ１１ｂ遺伝子についてのヒトオルソログは、ＩＴＧＡＭ又はインテグリン、αＭ（補体成分３受容体３サブユニット）であり、また、ＣＤ１１Ｂ、ＣＲ３Ａ、ＭＡＣ−１、ＭＡＣ１Ａ、ＭＧＣ１１７０４４、ＭＯ１Ａ、ＳＬＥＢ６、マクロファージ抗原αポリペプチド；好中球接着因子受容体α−Ｍサブユニット（染色体：１６；位置：１６ｐ１１．２染色体１６、ＮＣ＿００００１６．８（３１１７８７８９．．３１２５１７１４）、ＭＩＭ：１２０９８０、遺伝子ＩＤ：３６８４）とも呼ばれる。ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋及びＥｍｒ＋並びにＣＤ１４＋細胞を、適切なヒト血液細胞単離キット（ステムセル・テクノロジーズ（StemCell Technologies））を使用するポジティブセレクションにより、ＰＢＭＣから純化することができる。次に、単離された細胞集団の純度（＞８５％）は、適切な細胞表面マーカーに対する、蛍光剤を結合させた抗体（バイオレジェンド（BioLegend））でのフローサイトメトリー染色により確認される。
【００８９】
本明細書で使用するとき、「リアルタイムＰＣＲ」とは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を指し、また、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ／ｑＰＣＲ）又は速度論的ポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれる。リアルタイムＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく実験技術であり、これは、標的ＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量するために使用される。これにより、ＤＮＡ試料内の特定の配列の検出及び定量（インプットされたＤＮＡに対して正規化されるとき又は遺伝子の追加的な正規化の際に、コピー又は相対量の絶対数として）の両方を可能にする。
【００９０】
本明細書で使用するとき、免疫化学的アッセイは、抗体の、その抗原に対する反応を使用して、細胞抽出物中の物質の濃度を測定する生化学的試験である。本開示では、抗原は、遺伝子サインを含む、タンパク質をコードする遺伝子のいずれかにより発現されるタンパク質である。好ましい実施形態では、免疫化学的アッセイは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）である。
【００９１】
本明細書で使用するとき、「特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション」とは、チップなどの固体担体上のプローブ配列と患者の試験試料内の転写産物から生じたｃＤＮＡ配列との間でのハイブリダイゼーションを指す。この２つの核酸配列が実質的に相補的であれば、ハイブリダイゼーションは生じ、これは試験試料中のｃＤＮＡ配列の量に正比例する。次に、ハイブリダイゼーションの検出が、当該技術分野において周知の技術を使用して達成される。数多くの要因が、２つの核酸のハイブリダイゼーションの効率性及び選択性、例えば、標的核酸配列に対してのアレイ上の核酸メンバーに影響する。これらの要因には、核酸メンバーの長さ、ヌクレオチド配列及び／又は組成、ハイブリダイゼーション温度、緩衝組成物、並びに、核酸メンバーがハイブリッド化に必要とされる領域での立体障害についての可能性が挙げられる。正の相関関係が、核酸メンバーの長さと、核酸メンバーが標的配列をアニーリングする効率性及び選択性の両方との間に存在する。特に、より長い配列は、より短いものよりも高い融解温度（ＴＭ）を有し、所与の標的配列内で繰り返されにくく、これにより乱交雑ハイブリダイゼーションを最小化する。ハイブリダイゼーション温度は、核酸メンバーアニーリング効率性に反比例して変動し、ハイブリダイゼーション混合物中に含まれ得る有機溶媒、例えば、ホルムアミドの濃度も同様であるが、一方で塩濃度における増加は、結合を促進する。厳密なハイブリダイゼーション条件下でより長い核酸は、より短いものよりも効率的にハイブリッド化し、これはより許容的な条件下でも十分である。
【００９２】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含み、インタクトな分子、これらの断片（Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２断片など）、あるいは、インタクトな分子及び／又は断片の多量体又は凝集体であり得、例えば、免疫付与、合成又は遺伝子工学により、事実上生じ得るか又は産生される。
【００９３】
本明細書で使用するとき、表１、７、８、９、１０Ａ及び１０Ｂにおけるプローブについての全ての参照は、ジェネチップ・ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイ（the GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array）に提示されているプローブセットを指す。
【００９４】
以下の説明は、本出願の特定の実施形態、及び、患者における糖尿病を診断するための特定の方法に関する。特に、本出願は、糖尿病状態に関与すると従来は考えられていなかったいくつかを含む、多数の遺伝子が、糖尿病状態を有さない患者と比較して、糖尿病又は糖尿病前症状態を有する患者からの末梢血単核球細胞（ＰＭＢＣ）において示差的に発現されることを開示する。
【００９５】
１つの実施形態では、ＮＧＴ及びＴ２ＤのＰＢＭＣにおいて示差的に発現される遺伝子は、マイクロアレイ分析を使用して同定される。ＮＧＴ及びＴ２Ｄ患者（本実施例では、１０７人の患者のコホート）のＰＢＭＣからの転写産物は、アフィメトリクス・ヒトゲノムＨＧ−Ｕ１３３プラス２チップ（the Affymetrix Human Genome HG-U133Plus2 chip）を製造者の教示に従って使用して、最初にスクリーニングされる。およそ２００の示差的に発現される遺伝子が選択され、これはマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）プログラムを使用して、ＮＧＴとＴ２Ｄとの間で、フォールス・ディスカバリー・レート（False Discovery Rate）、ＦＤＲ＜２０％、倍率変化＞１．７を有した（表１を参照されたい）。
【００９６】
ここで、糖尿病分類の方法は、最初のマイクロアレイスクリーンで同定された糖尿病感受性遺伝子の異なる組み合わせの示差的な発現を判定することにより、記述される（表１２Ａを参照されたい）。表１２Ａはまた、選択された遺伝子のそれぞれのジェンバンクアクセス番号（Genbank Accession Number）も含む。
【００９７】
糖尿病感受性遺伝子の遺伝子発現は、多数の異なる技術を使用して生体試料において測定され得る。例えば、種々のｍＲＮＡの混合物内での糖尿病関連遺伝子からのｍＲＮＡの同定は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及び検出可能部分で標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの使用により都合よく達成される。
【００９８】
まず、試験試料が患者から回収される。良質なＲＮＡを得るためには、細胞溶解中に遊離するＲＮアーゼの活性を最小化することが必要である。これは、通常、組織を破壊し、同時にＲＮアーゼを不活性化又は抑制する単離法により達成される。内因性リボヌクレアーゼが少ない試料に対して、単離プロトコルは、一般に、膜を可溶化するための洗浄剤と、胎盤リボヌクレアーゼ抑制剤又はバナジル−リボヌクレオシド複合体などのＲＮアーゼの抑制剤とを含有する抽出緩衝液を使用する。内因性リボヌクレアーゼに富むインタクトな組織又は細胞などのより困難な試料からのＲＮＡ単離は、より積極的なアプローチを必要とする。これらの場合、組織又は細胞は、強力なタンパク質変性剤（通常、グアニジンイソチオシアネート）の中で迅速にホモジナイズされて、ヌクレアーゼを不可逆的に不活性化し、細胞膜を可溶化する。組織試料を直ちにホモジナイズすることができないならば、液体窒素中での浸漬により迅速に凍結させ、−８０℃で保存しなければならない。このやり方で凍結させた試料は、ＲＮＡ単離に先立って決して解凍させてはならず、そうでないと、このＲＮＡは、凍結時に生じる細胞溶解中に遊離したＲＮアーゼにより迅速に分解される。この組織は、液体窒素のプール内に浸漬され、乳鉢及び乳棒を使用して微細な粉末に粉砕されなければならない。いったん粉末化されたら、依然として凍結している組織は、ＲＮＡ抽出緩衝液中でホモジナイズされる。ＲＮＡ単離用の多数のキットが、現在、市販されている（アンビオン（Ambion）、キアゲン（Quiagen））。
【００９９】
当該技術分野において周知であるように、ｃＤＮＡは、まず、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーを使用して、鋳型ｍＲＮＡからｃＤＮＡの第一ストランドを第一に逆転写することにより生じる。本出願による有用な逆転写酵素には、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ及び他のレトロウィルスからの逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない（レビューに関しては、例えば、レビン（Levin）、１９９７年、セル（Cell）８８巻：５〜８頁、バーマ（Verma）、１９７７年、バイオケミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）４７３巻：１〜３８頁、ウー（Wu）ら、１９７５年、ＣＲＣクリティカル・レビューズ・イン・バイオケミストリー（CRC Crit. Rev. Biochem.）３巻：２８９〜３４７頁を参照されたい）。より最近では、多数のキットが、熱安定性逆転写酵素を使用するＲＴ−ＰＣＲ反応のために現在、市販され、例えば、ジェンアンプ（GeneAmp）（登録商標）熱安定性ｒＴｔｈ逆転写酵素ＲＮＡ ＰＣＲキット（Thermostable rTth Reverse Transcriptase RNA PCR Kit）（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））が挙げられる。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号（その内容は、それらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるようなインビトロでの所望のヌクレオチド配列の増幅のための方法を通常指す。ＰＣＲ反応は、繰り返される一連の温度サイクルを伴い、典型的には、１０〜１００μＬの体積で行われる。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４つのデオキシヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのそれぞれ）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ及び核酸鋳型を含む。ＰＣＲ反応は、第一プライマーが核酸鋳型配列の１つのストランド内のある領域に相補的な配列を含有して相補的なＤＮＡストランドの合成を準備刺激し、第二プライマーが標的核酸配列の第二ストランド内のある領域に相補的な配列を含有して相補的なＤＮＡストランドの合成を準備刺激するポリヌクレオチドプライマーのセットを準備することと、（ｉ）鋳型配列内に含有される標的核酸配列に対しての増幅に必要とされるプライマーのアニーリング工程、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成するプライマーを伸長する工程の、ＰＣＲサイクル工程に対して許容的である条件下で、鋳型依存性重合剤として核酸ポリメラーゼを採用する核酸鋳型配列を増幅することと、を含む。
【０１０１】
増幅の他の方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチドに特異的に基づく増幅（ＮＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
プライマーは、核酸関心領域に関わる当業者により、容易に設計及び合成することができる。本出願に使用するのに好適なプライマーは、任意の好適な方法を使用して設計できることが理解される。ＰＣＲのためのプライマー選択は、例えば、米国特許第６，８９８，５３１号（２００５年５月２４日発行、表題「プライマー対の選択のためのアルゴリズム（Algorithms for Selection of Primer Pairs）」）及び米国特許出願第１０／２３６，４８０号（２００２年９月５日出願）に記載されており、短範囲ＰＣＲ（short-range PCR）については、米国特許出願第１０／３４１，８３２号（２００３年１月１４日出願）がプライマー選択に関してのガイダンスを提供している。また、「オリゴ（Oligo）」、レーザージーン（LASERGENE）（登録商標）、プライマー・プレミア（primer premier）５（プレミア・バイオソフト（Premier Biosoft）社のウェブサイトにおいて入手可能）及びプライマー（primer）３（ホワイトヘッド・インスティトゥート・フォー・バイオメディカル・リサーチ（Whitehead Institute for Biomedical Research）（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Cambridge））のウェブサイトにおいて入手可能）などの公に入手可能なプログラムが存在する。プライマー設計は、使用されるハイブリダイゼーション条件に最適な融解温度（Ｔｍ）及びオリゴヌクレオチドプローブの所望の長さなどの多数のパラメータに基づく。更に、オリゴヌクレオチド設計は、ヘアピン構造及びプローブ間のダイマーなどの、分子が含有し得る潜在的な第二の構造を最小化するように試行し、目標は、ハイブリダイゼーションのために得られるプローブの入手可能性を最大化することである。好ましい実施形態では、ＰＣＲ法で使用されるプライマーは、ｃＤＮＡ鋳型内のヌクレオチド配列に相補的であり、好ましくはエクソン−イントロン境界領域を横断する。
【０１０３】
１つの実施形態では、ＰＣＲ反応は、ネステッドＰＣＲプライマーを使用することができる。
【０１０４】
１つの実施形態では、検出可能な標識が、増幅反応に含まれ得る。好適な標識には、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド（Texas Red）、フィリコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシカルボキシフルオセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレスセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレスセイン（５−ＦＡＭ）又はＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射能活性標識、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、並びに、他のものが挙げられる。標識は、二段階システムであってもよく、このシステムでは、増幅されたＤＮＡが、例えば、アビジン、特定の抗体などの高親和性結合パートナーを有するビオチン、ヘプテン、又は同類のものに結合され、この結合パートナーは検出可能な標識に結合される。標識は、プライマーの一方又は両方に結合され得る。あるいは、増幅に使用されるヌクレオチドのプールが、標識を増幅産物に組み込むために標識される。
【０１０５】
特に好ましい実施形態では、本出願は、米国特許第６，１４０，０５４号及び同第６，１７４，６７０号（これらも参照により全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているようなＦＲＥＴプローブの使用などのアッセイシステムを利用するために、ＰＣＲとハイブリダイゼーションプローブを組み合わせたシステムを利用する。その最も単純な構成の１つでは、ＦＲＥＴ、すなわち「蛍光共鳴エネルギー移動」アプローチは、増幅される核酸の同一のストランド上で近接部位を結合する２つのオリゴヌクレオチドを採用する。一方のオリゴヌクレオチドは、第一波長の光を吸収し、それに応じて光を放出するドナー蛍光色素分子で標識され、第二のものは、第一のドナーの発光に応じて蛍光発光できる（しかしながら、実質的には第一のドナーを励起する光源によるのではなく、また、その放出は第一蛍光色素分子のものとは識別することができる）アクセプター蛍光色素分子で標識される。この構成では、第二すなわちアクセプター蛍光色素分子は、２つのオリゴヌクレオチドが、これらが増幅される核酸上の近接部位に対してハイブリッド化する場合、例えば、ＰＣＲのアニーリング局面において、ごく近接するようになる際に生じるような、それが第一すなわちドナー蛍光色素分子にごく近接しているときに、蛍光発生複合体を形成して、蛍光発光の実質的な増加を示す。より多くの増幅される核酸が累積するにつれて、それだけ多くの蛍光発生複合体が形成され得、アクセプタープローブからの蛍光発光の増加が見られ、これは測定することができる。したがって、この方法により、形成される際の産物の量の検出が可能になる。
【０１０６】
増幅の検出が当該技術分野における多数の手段を使用して、例えば、ＰＣＲ反応でタックマン（TaqMan）（商標）ハイブリダイゼーションプローブを、いったん十分な増幅が生じたら標的拡散に特異的な蛍光発光の測定を使用して実施できることが、当業者により理解される。タックマン・リアルタイムＰＣＲは、従来のＰＣＲでのような終点でよりも、むしろ指数関数的段階の間に、蛍光色素分子を介して産物の累積を測定する。産物の指数関数的増大を使用して、閾値サイクル、ＣＴ、すなわち、ＰＣＲサイクルの数を測定し、この数で蛍光発光の有意な指数関数的増大が検出され、この数は、反応において存在するＤＮＡ鋳型のコピーの数に直接相互に関連付けられる。
【０１０７】
しかしながら、タックマンのアプローチに基づくもの（米国特許第５，５３８，８４８号及び同第５，６９１，１４６号（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、蛍光偏光アッセイ（例えば、ギブソン（Gibson）ら、１９９７年、クリニカル・ケミストリー（Clin Chem.）４３巻：１３３６〜１３４１頁）及びインベーダーアッセイ（例えば、アガーワル（Agarwal）ら、ダイアグノスティック・モルキュラー・パソロジー（Diagnostic）、２０００年９月、９巻（３号）：１５８〜１６４頁、ライアン，Ｄ（Ryan D）ら、モルキュラー・ダイアグノシス（Mol Diagn）、１９９９年６月、４巻（２号）：１３５〜１４４頁）などの他の同様な定量的「リアルタイム」及び均一核酸増幅／検出システムが存在することに当業者であれば気付くであろう。このようなシステムもまた、この記載されている出願での使用に適応可能であり、核酸増幅のリアルタイムモニタリングを可能にする。
【０１０８】
本出願の別の実施形態では、マトリックス又はマイクロチップは、それぞれが既知の配列のオリゴヌクレオチドを含有する遺伝子座のアレイを含有するように作製される。本開示では、各遺伝子座は、糖尿病感受性遺伝子の所望の部分に対して相補的な配列を含有するように合成されたモル過剰の選択された固定化合成オリゴマーを含有する。ＰＢＭＣ中に存在する糖尿病感受性遺伝子の転写産物は、本明細書に記載されているように、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅され、標識される。次に、マイクロチップ上のオリゴマーは、標識されたＲＴ−ＰＣＲ増幅糖尿病感受性遺伝子核酸でハイブリッド化される。ハイブリダイゼーションは、マイクロチップ中に埋め込まれた配列と標的配列との間の完全な又はほぼ完全な一致がハイブリダイゼーション中に生じることを確実にするための厳密な条件下で生じる。各遺伝子座で得られる蛍光発光は、ＰＢＭＣ中の１つ以上の糖尿病感受性遺伝子の発現レベルに比例する。
【０１０９】
本出願の他の実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子サイン発現プロファイルは、例えば、ＥＬＩＳＡ若しくは放射免疫アッセイなどの抗体に基づく結合アッセイ、又は、本明細書で定義されているような予め定められたサインの中の遺伝子のタンパク質産物を目的とするタンパク質アレイ含有抗体が挙げられる免疫化学の当該技術分野において周知の技術を使用して、測定される。
【０１１０】
１つの実施形態では、ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子の発現プロファイルが、グルコース耐性正常と２型糖尿病の患者からの末梢血単核球細胞において分析された。
【０１１１】
ヒトシャルコー・ライデン結晶タンパク質遺伝子は、主に好酸球において発現される。ＣＬＣは、ＮＧＴのＰＢＭＣ中、ＩＧＴのＰＢＭＣ中、Ｔ２ＤのＰＢＭＣ中の順に、下方制御される。１０７人の患者のコホートにおけるその発現の平均シグナル強度は、下記の表２に列挙されている。受信者動作特性（ＲＯＣ）解析は、ＣＬＣ遺伝子発現レベルがＩＧＴ／Ｔ２ＤからＮＧＴを分離するために使用できることを示した。
【表１】
【０１１２】
臨床状態の予測におけるＣＬＣ遺伝子の機能は、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を使用して、更に調査された。ＲＯＣ曲線は、感度と特異度との間の関係を示す。すなわち、感度の増加は、特異度の減少を伴う。曲線が左の軸に、それゆえにＲＯＣ空き領域の上端に、より近接して沿うにつれて、試験はより正確になる。逆に、曲線がＲＯＣグラフの４５°対角線に、より近接するようになるにつれて、試験はより不正確になる。ＲＯＣの下の面積は、試験の正確性の尺度である。試験の正確性は、その試験が、試験される集団を問題の病気を有するものと有さないものとに、どれだけよく分類するかに依存する。曲線の下の面積（「ＡＵＣ」と呼ぶ）＝１は完璧な試験を示し、一方で、面積＝０．５はより有用でない試験を示す。それゆえに、本出願の好ましい遺伝子及び診断方法は、０．５０を超えるＡＵＣを有し、より好ましい試験は０．６０を超えるＡＵＣを有し、更に好ましい試験は０．７０を超えるＡＵＣを有する。
【０１１３】
曲線の下の面積（ＡＵＣ）は、患者の状態の予測において、ＣＬＣ遺伝子の機能の尺度として計算された。ＣＬＣ遺伝子状態の受信者動作特性（ＲＯＣ）解析は、ＣＬＣ遺伝子発現レベルがＩＧＴ／Ｔ２ＤからＮＧＴを分離するために使用できることを示した（図１を参照されたい）。
【０１１４】
転写因子７様２（ＴＣＦ７Ｌ２）をコード化する遺伝的変異型は、２型糖尿病及びβ細胞インスリン機能異常の進行の危険性に強く関連している（米国特許出願公開第２００６／０２８６５８８号（その内容はこれにより本明細書にその全体が組み込まれる）を参照されたい）。ゲノムワイド関連研究は、ＴＣＦ７Ｌ２内のＳＮＰが、ＣＤＫＡＬ１、ＣＤＫＮ２Ａ／２Ｂ、ＦＴＯ、ＩＧＦ２ＢＰ２及びＳＬＣ３０Ａ８などの他のマーカー遺伝子中のＳＮＰ（リスクスコアの範囲は１．１２〜１．２０）に比較して、２型糖尿病進行の予測に関する最高の生涯リスクスコアを与えることを示唆する。ＴＣＦ７Ｌ２は広く発現し、この転写因子は、ＷｎＴファミリーのタンパク質のメンバーからの発生シグナルに反応することが知られている。機能的及び遺伝学的研究は、腸の発達及び腸内分泌細胞中のプログルカゴン遺伝子発現においてＴＣＦ７Ｌ２が果たす決定的な役割を指摘する。
【０１１５】
ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子が、単独で若しくは組み合わせてのいずれかで糖尿病の診断マーカーとなるかどうかを確かめるために、インスティトゥート・フォー・クリニカル・リサーチ＆ディブロップメント（Clinical Research & Development）（ＩＫＦＥ）（ドイツ、マインツ（Mainz））の協力でドイツ人の母集団から１８０人の被験者を募集した。患者試料回収に先立って、適切なＩＲＢ承認を得た。採用基準は、糖尿病の診断歴を有さない１８〜７５歳及びボディマス指数（ＢＭＩ）≧３０の患者、法的能力、並びに臨床研究及び必要とされる手順の性質と範囲とを理解する能力からなった。除外基準は、最近３０日以内の献血、インスリン依存型真性糖尿病、授乳期若しくは妊娠中の女性、研究の途中で妊娠する予定のある女性、避妊を行っていない性的に活発な女性、重度／複合アレルギーの病歴、ドラッグ若しくはアルコールの濫用、研究要件遵守の欠落からなった。７５ｇ経口グルコース負荷試験結果（ＯＧＴＴ）を含む全ての臨床測定値を、標準的な手順を使用して得た。
【０１１６】
血液試料を、静脈穿刺によりＣＰＴチューブ（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences））の中に吸引した。ＰＢＭＣを、製造者のプロトコルに従って単離し、最終的な細胞沈殿物を１ｍＬのトリゾール（Trizol）（インビトロジェン（Invitrogen））中に再懸濁し、−８０℃で保存した。続いて、全ＲＮＡを、製造者のプロトコルに従って純化し、ＤＥＰＣ処理したｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＲＮＡの定量及び品質を、ＮＤ−１０００分光光度計（Spectrophotometer）（ナノドロップ（NanoDrop））を使用して行い、リボグリーン（RiboGreen）キット（モルキュラー・プローブス（Molecular Probes））での分光光度的定量化により再確認した。ＲＮＡ鋳型の品質を、バイオアナライザー（Bioanalyzer）２１００（アジレント・テクノロジー（Agilent Technologies））を使用することにより、測定した。
【０１１７】
第一ストランドｃＤＮＡ合成を、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（High Capacity cDNA Reverse Transcription kit）（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を用い、各患者ＰＢＭＣ試料からの全ＲＮＡ２００ｎｇを使用して、行った。その後、反応混合物をｄｄＨ２Ｏで１０倍に希釈し、４μＬを、ＡＢＩプリズム７９００ＨＴ（ABI Prism 7900HT）配列検出システム上で１０μＬのタックマン（Taqman）ＰＣＲ反応中で鋳型として使用した。反応成分は、２ＸタックマンＰＣＲマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ）、０．９μＭの各プライマー、及び０．２５μＭの蛍光標識されたプローブ（バイオサーチ・テクノロジーズ（Biosearch Technologies））からなった。ＲＴ−ＰＣＲタックマンアッセイにおいて使用されるプライマー／プローブセットについての配列は、表３に示される。
【０１１８】
逆転写工程のためのサイクル条件は以下の通りである：
【表２】
【表３】
【０１１９】
ＴＣＦ７Ｌ２に特異的な２つの異なるプライマー／プローブの組み合わせ及びＣＬＣのための１つのプライム／プローブを使用するタックマンアッセイによる定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、それぞれの患者からのＰＢＭＣから単離したＲＮＡについて行った。ＰＣＲ工程についての熱サイクルプロファイルは、以下のように、９５℃を１０分、続いて、９５℃（１５秒）及び６０℃（１分）を４０サイクルであった。Ｃｔ値を、０．２〜０．３の閾値設定でＳＤＳバージョン２．１ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ）を使用して、生データから計算した。ピアソン相関によるＲｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎの再現性は、上記マーカーについて、Ｒ２＝０．９６〜０．９８であった。ΔＣｔ（サイクル閾値）の値を、目的のマーカーのＣｔからハウスキーピングβ−アクチン遺伝子のＣｔを減ずること、例えば、ＴＣＦ７Ｌ２の場合は、Ｃｔ ＴＣＦ７Ｌ２−Ｃｔアクチン、により計算した。［２−（ΔＣｔ）×１０００］の値を使用して、β−アクチンに対するＴＣＦ７Ｌ２の発現を表した。ＯＧＴＴの結果を、真の臨床状態として使用した。スチューデントのＴ検定を、正規化されたＣｔ値を使用して遺伝子マーカーの発現レベル間の統計的有意性を決定するために使用した。
【０１２０】
２時間ＯＧＴＴ測定及び現行のＡＤＡガイドラインに基づいて、研究に参加した１８０人の患者のうち、１０４人の患者をＮＧＴ（グルコース耐性正常）として、４９人の患者をＩＧＴ（グルコース耐性異常）として、分類し、２７人の患者はＴ２Ｄ（２型糖尿病）と考えられた。このＴ２Ｄ被験者は本研究で初めて糖尿病と診断されたので、各患者の病気の持続時間、及び、どれだけの期間ＰＢＭＣが高血糖微小環境に維持されていたかは、分からなかった。
【０１２１】
各患者に関し、β−アクチンに対して正規化されたＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣの発現レベルについてのｔ検定解析を、プライマー／プローブセットの値に基づき、グルコース耐性により分類して、表４に記す。ＮＧＴ及びＩＧＴにＴ２Ｄを加えた患者集団は、スチューデントのｔ検定による発現レベル間に統計的有意差を有し、それぞれｐ値＝０．００４（ＴＣＦ７Ｌ２セット１）、０．０２１（ＴＣＦ７Ｌ２セット３）及び０．０２２（ＣＬＣ）であった。これらの結果は、ＮＧＴに対する、糖尿病前症（ＩＧＴ）患者の、又は、糖尿病前症及びＴ２Ｄ患者を一緒にした組み合わせの、ＰＢＭＣにおけるＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子の示差的発現を示す。
【表４】
【０１２２】
次に、正常又は糖尿病前症／糖尿病として患者を分類するための診断ツールとしてＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣタックマンアッセイの機能を、２時間ＯＧＴＴと比較して、評価した。各ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣプライマー／プローブセットの正規化ΔＣｔ値について、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作製した（表５、図２Ａ及び２Ｂ）。ＴＣＦ７Ｌ２セット１及びＣＬＣのＰＣＲアッセイについてのＡＵＣ値はそれぞれ０．６３及び０．６１であった。２時間ＯＧＴＴ分類に比較して、ＰＢＭＣからのＴＣＦ７Ｌ２セット１の発現は、正常であるか又は糖尿病前症／糖尿病であるかに患者を正しく分類することができ、ＦＰＧ試験と共に使用したとき、ＡＵＣ＝０．７３であった（図２Ａ及び２Ｂ）。ＣＬＣは、ＴＣＦ７Ｌ２セット１に添加値を有さず、診断アルゴリズムとして考えられなかった。更に、ＦＰＧ≧１２６ｍｇ／ｄＬ（糖尿病とも考えられる）を有する１４人の患者を除外しても、アッセイの機能に変化は生じなかった。
【表５】
【０１２３】
１つの実施形態では、マイクロアレイ分析で選択されたか各遺伝子（表１を参照されたい）は、２時間ＯＧＴＴの結果とより近接して一致するように、ＴＣＦ７Ｌ２セット１の機能と組み合わされてもよい。
【０１２４】
別の実施形態では、２型糖尿病の危険性と強く関連する遺伝子（表６を参照されたい）もまた、２時間ＯＧＴＴの結果とより近接して一致するように、ＴＣＦ７Ｌ２セット１の機能と組み合わされてもよい。別の実施形態では、表１の１つ以上の遺伝子と組み合わせた表６の遺伝子を、糖尿病状態の診断に関する遺伝子サインについて本明細書に記載しているように試験することができる。
【表６】
【０１２５】
別の実施形態では、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーのメンバー、の発現もまた、ＮＧＴ及びＴ２ＤからＰＢＭＣにおいて示差的に発現された。
【０１２６】
ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーは、３つのメンバー、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ及びＣＤＫＮ１Ｃ、からなる。３つのメンバーの全ては、哺乳類細胞周期の制御において中心的な役割を果たすＣＤＫ４の活性を抑制することができる。膵島β細胞の複製は、β細胞の量的ホメオスタシスの維持おいて本質的な役割を果たす。ＣＤＫ４が体重及び膵臓β細胞増殖の制御において重要な役割を有することが知られている。マウスでは、ＣＤＫ４遺伝子の欠損はβ細胞量の減少に起因してインスリン欠乏性糖尿病を生じたが、一方で、ＣＤＫ４の活性化は、β膵島細胞の過形成を引き起こした。最近、２型糖尿病のゲノムワイド関連研究が、ＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子近傍のヌクレオチド変異が２型糖尿病の危険性に関連することを明らかにした。更に、ＣＤＫＮ２Ａの過剰発現は、老齢マウスにおいて膵島増殖の減少を導き、ＣＤＫＮ２Ｂの過剰発現は、マウスモデルにおける膵島過形成及び糖尿病に関連する。ＣＤＫＮ１Ｃは、染色体１１ｐ１５．５上に位置する母系発現遺伝子であり、ベックウィズ−ヴィードマン症候群（ＢＷＳ）、新生児高インスリン性低血糖症、並びに、出生前及び後の過成長に特徴付けられる疾患の病理発生に関わる。最近の研究はまた、ＣＤＫＮ１Ｃはインスリンにより下方制御され、ＣＤＫＮ１Ｃの変異型は２型糖尿病患者の出生時体重の増加に関連し得ることを示した。細胞周期の制御に加えて、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーは、アポトーシス、転写制御、分化及び細胞移動などの他の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。１０７人の患者コホートにおけるこの３つの遺伝子の発現を分析した。ＣＤＫＮ１Ｃのみが、ＮＧＴ、ＩＧＴ及びＴ２Ｄの間で示差的な発現を表した（表７を参照されたい）。ＨＧ−Ｕ１３３プラス２ジーンチップ（HG-U133Plus2 GeneChip）上でＣＤＫＮ１ＣをＰＢＭＣにおいて発現する５つのプローブが存在する。これらのそれぞれが、ＮＧＴとＩＧＴ／Ｔ２Ｄとの間で示差的な発現を表した（表７）。ＲＯＣ解析は、５つのプローブの発現レベルを使用して、Ｔ２ＤからＮＧＴを分類できることを示した（図３）。
【表７】
【０１２７】
当業者であれば、記載されている実施形態が糖尿病の診断ツールとして遺伝子サインを調査するという前提を与えていることを認識するであろう。正常な被験者と、糖尿病前症及び糖尿病の患者との間の根底にある生物学的プロセスを調査するために、経路解析を実施した。すなわち、ＨＧ−Ｕ１３３プラス２チップ上のプローブを、ユー（Yu）ら、ＢＭＣキャンサー（BMC Cancer）７巻：１８２ページ（２００７年）に記載されているような遺伝子オントロジー生物学的プロセス（Gene Ontology Biological Process）（ＧＯＢＰ）にマッピングした。非常に低い発現を有する遺伝子は、より高い変異を有する傾向があるので、データセットにおいて平均強度が２００未満である遺伝子を経路解析から除外した。結果として、２１２４７個のプローブを確保した。糖尿病前症又は糖尿病の進行と有意な関連を有する経路を同定するために、大域的検定プログラム（global test program）を、ＮＧＴ ｖｓ．ＩＧＴ、ＮＧＴ ｖｓ．Ｔ２Ｄ、又はＮＧＴ ｖｓ．ＩＧＴ＋Ｔ２Ｄを比較することにより、行った。少なくとも１０個のプローブ及び有意なｐ値（ｐ＜０．０５）を有する経路を各比較について同定した。３つの比較を通して患者の結果について一貫した相関を有する３つの経路が存在した。これらは、Ｂ細胞活性化（ＧＯ００４２１１３）、体液性免疫反応（ＧＯ０００６９５９）、及び複製時のＤＮＡの巻き戻し（ＧＯ０００６２６８）である。３つの経路の中で、Ｂ細胞活性化及び体液性免疫反応は、主に、糖尿病との負の相関を有し（ＩＧＴ／Ｔ２Ｄにおいてより低い発現）、一方で、複製時のＤＮＡの巻き戻しは、糖尿病との正の相関を有した（ＩＧＴ／Ｔ２Ｄにおいてより高い発現）。
【０１２８】
３つの鍵となる経路から経路に基づく遺伝子サインを構築するために、ｐ＜０．０５である遺伝子をプールし、これらの統計的有意性（大域的検定からのｚスコア）に基づいて分類した。遺伝子がリスト内の１つを超えるプローブを有し、これらの挙動が一致するならば、最高の有意性を有するものが確保された。遺伝子がリスト内の１つを超えるプローブを有し、これらの挙動が反対であるならば、この遺伝子の全てのプローブは除去された。結果として、１４個の特異的な遺伝子を得た（以下の表８を参照されたい）。
【表８】
【０１２９】
比較的高い変異を有する遺伝子を使用するサインを構築するために、ＣＶ＞０．２５である１０個の遺伝子を確保した。サインに最適な数の遺伝子を決定するために、上位２〜１０遺伝子の組み合わせをデータセット内で調査した。結果は、上位３遺伝子が患者の結果の予測に最良の機能を与えることを示した。この３つの遺伝子、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１は以下の表９にある。
【表９】
【表１０】
【０１３０】
１０７人の患者のコホートにおける３つの遺伝子サインのＲＯＣ分析（図４Ａ及び４Ｂ）は、このサインがＩＧＴ／Ｔ２ＤからＮＧＴを分類できることを表す。遺伝子の平均発現を表すヒストグラムを図４Ｃに示す。
【０１３１】
非情報提供性遺伝子を除去し、コホート内で１０以上のプレゼンスコール（presence call）を有する遺伝子のみを確保した。次に、１０７人の患者のコホートを５４人のトレーニングセットと５３人の試験セットとに分けた。ＯＧＴＴ分類に基づいて、トレーニングセットには２８人のＮＧＴ、１７人のＩＧＴ及び９人のＴ２Ｄが存在するが、一方で、試験セットには２９人のＮＧＴ、１６人のＩＧＴ及び８人のＴ２Ｄが存在する。ＮＧＴと、ＩＧＴ＋Ｔ２Ｄ患者との間で示差的な発現を有する遺伝子を同定するために、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）プログラムを行った。フォールス・ディスカバリー・レート（ＦＤＲ）が２０％未満であれば、遺伝子を選択した。結果として、２３５個の遺伝子を選択した。更に遺伝子リストを絞るために、２つの集団間で１．５よりも大きな倍率変化を有し、データセットの平均強度が２００よりも大きい遺伝子を確保した。結果として、１７個のプローブを確保した。これらの中で、４つは、ヘモグロビン遺伝子を発現するプローブであった。ヘモグロビンが赤血球においてきわめて高い発現を有することを考慮して、生じ得る混入を排除するためにこの４つのプローブを除外した。サインとしての遺伝子の最適な数を決定するために、上位の遺伝子の組み合わせの機能をトレーニングセットの２〜１３で調査した。結果は、上位１０遺伝子が曲線の下の面積（ＡＵＣ）に基づいて最良の機能を与えることを示した（表１０を参照されたい）。
【表１１】
【表１２】
【０１３２】
遺伝子サインを更に評価するために、試験セットにおける患者の結果を判定した。空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）レベルを使用する糖尿病前症及び糖尿病の予測もまた調査した。遺伝子サインとＦＰＧレベルとの間の相補的な効果を調査するために、これら２つの予測因子の組み合わせを使用して患者の結果を予測した。試験セットでＦＰＧ又は１０個の遺伝子サイン、あるいはＦＰＧと１０個の遺伝子サインとの組み合わせを使用する中でのＲＯＣ解析の比較を図５に示す。これは、１０個の遺伝子サインがＩＧＴ／Ｔ２ＤからＮＴＧを独立に分けることができ、ＦＰＧ及び１０個の遺伝子サインがより良好な予測のために相補的であることを表す（図５Ａ及び５Ｂを参照されたい）。１０７人の患者のコホートにおける１０個の遺伝子の平均発現シグナルを図５Ｃの一覧表及び棒グラフに示す。
【０１３３】
臨床データの統計分析は、ＮＧＴとＴ２Ｄとで示差的に発現される３個の遺伝子及び１０個のサインを同定した。
【０１３４】
別の実施形態では、診断アッセイは、糖尿病前症／糖尿病に対する正常のポイントオブケア分類について、又は、定義された期間、例えば、１／２〜２年、若しくは２〜５年、若しくは５〜１０年、若しくはそれ以上、にわたっての糖尿病前症／糖尿病の進行の予測について記載される。
【０１３５】
あるいは、遺伝子発現プロファイルは、例えば、ＥＬＩＳＡ又はプロテオミクスアレイ（proteomic array）を使用して、ｍＲＮＡによりコード化されたタンパク質の検出によって、決定される。これらの方法のすべては、当該技術分野において周知である。
【０１３６】
本明細書の開示はまた、患者における糖尿病状態の診断のための１つ以上の試薬を有するパッケージユニットを含むキットフォーマットも提供する。このキットは、以下の品目のうち１つ以上を含有し得る：緩衝液、使用説明書、及び、正又は負の対照。キットは、本明細書で記載されている方法を行うのに好適な比率で一緒に混合された試薬の容器を含み得る。試薬容器は好ましくは、本方法を行うときに計量工程を不要にする単位量で試薬を含有する。
【０１３７】
キットは、滅菌針、及び、患者の血液を回収するためのチューブ／容器を含み得る。回収チューブは典型的には、血液凝固を抑制するために、特定の添加剤、例えば、ヘパリン、を含有する。
【０１３８】
キットはまた、患者の試料における遺伝子サイン発現プロファイルの測定のための試薬を含有し得る。本明細書で開示されているように、遺伝子サイン発現プロファイルは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、マイクロチップを使用するオリゴヌクレオチドアッセイ、又は、ＥＬＩＳＡアッセイなどのタンパク質に基づくアッセイを当該技術分野において既知の種々の方法によって測定され得る。
【０１３９】
好ましい実施形態では、遺伝子サイン発現プロファイルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定される。
【０１４０】
増幅の１つの実施形態では、キットは、患者の血液試料における遺伝子サイン発現の増幅及び検出のプライマーを含む。プライマーは、ＴＯＰ１、ＣＤ２４、ＳＴＡＰ１、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ、ＮＯＧ遺伝子などの本明細書に記載されているような糖尿病感受性遺伝子のいずれか、又は表１若しくは６に列挙されている遺伝子のいずれかに相補的である配列を有する。
【０１４１】
糖尿病感受性遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために使用されるプライマー配列の例は、表１２及び１２Ｃに開示される。
【０１４２】
好ましい実施形態では、キット試薬は、ＦＤＡのインビトロ診断オフィス（FDA's Office of In Vitro Diagnostics）（ＦＤＡ−ＯＩＶＤ）により是認されたＰＣＲに基づく技術であるアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）による７５００ファストＤｘリアルタイムＰＣＲインストルメント（7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument）で機能するように設計される。
【０１４３】
更に別の実施形態では、キットは、３つの遺伝子（ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１）又は１０個の遺伝子（ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ）サインのハイブリダイゼーションプローブのアレイを含むマイクロチップを含む。別の態様では、マイクロチップは更に、表１又は６に列挙されている１つ以上の遺伝子のための１つ以上のハイブリダイゼーションプローブのアレイを含み得る。
【０１４４】
好ましい実施形態では、マイクロチップは、１〜５５，０００超のｍＲＮＡの遺伝子発現を平行して測定できるアフィメトリックス・ジーンチップＤｘ（Affymetrix GeneChipDx）技術で機能するように設計される。ＦＤＡ−ＯＩＶＤ、これはロシュ・モルキュラー・ダイアグノスティック（Roche Molecular Diagnostics）からのアンプリチップ（AmpliChip）Ｐ４５０製品及び経路診断組織起源試験（Pathwork Diagnostics Tissue of Origin test）での使用に関するプラットフォーム。
【表１３−１】
【表１３−２】
【表１３−３】
【表１３−４】
【表１３−５】
【表１３−６】
【表１３−７】
【表１３−８】
【表１４】
【表１５】
【表１６−１】
【表１６−２】
【表１６−３】
【表１６−４】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【０１４５】
〔実施の態様〕
（１） 患者における真性糖尿病を診断する方法において、
ａ．患者から採取された試験試料を提供する工程と、
ｂ．ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程と、
ｃ．前記遺伝子発現プロファイルを前記遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程と、
ｄ．前記遺伝子発現プロファイルと前記診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて前記患者における糖尿病状態を判定する工程と、
ｅ．前記判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、方法。
（２） 前記判定工程がコンピュータシステムにより遂行され、前記コンピュータシステムが、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）からなる群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行する、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記判定工程が、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む、実施態様２に記載の方法。
（４） 前記遺伝子サインが、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記糖尿病状態が、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態である、実施態様１に記載の方法。
（６） 前記試験試料が、血液試料である、実施態様１に記載の方法。
（７） 前記試験試料が、ＰＢＭＣ又はＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含む、実施態様１に記載の方法。
（８） 前記測定工程が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ若しくは特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴う、実施態様１に記載の方法。
（９） 患者における真性糖尿病を診断する方法において、
ａ．患者から採取された試験試料を提供する工程と、
ｂ．前記試験試料において、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程と、
ｃ．前記遺伝子発現プロファイルを前記遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程と、
ｄ．前記遺伝子発現プロファイルと前記診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて前記患者における糖尿病状態を判定する工程と、
ｅ．前記判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、方法。
（１０） 遺伝子サインの前記遺伝子発現プロファイルが、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む、実施態様９に記載の方法。
【０１４６】
（１１） 前記判定工程がコンピュータシステムにより遂行され、前記コンピュータシステムが、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）からなる群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行する、実施態様１０に記載の方法。
（１２） 前記判定工程が、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む、実施態様９に記載の方法。
（１３） 前記糖尿病状態が、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態である、実施態様９に記載の方法。
（１４） 前記試験試料が血液試料である、実施態様９に記載の方法。
（１５） 前記試験試料が、ＰＢＭＣ又はＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含む、実施態様９に記載の方法。
（１６） 前記測定工程が、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴う、実施態様９に記載の方法。
（１７） 患者における真性糖尿病を診断する方法において、
ａ．患者から採取された試験試料を提供する工程と、
ｂ．前記試験試料において、ＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定する工程と、
ｃ．前記遺伝子発現プロファイルを前記遺伝子サインの診断用遺伝子発現プロファイルと比較する工程と、
ｄ．前記遺伝子発現プロファイルと前記診断用遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な一致に少なくとも部分的に基づいて前記患者における糖尿病状態を判定する工程と、
ｅ．前記判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、方法。
（１８） 前記判定工程がコンピュータシステムにより遂行され、前記コンピュータシステムが、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）からなる群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行する、実施態様１７に記載の方法。
（１９） 前記判定工程が、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む、実施態様１８に記載の方法。
（２０） 前記遺伝子サインが、表１又は６に列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子を更に含む、実施態様１７に記載の方法。
【０１４７】
（２１） 前記糖尿病状態が、糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態である、実施態様１７に記載の方法。
（２２） 前記試験試料が、血液試料である、実施態様１７に記載の方法。
（２３） 前記試験試料が、ＰＢＭＣ又はＣＤ１１ｃ＋若しくはＣＤ１１ｂ＋若しくはＥｍｒ＋若しくは［ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｃ＋］若しくは［Ｅｍｒ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋］細胞若しくはＣＤ１４＋単球を含む、実施態様１７に記載の方法。
（２４） 前記測定工程が、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴う、実施態様１７に記載の方法。
（２５） 患者の糖尿病状態における変化を診断する方法において、
ａ．第一時点で患者から採取された第一試験試料を提供する工程と、
ｂ．前記第一試験試料における遺伝子サインの第一発現プロファイルを測定する工程であって、前記遺伝子サインが、ＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む遺伝子の第一の群から、又は、ＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む遺伝子の第二の群から選択される、測定する工程と、
ｃ．第二時点で前記患者から採取された第二試験試料を提供する工程と、
ｄ．前記第二試験試料における前記遺伝子サインの第二発現プロファイルを測定する工程と、
ｅ．前記第一発現プロファイルを前記第二発現プロファイルと比較する工程と、
ｆ．前記第一遺伝子発現プロファイルと前記第二遺伝子発現プロファイルとの間の実質的な差異に少なくとも部分的に基づいて前記患者における糖尿病状態の変化を判定する工程と、
ｇ．前記判定を医療専門家に表示する工程と、を含む、方法。
（２６） 前記判定工程がコンピュータシステムにより遂行され、前記コンピュータシステムが、遺伝子発現シグナルの線形結合、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、最近接モデル及びマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）からなる群から選択される１つ以上のアルゴリズムを実行する、実施態様２５に記載の方法。
（２７） 前記判定工程が、患者の代謝病プロファイルの分析を更に含む、実施態様２５に記載の方法。
（２８） 前記第一時点と前記第二時点との間の期間が、０〜２年又は１／４〜２年又は１／２〜２年又は２〜５年又は５〜１０年又は若しくはそれ以上である、実施態様２５に記載の方法。
（２９） 前記糖尿病状態が糖尿病前症状態又は２型糖尿病状態である、実施態様２５に記載の方法。
（３０） 前記第一及び第二試験試料が血液試料である、実施態様２５に記載の方法。
【０１４８】
（３１） 前記測定工程が、リアルタイムＰＣＲ、免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴う、実施態様２５に記載の方法。
（３２） 患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子又はこれらの変異型を含む遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
（３３） 試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、実施態様３２に記載のキット。
（３４） 遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、実施態様３２に記載のキット。
（３５） 患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
（３６） 試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、実施態様３５に記載のキット。
（３７） 遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、実施態様３５に記載のキット。
（３８） 患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
（３９） 試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、実施態様３８に記載のキット。
（４０） 遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、実施態様３８に記載のキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子又はこれらの変異型を含む遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
【請求項２】
試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
【請求項５】
試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
【請求項８】
試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、請求項７に記載のキット。
【請求項１】
患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＣＦ７Ｌ２及びＣＬＣ遺伝子又はこれらの変異型を含む遺伝子サインの発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
【請求項２】
試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＯＰ１、ＣＤ２４及びＳＴＡＰ１遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
【請求項５】
試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
患者の糖尿病に対する感受性を査定するためのキットであって、前記査定は試験装置により行われる、キットにおいて、
ａ．患者から試験試料を回収するための試薬と、
ｂ．患者の試験試料におけるＴＵＬＰ４、ＡＡ７４１３００、ＥＳＣＯ１、ＥＩＦ５Ｂ、ＡＣＴＲ２、ＷＮＫ１、ＣＯＣＨ、ＳＯＮ、ＴＰＲ及びＮＯＧ遺伝子を含む遺伝子サインの遺伝子発現プロファイルを測定するための試薬と、これらのためのパッケージングと、を含む、キット。
【請求項８】
試験試料を回収するための前記試薬が、血液試料を回収するための試薬である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
遺伝子サインの前記発現プロファイルを測定するための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ又は免疫化学的アッセイ又は特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である、請求項７に記載のキット。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５０２５３７（Ｐ２０１１−５０２５３７Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３４１８２（Ｐ２０１０−５３４１８２）
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３４２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４９０１
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３４２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４９０１
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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