糖結合性ポリペプチド、複合材料、及び薬剤送達システム
【課題】新規の糖結合性ポリペプチド及びその使用を提供する。
【解決手段】Ｃ型ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）由来の、特定な配列で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなる複数のポリペプチド、からなる群から選択される糖結合性ポリペプチド、該糖結合性ポリペプチドを支持体に結合してなる複合材料、並びに、該糖結合性ポリペプチド及び薬剤を含む薬剤送達システム。
【解決手段】Ｃ型ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）由来の、特定な配列で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなる複数のポリペプチド、からなる群から選択される糖結合性ポリペプチド、該糖結合性ポリペプチドを支持体に結合してなる複合材料、並びに、該糖結合性ポリペプチド及び薬剤を含む薬剤送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の糖結合性ポリペプチドに関する。具体的には、本発明の糖結合性ポリペプチドは、Ｃ型ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）のヘマグルチニンＨＡ１由来のポリペプチド又はその変異体であることを特徴とする。
【０００２】
本発明はさらに、該ポリペプチドを含むことを特徴とする複合材料及び薬剤送達システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
ボツリヌス菌は、グラム陽性・偏性嫌気性の大桿菌で芽胞を形成する。芽胞は湖沼や海、土壌中などに存在しているが、嫌気的な環境下で発芽・増殖し、神経毒素を産生する。菌は産生する神経毒素の抗原性の違いよりＡ〜Ｇ型に分類され、通常１菌株は１種類の毒素を産生する。神経毒素は、すべての型が分子量約１５万のタンパク質で性質も類似しているが、ヒトは主にＡ、Ｂ、Ｅ又はＦ型で中毒を起こすことが知られている。ボツリヌス毒素を摂取して起こる中毒（症）としては主なものに、（１）食品中で産生された毒素を摂取することにより起こる食餌性ボツリヌス中毒、（２）破傷風と同じ感染様式で創傷より芽胞が進入し、生体内で発芽・増殖・毒素産生が起こる創傷ボツリヌス症、（３）食品などと一緒に芽胞が摂取され、これが腸内で発芽・増殖し、産生された毒素を吸収することにより主に乳児で発症する乳児ボツリヌス症（非常に希ではあるが、成人で起こることもある）がある。
【０００４】
ボツリヌス神経毒素（ＮＴ）は、食品或いは培養上清中に数種類の無毒タンパク質と複合体を形成した巨大複合体分子として検出される。毒素複合体は分子量約１５万の神経毒素が幾種類かの無毒タンパク質成分と結合し、分子量約３００Ｋの１２Ｓ毒素、５００Ｋの１６Ｓ毒素、或いは９００Ｋの１９Ｓ毒素複合体として存在している。１２Ｓ毒素は、神経毒素に赤血球凝集活性を示さない分子量約１４０Ｋの無毒成分（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｎｏｎ−ＨＡ；ＮＴＮＨ）が結合して形成される。１６Ｓ毒素、１９Ｓ毒素はこの１２Ｓ毒素にさらに複数の無毒成分であるヘマグルチニン（ＨＡ）が結合して形成される。ＨＡにはＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３ａ、ＨＡ３ｂなどの成分が存在する(非特許文献１)。１９Ｓ毒素は１６Ｓ毒素の二量体である。これまで毒素複合体構成成分は、食品と共に経口摂取され消化管を通過する際にＮＴをプロテアーゼの作用から守る役割と、消化管内から上皮細胞層バリヤーを通過して体内循環系に神経毒素を送り込むいわゆるトランスサイトーシスのような吸収移行機構に関与しているのではないかと考えられている。マウスを用いた実験で、神経毒素のみでも胃から吸収されるという報告があるものの、モルモットを用いた実験で腸からの吸収を詳細に検討し場合、ＨＡをもった複合体構造の方がＨＡを持たないものと較べてよりよく吸収されるという報告がある。また、Ａ型やＢ型の毒素複合体では培養上皮細胞によるトランスサイトーシスが観察されている。
【０００５】
Ｉｎｏｕｅらは、Ｃ型ＨＡ１のＸ線結晶構造解析を行い、β−トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）構造をもつＣＨＡ１の立体構造を報告した（非特許文献２）。このなかで、既に立体構造や糖結合位置が明らかにされていてやはりβ−トレフォイル構造をもつリシンＢ鎖と一次構造の比較を行い、糖との結合に必要な水素結合を形成するアミノ酸の位置や疎水性の相互作用を示すアミノ酸の位置を検討して、ＣＨＡ１の糖結合位置の候補を１αリピートであると推定した。しかし、配列アラインメント（Ｆｉｇ．４）の比較から明らかなように、ＣＨＡ１の配列は、リシンＢ鎖、ＡＨＡ１又はＢＨＡ１の各配列とかなり相違しているため、またＩｎｏｕｅらが記載するように、β−トレフォイルドメインと糖（炭水化物）との位置、配向及び相互作用は異なるタンパク質間で変化するため、単に保存アミノ酸の存在のみからＣＨＡ１の真の糖結合部位を確定することは難しいと考えられる。さらにまた、Ｉｎｏｕｅらは、Ｃ型と一次構造が似ているＡ型のＨＡ１の２γにあるアミノ酸に変異（Ａｓｎ２８５Ａｌａ及びＡｓｐ２６３Ａｌａ）を導入し、ラクトースとの親和性が消失したことを確認し、さらにまた２αにあるアミノ酸を置換（Ａｓｐ１７１Ａｌａ及びＡｓｎ１８７Ａｌａ）してラクトース（非還元末端側については、ガラクトース）との結合性に変化が殆ど無いという結果を得て、これらのことより、Ａ型ＨＡ１の糖結合位置は２γであると結論している。しかし、ＨＡ１の糖結合位置は、Ａ型ＨＡ１で確認実証されたのみであり、一方、Ｃ型の糖結合部位は、上記のとおり、他のタンパク質との一次構造の相同性に基づいて推測されたが実験的に確認されていない。また、この際議論されているのはガラクトースに対する結合性のみである。
【０００６】
Ｆｕｊｉｎａｇａら（非特許文献１）は、小腸上皮細胞又は赤血球に対して結合するＣ型ボツリヌス菌１６Ｓ前駆体毒素の亜成分の解析を行い、ＨＡ１とＨＡ３ｂが異なる特異性をもって糖（炭水化物）を認識していることを報告している。しかし、その著者らは、この論文のなかでＣ型ＨＡ１の糖結合位置は記載も推測もしていない。
【０００７】
なお、Ｃ型ボツリヌス菌Ｃ−Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株の全ゲノム配列の解析は、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（非特許文献３）によって報告され、その全配列は、ＨＡ１配列（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３７７２９３９）を含みながら、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＮＣ＿００７５８１にて登録されている。
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｎａｇａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：１５２９−１５３８（２００４）
【非特許文献２】Ｉｎｏｕｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９：３３６１−３３７０（２００３）
【非特許文献３】Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（４８）：１７４７２−１７４７７（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｃ型ボツリヌス菌ＨＡ１の糖結合部位を解明し、該部位又はその変異体を利用した糖結合性ポリペプチドを提供することを目的とする。
【００１０】
本発明はまた、該ポリペプチドを含む複合材料又は薬剤送達システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
【００１２】
本発明は、その第１の態様において、
下記（１）〜（４）のポリペプチド：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（４）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
からなる群から選択される糖結合性ポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、ポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、上記（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、糖と非共有結合によって結合することを特徴とする。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、上記糖は、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンである。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、上記糖は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、或いはこれらの糖を少なくとも１つ含むオリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンである。
【００２３】
本発明は、その第２の態様において、上記定義の糖結合性ポリペプチドを支持体に結合してなる複合材料を提供する。
【００２４】
本発明は、その第３の態様において、上記定義の糖結合性ポリペプチド及び薬剤を含む薬剤送達システムを提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のポリペプチドは、糖に対し結合性を有することを特徴とする。このポリペプチドは、小腸上皮細胞表面のムチン糖鎖に親和性を有するとともに、天然型配列に対して変異を導入するときには小腸以外の粘膜組織(例えば食道、胃、大腸、鼻など)や癌組織の糖鎖に対し親和性をもたせることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明者らは、毒素の細胞内移行機構や細胞内輸送に関する一連の研究のなかで、Ｃ型ＨＡ１ポリペプチドと糖分子との相互作用部位を、結晶構造解析技術及び部位特異的突然変異誘発技術を用いて今回解明することができた。
【００２７】
本発明の糖結合性ポリペプチドは、小腸ムチンだけでなく顎下腺ムチンや胃ムチンなどの粘膜組織ムチンと結合性を有しているし、また、ムチン固定化マイクロタイタープレートを用いて糖特異性を検証したところ、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）などの糖を認識することを見出した。
【００２８】
さらにまた、ＦＬＡＧ標識ＨＡ成分の発現系を利用して培養細胞に対する結合性を検証したところ、ＨＡ１は、他の成分（ＨＡ３及びＨＡ３ｂ）より速やかに細胞内移行することも判明したことから、本発明の糖結合性ポリペプチドは、細胞内移行も可能とする特性を有していると考えられる。
【００２９】
本発明は、下記（１）〜（４）のポリペプチド：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（４）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
からなる群から選択される糖結合性ポリペプチドを提供する。
【００３０】
配列番号２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列はともに、Ｃ型ボツリヌス菌Ｃ−Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株のＨＡ１に由来する。Ｃ−Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株の全ゲノム配列は、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（非特許文献３）によって報告されており、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＮＣ＿００７５８１にて登録されている。この配列中、ＨＡ１配列はＧｅｎｅ ＩＤ：３７７２９３９（塩基配列番号７０９３７〜７１７９７）として公表されている（配列番号１及び配列番号９）。
【００３１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列中、配列番号２で表されるアミノ酸配列は１４９位〜１９１位からなり、また、配列番号３で表されるアミノ酸配列は２３７位〜２８６位からなり、いずれも４つの異なるβシートから構成されている。前者の糖結合部位はＳｉｔｅ Ｉと称し、一方、後者の糖結合部位はＳｉｔｅ ＩＩと称する。
【００３２】
Ｓｉｔｅ Ｉのアミノ酸配列のなかで、Ｎ−アセチルノイラミン酸との結合に関与するアミノ酸残基は、１６８位のロイシン（Ｌｅｕ）、１７６位のトリプトファン（Ｔｒｐ）、１７９位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）及び１８３位のアルギニン（Ａｒｇ）であり（図１０）、Ｎ−アセチルガラクトサミンとの結合に関与するアミノ酸残基は、１６７位のアスパラギン（Ａｓｎ）、１６８位のロイシン（Ｌｅｕ）、１７６位のトリプトファン（Ｔｒｐ）及びアルギニン（Ａｒｇ）であり（図４）、ガラクトースとの結合に関与するアミノ酸残基は、１６８位のロイシン（Ｌｅｕ）、１７６位のトリプトファン（Ｔｒｐ）及び１８３位のアルギニン（Ａｒｇ）である（図７）。
【００３３】
Ｓｉｔｅ ＩＩのアミノ酸配列のなかで、ガラクトースとの結合に関与するアミノ酸残基は、２５９位のアスパラギン（Ａｓｎ）、２７４位のヒスチジン（Ｈｉｓ）及び２７８位のアスパラギン（Ａｓｎ）である（図７）。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、糖が結合する立体構造（すなわち、４つのβシートからなる構造）を保持する限り、１又は数個のアミノ酸残基の変異を有していてもよい。この場合、好ましくは、糖の結合に関与する上記のアミノ酸残基は保存されるのがよい。
【００３５】
上記の変異は、アミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を含む。ここで、数個とは１０〜２、９〜２、８〜２、７〜２、６〜２、５〜２、４〜２、又は３〜２の整数を指す。
【００３６】
本発明によれば、好ましい変異ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、或いは、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３７】
本明細書中で使用される「含む」なる用語は、ＨＡ１由来の該アミノ酸配列以外の別個のアミノ酸配列を含んでもよいことを意味する。また、「同一性」なる用語は、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列の全アミノ酸数あたりの同一アミノ酸数の割合（％）であり、配列の整列比較（アラインメント）をするときにはギャップを導入してもよいしギャップを導入しなくてもよい。配列の％同一性の決定のためには、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用することができる（高木利久及び金久實編、ゲノムネットのデータベース利用法、第５章ホモロジー検索プログラムの利用法、１９９８年、共立出版）。
【００３８】
好ましい変異は、保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換とは、荷電性(正電荷又は負電荷)、極性（親水性又は疎水性）、構造的性質（芳香族官能性など）などの性質が類似したアミノ酸間の置換を意味する。例えば塩基性アミノ酸にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれるし、酸性アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれるし、疎水性アミノ酸にはバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、プロリンなどが含まれるし、極性アミノ酸にはセリン、トレオニン、メチオニン、グリシン、チロシン、グルタミン、アスパラギンなどが含まれるし、芳香族アミノ酸にはトリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれる。一方、非保存的アミノ酸置換は、上記の性質の異なるアミノ酸間の置換であり、この場合、例えば糖結合アミノ酸残基又はその近傍のアミノ酸残基を改変することによって糖に対する結合特異性を変化させることが可能となる。そのような置換の例は、Site IIの２７１位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）の、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）への置換、Site Iのトリプトファン(Trp)の、アラニン(Ala)への置換などである(図１２)。
【００３９】
本発明のポリペプチドの別の例は、上記（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドを含む以下の（５）〜（９）のポリペプチドを含む。
（５）配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、或いは、配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（６）配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、をからなるポリペプチド、或いは、配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（７）配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、或いは、配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（８）配列番号７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、或いは、配列番号７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（９）配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、或いは配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド。
【００４０】
上記の配列番号２〜８で表されるアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１のＨＡ１配列のアミノ酸残基番号に基づいて、１４９〜１９１位(配列番号２)、２３７〜２８６位(配列番号３)、１４９〜２３６位(配列番号４)、１００〜２３６位（配列番号５）、１９２〜２８６位(配列番号６)、１４９〜２８６位(配列番号７)、１００〜２８６位(配列番号８)のアミノ酸配列に相当する。
【００４１】
本発明のポリペプチドのさらに別の例は、上記（１）〜（９）のポリペプチドから選択されるポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である。好ましくは、上記（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である。ヘテロ又はホモ多量体は、例えば二量体、三量体、四量体などである。本明細書中「多量体」とは、同じか又は異なる２以上のポリペプチドが、直接的に、或いはリンカーを介して、結合して得られるポリペプチドである。ポリペプチド間の結合は、共有結合であってもよいし、又は非共有結合であってもよい。このような多量体は、糖が結合する立体構造を保持しており、複数の糖結合部位が存在する。リンカーの例は、ペプチド性リンカー、アミノ酸の遊離アミノ基と反応性のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ホルミル基、エポキシ基などの官能基を両端にもつ炭化水素などを含む。リンカーの別の例は、ポリペプチドのシステイン同士の反応によって形成されるジスルフィド結合である。これに対して、リンカーを介さない場合には、単にポリペプチド同士の親和性で複合体を形成してもよい。
【００４２】
本発明の実施形態において、上記ポリペプチドは、糖と非共有結合によって結合することを特徴とする。糖は、上記の３つ組又は４つ組の糖結合アミノ酸残基と水素結合や静電的結合、または疎水的結合によって結合される。
【００４３】
本発明のポリペプチドと結合可能な糖は、単糖、オリゴ糖、多糖、或いは糖タンパク質である。その他の糖の例は、糖脂質又はプロテオグリカンである。好ましくは、上記糖は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、或いはこれらの糖を少なくとも１つ含むオリゴ糖、多糖又は糖タンパク質である。
【００４４】
糖タンパク質の例は、ヒト器官(例えば腸、胃、食道、鼻など)の組織のムチン、例えばＭＵＣ１、２、３、４、６、１３、１５などである（Ｍ．Ｅ．Ｌｉｄｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：１３９４４−１３９５１（２００３）；Ｌ．Ｔ．Ｐａｌｌｅｓｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：２７５５−２７６３（２００２）；Ｊ．Ｒ．Ｇｉｍ Ｊｒ．ら，ＢＢＲＣ ２９１：４６６−４７５（２００２）；Ｓ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１８３２７−１８３３６（２００１）； Ｓ．Ｊ．Ｇｅｎｄｌｅｒ及びＡ．Ｐ．Ｓｐｉｃｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５７：６０７−６３４（１９９５）；Ｓ．Ｂ．Ｈｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：６４１−６５１（１９９３））。
【００４５】
ムチンは、高度にグリコシル化された糖タンパク質であって、粘液ゲルの主要な構造成分である。ムチンの生理学的機能は、細胞保護、機械的保護、分泌液の粘性維持、及び細胞認識である。腸管の主要なムチンにはＭＵＣ２やＭＵＣ３などがあり、胃ではＭＵＣ５ＡＣやＭＵＣ６などが多く発現している。ムチンはさらに、胆嚢、膵臓、精液小胞、及び女性の生殖管にも見出だされている。ムチンはまた、嚢胞性線維症や大腸癌の発達に関与することも知られている（Ｍ．Ｄａｖｒｉｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：３１１３２１（１９９９）；Ｅ．Ｌｉｎｄｈｏｒｓｔ，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，２１：１１６１２２（２０００））。
【００４６】
別の糖タンパク質の例は、赤血球膜のグリコホリン、細胞表面のインテグリン類、各種レセプター糖タンパク質などを含む。糖脂質の例は、細胞表面に存在するガングリオシド類（例えばＧＭ３）などを含む。プロテオグリカンの例は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸などを含む。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成技術又はＤＮＡ組換え技術を用いて合成することができる。
【００４８】
ペプチド合成は、液相法又は固相法によって行うことができる。一般に、アミノ酸のα−アミノ基又はα−カルボキシル基、或いは側鎖の官能基、を適当な保護基で保護したアミノ酸を原料とし、α−アミノ保護アミノ酸とα−カルボキシル保護アミノ酸との間でペプチド形成反応を行う。生成ジペプチドのα−カルボキシル保護基の脱保護を行ったのち、α−カルボキシル保護アミノ酸を原料としてペプチド形成反応を行う。生成トリペプチドに対して、さらに脱保護とペプチド形成反応を行い、この操作を繰り返して目的のポリペプチドを形成し、最後に全保護基の脱保護を行い、精製工程にかける。
【００４９】
α−アミノ保護基の例は、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基などを含む。その脱保護試薬の例は、接触還元（Ｐｄ触媒など）、ＨＦ／Ｎａ−ＮＨ３／ＨＢｒ、臭化水素/酢酸、トリフルオロ酢酸などを含む。
【００５０】
α−カルボキシル保護基の例は、メチル、エチル又はｔ−ブチルエステル基、ベンジルエステル基などを含む。その脱保護試薬の例は、苛性ソーダなどのアルカリ剤、接触還元（Ｐｄ触媒など）などを含む。
【００５１】
セリンやトレオニンの水酸基、チロシンのフェノール性水酸基、アルギニンのグアニジノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、リジンのε−アミノ基、グルタミン酸のγ−カルボキシル基、アスパラギン酸のβ−カルボキシル基、グルタミンやアスパラギンのアミド基、トリプトファンのインドール核、メチオニンのチオエーテル基などの側鎖の保護及び脱保護については、日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、第ＩＩ部ペプチド合成（２章液相法によるペプチド合成（矢島治明）、３章固相法によるペプチド合成(榊原俊平)）に記載されている。
【００５２】
ペプチド結合形成法には、酸クロリド法、混合酸無水物法、活性エステル法などが含まれる。
【００５３】
ペプチド合成方式には、段階的伸長法とフラグメント縮合法がある。段階的伸長法は、Ｎ末端側から順次、構成アミノ酸を結合する方式である。一方、フラグメント縮合法は、通常、ポリペプチドの合成に適用される方式であり、適当な長さのフラグメントのペプチド合成を行い、その後、各フラグメント同士を結合する方式である。
【００５４】
好ましいペプチド合成法は、固相法である。この方法はＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法として知られており、一般に、ペプチドのＣ末端のアミノ酸を架橋ポリスチレンに縮合させておき、Ｎ末端に向かってｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸などのα−アミノ保護アミノ酸を順次縮合させる。具体的な手法は、例えば日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、第ＩＩ部ペプチド合成（３章固相法によるペプチド合成(榊原俊平)）に記載されている。
【００５５】
ＤＮＡ組換え法を用いるポリペプチドの合成は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する遺伝子増幅、ベクターによるクローニング、発現ベクターで形質転換された大腸菌などの細菌細胞での発現などを含む方法で行うことができる。Ｃ型ＨＡ１の発現と精製は、例えばＦｕｊｉｎａｇａら（非特許文献１）又はＩｎｏｕｅら（非特許文献２）に記載されており、この手法と同様に、本発明のポリペプチドを合成することができる。
【００５６】
ＰＣＲ条件は、９４℃３０秒〜５分の変性、５５〜６０℃３０秒〜１分のアニーリング、及び７２℃１分〜１０分の伸長反応を１サイクルとし、２０〜４０サイクル行うことを含む。プライマーは、正方向プライマーと逆方向プライマーを、配列番号１のＨＡ１配列に基づいて、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅可能なように設計し、例えばＤＮＡ自動合成装置を用いて合成することができる。プライマーの長さは、例えば１５〜３０塩基、好ましくは１９〜２３塩基とすることができる。また、増幅のための鋳型は、Ｃ型ボツリヌス菌Ｃ−Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株の全ＲＮＡから調製したｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリー中に含まれるＨＡ１をコードするｃＤＮＡとすることができる。
【００５７】
さらにまた、発現ベクターは、例えば細菌用の市販プラスミドベクターのいずれかを使用することができる。ベクターには、プロモーター、複製開始点、シャイン−ダルガルノ配列(又はリボソーム結合部位)、ターミネーターなどの制御配列、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーなどを含むことができる。
【００５８】
変異体の合成は、例えばＰＣＲを利用した部位特異的突然変異誘発法などの公知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発法は、例えば、変異を導入したプライマーを合成し、ＨＡ１をコードするＤＮＡ、又は該ＤＮＡを含むベクターＤＮＡ、を鋳型としてＰＣＲを行うことを含む。この手法は、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行うことができる。
【００５９】
ＤＮＡ組換え法、ＰＣＲ法及び部位特異的突然変異誘発法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９； Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５に記載されている手法を利用することができる。
【００６０】
本発明のポリペプチドと糖との結合アッセイは、例えば後述の実施例５に記載の方法で行うことができる。簡単に説明すると、ムチン（例えばウシ顎下腺ムチン又はブタ胃ムチン）を固相化したマイクロタイターウエルプレートを作製し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングする。ウエルに、本発明のポリペプチドを加えてインキュベートし、プレートを洗浄した後、ウサギ抗Ｃ１６無毒成分抗血清又はウサギ抗ＨＡ１抗体と反応させ、標識化抗ウサギＩｇＧ抗体を加えて反応させて、結合したポリペプチドの量を定量する。標識は、放射性同位元素（１２５Ｉ、３２Ｐなど）又は酵素（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなど）などである。
【００６１】
本発明はさらに、上記定義の糖結合性ポリペプチドを支持体に結合してなる複合材料を提供する。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、糖を結合する特性を有するため、この特性を種々の用途に利用することができる。例えば、本発明のポリペプチドを支持体に結合することによって、該ポリペプチドに結合する糖、糖タンパク質、糖脂質などの物質の分離或いは分析のために、該複合材料を使用することができる。
【００６３】
支持体の例は、多糖類（例えばアガロース、セルロース、デキストランなど）、樹脂（ポリスチレン、ポリスチレン共重合体、ポリアクリルアミドなど）、シリカゲル、ガラスなどを含む。また、支持体の形状は、限定されないが、球状、粒子状、微粒子状、平面（例えばプレート、ウエルなど）などであり、支持体は多孔性又は非多孔性のいずれでもよい。
【００６４】
支持体へのポリペプチドの結合は、共有結合又は非共有結合のいずれでもよい。非共有結合の例は、吸着、イオン結合、水素結合などである。また、共有結合を利用する場合、支持体表面に、ポリペプチドの例えばアミノ基、カルボキシル基、イミダゾール基、フェノール性水酸基、チオール基などの基と反応性の官能基を導入することによって、この官能基にポリペプチドを直接又はスペーサーを介して結合させることができる。官能基の例は、臭化シアン（ＣＮＢｒ）による多糖類の活性化によって形成されるイミドカルボネートである。官能基の別の例は、ω−アミノアルキル基、ω−カルボキシアルキル基、ブロモアセチル基、チオール（ＳＨ）基、エポキシ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などである。スペーサーの例は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−などの基を含んでもよいＣ４〜Ｃ１０のアルキレン鎖である。官能性支持体の調製に関しては、例えば千畑一郎ら、実験と応用、アフィニティクロマトグラフィー、講談社サイエンティフィク、１９８０年に記載されており、その開示は本発明のために使用しうる。
【００６５】
本発明はさらに、上記定義の糖結合性ポリペプチド及び薬剤を含む薬剤送達システムを提供する。
【００６６】
本発明の薬剤送達システム（ＤＤＳ）は、例えば薬剤を内包するリポソームの表面に本発明のポリペプチドを結合して得られる複合体を含む。本発明のポリペプチドは、標的細胞（例えば小腸上皮細胞、大腸上皮細胞、大腸ガン細胞など）に移行し、該細胞内に入る性質をも有しているため、この性質を利用することによって、薬剤としてのタンパク質やポリペプチドを細胞内に送達することができる。リポソームは、好ましくはカチオン性リポソームであり、これにはコレステロール系カチオン性リポソームも含まれる（中西守ら、蛋白質核酸酵素４４巻１１号１５９０〜１５９６頁（１９９９年））。カチオン性リポソームは、陰イオン性表面をもつ細胞に接近しやすいという性質を有している。このようなリポソームと本発明のポリペプチドとによって、標的細胞に接近し、その細胞内に薬剤を届ける効率が増すと考えられる。
【００６７】
別のＤＤＳの例は、薬剤がタンパク質又はポリペプチドである場合、それらと本発明のポリペプチドとの融合体である。この場合も、本発明のポリペプチドは、標的細胞内に薬剤を送達する働きをする。もし薬剤タンパク質と本発明のポリペプチドとの融合部分に、細胞質プロテアーゼによって特異的に切断可能なアミノ酸配列を挿入する場合には、細胞内に移行後に、プロテアーゼの作用によって薬剤を細胞内で放出することも可能になるだろう。このような融合タンパク質は、ＤＮＡ組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記））を用いて合成することができる。
【００６８】
本発明のＤＤＳは、適切な賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて製剤化することができる。製剤は、固体、半固体または液体投与製剤、例えば溶液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、座剤、エマルジョン、噴霧剤などとしうる。また、製剤には、補助剤または添加剤、例えば安定化剤、界面活性剤、崩壊剤、結合剤、風味剤、懸濁助剤、滑沢剤、着色剤、噴射剤などを含みうる。投与経路は、経口、非経口、例えば静脈内投与、粘膜投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、直腸内投与、舌下投与などを含む。用量は、患者の年齢、性別、症状の程度などによって変化しうるが、例えば成人１ｋｇあたり１０μｇ〜１０ｍｇの有効成分（薬剤）の量である。
【００６９】
最後に、本発明のポリペプチドを、ＨＡ２及びＨＡ３と複合体を形成することも可能である。本発明のポリペプチドは、部位特異的突然変異の導入によって、天然型ＨＡ１と異なる配列を有し、糖に対する結合の特異性に変化をもたせることも可能である。例えば、アミノ酸置換により、ＨＡ１の結合糖の種類を変化させられるだけでなく、ＨＡ１分子で結合できる糖を０〜２個に調整することができる。さらにまた、ＨＡは多分子が会合して複合体を形成するため、ＨＡ分子にバリエーションが増えれば、複合体の認識できる糖の種類や構造は計り知れない数にのぼる。細胞表面の糖鎖構造は、動物種や組織、細胞の種類、正常か異常か等によって異なることが知られている。従って、例えばヒトで考えた場合、喉、食道、胃、小腸、大腸、他に鼻など様々な粘膜組織があり、これらに対して最も効率よく細胞表面の糖鎖に結合するように複合体を調製することが可能である。そのうえ、ヒト以外でも、イヌ、ネコ、ネズミといった哺乳類、鳥類、は虫類、魚類、さらに昆虫など脊椎動物以外にも、本発明のポリペプチドの応用の可能性がある。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、腸管壁からの効率的な体内吸収のための新規のＤＤＳとして使用可能であるし、また、例えば糖に親和性のあるレクチンのように、糖鎖構造を識別したり、糖鎖を分離したり、細胞に刺激を与える実験、研究用試薬としても使用可能である。この場合、１分子が認識できる糖の数を２個又はそれ以上に多価の反応性を付与されたものは、糖鎖の種類による分離や、識別において既存のものにない新たな用途開発につながる可能性がある。さらにまた、本発明のポリペプチドは、病気の診断、例えば細胞のガン化などにより、糖鎖構造の変化することが知られているガンの診断に使用することができる。ガン化によって変化した糖鎖構造を認識できるようにＨＡ１や複合体を調製すれば既存のものと同等な検出、或いは既存のものでは検出できなかったものの検出を可能とするような診断薬を創製できる。
【００７１】
本発明者らは、ＨＡ３についても結晶構造解析を進めてきたが、先行技術文献で記載されるようなβ−トレホイル構造などのこれまで糖親和性タンパクに多く認められた特徴的な構造などはなく、したがって、ＨＡ１で決定したような糖結合部位を、配列アラインメントのみで推測することは当業者といえども難しいことであり、実際に確認する必要があることも分かった。
【実施例１】
【００７２】
Ｃ型ボツリヌス菌ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株ＨＡ１の結晶構造解析
（１）ＨＡ１結晶の作製方法
ＨＡ１はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質として大腸菌で発現するようにｃＤＮＡを作製した。そして、ＭＢＰとＨＡ１との間にＦａｃｔｏｒ Ｘａによる切断可能サイトとＦＬＡＧタグを挿入した。この融合タンパク質を大腸菌で大量に発現させ、菌体を集めて破砕し、遠心分離で得られた上清をアミロースレジンカラム（Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ Ｉｎｃ．）にかけて精製した。次にＦａｃｔｏｒ Ｘａを作用させてＭＢＰを除去した後、イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＦＦ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にてＦＬＡＧタグ−ＨＡ１を精製した。
【００７３】
結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて２０℃で行った。具体的には３ｍｇ／ｍｌ濃度のＨＡ１溶液１．０μｌと等量の結晶化母液（１２％ エタノール及び１．７Ｍ ＮａＣｌを含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水）と混合したドロップをスライドグラス上で作成し、同じ結晶化母液を加えた２４−ウェルプレート上にそのスライドグラスをドロップが内側になるように配置してグリースを用いて密閉した。約一ヶ月程度の静置により結晶成長を行い良好な単斜晶型の結晶を得た。この条件は従来法に比べ母液組成が簡便であり、また、タンパク質濃度を下げることにより、より大きな結晶を形成させることが可能となった。
【００７４】
（２）ＨＡ１結晶の結晶構造解析の方法
ＨＡ１結晶の回折データは、高エネルギー加速器研究機構（茨城、つくば市）のシンクロトロン（ＰＦ−ＡＲ）に設置されたＢＬ−５Ａのビームラインで収集した。Ｘ線波長は１Å、結晶に窒素ガスを吹き付け、−１８０℃で測定を行った。全てのデータセットはＨＫＬ２０００ソフトウェア（ＨＫＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７６，ｐ３０７−３２６）を用いて解析を行った。
【００７５】
（３）ＨＡ１結晶の結晶データ
Ｘ線回折強度測定により１．６オングストロームの高分解能で回折データが得られた。ＨＡ１の単斜晶型結晶は空間群Ｃ２に属し、これは以前の報告（非特許文献２）と同様であった。格子定数はａ＝１３８．５オングストローム、ｂ＝６２．０オングストローム、ｃ＝８３．１オングストローム、α＝γ＝９０°、β＝１０４．４°であり、完全性は９９．８％、Ｒｍｅｒｇｅが６．９％となり、非常に良質な回折データであった。これらのデータを表１にまとめた。
【００７６】
【表１】
【００７７】
（４）ＨＡ１結晶の全体構造
結晶の空間群はＣ２に属し、非対称単位内にＭｏｌ−Ａ及びＭｏｌ−Ｂの２つの分子を含む（図１）。ＨＡ１の構造は、２つのβ−ｔｒｅｆｏｉｌドメインから構成され、α−ヘリックスからなるリンカーが２つのドメインをつないでおり、鉄アレイ様の形状をしている。Ｎ−末端側及びＣ−末端側β−ｔｒｅｆｏｉｌドメインはそれぞれ１〜１４１及び１４６〜２８６のアミノ酸残基で構成されている。１つのβ−ｔｒｅｆｏｉｌドメインは２つのストランドがβ−ヘアピンでつながった構造を三対持つが、それらは３回の繰り返し構造（リピート）をとっており、１つのリピートは４つのストランド（β１〜β４）で構成されている。
【実施例２】
【００７８】
Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１の結晶構造解析
（１）Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１結晶の作製方法
ＨＡ１−糖の複合体結晶の作製は、浸透法（ｓｏａｋｉｎｇ）により行なった。これは予めリガンドの無い状態でタンパク質の結晶を作製し、後からリガンドを含む溶液に結晶を浸すことで複合体構造を得る方法である。実際には０．１〜０．４ＭのＧａｌＮＡｃを結晶化母液に含む溶液にＨＡ１の結晶を浸し、約４時間後に回折データの収集に用いた。
【００７９】
（２）Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１結晶の結晶構造解析方法
実施例１と同様にして解析を行った。
【００８０】
（３）Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１結晶の結晶データ
Ｘ線回折強度測定により１．７オングストロームの高分解能で回折データが得られた。ＨＡ１―Ｎ−アセチルガラクトサミン複合体の単斜晶型結晶は空間群Ｃ２に属し、格子定数はａ＝１３７．９オングストローム、ｂ＝６２．１オングストローム、ｃ＝８２．４オングストローム、α＝γ＝９０°、β＝１０４．２°であり、完全性は９９．９％、Ｒｍｅｒｇｅが５．６％となり、非常に良質な回折データであった。これらのデータを表２にまとめて記載した。
【００８１】
【表２】
【００８２】
（４）Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１結晶の全体構造
リガンド糖は、ＨＡ１分子の３ヶ所に結合しているように見いだされ、Ｍｏｌ−Ａにおけるその部位をＳｉｔｅ ＩＡ 、Ｓｉｔｅ ＩＩＡ及びＳｉｔｅ ＩＩＩＡ、Ｍｏｌ−Ｂの各部位をＳｉｔｅ ＩＢ 、Ｓｉｔｅ ＩＩＢ及びＳｉｔｅ ＩＩＩＢと表記することとした。ＧａｌＮＡｃは、Ｓｉｔｅ ＩＢのみに確認された（図２）。
【００８３】
（５）Ｎ−アセチルガラクトサミンの電子密度マップ
リガンドとしてソーキングしたＧａｌＮＡｃの電子密度マップにモデルを当てはめた様子を図３に示した。図３はＸｔａｌＶｉｅｗシステム（ＭｃＲｅｅ，１９９９，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２５，１５６−１６５）のＸｆｉｔを用い、電子密度マップにモデルを当てはめることで作成した。ＧａｌＮＡｃ分子は良好な電子密度が得られ、糖のモデルがきれいにあてはまった。
【００８４】
（６）Ｎ−アセチルガラクトサミンと周辺アミノ酸との相互作用
ＧａｌＮＡｃのアセチル基に存在するＯ７分子はＡｒｇ１８３のグアニジド基由来の２ヶ所の窒素分子とそれぞれ２．７及び２．８オングストロームの距離で水素結合を形成し、ＧａｌＮＡｃの環構造がＴｒｐ１７６と疎水的なスタッキングを形成していた。またＧａｌＮＡｃのＯ３分子とＡｓｎ１６７の間に水分子を介した間接的な相互作用が認められた。これらの相互作用はＬｉｇｐｌｏｔソフトウェア（ＲＷａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．,１９９５，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，８， １２７−１３４）を用い、リガンド及び周辺アミノ酸残基の各原子間の距離より評価した（図４）。
【実施例３】
【００８５】
ガラクトースを結合させたＨＡ１の結晶構造解析
（１）ガラクトースを結合させたＨＡ１結晶の作製方法
実施例１と同様の手法で、０．１〜０．４Ｍのガラクトースを結晶化母液に含む溶液にＨＡ１の結晶を浸し、約４ｈ 後に回折データの収集に用いた。
【００８６】
（２）ガラクトースを結合させたＨＡ１結晶の結晶構造解析方法
実施例１と同様にして解析を行った。
【００８７】
（３）ガラクトースを結合させたＨＡ１結晶の結晶データ
Ｘ線回折強度測定により１．７８オングストロームの高分解能で回折データが得られた。ＨＡ１―ガラクトース複合体の単斜晶型結晶は空間群Ｃ２に属し、格子定数はａ＝１３７．９オングストローム、ｂ＝６２．２オングストローム、ｃ＝８２．３オングストローム、α＝γ＝９０°、β＝１０４．７°であり、完全性は９７．５％、Ｒｍｅｒｇｅが４．３％となり、非常に良質な回折データであった。これらのデータを、上記の表２にまとめて記載した。
【００８８】
（４）ガラクトースを結合させたＨＡ１結晶の全体構造
ＨＡ１−ガラクトース複合体の全体構造を図５に示した。ガラクトースはＣ−末端側β−ｔｒｅｆｏｉｌドメインに位置するＳｉｔｅ ＩＢ及びＳｉｔｅ ＩＩＢ の２ヶ所に確認できた。
【００８９】
（５）ガラクトースの電子密度マップ
ガラクトースの電子密度雲はＳｉｔｅ ＩＢ及びＳｉｔｅ ＩＩＢの２ヶ所に確認され、ガラクトース分子のモデルをきれいに当てはめることができた（図６）。電子密度マップの作成方法は実施例２と同じである。
【００９０】
（６）ガラクトースと周辺アミノ酸との相互作用
ガラクトース（Ｇａｌ）（Ｓｉｔｅ Ｉ、Ｓｉｔｅ ＩＩ）と周辺アミノ酸との相互作用を図７に示した。Ｓｉｔｅ ＩにおいてはＧａｌのＯ４及びＯ６分子はＡｒｇ１８３の２ヶ所のアミノ基とそれぞれ３．０及び２．６オングストロームの距離で水素結合を形成していた。また、ＧａｌのＯ１及びＯ５分子はＬｅｕ１６８と３．０オングストロームの距離で水素結合を形成していた。糖の環構造はＴｒｐ１７６の芳香環と疎水的なスタッキングを形成していた。Ｓｉｔｅ ＩＩにおいてＧａｌのＯ１及びＯ４分子はＡｓｎ２５９の側鎖及び主鎖に存在する窒素分子と２．７オングストロームの距離で水素結合を形成していた。ＧａｌのＯ３分子はＨｉｓ２７４及びＡｓｎ２７８の窒素分子と２．７オングストロームの距離で水素結合を形成していた。相互作用の評価はｌｉｇｐｌｏｔソフトウェア（ＲＷａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．,１９９５，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，８，１２７−１３４）で行った（図７）。
【００９１】
（７）Ｓｉｔｅ Ｉ及びＩＩの位置づけ
糖結合部位の立体構造における差異を検証する目的で、既に報告されているＡ型ＨＡ１（Ａｒｎｄｔ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４６，１０８３−１０９３）とＣ型ＨＡ１の結晶構造の比較を行なった。Ａ型のＨＡ１も２つのβ−ｔｒｅｆｏｉｌドメインで構成され、その形状はＣ型と非常に似ている。
【００９２】
Ｓｉｔｅ Ｉを見た場合、Ｃ型ではリシンの糖結合サイトと環状疎水性アミノ酸や糖と水素結合できるようなアミノ酸残基の配置が似ているため、Ｉｎｏｕｅら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９：３３６１−３３７０（２００３））は糖結合の可能性を推定している。しかし、それを証明するためにＡ型ＨＡ１の同サイトにある関連アミノ酸を置換する実験を行い、糖結合性に変化がないことからＡ型の同サイトが重要でないことのみを述べている。今回、本発明者らは、Ｘ線結晶構造解析において同サイトに結合している糖を直接観察することができた。しかも、Ｉｎｏｕｅら（上記）は、ガラクトースやラクトースの結合性にのみ着眼し、本発明者らが今回発見したＮ−アセチルガラクトサミンやＮ−アセチルノイラミン酸に関しては何の推測も考察も行っていないが、本発明者らは今回これらの糖についても同サイトに結合していることを確認した。
【００９３】
一方、Ｓｉｔｅ ＩＩにおいてもＩｎｏｕｅら(上記)は、Ｃ型の結合サイトであることを予想しているがそのことをＡ型で重要と考えられるアミノ酸の置換で証明しているのみである。本発明者らは、ガラクトースに関して、Ｃ型がこのサイトで結合できることをＸ線結晶構造解析より新たに証明した。しかし、後述図１１で明らかにするように、Ｓｉｔｅ Ｉにある結合に重要な役割を果たすと考えられるアミノ酸を別のものに置換した変異体ＨＡ１（Ｗ１７６Ａ）がムチンへの結合能を大きく消失してしまうことから、Ｃ型ではＳｉｔｅ ＩＩはＳｉｔｅ Ｉに比べ結合力がそれほど強くないことが考えられる。
【実施例４】
【００９４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１の結晶構造解析
（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の作製方法
実施例１と同様の手法で、０．１〜０．４ＭのＮ−アセチルノイラミン酸を結晶化母液に含む溶液にＨＡ１の結晶を浸し、約４ｈ 後に回折データの収集に用いた。
【００９５】
（２）Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の結晶構造解析方法
実施例１と同様にして解析を行った。
【００９６】
（３）Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の結晶データ
Ｘ線回折強度測定により２．２オングストロームの高分解能で回折データが得られた。ＨＡ１―アセチルノイラミン酸複合体の単斜晶型結晶は空間群Ｃ２に属し、格子定数はａ＝１３８．３オングストローム、ｂ＝６１．７オングストローム、ｃ＝８２．４オングストローム、α＝γ＝９０°、β＝１０４．３°であり、完全性は９５．０％、Ｒｍｅｒｇｅが５．０％となり、非常に良質な回折データであった。これらのデータを上記の表２にまとめて記載した。
【００９７】
（４）Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の全体構造
Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の全体構造を図８に示した。Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｓｉｔｅ ＩＡ及びＳｉｔｅ ＩＢにそれぞれ確認できた。Ｓｉｔｅ ＩＡとＳｉｔｅ ＩＢはＨＡ１分子が異なるものの同じ部位であり、結合に関与する残基も全く同様であった。
【００９８】
（５）Ｎ−アセチルノイラミン酸の電子密度マップ
Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｓｉｔｅ Ｉ）の電子密度マップを図９に示した。Ｎｅｕ５ＡｃのＳｉｔｅ Ｉに関しては両分子とも同様に良好な電子密度が得られたのでＳｉｔｅ ＩＡの電子密度雲にモデルを当てはめたもののみ掲載した。電子密度マップの作成方法は実施例２に同じである。
【００９９】
（６）Ｎ−アセチルノイラミン酸と周辺アミノ酸との相互作用
Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＳｉｔｅＩ）と周辺アミノ酸との相互作用を図１０に示した。Ｎｅｕ５Ａｃのアセチル基に存在するＯ１０分子はＡｒｇ１８３のグアニジド基由来の２ヶ所のアミノ基と３．０オングストロームの距離で水素結合を形成していた。Ｎｅｕ５Ａｃの環構造がＴｒｐ１７６と疎水的なスタッキングを形成し、Ｃ７及びＣ９分子とＰｈｅ１７９との間に疎水的な相互作用が認められた。相互作用の評価はＬｉｇｐｌｏｔソフトウェア（ＲＷａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．,１９９５，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，８，１２７−１３４）で行った。
【実施例５】
【０１００】
トリプトファン１７６をアラニンに置換したＨＡ１の結合能
（１）実験方法
ＨＡ１変異体Ｗ１７６ＡはｐＧＥＸ ５Ｘ−３に導入されたＨＡ１のｃＤＮＡ配列をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｍｕｌｔｉ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により製造元のマニュアルに従って改変することで作製し、その発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入した。発現誘導は０．５ｍＭ ＩＰＴＧで行ない、精製はグルタチオンアガロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のアフィニティーカラムを用いて行った。得られたＧＳＴ−ＨＡ１変異体はＧＳＴを切断しないでそのままアッセイに使用した。
【０１０１】
結合アッセイは以下の方法で行った。９６−ウェルマイクロプレート（ホワイトマキシソープモジュールＵ ｂｏｔｔｏｍ， Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）に１０μｇ／ｍｌ濃度でＰＢＳ（ｐＨ６．８）に溶解したウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）（シグマ社製）あるいはブタ胃ムチン（ＰＧＭ）（シグマ社製）を１００μｌずつ加え、４℃で一晩静置しムチンを固相化した。ＰＢＳによる洗浄の後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ＰＢＳに０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）を加え１時間静置することでブロッキングを行い、ＰＢＳＴによる洗浄に引き続き７６ｐｍｏｌのＧＳＴ−ＨＡ１を含むＰＢＳＴを１００μｌ加えて室温で１時間インキュベートした。次にウェルをＰＢＳＴで洗浄し２，０００倍希釈したウサギ抗Ｃ１６Ｓ無毒成分抗血清を加え１時間反応させた。ＰＢＳＴでウェルをよく洗浄し、１０，０００倍希釈したＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を加えて１時間の反応を行なった。その後ＰＢＳＴで再度ウェルを洗浄し、ルミノール溶液を加えて検出をおこなった。化学発光はルミノイメージングアナライザーＬＡＳ３０００（富士フィルム社製）で検出し、マルチゲージｖ２．１ソフトウェア（富士フィルム社製）で解析を行なった。
【０１０２】
（２）実験結果
結果を図１１に示した。図の縦軸はＨＡ１の固相化ムチンに対する結合量を示し、野生型ＨＡ１のＢＳＭ及びＰＧＭへの結合量をそれぞれ１００％とした時の変異体の結合量を割合で示している。図からＷ１７６Ａ変異体は、ＢＳＭへの結合能が１０％以下と極端に減少し、ＰＧＭに対する結合も４０％以下に減少した。このことから、Ｓｉｔｅ Ｉは糖結合部位として機能し、同部位がＨＡ１における主たる糖結合部位であることが示唆された。一般に、ＢＳＭは末端にＮ−アセチルノイラミン酸を持つ糖鎖が多数含まれており、ＰＧＭは末端がガラクトースの糖鎖を多く含んでいるとされている。Ｃ型ＨＡ１のこれらムチンに対する結合能の詳細はＮａｋａｍｕｒａらの文献（Ｎａｋａｍｕｒａら，ＢＢＡ − Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ；ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｇｅｎ．２００６．１１．００６）に記載されている。
【実施例６】
【０１０３】
アスパラギン酸２７１をフェニルアラニンに置換したＨＡ１の結合能
（１）実験方法
実施例５で作製したｐＧＥＸ ５Ｘ−３ベクターに導入されたＨＡ１の変異体Ｗ１７６ＡのｃＤＮＡ配列をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｍｕｌｔｉ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製） によりさらに改変してＤ２７１Ｆのアミノ酸置換体発現ベクターＷ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆを作製した。作製方法は製造元のマニュアルに従った。以下実施例５と同様にしてＧＳＴ−ＨＡ１変異体Ｗ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆを得た。結合アッセイは実施例５と同様に行ったが、ＨＡ１変異体をウエルに加える際に２５ｍＭのガラクトースあるいはＮｅｕ５Ａｃを同時に加える阻害実験も行った。
【０１０４】
（２）実験結果
図１２はＷ１７６Ａ変異体のＡｓｐ２７１をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換したＷ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体の固相化ムチンへの結合能を検証した結果である。図の縦軸はＨＡ１のムチンに対する結合量を示し、野生型ＨＡ１のＢＳＭ及びＰＧＭへの結合をそれぞれ１００％とした割合で示している。Ｗ１７６Ａで減少したムチンへの結合能はＷ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体では野生型と同程度或いはそれ以上の結合能を示すようになった。野生型ＨＡ１のＢＳＭへの結合は阻害剤として２５ｍＭ濃度で加えたＮｅｕ５Ａｃにより著明に減少したが、同濃度のＮｅｕ５Ａｃ添加でＷ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体のＢＳＭへの結合が阻害されることはなかった。一方、野生型ＨＡ１のＰＧＭへの結合は２５ｍＭ濃度のＧａｌの添加ではほとんど阻害されなかったが、Ｗ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体の結合は大きく阻害された。このことは、Ｗ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体がＳｉｔｅ ＩＩを主たる結合部位としてガラクトースを強く認識する特性を獲得したことを示している。
【実施例７】
【０１０５】
その他のアミノ酸置換をしたＨＡ１の結合能
実施例２の（１）と同様の手法で１７９番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアルギニン（Ａｒｇ）など側鎖の長いアミノ酸に置換した変異体のｃＤＮＡを作製し、大腸菌で発現させ、タンパク質を精製して糖に対する結合性を測定したところ、Ｎ−アセチルノイラミン酸に対する結合能が異なるものが得られた。
【０１０６】
実施例２の（１）と同様の手法で２５９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）をアラニン（Ａｌａ）に置換した変異体のｃＤＮＡを作製し、大腸菌で発現させ、タンパク質を精製して糖に対する結合性を測定したところ、Ｓｉｔｅ ＩＩでの糖結合性が減少した。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明のポリペプチドは、糖に対し結合性を有する特性を利用して、例えば特定の器官組織や癌組織に特異的な糖鎖に薬剤を送達するための薬剤送達システム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）、癌の診断、カラム担体の表面に結合させて糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなどを精製するための複合材料、などに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】Ｃ型ボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株ＨＡ１の全体構造。
【図２】ＨＡ１−Ｎ−アセチルガラクトサミン複合体の全体構造。
【図３】Ｎ−アセチルガラクトサミンの電子密度マップ。
【図４】ＨＡ１の糖結合部位におけるＧａｌＮＡｃと周辺残基との相互作用。
【図５】ＨＡ１−ガラクトース複合体の全体構造。
【図６】ガラクトースの電子密度マップ。
【図７】ＨＡ１の糖結合部位におけるガラクトースと周辺残基との相互作用。
【図８】ＨＡ１−Ｎ−アセチルノイラミン酸複合体の全体構造。
【図９】ＨＡ１−Ｎ−アセチルノイラミン酸の電子密度マップ。
【図１０】ＨＡ１の糖結合部位におけるＮｅｕ５Ａｃと周辺残基との相互作用。
【図１１】ＨＡ１変異体のムチン結合能。
【図１２】ＨＡ１変異体のムチン結合能。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の糖結合性ポリペプチドに関する。具体的には、本発明の糖結合性ポリペプチドは、Ｃ型ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）のヘマグルチニンＨＡ１由来のポリペプチド又はその変異体であることを特徴とする。
【０００２】
本発明はさらに、該ポリペプチドを含むことを特徴とする複合材料及び薬剤送達システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
ボツリヌス菌は、グラム陽性・偏性嫌気性の大桿菌で芽胞を形成する。芽胞は湖沼や海、土壌中などに存在しているが、嫌気的な環境下で発芽・増殖し、神経毒素を産生する。菌は産生する神経毒素の抗原性の違いよりＡ〜Ｇ型に分類され、通常１菌株は１種類の毒素を産生する。神経毒素は、すべての型が分子量約１５万のタンパク質で性質も類似しているが、ヒトは主にＡ、Ｂ、Ｅ又はＦ型で中毒を起こすことが知られている。ボツリヌス毒素を摂取して起こる中毒（症）としては主なものに、（１）食品中で産生された毒素を摂取することにより起こる食餌性ボツリヌス中毒、（２）破傷風と同じ感染様式で創傷より芽胞が進入し、生体内で発芽・増殖・毒素産生が起こる創傷ボツリヌス症、（３）食品などと一緒に芽胞が摂取され、これが腸内で発芽・増殖し、産生された毒素を吸収することにより主に乳児で発症する乳児ボツリヌス症（非常に希ではあるが、成人で起こることもある）がある。
【０００４】
ボツリヌス神経毒素（ＮＴ）は、食品或いは培養上清中に数種類の無毒タンパク質と複合体を形成した巨大複合体分子として検出される。毒素複合体は分子量約１５万の神経毒素が幾種類かの無毒タンパク質成分と結合し、分子量約３００Ｋの１２Ｓ毒素、５００Ｋの１６Ｓ毒素、或いは９００Ｋの１９Ｓ毒素複合体として存在している。１２Ｓ毒素は、神経毒素に赤血球凝集活性を示さない分子量約１４０Ｋの無毒成分（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｎｏｎ−ＨＡ；ＮＴＮＨ）が結合して形成される。１６Ｓ毒素、１９Ｓ毒素はこの１２Ｓ毒素にさらに複数の無毒成分であるヘマグルチニン（ＨＡ）が結合して形成される。ＨＡにはＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３ａ、ＨＡ３ｂなどの成分が存在する(非特許文献１)。１９Ｓ毒素は１６Ｓ毒素の二量体である。これまで毒素複合体構成成分は、食品と共に経口摂取され消化管を通過する際にＮＴをプロテアーゼの作用から守る役割と、消化管内から上皮細胞層バリヤーを通過して体内循環系に神経毒素を送り込むいわゆるトランスサイトーシスのような吸収移行機構に関与しているのではないかと考えられている。マウスを用いた実験で、神経毒素のみでも胃から吸収されるという報告があるものの、モルモットを用いた実験で腸からの吸収を詳細に検討し場合、ＨＡをもった複合体構造の方がＨＡを持たないものと較べてよりよく吸収されるという報告がある。また、Ａ型やＢ型の毒素複合体では培養上皮細胞によるトランスサイトーシスが観察されている。
【０００５】
Ｉｎｏｕｅらは、Ｃ型ＨＡ１のＸ線結晶構造解析を行い、β−トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）構造をもつＣＨＡ１の立体構造を報告した（非特許文献２）。このなかで、既に立体構造や糖結合位置が明らかにされていてやはりβ−トレフォイル構造をもつリシンＢ鎖と一次構造の比較を行い、糖との結合に必要な水素結合を形成するアミノ酸の位置や疎水性の相互作用を示すアミノ酸の位置を検討して、ＣＨＡ１の糖結合位置の候補を１αリピートであると推定した。しかし、配列アラインメント（Ｆｉｇ．４）の比較から明らかなように、ＣＨＡ１の配列は、リシンＢ鎖、ＡＨＡ１又はＢＨＡ１の各配列とかなり相違しているため、またＩｎｏｕｅらが記載するように、β−トレフォイルドメインと糖（炭水化物）との位置、配向及び相互作用は異なるタンパク質間で変化するため、単に保存アミノ酸の存在のみからＣＨＡ１の真の糖結合部位を確定することは難しいと考えられる。さらにまた、Ｉｎｏｕｅらは、Ｃ型と一次構造が似ているＡ型のＨＡ１の２γにあるアミノ酸に変異（Ａｓｎ２８５Ａｌａ及びＡｓｐ２６３Ａｌａ）を導入し、ラクトースとの親和性が消失したことを確認し、さらにまた２αにあるアミノ酸を置換（Ａｓｐ１７１Ａｌａ及びＡｓｎ１８７Ａｌａ）してラクトース（非還元末端側については、ガラクトース）との結合性に変化が殆ど無いという結果を得て、これらのことより、Ａ型ＨＡ１の糖結合位置は２γであると結論している。しかし、ＨＡ１の糖結合位置は、Ａ型ＨＡ１で確認実証されたのみであり、一方、Ｃ型の糖結合部位は、上記のとおり、他のタンパク質との一次構造の相同性に基づいて推測されたが実験的に確認されていない。また、この際議論されているのはガラクトースに対する結合性のみである。
【０００６】
Ｆｕｊｉｎａｇａら（非特許文献１）は、小腸上皮細胞又は赤血球に対して結合するＣ型ボツリヌス菌１６Ｓ前駆体毒素の亜成分の解析を行い、ＨＡ１とＨＡ３ｂが異なる特異性をもって糖（炭水化物）を認識していることを報告している。しかし、その著者らは、この論文のなかでＣ型ＨＡ１の糖結合位置は記載も推測もしていない。
【０００７】
なお、Ｃ型ボツリヌス菌Ｃ−Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株の全ゲノム配列の解析は、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（非特許文献３）によって報告され、その全配列は、ＨＡ１配列（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３７７２９３９）を含みながら、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＮＣ＿００７５８１にて登録されている。
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｎａｇａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：１５２９−１５３８（２００４）
【非特許文献２】Ｉｎｏｕｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９：３３６１−３３７０（２００３）
【非特許文献３】Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（４８）：１７４７２−１７４７７（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｃ型ボツリヌス菌ＨＡ１の糖結合部位を解明し、該部位又はその変異体を利用した糖結合性ポリペプチドを提供することを目的とする。
【００１０】
本発明はまた、該ポリペプチドを含む複合材料又は薬剤送達システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
【００１２】
本発明は、その第１の態様において、
下記（１）〜（４）のポリペプチド：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（４）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
からなる群から選択される糖結合性ポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、ポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、上記（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、上記ポリペプチドは、糖と非共有結合によって結合することを特徴とする。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、上記糖は、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンである。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、上記糖は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、或いはこれらの糖を少なくとも１つ含むオリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンである。
【００２３】
本発明は、その第２の態様において、上記定義の糖結合性ポリペプチドを支持体に結合してなる複合材料を提供する。
【００２４】
本発明は、その第３の態様において、上記定義の糖結合性ポリペプチド及び薬剤を含む薬剤送達システムを提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のポリペプチドは、糖に対し結合性を有することを特徴とする。このポリペプチドは、小腸上皮細胞表面のムチン糖鎖に親和性を有するとともに、天然型配列に対して変異を導入するときには小腸以外の粘膜組織(例えば食道、胃、大腸、鼻など)や癌組織の糖鎖に対し親和性をもたせることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明者らは、毒素の細胞内移行機構や細胞内輸送に関する一連の研究のなかで、Ｃ型ＨＡ１ポリペプチドと糖分子との相互作用部位を、結晶構造解析技術及び部位特異的突然変異誘発技術を用いて今回解明することができた。
【００２７】
本発明の糖結合性ポリペプチドは、小腸ムチンだけでなく顎下腺ムチンや胃ムチンなどの粘膜組織ムチンと結合性を有しているし、また、ムチン固定化マイクロタイタープレートを用いて糖特異性を検証したところ、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）などの糖を認識することを見出した。
【００２８】
さらにまた、ＦＬＡＧ標識ＨＡ成分の発現系を利用して培養細胞に対する結合性を検証したところ、ＨＡ１は、他の成分（ＨＡ３及びＨＡ３ｂ）より速やかに細胞内移行することも判明したことから、本発明の糖結合性ポリペプチドは、細胞内移行も可能とする特性を有していると考えられる。
【００２９】
本発明は、下記（１）〜（４）のポリペプチド：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（４）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
からなる群から選択される糖結合性ポリペプチドを提供する。
【００３０】
配列番号２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列はともに、Ｃ型ボツリヌス菌Ｃ−Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株のＨＡ１に由来する。Ｃ−Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株の全ゲノム配列は、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（非特許文献３）によって報告されており、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＮＣ＿００７５８１にて登録されている。この配列中、ＨＡ１配列はＧｅｎｅ ＩＤ：３７７２９３９（塩基配列番号７０９３７〜７１７９７）として公表されている（配列番号１及び配列番号９）。
【００３１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列中、配列番号２で表されるアミノ酸配列は１４９位〜１９１位からなり、また、配列番号３で表されるアミノ酸配列は２３７位〜２８６位からなり、いずれも４つの異なるβシートから構成されている。前者の糖結合部位はＳｉｔｅ Ｉと称し、一方、後者の糖結合部位はＳｉｔｅ ＩＩと称する。
【００３２】
Ｓｉｔｅ Ｉのアミノ酸配列のなかで、Ｎ−アセチルノイラミン酸との結合に関与するアミノ酸残基は、１６８位のロイシン（Ｌｅｕ）、１７６位のトリプトファン（Ｔｒｐ）、１７９位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）及び１８３位のアルギニン（Ａｒｇ）であり（図１０）、Ｎ−アセチルガラクトサミンとの結合に関与するアミノ酸残基は、１６７位のアスパラギン（Ａｓｎ）、１６８位のロイシン（Ｌｅｕ）、１７６位のトリプトファン（Ｔｒｐ）及びアルギニン（Ａｒｇ）であり（図４）、ガラクトースとの結合に関与するアミノ酸残基は、１６８位のロイシン（Ｌｅｕ）、１７６位のトリプトファン（Ｔｒｐ）及び１８３位のアルギニン（Ａｒｇ）である（図７）。
【００３３】
Ｓｉｔｅ ＩＩのアミノ酸配列のなかで、ガラクトースとの結合に関与するアミノ酸残基は、２５９位のアスパラギン（Ａｓｎ）、２７４位のヒスチジン（Ｈｉｓ）及び２７８位のアスパラギン（Ａｓｎ）である（図７）。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、糖が結合する立体構造（すなわち、４つのβシートからなる構造）を保持する限り、１又は数個のアミノ酸残基の変異を有していてもよい。この場合、好ましくは、糖の結合に関与する上記のアミノ酸残基は保存されるのがよい。
【００３５】
上記の変異は、アミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を含む。ここで、数個とは１０〜２、９〜２、８〜２、７〜２、６〜２、５〜２、４〜２、又は３〜２の整数を指す。
【００３６】
本発明によれば、好ましい変異ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、或いは、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３７】
本明細書中で使用される「含む」なる用語は、ＨＡ１由来の該アミノ酸配列以外の別個のアミノ酸配列を含んでもよいことを意味する。また、「同一性」なる用語は、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列の全アミノ酸数あたりの同一アミノ酸数の割合（％）であり、配列の整列比較（アラインメント）をするときにはギャップを導入してもよいしギャップを導入しなくてもよい。配列の％同一性の決定のためには、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用することができる（高木利久及び金久實編、ゲノムネットのデータベース利用法、第５章ホモロジー検索プログラムの利用法、１９９８年、共立出版）。
【００３８】
好ましい変異は、保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換とは、荷電性(正電荷又は負電荷)、極性（親水性又は疎水性）、構造的性質（芳香族官能性など）などの性質が類似したアミノ酸間の置換を意味する。例えば塩基性アミノ酸にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれるし、酸性アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれるし、疎水性アミノ酸にはバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、プロリンなどが含まれるし、極性アミノ酸にはセリン、トレオニン、メチオニン、グリシン、チロシン、グルタミン、アスパラギンなどが含まれるし、芳香族アミノ酸にはトリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれる。一方、非保存的アミノ酸置換は、上記の性質の異なるアミノ酸間の置換であり、この場合、例えば糖結合アミノ酸残基又はその近傍のアミノ酸残基を改変することによって糖に対する結合特異性を変化させることが可能となる。そのような置換の例は、Site IIの２７１位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）の、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）への置換、Site Iのトリプトファン(Trp)の、アラニン(Ala)への置換などである(図１２)。
【００３９】
本発明のポリペプチドの別の例は、上記（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドを含む以下の（５）〜（９）のポリペプチドを含む。
（５）配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、或いは、配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（６）配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、をからなるポリペプチド、或いは、配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（７）配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、或いは、配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（８）配列番号７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、或いは、配列番号７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（９）配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、或いは配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド。
【００４０】
上記の配列番号２〜８で表されるアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１のＨＡ１配列のアミノ酸残基番号に基づいて、１４９〜１９１位(配列番号２)、２３７〜２８６位(配列番号３)、１４９〜２３６位(配列番号４)、１００〜２３６位（配列番号５）、１９２〜２８６位(配列番号６)、１４９〜２８６位(配列番号７)、１００〜２８６位(配列番号８)のアミノ酸配列に相当する。
【００４１】
本発明のポリペプチドのさらに別の例は、上記（１）〜（９）のポリペプチドから選択されるポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である。好ましくは、上記（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である。ヘテロ又はホモ多量体は、例えば二量体、三量体、四量体などである。本明細書中「多量体」とは、同じか又は異なる２以上のポリペプチドが、直接的に、或いはリンカーを介して、結合して得られるポリペプチドである。ポリペプチド間の結合は、共有結合であってもよいし、又は非共有結合であってもよい。このような多量体は、糖が結合する立体構造を保持しており、複数の糖結合部位が存在する。リンカーの例は、ペプチド性リンカー、アミノ酸の遊離アミノ基と反応性のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ホルミル基、エポキシ基などの官能基を両端にもつ炭化水素などを含む。リンカーの別の例は、ポリペプチドのシステイン同士の反応によって形成されるジスルフィド結合である。これに対して、リンカーを介さない場合には、単にポリペプチド同士の親和性で複合体を形成してもよい。
【００４２】
本発明の実施形態において、上記ポリペプチドは、糖と非共有結合によって結合することを特徴とする。糖は、上記の３つ組又は４つ組の糖結合アミノ酸残基と水素結合や静電的結合、または疎水的結合によって結合される。
【００４３】
本発明のポリペプチドと結合可能な糖は、単糖、オリゴ糖、多糖、或いは糖タンパク質である。その他の糖の例は、糖脂質又はプロテオグリカンである。好ましくは、上記糖は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、或いはこれらの糖を少なくとも１つ含むオリゴ糖、多糖又は糖タンパク質である。
【００４４】
糖タンパク質の例は、ヒト器官(例えば腸、胃、食道、鼻など)の組織のムチン、例えばＭＵＣ１、２、３、４、６、１３、１５などである（Ｍ．Ｅ．Ｌｉｄｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：１３９４４−１３９５１（２００３）；Ｌ．Ｔ．Ｐａｌｌｅｓｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：２７５５−２７６３（２００２）；Ｊ．Ｒ．Ｇｉｍ Ｊｒ．ら，ＢＢＲＣ ２９１：４６６−４７５（２００２）；Ｓ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１８３２７−１８３３６（２００１）； Ｓ．Ｊ．Ｇｅｎｄｌｅｒ及びＡ．Ｐ．Ｓｐｉｃｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５７：６０７−６３４（１９９５）；Ｓ．Ｂ．Ｈｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：６４１−６５１（１９９３））。
【００４５】
ムチンは、高度にグリコシル化された糖タンパク質であって、粘液ゲルの主要な構造成分である。ムチンの生理学的機能は、細胞保護、機械的保護、分泌液の粘性維持、及び細胞認識である。腸管の主要なムチンにはＭＵＣ２やＭＵＣ３などがあり、胃ではＭＵＣ５ＡＣやＭＵＣ６などが多く発現している。ムチンはさらに、胆嚢、膵臓、精液小胞、及び女性の生殖管にも見出だされている。ムチンはまた、嚢胞性線維症や大腸癌の発達に関与することも知られている（Ｍ．Ｄａｖｒｉｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：３１１３２１（１９９９）；Ｅ．Ｌｉｎｄｈｏｒｓｔ，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，２１：１１６１２２（２０００））。
【００４６】
別の糖タンパク質の例は、赤血球膜のグリコホリン、細胞表面のインテグリン類、各種レセプター糖タンパク質などを含む。糖脂質の例は、細胞表面に存在するガングリオシド類（例えばＧＭ３）などを含む。プロテオグリカンの例は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸などを含む。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成技術又はＤＮＡ組換え技術を用いて合成することができる。
【００４８】
ペプチド合成は、液相法又は固相法によって行うことができる。一般に、アミノ酸のα−アミノ基又はα−カルボキシル基、或いは側鎖の官能基、を適当な保護基で保護したアミノ酸を原料とし、α−アミノ保護アミノ酸とα−カルボキシル保護アミノ酸との間でペプチド形成反応を行う。生成ジペプチドのα−カルボキシル保護基の脱保護を行ったのち、α−カルボキシル保護アミノ酸を原料としてペプチド形成反応を行う。生成トリペプチドに対して、さらに脱保護とペプチド形成反応を行い、この操作を繰り返して目的のポリペプチドを形成し、最後に全保護基の脱保護を行い、精製工程にかける。
【００４９】
α−アミノ保護基の例は、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基などを含む。その脱保護試薬の例は、接触還元（Ｐｄ触媒など）、ＨＦ／Ｎａ−ＮＨ３／ＨＢｒ、臭化水素/酢酸、トリフルオロ酢酸などを含む。
【００５０】
α−カルボキシル保護基の例は、メチル、エチル又はｔ−ブチルエステル基、ベンジルエステル基などを含む。その脱保護試薬の例は、苛性ソーダなどのアルカリ剤、接触還元（Ｐｄ触媒など）などを含む。
【００５１】
セリンやトレオニンの水酸基、チロシンのフェノール性水酸基、アルギニンのグアニジノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、リジンのε−アミノ基、グルタミン酸のγ−カルボキシル基、アスパラギン酸のβ−カルボキシル基、グルタミンやアスパラギンのアミド基、トリプトファンのインドール核、メチオニンのチオエーテル基などの側鎖の保護及び脱保護については、日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、第ＩＩ部ペプチド合成（２章液相法によるペプチド合成（矢島治明）、３章固相法によるペプチド合成(榊原俊平)）に記載されている。
【００５２】
ペプチド結合形成法には、酸クロリド法、混合酸無水物法、活性エステル法などが含まれる。
【００５３】
ペプチド合成方式には、段階的伸長法とフラグメント縮合法がある。段階的伸長法は、Ｎ末端側から順次、構成アミノ酸を結合する方式である。一方、フラグメント縮合法は、通常、ポリペプチドの合成に適用される方式であり、適当な長さのフラグメントのペプチド合成を行い、その後、各フラグメント同士を結合する方式である。
【００５４】
好ましいペプチド合成法は、固相法である。この方法はＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法として知られており、一般に、ペプチドのＣ末端のアミノ酸を架橋ポリスチレンに縮合させておき、Ｎ末端に向かってｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸などのα−アミノ保護アミノ酸を順次縮合させる。具体的な手法は、例えば日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、第ＩＩ部ペプチド合成（３章固相法によるペプチド合成(榊原俊平)）に記載されている。
【００５５】
ＤＮＡ組換え法を用いるポリペプチドの合成は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する遺伝子増幅、ベクターによるクローニング、発現ベクターで形質転換された大腸菌などの細菌細胞での発現などを含む方法で行うことができる。Ｃ型ＨＡ１の発現と精製は、例えばＦｕｊｉｎａｇａら（非特許文献１）又はＩｎｏｕｅら（非特許文献２）に記載されており、この手法と同様に、本発明のポリペプチドを合成することができる。
【００５６】
ＰＣＲ条件は、９４℃３０秒〜５分の変性、５５〜６０℃３０秒〜１分のアニーリング、及び７２℃１分〜１０分の伸長反応を１サイクルとし、２０〜４０サイクル行うことを含む。プライマーは、正方向プライマーと逆方向プライマーを、配列番号１のＨＡ１配列に基づいて、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅可能なように設計し、例えばＤＮＡ自動合成装置を用いて合成することができる。プライマーの長さは、例えば１５〜３０塩基、好ましくは１９〜２３塩基とすることができる。また、増幅のための鋳型は、Ｃ型ボツリヌス菌Ｃ−Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株の全ＲＮＡから調製したｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリー中に含まれるＨＡ１をコードするｃＤＮＡとすることができる。
【００５７】
さらにまた、発現ベクターは、例えば細菌用の市販プラスミドベクターのいずれかを使用することができる。ベクターには、プロモーター、複製開始点、シャイン−ダルガルノ配列(又はリボソーム結合部位)、ターミネーターなどの制御配列、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーなどを含むことができる。
【００５８】
変異体の合成は、例えばＰＣＲを利用した部位特異的突然変異誘発法などの公知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発法は、例えば、変異を導入したプライマーを合成し、ＨＡ１をコードするＤＮＡ、又は該ＤＮＡを含むベクターＤＮＡ、を鋳型としてＰＣＲを行うことを含む。この手法は、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行うことができる。
【００５９】
ＤＮＡ組換え法、ＰＣＲ法及び部位特異的突然変異誘発法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９； Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５に記載されている手法を利用することができる。
【００６０】
本発明のポリペプチドと糖との結合アッセイは、例えば後述の実施例５に記載の方法で行うことができる。簡単に説明すると、ムチン（例えばウシ顎下腺ムチン又はブタ胃ムチン）を固相化したマイクロタイターウエルプレートを作製し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングする。ウエルに、本発明のポリペプチドを加えてインキュベートし、プレートを洗浄した後、ウサギ抗Ｃ１６無毒成分抗血清又はウサギ抗ＨＡ１抗体と反応させ、標識化抗ウサギＩｇＧ抗体を加えて反応させて、結合したポリペプチドの量を定量する。標識は、放射性同位元素（１２５Ｉ、３２Ｐなど）又は酵素（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなど）などである。
【００６１】
本発明はさらに、上記定義の糖結合性ポリペプチドを支持体に結合してなる複合材料を提供する。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、糖を結合する特性を有するため、この特性を種々の用途に利用することができる。例えば、本発明のポリペプチドを支持体に結合することによって、該ポリペプチドに結合する糖、糖タンパク質、糖脂質などの物質の分離或いは分析のために、該複合材料を使用することができる。
【００６３】
支持体の例は、多糖類（例えばアガロース、セルロース、デキストランなど）、樹脂（ポリスチレン、ポリスチレン共重合体、ポリアクリルアミドなど）、シリカゲル、ガラスなどを含む。また、支持体の形状は、限定されないが、球状、粒子状、微粒子状、平面（例えばプレート、ウエルなど）などであり、支持体は多孔性又は非多孔性のいずれでもよい。
【００６４】
支持体へのポリペプチドの結合は、共有結合又は非共有結合のいずれでもよい。非共有結合の例は、吸着、イオン結合、水素結合などである。また、共有結合を利用する場合、支持体表面に、ポリペプチドの例えばアミノ基、カルボキシル基、イミダゾール基、フェノール性水酸基、チオール基などの基と反応性の官能基を導入することによって、この官能基にポリペプチドを直接又はスペーサーを介して結合させることができる。官能基の例は、臭化シアン（ＣＮＢｒ）による多糖類の活性化によって形成されるイミドカルボネートである。官能基の別の例は、ω−アミノアルキル基、ω−カルボキシアルキル基、ブロモアセチル基、チオール（ＳＨ）基、エポキシ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などである。スペーサーの例は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−などの基を含んでもよいＣ４〜Ｃ１０のアルキレン鎖である。官能性支持体の調製に関しては、例えば千畑一郎ら、実験と応用、アフィニティクロマトグラフィー、講談社サイエンティフィク、１９８０年に記載されており、その開示は本発明のために使用しうる。
【００６５】
本発明はさらに、上記定義の糖結合性ポリペプチド及び薬剤を含む薬剤送達システムを提供する。
【００６６】
本発明の薬剤送達システム（ＤＤＳ）は、例えば薬剤を内包するリポソームの表面に本発明のポリペプチドを結合して得られる複合体を含む。本発明のポリペプチドは、標的細胞（例えば小腸上皮細胞、大腸上皮細胞、大腸ガン細胞など）に移行し、該細胞内に入る性質をも有しているため、この性質を利用することによって、薬剤としてのタンパク質やポリペプチドを細胞内に送達することができる。リポソームは、好ましくはカチオン性リポソームであり、これにはコレステロール系カチオン性リポソームも含まれる（中西守ら、蛋白質核酸酵素４４巻１１号１５９０〜１５９６頁（１９９９年））。カチオン性リポソームは、陰イオン性表面をもつ細胞に接近しやすいという性質を有している。このようなリポソームと本発明のポリペプチドとによって、標的細胞に接近し、その細胞内に薬剤を届ける効率が増すと考えられる。
【００６７】
別のＤＤＳの例は、薬剤がタンパク質又はポリペプチドである場合、それらと本発明のポリペプチドとの融合体である。この場合も、本発明のポリペプチドは、標的細胞内に薬剤を送達する働きをする。もし薬剤タンパク質と本発明のポリペプチドとの融合部分に、細胞質プロテアーゼによって特異的に切断可能なアミノ酸配列を挿入する場合には、細胞内に移行後に、プロテアーゼの作用によって薬剤を細胞内で放出することも可能になるだろう。このような融合タンパク質は、ＤＮＡ組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記））を用いて合成することができる。
【００６８】
本発明のＤＤＳは、適切な賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて製剤化することができる。製剤は、固体、半固体または液体投与製剤、例えば溶液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、座剤、エマルジョン、噴霧剤などとしうる。また、製剤には、補助剤または添加剤、例えば安定化剤、界面活性剤、崩壊剤、結合剤、風味剤、懸濁助剤、滑沢剤、着色剤、噴射剤などを含みうる。投与経路は、経口、非経口、例えば静脈内投与、粘膜投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、直腸内投与、舌下投与などを含む。用量は、患者の年齢、性別、症状の程度などによって変化しうるが、例えば成人１ｋｇあたり１０μｇ〜１０ｍｇの有効成分（薬剤）の量である。
【００６９】
最後に、本発明のポリペプチドを、ＨＡ２及びＨＡ３と複合体を形成することも可能である。本発明のポリペプチドは、部位特異的突然変異の導入によって、天然型ＨＡ１と異なる配列を有し、糖に対する結合の特異性に変化をもたせることも可能である。例えば、アミノ酸置換により、ＨＡ１の結合糖の種類を変化させられるだけでなく、ＨＡ１分子で結合できる糖を０〜２個に調整することができる。さらにまた、ＨＡは多分子が会合して複合体を形成するため、ＨＡ分子にバリエーションが増えれば、複合体の認識できる糖の種類や構造は計り知れない数にのぼる。細胞表面の糖鎖構造は、動物種や組織、細胞の種類、正常か異常か等によって異なることが知られている。従って、例えばヒトで考えた場合、喉、食道、胃、小腸、大腸、他に鼻など様々な粘膜組織があり、これらに対して最も効率よく細胞表面の糖鎖に結合するように複合体を調製することが可能である。そのうえ、ヒト以外でも、イヌ、ネコ、ネズミといった哺乳類、鳥類、は虫類、魚類、さらに昆虫など脊椎動物以外にも、本発明のポリペプチドの応用の可能性がある。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、腸管壁からの効率的な体内吸収のための新規のＤＤＳとして使用可能であるし、また、例えば糖に親和性のあるレクチンのように、糖鎖構造を識別したり、糖鎖を分離したり、細胞に刺激を与える実験、研究用試薬としても使用可能である。この場合、１分子が認識できる糖の数を２個又はそれ以上に多価の反応性を付与されたものは、糖鎖の種類による分離や、識別において既存のものにない新たな用途開発につながる可能性がある。さらにまた、本発明のポリペプチドは、病気の診断、例えば細胞のガン化などにより、糖鎖構造の変化することが知られているガンの診断に使用することができる。ガン化によって変化した糖鎖構造を認識できるようにＨＡ１や複合体を調製すれば既存のものと同等な検出、或いは既存のものでは検出できなかったものの検出を可能とするような診断薬を創製できる。
【００７１】
本発明者らは、ＨＡ３についても結晶構造解析を進めてきたが、先行技術文献で記載されるようなβ−トレホイル構造などのこれまで糖親和性タンパクに多く認められた特徴的な構造などはなく、したがって、ＨＡ１で決定したような糖結合部位を、配列アラインメントのみで推測することは当業者といえども難しいことであり、実際に確認する必要があることも分かった。
【実施例１】
【００７２】
Ｃ型ボツリヌス菌ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株ＨＡ１の結晶構造解析
（１）ＨＡ１結晶の作製方法
ＨＡ１はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質として大腸菌で発現するようにｃＤＮＡを作製した。そして、ＭＢＰとＨＡ１との間にＦａｃｔｏｒ Ｘａによる切断可能サイトとＦＬＡＧタグを挿入した。この融合タンパク質を大腸菌で大量に発現させ、菌体を集めて破砕し、遠心分離で得られた上清をアミロースレジンカラム（Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ Ｉｎｃ．）にかけて精製した。次にＦａｃｔｏｒ Ｘａを作用させてＭＢＰを除去した後、イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＦＦ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にてＦＬＡＧタグ−ＨＡ１を精製した。
【００７３】
結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて２０℃で行った。具体的には３ｍｇ／ｍｌ濃度のＨＡ１溶液１．０μｌと等量の結晶化母液（１２％ エタノール及び１．７Ｍ ＮａＣｌを含むＭｉｌｌｉ−Ｑ水）と混合したドロップをスライドグラス上で作成し、同じ結晶化母液を加えた２４−ウェルプレート上にそのスライドグラスをドロップが内側になるように配置してグリースを用いて密閉した。約一ヶ月程度の静置により結晶成長を行い良好な単斜晶型の結晶を得た。この条件は従来法に比べ母液組成が簡便であり、また、タンパク質濃度を下げることにより、より大きな結晶を形成させることが可能となった。
【００７４】
（２）ＨＡ１結晶の結晶構造解析の方法
ＨＡ１結晶の回折データは、高エネルギー加速器研究機構（茨城、つくば市）のシンクロトロン（ＰＦ−ＡＲ）に設置されたＢＬ−５Ａのビームラインで収集した。Ｘ線波長は１Å、結晶に窒素ガスを吹き付け、−１８０℃で測定を行った。全てのデータセットはＨＫＬ２０００ソフトウェア（ＨＫＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７６，ｐ３０７−３２６）を用いて解析を行った。
【００７５】
（３）ＨＡ１結晶の結晶データ
Ｘ線回折強度測定により１．６オングストロームの高分解能で回折データが得られた。ＨＡ１の単斜晶型結晶は空間群Ｃ２に属し、これは以前の報告（非特許文献２）と同様であった。格子定数はａ＝１３８．５オングストローム、ｂ＝６２．０オングストローム、ｃ＝８３．１オングストローム、α＝γ＝９０°、β＝１０４．４°であり、完全性は９９．８％、Ｒｍｅｒｇｅが６．９％となり、非常に良質な回折データであった。これらのデータを表１にまとめた。
【００７６】
【表１】
【００７７】
（４）ＨＡ１結晶の全体構造
結晶の空間群はＣ２に属し、非対称単位内にＭｏｌ−Ａ及びＭｏｌ−Ｂの２つの分子を含む（図１）。ＨＡ１の構造は、２つのβ−ｔｒｅｆｏｉｌドメインから構成され、α−ヘリックスからなるリンカーが２つのドメインをつないでおり、鉄アレイ様の形状をしている。Ｎ−末端側及びＣ−末端側β−ｔｒｅｆｏｉｌドメインはそれぞれ１〜１４１及び１４６〜２８６のアミノ酸残基で構成されている。１つのβ−ｔｒｅｆｏｉｌドメインは２つのストランドがβ−ヘアピンでつながった構造を三対持つが、それらは３回の繰り返し構造（リピート）をとっており、１つのリピートは４つのストランド（β１〜β４）で構成されている。
【実施例２】
【００７８】
Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１の結晶構造解析
（１）Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１結晶の作製方法
ＨＡ１−糖の複合体結晶の作製は、浸透法（ｓｏａｋｉｎｇ）により行なった。これは予めリガンドの無い状態でタンパク質の結晶を作製し、後からリガンドを含む溶液に結晶を浸すことで複合体構造を得る方法である。実際には０．１〜０．４ＭのＧａｌＮＡｃを結晶化母液に含む溶液にＨＡ１の結晶を浸し、約４時間後に回折データの収集に用いた。
【００７９】
（２）Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１結晶の結晶構造解析方法
実施例１と同様にして解析を行った。
【００８０】
（３）Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１結晶の結晶データ
Ｘ線回折強度測定により１．７オングストロームの高分解能で回折データが得られた。ＨＡ１―Ｎ−アセチルガラクトサミン複合体の単斜晶型結晶は空間群Ｃ２に属し、格子定数はａ＝１３７．９オングストローム、ｂ＝６２．１オングストローム、ｃ＝８２．４オングストローム、α＝γ＝９０°、β＝１０４．２°であり、完全性は９９．９％、Ｒｍｅｒｇｅが５．６％となり、非常に良質な回折データであった。これらのデータを表２にまとめて記載した。
【００８１】
【表２】
【００８２】
（４）Ｎ−アセチルガラクトサミンを結合させたＨＡ１結晶の全体構造
リガンド糖は、ＨＡ１分子の３ヶ所に結合しているように見いだされ、Ｍｏｌ−Ａにおけるその部位をＳｉｔｅ ＩＡ 、Ｓｉｔｅ ＩＩＡ及びＳｉｔｅ ＩＩＩＡ、Ｍｏｌ−Ｂの各部位をＳｉｔｅ ＩＢ 、Ｓｉｔｅ ＩＩＢ及びＳｉｔｅ ＩＩＩＢと表記することとした。ＧａｌＮＡｃは、Ｓｉｔｅ ＩＢのみに確認された（図２）。
【００８３】
（５）Ｎ−アセチルガラクトサミンの電子密度マップ
リガンドとしてソーキングしたＧａｌＮＡｃの電子密度マップにモデルを当てはめた様子を図３に示した。図３はＸｔａｌＶｉｅｗシステム（ＭｃＲｅｅ，１９９９，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２５，１５６−１６５）のＸｆｉｔを用い、電子密度マップにモデルを当てはめることで作成した。ＧａｌＮＡｃ分子は良好な電子密度が得られ、糖のモデルがきれいにあてはまった。
【００８４】
（６）Ｎ−アセチルガラクトサミンと周辺アミノ酸との相互作用
ＧａｌＮＡｃのアセチル基に存在するＯ７分子はＡｒｇ１８３のグアニジド基由来の２ヶ所の窒素分子とそれぞれ２．７及び２．８オングストロームの距離で水素結合を形成し、ＧａｌＮＡｃの環構造がＴｒｐ１７６と疎水的なスタッキングを形成していた。またＧａｌＮＡｃのＯ３分子とＡｓｎ１６７の間に水分子を介した間接的な相互作用が認められた。これらの相互作用はＬｉｇｐｌｏｔソフトウェア（ＲＷａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．,１９９５，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，８， １２７−１３４）を用い、リガンド及び周辺アミノ酸残基の各原子間の距離より評価した（図４）。
【実施例３】
【００８５】
ガラクトースを結合させたＨＡ１の結晶構造解析
（１）ガラクトースを結合させたＨＡ１結晶の作製方法
実施例１と同様の手法で、０．１〜０．４Ｍのガラクトースを結晶化母液に含む溶液にＨＡ１の結晶を浸し、約４ｈ 後に回折データの収集に用いた。
【００８６】
（２）ガラクトースを結合させたＨＡ１結晶の結晶構造解析方法
実施例１と同様にして解析を行った。
【００８７】
（３）ガラクトースを結合させたＨＡ１結晶の結晶データ
Ｘ線回折強度測定により１．７８オングストロームの高分解能で回折データが得られた。ＨＡ１―ガラクトース複合体の単斜晶型結晶は空間群Ｃ２に属し、格子定数はａ＝１３７．９オングストローム、ｂ＝６２．２オングストローム、ｃ＝８２．３オングストローム、α＝γ＝９０°、β＝１０４．７°であり、完全性は９７．５％、Ｒｍｅｒｇｅが４．３％となり、非常に良質な回折データであった。これらのデータを、上記の表２にまとめて記載した。
【００８８】
（４）ガラクトースを結合させたＨＡ１結晶の全体構造
ＨＡ１−ガラクトース複合体の全体構造を図５に示した。ガラクトースはＣ−末端側β−ｔｒｅｆｏｉｌドメインに位置するＳｉｔｅ ＩＢ及びＳｉｔｅ ＩＩＢ の２ヶ所に確認できた。
【００８９】
（５）ガラクトースの電子密度マップ
ガラクトースの電子密度雲はＳｉｔｅ ＩＢ及びＳｉｔｅ ＩＩＢの２ヶ所に確認され、ガラクトース分子のモデルをきれいに当てはめることができた（図６）。電子密度マップの作成方法は実施例２と同じである。
【００９０】
（６）ガラクトースと周辺アミノ酸との相互作用
ガラクトース（Ｇａｌ）（Ｓｉｔｅ Ｉ、Ｓｉｔｅ ＩＩ）と周辺アミノ酸との相互作用を図７に示した。Ｓｉｔｅ ＩにおいてはＧａｌのＯ４及びＯ６分子はＡｒｇ１８３の２ヶ所のアミノ基とそれぞれ３．０及び２．６オングストロームの距離で水素結合を形成していた。また、ＧａｌのＯ１及びＯ５分子はＬｅｕ１６８と３．０オングストロームの距離で水素結合を形成していた。糖の環構造はＴｒｐ１７６の芳香環と疎水的なスタッキングを形成していた。Ｓｉｔｅ ＩＩにおいてＧａｌのＯ１及びＯ４分子はＡｓｎ２５９の側鎖及び主鎖に存在する窒素分子と２．７オングストロームの距離で水素結合を形成していた。ＧａｌのＯ３分子はＨｉｓ２７４及びＡｓｎ２７８の窒素分子と２．７オングストロームの距離で水素結合を形成していた。相互作用の評価はｌｉｇｐｌｏｔソフトウェア（ＲＷａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．,１９９５，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，８，１２７−１３４）で行った（図７）。
【００９１】
（７）Ｓｉｔｅ Ｉ及びＩＩの位置づけ
糖結合部位の立体構造における差異を検証する目的で、既に報告されているＡ型ＨＡ１（Ａｒｎｄｔ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４６，１０８３−１０９３）とＣ型ＨＡ１の結晶構造の比較を行なった。Ａ型のＨＡ１も２つのβ−ｔｒｅｆｏｉｌドメインで構成され、その形状はＣ型と非常に似ている。
【００９２】
Ｓｉｔｅ Ｉを見た場合、Ｃ型ではリシンの糖結合サイトと環状疎水性アミノ酸や糖と水素結合できるようなアミノ酸残基の配置が似ているため、Ｉｎｏｕｅら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９：３３６１−３３７０（２００３））は糖結合の可能性を推定している。しかし、それを証明するためにＡ型ＨＡ１の同サイトにある関連アミノ酸を置換する実験を行い、糖結合性に変化がないことからＡ型の同サイトが重要でないことのみを述べている。今回、本発明者らは、Ｘ線結晶構造解析において同サイトに結合している糖を直接観察することができた。しかも、Ｉｎｏｕｅら（上記）は、ガラクトースやラクトースの結合性にのみ着眼し、本発明者らが今回発見したＮ−アセチルガラクトサミンやＮ−アセチルノイラミン酸に関しては何の推測も考察も行っていないが、本発明者らは今回これらの糖についても同サイトに結合していることを確認した。
【００９３】
一方、Ｓｉｔｅ ＩＩにおいてもＩｎｏｕｅら(上記)は、Ｃ型の結合サイトであることを予想しているがそのことをＡ型で重要と考えられるアミノ酸の置換で証明しているのみである。本発明者らは、ガラクトースに関して、Ｃ型がこのサイトで結合できることをＸ線結晶構造解析より新たに証明した。しかし、後述図１１で明らかにするように、Ｓｉｔｅ Ｉにある結合に重要な役割を果たすと考えられるアミノ酸を別のものに置換した変異体ＨＡ１（Ｗ１７６Ａ）がムチンへの結合能を大きく消失してしまうことから、Ｃ型ではＳｉｔｅ ＩＩはＳｉｔｅ Ｉに比べ結合力がそれほど強くないことが考えられる。
【実施例４】
【００９４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１の結晶構造解析
（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の作製方法
実施例１と同様の手法で、０．１〜０．４ＭのＮ−アセチルノイラミン酸を結晶化母液に含む溶液にＨＡ１の結晶を浸し、約４ｈ 後に回折データの収集に用いた。
【００９５】
（２）Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の結晶構造解析方法
実施例１と同様にして解析を行った。
【００９６】
（３）Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の結晶データ
Ｘ線回折強度測定により２．２オングストロームの高分解能で回折データが得られた。ＨＡ１―アセチルノイラミン酸複合体の単斜晶型結晶は空間群Ｃ２に属し、格子定数はａ＝１３８．３オングストローム、ｂ＝６１．７オングストローム、ｃ＝８２．４オングストローム、α＝γ＝９０°、β＝１０４．３°であり、完全性は９５．０％、Ｒｍｅｒｇｅが５．０％となり、非常に良質な回折データであった。これらのデータを上記の表２にまとめて記載した。
【００９７】
（４）Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の全体構造
Ｎ−アセチルノイラミン酸を結合させたＨＡ１結晶の全体構造を図８に示した。Ｎｅｕ５Ａｃは、Ｓｉｔｅ ＩＡ及びＳｉｔｅ ＩＢにそれぞれ確認できた。Ｓｉｔｅ ＩＡとＳｉｔｅ ＩＢはＨＡ１分子が異なるものの同じ部位であり、結合に関与する残基も全く同様であった。
【００９８】
（５）Ｎ−アセチルノイラミン酸の電子密度マップ
Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｓｉｔｅ Ｉ）の電子密度マップを図９に示した。Ｎｅｕ５ＡｃのＳｉｔｅ Ｉに関しては両分子とも同様に良好な電子密度が得られたのでＳｉｔｅ ＩＡの電子密度雲にモデルを当てはめたもののみ掲載した。電子密度マップの作成方法は実施例２に同じである。
【００９９】
（６）Ｎ−アセチルノイラミン酸と周辺アミノ酸との相互作用
Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＳｉｔｅＩ）と周辺アミノ酸との相互作用を図１０に示した。Ｎｅｕ５Ａｃのアセチル基に存在するＯ１０分子はＡｒｇ１８３のグアニジド基由来の２ヶ所のアミノ基と３．０オングストロームの距離で水素結合を形成していた。Ｎｅｕ５Ａｃの環構造がＴｒｐ１７６と疎水的なスタッキングを形成し、Ｃ７及びＣ９分子とＰｈｅ１７９との間に疎水的な相互作用が認められた。相互作用の評価はＬｉｇｐｌｏｔソフトウェア（ＲＷａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．,１９９５，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，８，１２７−１３４）で行った。
【実施例５】
【０１００】
トリプトファン１７６をアラニンに置換したＨＡ１の結合能
（１）実験方法
ＨＡ１変異体Ｗ１７６ＡはｐＧＥＸ ５Ｘ−３に導入されたＨＡ１のｃＤＮＡ配列をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｍｕｌｔｉ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により製造元のマニュアルに従って改変することで作製し、その発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入した。発現誘導は０．５ｍＭ ＩＰＴＧで行ない、精製はグルタチオンアガロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のアフィニティーカラムを用いて行った。得られたＧＳＴ−ＨＡ１変異体はＧＳＴを切断しないでそのままアッセイに使用した。
【０１０１】
結合アッセイは以下の方法で行った。９６−ウェルマイクロプレート（ホワイトマキシソープモジュールＵ ｂｏｔｔｏｍ， Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）に１０μｇ／ｍｌ濃度でＰＢＳ（ｐＨ６．８）に溶解したウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）（シグマ社製）あるいはブタ胃ムチン（ＰＧＭ）（シグマ社製）を１００μｌずつ加え、４℃で一晩静置しムチンを固相化した。ＰＢＳによる洗浄の後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ＰＢＳに０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）を加え１時間静置することでブロッキングを行い、ＰＢＳＴによる洗浄に引き続き７６ｐｍｏｌのＧＳＴ−ＨＡ１を含むＰＢＳＴを１００μｌ加えて室温で１時間インキュベートした。次にウェルをＰＢＳＴで洗浄し２，０００倍希釈したウサギ抗Ｃ１６Ｓ無毒成分抗血清を加え１時間反応させた。ＰＢＳＴでウェルをよく洗浄し、１０，０００倍希釈したＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を加えて１時間の反応を行なった。その後ＰＢＳＴで再度ウェルを洗浄し、ルミノール溶液を加えて検出をおこなった。化学発光はルミノイメージングアナライザーＬＡＳ３０００（富士フィルム社製）で検出し、マルチゲージｖ２．１ソフトウェア（富士フィルム社製）で解析を行なった。
【０１０２】
（２）実験結果
結果を図１１に示した。図の縦軸はＨＡ１の固相化ムチンに対する結合量を示し、野生型ＨＡ１のＢＳＭ及びＰＧＭへの結合量をそれぞれ１００％とした時の変異体の結合量を割合で示している。図からＷ１７６Ａ変異体は、ＢＳＭへの結合能が１０％以下と極端に減少し、ＰＧＭに対する結合も４０％以下に減少した。このことから、Ｓｉｔｅ Ｉは糖結合部位として機能し、同部位がＨＡ１における主たる糖結合部位であることが示唆された。一般に、ＢＳＭは末端にＮ−アセチルノイラミン酸を持つ糖鎖が多数含まれており、ＰＧＭは末端がガラクトースの糖鎖を多く含んでいるとされている。Ｃ型ＨＡ１のこれらムチンに対する結合能の詳細はＮａｋａｍｕｒａらの文献（Ｎａｋａｍｕｒａら，ＢＢＡ − Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ；ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｇｅｎ．２００６．１１．００６）に記載されている。
【実施例６】
【０１０３】
アスパラギン酸２７１をフェニルアラニンに置換したＨＡ１の結合能
（１）実験方法
実施例５で作製したｐＧＥＸ ５Ｘ−３ベクターに導入されたＨＡ１の変異体Ｗ１７６ＡのｃＤＮＡ配列をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｍｕｌｔｉ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製） によりさらに改変してＤ２７１Ｆのアミノ酸置換体発現ベクターＷ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆを作製した。作製方法は製造元のマニュアルに従った。以下実施例５と同様にしてＧＳＴ−ＨＡ１変異体Ｗ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆを得た。結合アッセイは実施例５と同様に行ったが、ＨＡ１変異体をウエルに加える際に２５ｍＭのガラクトースあるいはＮｅｕ５Ａｃを同時に加える阻害実験も行った。
【０１０４】
（２）実験結果
図１２はＷ１７６Ａ変異体のＡｓｐ２７１をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換したＷ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体の固相化ムチンへの結合能を検証した結果である。図の縦軸はＨＡ１のムチンに対する結合量を示し、野生型ＨＡ１のＢＳＭ及びＰＧＭへの結合をそれぞれ１００％とした割合で示している。Ｗ１７６Ａで減少したムチンへの結合能はＷ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体では野生型と同程度或いはそれ以上の結合能を示すようになった。野生型ＨＡ１のＢＳＭへの結合は阻害剤として２５ｍＭ濃度で加えたＮｅｕ５Ａｃにより著明に減少したが、同濃度のＮｅｕ５Ａｃ添加でＷ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体のＢＳＭへの結合が阻害されることはなかった。一方、野生型ＨＡ１のＰＧＭへの結合は２５ｍＭ濃度のＧａｌの添加ではほとんど阻害されなかったが、Ｗ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体の結合は大きく阻害された。このことは、Ｗ１７６Ａ／Ｄ２７１Ｆ変異体がＳｉｔｅ ＩＩを主たる結合部位としてガラクトースを強く認識する特性を獲得したことを示している。
【実施例７】
【０１０５】
その他のアミノ酸置換をしたＨＡ１の結合能
実施例２の（１）と同様の手法で１７９番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアルギニン（Ａｒｇ）など側鎖の長いアミノ酸に置換した変異体のｃＤＮＡを作製し、大腸菌で発現させ、タンパク質を精製して糖に対する結合性を測定したところ、Ｎ−アセチルノイラミン酸に対する結合能が異なるものが得られた。
【０１０６】
実施例２の（１）と同様の手法で２５９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）をアラニン（Ａｌａ）に置換した変異体のｃＤＮＡを作製し、大腸菌で発現させ、タンパク質を精製して糖に対する結合性を測定したところ、Ｓｉｔｅ ＩＩでの糖結合性が減少した。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明のポリペプチドは、糖に対し結合性を有する特性を利用して、例えば特定の器官組織や癌組織に特異的な糖鎖に薬剤を送達するための薬剤送達システム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）、癌の診断、カラム担体の表面に結合させて糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなどを精製するための複合材料、などに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】Ｃ型ボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ株ＨＡ１の全体構造。
【図２】ＨＡ１−Ｎ−アセチルガラクトサミン複合体の全体構造。
【図３】Ｎ−アセチルガラクトサミンの電子密度マップ。
【図４】ＨＡ１の糖結合部位におけるＧａｌＮＡｃと周辺残基との相互作用。
【図５】ＨＡ１−ガラクトース複合体の全体構造。
【図６】ガラクトースの電子密度マップ。
【図７】ＨＡ１の糖結合部位におけるガラクトースと周辺残基との相互作用。
【図８】ＨＡ１−Ｎ−アセチルノイラミン酸複合体の全体構造。
【図９】ＨＡ１−Ｎ−アセチルノイラミン酸の電子密度マップ。
【図１０】ＨＡ１の糖結合部位におけるＮｅｕ５Ａｃと周辺残基との相互作用。
【図１１】ＨＡ１変異体のムチン結合能。
【図１２】ＨＡ１変異体のムチン結合能。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（４）のポリペプチド：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（４）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
からなる群から選択される糖結合性ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項８】
上記（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項９】
糖と非共有結合によって結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項１０】
糖が、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項１１】
糖が、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、或いはこれらの糖を少なくとも１つ含むオリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンである、請求項１０に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチドを支持体に結合してなる複合材料。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチド及び薬剤を含む薬剤送達システム。
【請求項１】
下記（１）〜（４）のポリペプチド：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチド、
（４）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチド、
からなる群から選択される糖結合性ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号７で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項８】
上記（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドのヘテロ又はホモ多量体である、請求項１に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項９】
糖と非共有結合によって結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項１０】
糖が、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項１１】
糖が、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、或いはこれらの糖を少なくとも１つ含むオリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンである、請求項１０に記載の糖結合性ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチドを支持体に結合してなる複合材料。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖結合性ポリペプチド及び薬剤を含む薬剤送達システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−１６９１６６（Ｐ２００８−１６９１６６Ａ）
【公開日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２６５（Ｐ２００７−５２６５）
【出願日】平成１９年１月１４日（２００７．１．１４）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１４日（２００７．１．１４）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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