糖鎖の切断触媒
ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒、該糖鎖の特異的切断剤、生体組織中に存在する該糖鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬、該糖鎖を特異的に切断する方法、低分子量化された該糖鎖を特異的に生産する方法、および該触媒、該切断剤および該医薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、新規な糖鎖切断触媒、糖鎖の特異的切断剤等に関する。
【背景技術】
まず、本明細書中で共通して用いる略号について説明する。
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳＡ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳＣ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳＤ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＤＳ（ＣＳＢと表記することもある）：デルマタン硫酸
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＫＳ：ケラタン硫酸
なおＣＳＡは、「グルクロン酸残基とＮ−アセチルガラクトサミン残基とがβ１，３グリコシド結合した二糖単位」が連続して結合されてなる分子であって、「グルクロン酸残基（β１−３）４位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基」からなる二糖単位を主たる構成成分とするＣＳである。
ＣＳＣは、「グルクロン酸残基とＮ−アセチルガラクトサミン残基とがβ１，３グリコシド結合した二糖単位」が連続して結合されてなる分子であって、「グルクロン酸残基（β１−３）６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基」からなる二糖単位を主たる構成成分とするＣＳである。
ＣＳＤは、「グルクロン酸残基とＮ−アセチルガラクトサミン残基とがβ１，３グリコシド結合した二糖単位」が連続して結合されてなる分子であって、「２位が硫酸化されたグルクロン酸残基（β１−３）６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基」からなる二糖単位を主たる構成成分とするＣＳである。
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７７，ｐ３３６５４−３３６６３（２００２）には、ヒアルロニダーゼの一種であるＨＹＡＬ１が記載されている。またＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２３６（１），ｐ１０−１５，（１９９７）には、ＨＹＡＬ１の全アミノ酸配列及びこれをコードするｃＤＮＡの全塩基配列が開示されている。
しかし、ＨＹＡＬ１がＣＳＢ、ＫＳ及び平均分子量１０００のＣＨを切断する活性を実質的に有さず、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤを切断する活性を有することは知られていない。
【発明の開示】
本発明は、ＨＹＡＬ１を必須成分とする新規な糖鎖切断触媒、糖鎖の特異的切断剤等を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＨＹＡＬ１を必須成分とする新規な糖鎖切断触媒、糖鎖の特異的切断剤及び医薬、並びにＨＹＡＬ１を特定の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む糖鎖の特異的切断方法、ＨＹＡＬ１を特定の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法、ＨＹＡＬ１を保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、前記触媒の製造方法、ＨＹＡＬ１を保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、前記切断剤の製造方法、及びＨＹＡＬ１を保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、前記医薬の製造方法等を提供するに至った。
本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とし、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒（以下、「本発明触媒」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明触媒は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とする、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断剤（以下、「本発明切断剤」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明切断剤は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とし、生体組織中に存在するＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬（以下、「本発明医薬」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明医薬は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。
また、本発明医薬による切断対象となる糖鎖が存在する「生体組織」は、髄核であることが好ましい。また本発明医薬は、椎間板ヘルニアの処置剤であることが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、当該糖鎖を特異的に切断する方法（以下、「本発明切断方法」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明切断方法においては、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨが切断されないことが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法（以下、「本発明糖鎖生産方法」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明糖鎖生産方法においては、低分子量化されたＤＳ、ＫＳ及びＣＨが生産されないことが好ましい。
また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明触媒の製造方法（以下、「本発明触媒製造方法」という）を提供する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明切断剤の製造方法（以下、「本発明切断剤製造方法」という）を提供する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明医薬の製造方法（以下、「本発明医薬製造方法」という）を提供する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
さらに本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質（以下、「本発明融合タンパク質」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明融合タンパク質は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。
さらに本発明は、上記本発明医薬を投与することを特徴とする、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在する疾患を処置する方法（以下、「本発明処置方法」という）を提供する。
本発明処置方法における好ましい本発明医薬及び好ましい生体組織は、上記本発明医薬において好ましいものと同様である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＨＡを用いた場合の結果を示す図である。
第２図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＨを用いた場合の結果を示す図である。
第３図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＳＡを用いた場合の結果を示す図である。
第４図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＳＢを用いた場合の結果を示す図である。
第５図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＳＣを用いた場合の結果を示す図である。
第６図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＳＤを用いた場合の結果を示す図である。
第７図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＫＳを用いた場合の結果を示す図である。
第８図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＨＡとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
第９図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＣＳＡとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
第１０図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＣＳＣとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
第１１図は酵素源をＰＨ２０、基質をＨＡとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
第１２図は酵素源をＰＨ２０、基質をＣＳＡとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を、発明の実施の形態によって詳説する。
＜１＞本発明触媒
本発明触媒は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とし、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
（Ａ）のタンパク質はＨＹＡＬ１のタンパク質である。
なお、天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように（Ａ）のタンパク質に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質も、本発明触媒の必須成分として用いることができる。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４））。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には（Ａ）のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質である。上記の（Ｂ）のタンパク質は、このようなタンパク質を規定するものである。
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、ＨＹＡＬ１の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基からなるタンパク質の場合、２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。配列番号２の場合には、２〜２２程度、好ましくは２〜１１、より好ましくは２〜６以下の数を示す。
本明細書において、（Ｂ）のタンパク質と同様に、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質も本発明触媒の有効成分として使用することができる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、最も好ましくは９７％以上の相同性を有することが好ましい。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて容易に算出することができ、このようなソフトウェアはインターネットによっても利用に供されている。
また本発明触媒における上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列には、他のタンパク質やペプチドのアミノ酸配列が含まれていても良い。すなわち上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質は、他のペプチドとの融合タンパク質であっても良い。本発明は、このような上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質（本発明融合タンパク質）をも提供する。本明細書における「他のペプチド」という用語は、「ポリペプチド」を含む概念として用いる。
本発明融合タンパク質としては、ＨＹＡＬ１とマーカーペプチドとの融合タンパク質等が例示される。このような本発明融合タンパク質は、精製や分析を容易にすることができるというメリットがある。上記マーカーペプチドとしては例えばＦＬＡＧペプチド、プロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質は、抗ＦＬＡＧ抗体を結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。プロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。本発明融合タンパク質は、なかでもＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質であることが好ましい。
本発明融合タンパク質は、以下の通り製造することができる。
まず、前記（Ａ）のタンパク質（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４３５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ａ）」という）を用意する。このＤＮＡは、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４３５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なったヌクレオチド配列を有するＤＮＡが存在するが、配列番号１におけるヌクレオチド番号１〜１３０８で示されるヌクレオチド配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。このＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０３０５６として登録されている。
また、前記（Ａ）のタンパク質に代えて前記（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ｂ）」という）を用いてもよい。「ＤＮＡ（ｂ）」は、前記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有する限りにおいて特に限定されない。
これらの糖鎖を切断する活性を有するか否かは、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。例えば、後述の実施例に示すようなＧＰＣにおける糖鎖のピークの移動によって検出することができ、この方法によって検出されることが好ましい。
また、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤ以外の種々の基質（糖鎖）を用いて、ＧＰＣにおける糖鎖のピークの移動の有無を検出することにより、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤに対する切断活性の特異性の有無を検出することができる。このような方法によって、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を保持しているアミノ酸の欠失、置換、挿入又は転位を容易に選択することができる。
このような「ＤＮＡ（ｂ）」としては、例えば「ＤＮＡ（ａ）」若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
上記ＤＮＡ（ａ）又はＤＮＡ（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いたタンパク質の発現は、当該ＤＮＡが保持されたベクター（好ましくは発現ベクター）を用いて行うことが好ましい。ＤＮＡのベクターへの組込みは、通常の方法によって行うことができる。
ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＥＺＺＺ１８（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＣＨ１１０（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＢＡＤ（インビトロゲン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社製）又はｐＳＥ４２０（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、ＣＯＳ細胞や３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などの哺乳類細胞と、ｐＧＩＲ２０１（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１３９４−１４０１）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８，５３２２）、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｎｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．（１９９１）Ｇｅｎｅ １０８，１９３−２００）、ｐＣＭＶ−２（イーストマン コダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）製）、ｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７（１９９０））又はｐＳＶＬ（ファルマシア バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせのほか、宿主細胞として酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に原核細胞（特に大腸菌細胞）とｐＥＴ１５ｂとの組み合わせが好ましい。
また、宿主細胞として昆虫細胞を用いることもできる。この場合にも、昆虫細胞に対応する各種ベクターを用いることができる。昆虫細胞としては、高発現ＳＦ＋細胞（ｅｘｐｒｅｓＳｆ＋（登録商標））を用いることが好ましい。また、ＤＮＡを組み込むトランスファーベクターとしてはｐＰＳＣ８やｐＰＳＣ１２が好ましい。ＤＮＡをｐＰＳＣ８に組み込む場合には、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ、ＮｒｕＩ、ＢｇｌＩＩを利用して組み込みを行うことができる。ＤＮＡをｐＰＳＣ１２に組み込む場合には、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩを利用して組み込みを行うことができる。また、タンパク質のＮ末端にＦＬＡＧペプチドが融合されたかたちで発現されるようにするために、トランスファーベクターに組み込む前に、対応するＤＮＡの末端にＦＬＡＧペプチドをコードする配列を付加しておくことが好ましい。
ＤＮＡをトランスファーベクターに組み込んだ後、これをバキュウロウイルスに導入することが好ましい。バキュウロウイルスとしては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）や、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ（ＢｍＮＰＶ）を用いることが好ましい。そして、目的とするＤＮＡが導入されたバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させればよい。
ＤＮＡを組込むベクターは、目的とするタンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることができる。ＤＮＡからのタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、通常の方法に従って行うことができる。
例えば、目的とするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを適当な宿主に導入することによって宿主を形質転換し、この形質転換体を生育させ、その生育物から発現されたタンパク質を採取することによって行うことができる。
本発明触媒は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有しており、この能力の有無も、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に切断する能力を有するものが好ましい。
また本発明触媒は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨに対する切断能力の有無も、前記と同様にＤＳ、ＫＳ又は平均分子量７０００のＣＨを基質として用いて、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
本発明触媒は、少なくとも前記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を含んでいればよい。すなわち本発明触媒は、前記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質自体をそのまま本発明触媒としてもよく、前記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質に加えて、これらのタンパク質に悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の成分を含有させてもよい。
本発明触媒の製造方法も特に限定されず、天然物から上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を単離してもよく、化学合成等によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよく、遺伝子工学的手法によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよい。遺伝子工学的手法によって本発明触媒を製造する方法については、後述の本発明触媒製造方法を参照されたい。
本発明触媒の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合した固定化酵素形態のいずれであってもよい。
＜２＞本発明切断剤
本発明切断剤は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とする、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断剤である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明切断剤は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有しており、この能力の有無も、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に切断する切断剤であることが好ましい。
また本発明切断剤は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨに対する切断能力の有無も、前記と同様にＤＳ、ＫＳ又は平均分子量７０００のＣＨを基質として用いて、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
そして本発明切断剤は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、このような目的の下でＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しない目的で用いられることが好ましい。
本発明切断剤の製剤化には、公知の方法を用いることができる。また本発明切断剤の形態も特に限定されず、例えば溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態、担体と結合した固定化酵素形態のいずれであってもよい。
本発明切断剤に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」と同様である。遺伝子工学的手法によって本発明切断剤を製造する方法については、後述の本発明切断剤製造方法を参照されたい。
＜３＞本発明医薬
本発明医薬は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とし、生体組織中に存在するＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明医薬は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有しており、この能力の有無も、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に切断する医薬であることが好ましい。
また本発明医薬は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨに対する切断能力の有無も、前記と同様にＤＳ、ＫＳ又は平均分子量７０００のＣＨを基質として用いて、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
そして本発明医薬は、生体組織中に存在するＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、このような目的の下でＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しない目的で用いられることが好ましい。
また本発明医薬が適用される生体組織は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断することが望まれる生体組織である限りにおいて特に限定されない。例えば、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が、健常状態におけるレベルよりも過剰に存在しているような生体組織が挙げられる。このような生体組織として具体的には髄核が例示され、なかでも椎間板ヘルニアの状態にある髄核が好ましい。すなわち本発明医薬は、椎間板ヘルニアの処置剤であることが好ましい。本明細書における「処置」の用語には、予防、進行抑制（悪化防止）、改善、治療等を目的とする処置が含まれる。
近年、コンドロイチナーゼを椎間板に投与して髄核を融解し、椎間板ヘルニアを治療する試みが現に行われている（米国特許第４６９６８１６号、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，２５３，３０１−３０８（１９９０））。このことから、ＣＳを切断する活性を有する本発明医薬は、同様に椎間板ヘルニアの処置剤として十分に利用しうるものである。
そして本発明医薬が適用される動物も特に限定されないが、脊椎動物であることが好ましく、なかでも哺乳類であることが好ましい。哺乳類としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ等が提示されるが、ヒトに対して適用されるものが特に好ましい。
本発明医薬の投与方法は、本発明医薬による生体組織中のＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射による投与が挙げられる。本発明医薬を髄核に適用する場合には、目的とする髄核が存在する椎間板又は脊髄硬膜外腔に注射することが好ましい。
投与方法に応じて上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を適宜製剤化して、本発明医薬とすることができる。通常、製剤化は医薬的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により行われる。剤形としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤等が挙げられる。なかでも注射剤が好ましい。
本発明医薬の投与量は、上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の種類、比活性、投与される動物の種類や症状等、投与対象となる生体組織の種類やその状態等によって個別的に設定されるべきものであり、特に限定されないが、一般的には一日あたり０．１μｇ〜１０００ｍｇ程度を投与することができる。
本発明医薬に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」と同様である。遺伝子工学的手法によって本発明医薬を製造する方法については、後述の本発明医薬製造方法を参照されたい。
＜４＞本発明切断方法
本発明切断方法は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、当該糖鎖を特異的に切断する方法である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質に関する説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」と同様である。上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる方法は、これらの分子が相互に接触して酵素反応が生ずる状態となる限りにおいて特に限定されず、例えば前者に後者を添加してもよく、後者に前者を添加してもよく、両者を同時に添加してもよい。
また、上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質を担体（例えば、ゲル、ビーズ、膜、プレート等）に固定させ、これとＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖とを接触させてもよい。
両者を接触させた後の反応の条件は、上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が作用する条件である限りにおいて特に限定されないが、これらのタンパク質の至適ｐＨ付近（例えばｐＨ４〜ｐＨ５程度）で反応させることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。またこのときの温度も、これらのタンパク質の活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、３５℃〜４０℃程度が例示される。またこれらのタンパク質の活性を増加させる物質がある場合には、その物質を添加してもよい。反応時間は、ｐＨ条件、温度条件、作用させるタンパク質及び糖鎖の量、及びどの程度の切断（低分子量化）を所望するか等によって適宜調節することができる。反応時間を長くすれば切断（低分子量化）の程度を増すことができ、反応時間を短くすればその程度を減ずることができる。
また本発明切断方法には、このようなタンパク質の作用工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
本発明切断方法によって、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が特異的に切断される。これらの糖鎖が切断されたか否かは、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に切断する方法であることが好ましい。
また本発明切断方法は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しないことが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨが切断されていないことも、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
すなわち本発明切断方法は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、このような目的の下でＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しない目的で用いられることが好ましい。
本発明切断方法に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」と同様である。
＜５＞本発明糖鎖生産方法
本発明糖鎖生産方法は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明糖鎖生産方法により、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が低分子量化された糖鎖を特異的に生産することができる。低分子量化された糖鎖が生産されたか否かは、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって確認することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に生産する方法であることが好ましい。
また本発明糖鎖生産方法は、低分子量化されたＤＳ、ＫＳ及びＣＨを生産しないことが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及びＣＨが生産されていないことも、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって確認することができる。
すなわち本発明糖鎖生産方法は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、このような目的の下でＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しない目的で用いられることが好ましい。
生成物から低分子量化された糖鎖を単離する方法等は、公知の方法によって行うことができる。
本発明糖鎖生産方法に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」及び「＜４＞本発明切断方法」と同様である。
＜６＞本発明触媒製造方法
本発明触媒製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明触媒の製造方法である。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
上記（ａ）のＤＮＡは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なった塩基配列を有するＤＮＡが存在するが、配列番号１で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。配列番号１で示されるＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０３０５６として登録されている。
上記（ｂ）のＤＮＡも、配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、例えば上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
上記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いたタンパク質の発現は、当該ＤＮＡが保持されたベクター（好ましくは発現ベクター）を用いて行うことが好ましい。ＤＮＡのベクターへの組込みは、通常の方法によって行うことができる。
ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系としては、ＣＯＳ細胞、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などの哺乳類細胞と、ｐＧＩＲ２０１（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１３９４−１４０１）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８，５３２２）、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｎｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．（１９９１）Ｇｅｎｅ １０８，１９３−２００）、ｐＣＭＶ−２（イーストマン コダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）製）、ｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７（１９９０））又はｐＳＶＬ（ファルマシア バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＥＺＺＺ１８（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＣＨ１１０（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＥＴ（ストラタジーン社製）、ｐＢＡＤ（インビトロゲン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社製）、及びｐＳＥ４２０（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、昆虫細胞とバキュロウイルスとの組み合わせのほか、宿主細胞として酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に哺乳類細胞（特にＣＯＳ細胞）とｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６（ＳＩＧＭＡ社製）との組み合わせが好ましい。
また、ＤＮＡを組込むベクターは、目的とするタンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることもできる。ＤＮＡからのタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、通常の方法に従って行うことができる。
例えば、目的とするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを適当な宿主に導入することによって宿主を形質転換し、この形質転換体を生育させ、その生育物から発現されたタンパク質を採取することによって行うことができる。
ここで「生育」とは、形質転換体である細胞や微生物自体の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養された宿主細胞・分泌物・排出物等を包含する概念である。生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わせて適宜選択できる。
生育物からのタンパク質の採取も、タンパク質の公知の抽出・精製方法によって行うことができる。
例えば目的とするタンパク質が、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。また目的とするタンパク質が細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によって目的とするタンパク質を抽出することができ、その抽出物をそのまま用いてもよい。
これらの培地や抽出物から、タンパク質をさらに精製することもできる。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、目的とするタンパク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
目的とするタンパク質が製造されたか否かは、アミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析することによって確認することができる。
また本発明切断方法には、以上のような発現・採取工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
＜７＞本発明切断剤製造方法
本発明切断剤製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明切断剤の製造方法である。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明切断剤製造方法に関するその他の説明は、前記の「＜６＞本発明触媒製造方法」と同様である。
＜８＞本発明医薬製造方法
本発明医薬製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明医薬の製造方法である。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明医薬製造方法に関するその他の説明は、前記の「＜６＞本発明触媒製造方法」と同様である。
＜９＞本発明処置方法
本発明処置方法は、本発明医薬を投与することを特徴とする、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在する疾患を処置する方法である。
本発明処置方法に関するその他の説明は、前記の「＜３＞本発明医薬」と同様である。
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらによって本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
（１）ＨＹＡＬ１遺伝子の発現
ＣＯＳ−７細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより入手）を、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で約２０〜４０％コンフルエントになるまで培養した。培養は５％ＣＯ２の下で３７℃で実施した。
配列番号１で示される塩基配列（ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡ）をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクター（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に組み込んだヒアルロニダーゼ発現ベクターを、ＴｒａｎｓＦａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中、３７℃で３日間培養した。培養は５％ＣＯ２の下で３７℃で実施した。
また、配列番号１で示される塩基配列（ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡ）が組み込まれていないｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクターをトランスフェクトした細胞についても、同様に培養した。
（２）酵素液の調製
上記（１）で培養された細胞（ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターをトランスフェクトしたもの、又はＨＹＡＬ１のｃＤＮＡを組み込んでいない発現ベクターをトランスフェクトしたもの）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４又はｐＨ６．０）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．２５Ｍ シュークロースを含有する溶液中、氷冷下でセルスクレーパーを用い破砕した。この破砕後の液をそのまま酵素液として用いた。
（３）基質特異性の解析
（２）で調製された酵素液を種々の基質と反応させることによって、酵素の基質特異性を解析した。反応は、０．２５％の各種基質、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４又はｐＨ５）又はリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６又はｐＨ７）を含有する反応混合液に（２）で調製された酵素を最終濃度２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）となるよう添加し、３７℃で４日間インキュベートすることによって行った。
ここで用いた基質は、以下の通りである。
＊ＨＳ：（鶏冠由来；生化学工業株式会社製）
＊ＣＨ：（サメ由来；生化学工業株式会社製）平均分子量７０００
＊ＣＳＡ（クジラ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
このＣＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６５０として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
・セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを示す。
・窒素含量：２．４〜２．８％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
・硫黄含量：６．２〜６．６％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
・ガラクトサミン含量：３２．０〜３７．０％（アミノ酸自動分析器）
・グルクロン酸含量：３５．０〜４０．０％（カルバゾール反応）
・分子量：２５，０００〜５０，０００（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３，ｐｐ５１７（１９２９）に記載の方法で測定）
・４−硫酸／６−硫酸：８０／２０（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，ｐ１５３６（１９６８）に記載の方法で測定）
＊ＤＳ（ブタ皮由来；生化学工業株式会社製）
このＤＳ（ＣＳＢ）は、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６６０として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
・赤外分光光度計で純粋と判断される
・窒素含量：２．４〜２．９％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
・硫黄含量：６．２〜６．９％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，ｐ１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
・ガラクトサミン含量：３２．０〜３７．０％（アミノ酸自動分析器）
・イズロン酸含量：３６．０〜４２．０％（カルバゾール反応）
・分子量：１１，０００〜２５，０００（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３，ｐ５１７（１９２９）に記載の方法で測定）
＊ＣＳＣ（サメ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
このＣＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６７０として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
・セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを示す。
・窒素含量：２．３〜２．７％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
・硫黄含量：６．４〜６．８（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，ｐ１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
・ガラクトサミン含量：３２．０〜３７．０％（アミノ酸自動分析器）
・グルクロン酸含量：３４．０〜３９．０％（カルバゾール反応）
・分子量：４０，０００〜８０，０００（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３，ｐｐ５１７（１９２９）に記載の方法で測定）
・４−硫酸／６−硫酸：１０／９０（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，ｐ１５３６（１９６８）に記載の方法で測定）
＊ＣＳＤ（サメ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
このＣＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６７６として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
窒素含量：２．２〜２．６％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
硫黄含量：７．１〜７．７％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１２３（１９５５）に記載の方法で測定）ガラクトサミン含量：３０〜３５％（アミノ酸自動分析器）
グルクロン酸含量：３２〜３５％（カルバゾール反応）
＊ＫＳ（ウシ角膜由来；生化学工業株式会社製）
このＫＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００７６０として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
・セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを示す。
・窒素含量：２．２〜３．０％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
・硫黄含量：６．５〜８．０％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，ｐ１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
・ガラクトース含量：３４〜４０％（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５０，ｐ２９８（１９５２）に記載の方法で測定）
・ガラクトサミン含量：検出限界以下（アミノ酸自動分析器）
・グルコサミン含量：３０〜４０％（ＨＩＴＡＣＨＩ ＫＬＡ−５；株式会社日立製作所製）
インキュベート後の溶液を、ゲル浸透クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ−Ｇ２５００ＰＷＸＬ、ＴＳＫｇｅｌ−Ｇ３０００ＰＷＸＬ及びＴＳＫｇｅｌ−Ｇ４０００ＰＷＸＬの３本。溶出液は０．２Ｍ ＮａＣｌ、流速は０．６ｍＬ／分）に付し、屈折率ピークの位置の移動を観察した。
基質としてＨＡを用いた場合の結果を第１図に、平均分子量７０００のＣＨを用いた場合の結果を第２図に、ＣＳＡを用いた場合の結果を第３図に、ＣＳＢを用いた場合の結果を第４図に、ＣＳＣを用いた場合の結果を第５図に、ＣＳＤを用いた場合の結果を第６図に、ＫＳを用いた場合の結果を第７図にそれぞれ示す。各グラフの縦軸は屈折率を、横軸は時間（保持時間；分）を示す。各図の上段（各図Ａ）はＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトしていない細胞の酵素液を、下段（各図Ｂ）はＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の酵素液をそれぞれ用いた場合の結果である。また図中の最も太い実線（青線）はｐＨ７、次に太い実線（赤線）はｐＨ６、最も細い実線（緑線）はｐＨ５、ドットによる線（黒線）はｐＨ４の反応混合液中でそれぞれ反応させたときの結果を示す。グラフの中央付近に存在するピークの保持時間が、上段のグラフ（ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトしていない）よりも長時間側にシフトした場合には、基質が低分子量化されたことになる。
第１図より、ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の酵素液をｐＨ４又はｐＨ５の条件下でＨＡに作用させると、中央付近に存在するピークが長時間側にシフトした（ＨＡが低分子量化された）。このことから、ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞では、ＨＡを切断する活性を有するＨＹＡＬ１が実際に発現されていることが確認された。
第２図、第４図及び第７図より、ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の酵素液をｐＨ４〜７の条件下でＣＳＢ、ＫＳ又は及び平均分子量７０００のＣＨに作用させても、中央付近に存在するピークのシフトは観察されなかった（これらの基質は低分子量化されなかった）。このことから、ＨＹＡＬ１はＣＳＢ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する活性を実質的に有しないことが示された。
第３図、第５図及び第６図より、ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の酵素液をｐＨ４又はｐＨ５の条件下でＣＳＡ、ＣＳＣ又はＣＳＤに作用させると、中央付近に存在するピークが長時間側にシフトした（これらの基質が低分子量化された）。このことから、ＨＹＡＬ１はＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤを切断する活性を有することが示された。
以上の結果から、ＨＹＡＬ１はＨＡのみならずＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤを切断する活性を有するが、ＤＳ（ＣＳＢ）、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する活性を実質的に有しないことが示された。
また、インキュベート後の溶液は不飽和糖を反映する２１０ｎｍの吸収を示さなかったことから、ＨＹＡＬ１はＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤを加水分解により切断することが示された。
（４）基質への反応性の解析
ＨＹＡＬ１の基質への反応性をＰＨ２０（精巣ヒアルロニダーゼ：ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｓ６７７９８として登録されているヒアルロニダーゼ）の基質への反応性と比較した。
ここで用いた酵素液、基質は（３）で用いた酵素液、基質と同じである。また反応液の組成、反応温度も（３）と同じである。ただし、反応時間は１日間、４日間、７日間、１４日間及び未反応の５点を設定し、反応終了後それぞれの試料は−３０℃で凍結保存した。
また第１１図、第１２図で用いたＰＨ２０の酵素液は（１）及び（２）で記載された方法によりＨＹＡＬ１と同様に調製した。ＰＨ２０のｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクターに組み込み、そのヒアルロニダーゼ発現ベクターを（１）と同条件でＣＯＳ細胞に導入してＰＨ２０タンパク質を一過性発現させた。その発現細胞を（２）と同条件で破砕し酵素液とした。
反応後の各試料は（３）と同様ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて示差屈折率ピークの位置の移動を観察した。
第８図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＨＡとした場合のクロマトグラフの結果を示し、第９図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＣＳＡとした場合、第１０図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＣＳＣとした場合の結果をそれぞれ示す。また第１１図は酵素源をＰＨ２０、基質をＨＡとした場合、第１２図は酵素源をＰＨ２０、基質をＣＳＡとした場合の結果をそれぞれ示す。各グラフの縦軸は屈折率を、横軸は時間（保持時間；分）を示す。図中の０日、１日、４日、７日、１４日はそれぞれの試料の反応時間を示す。また、図中の最も太い実線（黒線）は０日、次に太い実線（赤線）は１日、最も細い実線（青線）は４日、最も太いドットによる線（緑線）は７日、次に太いドットによる線（橙線）は１４日での結果を示す。
（３）と同様グラフの中央付近に存在するピークの保持時間が長時間側にシフトした場合には、基質が低分子量化されたことになる。
第８図より、反応時間が０の場合に認められるピークの保持時間が、１日以上反応させた場合に長時間側に移行する（ＨＡが低分子量化した）ことが判明した。同様に第９図より基質をＣＳＡとした場合にも、１日以上反応させることで、ピーク保持時間が長時間側に移行し、第１０図より基質をＣＳＣとした場合にも同様の結果を示すことが判明した。このことからＨＹＡＬ１はＨＡ、ＣＳＡ及びＣＳＣに対しほぼ同様の反応性を示すことが判明した。
第１１図より酵素源をＰＨ２０、基質をＨＡとした場合、反応時間に応じてピークの保持時間が長時間側に移行することが判明した。一方基質をＣＳＡとした場合には、反応時間を増加させてもピークの保持時間は顕著な変化を示さないことが第１２図より示された。このことからＰＨ２０は、ＣＳＡに対する反応性と比較してＨＡに対しては強い反応性を示すことが判明した。
以上の結果よりＨＹＡＬ１は、ＰＨ２０とは異なる基質反応性を有することがわかった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００３年３月３１日出願の日本特許出願（特願２００３−０９７３０１）および２００３年４月１８日出願の日本特許出願（特願２００３−１１３９６５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明触媒及び本発明切断剤は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有することから、このような糖鎖を特異的に切断（低分子量化）することができ極めて有用である。また本発明医薬は、生体組織中に存在するＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断することができることから、切断を望むこのような糖鎖を切断し、切断を望まない糖鎖を残存させることができ極めて有用である。さらに本発明医薬（本発明触媒、本発明切断剤）は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を加水分解により切断することから、細菌由来のリアーゼ酵素と違って不飽和も生成せず、さらに安全性が高い医薬とすることができる可能性があり、極めて有用である。
また本発明切断方法も、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断でき極めて有用である
本発明糖鎖生産方法も、低分子量化された所定の糖鎖を特異的に、かつ簡便、迅速、大量、安価に生産することができ極めて有用である。
本発明触媒製造方法、本発明切断剤製造方法及び本発明医薬製造方法も、本発明触媒、本発明切断剤及び本発明医薬を簡便、迅速、大量かつ安価に製造することができ、極めて有用である。本発明融合タンパク質も、本発明触媒、本発明切断剤や本発明医薬の必須成分とすることができ、極めて有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【技術分野】
本発明は、新規な糖鎖切断触媒、糖鎖の特異的切断剤等に関する。
【背景技術】
まず、本明細書中で共通して用いる略号について説明する。
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳＡ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳＣ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳＤ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＤＳ（ＣＳＢと表記することもある）：デルマタン硫酸
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＫＳ：ケラタン硫酸
なおＣＳＡは、「グルクロン酸残基とＮ−アセチルガラクトサミン残基とがβ１，３グリコシド結合した二糖単位」が連続して結合されてなる分子であって、「グルクロン酸残基（β１−３）４位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基」からなる二糖単位を主たる構成成分とするＣＳである。
ＣＳＣは、「グルクロン酸残基とＮ−アセチルガラクトサミン残基とがβ１，３グリコシド結合した二糖単位」が連続して結合されてなる分子であって、「グルクロン酸残基（β１−３）６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基」からなる二糖単位を主たる構成成分とするＣＳである。
ＣＳＤは、「グルクロン酸残基とＮ−アセチルガラクトサミン残基とがβ１，３グリコシド結合した二糖単位」が連続して結合されてなる分子であって、「２位が硫酸化されたグルクロン酸残基（β１−３）６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基」からなる二糖単位を主たる構成成分とするＣＳである。
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７７，ｐ３３６５４−３３６６３（２００２）には、ヒアルロニダーゼの一種であるＨＹＡＬ１が記載されている。またＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２３６（１），ｐ１０−１５，（１９９７）には、ＨＹＡＬ１の全アミノ酸配列及びこれをコードするｃＤＮＡの全塩基配列が開示されている。
しかし、ＨＹＡＬ１がＣＳＢ、ＫＳ及び平均分子量１０００のＣＨを切断する活性を実質的に有さず、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤを切断する活性を有することは知られていない。
【発明の開示】
本発明は、ＨＹＡＬ１を必須成分とする新規な糖鎖切断触媒、糖鎖の特異的切断剤等を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＨＹＡＬ１を必須成分とする新規な糖鎖切断触媒、糖鎖の特異的切断剤及び医薬、並びにＨＹＡＬ１を特定の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む糖鎖の特異的切断方法、ＨＹＡＬ１を特定の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法、ＨＹＡＬ１を保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、前記触媒の製造方法、ＨＹＡＬ１を保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、前記切断剤の製造方法、及びＨＹＡＬ１を保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、前記医薬の製造方法等を提供するに至った。
本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とし、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒（以下、「本発明触媒」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明触媒は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とする、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断剤（以下、「本発明切断剤」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明切断剤は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とし、生体組織中に存在するＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬（以下、「本発明医薬」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明医薬は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。
また、本発明医薬による切断対象となる糖鎖が存在する「生体組織」は、髄核であることが好ましい。また本発明医薬は、椎間板ヘルニアの処置剤であることが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、当該糖鎖を特異的に切断する方法（以下、「本発明切断方法」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明切断方法においては、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨが切断されないことが好ましい。
また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法（以下、「本発明糖鎖生産方法」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明糖鎖生産方法においては、低分子量化されたＤＳ、ＫＳ及びＣＨが生産されないことが好ましい。
また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明触媒の製造方法（以下、「本発明触媒製造方法」という）を提供する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明切断剤の製造方法（以下、「本発明切断剤製造方法」という）を提供する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明医薬の製造方法（以下、「本発明医薬製造方法」という）を提供する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
さらに本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質（以下、「本発明融合タンパク質」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明融合タンパク質は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。
さらに本発明は、上記本発明医薬を投与することを特徴とする、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在する疾患を処置する方法（以下、「本発明処置方法」という）を提供する。
本発明処置方法における好ましい本発明医薬及び好ましい生体組織は、上記本発明医薬において好ましいものと同様である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＨＡを用いた場合の結果を示す図である。
第２図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＨを用いた場合の結果を示す図である。
第３図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＳＡを用いた場合の結果を示す図である。
第４図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＳＢを用いた場合の結果を示す図である。
第５図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＳＣを用いた場合の結果を示す図である。
第６図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＣＳＤを用いた場合の結果を示す図である。
第７図は、ＨＹＡＬ１の基質としてＫＳを用いた場合の結果を示す図である。
第８図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＨＡとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
第９図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＣＳＡとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
第１０図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＣＳＣとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
第１１図は酵素源をＰＨ２０、基質をＨＡとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
第１２図は酵素源をＰＨ２０、基質をＣＳＡとした場合のクロマトグラフの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を、発明の実施の形態によって詳説する。
＜１＞本発明触媒
本発明触媒は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とし、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
（Ａ）のタンパク質はＨＹＡＬ１のタンパク質である。
なお、天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように（Ａ）のタンパク質に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質も、本発明触媒の必須成分として用いることができる。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４））。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には（Ａ）のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質である。上記の（Ｂ）のタンパク質は、このようなタンパク質を規定するものである。
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、ＨＹＡＬ１の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基からなるタンパク質の場合、２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。配列番号２の場合には、２〜２２程度、好ましくは２〜１１、より好ましくは２〜６以下の数を示す。
本明細書において、（Ｂ）のタンパク質と同様に、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質も本発明触媒の有効成分として使用することができる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、最も好ましくは９７％以上の相同性を有することが好ましい。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて容易に算出することができ、このようなソフトウェアはインターネットによっても利用に供されている。
また本発明触媒における上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列には、他のタンパク質やペプチドのアミノ酸配列が含まれていても良い。すなわち上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質は、他のペプチドとの融合タンパク質であっても良い。本発明は、このような上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質（本発明融合タンパク質）をも提供する。本明細書における「他のペプチド」という用語は、「ポリペプチド」を含む概念として用いる。
本発明融合タンパク質としては、ＨＹＡＬ１とマーカーペプチドとの融合タンパク質等が例示される。このような本発明融合タンパク質は、精製や分析を容易にすることができるというメリットがある。上記マーカーペプチドとしては例えばＦＬＡＧペプチド、プロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質は、抗ＦＬＡＧ抗体を結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。プロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。本発明融合タンパク質は、なかでもＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質であることが好ましい。
本発明融合タンパク質は、以下の通り製造することができる。
まず、前記（Ａ）のタンパク質（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４３５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ａ）」という）を用意する。このＤＮＡは、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４３５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なったヌクレオチド配列を有するＤＮＡが存在するが、配列番号１におけるヌクレオチド番号１〜１３０８で示されるヌクレオチド配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。このＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０３０５６として登録されている。
また、前記（Ａ）のタンパク質に代えて前記（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ｂ）」という）を用いてもよい。「ＤＮＡ（ｂ）」は、前記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有する限りにおいて特に限定されない。
これらの糖鎖を切断する活性を有するか否かは、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。例えば、後述の実施例に示すようなＧＰＣにおける糖鎖のピークの移動によって検出することができ、この方法によって検出されることが好ましい。
また、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤ以外の種々の基質（糖鎖）を用いて、ＧＰＣにおける糖鎖のピークの移動の有無を検出することにより、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤに対する切断活性の特異性の有無を検出することができる。このような方法によって、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を保持しているアミノ酸の欠失、置換、挿入又は転位を容易に選択することができる。
このような「ＤＮＡ（ｂ）」としては、例えば「ＤＮＡ（ａ）」若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
上記ＤＮＡ（ａ）又はＤＮＡ（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いたタンパク質の発現は、当該ＤＮＡが保持されたベクター（好ましくは発現ベクター）を用いて行うことが好ましい。ＤＮＡのベクターへの組込みは、通常の方法によって行うことができる。
ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＥＺＺＺ１８（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＣＨ１１０（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＢＡＤ（インビトロゲン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社製）又はｐＳＥ４２０（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、ＣＯＳ細胞や３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などの哺乳類細胞と、ｐＧＩＲ２０１（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１３９４−１４０１）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８，５３２２）、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｎｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．（１９９１）Ｇｅｎｅ １０８，１９３−２００）、ｐＣＭＶ−２（イーストマン コダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）製）、ｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７（１９９０））又はｐＳＶＬ（ファルマシア バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせのほか、宿主細胞として酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に原核細胞（特に大腸菌細胞）とｐＥＴ１５ｂとの組み合わせが好ましい。
また、宿主細胞として昆虫細胞を用いることもできる。この場合にも、昆虫細胞に対応する各種ベクターを用いることができる。昆虫細胞としては、高発現ＳＦ＋細胞（ｅｘｐｒｅｓＳｆ＋（登録商標））を用いることが好ましい。また、ＤＮＡを組み込むトランスファーベクターとしてはｐＰＳＣ８やｐＰＳＣ１２が好ましい。ＤＮＡをｐＰＳＣ８に組み込む場合には、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ、ＮｒｕＩ、ＢｇｌＩＩを利用して組み込みを行うことができる。ＤＮＡをｐＰＳＣ１２に組み込む場合には、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩを利用して組み込みを行うことができる。また、タンパク質のＮ末端にＦＬＡＧペプチドが融合されたかたちで発現されるようにするために、トランスファーベクターに組み込む前に、対応するＤＮＡの末端にＦＬＡＧペプチドをコードする配列を付加しておくことが好ましい。
ＤＮＡをトランスファーベクターに組み込んだ後、これをバキュウロウイルスに導入することが好ましい。バキュウロウイルスとしては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）や、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ（ＢｍＮＰＶ）を用いることが好ましい。そして、目的とするＤＮＡが導入されたバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させればよい。
ＤＮＡを組込むベクターは、目的とするタンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることができる。ＤＮＡからのタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、通常の方法に従って行うことができる。
例えば、目的とするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを適当な宿主に導入することによって宿主を形質転換し、この形質転換体を生育させ、その生育物から発現されたタンパク質を採取することによって行うことができる。
本発明触媒は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有しており、この能力の有無も、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に切断する能力を有するものが好ましい。
また本発明触媒は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨに対する切断能力の有無も、前記と同様にＤＳ、ＫＳ又は平均分子量７０００のＣＨを基質として用いて、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
本発明触媒は、少なくとも前記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を含んでいればよい。すなわち本発明触媒は、前記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質自体をそのまま本発明触媒としてもよく、前記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質に加えて、これらのタンパク質に悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の成分を含有させてもよい。
本発明触媒の製造方法も特に限定されず、天然物から上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を単離してもよく、化学合成等によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよく、遺伝子工学的手法によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよい。遺伝子工学的手法によって本発明触媒を製造する方法については、後述の本発明触媒製造方法を参照されたい。
本発明触媒の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合した固定化酵素形態のいずれであってもよい。
＜２＞本発明切断剤
本発明切断剤は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とする、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断剤である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明切断剤は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有しており、この能力の有無も、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に切断する切断剤であることが好ましい。
また本発明切断剤は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨに対する切断能力の有無も、前記と同様にＤＳ、ＫＳ又は平均分子量７０００のＣＨを基質として用いて、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
そして本発明切断剤は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、このような目的の下でＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しない目的で用いられることが好ましい。
本発明切断剤の製剤化には、公知の方法を用いることができる。また本発明切断剤の形態も特に限定されず、例えば溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態、担体と結合した固定化酵素形態のいずれであってもよい。
本発明切断剤に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」と同様である。遺伝子工学的手法によって本発明切断剤を製造する方法については、後述の本発明切断剤製造方法を参照されたい。
＜３＞本発明医薬
本発明医薬は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を必須成分とし、生体組織中に存在するＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明医薬は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有しており、この能力の有無も、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に切断する医薬であることが好ましい。
また本発明医薬は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する能力を有しないものが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨに対する切断能力の有無も、前記と同様にＤＳ、ＫＳ又は平均分子量７０００のＣＨを基質として用いて、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
そして本発明医薬は、生体組織中に存在するＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、このような目的の下でＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しない目的で用いられることが好ましい。
また本発明医薬が適用される生体組織は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断することが望まれる生体組織である限りにおいて特に限定されない。例えば、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が、健常状態におけるレベルよりも過剰に存在しているような生体組織が挙げられる。このような生体組織として具体的には髄核が例示され、なかでも椎間板ヘルニアの状態にある髄核が好ましい。すなわち本発明医薬は、椎間板ヘルニアの処置剤であることが好ましい。本明細書における「処置」の用語には、予防、進行抑制（悪化防止）、改善、治療等を目的とする処置が含まれる。
近年、コンドロイチナーゼを椎間板に投与して髄核を融解し、椎間板ヘルニアを治療する試みが現に行われている（米国特許第４６９６８１６号、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，２５３，３０１−３０８（１９９０））。このことから、ＣＳを切断する活性を有する本発明医薬は、同様に椎間板ヘルニアの処置剤として十分に利用しうるものである。
そして本発明医薬が適用される動物も特に限定されないが、脊椎動物であることが好ましく、なかでも哺乳類であることが好ましい。哺乳類としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ等が提示されるが、ヒトに対して適用されるものが特に好ましい。
本発明医薬の投与方法は、本発明医薬による生体組織中のＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射による投与が挙げられる。本発明医薬を髄核に適用する場合には、目的とする髄核が存在する椎間板又は脊髄硬膜外腔に注射することが好ましい。
投与方法に応じて上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を適宜製剤化して、本発明医薬とすることができる。通常、製剤化は医薬的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により行われる。剤形としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤等が挙げられる。なかでも注射剤が好ましい。
本発明医薬の投与量は、上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の種類、比活性、投与される動物の種類や症状等、投与対象となる生体組織の種類やその状態等によって個別的に設定されるべきものであり、特に限定されないが、一般的には一日あたり０．１μｇ〜１０００ｍｇ程度を投与することができる。
本発明医薬に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」と同様である。遺伝子工学的手法によって本発明医薬を製造する方法については、後述の本発明医薬製造方法を参照されたい。
＜４＞本発明切断方法
本発明切断方法は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、当該糖鎖を特異的に切断する方法である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質に関する説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」と同様である。上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる方法は、これらの分子が相互に接触して酵素反応が生ずる状態となる限りにおいて特に限定されず、例えば前者に後者を添加してもよく、後者に前者を添加してもよく、両者を同時に添加してもよい。
また、上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質を担体（例えば、ゲル、ビーズ、膜、プレート等）に固定させ、これとＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖とを接触させてもよい。
両者を接触させた後の反応の条件は、上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が作用する条件である限りにおいて特に限定されないが、これらのタンパク質の至適ｐＨ付近（例えばｐＨ４〜ｐＨ５程度）で反応させることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。またこのときの温度も、これらのタンパク質の活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、３５℃〜４０℃程度が例示される。またこれらのタンパク質の活性を増加させる物質がある場合には、その物質を添加してもよい。反応時間は、ｐＨ条件、温度条件、作用させるタンパク質及び糖鎖の量、及びどの程度の切断（低分子量化）を所望するか等によって適宜調節することができる。反応時間を長くすれば切断（低分子量化）の程度を増すことができ、反応時間を短くすればその程度を減ずることができる。
また本発明切断方法には、このようなタンパク質の作用工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
本発明切断方法によって、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が特異的に切断される。これらの糖鎖が切断されたか否かは、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に切断する方法であることが好ましい。
また本発明切断方法は、ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しないことが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨが切断されていないことも、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって検出することができる。
すなわち本発明切断方法は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、このような目的の下でＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しない目的で用いられることが好ましい。
本発明切断方法に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」と同様である。
＜５＞本発明糖鎖生産方法
本発明糖鎖生産方法は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
本発明糖鎖生産方法により、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が低分子量化された糖鎖を特異的に生産することができる。低分子量化された糖鎖が生産されたか否かは、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって確認することができる。その方法の説明は前記と同様である。なかでも、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤの４種類の糖鎖を特異的に生産する方法であることが好ましい。
また本発明糖鎖生産方法は、低分子量化されたＤＳ、ＫＳ及びＣＨを生産しないことが好ましい。ＤＳ、ＫＳ及びＣＨが生産されていないことも、低分子量化した糖鎖の一般的な検出方法によって確認することができる。
すなわち本発明糖鎖生産方法は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられるが、このような目的の下でＤＳ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断しない目的で用いられることが好ましい。
生成物から低分子量化された糖鎖を単離する方法等は、公知の方法によって行うことができる。
本発明糖鎖生産方法に関するその他の説明は、前記の「＜１＞本発明触媒」及び「＜４＞本発明切断方法」と同様である。
＜６＞本発明触媒製造方法
本発明触媒製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明触媒の製造方法である。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
上記（ａ）のＤＮＡは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なった塩基配列を有するＤＮＡが存在するが、配列番号１で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。配列番号１で示されるＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０３０５６として登録されている。
上記（ｂ）のＤＮＡも、配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、例えば上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
上記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いたタンパク質の発現は、当該ＤＮＡが保持されたベクター（好ましくは発現ベクター）を用いて行うことが好ましい。ＤＮＡのベクターへの組込みは、通常の方法によって行うことができる。
ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系としては、ＣＯＳ細胞、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などの哺乳類細胞と、ｐＧＩＲ２０１（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１３９４−１４０１）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８，５３２２）、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｎｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．（１９９１）Ｇｅｎｅ １０８，１９３−２００）、ｐＣＭＶ−２（イーストマン コダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）製）、ｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７（１９９０））又はｐＳＶＬ（ファルマシア バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＥＺＺＺ１８（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＣＨ１１０（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＥＴ（ストラタジーン社製）、ｐＢＡＤ（インビトロゲン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社製）、及びｐＳＥ４２０（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、昆虫細胞とバキュロウイルスとの組み合わせのほか、宿主細胞として酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に哺乳類細胞（特にＣＯＳ細胞）とｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６（ＳＩＧＭＡ社製）との組み合わせが好ましい。
また、ＤＮＡを組込むベクターは、目的とするタンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることもできる。ＤＮＡからのタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、通常の方法に従って行うことができる。
例えば、目的とするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを適当な宿主に導入することによって宿主を形質転換し、この形質転換体を生育させ、その生育物から発現されたタンパク質を採取することによって行うことができる。
ここで「生育」とは、形質転換体である細胞や微生物自体の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養された宿主細胞・分泌物・排出物等を包含する概念である。生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わせて適宜選択できる。
生育物からのタンパク質の採取も、タンパク質の公知の抽出・精製方法によって行うことができる。
例えば目的とするタンパク質が、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。また目的とするタンパク質が細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によって目的とするタンパク質を抽出することができ、その抽出物をそのまま用いてもよい。
これらの培地や抽出物から、タンパク質をさらに精製することもできる。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、目的とするタンパク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
目的とするタンパク質が製造されたか否かは、アミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析することによって確認することができる。
また本発明切断方法には、以上のような発現・採取工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
＜７＞本発明切断剤製造方法
本発明切断剤製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明切断剤の製造方法である。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明切断剤製造方法に関するその他の説明は、前記の「＜６＞本発明触媒製造方法」と同様である。
＜８＞本発明医薬製造方法
本発明医薬製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、本発明医薬の製造方法である。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明医薬製造方法に関するその他の説明は、前記の「＜６＞本発明触媒製造方法」と同様である。
＜９＞本発明処置方法
本発明処置方法は、本発明医薬を投与することを特徴とする、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在する疾患を処置する方法である。
本発明処置方法に関するその他の説明は、前記の「＜３＞本発明医薬」と同様である。
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらによって本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
（１）ＨＹＡＬ１遺伝子の発現
ＣＯＳ−７細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより入手）を、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で約２０〜４０％コンフルエントになるまで培養した。培養は５％ＣＯ２の下で３７℃で実施した。
配列番号１で示される塩基配列（ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡ）をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクター（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に組み込んだヒアルロニダーゼ発現ベクターを、ＴｒａｎｓＦａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中、３７℃で３日間培養した。培養は５％ＣＯ２の下で３７℃で実施した。
また、配列番号１で示される塩基配列（ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡ）が組み込まれていないｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクターをトランスフェクトした細胞についても、同様に培養した。
（２）酵素液の調製
上記（１）で培養された細胞（ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターをトランスフェクトしたもの、又はＨＹＡＬ１のｃＤＮＡを組み込んでいない発現ベクターをトランスフェクトしたもの）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４又はｐＨ６．０）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．２５Ｍ シュークロースを含有する溶液中、氷冷下でセルスクレーパーを用い破砕した。この破砕後の液をそのまま酵素液として用いた。
（３）基質特異性の解析
（２）で調製された酵素液を種々の基質と反応させることによって、酵素の基質特異性を解析した。反応は、０．２５％の各種基質、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４又はｐＨ５）又はリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６又はｐＨ７）を含有する反応混合液に（２）で調製された酵素を最終濃度２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）となるよう添加し、３７℃で４日間インキュベートすることによって行った。
ここで用いた基質は、以下の通りである。
＊ＨＳ：（鶏冠由来；生化学工業株式会社製）
＊ＣＨ：（サメ由来；生化学工業株式会社製）平均分子量７０００
＊ＣＳＡ（クジラ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
このＣＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６５０として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
・セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを示す。
・窒素含量：２．４〜２．８％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
・硫黄含量：６．２〜６．６％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
・ガラクトサミン含量：３２．０〜３７．０％（アミノ酸自動分析器）
・グルクロン酸含量：３５．０〜４０．０％（カルバゾール反応）
・分子量：２５，０００〜５０，０００（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３，ｐｐ５１７（１９２９）に記載の方法で測定）
・４−硫酸／６−硫酸：８０／２０（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，ｐ１５３６（１９６８）に記載の方法で測定）
＊ＤＳ（ブタ皮由来；生化学工業株式会社製）
このＤＳ（ＣＳＢ）は、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６６０として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
・赤外分光光度計で純粋と判断される
・窒素含量：２．４〜２．９％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
・硫黄含量：６．２〜６．９％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，ｐ１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
・ガラクトサミン含量：３２．０〜３７．０％（アミノ酸自動分析器）
・イズロン酸含量：３６．０〜４２．０％（カルバゾール反応）
・分子量：１１，０００〜２５，０００（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３，ｐ５１７（１９２９）に記載の方法で測定）
＊ＣＳＣ（サメ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
このＣＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６７０として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
・セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを示す。
・窒素含量：２．３〜２．７％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
・硫黄含量：６．４〜６．８（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，ｐ１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
・ガラクトサミン含量：３２．０〜３７．０％（アミノ酸自動分析器）
・グルクロン酸含量：３４．０〜３９．０％（カルバゾール反応）
・分子量：４０，０００〜８０，０００（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３，ｐｐ５１７（１９２９）に記載の方法で測定）
・４−硫酸／６−硫酸：１０／９０（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，ｐ１５３６（１９６８）に記載の方法で測定）
＊ＣＳＤ（サメ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
このＣＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６７６として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
窒素含量：２．２〜２．６％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
硫黄含量：７．１〜７．７％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１２３（１９５５）に記載の方法で測定）ガラクトサミン含量：３０〜３５％（アミノ酸自動分析器）
グルクロン酸含量：３２〜３５％（カルバゾール反応）
＊ＫＳ（ウシ角膜由来；生化学工業株式会社製）
このＫＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００７６０として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
・セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを示す。
・窒素含量：２．２〜３．０％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
・硫黄含量：６．５〜８．０％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，ｐ１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
・ガラクトース含量：３４〜４０％（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５０，ｐ２９８（１９５２）に記載の方法で測定）
・ガラクトサミン含量：検出限界以下（アミノ酸自動分析器）
・グルコサミン含量：３０〜４０％（ＨＩＴＡＣＨＩ ＫＬＡ−５；株式会社日立製作所製）
インキュベート後の溶液を、ゲル浸透クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ−Ｇ２５００ＰＷＸＬ、ＴＳＫｇｅｌ−Ｇ３０００ＰＷＸＬ及びＴＳＫｇｅｌ−Ｇ４０００ＰＷＸＬの３本。溶出液は０．２Ｍ ＮａＣｌ、流速は０．６ｍＬ／分）に付し、屈折率ピークの位置の移動を観察した。
基質としてＨＡを用いた場合の結果を第１図に、平均分子量７０００のＣＨを用いた場合の結果を第２図に、ＣＳＡを用いた場合の結果を第３図に、ＣＳＢを用いた場合の結果を第４図に、ＣＳＣを用いた場合の結果を第５図に、ＣＳＤを用いた場合の結果を第６図に、ＫＳを用いた場合の結果を第７図にそれぞれ示す。各グラフの縦軸は屈折率を、横軸は時間（保持時間；分）を示す。各図の上段（各図Ａ）はＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトしていない細胞の酵素液を、下段（各図Ｂ）はＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の酵素液をそれぞれ用いた場合の結果である。また図中の最も太い実線（青線）はｐＨ７、次に太い実線（赤線）はｐＨ６、最も細い実線（緑線）はｐＨ５、ドットによる線（黒線）はｐＨ４の反応混合液中でそれぞれ反応させたときの結果を示す。グラフの中央付近に存在するピークの保持時間が、上段のグラフ（ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトしていない）よりも長時間側にシフトした場合には、基質が低分子量化されたことになる。
第１図より、ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の酵素液をｐＨ４又はｐＨ５の条件下でＨＡに作用させると、中央付近に存在するピークが長時間側にシフトした（ＨＡが低分子量化された）。このことから、ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞では、ＨＡを切断する活性を有するＨＹＡＬ１が実際に発現されていることが確認された。
第２図、第４図及び第７図より、ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の酵素液をｐＨ４〜７の条件下でＣＳＢ、ＫＳ又は及び平均分子量７０００のＣＨに作用させても、中央付近に存在するピークのシフトは観察されなかった（これらの基質は低分子量化されなかった）。このことから、ＨＹＡＬ１はＣＳＢ、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する活性を実質的に有しないことが示された。
第３図、第５図及び第６図より、ＨＹＡＬ１のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の酵素液をｐＨ４又はｐＨ５の条件下でＣＳＡ、ＣＳＣ又はＣＳＤに作用させると、中央付近に存在するピークが長時間側にシフトした（これらの基質が低分子量化された）。このことから、ＨＹＡＬ１はＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤを切断する活性を有することが示された。
以上の結果から、ＨＹＡＬ１はＨＡのみならずＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤを切断する活性を有するが、ＤＳ（ＣＳＢ）、ＫＳ及び平均分子量７０００のＣＨを切断する活性を実質的に有しないことが示された。
また、インキュベート後の溶液は不飽和糖を反映する２１０ｎｍの吸収を示さなかったことから、ＨＹＡＬ１はＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤを加水分解により切断することが示された。
（４）基質への反応性の解析
ＨＹＡＬ１の基質への反応性をＰＨ２０（精巣ヒアルロニダーゼ：ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｓ６７７９８として登録されているヒアルロニダーゼ）の基質への反応性と比較した。
ここで用いた酵素液、基質は（３）で用いた酵素液、基質と同じである。また反応液の組成、反応温度も（３）と同じである。ただし、反応時間は１日間、４日間、７日間、１４日間及び未反応の５点を設定し、反応終了後それぞれの試料は−３０℃で凍結保存した。
また第１１図、第１２図で用いたＰＨ２０の酵素液は（１）及び（２）で記載された方法によりＨＹＡＬ１と同様に調製した。ＰＨ２０のｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクターに組み込み、そのヒアルロニダーゼ発現ベクターを（１）と同条件でＣＯＳ細胞に導入してＰＨ２０タンパク質を一過性発現させた。その発現細胞を（２）と同条件で破砕し酵素液とした。
反応後の各試料は（３）と同様ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて示差屈折率ピークの位置の移動を観察した。
第８図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＨＡとした場合のクロマトグラフの結果を示し、第９図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＣＳＡとした場合、第１０図は酵素源をＨＹＡＬ１、基質をＣＳＣとした場合の結果をそれぞれ示す。また第１１図は酵素源をＰＨ２０、基質をＨＡとした場合、第１２図は酵素源をＰＨ２０、基質をＣＳＡとした場合の結果をそれぞれ示す。各グラフの縦軸は屈折率を、横軸は時間（保持時間；分）を示す。図中の０日、１日、４日、７日、１４日はそれぞれの試料の反応時間を示す。また、図中の最も太い実線（黒線）は０日、次に太い実線（赤線）は１日、最も細い実線（青線）は４日、最も太いドットによる線（緑線）は７日、次に太いドットによる線（橙線）は１４日での結果を示す。
（３）と同様グラフの中央付近に存在するピークの保持時間が長時間側にシフトした場合には、基質が低分子量化されたことになる。
第８図より、反応時間が０の場合に認められるピークの保持時間が、１日以上反応させた場合に長時間側に移行する（ＨＡが低分子量化した）ことが判明した。同様に第９図より基質をＣＳＡとした場合にも、１日以上反応させることで、ピーク保持時間が長時間側に移行し、第１０図より基質をＣＳＣとした場合にも同様の結果を示すことが判明した。このことからＨＹＡＬ１はＨＡ、ＣＳＡ及びＣＳＣに対しほぼ同様の反応性を示すことが判明した。
第１１図より酵素源をＰＨ２０、基質をＨＡとした場合、反応時間に応じてピークの保持時間が長時間側に移行することが判明した。一方基質をＣＳＡとした場合には、反応時間を増加させてもピークの保持時間は顕著な変化を示さないことが第１２図より示された。このことからＰＨ２０は、ＣＳＡに対する反応性と比較してＨＡに対しては強い反応性を示すことが判明した。
以上の結果よりＨＹＡＬ１は、ＰＨ２０とは異なる基質反応性を有することがわかった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００３年３月３１日出願の日本特許出願（特願２００３−０９７３０１）および２００３年４月１８日出願の日本特許出願（特願２００３−１１３９６５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明触媒及び本発明切断剤は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有することから、このような糖鎖を特異的に切断（低分子量化）することができ極めて有用である。また本発明医薬は、生体組織中に存在するＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断することができることから、切断を望むこのような糖鎖を切断し、切断を望まない糖鎖を残存させることができ極めて有用である。さらに本発明医薬（本発明触媒、本発明切断剤）は、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を加水分解により切断することから、細菌由来のリアーゼ酵素と違って不飽和も生成せず、さらに安全性が高い医薬とすることができる可能性があり、極めて有用である。
また本発明切断方法も、ＨＡ、ＣＳＡ、ＣＳＣ及びＣＳＤからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断でき極めて有用である
本発明糖鎖生産方法も、低分子量化された所定の糖鎖を特異的に、かつ簡便、迅速、大量、安価に生産することができ極めて有用である。
本発明触媒製造方法、本発明切断剤製造方法及び本発明医薬製造方法も、本発明触媒、本発明切断剤及び本発明医薬を簡便、迅速、大量かつ安価に製造することができ、極めて有用である。本発明融合タンパク質も、本発明触媒、本発明切断剤や本発明医薬の必須成分とすることができ、極めて有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分として含有し、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲１に記載の触媒。
【請求項３】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分として含有し、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断剤。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項４】
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲３に記載の切断剤。
【請求項５】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分として含有し、生体組織中に存在するヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項６】
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲５に記載の医薬。
【請求項７】
生体組織が、髄核であることを特徴とする、請求の範囲５又は６に記載の医薬。
【請求項８】
医薬が、椎間板ヘルニアの処置剤であることを特徴とする、請求の範囲５〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、当該糖鎖を特異的に切断する方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
該タンパク質が、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有さないことを特徴とする、請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
低分子量化されたデルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びコンドロイチンを生産しないことを特徴とする、請求の範囲１１に記載の方法。
【請求項１３】
下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、請求の範囲１又は２に記載の触媒の製造方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、請求の範囲３又は４に記載の切断剤の製造方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、請求の範囲５〜８のいずれか１項に記載の医薬の製造方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求の範囲５記載の医薬を投与することを特徴とする、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在する疾患を処置する方法。
【請求項１９】
医薬が、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲１８に記載の方法。
【請求項２０】
生体組織が、髄核であることを特徴とする、請求の範囲１８に記載の方法。
【請求項２１】
疾患が、椎間板ヘルニアであることを特徴とする、請求の範囲１８に記載の方法。
【請求項２２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒としての使用。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項２３】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断剤としての使用。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項２４】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の、生体組織中に存在するヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する医薬の製造のための使用。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項２５】
医薬が、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲２４に記載の使用。
【請求項２６】
生体組織が、髄核であることを特徴とする、請求の範囲２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
医薬が、椎間板ヘルニアの処置剤であることを特徴とする、請求の範囲２４〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分として含有し、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲１に記載の触媒。
【請求項３】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分として含有し、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断剤。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項４】
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲３に記載の切断剤。
【請求項５】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分として含有し、生体組織中に存在するヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断するために用いられることを特徴とする医薬。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項６】
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲５に記載の医薬。
【請求項７】
生体組織が、髄核であることを特徴とする、請求の範囲５又は６に記載の医薬。
【請求項８】
医薬が、椎間板ヘルニアの処置剤であることを特徴とする、請求の範囲５〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、当該糖鎖を特異的に切断する方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
該タンパク質が、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有さないことを特徴とする、請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、低分子量化された当該糖鎖を特異的に生産する方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
低分子量化されたデルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びコンドロイチンを生産しないことを特徴とする、請求の範囲１１に記載の方法。
【請求項１３】
下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、請求の範囲１又は２に記載の触媒の製造方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、請求の範囲３又は４に記載の切断剤の製造方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いてタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、請求の範囲５〜８のいずれか１項に記載の医薬の製造方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求の範囲５記載の医薬を投与することを特徴とする、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖が生体組織に過剰に存在する疾患を処置する方法。
【請求項１９】
医薬が、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲１８に記載の方法。
【請求項２０】
生体組織が、髄核であることを特徴とする、請求の範囲１８に記載の方法。
【請求項２１】
疾患が、椎間板ヘルニアであることを特徴とする、請求の範囲１８に記載の方法。
【請求項２２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する触媒としての使用。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項２３】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖の特異的切断剤としての使用。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項２４】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の、生体組織中に存在するヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する能力を有する医薬の製造のための使用。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄからなる群から選ばれる１又は２以上の糖鎖を特異的に切断する活性を有するタンパク質。
【請求項２５】
医薬が、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及び平均分子量７０００のコンドロイチンを切断する能力を有しないことを特徴とする、請求の範囲２４に記載の使用。
【請求項２６】
生体組織が、髄核であることを特徴とする、請求の範囲２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
医薬が、椎間板ヘルニアの処置剤であることを特徴とする、請求の範囲２４〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９７０２２
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５８３０（Ｐ２００５−５０５８３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４６９５
【国際出願日】平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４６９５
【国際出願日】平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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