糖鎖の構築方法
【課題】 人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法を提供すること。
【解決手段】 非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで非還元末端の不飽和ヘキスロン酸をヘキスロン酸に変換した後、ヘキスロン酸のグリコシル化を行うことを特徴とする。本発明は、非還元末端の不飽和ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換とヘキスロン酸へのグリコシル化を行うことによる糖鎖を伸長するための新たな方法論を提供する。
【解決手段】 非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで非還元末端の不飽和ヘキスロン酸をヘキスロン酸に変換した後、ヘキスロン酸のグリコシル化を行うことを特徴とする。本発明は、非還元末端の不飽和ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換とヘキスロン酸へのグリコシル化を行うことによる糖鎖を伸長するための新たな方法論を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、核酸、タンパク質の次ぐ第三の“鎖”であり、近年、その役割や機能の実態が次第に明らかになるとともに、糖鎖の機能の向上や改変のための糖鎖工学の研究も盛んに行われていることは当業者に周知の通りである。例えば、人工的な糖鎖の構築方法については、グリコシダーゼの糖転移活性を利用したグリコシル化（例えば非特許文献１）などの酵素学的手法の他、化学的手法が種々提案されている。
【非特許文献１】H, Saitoh et al., J. Biol. Chem., 270, 3741-3747, 1995.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、人工的に糖鎖を構築するための新たな方法論の開発は、糖鎖工学上、非常に意義深いものである。
そこで本発明は、人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ところで、グリコサミノグリカンに微生物由来のコンドロイチナーゼなどのリアーゼを作用させることで、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖（例えば二糖や四糖）が得られることが古くから知られており、このオリゴ糖は、グリコサミノグリカンの定量分析や定性分析に利用されている（例えばH, Saito et al., J. Biol. Chem., 243, 1536-1542, 1968.）。また、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖に大量の水銀塩（例えば酢酸水銀をオリゴ糖に対して２７．５モル当量）を作用させて非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化を行うことで、Δ４−ヘキスロン酸を分解して除去できることが知られている（Ulf, Ludwigs et al., Biochem. J., 245, 795-804, 1987.）。しかしながら、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖を出発物質として新たに糖鎖を構築する報告は、本発明者が知る範囲において存在しない。
そこで本発明者は、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖を出発物質として用いる糖鎖の構築方法を鋭意検討した結果、このオリゴ糖は、そのままではグリコシダーゼの糖転移活性を利用したグリコシル化による非還元末端からの糖鎖の伸長を行うことができないが、このオリゴ糖に適切量の水銀塩を作用させることによる非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで、非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸が分解されて除去されることなくヘキスロン酸に変換され、構造中に含まれるまたは含まれ得る水酸基、カルボニル基、硫酸基、Ｎ−アセチル基などが壊変されずに保持された状態でグリコシダーゼを用いたグリコシル化による非還元末端からの糖鎖の伸長を行うことができることを見出した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明の糖鎖の構築方法は、請求項１記載の通り、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで非還元末端の不飽和ヘキスロン酸をヘキスロン酸に変換した後、ヘキスロン酸のグリコシル化を行うことを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖が非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖であることを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項１または２記載の方法において、ヘキスロン酸のグリコシル化をグリコシダーゼの糖転移活性を利用して行うことを特徴とする。
また、本発明の非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の非還元末端の不飽和ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換方法は、請求項４記載の通り、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の糖鎖の構築方法は、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで非還元末端の不飽和ヘキスロン酸をヘキスロン酸に変換した後、ヘキスロン酸のグリコシル化を行うことを特徴とするものである。
【０００８】
本発明の糖鎖の構築方法において出発物質として使用する非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖としては、例えば、微生物由来のコンドロイチナーゼＡＢＣ，ＡＢ，Ｂなどのコンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩ，ＩＩなどのヘパリチナーゼ、マンヌロン酸リアーゼ、微生物由来のヒアルロニダーゼなどのリアーゼをグリコサミノグリカンに作用させることで得られる、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖が挙げられる。なお、ここでオリゴ糖とは、単糖が２個以上グリコシド結合によって結合した化合物を意味する。
【０００９】
非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化に用いることができる水銀塩としては、例えば酢酸水銀（ＩＩ）の他、トリフルオロ酢酸水銀（ＩＩ）や塩化水銀（ＩＩ）などが挙げられる。水銀塩の使用量をオリゴ糖に対して最大で５モル当量と規定するのは、この量を超えると非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸が分解されて除去される割合が増えて望ましくないからである。水銀塩の使用量はオリゴ糖に対して最大で３モル当量が望ましく、２モル当量がより望ましい。なお、水銀塩の最低使用量はオリゴ糖に対して１モル当量とするのが望ましい。この量よりも少ないと不飽和結合のオキシ水銀化を効率よく行えない恐れがあるからである。反応は、一般的なオレフィンのオキシ水銀化−還元的脱水銀化におけるオキシ水銀化の条件、例えば、室温下の含水溶媒中で５分間〜１０時間行えばよい。
【００１０】
オキシ水銀化に引き続いて行う還元的脱水銀化は、例えば水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて行うことができる。その使用量は、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖に対して例えば１モル当量〜５モル当量とすればよい。反応は、一般的なオレフィンのオキシ水銀化−還元的脱水銀化における還元的脱水銀化の条件、例えば、０℃で５分間〜１０時間行えばよい。
【００１１】
以上の、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化とそれに続く還元的脱水銀化により、非還元末端にヘキスロン酸（例えばＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸）を有するオリゴ糖を得ることができる。次に行う非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化は、例えば、グリコシダーゼの糖転移活性を利用した方法により行うことができるが、この方法に制限されるわけではなく、非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化を行うことができる方法であればどのような方法であってもよい。グリコシダーゼの糖転移活性を利用した非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化において用いることができるグリコシダーゼとしては、例えば、非特許文献１に記載のウシ精巣性ヒアルロニダーゼが挙げられる。この酵素を利用した場合、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅなどのグリコサミノグリカンを供与体とすることで、その構成糖を２糖ずつ非還元末端のヘキスロン酸の４位の水酸基に結合（グリコシド結合）させて糖鎖を伸長することができる（非特許文献１）。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１３】
実施例１：非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換
工程Ａ：非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の調製
以下の反応式に示す反応を行った。
【００１４】
【化１】
【００１５】
コンドロイチン−４−硫酸構造を主としてコンドロイチン−６−硫酸構造も含む化合物１（生化学工業社製）（１００ｍｇ）を蒸留水（２．８ｍＬ）に溶解し、０．４Ｍ濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．５ｍＬ）、０．４Ｍ濃度の酢酸ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ）、０．１％のウシ血清アルブミン水溶液（０．４ｍＬ）を加え、次いでコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）（１０Ｕ）を加えて３７℃にて４８時間インキュベートした。その後、反応液を１００℃にて２分間加熱することにより酵素を失活させ、遠心後、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１を用いて化合物２を得た（薄茶色粉末、ＥＳＩ−ＭＳによるｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−＝４５８．２）。
【００１６】
（化合物２のＨＰＬＣ分析結果）
純度９３％。ガラクトサミンの４位に硫酸基が存在するもの７５％：保持時間２３分、ガラクトサミンの６位に硫酸基が存在するもの２５％：保持時間２１分。分析条件は下記の通り。
・カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−ＩＩ；５μｍ；２５０×４．６ｍｍ
・移動相：溶離液Ａ・・・１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液
溶離液Ｂ・・・１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液
・流速 ：１ｍＬ／分
・溶離液のグラジェント：時間（分） 溶離液Ａ（％） 溶離液Ｂ（％）
０ １００ ０
４０ ６０ ４０
・操作時間 ：４０分
・カラム温度：４５℃
・検出方法 ：ＵＶ２１５ｎｍ，２３２ｎｍ
・注入体積 ：２０μＬ
【００１７】
工程Ｂ：非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換
以下の反応式に示す反応を行った。
【００１８】
【化２】
【００１９】
化合物２（１８．５ｍｇ，４０．２４μｍｏｌ）を水（９２μＬ）とＴＨＦ（４６μＬ）の混合溶媒に溶解し、酢酸水銀（ＩＩ）（２３ｍｇ、７２μｍｏｌ、化合物２に対して１．８モル当量）を室温にて添加後、１時間攪拌した。次いで反応液を０℃に冷却した後、使用直前に予め調製しておいた水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１０ｍｇを１００μＬの飽和食塩水溶液に溶解したもの）（２１μＬ、化合物２に対して１．５モル当量）を添加し、０℃にて１時間攪拌した。反応液を遠心後、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１を用いて化合物３を得た（１３．８ｍｇ、収率７２％、薄茶色粉末、ＥＳＩ−ＭＳによるｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−＝４７６．３）。
【００２０】
（化合物３の１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）データ）
δ＝５．１７（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），５．１４（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），４．５９（ｂｒ−ｄ），４．５５（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），４．１５（ｍ），４．０７−４．０３（ｍ），４．０１−３．９５（ｍ），３．８９（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），３．７５（ｄｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．６７（ｍ），３．６３（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．８２（ｓ）
【００２１】
（化合物３のＨＰＬＣ分析結果）
ガラクトサミンの４位に硫酸基が存在するもの７１．３％：保持時間１２．０３分、ガラクトサミンの６位に硫酸基が存在するもの２８．７％：保持時間１２．８４分。分析条件は化合物２の分析条件と同じ。
【００２２】
実施例２：非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖を出発物質とした糖鎖構築
工程Ａ：非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の調製
以下の反応式に示す反応を行った。
【００２３】
【化３】
【００２４】
特許第３７３１１５０号公報に記載の方法に従って、サケ鼻軟骨から調製したプロテオグリカン（５００ｍｇ）を原材料とし、高垣啓一らの文献（J. Biol. Chem., 277, 18397-18403, 2002.）に従って結合領域の４糖（ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ）を含むコンドロイチン硫酸を調製した。次に、今淳らの文献（J. Biochem., 110, 132-135, 1991.）に従ってその還元末端を２−アミノピリジンで蛍光標識することにより化合物４を調製した（５１ｍｇ）。これを蒸留水（２８０μＬ）に溶解し、０．４Ｍ濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、５０μＬ）、０．４Ｍ濃度の酢酸ナトリウム水溶液（５０μＬ）、０．１％のウシ血清アルブミン水溶液（４０μＬ）を加え、次いでコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）（１．５Ｕ）を加えて３７℃にて４８時間インキュベートした。その後、反応液を１００℃にて２分間加熱することにより酵素を失活させ、遠心後、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１を用いて粗精製した。得られた溶出液の蛍光画分を減圧濃縮した後、ＨＰＬＣを用いて精製することにより化合物５を得た（黄土色粉末、ＥＳＩ−ＭＳによるｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０９０．２）。
【００２５】
（化合物５のＨＰＬＣ分析結果）
純度９７％。保持時間１０．６２分。分析条件は検出方法をＥｘ３２０ｎｍ，Ｅｍ４００ｎｍによる蛍光検出とすること以外は化合物２の分析条件と同じ。
【００２６】
工程Ｂ：非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換
以下の反応式に示す反応を行った。
【００２７】
【化４】
【００２８】
化合物５の水溶液（１０μＬ）に水（２０μＬ）とＴＨＦ（１５μＬ）を順に加え、酢酸水銀（ＩＩ）（１ｍｇ、３．１４μｍｏｌ、化合物５に対して１．８モル当量）を室温にて添加後、３０分間攪拌した。次いで反応液を０℃に冷却した後、使用直前に予め調製しておいた水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１０ｍｇを１００μＬの飽和食塩水溶液に溶解したもの）（３μＬ、化合物５に対して１．５モル当量）を添加し、０℃にて１時間攪拌した。反応液を遠心後、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１を用いて化合物６を得た（ＨＰＬＣのピーク面積から算出した収率８１％、ＥＳＩ−ＭＳによるｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝１１０８．４）。
【００２９】
（化合物６のＨＰＬＣ分析結果）
保持時間１０．５５分。分析条件は化合物５の分析条件と同じ。
【００３０】
工程Ｃ：非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化による糖鎖の伸長
以下の反応式に示す反応を行った。
【００３１】
【化５】
【００３２】
化合物６の水溶液（１０μＬ）にヒアルロン酸（紀文フードケミファ社製）の３重量％の水溶液（１０μＬ）と１Ｍ濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０、５μＬ）を加え、３７℃に加温した。次いでウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）（１０Ｕ）を加えて３７℃にて１時間インキュベートした。その後、反応液を１００℃にて２分間加熱することにより酵素を失活させ、遠心後、その上清のＨＰＬＣ分析を行うことで、糖転移産物である化合物７の生成を確認した。
【００３３】
（化合部７のＨＰＬＣ分析結果：図１）
化合物６にヒアルロン酸の２糖が転移した化合物の保持時間８分
同、ヒアルロン酸の４糖が転移した化合物の保持時間１０分
同、ヒアルロン酸の６糖が転移した化合物の保持時間１２分
同、ヒアルロン酸の８糖が転移した化合物の保持時間１４分
分析条件は下記の通り。
・カラム：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０；５μｍ；２５０×４．６ｍｍ
・移動相：溶離液Ａ・・・３％酢酸含有アセトニトリル（トリエチルアミンでｐＨ７．３
に調整）：蒸留水＝２０：８０
溶離液Ｂ・・・３％酢酸含有アセトニトリル（トリエチルアミンでｐＨ７．３
に調整）：蒸留水＝５０：５０
・流速 ：１ｍＬ／分
・溶離液のグラジェント：時間（分） 溶離液Ａ（％） 溶離液Ｂ（％）
０ １００ ０
６０ ０ １００
・操作時間 ：６０分
・カラム温度：４５℃
・検出方法 ：Ｅｘ３２０ｎｍ，Ｅｍ４００ｎｍによる蛍光検出
・注入体積 ：２０μＬ
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例２の非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化による糖鎖の伸長についてのＨＰＬＣ分析チャートである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、核酸、タンパク質の次ぐ第三の“鎖”であり、近年、その役割や機能の実態が次第に明らかになるとともに、糖鎖の機能の向上や改変のための糖鎖工学の研究も盛んに行われていることは当業者に周知の通りである。例えば、人工的な糖鎖の構築方法については、グリコシダーゼの糖転移活性を利用したグリコシル化（例えば非特許文献１）などの酵素学的手法の他、化学的手法が種々提案されている。
【非特許文献１】H, Saitoh et al., J. Biol. Chem., 270, 3741-3747, 1995.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、人工的に糖鎖を構築するための新たな方法論の開発は、糖鎖工学上、非常に意義深いものである。
そこで本発明は、人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ところで、グリコサミノグリカンに微生物由来のコンドロイチナーゼなどのリアーゼを作用させることで、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖（例えば二糖や四糖）が得られることが古くから知られており、このオリゴ糖は、グリコサミノグリカンの定量分析や定性分析に利用されている（例えばH, Saito et al., J. Biol. Chem., 243, 1536-1542, 1968.）。また、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖に大量の水銀塩（例えば酢酸水銀をオリゴ糖に対して２７．５モル当量）を作用させて非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化を行うことで、Δ４−ヘキスロン酸を分解して除去できることが知られている（Ulf, Ludwigs et al., Biochem. J., 245, 795-804, 1987.）。しかしながら、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖を出発物質として新たに糖鎖を構築する報告は、本発明者が知る範囲において存在しない。
そこで本発明者は、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖を出発物質として用いる糖鎖の構築方法を鋭意検討した結果、このオリゴ糖は、そのままではグリコシダーゼの糖転移活性を利用したグリコシル化による非還元末端からの糖鎖の伸長を行うことができないが、このオリゴ糖に適切量の水銀塩を作用させることによる非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで、非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸が分解されて除去されることなくヘキスロン酸に変換され、構造中に含まれるまたは含まれ得る水酸基、カルボニル基、硫酸基、Ｎ−アセチル基などが壊変されずに保持された状態でグリコシダーゼを用いたグリコシル化による非還元末端からの糖鎖の伸長を行うことができることを見出した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明の糖鎖の構築方法は、請求項１記載の通り、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで非還元末端の不飽和ヘキスロン酸をヘキスロン酸に変換した後、ヘキスロン酸のグリコシル化を行うことを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖が非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖であることを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項１または２記載の方法において、ヘキスロン酸のグリコシル化をグリコシダーゼの糖転移活性を利用して行うことを特徴とする。
また、本発明の非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の非還元末端の不飽和ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換方法は、請求項４記載の通り、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の糖鎖の構築方法は、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで非還元末端の不飽和ヘキスロン酸をヘキスロン酸に変換した後、ヘキスロン酸のグリコシル化を行うことを特徴とするものである。
【０００８】
本発明の糖鎖の構築方法において出発物質として使用する非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖としては、例えば、微生物由来のコンドロイチナーゼＡＢＣ，ＡＢ，Ｂなどのコンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩ，ＩＩなどのヘパリチナーゼ、マンヌロン酸リアーゼ、微生物由来のヒアルロニダーゼなどのリアーゼをグリコサミノグリカンに作用させることで得られる、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖が挙げられる。なお、ここでオリゴ糖とは、単糖が２個以上グリコシド結合によって結合した化合物を意味する。
【０００９】
非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化に用いることができる水銀塩としては、例えば酢酸水銀（ＩＩ）の他、トリフルオロ酢酸水銀（ＩＩ）や塩化水銀（ＩＩ）などが挙げられる。水銀塩の使用量をオリゴ糖に対して最大で５モル当量と規定するのは、この量を超えると非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸が分解されて除去される割合が増えて望ましくないからである。水銀塩の使用量はオリゴ糖に対して最大で３モル当量が望ましく、２モル当量がより望ましい。なお、水銀塩の最低使用量はオリゴ糖に対して１モル当量とするのが望ましい。この量よりも少ないと不飽和結合のオキシ水銀化を効率よく行えない恐れがあるからである。反応は、一般的なオレフィンのオキシ水銀化−還元的脱水銀化におけるオキシ水銀化の条件、例えば、室温下の含水溶媒中で５分間〜１０時間行えばよい。
【００１０】
オキシ水銀化に引き続いて行う還元的脱水銀化は、例えば水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて行うことができる。その使用量は、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖に対して例えば１モル当量〜５モル当量とすればよい。反応は、一般的なオレフィンのオキシ水銀化−還元的脱水銀化における還元的脱水銀化の条件、例えば、０℃で５分間〜１０時間行えばよい。
【００１１】
以上の、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化とそれに続く還元的脱水銀化により、非還元末端にヘキスロン酸（例えばＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸）を有するオリゴ糖を得ることができる。次に行う非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化は、例えば、グリコシダーゼの糖転移活性を利用した方法により行うことができるが、この方法に制限されるわけではなく、非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化を行うことができる方法であればどのような方法であってもよい。グリコシダーゼの糖転移活性を利用した非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化において用いることができるグリコシダーゼとしては、例えば、非特許文献１に記載のウシ精巣性ヒアルロニダーゼが挙げられる。この酵素を利用した場合、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅなどのグリコサミノグリカンを供与体とすることで、その構成糖を２糖ずつ非還元末端のヘキスロン酸の４位の水酸基に結合（グリコシド結合）させて糖鎖を伸長することができる（非特許文献１）。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１３】
実施例１：非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換
工程Ａ：非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の調製
以下の反応式に示す反応を行った。
【００１４】
【化１】
【００１５】
コンドロイチン−４−硫酸構造を主としてコンドロイチン−６−硫酸構造も含む化合物１（生化学工業社製）（１００ｍｇ）を蒸留水（２．８ｍＬ）に溶解し、０．４Ｍ濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．５ｍＬ）、０．４Ｍ濃度の酢酸ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ）、０．１％のウシ血清アルブミン水溶液（０．４ｍＬ）を加え、次いでコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）（１０Ｕ）を加えて３７℃にて４８時間インキュベートした。その後、反応液を１００℃にて２分間加熱することにより酵素を失活させ、遠心後、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１を用いて化合物２を得た（薄茶色粉末、ＥＳＩ−ＭＳによるｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−＝４５８．２）。
【００１６】
（化合物２のＨＰＬＣ分析結果）
純度９３％。ガラクトサミンの４位に硫酸基が存在するもの７５％：保持時間２３分、ガラクトサミンの６位に硫酸基が存在するもの２５％：保持時間２１分。分析条件は下記の通り。
・カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−ＩＩ；５μｍ；２５０×４．６ｍｍ
・移動相：溶離液Ａ・・・１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液
溶離液Ｂ・・・１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液
・流速 ：１ｍＬ／分
・溶離液のグラジェント：時間（分） 溶離液Ａ（％） 溶離液Ｂ（％）
０ １００ ０
４０ ６０ ４０
・操作時間 ：４０分
・カラム温度：４５℃
・検出方法 ：ＵＶ２１５ｎｍ，２３２ｎｍ
・注入体積 ：２０μＬ
【００１７】
工程Ｂ：非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換
以下の反応式に示す反応を行った。
【００１８】
【化２】
【００１９】
化合物２（１８．５ｍｇ，４０．２４μｍｏｌ）を水（９２μＬ）とＴＨＦ（４６μＬ）の混合溶媒に溶解し、酢酸水銀（ＩＩ）（２３ｍｇ、７２μｍｏｌ、化合物２に対して１．８モル当量）を室温にて添加後、１時間攪拌した。次いで反応液を０℃に冷却した後、使用直前に予め調製しておいた水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１０ｍｇを１００μＬの飽和食塩水溶液に溶解したもの）（２１μＬ、化合物２に対して１．５モル当量）を添加し、０℃にて１時間攪拌した。反応液を遠心後、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１を用いて化合物３を得た（１３．８ｍｇ、収率７２％、薄茶色粉末、ＥＳＩ−ＭＳによるｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−＝４７６．３）。
【００２０】
（化合物３の１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）データ）
δ＝５．１７（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），５．１４（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），４．５９（ｂｒ−ｄ），４．５５（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），４．１５（ｍ），４．０７−４．０３（ｍ），４．０１−３．９５（ｍ），３．８９（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），３．７５（ｄｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．６７（ｍ），３．６３（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．８２（ｓ）
【００２１】
（化合物３のＨＰＬＣ分析結果）
ガラクトサミンの４位に硫酸基が存在するもの７１．３％：保持時間１２．０３分、ガラクトサミンの６位に硫酸基が存在するもの２８．７％：保持時間１２．８４分。分析条件は化合物２の分析条件と同じ。
【００２２】
実施例２：非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖を出発物質とした糖鎖構築
工程Ａ：非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の調製
以下の反応式に示す反応を行った。
【００２３】
【化３】
【００２４】
特許第３７３１１５０号公報に記載の方法に従って、サケ鼻軟骨から調製したプロテオグリカン（５００ｍｇ）を原材料とし、高垣啓一らの文献（J. Biol. Chem., 277, 18397-18403, 2002.）に従って結合領域の４糖（ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ）を含むコンドロイチン硫酸を調製した。次に、今淳らの文献（J. Biochem., 110, 132-135, 1991.）に従ってその還元末端を２−アミノピリジンで蛍光標識することにより化合物４を調製した（５１ｍｇ）。これを蒸留水（２８０μＬ）に溶解し、０．４Ｍ濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、５０μＬ）、０．４Ｍ濃度の酢酸ナトリウム水溶液（５０μＬ）、０．１％のウシ血清アルブミン水溶液（４０μＬ）を加え、次いでコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）（１．５Ｕ）を加えて３７℃にて４８時間インキュベートした。その後、反応液を１００℃にて２分間加熱することにより酵素を失活させ、遠心後、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１を用いて粗精製した。得られた溶出液の蛍光画分を減圧濃縮した後、ＨＰＬＣを用いて精製することにより化合物５を得た（黄土色粉末、ＥＳＩ−ＭＳによるｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０９０．２）。
【００２５】
（化合物５のＨＰＬＣ分析結果）
純度９７％。保持時間１０．６２分。分析条件は検出方法をＥｘ３２０ｎｍ，Ｅｍ４００ｎｍによる蛍光検出とすること以外は化合物２の分析条件と同じ。
【００２６】
工程Ｂ：非還元末端のΔ４−ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換
以下の反応式に示す反応を行った。
【００２７】
【化４】
【００２８】
化合物５の水溶液（１０μＬ）に水（２０μＬ）とＴＨＦ（１５μＬ）を順に加え、酢酸水銀（ＩＩ）（１ｍｇ、３．１４μｍｏｌ、化合物５に対して１．８モル当量）を室温にて添加後、３０分間攪拌した。次いで反応液を０℃に冷却した後、使用直前に予め調製しておいた水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１０ｍｇを１００μＬの飽和食塩水溶液に溶解したもの）（３μＬ、化合物５に対して１．５モル当量）を添加し、０℃にて１時間攪拌した。反応液を遠心後、その上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１を用いて化合物６を得た（ＨＰＬＣのピーク面積から算出した収率８１％、ＥＳＩ−ＭＳによるｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝１１０８．４）。
【００２９】
（化合物６のＨＰＬＣ分析結果）
保持時間１０．５５分。分析条件は化合物５の分析条件と同じ。
【００３０】
工程Ｃ：非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化による糖鎖の伸長
以下の反応式に示す反応を行った。
【００３１】
【化５】
【００３２】
化合物６の水溶液（１０μＬ）にヒアルロン酸（紀文フードケミファ社製）の３重量％の水溶液（１０μＬ）と１Ｍ濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０、５μＬ）を加え、３７℃に加温した。次いでウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）（１０Ｕ）を加えて３７℃にて１時間インキュベートした。その後、反応液を１００℃にて２分間加熱することにより酵素を失活させ、遠心後、その上清のＨＰＬＣ分析を行うことで、糖転移産物である化合物７の生成を確認した。
【００３３】
（化合部７のＨＰＬＣ分析結果：図１）
化合物６にヒアルロン酸の２糖が転移した化合物の保持時間８分
同、ヒアルロン酸の４糖が転移した化合物の保持時間１０分
同、ヒアルロン酸の６糖が転移した化合物の保持時間１２分
同、ヒアルロン酸の８糖が転移した化合物の保持時間１４分
分析条件は下記の通り。
・カラム：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０；５μｍ；２５０×４．６ｍｍ
・移動相：溶離液Ａ・・・３％酢酸含有アセトニトリル（トリエチルアミンでｐＨ７．３
に調整）：蒸留水＝２０：８０
溶離液Ｂ・・・３％酢酸含有アセトニトリル（トリエチルアミンでｐＨ７．３
に調整）：蒸留水＝５０：５０
・流速 ：１ｍＬ／分
・溶離液のグラジェント：時間（分） 溶離液Ａ（％） 溶離液Ｂ（％）
０ １００ ０
６０ ０ １００
・操作時間 ：６０分
・カラム温度：４５℃
・検出方法 ：Ｅｘ３２０ｎｍ，Ｅｍ４００ｎｍによる蛍光検出
・注入体積 ：２０μＬ
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、人工プロテオグリカンや人工グリコサミノグリカンの作製のためなどに有用な糖鎖の構築方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例２の非還元末端のヘキスロン酸のグリコシル化による糖鎖の伸長についてのＨＰＬＣ分析チャートである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで非還元末端の不飽和ヘキスロン酸をヘキスロン酸に変換した後、ヘキスロン酸のグリコシル化を行うことを特徴とする糖鎖の構築方法。
【請求項２】
非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖が非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヘキスロン酸のグリコシル化をグリコシダーゼの糖転移活性を利用して行うことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことを特徴とする非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の非還元末端の不飽和ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換方法。
【請求項１】
非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことで非還元末端の不飽和ヘキスロン酸をヘキスロン酸に変換した後、ヘキスロン酸のグリコシル化を行うことを特徴とする糖鎖の構築方法。
【請求項２】
非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖が非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸を有するオリゴ糖であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヘキスロン酸のグリコシル化をグリコシダーゼの糖転移活性を利用して行うことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の不飽和ヘキスロン酸の不飽和結合のオキシ水銀化（ただし使用する水銀塩はオリゴ糖に対して最大で５モル当量とする）とそれに続く還元的脱水銀化を行うことを特徴とする非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を有するオリゴ糖の非還元末端の不飽和ヘキスロン酸のヘキスロン酸への変換方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２６８３８４（Ｐ２００９−２６８３８４Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２０１６０（Ｐ２００８−１２０１６０）
【出願日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
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