純粋な形態のラパマイシンならびにこの回収方法および精製方法
本発明は、１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンの純粋な形態；ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって、（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮する段階；（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行う段階；（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させる段階；（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施す段階；（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化する段階；（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施す段階；ならびに（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得る段階を含む、前記方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ラパマイシンの実質的に純粋な形態を開示する。本発明はまた、段階の組み合わせにおいてラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液からラパマイシンを回収し、精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景および従来技術：
１９７５年に、Vezina et al.は、ラパマイシンおよびシロリムスとしても知られている（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−２３，２７−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン(hentriacontine)−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペントンを、Streptomyces hygroscopicus培養物から収穫された抗真菌性抗生物質として確認した。この培養物は、イースター島土壌試料から単離された。（J. Antibiot. 28, 721-726 (1975)；および米国特許第3,929,992号、１９７５年１２月３０日にSehgal, et. al.に交付された。）Martel, R. et al. (1977)は、この化合物が免疫応答を妨げる能力を記載した(Can. J. Physiol. Pharmacol., 55, 48-51)。一層最近では、Calne, R. Y. et al. (1989)は、ラパマイシンが異所性心臓同種移植を施与されたラットにおいて免疫抑制性であることを記載した(Lancet、第２巻、２２７頁）。これらの化合物の多くの他の誘導体および構造的類似体は、免疫抑制剤特性を有する。
【０００３】
US 5,508,398には、中性の非ポリペプチドマクロライドを、前記中性マクロライドを含む発酵ブロス抽出物または母液の濃縮物中に存在する酸性、塩基性および無極性中性不純物から分離する方法が開示されており、これは、任意の順序の抽出段階（ａ）および随意に、段階（ｂ）および（ｃ）の一方または両方を含み、ここで（ａ）は水性塩基での抽出を含み、（ｂ）は水性酸での抽出を含み、（ｃ）は非芳香族炭化水素溶媒での処理を含む。
【０００４】
US 5,616,595には、発酵ブロスから水不溶性化合物（FK506、FK520およびラパマイシンを含む）を回収する方法が開示されており、これは、関連する化合物を、すべて単一の閉ざされた再循環系により濃縮し、可溶化し、ダイアフィルタリング(diafiltering)して、さらに下流の精製のための化合物を回収する、連続的な段階を含む。
【０００５】
マクロライド化合物を回収するための従来技術の方法は煩雑であるか、または精製のための特別な装備を必要とし、純粋な生成物は得られない。
【０００６】
本発明者(Wyeth)の錠剤は、Rapamuneの名称の下で市販されている。Rapamune錠剤を、本明細書中に記載される方法に従ってＨＰＬＣによって分析し、数種の不純物を含むことが見出された。ラパマイシンは、３種の異性体形態；異性体Ａ、異性体Ｂおよび異性体Ｃで存在することが知られている。これらの異性体を除いて、Rapamuneは、１．２％の全不純物、ＲＲＴ １．３４にて０．３９％の不純物、ＲＲＴ ０．９２にて０．１５％の不純物およびＲＲＴ ０．６９にて０．２４％の不純物を含んでいた。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、より純粋な形態のラパマイシンおよびこれを得るための方法を提供する。本発明は、ＨＰＬＣによって得られる１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンを開示する。本発明はまた、ＲＲＴ １．３４にて０．１５％未満の不純物含量を有するラパマイシンに関する。本発明は、ＲＲＴ ０．９２にて０．１５％未満の不純物含量を有するラパマイシンに関する。本発明は、ＲＲＴ ０．６９にて０．１５％未満の不純物含量を有するラパマイシンに関する。
本発明はまた、ラパマイシンを回収および精製するための方法に関する。
【０００８】
発明の目的：
本発明の主な目的は、１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンの純粋な形態を得ることにある。
本発明の尚他の目的は、ＲＲＴ １．３４、０．９２および０．６９分にて０．１５％未満の不純物を有するラパマイシンの純粋な形態を得ることにある。
【０００９】
本発明の尚他の目的は、ラパマイシンの純粋な形態を高速液体クロマトグラフィーにより得ることにある。
本発明のさらに他の目的は、ラパマイシンを発酵ブロスから回収し、精製するための方法を開発することにある。
【００１０】
発明の記載：
本発明は、１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンの純粋な形態；ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって、（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮する段階；（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行う段階；（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させる段階；（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施す段階；（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化する段階；（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施す段階；ならびに（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得る段階を含む、前記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
添付図面の簡単な説明：
【図１】図１は、RapamuneのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】図２は、精製したラパマイシンのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００１２】
発明の詳細な説明：
本発明は、１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンの純粋な形態に関する。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、ＲＲＴ １．３４、０．９２および０．６９分にて０．１５％未満の不純物を有する。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、９８．８％〜１００％の範囲内の純度を有する。
【００１３】
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、好ましくは９８．８％の純度を有する。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、発酵ブロスにより産生される。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、高速液体クロマトグラフィーにより得られる。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、結晶形態にある。
【００１４】
本発明はまた、ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって：
（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮する段階；
（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行う段階；
（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させる段階；
（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施す段階；
（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化する段階；
（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施す段階；ならびに
（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得る段階
を含む、前記方法に関する。
【００１５】
本発明の尚他の態様において、水不混和性溶媒は、炭化水素類、複素環式化合物、エーテル類およびエステル類を含む群から選択される。
本発明の尚他の態様において、水不混和性溶媒は、ベンゼン、トルエン、ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸イソブチルおよび酢酸ブチルを含む群から選択される。
本発明の尚他の態様において、水不混和性溶媒は酢酸エチルである。
【００１６】
本発明の尚他の態様において、水混和性溶媒は、水、アルコール類、ケトン類および誘電性非プロトン性溶媒を含む群から選択される。
本発明の尚他の態様において、水混和性溶媒は、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトンおよびアセトニトリルを含む群から選択される。
【００１７】
本発明の尚他の態様において、不活性固体は、珪藻土、砂、活性炭、シリカゲルおよびポリマー樹脂を含む群から選択される。
本発明の尚他の態様において、不活性固体は珪藻土である。
本発明の尚他の態様において、不活性固体は活性炭である。
【００１８】
本発明の尚他の態様において、用いる塩基は、有機塩基または無機塩基のいずれかである。
本発明の尚他の態様において、用いる塩基は無機塩基である。
本発明の尚他の態様において、塩基は重炭酸ナトリウムである。
【００１９】
本発明の尚他の態様において、用いる酸は、有機酸または無機酸のいずれかである。
本発明の尚他の態様において、用いる酸は無機酸である。
本発明の尚他の態様において、酸は塩酸である。
【００２０】
本発明の尚他の態様において、溶出を、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、石油エーテル、メタノールおよびジエチルエーテルまたはこれらの混合物を含む群から選択された有機溶媒を用いて行う。
本発明の尚他の態様において、溶出を、アセトンを用いて行う。
【００２１】
本発明の尚他の態様において、結晶化を、エーテル類を用いて行う。
本発明の尚他の態様において、結晶化を、ジエチルエーテルを用いて行う。
【００２２】
本発明の尚他の態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ポリスチレン、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、ポリ（アクリレート）およびポリ（メタクリレート）を含む群から選択されるポリマー樹脂を用いて行う。
本発明の尚他の態様において、逆相クロマトグラフィーを、Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８結合シリカを含む群から選択された樹脂を用いて行う。
【００２３】
本発明の尚他の態様において、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーにおける溶出を、メタノール、アセトン、アセトニトリル、水、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびテトラヒドロフランまたはこれらの混合物を含む群から選択された溶媒を用いて行う。
本発明の尚他の態様において、再結晶を、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ヘキサンおよびヘプタンを含む群から選択された有機溶媒を用いて行う。
【００２４】
本発明の尚他の態様において、精製された生成物は、ラパマイシンの異性体形態のいずれか１種、即ち異性体Ａ、異性体Ｂまたは異性体Ｃである。
本発明の尚他の態様において、精製された生成物は、ラパマイシンの異性体Ｂである。
【００２５】
本発明は、ＨＰＬＣにより１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンに関する。本発明はまた、ＲＲＴ １．３４にて０．１５％未満の不純物含量を有するラパマイシンに関する。Rapamuneおよび本発明からのラパマイシンのＬＣ−ＭＳ分析により、ＲＲＴ １．３４における不純物が［Ｍ＋Ｎａ］＋に相当する９５１のｍ／ｚにてピークを付与することが示される。この不純物は、ラパマイシンの質量より１４Ｄａ大きい質量を有する。本プロセスを用いて産生されるラパマイシン中に存在するＲＲＴ ０．６９またはＲＲＴ ０．９２における不純物は、各々０．１５％未満である。ここでのすべてのＲＲＴは、ラパマイシンの異性体Ｂに関してのものである。
【００２６】
本発明において精製されるRapamuneおよびラパマイシンを分析するために本発明において用いるＨＰＬＣ方法は、以下の通りである：
カラム：Agilent Eclipse XDB-C8、３．５μｍ、直径−４．６ｍｍ、長さ−１５０ｍｍ流量：１．５ｍｌ／分
検出波長：２８７ｎｍ
注入容積：２０μｌ
希釈剤：アセトニトリル
温度：４５℃
ラパマイシンの異性体Ｂのおよその滞留時間：２６分
移動相：緩衝液Ａ−アセトニトリル；緩衝液Ｂ−水中２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４。勾配は、表１に示す通りである。
【００２７】
【表１】
【００２８】
本発明はまた、ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって：
（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮すること；
（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行うこと；
（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させること；
（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施すこと；
（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化すること；
（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施すこと；ならびに
（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得ること
を含む、前記方法に関する。
【００２９】
本発明のラパマイシンは、発酵によって産生される。発酵によって得られるブロスを、水不混和性溶媒によって直接抽出することができる。水不混和性溶媒を、酢酸エチル、トルエン、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ブタノール、ベンゼン、クロロホルムおよびジクロロメタンから選択することができる。ブロスから得られる固体、半固体または液体形態のすべての天然材料を、水不混和性溶媒で処理して、ラパマイシンの水不混和性溶媒への可溶化をもたらすことができる。ラパマイシンを含む水不混和性溶媒を、濃縮することができる。濃縮を、既知の方法によって行うことができる。濃縮を、溶媒の蒸発によって行うことができる。溶媒の蒸発を、減圧を伴わずに、または減圧を伴って、加熱によって行うことができる。
【００３０】
濃縮物を、溶媒で処理して、ラパマイシンと共に存在する不純物の分離を行うことができる。不純物は、固体もしくは溶媒と不混和性の液体またはその両方の形態で存在し得る。不純物を、濾過、相分離またはこれらの両方によって分離することができる。溶媒は、水混和性溶媒であり得る。好ましくは、溶媒を、アセトン、メタノールまたはアセトニトリルから選択することができる。随意に、濃縮物は、不活性固体に結合し、これを塩基および／または酸で洗浄する。次に、ラパマイシンを、有機溶媒で溶出する。塩基および酸を、無機または有機塩基および酸から選択することができる。好ましくは、塩基は水性重炭酸ナトリウムであり得、酸は水性塩酸であり得る。有機溶媒を、ラパマイシンおよびこれらの混合物を溶解することができる溶媒から選択することができる。次に、溶出液を濃縮することができる。
【００３１】
濃縮物に、シリカゲルクロマトグラフィーを施すことができる。溶出を、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、メタノールおよびジエチルエーテルからの溶媒の１種またはこれらの混合物を用いて行うことができる。クロマトグラフィーからの画分を含む生成物を、混合し、濃縮することができる。濃縮物を溶媒で処理して、生成物を単離することができる。生成物を濾過し、乾燥することができる。随意に、この溶媒処理を繰り返してもよい。
【００３２】
生成物に、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを施すことができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ポリマー樹脂を用いて行ってもよい。このポリマー樹脂を、ポリスチレン、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、ポリ（アクリレート）およびポリ（メタクリレート）から選択することができる。逆相クロマトグラフィー用の樹脂を、Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８結合シリカから選択することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィー用の溶出溶媒を、メタノール、アセトン、アセトニトリル、水、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびテトラヒドロフランまたはこれらの混合物から選択することができる。所望の純度で生成物を含む画分を、混合し、濃縮し、水不混和性溶媒で抽出することができる。抽出物を濃縮することができる。
【００３３】
疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーの後に得られた濃縮物または生成物を、有機溶媒から再結晶することができる。この溶媒を、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、酢酸エチル、クロロホルムおよびジクロロメタンから選択することができる。
【００３４】
本発明を、以下の例の補助によりさらに詳述する。しかし、これらの例は、本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【００３５】
例１：ラパマイシンの回収
ラパマイシンを含む発酵ブロス（１１ｋｇ）を、１１ｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮して、２０６ｇの油状残留物を得た。残留物を、６００ｍｌのアセトニトリルで３回抽出した。アセトニトリル抽出物を濃縮して、９０ｇの油状残留物を得た。残留物を、１ｌの酢酸エチルと混合した。５００ｇの珪藻土を、この溶液に加えた。溶液を完全に濃縮した。濃縮物を、水に溶解した０．０１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液１ｌ中でスラリーとした。混合物を濾過した。濾過した固体を、９ｌの０．０１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液でさらに洗浄した。塩基での洗浄に、１０ｌの０．１Ｎの水性塩酸溶液を続けた。次に、固体を水で洗浄した。生成物を、酢酸エチルを用いて溶出した。溶出液を濃縮して、５６ｇの残留物を得た。
【００３６】
残留物を、シリカゲルを詰めたカラムに適用した。カラムを、ヘキサン中の１５％アセトンおよびヘキサン中の２５％アセトンで洗浄した。生成物を、ヘキサン中の４０％アセトンで溶出した。画分を含む生成物を濃縮して、２３ｇの残留物を得た。残留物を、ジエチルエーテルと混合し、混合物を、４℃にて撹拌した。混合物を濾過して、ラパマイシンの結晶を単離した。結晶を乾燥して、６ｇの白色粉末を〜９５％の純度で得た。
【００３７】
例２：ラパマイシンの回収
ラパマイシンを含む発酵ブロス（２５００ｋｇ）を、酢酸エチル（１：０．５、１：０．２５、１：０．２５の比率での３回の抽出）で抽出した。酢酸エチル抽出物を、約１０００ｋｇまで濃縮した。部分的に濃縮された酢酸エチル層を、水で洗浄した。酢酸エチル層を濃縮して、５０ｋｇの油状残留物を得た。残留物を、１５０ｋｇのアセトニトリルで３回抽出した。アセトニトリル抽出物を濃縮して、１１ｋｇの油状残留物を得た。残留物を、２００ｋｇの酢酸エチルと混合した。０．７６５ｋｇの活性炭を、この溶液に加えた。溶液を撹拌し、濾過した。濾液を完全に濃縮して、残留物を得た。
【００３８】
残留物を、シリカゲルを詰めたカラムに適用した。カラムを、ヘキサン中の１５％アセトンおよびヘキサン中の２５％アセトンで洗浄した。生成物を、ヘキサン中の４０％アセトンで溶出した。画分を含む生成物を濃縮して、油状残留物を得た。残留物を、２００ｋｇの酢酸エチルと混合した。０．７６５ｋｇの活性炭を、この溶液に加えた。溶液を撹拌し、濾過し、濃縮した。濃縮物を、ジエチルエーテルと混合し、混合物を、４℃にて撹拌した。混合物を濾過して、ラパマイシンの結晶を単離させた。結晶を乾燥して、１．１ｋｇの白色粉末を〜９０％の純度で得た。
【００３９】
例３：ラパマイシンの精製
例１において得られた粉末３ｇを、９０ｍｌのアセトニトリルに溶解した。溶液を濃縮し、結晶化のために４℃にて保持した。結晶を濾過し、乾燥した。２．５ｇの白色結晶が得られた。これらの結晶中の全不純物は０．５％であり、ＲＲＴ １．３４における不純物は０．２５％であった。
【００４０】
例４：ラパマイシンの精製
例２において得られた粉末７ｇを、１５０ｍｇ／ｍｌの濃度でアセトニトリルに溶解した。Ｃ８結合シリカを詰めたカラムに溶液をロードした。カラム直径は１００ｍｍであり、長さは２５０ｍｍであった。生成物を、６０：４０の比率のアセトニトリルおよび水の移動相で溶出した。純粋な生成物を含む画分をプールし、濃縮した。濃縮物を、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を濃縮した。濃縮物に、２００ｍｌのアセトニトリルを加えた。溶液を濃縮し、結晶化のために４℃にて保持した。結晶を濾過し、乾燥した。１．８ｇの白色粉末が得られた。この粉末中の全不純物は、０．１５％であった。ＲＲＴ １．３４および０．９２における不純物は、それぞれ０．０７％および０．０３％であった。ＲＲＴ ０．６９における不純物は、検出されなかった。
【００４１】
RapamuneについてのＨＰＬＣクロマトグラムおよび、上記のように得られたラパマイシンのＨＰＬＣクロマトグラムを、それぞれ図１および図２に示す。図１におけるクロマトグラムの詳細を、表２に示し、図２のクロマトグラムの詳細を、表３に示す。図１と図２との比較および対応する表により、本発明から得られるラパマイシンが実質的に純粋であることが示される。
【００４２】
【表２】
【００４３】
【表３】
【００４４】
例５：ラパマイシンの精製
例２において得られた粉末７ｇを、１７５ｍｌのアセトンに溶解した。これに、１７５ｍｌの水を加えた。溶液を、ＨＰ２０ＳＳ樹脂を詰めたカラムに通じた。カラム直径は２０ｍｍであり、長さは１ｍであった。カラムを、水中の５０％アセトンおよび水中の６０％アセトンで洗浄した。溶出を、水中の７０％アセトンを用いて行った。純粋な生成物を含む画分をプールし、濃縮した。濃縮物を、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を濃縮した。濃縮物に、２００ｍｌのアセトニトリルを加えた。溶液を濃縮し、結晶化のために４℃にて保持した。結晶を濾過し、乾燥した。１．６ｇの白色粉末が得られた。この粉末中の全不純物は、０．４５％であり、ＲＲＴ １．３４、０．９２および０．６８における不純物は、それぞれ０．０３％、０．１４％および０．１３％であった。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ラパマイシンの実質的に純粋な形態を開示する。本発明はまた、段階の組み合わせにおいてラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液からラパマイシンを回収し、精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景および従来技術：
１９７５年に、Vezina et al.は、ラパマイシンおよびシロリムスとしても知られている（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−２３，２７−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン(hentriacontine)−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペントンを、Streptomyces hygroscopicus培養物から収穫された抗真菌性抗生物質として確認した。この培養物は、イースター島土壌試料から単離された。（J. Antibiot. 28, 721-726 (1975)；および米国特許第3,929,992号、１９７５年１２月３０日にSehgal, et. al.に交付された。）Martel, R. et al. (1977)は、この化合物が免疫応答を妨げる能力を記載した(Can. J. Physiol. Pharmacol., 55, 48-51)。一層最近では、Calne, R. Y. et al. (1989)は、ラパマイシンが異所性心臓同種移植を施与されたラットにおいて免疫抑制性であることを記載した(Lancet、第２巻、２２７頁）。これらの化合物の多くの他の誘導体および構造的類似体は、免疫抑制剤特性を有する。
【０００３】
US 5,508,398には、中性の非ポリペプチドマクロライドを、前記中性マクロライドを含む発酵ブロス抽出物または母液の濃縮物中に存在する酸性、塩基性および無極性中性不純物から分離する方法が開示されており、これは、任意の順序の抽出段階（ａ）および随意に、段階（ｂ）および（ｃ）の一方または両方を含み、ここで（ａ）は水性塩基での抽出を含み、（ｂ）は水性酸での抽出を含み、（ｃ）は非芳香族炭化水素溶媒での処理を含む。
【０００４】
US 5,616,595には、発酵ブロスから水不溶性化合物（FK506、FK520およびラパマイシンを含む）を回収する方法が開示されており、これは、関連する化合物を、すべて単一の閉ざされた再循環系により濃縮し、可溶化し、ダイアフィルタリング(diafiltering)して、さらに下流の精製のための化合物を回収する、連続的な段階を含む。
【０００５】
マクロライド化合物を回収するための従来技術の方法は煩雑であるか、または精製のための特別な装備を必要とし、純粋な生成物は得られない。
【０００６】
本発明者(Wyeth)の錠剤は、Rapamuneの名称の下で市販されている。Rapamune錠剤を、本明細書中に記載される方法に従ってＨＰＬＣによって分析し、数種の不純物を含むことが見出された。ラパマイシンは、３種の異性体形態；異性体Ａ、異性体Ｂおよび異性体Ｃで存在することが知られている。これらの異性体を除いて、Rapamuneは、１．２％の全不純物、ＲＲＴ １．３４にて０．３９％の不純物、ＲＲＴ ０．９２にて０．１５％の不純物およびＲＲＴ ０．６９にて０．２４％の不純物を含んでいた。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、より純粋な形態のラパマイシンおよびこれを得るための方法を提供する。本発明は、ＨＰＬＣによって得られる１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンを開示する。本発明はまた、ＲＲＴ １．３４にて０．１５％未満の不純物含量を有するラパマイシンに関する。本発明は、ＲＲＴ ０．９２にて０．１５％未満の不純物含量を有するラパマイシンに関する。本発明は、ＲＲＴ ０．６９にて０．１５％未満の不純物含量を有するラパマイシンに関する。
本発明はまた、ラパマイシンを回収および精製するための方法に関する。
【０００８】
発明の目的：
本発明の主な目的は、１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンの純粋な形態を得ることにある。
本発明の尚他の目的は、ＲＲＴ １．３４、０．９２および０．６９分にて０．１５％未満の不純物を有するラパマイシンの純粋な形態を得ることにある。
【０００９】
本発明の尚他の目的は、ラパマイシンの純粋な形態を高速液体クロマトグラフィーにより得ることにある。
本発明のさらに他の目的は、ラパマイシンを発酵ブロスから回収し、精製するための方法を開発することにある。
【００１０】
発明の記載：
本発明は、１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンの純粋な形態；ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって、（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮する段階；（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行う段階；（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させる段階；（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施す段階；（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化する段階；（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施す段階；ならびに（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得る段階を含む、前記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
添付図面の簡単な説明：
【図１】図１は、RapamuneのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】図２は、精製したラパマイシンのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００１２】
発明の詳細な説明：
本発明は、１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンの純粋な形態に関する。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、ＲＲＴ １．３４、０．９２および０．６９分にて０．１５％未満の不純物を有する。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、９８．８％〜１００％の範囲内の純度を有する。
【００１３】
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、好ましくは９８．８％の純度を有する。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、発酵ブロスにより産生される。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、高速液体クロマトグラフィーにより得られる。
本発明の尚他の態様において、ラパマイシンは、結晶形態にある。
【００１４】
本発明はまた、ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって：
（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮する段階；
（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行う段階；
（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させる段階；
（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施す段階；
（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化する段階；
（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施す段階；ならびに
（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得る段階
を含む、前記方法に関する。
【００１５】
本発明の尚他の態様において、水不混和性溶媒は、炭化水素類、複素環式化合物、エーテル類およびエステル類を含む群から選択される。
本発明の尚他の態様において、水不混和性溶媒は、ベンゼン、トルエン、ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸イソブチルおよび酢酸ブチルを含む群から選択される。
本発明の尚他の態様において、水不混和性溶媒は酢酸エチルである。
【００１６】
本発明の尚他の態様において、水混和性溶媒は、水、アルコール類、ケトン類および誘電性非プロトン性溶媒を含む群から選択される。
本発明の尚他の態様において、水混和性溶媒は、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトンおよびアセトニトリルを含む群から選択される。
【００１７】
本発明の尚他の態様において、不活性固体は、珪藻土、砂、活性炭、シリカゲルおよびポリマー樹脂を含む群から選択される。
本発明の尚他の態様において、不活性固体は珪藻土である。
本発明の尚他の態様において、不活性固体は活性炭である。
【００１８】
本発明の尚他の態様において、用いる塩基は、有機塩基または無機塩基のいずれかである。
本発明の尚他の態様において、用いる塩基は無機塩基である。
本発明の尚他の態様において、塩基は重炭酸ナトリウムである。
【００１９】
本発明の尚他の態様において、用いる酸は、有機酸または無機酸のいずれかである。
本発明の尚他の態様において、用いる酸は無機酸である。
本発明の尚他の態様において、酸は塩酸である。
【００２０】
本発明の尚他の態様において、溶出を、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、石油エーテル、メタノールおよびジエチルエーテルまたはこれらの混合物を含む群から選択された有機溶媒を用いて行う。
本発明の尚他の態様において、溶出を、アセトンを用いて行う。
【００２１】
本発明の尚他の態様において、結晶化を、エーテル類を用いて行う。
本発明の尚他の態様において、結晶化を、ジエチルエーテルを用いて行う。
【００２２】
本発明の尚他の態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ポリスチレン、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、ポリ（アクリレート）およびポリ（メタクリレート）を含む群から選択されるポリマー樹脂を用いて行う。
本発明の尚他の態様において、逆相クロマトグラフィーを、Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８結合シリカを含む群から選択された樹脂を用いて行う。
【００２３】
本発明の尚他の態様において、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーにおける溶出を、メタノール、アセトン、アセトニトリル、水、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびテトラヒドロフランまたはこれらの混合物を含む群から選択された溶媒を用いて行う。
本発明の尚他の態様において、再結晶を、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ヘキサンおよびヘプタンを含む群から選択された有機溶媒を用いて行う。
【００２４】
本発明の尚他の態様において、精製された生成物は、ラパマイシンの異性体形態のいずれか１種、即ち異性体Ａ、異性体Ｂまたは異性体Ｃである。
本発明の尚他の態様において、精製された生成物は、ラパマイシンの異性体Ｂである。
【００２５】
本発明は、ＨＰＬＣにより１．２％未満の合計不純物含量を有するラパマイシンに関する。本発明はまた、ＲＲＴ １．３４にて０．１５％未満の不純物含量を有するラパマイシンに関する。Rapamuneおよび本発明からのラパマイシンのＬＣ−ＭＳ分析により、ＲＲＴ １．３４における不純物が［Ｍ＋Ｎａ］＋に相当する９５１のｍ／ｚにてピークを付与することが示される。この不純物は、ラパマイシンの質量より１４Ｄａ大きい質量を有する。本プロセスを用いて産生されるラパマイシン中に存在するＲＲＴ ０．６９またはＲＲＴ ０．９２における不純物は、各々０．１５％未満である。ここでのすべてのＲＲＴは、ラパマイシンの異性体Ｂに関してのものである。
【００２６】
本発明において精製されるRapamuneおよびラパマイシンを分析するために本発明において用いるＨＰＬＣ方法は、以下の通りである：
カラム：Agilent Eclipse XDB-C8、３．５μｍ、直径−４．６ｍｍ、長さ−１５０ｍｍ流量：１．５ｍｌ／分
検出波長：２８７ｎｍ
注入容積：２０μｌ
希釈剤：アセトニトリル
温度：４５℃
ラパマイシンの異性体Ｂのおよその滞留時間：２６分
移動相：緩衝液Ａ−アセトニトリル；緩衝液Ｂ−水中２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４。勾配は、表１に示す通りである。
【００２７】
【表１】
【００２８】
本発明はまた、ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって：
（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮すること；
（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行うこと；
（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させること；
（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施すこと；
（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化すること；
（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施すこと；ならびに
（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得ること
を含む、前記方法に関する。
【００２９】
本発明のラパマイシンは、発酵によって産生される。発酵によって得られるブロスを、水不混和性溶媒によって直接抽出することができる。水不混和性溶媒を、酢酸エチル、トルエン、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ブタノール、ベンゼン、クロロホルムおよびジクロロメタンから選択することができる。ブロスから得られる固体、半固体または液体形態のすべての天然材料を、水不混和性溶媒で処理して、ラパマイシンの水不混和性溶媒への可溶化をもたらすことができる。ラパマイシンを含む水不混和性溶媒を、濃縮することができる。濃縮を、既知の方法によって行うことができる。濃縮を、溶媒の蒸発によって行うことができる。溶媒の蒸発を、減圧を伴わずに、または減圧を伴って、加熱によって行うことができる。
【００３０】
濃縮物を、溶媒で処理して、ラパマイシンと共に存在する不純物の分離を行うことができる。不純物は、固体もしくは溶媒と不混和性の液体またはその両方の形態で存在し得る。不純物を、濾過、相分離またはこれらの両方によって分離することができる。溶媒は、水混和性溶媒であり得る。好ましくは、溶媒を、アセトン、メタノールまたはアセトニトリルから選択することができる。随意に、濃縮物は、不活性固体に結合し、これを塩基および／または酸で洗浄する。次に、ラパマイシンを、有機溶媒で溶出する。塩基および酸を、無機または有機塩基および酸から選択することができる。好ましくは、塩基は水性重炭酸ナトリウムであり得、酸は水性塩酸であり得る。有機溶媒を、ラパマイシンおよびこれらの混合物を溶解することができる溶媒から選択することができる。次に、溶出液を濃縮することができる。
【００３１】
濃縮物に、シリカゲルクロマトグラフィーを施すことができる。溶出を、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、メタノールおよびジエチルエーテルからの溶媒の１種またはこれらの混合物を用いて行うことができる。クロマトグラフィーからの画分を含む生成物を、混合し、濃縮することができる。濃縮物を溶媒で処理して、生成物を単離することができる。生成物を濾過し、乾燥することができる。随意に、この溶媒処理を繰り返してもよい。
【００３２】
生成物に、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを施すことができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ポリマー樹脂を用いて行ってもよい。このポリマー樹脂を、ポリスチレン、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、ポリ（アクリレート）およびポリ（メタクリレート）から選択することができる。逆相クロマトグラフィー用の樹脂を、Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８結合シリカから選択することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィー用の溶出溶媒を、メタノール、アセトン、アセトニトリル、水、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびテトラヒドロフランまたはこれらの混合物から選択することができる。所望の純度で生成物を含む画分を、混合し、濃縮し、水不混和性溶媒で抽出することができる。抽出物を濃縮することができる。
【００３３】
疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーの後に得られた濃縮物または生成物を、有機溶媒から再結晶することができる。この溶媒を、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、酢酸エチル、クロロホルムおよびジクロロメタンから選択することができる。
【００３４】
本発明を、以下の例の補助によりさらに詳述する。しかし、これらの例は、本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【００３５】
例１：ラパマイシンの回収
ラパマイシンを含む発酵ブロス（１１ｋｇ）を、１１ｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮して、２０６ｇの油状残留物を得た。残留物を、６００ｍｌのアセトニトリルで３回抽出した。アセトニトリル抽出物を濃縮して、９０ｇの油状残留物を得た。残留物を、１ｌの酢酸エチルと混合した。５００ｇの珪藻土を、この溶液に加えた。溶液を完全に濃縮した。濃縮物を、水に溶解した０．０１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液１ｌ中でスラリーとした。混合物を濾過した。濾過した固体を、９ｌの０．０１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液でさらに洗浄した。塩基での洗浄に、１０ｌの０．１Ｎの水性塩酸溶液を続けた。次に、固体を水で洗浄した。生成物を、酢酸エチルを用いて溶出した。溶出液を濃縮して、５６ｇの残留物を得た。
【００３６】
残留物を、シリカゲルを詰めたカラムに適用した。カラムを、ヘキサン中の１５％アセトンおよびヘキサン中の２５％アセトンで洗浄した。生成物を、ヘキサン中の４０％アセトンで溶出した。画分を含む生成物を濃縮して、２３ｇの残留物を得た。残留物を、ジエチルエーテルと混合し、混合物を、４℃にて撹拌した。混合物を濾過して、ラパマイシンの結晶を単離した。結晶を乾燥して、６ｇの白色粉末を〜９５％の純度で得た。
【００３７】
例２：ラパマイシンの回収
ラパマイシンを含む発酵ブロス（２５００ｋｇ）を、酢酸エチル（１：０．５、１：０．２５、１：０．２５の比率での３回の抽出）で抽出した。酢酸エチル抽出物を、約１０００ｋｇまで濃縮した。部分的に濃縮された酢酸エチル層を、水で洗浄した。酢酸エチル層を濃縮して、５０ｋｇの油状残留物を得た。残留物を、１５０ｋｇのアセトニトリルで３回抽出した。アセトニトリル抽出物を濃縮して、１１ｋｇの油状残留物を得た。残留物を、２００ｋｇの酢酸エチルと混合した。０．７６５ｋｇの活性炭を、この溶液に加えた。溶液を撹拌し、濾過した。濾液を完全に濃縮して、残留物を得た。
【００３８】
残留物を、シリカゲルを詰めたカラムに適用した。カラムを、ヘキサン中の１５％アセトンおよびヘキサン中の２５％アセトンで洗浄した。生成物を、ヘキサン中の４０％アセトンで溶出した。画分を含む生成物を濃縮して、油状残留物を得た。残留物を、２００ｋｇの酢酸エチルと混合した。０．７６５ｋｇの活性炭を、この溶液に加えた。溶液を撹拌し、濾過し、濃縮した。濃縮物を、ジエチルエーテルと混合し、混合物を、４℃にて撹拌した。混合物を濾過して、ラパマイシンの結晶を単離させた。結晶を乾燥して、１．１ｋｇの白色粉末を〜９０％の純度で得た。
【００３９】
例３：ラパマイシンの精製
例１において得られた粉末３ｇを、９０ｍｌのアセトニトリルに溶解した。溶液を濃縮し、結晶化のために４℃にて保持した。結晶を濾過し、乾燥した。２．５ｇの白色結晶が得られた。これらの結晶中の全不純物は０．５％であり、ＲＲＴ １．３４における不純物は０．２５％であった。
【００４０】
例４：ラパマイシンの精製
例２において得られた粉末７ｇを、１５０ｍｇ／ｍｌの濃度でアセトニトリルに溶解した。Ｃ８結合シリカを詰めたカラムに溶液をロードした。カラム直径は１００ｍｍであり、長さは２５０ｍｍであった。生成物を、６０：４０の比率のアセトニトリルおよび水の移動相で溶出した。純粋な生成物を含む画分をプールし、濃縮した。濃縮物を、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を濃縮した。濃縮物に、２００ｍｌのアセトニトリルを加えた。溶液を濃縮し、結晶化のために４℃にて保持した。結晶を濾過し、乾燥した。１．８ｇの白色粉末が得られた。この粉末中の全不純物は、０．１５％であった。ＲＲＴ １．３４および０．９２における不純物は、それぞれ０．０７％および０．０３％であった。ＲＲＴ ０．６９における不純物は、検出されなかった。
【００４１】
RapamuneについてのＨＰＬＣクロマトグラムおよび、上記のように得られたラパマイシンのＨＰＬＣクロマトグラムを、それぞれ図１および図２に示す。図１におけるクロマトグラムの詳細を、表２に示し、図２のクロマトグラムの詳細を、表３に示す。図１と図２との比較および対応する表により、本発明から得られるラパマイシンが実質的に純粋であることが示される。
【００４２】
【表２】
【００４３】
【表３】
【００４４】
例５：ラパマイシンの精製
例２において得られた粉末７ｇを、１７５ｍｌのアセトンに溶解した。これに、１７５ｍｌの水を加えた。溶液を、ＨＰ２０ＳＳ樹脂を詰めたカラムに通じた。カラム直径は２０ｍｍであり、長さは１ｍであった。カラムを、水中の５０％アセトンおよび水中の６０％アセトンで洗浄した。溶出を、水中の７０％アセトンを用いて行った。純粋な生成物を含む画分をプールし、濃縮した。濃縮物を、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を濃縮した。濃縮物に、２００ｍｌのアセトニトリルを加えた。溶液を濃縮し、結晶化のために４℃にて保持した。結晶を濾過し、乾燥した。１．６ｇの白色粉末が得られた。この粉末中の全不純物は、０．４５％であり、ＲＲＴ １．３４、０．９２および０．６８における不純物は、それぞれ０．０３％、０．１４％および０．１３％であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．２％未満の合計不純物含量を有する、ラパマイシンの純粋な形態。
【請求項２】
ラパマイシンが、ＲＲＴ １．３４、０．９２および０．６９分にて０．１５％未満の不純物を有する、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項３】
ラパマイシンが、９８．８％〜１００％の範囲内の純度を有する、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項４】
ラパマイシンが、好ましくは９８．８％の純度を有する、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項５】
ラパマイシンが、発酵ブロスにより産生される、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項６】
ラパマイシンが、高速液体クロマトグラフィーにより得られる、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項７】
ラパマイシンが結晶形態にある、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項８】
ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって：
（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮すること；
（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行うこと；
（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させること；
（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施すこと；
（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化すること；
（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施すこと；ならびに
（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得ること
を含む、前記方法。
【請求項９】
水不混和性溶媒が、炭化水素類、複素環式化合物、エーテル類およびエステル類を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
水不混和性溶媒が、ベンゼン、トルエン、ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸イソブチルおよび酢酸ブチルを含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
水不混和性溶媒が酢酸エチルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
水混和性溶媒が、水、アルコール類、ケトン類および誘電性非プロトン性溶媒を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
水混和性溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトンおよびアセトニトリルを含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
不活性固体が、珪藻土、砂、活性炭、シリカゲルおよびポリマー樹脂を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
不活性固体が珪藻土である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
不活性固体が活性炭である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
用いる塩基が有機塩基または無機塩基のいずれかである、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
用いる塩基が無機塩基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
塩基が重炭酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
用いる酸が有機酸または無機酸のいずれかである、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
用いる酸が無機酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
酸が塩酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
溶出を、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、石油エーテル、メタノールおよびジエチルエーテルまたはこれらの混合物を含む群から選択される有機溶媒を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
溶出を、アセトンを用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
結晶化を、エーテル類を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
結晶化を、ジエチルエーテルを用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２７】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ポリスチレン、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、ポリ（アクリレート）およびポリ（メタクリレート）を含む群から選択されるポリマー樹脂を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２８】
逆相クロマトグラフィーを、Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８結合シリカを含む群から選択される樹脂を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２９】
疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーにおける溶出を、メタノール、アセトン、アセトニトリル、水、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびテトラヒドロフランまたはこれらの混合物を含む群から選択される溶媒を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項３０】
再結晶を、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ヘキサンおよびヘプタンを含む群から選択される有機溶媒を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項３１】
精製された生成物が、ラパマイシンの異性体形態のいずれか１種、即ち異性体Ａ、異性体Ｂまたは異性体Ｃである、請求項８に記載の方法。
【請求項３２】
精製された生成物が、ラパマイシンの異性体Ｂである、請求項８に記載の方法。
【請求項１】
１．２％未満の合計不純物含量を有する、ラパマイシンの純粋な形態。
【請求項２】
ラパマイシンが、ＲＲＴ １．３４、０．９２および０．６９分にて０．１５％未満の不純物を有する、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項３】
ラパマイシンが、９８．８％〜１００％の範囲内の純度を有する、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項４】
ラパマイシンが、好ましくは９８．８％の純度を有する、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項５】
ラパマイシンが、発酵ブロスにより産生される、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項６】
ラパマイシンが、高速液体クロマトグラフィーにより得られる、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項７】
ラパマイシンが結晶形態にある、請求項１に記載のラパマイシン。
【請求項８】
ラパマイシンを回収し、精製するための方法であって：
（ａ）ラパマイシンを含む発酵ブロス、抽出物または溶液を水不混和性溶媒で処理し、濃縮すること；
（ｂ）水混和性溶媒を加えて、存在する不純物の分離を行うこと；
（ｃ）随意に、段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒を不活性固体に結合させ、固体を塩基および酸で洗浄し、続いて溶出させること；
（ｄ）段階（ｃ）からの溶出液または段階（ｂ）からの生成物を含む溶媒に、シリカゲルクロマトグラフィーを施すこと；
（ｅ）段階（ｄ）から得られた生成物を結晶化すること；
（ｆ）段階（ｅ）からの生成物の溶液に、疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーを施すこと；ならびに
（ｇ）再結晶させて、ラパマイシンを実質的に純粋な形態で得ること
を含む、前記方法。
【請求項９】
水不混和性溶媒が、炭化水素類、複素環式化合物、エーテル類およびエステル類を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
水不混和性溶媒が、ベンゼン、トルエン、ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸イソブチルおよび酢酸ブチルを含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
水不混和性溶媒が酢酸エチルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
水混和性溶媒が、水、アルコール類、ケトン類および誘電性非プロトン性溶媒を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
水混和性溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトンおよびアセトニトリルを含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
不活性固体が、珪藻土、砂、活性炭、シリカゲルおよびポリマー樹脂を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
不活性固体が珪藻土である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
不活性固体が活性炭である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
用いる塩基が有機塩基または無機塩基のいずれかである、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
用いる塩基が無機塩基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
塩基が重炭酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
用いる酸が有機酸または無機酸のいずれかである、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
用いる酸が無機酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
酸が塩酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
溶出を、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、石油エーテル、メタノールおよびジエチルエーテルまたはこれらの混合物を含む群から選択される有機溶媒を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
溶出を、アセトンを用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
結晶化を、エーテル類を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
結晶化を、ジエチルエーテルを用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２７】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ポリスチレン、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、ポリ（アクリレート）およびポリ（メタクリレート）を含む群から選択されるポリマー樹脂を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２８】
逆相クロマトグラフィーを、Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８結合シリカを含む群から選択される樹脂を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項２９】
疎水性相互作用または逆相クロマトグラフィーにおける溶出を、メタノール、アセトン、アセトニトリル、水、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびテトラヒドロフランまたはこれらの混合物を含む群から選択される溶媒を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項３０】
再結晶を、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ヘキサンおよびヘプタンを含む群から選択される有機溶媒を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項３１】
精製された生成物が、ラパマイシンの異性体形態のいずれか１種、即ち異性体Ａ、異性体Ｂまたは異性体Ｃである、請求項８に記載の方法。
【請求項３２】
精製された生成物が、ラパマイシンの異性体Ｂである、請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５０９３１７（Ｐ２０１０−５０９３１７Ａ）
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３５８８３（Ｐ２００９−５３５８８３）
【出願日】平成１８年１２月２６日（２００６．１２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００６／０００５０２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５６３７２
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０９１２９２２２）バイオコン リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】２０ｔｈ ＫＭ，Ｈｏｓｕｒ Ｒｏａｄ， Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｉｔｙ， Ｂａｎｇａｌｏｒｅ， Ｋａｒｎａｔａｋａ ５６０ １００ Ｉｎｄｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２６日（２００６．１２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００６／０００５０２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５６３７２
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０９１２９２２２）バイオコン リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】２０ｔｈ ＫＭ，Ｈｏｓｕｒ Ｒｏａｄ， Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｉｔｙ， Ｂａｎｇａｌｏｒｅ， Ｋａｒｎａｔａｋａ ５６０ １００ Ｉｎｄｉａ
【Ｆターム（参考）】
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