細胞の画像を格付けするための方法
本発明に記載されている方法は、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）の画像を分析するために使用される。画像は、マルチパラメータ・フローサイトメトリー、CellSpotter蛍光顕微鏡法画像法システム、およびCellTracks Analyzerを含めた多数のプラットフォームから取得される。これらの画像はその後、種々の性質に基づいて格付けされ、陽性のＣＴＣ事象である可能性が最も高いものから最も低いものへの順番でユーザーに提示される。格付け方法は、ＣＴＣにより決定されたときの悪性度のように、循環性レア細胞に基づいて疾病を診断し、モニターし、スクリーンするのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
Jan KeijおよびJohn Silvia
〔関連出願に対する相互参照〕
この出願は、本明細書中に参照により組み込まれ、一部で２００６年９月５日に出願された米国仮出願第６０／８４２，４０５号の優先権を主張する、本出願である。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、全般的に、画像分析に関する。循環性腫瘍細胞のような画像は、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法から得られ、それらの物理的な性質により格付けされる。
【０００３】
〔発明の背景〕
多くの臨床医は、癌が、その初期には器官が限局された疾病であると考えている。しかしながら、この意見は正しくないようであり、癌は多くの場合、現在利用可能である方法を用いてそれが最初に検出されるときまでには、全身性の疾病である。主要な癌は、臨床的な徴候の出現前の疾病の初期で、循環内への新生細胞の散布（shedding）を始めるという証拠がある。腫瘍の血管新生により、循環内へと散布された腫瘍細胞は、遠位の部位で付着し、コロニーを作り、転移を形成し得る。これらの循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、健康な人の細胞では普通は見付からないことから、特定の癌腫の診断および治療のための基準を形成するマーカーを含んでいる。したがって、循環内の腫瘍細胞の存在は、マンモグラフィのようなその他のテスト、またはＰＳＡの測定の代わりに、あるいはこれらと協同して、癌に対してスクリーンするために使用されることができる。標的細胞上もしくは標的細胞内の関連するマーカーに向けられている適正な単クローン抗体（mononclonal antibodies）を利用することにより、または細胞タンパク質発現に対するその他のアッセイを使用することにより、または細胞のｍＲＮＡの分析により、そのような細胞の器官起点、例えば、乳房、前立腺、大腸、肺、卵巣、またはその他の非造血性の癌（non-hematopoietic cancers）が容易に決定され得る。
【０００４】
このように、癌細胞が検出されることができる場合、腫瘍の臨床的なサインは本質的には無いが、それらの存在だけでなく、起点の器官をも同定することができるであろう。さらにまた、臨床的なデータに基づいて、癌は、潜在的に非常に有害な転移性の細胞の存在により特徴づけられることから結果的に処置される血液で運ばれる疾病（blood borne disease）と考えられなければならない。例えばその後の手術が続く、ＣＴＣの証拠を全く検出することができない場合には、放射線、ホルモン治療、または化学療法のような引き続きの治療が必要かどうか、さらなる臨床的な研究から決定することもでき得る。そのような治療、またはその効力についての患者の必要性を予測することは、そのような療法の出費を仮定すれば、臨床的な情報の有意で有益な一例である。循環における腫瘍細胞の数が、疾病の初めからその最終的な局面まで、疾病の進行の段階に関係することも明らかである。
【０００５】
悪性腫瘍は、それらの隣接する組織に侵入する能力により特徴づけられる。一般に、直径が１ｍｍの腫瘍は、血管新生化され、動物の研究は、腫瘍に存在する４％ほどの細胞が、２４時間の期間に循環内へと散布され得ることを示している（Butler, TP & Gullino PM, 1975 Cancer Research 35:512-516）。腫瘍の散布能力は、腫瘍の病原力に依存する可能性が高い。たとえ連続的な基準で、腫瘍細胞が循環内へと散布されても、遠位の転移を生じさせるであろう割合は、無いか、または僅かでしかないと考えられている（上方のButler & Gullino）。腫瘍の質量における増加は、循環性腫瘍細胞の頻度の増加に比例すると予想されていたかも知れない。このことが事実であることがわかったならば、高レベルの感度を有する利用可能な方法が、遠位に転移した患者だけでなく、疾病が局在化された患者における腫瘍の重みの評価を促進したであろう。疾病が局在化されている患者の抹消血における腫瘍細胞の検出は、より早い段階での腫瘍を検出するだけでなく、腫瘍の潜在的な感染度に関する指標をも提供する潜在能力を有する。
【０００６】
顕微鏡画像法による循環性腫瘍細胞の検出は、同様に、分類可能な腫瘍細胞における見せかけの減少、および妨害する染色可能な壊死組織片における対応する増加により不利な影響を受ける。したがって、血液の吸い出しと標本の処理との間に２４時間ほどの遅れがあるかも知れないことから、血液標本の完全性または品質を維持することは、最も重要なことである。そのような遅れが予想されるべきなのは、このアッセイのために血液を処理するのに使用される技術および設備が各検査室のすべてで容易に利用可能ではないかも知れないからである。サンプルがサンプル処理のための検査室に到着するのに必要な時間は、非常に多岐にわたり得る。したがって、サンプルが処理されることができる時間帯を確立することが重要である。ごく普通の血液学的分析では、血液サンプルは、２４時間以内に分析されることができる。しかしながら、珍しい血液細胞の分析はより重大な意味を持つので、血液サンプルが分析されることができる時間帯はより短くなる。
【０００７】
一例は、血液細胞の免疫表現型を特定すること（immunophenotyping）であり、これは、一般には、２４時間以内に実施されなければならない。癌細胞アッセイにおいて、より大きい容量の血液が処理されなければならず、また、ＣＴＣおよび造血性細胞の両方からの細胞を崩壊することにより放出される材料が、バックグランドを増加させ、したがって、腫瘍細胞を検出する能力を減少させるので、血液サンプルの分解は、より問題になってくることがある。非常に多くのＣＴＣが、腫瘍部位から連続的に散布されてくることがあり、定常状態のレベルが維持され、定常状態のレベルでは、ＣＴＣの破壊が、次々と腫瘍の負担のサイズに依存する散布速度と等しくなる（JG Morenoらの”Changes in Circulating Carcinoma Cells in Patients with Metastatic Prostate Cancer Correlates with Disease State.” Urology 58. 2001を参照のこと）。
【０００８】
一般的に、より耐性で増殖性のある細胞が、生存して、二次的な部位または転移性の部位を確立する。末梢の循環において、ＣＴＣは、活性化された好中球およびマクロファージによりインビボで（また、インビトロでも）さらに攻撃され、結果として進行的に、膜の貫通、電解質の漏出、分子が小さくなること、ならびに、細胞の生存のために必須な、ＤＮＡ、クロマチン等を含めた重大な意味を持つ細胞要素の損失へとつながる。細胞の消滅の臨界点では、細胞破壊がさらにアポトーシスにより補助される。アポトーシスは、細胞外の種、例えば細胞障害性の抗癌薬により引き起こされるか、または媒介される、壊死または急速な細胞の死とは異なる、一連の段階的な遅い細胞内の事象により特徴づけられる。これらの破壊性のプロセスの全てあるいはいくらかは、ＣＴＣを分解することからだけでなく、大抵の細胞障害性の薬剤はほとんど有毒になる用量で投与されるので、薬物療法の間の正常な造血性の細胞の意図的ではない破壊からも、染色可能なＤＮＡ、ＤＮＡ断片、および「ＤＮＡはしご（DNA ladder）」構造を含めた壊死組織片および／または凝集塊の形成を引き起こし得る。
【０００９】
この特定の技術分野において、血液から腫瘍細胞を回収するための種々の方法が知られている。AmCellおよびMiltenyiに対する米国特許第６，１９０，８７０号は、フローサイトメトリー数え上げ（flow cytometric enumeration）が続く、免疫磁気的単離（immunomagnetic isolation）を教示している。しかしながら、免疫磁気的分離の前に、血液サンプルは、密度勾配を用いて予備処理される。サンプルの視覚的な分析もまた、行われない。
【００１０】
Immunivestに対する米国特許第６，３６５，３６２号において、血液中の腫瘍細胞について免疫磁気的に濃縮し、分析する方法が記述されている。この方法は詳細には、無傷の細胞を分析することに向けられており、ここでは、細胞の数が疾病の状態に相関する。単離された細胞は、核酸、およびさらなるマーカーの存在について標識され、このことが、分析の間の標的ではないサンプル成分の排除を可能にする。
【００１１】
それらの起点の組織における上皮細胞は、確立された成長および発達の「ルール」に従う。これらのルールは、個体群の制御を含む。これは、正常な環境下では、細胞の数およびサイズが一定のままであり、生物体の正常な成長および発達にとって必要な場合にのみ変化することを意味する。上皮または不死の細胞の基底細胞のみが分裂するであろう、そして、基底細胞は上皮がその機能を実行する必要がある場合にその分裂をなすであろうが、何にせよこれは上皮の性質および場所に依存している。ある異常だが良性の環境下では、細胞は増殖するであろう、そして、基底層は通常よりも分裂し、増殖を引き起こすであろう。その他のある異常だが良性の環境下では、細胞は、各自の組織にとって正常であるものを超えてサイズが増大し、葉酸が欠乏したときのように、細胞の巨大化傾向を引き起す。
【００１２】
上皮組織は、悪性になる前の病変、または悪性の病変が原因でも、細胞のサイズまたは数が増大することがある。これらの場合には、上述したのと同じ変化が、穏やかな軽度の上皮内の病変から重篤な悪性度までにわたる細胞核の異常を伴う。これらの細胞における変化は、上皮の厚さの部分に影響することがあり、それらの重症度が増すにしたがって、ますます厚くなるそのような上皮の部分を含むことになるであろう。これらの細胞は、接触抑制の制限に従わず、組織の制御なしで成長を続ける。上皮の全体の厚さが、悪性の変化による影響を受ける場合には、この状態が生体内原位置の癌腫（ＣＩＳ）と認識される。
【００１３】
悪性の細胞は、それらの悪性の潜在能力が増加するにつれて、最終的には、基底膜を通過し、器官の間質に侵入することができるようになる。間質に侵入した後で、これらの細胞は、血管に到達するための潜在能力を有するものと考えられる。ひとたびそれらが血管に浸潤すると、悪性の細胞は、それらが始まった環境とは全く異なる環境で適所を見つける。
【００１４】
細胞は、単細胞として、あるいは２つまたはそれ以上の細胞の凝集塊として血管に浸潤し得る。循環系の中を循環する上皮性起点の単細胞は、２つの結果のうちの一方を有することになる。これは、死ぬかも知れないし、あるいは生存するかも知れない。
【００１５】
〔発明の簡単な説明〕
本発明において記述されている方法は、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）の画像を分析するために使用される。画像は、マルチパラメータ・フローサイトメトリー、CellSpotter蛍光顕微鏡法画像法システム、およびCellTracks Analyzerを含めた、多数のプラットフォームから取得され得る。これらの画像は、その後、種々の性質に基づいて格付けされ、陽性ＣＴＣ事象の可能性が最も高いものから最も低いものへの順番でユーザーに提示される。本明細書には、ＣＴＣにより決定されたときの悪性度を含めた循環性レア細胞に基づく疾病を診断し、モニターし、スクリーンする方法が記述されている。
【００１６】
〔発明の詳細な説明〕
本明細書では、当業者によく理解されている種々の用語が使用される。これらの用語の意図されている意味は、容認されている意味からそれることはない。
【００１７】
用語「生物学的な標本」または「生物学的なサンプル」は交換可能に使用されてもよく、興味の対象である細胞を含有しているのではないかと思われる、また、分析されるべきであるヒト被検者から得られた液体または組織の小部分をさす。生物学的標本は、流体の部分、細胞の部分、および可溶性の材料を含有する部分をさす。生物学的な標本または生物学的なサンプルは、身体の液体に限定するものではなく、末梢血、組織ホモジネート、乳頭吸引液、結腸洗浄液、痰、気管支洗浄液、およびヒト被検者から得られることができる細胞のいかなるその他の源をも含む。例示的な組織ホモジネートは、乳癌患者における前哨節から得られてもよい。
【００１８】
用語「レア細胞（rare cells）」は、本明細書中では、生物学的な標本に普通は存在しないが、感染性の疾病、慢性の疾病、傷害、または妊娠のような正常でない状態の指標として存在し得る細胞として定義されている。レア細胞は、生物学的な標本において普通に存在することもあるが、正常な生物学的な標本に典型的に存在する細胞よりも数オーダー分だけ少ない頻度で存在する細胞をもさす。
【００１９】
用語「決定因子」は、前述した標的の生体実体（bioentities）のいずれかに関して使用されている場合には、しばしば免疫反応を誘発する高分子の抗原に存在する化学的モザイクのことを広くさす。決定因子は、「エピトープ」と交換可能に使用されてもよい。「生体特異的なリガンド（biospecific ligand）」または「生体特異的な試薬」は、本明細書中において交換可能に使用され、決定因子を特異的に結合し得る。決定因子は、特異的結合物質（例えば、リガンドまたは試薬）に選択的に結合することに関与し、その原因となる標的の生体実体の部分をさし、選択的な結合を起こすためにはこの部分が存在することが必要である。基本的な用語において、決定因子は、結合親和力を有する、従って特異的結合対反応における薬剤、リガンド、および／または試薬によって認められる標的の生体実体上の分子接触領域である。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「特異的結合対（specific binding pair）」は、抗原−抗体、レセプター−ホルモン、レセプター−リガンド、アゴニスト−拮抗物質、レクチン−炭水化物、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ハイブリッド形成配列、ＦｃレセプターまたはマウスＩｇＧ−タンパク質Ａ、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、およびウイルス−レセプターの相互作用を含む。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「検出可能に標識する」は、直接的または間接的のいずれかの、物理的手段または化学的手段による検出または測定が、テストサンプル中の標的の生体実体の存在を示しているあらゆる物質をさす。有用な検出可能な標識の代表的な例は、限定されるものではないが下記のものを含む。すなわち、光吸収、蛍光、反射率、光散乱、リン光、もしくは発光の性質に基づいて検出可能な分子またはイオン；放射性の性質により検出可能な分子またはイオン；細胞核の磁気共鳴もしくは常磁性の性質により検出可能な分子またはイオンである。光吸収または蛍光に基づいて間接的に検出可能な分子の群の中に含まれるのは、例えば、（例えば、光非吸収性分子から光吸収性分子へと、あるいは、非蛍光分子から蛍光分子へと）適正な物質を転化させる種々の酵素である。分析は、マルチパラメータ・フローサイトメトリー免疫蛍光顕微鏡法、レーザースキャニング血球計算法、明視野に基づく画像分析、キャピラリィ容積測定、スペクトル画像法分析、手動の細胞分析、CellSpotter分析、CellTrack分析、および自動化された細胞分析を含めた、一般に使用される多数のプラットフォームの中のいずれかを使用して実行されることができる。
【００２２】
句「〜の実質的な排除のために（to the substantial exclusion of）」は、生体特異的なリガンドまたは生体特異的な試薬とその対応する標的の決定因子との間の結合反応の特異性をさす。生体特異的なリガンドおよび試薬は、それらの標的の決定因子に対する特異的な結合活性は有しているが、その他のサンプル成分に対して低レベルの非特異的な結合を示してもよい。
【００２３】
句「初期の癌」は、本明細書中では「ステージＩ」または「ステージII」の癌と交換可能に使用され、器官が限局されると臨床的に決定されたそれらの癌をさす。乳癌患者に対するマンモグラフィ、または肺癌患者に対するＸ線のような従来の方法により検出されるには小さすぎる腫瘍もまた、含まれる。マンモグラフィは、ほぼ２ｘ１０８細胞を有する腫瘍を検出することができるが、本発明の方法は、ほぼこのサイズまたはそれよりも小さい腫瘍から循環性癌細胞の検出を可能にするであろう。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「形態学的分析」は、サイズ、形状、またはある特色がある／無いといった対象に対する視覚的に観察可能な特徴をさす。形態学的な特色を視覚化するために、対象は典型的には非特異的に染色される。本明細書中で使用される用語「エピトープ分析（epitopical analysis）」は、あるエピトープについて標識された対象上でなされる観察をさす。エピトープの特色を視覚化するために、対象は典型的には特異的に染色されるか、または標識される。形態学的分析は、対象のより完全な分析を提供するために、エピトープ分析と組み合わされてもよい。
【００２５】
サンプルが分析されるとき、確信をもってサンプルの評価を行うために、再考するための多数の画像が存在することがある。現在は、全ての事象の画像が再考者に提示される。これらの事象の順番は、サンプル容器におけるそれらの場所により単純に決定され、例えば、第１の画像は取得の開始時のものであり、最後の画像は取得の最後からのものである。確信的な決定をするために、各画像は、その他と独立して再考されなければならない。興味の対象である事象はレア標的細胞なので、それらの場所は、サンプル容器の中で無作為に生じ、引き続いて再考の中でも無作為に生じるであろう。したがって、興味の対象である全てのまれな事象を同定することは、全サンプルを再考することを必要とする場合がある。
【００２６】
診断を行うことにおいて、陽性の事象の総数が、最も重要な結果である。癌のような疾病において、より大きな数の陽性の事象が、疾病の重症度を決定する。陽性の事象の数についての確立された閾値がある場合には、実数値は、サンプルがこの閾値を超えているかどうかを決定するほどには重要ではない場合がある。言い換えれば、サンプルが多くの陽性の事象を有しており、閾値を超えている場合には、このサンプルは、個々の全ての事象を再考することなく、陽性とみなされることができる。
【００２７】
本発明は、特定の事象を同定するために、確立された判断基準に合致する可能性が最も高いものから可能性が最も低いものへの順番で結果を示すことにより再考者を援助する。より確かな候補が再考の開始時に示されているときには、再考により、サンプルが閾値を超えているかどうかをより早く決定することができる。さらにまた、この方法を使用すると、スコアが提供され、このスコアを上回る事象は陽性の事象である可能性が最も高く、これが下回る場合にはその可能性が最も高くはない。
【００２８】
画像を分析するために、再考者は、サイズ、形状、および画像における対象の強度のような判断基準を使用する。事象が陽性であるかどうかを決定するために、再考者は、対照の比較可能なサイズ、および与えられた事象についての画像の重複度の量のような判断基準を使用する。ＣＴＣを同定する場合には、細胞は円形または長円形であろう。核の画像は、細胞質の画像よりも小さくなければならない。核はまた、細胞質に見えるように囲まれていなければならない。画像の強度もまた、決定を行うことにおいて重要である。
【００２９】
本発明は、単純な組の判断基準に基づいてＣＴＣ事象を格付けする。第１に、本発明は、サイトケラチン陽性事象を同定する。次に、与えられたサイトケラチン事象について、核酸事象との重複度の量を測定する。これらの画像が適当に重複しているならば、事象が白血球として陽性か、または陰性かを決定する。各事象が、この組の判断基準を通ると、最も可能性の高いＣＴＣ候補事象が最後により高いスコアとなり、分析の間、再考者にそれらの格付けスコアに基づいて画像が提示される。
【００３０】
例１：CellTracks Analyzer画像格付け
CellTracks Analyzerを用いて分析したサンプルを、サイトケラチン−ＰＥ、ＤＡＰＩ、およびＣＤ４５−ＡＰＣで染色する。ＣＴＣサンプルについて、細胞についての判断基準も満たす、フィコエリトリン（ＰＥ）陽性で、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（4',6-Diamidino-2-phenylindol）（ＤＡＰＩ）陽性で、アロフィコシアニン（allophycocyanin）（ＡＰＣ）陰性の事象を、腫瘍細胞として数える。ＰＥ陰性で、ＡＰＣ陽性の事象を、白血球として数える。しかしながら、ＰＥ陽性で、ＡＰＣ陽性の事象の例もある。これらは、二重陽性事象として数えられる。
【００３１】
サイトケラチン−ＰＥ画像について、本発明は、染色強度輪郭を分析する。これらの画像に現れる対象の強度は、明りょうでない（noisy）場合がある。サイトケラチン染色は、明らかに陽性の細胞において、非常に均一である。典型的な細胞の場合には、画像において示されるある量のノイズがある。このノイズは、本発明ではkuanフィルタリングを使用して除去される。このことは、バックグラウンドと比較して均一には輝かない対象を見つけるために必要とされる。フィルタリングはまた、一箇所で近接している個々の対象を、各対象の境界を見つけることにより、システムに同定させることにもつながる。
【００３２】
ＤＡＰＩは、核酸を標識するのに使用される。ＤＡＰＩ画像は、分析され、強度プロフィールに基づいてセグメントに単離される。過度のセグメント分けの場合を防ぐために、閾値をセットする。ここでは、単一の対象が、１個以上の別個のセグメントとして表される。しかしながら、核酸染色は、サイトケラチン染色よりもより予測可能であることから、別個の対象を区別するために必要なフィルタリングはより少ない。
【００３３】
ひとたびこれらの対象が同定されると、これら対象には、サイトケラチン−ＰＥおよびＤＡＰＩの両方について、それらの強度に基づいてスコアがつけられる。より高い強度の対象は、より高いスコアが与えられる。その後、対象は、２つの画像の重複度に基づいて分析される。核酸は、サイトケラチンの境界域内に現れるであろう。より高い画分の重複度を有する対象は、より高いスコアが与えられる。図１に示されているように、ＤＡＰＩ対象は、サイトケラチン内によく一致しており、陽性のＣＴＣ事象である。
【００３４】
サンプルもまた、ＣＤ４５−ＡＰＣで染色される。これは、白血球を染色するために使用され、標的ではない事象を同定する。ＡＰＣについて陽性の対象は、ＣＴＣのものとはみなされないであろう。しかしながら、二重陽性の事象として知られているＰＥおよびＡＰＣについて陽性である小さい個体群の事象がある。したがって、判断基準としてＡＰＣ陽性または陰性をただ使用する代わりに、ＡＰＣとＰＥとの比が、ＣＴＣおよび白血球から二重陽性の事象を分別するために使用される。これらの事象は、この比に基づいてスコアが付けられ、これにより、ＣＴＣの可能性があるもの（likely CTC's）に、白血球の可能性があるものよりも高いスコアが与えられる。図２および図３において、ＣＴＣ（ＤＡＰＩ陽性およびＰＥ陽性）は、白血球と共に見られることができる（ＡＰＣ陽性およびＤＡＰＩ陽性）。
【００３５】
上述のプロセスを通してひとたび各対象が分析されると、画像が、それらのスコアの順番で再考者に提示される。結果は、ＣＴＣの可能性が高い事象が、画像の組の始めに現れ、より可能性が低い対象は、組の中のさらに遠くに現れる。
【００３６】
本発明の組成物、方法、およびキットを用いて検出され得る異なる種類の癌の例は、アプドーマ（apudoma）、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン−ピアス（Brown-Pearce）、腺管、エールリッヒ腫瘍（Ehrlich tumor）、生体内原位置（in situ）、クレブズ２（Krebs 2）、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺（non-small cell lung）、燕麦細胞、乳頭状、硬性癌、細気管支、気管支原生、扁平上皮細胞、および移行細胞）、細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞の腫瘍、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、間葉細胞腫、原腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、トロホブラスト腫（throphoblastic tumor）、腺癌、アデノーマ、胆管癌、胆脂腫、円柱腫、粘液性嚢胞性癌（cystadenocarcinoma）、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、ギナンドロブラストーマ（gynandroblastoma）、肝腫、汗腺腫（hidradenoma）、島細胞の腫瘍、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞の腫瘍、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、神経細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性旁神経節腫（paraganglioma nonchromaffin）、アンチオケラトーマ（antiokeratoma）、硬化性の血管腫（angioma sclerosing）、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫（lymphangiomyoma）、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌腫、横紋筋肉腫、肉腫（カポジの、および肥満細胞）、新生物（例えば、骨、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭部および頚部、中枢神経系、聴覚、骨盤、気道、および泌尿生殖器）、神経線維腫症、および子宮頚部形成異常を含む。
【００３７】
しかしながら、本発明は、循環性上皮細胞のみの検出に限定されるものではない。例えば、内皮細胞は、心筋梗塞を有する患者の血液中で観察されてきた。内皮細胞、心筋細胞、およびウイルスに感染した細胞は、上皮細胞のように、利用可能な単クローン抗体により認識された細胞の種類の特異的な決定因子を有する。したがって、本発明の方法は、循環性内皮細胞を検出するのに順応してもよい。加えて、本発明は、感染性の疾病の患者の末梢血に負荷された細菌性の細胞の検出を可能にし、この患者は、本発明の組成物、方法、およびキットを用いて評価されてもよい。これらのレア細胞が、本明細書中に上述されているものと同様の状態で存在する場合には、循環おいて同様に挙動するであろうと予想することは理にかなっているであろう。
【００３８】
本明細書中に開示されている発明の好ましい実施形態は、本発明が、癌診断の追加する分野および適用で利用されることを可能にするとも考えられている。本発明の改良された診断モードが、好ましい実施形態の前述の説明により限定されるものではないことは、当業者に明らかであろう。最後に、上述で示されたある実施形態は、詳細な説明を提供するが、次の請求項は、詳細な説明による範囲に限定されるものではない。事実、種々の改変例が、次の請求項の精神から逸脱することなく、なされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】陽性ＣＴＣ事象の画像を示す。
【図２】同じフレーム中の白血球と共に陽性ＣＴＣ事象の画像を示す。
【図３】同じフレーム中の複数の白血球と共に陽性ＣＴＣ事象の画像を示す。
【開示の内容】
【０００１】
Jan KeijおよびJohn Silvia
〔関連出願に対する相互参照〕
この出願は、本明細書中に参照により組み込まれ、一部で２００６年９月５日に出願された米国仮出願第６０／８４２，４０５号の優先権を主張する、本出願である。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、全般的に、画像分析に関する。循環性腫瘍細胞のような画像は、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法から得られ、それらの物理的な性質により格付けされる。
【０００３】
〔発明の背景〕
多くの臨床医は、癌が、その初期には器官が限局された疾病であると考えている。しかしながら、この意見は正しくないようであり、癌は多くの場合、現在利用可能である方法を用いてそれが最初に検出されるときまでには、全身性の疾病である。主要な癌は、臨床的な徴候の出現前の疾病の初期で、循環内への新生細胞の散布（shedding）を始めるという証拠がある。腫瘍の血管新生により、循環内へと散布された腫瘍細胞は、遠位の部位で付着し、コロニーを作り、転移を形成し得る。これらの循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、健康な人の細胞では普通は見付からないことから、特定の癌腫の診断および治療のための基準を形成するマーカーを含んでいる。したがって、循環内の腫瘍細胞の存在は、マンモグラフィのようなその他のテスト、またはＰＳＡの測定の代わりに、あるいはこれらと協同して、癌に対してスクリーンするために使用されることができる。標的細胞上もしくは標的細胞内の関連するマーカーに向けられている適正な単クローン抗体（mononclonal antibodies）を利用することにより、または細胞タンパク質発現に対するその他のアッセイを使用することにより、または細胞のｍＲＮＡの分析により、そのような細胞の器官起点、例えば、乳房、前立腺、大腸、肺、卵巣、またはその他の非造血性の癌（non-hematopoietic cancers）が容易に決定され得る。
【０００４】
このように、癌細胞が検出されることができる場合、腫瘍の臨床的なサインは本質的には無いが、それらの存在だけでなく、起点の器官をも同定することができるであろう。さらにまた、臨床的なデータに基づいて、癌は、潜在的に非常に有害な転移性の細胞の存在により特徴づけられることから結果的に処置される血液で運ばれる疾病（blood borne disease）と考えられなければならない。例えばその後の手術が続く、ＣＴＣの証拠を全く検出することができない場合には、放射線、ホルモン治療、または化学療法のような引き続きの治療が必要かどうか、さらなる臨床的な研究から決定することもでき得る。そのような治療、またはその効力についての患者の必要性を予測することは、そのような療法の出費を仮定すれば、臨床的な情報の有意で有益な一例である。循環における腫瘍細胞の数が、疾病の初めからその最終的な局面まで、疾病の進行の段階に関係することも明らかである。
【０００５】
悪性腫瘍は、それらの隣接する組織に侵入する能力により特徴づけられる。一般に、直径が１ｍｍの腫瘍は、血管新生化され、動物の研究は、腫瘍に存在する４％ほどの細胞が、２４時間の期間に循環内へと散布され得ることを示している（Butler, TP & Gullino PM, 1975 Cancer Research 35:512-516）。腫瘍の散布能力は、腫瘍の病原力に依存する可能性が高い。たとえ連続的な基準で、腫瘍細胞が循環内へと散布されても、遠位の転移を生じさせるであろう割合は、無いか、または僅かでしかないと考えられている（上方のButler & Gullino）。腫瘍の質量における増加は、循環性腫瘍細胞の頻度の増加に比例すると予想されていたかも知れない。このことが事実であることがわかったならば、高レベルの感度を有する利用可能な方法が、遠位に転移した患者だけでなく、疾病が局在化された患者における腫瘍の重みの評価を促進したであろう。疾病が局在化されている患者の抹消血における腫瘍細胞の検出は、より早い段階での腫瘍を検出するだけでなく、腫瘍の潜在的な感染度に関する指標をも提供する潜在能力を有する。
【０００６】
顕微鏡画像法による循環性腫瘍細胞の検出は、同様に、分類可能な腫瘍細胞における見せかけの減少、および妨害する染色可能な壊死組織片における対応する増加により不利な影響を受ける。したがって、血液の吸い出しと標本の処理との間に２４時間ほどの遅れがあるかも知れないことから、血液標本の完全性または品質を維持することは、最も重要なことである。そのような遅れが予想されるべきなのは、このアッセイのために血液を処理するのに使用される技術および設備が各検査室のすべてで容易に利用可能ではないかも知れないからである。サンプルがサンプル処理のための検査室に到着するのに必要な時間は、非常に多岐にわたり得る。したがって、サンプルが処理されることができる時間帯を確立することが重要である。ごく普通の血液学的分析では、血液サンプルは、２４時間以内に分析されることができる。しかしながら、珍しい血液細胞の分析はより重大な意味を持つので、血液サンプルが分析されることができる時間帯はより短くなる。
【０００７】
一例は、血液細胞の免疫表現型を特定すること（immunophenotyping）であり、これは、一般には、２４時間以内に実施されなければならない。癌細胞アッセイにおいて、より大きい容量の血液が処理されなければならず、また、ＣＴＣおよび造血性細胞の両方からの細胞を崩壊することにより放出される材料が、バックグランドを増加させ、したがって、腫瘍細胞を検出する能力を減少させるので、血液サンプルの分解は、より問題になってくることがある。非常に多くのＣＴＣが、腫瘍部位から連続的に散布されてくることがあり、定常状態のレベルが維持され、定常状態のレベルでは、ＣＴＣの破壊が、次々と腫瘍の負担のサイズに依存する散布速度と等しくなる（JG Morenoらの”Changes in Circulating Carcinoma Cells in Patients with Metastatic Prostate Cancer Correlates with Disease State.” Urology 58. 2001を参照のこと）。
【０００８】
一般的に、より耐性で増殖性のある細胞が、生存して、二次的な部位または転移性の部位を確立する。末梢の循環において、ＣＴＣは、活性化された好中球およびマクロファージによりインビボで（また、インビトロでも）さらに攻撃され、結果として進行的に、膜の貫通、電解質の漏出、分子が小さくなること、ならびに、細胞の生存のために必須な、ＤＮＡ、クロマチン等を含めた重大な意味を持つ細胞要素の損失へとつながる。細胞の消滅の臨界点では、細胞破壊がさらにアポトーシスにより補助される。アポトーシスは、細胞外の種、例えば細胞障害性の抗癌薬により引き起こされるか、または媒介される、壊死または急速な細胞の死とは異なる、一連の段階的な遅い細胞内の事象により特徴づけられる。これらの破壊性のプロセスの全てあるいはいくらかは、ＣＴＣを分解することからだけでなく、大抵の細胞障害性の薬剤はほとんど有毒になる用量で投与されるので、薬物療法の間の正常な造血性の細胞の意図的ではない破壊からも、染色可能なＤＮＡ、ＤＮＡ断片、および「ＤＮＡはしご（DNA ladder）」構造を含めた壊死組織片および／または凝集塊の形成を引き起こし得る。
【０００９】
この特定の技術分野において、血液から腫瘍細胞を回収するための種々の方法が知られている。AmCellおよびMiltenyiに対する米国特許第６，１９０，８７０号は、フローサイトメトリー数え上げ（flow cytometric enumeration）が続く、免疫磁気的単離（immunomagnetic isolation）を教示している。しかしながら、免疫磁気的分離の前に、血液サンプルは、密度勾配を用いて予備処理される。サンプルの視覚的な分析もまた、行われない。
【００１０】
Immunivestに対する米国特許第６，３６５，３６２号において、血液中の腫瘍細胞について免疫磁気的に濃縮し、分析する方法が記述されている。この方法は詳細には、無傷の細胞を分析することに向けられており、ここでは、細胞の数が疾病の状態に相関する。単離された細胞は、核酸、およびさらなるマーカーの存在について標識され、このことが、分析の間の標的ではないサンプル成分の排除を可能にする。
【００１１】
それらの起点の組織における上皮細胞は、確立された成長および発達の「ルール」に従う。これらのルールは、個体群の制御を含む。これは、正常な環境下では、細胞の数およびサイズが一定のままであり、生物体の正常な成長および発達にとって必要な場合にのみ変化することを意味する。上皮または不死の細胞の基底細胞のみが分裂するであろう、そして、基底細胞は上皮がその機能を実行する必要がある場合にその分裂をなすであろうが、何にせよこれは上皮の性質および場所に依存している。ある異常だが良性の環境下では、細胞は増殖するであろう、そして、基底層は通常よりも分裂し、増殖を引き起こすであろう。その他のある異常だが良性の環境下では、細胞は、各自の組織にとって正常であるものを超えてサイズが増大し、葉酸が欠乏したときのように、細胞の巨大化傾向を引き起す。
【００１２】
上皮組織は、悪性になる前の病変、または悪性の病変が原因でも、細胞のサイズまたは数が増大することがある。これらの場合には、上述したのと同じ変化が、穏やかな軽度の上皮内の病変から重篤な悪性度までにわたる細胞核の異常を伴う。これらの細胞における変化は、上皮の厚さの部分に影響することがあり、それらの重症度が増すにしたがって、ますます厚くなるそのような上皮の部分を含むことになるであろう。これらの細胞は、接触抑制の制限に従わず、組織の制御なしで成長を続ける。上皮の全体の厚さが、悪性の変化による影響を受ける場合には、この状態が生体内原位置の癌腫（ＣＩＳ）と認識される。
【００１３】
悪性の細胞は、それらの悪性の潜在能力が増加するにつれて、最終的には、基底膜を通過し、器官の間質に侵入することができるようになる。間質に侵入した後で、これらの細胞は、血管に到達するための潜在能力を有するものと考えられる。ひとたびそれらが血管に浸潤すると、悪性の細胞は、それらが始まった環境とは全く異なる環境で適所を見つける。
【００１４】
細胞は、単細胞として、あるいは２つまたはそれ以上の細胞の凝集塊として血管に浸潤し得る。循環系の中を循環する上皮性起点の単細胞は、２つの結果のうちの一方を有することになる。これは、死ぬかも知れないし、あるいは生存するかも知れない。
【００１５】
〔発明の簡単な説明〕
本発明において記述されている方法は、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）の画像を分析するために使用される。画像は、マルチパラメータ・フローサイトメトリー、CellSpotter蛍光顕微鏡法画像法システム、およびCellTracks Analyzerを含めた、多数のプラットフォームから取得され得る。これらの画像は、その後、種々の性質に基づいて格付けされ、陽性ＣＴＣ事象の可能性が最も高いものから最も低いものへの順番でユーザーに提示される。本明細書には、ＣＴＣにより決定されたときの悪性度を含めた循環性レア細胞に基づく疾病を診断し、モニターし、スクリーンする方法が記述されている。
【００１６】
〔発明の詳細な説明〕
本明細書では、当業者によく理解されている種々の用語が使用される。これらの用語の意図されている意味は、容認されている意味からそれることはない。
【００１７】
用語「生物学的な標本」または「生物学的なサンプル」は交換可能に使用されてもよく、興味の対象である細胞を含有しているのではないかと思われる、また、分析されるべきであるヒト被検者から得られた液体または組織の小部分をさす。生物学的標本は、流体の部分、細胞の部分、および可溶性の材料を含有する部分をさす。生物学的な標本または生物学的なサンプルは、身体の液体に限定するものではなく、末梢血、組織ホモジネート、乳頭吸引液、結腸洗浄液、痰、気管支洗浄液、およびヒト被検者から得られることができる細胞のいかなるその他の源をも含む。例示的な組織ホモジネートは、乳癌患者における前哨節から得られてもよい。
【００１８】
用語「レア細胞（rare cells）」は、本明細書中では、生物学的な標本に普通は存在しないが、感染性の疾病、慢性の疾病、傷害、または妊娠のような正常でない状態の指標として存在し得る細胞として定義されている。レア細胞は、生物学的な標本において普通に存在することもあるが、正常な生物学的な標本に典型的に存在する細胞よりも数オーダー分だけ少ない頻度で存在する細胞をもさす。
【００１９】
用語「決定因子」は、前述した標的の生体実体（bioentities）のいずれかに関して使用されている場合には、しばしば免疫反応を誘発する高分子の抗原に存在する化学的モザイクのことを広くさす。決定因子は、「エピトープ」と交換可能に使用されてもよい。「生体特異的なリガンド（biospecific ligand）」または「生体特異的な試薬」は、本明細書中において交換可能に使用され、決定因子を特異的に結合し得る。決定因子は、特異的結合物質（例えば、リガンドまたは試薬）に選択的に結合することに関与し、その原因となる標的の生体実体の部分をさし、選択的な結合を起こすためにはこの部分が存在することが必要である。基本的な用語において、決定因子は、結合親和力を有する、従って特異的結合対反応における薬剤、リガンド、および／または試薬によって認められる標的の生体実体上の分子接触領域である。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「特異的結合対（specific binding pair）」は、抗原−抗体、レセプター−ホルモン、レセプター−リガンド、アゴニスト−拮抗物質、レクチン−炭水化物、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ハイブリッド形成配列、ＦｃレセプターまたはマウスＩｇＧ−タンパク質Ａ、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、およびウイルス−レセプターの相互作用を含む。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「検出可能に標識する」は、直接的または間接的のいずれかの、物理的手段または化学的手段による検出または測定が、テストサンプル中の標的の生体実体の存在を示しているあらゆる物質をさす。有用な検出可能な標識の代表的な例は、限定されるものではないが下記のものを含む。すなわち、光吸収、蛍光、反射率、光散乱、リン光、もしくは発光の性質に基づいて検出可能な分子またはイオン；放射性の性質により検出可能な分子またはイオン；細胞核の磁気共鳴もしくは常磁性の性質により検出可能な分子またはイオンである。光吸収または蛍光に基づいて間接的に検出可能な分子の群の中に含まれるのは、例えば、（例えば、光非吸収性分子から光吸収性分子へと、あるいは、非蛍光分子から蛍光分子へと）適正な物質を転化させる種々の酵素である。分析は、マルチパラメータ・フローサイトメトリー免疫蛍光顕微鏡法、レーザースキャニング血球計算法、明視野に基づく画像分析、キャピラリィ容積測定、スペクトル画像法分析、手動の細胞分析、CellSpotter分析、CellTrack分析、および自動化された細胞分析を含めた、一般に使用される多数のプラットフォームの中のいずれかを使用して実行されることができる。
【００２２】
句「〜の実質的な排除のために（to the substantial exclusion of）」は、生体特異的なリガンドまたは生体特異的な試薬とその対応する標的の決定因子との間の結合反応の特異性をさす。生体特異的なリガンドおよび試薬は、それらの標的の決定因子に対する特異的な結合活性は有しているが、その他のサンプル成分に対して低レベルの非特異的な結合を示してもよい。
【００２３】
句「初期の癌」は、本明細書中では「ステージＩ」または「ステージII」の癌と交換可能に使用され、器官が限局されると臨床的に決定されたそれらの癌をさす。乳癌患者に対するマンモグラフィ、または肺癌患者に対するＸ線のような従来の方法により検出されるには小さすぎる腫瘍もまた、含まれる。マンモグラフィは、ほぼ２ｘ１０８細胞を有する腫瘍を検出することができるが、本発明の方法は、ほぼこのサイズまたはそれよりも小さい腫瘍から循環性癌細胞の検出を可能にするであろう。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「形態学的分析」は、サイズ、形状、またはある特色がある／無いといった対象に対する視覚的に観察可能な特徴をさす。形態学的な特色を視覚化するために、対象は典型的には非特異的に染色される。本明細書中で使用される用語「エピトープ分析（epitopical analysis）」は、あるエピトープについて標識された対象上でなされる観察をさす。エピトープの特色を視覚化するために、対象は典型的には特異的に染色されるか、または標識される。形態学的分析は、対象のより完全な分析を提供するために、エピトープ分析と組み合わされてもよい。
【００２５】
サンプルが分析されるとき、確信をもってサンプルの評価を行うために、再考するための多数の画像が存在することがある。現在は、全ての事象の画像が再考者に提示される。これらの事象の順番は、サンプル容器におけるそれらの場所により単純に決定され、例えば、第１の画像は取得の開始時のものであり、最後の画像は取得の最後からのものである。確信的な決定をするために、各画像は、その他と独立して再考されなければならない。興味の対象である事象はレア標的細胞なので、それらの場所は、サンプル容器の中で無作為に生じ、引き続いて再考の中でも無作為に生じるであろう。したがって、興味の対象である全てのまれな事象を同定することは、全サンプルを再考することを必要とする場合がある。
【００２６】
診断を行うことにおいて、陽性の事象の総数が、最も重要な結果である。癌のような疾病において、より大きな数の陽性の事象が、疾病の重症度を決定する。陽性の事象の数についての確立された閾値がある場合には、実数値は、サンプルがこの閾値を超えているかどうかを決定するほどには重要ではない場合がある。言い換えれば、サンプルが多くの陽性の事象を有しており、閾値を超えている場合には、このサンプルは、個々の全ての事象を再考することなく、陽性とみなされることができる。
【００２７】
本発明は、特定の事象を同定するために、確立された判断基準に合致する可能性が最も高いものから可能性が最も低いものへの順番で結果を示すことにより再考者を援助する。より確かな候補が再考の開始時に示されているときには、再考により、サンプルが閾値を超えているかどうかをより早く決定することができる。さらにまた、この方法を使用すると、スコアが提供され、このスコアを上回る事象は陽性の事象である可能性が最も高く、これが下回る場合にはその可能性が最も高くはない。
【００２８】
画像を分析するために、再考者は、サイズ、形状、および画像における対象の強度のような判断基準を使用する。事象が陽性であるかどうかを決定するために、再考者は、対照の比較可能なサイズ、および与えられた事象についての画像の重複度の量のような判断基準を使用する。ＣＴＣを同定する場合には、細胞は円形または長円形であろう。核の画像は、細胞質の画像よりも小さくなければならない。核はまた、細胞質に見えるように囲まれていなければならない。画像の強度もまた、決定を行うことにおいて重要である。
【００２９】
本発明は、単純な組の判断基準に基づいてＣＴＣ事象を格付けする。第１に、本発明は、サイトケラチン陽性事象を同定する。次に、与えられたサイトケラチン事象について、核酸事象との重複度の量を測定する。これらの画像が適当に重複しているならば、事象が白血球として陽性か、または陰性かを決定する。各事象が、この組の判断基準を通ると、最も可能性の高いＣＴＣ候補事象が最後により高いスコアとなり、分析の間、再考者にそれらの格付けスコアに基づいて画像が提示される。
【００３０】
例１：CellTracks Analyzer画像格付け
CellTracks Analyzerを用いて分析したサンプルを、サイトケラチン−ＰＥ、ＤＡＰＩ、およびＣＤ４５−ＡＰＣで染色する。ＣＴＣサンプルについて、細胞についての判断基準も満たす、フィコエリトリン（ＰＥ）陽性で、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（4',6-Diamidino-2-phenylindol）（ＤＡＰＩ）陽性で、アロフィコシアニン（allophycocyanin）（ＡＰＣ）陰性の事象を、腫瘍細胞として数える。ＰＥ陰性で、ＡＰＣ陽性の事象を、白血球として数える。しかしながら、ＰＥ陽性で、ＡＰＣ陽性の事象の例もある。これらは、二重陽性事象として数えられる。
【００３１】
サイトケラチン−ＰＥ画像について、本発明は、染色強度輪郭を分析する。これらの画像に現れる対象の強度は、明りょうでない（noisy）場合がある。サイトケラチン染色は、明らかに陽性の細胞において、非常に均一である。典型的な細胞の場合には、画像において示されるある量のノイズがある。このノイズは、本発明ではkuanフィルタリングを使用して除去される。このことは、バックグラウンドと比較して均一には輝かない対象を見つけるために必要とされる。フィルタリングはまた、一箇所で近接している個々の対象を、各対象の境界を見つけることにより、システムに同定させることにもつながる。
【００３２】
ＤＡＰＩは、核酸を標識するのに使用される。ＤＡＰＩ画像は、分析され、強度プロフィールに基づいてセグメントに単離される。過度のセグメント分けの場合を防ぐために、閾値をセットする。ここでは、単一の対象が、１個以上の別個のセグメントとして表される。しかしながら、核酸染色は、サイトケラチン染色よりもより予測可能であることから、別個の対象を区別するために必要なフィルタリングはより少ない。
【００３３】
ひとたびこれらの対象が同定されると、これら対象には、サイトケラチン−ＰＥおよびＤＡＰＩの両方について、それらの強度に基づいてスコアがつけられる。より高い強度の対象は、より高いスコアが与えられる。その後、対象は、２つの画像の重複度に基づいて分析される。核酸は、サイトケラチンの境界域内に現れるであろう。より高い画分の重複度を有する対象は、より高いスコアが与えられる。図１に示されているように、ＤＡＰＩ対象は、サイトケラチン内によく一致しており、陽性のＣＴＣ事象である。
【００３４】
サンプルもまた、ＣＤ４５−ＡＰＣで染色される。これは、白血球を染色するために使用され、標的ではない事象を同定する。ＡＰＣについて陽性の対象は、ＣＴＣのものとはみなされないであろう。しかしながら、二重陽性の事象として知られているＰＥおよびＡＰＣについて陽性である小さい個体群の事象がある。したがって、判断基準としてＡＰＣ陽性または陰性をただ使用する代わりに、ＡＰＣとＰＥとの比が、ＣＴＣおよび白血球から二重陽性の事象を分別するために使用される。これらの事象は、この比に基づいてスコアが付けられ、これにより、ＣＴＣの可能性があるもの（likely CTC's）に、白血球の可能性があるものよりも高いスコアが与えられる。図２および図３において、ＣＴＣ（ＤＡＰＩ陽性およびＰＥ陽性）は、白血球と共に見られることができる（ＡＰＣ陽性およびＤＡＰＩ陽性）。
【００３５】
上述のプロセスを通してひとたび各対象が分析されると、画像が、それらのスコアの順番で再考者に提示される。結果は、ＣＴＣの可能性が高い事象が、画像の組の始めに現れ、より可能性が低い対象は、組の中のさらに遠くに現れる。
【００３６】
本発明の組成物、方法、およびキットを用いて検出され得る異なる種類の癌の例は、アプドーマ（apudoma）、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン−ピアス（Brown-Pearce）、腺管、エールリッヒ腫瘍（Ehrlich tumor）、生体内原位置（in situ）、クレブズ２（Krebs 2）、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺（non-small cell lung）、燕麦細胞、乳頭状、硬性癌、細気管支、気管支原生、扁平上皮細胞、および移行細胞）、細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞の腫瘍、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、間葉細胞腫、原腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、トロホブラスト腫（throphoblastic tumor）、腺癌、アデノーマ、胆管癌、胆脂腫、円柱腫、粘液性嚢胞性癌（cystadenocarcinoma）、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、ギナンドロブラストーマ（gynandroblastoma）、肝腫、汗腺腫（hidradenoma）、島細胞の腫瘍、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞の腫瘍、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、神経細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性旁神経節腫（paraganglioma nonchromaffin）、アンチオケラトーマ（antiokeratoma）、硬化性の血管腫（angioma sclerosing）、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫（lymphangiomyoma）、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌腫、横紋筋肉腫、肉腫（カポジの、および肥満細胞）、新生物（例えば、骨、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭部および頚部、中枢神経系、聴覚、骨盤、気道、および泌尿生殖器）、神経線維腫症、および子宮頚部形成異常を含む。
【００３７】
しかしながら、本発明は、循環性上皮細胞のみの検出に限定されるものではない。例えば、内皮細胞は、心筋梗塞を有する患者の血液中で観察されてきた。内皮細胞、心筋細胞、およびウイルスに感染した細胞は、上皮細胞のように、利用可能な単クローン抗体により認識された細胞の種類の特異的な決定因子を有する。したがって、本発明の方法は、循環性内皮細胞を検出するのに順応してもよい。加えて、本発明は、感染性の疾病の患者の末梢血に負荷された細菌性の細胞の検出を可能にし、この患者は、本発明の組成物、方法、およびキットを用いて評価されてもよい。これらのレア細胞が、本明細書中に上述されているものと同様の状態で存在する場合には、循環おいて同様に挙動するであろうと予想することは理にかなっているであろう。
【００３８】
本明細書中に開示されている発明の好ましい実施形態は、本発明が、癌診断の追加する分野および適用で利用されることを可能にするとも考えられている。本発明の改良された診断モードが、好ましい実施形態の前述の説明により限定されるものではないことは、当業者に明らかであろう。最後に、上述で示されたある実施形態は、詳細な説明を提供するが、次の請求項は、詳細な説明による範囲に限定されるものではない。事実、種々の改変例が、次の請求項の精神から逸脱することなく、なされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】陽性ＣＴＣ事象の画像を示す。
【図２】同じフレーム中の白血球と共に陽性ＣＴＣ事象の画像を示す。
【図３】同じフレーム中の複数の白血球と共に陽性ＣＴＣ事象の画像を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の細胞画像を格付けするための方法において、
ａ．プラットフォームから画像を取得することと、
ｂ．形態学的分析、エピトープ分析、およびこれらの組み合わせからなる群からの前記画像の性質を格付けすることと、
ｃ．陽性の循環性腫瘍細胞の可能性が最も高いものから可能性が最も低いものへの順番で画像を提示することと、
ｄ．分析のために前記画像を選択することであって、前記分析は、疾病を診断すること、疾病をモニターすること、疾病をスクリーンすること、およびこれらの組み合わせからなる群からのものである、選択することと、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記プラットフォームは、マルチパラメータ・フローサイトメトリー、CellSpoter蛍光顕微鏡法、またはCellTracks Analyzer画像法である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記形態学的分析は、計量、形状分析、サイズ分析、細胞質／核の重複度、細胞質／核の相対的強度、およびこれらの組み合わせからなる群からのものである、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記エピトープ分析は、ＰＥ陽性事象、ＤＡＰＩ陽性事象、およびＡＰＣ陰性事象を同定するものである、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
バックグラウンドノイズは、kuanフィルタリングにより除去される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
前記細胞画像は、循環性腫瘍細胞、上皮細胞、内皮細胞、細菌細胞、およびウイルスに感染した細胞からなる群からのものである、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、
前記細胞画像は、循環性腫瘍細胞である、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、
前記エピトープ分析は、サイトケラチン−ＰＥ陽性事象、ＤＡＰＩ−染色された核陽性事象、およびCD-45 APC陰性事象を同定するものである、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、
前記順番は、前記サイトケラチン−ＰＥ陽性事象、および前記ＤＡＰＩ−染色された核陽性事象について強度をスコア付けすることによるものである、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
前記エピトープ分析は、前記サイトケラチン−ＰＥ陽性事象、および前記ＤＡＰＩ−染色された核陽性事象の画分の重複度によりさらに決定されるものである、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、
CD-45 APC陽性事象は、ＡＰＣ対ＰＥ強度比によりさらにスコア付けされ、前記強度比が高くなると、循環性腫瘍細胞のスコアが低くなることを示す、方法。
【請求項１】
液体サンプル中の細胞画像を格付けするための方法において、
ａ．プラットフォームから画像を取得することと、
ｂ．形態学的分析、エピトープ分析、およびこれらの組み合わせからなる群からの前記画像の性質を格付けすることと、
ｃ．陽性の循環性腫瘍細胞の可能性が最も高いものから可能性が最も低いものへの順番で画像を提示することと、
ｄ．分析のために前記画像を選択することであって、前記分析は、疾病を診断すること、疾病をモニターすること、疾病をスクリーンすること、およびこれらの組み合わせからなる群からのものである、選択することと、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記プラットフォームは、マルチパラメータ・フローサイトメトリー、CellSpoter蛍光顕微鏡法、またはCellTracks Analyzer画像法である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記形態学的分析は、計量、形状分析、サイズ分析、細胞質／核の重複度、細胞質／核の相対的強度、およびこれらの組み合わせからなる群からのものである、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記エピトープ分析は、ＰＥ陽性事象、ＤＡＰＩ陽性事象、およびＡＰＣ陰性事象を同定するものである、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
バックグラウンドノイズは、kuanフィルタリングにより除去される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
前記細胞画像は、循環性腫瘍細胞、上皮細胞、内皮細胞、細菌細胞、およびウイルスに感染した細胞からなる群からのものである、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、
前記細胞画像は、循環性腫瘍細胞である、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、
前記エピトープ分析は、サイトケラチン−ＰＥ陽性事象、ＤＡＰＩ−染色された核陽性事象、およびCD-45 APC陰性事象を同定するものである、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、
前記順番は、前記サイトケラチン−ＰＥ陽性事象、および前記ＤＡＰＩ−染色された核陽性事象について強度をスコア付けすることによるものである、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
前記エピトープ分析は、前記サイトケラチン−ＰＥ陽性事象、および前記ＤＡＰＩ−染色された核陽性事象の画分の重複度によりさらに決定されるものである、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、
CD-45 APC陽性事象は、ＡＰＣ対ＰＥ強度比によりさらにスコア付けされ、前記強度比が高くなると、循環性腫瘍細胞のスコアが低くなることを示す、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５０２９８６（Ｐ２０１０−５０２９８６Ａ）
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７３６２（Ｐ２００９−５２７３６２）
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１９０４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３０３８１
【国際公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１９０４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３０３８１
【国際公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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