細胞を検出および単離するためのマイクロ流体分取装置
血液試料における１または複数の疾患血液細胞を検出する方法は、血液試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、非疾患血液細胞と比較して疾患血液細胞の変形能が低下していることに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って疾患血液細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、疾患血液細胞は、チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、非疾患血液細胞は、チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する。１または複数のチャネルは、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って細胞を単離するように適合させることもできる。一部の実施形態では、１または複数のチャネルが、螺旋状チャネルでありうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１０年３月４日に出願された、米国特許仮出願第６１／３１０，３８７号、および２０１０年９月１７日に出願された、米国特許仮出願第６１／３８３，８８１号の利益を主張するものである。上記出願による開示の全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
［発明の分野］
細胞を分離するためのマクロスケールの対流法には、細胞のサイズ、変形能、および密度の相違を利用して標的細胞を濾別する、膜ベースのフィルターを用いる物理的濾過および密度勾配による遠心分離が含まれる。これらの技法は労働集約的であり、多段階の試料調製を必要とし、これにより、アーチファクトが導入される場合もあり、または所望の細胞が失われる場合もある。膜濾過法はまた、容易に閉塞を起こしやすく、頻繁な洗浄を必要ともする。さらにまた、濾過法および遠心分離法にかけられた標的細胞の元の表現型が、機械的な応力に誘導されて変化する証拠も報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、後続の解析のために、細胞の喪失を最小化し、元の標的細胞の表現型を維持することができる、血液試料を処理するためのより簡易でより効率的な技法を開発する必要が明らかに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
マイクロフルイディクスは、主に、その長さのスケールが小さく、これにより、血液分離時における細胞内微小環境をより良好に制御することが可能となるため、血液試料を処理するのに特に好適である。ＲＢＣの変形能の研究、血小板および血漿の分離、白血球の分離、ならびに血液に由来するＣＴＣ（循環腫瘍細胞）または胎児細胞などの希少細胞の単離など、異なる適用のためのオンチップの血液解析が、複数のグループにより示されている。しかし、これらのマイクロ流体システムにおける主要な限界は、試料が希釈されるため、または流速が遅いために、処理のスループットが低度なことであり、このために、これらのマイクロ流体システムは、通常容量がミリリットル単位である臨床血液試料を処理するのに不適となっている。本明細書では、これらの問題を克服するマイクロ流体デバイスについて説明する。
【０００５】
したがって、本発明は一般に、試料における（１または複数の）細胞を検出する方法を対象とする。具体的な態様では、本発明が、血液試料（例えば、全血液）における１または複数の疾患血液細胞を検出する方法を対象とする。この方法は、血液試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、非疾患血液細胞と比較して疾患血液細胞の変形能が低下していることに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って疾患血液細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、存在する場合は、疾患血液細胞が、チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、非疾患血液細胞が、チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動し、これにより、試料における１または複数の疾患血液細胞を検出する。
【０００６】
別の態様では、本発明が、個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する方法を対象とし、この方法は、試料を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、存在する場合は、循環腫瘍細胞が、チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、試料中の他の細胞が、チャネルの別の部分に沿って第２の出口へと流動し、これにより、個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞を検出する。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明が、非同調細胞の混合物（例えば、懸濁液）から１または複数の同調細胞を単離する方法を対象とする。この方法は、非同調細胞の混合物を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入し、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って同調細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、より大型の同調細胞が、チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、より小型の同調細胞が、チャネルの他の部分に沿って少なくとも１つの他の出口へと流動し、これにより、非同調細胞の混合物から１または複数の同調細胞を単離するステップを含む。
【０００８】
なお別の態様では、本発明が、個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する方法を対象とする。この方法は、試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、存在する場合は、循環腫瘍細胞が、チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、試料中の他の細胞が、チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動し、これにより、個体の試料における１または複数のＣＴＣを検出する。
【０００９】
本発明は、試料を化学的に修飾することなく、臨床試料のより迅速な処理を可能とし、これにより、処理時間を短縮し、処理費用を削減する、比較的高流速での持続的作動、ならびに後続の生物学的アッセイのための生細胞の回収を含めた多くの利点を有する。
【００１０】
同じ参照符号が異なる図面を通して同じ部分を指す付属の図面において示される通り、前出は、本発明の例示的実施形態についての以下のより具体的な説明から明らかであろう。図面は、必ずしも原寸大ではなく、代わりに、本発明の実施形態の例示に力点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のマイクロチャネルのデザインおよび分離の原理を示す概略図である。１Ａ：デバイスの寸法を示すマイクロ流体のデザインの一例を示す概略図である。このデバイスでは、マイクロチャネルが、入口では幅１００μｍのセグメントを含み、これが、１５μｍまで狭窄する。出口では、マイクロチャネルが、１：２：１の比に分割された３つの出口の分枝を伴う、目視観察を改善するための幅１００μｍの区分へと開口した。マイクロチャネルの高さは、１０μｍに固定した。１Ｂ：分離の原理を例示する、マイクロチャネルの断面概略図および上面概略図である。流動が出口に到達し、３つの出口系を用いて濾出されると、マイクロチャネルの入口では無作為に分布させた感染赤血球（infected red blood cells：ｉＲＢＣ）が、チャネルの側壁へと辺縁趨向する。
【図２】２（Ａ）：ヘマトクリット値を１％とする試料、２（Ｂ）：ヘマトクリット値を１０％とする試料、および２Ｃ：ヘマトクリット値を４０％とする試料において、流速を変化させるときの、マイクロチャネル出口における、標準化された３μｍビーズの分布を示すヒストグラムである。
【図３】３Ａ：５μＬ／分の流速で、試料のヘマトクリット値を変化させるときの、側方出口における３μｍビーズの濾過効率についてのグラフ、および３Ｂ：ヘマトクリット値を４０％とする試料において、流速を変化させるときの、側方出口における３μｍビーズの濾過効率についてのグラフである。また、図では、出口におけるチャネル断面にわたるビーズの分布を示す蛍光画像も示される（白色の点線は、おおよそのチャネル壁面の境界を示す）。
【図４】４Ａ：ヘマトクリット値を１０％とする試料、および４（Ｂ）：ヘマトクリット値を４０％とする試料において、流速を変化させるときの、マイクロチャネル出口における、標準化されたｉＲＢＣの分布を示すヒストグラムである。３μｍのビーズによる結果とは対照的に、１０％のヘマトクリット値では、ｉＲＢＣの辺縁趨向が観察されない。４０％のヘマトクリット値では、すべての流速条件で、約８０％のｉＲＢＣが、側壁へと辺縁趨向する。
【図５】ヘマトクリット値を４０％とする試料において、流速を変化させるときの、側方出口における後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣの濾過効率についてのグラフである。また、図では、出口におけるチャネル断面にわたるＤＡＰＩ染色されたｉＲＢＣの分布を示す蛍光画像も示される（白色の点線は、おおよそのチャネル壁面の境界を示す）。
【図６】３つの出口で回収されるｉＲＢＣおよび正常ＲＢＣの濃度を示すフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）データのグラフである。プロットは、６Ａ：後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣ試料、および６Ｂ：環状期ｉＲＢＣ試料について、３つの出口にわたるｉＲＢＣの分布を示すカウント結果を例示する。結果は、後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣについて＞９０％の濾過効率、および早期環状期ｉＲＢＣについて約７５％の濾過効率を示す。
【図７】ＰＤＭＳで製作された、単一の入口および８つの均等に分割された出口（１〜８と表示する）を伴う、ＣＴＣを単離するために製作された螺旋状マイクロチャネルの写真である（目視観察のため、マイクロチャネルには染料を満たす）。図７Ａにはまた、螺旋状マイクロチャネルの出口区分を例示する顕微鏡画像も示される。
【図８】ＣＴＣを単離するための螺旋状分取装置の概略図である。入口では、血液細胞（ＲＢＣ、白血球、およびＣＴＣ）が、マイクロチャネル断面にわたり無作為に分布している。慣性揚力およびディーン渦の影響下において、これらの細胞は、それらのサイズに基づいて断面内の異なる位置において平衡化し、より大型のＣＴＣが、マイクロチャネル内壁に最も近接して平衡化する。次いで、８つの均等な間隔を置いた出口を用いて個々の細胞流を抽出し、分離を達成する。
【図９】図９Ａ：細胞周期を同調させるために開発した螺旋状マイクロ流体デザインの概略図（慣性揚力およびディーン抗力の影響下において、非同調細胞集団をサイズにより画分化して、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期の比較的純粋な細胞集団を得る。Ｇ２／Ｍ期の細胞が、大型サイズのために、マイクロチャネルの内壁に最も近接して平衡化した後、Ｓ期およびＧ０／Ｇ１期の細胞が平衡化する；挿入図は、ＰＤＭＳで製作した、１つの入口および８つの出口を伴う螺旋状マイクロチャネルの写真である）および９Ｂ：蛍光標識したポリスチレン粒子を用いるデザイン原理の検証を示す図（２．５ｍｌ／分の流速で、高さ１４０μｍのマイクロチャネルの入口、出口前における幅５００μｍのチャネル区分、および分枝状出口における直径１０μｍ、１５μｍ、および２５μｍの粒子の分布および位置を示す重ね合せ画像である。入口において無作為に分布させた粒子が、秩序立ったフォーカス流を形成し、次いで、これが、出口１、２、および３において個別に回収される。）である。
【図１０】永久細胞系（１０Ａ＝ＨｅＬａ細胞、１０Ｂ＝ＫＫＵ−１００細胞、１０Ｃ＝ＣＨＯ−ＣＤ３６細胞）による細胞周期解析の結果を示すグラフである。ヒストグラムは、同調後のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期において分取された一倍体細胞のＤＮＡ含量の分布を示す。Ｇ２／Ｍ期の細胞のＤＮＡ量は、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の２倍であり、したがって、蛍光強度を倍増させる。出口１から回収されたより大型細胞が、Ｇ２／Ｍ期集団の比率の増大を示すのに対し、出口４から回収された小型細胞は、Ｇ０／Ｇ１期集団の著明な濃縮を示す。プロットにはまた、同調細胞のサイズ分布も示す。
【図１１】出口１、２、３、および４から回収されたサイズ分取ｈＭＳＣ細胞の光学顕微鏡写真である。１１Ａは、出口１で回収された細胞の平均直径が、出口４で回収された約１５μｍと比較して、約２４μｍであることを示す（ｐ＜０．００１）。１１Ｂは、回収された細胞のトリパンブルー染色された顕微鏡写真を示し、分取後におけるｈＭＳＣの生存率を示す（矢印は、非生存細胞を示す）。結果は、これらのマイクロチャネルにおける細胞が受ける高度のせん断が、これらの細胞の生存率を損なわず、＞９０％の生存率を達成していることを示す。１１Ｃは、再播種細胞の光学顕微鏡写真であり、出口から回収された細胞の増殖速度間における著明な差違を示さず、高い生存率および無菌性を示す（バー＝５０μｍ）。
【図１２】同調後のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期において分取されたｈＭＳＣのＤＮＡ含量の分布を示すヒストグラムである。プロットにはまた、同調細胞のサイズ分布も示す（ｐ＜０．０５）。
【図１３】増大させる異なる時間間隔において、出口４から回収された分取ｈＭＳＣのＤＮＡ含量の分布を示すヒストグラムである。出口４におけるｈＭＳＣ（２４時間目に８２．３％）のすべてが、１日目にＳ期およびＧ２／Ｍ期へと移行する（７９．７％）ので、ｈＭＳＣは、同調細胞分裂を裏付ける。接触阻害のために、２日目以降、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の百分率が増大する。分裂間期では、確率的変動のために、同調性が時間と共に減衰する。
【図１４】開発された超ハイスループットＣＴＣ単離チップの概略図であり、作動原理を示す図である。全血液をデバイスの内側の入口を介して送入する一方、シース液は外側の入口から通入する。チャネルが曲線形状であるため、ディーン抗力の影響下では、より小型の血液細胞（ＲＢＣおよびＷＢＣ）が、２つの反転渦に従い、チャネルの外壁へと移動する（断面図）。それらのより大型サイズのため、ＣＴＣは、それらをマイクロチャネルの内壁に沿って平衡化させる強い慣性揚力を受け、これにより、分離が達成される。
【図１５】螺旋状マイクロチャネルの出口におけるＲＢＣ、白血球、およびＣＴＣの側面方向の位置を示す平均合成画像（１５Ａ）およびラインスキャン（１５Ｂ）である。画像は、血液細胞（ＲＢＣおよび白血球）が、ディーン抗力の影響下でチャネルの外側半分へと転置されるのに対し、より大型のＣＴＣは、慣性揚力の影響下でチャネルの内壁により近接してフォーカスすることを示す。
【図１６】血液から希少細胞を単離するためのマイクロ流体デバイスの概略図である。マイクロチャネルのデザインは、収縮−拡張アレイによりパターン化された、高アスペクト比の矩形マイクロチャネルからなる。細胞フォーカシング領域では、せん断変調性慣性揚力の影響下で、すべての細胞が、チャネルの側壁に沿って効率的に平衡化する。希少細胞絞込み領域を流動するとき、より大型細胞の質量中心が、チャネル中央に沿って整列するのに対し、より小型の血液細胞は、チャネルの側壁に沿ったフォーカシングを維持する。分枝状出口をデザインすることにより、中央出口においてより大型の希少細胞の回収が可能となる一方で、残りの血液細胞は、側方出口から除去される。
【図１７】マイクロチャネルのアスペクト比（ＡＲ）が赤血球フォーカシングに対して及ぼす影響を示す図である。１７Ａ：アスペクト比を増大させたときのＲＢＣの平衡化を示す、平均合成画像である。注入される血液試料は、ヘマトクリット値を１％で固定し、Ｒｅ＝１００で送入した。マイクロチャネルは、入口における幅２００μｍのセグメントで始まり、分離を増強するための分枝部分の直前の出口で、幅３００μｍの区分へと開口する。併載される概略図は、出口におけるマイクロチャネル断面内のＲＢＣのおおよその位置を示す（点線は、チャネル壁のおおよその位置を示す）。１７Ｂ：出口において測定した、マイクロチャネル幅にわたるＲＢＣの確率分布を表すラインスキャンである。プロットではまた、側方出口の位置を示す出口における分布も示される。
【図１８】流速（Ｒｅ）が赤血球フォーカシングに対して及ぼす影響を示す図である。１８Ａ：流速を増大させたときのＲＢＣの平衡化を示す、平均合成画像である。注入される血液試料は、ヘマトクリット値を１％で固定し、ＡＲ＝５とするマイクロチャネルを介して送入した（点線は、チャネル壁のおおよその位置を示す）。１８Ｂ：出口において測定した、マイクロチャネル幅にわたるＲＢＣの確率分布を表すラインスキャンである。１８Ｃ：レイノルズ数（Ｒｅ）を増大させたときの、チャネル中央部における無細胞領域幅、および細胞バンドの厚さを示す実験結果の図である。
【図１９】ヘマトクリット値が赤血球フォーカシングに対して及ぼす影響を示す図である。１９Ａ：ヘマトクリット値を増大させたときのＲＢＣの平衡化を示す、平均合成画像である。注入される血液試料は、ＡＲ＝５とするマイクロチャネルを介して、Ｒｅ＝１００で送入した（点線は、チャネル壁のおおよその位置を示す）。１９Ｂ：出口において測定した、マイクロチャネル幅にわたるＲＢＣの確率分布を表すラインスキャンである。１９Ｃ：ヘマトクリット値を増大させたときの、チャネル中央部における無細胞領域幅、および細胞バンドの厚さを示す実験結果の図である。
【図２０】開発したマイクロ流体デバイスの希少細胞を単離する原理を示す経時画像を例示する図である。細胞フォーカシング領域では、せん断変調性慣性力の影響下において、ＣＴＣ（黄色の丸でマークされたＭＣＦ−７細胞）が、マイクロチャネルの側壁に沿って平衡化する。ＣＴＣは、マイクロチャネル中央部のいずれかの側への駆逐を維持するので、チャネルの拡張領域ではこれが明らかとなる（白色の点線は、おおよそのチャネル中央部を示す）。絞込み区分を通過するとき、ＣＴＣの慣性の中心は、マイクロチャネル幅の中心と共に整列する。拡張領域では、ＣＴＣが、引き続き流動の流線に追従し、マイクロチャネル幅の中心に沿った整列を維持する。
【図２１】細胞絞込み領域におけるチャネル幅がＣＴＣ分離効率に対して及ぼす影響を示す図である。２１Ａ：「絞込み」幅を変化させながら、マイクロチャネルにおける流速を増大させたときの、中央出口におけるＭＣＦ−７細胞の単離を示す、平均合成画像である（点線は、チャネル壁のおおよその位置を示す）。２１Ｂ：Ｒｅを増大させたときの、中央出口において回収されたＭＣＦ−７細胞および末梢血白血球の画分を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の例示的な実施形態についての説明を以下に示す。
【００１３】
本発明は一般に、マイクロ流体デバイスと、２つ以上の（複数の）細胞型（例えば、細胞のコレクションまたは細胞の混合物）を含む試料から、１または複数の特定の細胞型（例えば、検出および／または単離される１または複数の標的細胞）を検出および／または単離するための、このようなデバイスの使用とを対象とする。マイクロ流体デバイスは、試料を導入するための１または複数の入口と、試料がその中を流動する１または複数のチャネルと、１または複数の出口であるが、典型的には少なくとも２つの出口とを含み、試料において検出される細胞および／もしくは単離される細胞は、出口のうちの１つ（例えば、第１の出口）を流動し、試料中の残りの細胞は、単離される細胞と同じ出口を流動せず、かつ／または別の（異なる）出口（例えば、第２の出口）を流動する。１または複数のチャネルの各々は、チャネルの断面の少なくとも一部に沿って１または複数の標的細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを有し、１または複数の標的細胞が、各チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、残りの細胞が、各チャネルの第２の部分に沿って流動し、１または複数の標的細胞と同じ出口を介して流動せず、かつ／または１もしくは複数の出口（異なる出口、例えば、第２の出口、第３の出口、第４の出口、第５の出口、第６の出口、第７の出口、第８の出口など）を介して流動する。
【００１４】
本明細書で説明される場合、マイクロ流体デバイスは、試料をデバイスに導入するための１または複数の（少なくとも１つの）入口を有しうる。例えば、デバイスは、１つの入口、２つの入口、３つの入口、４つの入口、５つの入口、６つの入口、７つの入口、８つの入口、９つの入口、１０の入口などを有しうる。
【００１５】
当業者に知られている各種の技法を用いて、試料をデバイスに導入することができる。例えば、シリンジおよび／またはポンプを用いて試料を導入することができる。
【００１６】
同様に、マイクロ流体デバイスは、１または複数の出口も有しうる。一部の態様では、デバイスが、１つの出口、２つの出口、３つの出口、４つの出口、５つの出口、６つの出口、７つの出口、８つの出口、９つの出口、１０の出口などを有しうる。具体的な態様では、デバイスが、少なくとも２つの出口を有する。別の態様では、デバイスが３つの出口を有する。さらに別の態様では、デバイスが４つの出口を有する。なお別の態様では、デバイスが８つの出口を有する。
【００１７】
デバイスはまた、１または複数の入口を、１または複数の出口へと接続する、１または複数のチャネル（例えば、並列チャネル、例えば、１つの並列チャネル、２つの並列チャネル、３つの並列チャネル、４つの並列チャネル、５つの並列チャネル、６つの並列チャネル、７つの並列チャネル、８つの並列チャネル、９つの並列チャネル、１０の並列チャネルなど）も含む。１または複数のチャネルは、試料における１または複数の標的細胞を、残りの細胞から分離することを可能とするアスペクト比を規定する高さおよび幅の断面を含む。本明細書で用いられる場合、アスペクト比とは、チャネルの高さをその幅で除した比であり、標的細胞が、チャネルの断面の少なくとも一部に沿って第１の出口へと流動し、残りの細胞が、チャネルの断面の異なる部分（例えば、第２の部分、第３の部分、第４の部分など）に沿って、および異なる出口（例えば、第２の出口、第３の出口、第４の出口など）など、標的細胞と同じでない出口へと流動することを可能とするのに適切なチャネルの断面をもたらす。適切なアスペクト比は、試料における残りの細胞の同じであるかまたは類似の構造的特徴と比較して、試料における標的細胞の構造的特徴が異なることに基づいて標的細胞を、チャネルの異なる部分に沿って流動させる。このような構造的特徴の例には、細胞のサイズ、硬さ、変形能、接着性（例えば、細胞接着性）などが含まれる。例えば、本明細書で示される通り、１、２．５、３．７５、５、または７のアスペクト比を用いることができる。
【００１８】
当業者により理解される通り、チャネルは、多様な形状でありうる。一部の態様では、チャネルが線状であり得る。線状チャネルの高さは、約２０μｍ、約５０μｍ、約７５μｍ、約１００μｍ、および約１５０μｍなど、約１０μｍ〜約２００μｍの範囲にありうる。線状チャネルの幅は、約１２μｍ、約１５μｍ、および約２０μｍなど、約１０μｍ〜約５０μｍの範囲にありうる。線状チャネルの長さは、約３ｃｍなど、約１ｃｍ〜約５ｃｍの範囲にありうる。
【００１９】
他の態様では、チャネルが湾曲している。具体的な態様では、チャネルが螺旋状である。螺旋状チャネルの高さは、約１００μｍおよび約１４０μｍなど、約１０μｍ〜約２００μｍの範囲にありうる。螺旋状チャネルの幅は、約１００μｍ〜約５００μｍの範囲にありうる。螺旋状チャネルの長さは、約１ｃｍ〜約１０ｃｍの範囲にありうる。
【００２０】
試料は、マイクロ流体デバイス内を多様な流速で流動することが可能であり、例えば、生理学的な流速（例えば、細動脈における生理学的な流速）で流動することも可能であり、または非生理学的な流速で流動することも可能である。例示的な流速には、１分間当たりの細胞約２０００万個が含まれるか、または例示的な流速が、約２．５ｍＬ／分〜約５μＬ／分の範囲にある。
【００２１】
本明細書で説明されるマイクロ流体デバイスは、１または複数の標的細胞を、細胞試料から検出、分離、および／または単離するのに用いることができる。細胞試料は、例えば、血液（例えば、全血液）、血漿、腹水、リンパ、脊髄液、尿、組織などの生物学的試料でありうる。試料はまた、細胞培養試料でもありうる。具体的な態様では、試料が、血液試料（例えば、全血液試料）である。血液試料は、低ヘマトクリット値（例えば、約１〜１０％）の場合もあり、または高ヘマトクリット値（例えば、約２０〜５０％）の場合もある。
【００２２】
血液とは、血漿における細胞の複合懸濁物（血液容量の約４０〜４５％）であり、細胞への酸素および栄養分の輸送、細胞内の老廃生成物の除去、および免疫的防御の備給を含め、複数の重要な役割を果たす。赤血球（ＲＢＣ）は、全血液細胞成分のうちの＞９９％を占め（全血液１ミリリットル当たり約５×１０９個のＲＢＣ）、残りの＜１％は、末梢血白血球（ＰＢＬ）および血小板からなる。その複合的性格のために、マイクロ流体バイオチップを用いて血液を解析することは、困難な課題となっている。ＲＢＣおよび白血球に加えて、患者の末梢血においては、胎児有核赤血球、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、幹細胞、および白血病性細胞など、他の低量細胞もまた見出され、これらは、患者のモニタリング、疾患の診断、治療的処置のモニタリング、および科学的な基礎研究の実施など、多様な生物医学的適用に用いることができる。しかし、これらの細胞は、極めて希少であるため、解析の前にこれらの細胞を血液から効率的に単離するには、濃縮ステップまたは分離ステップが、ほとんど常に必要である。
【００２３】
したがって、本明細書で説明される１または複数のマイクロ流体デバイス（例えば、マイクロ流体デバイスの、例えば、並列または直列のカスケード）は、多様な目的に用いることができ、一態様では、多様な標的細胞を検出、分離、および／または単離するのに用いることができる。多様な標的細胞を検出することができる。例には、疾患細胞（例えば、マラリア感染赤血球、白血病性赤血球、鎌状赤血球貧血性赤血球、またはこれらの組合せなどの疾患血液細胞、非同調細胞の混合物中における同調細胞、および循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））が含まれる。
【００２４】
一態様では、デバイスを、血液試料において１または複数の疾患血液細胞を検出する方法において用いる。この方法は、血液試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、非疾患血液細胞と比較して、疾患血液細胞の変形能が低下していることに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って疾患血液細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅からなる断面とを各チャネルが有し、疾患血液細胞が、各チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、非疾患血液細胞が、各チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する。本明細書で用いられる場合、疾患細胞とは、非疾患（例えば、健常）細胞と比較して、１または複数の側面において、構造的に異なっている。例えば、疾患細胞は、サイズ、硬さ、変形能、接着性、またはこれらの組合せが、非疾患細胞とは異なりうる。例えば、疾患細胞は、マラリア感染赤血球、鎌状赤血球貧血性赤血球、白血病性赤血球、またはこれらの組合せでありうる。一態様では、疾患細胞が、早期（例えば、環状期）マラリア感染赤血球の場合もあり、または後期（例えば、栄養体期または分裂体期）マラリア感染赤血球の場合もある。血液試料は、約５μＬ／分の流速で導入することができる。一態様では、環状期マラリア感染赤血球を、約７５％〜約８５％の範囲の効率で分離することができる。別の態様では、後期マラリア感染赤血球を、約９０％の効率で分離することができる。方法は、疾患細胞を第１の出口から回収するステップをさらに含みうる。一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約１〜約２の範囲にありうる。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスが、目視観察を改善するための拡張領域をさらに含みうる。一部の実施形態では、第２の出口の幅が、第１の出口の幅より約２〜約１０倍の範囲で広い場合がある。特定の実施形態では、チャネルの幅が、約１５μｍでありうる。一部の実施形態では、チャネルの高さが、約１０μｍでありうる。
【００２５】
上記で論じた通り、具体的な態様では、疾患細胞が、マラリア感染赤血球である。マラリアは、世界の人口のうちの半分（３３億人）に危険性があり、毎年１００万〜２００万人が死亡すると推定されている、最も重度の寄生虫性疾患のうちの１つである。これらの罹患諸国では、貧困国における医療資源の欠如が、マラリアと戦うための大きな経済的負担を課すことにより、状況をさらに悪化させている。ヒトマラリア種の４つの型のうちでは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（Ｐ．）ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが、最も致死性である。感染すると、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球（ｉＲＢＣ）は、４８時間にわたる赤内期における多様な感染進行段階（環状期、栄養体期、および分裂体期）を経る。この時期において、マラリア原虫は、宿主ＲＢＣを持続的にリモデリングし、ｉＲＢＣ膜をより接着性とする特定の原虫性タンパク質を移出し、これにより、マラリア原虫が成熟するにつれて、ｉＲＢＣ膜の細胞接着性および進行性の硬化を推進する。これらの原虫誘導性の形態変化は、微小循環を損ない、なお、重度のマラリア症例では、貧血、代謝性アシドーシス、または臓器不全などの病態生理的帰結へと顕在化する場合もある。
【００２６】
本発明の一態様では、ｉｎ ｖｉｖｏにおける白血球の辺縁趨向現象（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ＨＬら（１９８４），Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２７（２）：２０４〜２２２；Ｆｉｅｂｉｇ Ｅら（１９９１），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ．１０（２）：１２７〜１４４）に触発された、マイクロ流体デバイスにおける、感染赤血球（ｉＲＢＣ）分離の変形能ベースの分離法が説明される。内腔径が約３００μｍ未満の血管では、白血球よりサイズが小さく、変形能が大きいＲＢＣは、血管の中心軸へと移動する傾向があり、その結果として、血管壁に隣接して、低ヘマトクリット値の血漿層が形成され、血管の中心では、赤血球（ＲＢＣ）濃度が増大する（Ｐｒｉｅｓ ＡＲら（１９９６），Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３２（４）：６５４〜６６７）。この内側へのＲＢＣの移動は、血管内部のポアズイユ流プロファイルに帰せられ、この結果、中心へと向かう圧力勾配誘導性の力がもたらされる（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ＨＬら（１９８９），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２５７（３）：Ｈ１００５〜Ｈ１０１５）。中心を最大とする、血管における放物線状の流体速度プロファイルのために、中心軸におけるＲＢＣのバルク流は、より迅速に流過する。このため、ファーレウス効果である管路内ヘマトクリット値の低下がもたらされ、また、細胞の枯渇した血漿層が存在するために、見かけの血液粘性の低下ももたらされる（ファーレウス−リンドクヴィスト効果）（同上）。ＲＢＣは、中心軸へと移動するので、白血球と移動するＲＢＣとの力学的衝突の結果、適切に辺縁趨向と称する、より大型の（そして変形能が小さい）白血球が血管壁へと駆逐される現象（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ＨＬら（１９８４），Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２７（２）：２０４〜２２２；およびＦｉｅｂｉｇ Ｅら（１９９１），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ．１０（２）：１２７〜１４４）がもたらされる。全血液から血漿を分離するためのマイクロ流体デバイス（Ｆａｎ Ｒら（２００８），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２６（１２）：１３７３〜１３７８；およびＪａｇｇｉ ＲＤら（２００７），Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．３（１）：４７〜５３）、および全血液から白血球を濃縮するためのマイクロ流体デバイス（Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓ ＳＳら（２００５），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７７（３）：９３３〜９３７）では、ファーレウス効果および辺縁趨向というこれらの２つの血行力学的効果が用いられている。これらの先行例では、分離される細胞が、変形能（硬さ）およびサイズのいずれにおいてもＲＢＣとは顕著に異なっていた。しかし、本明細書では、サイズが同じで、細胞の変形能がわずかに異なるに過ぎない正常ＲＢＣとマラリア感染ｉＲＢＣとを分離するための、この生体模倣による分離法の適用が説明される。
【００２７】
まず、蛍光標識して全血液中に懸濁させた硬質の３μｍポリスチレンビーズを用いることにより、分離の原理を裏付けた。次いで、全血液と混合した、環状期ｉＲＢＣおよび後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣの両方を用いて試験を実施した。本明細書における結果は、環状期ｉＲＢＣについて約７５％の分離効率を示し、後期ｉＲＢＣについて最大約９９％など、＞９０％の分離効率を示す。
【００２８】
本明細書で説明される分離法は、蛍光色素または他の化学修飾を必要とせず、ヘマトクリット値の高い（約４０％）、未処理の血液試料に対して直接実施することができる。高ヘマトクリット値とは、約２０％〜約５０％の範囲のヘマトクリット値であり、具体的な態様では、約３０％または約４０％のヘマトクリット値である。一態様では、マイクロ流体デバイスが、入口が一つ、出口が三つのデバイスであり、流速が、ギムザ染色など、下流における検出法との容易なインターフェース形成を可能とする。デバイスの作動は、電気またはバッテリーを必要とせず、重力送りの送液を用いうるであろう。これらの特徴のすべてにより、このデバイスは、試料供給源が制約される臨床状況におけるオンサイトの検査に理想的なｉＲＢＣ濃縮法となっている。加えて、このデバイスは、これらもまた細胞の硬さの変化を特徴とする、他の血液細胞疾患（例えば、鎌状赤血球貧血および白血病）にも容易に適用することができる（Ｅｖａｎｓ Ｅら（１９８４），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７３（２）：４７７〜４８８；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｔｈ ＭＪら（２００６），Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，９０（８）：２９９４〜３００３）。
【００２９】
その中で原虫が成熟するのに応じたｉＲＢＣの硬さの変化は、広範にわたり研究されている（Ｐａｕｌｉｔｓｃｈｋｅ Ｍら（１９９３）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２２（５）：５８１〜５８９；Ｓｕｒｅｓｈ Ｓら（２００５），Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１（１）：１５〜３０；Ｓｈｅｌｂｙ ＪＰら（２００３），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、１００（２５）：１４６１８〜１４６２２）。Ｓｕｒｅｓｈらは、光ピンセットを用いて、異なる感染期における個々のｉＲＢＣを伸展させ、これらの弾性率を測定した。報告される非感染ＲＢＣ、環状期ｉＲＢＣ、栄養体期ｉＲＢＣ、および分裂体期ｉＲＢＣの弾性率はそれぞれ、約８、１６、２１．３、および５３．３μＮ／ｍであった（Ｓｕｒｅｓ Ｓら（２００５），Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１（１）：１５〜３０）。様々な段階で、細胞の硬さがこのように顕著に変化することは、細胞内に大型で非変形性の原虫が存在することに部分的に帰せられており、その結果として、内部粘性が大きく増大する（Ｃｌｅｎｉｓｔｅｒ ＦＫら（２００２），Ｂｌｏｏｄ、９９（３）：１０６０〜１０６３；およびＮａｓｈ ＧＢら（１９８９），Ｂｌｏｏｄ．７４（２）：８５５〜８６１）。原虫が成熟するにつれ、円板状のｉＲＢＣは、表面積対容量比が減少するにつれてより球状化し、細胞の変形能が低下する（Ｎａｓｈ ＧＢら（１９８９），Ｂｌｏｏｄ．７４（２）：８５５〜８６１；およびＨｅｒｒｉｃｋｓ Ｔら（２００９），Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１１（９）：１３４０〜１３５３）。また、原虫のタンパク質の放出は、膜内のスペクトリンネットワークを架橋形成および安定化することにより、ｉＲＢＣ膜を硬化させ、これにより、ｉＲＢＣの可撓性を低下させる（Ｃｒａｎｓｔｏｎ ＨＡら（１９８４），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２３（４６３４）：４００〜４０３）。近年の研究は、後期栄養体期ｉＲＢＣおよび後期分裂体期ｉＲＢＣの膜の硬さが、熱性温度でさらに増大することから、微小循環内の血管閉塞におけるその役割について推定していることを報告している（Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃ Ｍら（２００９），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２９６（１）：Ｃ５９〜Ｃ６４）。ＲＢＣにおける変形能（およびｉＲＢＣにおける変形能の欠如）は、重要な生理学的意義を有する。正常ＲＢＣは、変形能が高く、このために、微小な毛細血管を通過するときに変形を受け（Ｓｕｔｔｏｎ Ｎら（１９９７），Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３（３）：２７２〜２８１）、脾臓によるクリアランスを回避し（Ｓａｆｅｕｋｕｉ Ｉら（２００８），Ｂｌｏｏｄ．１２２（６）：２５２０〜２５２８），低レイノルズ数ではまた側方移動も誘導する（Ｃｏｕｐｉｅｒ Ｇら（２００８），Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ．２０（１１）：４）ことが可能となる。ｉＲＢＣにおいて変形能が低下すれば、複数の重要な病態生理的帰結がもたらされうるであろう。例えば、Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓらは、微小血管ネットワークを模倣するマイクロ流体デバイスにおいて、グルタルアルデヒドで処置したＲＢＣ（変形能を低下させたＲＢＣ）の流動について研究し（Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓ ＳＳら（２００６），Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．６（７）：９１４〜９２０）、ＲＢＣの硬さが増大すると共に、ネットワーク内における血液流度が低下し、その結果、チャネルにおける閉塞、およびヘマトクリット値分布の不均一がもたらされることを示した。近年の研究はまた、硬化したＲＢＣがまた、狭窄したマイクロチャネルにおける無細胞層の厚さにも影響を及ぼし（Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｈら（２００９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ．４２（７）：８３８〜８４３）、ｉＲＢＣ、とりわけ、後期栄養体期ｉＲＢＣおよび後期分裂体期ｉＲＢＣが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、内皮における多段階の白血球動員（白血球のローリングおよびその後における接着）を模倣する（Ｈｏ Ｍら（２０００），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｅｎ．１９２（８）：１２０５〜１２１１）ことも示している。実際、微小血管系における細胞接着は、ｉＲＢＣが、それらの変形能の喪失を認識する脾臓によるクリアランスを回避する一助となっている。脾臓における固有のスリット様の構成は、ＲＢＣが、静脈洞内の狭小な内皮間スリットにおいて著しく変形することを要求する（Ｓａｆｅｕｋｕｉ Ｉら（２００８），Ｂｌｏｏｄ．１２２（６）：２５２０〜２５２８）。より硬いｉＲＢＣは脾臓内で上流に保持され、「種抜き（pitting）」（機械的な押出しにより、ｉＲＢＣから原虫を機械的に絞り出すこと）を受け、これにより、循環からｉＲＢＣが効果的に除去され、原虫負荷が低下する。
【００３０】
本明細書で示される通り、フローサイトメトリーが、細胞表面マーカーに基づき細胞を分取する技法として堅固に確立されているが、これとは独立ではあるが、生理学的に有意義な、細胞を精製／濃縮するための測定基準を、細胞の変形能はもたらしている。変形能に基づく細胞の分離には、多様な技法が適用されている（Ｘｉａｏｍｉ Ｔら（１９９５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．６７４（１）：３９〜４７；およびＬｉｎｃｏｌｎ Ｂら（２００４），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ．５９Ａ（２）：２０３〜２０９）。しかし、これらの技法の大半は、バッチフロー方式で作動し（Ｘｉａｏｍｉ Ｔら（１９９５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．６７４（１）：３９〜４７）、その結果、ロースループットであり、変形能が異なる細胞を個別に回収することができない（Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｂら（２００４），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ．５９Ａ（２）：２０３〜２０９）。
【００３１】
別の態様では、マイクロ流体デバイスを用いて、循環腫瘍細胞を検出、分離、および／または単離することができる。腫瘍形成の致死的な帰結である癌転移は、癌に関連する全死亡のうちで、約９０％を占めている。転移の主要原因である循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出することにより、病期および癌の進行と関連する貴重な洞察をもたらすことができる。ＣＴＣの計数はまた、治療的処置の奏効を臨床的に評価およびモニタリングするのにも用いられる。ＣＴＣは、血液細胞１０９個当たり１個ほどの少なさを含む極めて希少な細胞であり、形態および分子署名が高度に不均一であるので、これらを血液から単離することは、技術的な難題となっている。
【００３２】
したがって、一態様ではまた、本発明が、個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞を検出する方法も対象とする。この方法は、試料を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、循環腫瘍細胞が、チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、試料中の他の細胞が、チャネルの別の部分に沿って第２の出口へと流動する。方法は、循環腫瘍細胞を第１の出口から回収するステップのほか、循環腫瘍細胞を解析して、治療的処置の有効性を評価するステップもさらに包含しうる。試料は、血液試料でありうる。
【００３３】
本明細書では、マイクロ流体素子を用いて血液から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分取する、ハイスループットの細胞分離法が説明される。一態様では、デザインが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製作された、低アスペクト比で螺旋形状のマイクロチャネルからなる。分離は、マイクロチャネル断面内の異なる位置において細胞を平衡化させる、大きな細胞サイズに起因する慣性揚力と、螺旋形状に起因するディーン抗力との相互作用に依拠する。次いで、適切な分枝状出口をデザインすることにより、細胞を、それらのサイズに基づき個別に回収することができる。この技法を、典型的には直径が約２０μｍでサイズがより大きいＣＴＣを、血液細胞（約８μｍのＲＢＣ、約１０〜１５μｍの白血球（ＷＢＣ））から分離して、早期癌を検出し、治療の有効性をモニタリングすることに適用した。
【００３４】
螺旋状のマイクロチャネル内を流動する細胞は、慣性揚力と、遠心加速度により誘導されるディーン抗力との組合せの下にある。細胞サイズの４乗に伴って変化する慣性揚力は、マイクロチャネル断面内の異なる複数の平衡位置に細胞をフォーカスする一因となる。ディーン抗力の成分を付加して、螺旋形状のマイクロチャネルをデザインすることにより、これらの複数の平衡位置を、マイクロチャネル内壁近傍の１カ所だけに縮減することができる。揚力とディーン抗力との比は、細胞のサイズを変化させるときに変化するので、最大の細胞がマイクロチャネル壁に最も近接して平衡化する形で、細胞を、それらのサイズに基づいてマイクロチャネル断面に沿った異なる位置に平衡化させることができる。この結果、異なる細胞流の進化が生じ、適切な出口をデザインすることにより、これらを個別に回収することができる。
【００３５】
デバイスは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製作し、顕微鏡用のスライドガラスに接着する（図７Ａおよび７Ｂ）。マイクロチャネルのデザインは、拡張型の８等分された出口系を伴う、５００×１００μｍ（幅×高さ）のマイクロチャネルからなる。注入される試料は、濃度の異なるＣＴＣでスパイクした希釈全血液（０．１％のヘマトクリット値）からなる。試料がマイクロチャネル内を流動するにつれて、正常ＲＢＣ、白血球、およびＣＴＣが、それらのサイズに基づいてマイクロチャネル断面にわたり平衡化する。ＣＴＣはその大型のサイズ（約２０μｍ）のために、慣性揚力により大きな影響を受け、チャネル内壁に近接して平衡化する。ＣＴＣより小型であるＲＢＣ（約８μｍ）および白血球（１０〜１５μｍ）は、ディーン抗力により大きな影響を受け、マイクロチャネル内壁から遠く離れてフォーカスし、このために分離が達成される。低アスペクト比のマイクロチャネルをデザインすることにより、この平衡位置の差違が増幅され、図８に示す通り、希少なＣＴＣを出口１から回収することが容易となり、他の出口には残りの血液細胞が含有され、このために、持続的なハイスループットのサイズベースの分離が達成されることができる。この技法の別の実施形態では、この分離法を用いるならば、腹水に由来する間質細胞、血液に由来する白血病性細胞、および母体血液に由来する胎児有核赤血球を含めた他の希少細胞を単離することができるであろう。
【００３６】
一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約３．７５など、約１〜約５の範囲にある。特定の実施形態では、方法が、細胞型が混合された集団内に存在する幹細胞または前駆細胞を、細胞の直径に基づいて機能的に異なる亜集団へと分離するステップを含みうる。次いで、これらの亜集団をデバイスから回収し、固有の代謝機能との関連で解析し、例えば、増殖能、分化能、または特定の薬剤に対する応答能を増強させることが可能であった特定の亜集団を単離および濃縮することができる。特定の実施形態では、チャネルの幅が約５００μｍであることが可能であり、チャネルの高さが約１００μｍでありうる。
【００３７】
本明細書では、マイクロチャネルの螺旋形状を用いて全血液から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分取する、ハイスループットのサイズベースの細胞分離法が説明される。このデザインは、多様なサイズの細胞に対して作用する慣性揚力および粘性抗力を利用して、示差的な移動を達成する。マイクロチャネルの螺旋形状のために優越する慣性力およびディーン回転力は、より大型のＣＴＣに、マイクロチャネル内壁近傍の単一の平衡位置にフォーカスさせ、これを占拠させる。より小型の血液成分（ＲＢＣおよび白血球）は、ディーン力の影響下において、チャネルの外側半分に移動し、その結果として、２つの異なる流れが形成され、次いで、これらを、２つの個別の出口において回収する。全血液を処理する能力により、提起される技法は、１ｍＬの全血液を処理するのに要する時間が１０分間未満であり、内側の出口におけるＣＴＣ回収率を９０％として、血液細胞のうちの９９％を除去することが可能である。
【００３８】
曲線状チャネル内を流動する流体は、放射方向の外側に向けられた遠心加速度を受け、チャネルの上半分および下半分において、ディーン渦として知られる２つの反転渦を形成する。これらの二次流の大きさは、
【数１】
［式中、ρは、流体密度であり、Ｕｆは、平均流速であり、μは、流体の粘性であり、Ｒｃは、チャネル流路の曲率半径であり、Ｄｈは、チャネルの流体力学的直径であり、Ｒｅは、流動のレイノルズ数（慣性力対粘性力の比）である］により与えられる無次元のパラメータであるディーン数（Ｄｅ）により定量化される。したがって、曲線状チャネル内を流動する粒子は、これらを渦内の流動方向に沿って取り込み駆動する、これらの横方向のディーン流が存在するために、抗力を受ける。この動きは、上方または下方から目視すると、下流への距離が増大すると共に、内壁と外壁との間のチャネル幅に沿った粒子の往復運動に変換される。これらの細胞がチャネル内を流動するときに側方に移動する速度は、ディーン数に依存し、これは、
【数２】
を用いて計算することができる。
【００３９】
ディーン渦に沿って粒子が横切る側面方向の距離は、「ディーン周期」との関係で定義することができる。例えば、初期にマイクロチャネルの内壁近傍に位置し、下流への所与の距離においてチャネルの外壁へと移動する粒子は、１／２のディーン周期を経過したという。マイクロチャネル内壁近傍の元の位置に戻ると、全ディーン周期を経過する。したがって、所与のマイクロチャネル長に対して、流速（Ｒｅ）条件を増大させると、粒子は、複数のディーン周期にわたる移動を経過することができる。全ディーン周期による移動長は、
【数３】
［式中、ｗは、マイクロチャネルの幅であり、ｈは、マイクロチャネルの高さである］として計算することができる。結果として、ディーン移動に必要とされるマイクロチャネルの全長は、
【数４】
により与えられる。
【００４０】
ディーン抗力とは別に、直径がマイクロチャネルの寸法と同等なより大型の細胞はまた、無視できない慣性揚力（ＦＬ）（せん断誘導性の慣性揚力および壁面誘導性の慣性揚力の両方）も受け、結果として、それらのフォーカシングおよび平衡化がもたらされる。ポアズイユ流における放物線状の速度プロファイルは、粒子に作用して、それらを、マイクロチャネルの中心から遠ざけてチャネルの壁面へと方向付ける、せん断誘導性の慣性揚力ＦＩＬを結果としてもたらす。これらの粒子がチャネル壁面のより近くに移動すると、壁面が突然現れるために、粒子の周囲に形成される回転後流が断ち切られ、粒子を壁面から遠ざけてマイクロチャネルの中心へと方向付ける揚力（ＦＷＬ）が誘導される。これらの２つの反対向きの揚力の結果として、粒子は、マイクロチャネル辺縁部周囲の、異なる予測可能な位置で平衡化（フォーカス）する。この効果は、サイズがマイクロチャネルの寸法と同等のａｃ／ｈ≒０．１である粒子に優勢である。曲線形状のマイクロチャネルでは、慣性揚力（ＦＬ）と、ディーン抗力（ＦＤ）との相互作用により、平衡位置は、各々がディーン渦の上腕内および下腕内にある、チャネル内壁近傍の２カ所だけに縮減される。２カ所の平衡位置は、マイクロチャネルの高さに沿って互いに重なり合い、所与の粒子サイズに対して、マイクロチャネルの内壁から同じ距離に位置する、すなわち、マイクロチャネルの幅にわたる単一の位置として目視される。
【００４１】
本明細書で説明される研究は、これらの２つの現象、すなわち、ディーン移動および慣性フォーカシングを利用して、ＣＴＣを血液から単離する。一態様では、デザインが、全長約１０ｃｍの、２入口２出口の螺旋状マイクロチャネルを含む。マイクロチャネルの幅は約５００μｍであり、高さは約１４０μｍである。図１５Ａおよび１５Ｂに示す通り、より大型のＣＴＣが慣性によるフォーカシングを受ける一方で、より小型の血液細胞（ＲＢＣおよび白血球）の移動はディーン抗力の影響を受ける（すなわち、ＣＴＣだけが、ａｃ／ｈ≒０．１の比を満たす）ように、チャネルの寸法を選択する。入口では、全血液試料を螺旋状マイクロチャネルの内側の入口に送入し、シース液（例えば、１×ＰＢＳ）を螺旋状マイクロチャネルの外側の入口を介して送入する（図１４）。シース液は、すべての細胞が、ほぼ同じ位置から移動を開始するように、入口において全血液を絞り込み、全血液試料を、チャネル幅における狭小な領域に閉じ込めるのに用いることができる。試験中、ディーン抗力の影響下にある小型の細胞は、ディーン渦に沿って移動を開始し、チャネルの外壁へと移動する。ＣＴＣが受ける強い慣性揚力は、ディーン抗力の影響下でＣＴＣが移動することを阻止し、ＣＴＣに、マイクロチャネルの内壁近傍における２カ所の平衡位置にフォーカスさせ、これらを占拠させる。他方、ＲＢＣおよび白血球は慣性力による影響を受けないので、これらの細胞は、ディーン渦に沿って循環し続ける。細胞が、ディーン周期の半分の移動を経過すること確保する適切な流速を計算することにより、出口では、ＣＴＣがチャネルの内壁近傍にフォーカスする一方で、ＲＢＣおよび白血球は、チャネルの外側半分へと転置される。こうして、ＣＴＣを内側の出口で単離および回収しうる一方で、他の血液細胞は、外側の出口で回収される（図１４）。この技法を用いる利点は、それが、ヘマトクリット値が極めて高値の試料（全血液）を処理することが可能であり、このため、試料の調製ステップが縮減され、解析時間も大幅に短縮されることである。この技法を用いると、１ｍＬの全血液を、１０分間以内で処理することができる。
【００４２】
別の態様では、個体の試料における循環腫瘍細胞を検出する方法が、試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、循環腫瘍細胞が、チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、試料中の他の細胞が、チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する。方法は、循環腫瘍細胞を第１の出口から回収するステップと、循環腫瘍細胞を解析して、治療的処置の有効性を評価するステップとをさらに包含しうる。試料は、血液試料でありうる。一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約２〜約１０の範囲にありうる。他の一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約３〜約５の範囲にありうる。入口から遠位の端部におけるチャネルの幅は、単離される細胞のオーダーにありうる、すなわち、入口から遠位の端部におけるチャネルの幅は、単離される細胞のサイズとほぼ同じサイズでありうる。一部の実施形態では、チャネルの幅が、約２０μｍでありうる。マイクロ流体デバイスは、入口から遠位のチャネル端部において、目視観察を改善するための拡張領域をさらに含みうる。一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスが、すべての細胞を、チャネルの長手方向へと移動（ｍｉｇｒａｔｅ）させ、チャネルの長手方向に沿って移動（ｍｏｖｅ）させるように適合させた断面を有する、少なくとも１つの細胞フォーカシング領域をさらに含みうる。
【００４３】
本明細書では、血液からＣＴＣを単離するための、せん断変調型慣性マイクロ流体素子の適用が説明される。図１６は、開発されたマイクロ流体デバイスの概略図を示す。デバイスは、全血液細胞のうちの＞９９％を占める赤血球の大半またはすべてを除去することにより、末梢血から希少細胞を、単一のステップで効率的に分離することを可能とする。一態様では、デザインが、単一の入口による、収縮−拡張アレイによりパターン化された、高アスペクト比の矩形マイクロチャネルからなる。収縮領域および拡張領域の幅は、それぞれ、約２０μｍおよび６０μｍであり、それらの長さは、約１００μｍであった。チャネルは、全長を約１．５ｃｍとする、収縮−拡張領域による約７５のサブユニット（収縮領域と拡張領域との対が、１つのサブユニットをなす）を含む。出口は、目視観察を増強するために、幅約３００μｍの区分へと開口し、２つの側方出口アームおよび中央出口アームである、幅約１００μｍの３つの分枝状アームへと等分されている。標的細胞が中央出口において回収される一方で、他のすべての血液成分は、側方出口から除去される。本明細書では、この新規の技法の適用として、単一のチャネルを用いて、１分間当たりの細胞１０８個の処理を可能とする高効率（＞８０％のＣＴＣ回収率）およびハイスループット（４００μＬ／分の流速）で、血液から希少ＣＴＣを分離することが裏付けられる。チャネルのデザインは、数分間以内に、数ミリリットルの臨床血液試料を処理する能力を伴う、簡易な並列化を可能とする。デバイスは、末梢血白血球および胎児有核赤血球を含めた他の希少細胞を血液から単離するのにもカスタマイズすることができる（Ｖｏｎａ，Ｇ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００２．１６０（１）：５１ページ）。
【００４４】
チャネル（例えば、マイクロチャネル）内の慣性揚力ベースの細胞フォーカシングは、早くも、新規でハイスループットの物理的な細胞分離法をもたらしつつある（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，「Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ」、２０１０；Ｄｉ Ｃａｒｌｏ、Ｄ．，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ，２００９，９（２１）：３０３８ページ）。開発されたバイオチップは、これらの慣性揚力を及ぼして、ＣＴＣを他の末梢血細胞から単離することに成功している。高アスペクト比のマイクロチャネル区分は、２つの領域：（ｉ）細胞フォーカシング領域と、（ｉｉ）希少細胞絞込み領域（図１６）とに分割することができる。細胞フォーカシング領域（最初の７０のサブユニット）では、せん断変調性慣性揚力の影響下において、すべての細胞が、チャネル長手の側壁に沿って移動および平衡化する（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８、２０：１０１７０２ページ）。マイクロチャネル内を流動する流体中に懸濁されている、中性浮力をもつ浮揚性の粒子／細胞は、粘性抗力および慣性揚力の両方の下に置かれることが典型的である。平面ポアズイユ流における放物線状層流の速度プロファイルは、せん断誘導性慣性揚力をもたらし、この結果、チャネル中央から遠ざかる、マイクロチャネル壁面への粒子移動がもたらされる（Ａｓｍｏｌｏｖ，Ｅ．Ｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，１９９９，３８１：６３〜８７ページ）。粒子が、チャネル壁面により近接するにつれて、粒子の周囲で誘導される非対称性後流が、壁面誘導性揚力を発生させ、これらの粒子を壁面から遠ざけるように駆動する（Ｚｅｎｇ，Ｌ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，２００５，５３６：１〜２５ページ）。これらの２つの反対向きの揚力が、互いを相殺する結果として、均一に分散した粒子が、マイクロチャネル辺縁部周囲の狭小なバンドに平衡化する（Ｍａｔａｓ，Ｊ．Ｐ．ら，「Ｏｉｌ ＆ Ｇａｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、２００４，５９（１）：５９〜７０ページ；Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．ら，Ｎａｔｕｒｅ、１９６１、１８９：２０９〜２１０ページ；Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈ、１９６２，１４：１１５〜１３６ページ；Ｍａｔａｓ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，２００４，５１５：１７１〜１９５ページ）。これらの慣性力は一般に、マイクロ流体素子ベースの流動では、ほぼ確実にチャネルのレイノルズ数が低値である（チャネルの寸法が小さく、流速が低速である結果として）ために無視される。しかし、粒子／細胞のサイズが、チャネルの寸法と同等である場合は、これらの慣性揚力が無視できないものとなり、流動の流線を横切る側方への粒子の移動をもたらす。
【００４５】
実際のマイクロ流体への適用で、細胞が有限のチャネル長にフォーカスされるような平衡化は、ａｃ／Ｄｈ≧０．０７の場合に生じる［式中、ａｃは、細胞の直径であり、Ｄｈは、マイクロチャネルの流体力学的直径である］（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８，２０：１０１７０２ページ；Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ，２００８，８（１１）：１９０６〜１９１４ページ；Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｏｌｏｇｙ，１９９７，４１：６２１ページ；Ｄｉ Ｃａｒｌｏ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７，１０４（４８）：１８８９２ページ）。正方形のマイクロチャネルにおいて、低レイノルズ数（Ｒｅ＜１００）の流動では、４つの側面すべてにおけるせん断勾配が均一であるため、８つの安定的な平衡位置が存在する（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８，２０：１０１７０２ページ；Ｃｈｕｎ，Ｂら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００６，１８：０３１７０４ページ；Ｂｈａｇａｔ，ＡＡＳ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９，７（２）：２１７〜２２６ページ）。近年の報告は、高アスペクト比の矩形のマイクロチャネルにおいて、せん断率を変調させると、マイクロチャネルの長手に沿った優先的フォーカシングが結果として得られることを裏付けている（この場合は高さ）（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８，２０：１０１７０２ページ；Ｂｈａｇａｔ，ＡＡＳ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９，７（２）：２１７〜２２６ページ）。慣性揚力は、ＦＬ∝Ｇ２［式中、Ｇは、チャネルに沿ったせん断率である］としてスケーリングされるので、高アスペクト比（ＡＲ：チャネルの高さ対チャネルの幅の比）の矩形のマイクロチャネルの断面は、チャネル幅に沿ったより高いせん断率をもたらし（∝ＡＲ２）、マイクロチャネルの高さに沿った細胞の平衡化を駆動する。したがって、入口において分散した細胞は、移動し、チャネルの側壁近傍における２つの流れに整列され、無細胞の中央領域を創出する。本明細書で示す通り、この現象を利用して、すべての末梢血細胞をチャネル壁面に沿ってフォーカスし、下流で除去した。本明細書では、「平衡化」という用語と「フォーカシング」という用語とを互換的に用い、これらにより、細胞がマイクロチャネルの長手の側壁に沿って最終的な静止位置へと移動することを示唆する。
【００４６】
マイクロ流体デバイスはまた、チャネルの出口の前に、希少細胞絞込み領域（例えば、最後の５つの収縮−拡張サブユニット）も含むことができ、これは、希少細胞を他の血液細胞からうまく単離するのに用いられる（図１６）。より大型のＣＴＣ細胞の慣性の中心が、マイクロチャネルの中心軸に沿って整列するように、この絞込み領域における収縮幅（または絞込み幅）は、ＣＴＣの直径と同等である（すなわち、ＣＴＣのオーダーにある）ようにデザインする。したがって、出口では、赤血球およびＰＢＬがチャネルの側壁に沿ったフォーカシングを維持する一方で、より大型のＣＴＣは、チャネルの中心軸に沿って流過し、これにより、中心の出口からすべての希少細胞を回収することが可能となる一方で、血液細胞のうちの＞９９％は、側方出口から除去される。
【００４７】
高アスペクト比のデバイスでは、マイクロチャネルの幅が、細胞フォーカシングを制御する重要な寸法である。本明細書では、この寸法が、収縮領域の幅に対応し、これを約２０μｍとした。理想的には、直行するだけのマイクロチャネル（収縮−拡張アレイのないマイクロチャネル）でも、チャネルの側壁に沿った効果的な細胞の平衡化には十分である（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８，２０：１０１７０２ページ；Ｂｈａｇａｔ，ＡＡＳ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９，７（２）：２１７〜２２６ページ）。しかし、拡張領域を規則的な間隔で包含する理由は、二重のものである。第１に、これらのチャネルは、二重の鋳型形成工程（下記の「方法」の節を参照されたい）を用いるＰＤＭＳポリマーにより製作されているので、アスペクト比が＞２であるレリーフ構造は、変形および歪みに対して高度に感受性である（Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ，Ｅ．ら，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９９７，９（９）：７４１〜７４６ページ；Ｘｉａ，Ｙ．ら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８，２８（１）：１５３〜１８４ページ）。幅約６０μｍの拡張領域は、マイクロチャネルにより多大な構造的安定性をもたらしており、約７．５までの高アスペクト比の構造特徴を製作することを可能としている。第２に、拡張領域はまた、マイクロチャネル長にわたる圧力低下を軽減する働きもあり、デバイスを故障させることなく、高流速（Ｒｅ＞１００）の検査を可能とする。
【００４８】
別の態様では、マイクロ流体デバイスを、非同調細胞の混合物から１または複数の同調細胞を単離する方法において用いることができる。この方法は、非同調細胞の混合物を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って同調細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、より大型の同調細胞が、チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、より小型の同調細胞が、チャネルの他の部分に沿って少なくとも１つの他の出口へと流動する。
【００４９】
細胞周期は、細胞がその内容物を複製し、次いで、２つの娘細胞へと分割する、順序の決まった継起的イベントからなる。真核細胞では、適正な細胞分裂をもたらすこれらの異なるイベントを、４つの継起的な相：Ｇ１期（間隙期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２期（間隙期）、およびＭ期（有糸分裂期）に分割することができる。細胞周期を進むにつれ、細胞は、Ｓ期においてその染色体を複製し、Ｍ期においてこの染色体を分離する。長期間にわたるサイズのホメオスタシスを維持するために、細胞は、分裂する前に、サイズを平均で倍増させなければならない。Ｇ１期およびＧ２期の間隙期は、新たな高分子および各種の細胞小器官を合成するための時間をもたらし、細胞が、その外部環境をモニタリングして、その状態が、Ｓ期およびＭ期のそれぞれに入るのに適すると確認することを可能とする。有糸分裂後、細胞は、一時的な静止状態であるＧ０期に入ってから、再度細胞周期に入る。
【００５０】
細胞周期の同調は、細胞の特性および生物学的過程を研究し、細胞分裂前の各相に関与する遺伝子制御機構および遺伝子制御イベントを解明するのに不可欠である。同調培養物とは、細胞が、細胞周期の特定の相にあり、サイズおよびＤＮＡ含量など、類似の物理的特性および生化学的特性を示す培養物である。次いで、細胞は、その後の時点では同じ相にある比較的均一な群として、細胞周期を経過する。癌細胞による研究は、細胞周期における特定のチェックポイントに関与する重要な癌遺伝子の表現型および分布を明らかにしている。抗癌薬は、細胞周期の異なる相にある細胞を標的とすることが知られているため、癌の治療学は、腫瘍細胞試料を同調させることが可能であるかどうかに大幅に依存してきた。高度に同調させた細胞集団の使用はまた、多様な生物学的系の開発も大幅に容易とし、有用性も大幅に促進してきた。患者の免疫プロファイルに合致する細胞および組織の生成に核の導入が必要とされる幹細胞療法では、Ｇ０／Ｇ１期の幹細胞が高度な核導入効率を付与するので、細胞周期の同調が技法の成功にとって極めて重要である。したがって、それらの細胞周期の各相にある細胞を同調させるのに有効な技法を開発する必要が存在する。
【００５１】
以下では、螺旋状のマイクロチャネルにおける慣性力を用いて細胞を同調させる、マイクロ流体素子ベースの手法について説明する。近年では、慣性移動の原理に基づいてマイクロ流体システムにおけるサイズベースの粒子分離が開発されている（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９、７（２）：２１７〜２２６ページ；Ｄｉ Ｃａｒｌｏ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７、１０４（４８）：１８８９２ページ）。ポアズイユ流条件下にある螺旋形状のマイクロチャネルでは、多様なサイズの粒子が、慣性揚力およびディーン抗力の影響下において、マイクロチャネル断面に沿った異なる位置で平衡化する。本明細書で説明する通り、この原理を用い、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＣＤ３６細胞）および癌細胞（ＨｅＬａ細胞およびＫＫＵ−Ｉ００細胞）を含めた、複数の哺乳動物による永久細胞系を、Ｇ０／Ｇ１期の細胞に富む集団（＞８５％）、Ｓ期の細胞に富む集団、およびＧ２／Ｍ期の細胞に富む集団へと同調させることに成功した。分離の原理は、細胞周期における細胞の容量（および、したがって、直径、または、より一般的には、「サイズ」）と、その相との関係を利用する。本明細書ではまた、初代細胞系（骨髄）由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を同調させるためのこの技法の使用も裏付けられる。結果は、非同調試料による約２．８：１のＧ０／Ｇ１期集団対Ｇ２／Ｍ期集団比が、約１５．７：１へと濃縮されることを示す。同様に、同調させた後では、Ｇ２／Ｍ期集団の約４倍の濃縮が得られている。これらの結果は、他のマイクロ流体システムを用いて報告された結果（Ｋｉｍ，Ｕ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７、１０４（５２）：２０７０８ページ；Ｔｈｅｖｏｚ，Ｐ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０、８２：３０９４〜３０９８ページ；Ｃｈｏｉ，Ｓ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９、８１（５）：１９６４〜１９６８ページ；Ｍｉｇｉｔａ，Ｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，２：６５７〜６６０ページ）と同等であるが、スループットが顕著に増大したことにより、生存率の高い（約９５％）多数の細胞（１時間当たりの細胞約１５×１０６個）を同調させることが可能となっている。このデバイスのマイクロチャネルのデザインと組み合わせたパッシブの作動原理により、多くの異なる初代細胞型についての生物学的研究における多様な適用が可能となっていると考えられる。
【００５２】
当業者に知られている通り、「非同調細胞」とは、多様な相、例えば、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期にある細胞の混合物である。本明細書で用いられる場合、「同調細胞」とは、細胞周期の同じ相にある細胞を指す。非同調細胞の混合物は、哺乳動物の癌細胞の懸濁液もしくは間葉系幹細胞の懸濁液、組織、またはこれらの組合せでありうる。方法は、同調細胞を第１の出口から回収するステップをさらに含みうる。一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約１〜約５の範囲にありうる。特定の実施形態では、チャネルの幅が、約５００μｍでありえ、チャネルの高さが、約１４０μｍでありうる。
【００５３】
本明細書で説明する方法は、さらなる解析のために、例えば、蛍光活性化細胞分取などのために、デバイスから標的細胞を回収（単離）するステップをさらに含みうる。
【００５４】
当業者により理解される通り、方法はまた、標的細胞を濃縮するステップもさらに含みうる。例えば、複数の出口を有するデバイスの場合は、分離および／または濃縮を増強するように出口の寸法比をデザインすることができる。例えば、３つの出口を伴うデバイスを例として用いると、寸法比は、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：５：１、１：６：１、１：７：１、１：８：１、１：９：１、１：１０：１などでありうる。
【００５５】
標的細胞の濃縮率は、例えば、約２倍、約３倍、または約４倍の濃縮率に到達させることができる。
【実施例１】
【００５６】
［細胞を分離および単離するための変形能ベースの分取］
［材料および方法］
［マラリア原虫の培養］
本研究では、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの３Ｄ７株を用いた。原虫は、１０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）１ｍｌと併せた、１ＭのＮａＯＨ １ｍｌ中に溶解させた、０．３ｇのＬ−グルタミン、５ｇのＡｌｂｕＭＡＸ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、２ｇのＮａＨＣＯ３、および０．０５ｇのヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ培地１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で培養した。原虫を、２．５％のソルビトールを用いて環状期で同調させ、同調培養を維持した。５％のＣＯ２気体、３％のＯ２気体、および９２％のＮ２気体の混合物により通気した後、３７℃で培養物を保存し、それらのヘマトクリット値を２．５％で維持した。環状期、後期栄養体期、および後期分裂体期において細胞を回収した。原虫培養物のための全血液は、健常ドナーから得、これをスピンダウンしてＲＢＣを分離した。ＲＢＣペレットをＣＰＤＡで３日間にわたり処理してから、ＲＰＭＩ １６４０で３回にわたり洗浄し、使用のために保管した。
【００５７】
［試料の調製］
血液試料を、１倍濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、および１％ｖ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する洗浄緩衝液で３回にわたり洗浄してから、実験を行った。直径３μｍの蛍光標識したマイクロビーズ（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を血液に添加し（０．０１％の容量画分）、１×ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ、および３．５ｗ／ｖ％のデキストラン４０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ Ａｓｉａ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を含有する試料緩衝液中で再懸濁させた。デキストランは、正常な血漿の有効粘性をもたらし、実験中の赤血球の沈降および連銭形成を防止する一助となった（Ｙｅｈ Ｃら（１９９４）、６６（５）：１７０６〜１７１６）。目視観察および定量化のため、ｉＲＢＣ（０．０１％の寄生虫血）を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で染色した。次いで、最終的な血液懸濁物を、試料緩衝液により相応に、多様なヘマトクリット値（１％、１０％、および４０％）に調整した。
【００５８】
［デバイスの特徴づけ］
デバイスは、標準的なマイクロファブリケーションソフトリソグラフ法（ＭｃＤｏｎａｌｄ ＪＣら（２００２），Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３５（７）：４９１〜４９９）を用いて、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）により製作した。マイクロ流体デバイスを特徴づけるために、細胞試料を１ｃｃのシリンジに充填し、多様な流速で駆動されるシリンジポンプ（Ｆｕｓｉｏｎ ４００、Ｃｈｅｍｙｘ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、マイクロ流体デバイス内に送入した。１２ビットのＥＭＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎＥＭ＋ ８８５、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を装備した倒立型落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、流動を実験的に観察した。試験中、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、出口において、チャネルのハイスピード画像を収集した。
【００５９】
分離効率を定量化するため、蛍光標識したマイクロビーズおよびｉＲＢＣの分散度を、マイクロチャネルの出口で撮影した画像から測定した。マイクロビーズおよびｉＲＢＣの分散度は、出口が幅１００μｍのマイクロチャネルを、各々１０μｍずつの１０の等しい区画（bin）に分割し、各区画を通過するビーズ／ｉＲＢＣの数をカウントすることにより測定した（Ｂｈａｇａｔ ＡＡＳら（２００８），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１８（８）：９）。次いで、カウントをプロットして、チャネル幅にわたるビーズ／ｉＲＢＣの分布を示した。側方出口で測定されたビーズ／ｉＲＢＣのカウントを、全出口におけるカウントに照らして標準化することにより、濾過効率を決定した。濾過を完了するのに、すべてのビーズ／ｉＲＢＣが、２つのチャネル側壁へと移動し、２つの側方出口から効率的に濾過されることが期待される。回収された出口試料に対して、ＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いる蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を実施することにより、分離効率をさらに検証した。
【００６０】
［マイクロチャネルのデザイン］
このマイクロチャネルのデザインは、長さ３ｃｍ、１５×１０μｍ（幅×高さ）で、拡張非対称型３出口システムを伴うマイクロチャネルとした。マイクロチャネルは、入口における幅１００μｍのセグメントで始まり、１５μｍへと狭窄した。出口において、マイクロチャネルは、幅１００μｍの区画へと開口し、目視観察を増強した。ｉＲＢＣ感染血により調べる前に、全血液中に懸濁させた３μｍの硬質ポリスチレンビーズを用いて、濾過の原理を確認した。後期ｉＲＢＣにおいて見出される原虫とサイズが同様であり、このため、実際のｉＲＢＣ挙動を表すので、３μｍのビーズを選択した。試料は、０．０５〜０．１％のビーズまたは異なる感染期のｉＲＢＣでスパイクした全血液（４０〜４５％のヘマトクリット値）からなる。血液試料が、１５×１０μｍのマイクロチャネルを流動するにつれて、ｉＲＢＣより変形能が大きい正常ＲＢＣは、チャネルの中心軸に対して側方に移動し、より硬いｉＲＢＣを、チャネルの壁面へと駆逐する。低アスペクト比のマイクロチャネルをデザインすることにより、ｉＲＢＣを、チャネル幅だけに沿って辺縁趨向させ、これにより、各側壁近傍に整列させることができる。次いで、非対称型３出口システムを用いてｉＲＢＣを濾過し、これにより、持続的でハイスループットの変形能ベースの濾過を達成する。図１は、開発されたマイクロ流体デザインの概略図を示す。
【００６１】
［結果および考察］
濃縮した血流における変形能ベースの側方駆逐現象を検証するために、まず、ヘマトクリット値を１０〜４０％とする血液懸濁物中において、ＲＢＣとほぼ同じ大きさである、直径６μｍの硬質ポリスチレンマイクロビーズを調べた。流動が出口に到達する時点までに、すべてのビーズがマイクロチャネルの２つの側壁近傍に整列したことから、辺縁趨向が裏付けられた。次いで、後期ｉＲＢＣにおいて見出される原虫（３〜５μｍ）とサイズが同様であるために、蛍光標識したより小型の３μｍポリスチレンビーズにより実験を繰り返した。硬い原虫が、感染細胞における変形能の喪失の主な原因である（Ｎａｓｈ ＧＢら（１９８９），Ｂｌｏｏｄ．７４（２）：８５５〜８６１）ので、３μｍのビーズは、ｉＲＢＣの流動挙動をよく表す。ヘマトクリット値を１％、１０％、および４０％とする血液懸濁物中にビーズを添加し、多様な流速でデバイスを介して送入した。各区画位置を通過するビーズをカウントすることにより、分離効率を定量化した。一貫して、各実験につき合計２００個ずつのビーズをカウントした。図２Ａ〜２Ｃは、流速を変化させるときの、マイクロチャネル幅にわたるビーズの分布をプロットする。低ヘマトクリット値（１％のヘマトクリット値）では、ビーズおよびＲＢＣが、チャネル幅にわたる均一な分散を維持したことから、軸方向の移動および辺縁趨向が無視できる程度であることが示される。ヘマトクリット値を１０％および４０％へと増大させると、マイクロチャネルの中央部において、十分に成長した、ＲＢＣを優勢とするコアの形成が結果としてもたらされる。ビーズとＲＢＣとの相互作用が強いため、ほとんどすべてのビーズ（＞９０％）が、チャネル側壁へと駆逐された（図２Ｂ〜２Ｃの区画１および１０）。これらの結果は、他の研究者らにより報告されている結果と一致することから、細胞の辺縁趨向に対する高ヘマトクリット値の役割が示唆される（Ｊａｉｎ Ａら（２００９）、ＰＬｏＳ ＯＮＥ．４（９）：ｅ７１０４）。図３Ａは、ヘマトクリット値を変化させた試料について、側方出口および中央出口アームにおいて測定した３μｍビーズの分布を示す。すべての実験は、５μＬ／分で一定の流速で実施した。ヘマトクリット値を１％とする場合、中央出口のビーズは、側方出口の約２倍であった。これは、マイクロチャネルの中央部においては流速が速くなることに帰せられ（ポアズイユ流）、所与の時間においてマイクロチャネルの中央部を通過するビーズが結果として増大する。しかし、ヘマトクリット値を増大させると（１０％および４０％とすると）、ほとんどすべてのビーズ（約９０％）がチャネルの側壁へと駆逐され、側方出口により回収された。ヘマトクリット値を１０％から４０％へと増大させると、濾過効率もまた、８９％から９７％へと増大したことから、辺縁趨向の増大が示される（Ｚｈａｏ Ｒら（２００８），Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３６（７）：１１３０〜１１４１）。
【００６２】
本発明者らのマイクロチャネルでは、高ヘマトクリット値の試料が、ビーズの側方駆逐の増強を結果としてもたらす。次に、流速が分離効率に対して及ぼす影響を決定するために、実験を実施した。図３Ａに示す結果に基づいて蛍光標識したビーズでスパイクした４０％のヘマトクリット値試料を、０．２μＬ／分〜５μＬ／分の範囲の流速で調べた。図３Ｂは、流速を増大させたときの側方出口および中央出口アームで測定される３μｍビーズの分布を示す。ビーズの辺縁趨向効率は、調べたすべての流動条件において、約９０％でほぼ一定を維持した。これは、近年において報告される他の結果と符合する（Ｚｈａｏ Ｒら（２００８），Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３６（７）：１１３０〜１１４１）。この挙動は、以下の理由により説明することができる。流速を低下させると、硬いビーズは、チャネル長を縦断するのにより長時間を費やし、このため、複数の細胞が相互作用して側方へと辺縁趨向するのに十分な時間が与えられる。しかし、流速を増大させると、慣性が増大するために、ＲＢＣは、マイクロチャネルの中心軸へとより迅速に移動し、十分に明確なコアを形成する。この結果、硬いビーズは中央部から側壁へと「押し」のけられ、このため、流速を増大させてもなお、効率的な分離が達成される。
【００６３】
ポリスチレンビーズを用いる実験によるデザイン原理の検証に続いて、次に、マラリア感染ｉＲＢＣによる試験を実施した。図３Ａおよび３Ｂに示される結果に基づいてヘマトクリット値を１０％および４０％とするｉＲＢＣ試料について調べた。まず、それらの硬さが増大するために、早期ｉＲＢＣと比較した場合、辺縁趨向効果がより顕著となるので、後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣを用いて、すべての試験を行った。図４Ａおよび４Ｂは、流速条件を変化させて、ヘマトクリット値を１０％および４０％とした場合に、マイクロチャネルの出口において測定された、ｉＲＢＣの分布結果を示す。硬質ポリスチレンビーズにより得られた結果とは逆に、ヘマトクリット値を１０％とする場合、本発明者らは、ｉＲＢＣの側壁への辺縁趨向が無視できる程度であることを認める。ｉＲＢＣカウントは、チャネルの中心軸周囲において放物線状の分布を示し、ポアズイユの速度プロファイルと符合する。これは、細胞間相互作用を中程度とするとき、ｉＲＢＣと正常ＲＢＣとの変形能の差違が、ｉＲＢＣを側壁へと駆逐するのに十分ではないことを示す。
【００６４】
しかし、ヘマトクリット値を４０％まで増大させると、著明なｉＲＢＣの辺縁趨向が結果としてもたらされる（図４Ｂ）。図により、すべての流動条件について、約８０％のｉＲＢＣが、区画１および１０に駆逐され、ポリスチレンビーズにより得られた結果と同様となった。調べたすべての流速で辺縁趨向効果が観察されたことから、ヘマトクリット値が、ｉＲＢＣの辺縁趨向の主要な因子であることが示される。ヘマトクリット値を増大させると、細胞間相互作用の増大が促進され、変形能の低いｉＲＢＣがチャネルの側壁へと駆逐され、これにより、感染細胞の効率的な分離が可能となり、これにより、変形能の低いｉＲＢＣを分離するための細胞の辺縁趨向の使用が裏付けられ、鎌状赤血球貧血および白血病など、赤血球の硬さの変化を特徴とする他の疾患を診断するのにこの技法を適用することが支持される。
【００６５】
図５は、流速を変化させるときの、このｉＲＢＣ辺縁趨向現象による分離効率を示す。この技法が、高流速（５μＬ／分）を含め、調べたすべての流動条件において同様な良好さで作用したことは、ハイスループットの分離を行う場合の重要な考慮点であり、これに注目することは重要である。予測される通り、ｉＲＢＣはなお変形可能であり、このため、側方へと辺縁趨向する効率が低いので、ｉＲＢＣの分離効率は、硬質のビーズにより測定した場合の分離効率ほど高くはなかった。
【００６６】
最後に、濾過効率の精度を検証するため、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて、出口における試料を解析した。ヘマトクリット値を４０％とする血液懸濁物における、環状期ｉＲＢＣおよび後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣの両方を、５μＬ／分でデバイスを介して送入し、流出物を回収し、ＦＡＣＳを用いて解析した。合計５００，０００のイベントを記録し、ｉＲＢＣの分離効率のより正確な表示を得た。後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣによる実験の場合、側方出口と中央出口との間では、９２％の濾過効率が測定された。これは、区画内のカウントデータと符合する（図６Ａ）。側方出口が、３つの出口の容量のうちの５０％を占めるので、側方出口におけるｉＲＢＣ濃度は、注入試料と比較して２倍の濃縮率を示す。しかし、この数は、出口チャネルのデザインが最適化されていないことの影響を受けるものであり、同じ工程を反復しうる場合はさらに改善することができる。
【００６７】
このｉＲＢＣの辺縁趨向を、マラリアの診断に適用するには、環状期ｉＲＢＣを濃縮することが重要である。典型的にはマラリア感染患者において、後期（栄養体期／分裂体期）ｉＲＢＣは、毛細血管後細静脈内に付着閉塞し、マラリア感染を検出するために、末梢血流中で循環するのが観察されるのは、環状期ｉＲＢＣだけである（Ｄｅｍｉｒｅｖ ＰＡら（２００２）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７４（１４）：３２６２〜３２６６；およびＧａｓｃｏｙｎｅ Ｐら（２００２）、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ２（２）：７０〜７５）。最適化させた分離条件（４０％のヘマトクリット値、５μＬ／分）下において、環状期ｉＲＢＣについてのこの技法の分離効率を調べ、ＦＡＣＳを用いて、回収された流出物を解析した（図６Ｂ）。環状期ｉＲＢＣは、細胞表面積対容量比の減少、および細胞膜の硬化のために、非感染細胞よりわずかに硬化するに過ぎない（Ｓｕｒｅｓｈ Ｓら（２００５），Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１（１）：１５〜３０；Ｎａｓｈ ＧＢら（１９８９），Ｂｌｏｏｄ．７４（２）：８５５〜８６１；およびＨｅｒｒｉｃｋｓ Ｔら（２００９），Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１１（９）：１３４０〜１３５３）。しかし、ｉＲＢＣを濾過するのにこの辺縁趨向現象を用いると、変形能のこのわずかな差異でもなお利用することができる。環状期ｉＲＢＣの分離効率が、後期ｉＲＢＣの分離効率より低いことは当然である。結果は、環状期ｉＲＢＣもまた、チャネルの側方へと辺縁趨向し、約８０％の分離効率を結果としてもたらすことを示す。収集されたビデオ画像を解析したところ、後期ｉＲＢＣが側壁へと完全に駆逐されるのに対し、早期ｉＲＢＣは、それほどは駆逐されないことが認められた。これは、例えば、より長型のマイクロチャネルを用い、これにより、環状期ｉＲＢＣに、側壁へと完全に辺縁趨向するのに十分な時間を与えることで、さらに改善することができる。また、出口を適切な形で分割することにより（例えば、３つのアーム間で、１：２：１の比を用いるのではなく、１：１０：１の幅比を用いることにより）、開発したマイクロ流体デバイスを、低度の寄生虫血における検出感度を改善したマラリア診断のための濃縮ツールとして用いることもまた可能であろう。
【００６８】
より硬いｉＲＢＣは、白血球のように挙動し、側壁への辺縁趨向を受ける。これを裏付けることにより、ｉＲＢＣの微小循環による血行力学的効果、および細胞接着性に対するその病態生理的重要性に対する洞察がもたらされる。前出で言及した通り、ｉＲＢＣにおける２つの重要な形態変化は、ｉＲＢＣ膜の接着性の増大、および変形能の低下である。これらの変化は、重度のマラリアの発症機序において枢要であり、各種の宿主細胞へのｉＲＢＣの細胞接着をもたらす。これらのｉＲＢＣの毛細血管壁への辺縁趨向はまた、細静脈の毛細血管における付着閉塞ももたらし、微小循環を含む毛細血管の閉塞の一因となる（Ｄｏｎｄｒｏｐ ＡＭら（２０００），Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ．１６（６）：２２８〜２３２；およびＣｏｏｋｅ ＢＭら（２０００），Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ．１６（１０）：４１６〜４２０）。Ｈｏらは、ｉＲＢＣによる内皮への細胞接着が、ローリングおよび接着など、多段階による白血球動員を模倣し、この過程が、ヒトの毛細血管後の細静脈、および細動脈系の両方において生じたことを、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて示している（Ｈｏ Ｍら（２０００）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９２（８）：１２０５〜１２１１）。示された結果は、硬い後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣが、側方へと駆逐され、マイクロチャネルの辺縁を流動することを示す。ｉｎ ｖｉｖｏなら、これは、ｉＲＢＣが側方へと分枝する小型の毛細血管へと侵入し、結果として、その後、ｉＲＢＣが毛細血管床に付着閉塞することを促進するであろう。また、生理学的な細動脈流に類似する広範な流動条件（Ｒｅ＝０．０１〜２．２２）にわたっても、ｉＲＢＣの辺縁趨向について調べられており（Ｐｏｐｅｌ ＡＳら（２００５），Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ． ３７：４３〜６９）、ｉｎ ｖｉｖｏにおける付着閉塞および細胞接着に対する変形能低下の役割がさらに確認されている。
【００６９】
生理学的な細胞辺縁趨向現象を、マイクロ流体デバイスにおける持続的な変形能ベースのｉＲＢＣ濾過を達成するのに適用した。この技法は、他のマイクロ流体分離法を上回る多くの顕著な利点をもたらす。まず、持続的な作動方式は、試料のハイスループット（５μＬ／分；１分間当たりの細胞約２０００万個）を可能とし、低度の寄生虫血における検出感度を増強する（Ｇａｓｃｏｙｎｅ Ｐら（２００２），Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．２（２）：７０〜７５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＰＡら（２００６），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ．７４（４）：５６８〜５７２）。パッシブの作動原理は、機能性のために外力の場を組み込む必要を排し、このマイクロ流体デバイスを現場環境に理想的なものとしている。患者に由来する全血液を、直接検査することができるので、他のマイクロスケールにおける分離法とは異なり、試料の調製ステップが不要であり（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＰＡら（２００６），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ．７４（４）：５６８〜５７２；Ｋａｒｌ Ｓら（２００８），Ｍａｌａｒｉａ Ｊｏｕｒｎａｌ．７（１）：６６）、処理時間がさらに短縮され、処理費用がさらに削減される。また、特別な化学物質または抗体も不要なので、高温多湿の気候に悩まされ、保冷庫が不足するマラリア罹患諸国にとって主要な憂慮点である、試薬の保存問題を解決する一助となっている（Ｓｔｅｖｅｎｓ ＤＹら（２００８），Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．８（１２）：２０３８〜２０４５）。最後に、このデバイスの費用低廉でディスポーザブルな性格は、このデバイスを、現場臨床に理想的なものとしている。
【００７０】
［結論］
本明細書では、生体模倣性の細胞辺縁趨向に基づくマイクロ流体デバイスにおける持続的な変形能ベースのｉＲＢＣ濾過法を導入する。本明細書では、より硬いｉＲＢＣが、白血球と同様に挙動し、生理学的条件下において、側壁へと辺縁趨向することが裏付けられる。結果は、広範な流速にわたり観察された最適の辺縁趨向のためには、試料の高ヘマトクリット値（４０％）が重要であったことを示す。試験は、５μＬ／分の比較的高度のスループットにおいて、全血液と混合した環状期ｉＲＢＣおよび後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣの両方により実施した。濾過効率は、区画カウント法およびＦＡＣＳ解析を個別に用いて決定した。報告される結果は、早期環状期ｉＲＢＣには約７５％、および後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣには＞９０％の高濾過効率を示す。さらなる試料の改変および調製の必要を排するこのパッシブのマイクロ流体デバイスでは、全血液試料を直接用いうるので、この技法は、医療資源の乏しい環境におけるオンサイトの検査に理想的であり、診断をより迅速およびより正確なものとする。最後に、分離の原理が、内因性バイオマーカーとしての変形能の差違に基づくので、デバイスは、これらもまた細胞の硬さの変化により特徴づけられる、鎌状赤血球貧血および白血病など、他の血液細胞疾患にも容易に適用することができる。
【実施例２】
【００７１】
［螺旋状マイクロ流体素子における細胞周期の同調］
［材料および方法］
［細胞の培養］
１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と併せて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を補充した、低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で、間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を培養した。１％ペニシリン−ストレプトマイシンと併せて１０％ＦＢＳを補充した、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で、ヒトＣＤ３６をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ−ＣＤ３６細胞（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を培養した。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した、低グルコースのＤＭＥＭ中で子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ−２（商標）、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を培養した。胆管癌腫細胞系であるＫＫＵ−１００細胞（恵与による）を、１０％ＦＢＳ、３％ＨＥＰＥＳ緩衝液、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するハムＦ−１２培地中で培養した。すべての培養物を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃に維持した。１ｃｍ２当たりの細胞５００個でＭＳＣを播種し、１７５ｃｍ２の滅菌フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で培養し、４８時間後に０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液により解離させて、接触阻害を阻止した。ＣＨＯ−ＣＤ３６細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＫＫＵ−１００細胞を、２５ｃｍ２の滅菌フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で培養し、毎週３回ずつ継代培養（１：４）し、４８時間ごとに培地を置換した。コンフルエント未満の単層は、０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液により解離した。
【００７２】
試験の前に、非同調細胞を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する緩衝液中で、１ｍＬ当たりの細胞１００，０００個まで希釈し、凝集およびマイクロチャネル壁面への吸着を阻止した。３．５％ｗ／ｖのデキストラン４０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ Ａｓｉａ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を補充することにより、細胞の沈殿を阻止するように、溶液密度を調整した。
【００７３】
［接触阻害および血清飢餓による間葉系幹細胞の同調］
接触阻害によりＧ１期の停止を開始させるため、１ｃｍ２当たりの細胞２０，０００個でＭＳＣを播種し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で４８時間にわたり培養した。血清飢餓によりＧ１期を停止させるため、１ｃｍ２当たりの細胞５００個でＭＳＣを播種し、ＦＢＳを伴わないＤＭＥＭ中で４８時間にわたり培養した。停止された細胞を、０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液により解離してから、７０％のエタノール中で３０分間にわたり固定した。
【００７４】
［マイクロチャネルの製作］
デバイスは、標準的なソフトリソグラフ法（Ｘｉａ，Ｙ．ら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８（１）：１５３〜１８４ページ）を用いて、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）により製作した（図９Ａ）。略述すると、まず、６インチのシリコンウェハーにパターンを描き、深堀反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を用いてエッチングし、ウェハー上にチャネルを画定する。エッチングの後、パターンが描かれたシリコンウェハーを、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈペルフルオロオクチル）シラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で２時間にわたり処理して、ＰＤＭＳ鋳型のリリースを促進した。シラン化の後、硬化剤と１０：１（ｗ／ｗ）の比で混合したＰＤＭＳプレポリマーを、シリコン原型へと注入し、７０℃で２．５時間にわたり硬化させた。次いで、硬化したＰＤＭＳ鋳型をシリコンウェハーから剥離させ、その後のＰＤＭＳ鋳造のための母型として用いた。次に、このＰＤＭＳ母型を２時間にわたりシラン化し、その後のＰＤＭＳ鋳型のリリースを支援した。所望のパターンによる最終ＰＤＭＳ鋳型における硬化の後、１．５ｍｍの生検用パンチを用いて、入口および出口のための小孔を開けた。次いで、ＰＤＭＳ鋳型を酸素プラズマ処理（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｆｅｍｔｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いて、顕微鏡用スライドガラス（１インチ×３インチ×１ｍｍ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に不可逆的に接着させた。
【００７５】
［デバイスの特徴づけ］
蛍光ポリスチレンビーズ（２５μｍ：緑色、１５μｍ：青色、および１０μｍ：赤色）（ＩＴＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を、均等の比率で、１％ＢＳＡを伴う１×ＰＢＳおよび３．５（ｗ／ｖ）倍濃度のデキストラン４０中に、１ｍＬ当たりのビーズ１．２×１０５個の総濃度で懸濁させた。螺旋状マイクロ流体デバイスを特徴づけるために、ビーズの混合物および細胞懸濁液を６０ｍＬのシリンジに充填し、２．５ｍＬ／分の流速で駆動されるシリンジポンプ（ＮＥ−１０００、Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、マイクロチャネル内に注射した。１２ビットのＥＭＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎＥＭ＋ ８８５、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を装備した倒立型落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、流動を実験的に観察した。試験後、出口から回収される細胞試料の顕微鏡画像を収集し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、細胞サイズを写真から計算した。
【００７６】
［ＦＡＣＳを用いる細胞周期の解析］
分取された試料に対して、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いるフローサイトメトリー解析を実施し、細胞内のＤＮＡ含量を解析した（Ｗｅｒｓｔｏ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｂ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２００１．４６（５）：２９６〜３０６ページ）。分取された同調細胞試料は、１×ＰＢＳ中で洗浄し、７０％のエタノール中、４℃で３０分間にわたり固定した。次いで、６００ｇで５分間にわたり細胞を遠心分離し、１×ＰＢＳ、３．８ｍＭのクエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、１０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ（ｉ−ＤＮＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、および５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を含有する染色溶液中で３０分間にわたりインキュベートした。次いで、ＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）およびＣｙｆｌｏｇｉｃ（ＣｙＦｌｏ Ｌｔｄ、Ｆｉｎｌａｎｄ）データ解析ソフトウェアを用いるＦＡＣＳ解析を実施することにより、染色した細胞を、同調効率について調べた。
【００７７】
［結果および考察］
［デザイン原理］
図９Ａは、螺旋状分離装置の概略図を示す。マイクロ流体システムにおいて慣性力を用いる、サイズベースの細胞分離は、それらの高分離分解能、および極めて高度なスループットのために関心を集めている。ポアズイユ流条件下にある単純な粒子含有管内流では、せん断誘導性揚力と壁面誘導性揚力との均衡により、懸濁する粒子を、管辺縁部の周囲に環状形に平衡化させる、「管状絞込み」効果が生じる（Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ、１９６１、１８９：２０９〜２１０ページ；Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，１９６２，１４（０１）：１１５〜１３５ページ；Ｍａｔａｓ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，２００４，５１５：１７１〜１９５ページ）。ＣｈｕｎおよびＬａｄｄは、断面が矩形のチャネルでは、揚力（ＦＬ）が、チャネル断面にわたる８カ所の異なる位置において粒子を平衡化させることから、管と比較した対称性の破れが反映されることを裏付けた（Ｃｈｕｎ，Ｂら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ、２００６、１８：０３１７０４ページ）。Ａｓｏｍｏｌｏｖによる数値計算は、この揚力が、粒子サイズ（ｄ）に極めて感受性であり、その４乗に伴って変化する（ＦＬ∝ｄ４）ことを示す（Ａｓｍｏｌｏｖ，Ｅ．Ｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，１９９９，３８１：６３〜８７ページ）。近年、この慣性による粒子の移動が、１．９μｍの粒子と５９０ｎｍの粒子とを分離するためのマイクロチャネル流において用いられている（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、２００９、７（２）：２１７〜２２６ページ）。ｄ／Ｄ≧０．０７［式中、Ｄは、マイクロチャネルの直径である］では、これらの慣性揚力が顕著に大きく、この結果、粒子の平衡化が短い距離内で生じ、マイクロ流体システムにとって理想的となることを研究は示している（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９，７（２）：２１７〜２２６ページ；Ｄｉ Ｃａｒｌｏ， Ｄ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７、１０４（４８）：１８８９２ページ； Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｒ．Ｅ．ら， Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｄｒｉｖｅｎ ｆｌｏｗ ｉｎ ａ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｕｉｔ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｏｌｏｇｙ， １９９７．４１：６２１ページ）。低アスペクト比の矩形マイクロチャネルでは、マイクロチャネルの直径Ｄを、マイクロチャネルの高さ（Ｈ）に近似することができる（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８、２０：１０１７０２ページ）。
【００７８】
螺旋形状のマイクロチャネルでは、外向きの遠心力により、マイクロチャネルの上半分および下半分において、ディーン渦としてもまた知られる反転渦がもたらされる。これらの二次的なディーン渦は、懸濁する粒子に対して抗力を及ぼし、粒子を渦の中に引き込む。このディーン抗力（ＦＤ）の大きさは、粒子サイズおよびチャネル断面内の粒子の位置に伴って変化する（ＦＤ∝ｄ）。したがって、螺旋状マイクロチャネル内を流動する粒子は、慣性揚力およびディーン抗力の両方の下に置かれる。慣性揚力（ＦＬ）と、ディーン抗力（ＦＤ）との相互作用により、８カ所の平衡位置は、各々がディーン渦の上腕内および下腕内にある、チャネル内壁近傍の２カ所だけに縮減される（Ｒｕｓｓｏｍ，Ａ．ら，Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ、２００９，１１：０７５０２５ページ）。２カ所の平衡位置は、マイクロチャネルの高さに沿って互いに重なり合い、所与の粒子サイズに対して、マイクロチャネルの内壁から同じ距離に位置する、すなわち、マイクロチャネルの幅にわたる単一の位置として目視される（図９Ｂ）。このフォーカシング位置は、ＦＬおよびＦＤの両方に依存するので、粒子サイズに伴って顕著に変化する（ＦＬ／ＦＤ∝ｄ３）。これは、サイズの異なる粒子が、マイクロチャネル断面内で、側面方向の異なる位置を占め、最大の粒子が、チャネルの内壁に最も近接することを示唆する（Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２００９，９（２０）：２９７３〜２９８０ページ）。このため、分枝状出口をデザインすることにより、異なるサイズの画分が抽出され、分離が達成されることができる。
【００７９】
慣性揚力とディーン力との組合せ効果を用いる、持続的なサイズベースの分離は、Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉらにより、単回の通過による１０μｍ、１５μｍ、および２０μｍの粒子の分離、およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞とＣ６ラット神経膠腫細胞との分離に適用された（Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２００９、９（２０）：２９７３〜２９８０ページ）。Ｒｕｓｓｏｍらは、この技法を、血液中における白血球の濃縮を達成するのにさらに適用した（Ｒｕｓｓｏｍ，Ａ．ら，Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ、２００９、１１：０７５０２５ページ）。本研究において、本発明者らは、この原理を、細胞周期におけるそれらの相に基づいて細胞を同調させるのに適合させた。このデバイスの作動原理は、細胞容量（および、したがって、細胞サイズ）と細胞周期におけるその相との関係を利用して、細胞を同調させる。本明細書で説明する通り、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、Ｇ１／Ｇ２期細胞、Ｓ期細胞、およびＧ２／Ｍ期細胞の同調集団へとサイズにより画分化した。
【００８０】
デザイン原理を裏付け、流動条件を決定するため、螺旋状マイクロチャネル内で、サイズが２５μｍ、１５μｍ、および１０μｍの蛍光標識したポリスチレンビーズの混合物を調べた。ビーズの直径は、哺乳動物細胞のサイズ範囲を模倣するように選択した。マイクロチャネルのデザインは、１つの入口および８つの分枝状出口を伴う、９つのループによる螺旋形状からなった。異なる細胞型について、マイクロチャネルの幅は、５００μｍで固定し、高さは、ｄ／Ｄ比が＞０．０７を満たすように変化させた。図９Ｂは、２．５ｍＬ／分の最適化させた流速で、マイクロチャネルの入口および出口において収集したマイクロビーズの蛍光重ね合せ画像を示す。流動が出口に到達する時間までに、２５μｍ、１５μｍ、および１０μｍのビーズは、マイクロチャネル断面にわたる３つの異なる流れにフォーカスされ、それぞれ、出口１、出口２、および出口３において効率的に回収される。
【００８１】
［永久培養物の同調］
指数関数的に増殖する哺乳動物細胞培養物では、Ｇ１期の新生細胞が、この培養物のサイズ分布の下端のサイズである（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，６０（６）：１０９９〜１１０６ページ）。細胞が、タンパク質および脂質の合成を介して臨界サイズとなったとき、細胞は、後期Ｇ１期において新たな細胞周期を開始し、Ｓ期においてＤＮＡを合成する。細胞成長は、細胞が、Ｇ０／Ｇ１期における細胞の元のサイズの約２倍まで成長する有糸分裂期（Ｍ期）まで持続する。これに対応して、Ｇ２／Ｍ期における細胞は、２コピーずつのＤＮＡを有する。
【００８２】
２つの癌細胞系（ＨｅＬａ細胞およびＫＫＵ−１００細胞）を用いて、デバイスの同調性能を探索した。ＨｅＬａ細胞集団およびＫＫＵ−１００細胞集団の平均直径が、それぞれ、１６．３±２．５μｍおよび１７．８±２．４μｍと測定されたので、高さ１４０μｍの螺旋状マイクロチャネル（ｄ／Ｈ≧０．０７の条件を満たす）を用いて細胞を分取した。細胞をマイクロチャネルに導入すると、サイズ分布が広範な非同調細胞が、マイクロチャネルの内側の半分に沿った、側面方向の異なる位置において、異なる軌跡へと分離される。分取後、出口１〜４から回収される非分取（対照）細胞および分取細胞の光学顕微鏡画像を撮影し、これらの直径を記録および解析した。細胞を、それらのサイズに基づき分離することに成功した。最大の細胞集団は、マイクロチャネルの内壁に最も近接した出口（出口１）において回収され、平均直径は、１９．４±５．６μｍ（ＨｅＬａ）および２４．６±３．０μｍ（ＫＫＵ−１００）であった。最小のＨｅＬａ細胞集団およびＫＫＵ−１００細胞集団は、出口４において回収され、平均直径は、それぞれ、１３．５±１．５μｍおよび１６．６±２．４μｍであった。同様に、別の細胞系であるＣＨＯ−ＣＤ３６細胞もまた、より大型のサイズ分布（１３．３〜３６．７μｍ）を収容する、高さ２００μｍのマイクロチャネルを用いて、サイズにより画分化した。
【００８３】
細胞周期の異なる相にある細胞は、細胞内のＤＮＡ含量により識別することができる。異なる相における分離細胞の分布は、フローサイトメトリー解析を用いて推定した。前出で言及した通り、Ｇ２／Ｍ期にある細胞のＤＮＡ蛍光強度は、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の２倍であることが典型的である。各相における細胞の百分率を計算し、二倍体または凝集体の細胞は、蛍光のパルス面積対パルス幅のプロットを用いて識別した（Ｗｅｒｓｔｏ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｂ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００１．４６（５）：２９６〜３０６ページ）。図１０Ａ〜１０Ｃは、ＨｅＬａ細胞、ＫＫＵ−１００細胞、およびＣＨＯ−ＣＤ３６細胞を同調させた後、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期において分取された一倍体細胞のＤＮＡ含量の分布を示すヒストグラムを表示する。分離後、出口４から回収された細胞では、高度の細胞同調性が達成され、ＨｅＬａ細胞のうちの８４％、ＫＫＵ−１００細胞のうちの９６％、およびＣＨＯ−ＣＤ３６細胞のうちの８６％が、Ｇ０／Ｇ１期に同調した。同時に、出口１から回収された細胞でも、Ｇ２／Ｍ期における２〜３倍の濃縮が達成された。
【表１】
【００８４】
これらの結果は、他のマイクロ流体システムを用いて報告された結果（Ｋｉｍ，Ｕ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７，１０４（５２）：２０７０８ページ；Ｔｈｅｖｏｚ，Ｐ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，８２：３０９４〜３０９８ページ；Ｃｈｏｉ，Ｓ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，８１（５）：１９６４〜１９６８ページ；Ｍｉｇｉｔａ，Ｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，２：６５７〜６６０ページ）と同等である。しかし、本技法の高度な流動スループットは、報告されている他のマイクロフルイディクス法より顕著に高量である、１時間当たりの細胞約１５×１０６個を画分化することが可能である。パッシブの分取原理はまた、＞９０％の細胞生存率も確保する。各種のマイクロ流体細胞周期同調システムの概要を表２に示す。
【表２】
【００８５】
［初代培養物（ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ））の同調］
次いで、デバイスが、初代細胞系（骨髄）由来のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を同調させる能力について調べた。癌細胞系または形質転換細胞系と異なり、ｈＭＳＣは、接触阻害に対する感受性が高い。１５００ｃｍ−２および３０００ｃｍ−２の密度で播種したｈＭＳＣの細胞内ＤＮＡ含量を解析すると、培養の２日後において、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞が実質的に少なくなる。したがって、Ｓ期の細胞集団およびＧ２／Ｍ期の細胞集団を濃縮するため、５００ｃｍ−２のより低密度で細胞を播種し、２日間にわたり培養してから分取した。図１１Ａ〜１１Ｃは、出口１〜４から回収された分取ｈＭＳＣの光学顕微鏡写真および生存率の結果を示す。出口１から回収されたｈＭＳＣの平均細胞直径は、２３．５±５．６μｍであり、出口４から回収された細胞（約１５．５±２．１μｍ）より顕著に大きかった。分離後、トリパンブルー除外アッセイおよび長時間にわたる再培養により、細胞の生存率を評価した。分取細胞の生存率は、対照の非分取ＭＳＣの生存率と同様であり、各出口から回収された細胞のうちの９０％超が色素を含まなかったことから、いかなる物理的な損傷を与えずに細胞が分取されたことが示される（図１１Ｂ）。培養の１４日後、分取ｈＭＳＣの形態が、非分取（対照）細胞の形態と類似していたことから、分取後においても細胞生存率が維持されていることがさらに裏付けられる（図１１Ｃ）。
【００８６】
ＤＮＡについてのヒストグラムにより示される通り、対照のＭＳＣ培養物では、細胞のうちの５６．２％がＧ０／Ｇ１期にあり、２４．３％がＳ期にあり、１９．９％がＧ２／Ｍ期にあることが判明した（図１２）。同調後、出口２から回収された細胞集団が、Ｓ期にある細胞集団およびＧ２／Ｍ期にある細胞集団を組み合わせて７２．７％であったのに対し、出口４からの細胞のうちの８６．１％は、Ｇ０／Ｇ１期に同調していた（表１）。これらの結果は、非同調試料の３：１のＧ０／Ｇ１期集団対Ｇ２／Ｍ期集団の比が、出口４で回収される試料では、１６：１へと濃縮されていることを示す。同様に、出口１で回収された試料では、Ｇ２／Ｍ期集団の４倍の濃縮が得られる。
【００８７】
ｈＭＳＣがＧ０／Ｇ１期で同調していたことを実験的に裏付けるために、最小のｈＭＳＣ集団（出口４）の同調性を、血清飢餓および接触阻害によりＧ０／Ｇ１期で停止させたｈＭＳＣと比較した。接触阻害による７６．４％、および４８時間にわたる血清飢餓による７７．５％と比較して、デバイスの出口４から回収されたｈＭＳＣのうちの８６．２％が、Ｇ０／Ｇ１期で同調していることが判明した。出口４から回収されるｈＭＳＣの対応する直径（１５．５±２．１μｍ）は、血清飢餓細胞（１６．９±４．２μｍ）および接触阻害細胞（２３．３±３．８μｍ）よりサイズ分布が狭い。接触阻害は、ＤＮＡ量が同様の細胞をもたらしたが、停止させた集団の細胞サイズは、元の培養物と同程度に均質性を欠いていた（２１．９±３．５μｍ）ことが注目された。同調の成功についての主要な基準は、同調細胞集団におけるＤＮＡ含量が同様なことであるが、細胞のサイズ分布もまた、初期細胞と比較して、比較的均一なことである（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，６０（６）：１０９９〜１１０６ページ）。接触阻害群の細胞直径が広範囲にばらついていることは、細胞が、同様のＤＮＡ量を伴って停止しただけであり、タンパク質および質量の合成をもたらす他の細胞過程が真に同調したわけではなかったことを示す。これに対し、培養物から血清を除去した場合は、Ｇ１期のＤＮＡ量を有するｈＭＳＣを同調させ、物質合成を停止させたが、細胞のサイズ範囲は、本発明者らのデバイスにより同調させた細胞と比較して、やはり比較的大きかった。したがって、血清飢餓細胞は、ＤＮＡ量は比較的同様であったが、真に同調していたわけではなかった。また、血清飢餓させたｈＭＳＣの形状は、比較的多くの気泡を伴ってより不規則であったことから、血清飢餓に誘導されるストレス下においては、ｈＭＳＣの正常な生理状態の破壊が示されることも注目された。
【００８８】
デバイスにより同調させたｈＭＳＣが、同調分裂を経過するかどうかを、次に探索した。同調した細胞は、同様のサイズおよびＤＮＡ含量を有するだけでなく、比較的均一なコホートとして細胞周期を経過しうるということを基本的な仮定とする。この仮説を検証するため、Ｇ０／Ｇ１期における同調性を８６％とする、出口４から回収したｈＭＳＣを再播種し、２４、４８、および７２時間後にそれらのＤＮＡ含量を解析した（図１３）。興味深いことに、培養の２４時間後、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にある細胞の百分率が７９．７％であったことから、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の大半が、後続の相へと進行したことが示される（表３）。
【表３】
【００８９】
哺乳動物細胞は、Ｇ１／Ｓ期に１６〜２４時間とどまり、Ｇ２／Ｍ期にとどまるのは約２〜３時間だけであることが典型的である（Ｋｉｍ，Ｕ．ら，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｐｈａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００７、１０４（５２）：２０７０８ページ）。したがって、培養の２４時間後には、細胞の大半が、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にあることが見出されると予測される。しかし、細胞の同調性は、分裂間期における確率的変動の結果として、時間と共に減衰した。細胞増殖の接触阻害により、Ｇ０／Ｇ１期のｈＭＳＣ集団が、培養の７４時間後に６９．４％へと増大した。アフィジコリン、ロスコビチン、およびコルヒチンなど、多くの化学的方法または「バッチ処理」が、細胞培養物を、その細胞培養物の特定の相で停止させるのに用いられているが、正常な細胞周期の進行は破壊されることが多い（Ｃｈｏｉ，Ｓ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，８１（５）：１９６４〜１９６８ページ）。例えば、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄらは、チミジン−ノコダゾール遮断を用いて、ＨｅＬａ細胞をＧ２期で停止させた（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２００２，１３（６）：１９７７ページ）。停止手順を解除して１２時間後、ただ１つの相または多くとも２つの相に由来する細胞ではなく、細胞周期のすべての相に由来する細胞が存在した。これに対し、本明細書における結果は、デバイスにより同調させたｈＭＳＣが示す細胞分裂は、比較的同調していることを示す。
【００９０】
［結論］
本明細書では、哺乳動物細胞を、サイズに基づいて細胞周期の異なる段階へと画分化するのに、慣性力とディーン抗力との組合せ効果を用いる、螺旋状マイクロ流体デバイスの適用が裏付けられる。デバイスは、極めて高度な試料スループット（１時間当たりの細胞約１５×１０６個）を可能とし、これにより、試料の処理時間を顕著に短縮する持続的作動を含め、他のマイクロ流体による分離法を上回る多くの顕著な利点をもたらす。パッシブの作動原理は、機能性のための外力の場または阻害性化学物質を組み込む必要を排し、これにより、分取細胞の完全性および生存率が保存される（＞９０％）。したがって、本明細書では、マイクロフルイディクスの使用により、生存率を顕著に上昇させながら、細胞周期を同調させるハイスループットがもたらされることが裏付けられる。哺乳動物細胞の懸濁液を直接分離し、同調させうるので、ＦＡＣＳおよびＣＣＥなどの他の方法とは異なり、試料の調製ステップが不要であり、処理時間がさらに短縮され、処理費用がさらに削減される。細胞周期用のマイクロ流体デバイスの性質が、ハイスループットであり、かつ侵襲性を最小とするものであるとすれば、バイオテクノロジーに関する研究において様々に適用することができ、有用となりうるであろう。
【実施例３】
【００９１】
［循環腫瘍細胞をハイスループットで単離するための、せん断変調型希少細胞抽出法によるバイオチップ］
［材料および方法］
［細胞の培養および試料の調製］
本研究では、２つのヒト乳腺癌腫細胞系であるＭＣＦ−７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞について調べた。１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と併せて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を補充した、低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で、ＭＣＦ−７細胞（ＨＴＢ−２２ＴＭ、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＨＴＢ−２６ＴＭ、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を培養した。培養物を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃に維持した。細胞を、２５ｃｍ２の滅菌フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で培養し、毎週３回ずつ継代培養（１：４）し、４８時間ごとに培地を置換した。コンフルエント未満の単層は、０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により解離した。対照実験および回収実験のため、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する緩衝液中で癌細胞を希釈し、配管およびマイクロチャネル壁面への非特異的吸着を阻止した。３％ｗ／ｖのデキストラン４０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ Ａｓｉａ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を補充することにより、細胞の沈殿を防止するように、緩衝液密度を増大させた（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、２０１０、１０（１９）：２６０５〜２６１３ページ）。ＲＢＣ平衡化実験では、健常ドナーから得た全血液をスピンダウンして、ＲＢＣを分離した。最終的な試料濃度を、試料緩衝液により相応に、多様なヘマトクリット値（０．５％〜５％）に調整した。白血球対照実験では、製造元の指示書に従い、全血液を、ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）により処理して、純粋な白血球集団を得た。
【００９２】
［マイクロチャネルの製作］
デバイスは、二重鋳型形成工程（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ，２０１０，１０（１９）：２６０５〜２６１３ページ）を用いて、ポリジメチルシロキサンポリマー（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）により製作した。まず、収縮−拡張マイクロチャネルはＡＺ（登録商標）Ｐ４６２０フォトレジストを用いて、シリコンウェハーにパターンを描いた。リソグラフ法に従い、深堀反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を用いてマイクロチャネルをシリコンにエッチングした。次に、フォトレジストを剥離し、パターンが描かれたシリコンウェハーを、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクチル）シラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で２時間にわたりシラン化して、ＰＤＭＳ鋳型のリリースを促進した。次いで、硬化剤と５：１（ｗ／ｗ）の比で混合したＰＤＭＳプレポリマーを、シリコンウェハーへと注入し、７０℃で２時間にわたり硬化させた。より高比率の硬化剤を用いて、架橋形成の増大を促進し、これにより、容易に変形しがちである高アスペクト比の構造を製作するために、ＰＤＭＳ鋳型の硬さを増大させた。この硬化させたＰＤＭＳ鋳型が、今度は、その後のＰＤＭＳ鋳造のための原型（陰画の複製）として作用する。次いで、このＰＤＭＳ母型を２時間にわたりシラン化し、その後の、パターン化されたマイクロチャネルを伴うＰＤＭＳ鋳型のリリースを促進した。最後に、入口および出口のための小孔を開け、次いで、短時間にわたり、酸素プラズマ環境（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｆｅｍｔｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）へと曝露することにより、ＰＤＭＳ鋳型を、顕微鏡用スライドガラスに不可逆的に接着させた。プラズマ処理の後、表面を互いと速やかに接触させ、７０℃で３時間にわたり静置して、接着を完了させる。
【００９３】
［デバイスの特徴づけ］
試験の間、シリンジポンプ（ＮＥ−１０００、Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてレイノルズ数（Ｒｅ）を変化させながら、マイクロ流体デバイス内に試料を送入した。マイクロチャネルを、ハイスピードＣＣＤカメラ（ＦＡＳＴＣＡＭ １０２４ ＰＣＩ、Ｐｈｏｔｒｏｎ、ＵＳＡ）を装備した倒立型位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１）に取り付けた。次いで、チャネルの出口において収集されるハイスピードのビデオ画像を、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを用いて解析した。
【００９４】
［免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ解析］
中央出口における試料および側方出口における試料に対してＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いるフローサイトメトリー解析を実施することにより、回収効率、回収率および濃縮率を決定するために実施された実験からの結果を解析した。免疫蛍光染色により、目視観察および定量化のために、多様な細胞型を差別化することが可能となった。流出試料を、１５分間にわたりＦｃＲブロッキング試薬と共にインキュベートして（１：１００；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、非特異的結合を遮断した後、４０分間にわたり、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート内皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）と共にインキュベートし（１：１００；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、癌細胞を同定した。４０分間にわたりイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＣＤ４５（１：１００；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）マーカーで染色することにより、末梢血白血球を同定した。
【００９５】
［結果および考察］
ＲＢＣは、すべての血液細胞のうちの＞９９％を占めるので、有意義な濃縮を達成するには、ＲＢＣを完全に除去することが枢要である。マイクロチャネルのデザインおよび試験条件は、マイクロチャネルのアスペクト比、流速、および試料のヘマトクリット値を含めた各種のパラメータが、ＲＢＣフォーカシングおよび側方出口からの除去に対して及ぼす影響を調べることにより最適化した。
【００９６】
［アスペクト比（ＡＲ）の影響］
図１７Ａおよび１７Ｂは、マイクロチャネルのアスペクト比がＲＢＣフォーカシングに対して及ぼす影響を示す。断面が矩形のマイクロチャネルでは、チャネル断面にわたるせん断変調を利用して、チャネルの長手に沿って、細胞を優先的に平衡化させることができる。高アスペクト比の別の利点は、より高流速で試料を処理し、これにより、スループットを増大させる能力である。アスペクト比の影響を調べるため、高さ２０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、および１５０μｍのマイクロチャネルを製作し、それぞれ、１、２．５、３．７５、５、および７．５のアスペクト比を得た。チャネルにわたるＲＢＣ分布を、アスペクト比の関数として示す合成画像およびラインスキャンを、図１７Ａおよび１７Ｂに示す。
【００９７】
正方形のマイクロチャネル（ＡＲ＝１）の場合、Ｒｅ＝１００および１％のヘマトクリット値とするとき、ＲＢＣは、チャネル断面にわたり、フォーカスの弱い細胞リングを形成する環状形で平衡化する（概略的に示す）。断面にわたり均一の流体せん断は、細胞を、それらの平衡位置において強くフォーカスさせるのに、より長いマイクロチャネル長を要求する。アスペクト比を２．５に増大させると、チャネル幅にわたる細胞の優先的移動、およびマイクロチャネルの高さに沿った平衡化が開始される。しかし、ラインスキャンは、すべてのＲＢＣが、所与のチャネル長で平衡位置にフォーカスしたわけではないことを明確に示す。アスペクト比を３．７５とするマイクロチャネルでは、このマイクロチャネルの高さで、すべてのＲＢＣが平衡化する。これは、マイクロチャネルの中央部に沿った、顕著な無細胞領域の形成により明らかである。アスペクト比を５へとさらに増大させると、チャネルの側壁へとより近接する、２つの強くフォーカスされた細胞バンドの移動が引き起こされる。本発明者らがマイクロチャネルのアスペクト比を７．５へと増大させると、興味深い効果が認められる。この極めて高度なアスペクト比のチャネルでは、フォーカスしたＲＢＣバンドが、内側バンドと外側バンドの２つに分割されることが観察される。この観察は、慣性移動に対するアスペクト比の影響について調べる、ごく近年の実験およびモデル化による研究（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ、「Ｓｈｅａｒ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｉｎｅｒｔｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」，２００９，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ；Ｇｕｐｔａ，Ａら，４７ｔｈ ＡＩＡＡ Ａｅｒｏｓｐａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００９，Ｏｒｌａｎｄｏ）と符合する。この挙動の原因となる正確な機構はいまだ不明であり、さらなる探索に値する。しかし、この影響は、分離適用には好ましくなく、したがって、本発明者らは、本研究を、アスペクト比を最大で５とするチャネルに限定する。
【００９８】
［レイノルズ数（Ｒｅ）の影響］
図１８Ａ〜１８Ｃは、ＲＢＣフォーカシングに対するＲｅの影響を示す。ハイスループットを得るには、血液試料を高流速で処理することが必要である。ＡＲ＝５（ｈ＝１００μｍ）のマイクロチャネルにおいて、ヘマトクリットを１％とする試料を用いて試験を行った。Ｒｅを１０〜１５０の範囲とするときのＲＢＣの平衡化について調べた。デバイスの故障を結果としてもたらす、マイクロチャネルにわたる高度の圧力降下のために、より高度の流速について調べることはできなかった。低度の流速（Ｒｅ≦２５）では、ＲＢＣに作用する慣性揚力が粘性抗力より弱く、このため、平衡化が観察されない。流速をＲｅ＝５０以上に増大させると、ＲＢＣが抗力を凌駕し、チャネルの側壁へと優先的に移動し、２つの十分に明確な細胞バンド（上方または下方から撮像すると、２つの異なるピークとして観察される）を形成することが可能となる。また、Ｒｅを増大させると、ＲＢＣの平衡位置が、マイクロチャネル壁面により近接するように移動することも観察された（Ｃｈｕｎ，Ｂら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００６，１８：０３１７０４ページ）。
【００９９】
フォーカシングの程度をＲｅの関数として定量化するため、２つのパラメータ：無細胞領域幅、および細胞バンド幅を定義した（図１８Ｂ）。無細胞領域幅は、ＲＢＣを完全に欠いた、マイクロチャネル中央部における、標準化されたマイクロチャネル幅である。無細胞領域幅は、２つの細胞占有領域間における距離の半値全幅（ＦＷＨＭ）を測定することにより、ＲＢＣの確率分布プロファイルから計算される。同様に、ＲＢＣにより占有される領域のＦＷＨＭを測定することにより、細胞バンド幅が計算される。図１８Ｃは、無細胞領域幅および細胞バンド幅をＲｅの関数としてプロットする図である。Ｒｅが増大するにつれ、大きな慣性揚力により、より強いＲＢＣフォーカシングが誘導される。これは、細胞バンドの幅の減少により明らかである（図１８Ｃ）。結果として、無細胞領域幅は、流速の増大に伴い増大する。Ｒｅが低値（＜１００）のときは、ＲＢＣフォーカシングがより強まる結果として細胞バンド幅が減少することから、マイクロチャネルの中央部における無細胞領域の増大が説明される。Ｒｅ＝１００を超えると、細胞バンド幅は一定を維持するが、２つのＲＢＣバンドが、チャネル側壁により近接するように移動することにより、無細胞領域の増大が説明される。ＲＢＣフォーカシングおよび側方出口における回収を最適とするには、Ｒｅの範囲を強いフォーカシング領域（≧１００）において操作することが重要である（図１８Ｃ）。
【０１００】
［ヘマトクリット値の影響］
次に、ＲＢＣフォーカシングをそれほど弱めることなく、これらのマイクロチャネルにおいて処理しうる最高度の試料ヘマトクリット値を決定した。全血液の処理（約４０％のヘマトクリット値）を伴う適用では、高ヘマトクリット値を伴う操作により、処理時間および解析時間を短縮することが望ましい。無細胞領域幅および細胞バンド幅のパラメータを用いて、最適の試験条件を決定した。ＡＲ＝５のマイクロチャネルにおいて、Ｒｅ＝１００で、ヘマトクリット値を０．５％〜５％の範囲として、実験を実施した。ヘマトクリット値の増大がＲＢＣの平衡化に対して及ぼす影響を示す合成画像およびラインスキャンを、図１９Ａ〜１９Ｃに示す。流入するヘマトクリット値が増大するにつれ、ＲＢＣバンド幅が直線的に増大し、結果として、中央の無細胞領域幅が減少した。容量画分（ヘマトクリット値）を増大させるときは、平衡化位置を占拠しようとするＲＢＣが増大する結果として、著明な細胞間相互作用により誘導される分散がもたらされるので、この傾向が予測される。
【０１０１】
ヘマトクリット値を３％以上へと増大させたところ、興味深い影響が観察された。前出の、アスペクト比を７．５とするマイクロチャネルで認められた通り、ここでもまた、細胞バンドが、内側および外側の２つの顕著なバンドへと分割されることが観察された。これらの複数のバンドの形成は、前出の、高アスペクト比のマイクロチャネルでも観察された（Ｇｕｐｔａ，Ａら，４７ｔｈ ＡＩＡＡ Ａｅｒｏｓｐａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００９，Ｏｒｌａｎｄｏ）が、今回の観察は、この現象の誘発に対して果たす容量画分の役割を示す。ここでもまた、これらの内側バンドおよび外側バンドの形成は、中央部の無細胞領域幅を減殺するので、分離適用には好ましくない。この理由で、本研究は、試験前に全血液を２０倍に希釈することを示唆する、ヘマトクリット値の最大値を２％とする試料に限定される。
【０１０２】
［絞込み幅がＣＴＣの単離および回収に及ぼす影響］
デザイン原理の節で言及した通り、希少細胞を他の血液細胞から成功裏に単離するには、「絞込み」幅を用いる。希少細胞の直径と同等である（希少細胞の直径より小さいか、または希少細胞の直径のオーダーにある）ように、この絞込み領域に沿った収縮幅をデザインすることにより、希少細胞が収縮チャネルを縦断するときに、希少細胞の効果的な「押込み」が確保される。しがたって、これらのより大型細胞の慣性の中心が、拡張領域へと流過するときに、マイクロチャネルの中心軸に沿って整列することから、分離が達成される（Ｙａｍａｄａ，Ｍ．ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，７６（１８）：５４６５〜５４７１ページ）（図２０）。裏付けとして、この技法を、ＣＴＣを単離するのに用いた。
【０１０３】
測定による平均直径を、それぞれ、１８．１±１．８μｍおよび１８．２±２．８μｍとする、２つのヒト乳腺癌腫細胞系であるＭＣＦ−７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞について調べた。ＣＴＣの平均サイズは、１５μｍを超える（Ｔａｎ，Ｓら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２００９，１１（４）：８８３〜８９２ページ；Ｖｏｎａ，Ｇ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０００，１５６（１）：５７〜６３ページ）ので、絞込み幅を１０μｍ、１２μｍ、および１５μｍとするマイクロチャネルをデザインして、側方出口におけるＣＴＣの喪失が最小となることを確保した。図２１Ａおよび２１Ｂは、チャネルのＲｅを増大させるときに、絞込み幅が、ＭＣＦ−７細胞の分離に対して及ぼす影響を示す。低値のＲｅ＝５０では、３つの収縮幅すべてについて、約９５％の腫瘍細胞が、中央出口で回収された。Ｒｅを増大させたところ、おそらくは、層流による高度なせん断応力下では、癌細胞の変形能が大きいために、回収効率の低下が結果としてもたらされた（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｂ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ，２００４，５９（２）：２０３〜２０９ページ；Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２００９，１１（３）：５５７〜５６４ページ）。高流速では、懸濁細胞と担体緩衝液との表面張力による不適合から、界面間応力が誘導され、ＣＴＣ形状の歪みがもたらされた。粘弾性の細胞は、球形から伸長した長球へと変形する（Ｂｏｒｎ，Ｃ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９２，４０（９）：１００４〜１０１０ページ）。ＣＴＣが伸長すると、それらの臨界寸法が、初期直径より小さくなるので、このために、ＣＴＣの有効な絞込みが回避される。重要であるが見過ごされることの多い因子である、高流速において圧力に誘導されるＰＤＭＳの変形が生じれば、これもまた、高流速における回収効率の低下の部分的な原因となりうるであろう。硬質プラスチック（ＰＭＭＡ、ＣＯＣ）などの代替的材料を考慮すれば、この問題を克服する可能性が高く、これにより、回収効率が増大するであろう。ＣＴＣは、極めて希少な細胞集団なので、本研究では、９０％の回収効率カットオフを目標とした。ＲＢＣだけで実施した実験からの結果は、Ｒｅ＝１００の流動が、これらを側方出口から除去するのに最適であることを示唆する。これらの結果に基づいて１０μｍのチャネル幅を、効率的なＣＴＣ回収に選択した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についても、同様の結果が観察された。
【０１０４】
絞込み領域を通過する癌細胞は、無視できない変形を受けるので、癌細胞が受ける大きな応力および高度のせん断のために、癌細胞の完全性および生存率が懸念される。分離後、方法節で説明した手順を用いて、ＭＣＦ−７細胞を再播種して培養物中に戻すことにより、細胞の生存率を調べ、細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎおよびｇｒｏｗｔｈ）を観察した。培養の４日後、単離ＭＣＦ−７細胞の増殖速度は、対照細胞の増殖速度と同様であり、形態には認識可能な変化が見られなかった。結果は、開発された技法が、単離時において細胞に対して及ぼす影響は最小限であり、分取後における高い細胞生存率を維持することを裏付ける。
【０１０５】
その後の下流におけるＣＴＣ解析では、単離試料には末梢血白血球（ＰＢＬ）が存在するために、夾雑を最小化することが重要である。ＰＢＬを除去するデバイスの効率を評価するため、ＲＢＣ溶解により単離されたヒト白血球の純粋集団を、Ｒｅを変化させながらマイクロチャネル（絞込み幅＝１０μｍ）内に流した。ヒト白血球の平均直径は、直径１０μｍより小さい（Ｓｅｔｈｕ，Ｐ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２００６，６（１）：８３〜８９ページ；Ｓｃｈｍｉｄ−Ｓｃｈｏｎｂｅｉｎ，Ｇ．Ｗ．ら，Ｂｌｏｏｄ，１９８０，５６（５）：８６６ページ；Ｄｏｗｎｅｙ，Ｇ．Ｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９０、６９（５）：１７６７ページ）ので、細胞絞込み領域におけるＰＢＬの流路は変化せずに維持され、このため、側方出口から濾出される（図２１Ｂ）。図から明らかである通り、Ｒｅ＝５０および７５のときは、慣性による細胞フォーカシングが弱いために、ＰＢＬの画分が、中央出口においてなおも回収される。しかし、Ｒｅ≧１００では、すべての白血球が、チャネルの側壁に沿って平衡化し、中央出口では細胞が回収されなかった（回収効率は約０％）。
【０１０６】
デバイスの性能をさらに評価するため、濃度を変化させるＭＣＦ−７細胞を、ＰＢＳ緩衝液中にスパイクし、バイオチップの中央出口から回収した。ＦＡＣＳを用いて入口の試料および中央出口の試料を解析し、回収率を確認した。試験中にＣＴＣが失われれば、潜在的な誤診をもたらしうるであろう。結果は、ＣＴＣの単離効率と符合する９０％の回収率を示したことから、試料を回収および解析するときに失われる細胞は無視しうる程度であることが示唆される。おそらく、絞込み領域に沿って細胞間の相互作用が増大するために、より高濃度（１ｍＬ当たりの細胞１０４個）では、ＣＴＣ回収率の低下（約８５％への低下）が観察された。
【０１０７】
［血液中におけるＣＴＣの濃縮］
デバイスの寸法および作動条件を特徴づけた後で、最適なパラメータを用いて、全血液中にスパイクしたＭＣＦ−７細胞をデバイスにより解析した。ＭＣＦ−７細胞（１ｍＬ当たりの細胞５００個）をスパイクした血液試料を、約１．５〜２％のヘマトクリット値まで希釈し、Ｒｅ＝１００で、アスペクト比＝５のマイクロチャネルを介して送入した。細胞絞込み領域の幅は、１０μｍに固定した。ＦＡＣＳおよび血球計を用いて、蛍光マーカーで標識した流出試料を解析し、分離による濃縮率を計算した。結果を表４に示すが、これにより、ＳＭＡＲＴデバイス（１段目）内の単回通過により、ＲＢＣについては約３００倍の濃縮率、およびＰＢＬについては約８５０倍の濃縮率が示され、ＣＴＣ回収率は約８５％である。
【表４】
【０１０８】
これらの濃縮率は、大半の細胞分離適用について相当な程度であるが、血液細胞を伴う分離は、理想的には、１０７〜１０８倍の濃縮を必要とする（Ｌａｒａ，Ｏ．ら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００４，３２（１０）：８９１〜９０４ページ）。絞込み領域において大型のＣＴＣが存在するために、そのすぐの近傍では流動場が撹乱されたので、この研究における濃縮率は限定的なものであった。結果として、少量のＲＢＣおよびＰＢＬが中央出口で回収された。これは、ＣＴＣの到達が、フォーカスしない血液細胞のバーストを常に伴う、出口において収集されたハイスピードのビデオ画像から明らかである。したがって、ＣＴＣを検出するためにより高度で有意義な濃縮率を達成するために、デバイスの中央出口から回収された試料を、デバイスにより再度処理し、夾雑する血液細胞を完全に除去した（２段目）。１段目からの出口配管を、カスケード状の構成で別のデバイスに接続することにより、これを実装した。２段目を付加することにより、ＭＣＦ−７の濃縮率は、ＲＢＣについて３．２５×１０５（５．５ ｌｏｇ１０）倍、およびＰＢＬについて約１．２×１０４（４．１ ｌｏｇ１０）倍へと顕著に増大し、全ＣＴＣ回収率の低下は最小（約８１％への低下）である。これは、血液１ｍＬ当たりのＲＢＣ約１５，０００個および血液１ｍＬ当たりのＰＢＬ８５０個未満に変換される（全血液１ｍＬ中のＲＢＣを５０億個とし、全血液１ｍＬ中のＰＢＬを１０００万個とする）。
【０１０９】
デバイスの濃縮性能は、他の一般的なＣＴＣ分取法と同等である（Ｎａｇｒａｔｈ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１７３）：１２３５〜１２３９ページ；Ｔａｎ，Ｓら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２００９，１１（４）：８８３〜８９２ページ；Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｈ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００９、１２１６（４７）：８２８９〜８２９５ページ；Ｖｏｎａ，Ｇ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０００、１５６（１）：５７〜６３ページ；Ｚｈｅｎｇ，Ｓ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００７，１１６２（２）：１５４〜１６１ページ；Ｚａｂａｇｌｏ，Ｌ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ，２００３，５５（２）：１０２〜１０８ページ；Ｌａｒａ，Ｏ．ら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００４、３２（１０）：８９１〜９０４ページ）。例えば、Ｚａｂａｇｌｏらにより用いられているポリカーボネート膜による濾過法は、ＣＴＣ回収率を＞９０％とし、０．１％ＰＢＬを伴うことについて報告している（Ｚａｂａｇｌｏ，Ｌ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ，２００３，５５（２）：１０２〜１０８ページ）。Ｖｏｎａらにより報告されているＩＳＥＴ法は、回収率を約８０％とし、血液１ｍＬ当たりのＰＢＬをわずかに２０個とする、優れたＣＴＣ濃縮率について報告している（Ｖｏｎａ，Ｇ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０００、１５６（１）：５７〜６３ページ）。Ｌａｒａらは、赤血球溶解を、免疫磁性によるＰＢＬの枯渇と組み合わせる、２ステップの陰性選択法を用いて、５．１７ ｌｏｇ１０倍のＣＴＣ濃縮率を報告した（Ｌａｒａ，Ｏ．ら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００４，３２（１０）：８９１〜９０４ページ）。ＲＢＣは、溶解により１００％が効率的に枯渇したのに対し、単離試料は、約０．３％のＰＢＬに由来するＤＮＡにより依然として汚染されているので、濃縮の倍数はデバイスと同等である。デバイスの性能はまた、１０４〜１０６倍の濃縮を得ることが可能な免疫媒介ＣＴＣ分離法（免疫磁性ＣＴＣ分離法、免疫蛍光ＣＴＣ分離法、および免疫結合ＣＴＣ分離法を含めた）（Ｎａｇｒａｔｈ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１７３）：１２３５〜１２３９ページ；Ｐａｔｅｒｌｉｎｉ−Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｐ．およびＮ．Ｌ．Ｂｅｎａｌｉ，Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ，２００７，２５３（２）：１８０〜２０４ページ）とも同等である。
【０１１０】
ＲＢＣから白血球を成功裏に濃縮することにより、血液から他の低量の細胞を単離するためのデバイスの多用途性が裏付けられた。これは、細胞絞込み領域における収縮幅を８μｍへと変化させ、これにより、中央出口においてより大型のＰＢＬの回収を可能とすることだけによって達成された（Ｓｅｔｈｕ，Ｐ．， Ａ． Ｓｉｎ，ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２００６，６（１）：８３〜８９ページ；Ｓｃｈｍｉｄ−Ｓｃｈｏｎｂｅｉｎ，Ｇ．Ｗ．ら，Ｂｌｏｏｄ、１９８０、５６（５）：８６６ページ；Ｄｏｗｎｅｙ，Ｇ．Ｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９０、６９（５）：１７６７ページ）。側方出口を介してすべてのＲＢＣを効率的に除去することにより、デバイスは、中央出口において、１００倍の白血球の濃縮率を達成し、約６０％のＰＢＬ回収率をもたらした。
【０１１１】
オンチップで血液解析を行い、血液から希少細胞を単離するには、短時間でミリリットル単位の臨床血液試料を処理するハイスループットが重要である。４００μｌ／分の流速（Ｒｅ＝１００）で、ヘマトクリット値を２％とする試料を調べることにより、このデバイスは、単体のデバイスを用いて、１分間当たりの細胞約１０８個を処理することが可能である。これは、１ｍＬの全血液に対する約５０分間の処理時間へと転換される。わずか４つの並列チャネルをデザインすると、解析時間を、事実上、血液１ｍＬ当たり１５分間未満にまで短縮することができ、他の一般的なＣＴＣ検出法より顕著に高速となる。マイクロ流体素子による免疫結合法は、ＣＴＣと抗体でコーティングした表面との最大の相互作用を可能とし、分離時におけるＣＴＣの解離を阻止する、低流速による処理に限定されることが典型的である（Ｎａｇｒａｔｈ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１７３）：１２３５〜１２３９ページ；Ｇｌｅｇｈｏｒｎ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、２０１０、１０（１）：２７〜２９ページ）。ＣＴＣの物理的捕捉と関連する、一般的なマイクロ流体濾過法はまた、トラップまたは小孔により変形することなく、ＣＴＣの捕捉の維持を確保するためにも、低流速に限定されている（Ａｄａｍｓ，Ａ．Ａ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００８，１３０（２７）：８６３３〜８６４１ページ；Ｔａｎ，Ｓら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２００９．１１（４）：８８３〜８９２ページ）。さらに、いかなる捕捉されたＣＴＣの物理的な存在も、捕捉領域内の流動パターンを変化させるので、ＣＴＣカウントがより大きくなると、捕捉効率が低下する。解析のための複雑な回収手順と共に、血液処理後に必要とされるさらなる洗浄ステップは、全処理時間をさらに延長する。デバイスは、遺伝子解析、薬物スクリーニング、および分子標的癌治療など、下流における分子アッセイのためにＣＴＣの回収を可能とする、持続的な分取能および回収能をもたらす。単離細胞は、終点調査を行うのではなく、リアルタイムで計数および解析することもできる。
【０１１２】
［結論
血液から生存希少細胞を単離する、ハイスループットで高感度な技法について説明した。血液から低量の細胞をサイズベースで単離するデバイスでは、せん断変調性の慣性による細胞フォーカシングを用いた。開発したデバイスの適用として、高度な効率（約８０％）およびスループット（約４００μＬ／分）を伴う、末梢血からのＣＴＣの分離が裏付けられた。デバイスは、２段式のカスケード型配置を用いて、赤血球（ＲＢＣ）については３．２５×１０５倍の濃縮率、およびＰＢＬについては１．２×１０４倍の濃縮率をもたらす。試料の希釈は必要とされるが、単純なチャネルデザインは、数分間以内に、ミリリットル単位の臨床血液試料を解析する能力を伴う簡易な並列化を可能とする。デバイスの下流にチップベースの検出を組み込むことにより、臨床癌診断のための強力なツールがもたらされる。最後に、絞込み幅を特定の適用にカスタマイズすることにより、胎児細胞および幹細胞を含め、血液から他の希少細胞を濃縮するのにチップを容易に用いることができる。
【０１１３】
本明細書で引用されるすべての特許、出願公開、および参考文献による関連する教示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１１４】
その例示的な実施形態に言及しながら、本発明を具体的に示し、説明してきたが、付属の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明において多様な形態および詳細の変化を行いうることが、当業者により理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１０年３月４日に出願された、米国特許仮出願第６１／３１０，３８７号、および２０１０年９月１７日に出願された、米国特許仮出願第６１／３８３，８８１号の利益を主張するものである。上記出願による開示の全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
［発明の分野］
細胞を分離するためのマクロスケールの対流法には、細胞のサイズ、変形能、および密度の相違を利用して標的細胞を濾別する、膜ベースのフィルターを用いる物理的濾過および密度勾配による遠心分離が含まれる。これらの技法は労働集約的であり、多段階の試料調製を必要とし、これにより、アーチファクトが導入される場合もあり、または所望の細胞が失われる場合もある。膜濾過法はまた、容易に閉塞を起こしやすく、頻繁な洗浄を必要ともする。さらにまた、濾過法および遠心分離法にかけられた標的細胞の元の表現型が、機械的な応力に誘導されて変化する証拠も報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、後続の解析のために、細胞の喪失を最小化し、元の標的細胞の表現型を維持することができる、血液試料を処理するためのより簡易でより効率的な技法を開発する必要が明らかに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
マイクロフルイディクスは、主に、その長さのスケールが小さく、これにより、血液分離時における細胞内微小環境をより良好に制御することが可能となるため、血液試料を処理するのに特に好適である。ＲＢＣの変形能の研究、血小板および血漿の分離、白血球の分離、ならびに血液に由来するＣＴＣ（循環腫瘍細胞）または胎児細胞などの希少細胞の単離など、異なる適用のためのオンチップの血液解析が、複数のグループにより示されている。しかし、これらのマイクロ流体システムにおける主要な限界は、試料が希釈されるため、または流速が遅いために、処理のスループットが低度なことであり、このために、これらのマイクロ流体システムは、通常容量がミリリットル単位である臨床血液試料を処理するのに不適となっている。本明細書では、これらの問題を克服するマイクロ流体デバイスについて説明する。
【０００５】
したがって、本発明は一般に、試料における（１または複数の）細胞を検出する方法を対象とする。具体的な態様では、本発明が、血液試料（例えば、全血液）における１または複数の疾患血液細胞を検出する方法を対象とする。この方法は、血液試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、非疾患血液細胞と比較して疾患血液細胞の変形能が低下していることに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って疾患血液細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、存在する場合は、疾患血液細胞が、チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、非疾患血液細胞が、チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動し、これにより、試料における１または複数の疾患血液細胞を検出する。
【０００６】
別の態様では、本発明が、個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する方法を対象とし、この方法は、試料を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、存在する場合は、循環腫瘍細胞が、チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、試料中の他の細胞が、チャネルの別の部分に沿って第２の出口へと流動し、これにより、個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞を検出する。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明が、非同調細胞の混合物（例えば、懸濁液）から１または複数の同調細胞を単離する方法を対象とする。この方法は、非同調細胞の混合物を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入し、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って同調細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、より大型の同調細胞が、チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、より小型の同調細胞が、チャネルの他の部分に沿って少なくとも１つの他の出口へと流動し、これにより、非同調細胞の混合物から１または複数の同調細胞を単離するステップを含む。
【０００８】
なお別の態様では、本発明が、個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する方法を対象とする。この方法は、試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、存在する場合は、循環腫瘍細胞が、チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、試料中の他の細胞が、チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動し、これにより、個体の試料における１または複数のＣＴＣを検出する。
【０００９】
本発明は、試料を化学的に修飾することなく、臨床試料のより迅速な処理を可能とし、これにより、処理時間を短縮し、処理費用を削減する、比較的高流速での持続的作動、ならびに後続の生物学的アッセイのための生細胞の回収を含めた多くの利点を有する。
【００１０】
同じ参照符号が異なる図面を通して同じ部分を指す付属の図面において示される通り、前出は、本発明の例示的実施形態についての以下のより具体的な説明から明らかであろう。図面は、必ずしも原寸大ではなく、代わりに、本発明の実施形態の例示に力点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のマイクロチャネルのデザインおよび分離の原理を示す概略図である。１Ａ：デバイスの寸法を示すマイクロ流体のデザインの一例を示す概略図である。このデバイスでは、マイクロチャネルが、入口では幅１００μｍのセグメントを含み、これが、１５μｍまで狭窄する。出口では、マイクロチャネルが、１：２：１の比に分割された３つの出口の分枝を伴う、目視観察を改善するための幅１００μｍの区分へと開口した。マイクロチャネルの高さは、１０μｍに固定した。１Ｂ：分離の原理を例示する、マイクロチャネルの断面概略図および上面概略図である。流動が出口に到達し、３つの出口系を用いて濾出されると、マイクロチャネルの入口では無作為に分布させた感染赤血球（infected red blood cells：ｉＲＢＣ）が、チャネルの側壁へと辺縁趨向する。
【図２】２（Ａ）：ヘマトクリット値を１％とする試料、２（Ｂ）：ヘマトクリット値を１０％とする試料、および２Ｃ：ヘマトクリット値を４０％とする試料において、流速を変化させるときの、マイクロチャネル出口における、標準化された３μｍビーズの分布を示すヒストグラムである。
【図３】３Ａ：５μＬ／分の流速で、試料のヘマトクリット値を変化させるときの、側方出口における３μｍビーズの濾過効率についてのグラフ、および３Ｂ：ヘマトクリット値を４０％とする試料において、流速を変化させるときの、側方出口における３μｍビーズの濾過効率についてのグラフである。また、図では、出口におけるチャネル断面にわたるビーズの分布を示す蛍光画像も示される（白色の点線は、おおよそのチャネル壁面の境界を示す）。
【図４】４Ａ：ヘマトクリット値を１０％とする試料、および４（Ｂ）：ヘマトクリット値を４０％とする試料において、流速を変化させるときの、マイクロチャネル出口における、標準化されたｉＲＢＣの分布を示すヒストグラムである。３μｍのビーズによる結果とは対照的に、１０％のヘマトクリット値では、ｉＲＢＣの辺縁趨向が観察されない。４０％のヘマトクリット値では、すべての流速条件で、約８０％のｉＲＢＣが、側壁へと辺縁趨向する。
【図５】ヘマトクリット値を４０％とする試料において、流速を変化させるときの、側方出口における後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣの濾過効率についてのグラフである。また、図では、出口におけるチャネル断面にわたるＤＡＰＩ染色されたｉＲＢＣの分布を示す蛍光画像も示される（白色の点線は、おおよそのチャネル壁面の境界を示す）。
【図６】３つの出口で回収されるｉＲＢＣおよび正常ＲＢＣの濃度を示すフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）データのグラフである。プロットは、６Ａ：後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣ試料、および６Ｂ：環状期ｉＲＢＣ試料について、３つの出口にわたるｉＲＢＣの分布を示すカウント結果を例示する。結果は、後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣについて＞９０％の濾過効率、および早期環状期ｉＲＢＣについて約７５％の濾過効率を示す。
【図７】ＰＤＭＳで製作された、単一の入口および８つの均等に分割された出口（１〜８と表示する）を伴う、ＣＴＣを単離するために製作された螺旋状マイクロチャネルの写真である（目視観察のため、マイクロチャネルには染料を満たす）。図７Ａにはまた、螺旋状マイクロチャネルの出口区分を例示する顕微鏡画像も示される。
【図８】ＣＴＣを単離するための螺旋状分取装置の概略図である。入口では、血液細胞（ＲＢＣ、白血球、およびＣＴＣ）が、マイクロチャネル断面にわたり無作為に分布している。慣性揚力およびディーン渦の影響下において、これらの細胞は、それらのサイズに基づいて断面内の異なる位置において平衡化し、より大型のＣＴＣが、マイクロチャネル内壁に最も近接して平衡化する。次いで、８つの均等な間隔を置いた出口を用いて個々の細胞流を抽出し、分離を達成する。
【図９】図９Ａ：細胞周期を同調させるために開発した螺旋状マイクロ流体デザインの概略図（慣性揚力およびディーン抗力の影響下において、非同調細胞集団をサイズにより画分化して、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期の比較的純粋な細胞集団を得る。Ｇ２／Ｍ期の細胞が、大型サイズのために、マイクロチャネルの内壁に最も近接して平衡化した後、Ｓ期およびＧ０／Ｇ１期の細胞が平衡化する；挿入図は、ＰＤＭＳで製作した、１つの入口および８つの出口を伴う螺旋状マイクロチャネルの写真である）および９Ｂ：蛍光標識したポリスチレン粒子を用いるデザイン原理の検証を示す図（２．５ｍｌ／分の流速で、高さ１４０μｍのマイクロチャネルの入口、出口前における幅５００μｍのチャネル区分、および分枝状出口における直径１０μｍ、１５μｍ、および２５μｍの粒子の分布および位置を示す重ね合せ画像である。入口において無作為に分布させた粒子が、秩序立ったフォーカス流を形成し、次いで、これが、出口１、２、および３において個別に回収される。）である。
【図１０】永久細胞系（１０Ａ＝ＨｅＬａ細胞、１０Ｂ＝ＫＫＵ−１００細胞、１０Ｃ＝ＣＨＯ−ＣＤ３６細胞）による細胞周期解析の結果を示すグラフである。ヒストグラムは、同調後のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期において分取された一倍体細胞のＤＮＡ含量の分布を示す。Ｇ２／Ｍ期の細胞のＤＮＡ量は、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の２倍であり、したがって、蛍光強度を倍増させる。出口１から回収されたより大型細胞が、Ｇ２／Ｍ期集団の比率の増大を示すのに対し、出口４から回収された小型細胞は、Ｇ０／Ｇ１期集団の著明な濃縮を示す。プロットにはまた、同調細胞のサイズ分布も示す。
【図１１】出口１、２、３、および４から回収されたサイズ分取ｈＭＳＣ細胞の光学顕微鏡写真である。１１Ａは、出口１で回収された細胞の平均直径が、出口４で回収された約１５μｍと比較して、約２４μｍであることを示す（ｐ＜０．００１）。１１Ｂは、回収された細胞のトリパンブルー染色された顕微鏡写真を示し、分取後におけるｈＭＳＣの生存率を示す（矢印は、非生存細胞を示す）。結果は、これらのマイクロチャネルにおける細胞が受ける高度のせん断が、これらの細胞の生存率を損なわず、＞９０％の生存率を達成していることを示す。１１Ｃは、再播種細胞の光学顕微鏡写真であり、出口から回収された細胞の増殖速度間における著明な差違を示さず、高い生存率および無菌性を示す（バー＝５０μｍ）。
【図１２】同調後のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期において分取されたｈＭＳＣのＤＮＡ含量の分布を示すヒストグラムである。プロットにはまた、同調細胞のサイズ分布も示す（ｐ＜０．０５）。
【図１３】増大させる異なる時間間隔において、出口４から回収された分取ｈＭＳＣのＤＮＡ含量の分布を示すヒストグラムである。出口４におけるｈＭＳＣ（２４時間目に８２．３％）のすべてが、１日目にＳ期およびＧ２／Ｍ期へと移行する（７９．７％）ので、ｈＭＳＣは、同調細胞分裂を裏付ける。接触阻害のために、２日目以降、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の百分率が増大する。分裂間期では、確率的変動のために、同調性が時間と共に減衰する。
【図１４】開発された超ハイスループットＣＴＣ単離チップの概略図であり、作動原理を示す図である。全血液をデバイスの内側の入口を介して送入する一方、シース液は外側の入口から通入する。チャネルが曲線形状であるため、ディーン抗力の影響下では、より小型の血液細胞（ＲＢＣおよびＷＢＣ）が、２つの反転渦に従い、チャネルの外壁へと移動する（断面図）。それらのより大型サイズのため、ＣＴＣは、それらをマイクロチャネルの内壁に沿って平衡化させる強い慣性揚力を受け、これにより、分離が達成される。
【図１５】螺旋状マイクロチャネルの出口におけるＲＢＣ、白血球、およびＣＴＣの側面方向の位置を示す平均合成画像（１５Ａ）およびラインスキャン（１５Ｂ）である。画像は、血液細胞（ＲＢＣおよび白血球）が、ディーン抗力の影響下でチャネルの外側半分へと転置されるのに対し、より大型のＣＴＣは、慣性揚力の影響下でチャネルの内壁により近接してフォーカスすることを示す。
【図１６】血液から希少細胞を単離するためのマイクロ流体デバイスの概略図である。マイクロチャネルのデザインは、収縮−拡張アレイによりパターン化された、高アスペクト比の矩形マイクロチャネルからなる。細胞フォーカシング領域では、せん断変調性慣性揚力の影響下で、すべての細胞が、チャネルの側壁に沿って効率的に平衡化する。希少細胞絞込み領域を流動するとき、より大型細胞の質量中心が、チャネル中央に沿って整列するのに対し、より小型の血液細胞は、チャネルの側壁に沿ったフォーカシングを維持する。分枝状出口をデザインすることにより、中央出口においてより大型の希少細胞の回収が可能となる一方で、残りの血液細胞は、側方出口から除去される。
【図１７】マイクロチャネルのアスペクト比（ＡＲ）が赤血球フォーカシングに対して及ぼす影響を示す図である。１７Ａ：アスペクト比を増大させたときのＲＢＣの平衡化を示す、平均合成画像である。注入される血液試料は、ヘマトクリット値を１％で固定し、Ｒｅ＝１００で送入した。マイクロチャネルは、入口における幅２００μｍのセグメントで始まり、分離を増強するための分枝部分の直前の出口で、幅３００μｍの区分へと開口する。併載される概略図は、出口におけるマイクロチャネル断面内のＲＢＣのおおよその位置を示す（点線は、チャネル壁のおおよその位置を示す）。１７Ｂ：出口において測定した、マイクロチャネル幅にわたるＲＢＣの確率分布を表すラインスキャンである。プロットではまた、側方出口の位置を示す出口における分布も示される。
【図１８】流速（Ｒｅ）が赤血球フォーカシングに対して及ぼす影響を示す図である。１８Ａ：流速を増大させたときのＲＢＣの平衡化を示す、平均合成画像である。注入される血液試料は、ヘマトクリット値を１％で固定し、ＡＲ＝５とするマイクロチャネルを介して送入した（点線は、チャネル壁のおおよその位置を示す）。１８Ｂ：出口において測定した、マイクロチャネル幅にわたるＲＢＣの確率分布を表すラインスキャンである。１８Ｃ：レイノルズ数（Ｒｅ）を増大させたときの、チャネル中央部における無細胞領域幅、および細胞バンドの厚さを示す実験結果の図である。
【図１９】ヘマトクリット値が赤血球フォーカシングに対して及ぼす影響を示す図である。１９Ａ：ヘマトクリット値を増大させたときのＲＢＣの平衡化を示す、平均合成画像である。注入される血液試料は、ＡＲ＝５とするマイクロチャネルを介して、Ｒｅ＝１００で送入した（点線は、チャネル壁のおおよその位置を示す）。１９Ｂ：出口において測定した、マイクロチャネル幅にわたるＲＢＣの確率分布を表すラインスキャンである。１９Ｃ：ヘマトクリット値を増大させたときの、チャネル中央部における無細胞領域幅、および細胞バンドの厚さを示す実験結果の図である。
【図２０】開発したマイクロ流体デバイスの希少細胞を単離する原理を示す経時画像を例示する図である。細胞フォーカシング領域では、せん断変調性慣性力の影響下において、ＣＴＣ（黄色の丸でマークされたＭＣＦ−７細胞）が、マイクロチャネルの側壁に沿って平衡化する。ＣＴＣは、マイクロチャネル中央部のいずれかの側への駆逐を維持するので、チャネルの拡張領域ではこれが明らかとなる（白色の点線は、おおよそのチャネル中央部を示す）。絞込み区分を通過するとき、ＣＴＣの慣性の中心は、マイクロチャネル幅の中心と共に整列する。拡張領域では、ＣＴＣが、引き続き流動の流線に追従し、マイクロチャネル幅の中心に沿った整列を維持する。
【図２１】細胞絞込み領域におけるチャネル幅がＣＴＣ分離効率に対して及ぼす影響を示す図である。２１Ａ：「絞込み」幅を変化させながら、マイクロチャネルにおける流速を増大させたときの、中央出口におけるＭＣＦ−７細胞の単離を示す、平均合成画像である（点線は、チャネル壁のおおよその位置を示す）。２１Ｂ：Ｒｅを増大させたときの、中央出口において回収されたＭＣＦ−７細胞および末梢血白血球の画分を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の例示的な実施形態についての説明を以下に示す。
【００１３】
本発明は一般に、マイクロ流体デバイスと、２つ以上の（複数の）細胞型（例えば、細胞のコレクションまたは細胞の混合物）を含む試料から、１または複数の特定の細胞型（例えば、検出および／または単離される１または複数の標的細胞）を検出および／または単離するための、このようなデバイスの使用とを対象とする。マイクロ流体デバイスは、試料を導入するための１または複数の入口と、試料がその中を流動する１または複数のチャネルと、１または複数の出口であるが、典型的には少なくとも２つの出口とを含み、試料において検出される細胞および／もしくは単離される細胞は、出口のうちの１つ（例えば、第１の出口）を流動し、試料中の残りの細胞は、単離される細胞と同じ出口を流動せず、かつ／または別の（異なる）出口（例えば、第２の出口）を流動する。１または複数のチャネルの各々は、チャネルの断面の少なくとも一部に沿って１または複数の標的細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを有し、１または複数の標的細胞が、各チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、残りの細胞が、各チャネルの第２の部分に沿って流動し、１または複数の標的細胞と同じ出口を介して流動せず、かつ／または１もしくは複数の出口（異なる出口、例えば、第２の出口、第３の出口、第４の出口、第５の出口、第６の出口、第７の出口、第８の出口など）を介して流動する。
【００１４】
本明細書で説明される場合、マイクロ流体デバイスは、試料をデバイスに導入するための１または複数の（少なくとも１つの）入口を有しうる。例えば、デバイスは、１つの入口、２つの入口、３つの入口、４つの入口、５つの入口、６つの入口、７つの入口、８つの入口、９つの入口、１０の入口などを有しうる。
【００１５】
当業者に知られている各種の技法を用いて、試料をデバイスに導入することができる。例えば、シリンジおよび／またはポンプを用いて試料を導入することができる。
【００１６】
同様に、マイクロ流体デバイスは、１または複数の出口も有しうる。一部の態様では、デバイスが、１つの出口、２つの出口、３つの出口、４つの出口、５つの出口、６つの出口、７つの出口、８つの出口、９つの出口、１０の出口などを有しうる。具体的な態様では、デバイスが、少なくとも２つの出口を有する。別の態様では、デバイスが３つの出口を有する。さらに別の態様では、デバイスが４つの出口を有する。なお別の態様では、デバイスが８つの出口を有する。
【００１７】
デバイスはまた、１または複数の入口を、１または複数の出口へと接続する、１または複数のチャネル（例えば、並列チャネル、例えば、１つの並列チャネル、２つの並列チャネル、３つの並列チャネル、４つの並列チャネル、５つの並列チャネル、６つの並列チャネル、７つの並列チャネル、８つの並列チャネル、９つの並列チャネル、１０の並列チャネルなど）も含む。１または複数のチャネルは、試料における１または複数の標的細胞を、残りの細胞から分離することを可能とするアスペクト比を規定する高さおよび幅の断面を含む。本明細書で用いられる場合、アスペクト比とは、チャネルの高さをその幅で除した比であり、標的細胞が、チャネルの断面の少なくとも一部に沿って第１の出口へと流動し、残りの細胞が、チャネルの断面の異なる部分（例えば、第２の部分、第３の部分、第４の部分など）に沿って、および異なる出口（例えば、第２の出口、第３の出口、第４の出口など）など、標的細胞と同じでない出口へと流動することを可能とするのに適切なチャネルの断面をもたらす。適切なアスペクト比は、試料における残りの細胞の同じであるかまたは類似の構造的特徴と比較して、試料における標的細胞の構造的特徴が異なることに基づいて標的細胞を、チャネルの異なる部分に沿って流動させる。このような構造的特徴の例には、細胞のサイズ、硬さ、変形能、接着性（例えば、細胞接着性）などが含まれる。例えば、本明細書で示される通り、１、２．５、３．７５、５、または７のアスペクト比を用いることができる。
【００１８】
当業者により理解される通り、チャネルは、多様な形状でありうる。一部の態様では、チャネルが線状であり得る。線状チャネルの高さは、約２０μｍ、約５０μｍ、約７５μｍ、約１００μｍ、および約１５０μｍなど、約１０μｍ〜約２００μｍの範囲にありうる。線状チャネルの幅は、約１２μｍ、約１５μｍ、および約２０μｍなど、約１０μｍ〜約５０μｍの範囲にありうる。線状チャネルの長さは、約３ｃｍなど、約１ｃｍ〜約５ｃｍの範囲にありうる。
【００１９】
他の態様では、チャネルが湾曲している。具体的な態様では、チャネルが螺旋状である。螺旋状チャネルの高さは、約１００μｍおよび約１４０μｍなど、約１０μｍ〜約２００μｍの範囲にありうる。螺旋状チャネルの幅は、約１００μｍ〜約５００μｍの範囲にありうる。螺旋状チャネルの長さは、約１ｃｍ〜約１０ｃｍの範囲にありうる。
【００２０】
試料は、マイクロ流体デバイス内を多様な流速で流動することが可能であり、例えば、生理学的な流速（例えば、細動脈における生理学的な流速）で流動することも可能であり、または非生理学的な流速で流動することも可能である。例示的な流速には、１分間当たりの細胞約２０００万個が含まれるか、または例示的な流速が、約２．５ｍＬ／分〜約５μＬ／分の範囲にある。
【００２１】
本明細書で説明されるマイクロ流体デバイスは、１または複数の標的細胞を、細胞試料から検出、分離、および／または単離するのに用いることができる。細胞試料は、例えば、血液（例えば、全血液）、血漿、腹水、リンパ、脊髄液、尿、組織などの生物学的試料でありうる。試料はまた、細胞培養試料でもありうる。具体的な態様では、試料が、血液試料（例えば、全血液試料）である。血液試料は、低ヘマトクリット値（例えば、約１〜１０％）の場合もあり、または高ヘマトクリット値（例えば、約２０〜５０％）の場合もある。
【００２２】
血液とは、血漿における細胞の複合懸濁物（血液容量の約４０〜４５％）であり、細胞への酸素および栄養分の輸送、細胞内の老廃生成物の除去、および免疫的防御の備給を含め、複数の重要な役割を果たす。赤血球（ＲＢＣ）は、全血液細胞成分のうちの＞９９％を占め（全血液１ミリリットル当たり約５×１０９個のＲＢＣ）、残りの＜１％は、末梢血白血球（ＰＢＬ）および血小板からなる。その複合的性格のために、マイクロ流体バイオチップを用いて血液を解析することは、困難な課題となっている。ＲＢＣおよび白血球に加えて、患者の末梢血においては、胎児有核赤血球、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、幹細胞、および白血病性細胞など、他の低量細胞もまた見出され、これらは、患者のモニタリング、疾患の診断、治療的処置のモニタリング、および科学的な基礎研究の実施など、多様な生物医学的適用に用いることができる。しかし、これらの細胞は、極めて希少であるため、解析の前にこれらの細胞を血液から効率的に単離するには、濃縮ステップまたは分離ステップが、ほとんど常に必要である。
【００２３】
したがって、本明細書で説明される１または複数のマイクロ流体デバイス（例えば、マイクロ流体デバイスの、例えば、並列または直列のカスケード）は、多様な目的に用いることができ、一態様では、多様な標的細胞を検出、分離、および／または単離するのに用いることができる。多様な標的細胞を検出することができる。例には、疾患細胞（例えば、マラリア感染赤血球、白血病性赤血球、鎌状赤血球貧血性赤血球、またはこれらの組合せなどの疾患血液細胞、非同調細胞の混合物中における同調細胞、および循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））が含まれる。
【００２４】
一態様では、デバイスを、血液試料において１または複数の疾患血液細胞を検出する方法において用いる。この方法は、血液試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、非疾患血液細胞と比較して、疾患血液細胞の変形能が低下していることに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って疾患血液細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅からなる断面とを各チャネルが有し、疾患血液細胞が、各チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、非疾患血液細胞が、各チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する。本明細書で用いられる場合、疾患細胞とは、非疾患（例えば、健常）細胞と比較して、１または複数の側面において、構造的に異なっている。例えば、疾患細胞は、サイズ、硬さ、変形能、接着性、またはこれらの組合せが、非疾患細胞とは異なりうる。例えば、疾患細胞は、マラリア感染赤血球、鎌状赤血球貧血性赤血球、白血病性赤血球、またはこれらの組合せでありうる。一態様では、疾患細胞が、早期（例えば、環状期）マラリア感染赤血球の場合もあり、または後期（例えば、栄養体期または分裂体期）マラリア感染赤血球の場合もある。血液試料は、約５μＬ／分の流速で導入することができる。一態様では、環状期マラリア感染赤血球を、約７５％〜約８５％の範囲の効率で分離することができる。別の態様では、後期マラリア感染赤血球を、約９０％の効率で分離することができる。方法は、疾患細胞を第１の出口から回収するステップをさらに含みうる。一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約１〜約２の範囲にありうる。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスが、目視観察を改善するための拡張領域をさらに含みうる。一部の実施形態では、第２の出口の幅が、第１の出口の幅より約２〜約１０倍の範囲で広い場合がある。特定の実施形態では、チャネルの幅が、約１５μｍでありうる。一部の実施形態では、チャネルの高さが、約１０μｍでありうる。
【００２５】
上記で論じた通り、具体的な態様では、疾患細胞が、マラリア感染赤血球である。マラリアは、世界の人口のうちの半分（３３億人）に危険性があり、毎年１００万〜２００万人が死亡すると推定されている、最も重度の寄生虫性疾患のうちの１つである。これらの罹患諸国では、貧困国における医療資源の欠如が、マラリアと戦うための大きな経済的負担を課すことにより、状況をさらに悪化させている。ヒトマラリア種の４つの型のうちでは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（Ｐ．）ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが、最も致死性である。感染すると、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球（ｉＲＢＣ）は、４８時間にわたる赤内期における多様な感染進行段階（環状期、栄養体期、および分裂体期）を経る。この時期において、マラリア原虫は、宿主ＲＢＣを持続的にリモデリングし、ｉＲＢＣ膜をより接着性とする特定の原虫性タンパク質を移出し、これにより、マラリア原虫が成熟するにつれて、ｉＲＢＣ膜の細胞接着性および進行性の硬化を推進する。これらの原虫誘導性の形態変化は、微小循環を損ない、なお、重度のマラリア症例では、貧血、代謝性アシドーシス、または臓器不全などの病態生理的帰結へと顕在化する場合もある。
【００２６】
本発明の一態様では、ｉｎ ｖｉｖｏにおける白血球の辺縁趨向現象（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ＨＬら（１９８４），Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２７（２）：２０４〜２２２；Ｆｉｅｂｉｇ Ｅら（１９９１），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ．１０（２）：１２７〜１４４）に触発された、マイクロ流体デバイスにおける、感染赤血球（ｉＲＢＣ）分離の変形能ベースの分離法が説明される。内腔径が約３００μｍ未満の血管では、白血球よりサイズが小さく、変形能が大きいＲＢＣは、血管の中心軸へと移動する傾向があり、その結果として、血管壁に隣接して、低ヘマトクリット値の血漿層が形成され、血管の中心では、赤血球（ＲＢＣ）濃度が増大する（Ｐｒｉｅｓ ＡＲら（１９９６），Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３２（４）：６５４〜６６７）。この内側へのＲＢＣの移動は、血管内部のポアズイユ流プロファイルに帰せられ、この結果、中心へと向かう圧力勾配誘導性の力がもたらされる（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ＨＬら（１９８９），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２５７（３）：Ｈ１００５〜Ｈ１０１５）。中心を最大とする、血管における放物線状の流体速度プロファイルのために、中心軸におけるＲＢＣのバルク流は、より迅速に流過する。このため、ファーレウス効果である管路内ヘマトクリット値の低下がもたらされ、また、細胞の枯渇した血漿層が存在するために、見かけの血液粘性の低下ももたらされる（ファーレウス−リンドクヴィスト効果）（同上）。ＲＢＣは、中心軸へと移動するので、白血球と移動するＲＢＣとの力学的衝突の結果、適切に辺縁趨向と称する、より大型の（そして変形能が小さい）白血球が血管壁へと駆逐される現象（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ＨＬら（１９８４），Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２７（２）：２０４〜２２２；およびＦｉｅｂｉｇ Ｅら（１９９１），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ．１０（２）：１２７〜１４４）がもたらされる。全血液から血漿を分離するためのマイクロ流体デバイス（Ｆａｎ Ｒら（２００８），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２６（１２）：１３７３〜１３７８；およびＪａｇｇｉ ＲＤら（２００７），Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．３（１）：４７〜５３）、および全血液から白血球を濃縮するためのマイクロ流体デバイス（Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓ ＳＳら（２００５），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７７（３）：９３３〜９３７）では、ファーレウス効果および辺縁趨向というこれらの２つの血行力学的効果が用いられている。これらの先行例では、分離される細胞が、変形能（硬さ）およびサイズのいずれにおいてもＲＢＣとは顕著に異なっていた。しかし、本明細書では、サイズが同じで、細胞の変形能がわずかに異なるに過ぎない正常ＲＢＣとマラリア感染ｉＲＢＣとを分離するための、この生体模倣による分離法の適用が説明される。
【００２７】
まず、蛍光標識して全血液中に懸濁させた硬質の３μｍポリスチレンビーズを用いることにより、分離の原理を裏付けた。次いで、全血液と混合した、環状期ｉＲＢＣおよび後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣの両方を用いて試験を実施した。本明細書における結果は、環状期ｉＲＢＣについて約７５％の分離効率を示し、後期ｉＲＢＣについて最大約９９％など、＞９０％の分離効率を示す。
【００２８】
本明細書で説明される分離法は、蛍光色素または他の化学修飾を必要とせず、ヘマトクリット値の高い（約４０％）、未処理の血液試料に対して直接実施することができる。高ヘマトクリット値とは、約２０％〜約５０％の範囲のヘマトクリット値であり、具体的な態様では、約３０％または約４０％のヘマトクリット値である。一態様では、マイクロ流体デバイスが、入口が一つ、出口が三つのデバイスであり、流速が、ギムザ染色など、下流における検出法との容易なインターフェース形成を可能とする。デバイスの作動は、電気またはバッテリーを必要とせず、重力送りの送液を用いうるであろう。これらの特徴のすべてにより、このデバイスは、試料供給源が制約される臨床状況におけるオンサイトの検査に理想的なｉＲＢＣ濃縮法となっている。加えて、このデバイスは、これらもまた細胞の硬さの変化を特徴とする、他の血液細胞疾患（例えば、鎌状赤血球貧血および白血病）にも容易に適用することができる（Ｅｖａｎｓ Ｅら（１９８４），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７３（２）：４７７〜４８８；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｔｈ ＭＪら（２００６），Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，９０（８）：２９９４〜３００３）。
【００２９】
その中で原虫が成熟するのに応じたｉＲＢＣの硬さの変化は、広範にわたり研究されている（Ｐａｕｌｉｔｓｃｈｋｅ Ｍら（１９９３）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２２（５）：５８１〜５８９；Ｓｕｒｅｓｈ Ｓら（２００５），Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１（１）：１５〜３０；Ｓｈｅｌｂｙ ＪＰら（２００３），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、１００（２５）：１４６１８〜１４６２２）。Ｓｕｒｅｓｈらは、光ピンセットを用いて、異なる感染期における個々のｉＲＢＣを伸展させ、これらの弾性率を測定した。報告される非感染ＲＢＣ、環状期ｉＲＢＣ、栄養体期ｉＲＢＣ、および分裂体期ｉＲＢＣの弾性率はそれぞれ、約８、１６、２１．３、および５３．３μＮ／ｍであった（Ｓｕｒｅｓ Ｓら（２００５），Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１（１）：１５〜３０）。様々な段階で、細胞の硬さがこのように顕著に変化することは、細胞内に大型で非変形性の原虫が存在することに部分的に帰せられており、その結果として、内部粘性が大きく増大する（Ｃｌｅｎｉｓｔｅｒ ＦＫら（２００２），Ｂｌｏｏｄ、９９（３）：１０６０〜１０６３；およびＮａｓｈ ＧＢら（１９８９），Ｂｌｏｏｄ．７４（２）：８５５〜８６１）。原虫が成熟するにつれ、円板状のｉＲＢＣは、表面積対容量比が減少するにつれてより球状化し、細胞の変形能が低下する（Ｎａｓｈ ＧＢら（１９８９），Ｂｌｏｏｄ．７４（２）：８５５〜８６１；およびＨｅｒｒｉｃｋｓ Ｔら（２００９），Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１１（９）：１３４０〜１３５３）。また、原虫のタンパク質の放出は、膜内のスペクトリンネットワークを架橋形成および安定化することにより、ｉＲＢＣ膜を硬化させ、これにより、ｉＲＢＣの可撓性を低下させる（Ｃｒａｎｓｔｏｎ ＨＡら（１９８４），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２３（４６３４）：４００〜４０３）。近年の研究は、後期栄養体期ｉＲＢＣおよび後期分裂体期ｉＲＢＣの膜の硬さが、熱性温度でさらに増大することから、微小循環内の血管閉塞におけるその役割について推定していることを報告している（Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃ Ｍら（２００９），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２９６（１）：Ｃ５９〜Ｃ６４）。ＲＢＣにおける変形能（およびｉＲＢＣにおける変形能の欠如）は、重要な生理学的意義を有する。正常ＲＢＣは、変形能が高く、このために、微小な毛細血管を通過するときに変形を受け（Ｓｕｔｔｏｎ Ｎら（１９９７），Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３（３）：２７２〜２８１）、脾臓によるクリアランスを回避し（Ｓａｆｅｕｋｕｉ Ｉら（２００８），Ｂｌｏｏｄ．１２２（６）：２５２０〜２５２８），低レイノルズ数ではまた側方移動も誘導する（Ｃｏｕｐｉｅｒ Ｇら（２００８），Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ．２０（１１）：４）ことが可能となる。ｉＲＢＣにおいて変形能が低下すれば、複数の重要な病態生理的帰結がもたらされうるであろう。例えば、Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓらは、微小血管ネットワークを模倣するマイクロ流体デバイスにおいて、グルタルアルデヒドで処置したＲＢＣ（変形能を低下させたＲＢＣ）の流動について研究し（Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓ ＳＳら（２００６），Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．６（７）：９１４〜９２０）、ＲＢＣの硬さが増大すると共に、ネットワーク内における血液流度が低下し、その結果、チャネルにおける閉塞、およびヘマトクリット値分布の不均一がもたらされることを示した。近年の研究はまた、硬化したＲＢＣがまた、狭窄したマイクロチャネルにおける無細胞層の厚さにも影響を及ぼし（Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｈら（２００９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ．４２（７）：８３８〜８４３）、ｉＲＢＣ、とりわけ、後期栄養体期ｉＲＢＣおよび後期分裂体期ｉＲＢＣが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、内皮における多段階の白血球動員（白血球のローリングおよびその後における接着）を模倣する（Ｈｏ Ｍら（２０００），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｅｎ．１９２（８）：１２０５〜１２１１）ことも示している。実際、微小血管系における細胞接着は、ｉＲＢＣが、それらの変形能の喪失を認識する脾臓によるクリアランスを回避する一助となっている。脾臓における固有のスリット様の構成は、ＲＢＣが、静脈洞内の狭小な内皮間スリットにおいて著しく変形することを要求する（Ｓａｆｅｕｋｕｉ Ｉら（２００８），Ｂｌｏｏｄ．１２２（６）：２５２０〜２５２８）。より硬いｉＲＢＣは脾臓内で上流に保持され、「種抜き（pitting）」（機械的な押出しにより、ｉＲＢＣから原虫を機械的に絞り出すこと）を受け、これにより、循環からｉＲＢＣが効果的に除去され、原虫負荷が低下する。
【００３０】
本明細書で示される通り、フローサイトメトリーが、細胞表面マーカーに基づき細胞を分取する技法として堅固に確立されているが、これとは独立ではあるが、生理学的に有意義な、細胞を精製／濃縮するための測定基準を、細胞の変形能はもたらしている。変形能に基づく細胞の分離には、多様な技法が適用されている（Ｘｉａｏｍｉ Ｔら（１９９５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．６７４（１）：３９〜４７；およびＬｉｎｃｏｌｎ Ｂら（２００４），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ．５９Ａ（２）：２０３〜２０９）。しかし、これらの技法の大半は、バッチフロー方式で作動し（Ｘｉａｏｍｉ Ｔら（１９９５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．６７４（１）：３９〜４７）、その結果、ロースループットであり、変形能が異なる細胞を個別に回収することができない（Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｂら（２００４），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ．５９Ａ（２）：２０３〜２０９）。
【００３１】
別の態様では、マイクロ流体デバイスを用いて、循環腫瘍細胞を検出、分離、および／または単離することができる。腫瘍形成の致死的な帰結である癌転移は、癌に関連する全死亡のうちで、約９０％を占めている。転移の主要原因である循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出することにより、病期および癌の進行と関連する貴重な洞察をもたらすことができる。ＣＴＣの計数はまた、治療的処置の奏効を臨床的に評価およびモニタリングするのにも用いられる。ＣＴＣは、血液細胞１０９個当たり１個ほどの少なさを含む極めて希少な細胞であり、形態および分子署名が高度に不均一であるので、これらを血液から単離することは、技術的な難題となっている。
【００３２】
したがって、一態様ではまた、本発明が、個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞を検出する方法も対象とする。この方法は、試料を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、循環腫瘍細胞が、チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、試料中の他の細胞が、チャネルの別の部分に沿って第２の出口へと流動する。方法は、循環腫瘍細胞を第１の出口から回収するステップのほか、循環腫瘍細胞を解析して、治療的処置の有効性を評価するステップもさらに包含しうる。試料は、血液試料でありうる。
【００３３】
本明細書では、マイクロ流体素子を用いて血液から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分取する、ハイスループットの細胞分離法が説明される。一態様では、デザインが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製作された、低アスペクト比で螺旋形状のマイクロチャネルからなる。分離は、マイクロチャネル断面内の異なる位置において細胞を平衡化させる、大きな細胞サイズに起因する慣性揚力と、螺旋形状に起因するディーン抗力との相互作用に依拠する。次いで、適切な分枝状出口をデザインすることにより、細胞を、それらのサイズに基づき個別に回収することができる。この技法を、典型的には直径が約２０μｍでサイズがより大きいＣＴＣを、血液細胞（約８μｍのＲＢＣ、約１０〜１５μｍの白血球（ＷＢＣ））から分離して、早期癌を検出し、治療の有効性をモニタリングすることに適用した。
【００３４】
螺旋状のマイクロチャネル内を流動する細胞は、慣性揚力と、遠心加速度により誘導されるディーン抗力との組合せの下にある。細胞サイズの４乗に伴って変化する慣性揚力は、マイクロチャネル断面内の異なる複数の平衡位置に細胞をフォーカスする一因となる。ディーン抗力の成分を付加して、螺旋形状のマイクロチャネルをデザインすることにより、これらの複数の平衡位置を、マイクロチャネル内壁近傍の１カ所だけに縮減することができる。揚力とディーン抗力との比は、細胞のサイズを変化させるときに変化するので、最大の細胞がマイクロチャネル壁に最も近接して平衡化する形で、細胞を、それらのサイズに基づいてマイクロチャネル断面に沿った異なる位置に平衡化させることができる。この結果、異なる細胞流の進化が生じ、適切な出口をデザインすることにより、これらを個別に回収することができる。
【００３５】
デバイスは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製作し、顕微鏡用のスライドガラスに接着する（図７Ａおよび７Ｂ）。マイクロチャネルのデザインは、拡張型の８等分された出口系を伴う、５００×１００μｍ（幅×高さ）のマイクロチャネルからなる。注入される試料は、濃度の異なるＣＴＣでスパイクした希釈全血液（０．１％のヘマトクリット値）からなる。試料がマイクロチャネル内を流動するにつれて、正常ＲＢＣ、白血球、およびＣＴＣが、それらのサイズに基づいてマイクロチャネル断面にわたり平衡化する。ＣＴＣはその大型のサイズ（約２０μｍ）のために、慣性揚力により大きな影響を受け、チャネル内壁に近接して平衡化する。ＣＴＣより小型であるＲＢＣ（約８μｍ）および白血球（１０〜１５μｍ）は、ディーン抗力により大きな影響を受け、マイクロチャネル内壁から遠く離れてフォーカスし、このために分離が達成される。低アスペクト比のマイクロチャネルをデザインすることにより、この平衡位置の差違が増幅され、図８に示す通り、希少なＣＴＣを出口１から回収することが容易となり、他の出口には残りの血液細胞が含有され、このために、持続的なハイスループットのサイズベースの分離が達成されることができる。この技法の別の実施形態では、この分離法を用いるならば、腹水に由来する間質細胞、血液に由来する白血病性細胞、および母体血液に由来する胎児有核赤血球を含めた他の希少細胞を単離することができるであろう。
【００３６】
一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約３．７５など、約１〜約５の範囲にある。特定の実施形態では、方法が、細胞型が混合された集団内に存在する幹細胞または前駆細胞を、細胞の直径に基づいて機能的に異なる亜集団へと分離するステップを含みうる。次いで、これらの亜集団をデバイスから回収し、固有の代謝機能との関連で解析し、例えば、増殖能、分化能、または特定の薬剤に対する応答能を増強させることが可能であった特定の亜集団を単離および濃縮することができる。特定の実施形態では、チャネルの幅が約５００μｍであることが可能であり、チャネルの高さが約１００μｍでありうる。
【００３７】
本明細書では、マイクロチャネルの螺旋形状を用いて全血液から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分取する、ハイスループットのサイズベースの細胞分離法が説明される。このデザインは、多様なサイズの細胞に対して作用する慣性揚力および粘性抗力を利用して、示差的な移動を達成する。マイクロチャネルの螺旋形状のために優越する慣性力およびディーン回転力は、より大型のＣＴＣに、マイクロチャネル内壁近傍の単一の平衡位置にフォーカスさせ、これを占拠させる。より小型の血液成分（ＲＢＣおよび白血球）は、ディーン力の影響下において、チャネルの外側半分に移動し、その結果として、２つの異なる流れが形成され、次いで、これらを、２つの個別の出口において回収する。全血液を処理する能力により、提起される技法は、１ｍＬの全血液を処理するのに要する時間が１０分間未満であり、内側の出口におけるＣＴＣ回収率を９０％として、血液細胞のうちの９９％を除去することが可能である。
【００３８】
曲線状チャネル内を流動する流体は、放射方向の外側に向けられた遠心加速度を受け、チャネルの上半分および下半分において、ディーン渦として知られる２つの反転渦を形成する。これらの二次流の大きさは、
【数１】
［式中、ρは、流体密度であり、Ｕｆは、平均流速であり、μは、流体の粘性であり、Ｒｃは、チャネル流路の曲率半径であり、Ｄｈは、チャネルの流体力学的直径であり、Ｒｅは、流動のレイノルズ数（慣性力対粘性力の比）である］により与えられる無次元のパラメータであるディーン数（Ｄｅ）により定量化される。したがって、曲線状チャネル内を流動する粒子は、これらを渦内の流動方向に沿って取り込み駆動する、これらの横方向のディーン流が存在するために、抗力を受ける。この動きは、上方または下方から目視すると、下流への距離が増大すると共に、内壁と外壁との間のチャネル幅に沿った粒子の往復運動に変換される。これらの細胞がチャネル内を流動するときに側方に移動する速度は、ディーン数に依存し、これは、
【数２】
を用いて計算することができる。
【００３９】
ディーン渦に沿って粒子が横切る側面方向の距離は、「ディーン周期」との関係で定義することができる。例えば、初期にマイクロチャネルの内壁近傍に位置し、下流への所与の距離においてチャネルの外壁へと移動する粒子は、１／２のディーン周期を経過したという。マイクロチャネル内壁近傍の元の位置に戻ると、全ディーン周期を経過する。したがって、所与のマイクロチャネル長に対して、流速（Ｒｅ）条件を増大させると、粒子は、複数のディーン周期にわたる移動を経過することができる。全ディーン周期による移動長は、
【数３】
［式中、ｗは、マイクロチャネルの幅であり、ｈは、マイクロチャネルの高さである］として計算することができる。結果として、ディーン移動に必要とされるマイクロチャネルの全長は、
【数４】
により与えられる。
【００４０】
ディーン抗力とは別に、直径がマイクロチャネルの寸法と同等なより大型の細胞はまた、無視できない慣性揚力（ＦＬ）（せん断誘導性の慣性揚力および壁面誘導性の慣性揚力の両方）も受け、結果として、それらのフォーカシングおよび平衡化がもたらされる。ポアズイユ流における放物線状の速度プロファイルは、粒子に作用して、それらを、マイクロチャネルの中心から遠ざけてチャネルの壁面へと方向付ける、せん断誘導性の慣性揚力ＦＩＬを結果としてもたらす。これらの粒子がチャネル壁面のより近くに移動すると、壁面が突然現れるために、粒子の周囲に形成される回転後流が断ち切られ、粒子を壁面から遠ざけてマイクロチャネルの中心へと方向付ける揚力（ＦＷＬ）が誘導される。これらの２つの反対向きの揚力の結果として、粒子は、マイクロチャネル辺縁部周囲の、異なる予測可能な位置で平衡化（フォーカス）する。この効果は、サイズがマイクロチャネルの寸法と同等のａｃ／ｈ≒０．１である粒子に優勢である。曲線形状のマイクロチャネルでは、慣性揚力（ＦＬ）と、ディーン抗力（ＦＤ）との相互作用により、平衡位置は、各々がディーン渦の上腕内および下腕内にある、チャネル内壁近傍の２カ所だけに縮減される。２カ所の平衡位置は、マイクロチャネルの高さに沿って互いに重なり合い、所与の粒子サイズに対して、マイクロチャネルの内壁から同じ距離に位置する、すなわち、マイクロチャネルの幅にわたる単一の位置として目視される。
【００４１】
本明細書で説明される研究は、これらの２つの現象、すなわち、ディーン移動および慣性フォーカシングを利用して、ＣＴＣを血液から単離する。一態様では、デザインが、全長約１０ｃｍの、２入口２出口の螺旋状マイクロチャネルを含む。マイクロチャネルの幅は約５００μｍであり、高さは約１４０μｍである。図１５Ａおよび１５Ｂに示す通り、より大型のＣＴＣが慣性によるフォーカシングを受ける一方で、より小型の血液細胞（ＲＢＣおよび白血球）の移動はディーン抗力の影響を受ける（すなわち、ＣＴＣだけが、ａｃ／ｈ≒０．１の比を満たす）ように、チャネルの寸法を選択する。入口では、全血液試料を螺旋状マイクロチャネルの内側の入口に送入し、シース液（例えば、１×ＰＢＳ）を螺旋状マイクロチャネルの外側の入口を介して送入する（図１４）。シース液は、すべての細胞が、ほぼ同じ位置から移動を開始するように、入口において全血液を絞り込み、全血液試料を、チャネル幅における狭小な領域に閉じ込めるのに用いることができる。試験中、ディーン抗力の影響下にある小型の細胞は、ディーン渦に沿って移動を開始し、チャネルの外壁へと移動する。ＣＴＣが受ける強い慣性揚力は、ディーン抗力の影響下でＣＴＣが移動することを阻止し、ＣＴＣに、マイクロチャネルの内壁近傍における２カ所の平衡位置にフォーカスさせ、これらを占拠させる。他方、ＲＢＣおよび白血球は慣性力による影響を受けないので、これらの細胞は、ディーン渦に沿って循環し続ける。細胞が、ディーン周期の半分の移動を経過すること確保する適切な流速を計算することにより、出口では、ＣＴＣがチャネルの内壁近傍にフォーカスする一方で、ＲＢＣおよび白血球は、チャネルの外側半分へと転置される。こうして、ＣＴＣを内側の出口で単離および回収しうる一方で、他の血液細胞は、外側の出口で回収される（図１４）。この技法を用いる利点は、それが、ヘマトクリット値が極めて高値の試料（全血液）を処理することが可能であり、このため、試料の調製ステップが縮減され、解析時間も大幅に短縮されることである。この技法を用いると、１ｍＬの全血液を、１０分間以内で処理することができる。
【００４２】
別の態様では、個体の試料における循環腫瘍細胞を検出する方法が、試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の少なくとも一部に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、循環腫瘍細胞が、チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、試料中の他の細胞が、チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する。方法は、循環腫瘍細胞を第１の出口から回収するステップと、循環腫瘍細胞を解析して、治療的処置の有効性を評価するステップとをさらに包含しうる。試料は、血液試料でありうる。一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約２〜約１０の範囲にありうる。他の一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約３〜約５の範囲にありうる。入口から遠位の端部におけるチャネルの幅は、単離される細胞のオーダーにありうる、すなわち、入口から遠位の端部におけるチャネルの幅は、単離される細胞のサイズとほぼ同じサイズでありうる。一部の実施形態では、チャネルの幅が、約２０μｍでありうる。マイクロ流体デバイスは、入口から遠位のチャネル端部において、目視観察を改善するための拡張領域をさらに含みうる。一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスが、すべての細胞を、チャネルの長手方向へと移動（ｍｉｇｒａｔｅ）させ、チャネルの長手方向に沿って移動（ｍｏｖｅ）させるように適合させた断面を有する、少なくとも１つの細胞フォーカシング領域をさらに含みうる。
【００４３】
本明細書では、血液からＣＴＣを単離するための、せん断変調型慣性マイクロ流体素子の適用が説明される。図１６は、開発されたマイクロ流体デバイスの概略図を示す。デバイスは、全血液細胞のうちの＞９９％を占める赤血球の大半またはすべてを除去することにより、末梢血から希少細胞を、単一のステップで効率的に分離することを可能とする。一態様では、デザインが、単一の入口による、収縮−拡張アレイによりパターン化された、高アスペクト比の矩形マイクロチャネルからなる。収縮領域および拡張領域の幅は、それぞれ、約２０μｍおよび６０μｍであり、それらの長さは、約１００μｍであった。チャネルは、全長を約１．５ｃｍとする、収縮−拡張領域による約７５のサブユニット（収縮領域と拡張領域との対が、１つのサブユニットをなす）を含む。出口は、目視観察を増強するために、幅約３００μｍの区分へと開口し、２つの側方出口アームおよび中央出口アームである、幅約１００μｍの３つの分枝状アームへと等分されている。標的細胞が中央出口において回収される一方で、他のすべての血液成分は、側方出口から除去される。本明細書では、この新規の技法の適用として、単一のチャネルを用いて、１分間当たりの細胞１０８個の処理を可能とする高効率（＞８０％のＣＴＣ回収率）およびハイスループット（４００μＬ／分の流速）で、血液から希少ＣＴＣを分離することが裏付けられる。チャネルのデザインは、数分間以内に、数ミリリットルの臨床血液試料を処理する能力を伴う、簡易な並列化を可能とする。デバイスは、末梢血白血球および胎児有核赤血球を含めた他の希少細胞を血液から単離するのにもカスタマイズすることができる（Ｖｏｎａ，Ｇ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００２．１６０（１）：５１ページ）。
【００４４】
チャネル（例えば、マイクロチャネル）内の慣性揚力ベースの細胞フォーカシングは、早くも、新規でハイスループットの物理的な細胞分離法をもたらしつつある（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，「Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ」、２０１０；Ｄｉ Ｃａｒｌｏ、Ｄ．，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ，２００９，９（２１）：３０３８ページ）。開発されたバイオチップは、これらの慣性揚力を及ぼして、ＣＴＣを他の末梢血細胞から単離することに成功している。高アスペクト比のマイクロチャネル区分は、２つの領域：（ｉ）細胞フォーカシング領域と、（ｉｉ）希少細胞絞込み領域（図１６）とに分割することができる。細胞フォーカシング領域（最初の７０のサブユニット）では、せん断変調性慣性揚力の影響下において、すべての細胞が、チャネル長手の側壁に沿って移動および平衡化する（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８、２０：１０１７０２ページ）。マイクロチャネル内を流動する流体中に懸濁されている、中性浮力をもつ浮揚性の粒子／細胞は、粘性抗力および慣性揚力の両方の下に置かれることが典型的である。平面ポアズイユ流における放物線状層流の速度プロファイルは、せん断誘導性慣性揚力をもたらし、この結果、チャネル中央から遠ざかる、マイクロチャネル壁面への粒子移動がもたらされる（Ａｓｍｏｌｏｖ，Ｅ．Ｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，１９９９，３８１：６３〜８７ページ）。粒子が、チャネル壁面により近接するにつれて、粒子の周囲で誘導される非対称性後流が、壁面誘導性揚力を発生させ、これらの粒子を壁面から遠ざけるように駆動する（Ｚｅｎｇ，Ｌ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，２００５，５３６：１〜２５ページ）。これらの２つの反対向きの揚力が、互いを相殺する結果として、均一に分散した粒子が、マイクロチャネル辺縁部周囲の狭小なバンドに平衡化する（Ｍａｔａｓ，Ｊ．Ｐ．ら，「Ｏｉｌ ＆ Ｇａｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、２００４，５９（１）：５９〜７０ページ；Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．ら，Ｎａｔｕｒｅ、１９６１、１８９：２０９〜２１０ページ；Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈ、１９６２，１４：１１５〜１３６ページ；Ｍａｔａｓ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，２００４，５１５：１７１〜１９５ページ）。これらの慣性力は一般に、マイクロ流体素子ベースの流動では、ほぼ確実にチャネルのレイノルズ数が低値である（チャネルの寸法が小さく、流速が低速である結果として）ために無視される。しかし、粒子／細胞のサイズが、チャネルの寸法と同等である場合は、これらの慣性揚力が無視できないものとなり、流動の流線を横切る側方への粒子の移動をもたらす。
【００４５】
実際のマイクロ流体への適用で、細胞が有限のチャネル長にフォーカスされるような平衡化は、ａｃ／Ｄｈ≧０．０７の場合に生じる［式中、ａｃは、細胞の直径であり、Ｄｈは、マイクロチャネルの流体力学的直径である］（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８，２０：１０１７０２ページ；Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ，２００８，８（１１）：１９０６〜１９１４ページ；Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｏｌｏｇｙ，１９９７，４１：６２１ページ；Ｄｉ Ｃａｒｌｏ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７，１０４（４８）：１８８９２ページ）。正方形のマイクロチャネルにおいて、低レイノルズ数（Ｒｅ＜１００）の流動では、４つの側面すべてにおけるせん断勾配が均一であるため、８つの安定的な平衡位置が存在する（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８，２０：１０１７０２ページ；Ｃｈｕｎ，Ｂら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００６，１８：０３１７０４ページ；Ｂｈａｇａｔ，ＡＡＳ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９，７（２）：２１７〜２２６ページ）。近年の報告は、高アスペクト比の矩形のマイクロチャネルにおいて、せん断率を変調させると、マイクロチャネルの長手に沿った優先的フォーカシングが結果として得られることを裏付けている（この場合は高さ）（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８，２０：１０１７０２ページ；Ｂｈａｇａｔ，ＡＡＳ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９，７（２）：２１７〜２２６ページ）。慣性揚力は、ＦＬ∝Ｇ２［式中、Ｇは、チャネルに沿ったせん断率である］としてスケーリングされるので、高アスペクト比（ＡＲ：チャネルの高さ対チャネルの幅の比）の矩形のマイクロチャネルの断面は、チャネル幅に沿ったより高いせん断率をもたらし（∝ＡＲ２）、マイクロチャネルの高さに沿った細胞の平衡化を駆動する。したがって、入口において分散した細胞は、移動し、チャネルの側壁近傍における２つの流れに整列され、無細胞の中央領域を創出する。本明細書で示す通り、この現象を利用して、すべての末梢血細胞をチャネル壁面に沿ってフォーカスし、下流で除去した。本明細書では、「平衡化」という用語と「フォーカシング」という用語とを互換的に用い、これらにより、細胞がマイクロチャネルの長手の側壁に沿って最終的な静止位置へと移動することを示唆する。
【００４６】
マイクロ流体デバイスはまた、チャネルの出口の前に、希少細胞絞込み領域（例えば、最後の５つの収縮−拡張サブユニット）も含むことができ、これは、希少細胞を他の血液細胞からうまく単離するのに用いられる（図１６）。より大型のＣＴＣ細胞の慣性の中心が、マイクロチャネルの中心軸に沿って整列するように、この絞込み領域における収縮幅（または絞込み幅）は、ＣＴＣの直径と同等である（すなわち、ＣＴＣのオーダーにある）ようにデザインする。したがって、出口では、赤血球およびＰＢＬがチャネルの側壁に沿ったフォーカシングを維持する一方で、より大型のＣＴＣは、チャネルの中心軸に沿って流過し、これにより、中心の出口からすべての希少細胞を回収することが可能となる一方で、血液細胞のうちの＞９９％は、側方出口から除去される。
【００４７】
高アスペクト比のデバイスでは、マイクロチャネルの幅が、細胞フォーカシングを制御する重要な寸法である。本明細書では、この寸法が、収縮領域の幅に対応し、これを約２０μｍとした。理想的には、直行するだけのマイクロチャネル（収縮−拡張アレイのないマイクロチャネル）でも、チャネルの側壁に沿った効果的な細胞の平衡化には十分である（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８，２０：１０１７０２ページ；Ｂｈａｇａｔ，ＡＡＳ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９，７（２）：２１７〜２２６ページ）。しかし、拡張領域を規則的な間隔で包含する理由は、二重のものである。第１に、これらのチャネルは、二重の鋳型形成工程（下記の「方法」の節を参照されたい）を用いるＰＤＭＳポリマーにより製作されているので、アスペクト比が＞２であるレリーフ構造は、変形および歪みに対して高度に感受性である（Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ，Ｅ．ら，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９９７，９（９）：７４１〜７４６ページ；Ｘｉａ，Ｙ．ら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８，２８（１）：１５３〜１８４ページ）。幅約６０μｍの拡張領域は、マイクロチャネルにより多大な構造的安定性をもたらしており、約７．５までの高アスペクト比の構造特徴を製作することを可能としている。第２に、拡張領域はまた、マイクロチャネル長にわたる圧力低下を軽減する働きもあり、デバイスを故障させることなく、高流速（Ｒｅ＞１００）の検査を可能とする。
【００４８】
別の態様では、マイクロ流体デバイスを、非同調細胞の混合物から１または複数の同調細胞を単離する方法において用いることができる。この方法は、非同調細胞の混合物を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って同調細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、より大型の同調細胞が、チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、より小型の同調細胞が、チャネルの他の部分に沿って少なくとも１つの他の出口へと流動する。
【００４９】
細胞周期は、細胞がその内容物を複製し、次いで、２つの娘細胞へと分割する、順序の決まった継起的イベントからなる。真核細胞では、適正な細胞分裂をもたらすこれらの異なるイベントを、４つの継起的な相：Ｇ１期（間隙期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２期（間隙期）、およびＭ期（有糸分裂期）に分割することができる。細胞周期を進むにつれ、細胞は、Ｓ期においてその染色体を複製し、Ｍ期においてこの染色体を分離する。長期間にわたるサイズのホメオスタシスを維持するために、細胞は、分裂する前に、サイズを平均で倍増させなければならない。Ｇ１期およびＧ２期の間隙期は、新たな高分子および各種の細胞小器官を合成するための時間をもたらし、細胞が、その外部環境をモニタリングして、その状態が、Ｓ期およびＭ期のそれぞれに入るのに適すると確認することを可能とする。有糸分裂後、細胞は、一時的な静止状態であるＧ０期に入ってから、再度細胞周期に入る。
【００５０】
細胞周期の同調は、細胞の特性および生物学的過程を研究し、細胞分裂前の各相に関与する遺伝子制御機構および遺伝子制御イベントを解明するのに不可欠である。同調培養物とは、細胞が、細胞周期の特定の相にあり、サイズおよびＤＮＡ含量など、類似の物理的特性および生化学的特性を示す培養物である。次いで、細胞は、その後の時点では同じ相にある比較的均一な群として、細胞周期を経過する。癌細胞による研究は、細胞周期における特定のチェックポイントに関与する重要な癌遺伝子の表現型および分布を明らかにしている。抗癌薬は、細胞周期の異なる相にある細胞を標的とすることが知られているため、癌の治療学は、腫瘍細胞試料を同調させることが可能であるかどうかに大幅に依存してきた。高度に同調させた細胞集団の使用はまた、多様な生物学的系の開発も大幅に容易とし、有用性も大幅に促進してきた。患者の免疫プロファイルに合致する細胞および組織の生成に核の導入が必要とされる幹細胞療法では、Ｇ０／Ｇ１期の幹細胞が高度な核導入効率を付与するので、細胞周期の同調が技法の成功にとって極めて重要である。したがって、それらの細胞周期の各相にある細胞を同調させるのに有効な技法を開発する必要が存在する。
【００５１】
以下では、螺旋状のマイクロチャネルにおける慣性力を用いて細胞を同調させる、マイクロ流体素子ベースの手法について説明する。近年では、慣性移動の原理に基づいてマイクロ流体システムにおけるサイズベースの粒子分離が開発されている（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９、７（２）：２１７〜２２６ページ；Ｄｉ Ｃａｒｌｏ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７、１０４（４８）：１８８９２ページ）。ポアズイユ流条件下にある螺旋形状のマイクロチャネルでは、多様なサイズの粒子が、慣性揚力およびディーン抗力の影響下において、マイクロチャネル断面に沿った異なる位置で平衡化する。本明細書で説明する通り、この原理を用い、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＣＤ３６細胞）および癌細胞（ＨｅＬａ細胞およびＫＫＵ−Ｉ００細胞）を含めた、複数の哺乳動物による永久細胞系を、Ｇ０／Ｇ１期の細胞に富む集団（＞８５％）、Ｓ期の細胞に富む集団、およびＧ２／Ｍ期の細胞に富む集団へと同調させることに成功した。分離の原理は、細胞周期における細胞の容量（および、したがって、直径、または、より一般的には、「サイズ」）と、その相との関係を利用する。本明細書ではまた、初代細胞系（骨髄）由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を同調させるためのこの技法の使用も裏付けられる。結果は、非同調試料による約２．８：１のＧ０／Ｇ１期集団対Ｇ２／Ｍ期集団比が、約１５．７：１へと濃縮されることを示す。同様に、同調させた後では、Ｇ２／Ｍ期集団の約４倍の濃縮が得られている。これらの結果は、他のマイクロ流体システムを用いて報告された結果（Ｋｉｍ，Ｕ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７、１０４（５２）：２０７０８ページ；Ｔｈｅｖｏｚ，Ｐ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０、８２：３０９４〜３０９８ページ；Ｃｈｏｉ，Ｓ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９、８１（５）：１９６４〜１９６８ページ；Ｍｉｇｉｔａ，Ｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，２：６５７〜６６０ページ）と同等であるが、スループットが顕著に増大したことにより、生存率の高い（約９５％）多数の細胞（１時間当たりの細胞約１５×１０６個）を同調させることが可能となっている。このデバイスのマイクロチャネルのデザインと組み合わせたパッシブの作動原理により、多くの異なる初代細胞型についての生物学的研究における多様な適用が可能となっていると考えられる。
【００５２】
当業者に知られている通り、「非同調細胞」とは、多様な相、例えば、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期にある細胞の混合物である。本明細書で用いられる場合、「同調細胞」とは、細胞周期の同じ相にある細胞を指す。非同調細胞の混合物は、哺乳動物の癌細胞の懸濁液もしくは間葉系幹細胞の懸濁液、組織、またはこれらの組合せでありうる。方法は、同調細胞を第１の出口から回収するステップをさらに含みうる。一部の実施形態では、チャネルのアスペクト比が、約１〜約５の範囲にありうる。特定の実施形態では、チャネルの幅が、約５００μｍでありえ、チャネルの高さが、約１４０μｍでありうる。
【００５３】
本明細書で説明する方法は、さらなる解析のために、例えば、蛍光活性化細胞分取などのために、デバイスから標的細胞を回収（単離）するステップをさらに含みうる。
【００５４】
当業者により理解される通り、方法はまた、標的細胞を濃縮するステップもさらに含みうる。例えば、複数の出口を有するデバイスの場合は、分離および／または濃縮を増強するように出口の寸法比をデザインすることができる。例えば、３つの出口を伴うデバイスを例として用いると、寸法比は、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：５：１、１：６：１、１：７：１、１：８：１、１：９：１、１：１０：１などでありうる。
【００５５】
標的細胞の濃縮率は、例えば、約２倍、約３倍、または約４倍の濃縮率に到達させることができる。
【実施例１】
【００５６】
［細胞を分離および単離するための変形能ベースの分取］
［材料および方法］
［マラリア原虫の培養］
本研究では、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの３Ｄ７株を用いた。原虫は、１０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）１ｍｌと併せた、１ＭのＮａＯＨ １ｍｌ中に溶解させた、０．３ｇのＬ−グルタミン、５ｇのＡｌｂｕＭＡＸ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、２ｇのＮａＨＣＯ３、および０．０５ｇのヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ培地１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で培養した。原虫を、２．５％のソルビトールを用いて環状期で同調させ、同調培養を維持した。５％のＣＯ２気体、３％のＯ２気体、および９２％のＮ２気体の混合物により通気した後、３７℃で培養物を保存し、それらのヘマトクリット値を２．５％で維持した。環状期、後期栄養体期、および後期分裂体期において細胞を回収した。原虫培養物のための全血液は、健常ドナーから得、これをスピンダウンしてＲＢＣを分離した。ＲＢＣペレットをＣＰＤＡで３日間にわたり処理してから、ＲＰＭＩ １６４０で３回にわたり洗浄し、使用のために保管した。
【００５７】
［試料の調製］
血液試料を、１倍濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、および１％ｖ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する洗浄緩衝液で３回にわたり洗浄してから、実験を行った。直径３μｍの蛍光標識したマイクロビーズ（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を血液に添加し（０．０１％の容量画分）、１×ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ、および３．５ｗ／ｖ％のデキストラン４０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ Ａｓｉａ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を含有する試料緩衝液中で再懸濁させた。デキストランは、正常な血漿の有効粘性をもたらし、実験中の赤血球の沈降および連銭形成を防止する一助となった（Ｙｅｈ Ｃら（１９９４）、６６（５）：１７０６〜１７１６）。目視観察および定量化のため、ｉＲＢＣ（０．０１％の寄生虫血）を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で染色した。次いで、最終的な血液懸濁物を、試料緩衝液により相応に、多様なヘマトクリット値（１％、１０％、および４０％）に調整した。
【００５８】
［デバイスの特徴づけ］
デバイスは、標準的なマイクロファブリケーションソフトリソグラフ法（ＭｃＤｏｎａｌｄ ＪＣら（２００２），Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３５（７）：４９１〜４９９）を用いて、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）により製作した。マイクロ流体デバイスを特徴づけるために、細胞試料を１ｃｃのシリンジに充填し、多様な流速で駆動されるシリンジポンプ（Ｆｕｓｉｏｎ ４００、Ｃｈｅｍｙｘ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、マイクロ流体デバイス内に送入した。１２ビットのＥＭＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎＥＭ＋ ８８５、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を装備した倒立型落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、流動を実験的に観察した。試験中、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、出口において、チャネルのハイスピード画像を収集した。
【００５９】
分離効率を定量化するため、蛍光標識したマイクロビーズおよびｉＲＢＣの分散度を、マイクロチャネルの出口で撮影した画像から測定した。マイクロビーズおよびｉＲＢＣの分散度は、出口が幅１００μｍのマイクロチャネルを、各々１０μｍずつの１０の等しい区画（bin）に分割し、各区画を通過するビーズ／ｉＲＢＣの数をカウントすることにより測定した（Ｂｈａｇａｔ ＡＡＳら（２００８），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１８（８）：９）。次いで、カウントをプロットして、チャネル幅にわたるビーズ／ｉＲＢＣの分布を示した。側方出口で測定されたビーズ／ｉＲＢＣのカウントを、全出口におけるカウントに照らして標準化することにより、濾過効率を決定した。濾過を完了するのに、すべてのビーズ／ｉＲＢＣが、２つのチャネル側壁へと移動し、２つの側方出口から効率的に濾過されることが期待される。回収された出口試料に対して、ＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いる蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を実施することにより、分離効率をさらに検証した。
【００６０】
［マイクロチャネルのデザイン］
このマイクロチャネルのデザインは、長さ３ｃｍ、１５×１０μｍ（幅×高さ）で、拡張非対称型３出口システムを伴うマイクロチャネルとした。マイクロチャネルは、入口における幅１００μｍのセグメントで始まり、１５μｍへと狭窄した。出口において、マイクロチャネルは、幅１００μｍの区画へと開口し、目視観察を増強した。ｉＲＢＣ感染血により調べる前に、全血液中に懸濁させた３μｍの硬質ポリスチレンビーズを用いて、濾過の原理を確認した。後期ｉＲＢＣにおいて見出される原虫とサイズが同様であり、このため、実際のｉＲＢＣ挙動を表すので、３μｍのビーズを選択した。試料は、０．０５〜０．１％のビーズまたは異なる感染期のｉＲＢＣでスパイクした全血液（４０〜４５％のヘマトクリット値）からなる。血液試料が、１５×１０μｍのマイクロチャネルを流動するにつれて、ｉＲＢＣより変形能が大きい正常ＲＢＣは、チャネルの中心軸に対して側方に移動し、より硬いｉＲＢＣを、チャネルの壁面へと駆逐する。低アスペクト比のマイクロチャネルをデザインすることにより、ｉＲＢＣを、チャネル幅だけに沿って辺縁趨向させ、これにより、各側壁近傍に整列させることができる。次いで、非対称型３出口システムを用いてｉＲＢＣを濾過し、これにより、持続的でハイスループットの変形能ベースの濾過を達成する。図１は、開発されたマイクロ流体デザインの概略図を示す。
【００６１】
［結果および考察］
濃縮した血流における変形能ベースの側方駆逐現象を検証するために、まず、ヘマトクリット値を１０〜４０％とする血液懸濁物中において、ＲＢＣとほぼ同じ大きさである、直径６μｍの硬質ポリスチレンマイクロビーズを調べた。流動が出口に到達する時点までに、すべてのビーズがマイクロチャネルの２つの側壁近傍に整列したことから、辺縁趨向が裏付けられた。次いで、後期ｉＲＢＣにおいて見出される原虫（３〜５μｍ）とサイズが同様であるために、蛍光標識したより小型の３μｍポリスチレンビーズにより実験を繰り返した。硬い原虫が、感染細胞における変形能の喪失の主な原因である（Ｎａｓｈ ＧＢら（１９８９），Ｂｌｏｏｄ．７４（２）：８５５〜８６１）ので、３μｍのビーズは、ｉＲＢＣの流動挙動をよく表す。ヘマトクリット値を１％、１０％、および４０％とする血液懸濁物中にビーズを添加し、多様な流速でデバイスを介して送入した。各区画位置を通過するビーズをカウントすることにより、分離効率を定量化した。一貫して、各実験につき合計２００個ずつのビーズをカウントした。図２Ａ〜２Ｃは、流速を変化させるときの、マイクロチャネル幅にわたるビーズの分布をプロットする。低ヘマトクリット値（１％のヘマトクリット値）では、ビーズおよびＲＢＣが、チャネル幅にわたる均一な分散を維持したことから、軸方向の移動および辺縁趨向が無視できる程度であることが示される。ヘマトクリット値を１０％および４０％へと増大させると、マイクロチャネルの中央部において、十分に成長した、ＲＢＣを優勢とするコアの形成が結果としてもたらされる。ビーズとＲＢＣとの相互作用が強いため、ほとんどすべてのビーズ（＞９０％）が、チャネル側壁へと駆逐された（図２Ｂ〜２Ｃの区画１および１０）。これらの結果は、他の研究者らにより報告されている結果と一致することから、細胞の辺縁趨向に対する高ヘマトクリット値の役割が示唆される（Ｊａｉｎ Ａら（２００９）、ＰＬｏＳ ＯＮＥ．４（９）：ｅ７１０４）。図３Ａは、ヘマトクリット値を変化させた試料について、側方出口および中央出口アームにおいて測定した３μｍビーズの分布を示す。すべての実験は、５μＬ／分で一定の流速で実施した。ヘマトクリット値を１％とする場合、中央出口のビーズは、側方出口の約２倍であった。これは、マイクロチャネルの中央部においては流速が速くなることに帰せられ（ポアズイユ流）、所与の時間においてマイクロチャネルの中央部を通過するビーズが結果として増大する。しかし、ヘマトクリット値を増大させると（１０％および４０％とすると）、ほとんどすべてのビーズ（約９０％）がチャネルの側壁へと駆逐され、側方出口により回収された。ヘマトクリット値を１０％から４０％へと増大させると、濾過効率もまた、８９％から９７％へと増大したことから、辺縁趨向の増大が示される（Ｚｈａｏ Ｒら（２００８），Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３６（７）：１１３０〜１１４１）。
【００６２】
本発明者らのマイクロチャネルでは、高ヘマトクリット値の試料が、ビーズの側方駆逐の増強を結果としてもたらす。次に、流速が分離効率に対して及ぼす影響を決定するために、実験を実施した。図３Ａに示す結果に基づいて蛍光標識したビーズでスパイクした４０％のヘマトクリット値試料を、０．２μＬ／分〜５μＬ／分の範囲の流速で調べた。図３Ｂは、流速を増大させたときの側方出口および中央出口アームで測定される３μｍビーズの分布を示す。ビーズの辺縁趨向効率は、調べたすべての流動条件において、約９０％でほぼ一定を維持した。これは、近年において報告される他の結果と符合する（Ｚｈａｏ Ｒら（２００８），Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３６（７）：１１３０〜１１４１）。この挙動は、以下の理由により説明することができる。流速を低下させると、硬いビーズは、チャネル長を縦断するのにより長時間を費やし、このため、複数の細胞が相互作用して側方へと辺縁趨向するのに十分な時間が与えられる。しかし、流速を増大させると、慣性が増大するために、ＲＢＣは、マイクロチャネルの中心軸へとより迅速に移動し、十分に明確なコアを形成する。この結果、硬いビーズは中央部から側壁へと「押し」のけられ、このため、流速を増大させてもなお、効率的な分離が達成される。
【００６３】
ポリスチレンビーズを用いる実験によるデザイン原理の検証に続いて、次に、マラリア感染ｉＲＢＣによる試験を実施した。図３Ａおよび３Ｂに示される結果に基づいてヘマトクリット値を１０％および４０％とするｉＲＢＣ試料について調べた。まず、それらの硬さが増大するために、早期ｉＲＢＣと比較した場合、辺縁趨向効果がより顕著となるので、後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣを用いて、すべての試験を行った。図４Ａおよび４Ｂは、流速条件を変化させて、ヘマトクリット値を１０％および４０％とした場合に、マイクロチャネルの出口において測定された、ｉＲＢＣの分布結果を示す。硬質ポリスチレンビーズにより得られた結果とは逆に、ヘマトクリット値を１０％とする場合、本発明者らは、ｉＲＢＣの側壁への辺縁趨向が無視できる程度であることを認める。ｉＲＢＣカウントは、チャネルの中心軸周囲において放物線状の分布を示し、ポアズイユの速度プロファイルと符合する。これは、細胞間相互作用を中程度とするとき、ｉＲＢＣと正常ＲＢＣとの変形能の差違が、ｉＲＢＣを側壁へと駆逐するのに十分ではないことを示す。
【００６４】
しかし、ヘマトクリット値を４０％まで増大させると、著明なｉＲＢＣの辺縁趨向が結果としてもたらされる（図４Ｂ）。図により、すべての流動条件について、約８０％のｉＲＢＣが、区画１および１０に駆逐され、ポリスチレンビーズにより得られた結果と同様となった。調べたすべての流速で辺縁趨向効果が観察されたことから、ヘマトクリット値が、ｉＲＢＣの辺縁趨向の主要な因子であることが示される。ヘマトクリット値を増大させると、細胞間相互作用の増大が促進され、変形能の低いｉＲＢＣがチャネルの側壁へと駆逐され、これにより、感染細胞の効率的な分離が可能となり、これにより、変形能の低いｉＲＢＣを分離するための細胞の辺縁趨向の使用が裏付けられ、鎌状赤血球貧血および白血病など、赤血球の硬さの変化を特徴とする他の疾患を診断するのにこの技法を適用することが支持される。
【００６５】
図５は、流速を変化させるときの、このｉＲＢＣ辺縁趨向現象による分離効率を示す。この技法が、高流速（５μＬ／分）を含め、調べたすべての流動条件において同様な良好さで作用したことは、ハイスループットの分離を行う場合の重要な考慮点であり、これに注目することは重要である。予測される通り、ｉＲＢＣはなお変形可能であり、このため、側方へと辺縁趨向する効率が低いので、ｉＲＢＣの分離効率は、硬質のビーズにより測定した場合の分離効率ほど高くはなかった。
【００６６】
最後に、濾過効率の精度を検証するため、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて、出口における試料を解析した。ヘマトクリット値を４０％とする血液懸濁物における、環状期ｉＲＢＣおよび後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣの両方を、５μＬ／分でデバイスを介して送入し、流出物を回収し、ＦＡＣＳを用いて解析した。合計５００，０００のイベントを記録し、ｉＲＢＣの分離効率のより正確な表示を得た。後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣによる実験の場合、側方出口と中央出口との間では、９２％の濾過効率が測定された。これは、区画内のカウントデータと符合する（図６Ａ）。側方出口が、３つの出口の容量のうちの５０％を占めるので、側方出口におけるｉＲＢＣ濃度は、注入試料と比較して２倍の濃縮率を示す。しかし、この数は、出口チャネルのデザインが最適化されていないことの影響を受けるものであり、同じ工程を反復しうる場合はさらに改善することができる。
【００６７】
このｉＲＢＣの辺縁趨向を、マラリアの診断に適用するには、環状期ｉＲＢＣを濃縮することが重要である。典型的にはマラリア感染患者において、後期（栄養体期／分裂体期）ｉＲＢＣは、毛細血管後細静脈内に付着閉塞し、マラリア感染を検出するために、末梢血流中で循環するのが観察されるのは、環状期ｉＲＢＣだけである（Ｄｅｍｉｒｅｖ ＰＡら（２００２）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７４（１４）：３２６２〜３２６６；およびＧａｓｃｏｙｎｅ Ｐら（２００２）、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ２（２）：７０〜７５）。最適化させた分離条件（４０％のヘマトクリット値、５μＬ／分）下において、環状期ｉＲＢＣについてのこの技法の分離効率を調べ、ＦＡＣＳを用いて、回収された流出物を解析した（図６Ｂ）。環状期ｉＲＢＣは、細胞表面積対容量比の減少、および細胞膜の硬化のために、非感染細胞よりわずかに硬化するに過ぎない（Ｓｕｒｅｓｈ Ｓら（２００５），Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１（１）：１５〜３０；Ｎａｓｈ ＧＢら（１９８９），Ｂｌｏｏｄ．７４（２）：８５５〜８６１；およびＨｅｒｒｉｃｋｓ Ｔら（２００９），Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１１（９）：１３４０〜１３５３）。しかし、ｉＲＢＣを濾過するのにこの辺縁趨向現象を用いると、変形能のこのわずかな差異でもなお利用することができる。環状期ｉＲＢＣの分離効率が、後期ｉＲＢＣの分離効率より低いことは当然である。結果は、環状期ｉＲＢＣもまた、チャネルの側方へと辺縁趨向し、約８０％の分離効率を結果としてもたらすことを示す。収集されたビデオ画像を解析したところ、後期ｉＲＢＣが側壁へと完全に駆逐されるのに対し、早期ｉＲＢＣは、それほどは駆逐されないことが認められた。これは、例えば、より長型のマイクロチャネルを用い、これにより、環状期ｉＲＢＣに、側壁へと完全に辺縁趨向するのに十分な時間を与えることで、さらに改善することができる。また、出口を適切な形で分割することにより（例えば、３つのアーム間で、１：２：１の比を用いるのではなく、１：１０：１の幅比を用いることにより）、開発したマイクロ流体デバイスを、低度の寄生虫血における検出感度を改善したマラリア診断のための濃縮ツールとして用いることもまた可能であろう。
【００６８】
より硬いｉＲＢＣは、白血球のように挙動し、側壁への辺縁趨向を受ける。これを裏付けることにより、ｉＲＢＣの微小循環による血行力学的効果、および細胞接着性に対するその病態生理的重要性に対する洞察がもたらされる。前出で言及した通り、ｉＲＢＣにおける２つの重要な形態変化は、ｉＲＢＣ膜の接着性の増大、および変形能の低下である。これらの変化は、重度のマラリアの発症機序において枢要であり、各種の宿主細胞へのｉＲＢＣの細胞接着をもたらす。これらのｉＲＢＣの毛細血管壁への辺縁趨向はまた、細静脈の毛細血管における付着閉塞ももたらし、微小循環を含む毛細血管の閉塞の一因となる（Ｄｏｎｄｒｏｐ ＡＭら（２０００），Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ．１６（６）：２２８〜２３２；およびＣｏｏｋｅ ＢＭら（２０００），Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ．１６（１０）：４１６〜４２０）。Ｈｏらは、ｉＲＢＣによる内皮への細胞接着が、ローリングおよび接着など、多段階による白血球動員を模倣し、この過程が、ヒトの毛細血管後の細静脈、および細動脈系の両方において生じたことを、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて示している（Ｈｏ Ｍら（２０００）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９２（８）：１２０５〜１２１１）。示された結果は、硬い後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣが、側方へと駆逐され、マイクロチャネルの辺縁を流動することを示す。ｉｎ ｖｉｖｏなら、これは、ｉＲＢＣが側方へと分枝する小型の毛細血管へと侵入し、結果として、その後、ｉＲＢＣが毛細血管床に付着閉塞することを促進するであろう。また、生理学的な細動脈流に類似する広範な流動条件（Ｒｅ＝０．０１〜２．２２）にわたっても、ｉＲＢＣの辺縁趨向について調べられており（Ｐｏｐｅｌ ＡＳら（２００５），Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ． ３７：４３〜６９）、ｉｎ ｖｉｖｏにおける付着閉塞および細胞接着に対する変形能低下の役割がさらに確認されている。
【００６９】
生理学的な細胞辺縁趨向現象を、マイクロ流体デバイスにおける持続的な変形能ベースのｉＲＢＣ濾過を達成するのに適用した。この技法は、他のマイクロ流体分離法を上回る多くの顕著な利点をもたらす。まず、持続的な作動方式は、試料のハイスループット（５μＬ／分；１分間当たりの細胞約２０００万個）を可能とし、低度の寄生虫血における検出感度を増強する（Ｇａｓｃｏｙｎｅ Ｐら（２００２），Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．２（２）：７０〜７５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＰＡら（２００６），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ．７４（４）：５６８〜５７２）。パッシブの作動原理は、機能性のために外力の場を組み込む必要を排し、このマイクロ流体デバイスを現場環境に理想的なものとしている。患者に由来する全血液を、直接検査することができるので、他のマイクロスケールにおける分離法とは異なり、試料の調製ステップが不要であり（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＰＡら（２００６），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ．７４（４）：５６８〜５７２；Ｋａｒｌ Ｓら（２００８），Ｍａｌａｒｉａ Ｊｏｕｒｎａｌ．７（１）：６６）、処理時間がさらに短縮され、処理費用がさらに削減される。また、特別な化学物質または抗体も不要なので、高温多湿の気候に悩まされ、保冷庫が不足するマラリア罹患諸国にとって主要な憂慮点である、試薬の保存問題を解決する一助となっている（Ｓｔｅｖｅｎｓ ＤＹら（２００８），Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．８（１２）：２０３８〜２０４５）。最後に、このデバイスの費用低廉でディスポーザブルな性格は、このデバイスを、現場臨床に理想的なものとしている。
【００７０】
［結論］
本明細書では、生体模倣性の細胞辺縁趨向に基づくマイクロ流体デバイスにおける持続的な変形能ベースのｉＲＢＣ濾過法を導入する。本明細書では、より硬いｉＲＢＣが、白血球と同様に挙動し、生理学的条件下において、側壁へと辺縁趨向することが裏付けられる。結果は、広範な流速にわたり観察された最適の辺縁趨向のためには、試料の高ヘマトクリット値（４０％）が重要であったことを示す。試験は、５μＬ／分の比較的高度のスループットにおいて、全血液と混合した環状期ｉＲＢＣおよび後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣの両方により実施した。濾過効率は、区画カウント法およびＦＡＣＳ解析を個別に用いて決定した。報告される結果は、早期環状期ｉＲＢＣには約７５％、および後期栄養体期／分裂体期ｉＲＢＣには＞９０％の高濾過効率を示す。さらなる試料の改変および調製の必要を排するこのパッシブのマイクロ流体デバイスでは、全血液試料を直接用いうるので、この技法は、医療資源の乏しい環境におけるオンサイトの検査に理想的であり、診断をより迅速およびより正確なものとする。最後に、分離の原理が、内因性バイオマーカーとしての変形能の差違に基づくので、デバイスは、これらもまた細胞の硬さの変化により特徴づけられる、鎌状赤血球貧血および白血病など、他の血液細胞疾患にも容易に適用することができる。
【実施例２】
【００７１】
［螺旋状マイクロ流体素子における細胞周期の同調］
［材料および方法］
［細胞の培養］
１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と併せて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を補充した、低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で、間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を培養した。１％ペニシリン−ストレプトマイシンと併せて１０％ＦＢＳを補充した、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で、ヒトＣＤ３６をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ−ＣＤ３６細胞（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を培養した。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した、低グルコースのＤＭＥＭ中で子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ−２（商標）、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を培養した。胆管癌腫細胞系であるＫＫＵ−１００細胞（恵与による）を、１０％ＦＢＳ、３％ＨＥＰＥＳ緩衝液、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するハムＦ−１２培地中で培養した。すべての培養物を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃に維持した。１ｃｍ２当たりの細胞５００個でＭＳＣを播種し、１７５ｃｍ２の滅菌フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で培養し、４８時間後に０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液により解離させて、接触阻害を阻止した。ＣＨＯ−ＣＤ３６細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＫＫＵ−１００細胞を、２５ｃｍ２の滅菌フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で培養し、毎週３回ずつ継代培養（１：４）し、４８時間ごとに培地を置換した。コンフルエント未満の単層は、０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液により解離した。
【００７２】
試験の前に、非同調細胞を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する緩衝液中で、１ｍＬ当たりの細胞１００，０００個まで希釈し、凝集およびマイクロチャネル壁面への吸着を阻止した。３．５％ｗ／ｖのデキストラン４０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ Ａｓｉａ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を補充することにより、細胞の沈殿を阻止するように、溶液密度を調整した。
【００７３】
［接触阻害および血清飢餓による間葉系幹細胞の同調］
接触阻害によりＧ１期の停止を開始させるため、１ｃｍ２当たりの細胞２０，０００個でＭＳＣを播種し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で４８時間にわたり培養した。血清飢餓によりＧ１期を停止させるため、１ｃｍ２当たりの細胞５００個でＭＳＣを播種し、ＦＢＳを伴わないＤＭＥＭ中で４８時間にわたり培養した。停止された細胞を、０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液により解離してから、７０％のエタノール中で３０分間にわたり固定した。
【００７４】
［マイクロチャネルの製作］
デバイスは、標準的なソフトリソグラフ法（Ｘｉａ，Ｙ．ら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８（１）：１５３〜１８４ページ）を用いて、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）により製作した（図９Ａ）。略述すると、まず、６インチのシリコンウェハーにパターンを描き、深堀反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を用いてエッチングし、ウェハー上にチャネルを画定する。エッチングの後、パターンが描かれたシリコンウェハーを、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈペルフルオロオクチル）シラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で２時間にわたり処理して、ＰＤＭＳ鋳型のリリースを促進した。シラン化の後、硬化剤と１０：１（ｗ／ｗ）の比で混合したＰＤＭＳプレポリマーを、シリコン原型へと注入し、７０℃で２．５時間にわたり硬化させた。次いで、硬化したＰＤＭＳ鋳型をシリコンウェハーから剥離させ、その後のＰＤＭＳ鋳造のための母型として用いた。次に、このＰＤＭＳ母型を２時間にわたりシラン化し、その後のＰＤＭＳ鋳型のリリースを支援した。所望のパターンによる最終ＰＤＭＳ鋳型における硬化の後、１．５ｍｍの生検用パンチを用いて、入口および出口のための小孔を開けた。次いで、ＰＤＭＳ鋳型を酸素プラズマ処理（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｆｅｍｔｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いて、顕微鏡用スライドガラス（１インチ×３インチ×１ｍｍ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に不可逆的に接着させた。
【００７５】
［デバイスの特徴づけ］
蛍光ポリスチレンビーズ（２５μｍ：緑色、１５μｍ：青色、および１０μｍ：赤色）（ＩＴＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を、均等の比率で、１％ＢＳＡを伴う１×ＰＢＳおよび３．５（ｗ／ｖ）倍濃度のデキストラン４０中に、１ｍＬ当たりのビーズ１．２×１０５個の総濃度で懸濁させた。螺旋状マイクロ流体デバイスを特徴づけるために、ビーズの混合物および細胞懸濁液を６０ｍＬのシリンジに充填し、２．５ｍＬ／分の流速で駆動されるシリンジポンプ（ＮＥ−１０００、Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、マイクロチャネル内に注射した。１２ビットのＥＭＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎＥＭ＋ ８８５、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を装備した倒立型落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、流動を実験的に観察した。試験後、出口から回収される細胞試料の顕微鏡画像を収集し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、細胞サイズを写真から計算した。
【００７６】
［ＦＡＣＳを用いる細胞周期の解析］
分取された試料に対して、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いるフローサイトメトリー解析を実施し、細胞内のＤＮＡ含量を解析した（Ｗｅｒｓｔｏ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｂ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２００１．４６（５）：２９６〜３０６ページ）。分取された同調細胞試料は、１×ＰＢＳ中で洗浄し、７０％のエタノール中、４℃で３０分間にわたり固定した。次いで、６００ｇで５分間にわたり細胞を遠心分離し、１×ＰＢＳ、３．８ｍＭのクエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、１０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ（ｉ−ＤＮＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、および５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を含有する染色溶液中で３０分間にわたりインキュベートした。次いで、ＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）およびＣｙｆｌｏｇｉｃ（ＣｙＦｌｏ Ｌｔｄ、Ｆｉｎｌａｎｄ）データ解析ソフトウェアを用いるＦＡＣＳ解析を実施することにより、染色した細胞を、同調効率について調べた。
【００７７】
［結果および考察］
［デザイン原理］
図９Ａは、螺旋状分離装置の概略図を示す。マイクロ流体システムにおいて慣性力を用いる、サイズベースの細胞分離は、それらの高分離分解能、および極めて高度なスループットのために関心を集めている。ポアズイユ流条件下にある単純な粒子含有管内流では、せん断誘導性揚力と壁面誘導性揚力との均衡により、懸濁する粒子を、管辺縁部の周囲に環状形に平衡化させる、「管状絞込み」効果が生じる（Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ、１９６１、１８９：２０９〜２１０ページ；Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，１９６２，１４（０１）：１１５〜１３５ページ；Ｍａｔａｓ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，２００４，５１５：１７１〜１９５ページ）。ＣｈｕｎおよびＬａｄｄは、断面が矩形のチャネルでは、揚力（ＦＬ）が、チャネル断面にわたる８カ所の異なる位置において粒子を平衡化させることから、管と比較した対称性の破れが反映されることを裏付けた（Ｃｈｕｎ，Ｂら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ、２００６、１８：０３１７０４ページ）。Ａｓｏｍｏｌｏｖによる数値計算は、この揚力が、粒子サイズ（ｄ）に極めて感受性であり、その４乗に伴って変化する（ＦＬ∝ｄ４）ことを示す（Ａｓｍｏｌｏｖ，Ｅ．Ｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，１９９９，３８１：６３〜８７ページ）。近年、この慣性による粒子の移動が、１．９μｍの粒子と５９０ｎｍの粒子とを分離するためのマイクロチャネル流において用いられている（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、２００９、７（２）：２１７〜２２６ページ）。ｄ／Ｄ≧０．０７［式中、Ｄは、マイクロチャネルの直径である］では、これらの慣性揚力が顕著に大きく、この結果、粒子の平衡化が短い距離内で生じ、マイクロ流体システムにとって理想的となることを研究は示している（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２００９，７（２）：２１７〜２２６ページ；Ｄｉ Ｃａｒｌｏ， Ｄ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７、１０４（４８）：１８８９２ページ； Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｒ．Ｅ．ら， Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｄｒｉｖｅｎ ｆｌｏｗ ｉｎ ａ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｕｉｔ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｏｌｏｇｙ， １９９７．４１：６２１ページ）。低アスペクト比の矩形マイクロチャネルでは、マイクロチャネルの直径Ｄを、マイクロチャネルの高さ（Ｈ）に近似することができる（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．ら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００８、２０：１０１７０２ページ）。
【００７８】
螺旋形状のマイクロチャネルでは、外向きの遠心力により、マイクロチャネルの上半分および下半分において、ディーン渦としてもまた知られる反転渦がもたらされる。これらの二次的なディーン渦は、懸濁する粒子に対して抗力を及ぼし、粒子を渦の中に引き込む。このディーン抗力（ＦＤ）の大きさは、粒子サイズおよびチャネル断面内の粒子の位置に伴って変化する（ＦＤ∝ｄ）。したがって、螺旋状マイクロチャネル内を流動する粒子は、慣性揚力およびディーン抗力の両方の下に置かれる。慣性揚力（ＦＬ）と、ディーン抗力（ＦＤ）との相互作用により、８カ所の平衡位置は、各々がディーン渦の上腕内および下腕内にある、チャネル内壁近傍の２カ所だけに縮減される（Ｒｕｓｓｏｍ，Ａ．ら，Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ、２００９，１１：０７５０２５ページ）。２カ所の平衡位置は、マイクロチャネルの高さに沿って互いに重なり合い、所与の粒子サイズに対して、マイクロチャネルの内壁から同じ距離に位置する、すなわち、マイクロチャネルの幅にわたる単一の位置として目視される（図９Ｂ）。このフォーカシング位置は、ＦＬおよびＦＤの両方に依存するので、粒子サイズに伴って顕著に変化する（ＦＬ／ＦＤ∝ｄ３）。これは、サイズの異なる粒子が、マイクロチャネル断面内で、側面方向の異なる位置を占め、最大の粒子が、チャネルの内壁に最も近接することを示唆する（Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２００９，９（２０）：２９７３〜２９８０ページ）。このため、分枝状出口をデザインすることにより、異なるサイズの画分が抽出され、分離が達成されることができる。
【００７９】
慣性揚力とディーン力との組合せ効果を用いる、持続的なサイズベースの分離は、Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉらにより、単回の通過による１０μｍ、１５μｍ、および２０μｍの粒子の分離、およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞とＣ６ラット神経膠腫細胞との分離に適用された（Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２００９、９（２０）：２９７３〜２９８０ページ）。Ｒｕｓｓｏｍらは、この技法を、血液中における白血球の濃縮を達成するのにさらに適用した（Ｒｕｓｓｏｍ，Ａ．ら，Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ、２００９、１１：０７５０２５ページ）。本研究において、本発明者らは、この原理を、細胞周期におけるそれらの相に基づいて細胞を同調させるのに適合させた。このデバイスの作動原理は、細胞容量（および、したがって、細胞サイズ）と細胞周期におけるその相との関係を利用して、細胞を同調させる。本明細書で説明する通り、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、Ｇ１／Ｇ２期細胞、Ｓ期細胞、およびＧ２／Ｍ期細胞の同調集団へとサイズにより画分化した。
【００８０】
デザイン原理を裏付け、流動条件を決定するため、螺旋状マイクロチャネル内で、サイズが２５μｍ、１５μｍ、および１０μｍの蛍光標識したポリスチレンビーズの混合物を調べた。ビーズの直径は、哺乳動物細胞のサイズ範囲を模倣するように選択した。マイクロチャネルのデザインは、１つの入口および８つの分枝状出口を伴う、９つのループによる螺旋形状からなった。異なる細胞型について、マイクロチャネルの幅は、５００μｍで固定し、高さは、ｄ／Ｄ比が＞０．０７を満たすように変化させた。図９Ｂは、２．５ｍＬ／分の最適化させた流速で、マイクロチャネルの入口および出口において収集したマイクロビーズの蛍光重ね合せ画像を示す。流動が出口に到達する時間までに、２５μｍ、１５μｍ、および１０μｍのビーズは、マイクロチャネル断面にわたる３つの異なる流れにフォーカスされ、それぞれ、出口１、出口２、および出口３において効率的に回収される。
【００８１】
［永久培養物の同調］
指数関数的に増殖する哺乳動物細胞培養物では、Ｇ１期の新生細胞が、この培養物のサイズ分布の下端のサイズである（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，６０（６）：１０９９〜１１０６ページ）。細胞が、タンパク質および脂質の合成を介して臨界サイズとなったとき、細胞は、後期Ｇ１期において新たな細胞周期を開始し、Ｓ期においてＤＮＡを合成する。細胞成長は、細胞が、Ｇ０／Ｇ１期における細胞の元のサイズの約２倍まで成長する有糸分裂期（Ｍ期）まで持続する。これに対応して、Ｇ２／Ｍ期における細胞は、２コピーずつのＤＮＡを有する。
【００８２】
２つの癌細胞系（ＨｅＬａ細胞およびＫＫＵ−１００細胞）を用いて、デバイスの同調性能を探索した。ＨｅＬａ細胞集団およびＫＫＵ−１００細胞集団の平均直径が、それぞれ、１６．３±２．５μｍおよび１７．８±２．４μｍと測定されたので、高さ１４０μｍの螺旋状マイクロチャネル（ｄ／Ｈ≧０．０７の条件を満たす）を用いて細胞を分取した。細胞をマイクロチャネルに導入すると、サイズ分布が広範な非同調細胞が、マイクロチャネルの内側の半分に沿った、側面方向の異なる位置において、異なる軌跡へと分離される。分取後、出口１〜４から回収される非分取（対照）細胞および分取細胞の光学顕微鏡画像を撮影し、これらの直径を記録および解析した。細胞を、それらのサイズに基づき分離することに成功した。最大の細胞集団は、マイクロチャネルの内壁に最も近接した出口（出口１）において回収され、平均直径は、１９．４±５．６μｍ（ＨｅＬａ）および２４．６±３．０μｍ（ＫＫＵ−１００）であった。最小のＨｅＬａ細胞集団およびＫＫＵ−１００細胞集団は、出口４において回収され、平均直径は、それぞれ、１３．５±１．５μｍおよび１６．６±２．４μｍであった。同様に、別の細胞系であるＣＨＯ−ＣＤ３６細胞もまた、より大型のサイズ分布（１３．３〜３６．７μｍ）を収容する、高さ２００μｍのマイクロチャネルを用いて、サイズにより画分化した。
【００８３】
細胞周期の異なる相にある細胞は、細胞内のＤＮＡ含量により識別することができる。異なる相における分離細胞の分布は、フローサイトメトリー解析を用いて推定した。前出で言及した通り、Ｇ２／Ｍ期にある細胞のＤＮＡ蛍光強度は、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の２倍であることが典型的である。各相における細胞の百分率を計算し、二倍体または凝集体の細胞は、蛍光のパルス面積対パルス幅のプロットを用いて識別した（Ｗｅｒｓｔｏ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｂ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００１．４６（５）：２９６〜３０６ページ）。図１０Ａ〜１０Ｃは、ＨｅＬａ細胞、ＫＫＵ−１００細胞、およびＣＨＯ−ＣＤ３６細胞を同調させた後、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期において分取された一倍体細胞のＤＮＡ含量の分布を示すヒストグラムを表示する。分離後、出口４から回収された細胞では、高度の細胞同調性が達成され、ＨｅＬａ細胞のうちの８４％、ＫＫＵ−１００細胞のうちの９６％、およびＣＨＯ−ＣＤ３６細胞のうちの８６％が、Ｇ０／Ｇ１期に同調した。同時に、出口１から回収された細胞でも、Ｇ２／Ｍ期における２〜３倍の濃縮が達成された。
【表１】
【００８４】
これらの結果は、他のマイクロ流体システムを用いて報告された結果（Ｋｉｍ，Ｕ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７，１０４（５２）：２０７０８ページ；Ｔｈｅｖｏｚ，Ｐ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，８２：３０９４〜３０９８ページ；Ｃｈｏｉ，Ｓ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，８１（５）：１９６４〜１９６８ページ；Ｍｉｇｉｔａ，Ｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，２：６５７〜６６０ページ）と同等である。しかし、本技法の高度な流動スループットは、報告されている他のマイクロフルイディクス法より顕著に高量である、１時間当たりの細胞約１５×１０６個を画分化することが可能である。パッシブの分取原理はまた、＞９０％の細胞生存率も確保する。各種のマイクロ流体細胞周期同調システムの概要を表２に示す。
【表２】
【００８５】
［初代培養物（ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ））の同調］
次いで、デバイスが、初代細胞系（骨髄）由来のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を同調させる能力について調べた。癌細胞系または形質転換細胞系と異なり、ｈＭＳＣは、接触阻害に対する感受性が高い。１５００ｃｍ−２および３０００ｃｍ−２の密度で播種したｈＭＳＣの細胞内ＤＮＡ含量を解析すると、培養の２日後において、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞が実質的に少なくなる。したがって、Ｓ期の細胞集団およびＧ２／Ｍ期の細胞集団を濃縮するため、５００ｃｍ−２のより低密度で細胞を播種し、２日間にわたり培養してから分取した。図１１Ａ〜１１Ｃは、出口１〜４から回収された分取ｈＭＳＣの光学顕微鏡写真および生存率の結果を示す。出口１から回収されたｈＭＳＣの平均細胞直径は、２３．５±５．６μｍであり、出口４から回収された細胞（約１５．５±２．１μｍ）より顕著に大きかった。分離後、トリパンブルー除外アッセイおよび長時間にわたる再培養により、細胞の生存率を評価した。分取細胞の生存率は、対照の非分取ＭＳＣの生存率と同様であり、各出口から回収された細胞のうちの９０％超が色素を含まなかったことから、いかなる物理的な損傷を与えずに細胞が分取されたことが示される（図１１Ｂ）。培養の１４日後、分取ｈＭＳＣの形態が、非分取（対照）細胞の形態と類似していたことから、分取後においても細胞生存率が維持されていることがさらに裏付けられる（図１１Ｃ）。
【００８６】
ＤＮＡについてのヒストグラムにより示される通り、対照のＭＳＣ培養物では、細胞のうちの５６．２％がＧ０／Ｇ１期にあり、２４．３％がＳ期にあり、１９．９％がＧ２／Ｍ期にあることが判明した（図１２）。同調後、出口２から回収された細胞集団が、Ｓ期にある細胞集団およびＧ２／Ｍ期にある細胞集団を組み合わせて７２．７％であったのに対し、出口４からの細胞のうちの８６．１％は、Ｇ０／Ｇ１期に同調していた（表１）。これらの結果は、非同調試料の３：１のＧ０／Ｇ１期集団対Ｇ２／Ｍ期集団の比が、出口４で回収される試料では、１６：１へと濃縮されていることを示す。同様に、出口１で回収された試料では、Ｇ２／Ｍ期集団の４倍の濃縮が得られる。
【００８７】
ｈＭＳＣがＧ０／Ｇ１期で同調していたことを実験的に裏付けるために、最小のｈＭＳＣ集団（出口４）の同調性を、血清飢餓および接触阻害によりＧ０／Ｇ１期で停止させたｈＭＳＣと比較した。接触阻害による７６．４％、および４８時間にわたる血清飢餓による７７．５％と比較して、デバイスの出口４から回収されたｈＭＳＣのうちの８６．２％が、Ｇ０／Ｇ１期で同調していることが判明した。出口４から回収されるｈＭＳＣの対応する直径（１５．５±２．１μｍ）は、血清飢餓細胞（１６．９±４．２μｍ）および接触阻害細胞（２３．３±３．８μｍ）よりサイズ分布が狭い。接触阻害は、ＤＮＡ量が同様の細胞をもたらしたが、停止させた集団の細胞サイズは、元の培養物と同程度に均質性を欠いていた（２１．９±３．５μｍ）ことが注目された。同調の成功についての主要な基準は、同調細胞集団におけるＤＮＡ含量が同様なことであるが、細胞のサイズ分布もまた、初期細胞と比較して、比較的均一なことである（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，６０（６）：１０９９〜１１０６ページ）。接触阻害群の細胞直径が広範囲にばらついていることは、細胞が、同様のＤＮＡ量を伴って停止しただけであり、タンパク質および質量の合成をもたらす他の細胞過程が真に同調したわけではなかったことを示す。これに対し、培養物から血清を除去した場合は、Ｇ１期のＤＮＡ量を有するｈＭＳＣを同調させ、物質合成を停止させたが、細胞のサイズ範囲は、本発明者らのデバイスにより同調させた細胞と比較して、やはり比較的大きかった。したがって、血清飢餓細胞は、ＤＮＡ量は比較的同様であったが、真に同調していたわけではなかった。また、血清飢餓させたｈＭＳＣの形状は、比較的多くの気泡を伴ってより不規則であったことから、血清飢餓に誘導されるストレス下においては、ｈＭＳＣの正常な生理状態の破壊が示されることも注目された。
【００８８】
デバイスにより同調させたｈＭＳＣが、同調分裂を経過するかどうかを、次に探索した。同調した細胞は、同様のサイズおよびＤＮＡ含量を有するだけでなく、比較的均一なコホートとして細胞周期を経過しうるということを基本的な仮定とする。この仮説を検証するため、Ｇ０／Ｇ１期における同調性を８６％とする、出口４から回収したｈＭＳＣを再播種し、２４、４８、および７２時間後にそれらのＤＮＡ含量を解析した（図１３）。興味深いことに、培養の２４時間後、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にある細胞の百分率が７９．７％であったことから、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の大半が、後続の相へと進行したことが示される（表３）。
【表３】
【００８９】
哺乳動物細胞は、Ｇ１／Ｓ期に１６〜２４時間とどまり、Ｇ２／Ｍ期にとどまるのは約２〜３時間だけであることが典型的である（Ｋｉｍ，Ｕ．ら，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｐｈａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００７、１０４（５２）：２０７０８ページ）。したがって、培養の２４時間後には、細胞の大半が、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にあることが見出されると予測される。しかし、細胞の同調性は、分裂間期における確率的変動の結果として、時間と共に減衰した。細胞増殖の接触阻害により、Ｇ０／Ｇ１期のｈＭＳＣ集団が、培養の７４時間後に６９．４％へと増大した。アフィジコリン、ロスコビチン、およびコルヒチンなど、多くの化学的方法または「バッチ処理」が、細胞培養物を、その細胞培養物の特定の相で停止させるのに用いられているが、正常な細胞周期の進行は破壊されることが多い（Ｃｈｏｉ，Ｓ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，８１（５）：１９６４〜１９６８ページ）。例えば、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄらは、チミジン−ノコダゾール遮断を用いて、ＨｅＬａ細胞をＧ２期で停止させた（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２００２，１３（６）：１９７７ページ）。停止手順を解除して１２時間後、ただ１つの相または多くとも２つの相に由来する細胞ではなく、細胞周期のすべての相に由来する細胞が存在した。これに対し、本明細書における結果は、デバイスにより同調させたｈＭＳＣが示す細胞分裂は、比較的同調していることを示す。
【００９０】
［結論］
本明細書では、哺乳動物細胞を、サイズに基づいて細胞周期の異なる段階へと画分化するのに、慣性力とディーン抗力との組合せ効果を用いる、螺旋状マイクロ流体デバイスの適用が裏付けられる。デバイスは、極めて高度な試料スループット（１時間当たりの細胞約１５×１０６個）を可能とし、これにより、試料の処理時間を顕著に短縮する持続的作動を含め、他のマイクロ流体による分離法を上回る多くの顕著な利点をもたらす。パッシブの作動原理は、機能性のための外力の場または阻害性化学物質を組み込む必要を排し、これにより、分取細胞の完全性および生存率が保存される（＞９０％）。したがって、本明細書では、マイクロフルイディクスの使用により、生存率を顕著に上昇させながら、細胞周期を同調させるハイスループットがもたらされることが裏付けられる。哺乳動物細胞の懸濁液を直接分離し、同調させうるので、ＦＡＣＳおよびＣＣＥなどの他の方法とは異なり、試料の調製ステップが不要であり、処理時間がさらに短縮され、処理費用がさらに削減される。細胞周期用のマイクロ流体デバイスの性質が、ハイスループットであり、かつ侵襲性を最小とするものであるとすれば、バイオテクノロジーに関する研究において様々に適用することができ、有用となりうるであろう。
【実施例３】
【００９１】
［循環腫瘍細胞をハイスループットで単離するための、せん断変調型希少細胞抽出法によるバイオチップ］
［材料および方法］
［細胞の培養および試料の調製］
本研究では、２つのヒト乳腺癌腫細胞系であるＭＣＦ−７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞について調べた。１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と併せて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を補充した、低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で、ＭＣＦ−７細胞（ＨＴＢ−２２ＴＭ、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＨＴＢ−２６ＴＭ、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を培養した。培養物を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃に維持した。細胞を、２５ｃｍ２の滅菌フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で培養し、毎週３回ずつ継代培養（１：４）し、４８時間ごとに培地を置換した。コンフルエント未満の単層は、０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により解離した。対照実験および回収実験のため、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する緩衝液中で癌細胞を希釈し、配管およびマイクロチャネル壁面への非特異的吸着を阻止した。３％ｗ／ｖのデキストラン４０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ Ａｓｉａ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を補充することにより、細胞の沈殿を防止するように、緩衝液密度を増大させた（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、２０１０、１０（１９）：２６０５〜２６１３ページ）。ＲＢＣ平衡化実験では、健常ドナーから得た全血液をスピンダウンして、ＲＢＣを分離した。最終的な試料濃度を、試料緩衝液により相応に、多様なヘマトクリット値（０．５％〜５％）に調整した。白血球対照実験では、製造元の指示書に従い、全血液を、ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）により処理して、純粋な白血球集団を得た。
【００９２】
［マイクロチャネルの製作］
デバイスは、二重鋳型形成工程（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ，２０１０，１０（１９）：２６０５〜２６１３ページ）を用いて、ポリジメチルシロキサンポリマー（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）により製作した。まず、収縮−拡張マイクロチャネルはＡＺ（登録商標）Ｐ４６２０フォトレジストを用いて、シリコンウェハーにパターンを描いた。リソグラフ法に従い、深堀反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を用いてマイクロチャネルをシリコンにエッチングした。次に、フォトレジストを剥離し、パターンが描かれたシリコンウェハーを、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクチル）シラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で２時間にわたりシラン化して、ＰＤＭＳ鋳型のリリースを促進した。次いで、硬化剤と５：１（ｗ／ｗ）の比で混合したＰＤＭＳプレポリマーを、シリコンウェハーへと注入し、７０℃で２時間にわたり硬化させた。より高比率の硬化剤を用いて、架橋形成の増大を促進し、これにより、容易に変形しがちである高アスペクト比の構造を製作するために、ＰＤＭＳ鋳型の硬さを増大させた。この硬化させたＰＤＭＳ鋳型が、今度は、その後のＰＤＭＳ鋳造のための原型（陰画の複製）として作用する。次いで、このＰＤＭＳ母型を２時間にわたりシラン化し、その後の、パターン化されたマイクロチャネルを伴うＰＤＭＳ鋳型のリリースを促進した。最後に、入口および出口のための小孔を開け、次いで、短時間にわたり、酸素プラズマ環境（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｆｅｍｔｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）へと曝露することにより、ＰＤＭＳ鋳型を、顕微鏡用スライドガラスに不可逆的に接着させた。プラズマ処理の後、表面を互いと速やかに接触させ、７０℃で３時間にわたり静置して、接着を完了させる。
【００９３】
［デバイスの特徴づけ］
試験の間、シリンジポンプ（ＮＥ−１０００、Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてレイノルズ数（Ｒｅ）を変化させながら、マイクロ流体デバイス内に試料を送入した。マイクロチャネルを、ハイスピードＣＣＤカメラ（ＦＡＳＴＣＡＭ １０２４ ＰＣＩ、Ｐｈｏｔｒｏｎ、ＵＳＡ）を装備した倒立型位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１）に取り付けた。次いで、チャネルの出口において収集されるハイスピードのビデオ画像を、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを用いて解析した。
【００９４】
［免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ解析］
中央出口における試料および側方出口における試料に対してＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いるフローサイトメトリー解析を実施することにより、回収効率、回収率および濃縮率を決定するために実施された実験からの結果を解析した。免疫蛍光染色により、目視観察および定量化のために、多様な細胞型を差別化することが可能となった。流出試料を、１５分間にわたりＦｃＲブロッキング試薬と共にインキュベートして（１：１００；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、非特異的結合を遮断した後、４０分間にわたり、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート内皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）と共にインキュベートし（１：１００；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、癌細胞を同定した。４０分間にわたりイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＣＤ４５（１：１００；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）マーカーで染色することにより、末梢血白血球を同定した。
【００９５】
［結果および考察］
ＲＢＣは、すべての血液細胞のうちの＞９９％を占めるので、有意義な濃縮を達成するには、ＲＢＣを完全に除去することが枢要である。マイクロチャネルのデザインおよび試験条件は、マイクロチャネルのアスペクト比、流速、および試料のヘマトクリット値を含めた各種のパラメータが、ＲＢＣフォーカシングおよび側方出口からの除去に対して及ぼす影響を調べることにより最適化した。
【００９６】
［アスペクト比（ＡＲ）の影響］
図１７Ａおよび１７Ｂは、マイクロチャネルのアスペクト比がＲＢＣフォーカシングに対して及ぼす影響を示す。断面が矩形のマイクロチャネルでは、チャネル断面にわたるせん断変調を利用して、チャネルの長手に沿って、細胞を優先的に平衡化させることができる。高アスペクト比の別の利点は、より高流速で試料を処理し、これにより、スループットを増大させる能力である。アスペクト比の影響を調べるため、高さ２０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、および１５０μｍのマイクロチャネルを製作し、それぞれ、１、２．５、３．７５、５、および７．５のアスペクト比を得た。チャネルにわたるＲＢＣ分布を、アスペクト比の関数として示す合成画像およびラインスキャンを、図１７Ａおよび１７Ｂに示す。
【００９７】
正方形のマイクロチャネル（ＡＲ＝１）の場合、Ｒｅ＝１００および１％のヘマトクリット値とするとき、ＲＢＣは、チャネル断面にわたり、フォーカスの弱い細胞リングを形成する環状形で平衡化する（概略的に示す）。断面にわたり均一の流体せん断は、細胞を、それらの平衡位置において強くフォーカスさせるのに、より長いマイクロチャネル長を要求する。アスペクト比を２．５に増大させると、チャネル幅にわたる細胞の優先的移動、およびマイクロチャネルの高さに沿った平衡化が開始される。しかし、ラインスキャンは、すべてのＲＢＣが、所与のチャネル長で平衡位置にフォーカスしたわけではないことを明確に示す。アスペクト比を３．７５とするマイクロチャネルでは、このマイクロチャネルの高さで、すべてのＲＢＣが平衡化する。これは、マイクロチャネルの中央部に沿った、顕著な無細胞領域の形成により明らかである。アスペクト比を５へとさらに増大させると、チャネルの側壁へとより近接する、２つの強くフォーカスされた細胞バンドの移動が引き起こされる。本発明者らがマイクロチャネルのアスペクト比を７．５へと増大させると、興味深い効果が認められる。この極めて高度なアスペクト比のチャネルでは、フォーカスしたＲＢＣバンドが、内側バンドと外側バンドの２つに分割されることが観察される。この観察は、慣性移動に対するアスペクト比の影響について調べる、ごく近年の実験およびモデル化による研究（Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ、「Ｓｈｅａｒ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｉｎｅｒｔｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」，２００９，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ；Ｇｕｐｔａ，Ａら，４７ｔｈ ＡＩＡＡ Ａｅｒｏｓｐａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００９，Ｏｒｌａｎｄｏ）と符合する。この挙動の原因となる正確な機構はいまだ不明であり、さらなる探索に値する。しかし、この影響は、分離適用には好ましくなく、したがって、本発明者らは、本研究を、アスペクト比を最大で５とするチャネルに限定する。
【００９８】
［レイノルズ数（Ｒｅ）の影響］
図１８Ａ〜１８Ｃは、ＲＢＣフォーカシングに対するＲｅの影響を示す。ハイスループットを得るには、血液試料を高流速で処理することが必要である。ＡＲ＝５（ｈ＝１００μｍ）のマイクロチャネルにおいて、ヘマトクリットを１％とする試料を用いて試験を行った。Ｒｅを１０〜１５０の範囲とするときのＲＢＣの平衡化について調べた。デバイスの故障を結果としてもたらす、マイクロチャネルにわたる高度の圧力降下のために、より高度の流速について調べることはできなかった。低度の流速（Ｒｅ≦２５）では、ＲＢＣに作用する慣性揚力が粘性抗力より弱く、このため、平衡化が観察されない。流速をＲｅ＝５０以上に増大させると、ＲＢＣが抗力を凌駕し、チャネルの側壁へと優先的に移動し、２つの十分に明確な細胞バンド（上方または下方から撮像すると、２つの異なるピークとして観察される）を形成することが可能となる。また、Ｒｅを増大させると、ＲＢＣの平衡位置が、マイクロチャネル壁面により近接するように移動することも観察された（Ｃｈｕｎ，Ｂら，Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，２００６，１８：０３１７０４ページ）。
【００９９】
フォーカシングの程度をＲｅの関数として定量化するため、２つのパラメータ：無細胞領域幅、および細胞バンド幅を定義した（図１８Ｂ）。無細胞領域幅は、ＲＢＣを完全に欠いた、マイクロチャネル中央部における、標準化されたマイクロチャネル幅である。無細胞領域幅は、２つの細胞占有領域間における距離の半値全幅（ＦＷＨＭ）を測定することにより、ＲＢＣの確率分布プロファイルから計算される。同様に、ＲＢＣにより占有される領域のＦＷＨＭを測定することにより、細胞バンド幅が計算される。図１８Ｃは、無細胞領域幅および細胞バンド幅をＲｅの関数としてプロットする図である。Ｒｅが増大するにつれ、大きな慣性揚力により、より強いＲＢＣフォーカシングが誘導される。これは、細胞バンドの幅の減少により明らかである（図１８Ｃ）。結果として、無細胞領域幅は、流速の増大に伴い増大する。Ｒｅが低値（＜１００）のときは、ＲＢＣフォーカシングがより強まる結果として細胞バンド幅が減少することから、マイクロチャネルの中央部における無細胞領域の増大が説明される。Ｒｅ＝１００を超えると、細胞バンド幅は一定を維持するが、２つのＲＢＣバンドが、チャネル側壁により近接するように移動することにより、無細胞領域の増大が説明される。ＲＢＣフォーカシングおよび側方出口における回収を最適とするには、Ｒｅの範囲を強いフォーカシング領域（≧１００）において操作することが重要である（図１８Ｃ）。
【０１００】
［ヘマトクリット値の影響］
次に、ＲＢＣフォーカシングをそれほど弱めることなく、これらのマイクロチャネルにおいて処理しうる最高度の試料ヘマトクリット値を決定した。全血液の処理（約４０％のヘマトクリット値）を伴う適用では、高ヘマトクリット値を伴う操作により、処理時間および解析時間を短縮することが望ましい。無細胞領域幅および細胞バンド幅のパラメータを用いて、最適の試験条件を決定した。ＡＲ＝５のマイクロチャネルにおいて、Ｒｅ＝１００で、ヘマトクリット値を０．５％〜５％の範囲として、実験を実施した。ヘマトクリット値の増大がＲＢＣの平衡化に対して及ぼす影響を示す合成画像およびラインスキャンを、図１９Ａ〜１９Ｃに示す。流入するヘマトクリット値が増大するにつれ、ＲＢＣバンド幅が直線的に増大し、結果として、中央の無細胞領域幅が減少した。容量画分（ヘマトクリット値）を増大させるときは、平衡化位置を占拠しようとするＲＢＣが増大する結果として、著明な細胞間相互作用により誘導される分散がもたらされるので、この傾向が予測される。
【０１０１】
ヘマトクリット値を３％以上へと増大させたところ、興味深い影響が観察された。前出の、アスペクト比を７．５とするマイクロチャネルで認められた通り、ここでもまた、細胞バンドが、内側および外側の２つの顕著なバンドへと分割されることが観察された。これらの複数のバンドの形成は、前出の、高アスペクト比のマイクロチャネルでも観察された（Ｇｕｐｔａ，Ａら，４７ｔｈ ＡＩＡＡ Ａｅｒｏｓｐａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００９，Ｏｒｌａｎｄｏ）が、今回の観察は、この現象の誘発に対して果たす容量画分の役割を示す。ここでもまた、これらの内側バンドおよび外側バンドの形成は、中央部の無細胞領域幅を減殺するので、分離適用には好ましくない。この理由で、本研究は、試験前に全血液を２０倍に希釈することを示唆する、ヘマトクリット値の最大値を２％とする試料に限定される。
【０１０２】
［絞込み幅がＣＴＣの単離および回収に及ぼす影響］
デザイン原理の節で言及した通り、希少細胞を他の血液細胞から成功裏に単離するには、「絞込み」幅を用いる。希少細胞の直径と同等である（希少細胞の直径より小さいか、または希少細胞の直径のオーダーにある）ように、この絞込み領域に沿った収縮幅をデザインすることにより、希少細胞が収縮チャネルを縦断するときに、希少細胞の効果的な「押込み」が確保される。しがたって、これらのより大型細胞の慣性の中心が、拡張領域へと流過するときに、マイクロチャネルの中心軸に沿って整列することから、分離が達成される（Ｙａｍａｄａ，Ｍ．ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，７６（１８）：５４６５〜５４７１ページ）（図２０）。裏付けとして、この技法を、ＣＴＣを単離するのに用いた。
【０１０３】
測定による平均直径を、それぞれ、１８．１±１．８μｍおよび１８．２±２．８μｍとする、２つのヒト乳腺癌腫細胞系であるＭＣＦ−７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞について調べた。ＣＴＣの平均サイズは、１５μｍを超える（Ｔａｎ，Ｓら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２００９，１１（４）：８８３〜８９２ページ；Ｖｏｎａ，Ｇ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０００，１５６（１）：５７〜６３ページ）ので、絞込み幅を１０μｍ、１２μｍ、および１５μｍとするマイクロチャネルをデザインして、側方出口におけるＣＴＣの喪失が最小となることを確保した。図２１Ａおよび２１Ｂは、チャネルのＲｅを増大させるときに、絞込み幅が、ＭＣＦ−７細胞の分離に対して及ぼす影響を示す。低値のＲｅ＝５０では、３つの収縮幅すべてについて、約９５％の腫瘍細胞が、中央出口で回収された。Ｒｅを増大させたところ、おそらくは、層流による高度なせん断応力下では、癌細胞の変形能が大きいために、回収効率の低下が結果としてもたらされた（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｂ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ，２００４，５９（２）：２０３〜２０９ページ；Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２００９，１１（３）：５５７〜５６４ページ）。高流速では、懸濁細胞と担体緩衝液との表面張力による不適合から、界面間応力が誘導され、ＣＴＣ形状の歪みがもたらされた。粘弾性の細胞は、球形から伸長した長球へと変形する（Ｂｏｒｎ，Ｃ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９２，４０（９）：１００４〜１０１０ページ）。ＣＴＣが伸長すると、それらの臨界寸法が、初期直径より小さくなるので、このために、ＣＴＣの有効な絞込みが回避される。重要であるが見過ごされることの多い因子である、高流速において圧力に誘導されるＰＤＭＳの変形が生じれば、これもまた、高流速における回収効率の低下の部分的な原因となりうるであろう。硬質プラスチック（ＰＭＭＡ、ＣＯＣ）などの代替的材料を考慮すれば、この問題を克服する可能性が高く、これにより、回収効率が増大するであろう。ＣＴＣは、極めて希少な細胞集団なので、本研究では、９０％の回収効率カットオフを目標とした。ＲＢＣだけで実施した実験からの結果は、Ｒｅ＝１００の流動が、これらを側方出口から除去するのに最適であることを示唆する。これらの結果に基づいて１０μｍのチャネル幅を、効率的なＣＴＣ回収に選択した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についても、同様の結果が観察された。
【０１０４】
絞込み領域を通過する癌細胞は、無視できない変形を受けるので、癌細胞が受ける大きな応力および高度のせん断のために、癌細胞の完全性および生存率が懸念される。分離後、方法節で説明した手順を用いて、ＭＣＦ−７細胞を再播種して培養物中に戻すことにより、細胞の生存率を調べ、細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎおよびｇｒｏｗｔｈ）を観察した。培養の４日後、単離ＭＣＦ−７細胞の増殖速度は、対照細胞の増殖速度と同様であり、形態には認識可能な変化が見られなかった。結果は、開発された技法が、単離時において細胞に対して及ぼす影響は最小限であり、分取後における高い細胞生存率を維持することを裏付ける。
【０１０５】
その後の下流におけるＣＴＣ解析では、単離試料には末梢血白血球（ＰＢＬ）が存在するために、夾雑を最小化することが重要である。ＰＢＬを除去するデバイスの効率を評価するため、ＲＢＣ溶解により単離されたヒト白血球の純粋集団を、Ｒｅを変化させながらマイクロチャネル（絞込み幅＝１０μｍ）内に流した。ヒト白血球の平均直径は、直径１０μｍより小さい（Ｓｅｔｈｕ，Ｐ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２００６，６（１）：８３〜８９ページ；Ｓｃｈｍｉｄ−Ｓｃｈｏｎｂｅｉｎ，Ｇ．Ｗ．ら，Ｂｌｏｏｄ，１９８０，５６（５）：８６６ページ；Ｄｏｗｎｅｙ，Ｇ．Ｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９０、６９（５）：１７６７ページ）ので、細胞絞込み領域におけるＰＢＬの流路は変化せずに維持され、このため、側方出口から濾出される（図２１Ｂ）。図から明らかである通り、Ｒｅ＝５０および７５のときは、慣性による細胞フォーカシングが弱いために、ＰＢＬの画分が、中央出口においてなおも回収される。しかし、Ｒｅ≧１００では、すべての白血球が、チャネルの側壁に沿って平衡化し、中央出口では細胞が回収されなかった（回収効率は約０％）。
【０１０６】
デバイスの性能をさらに評価するため、濃度を変化させるＭＣＦ−７細胞を、ＰＢＳ緩衝液中にスパイクし、バイオチップの中央出口から回収した。ＦＡＣＳを用いて入口の試料および中央出口の試料を解析し、回収率を確認した。試験中にＣＴＣが失われれば、潜在的な誤診をもたらしうるであろう。結果は、ＣＴＣの単離効率と符合する９０％の回収率を示したことから、試料を回収および解析するときに失われる細胞は無視しうる程度であることが示唆される。おそらく、絞込み領域に沿って細胞間の相互作用が増大するために、より高濃度（１ｍＬ当たりの細胞１０４個）では、ＣＴＣ回収率の低下（約８５％への低下）が観察された。
【０１０７】
［血液中におけるＣＴＣの濃縮］
デバイスの寸法および作動条件を特徴づけた後で、最適なパラメータを用いて、全血液中にスパイクしたＭＣＦ−７細胞をデバイスにより解析した。ＭＣＦ−７細胞（１ｍＬ当たりの細胞５００個）をスパイクした血液試料を、約１．５〜２％のヘマトクリット値まで希釈し、Ｒｅ＝１００で、アスペクト比＝５のマイクロチャネルを介して送入した。細胞絞込み領域の幅は、１０μｍに固定した。ＦＡＣＳおよび血球計を用いて、蛍光マーカーで標識した流出試料を解析し、分離による濃縮率を計算した。結果を表４に示すが、これにより、ＳＭＡＲＴデバイス（１段目）内の単回通過により、ＲＢＣについては約３００倍の濃縮率、およびＰＢＬについては約８５０倍の濃縮率が示され、ＣＴＣ回収率は約８５％である。
【表４】
【０１０８】
これらの濃縮率は、大半の細胞分離適用について相当な程度であるが、血液細胞を伴う分離は、理想的には、１０７〜１０８倍の濃縮を必要とする（Ｌａｒａ，Ｏ．ら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００４，３２（１０）：８９１〜９０４ページ）。絞込み領域において大型のＣＴＣが存在するために、そのすぐの近傍では流動場が撹乱されたので、この研究における濃縮率は限定的なものであった。結果として、少量のＲＢＣおよびＰＢＬが中央出口で回収された。これは、ＣＴＣの到達が、フォーカスしない血液細胞のバーストを常に伴う、出口において収集されたハイスピードのビデオ画像から明らかである。したがって、ＣＴＣを検出するためにより高度で有意義な濃縮率を達成するために、デバイスの中央出口から回収された試料を、デバイスにより再度処理し、夾雑する血液細胞を完全に除去した（２段目）。１段目からの出口配管を、カスケード状の構成で別のデバイスに接続することにより、これを実装した。２段目を付加することにより、ＭＣＦ−７の濃縮率は、ＲＢＣについて３．２５×１０５（５．５ ｌｏｇ１０）倍、およびＰＢＬについて約１．２×１０４（４．１ ｌｏｇ１０）倍へと顕著に増大し、全ＣＴＣ回収率の低下は最小（約８１％への低下）である。これは、血液１ｍＬ当たりのＲＢＣ約１５，０００個および血液１ｍＬ当たりのＰＢＬ８５０個未満に変換される（全血液１ｍＬ中のＲＢＣを５０億個とし、全血液１ｍＬ中のＰＢＬを１０００万個とする）。
【０１０９】
デバイスの濃縮性能は、他の一般的なＣＴＣ分取法と同等である（Ｎａｇｒａｔｈ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１７３）：１２３５〜１２３９ページ；Ｔａｎ，Ｓら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２００９，１１（４）：８８３〜８９２ページ；Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｈ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００９、１２１６（４７）：８２８９〜８２９５ページ；Ｖｏｎａ，Ｇ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０００、１５６（１）：５７〜６３ページ；Ｚｈｅｎｇ，Ｓ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００７，１１６２（２）：１５４〜１６１ページ；Ｚａｂａｇｌｏ，Ｌ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ，２００３，５５（２）：１０２〜１０８ページ；Ｌａｒａ，Ｏ．ら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００４、３２（１０）：８９１〜９０４ページ）。例えば、Ｚａｂａｇｌｏらにより用いられているポリカーボネート膜による濾過法は、ＣＴＣ回収率を＞９０％とし、０．１％ＰＢＬを伴うことについて報告している（Ｚａｂａｇｌｏ，Ｌ．ら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ，２００３，５５（２）：１０２〜１０８ページ）。Ｖｏｎａらにより報告されているＩＳＥＴ法は、回収率を約８０％とし、血液１ｍＬ当たりのＰＢＬをわずかに２０個とする、優れたＣＴＣ濃縮率について報告している（Ｖｏｎａ，Ｇ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０００、１５６（１）：５７〜６３ページ）。Ｌａｒａらは、赤血球溶解を、免疫磁性によるＰＢＬの枯渇と組み合わせる、２ステップの陰性選択法を用いて、５．１７ ｌｏｇ１０倍のＣＴＣ濃縮率を報告した（Ｌａｒａ，Ｏ．ら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００４，３２（１０）：８９１〜９０４ページ）。ＲＢＣは、溶解により１００％が効率的に枯渇したのに対し、単離試料は、約０．３％のＰＢＬに由来するＤＮＡにより依然として汚染されているので、濃縮の倍数はデバイスと同等である。デバイスの性能はまた、１０４〜１０６倍の濃縮を得ることが可能な免疫媒介ＣＴＣ分離法（免疫磁性ＣＴＣ分離法、免疫蛍光ＣＴＣ分離法、および免疫結合ＣＴＣ分離法を含めた）（Ｎａｇｒａｔｈ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１７３）：１２３５〜１２３９ページ；Ｐａｔｅｒｌｉｎｉ−Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｐ．およびＮ．Ｌ．Ｂｅｎａｌｉ，Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ，２００７，２５３（２）：１８０〜２０４ページ）とも同等である。
【０１１０】
ＲＢＣから白血球を成功裏に濃縮することにより、血液から他の低量の細胞を単離するためのデバイスの多用途性が裏付けられた。これは、細胞絞込み領域における収縮幅を８μｍへと変化させ、これにより、中央出口においてより大型のＰＢＬの回収を可能とすることだけによって達成された（Ｓｅｔｈｕ，Ｐ．， Ａ． Ｓｉｎ，ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，２００６，６（１）：８３〜８９ページ；Ｓｃｈｍｉｄ−Ｓｃｈｏｎｂｅｉｎ，Ｇ．Ｗ．ら，Ｂｌｏｏｄ、１９８０、５６（５）：８６６ページ；Ｄｏｗｎｅｙ，Ｇ．Ｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９０、６９（５）：１７６７ページ）。側方出口を介してすべてのＲＢＣを効率的に除去することにより、デバイスは、中央出口において、１００倍の白血球の濃縮率を達成し、約６０％のＰＢＬ回収率をもたらした。
【０１１１】
オンチップで血液解析を行い、血液から希少細胞を単離するには、短時間でミリリットル単位の臨床血液試料を処理するハイスループットが重要である。４００μｌ／分の流速（Ｒｅ＝１００）で、ヘマトクリット値を２％とする試料を調べることにより、このデバイスは、単体のデバイスを用いて、１分間当たりの細胞約１０８個を処理することが可能である。これは、１ｍＬの全血液に対する約５０分間の処理時間へと転換される。わずか４つの並列チャネルをデザインすると、解析時間を、事実上、血液１ｍＬ当たり１５分間未満にまで短縮することができ、他の一般的なＣＴＣ検出法より顕著に高速となる。マイクロ流体素子による免疫結合法は、ＣＴＣと抗体でコーティングした表面との最大の相互作用を可能とし、分離時におけるＣＴＣの解離を阻止する、低流速による処理に限定されることが典型的である（Ｎａｇｒａｔｈ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１７３）：１２３５〜１２３９ページ；Ｇｌｅｇｈｏｒｎ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、２０１０、１０（１）：２７〜２９ページ）。ＣＴＣの物理的捕捉と関連する、一般的なマイクロ流体濾過法はまた、トラップまたは小孔により変形することなく、ＣＴＣの捕捉の維持を確保するためにも、低流速に限定されている（Ａｄａｍｓ，Ａ．Ａ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００８，１３０（２７）：８６３３〜８６４１ページ；Ｔａｎ，Ｓら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２００９．１１（４）：８８３〜８９２ページ）。さらに、いかなる捕捉されたＣＴＣの物理的な存在も、捕捉領域内の流動パターンを変化させるので、ＣＴＣカウントがより大きくなると、捕捉効率が低下する。解析のための複雑な回収手順と共に、血液処理後に必要とされるさらなる洗浄ステップは、全処理時間をさらに延長する。デバイスは、遺伝子解析、薬物スクリーニング、および分子標的癌治療など、下流における分子アッセイのためにＣＴＣの回収を可能とする、持続的な分取能および回収能をもたらす。単離細胞は、終点調査を行うのではなく、リアルタイムで計数および解析することもできる。
【０１１２】
［結論
血液から生存希少細胞を単離する、ハイスループットで高感度な技法について説明した。血液から低量の細胞をサイズベースで単離するデバイスでは、せん断変調性の慣性による細胞フォーカシングを用いた。開発したデバイスの適用として、高度な効率（約８０％）およびスループット（約４００μＬ／分）を伴う、末梢血からのＣＴＣの分離が裏付けられた。デバイスは、２段式のカスケード型配置を用いて、赤血球（ＲＢＣ）については３．２５×１０５倍の濃縮率、およびＰＢＬについては１．２×１０４倍の濃縮率をもたらす。試料の希釈は必要とされるが、単純なチャネルデザインは、数分間以内に、ミリリットル単位の臨床血液試料を解析する能力を伴う簡易な並列化を可能とする。デバイスの下流にチップベースの検出を組み込むことにより、臨床癌診断のための強力なツールがもたらされる。最後に、絞込み幅を特定の適用にカスタマイズすることにより、胎児細胞および幹細胞を含め、血液から他の希少細胞を濃縮するのにチップを容易に用いることができる。
【０１１３】
本明細書で引用されるすべての特許、出願公開、および参考文献による関連する教示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１１４】
その例示的な実施形態に言及しながら、本発明を具体的に示し、説明してきたが、付属の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明において多様な形態および詳細の変化を行いうることが、当業者により理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料における１または複数の疾患血液細胞を検出する方法であって、前記血液試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、非疾患血液細胞と比較して疾患血液細胞の変形能が低下していることに基づいて前記チャネルの断面の少なくとも一部に沿って疾患血液細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各線状チャネルが有し、疾患血液細胞が、前記チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、非疾患血液細胞が、前記チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する方法。
【請求項２】
前記疾患細胞のサイズ、硬さ、変形能、接着性、またはこれらの組合せが、前記非疾患細胞とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液試料が、全血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患細胞が、環状期、または栄養体期、または分裂体期のマラリア感染赤血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患細胞が、環状期のマラリア感染赤血球である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血液試料が、約５μＬ／分の流速で導入される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記環状期のマラリア感染赤血球が、約７５％〜約８５％の範囲の効率で分離され、前記栄養体期のマラリア感染赤血球が、約９０％の効率で分離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１または複数の疾患細胞が、マラリア感染赤血球、鎌状赤血球貧血性赤血球、白血病性赤血球、またはこれらの組合せである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患細胞を前記第１の出口から回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記チャネルのアスペクト比が、約１〜約２の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロ流体デバイスが、拡張領域をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の出口の幅が、前記第１の出口の幅より約２〜約１０倍の範囲で広い、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記チャネルの幅が、約１５μｍである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記チャネルの高さが、約１０μｍである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞を検出する方法であって、前記試料を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、循環腫瘍細胞が、前記チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、前記試料中の他の細胞が、前記チャネルの別の部分に沿って第２の出口へと流動する方法。
【請求項１６】
循環腫瘍細胞を前記第１の出口から回収するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記循環腫瘍細胞を解析するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記循環腫瘍細胞を解析するステップが、治療的処置の有効性を評価するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記チャネルのアスペクト比が、約１〜約５の範囲にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記チャネルの幅が、約５００μｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記チャネルの高さが、約１００μｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が血液試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液試料が、胎児有核赤血球を含む母体血液試料である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
非同調細胞の混合物から１または複数の同調細胞を単離する方法であって、非同調細胞の懸濁液を、少なくとも１つの螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいて前記チャネルの断面の部分に沿って同調細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各螺旋状チャネルが有し、より大型の同調細胞が、前記チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、より小型の同調細胞が、前記チャネルの他の部分に沿って少なくとも１つの他の出口へと流動する方法。
【請求項２５】
同調細胞を前記第１の出口から回収するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記チャネルのアスペクト比が、約１〜約５の範囲にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記チャネルの幅が、約５００μｍである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記チャネルの高さが、約１４０μｍである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
非同調細胞の混合物が、哺乳動物の癌細胞の懸濁液もしくは間葉系幹細胞の懸濁液、またはこれらの組合せである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞を検出する方法であって、前記試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいて前記チャネルの断面の少なくとも一部に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、循環腫瘍細胞が、前記チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、前記試料中の他の細胞が、前記チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する方法。
【請求項３１】
循環腫瘍細胞を前記第１の出口から回収するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記循環腫瘍細胞を解析するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記循環腫瘍細胞を解析するステップが、治療的処置の有効性を評価するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記チャネルのアスペクト比が、約２〜約１０の範囲にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記チャネルのアスペクト比が、約３〜約５の範囲にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記入口から遠位の端部における前記チャネルの幅が、単離される細胞のオーダーにある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記チャネルの幅が、約２０μｍである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記マイクロ流体デバイスが、前記入口から遠位のチャネル端部において拡張領域をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記マイクロ流体デバイスが、すべての細胞を、チャネルの長手方向へと移動させ、チャネルの長手方向に沿って移動させるように適合させた断面を有する、少なくとも１つの細胞フォーカシング領域をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が血液試料である、請求項３０に記載の方法。
【請求項１】
血液試料における１または複数の疾患血液細胞を検出する方法であって、前記血液試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、非疾患血液細胞と比較して疾患血液細胞の変形能が低下していることに基づいて前記チャネルの断面の少なくとも一部に沿って疾患血液細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各線状チャネルが有し、疾患血液細胞が、前記チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、非疾患血液細胞が、前記チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する方法。
【請求項２】
前記疾患細胞のサイズ、硬さ、変形能、接着性、またはこれらの組合せが、前記非疾患細胞とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液試料が、全血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患細胞が、環状期、または栄養体期、または分裂体期のマラリア感染赤血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患細胞が、環状期のマラリア感染赤血球である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血液試料が、約５μＬ／分の流速で導入される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記環状期のマラリア感染赤血球が、約７５％〜約８５％の範囲の効率で分離され、前記栄養体期のマラリア感染赤血球が、約９０％の効率で分離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１または複数の疾患細胞が、マラリア感染赤血球、鎌状赤血球貧血性赤血球、白血病性赤血球、またはこれらの組合せである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患細胞を前記第１の出口から回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記チャネルのアスペクト比が、約１〜約２の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロ流体デバイスが、拡張領域をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の出口の幅が、前記第１の出口の幅より約２〜約１０倍の範囲で広い、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記チャネルの幅が、約１５μｍである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記チャネルの高さが、約１０μｍである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞を検出する方法であって、前記試料を、１または複数の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、循環腫瘍細胞が、前記チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、前記試料中の他の細胞が、前記チャネルの別の部分に沿って第２の出口へと流動する方法。
【請求項１６】
循環腫瘍細胞を前記第１の出口から回収するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記循環腫瘍細胞を解析するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記循環腫瘍細胞を解析するステップが、治療的処置の有効性を評価するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記チャネルのアスペクト比が、約１〜約５の範囲にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記チャネルの幅が、約５００μｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記チャネルの高さが、約１００μｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が血液試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液試料が、胎児有核赤血球を含む母体血液試料である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
非同調細胞の混合物から１または複数の同調細胞を単離する方法であって、非同調細胞の懸濁液を、少なくとも１つの螺旋状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいて前記チャネルの断面の部分に沿って同調細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各螺旋状チャネルが有し、より大型の同調細胞が、前記チャネルの半径方向の最も内側の部分に沿って第１の出口へと流動し、より小型の同調細胞が、前記チャネルの他の部分に沿って少なくとも１つの他の出口へと流動する方法。
【請求項２５】
同調細胞を前記第１の出口から回収するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記チャネルのアスペクト比が、約１〜約５の範囲にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記チャネルの幅が、約５００μｍである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記チャネルの高さが、約１４０μｍである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
非同調細胞の混合物が、哺乳動物の癌細胞の懸濁液もしくは間葉系幹細胞の懸濁液、またはこれらの組合せである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
個体の試料における１または複数の循環腫瘍細胞を検出する方法であって、前記試料を、１または複数の線状チャネルを含むマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口に導入するステップを含み、細胞のサイズに基づいて前記チャネルの断面の少なくとも一部に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適合させた、長さと、アスペクト比を規定する高さおよび幅の断面とを各チャネルが有し、循環腫瘍細胞が、前記チャネルの第１の部分に沿って第１の出口へと流動し、前記試料中の他の細胞が、前記チャネルの第２の部分に沿って第２の出口へと流動する方法。
【請求項３１】
循環腫瘍細胞を前記第１の出口から回収するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記循環腫瘍細胞を解析するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記循環腫瘍細胞を解析するステップが、治療的処置の有効性を評価するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記チャネルのアスペクト比が、約２〜約１０の範囲にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記チャネルのアスペクト比が、約３〜約５の範囲にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記入口から遠位の端部における前記チャネルの幅が、単離される細胞のオーダーにある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記チャネルの幅が、約２０μｍである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記マイクロ流体デバイスが、前記入口から遠位のチャネル端部において拡張領域をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記マイクロ流体デバイスが、すべての細胞を、チャネルの長手方向へと移動させ、チャネルの長手方向に沿って移動させるように適合させた断面を有する、少なくとも１つの細胞フォーカシング領域をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が血液試料である、請求項３０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２０１３−５２１００１（Ｐ２０１３−５２１００１Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５６２７２（Ｐ２０１２−５５６２７２）
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２７２７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０９７６２
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０７３３５６８７）ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール (28)
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２７２７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０９７６２
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０７３３５６８７）ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール (28)
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】
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