細胞内で細胞毒性を低減して抗ウイルス性小ＲＮＡ分子を発現させる方法
一態様において、本発明は、レトロウイルスベクターを使用して、細胞内で小ＲＮＡ分子を発現する方法及び組成物を提供する（図ＩＡ）。本発明の方法を使用して、細胞内で低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現することができる。さらなる態様では、本発明は、レンチウイルスをコードするｓｉＲＮＡを産生する方法であって、ｓｉＲＮＡ活性がレンチウイルスライフサイクルに干渉し得る、方法を提供する。またさらなる態様では、本発明は、ＣＣＲ５を低下するように調節することが可能なｓｉＲＮＡ等の小ＲＮＡ分子を細胞内で発現する方法であって、小ＲＮＡ分子の発現が細胞に対して比較的細胞毒性ではない、方法を提供する。本発明は、細胞に対して比較的細胞毒性ではない、ＣＣＲ５を低下するように調節することが可能なｓｉＲＮＡ等の小ＲＮＡ分子も含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、ＲＮＡ分子を送達するように、及びより具体的には遺伝子発現を下方調節又は調整するのに使用することができる二本鎖ＲＮＡ分子を送達するように、改変されたウイルス構築物を使用して、細胞又は動物において遺伝子発現を変える方法に関する。本発明の特定の態様は、ＲＮＡ分子を発現するように改変されたウイルス構築物の送達を介して、病原性ウイルス遺伝子又は病原性ウイルスのライフサイクルに必要な遺伝子を低下するように調節することに関する。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡ分子は、標的細胞に対して毒性ではない。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００２年９月１３日に出願した米国特許出願第１０／２４３，５５３号明細書の一部継続出願である、２００２年１２月１２日に出願した米国特許出願第１０／３１９，３４１号明細書の一部継続出願であり、２００１年９月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／３２２，０３１号明細書、２００２年１月９日に出願した米国仮特許出願第６０／３４７，７８２号明細書、２００２年６月１８日に出願した米国仮特許出願第６０／３８９，５９２号明細書、及び２００２年８月２７日に出願した米国仮特許出願第６０／４０６，４３６号明細書に対する優先権を主張する。優先出願は全て、その全体が参照により援用される。
【０００３】
［政府援助］
本発明は、国立衛生研究所より授与された補助金番号ＧＭ３９４５８、ＡＩ５５２８１−０３、及びＡＩ３９９７５−０５の下で政府の支援を用いて為された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又はサイレンシングは、近年発見された現象である（非特許文献１、非特許文献２）。低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）とは、それらが相同性を示す遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、様々な培養細胞並びに無脊椎動物で、特定遺伝子の発現を低下するように調節するための道具として使用されてきた。このようなアプローチの多くは、最近概説されている（非特許文献３）。しかし、このようなアプローチには限界がある。例えば、本明細書中に記載される本発明以前には、ＲＮＡ干渉を通じて低下するように調節された特定の遺伝子を有するトランスジェニック哺乳類の発生を可能にする技法はない。同様に、調節機能を有する小ＲＮＡ分子を導入するためのより堅実な方法が必要とされている。本明細書中に提供される本発明は、ＲＮＡ介在性遺伝子調節の分野でのこれら及び他の制限に対処する。同じく、ウイルス及びウイルス感染に関連する疾患の治療には、方法及び組成物の改良が必要である。
【０００５】
標的細胞における小ＲＮＡ分子の細胞毒性及び他の有害作用が、当該技術分野で言及され、ｓｉＲＮＡの発現レベルと相関付けられている（非特許文献４）。小ＲＮＡ分子を発現するのにより弱いプロモーターを利用すると、明らかな毒性の低減を示すが、ｓｉＲＮＡの有効性も弱くなった。
【０００６】
研究によって、例えば、インターフェロン応答遺伝子の導入（非特許文献５を参照されたい）、オフターゲット（off target）効果によって引き起こされるｍＲＮＡ発現プロファイルの全体的変化（非特許文献６を参照されたい）及びマイクロＲＮＡ異常調節による細胞毒性作用（非特許文献７）等の有害作用が報告されている。またｓｈＲＮＡ発現の際、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したヒトＴリンパ球で、細胞毒性作用が観察された（非特許文
献４）。例えばＨＩＶ−１疾患に対して細胞内免疫付与を達成するために、ｓｉＲＮＡ発現が長期間にわたって安定して生体中に維持される状況では、ｓｉＲＮＡの任意の細胞毒性作用が特に問題になる可能性がある（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. Fire et al., Nature 391, 806（1998）
【非特許文献２】C. E. Rocheleau et al. Cell 90, 707（1997）
【非特許文献３】P. D. Zamore, Science 296, 1265（2002）
【非特許文献４】D. S. An et al., Mol. Ther. 14, 494-504（2006）
【非特許文献５】R. J. Fish and E. K. Kruithof, BMC. Mol. Biol. 5, 9 （2004）
【非特許文献６】A. L. Jackson et al., RNA. 12, 1179-1187 （2006）
【非特許文献７】D. Grimm et al., Nature. 441, 537-541 （2006）
【非特許文献８】D. Baltimore, Nature 335, 395-396 （1988）
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、概して、細胞内でＲＮＡ分子（単数又は複数）を発現させる方法に関する。これらの方法は、多様な細胞型及び多様な目的で使用され得る。例えば、ＲＮＡ分子は、細胞内でマーカーとなり、遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムであり、ＲＮＡ干渉を通じて遺伝子を低下するように調節するために役立ち得る。
【０００９】
一態様において、標的核酸（ウイルスゲノム、ウイルス性転写物、又はウイルス複製に必要な宿主細胞遺伝子等）のＲＮＡ干渉を通じて病原菌のライフサイクルの１つ又は複数の局面を阻害する、１つ又は複数のＲＮＡ分子の発現によって感染を治療又は予防する方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡ分子を発現させる方法が提供され、本方法は、パッケージング細胞株にレトロウイルス構築物をトランスフェクトすること、及びパッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収することを含む。それから、宿主細胞に組換えレトロウイルスを感染させる。
【００１１】
組換えレトロウイルス構築物は、好ましくは、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、少なくとも１つのＲＮＡコード領域、及び少なくとも１つの終結配列を有する。ＲＮＡコード領域は、好ましくは、標的核酸内の標的配列と少なくとも約９０％同一である配列を含む。好ましくは、標的核酸は、病原菌（例えば、病原性ウイルスＲＮＡゲノム若しくはゲノム転写物の一部分、又は病原性ウイルスのライフサイクルに関与する標的細胞遺伝子の一部分）のライフサイクルに必要なものである。
【００１２】
一実施の形態において、本発明の方法は、病原菌のライフサイクルを破壊するために使用される。詳細な実施の形態において、本方法は、直接ＲＮＡゲノムを標的とすることにより、ＲＮＡゲノムを有するウイルス（例えば、レトロウイルス）のライフサイクルを破壊するために使用される。別の実施の形態において、個別のウイルス遺伝子の転写物を含むウイルスゲノム転写物が標的となる。本方法はまた、宿主細胞で遺伝子を低下するように調節するために使用することができ、ここで遺伝子は、ウイルスのライフサイクルに関与する（例えば、宿主細胞内へウイルスが入るのに必要な受容体又は補助受容体）。
【００１３】
幾つかの実施の形態において、ＲＮＡコード領域は、ｓｉＲＮＡ、好ましくはセンス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有する自己相補的な「ヘアピン」ＲＮＡ分子をコードする。ループ領域は一般に、約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長であり
、さらに好適な実施の形態では約６ヌクレオチド長〜約９ヌクレオチド長である。ヘアピン分子の二本鎖領域は、標的配列と相同なヌクレオチド配列を含む。ヘアピン分子中の配列は、標的配列と、好ましくは少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは少なくとも約９５％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも約９９％同一である。
【００１４】
他の実施の形態において、ＲＮＡコード領域は第１のＲＮＡ分子をコードし、レトロウイルス構築物は第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター及び第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに操作可能に連結した第２のＲＮＡコード領域を有する。このような実施の形態では、第２のＲＮＡコード領域は、第１のＲＮＡ分子と実質的に相補的なＲＮＡ分子をコードする。第１及び第２のＲＮＡコード領域の発現に際して、二本鎖複合体が細胞内で形成される。
【００１５】
さらに別の実施の形態において、レトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第１のＲＮＡ分子の合成をもたらし、且つ第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第１のＲＮＡ分子と実質的に相補的な第２のＲＮＡ分子の合成をもたらすように、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域を有し得る。このような一実施の形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列によりＲＮＡコード領域と分離されている。
【００１６】
本発明の一実施の形態において、標的細胞は胚細胞である。本明細書中に使用される胚細胞は、単細胞胚、及び初期胚内の胚細胞を含む。標的細胞は胚形成幹細胞であってもよい。標的細胞が胚細胞である場合、胚細胞は、組換えレトロウイルスを哺乳類胚細胞の透明帯と細胞膜との間に注入することにより、感染させられ得る。別の実施の形態では、胚細胞は、透明帯を除去して、組換えレトロウイルスを含有する溶液中で細胞をインキュベートすることにより感染させられ得る。このような実施の形態では、透明帯は、酵素的消化により除去され得る。標的細胞が胚細胞又は胚形成幹細胞である場合、本発明の方法は、偽妊娠のメスに胚細胞を移植してトランスジェニック動物を発生させることも含む。このような様式において、特定の病原菌（ウイルス等）に耐性であるトランスジェニック動物を発生することができる。
【００１７】
本発明の方法はまた、様々な初代細胞、ｅｘ ｖｉｖｏ正常細胞若しくは疾患細胞、又は様々な組織培養条件に適合した細胞で使用され得る。細胞は、好ましくは、ヒト、マウス、又は他の脊椎動物から得られる。細胞は、造血幹細胞若しくは前駆体細胞、中枢神経系細胞、様々な他の組織及び器官の再生能を有する細胞、樹状細胞並びに他の発達中及び成熟した骨髄細胞及びリンパ系細胞、並びに異なる細胞系由来の癌細胞を含み得るが、これらに限定されない。
【００１８】
別の態様において、本発明は、細胞内でのＲＮＡ分子（単数又は複数）発現のためのレトロウイルス構築物を提供する。構築物は、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを含む。一実施の形態においてレトロウイルス構築物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと操作可能に連結したＲＮＡコード領域を有する。ＲＮＡコード領域の直後にｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列が続き、ｐｏｌ ＩＩＩによるＲＮＡ合成の終結に関する。ｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列は一般に、４つ以上の連続したチミジン（「Ｔ」）残基を有する。好適な実施の形態において、５個の連続したＴのクラスターがターミネーターとして使用され、これによりｐｏｌ ＩＩＩ転写はＤＮＡテンプレートの二番目又は三番目のＴで止まり、したがって２つ又は３つのウリジン（「Ｕ」）残基のみがコード配列の３’末端に付加される。様々なｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを本発明で使用することができ、例えば、ヒト若しくはマウス起源のＨ１ ＲＮＡ遺伝子若しくはＵ６ ｓｎＲＮＡ遺伝子由来、又は任意の他の種由来のプロモーター断片
を含む。また、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、他の望ましい性質（遍在性又は組織特異的様式のいずれかで小化学分子により誘発される能力等）を取り込むように修飾／操作され得る。例えば、一実施の形態において、プロモーターはテトラサイクリンにより活性化されてもよい。別の実施の形態において、プロモーターはＩＰＴＧ（ｌａｃＩ系）により活性化されてもよい。
【００１９】
レトロウイルス構築物は、多数のレトロウイルスベクターに基づき得る。好適な実施の形態において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５’長末端反復（long terminal repeat）（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列を有する。別の実施の形態において、レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来する。さらに別の実施の形態において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス及びＭＳＣＶ構築物のハイブリッドである。
【００２０】
さらなる実施の形態において、ＲＮＡコード領域は、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有する自己相補的なＲＮＡ分子をコードする。このようなＲＮＡ分子は、発現した場合、好ましくは「ヘアピン」構造を形成する。ループ領域は一般に、約２ヌクレオチド長〜１５ヌクレオチド長である。好適な実施の形態において、ループ領域は６ヌクレオチド長〜９ヌクレオチド長である。本発明のこのような一実施の形態において、センス領域及びアンチセンス領域は、約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長の間である。一実施の形態において、本発明のこの実施の形態のＲＮＡコード領域は、いかなる余計な非コードヌクレオチドも５’末端に存在せずにＲＮＡコード配列が正確に発現され得る（すなわち、発現した配列は標的配列と５’末端で同一である）ように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの下流に操作可能に連結される。ＲＮＡコード領域の合成は、ターミネーター部位で終了する。好ましい一実施の形態において、ターミネーターは５個の連続したＴ残基を有する。
【００２１】
本発明の別の態様において、レトロウイルスベクターは複数のＲＮＡコード領域を含み得る。このような一実施の形態において、ＲＮＡコード領域は第１のＲＮＡ分子をコードし、レトロウイルス構築物は、第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター及び第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに操作可能に連結された第２のＲＮＡコード領域を有する。この実施の形態において、第２のＲＮＡ分子は、発現した時に第１及び第２のＲＮＡ分子が二本鎖構造を形成し得るように、実質的に第１のＲＮＡ分子と相補的であり得る。ＲＮＡ複合体の二本鎖領域は、ウイルスゲノム、ウイルスゲノム転写物、又は病原性ウイルスのライフサイクルに必要なタンパク質をコードする標的細胞ＲＮＡのいずれかの標的領域と少なくとも約９０％同一である。本発明の方法はまた、ヘアピン様の自己相補的なＲＮＡ分子又は他の非ヘアピン分子をコードする複数のＲＮＡコード領域を含む。
【００２２】
本発明のさらに別の実施の形態において、レトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現がセンス鎖としての第１のＲＮＡ分子の合成をもたらし、且つ第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第１のＲＮＡ分子と実質的に相補的であるアンチセンス鎖としての第２のＲＮＡ分子の合成をもたらすように、反対方向で同じＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有する。このような実施の形態において、両方のＲＮＡ分子は、終結配列によりコードされる３’オーバーハングの残基を含有し得る。一実施の形態において、両方のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列によりＲＮＡコード領域と分離されている。終結配列は５個の連続したＴ残基を有することが好ましい。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、５’ＬＴＲ配列はＨＩＶに由来し得る。レトロウイルス構築物はまた、ウッドチャック肝炎ウイルスエンハンサー因子配列及び／又はｔＲＮＡアン
バー抑制因子配列を有し得る。
【００２４】
本発明の一実施の形態において、自己不活性化３’ＬＴＲはエンハンサー配列が欠失したＵ３因子であり得る。さらに別の実施の形態において、自己不活性化３’ＬＴＲは修飾ＨＩＶ３’ＬＴＲである。
【００２５】
組換えレトロウイルス構築物は、例えば、水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって偽型とすることが可能である。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、ウイルス構築物はまた、対象の遺伝子をコードし得る。対象の遺伝子は、ポリメラーゼＩＩプロモーターに連結し得る。様々なポリメラーゼＩＩプロモーターを本発明で使用することができ、例えば、ＣＭＶプロモーターを含む。選択されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、大部分の組織で発現を駆動することが可能な遍在性プロモーター（例えば、ヒトユビキチン−Ｃプロモーター、ＣＭＶβ−アクチンプロモーター、及びＰＧＫプロモーター）であり得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターはまた、組織特異的プロモーターであり得る。このような構築物はまた、例えば、ポリメラーゼＩＩプロモーターと操作可能に連結したエンハンサー配列を含有し得る。
【００２７】
一実施の形態において、対象の遺伝子は、ベクターが首尾よくトランスフェクト又は形質導入されて、その配列が発現したことを確認するために使用され得るマーカー又はレポーター遺伝子である。このような一実施の形態において、対象の遺伝子は蛍光レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）である。さらに別の実施の形態において、対象の遺伝子は、首尾よく形質導入された細胞を選択するために使用され得る薬物耐性遺伝子である。例えば、薬物耐性遺伝子は、ゼオシン耐性遺伝子（ｚｅｏ）であり得る。対象の遺伝子はまた、薬物耐性遺伝子と蛍光レポーター遺伝子とのハイブリッド（ｚｅｏ／ｇｆｐ融合等）であり得る。本発明の別の態様において、対象の遺伝子は、誘導性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの転写活性を調節し得るタンパク質因子をコードする。このような一実施の形態において、対象の遺伝子は、テトラサイクリン応答性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを調節するｔｅｔＲ（ｔｅｔオペロンのリプレッサー）である。
【００２８】
本発明の別の態様は、細胞内でＲＮＡ分子（単数又は複数）を発現させる方法を提供することである。一実施の形態において、パッケージング細胞株に、本発明のレトロウイルス構築物をトランスフェクトし、組換えレトロウイルス性粒子をパッケージング細胞株から回収し、標的細胞に組換えレトロウイルス粒子を感染させる。このような方法によれば、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）、自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、及び少なくとも１つのＲＮＡコード領域由来のＲ配列及びＵ５配列を有する。レトロウイルス構築物はまた、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した終結配列を有し得る。
【００２９】
さらなる態様において、ＨＩＶ感染を患っている患者を治療する方法が提供される。一実施の形態において、ＣＤ３４陽性標的細胞が患者から単離される。次いで、標的細胞に、本発明のレトロウイルス構築物をトランスフェクトしたパッケージング細胞株から回収された組換えレトロウイルスを感染させる。好ましくは、組換えレトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、少なくとも１つのＲＮＡコード領域、及び少なくとも１つの終結配列を含む。一実施の形態において、ＲＮＡコード領域はＨＩＶゲノムの標的領域、ＨＩＶゲノム転写物、又はＨＩＶライフサイクルに関与する細胞遺伝子と少なくとも約９０％同一である配列を含む。標的領域は、好ましくは約１８ヌクレオチド長〜約２３ヌクレオチド長である。
【００３０】
一実施の形態において、ＲＮＡコード領域は、ヘアピンＲＮＡ分子をコードする。
【００３１】
好ましい実施の形態において、ＲＮＡコード領域は、ＣＣＲ５遺伝子又はＣＸＣＲ４遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である。
【００３２】
またさらなる態様において、特にｓｉＲＮＡ活性がウイルスライフサイクル又は細胞遺伝子に干渉し得る、レンチウイルスをコードする高い力価のｓｉＲＮＡを産生する方法が提供される。
【００３３】
一実施の形態において、組換えレトロウイルスを産生する方法は、パッケージング細胞株に、第１の遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である第１のＲＮＡコード領域を含むレトロウイルス構築物と、第２の遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である第２のＲＮＡコード領域を含む第１のベクターとを同時トランスフェクトすること（cotransfecting）を含み、第２の遺伝子の発現がＲＮＡ干渉を媒介する。第１のＲＮＡコード領域及び第２のＲＮＡコード領域が、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードするのが好ましく、センス領域は、アンチセンス領域と実質的に相補的である。
【００３４】
第１のＲＮＡコード領域は、病原性ウイルスのゲノム内の遺伝子、病原性ウイルスのライフサイクルに関与する細胞遺伝子、及び疾患又は障害を媒介する遺伝子から成る群から選択される遺伝子と少なくとも約９０％同一であるのが好ましい。特定の実施の形態では、第１のＲＮＡコード領域は、ｇａｇ、ｐｏｌ又はｒｅｖ等のＨＩＶウイルス由来の遺伝子と少なくとも約９０％同一である。
【００３５】
第２の遺伝子は、Ｄｉｃｅｒ−１、Ｄｉｃｅｒ−２、ＦＭＲ１、ｅＩＦ２Ｃ２、ｅＩＦ２Ｃ１（ＧＥＲｐ９５）／ｈＡｇｏ１、ｅＩＦ２Ｃ２／ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、ｈＡｇｏ４、ｈＡｇｏ５、Ｈｉｗｉ１／Ｍｉｗｉ１、Ｈｉｗｉ２／Ｍｉｗｉ２、Ｈｉｌｉ／Ｍｉｌｉ、Ｇｅｍｉｎ３、Ｐ６７８ヘリカーゼ、Ｇｅｍｉｎ２、Ｇｅｍｉｎ４、Ｐ１１５／スライサー及びＶＩＧをコードする遺伝子の群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、第２の遺伝子はＤｉｃｅｒ−１又はｅＩＦ２Ｃ２をコードする。
【００３６】
一実施の形態において、第２のＲＮＡコード領域は、Ｄｉｃｅｒ−１をコードする遺伝子の一部、又はｅＩＦ２Ｃ２をコードする遺伝子の一部と少なくとも約９０％同一である配列を含む。特定の実施の形態では、第２のＲＮＡコード領域は、配列番号８の配列を含むが、別の実施の形態では、第２のＲＮＡコード領域は、配列番号９の配列を含む。
【００３７】
さらにパッケージング細胞株に、第３の遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である第３のＲＮＡコード領域を含む第２のベクターを同時トランスフェクトしてもよく、第３の遺伝子の発現がＲＮＡ干渉を媒介する。第３の遺伝子は、Ｄｉｃｅｒ−１、Ｄｉｃｅｒ−２、ＦＭＲ１、ｅＩＦ２Ｃ２、ｅＩＦ２Ｃ１（ＧＥＲｐ９５）／ｈＡｇｏ１、ｅＩＦ２Ｃ２／ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、ｈＡｇｏ４、ｈＡｇｏ５、Ｈｉｗｉ１／Ｍｉｗｉ１、Ｈｉｗｉ２／Ｍｉｗｉ２、Ｈｉｌｉ／Ｍｉｌｉ、Ｇｅｍｉｎ３、Ｐ６７８ヘリカーゼ、Ｇｅｍｉｎ２、Ｇｅｍｉｎ４、Ｐ１１５／スライサー及びＶＩＧをコードする遺伝子の群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、第３の遺伝子はＤｉｃｅｒ−１又はｅＩＦ２Ｃ２をコードする。
【００３８】
さらなる実施の形態において、パッケージング細胞に、標的遺伝子の一部と少なくとも約９０％同一である第１のＲＮＡコード領域を含むレトロウイルス構築物をトランスフェクトすること、及びパッケージング細胞においてＲＮＡ干渉を阻害することを含む、組換えレトロウイルスを産生する方法が提供される。
【００３９】
ＲＮＡ干渉を媒介する遺伝子と少なくとも約９０％同一であるｓｉＲＮＡをパッケージング細胞で発現することによって、ＲＮＡ干渉を阻害するのが好ましい。ｓｉＲＮＡは、パッケージング細胞で一時的に発現し得るか、又は安定して発現し得る。
【００４０】
別の実施の形態において、レンチウイルスをコードするｓｉＲＮＡを産生する方法が提供され、ｓｉＲＮＡ活性がウイルスライフサイクルの局面に干渉し得る。パッケージング細胞に、レンチウイルスをコードするベクターをトランスフェクトし、パッケージング細胞でｓｉＲＮＡ活性を阻害する。
【００４１】
別の実施の形態において、パッケージング細胞株にレトロウイルス構築物をトランスフェクトする工程と、パッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収する工程と、ｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞に組換えレトロウイルスを感染させる工程とを含む、細胞内でＲＮＡ分子を発現する方法が提供される。組換えレトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と、第１のＲＮＡコード領域と、第１の終結配列とを含み得る。ＲＮＡコード領域の発現によって、標的遺伝子又はゲノム転写物の下方調節がもたらされ得る。第１のＲＮＡコード領域は、標的細胞に対して比較的細胞毒性ではないＣＣＲ５に指向性を有するｓｉＲＮＡを含み得る。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は配列番号１６の配列を含む。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は配列番号１７から成る。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域はヘアピン領域を含む。幾つかの実施の形態では、標的細胞内のＲＮＡコード領域の発現は、少なくとも約１０日間、ヒト末梢血単核細胞であり得る標的細胞の増殖速度を変えない。
【００４２】
幾つかの態様において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列をさらに含む。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードする。センス領域は、アンチセンス領域と実質的に相補的であり得る。ループ領域は、約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長であり得る。ＲＮＡコード領域の少なくとも一部が標的領域と実質的に相補的であり得る。標的領域は、１５ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長であり得る。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は、１８ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長の標的領域と実質的に相補的である。
【００４３】
幾つかの実施の形態において、パッケージング細胞株はＨＥＫ２９３細胞株である。５’ＬＴＲ配列はＨＩＶ由来であり得る。自己不活性化３’ＬＴＲは、そのエンハンサー配列が欠失したＵ３因子を含み、修飾ＨＩＶ ３’ＬＴＲであり得る。幾つかの実施の形態では、組換えレトロウイルスは偽型（シュードタイプ）である。例えば、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって、レトロウイルスを偽型にすることができる。他の実施の形態では、５’ＬＴＲ配列は、モロニーマウス白血病ウイルス又はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来であり得る。
【００４４】
幾つかの実施の形態において、標的細胞はヒト細胞である。標的細胞は、造血細胞である可能性があり、例えばＣＤ３４陽性造血細胞であり得る。標的細胞は培養細胞であり得る。
【００４５】
この方法は、患者から標的となるＣＤ３４陽性造血細胞を単離する工程も含み得る。幾つかの態様では、この方法は、感染したＣＤ３４陽性造血細胞を患者に再導入する工程を含み得る。
【００４６】
ＨＩＶに感染した患者を治療する方法も開示する。この方法は、患者からＣＤ３４陽性標的細胞を単離する工程と、レトロウイルス構築物をトランスフェクトしたパッケージン
グ細胞株から回収された組換えレトロウイルスを標的細胞に感染させる工程とを含み得る。組換えレトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と、第１のＲＮＡコード領域と、第１の終結配列とを含み得る。ＲＮＡコード領域の発現によって、ＣＣＲ５の下方調節がもたらされ得る。
【００４７】
別の態様において、標的細胞においてＣＣＲ５を低下するように調節するように構築されたｓｉＲＮＡを含む小ＲＮＡ分子が提供される。幾つかの実施の形態では、ｓｉＲＮＡのＲＮＡコード領域は配列番号１７をコードする。ＲＮＡコード領域は、ヘアピン領域を含み得る。ｓｉＲＮＡは、標的細胞に対して比較的細胞毒性ではないのが好ましい。幾つかの実施の形態では、ヒト末梢血単核細胞であり得る標的細胞内のＲＮＡコード領域の発現は、少なくとも約１０日間、標的細胞の増殖速度を変えない。幾つかの態様において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列をさらに含む。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードする。センス領域は、アンチセンス領域と実質的に相補的であり得る。標的領域は、１８ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長であり得る。
【００４８】
細胞内でＲＮＡ分子を発現する方法も開示する。この方法は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と操作可能に連結する第１のＲＮＡコード領域と、第１の終結配列とを含む組換えレトロウイルスを標的細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させる工程を含む。ＲＮＡコード領域の発現によって、標的細胞においてＣＣＲ５の下方調節がもたらされ、ＲＮＡコード領域は、配列番号１７の配列を含み得る。
【００４９】
細胞でＣＣＲ５を低下するように調節する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と、第１のＲＮＡコード領域と、第１の終結配列とを含む組換えレンチウイルスをトランスフェクトする工程を含む、方法も開示する。ＲＮＡコード領域は、配列番号１７の配列を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】「ＲＮＡカセット」と呼ばれるＲＮＡ発現のための発現カセットと「マーカー遺伝子」又は対象の遺伝子とを保有するレトロウイルスベクターの概略図である。ＲＮＡ発現カセットは、レトロウイルス構築物の任意の許容部位で、単一コピー又は複数のタンデムコピーのいずれかとして埋め込まれ得る。また、図に示されないものの、２つ以上のＲＮＡ発現カセットがレトロウイルス構築物に存在し得る。
【図１Ｂ】ＲＮＡ発現カセットがマーカー遺伝子に隣接する、同様な構築物を示す図である。
【図２】ｓｉＲＮＡ領域１１０〜ｓｉＲＮＡ領域１３０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００を有し、センス領域１１０、ループ領域１２０、及びアンチセンス領域１３０、並びにターミネーター配列１４０を有するＲＮＡ発現カセットの概略図である。
【図３】第１のＲＮＡコード領域１１０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００及び第１のターミネーター配列１４０、並びに第２のＲＮＡコード領域１１５に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５及び第２のターミネーター１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図である。
【図４】ＲＮＡコード領域１１０に連結した第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００及び第１のターミネーター配列１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図である。発現カセットは、１１０と逆順で同じ配列のＲＮＡコード領域１１５に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５及び第２のターミネーター１４０を有する。
【図５】レンチウイルスベクターをコードするｌａｃＺ ｓｉＲＮＡの概略図である。５’ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５’ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ因子；ｐｏｌ ＩＩＩ：ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−８）；ｓｉＲＮＡ：ｌａｃＺ特異的小ヘアピンＲＮＡコード領域、その構造及び詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節因子。３’ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ。
【図６】レンチウイルスベクターによりコードされたｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡは、ウイルスを形質導入された哺乳類細胞で、ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現を効果的に阻害し得る。ＭＥＦ：マウス胚線維芽細胞；ＨＥＫ２９３：ヒト胚腎臓細胞。試験細胞株はいずれもｌａｃＺ及びホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を内在し、そしてレポーター遺伝子の発現レベルは、化学発光アッセイにより測定され得る。ｃｔｒｌ：感染していない親細胞のｌａｃＺ活性対Ｌｕｃ活性の比で、任意に１に設定された。形質導入：ｌａｃＺ対Ｌｕｃ比の減少として算出されたｌａｃＺ発現の特異的阻害。
【図７】レンチウイルスベクターによりコードされたｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック動物は、ＲＯＳＡ２６＋／−バックグラウンドで遍在性ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現を首尾よく抑制し得る。ＲＯＳＡ１〜ＲＯＳＡ６：陽性対照として供される、６つのＥ１７．５ ＲＯＳＡ２６＋／−胚の肢組織でのｌａｃＺ活性。個々のＲＯＳＡ２６＋／−胚間のｌａｃＺ活性の差異は、可変のタンパク質抽出効率から生じ得る。ＴＧ１〜ＴＧ４：ＲＯＳＡ＋／−バックグラウンドでレンチウイルスベクターコード化ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡ分子を発現する４つのＥ１７．５トランスジェニック胚の肢組織でのｌａｃＺ活性。ＷＴ１〜ＷＴ６：陰性対照として含まれる、６つのＥ１７．５ Ｃ５７Ｂ１／６野生型胚の肢組織でのｌａｃＺ活性。内因性β−ガラクトシダーゼ活性のバックグラウンドレベルは、全般的に１０００ＬＵ／ｕｇを下回り、したがってカラムは見えない。
【図８】Ｔｅｔ誘導性ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡレンチウイルスベクターの概略図である。Ｔｅｔリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ、配列番号７）は、ヒトユビキチンＣプロモーターの制御下にあり、その発現はＩＲＥＳ因子（内部リボソーム侵入部位）と結び付いた下流のＧＦＰマーカーによりモニタリングされ得る。抗ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡカセットは、ＰＳＥとＴＡＴＡボックスとの間に単一ＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＯ１）を含有するヒトＵ６−プロモーター（−３２８〜＋１）由来のＴｅｔ誘導性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（配列番号６）により駆動される。テトラサイクリンの非存在下、ＴｅｔＲはプロモーターと結合して、その発現が抑制される。テトラサイクリンを添加すると、ＴｅｔＲはプロモーターから移動して転写が開始される。
【図９】Ｔｅｔ誘導性ｓｉＲＮＡ発現カセットがドキシサイクリン処理に応じて遺伝子発現を調節し得ることを実証する実験結果を示す図である。ｌａｃＺ及びルシフェラーゼ二重発現ＨＥＫ２９３細胞（２９３Ｚ＋Ｌｕｃ）に、ユビキチンＣプロモーターの制御下にある、Ｔｅｔ誘導性ｌａｃＺ−ｓｉＲＮＡカセット及びＴｅｔリプレッサーを保有するレンチウイルスベクター（図８）を形質導入した。形質導入した細胞を、４８時間１０ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理する（Ｐｌｕｓ Ｄｏｘ）か、又は対照としてドキシサイクリン処理を行わなかった（Ｎｏ Ｄｏｘ）。ＬａｃＺ及びルシフェラーゼ活性を先の図で記載されるように測定した。相対抑制活性をｌａｃＺ対ルシフェラーゼの比として算出し、そしてＮｏ Ｄｏｘ対照を任意に１に設定した。
【図１０】レンチウイルスベクターをコードする抗ヒトＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡの概略図である。５’ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５’ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ因子；ヒトＵ６−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−３２８〜＋１）；ｓｉＲＮＡ：ヒトＣＣＲ５特異的短鎖ヘアピンカセット、その構造及び詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節因子。３’ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ。
【図１１】レンチウイルスベクターによりコードされた抗ヒトＣＣＲ５特異的ｓｉＲＮＡは、形質導入されたヒト細胞におけるＣＣＲ５発現を効率的に抑制し得る。形質導入又は非形質導入ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５でのＣＣＲ５の細胞表面発現（Deng, et al., Nature, 381, 661（1996））を、フローサイトメトリ解析（ＦＡＣＳ）で測定し、そして相対発現レベルを平均蛍光強度により算出した。非特異的ｓｉＲＮＡも、対照として含まれた。
【図１２】レンチウイルスベクターをコードする抗ＨＩＶ−１ ｓｉＲＮＡの概略図である。５’ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５’ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ因子；ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−９）；ｓｉＲＮＡ：ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンカセット、その構造及び詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節因子。３’ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ。
【図１３】レンチウイルスベクターによりコードされる抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的ｓｉＲＮＡがヒト細胞におけるＨＩＶ転写の発現を効率的に抑制し得ることを実証する図である。ＨＩＶ−１ウイルスの転写活性は、ｅｎｖ／ｎｅｆ領域に挿入されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で測定される（Li, et al. J Virol., 65, 3973（1991））。非形質導入親細胞のルシフェラーゼ活性を任意に１に設定し、これに従って形質導入細胞の相対ＨＩＶ転写レベルを算出した。非特異的ｓｉＲＮＡ含有ベクターは対照として含まれた。
【図１４】抗ＨＩＶ Ｒｅｖ及び抗ヒトＣＣＲ ｓｉＲＮＡ発現カセットの両方を保有する二価レトロウイルスベクターの概略図である。符号は先の図で記載されるものと同じである。
【図１５】野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖパッケージングプラスミド、Ｒｅｖ−ｓｉＲＮＡ媒介性分解に耐性がある変異型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、又は抗Ｄｉｃｅｒ、抗ｅＩＦ２Ｃ２若しくは抗Ｄｉｃｅｒ及び抗ｅＩＦ２Ｃ２のｓｉＲＮＡの存在下での野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖを同時トランスフェクトした後の抗Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡ発現カセットを含むレンチウイルスベクターからのウイルス産生を示す図である。
【図１６】（図１６Ａ）９６ウェルプレートでヒトＣＣＲ５に対して、無作為に生成したｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターをＣＥＭ−ＮＫＲ−ＣＣＲ５細胞に形質導入し、３日間培養して、ＧＦＰ発現集団においてＣＣＲ５発現に関してフローサイトメトリで解析した研究の結果を示す図である。図１６Ａに示されるように、スクリーニングした４００個のｓｈＲＮＡのうち、ヒトｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）は、以前に公開されたヒトｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）（配列番号１４）よりも効率的にＣＣＲ５を低減した。Ｕ６プロモーターから発現した以前に開示された強力なｓｈＲＮＡ（非特許文献４）とは異なり、ヒトｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）の発現は、１２日の培養期間にわたり、形質導入したＴリンパ球の成長速度を変えなかった。以下で考慮されるように、ヘアピン型のｓｉＲＮＡを調べたが、ｓｉＲＮＡは、非共有結合的に結び付いて二本鎖を形成する２つの異なるＲＮＡ分子も含み得る。 （図１６Ｂ）ｓｉＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）によるヒト初代リンパ球（ｈｕＰＢＬ）における内因性ＣＣＲ５発現の効率的な低減を示す図である。ＰＨＡ／ＩＬ２活性化ｈｕＰＢＬに、ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）を保有するレンチウイルスベクターを形質導入し、モノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリによって、ＧＦＰ＋集団におけるＣＣＲ５発現に関して感染の８日後に解析した。ＧＦＰ＋集団におけるＣＣＲ５発現の割合を算出し、それぞれのパネル図の上部に示した。図１６及び図１７に示されるように、「Ｍｏｃｋ」という表示はベクターの形質導入がないことを示している。ラベル「Ｎｏ ｓｈＲＮＡ」は、ベクター中にｓｈＲＮＡがないベクターの形質導入を示している。
【図１７Ａ】アカゲザル（rhesus）ＣＣＲ５（ｒｈ１００５）（配列番号２０）に対するｓｈＲＮＡを、ｒｈＣＣＲ５発現２９３Ｔ細胞で調べた研究の結果を示す図である。末梢血動員アカゲザルＣＤ３４＋細胞を形質導入した後に、骨髄を破壊した（myeloablated）動物に自己移植することによって、このｓｈＲＮＡの機能及び安全性を調べた。ｒｈＣＣＲ５に対して、ｓｈＲＮＡ（ｒｈ１００５）を保有するＳＩＶベースのレンチウイルスベクターを細胞に形質導入し、形質導入の４日後に、モノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリによって、ＣＣＲ５及びＧＦＰの発現に関して解析した。示されるように、ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｒｈ１００５）は、ｒｈＣＣＲ５−２９３Ｔ細胞におけるｒｈＣＣＲ５発現を低減したが、標的配列における単一ヌクレオチドミスマッチによるヒトＣＣＲ５発現ＣＣＲ５ＮＫＲＣＥＭ細胞におけるヒトＣＣＲ５発現は低減しなかった。同様に、ｈｕＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡはヒトＣＣＲ５発現を低減したが、アカゲザルＣＣＲ５発現は低減しなかった。
【図１７Ｂ】ＰＨＡ／ＩＬ２活性化初代アカゲザル（rhesus macaque）リンパ球にアカゲザルＣＣＲ５（ｒｈ１００５）（配列番号２０）に対するｓｈＲＮＡを発現するＳＩＶベクターを感染させる研究の結果を示す図である。ＧＦＰ＋細胞及びＧＦＰ−細胞におけるフローサイトメトリによって、ＣＣＲ５発現を解析した。ホタルのルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを発現するベクターを対照として使用した。この図は、初代アカゲザルＰＢＭＣにおいてＲｈＣＣＲ５（ｒｈ１００５）ｓｈＲＮＡによってＣＣＲ５発現が阻害されたことを示している。
【図１８Ａ】移植したアカゲザルにおける末梢血細胞での安定なＥＧＦＰマーキングを示す図である。幹細胞移植の後、フローサイトメトリ解析によって、顆粒球（白色四角）、単球（黒色四角）、リンパ球（黒色三角）集団でＥＧＦＰ発現をモニタリングした。
【図１８Ｂ】ＧＦＰ＋リンパ球における安定なＣＣＲ５低減を示す図である。フローサイトメトリによるＧＦＰ＋細胞（黒色グラフ）及びＧＦＰ−細胞（灰色グラフ）におけるＣＣＲ５発現の割合をモニタリングした。ｓｈＲＮＡ発現単位ではなく、ＧＦＰを保有するレンチウイルスベクターを対照動物２ＲＣ００３に事前に移植した。
【図１８Ｃ】移植の５ヵ月後の代表的なＣＣＲ５／ＧＦＰプロット図である。ＣＣＲ５、並びにリンパ球集団におけるＣＣＲ５及びＥＧＦＰの発現に関して、移植されたマカク由来の末梢血を染色し、フローサイトメトリで解析した。（それぞれの象限で示される）それぞれの象限での事象の割合に基づき、ＧＦＰ＋リンパ球集団及びＧＦＰ−リンパ球集団におけるＣＣＲ５発現の割合を算出し、それぞれのパネル図の上部に示した。
【図１８Ｄ】アカゲザルのリンパ球におけるｓｉＲＮＡの検出を示す図である。ｓｈＲＮＡ形質導入動物ＲＱ３５７０由来のＰＨＡ／ＩＬ２刺激リンパ球の小ＲＮＡ分画におけるノーザンブロット解析によって、２２ｎｔアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡが検出されたが、対照動物２ＲＣ００３由来の細胞では検出されなかった。
【図１９】ＥＧＦＰ＋リンパ球集団又はＥＧＦＰ−リンパ球集団におけるリンパ球細胞表面マーカー発現を示す図である。示されるように、ＥＧＦＰ＋依存性（gated）リンパ球集団又はＥＧＦＰ−依存性リンパ球集団での細胞表面マーカー発現に関して、フローサイトメトリによって、移植の１１ヵ月後のアカゲザル２ＲＣ００３、ＲＱ３５７０、及びＲＱ５４２７由来の末梢血を解析した。図１９Ａは、ＥＧＦＰ＋集団及びＥＧＦＰ−集団におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ９５（ｆａｓ）発現を示す。ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ９５（ｆａｓ）−は、未感作細胞型を表し、ＣＤ４５−／ＣＤ９５（ｆａｓ）＋は、記憶細胞型を表す。図１９Ｂは、ＥＧＦＰ＋集団又はＥＧＦＰ−集団におけるＣＤ４／ＣＤ８発現を示す。図１９Ｃは、ＥＧＦＰ＋集団及びＥＧＦＰ＋集団におけるＣＸＣＲ４発現を示す。アイソタイプ対照の染色に基づき、象限を構築した。それぞれの象限において、陽性染色細胞の割合を示す。
【図２０】ｅｘ ｖｉｖｏ培養中、ＰＨＡ／ＩＬ２刺激リンパ球におけるＥＧＦＰ＋細胞部分の速度を示す図である。移植の１１ヶ月後、移植動物から末梢血のリンパ球を単離し、２日間ＰＨＡ／ＩＬ２で刺激し、ＩＬ２と共に９日間培養した（合計１１日）。フローサイトメトリによって、リンパ球集団で、ＥＧＦＰ発現の割合をモニタリングした。実験は三重で行った。リンパ球集団におけるＥＧＦＰ発現の平均割合及び誤差バー（標準偏差）を示す。
【図２１】ｅｘ ｖｉｖｏ培養中、リンパ球における安定なＣＣＲ５低減を示す図である。ＰＨＡ／ＩＬ２のｅｘ ｖｉｖｏ培養中、７日目、９日目及び１１日目でのフローサイトメトリによるＥＧＦＰ＋（黒色グラフ）及びＥＧＦＰ−（灰色グラフ）におけるＣＣＲ５発現の割合に関して、図１９及び図２０に示される実験からの細胞を解析した。ＣＣＲ５発現の平均割合及び誤差バー（標準偏差）を示す。実験は三重で行った。
【図２２Ａ】ｅｘ ｖｉｖｏでのＳＩＶ複製の阻害を示す図である。移植の１３ヵ月後のＲＱ３５７０由来の末梢血リンパ球をＧＦＰ＋集団及びＧＦＰ−集団で分けて、２日間ＰＨＡ／ＩＬ２、及び２日間ＩＬ２で刺激した。刺激後、０．０４の感染多重度（moi）（ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５細胞での滴定によるウイルスストックの感染単位は４×１０4／ｍｌであった）で１時間、１×１０5個のＧＦＰ＋細胞又はＧＦＰ−細胞にＳＩＶｍａｃ２３９ １００μｌを感染させ、培養下で、１１日間ｐ２７産生に関してモニタリングした。感染実験を三重で行った。培養上清中の平均ｐ２７産生（ｎｇ／ｍｌ）及び誤差バー（標準偏差）を示す。
【図２２Ｂ】ＧＦＰ＋選別リンパ球及びＧＦＰ−選別リンパ球におけるＣＣＲ５発現の割合を示す図である。フローサイトメトリ解析によって、ｅｘ ｖｉｖｏ培養中、ＣＣＲ５発現をモニタリングして、ＧＦＰ＋選別リンパ球集団（黒色グラフ）とＧＦＰ−選別リンパ球集団（灰色グラフ）との間で比較した。
【図２２Ｃ】ＧＦＰ＋選別ＰＨＡ／ＩＬ２活性化リンパ球（黒色グラフ）及びＧＦＰ−選別ＰＨＡ／ＩＬ２活性化リンパ球（灰色グラフ）におけるＣＣＲ５発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明者らは、例えばＨＩＶを治療するために標的細胞に与えることができる特定の性質があるｓｈＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ ｈｕ（１００５）（配列番号１７）を同定している。様々な方法で、ｓｈＲＮＡの標的細胞への送達を達成することができる。例えば、Baltimore et al.に対する米国特許出願公開第２００３／０１０１４７２号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）において、例えば対象の導入遺伝子を細胞又は動物に導入する方法が記載されている。
【００５２】
他に定義されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似、又は等価な任意の方法、装置、及び材料が、本発明の実施で使用され得る。
【００５３】
「導入遺伝子」は、ヒトの介入により（例えば本発明の方法により）宿主細胞の１つ又は複数の染色体中に組み込まれている、任意のヌクレオチド配列、特にＤＮＡ配列を意味する。一実施形態において、導入遺伝子は「ＲＮＡコード領域」である。別の実施形態において、導入遺伝子は「対象の遺伝子」を含む。他の実施形態において、導入遺伝子はヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列であってもよく、これは、それが組み込まれている染色体を標識するために使用される。この場合、導入遺伝子は、発現され得るタンパク質をコードする遺伝子を含む必要はない。
【００５４】
「対象の遺伝子」は、宿主細胞への組み込みに望ましいタンパク質又は他の分子をコードする核酸配列である。一実施形態において、対象の遺伝子は、宿主細胞でその発現が望まれるタンパク質又は他の分子をコードする。この実施形態において、対象の遺伝子は一般に、対象の遺伝子の所望の発現を得るために有用な他の配列（転写調節配列等）に操作可能に連結している。
【００５５】
「機能的に関連して（functional relationship：機能的な関連性）」及び「操作可能に連結している」は、プロモーター及び／又はエンハンサーに関して遺伝子が正しい位置及び方向にあり、プロモーター及び／又はエンハンサーが適切な分子に接触すると遺伝子
の発現が影響を受けることを意味するが、これに限定されない。
【００５６】
「ＲＮＡコード領域」は、ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ等）の合成用テンプレートとなり得る核酸である。好ましくは、ＲＮＡコード領域はＤＮＡ配列である。
【００５７】
「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、相同性を示す遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子である。遺伝子又は他のヌクレオチド配列の相同性がある領域は、「標的領域」として既知である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、センス領域、ループ領域、及びセンス領域と相補的なアンチセンス領域を含む「ヘアピン」又はステムループＲＮＡ分子であり得る。典型的に少なくとも１つのセンス領域及びアンチセンス領域は標的領域に相補的である。このような分子は、小ヘアピンＲＮＡ又は「ｓｈＲＮＡ」と呼ぶことができる。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、非共有結合的に結び付いて二本鎖を形成する２個の別個のＲＮＡ分子を含む。
【００５８】
用語「動物」は、その最も広義において使用され、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、及び両生類を含む全動物を示す。
【００５９】
用語「哺乳類」は、哺乳綱の全成員を示し、哺乳類として分類される任意の動物を含み、ヒト、家畜動物（domestic and farm animals）、並びに動物園、競技用、又はペット用の動物（マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及び高等霊長類等）が挙げられる。
【００６０】
「標的細胞」又は「宿主細胞」は、本発明の方法及び組成物を使用して形質転換される細胞を意味する。
【００６１】
用語「病原性ウイルス」は、動物に感染する能力があるウイルスを示すものとして、本明細書中に使用される。
【００６２】
「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。
【００６３】
「レンチウイルス」は、分裂細胞及び非分裂細胞に感染する能力があるレトロウイルス属を示す。レンチウイルスの例の幾つかとして、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：１型ＨＩＶ、及び２型ＨＩＶを含む）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子；ヒツジに脳炎（ビスナ） 又は肺炎（マエディ）を引き起こすビスナ−マエディ（visna-maedi）、ヤギで免疫不全、関節炎、及び脳症を引き起こすヤギ関節炎−脳炎ウイルス；ウマで自己免疫性溶血性貧血及び脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコで免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシでリンパ節症、リンパ球増加、及びおそらく中枢神経系の感染を引き起こすウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；並びに類人猿で免疫不全及び脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【００６４】
本明細書中に使用されるとおりの「ハイブリッドウイルス」は、１つ又は複数の他のウイルスベクター由来の成分（非レトロウイルスベクター由来の因子を含む）を有するウイルス、例えば、アデノウイルスーレトロウイルスハイブリッドを示す。本明細書中に使用されるように、レトロウイルス成分を有するハイブリッドベクターは、レトロウイルスの範囲内にあると判断されることになる。
【００６５】
レンチウイルスゲノムは一般に、５’長末端反復（ＬＴＲ）、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）及び３’ＬＴＲに組織化されている。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサー及びプロモーター因子を含む。Ｕ５領域は、
ポリアデニル化シグナルを含む。Ｒ（繰返し）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域を分断し、Ｒ領域の転写配列は、ウイルスＲＮＡの５’末端及び３’末端の両方で現れる。例えば、"RNA Viruses: A Practical Approach"（Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, （2000））、O Narayan and Clements J. Gen. Virology 70: 1617-1639 （1989）、Fields et al. Fundamental Virology Raven Press. （1990）、Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. J Virol. 72 （10）: 8150-7 （1998）、及び米国特許第６，０１３，５１６号明細書を参照されたい。
【００６６】
レンチウイルスベクターは当該技術分野で既知であり、幾つかは、造血幹細胞にトランスフェクトするために使用されている。このようなベクターは、例えば、以下の文献に見出すことが可能であり、これらは本明細書中に参照により援用される：Evans JT et al. Hum Gene Ther 1999; 10: 1479-1489、Case SS, Price MA, Jordan CT et al. Proc Natl
Acad Sci USA 1999; 96: 2988-2993、Uchida N, Sutton RE, Friera AM et al. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 11939-11944、Miyoshi H, Smith KA, Mosier DE et al. Science 1999; 283: 682-686、Sutton RE, Wu HT, Rigg R et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors efficiently transduce human hematopoietic stem cells. J Virol 1998; 72: 5781-5788。
【００６７】
「ビリオン」、「ウイルス粒子」、及び「レトロウイルス性粒子」は、ＲＮＡゲノム、ｐｏｌ遺伝子由来のタンパク質、ｇａｇ遺伝子由来のタンパク質及びエンベロープ（糖）タンパク質を表す脂質二重層を含む単一のウイルスを示すものとして、本明細書中に使用される。ＲＮＡゲノムは通常、組換えＲＮＡゲノムであり、したがって、天然のウイルスゲノムにとって外来性のＲＮＡ配列を含み得る。ＲＮＡゲノムはまた欠損した内在性ウイルス配列を含有し得る。
【００６８】
「偽型（シュードタイプ）」レトロウイルスは、ＲＮＡゲノムの由来となるウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス性粒子である。エンベロープタンパク質は、別のレトロウイルス由来又は非レトロウイルス性ウイルス由来であってもよい。好適なエンベロープタンパク質は、水泡性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ
Ｇ）タンパク質である。しかしながら、ヒト感染の可能性を排除するために、ウイルスは代替的に、特定の種（マウス又は鳥類等）に感染を限定するエコトロピックエンベロープタンパク質を有する偽型とされ得る。例えば、一実施形態において、変異型エコトロピックエンベロープタンパク質（エコトロピックエンベロープタンパク質４．１７（Powell
et al. Nature Biotechnology 18 （12）: 1279-1282 （2000））等）が使用される。
【００６９】
用語「プロウイルス」は、ＲＮＡレトロウイルスのゲノムに対応する、真核生物染色体に存在する二本鎖ＤＮＡ配列を示すものとして使用される。プロウイルスは、宿主細胞の溶解又は破壊を引き起こすことなく、１つの細胞世代から次の世代へと伝達され得る。
【００７０】
「自己不活性化３’ＬＴＲ」は、ＬＴＲ配列に下流遺伝子の発現を駆動することを防ぐ突然変異、置換、又は欠失が含有される３’長末端反復（ＬＴＲ）である。３’ＬＴＲのＵ３領域のコピーは、組み込まれたプロウイルスでの両ＬＴＲの生成用テンプレートとして作用する。したがって、不活性化欠失又は変異を有する３’ＬＴＲがプロウイルスの５’ＬＴＲとして組み込まれる場合、５’ＬＴＲからの転写は不可能である。これは、ウイルスエンハンサー／プロモーターと任意の内部エンハンサー／プロモーターとの間の競合を排除する。自己不活性化３’ＬＴＲは、例えば、Zufferey et al. J. Virol. 72: 9873-9880 （1998）、Miyoshi et al. J. Virol. 72: 8150-8157、及び Iwakuma et al. Virology 261: 120-132 （1999）に記載される。
【００７１】
用語「ＲＮＡ干渉又はサイレンシング」は、遺伝子発現のＲＮＡ媒介性阻害の全ての転
写後機構及び転写機構（P. D. Zamore, Science 296,1265（2002）に記載されるもの等）を含むものとして、広く定義される。
【００７２】
本明細書中に使用されるとおりの「実質的な相補性」及び「実質的に相補的な」は、２つの核酸が、約１５ヌクレオチドを超える領域、より好ましくは約１９ヌクレオチドを超える領域にわたり、少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、及び最も好ましくは少なくとも９５％相補的であることを意味する。
【００７３】
本発明の一態様において、組換えレトロウイルスは、対象のＲＮＡコード領域を細胞へ、好ましくは哺乳類細胞へ送達するために使用される。細胞は、初代細胞又は培養細胞であってもよい。一実施形態において、細胞は卵母細胞又は胚細胞、より好ましくは１細胞期胚である。別の実施形態において、細胞は造血幹細胞である。したがって、ＲＮＡコード領域及び任意の関連する遺伝要素は、宿主細胞のゲノムにプロウイルスとして組み込まれる。標的細胞が胚である場合、細胞は次いで、当該技術分野で既知の方法により、トランスジェニック動物へ発達させられ得る。
【００７４】
ＲＮＡコード領域を送達するために使用される組換えレトロウイルスは、好ましくは修飾レンチウイルスであり、したがって分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染することが可能である。組換えレトロウイルスは、好ましくはＲＮＡコード領域を含む修飾レンチウイルスゲノムを含む。さらに、修飾レンチウイルスゲノムは、好ましくはウイルス複製に必要なタンパク質の内在性遺伝子を欠いており、したがって望ましくない複製（標的細胞の複製等）を防ぐ。必要なタンパク質は、以下に記載されるように、好ましくは、組換えレトロウイルスの産生の間パッケージング細胞株にトランスで提供される。
【００７５】
別の実施形態において、ＲＮＡコード領域を送達するために使用される組換えレトロウイルスは、修飾モロニーウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスである。さらなる実施形態において、ウイルスはマウス幹細胞ウイルスである（Hawley, R. G., et al. （1996） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10297-10302、Keller, G., et al. （1998） Blood 92: 877-887、Hawley, R. G., et al. （1994） Gene Ther. 1: 136-138）。組換えレトロウイルスはまた、Choi, JK; Hoanga, N; Vilardi, AM; Conrad, P; Emerson, SG; Gewirtz, AM. （2001）Hybrid HIV/MSCV LTR Enhances Transgene Expression of Lentiviral Vectors in Human CD34+ Hematopoietic Cells. Stem Cells 19, No. 3, 236-246に記載されるもののようなハイブリッドウイルスであり得る。
【００７６】
一実施形態において、導入遺伝子、好ましくはＲＮＡコード領域は、無処理のレトロウイルス５’ＬＴＲ及び自己不活性化３’ＬＴＲを含むウイルス構築物に組込まれる。ウイルス構築物は、好ましくは、ウイルス構築物に基づくウイルスゲノムＲＮＡを所望の宿主特異性を有するウイルス粒子にパッケージングするパッケージング細胞株に導入される。ウイルス粒子は回収されて宿主細胞に感染させられる。これらの態様のそれぞれが、以下に詳細に記載される。
【００７７】
ウイルス構築物
ウイルス構築物は、パッケージング細胞での組換えウイルス粒子の産生に必要な配列を含むヌクレオチド配列である。一実施形態において、ウイルス構築物はさらに宿主で対象の遺伝子の所望の発現を可能にする遺伝要素を含む。
【００７８】
ウイルス構築物の発生は、当該技術分野で既知の任意の適切な遺伝子工学技法を使用して達成することができ、例えば、Sambrook et al. （Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. （1989））、Coffin et al. （Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. （1997）） 及び"RNA Viru
ses : A Practical Approach"（Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, （2000））に記載されるように、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、及びＤＮＡシークエンシングの標準技法を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
ウイルス構築物は、任意の既知の生物のゲノム由来の配列を組込み得る。配列は、それらの自然の形で組込まれてもよく、また任意の方法で修飾されてもよい。例えば、配列は挿入、欠失、又は置換を含んでもよい。好適な実施形態において、ウイルス構築物はレンチウイルスゲノム（ＨＩＶゲノム又はＳＩＶゲノム等）由来の配列を含む。別の好適な実施形態において、ウイルス構築物はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）の配列を含む。
【００８０】
ウイルス構築物は、好ましくは、レンチウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス、又はそれらのハイブリッドの５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ由来の配列を含む。一実施形態において、ウイルス構築物は、レンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列並びにレンチウイルス由来の不活性化又は自己不活性化３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲ配列は、任意の種からの任意のレンチウイルス由来のＬＴＲ配列であり得る。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ又はＢＩＶ由来のＬＴＲ配列であり得る。好ましくは、ＬＴＲ配列はＨＩＶ ＬＴＲ配列である。ウイルスはまた、ＭＭＶ又はＭＳＣＶ由来の配列を取り込み得る。
【００８１】
ウイルス構築物は、好ましくは、不活性化又は自己不活性化３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲは、当該技術分野で既知の任意の方法により自己不活性化にされ得る。一実施形態において３’ＬＴＲのＵ３因子は、そのエンハンサー配列、好ましくはＴＡＴＡボックス、Ｓｐｌ及びＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ部位の欠失を含有する。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルスは不活性化５’ＬＴＲを含むことになる。
【００８２】
任意で、レンチウイルス５’ＬＴＲ由来のＵ３配列は、ウイルス構築物のプロモーター配列で置換され得る。このことは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させ得る。エンハンサー配列もまた含まれ得る。パッケージング細胞株でのウイルスＲＮＡゲノムの発現を増加させる任意のエンハンサー／プロモーターの組合せが使用され得る。このような一実施形態においてＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（米国特許第５，１６８，０６２号明細書、Karasuyama et al. J. Exp. Med. 169: 13（1989）。
【００８３】
ウイルス構築物はまた、導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、プロウイルス用マーカーとして働く配列を含む任意のヌクレオチド配列であり得る。好ましくは、導入遺伝子は、１つ又は複数のＲＮＡコード領域及び／又は１つ又は複数の対象の遺伝子を含む。
【００８４】
好適な実施形態において、導入遺伝子は少なくとも１つのＲＮＡコード領域を含む。好ましくは、ＲＮＡコード領域は、宿主細胞で所望のＲＮＡ分子を発現させるためのテンプレートとして働き得るＤＮＡ配列である。一実施形態において、ウイルス構築物は、２つ以上のＲＮＡコード領域を含む。
【００８５】
ウイルス構築物はまた、好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結しており、終結配列とも連結し得る。また、２つ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが組込まれ得る。
【００８６】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、当業者に既知である。ＲＮＡポリメラーゼ
ＩＩＩプロモーターの適した範囲は、例えば、Paule and White. Nucleic Acids Research., Vol 28, pp 1283-1298 （2000）に見いだすことが可能であり、これは本明細書中にその全体が参照により援用される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの定義にはまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにその下流のＲＮＡコード配列を転写するよう指図し得る任意の合成又は操作されたＤＮＡ断片も含まれる。さらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーター、又はウイルスベクターの一部分として使用されるプロモーターが誘導され得る。任意の適した誘導Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが本発明の方法で使用され得る。特に適したＰｏｌ ＩＩＩプロモーターとして、Ohkawa and Taira Human
Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 （2000）並びに Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 （2001）で与えられるテトラサイクリン応答性プロモーターが挙げられ、これらは本明細書中に参照により援用される。
【００８７】
一実施形態において、ウイルス構築物はさらに、１つ又は複数の標的細胞で望ましく発現されるタンパク質（例えば、レポーター又はマーカータンパク質）をコードする遺伝子を含む。好ましくは、対象の遺伝子は５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置する。さらに、対象の遺伝子は好ましくは、他の遺伝要素（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー等の転写調節配列）と機能的に関連しており、いったん対象の遺伝子が標的細胞ゲノム中に組込まれると特定の様式で対象の遺伝子の発現を調節する。或る特定の実施形態において、有用な転写調節配列は、時間的及び空間的の両方で、活性に関して高度に調節されるものである。
【００８８】
好ましくは、対象の遺伝子は内部ポリメラーゼＩＩプロモーター／エンハンサー制御配列と機能的に関連している。「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルス構築物の５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置し、発現が望ましい遺伝子と操作可能に連結するものである。
【００８９】
ポリメラーゼＩＩプロモーター／エンハンサーは、それが機能的に関連している遺伝子の発現を増加させることが既知である任意のプロモーター、エンハンサー、又はプロモーター／エンハンサーの組合せであり得る。「機能的に関連して」及び「操作可能に連結した」とは、プロモーター及び／又はエンハンサーに関して導入遺伝子又はＲＮＡコード領域が正しい位置及び方向にあり、プロモーター及び／又はエンハンサーが適切な分子に接触すると遺伝子の発現が影響を受けることを意味するが、これに限定されない。
【００９０】
別の実施形態において、対象の遺伝子は、異種集団内（例えば、動物内、又はより具体的にヒト患者内）で、処理された標的細胞の選択的致死を可能にするための安全上の注意から含まれる遺伝子である。このような一実施形態において、対象の遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）であり、その発現は、標的細胞を薬物ガンシクロビルの作用に感受性にする。
【００９１】
また、２つ以上の対象の遺伝子が、内部プロモーターと機能的に関連して置かれ得る。例えば、マーカータンパク質をコードする遺伝子が、第１の対象の遺伝子の後に置かれて所望のタンパク質を発現する細胞の同定を可能にし得る。一実施形態において、蛍光マーカータンパク質、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、対象の遺伝子と共に構築物中に組込まれる。第２のレポーター遺伝子が含まれる場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列もまた、好ましくは含まれる（米国特許第４，９３７，１９０号明細書）。ＩＲＥＳ配列は、レポーター遺伝子の発現を促進し得る。
【００９２】
ウイルス構築物はまた、さらなる遺伝要素を含み得る。構築物に含まれ得る要素の型は任意の方法に制限されず、特定の結果を達成するために当業者により選択される。例えば、標的細胞へのウイルスゲノムの核侵入を促進するシグナルが含まれ得る。このようなシ
グナルの例は、ＨＩＶ−１フラップシグナルである。
【００９３】
さらに、動物のゲノム中のプロウイルス組み込み部位の特性付けを促進する要素が含まれ得る。例えば、ｔＲＮＡアンバー抑制因子配列が構築物に含まれ得る。
【００９４】
また、構築物は、対象の遺伝子の発現を高めるように設計された１つ又は複数の遺伝要素を含み得る。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答因子（ＷＲＥ）が、構築物中に置かれ得る（Zufferey et al. J. Virol. 74: 3668-3681（1999）、Deglon et al. Hum. Gene Ther. 11: 179-190（2000））。
【００９５】
ニワトリβ−グロビンインスレーター（Chung et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 575-580 （1997））もまた、ウイルス構築物に含まれ得る。この要素は、メチル化及びヘテロクロマチン化効果により標的細胞において組み込まれたプロウイルスのサイレンシングの機会を減少させることが示されている。また、インスレーターは、内在エンハンサー、プロモーター、及び外因性遺伝子を、染色体の組み込み部位での周囲のＤＮＡの正又は負の位置効果から遮断し得る。
【００９６】
任意のさらなる遺伝要素は、好ましくは対象の遺伝子又はＲＮＡコード領域の３’に挿入される。
【００９７】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは以下を含む：ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列；ＨＩＶ５’ ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列；ＨＩＶ−１フラップシグナル；内在エンハンサー；内在プロモーター；対象の遺伝子；ウッドチャック肝炎ウイルス応答因子；ｔＲＮＡアンバー抑制因子配列；エンハンサー配列が欠失したＵ３因子；ニワトリβ−グロビンインスレーター；並びにＨＩＶ３’ＬＴＲのＲ配列及びＵ５配列。
【００９８】
ウイルス構築物は、好ましくは、パッケージング細胞株にトランスフェクトし得るプラスミド中にクローニングされる。好適なプラスミドは、好ましくは、細菌でのプラスミド複製に有用な配列を含む。
【００９９】
例示のレトロウイルス構築物の概略図は、図１Ａ及び図１Ｂに示される。
【０１００】
ウイルスの産生
感染性レトロウイルス性粒子（そのゲノムは上記に記載されるウイルス構築物のＲＮＡコピーを含む）を産生するために、当該技術分野で既知の任意の方法が使用され得る。
【０１０１】
好ましくは、ウイルス構築物はパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子中にパッケージングするためにトランスで必要とされるウイルスタンパク質を提供する。パッケージング細胞株は、レトロウイルスタンパク質を発現することが可能な任意の細胞株であり得る。好適なパッケージング細胞株としては、２９３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ Ｘ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、及びＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３０）が挙げられる。最も好適な細胞株は、２９３細胞株である。
【０１０２】
パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定して発現し得る。このようなパッケージング細胞株は、例えば、米国特許第６，２１８，１８１号明細書に記載される。代替的には、パッケージング細胞株に、必要なウイルスタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドを一時的にトランスフェクトし得る。
【０１０３】
一実施形態において、ＲＮＡゲノムのパッケージングに必要なウイルスタンパク質を安定して発現するパッケージング細胞株に、上記に記載されるウイルス構築物を含むプラスミドをトランスフェクトする。
【０１０４】
別の実施形態において、本質的にYee et al. （Methods Cell. Biol. 43A, 99-112 （1994））に記載されるように、必要なウイルスタンパク質を安定して発現しないパッケージング細胞株に、２つ以上のプラスミドを同時トランスフェクトする。プラスミドの１つは、ＲＮＡコード領域を含むウイルス構築物を含む。他のプラスミド（複数可）は、細胞が所望の宿主細胞に感染可能な機能的ウイルスを産生することを可能にするために必要なタンパク質をコードする核酸を含む。
【０１０５】
パッケージング細胞株は、エンベロープ遺伝子産生物を発現しなくてもよい。この場合、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムを、エンベロープタンパク質を欠いた粒子中にパッケージングする。エンベロープタンパク質は、ウイルス粒子の宿主範囲に一部応答性であるので、ウイルスは、好ましくは偽型である。したがって、パッケージング細胞株に、好ましくは、ウイルスが宿主細胞中へ入ることを許容する膜会合タンパク質をコードする配列を含むプラスミドをトランスフェクトする。当業者は、使用されることになる宿主細胞に適切な偽型を選択し得る。例えば、一実施形態において、ウイルスは、水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶｇ）によって偽型となる。特定の宿主範囲を与えることに加えて、この偽型は、ウイルスが非常に高い力価に濃縮されることを許容し得る。ウイルスは、代替的に、特定の種（マウス又は鳥類等）への感染を制限するエコトロピックエンベロープタンパク質によって偽型となり得る。例えば、別の実施形態において、変異型エコトロピックエンベロープタンパク質（エコトロピックエンベロープタンパク質４．１７（Powell et al. Nature Biotechnology 18 （12）: 1279-1282（2000））等）が使用される。
【０１０６】
好適な実施形態において、ウイルスタンパク質を安定して発現しないパッケージング細胞株には、ウイルス構築物、ｅｎｖ、ｎｅｆ、５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ及びｖｐｕ配列が欠失したＨＩＶ−１パッケージングベクターを含む第２のベクター、並びにエンベロープ糖タンパク質をコードする第３のベクターをトランスフェクトする。好ましくは、第３のベクターは、ＶＳＶｇエンベロープ糖タンパク質をコードする。
【０１０７】
上記のウイルス構築物が、細胞遺伝子又はウイルス遺伝子、特にウイルスのライフサイクルに関与する遺伝子等の必須遺伝子に対して指向性を有するｓｉＲＮＡを含む場合、パッケージング細胞におけるウイルス産生が大幅に低減し得る。したがって本発明の別の実施形態では、パッケージング細胞におけるＲＮＡ干渉活性が抑制されて、組換えウイルスの産生を改善する。パッケージング細胞株においてＲＮＡ干渉を抑制することによって、ｓｉＲＮＡ標的化必須遺伝子、例えばＨＩＶ−１ライフサイクルに必要なＣｉｓ調節因子を発現する組換えレトロウイルスをその治療上の使用を容易にするために十分量産生することができる。
【０１０８】
例えば、ＲＮＡ干渉に必要な１つ又は複数の成分を妨げることによって、ウイルス産生を低減するｓｉＲＮＡ活性の抑制が達成され得る。このような成分には、例えば不活性なヘアピン前駆体ｓｉＲＮＡを処理して開口末端の（open-ended）二本鎖成熟ｓｉＲＮＡにする経路における分子、及び標的ＲＮＡの分解に必須なＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成及び機能に関与する分子が含まれる。ＲＮＡ干渉に必要な成分の例としては、Ｄｉｃｅｒ−１及びＤｉｃｅｒ−２等のＲＮａｓｅＩＩＩファミリー成員（Hammond et al. Nat. Rev. Genet. 2:110-119（2001））、ＦＭＲ１等のＤｉｃｅｒ関連タンパク質（Ishizuka et al. Genes Dev. 16:2497-2508（2002）、Caudy et al. Genes Dev.
16:2491-2496 （2002））、ＲＩＳＣの会合及び活性に必要である（Mourelatos et al.
Genes Dev. 16（6）:720-728 （2002）、Carmell et al. Genes Dev. 16（21）:2733-2742 （2002））、ｅＩＦ２Ｃ２、ｅＩＦ２Ｃ１（ＧＥＲｐ９５）／ｈＡｇｏ１、ｅＩＦ２Ｃ２／ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、ｈＡｇｏ４及びｈＡｇｏ５等のアルゴノートタンパク質のＡｇｏ１サブファミリー成員（Carmell et al. Genes Dev. 16（21）:2733-2742 （2002））と、Ｈｉｗｉ１／Ｍｉｗｉ１、Ｈｉｗｉ２／Ｍｉｗｉ２及びＨｉｌｉ／Ｍｉｌｉ等のアルゴノートタンパク質のＰｉｗｉサブファミリー成員（Carmell et al. Genes Dev. 26:2733-2742（2002））とを含むアルゴノートタンパク質、Ｇｅｍｉｎ３等のＲＮＡヘリカーゼ（Mourelatos et al. Genes Dev. 16（6）:720-728 （2002））及びＰ６７８ヘリカーゼ（Ishizuka et al.、前出）並びにＧｅｍｉｎ２、Ｇｅｍｉｎ４、Ｐ１１５／スライサー及びＶＩＧ等の他のＲＩＳＣ／ｍｉＲＮＰ関連タンパク質（Mourelatos et al. Genes Dev. 16（6）:720-728 （2002）、Schwarz and Zamore Genes Dev. 16:1025-1031 （2002）、Caudy et al. Genes Dev. 16:2491-2496 （2002））が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、完全なｓｉＲＮＡの活性に必要であることが当該技術分野で既知である任意の成分が標的となり得る。
【０１０９】
ＲＮＡ干渉活性の抑制が、当該技術分野で既知の任意の方法によって達成され得る。これには、ＲＮＡ干渉の一因となる分子を阻害するためのパッケージング細胞におけるｓｉＲＮＡ分子を発現する構築物の同時トランスフェクション又は安定なトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
一実施形態において、ＲＮＡ干渉を阻害するｓｉＲＮＡ分子、例えばＤｉｃｅｒ活性及び／又はｅＩＦ２Ｃ２活性を阻害するｓｉＲＮＡ分子を発現する１つ又は複数のベクターの同時トランスフェクションによって、パッケージング細胞株からのウイルスの産生が増大する。好ましい実施形態では、ＲＮＡ干渉を阻害する１つ又は複数の分子、例えばＤｉｃｅｒ活性及び／又はｅＩＦ２Ｃ２活性を阻害するｓｉＲＮＡを安定して発現するパッケージング細胞株を作製する。
【０１１１】
次いで、組換えウイルスは、パッケージング細胞から精製され、滴定され、そして所望の濃度に希釈されるのが好ましい。
【０１１２】
ウイルス送達
ウイルスは、ウイルスが細胞に感染することを可能にする任意の方法で細胞に送達され得る。好ましくは、ウイルスは細胞膜と接触させられる。ウイルスを哺乳類細胞へ送達する好適な方法は、直接接触を通じてである。
【０１１３】
一実施形態において、標的細胞は、好ましくは、培養皿でウイルスと接触させられる。ウイルスは培地に懸濁されて培養皿のウェルに加えられ得る。ウイルスを含有する培地は、細胞を平板培養する前に加えられても、細胞を平板培養した後に加えられてもよい。好ましくは、生存性を提供するのに、且つ宿主細胞の感染が生じるように培地中のウイルス濃度を適したものにするのに適切な量の培地で、細胞をインキュベートする。
【０１１４】
細胞は、好ましくは、ウイルスが細胞に感染することを可能にするのに十分な長さの時間、ウイルスと共にインキュベートされる。好ましくは、細胞は、少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも５時間、及びさらにより好ましくは少なくとも１０時間ウイルスと共にインキュベートされる。
【０１１５】
任意のこのような実施形態において、細胞に感染するのに十分な任意の濃度のウイルスが使用され得る。標的細胞が培養される場合、ウイルス粒子の濃度は、少なくとも１ｐｆｕ／μｌ、より好ましくは少なくとも１０ｐｆｕ／μｌ、さらにより好ましくは少なくとも４００ｐｆｕ／μｌ、及びさらにより好ましくは少なくとも１×１０4ｐｆｕ／μｌで
ある。
【０１１６】
ウイルス感染に続いて、細胞は動物に導入され得る。培養細胞の導入位置は、使用される細胞型に依存する。例えば、細胞が造血細胞である場合、細胞は末梢血流中に導入され得る。動物に導入される細胞は、有害な免疫応答を回避するため、その動物由来の細胞であるのが好ましい。同様な免疫構成を有するドナー動物由来の細胞もまた使用され得る。免疫原性応答を回避するように設計されたものを含む他の細胞もまた使用され得る。
【０１１７】
別の実施形態において、適量のウイルスが、例えば身体への注射を通じて、直接動物に導入される。このような一実施形態において、ウイルス粒子は動物の末梢血流に注射される。他の注射位置も適している。ウイルスの型に依存して、導入は他の手段を通じて行うことができ、例えば、吸入又は上皮組織（例えば、目、口、又は皮膚のもの）との直接接触を含む。
【０１１８】
導入細胞を取り込む細胞及び動物は、例えば、ＲＮＡコード領域の組込、組み込まれたＲＮＡコード領域のコピー数、及び組み込み位置について、解析され得る。このような解析は、任意の時点で行われ、当該技術分野で既知の任意の方法により行われ得る。標準方法は、例えば、Hogan et al.（前出）に記載される。
【０１１９】
上記で開示した細胞の感染方法は、細胞の種特異的特性に依存しない。結果として、それらは容易に全ての哺乳類種に拡張される。
【０１２０】
上記されるように、修飾レトロウイルスは、それに対して広い宿主範囲を与えるために偽型であり得る。当業者はまた、特定の動物種で対象の遺伝子の所望の発現を達成するための適切な内在プロモーターを認識する。したがって、当業者は、任意の種由来の細胞を感染させる方法を変更することができる。
【０１２１】
標的細胞での遺伝子発現の下方調節
本明細書中に記載される方法は、細胞でのＲＮＡ分子の発現を可能にし、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターからは容易に発現され得ない小ＲＮＡ分子の発現に特に適している。本発明の好適な実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を低下するように調節するために細胞内で発現される。標的遺伝子を低下するように調節する能力は、特定の遺伝子の生物学的機能を同定することを含む多くの治療及び研究用途を有する。本発明の技法及び組成物を使用して、細胞培養液及び哺乳類生物での両方で大多数の遺伝子の発現をノックダウン（又は下方調節）することが可能になる。詳細には、病原菌（病原性ウイルス等）のライフサイクルに必要な標的細胞の遺伝子を低下するように調節することが望ましい。
【０１２２】
本発明の好適な実施形態において、ＲＮＡ発現カセットはＰｏｌ ＩＩＩプロモーター及びＲＮＡコード領域を含む。ＲＮＡコード領域は、好ましくは特定の遺伝子（単数又は複数）の発現を低下するように調節することが可能なＲＮＡ分子をコードする。コードされるＲＮＡ分子は、例えば、下方調節される遺伝子をコードするＲＮＡ分子の配列と相補的であり得る。このような実施形態において、ＲＮＡ分子は、アンチセンス機構を通じて作用するように設計される。
【０１２３】
より好適な実施形態は、二本鎖ＲＮＡ複合体、又はステムループ若しくはいわゆる「ヘアピン」構造を有するＲＮＡ分子の発現を含む。本明細書中に使用されるように、用語「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ複合体の二本鎖領域及びヘアピン又はステムループ（stem-lop）構造の二本鎖領域の両方を示す。ＲＮＡコード領域は、一本鎖ＲＮＡ、２つ以上の相補的一本鎖ＲＮＡ又はヘアピン形成ＲＮＡをコードし得る。
【０１２４】
二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉又は抑制と呼ばれるプロセスを通じて、相補配列を有する遺伝子の遺伝子発現を阻害することが示されている（例えば、Hammond et al. Nat. Rev.
Genet. 2: 110-119（2001）を参照されたい）。
【０１２５】
本発明によると、下方調節される標的遺伝子の領域に対応するＲＮＡ二本鎖又はｓｉＲＮＡが、細胞で発現される。ＲＮＡ二本鎖は、下方調節の標的となる遺伝子の配列と、配列が実質的に同一である（典型的には少なくとも約８０％同一であり、より典型的には少なくとも約９０％同一である）。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、例えば、Bummelkamp et al. Science 296: 550-553（2202）、Caplen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747
（2001）、及び Paddison et al. Genes & Devel. 16: 948-958（2002）に記載されている。
【０１２６】
ＲＮＡ二本鎖は一般に、少なくとも約１５ヌクレオチド長であり、好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長である。生物によっては、ＲＮＡ二本鎖は著しく長くなり得る。さらに好適な実施形態において、ＲＮＡ二本鎖は、約１９ヌクレオチド長〜２２ヌクレオチド長の間である。ＲＮＡ二本鎖は好ましくは、この領域にわたり標的ヌクレオチド配列と同一である。
【０１２７】
下方調節されることになる遺伝子が高度に保存されている遺伝子のファミリー内にある場合、二本鎖領域の配列は、配列の比較により所望の遺伝子のみを標的とするように選択され得る。生物内の相同遺伝子のファミリー間で十分な同一性がある場合、二本鎖領域は、複数の遺伝子を同時に低下するように調節するように設計され得る。
【０１２８】
二本鎖ＲＮＡは、単一のレトロウイルス構築物由来の細胞で発現され得る。好適な実施形態において、構築物の単一のＲＮＡコード領域は、センス領域と、ループ領域と、アンチセンス領域とを含む自己相補的なヘアピンＲＮＡの発現用のテンプレートとしての役目を果たす。この実施形態は図２に例示されており、図２はセンス領域１１０、ループ領域１２０、アンチセンス領域１３０、及びターミネーター領域１４０を有するＲＮＡコード領域に操作可能に連結されたＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター１００を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。センス領域１１０及びアンチセンス領域１３０は、それぞれ好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長である。ループ領域１２０は、好ましくは約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは約４ヌクレオチド長〜約９ヌクレオチド長である。発現に続いて、センス領域及びアンチセンス領域は二本鎖を形成する。
【０１２９】
別の実施形態において、レトロウイルス構築物は２つのＲＮＡコード領域を含む。第１のコード領域は第１のＲＮＡの発現用テンプレートであり、第２のコード領域は第２のＲＮＡの発現用テンプレートである。発現に続いて、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは二本鎖を形成する。レトロウイルス構築物は、好ましくは、第１のＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第１のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター及び第２のＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第２のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターも含む。この実施形態は図３に図示されており、第１のＲＮＡコード領域１１０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００及び第１のターミネーター配列１４０、並びに第２のＲＮＡコード領域１１５に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５及び第２のターミネーター１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。
【０１３０】
本発明のさらに別の実施形態において、レトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現がセンス鎖としての第１のＲＮＡ分子の合成をもたらし、第２のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード
領域の発現が第１のＲＮＡ分子と実質的に相補的であるアンチセンス鎖としての第２のＲＮＡ分子の合成をもたらすように、第１のＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第１のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、及び反対方向で同じ第１のＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第２のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。このような一実施形態において、両方のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列、好ましくは５個の連続したＴ残基を有する終結配列によりＲＮＡコード領域と分断されている。図４は、ＲＮＡコード領域１１０に連結した第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００及び第１のターミネーター配列１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。発現カセットは、ＲＮＡコード領域１１５（１１０と逆順で同じ配列）に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５及び第２のターミネーター１４０を有する。
【０１３１】
さらなる実施形態において、ＲＮＡ二本鎖は、２つ以上のレトロウイルス構築物を使用して発現される。一実施形態において、第１のＲＮＡの発現を指示する第１のレトロウイルス構築物が使用され、第１のＲＮＡと相補的である第２のＲＮＡの発現を指示する第２のレトロウイルス構築物が使用される。発現に続いて、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは二本鎖領域を形成する。しかしながら、単一のレトロウイルス構築物由来のレトロウイルス性粒子を使用して全二本鎖領域を導入することが好ましい。上記されるように、単一のウイルス構築物から二本鎖ＲＮＡを発現する複数の戦略が、図２〜図４に示される。
【０１３２】
ＲＮＡ二本鎖は、二本鎖の片側又は両側に一本鎖領域が隣接していてもよい。例えば、ヘアピンの場合、一本鎖ループ領域は１つの末端で二本鎖領域と連結する。
【０１３３】
ＲＮＡコード領域は一般に、ターミネーター配列に操作可能に連結している。ｐｏｌ ＩＩＩターミネーターは、好ましくは４つ以上のチミジン（「Ｔ」）残基のストレッチから成る。好適な実施形態において、５個の連続したＴのクラスターは、ＲＮＡコード領域の直ぐ下流に連結してターミネーターとしての役割を果たす。このような構築物において、ｐｏｌ ＩＩＩ転写はＤＮＡテンプレートの二番目又は三番目のＴで終了し、したがって２個又は３個のウリジン（「Ｕ」）残基のみがコード配列の３’末端に付加される。
【０１３４】
ＲＮＡコード領域の配列、及びしたがってＲＮＡ二本鎖の配列は、好ましくは、発現が細胞又は生物で低下するように調節される遺伝子の配列と相補的であるように選択される。所定の標的遺伝子のために所定のＲＮＡ二本鎖配列で達成される下方調節の程度は、配列により変化する。当業者は、有効な配列を容易に同定することができる。例えば、抑制量を最大にするために、標的細胞を処理する前又はトランスジェニック動物を発生させる前に多数の配列が細胞培養液で試験され得る。ＲＮＡ干渉に関する配列要件の理解が促されるので、ＲＮＡ二本鎖は当業者により選択され得る。
【０１３５】
標的細胞におけるウイルス複製及び／又は遺伝子発現の阻害
本発明の一態様に従って、標的のＲＮＡ二本鎖は、例えば、ウイルスの遺伝子発現、及びウイルス複製に必要な細胞性受容体又は補助受容体の発現を含むウイルスのライフサイクル又は複製に必要な配列である。本発明の一実施形態において、阻害されるウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。特定の実施形態では、標的配列は、Ｒｅｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、Ψ、ａｔｔ、ｐｂｓ、ｐｐｔ、並びに他の本質的なＤＮＡ及びＲＮＡシス調節因子から成る群から選択される。
【０１３６】
本発明はまた、ウイルス感染している患者を治療する方法を含む。一実施形態において、本方法は、通常のウイルス複製に重要であるヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの領域と、少なくとも９０％の相同性を有し、好ましくは同一である少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡをコードする、有効量の組換えレトロウイルス性粒子
（複数可）を患者へ投与することを含む。例えば、二本鎖ＲＮＡは、ウイルスゲノム、ウイルス遺伝子転写物、又はウイルスのライフサイクルに必要な患者の細胞性受容体の遺伝子の核酸と相同性を有し得る。
【０１３７】
一実施形態において、治療される患者は、ヒト免疫不全ウイルスに感染している。組換えウイルス粒子で治療する前に、標的細胞を患者から取り出す。好適な実施形態において、標的細胞は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞である。このような幹細胞は、当業者により精製され得る。このような精製の方法は既知であり、例えば、米国特許第４，９６５，２０４号明細書、同第４，７１４，６８０号明細書、同第５，０６１，６２０号明細書、同第５，６４３，７４１号明細書、同第５，６７７，１３６号明細書、同第５，７１６，８２７号明細書、同第５，７５０，３９７号明細書、及び同第５，７５９，７９３号明細書に教示されている。このようなＣＤ３４陽性幹細胞を精製する方法の１つは、末梢血のサンプルを遠心分離して単核細胞と顆粒球とを分離して蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）により選別することを含む。上記の技法のいずれかによって選別された細胞は、ＣＤ３４＋細胞に富むものであり得る。特定の実施形態において、細胞は磁気分離技術（Miltenyi Biotecから入手可能なもの等）によってＣＤ３４＋細胞に富むものであり、以下の刊行物に記載される：Kogler et al. （1998） Bone Marrow Transplant. 21: 233-241; Pasino et al.（2000） Br. J. Haematol. 108: 793-800。単離ＣＤ３４陽性幹細胞は、ウイルスゲノム内の１つ又は複数の標的及び／又はウイルスのライフサイクルに必要である細胞標的（例えば、病原性ウイルスの侵入に必要な受容体又は補助受容体を含む）に対して指向性を有する二本鎖ＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域を有する組換えレトロウイルス性粒子で処理される。処理された幹細胞は、次いで患者に再導入される。
【０１３８】
本発明の方法は、様々なウイルス性疾患（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎及びＧ型肝炎、ヒト乳頭腫（pailloma）ウイルス（ＨＰＶ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む）を治療するために使用され得る。
【０１３９】
患者に所望の病原菌（ウイルス等）に対する免疫力又は耐性の増加を与える目的で、抗ウイルス性組換えレトロウイルスで患者を治療することもまた可能である。
【０１４０】
細胞性標的
本発明によれば、当業者は、細胞性成分、例えばＲＮＡ、又は病原菌のライフサイクル、特にウイルスのライフサイクルに必要な細胞性タンパク質をコードするＲＮＡを、標的とし得る。好適な実施形態において、選択される細胞性標的は、正常な細胞増殖及び生存に必要であるタンパク質又はＲＮＡではない。ウイルスのライフサイクルを破壊するのに適したタンパク質として、例えば、ウイルス侵入に関係する細胞表面受容体（一次受容体及び二次受容体の両方を含む）、及びウイルスゲノムの転写に関係する転写因子、宿主染色体への組み込みに関係するタンパク質、及びウイルス遺伝子発現の翻訳又は他の調節に関係するタンパク質が挙げられる。
【０１４１】
細胞内へのウイルス侵入のための受容体として、多数の細胞性タンパク質が既知である。このような受容体の幾つかは、E. Baranowski、C. M. Ruiz-Jarabo、及びE. Domingoによる論文"Evolution of Cell Recognition by Viruses" Science 292: 1102-1105に列挙され、これは本明細書中にその全体が参照により援用される。ウイルスよる認識に関係する幾つかの細胞性受容体は、以下に列挙される：アデノウイルス：ＣＡＲ、インテグリン、ＭＨＣ Ｉ、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、シアル酸；サイトメガロウイルス：ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン；コクサッキーウイルス：インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＭＨＣ Ｉ；Ａ型肝炎：マウス様Ｉ型内在性膜糖タンパク質；Ｃ型肝炎：ＣＤ８１、低密度リポタンパク質受容体；ＨＩＶ（レトロウイルス科）：ＣＤ４、ＣＸＣＲ
４、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン；ＨＳＶ：ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、ＰＶＲ、ＨｖｅＢ、ＨｖｅＣ；インフルエンザウイルス：シアル酸；はしか：ＣＤ４６、ＣＤ５５；ポリオウイルス：ＰＶＲ、ＨｖｅＢ、ＨｖｅＣ；ヒトパピローマウイルス：インテグリン。当業者は、本発明が現在既知である受容体と共に使用することに制限されないことを認識する。新規細胞性受容体及び補助受容体が発見されると、本発明の方法はこのような配列に応用され得る。
【０１４２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ＨＩＶウイルス標的：
本発明の一実施形態において、レトロウイルス構築物は、ＨＩＶウイルス性ＲＮＡゲノム、すなわちＨＩＶウイルスゲノムの発現領域に対して（例えば、組み込まれたＨＩＶウイルスの９ｋｂ転写物のうち約１９ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長の任意の領域、又は、ＨＩＶの様々なスプライシングｍＲＮＡ転写物のいずれかに対して）少なくとも９０％相同性を有する二本鎖分子をコードするＲＮＡコード領域を有する（Schwartz, S; Felber, BK; Benko, DM; Fenya, EM; Pavlakis, GN. Cloning and functional analysis of multiply spliced mRNA species of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 1990; 64（6）: 2519-29）。ＨＩＶ転写物中の標的領域は、ウイルス遺伝子（例えば、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、及びｒｅｖを含む）のいずれかに対応するように選択され得る。別の実施形態において、ＲＮＡコード領域は、ＨＩＶウイルスの受容体又は補助受容体と少なくとも９０％相同性を有する二本鎖領域をコードする。例えば、ＨＩＶのＴ細胞侵入の一次受容体はＣＤ４である。好適な実施形態において、補助受容体であるＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）及びＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）は、本発明の方法に従って下方調節される。ＣＸＣＲ４（Feddersppiel et al. Genomics 16: 707-712（1993））は、ＨＩＶのＴ細胞栄養株の主要な補助受容体であるが、ＣＣＲ５（Mummidi et al. J. Biol. Chem. 272: 30662-30671（1997））は、ＨＩＶのマクロファージ栄養株の主要な補助受容体である。ＨＩＶに対する他の細胞性標的は、ＨＩＶライフサイクルに関係するタンパク質のＲＮＡ転写物を含み、これにはシクロフィリン、ＣＲＭ−１、インポーチン−β、ＨＰ６８（Zimmerman C, et al. Identification of a host protein essential for assembly of immature HIV-1 capsids. Nature 415 （6867）: 88-92（2002））、及び依然として未知の他の細胞性要因が挙げられる。
【０１４３】
ＣＣＲ５は、必須のヒト遺伝子ではないが、ＨＩＶ−１のほとんどの株による感染に必須であるために好ましい標的である。ＣＣＲ５細胞表面発現を妨げるＣＣＲ５Δ３２対立遺伝子がホモ接合型である個体は、ＨＩＶ−１感染に耐性であるか、そうでなければ見かけ上正常である（例えばR. Liu et al., Cell 86. 367-377（1996）、M. Samson et al.,
Nature 382, 722-725（1996）、M. Dean et al., Science 273, 1856-1862（1996）、Y.
Huang et al., Nat Med 2, 1240-1243（1996）を参照されたい）。ＨＩＶ−１が主にＴ細胞及びマクロファージに感染するために、ＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡを安定して発現し、ＨＩＶ−１感染の標的である子孫細胞においてＣＣＲ５を低下するように調節するために、造血幹細胞の移植を利用することができる。さらに、ＣＣＲ５に対する非毒性のｓｉＲＮＡは例えば、単独及びＨＩＶに対して指向性を有する他の「遺伝学的免疫付与」試薬との組合せの両方での力価のさらなる最適化の基礎となり得る。ｉｎ ｖｉｖｏ環境下で治療に適用する場合、強いＨＩＶ−１による選択圧によって、低レベルのＣＣＲ５を発現する耐性細胞が長時間にわたって選択される可能性がある。
【０１４４】
標的細胞の細胞毒性の低減
幾つかの実施形態において、小ＲＮＡ分子、例えば小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、標的細胞で発現した後の重要な標的細胞の細胞毒性又は他の有害作用には関連しない。一実施形態では、小ＲＮＡ分子は、細胞標的に対する細胞毒性が許容可能なレベルになるように構築し、またｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｅｘ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで生
体組織に導入される場合、標的遺伝子を安定して低下するように調節することができる。標的遺伝子の特定の標的配列に対して指向性を有するｓｉＲＮＡ等の小ＲＮＡ分子の様々なライブラリをスクリーニングすることによって、（１）標的細胞に対する毒性が比較的低レベルであり、（２）標的細胞の標的遺伝子を安定して低下するように調節することができる小ＲＮＡ分子を同定することができる。このようなスクリーニングの例は以下の実施例９に記載する。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、比較的に非細胞毒性である小ＲＮＡ分子は、病原性ウイルス（例えばＨＩＶ）のゲノム内の遺伝子、病原性ウイルスのライフサイクルに関与する細胞遺伝子、又は疾患若しくは障害を媒介する遺伝子に対して指向性を有する。一実施形態では、形質導入された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する著しい細胞毒性をもたらさずにＣＣＲ５を低下するように調節することができるｓｉＲＮＡを同定する。実施形態によってはｓｈＲＮＡであり得る、比較的に非細胞毒性であるｓｉＲＮＡ（本明細書中で非細胞毒性ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）は、好ましくはレンチウイルスベクターと併用してＨ１プロモーターを使用して、ＰＢＭＣで発現することができる。好ましい実施形態では、形質導入された標的細胞内の非細胞毒性小ＲＮＡ分子の発現は、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、８日、１０日、１２日、１５日、３０日、６０日、９０日、１８０日、３６０日、７２０日、又はそれ以上の間、標的細胞の増殖速度を変えない。この実施形態又は他の実施形態では、小ＲＮＡ分子は、許容可能な細胞毒性であり、又は言い換えればこれまでに記載されたｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）等の他の既知のｓｉＲＮＡに比べて、以下の作用を引き起こさないか、又は比較的少ししか引き起こさない場合、標的細胞に対して比較的に非細胞毒性である（D. S. An et al., Mol.Ther. 14, 494-504 （2006））：インターフェロン応答遺伝子の導入（R. J. Fish and E. K. Kruithof, BMC.Mol.Biol. 5, 9 （2004）を参照されたい）、オフターゲット効果によって引き起こされるｍＲＮＡ発現プロファイルの全体変化（A. L. Jackson et al., RNA. 12, 1179-1187 （2006）を参照されたい）又はｍｉＲＮＡ調節不全による細胞毒性作用（D. Grimm et al., Nature. 441, 537-541 （2006））。ＣＣＲ５に対して指向性を有する、このようなｓｈＲＮＡの非限定的な例は、配列番号１７（ｈｕ１００５）で与えられるｓｈＲＮＡである。
【０１４６】
抗ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ
以下の実施例９で考慮されるように、４００個を超えるｓｈＲＮＡのスクリーニングにおいて、図１６Ａで示されるように、ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）は、これまでに公開されたｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）（配列番号１４）よりも効果的にＣＣＲ５を低減した。ｃＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡは、ＣＣＲ５の標的領域、例えば配列番号１６の領域に相補的な、又は実質的に相補的な領域を含むのが好ましい。幾つかの実施形態では、ｓｉＲＮＡはｓｈＲＮＡであり、したがってヘアピン領域を含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有する。センス領域はアンチセンス領域と実質的に相補的であるのが好ましい。幾つかの実施形態では、ループ領域は、約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長であり得る。ＣＣＲ５に対して指向性を有するｓｉＲＮＡの好ましい実施形態では、小ＲＮＡ分子は、例えば約１ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１０ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長、より好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長の領域、例えば約２０ヌクレオチド長の範囲を含み、この領域は配列番号１７と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上同一である。
【０１４７】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、いかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意図しない。実際、本明細書中に図示及び記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、以下の記載から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【０１４８】
本明細書中で言及される全ての特許及び参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１４９】
実施例１
本実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位へ挿入することにより、ｌａｃＺ遺伝子に対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物を構築した（図５）。ＨＣ−ＦＵＧＷベクター（配列番号３）は、形質導入事象を追跡するための、ヒトユビキチンプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子を含有する。このベクターはまた、ウイルス力価を改善するためのＨＩＶ ＤＮＡフラップ因子、及びウイルス遺伝子の高レベル発現のためのＷＰＲＥも含有する。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター及び小ヘアピンＲＮＡコード領域から成り、これにｐｏｌ ＩＩＩターミネーター部位が続く。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ヒトＨ１−ＲＮＡプロモーターの−２４０〜−８領域に由来し、そして７塩基対のリンカー配列によって下流のＲＮＡコード領域に連結されて、転写がＲＮＡコード配列の最初のヌクレオチドから正確に開始されることを確実にする。小ヘアピンＲＮＡコード領域は、ｌａｃＺ遺伝子コード配列のセンス鎖の１９１５〜１９３３領域に対応する１９ｎｔ配列、及び９ｎｔループ領域により分断された１９ｎｔの完全な逆相補配列を含有する。ターミネーターは、ＲＮＡコード配列の直ぐ下流に連結した５個の連続したチミジン残基から成る。
【０１５０】
実施例２
この実施例は、培養哺乳類細胞へのレトロウイルスベクターの形質導入を実証する（図６）。実施例１に記載される小ヘアピンＲＮＡ分子をコードするレトロウイルスベクターを使用して、ｌａｃＺを発現する培養哺乳類細胞にトランスフェクトし、そして試験遺伝子ｌａｃＺの発現の著しい減少を引き起こした。ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルスを、レトロウイルスベクター、ヘルパーウイルスプラスミド（ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ）、及びＶＳＶｇ発現プラスミドのＨＥＫ２９３細胞における同時トランスフェクションにより産生した。ウイルス粒子を細胞培養液の上清から採取して、超遠心分離により濃縮した。濃縮ウイルス調製物を使用して、ｌａｃＺとホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーター遺伝子との両方を内在する、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）又はＨＥＫ２９３細胞のいずれかに感染させた。感染を、ウイルス性ベクターのマーカー遺伝子カセットから発現するＧＦＰシグナルによりモニタリングした。この実験条件下、９８％を超える試験細胞がＧＰＦ＋であり、したがって首尾よく形質導入された。ｌａｃＺ及びＬｕｃレポーター遺伝子の発現レベルを、市販のキット（Roche製ｌａｃＺアッセイキット及びPromega製Ｌｕｃ）を使用して化学発光アッセイにより測定した。ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルスは、ｌａｃＺの発現のみを阻害し、Ｌｕｃは阻害しなかった。特異的阻害を、ｌａｃＺ活性対Ｌｕｃ活性の比により決定した。未感染の親細胞のｌａｃＺ／Ｌｕｃ比を、任意に１に設定し、これに応じて感染細胞の値を算出した。図６に示されるとおり、ウイルスのトランスフェクションは、ＭＥＫ細胞及びＨＥＫ２９３細胞の両方でｌａｃＺ遺伝子の発現量の劇的な減少をもたらした。
【０１５１】
ｔｅｔ誘導性ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡレンチウイルスベクターをまた、図８に例示されるように調製した。Ｔｅｔリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ、配列番号７）の発現が下流のＧＦＰマーカーによりモニタリングされ得るように、それをヒトユビキチンＣプロモーターの制御下に置いた。抗ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡカセットを、ＰＳＥとＴＡＴＡボックスとの間に単一のＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＯ１）を含有するヒトＵ６−プロモーター（−３２８〜＋１）由来のＴｅｔ誘導性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（配列番号６）により駆動した。ＴｅｔＲコード配列を、大腸菌のＴＯＰ１０株由来のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅して、Ｂｇｌ２−ＥｃｏＲＩ断片としてＦＵＩＧＷの修飾型中にクローニングした。テトラサイクリンの非存在下、ＴｅｔＲはプロモーターに結合してその発現が抑制される。テト
ラサイクリンを添加すると、ＴｅｔＲはプロモーターから移動して転写が開始される。
【０１５２】
Ｔｅｔ誘導性ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ドキシサイクリン処理に応じて遺伝子発現を調節することが可能であった。ウイルスをＴｅｔ誘導性ｌａｃＺ−ｓｉＲＮＡカセット及びユビキチンＣプロモーター制御下のＴｅｔリプレッサーを保有するレトロウイルス構築物から調製し、そしてｌａｃＺ及びルシフェラーゼ（２９３Ｚ＋Ｌｕｃ）の両方を発現するＨＥＫ２９３細胞に形質導入するために使用した。形質導入細胞を、４８時間１０ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理する（Ｐｌｕｓ Ｄｏｘ）か、又は対照としてドキシサイクリン処理を行わなかった（Ｎｏ Ｄｏｘ）。ＬａｃＺ及びルシフェラーゼ活性を先の図に記載されるように測定した。相対抑制活性をｌａｃＺ対ルシフェラーゼの比として算出し、そしてＮｏ Ｄｏｘ対照を任意に１に設定した。図９に見られるとおり、ドキシサイクリンの存在下、ｌａｃＺ活性の抑制は、顕著に向上した。
【０１５３】
実施例３
この実施例は、レンチウイルスベクターによりコードされるｓｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック動物の発生を実証する。実施例１に記載されるｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡ構築物の発現は、ＲＯＳＡ２６＋／−マウスでｌａｃＺ活性の高度抑制をもたらした。ＲＯＳＡ２６＋／−動物は、遍在的に発現されるｌａｃＺレポーター遺伝子のコピーを１つ保有する。実施例２に記載されるｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルス調製物を、ホルモン刺激したＣ５７Ｂ１／６メスドナー×ＲＯＳＡ２６＋／＋種オスから得られたＲＯＳＡ２６＋／−単細胞胚の卵黄周囲注射に使用した。注射単細胞胚を、続いて時期を合わせた偽妊娠メス受容者の卵管へ移した。１５．５日〜１７．５日胚（Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５）の胎児を代理母から取り出した。蛍光顕微鏡下、胎児で観測される陽性ＧＦＰシグナルにより、成功した遺伝子導入を採点した。胎児の肢組織から調製されたタンパク質抽出物を、製造業者の取扱説明書（Roche）に従ってＬａｃＺ化学発光アッセイに使用し、そして組織抽出物のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（BioRad）により決定した。ＬａｃＺ発現レベルは、タンパク質１ｕｇあたりの光単位（ＬＵ）として表した（ＬＵ／ｕｇ）。Ｃ５７Ｂ１／６メス×ＲＯＳＡ２６＋／＋オス、及びＣ５７Ｂ１／６メス×Ｃ５７Ｂ１／６オスの時期を合わせた交配からのＥ１５．５〜Ｅ１７．５胎児を、それぞれ陽性対照及び陰性対照とした。結果を図７に示す。動物Ｇ１〜Ｇ４（ｓｉＲＮＡ構築物をコードするレンチウイルスベクターで処理されたもの）では、未処理の対照動物と比較して、動物はｌａｃＺ遺伝子の顕著に減少した発現を示した。
【０１５４】
実施例４
抗ヒトＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域を含むレンチウイルス構築物を調製した。図１０に例示されるように、ベクターは、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５’ＬＴＲ、ＨＩＶフラップ因子、ヒトＵ６−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター（−３２８〜＋１、配列番号４）、ヒトＣＣＲ５特異的短鎖ヘアピンＲＮＡカセット、内在ユビキチンプロモーター、ユビキチンプロモーターと操作可能に連結したＧＦＰマーカー遺伝子、ＷＲＥ調節因子、及びＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲを含んでいた。抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡの構造及び配列は図１０及び配列番号１で提供される。
【０１５５】
組換えレトロウイルスを、上記のように、抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡベクター構築物から調製した。ヒトＭＡＧＩ−ＣＣＲ５細胞（Deng et al., Nature 381: 661 （1996））に、非特異的対照ｓｉＲＮＡをコードする組換えウイルス又はレトロウイルスを感染させ、そしてＣＣＲ５の細胞表面発現をフローサイトメトリ解析により測定した。平均蛍光強度により相対発現レベルを算出した。図１１に見られるように、抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡは、ＣＣＲ５発現レベルをほぼ完全に減少させたが、非特異的ｓｉＲＮＡは発現をまったく抑制しなかった。
【０１５６】
実施例５
図１２に例示されるように、レンチウイルスベクターをコードするさらなる抗ＨＩＶ−１ ｓｉＲＮＡを構築した。このベクターは、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡ（配列番号２）をコードするＲＮＡコード領域を含んでいた。抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ−１をコードするＲｅｖの８４２０〜８４６８領域を標的とした（nucleotide coordinate of NL4-3 strain; Salminen et al. Virology 213 : 80-86 （1995））。ｓｉＲＮＡコード領域の配列及び構造は、同じく図１２に例示される。抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡの発現は、ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−９、配列番号５）により駆動された。
【０１５７】
抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡの、ヒト細胞におけるＨＩＶ転写の抑制能を測定した。ＨＩＶ−１の転写活性を、本質的にLi et al. J. Virol. 65: 3973（1991））に記載されるように、ｅｎｖ／ｎｅｆ領域で挿入されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性に基づいて測定した。
【０１５８】
上記されるように、ベクター構築物から組換えレトロウイルスを調製し、ＨＩＶ−１を含むヒト細胞にレポーター構築物を感染させるために使用した。形質導入されていない親細胞のルシフェラーゼ活性を任意に１に設定し、これに従って形質導入細胞の相対ＨＩＶ転写レベルを算出した。非特異的ｓｉＲＮＡを対照として使用した。
【０１５９】
図１３に見られるように、ＨＩＶ−１転写は、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡコード領域を含む組換えレトロウイルスを感染させた細胞で顕著に抑制されたが、非特異的ｓｉＲＮＡは明らかな効果を有さなかった。
【０１６０】
実施例６
本実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位へ挿入することにより、ＨＩＶゲノムに対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物を構築する。ＨＣ−ＦＵＧＷベクターは、形質導入事象を追跡するための、ヒトユビキチンプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子を含む。ベクターはまた、ウイルス力価を改善するためのＨＩＶ ＤＮＡフラップ因子、及びウイルス遺伝子の高レベル発現のためのＷＰＲＥを含有する。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター及び小ヘアピンＲＮＡコード領域から成り、これにｐｏｌ ＩＩＩターミネーター部位が続く。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ヒトＨ１−ＲＮＡプロモーターの−２４０〜−８領域に由来し、７塩基対のリンカー配列によって下流のＲＮＡコード領域に連結されて、転写がＲＮＡコード配列の最初のヌクレオチドから正確に開始されることを確実にする。小ヘアピンＲＮＡコード領域は、ＣＣＲ５コード配列の領域に対応する２１ｎｔ配列、及び４ｎｔループ領域により分断された２１ｎｔの完全な逆相補配列を含有する。ターミネーターは、ＲＮＡコード配列の直ぐ下流に連結した５個の連続したチミジン残基から成る。
【０１６１】
レトロウイルス構築物を使用して、パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）に、ヘルパーウイルスプラスミド及びＶＳＶｇ発現プラスミドを共にトランスフェクトする。組換えウイルス粒子が回収される。
【０１６２】
免疫磁気アプローチを使用して、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を患者の骨髄から単離する（例えば、Choi et al. （1995） Blood 85: 402-413、Fehse et al. （1997） Human Gene
Therapy 8: 1815-1824、Di Nicola et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 1117-1121、Servida et al. （1996） Stem Cells 14: 430-438、de Wynter et al. （1995） Stem Cells 13: 524-532、Ye et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 997-1008を参照されたい）。細胞を培養して、組換えウイルス粒子で処理する。感染細胞を、Ｇ
ＦＰの発現に基づいてＦＡＣＳにより選別する。ＧＦＰを発現する細胞を、注射して患者に再導入する。
【０１６３】
実施例７
本実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位に挿入することにより、ＨＩＶゲノムに対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物を構築する。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域に操作可能に連結したヒトＨ１プロモーターを含む。ｓｉＲＮＡ発現カセットはさらに、小抗ＣＣＲ５ヘアピンＲＮＡに操作可能に連結したｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。レトロウイルス構築物は、図１４に例示される。
【０１６４】
レトロウイルス構築物を使用して、パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）に、ヘルパーウイルスプラスミド及びＶＳＶｇ発現プラスミドを共にトランスフェクトする。組換えウイルス粒子が回収される。
【０１６５】
免疫磁気アプローチを使用して、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を患者の骨髄から単離する（例えば、Choi et al. （1995） Blood 85: 402-413、Fehse et al. （1997） Human Gene
Therapy 8: 1815-1824、Di Nicola et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 1117-1121、Servida et al. （1996） Stem Cells 14: 430-438、de Wynter et al. （1995） Stem Cells 13: 524-532、Ye et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 997-1008を参照されたい）。細胞を培養して、組換えウイルス粒子で処理する。感染細胞を、ＧＦＰの発現に基づいてＦＡＣＳにより選別する。ＧＦＰを発現する細胞を、注射して患者に再導入する。
【０１６６】
実施例８
実施例６に記載されたように、２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスベクター、野生型Ｒｅｖ配列（配列番号１１）を含むパッケージングプラスミド（ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、Dull, T.
et al. J Virol. 72（11）: 8463-8471 （1998））及びＶＳＶｇ発現プラスミドを同時トランスフェクションすることによって、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡ発現カセットを保有するレンチウイルスベクターからのウイルス産生を調べた。Ｒｅｖ−ｓｉＲＮＡ媒介性分解に耐性がある変異型のｐＲＳＶ−Ｒｅｖパッケージングプラスミドの使用によって、ウイルス産生の増大能を調べた。このプラスミドでは、変異型Ｒｅｖヌクレオチド配列（配列番号１２）は、Ｒｅｖ ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡ媒介性分解に対して耐性にさせるが、アミノ酸配列を変えない２つのサイレント変異を含む。さらに、ＲＮＡ干渉を阻害する１つ又は複数のｓｉＲＮＡの発現のウイルス産生に対する作用を調べた。
【０１６７】
細胞に、野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ単独、変異型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ＋抗Ｄｉｃｅｒ−１ ｓｉＲＮＡ（配列番号８）の発現を駆動するプラスミド、野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ＋抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡ（配列番号９）の発現を駆動するプラスミド、又は野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ＋抗Ｄｉｃｅｒ−１ ｓｉＲＮＡ及び抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡの発現を駆動するプラスミドのいずれかを同時トランスフェクトした。抗Ｄｉｃｅｒ−１及び抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡ発現は、ヒトＨ１−ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４１〜−９、配列番号１０）の制御下であった。表１及び図１５で見ることができるように、抗Ｄｉｃｅｒ ｓｉＲＮＡ及び抗Ｄｉｃｅｒ ｓｉＲＮＡと抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡとの組合せの存在下でｐＲＳＶ−Ｒｅｖをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のウイルス力価が最も大きかった。
【０１６８】
【表１】
【０１６９】
抗Ｄｉｃｅｒ−１ ｓｉＲＮＡ（配列番号８）及び抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡ（配列番号９）の両方を安定して発現するパッケージング細胞株を作製した。２９３Ｔ細胞に、抗ｅＩＦ２Ｃ２発現カセット及び抗Ｄｉｃｅｒ発現カセットを含むｐｃＤＮＡ４（Invitrogen）ベクター、並びに薬剤選択のためのＺｅｏｃｉｎ耐性遺伝子をトランスフェクトした。
【０１７０】
実施例９〜実施例１１
実験方法
以下に記載される実施例９〜実施例１１に、以下の実験方法を使用した。
【０１７１】
ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡライブラリの構築
ｃＤＮＡからのＲＮＡｉライブラリ酵素産生（enzymatic production of RNAi libraries）（ＥＰＲＩＬ）法（D. Shirane et al., Nat. Genet. 36, 190-196 （2004））を適応することによって、ヒトＣＣＲ５配列に対して指向性を有するランダムｓｈＲＮＡライブラリを作製した。プライマー対（５’ＧＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡ３’）（配列番号２２）；５’ＧＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣ３’）（配列番号２３）とＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）とを使用して、ヒトＣＣＲ５ ｃＤＮＡをｐＢＡＢＥ．ＣＣＲ５プラスミドＤＮＡ（NIHのＡＩＤＳ調査及び参照試薬プログラム）からＰＣＲ増幅した。ＣＣＲ５ ｃＤＮＡをＤＮＡｓｅＩ（Qiagen）で一部消化し、１００ｂｐ〜２００ｂｐのＤＮＡ断片を生成した。ＤＮＡ断片を、ＭｍｅＩ制限酵素部位（５’ＧＴＣＧＧＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＧＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＣＧＡＣ３’）（配列番号２４）を含有するヘアピンアダプタ１（Ａｄ１）ＤＮＡリンカーとライゲートした。それから、ライゲートしたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）で処理した後、大腸菌ＤＮＡリガーゼ処理（NEB）を行い、Ａｄ１の５’末端とＣＣＲ５のＤＮＡ断片の３’末端との間の切れ目を閉じた。Ａｄ１とライゲートしたＤＮＡ（約４０ｎｔ）をＭｍｅＩ（NEB）で消化し、ネイティブＰＡＧＥゲルから精製した。精製したＤＮＡ断片をアダプタ２（Ａｄ２）リンカー（＋鎖：５’ＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＧＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＧＡＧＴＣ３’）（配列番号２５）（−鎖：５’ＴＡＣＣＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＮＮ３’）（ここで、Ｎはそれぞれの位置において任意のヌクレオチドである）（配列番号２６）とライゲートし、ネイティブＰＡＧＥゲルから精製した。精製したＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）で処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって切れ目を
閉じた。プライマー（５’ＧＡＣＴＣＡＣＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＧＡＡＧ３’）（配列番号２７）と、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片（NEB）と、ＰＡＧＥゲルから精製して得られた生成物とを使用して、Ａｄ２とライゲートしたＤＮＡ断片をプライマー伸長反応にかけた。精製したＤＮＡ断片をＢｐｍＩで消化し、クレノウ断片（NEB）で平滑末端化して、ＢａｍＨＩで消化し、ヒトＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと４Ｔ終結シグナルとを含有するｐＢＳｈＨ１〜５のプラスミドＤＮＡとライゲートした。ライゲーション混合物を電気穿孔法で大腸菌（ＸＬ１ ｂｌｕｅ）に導入し、一晩１０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンで２×ＹＴ寒天プレート上で平板培養した。約８０００個のコロニーを合わせて、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡをＢｃｇＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB）で平滑末端化して、再びライゲートし、余分なＤＮＡ配列を除去した。再びライゲートしたプラスミドＤＮＡは、ＭｆｅＩでさらに処理し、ＢｃｇＩで不完全にしか消化されなかったプラスミドの汚染を取り除き、大腸菌を形質転換するのに使用した。プラスミドＤＮＡの２０個のコロニーをシークエンシングし、ＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡ配列がランダムであることを確認した。配列を確認した後、Ｈ１プロモーターと、ｓｈＲＮＡ配列と、４Ｔ終結シグナルとから成るｓｈＲＮＡ発現単位は、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩの消化によってｐＢＳｈＨ１〜５プラスミドＤＮＡから切り取り、ＦＧ１２レンチウイルスベクターのＸｂａＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した（X.
F. Qin, D. S. An, I. S. Chen, D. Baltimore, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 2003. Jan. 7;100（1）:183.-8. 100, 183-188 （2003））。この手順はアカゲザルＣＣＲ５でも行った。
【０１７２】
レンチウイルスベクター産生及びｓｈＲＮＡライブラリスクリーニング
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）−Ｇ偽型レンチウイルスベクターの４００個のクローンを、９６ウェルプレート中の２９３Ｔ細胞で個々に作製した。移植の４８時間後に、各ウェルからベクター上清を回収し、９６ウェルプレート中のＣＣＲ５ＮＫＲＣＥＭ細胞を感染させるのに使用した。ヒトＣＣＲ５（２Ｄ７ ＡＰＣ、BD Biosciences）に対するモノクローナル染色及びフローサイトメトリ解析によって、感染の３日後、ＥＧＦＰ＋細胞におけるＣＣＲ５発現の低減を解析した。それらのＣＣＲ５発現の低減能によって、ｓｉＲＮＡを同定した。
【０１７３】
ヒト及びアカゲザルのＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡ
同定したｓｉＲＮＡの中で、（ｈｕ１００５）で示されるヒトｓｈＲＮＡ、及びＣＣＲ５に対して指向性を有する対応するアカゲザル（ｒｈ１００５）ｓｈＲＮＡは、以下で示される特に望ましい特性を有することが見出された。ヒトＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）配列（ＲＮＡ）を配列番号１７に示す。ｓｈＲＮＡライブラリスクリーニングから同定したヒトＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）の標的配列は、５’ＧＡＧＣＡＡＧＣＵＣＡＧＵＵＵＡＣＡＣＣ３’（配列番号１６）であり、プラスミドＤＮＡにおけるＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）配列は配列番号１８に示す。アカゲザルＣＣＲ５
ｓｈＲＮＡ（ｒｈ１００５）配列（ＲＮＡ）は配列番号２０に示す。アカゲザルのＣＣＲ５ ｍＲＮＡにおける対応するアカゲザルｓｈＲＮＡ ＣＣＲ５（ｒｈ１００５）標的配列は、５’ＧＡＧＣＡＡＧＵＵＣＡＧＵＵＵＡＣＡＣＣ３’（配列番号１９）であり、プラスミドＤＮＡにおけるアカゲザルＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（１００５）配列は配列番号２１に示す。ハイブリッド形成したオリゴＤＮＡ（センス ５’−ｇａｔｃｃｃｃＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣ−ＴＴＧＴＣＣＧＡＣ−ＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＣ−ＴＴＴＴＴｃ−３’）（配列番号２８）（アンチセンス ３’−ｇｇｇＣＴＣＧＴＴＣＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＴＧＧ−ＡＡＣＡＧＧＣＴＧ−ＣＣＡＣＡＴＴＴＧＡＣＴＴＧＡＡＣＧＡＧ−ＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴ−５’）（配列番号２９）をｐＢＳｈＨ１〜３プラスミドＤＮＡに挿入することによって、アカゲザルＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ発現単位を生成した（X. F. Qin, D. S. An, I. S. Chen, D. Baltimore, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2003 Jan. 7;100（1）: 183.-8. 100, 183-188（2003））。シークエンシングに
よって、ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ配列を確認した。
【０１７４】
比較目的で使用したＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）の標的配列（配列番号１３）は、以前に記載されている（D. S. An et al., Mol.Ther. 14, 494-504 （2006）、その全体が参照により本明細書中に援用される）。ヒトＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）配列（ＲＮＡ）は配列番号１４に示し、プラスミドＤＮＡにおけるヒトＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）配列を配列番号１５に示す。
【０１７５】
ＳＩＶｍａｃ２５１ベースのレンチウイルスベクター構築
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入試験のため、ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ発現単位をＳＩＶベースのベクターに挿入するために、ｐＳＩＶ−ｇａｍｅｓ４に由来するｐＳＩＶ−Ｒ４ＳＡＷ１０において、ＣｌａＩ部位にオリゴＤＮＡを挿入することによって、ＸｂａＩ部位及びＸｈｏＩ部位を作製した（P. E. Mangeot et al., J.Virol. 74, 8307-8315 （2000）、P. E. Mangeot et al., Mol.Ther. 5, 283-290 （2002））。ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ発現単位は、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩの消化によってｐＢＳｈＨ１〜３から切り取り、ｐＳＩＶ−Ｒ４ＳＡＷ１０のＸｂａＩ部位及びＸｈｏＩ部位に挿入した。動物移植試験のためのＳＩＶベクターを構築するために、オリゴＤＮＡリンカー（＋鎖 ５’ＣＧＡＴＡＣＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＡＣＧＣ３’）（配列番号３０）（−鎖５’ＧＴＣＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＧＴＡＴ３’）（配列番号３１）を使用して、ｐＣＳ−Ｒｈ−ＭＬＶ−ＥプラスミドＤＮＡ（S. Kung, An D.S., Chen I.S.Y., J. Virol. 74, 3668-3681 （2000））から切り出したＲｈＭＬＶ ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列を含有するＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片をＳＩＶベクター（ｐＳＩＶ−ＲＭＥＳ ＧＡＥ）のＣｌａＩ／ＳａｌＩ部位に挿入した（P. E. Mangeot et al., Mol.Ther. 5, 283-290 （2002））。これにより、ベクターｐＳＩＶ ＧＡＥ ＲｈＭＬＶ−Ｅが得られた。ＥＧＦＰ発現は、ＲｈＭＬＶプロモーターを使用して、非ヒト霊長類のリンパ球で効率的に発現することが示されている（S. Kung, An D.S., Chen I.S.Y., J. Virol. 74, 3668-3681
（2000））。Ｈ１プロモーター−ｓｈＲＮＡ発現単位を含有する、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化したＤＮＡ断片を、ｐＳＩＶ−ＧＡＥ ＲｈＭＬＶ−ＥベクターのＲｈＭＬＶプロモーターの前にあるＡｖｒＩＩ部位及びＳａｌＩ部位に挿入し、最終のｐＳＩＶ ＧＡＥ
ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ ＲｈＭＬＶ−Ｅベクターが得られた。
【０１７６】
レンチウイルスベクター形質導入
ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルス／レンチウイルスベクターストックは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって作製した。要するに、１０％ ＦＣＳと、１００単位のペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを含有するイスコブ改変イーグル培地中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。ベクタープラスミドと、ＭＬＶパッケージングプラスミド（ｐＳＶ−ｐｓｉ−ｅｎｖ−ＭＬＶ）（Landau NR and Littman DR, J. Virol 66, 5110-5113 （1992））と、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド（ｐＨＣＭＶＧ）（J. K. Yee, T. Friedmann, J. C. Burns, Methods Cell Biol. 43 Pt A:99-112, 99-112 （1994））とを同時トランスフェクトすることによって、ｐＢａｂｅ−ｒｈＣＣＲ５レトロウイルスベクターを作製した。ベクタープラスミドと、ＨＩＶ−１レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＲＳＶＲＥＶ及びｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（T. Dull et al., J.Virol. 72, 8463-8471（1998））とを同時トランスフェクトすることによって、ＨＩＶベクターを作製した。記載のリン酸カルシウムトランスフェクションで、ＳＩＶベクター、ＳＩＶパッケージングベクターｐＳＩＶ１５、ｐＧＲＥＶ、ｐＳＩ−ｋ−ＶＰＸプラスミドのＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、ｐＨＣＭＶＧ ＳＩＶベースのベクターを作製した（P. E. Mangeot et al,, Mol.Ther. 5. 283-290 （2002））。トランスフェクションの２日後に、ウイルス培養上清を回収し、超遠心分離によって３００倍に濃縮した。ＥＧＦＰ発現に基づき、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で濃縮したウイルスストックを滴定した。
【０１７７】
細胞
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＶＳＶ−Ｇ偽型ｐＢａｂｅ−ｒｈＣＣＲ５レトロウイルスベクターを感染させた後、ピューロマイシン選択することよって（１ｕｇ／ｍｌ）、ｒｈＣＣＲ５−２９３Ｔ細胞を作製した。NIHのＡＩＤＳ試薬プログラムからＣＣＲ５−ＮＫＲ−ＣＥＭを取得した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（GE healthcare life sciences）によるロイコパックからヒト初代末梢血単核細胞を単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳによって、アカゲザル初代末梢血単核細胞を末梢血から単離した。
【０１７８】
アカゲザル細胞の形質導入及び移植
使用する動物は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（National
Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）（保険社会福祉省［ＤＨＨＳ］公開番号ＮＩＨ８５−２３）のガイドラインに従って維持及び使用された集団飼育したアカゲザル（マカク・ムラット（Macaca mulatto：アカゲザル））であった。このプロトコルは、国立心肺血液研究所の動物実験委員会（Animal Care and Use Committee of National Heart, Lung, and Blood Institute）、ＮＩＨ／ＤＨＨＳで認可された。動物には、特定の病原菌が存在しなかった（サルＴ−リンパ向性ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルレトロウイルス及びヘルペスウイルスＢに対して血清学的に陰性であった）。
【０１７９】
ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞を末梢血（ＰＢ）に動員し、上記のように精製した（W. E. Sander et al., J.Nucl.Med. 47, 1212-1219（2006））。ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ、Cambrex Bio Science）を有するＸ−Ｖｉｖｏ １０血清無含有培地（BioWhittaker）中、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において、２日間１日１回、２．４の感染多重度で、ＶＳＶ−Ｇ偽型ＳＩＶ ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ ＲｈＭＬＶ−Ｅベクターを用いてｅｘ ｖｉｖｏで２匹の動物由来のＰＢのＣＤ３４+細胞（ＲＱ３５７０動物及びＲＱ５４２７動物それぞれに関して、７×１０7個及び１×１０8個）を形質導入した。１回目の形質導入の６４時間後のフローサイトメトリによるＥＧＦＰ発現の定量化によって形質導入効率を解析した。ＲＱ３５７０動物及びＲＱ５４２７動物でそれぞれ、細胞の１８％及び７．４％がＥＧＦＰ陽性であった。２匹の動物に１．６×１０8個の形質導入したＰＢ ＣＤ３４+細胞を自己移植した。全ての動物に、移植前に２日連続して（−１日目及び０日目、０日目は再注入の日である）、５Ｇｙの分割線量で全身に１０Ｇｙのγ線を照射し、動物を抗生物質、血液、及びしたがって流体支持体によって支持した。
【０１８０】
モノクローナル抗体及び染色法及びフローサイトメトリ解析
全血染色法を使用して、末梢血リンパ球中のモノクローナル抗体によって細胞表面上のＣＣＲ５を検出した（B. Lee, M. Sharron, L. J. Montaner, D. Weissman, R. W. Doms,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 96, 5215-5220 （1999））。要するに、ＥＤＴＡ処理全血を遠心分離して、血漿を除去した。濃縮血液（packed blood）５０μｌをモノクローナル抗体と混合し、室温で３０分間染色した後、塩化アンモニウム媒介性の赤血球溶解を行ない、ＰＢＳ中で２％ホルムアルデヒドによって固定した。ｅｘ ｖｉｖｏでのＰＨＡ／ＩＬ２刺激細胞の染色のために、ＰＢＳ １００μｌの入った２％ＦＣＳ中で、細胞（１×１０5個）を抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体（ヒトでは２Ｄ７）（アカゲザルでは３Ａ９）５μｌと混合し、室温で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳの入った２％ＦＣＳで洗浄し、２％ホルムアルデヒドの入ったＰＢＳで固定した。この試験で使用するモノクローナル抗体は、抗ヒトＣＣＲ５（２Ｄ７ ＡＰＣ、５５６９０３、BD Biosciences）、アカゲザルＣＣＲ５（３Ａ９ ＡＰＣ、５５０５８６、BD Biosciences）、ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ（５５０６３１、BD Biosciences）、ＣＤ８ＰＥ（５５５３６７、BD Biosciences）
、ＣＸＣＲ４ ＰＥ（５５５９７４、BD Biosciences）、ＣＤ４５ＲＯ ＰＥ−Ｃｙ７（３３７１６７、BD Biosciences）、ＣＤ９５ ＰＥ（５５６６４１、BD Biosciences）を含んでいた。ＦＡＣＳキャリバー（BD Biosciences）又はＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Beckman Coulter）によって、染色細胞を解析した。
【０１８１】
細胞選別
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（GE Healthcare Life Sciences）によって、末梢血由来の単核細胞を単離し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ細胞選別装置（BD Biosciences）によって、ＥＧＦＰ＋リンパ球集団及びＥＧＦＰ−リンパ球集団を単離した。選別細胞のフローサイトメトリ解析によって求められるように、ＥＧＦＰ＋集団及びＥＧＦＰ−集団の選別純度はそれぞれ、９２％及び９６％であった。
【０１８２】
小ＲＮＡ単離
製造業者の取扱説明書に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Invitrogen）を使用して刺激の９日後に、小ＲＮＡ分画をＰＨＡ／ＩＬ２刺激アカゲザル（rhesus monkey）の末梢血リンパ球（約４×１０8個の細胞）から単離した。
【０１８３】
ｓｉＲＮＡのノーザンブロット解析
分画化した小ＲＮＡ ２５μｇを１５％尿素−アクリルアミド−ＴＢＥゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ、National diagnostics）上に分散させ、０．５×ＴＢＥ中で１時間８０ボルトでナイロン膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ、NEN）に電気移動（electrotransferred：エレクトロトランスファー）させた。膜を乾燥させ、ＵＶ架橋して、１時間８０℃で焼成した。製造業者の取扱説明書に従って、Ｓｔａｒｆｉｒｅオリゴキット（Integrated
DNA Technologies）及びα−32Ｐ ｄＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、PerkinElmer）を使用して、オリゴヌクレオチドプローブ（センス：ＧＡＧ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＡＧ ＴＴＴ ＡＣＡ ＣＣ（配列番号３２）、アンチセンス：ＧＧＴ ＧＴＡ ＡＡＣ ＴＧＡ ＡＣＴ ＴＧＣ ＴＣ）（配列番号３３）を標識した。ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）−オリゴ（Ambion）中で一晩３７℃で、プローブを膜とハイブリッド形成させた。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間３７℃で３回膜を洗浄した。ブロットをホスホルイメージングプレートに曝露した後、標準として合成ｒｈＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡ（ＧＧＵ ＧＵＡ ＡＡＣ ＵＧＡ ＡＣＵ ＵＧＣ ＵＣ（配列番号３４）、Sigma-Proligo）でのホスホルイメージャ（phosphorimager）（ストームシステム、Molecular Dynamics）を使用する解析によって、シグナル検出及びノーザンブロット解析を実施した。
【０１８４】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析
公開されたプライマー対及びプローブを利用して、アカゲザルＣＣＲ５ ｍＲＮＡ及びβ２ミクログロブリンを検出した（J. J. Mattapallil et al.434,1093-1097, Nature, （2005））。トリゾール試薬（Invitrogen）によって、全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を選別したＥＧＦＰ＋アカゲザルＰＢＬ又はＥＧＦＰ−アカゲザルＰＢＬから単離し、Qiagenの一工程ＲＴ−ＰＣＲキット及び以下の条件（ＲＴ反応で５０℃、３０分及び５５℃、１０分、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＲＴ不活性化及び活性化で９５℃、１５分、ＰＣＲで９５℃、１５秒、５５℃、３０秒及び６０℃、９０秒を５０サイクル）を使用して、ＲＴ ＰＣＲ反応にかけた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ
Ｔ７、Ambion）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したアカゲザルＣＣＲ５及びβ２ミクログロブリンのＲＮＡを段階希釈することによって、ＣＣＲ５及びβ２ミクログロブリンのｍＲＮＡ定量化のためのＲＮＡ標準を作製した。
【０１８５】
ｓｉＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析
リアルタイムステム−ループＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、アカゲザルＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のレベルを定量した（C. Chen et al., Nucleic Acids Res.
33, e179 （2005））。トリゾール試薬（Invitrogen）によって、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）をアカゲザルＰＢＬから単離し、ＲＴ反応（１６℃３０分、４２℃３０分、８５℃５分）にかけた後、ＰＣＲ（９５℃１０分を１サイクル、９５℃１５秒及び５８℃１分を５０サイクル）を行った。プライマー及びプローブの配列は以下の通りである。ＲＴステムループプライマー：５’ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡ３’（配列番号３５）、フォワードプライマー：５’ＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＣ３’（配列番号３６）、リバースプライマー：５’ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ（配列番号３７）；プローブ：６−ＦＡＭ−ＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡ−ＭＧＢ（配列番号３８）。ｒｈＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡの段階希釈した合成２２ｎｔアンチセンス鎖の組（ＧＧＵ ＧＵＡ ＡＡＣ ＵＧＡ ＡＣＵ ＵＧＣ ＵＣ、Sigma-Proligo）（配列番号３９）を定量のための標準として使用した。
【０１８６】
ＳＩＶ産生及び感染
選別したＥＧＦＰ＋アカゲザルＰＢＬ又はＥＧＦＰ−アカゲザルＰＢＬをＰＨＡ（５ｕｇ／ｍｌ、Sigma）及びＩＬ２（濃縮）で２日間刺激した。それからＰＨＡを除去し、細胞をＩＬ２でさらに２日間刺激した。細胞（１×１０5個）に、３７℃で１時間ＳＩＶｍａｃ２３９（０．０４の感染多重度）１００ｕｌを感染させ、２％ＦＣＳの入ったＰＢＳで２回洗浄し、媒体で１回洗浄して、ＩＬ２の入ったＲＰＭＩ ２０％ＦＣＳ中で再懸濁し、培養した。
【０１８７】
産生したウイルスをＣＥＭＸ１７４細胞で伝播した。ＳｐｈＩ消化によって線形化したＳＩＶｍａｃ２３９プラスミドＤＮＡの５’側の半分と３’側の半分とをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。記載のように、ＭＡＧＩ ＣＣＲ５細胞で、ウイルスストックの感染力価を求めた（４×１０4感染単位／ｍｌ）（ｐ２７値＝７２ｎｇ／ｍｌ）（B. Chackerian, E. M. Long, P. A. Luciw, J. Overbaugh, J.Virol. 71 , 3932-3939（1997））。
【０１８８】
ＥＬＩＳＡ
製造業者の取扱説明書に従って、ＣＯＵＬＴＥＲ ＳＩＶコア抗原アッセイを使用して、ＳＩＶ感染培養上清におけるＳＩＶ ｐ２７コア抗原のレベルを測定した（カタログ番号６６０４３９５、Beckman Coulter）。
【０１８９】
実施例９
ヒトＣＣＲ５配列に対して指向性を有するｓｈＲＮＡのランダムライブラリをスクリーニングし、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において明確な毒性はなく、図１６Ａ〜図１６Ｂで示されるように、今日までに特徴付けられたｓｈＲＮＡの中でＣＣＲ５を阻害するのに最も強力であった、標的配列を含むｓｉＲＮＡを同定した（標識ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５））（配列番号１６）。これまでに記載の強力なｓｈＲＮＡとは異なり（D. S. An et al., Mol. Ther. 14, 494-504（2006））、このｓｉＲＮＡ（配列番号１７）の発現は、１２日の培養期間にわたり形質導入Ｔリンパ球の増殖速度を変えなかった。
【０１９０】
ＣＥＭ−ＮＫＲ−ＣＣＲ５細胞に、９６ウェルプレートにおいてヒトＣＣＲ５に対してランダムｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを形質導入し、３日間培養して、ＧＦＰ−発現集団におけるＣＣＲ５発現に関して、フローサイトメトリによって解析した。図１６Ａで示されるように、スクリーニングした４００個のｓｈＲＮＡのうち、ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）は、これまでに公開されたｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）（配列番号１４）よりも効率的にＣＣＲ５を低減した。図１６Ｂは、ヒト初代リンパ球（ｈｕＰＢＬ）において内因性ＣＣＲ５発現の効率的な低減を示すデータを示す。ＰＨＡ
／ＩＬ２活性化ｈｕＰＢＬに、ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）を保有するレンチウイルスベクターを形質導入し、モノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリによって、ＧＦＰ＋集団におけるＣＣＲ５発現に関して感染の８日後に解析した。ＧＦＰ＋集団におけるＣＣＲ５発現の割合を算出し、それぞれのパネルの上部に示した。図１６〜図１７に示されるように、「Ｍｏｃｋ」という表示はベクターの形質導入がないことを示している。「ｓｈＲＮＡなし」という表示は、ｓｈＲＮＡ発現がないベクターの形質導入を示している。
【０１９１】
実施例１０
本実施例において、アカゲザルＣＣＲ５（ｒｈ１００５）（配列番号２０）に対するｓｈＲＮＡをｒｈＣＣＲ５発現２９３Ｔ細胞で調べた。アカゲザルＣＣＲ５（ｒｈ１００５）ｓｈＲＮＡ（配列番号２０）は、ヒトＣＣＲ５（ｈｕ１００５）とは２つのヌクレオチドが異なり、ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれで単一ヌクレオチドの違いがある。アカゲザル造血幹細胞移植モデルはおそらく、ヒトにおける造血幹細胞移植に最も近いモデルである。細胞にｒｈＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡ（１００５）（配列番号２０）を保有するＳＩＶベースのレンチウイルスベクターを形質導入し、形質導入の４日後にモノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリによって、ＣＣＲ５及びＧＦＰの発現に関して解析した。図１７Ａで示されるように、ｒｈＣＣＲ５のｓｈＲＮＡは、ｒｈＣＣＲ５−２９３Ｔ細胞におけるｒｈＣＣＲ５発現を低減したが、図１７Ａで示されるように、標的配列における単一ヌクレオチドミスマッチのために、ヒトＣＣＲ５発現ＣＣＲ５ＮＫＲＣＥＭ細胞においてヒトＣＣＲ５を低減しなかった。同様に、ｈｕＣＣＲ５のｓｈＲＮＡはヒトＣＣＲ５を低減したが、アカゲザルＣＣＲ５は低減しなかった。相同的なヒトＣＣＲ５のｓｈＲＮＡと同じように、明らかな細胞毒性は存在しなかった（データ図示せず）。
【０１９２】
実施例１１
末梢血動員アカゲザルＣＤ３４＋細胞に形質導入した後、骨髄除去動物に自己移植することによって、アカゲザルＣＣＲ５のｓｈＲＮＡ（ｒｈ１００５）（配列番号２０）の機能及び安全性を調べた。本実施例では、ＰＨＡ／ＩＬ２活性化初代アカゲザルリンパ球に、アカゲザルＣＣＲ５（ｒｈ１００５）（配列番号２０）に対するｓｈＲＮＡを発現するＳＩＶベクター発現を感染させ、ＧＦＰ＋細胞及びＧＦＰ−細胞において、フローサイトメトリによって、ＣＣＲ５発現を解析した。ホタルルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを発現するベクターを対照として使用した。また図１７Ｂで示されるように、初代アカゲザルＰＢＭＣにおけるＲｈＣＣＲ５のｓｈＲＮＡによって、ＣＣＲ５発現を阻害した。
【０１９３】
続いて、２匹のアカゲザル（ＲＱ３５７０及びＲＱ５４２７）に、このベクターを形質導入したＣＤ３４＋ ＨＳＣ細胞を移植した。２匹の動物由来の非ヒト霊長類の動員及び免疫選択したＰＢ ＣＤ３４＋細胞に、ｅｘ ｖｉｖｏで血清無含有培地中で、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２日間１日１回、２．４の感染多重度でベクター（ＳＩＶ ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ ＲｈＭＬＶ−Ｅ）をｅｘ ｖｉｖｏ形質導入した。１回目の形質導入の６４時間後のフローサイトメトリによるＥＧＦＰ発現の定量化によって形質導入効率を解析した。ＲＱ３５７０動物及びＲＱ５４２７動物でそれぞれ、細胞の１８％及び７．４％がＥＧＦＰ陽性であった。２匹の動物に１．６×１０8個の形質導入したＰＢ ＣＤ３４＋細胞を自己移植した。全ての動物に、移植前に２日連続して（−１日目及び０日目、０日目は再注入の日である）、５Ｇｙの分割線量で全身に１０Ｇｙのγ線を照射した。白血球数は、７日目〜８日目の間に、１０００細胞数／μｌまで回復し、血小板数は５００００個／μｌ未満になることはなかった）。今までベクターにおけるＥＧＦＰレポーターによるフローサイトメトリ解析でモニタリングされたような正常な速度及びマーキングは、１１ヶ月間、顆粒球、単球及びリンパ球系統（それぞれ、白色四角、黒色四角及び黒色三角の集団で示される）で観察された（図１８Ａ
）。
【０１９４】
図１８Ｂで示されるように、ＣＣＲ５の細胞表面発現は、検査した全ての時点（移植後、最大９ヶ月）でＥＧＦＰ−集団に比べてＥＧＦＰ＋集団の方が低減した。ＣＣＲ５下方調節の程度は、３倍〜１０倍の範囲だった。これに対して、ＥＧＦＰを発現するが、ｓｈＲＮＡを有さないレンチウイルスベクターを移植した対照動物２ＲＣ００３は、任意の時点でＣＣＲ５下方調節の痕跡を示していなかった。図１８Ｂは、フローサイトメトリによってモニタリングされたＧＦＰ＋細胞（黒色グラフ）及びＧＦＰ−細胞（灰色グラフ）におけるＣＣＲ５発現の割合を示している。
【０１９５】
移植マカク由来の末梢血をＣＣＲ５に対して染色し、リンパ球集団におけるＣＣＲ５及びＥＧＦＰの発現をフローサイトメトリで解析した。図１８Ｃの（それぞれの象限で示される）それぞれの象限での事象の割合に基づき、ＧＦＰ＋リンパ球集団及びＧＦＰ−リンパ球集団におけるＣＣＲ５発現の割合を算出し、それぞれのパネル図の上部に示す。ＥＧＦＰ＋細胞で、ＣＣＲ５のｍＲＮＡレベルの５倍〜１０倍の低減が見られ、これはＣＣＲ５細胞表面発現のフローサイトメトリ解析に一致していた（データ図示せず）。
【０１９６】
１匹の移植アカゲザル由来のリンパ球のマイクロノーザンブロット解析は、ｓｈＲＮＡ形質導入動物ＲＱ３５７０由来のＰＨＡ／ＩＬ２刺激リンパ球の小ＲＮＡ分画において、ＣＣＲ５のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に対応する２２ヌクレオチドバンドが存在し（図１８Ｄ）、対照動物２ＲＣ００３由来の細胞では存在しなかったことを示した。ＲＴ−ＰＣＲによるｓｉＲＮＡのレベルのさらなる定量は、１つのＥＧＦＰ＋細胞当たりおよそ３×１０4個のｓｉＲＮＡ分子の発現を示し、これは両方の動物で一致していた。この数は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入されたアカゲザルＰＢＬから発現されたｓｉＲＮＡのレベルにも一致する（データ図示せず）。
【０１９７】
重要なことに、造血細胞分化による１１ヶ月間のこの試験にわたるＣＣＲ５のｓｉＲＮＡの発現にもかかわらず、明らかな毒性は見られなかった。正常な速度での移植後に、顕著に細胞レベルが増大し、試験の間、１４ヶ月にわたり安定していた。図１９Ａ〜図１９Ｃに示されるように、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＸＣＲ４ケモカイン（ｃ−ｘ−ｃモチーフ）受容体４、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ９５（ｆａｓ）のフローサイトメトリプロファイルは、ＥＧＦＰ＋亜集団及びＥＧＦＰ−亜集団とほぼ同一である。ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ９５−細胞は、天然Ｔリンパ球集団を表すが、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ９５＋は記憶Ｔリンパ球集団を表す（J. J. Mattapallil et al. 434, 1093-1097, Nature, （2005））。図２０で示されるように、ＥＧＦＰ標識したリンパ球は、培養下で非形質導入細胞と同じ速度でＰＨＡ及びＩＬ２刺激に対して正常に応答し、最大１２日間、同じ頻度で維持される。図２１で示されるように、ＥＧＦＰ−集団ではＣＣＲ５の全体発現が、細胞集団の５％〜３５％増大するにもかかわらず、ＥＧＦＰ＋集団でのＣＣＲ５表面発現の低減は、ｅｘ ｖｉｖｏ培養と同じ期間持続する。
【０１９８】
次に、サル免疫不全ウイルス感染に対するアカゲザルＰＢＬの感受性を調べた。移植の１３ヵ月後のＲＱ３５７０由来の末梢血リンパ球を、ＧＦＰ＋集団及びＧＦＰ−集団で分け、２日間、ＰＨＡ／ＩＬ２で、及び２日間、ＩＬ２で刺激した。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−の選別純度はそれぞれ、９３．４％及び９９．９％であった。刺激後、０．０４の感染多重度（ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５細胞での滴定によるウイルスストックの感染単位は４×１０4／ｍｌであった）で１時間、１×１０5個のＧＦＰ＋細胞又はＧＦＰ−細胞にＳＩＶｍａｃ２３９ １００μｌを感染させ、培養下で、１１日間ｐ２７産生に関してモニタリングした。感染実験を三重で行った。培養上清中の平均ｐ２７産生（ｎｇ／ｍｌ）及び誤差バー（標準偏差）を図２２Ａに示す。細胞数に基づき、同程度の効率で両方の亜集団を増殖した。
【０１９９】
図２２Ｂは、フローサイトメトリ解析によって、ｅｘ ｖｉｖｏ培養中にモニタリングし、ＧＦＰ＋選別リンパ球集団（黒色グラフ）とＧＦＰ−選別リンパ球集団（灰色グラフ）との間で比較したＣＣＲ５発現を示している。感染時でのＣＣＲ５発現の割合及びＭＦＩは、ＧＦＰ＋集団で４％及び９．９％であり、ＧＦＰ−集団で８％及び１６．２％であった。図２２Ｃで示されるように、９日の培養期間にわたって、細胞のＧＦＰ＋集団は、ＧＦＰ−集団よりも約３倍低いレベルのＳＩＶｍａｃ２３９ ｐ２７抗原を産生した。ＣＣＲ５発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＧＦＰ＋選別細胞では黒色グラフで示し、ＧＦＰ−選別細胞（ＰＨＡ／ＩＬ２活性化リンパ球）では灰色グラフで示す。耐性度は比較的軽微であったが（培養中、３倍）、ＣＣＲ５レベルが、レクチン／ＩＬ−２刺激のために、ｅｘ ｖｉｖｏで有意に増大したことに留意することが重要である。さらに、ＣＣＲ５がＳＩＶ侵入に対する主要且つ最も有効な補助受容体として報告されているが、ＣＣＲ５が存在しないとき、ＳＩＶは、他の補助受容体を利用することが報告されている（例えばP. A. Marx and Z. Chen, Semin. Immunol. 10, 215-223（1998）を参照されたい）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、ＲＮＡ分子を送達するように、及びより具体的には遺伝子発現を下方調節又は調整するのに使用することができる二本鎖ＲＮＡ分子を送達するように、改変されたウイルス構築物を使用して、細胞又は動物において遺伝子発現を変える方法に関する。本発明の特定の態様は、ＲＮＡ分子を発現するように改変されたウイルス構築物の送達を介して、病原性ウイルス遺伝子又は病原性ウイルスのライフサイクルに必要な遺伝子を低下するように調節することに関する。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡ分子は、標的細胞に対して毒性ではない。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００２年９月１３日に出願した米国特許出願第１０／２４３，５５３号明細書の一部継続出願である、２００２年１２月１２日に出願した米国特許出願第１０／３１９，３４１号明細書の一部継続出願であり、２００１年９月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／３２２，０３１号明細書、２００２年１月９日に出願した米国仮特許出願第６０／３４７，７８２号明細書、２００２年６月１８日に出願した米国仮特許出願第６０／３８９，５９２号明細書、及び２００２年８月２７日に出願した米国仮特許出願第６０／４０６，４３６号明細書に対する優先権を主張する。優先出願は全て、その全体が参照により援用される。
【０００３】
［政府援助］
本発明は、国立衛生研究所より授与された補助金番号ＧＭ３９４５８、ＡＩ５５２８１−０３、及びＡＩ３９９７５−０５の下で政府の支援を用いて為された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又はサイレンシングは、近年発見された現象である（非特許文献１、非特許文献２）。低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）とは、それらが相同性を示す遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、様々な培養細胞並びに無脊椎動物で、特定遺伝子の発現を低下するように調節するための道具として使用されてきた。このようなアプローチの多くは、最近概説されている（非特許文献３）。しかし、このようなアプローチには限界がある。例えば、本明細書中に記載される本発明以前には、ＲＮＡ干渉を通じて低下するように調節された特定の遺伝子を有するトランスジェニック哺乳類の発生を可能にする技法はない。同様に、調節機能を有する小ＲＮＡ分子を導入するためのより堅実な方法が必要とされている。本明細書中に提供される本発明は、ＲＮＡ介在性遺伝子調節の分野でのこれら及び他の制限に対処する。同じく、ウイルス及びウイルス感染に関連する疾患の治療には、方法及び組成物の改良が必要である。
【０００５】
標的細胞における小ＲＮＡ分子の細胞毒性及び他の有害作用が、当該技術分野で言及され、ｓｉＲＮＡの発現レベルと相関付けられている（非特許文献４）。小ＲＮＡ分子を発現するのにより弱いプロモーターを利用すると、明らかな毒性の低減を示すが、ｓｉＲＮＡの有効性も弱くなった。
【０００６】
研究によって、例えば、インターフェロン応答遺伝子の導入（非特許文献５を参照されたい）、オフターゲット（off target）効果によって引き起こされるｍＲＮＡ発現プロファイルの全体的変化（非特許文献６を参照されたい）及びマイクロＲＮＡ異常調節による細胞毒性作用（非特許文献７）等の有害作用が報告されている。またｓｈＲＮＡ発現の際、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したヒトＴリンパ球で、細胞毒性作用が観察された（非特許文
献４）。例えばＨＩＶ−１疾患に対して細胞内免疫付与を達成するために、ｓｉＲＮＡ発現が長期間にわたって安定して生体中に維持される状況では、ｓｉＲＮＡの任意の細胞毒性作用が特に問題になる可能性がある（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. Fire et al., Nature 391, 806（1998）
【非特許文献２】C. E. Rocheleau et al. Cell 90, 707（1997）
【非特許文献３】P. D. Zamore, Science 296, 1265（2002）
【非特許文献４】D. S. An et al., Mol. Ther. 14, 494-504（2006）
【非特許文献５】R. J. Fish and E. K. Kruithof, BMC. Mol. Biol. 5, 9 （2004）
【非特許文献６】A. L. Jackson et al., RNA. 12, 1179-1187 （2006）
【非特許文献７】D. Grimm et al., Nature. 441, 537-541 （2006）
【非特許文献８】D. Baltimore, Nature 335, 395-396 （1988）
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、概して、細胞内でＲＮＡ分子（単数又は複数）を発現させる方法に関する。これらの方法は、多様な細胞型及び多様な目的で使用され得る。例えば、ＲＮＡ分子は、細胞内でマーカーとなり、遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムであり、ＲＮＡ干渉を通じて遺伝子を低下するように調節するために役立ち得る。
【０００９】
一態様において、標的核酸（ウイルスゲノム、ウイルス性転写物、又はウイルス複製に必要な宿主細胞遺伝子等）のＲＮＡ干渉を通じて病原菌のライフサイクルの１つ又は複数の局面を阻害する、１つ又は複数のＲＮＡ分子の発現によって感染を治療又は予防する方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡ分子を発現させる方法が提供され、本方法は、パッケージング細胞株にレトロウイルス構築物をトランスフェクトすること、及びパッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収することを含む。それから、宿主細胞に組換えレトロウイルスを感染させる。
【００１１】
組換えレトロウイルス構築物は、好ましくは、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、少なくとも１つのＲＮＡコード領域、及び少なくとも１つの終結配列を有する。ＲＮＡコード領域は、好ましくは、標的核酸内の標的配列と少なくとも約９０％同一である配列を含む。好ましくは、標的核酸は、病原菌（例えば、病原性ウイルスＲＮＡゲノム若しくはゲノム転写物の一部分、又は病原性ウイルスのライフサイクルに関与する標的細胞遺伝子の一部分）のライフサイクルに必要なものである。
【００１２】
一実施の形態において、本発明の方法は、病原菌のライフサイクルを破壊するために使用される。詳細な実施の形態において、本方法は、直接ＲＮＡゲノムを標的とすることにより、ＲＮＡゲノムを有するウイルス（例えば、レトロウイルス）のライフサイクルを破壊するために使用される。別の実施の形態において、個別のウイルス遺伝子の転写物を含むウイルスゲノム転写物が標的となる。本方法はまた、宿主細胞で遺伝子を低下するように調節するために使用することができ、ここで遺伝子は、ウイルスのライフサイクルに関与する（例えば、宿主細胞内へウイルスが入るのに必要な受容体又は補助受容体）。
【００１３】
幾つかの実施の形態において、ＲＮＡコード領域は、ｓｉＲＮＡ、好ましくはセンス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有する自己相補的な「ヘアピン」ＲＮＡ分子をコードする。ループ領域は一般に、約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長であり
、さらに好適な実施の形態では約６ヌクレオチド長〜約９ヌクレオチド長である。ヘアピン分子の二本鎖領域は、標的配列と相同なヌクレオチド配列を含む。ヘアピン分子中の配列は、標的配列と、好ましくは少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは少なくとも約９５％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも約９９％同一である。
【００１４】
他の実施の形態において、ＲＮＡコード領域は第１のＲＮＡ分子をコードし、レトロウイルス構築物は第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター及び第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに操作可能に連結した第２のＲＮＡコード領域を有する。このような実施の形態では、第２のＲＮＡコード領域は、第１のＲＮＡ分子と実質的に相補的なＲＮＡ分子をコードする。第１及び第２のＲＮＡコード領域の発現に際して、二本鎖複合体が細胞内で形成される。
【００１５】
さらに別の実施の形態において、レトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第１のＲＮＡ分子の合成をもたらし、且つ第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第１のＲＮＡ分子と実質的に相補的な第２のＲＮＡ分子の合成をもたらすように、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域を有し得る。このような一実施の形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列によりＲＮＡコード領域と分離されている。
【００１６】
本発明の一実施の形態において、標的細胞は胚細胞である。本明細書中に使用される胚細胞は、単細胞胚、及び初期胚内の胚細胞を含む。標的細胞は胚形成幹細胞であってもよい。標的細胞が胚細胞である場合、胚細胞は、組換えレトロウイルスを哺乳類胚細胞の透明帯と細胞膜との間に注入することにより、感染させられ得る。別の実施の形態では、胚細胞は、透明帯を除去して、組換えレトロウイルスを含有する溶液中で細胞をインキュベートすることにより感染させられ得る。このような実施の形態では、透明帯は、酵素的消化により除去され得る。標的細胞が胚細胞又は胚形成幹細胞である場合、本発明の方法は、偽妊娠のメスに胚細胞を移植してトランスジェニック動物を発生させることも含む。このような様式において、特定の病原菌（ウイルス等）に耐性であるトランスジェニック動物を発生することができる。
【００１７】
本発明の方法はまた、様々な初代細胞、ｅｘ ｖｉｖｏ正常細胞若しくは疾患細胞、又は様々な組織培養条件に適合した細胞で使用され得る。細胞は、好ましくは、ヒト、マウス、又は他の脊椎動物から得られる。細胞は、造血幹細胞若しくは前駆体細胞、中枢神経系細胞、様々な他の組織及び器官の再生能を有する細胞、樹状細胞並びに他の発達中及び成熟した骨髄細胞及びリンパ系細胞、並びに異なる細胞系由来の癌細胞を含み得るが、これらに限定されない。
【００１８】
別の態様において、本発明は、細胞内でのＲＮＡ分子（単数又は複数）発現のためのレトロウイルス構築物を提供する。構築物は、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを含む。一実施の形態においてレトロウイルス構築物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと操作可能に連結したＲＮＡコード領域を有する。ＲＮＡコード領域の直後にｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列が続き、ｐｏｌ ＩＩＩによるＲＮＡ合成の終結に関する。ｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列は一般に、４つ以上の連続したチミジン（「Ｔ」）残基を有する。好適な実施の形態において、５個の連続したＴのクラスターがターミネーターとして使用され、これによりｐｏｌ ＩＩＩ転写はＤＮＡテンプレートの二番目又は三番目のＴで止まり、したがって２つ又は３つのウリジン（「Ｕ」）残基のみがコード配列の３’末端に付加される。様々なｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを本発明で使用することができ、例えば、ヒト若しくはマウス起源のＨ１ ＲＮＡ遺伝子若しくはＵ６ ｓｎＲＮＡ遺伝子由来、又は任意の他の種由来のプロモーター断片
を含む。また、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、他の望ましい性質（遍在性又は組織特異的様式のいずれかで小化学分子により誘発される能力等）を取り込むように修飾／操作され得る。例えば、一実施の形態において、プロモーターはテトラサイクリンにより活性化されてもよい。別の実施の形態において、プロモーターはＩＰＴＧ（ｌａｃＩ系）により活性化されてもよい。
【００１９】
レトロウイルス構築物は、多数のレトロウイルスベクターに基づき得る。好適な実施の形態において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５’長末端反復（long terminal repeat）（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列を有する。別の実施の形態において、レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来する。さらに別の実施の形態において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス及びＭＳＣＶ構築物のハイブリッドである。
【００２０】
さらなる実施の形態において、ＲＮＡコード領域は、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有する自己相補的なＲＮＡ分子をコードする。このようなＲＮＡ分子は、発現した場合、好ましくは「ヘアピン」構造を形成する。ループ領域は一般に、約２ヌクレオチド長〜１５ヌクレオチド長である。好適な実施の形態において、ループ領域は６ヌクレオチド長〜９ヌクレオチド長である。本発明のこのような一実施の形態において、センス領域及びアンチセンス領域は、約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長の間である。一実施の形態において、本発明のこの実施の形態のＲＮＡコード領域は、いかなる余計な非コードヌクレオチドも５’末端に存在せずにＲＮＡコード配列が正確に発現され得る（すなわち、発現した配列は標的配列と５’末端で同一である）ように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの下流に操作可能に連結される。ＲＮＡコード領域の合成は、ターミネーター部位で終了する。好ましい一実施の形態において、ターミネーターは５個の連続したＴ残基を有する。
【００２１】
本発明の別の態様において、レトロウイルスベクターは複数のＲＮＡコード領域を含み得る。このような一実施の形態において、ＲＮＡコード領域は第１のＲＮＡ分子をコードし、レトロウイルス構築物は、第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター及び第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに操作可能に連結された第２のＲＮＡコード領域を有する。この実施の形態において、第２のＲＮＡ分子は、発現した時に第１及び第２のＲＮＡ分子が二本鎖構造を形成し得るように、実質的に第１のＲＮＡ分子と相補的であり得る。ＲＮＡ複合体の二本鎖領域は、ウイルスゲノム、ウイルスゲノム転写物、又は病原性ウイルスのライフサイクルに必要なタンパク質をコードする標的細胞ＲＮＡのいずれかの標的領域と少なくとも約９０％同一である。本発明の方法はまた、ヘアピン様の自己相補的なＲＮＡ分子又は他の非ヘアピン分子をコードする複数のＲＮＡコード領域を含む。
【００２２】
本発明のさらに別の実施の形態において、レトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現がセンス鎖としての第１のＲＮＡ分子の合成をもたらし、且つ第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第１のＲＮＡ分子と実質的に相補的であるアンチセンス鎖としての第２のＲＮＡ分子の合成をもたらすように、反対方向で同じＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有する。このような実施の形態において、両方のＲＮＡ分子は、終結配列によりコードされる３’オーバーハングの残基を含有し得る。一実施の形態において、両方のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列によりＲＮＡコード領域と分離されている。終結配列は５個の連続したＴ残基を有することが好ましい。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、５’ＬＴＲ配列はＨＩＶに由来し得る。レトロウイルス構築物はまた、ウッドチャック肝炎ウイルスエンハンサー因子配列及び／又はｔＲＮＡアン
バー抑制因子配列を有し得る。
【００２４】
本発明の一実施の形態において、自己不活性化３’ＬＴＲはエンハンサー配列が欠失したＵ３因子であり得る。さらに別の実施の形態において、自己不活性化３’ＬＴＲは修飾ＨＩＶ３’ＬＴＲである。
【００２５】
組換えレトロウイルス構築物は、例えば、水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって偽型とすることが可能である。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、ウイルス構築物はまた、対象の遺伝子をコードし得る。対象の遺伝子は、ポリメラーゼＩＩプロモーターに連結し得る。様々なポリメラーゼＩＩプロモーターを本発明で使用することができ、例えば、ＣＭＶプロモーターを含む。選択されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、大部分の組織で発現を駆動することが可能な遍在性プロモーター（例えば、ヒトユビキチン−Ｃプロモーター、ＣＭＶβ−アクチンプロモーター、及びＰＧＫプロモーター）であり得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターはまた、組織特異的プロモーターであり得る。このような構築物はまた、例えば、ポリメラーゼＩＩプロモーターと操作可能に連結したエンハンサー配列を含有し得る。
【００２７】
一実施の形態において、対象の遺伝子は、ベクターが首尾よくトランスフェクト又は形質導入されて、その配列が発現したことを確認するために使用され得るマーカー又はレポーター遺伝子である。このような一実施の形態において、対象の遺伝子は蛍光レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）である。さらに別の実施の形態において、対象の遺伝子は、首尾よく形質導入された細胞を選択するために使用され得る薬物耐性遺伝子である。例えば、薬物耐性遺伝子は、ゼオシン耐性遺伝子（ｚｅｏ）であり得る。対象の遺伝子はまた、薬物耐性遺伝子と蛍光レポーター遺伝子とのハイブリッド（ｚｅｏ／ｇｆｐ融合等）であり得る。本発明の別の態様において、対象の遺伝子は、誘導性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの転写活性を調節し得るタンパク質因子をコードする。このような一実施の形態において、対象の遺伝子は、テトラサイクリン応答性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを調節するｔｅｔＲ（ｔｅｔオペロンのリプレッサー）である。
【００２８】
本発明の別の態様は、細胞内でＲＮＡ分子（単数又は複数）を発現させる方法を提供することである。一実施の形態において、パッケージング細胞株に、本発明のレトロウイルス構築物をトランスフェクトし、組換えレトロウイルス性粒子をパッケージング細胞株から回収し、標的細胞に組換えレトロウイルス粒子を感染させる。このような方法によれば、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）、自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、及び少なくとも１つのＲＮＡコード領域由来のＲ配列及びＵ５配列を有する。レトロウイルス構築物はまた、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した終結配列を有し得る。
【００２９】
さらなる態様において、ＨＩＶ感染を患っている患者を治療する方法が提供される。一実施の形態において、ＣＤ３４陽性標的細胞が患者から単離される。次いで、標的細胞に、本発明のレトロウイルス構築物をトランスフェクトしたパッケージング細胞株から回収された組換えレトロウイルスを感染させる。好ましくは、組換えレトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、少なくとも１つのＲＮＡコード領域、及び少なくとも１つの終結配列を含む。一実施の形態において、ＲＮＡコード領域はＨＩＶゲノムの標的領域、ＨＩＶゲノム転写物、又はＨＩＶライフサイクルに関与する細胞遺伝子と少なくとも約９０％同一である配列を含む。標的領域は、好ましくは約１８ヌクレオチド長〜約２３ヌクレオチド長である。
【００３０】
一実施の形態において、ＲＮＡコード領域は、ヘアピンＲＮＡ分子をコードする。
【００３１】
好ましい実施の形態において、ＲＮＡコード領域は、ＣＣＲ５遺伝子又はＣＸＣＲ４遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である。
【００３２】
またさらなる態様において、特にｓｉＲＮＡ活性がウイルスライフサイクル又は細胞遺伝子に干渉し得る、レンチウイルスをコードする高い力価のｓｉＲＮＡを産生する方法が提供される。
【００３３】
一実施の形態において、組換えレトロウイルスを産生する方法は、パッケージング細胞株に、第１の遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である第１のＲＮＡコード領域を含むレトロウイルス構築物と、第２の遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である第２のＲＮＡコード領域を含む第１のベクターとを同時トランスフェクトすること（cotransfecting）を含み、第２の遺伝子の発現がＲＮＡ干渉を媒介する。第１のＲＮＡコード領域及び第２のＲＮＡコード領域が、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードするのが好ましく、センス領域は、アンチセンス領域と実質的に相補的である。
【００３４】
第１のＲＮＡコード領域は、病原性ウイルスのゲノム内の遺伝子、病原性ウイルスのライフサイクルに関与する細胞遺伝子、及び疾患又は障害を媒介する遺伝子から成る群から選択される遺伝子と少なくとも約９０％同一であるのが好ましい。特定の実施の形態では、第１のＲＮＡコード領域は、ｇａｇ、ｐｏｌ又はｒｅｖ等のＨＩＶウイルス由来の遺伝子と少なくとも約９０％同一である。
【００３５】
第２の遺伝子は、Ｄｉｃｅｒ−１、Ｄｉｃｅｒ−２、ＦＭＲ１、ｅＩＦ２Ｃ２、ｅＩＦ２Ｃ１（ＧＥＲｐ９５）／ｈＡｇｏ１、ｅＩＦ２Ｃ２／ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、ｈＡｇｏ４、ｈＡｇｏ５、Ｈｉｗｉ１／Ｍｉｗｉ１、Ｈｉｗｉ２／Ｍｉｗｉ２、Ｈｉｌｉ／Ｍｉｌｉ、Ｇｅｍｉｎ３、Ｐ６７８ヘリカーゼ、Ｇｅｍｉｎ２、Ｇｅｍｉｎ４、Ｐ１１５／スライサー及びＶＩＧをコードする遺伝子の群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、第２の遺伝子はＤｉｃｅｒ−１又はｅＩＦ２Ｃ２をコードする。
【００３６】
一実施の形態において、第２のＲＮＡコード領域は、Ｄｉｃｅｒ−１をコードする遺伝子の一部、又はｅＩＦ２Ｃ２をコードする遺伝子の一部と少なくとも約９０％同一である配列を含む。特定の実施の形態では、第２のＲＮＡコード領域は、配列番号８の配列を含むが、別の実施の形態では、第２のＲＮＡコード領域は、配列番号９の配列を含む。
【００３７】
さらにパッケージング細胞株に、第３の遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である第３のＲＮＡコード領域を含む第２のベクターを同時トランスフェクトしてもよく、第３の遺伝子の発現がＲＮＡ干渉を媒介する。第３の遺伝子は、Ｄｉｃｅｒ−１、Ｄｉｃｅｒ−２、ＦＭＲ１、ｅＩＦ２Ｃ２、ｅＩＦ２Ｃ１（ＧＥＲｐ９５）／ｈＡｇｏ１、ｅＩＦ２Ｃ２／ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、ｈＡｇｏ４、ｈＡｇｏ５、Ｈｉｗｉ１／Ｍｉｗｉ１、Ｈｉｗｉ２／Ｍｉｗｉ２、Ｈｉｌｉ／Ｍｉｌｉ、Ｇｅｍｉｎ３、Ｐ６７８ヘリカーゼ、Ｇｅｍｉｎ２、Ｇｅｍｉｎ４、Ｐ１１５／スライサー及びＶＩＧをコードする遺伝子の群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、第３の遺伝子はＤｉｃｅｒ−１又はｅＩＦ２Ｃ２をコードする。
【００３８】
さらなる実施の形態において、パッケージング細胞に、標的遺伝子の一部と少なくとも約９０％同一である第１のＲＮＡコード領域を含むレトロウイルス構築物をトランスフェクトすること、及びパッケージング細胞においてＲＮＡ干渉を阻害することを含む、組換えレトロウイルスを産生する方法が提供される。
【００３９】
ＲＮＡ干渉を媒介する遺伝子と少なくとも約９０％同一であるｓｉＲＮＡをパッケージング細胞で発現することによって、ＲＮＡ干渉を阻害するのが好ましい。ｓｉＲＮＡは、パッケージング細胞で一時的に発現し得るか、又は安定して発現し得る。
【００４０】
別の実施の形態において、レンチウイルスをコードするｓｉＲＮＡを産生する方法が提供され、ｓｉＲＮＡ活性がウイルスライフサイクルの局面に干渉し得る。パッケージング細胞に、レンチウイルスをコードするベクターをトランスフェクトし、パッケージング細胞でｓｉＲＮＡ活性を阻害する。
【００４１】
別の実施の形態において、パッケージング細胞株にレトロウイルス構築物をトランスフェクトする工程と、パッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収する工程と、ｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞に組換えレトロウイルスを感染させる工程とを含む、細胞内でＲＮＡ分子を発現する方法が提供される。組換えレトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と、第１のＲＮＡコード領域と、第１の終結配列とを含み得る。ＲＮＡコード領域の発現によって、標的遺伝子又はゲノム転写物の下方調節がもたらされ得る。第１のＲＮＡコード領域は、標的細胞に対して比較的細胞毒性ではないＣＣＲ５に指向性を有するｓｉＲＮＡを含み得る。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は配列番号１６の配列を含む。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は配列番号１７から成る。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域はヘアピン領域を含む。幾つかの実施の形態では、標的細胞内のＲＮＡコード領域の発現は、少なくとも約１０日間、ヒト末梢血単核細胞であり得る標的細胞の増殖速度を変えない。
【００４２】
幾つかの態様において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列をさらに含む。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードする。センス領域は、アンチセンス領域と実質的に相補的であり得る。ループ領域は、約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長であり得る。ＲＮＡコード領域の少なくとも一部が標的領域と実質的に相補的であり得る。標的領域は、１５ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長であり得る。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は、１８ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長の標的領域と実質的に相補的である。
【００４３】
幾つかの実施の形態において、パッケージング細胞株はＨＥＫ２９３細胞株である。５’ＬＴＲ配列はＨＩＶ由来であり得る。自己不活性化３’ＬＴＲは、そのエンハンサー配列が欠失したＵ３因子を含み、修飾ＨＩＶ ３’ＬＴＲであり得る。幾つかの実施の形態では、組換えレトロウイルスは偽型（シュードタイプ）である。例えば、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって、レトロウイルスを偽型にすることができる。他の実施の形態では、５’ＬＴＲ配列は、モロニーマウス白血病ウイルス又はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来であり得る。
【００４４】
幾つかの実施の形態において、標的細胞はヒト細胞である。標的細胞は、造血細胞である可能性があり、例えばＣＤ３４陽性造血細胞であり得る。標的細胞は培養細胞であり得る。
【００４５】
この方法は、患者から標的となるＣＤ３４陽性造血細胞を単離する工程も含み得る。幾つかの態様では、この方法は、感染したＣＤ３４陽性造血細胞を患者に再導入する工程を含み得る。
【００４６】
ＨＩＶに感染した患者を治療する方法も開示する。この方法は、患者からＣＤ３４陽性標的細胞を単離する工程と、レトロウイルス構築物をトランスフェクトしたパッケージン
グ細胞株から回収された組換えレトロウイルスを標的細胞に感染させる工程とを含み得る。組換えレトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と、第１のＲＮＡコード領域と、第１の終結配列とを含み得る。ＲＮＡコード領域の発現によって、ＣＣＲ５の下方調節がもたらされ得る。
【００４７】
別の態様において、標的細胞においてＣＣＲ５を低下するように調節するように構築されたｓｉＲＮＡを含む小ＲＮＡ分子が提供される。幾つかの実施の形態では、ｓｉＲＮＡのＲＮＡコード領域は配列番号１７をコードする。ＲＮＡコード領域は、ヘアピン領域を含み得る。ｓｉＲＮＡは、標的細胞に対して比較的細胞毒性ではないのが好ましい。幾つかの実施の形態では、ヒト末梢血単核細胞であり得る標的細胞内のＲＮＡコード領域の発現は、少なくとも約１０日間、標的細胞の増殖速度を変えない。幾つかの態様において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列をさらに含む。幾つかの実施の形態では、ＲＮＡコード領域は、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードする。センス領域は、アンチセンス領域と実質的に相補的であり得る。標的領域は、１８ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長であり得る。
【００４８】
細胞内でＲＮＡ分子を発現する方法も開示する。この方法は、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と操作可能に連結する第１のＲＮＡコード領域と、第１の終結配列とを含む組換えレトロウイルスを標的細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させる工程を含む。ＲＮＡコード領域の発現によって、標的細胞においてＣＣＲ５の下方調節がもたらされ、ＲＮＡコード領域は、配列番号１７の配列を含み得る。
【００４９】
細胞でＣＣＲ５を低下するように調節する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と、第１のＲＮＡコード領域と、第１の終結配列とを含む組換えレンチウイルスをトランスフェクトする工程を含む、方法も開示する。ＲＮＡコード領域は、配列番号１７の配列を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】「ＲＮＡカセット」と呼ばれるＲＮＡ発現のための発現カセットと「マーカー遺伝子」又は対象の遺伝子とを保有するレトロウイルスベクターの概略図である。ＲＮＡ発現カセットは、レトロウイルス構築物の任意の許容部位で、単一コピー又は複数のタンデムコピーのいずれかとして埋め込まれ得る。また、図に示されないものの、２つ以上のＲＮＡ発現カセットがレトロウイルス構築物に存在し得る。
【図１Ｂ】ＲＮＡ発現カセットがマーカー遺伝子に隣接する、同様な構築物を示す図である。
【図２】ｓｉＲＮＡ領域１１０〜ｓｉＲＮＡ領域１３０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００を有し、センス領域１１０、ループ領域１２０、及びアンチセンス領域１３０、並びにターミネーター配列１４０を有するＲＮＡ発現カセットの概略図である。
【図３】第１のＲＮＡコード領域１１０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００及び第１のターミネーター配列１４０、並びに第２のＲＮＡコード領域１１５に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５及び第２のターミネーター１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図である。
【図４】ＲＮＡコード領域１１０に連結した第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００及び第１のターミネーター配列１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図である。発現カセットは、１１０と逆順で同じ配列のＲＮＡコード領域１１５に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５及び第２のターミネーター１４０を有する。
【図５】レンチウイルスベクターをコードするｌａｃＺ ｓｉＲＮＡの概略図である。５’ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５’ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ因子；ｐｏｌ ＩＩＩ：ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−８）；ｓｉＲＮＡ：ｌａｃＺ特異的小ヘアピンＲＮＡコード領域、その構造及び詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節因子。３’ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ。
【図６】レンチウイルスベクターによりコードされたｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡは、ウイルスを形質導入された哺乳類細胞で、ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現を効果的に阻害し得る。ＭＥＦ：マウス胚線維芽細胞；ＨＥＫ２９３：ヒト胚腎臓細胞。試験細胞株はいずれもｌａｃＺ及びホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を内在し、そしてレポーター遺伝子の発現レベルは、化学発光アッセイにより測定され得る。ｃｔｒｌ：感染していない親細胞のｌａｃＺ活性対Ｌｕｃ活性の比で、任意に１に設定された。形質導入：ｌａｃＺ対Ｌｕｃ比の減少として算出されたｌａｃＺ発現の特異的阻害。
【図７】レンチウイルスベクターによりコードされたｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック動物は、ＲＯＳＡ２６＋／−バックグラウンドで遍在性ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現を首尾よく抑制し得る。ＲＯＳＡ１〜ＲＯＳＡ６：陽性対照として供される、６つのＥ１７．５ ＲＯＳＡ２６＋／−胚の肢組織でのｌａｃＺ活性。個々のＲＯＳＡ２６＋／−胚間のｌａｃＺ活性の差異は、可変のタンパク質抽出効率から生じ得る。ＴＧ１〜ＴＧ４：ＲＯＳＡ＋／−バックグラウンドでレンチウイルスベクターコード化ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡ分子を発現する４つのＥ１７．５トランスジェニック胚の肢組織でのｌａｃＺ活性。ＷＴ１〜ＷＴ６：陰性対照として含まれる、６つのＥ１７．５ Ｃ５７Ｂ１／６野生型胚の肢組織でのｌａｃＺ活性。内因性β−ガラクトシダーゼ活性のバックグラウンドレベルは、全般的に１０００ＬＵ／ｕｇを下回り、したがってカラムは見えない。
【図８】Ｔｅｔ誘導性ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡレンチウイルスベクターの概略図である。Ｔｅｔリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ、配列番号７）は、ヒトユビキチンＣプロモーターの制御下にあり、その発現はＩＲＥＳ因子（内部リボソーム侵入部位）と結び付いた下流のＧＦＰマーカーによりモニタリングされ得る。抗ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡカセットは、ＰＳＥとＴＡＴＡボックスとの間に単一ＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＯ１）を含有するヒトＵ６−プロモーター（−３２８〜＋１）由来のＴｅｔ誘導性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（配列番号６）により駆動される。テトラサイクリンの非存在下、ＴｅｔＲはプロモーターと結合して、その発現が抑制される。テトラサイクリンを添加すると、ＴｅｔＲはプロモーターから移動して転写が開始される。
【図９】Ｔｅｔ誘導性ｓｉＲＮＡ発現カセットがドキシサイクリン処理に応じて遺伝子発現を調節し得ることを実証する実験結果を示す図である。ｌａｃＺ及びルシフェラーゼ二重発現ＨＥＫ２９３細胞（２９３Ｚ＋Ｌｕｃ）に、ユビキチンＣプロモーターの制御下にある、Ｔｅｔ誘導性ｌａｃＺ−ｓｉＲＮＡカセット及びＴｅｔリプレッサーを保有するレンチウイルスベクター（図８）を形質導入した。形質導入した細胞を、４８時間１０ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理する（Ｐｌｕｓ Ｄｏｘ）か、又は対照としてドキシサイクリン処理を行わなかった（Ｎｏ Ｄｏｘ）。ＬａｃＺ及びルシフェラーゼ活性を先の図で記載されるように測定した。相対抑制活性をｌａｃＺ対ルシフェラーゼの比として算出し、そしてＮｏ Ｄｏｘ対照を任意に１に設定した。
【図１０】レンチウイルスベクターをコードする抗ヒトＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡの概略図である。５’ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５’ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ因子；ヒトＵ６−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−３２８〜＋１）；ｓｉＲＮＡ：ヒトＣＣＲ５特異的短鎖ヘアピンカセット、その構造及び詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節因子。３’ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ。
【図１１】レンチウイルスベクターによりコードされた抗ヒトＣＣＲ５特異的ｓｉＲＮＡは、形質導入されたヒト細胞におけるＣＣＲ５発現を効率的に抑制し得る。形質導入又は非形質導入ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５でのＣＣＲ５の細胞表面発現（Deng, et al., Nature, 381, 661（1996））を、フローサイトメトリ解析（ＦＡＣＳ）で測定し、そして相対発現レベルを平均蛍光強度により算出した。非特異的ｓｉＲＮＡも、対照として含まれた。
【図１２】レンチウイルスベクターをコードする抗ＨＩＶ−１ ｓｉＲＮＡの概略図である。５’ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５’ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ因子；ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−９）；ｓｉＲＮＡ：ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンカセット、その構造及び詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節因子。３’ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ。
【図１３】レンチウイルスベクターによりコードされる抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的ｓｉＲＮＡがヒト細胞におけるＨＩＶ転写の発現を効率的に抑制し得ることを実証する図である。ＨＩＶ−１ウイルスの転写活性は、ｅｎｖ／ｎｅｆ領域に挿入されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で測定される（Li, et al. J Virol., 65, 3973（1991））。非形質導入親細胞のルシフェラーゼ活性を任意に１に設定し、これに従って形質導入細胞の相対ＨＩＶ転写レベルを算出した。非特異的ｓｉＲＮＡ含有ベクターは対照として含まれた。
【図１４】抗ＨＩＶ Ｒｅｖ及び抗ヒトＣＣＲ ｓｉＲＮＡ発現カセットの両方を保有する二価レトロウイルスベクターの概略図である。符号は先の図で記載されるものと同じである。
【図１５】野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖパッケージングプラスミド、Ｒｅｖ−ｓｉＲＮＡ媒介性分解に耐性がある変異型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、又は抗Ｄｉｃｅｒ、抗ｅＩＦ２Ｃ２若しくは抗Ｄｉｃｅｒ及び抗ｅＩＦ２Ｃ２のｓｉＲＮＡの存在下での野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖを同時トランスフェクトした後の抗Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡ発現カセットを含むレンチウイルスベクターからのウイルス産生を示す図である。
【図１６】（図１６Ａ）９６ウェルプレートでヒトＣＣＲ５に対して、無作為に生成したｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターをＣＥＭ−ＮＫＲ−ＣＣＲ５細胞に形質導入し、３日間培養して、ＧＦＰ発現集団においてＣＣＲ５発現に関してフローサイトメトリで解析した研究の結果を示す図である。図１６Ａに示されるように、スクリーニングした４００個のｓｈＲＮＡのうち、ヒトｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）は、以前に公開されたヒトｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）（配列番号１４）よりも効率的にＣＣＲ５を低減した。Ｕ６プロモーターから発現した以前に開示された強力なｓｈＲＮＡ（非特許文献４）とは異なり、ヒトｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）の発現は、１２日の培養期間にわたり、形質導入したＴリンパ球の成長速度を変えなかった。以下で考慮されるように、ヘアピン型のｓｉＲＮＡを調べたが、ｓｉＲＮＡは、非共有結合的に結び付いて二本鎖を形成する２つの異なるＲＮＡ分子も含み得る。 （図１６Ｂ）ｓｉＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）によるヒト初代リンパ球（ｈｕＰＢＬ）における内因性ＣＣＲ５発現の効率的な低減を示す図である。ＰＨＡ／ＩＬ２活性化ｈｕＰＢＬに、ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）を保有するレンチウイルスベクターを形質導入し、モノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリによって、ＧＦＰ＋集団におけるＣＣＲ５発現に関して感染の８日後に解析した。ＧＦＰ＋集団におけるＣＣＲ５発現の割合を算出し、それぞれのパネル図の上部に示した。図１６及び図１７に示されるように、「Ｍｏｃｋ」という表示はベクターの形質導入がないことを示している。ラベル「Ｎｏ ｓｈＲＮＡ」は、ベクター中にｓｈＲＮＡがないベクターの形質導入を示している。
【図１７Ａ】アカゲザル（rhesus）ＣＣＲ５（ｒｈ１００５）（配列番号２０）に対するｓｈＲＮＡを、ｒｈＣＣＲ５発現２９３Ｔ細胞で調べた研究の結果を示す図である。末梢血動員アカゲザルＣＤ３４＋細胞を形質導入した後に、骨髄を破壊した（myeloablated）動物に自己移植することによって、このｓｈＲＮＡの機能及び安全性を調べた。ｒｈＣＣＲ５に対して、ｓｈＲＮＡ（ｒｈ１００５）を保有するＳＩＶベースのレンチウイルスベクターを細胞に形質導入し、形質導入の４日後に、モノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリによって、ＣＣＲ５及びＧＦＰの発現に関して解析した。示されるように、ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｒｈ１００５）は、ｒｈＣＣＲ５−２９３Ｔ細胞におけるｒｈＣＣＲ５発現を低減したが、標的配列における単一ヌクレオチドミスマッチによるヒトＣＣＲ５発現ＣＣＲ５ＮＫＲＣＥＭ細胞におけるヒトＣＣＲ５発現は低減しなかった。同様に、ｈｕＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡはヒトＣＣＲ５発現を低減したが、アカゲザルＣＣＲ５発現は低減しなかった。
【図１７Ｂ】ＰＨＡ／ＩＬ２活性化初代アカゲザル（rhesus macaque）リンパ球にアカゲザルＣＣＲ５（ｒｈ１００５）（配列番号２０）に対するｓｈＲＮＡを発現するＳＩＶベクターを感染させる研究の結果を示す図である。ＧＦＰ＋細胞及びＧＦＰ−細胞におけるフローサイトメトリによって、ＣＣＲ５発現を解析した。ホタルのルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを発現するベクターを対照として使用した。この図は、初代アカゲザルＰＢＭＣにおいてＲｈＣＣＲ５（ｒｈ１００５）ｓｈＲＮＡによってＣＣＲ５発現が阻害されたことを示している。
【図１８Ａ】移植したアカゲザルにおける末梢血細胞での安定なＥＧＦＰマーキングを示す図である。幹細胞移植の後、フローサイトメトリ解析によって、顆粒球（白色四角）、単球（黒色四角）、リンパ球（黒色三角）集団でＥＧＦＰ発現をモニタリングした。
【図１８Ｂ】ＧＦＰ＋リンパ球における安定なＣＣＲ５低減を示す図である。フローサイトメトリによるＧＦＰ＋細胞（黒色グラフ）及びＧＦＰ−細胞（灰色グラフ）におけるＣＣＲ５発現の割合をモニタリングした。ｓｈＲＮＡ発現単位ではなく、ＧＦＰを保有するレンチウイルスベクターを対照動物２ＲＣ００３に事前に移植した。
【図１８Ｃ】移植の５ヵ月後の代表的なＣＣＲ５／ＧＦＰプロット図である。ＣＣＲ５、並びにリンパ球集団におけるＣＣＲ５及びＥＧＦＰの発現に関して、移植されたマカク由来の末梢血を染色し、フローサイトメトリで解析した。（それぞれの象限で示される）それぞれの象限での事象の割合に基づき、ＧＦＰ＋リンパ球集団及びＧＦＰ−リンパ球集団におけるＣＣＲ５発現の割合を算出し、それぞれのパネル図の上部に示した。
【図１８Ｄ】アカゲザルのリンパ球におけるｓｉＲＮＡの検出を示す図である。ｓｈＲＮＡ形質導入動物ＲＱ３５７０由来のＰＨＡ／ＩＬ２刺激リンパ球の小ＲＮＡ分画におけるノーザンブロット解析によって、２２ｎｔアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡが検出されたが、対照動物２ＲＣ００３由来の細胞では検出されなかった。
【図１９】ＥＧＦＰ＋リンパ球集団又はＥＧＦＰ−リンパ球集団におけるリンパ球細胞表面マーカー発現を示す図である。示されるように、ＥＧＦＰ＋依存性（gated）リンパ球集団又はＥＧＦＰ−依存性リンパ球集団での細胞表面マーカー発現に関して、フローサイトメトリによって、移植の１１ヵ月後のアカゲザル２ＲＣ００３、ＲＱ３５７０、及びＲＱ５４２７由来の末梢血を解析した。図１９Ａは、ＥＧＦＰ＋集団及びＥＧＦＰ−集団におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ９５（ｆａｓ）発現を示す。ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ９５（ｆａｓ）−は、未感作細胞型を表し、ＣＤ４５−／ＣＤ９５（ｆａｓ）＋は、記憶細胞型を表す。図１９Ｂは、ＥＧＦＰ＋集団又はＥＧＦＰ−集団におけるＣＤ４／ＣＤ８発現を示す。図１９Ｃは、ＥＧＦＰ＋集団及びＥＧＦＰ＋集団におけるＣＸＣＲ４発現を示す。アイソタイプ対照の染色に基づき、象限を構築した。それぞれの象限において、陽性染色細胞の割合を示す。
【図２０】ｅｘ ｖｉｖｏ培養中、ＰＨＡ／ＩＬ２刺激リンパ球におけるＥＧＦＰ＋細胞部分の速度を示す図である。移植の１１ヶ月後、移植動物から末梢血のリンパ球を単離し、２日間ＰＨＡ／ＩＬ２で刺激し、ＩＬ２と共に９日間培養した（合計１１日）。フローサイトメトリによって、リンパ球集団で、ＥＧＦＰ発現の割合をモニタリングした。実験は三重で行った。リンパ球集団におけるＥＧＦＰ発現の平均割合及び誤差バー（標準偏差）を示す。
【図２１】ｅｘ ｖｉｖｏ培養中、リンパ球における安定なＣＣＲ５低減を示す図である。ＰＨＡ／ＩＬ２のｅｘ ｖｉｖｏ培養中、７日目、９日目及び１１日目でのフローサイトメトリによるＥＧＦＰ＋（黒色グラフ）及びＥＧＦＰ−（灰色グラフ）におけるＣＣＲ５発現の割合に関して、図１９及び図２０に示される実験からの細胞を解析した。ＣＣＲ５発現の平均割合及び誤差バー（標準偏差）を示す。実験は三重で行った。
【図２２Ａ】ｅｘ ｖｉｖｏでのＳＩＶ複製の阻害を示す図である。移植の１３ヵ月後のＲＱ３５７０由来の末梢血リンパ球をＧＦＰ＋集団及びＧＦＰ−集団で分けて、２日間ＰＨＡ／ＩＬ２、及び２日間ＩＬ２で刺激した。刺激後、０．０４の感染多重度（moi）（ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５細胞での滴定によるウイルスストックの感染単位は４×１０4／ｍｌであった）で１時間、１×１０5個のＧＦＰ＋細胞又はＧＦＰ−細胞にＳＩＶｍａｃ２３９ １００μｌを感染させ、培養下で、１１日間ｐ２７産生に関してモニタリングした。感染実験を三重で行った。培養上清中の平均ｐ２７産生（ｎｇ／ｍｌ）及び誤差バー（標準偏差）を示す。
【図２２Ｂ】ＧＦＰ＋選別リンパ球及びＧＦＰ−選別リンパ球におけるＣＣＲ５発現の割合を示す図である。フローサイトメトリ解析によって、ｅｘ ｖｉｖｏ培養中、ＣＣＲ５発現をモニタリングして、ＧＦＰ＋選別リンパ球集団（黒色グラフ）とＧＦＰ−選別リンパ球集団（灰色グラフ）との間で比較した。
【図２２Ｃ】ＧＦＰ＋選別ＰＨＡ／ＩＬ２活性化リンパ球（黒色グラフ）及びＧＦＰ−選別ＰＨＡ／ＩＬ２活性化リンパ球（灰色グラフ）におけるＣＣＲ５発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明者らは、例えばＨＩＶを治療するために標的細胞に与えることができる特定の性質があるｓｈＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ ｈｕ（１００５）（配列番号１７）を同定している。様々な方法で、ｓｈＲＮＡの標的細胞への送達を達成することができる。例えば、Baltimore et al.に対する米国特許出願公開第２００３／０１０１４７２号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）において、例えば対象の導入遺伝子を細胞又は動物に導入する方法が記載されている。
【００５２】
他に定義されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似、又は等価な任意の方法、装置、及び材料が、本発明の実施で使用され得る。
【００５３】
「導入遺伝子」は、ヒトの介入により（例えば本発明の方法により）宿主細胞の１つ又は複数の染色体中に組み込まれている、任意のヌクレオチド配列、特にＤＮＡ配列を意味する。一実施形態において、導入遺伝子は「ＲＮＡコード領域」である。別の実施形態において、導入遺伝子は「対象の遺伝子」を含む。他の実施形態において、導入遺伝子はヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列であってもよく、これは、それが組み込まれている染色体を標識するために使用される。この場合、導入遺伝子は、発現され得るタンパク質をコードする遺伝子を含む必要はない。
【００５４】
「対象の遺伝子」は、宿主細胞への組み込みに望ましいタンパク質又は他の分子をコードする核酸配列である。一実施形態において、対象の遺伝子は、宿主細胞でその発現が望まれるタンパク質又は他の分子をコードする。この実施形態において、対象の遺伝子は一般に、対象の遺伝子の所望の発現を得るために有用な他の配列（転写調節配列等）に操作可能に連結している。
【００５５】
「機能的に関連して（functional relationship：機能的な関連性）」及び「操作可能に連結している」は、プロモーター及び／又はエンハンサーに関して遺伝子が正しい位置及び方向にあり、プロモーター及び／又はエンハンサーが適切な分子に接触すると遺伝子
の発現が影響を受けることを意味するが、これに限定されない。
【００５６】
「ＲＮＡコード領域」は、ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ等）の合成用テンプレートとなり得る核酸である。好ましくは、ＲＮＡコード領域はＤＮＡ配列である。
【００５７】
「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、相同性を示す遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子である。遺伝子又は他のヌクレオチド配列の相同性がある領域は、「標的領域」として既知である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、センス領域、ループ領域、及びセンス領域と相補的なアンチセンス領域を含む「ヘアピン」又はステムループＲＮＡ分子であり得る。典型的に少なくとも１つのセンス領域及びアンチセンス領域は標的領域に相補的である。このような分子は、小ヘアピンＲＮＡ又は「ｓｈＲＮＡ」と呼ぶことができる。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、非共有結合的に結び付いて二本鎖を形成する２個の別個のＲＮＡ分子を含む。
【００５８】
用語「動物」は、その最も広義において使用され、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、及び両生類を含む全動物を示す。
【００５９】
用語「哺乳類」は、哺乳綱の全成員を示し、哺乳類として分類される任意の動物を含み、ヒト、家畜動物（domestic and farm animals）、並びに動物園、競技用、又はペット用の動物（マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及び高等霊長類等）が挙げられる。
【００６０】
「標的細胞」又は「宿主細胞」は、本発明の方法及び組成物を使用して形質転換される細胞を意味する。
【００６１】
用語「病原性ウイルス」は、動物に感染する能力があるウイルスを示すものとして、本明細書中に使用される。
【００６２】
「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。
【００６３】
「レンチウイルス」は、分裂細胞及び非分裂細胞に感染する能力があるレトロウイルス属を示す。レンチウイルスの例の幾つかとして、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：１型ＨＩＶ、及び２型ＨＩＶを含む）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子；ヒツジに脳炎（ビスナ） 又は肺炎（マエディ）を引き起こすビスナ−マエディ（visna-maedi）、ヤギで免疫不全、関節炎、及び脳症を引き起こすヤギ関節炎−脳炎ウイルス；ウマで自己免疫性溶血性貧血及び脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコで免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシでリンパ節症、リンパ球増加、及びおそらく中枢神経系の感染を引き起こすウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；並びに類人猿で免疫不全及び脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【００６４】
本明細書中に使用されるとおりの「ハイブリッドウイルス」は、１つ又は複数の他のウイルスベクター由来の成分（非レトロウイルスベクター由来の因子を含む）を有するウイルス、例えば、アデノウイルスーレトロウイルスハイブリッドを示す。本明細書中に使用されるように、レトロウイルス成分を有するハイブリッドベクターは、レトロウイルスの範囲内にあると判断されることになる。
【００６５】
レンチウイルスゲノムは一般に、５’長末端反復（ＬＴＲ）、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）及び３’ＬＴＲに組織化されている。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサー及びプロモーター因子を含む。Ｕ５領域は、
ポリアデニル化シグナルを含む。Ｒ（繰返し）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域を分断し、Ｒ領域の転写配列は、ウイルスＲＮＡの５’末端及び３’末端の両方で現れる。例えば、"RNA Viruses: A Practical Approach"（Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, （2000））、O Narayan and Clements J. Gen. Virology 70: 1617-1639 （1989）、Fields et al. Fundamental Virology Raven Press. （1990）、Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. J Virol. 72 （10）: 8150-7 （1998）、及び米国特許第６，０１３，５１６号明細書を参照されたい。
【００６６】
レンチウイルスベクターは当該技術分野で既知であり、幾つかは、造血幹細胞にトランスフェクトするために使用されている。このようなベクターは、例えば、以下の文献に見出すことが可能であり、これらは本明細書中に参照により援用される：Evans JT et al. Hum Gene Ther 1999; 10: 1479-1489、Case SS, Price MA, Jordan CT et al. Proc Natl
Acad Sci USA 1999; 96: 2988-2993、Uchida N, Sutton RE, Friera AM et al. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 11939-11944、Miyoshi H, Smith KA, Mosier DE et al. Science 1999; 283: 682-686、Sutton RE, Wu HT, Rigg R et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors efficiently transduce human hematopoietic stem cells. J Virol 1998; 72: 5781-5788。
【００６７】
「ビリオン」、「ウイルス粒子」、及び「レトロウイルス性粒子」は、ＲＮＡゲノム、ｐｏｌ遺伝子由来のタンパク質、ｇａｇ遺伝子由来のタンパク質及びエンベロープ（糖）タンパク質を表す脂質二重層を含む単一のウイルスを示すものとして、本明細書中に使用される。ＲＮＡゲノムは通常、組換えＲＮＡゲノムであり、したがって、天然のウイルスゲノムにとって外来性のＲＮＡ配列を含み得る。ＲＮＡゲノムはまた欠損した内在性ウイルス配列を含有し得る。
【００６８】
「偽型（シュードタイプ）」レトロウイルスは、ＲＮＡゲノムの由来となるウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス性粒子である。エンベロープタンパク質は、別のレトロウイルス由来又は非レトロウイルス性ウイルス由来であってもよい。好適なエンベロープタンパク質は、水泡性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ
Ｇ）タンパク質である。しかしながら、ヒト感染の可能性を排除するために、ウイルスは代替的に、特定の種（マウス又は鳥類等）に感染を限定するエコトロピックエンベロープタンパク質を有する偽型とされ得る。例えば、一実施形態において、変異型エコトロピックエンベロープタンパク質（エコトロピックエンベロープタンパク質４．１７（Powell
et al. Nature Biotechnology 18 （12）: 1279-1282 （2000））等）が使用される。
【００６９】
用語「プロウイルス」は、ＲＮＡレトロウイルスのゲノムに対応する、真核生物染色体に存在する二本鎖ＤＮＡ配列を示すものとして使用される。プロウイルスは、宿主細胞の溶解又は破壊を引き起こすことなく、１つの細胞世代から次の世代へと伝達され得る。
【００７０】
「自己不活性化３’ＬＴＲ」は、ＬＴＲ配列に下流遺伝子の発現を駆動することを防ぐ突然変異、置換、又は欠失が含有される３’長末端反復（ＬＴＲ）である。３’ＬＴＲのＵ３領域のコピーは、組み込まれたプロウイルスでの両ＬＴＲの生成用テンプレートとして作用する。したがって、不活性化欠失又は変異を有する３’ＬＴＲがプロウイルスの５’ＬＴＲとして組み込まれる場合、５’ＬＴＲからの転写は不可能である。これは、ウイルスエンハンサー／プロモーターと任意の内部エンハンサー／プロモーターとの間の競合を排除する。自己不活性化３’ＬＴＲは、例えば、Zufferey et al. J. Virol. 72: 9873-9880 （1998）、Miyoshi et al. J. Virol. 72: 8150-8157、及び Iwakuma et al. Virology 261: 120-132 （1999）に記載される。
【００７１】
用語「ＲＮＡ干渉又はサイレンシング」は、遺伝子発現のＲＮＡ媒介性阻害の全ての転
写後機構及び転写機構（P. D. Zamore, Science 296,1265（2002）に記載されるもの等）を含むものとして、広く定義される。
【００７２】
本明細書中に使用されるとおりの「実質的な相補性」及び「実質的に相補的な」は、２つの核酸が、約１５ヌクレオチドを超える領域、より好ましくは約１９ヌクレオチドを超える領域にわたり、少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、及び最も好ましくは少なくとも９５％相補的であることを意味する。
【００７３】
本発明の一態様において、組換えレトロウイルスは、対象のＲＮＡコード領域を細胞へ、好ましくは哺乳類細胞へ送達するために使用される。細胞は、初代細胞又は培養細胞であってもよい。一実施形態において、細胞は卵母細胞又は胚細胞、より好ましくは１細胞期胚である。別の実施形態において、細胞は造血幹細胞である。したがって、ＲＮＡコード領域及び任意の関連する遺伝要素は、宿主細胞のゲノムにプロウイルスとして組み込まれる。標的細胞が胚である場合、細胞は次いで、当該技術分野で既知の方法により、トランスジェニック動物へ発達させられ得る。
【００７４】
ＲＮＡコード領域を送達するために使用される組換えレトロウイルスは、好ましくは修飾レンチウイルスであり、したがって分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染することが可能である。組換えレトロウイルスは、好ましくはＲＮＡコード領域を含む修飾レンチウイルスゲノムを含む。さらに、修飾レンチウイルスゲノムは、好ましくはウイルス複製に必要なタンパク質の内在性遺伝子を欠いており、したがって望ましくない複製（標的細胞の複製等）を防ぐ。必要なタンパク質は、以下に記載されるように、好ましくは、組換えレトロウイルスの産生の間パッケージング細胞株にトランスで提供される。
【００７５】
別の実施形態において、ＲＮＡコード領域を送達するために使用される組換えレトロウイルスは、修飾モロニーウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスである。さらなる実施形態において、ウイルスはマウス幹細胞ウイルスである（Hawley, R. G., et al. （1996） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10297-10302、Keller, G., et al. （1998） Blood 92: 877-887、Hawley, R. G., et al. （1994） Gene Ther. 1: 136-138）。組換えレトロウイルスはまた、Choi, JK; Hoanga, N; Vilardi, AM; Conrad, P; Emerson, SG; Gewirtz, AM. （2001）Hybrid HIV/MSCV LTR Enhances Transgene Expression of Lentiviral Vectors in Human CD34+ Hematopoietic Cells. Stem Cells 19, No. 3, 236-246に記載されるもののようなハイブリッドウイルスであり得る。
【００７６】
一実施形態において、導入遺伝子、好ましくはＲＮＡコード領域は、無処理のレトロウイルス５’ＬＴＲ及び自己不活性化３’ＬＴＲを含むウイルス構築物に組込まれる。ウイルス構築物は、好ましくは、ウイルス構築物に基づくウイルスゲノムＲＮＡを所望の宿主特異性を有するウイルス粒子にパッケージングするパッケージング細胞株に導入される。ウイルス粒子は回収されて宿主細胞に感染させられる。これらの態様のそれぞれが、以下に詳細に記載される。
【００７７】
ウイルス構築物
ウイルス構築物は、パッケージング細胞での組換えウイルス粒子の産生に必要な配列を含むヌクレオチド配列である。一実施形態において、ウイルス構築物はさらに宿主で対象の遺伝子の所望の発現を可能にする遺伝要素を含む。
【００７８】
ウイルス構築物の発生は、当該技術分野で既知の任意の適切な遺伝子工学技法を使用して達成することができ、例えば、Sambrook et al. （Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. （1989））、Coffin et al. （Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. （1997）） 及び"RNA Viru
ses : A Practical Approach"（Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, （2000））に記載されるように、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、及びＤＮＡシークエンシングの標準技法を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
ウイルス構築物は、任意の既知の生物のゲノム由来の配列を組込み得る。配列は、それらの自然の形で組込まれてもよく、また任意の方法で修飾されてもよい。例えば、配列は挿入、欠失、又は置換を含んでもよい。好適な実施形態において、ウイルス構築物はレンチウイルスゲノム（ＨＩＶゲノム又はＳＩＶゲノム等）由来の配列を含む。別の好適な実施形態において、ウイルス構築物はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）の配列を含む。
【００８０】
ウイルス構築物は、好ましくは、レンチウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス、又はそれらのハイブリッドの５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ由来の配列を含む。一実施形態において、ウイルス構築物は、レンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列並びにレンチウイルス由来の不活性化又は自己不活性化３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲ配列は、任意の種からの任意のレンチウイルス由来のＬＴＲ配列であり得る。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ又はＢＩＶ由来のＬＴＲ配列であり得る。好ましくは、ＬＴＲ配列はＨＩＶ ＬＴＲ配列である。ウイルスはまた、ＭＭＶ又はＭＳＣＶ由来の配列を取り込み得る。
【００８１】
ウイルス構築物は、好ましくは、不活性化又は自己不活性化３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲは、当該技術分野で既知の任意の方法により自己不活性化にされ得る。一実施形態において３’ＬＴＲのＵ３因子は、そのエンハンサー配列、好ましくはＴＡＴＡボックス、Ｓｐｌ及びＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ部位の欠失を含有する。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルスは不活性化５’ＬＴＲを含むことになる。
【００８２】
任意で、レンチウイルス５’ＬＴＲ由来のＵ３配列は、ウイルス構築物のプロモーター配列で置換され得る。このことは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させ得る。エンハンサー配列もまた含まれ得る。パッケージング細胞株でのウイルスＲＮＡゲノムの発現を増加させる任意のエンハンサー／プロモーターの組合せが使用され得る。このような一実施形態においてＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（米国特許第５，１６８，０６２号明細書、Karasuyama et al. J. Exp. Med. 169: 13（1989）。
【００８３】
ウイルス構築物はまた、導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、プロウイルス用マーカーとして働く配列を含む任意のヌクレオチド配列であり得る。好ましくは、導入遺伝子は、１つ又は複数のＲＮＡコード領域及び／又は１つ又は複数の対象の遺伝子を含む。
【００８４】
好適な実施形態において、導入遺伝子は少なくとも１つのＲＮＡコード領域を含む。好ましくは、ＲＮＡコード領域は、宿主細胞で所望のＲＮＡ分子を発現させるためのテンプレートとして働き得るＤＮＡ配列である。一実施形態において、ウイルス構築物は、２つ以上のＲＮＡコード領域を含む。
【００８５】
ウイルス構築物はまた、好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結しており、終結配列とも連結し得る。また、２つ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが組込まれ得る。
【００８６】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、当業者に既知である。ＲＮＡポリメラーゼ
ＩＩＩプロモーターの適した範囲は、例えば、Paule and White. Nucleic Acids Research., Vol 28, pp 1283-1298 （2000）に見いだすことが可能であり、これは本明細書中にその全体が参照により援用される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの定義にはまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにその下流のＲＮＡコード配列を転写するよう指図し得る任意の合成又は操作されたＤＮＡ断片も含まれる。さらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーター、又はウイルスベクターの一部分として使用されるプロモーターが誘導され得る。任意の適した誘導Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが本発明の方法で使用され得る。特に適したＰｏｌ ＩＩＩプロモーターとして、Ohkawa and Taira Human
Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 （2000）並びに Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 （2001）で与えられるテトラサイクリン応答性プロモーターが挙げられ、これらは本明細書中に参照により援用される。
【００８７】
一実施形態において、ウイルス構築物はさらに、１つ又は複数の標的細胞で望ましく発現されるタンパク質（例えば、レポーター又はマーカータンパク質）をコードする遺伝子を含む。好ましくは、対象の遺伝子は５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置する。さらに、対象の遺伝子は好ましくは、他の遺伝要素（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー等の転写調節配列）と機能的に関連しており、いったん対象の遺伝子が標的細胞ゲノム中に組込まれると特定の様式で対象の遺伝子の発現を調節する。或る特定の実施形態において、有用な転写調節配列は、時間的及び空間的の両方で、活性に関して高度に調節されるものである。
【００８８】
好ましくは、対象の遺伝子は内部ポリメラーゼＩＩプロモーター／エンハンサー制御配列と機能的に関連している。「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルス構築物の５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置し、発現が望ましい遺伝子と操作可能に連結するものである。
【００８９】
ポリメラーゼＩＩプロモーター／エンハンサーは、それが機能的に関連している遺伝子の発現を増加させることが既知である任意のプロモーター、エンハンサー、又はプロモーター／エンハンサーの組合せであり得る。「機能的に関連して」及び「操作可能に連結した」とは、プロモーター及び／又はエンハンサーに関して導入遺伝子又はＲＮＡコード領域が正しい位置及び方向にあり、プロモーター及び／又はエンハンサーが適切な分子に接触すると遺伝子の発現が影響を受けることを意味するが、これに限定されない。
【００９０】
別の実施形態において、対象の遺伝子は、異種集団内（例えば、動物内、又はより具体的にヒト患者内）で、処理された標的細胞の選択的致死を可能にするための安全上の注意から含まれる遺伝子である。このような一実施形態において、対象の遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）であり、その発現は、標的細胞を薬物ガンシクロビルの作用に感受性にする。
【００９１】
また、２つ以上の対象の遺伝子が、内部プロモーターと機能的に関連して置かれ得る。例えば、マーカータンパク質をコードする遺伝子が、第１の対象の遺伝子の後に置かれて所望のタンパク質を発現する細胞の同定を可能にし得る。一実施形態において、蛍光マーカータンパク質、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、対象の遺伝子と共に構築物中に組込まれる。第２のレポーター遺伝子が含まれる場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列もまた、好ましくは含まれる（米国特許第４，９３７，１９０号明細書）。ＩＲＥＳ配列は、レポーター遺伝子の発現を促進し得る。
【００９２】
ウイルス構築物はまた、さらなる遺伝要素を含み得る。構築物に含まれ得る要素の型は任意の方法に制限されず、特定の結果を達成するために当業者により選択される。例えば、標的細胞へのウイルスゲノムの核侵入を促進するシグナルが含まれ得る。このようなシ
グナルの例は、ＨＩＶ−１フラップシグナルである。
【００９３】
さらに、動物のゲノム中のプロウイルス組み込み部位の特性付けを促進する要素が含まれ得る。例えば、ｔＲＮＡアンバー抑制因子配列が構築物に含まれ得る。
【００９４】
また、構築物は、対象の遺伝子の発現を高めるように設計された１つ又は複数の遺伝要素を含み得る。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答因子（ＷＲＥ）が、構築物中に置かれ得る（Zufferey et al. J. Virol. 74: 3668-3681（1999）、Deglon et al. Hum. Gene Ther. 11: 179-190（2000））。
【００９５】
ニワトリβ−グロビンインスレーター（Chung et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 575-580 （1997））もまた、ウイルス構築物に含まれ得る。この要素は、メチル化及びヘテロクロマチン化効果により標的細胞において組み込まれたプロウイルスのサイレンシングの機会を減少させることが示されている。また、インスレーターは、内在エンハンサー、プロモーター、及び外因性遺伝子を、染色体の組み込み部位での周囲のＤＮＡの正又は負の位置効果から遮断し得る。
【００９６】
任意のさらなる遺伝要素は、好ましくは対象の遺伝子又はＲＮＡコード領域の３’に挿入される。
【００９７】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは以下を含む：ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列；ＨＩＶ５’ ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列；ＨＩＶ−１フラップシグナル；内在エンハンサー；内在プロモーター；対象の遺伝子；ウッドチャック肝炎ウイルス応答因子；ｔＲＮＡアンバー抑制因子配列；エンハンサー配列が欠失したＵ３因子；ニワトリβ−グロビンインスレーター；並びにＨＩＶ３’ＬＴＲのＲ配列及びＵ５配列。
【００９８】
ウイルス構築物は、好ましくは、パッケージング細胞株にトランスフェクトし得るプラスミド中にクローニングされる。好適なプラスミドは、好ましくは、細菌でのプラスミド複製に有用な配列を含む。
【００９９】
例示のレトロウイルス構築物の概略図は、図１Ａ及び図１Ｂに示される。
【０１００】
ウイルスの産生
感染性レトロウイルス性粒子（そのゲノムは上記に記載されるウイルス構築物のＲＮＡコピーを含む）を産生するために、当該技術分野で既知の任意の方法が使用され得る。
【０１０１】
好ましくは、ウイルス構築物はパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子中にパッケージングするためにトランスで必要とされるウイルスタンパク質を提供する。パッケージング細胞株は、レトロウイルスタンパク質を発現することが可能な任意の細胞株であり得る。好適なパッケージング細胞株としては、２９３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ Ｘ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、及びＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３０）が挙げられる。最も好適な細胞株は、２９３細胞株である。
【０１０２】
パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定して発現し得る。このようなパッケージング細胞株は、例えば、米国特許第６，２１８，１８１号明細書に記載される。代替的には、パッケージング細胞株に、必要なウイルスタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドを一時的にトランスフェクトし得る。
【０１０３】
一実施形態において、ＲＮＡゲノムのパッケージングに必要なウイルスタンパク質を安定して発現するパッケージング細胞株に、上記に記載されるウイルス構築物を含むプラスミドをトランスフェクトする。
【０１０４】
別の実施形態において、本質的にYee et al. （Methods Cell. Biol. 43A, 99-112 （1994））に記載されるように、必要なウイルスタンパク質を安定して発現しないパッケージング細胞株に、２つ以上のプラスミドを同時トランスフェクトする。プラスミドの１つは、ＲＮＡコード領域を含むウイルス構築物を含む。他のプラスミド（複数可）は、細胞が所望の宿主細胞に感染可能な機能的ウイルスを産生することを可能にするために必要なタンパク質をコードする核酸を含む。
【０１０５】
パッケージング細胞株は、エンベロープ遺伝子産生物を発現しなくてもよい。この場合、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムを、エンベロープタンパク質を欠いた粒子中にパッケージングする。エンベロープタンパク質は、ウイルス粒子の宿主範囲に一部応答性であるので、ウイルスは、好ましくは偽型である。したがって、パッケージング細胞株に、好ましくは、ウイルスが宿主細胞中へ入ることを許容する膜会合タンパク質をコードする配列を含むプラスミドをトランスフェクトする。当業者は、使用されることになる宿主細胞に適切な偽型を選択し得る。例えば、一実施形態において、ウイルスは、水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶｇ）によって偽型となる。特定の宿主範囲を与えることに加えて、この偽型は、ウイルスが非常に高い力価に濃縮されることを許容し得る。ウイルスは、代替的に、特定の種（マウス又は鳥類等）への感染を制限するエコトロピックエンベロープタンパク質によって偽型となり得る。例えば、別の実施形態において、変異型エコトロピックエンベロープタンパク質（エコトロピックエンベロープタンパク質４．１７（Powell et al. Nature Biotechnology 18 （12）: 1279-1282（2000））等）が使用される。
【０１０６】
好適な実施形態において、ウイルスタンパク質を安定して発現しないパッケージング細胞株には、ウイルス構築物、ｅｎｖ、ｎｅｆ、５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ及びｖｐｕ配列が欠失したＨＩＶ−１パッケージングベクターを含む第２のベクター、並びにエンベロープ糖タンパク質をコードする第３のベクターをトランスフェクトする。好ましくは、第３のベクターは、ＶＳＶｇエンベロープ糖タンパク質をコードする。
【０１０７】
上記のウイルス構築物が、細胞遺伝子又はウイルス遺伝子、特にウイルスのライフサイクルに関与する遺伝子等の必須遺伝子に対して指向性を有するｓｉＲＮＡを含む場合、パッケージング細胞におけるウイルス産生が大幅に低減し得る。したがって本発明の別の実施形態では、パッケージング細胞におけるＲＮＡ干渉活性が抑制されて、組換えウイルスの産生を改善する。パッケージング細胞株においてＲＮＡ干渉を抑制することによって、ｓｉＲＮＡ標的化必須遺伝子、例えばＨＩＶ−１ライフサイクルに必要なＣｉｓ調節因子を発現する組換えレトロウイルスをその治療上の使用を容易にするために十分量産生することができる。
【０１０８】
例えば、ＲＮＡ干渉に必要な１つ又は複数の成分を妨げることによって、ウイルス産生を低減するｓｉＲＮＡ活性の抑制が達成され得る。このような成分には、例えば不活性なヘアピン前駆体ｓｉＲＮＡを処理して開口末端の（open-ended）二本鎖成熟ｓｉＲＮＡにする経路における分子、及び標的ＲＮＡの分解に必須なＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成及び機能に関与する分子が含まれる。ＲＮＡ干渉に必要な成分の例としては、Ｄｉｃｅｒ−１及びＤｉｃｅｒ−２等のＲＮａｓｅＩＩＩファミリー成員（Hammond et al. Nat. Rev. Genet. 2:110-119（2001））、ＦＭＲ１等のＤｉｃｅｒ関連タンパク質（Ishizuka et al. Genes Dev. 16:2497-2508（2002）、Caudy et al. Genes Dev.
16:2491-2496 （2002））、ＲＩＳＣの会合及び活性に必要である（Mourelatos et al.
Genes Dev. 16（6）:720-728 （2002）、Carmell et al. Genes Dev. 16（21）:2733-2742 （2002））、ｅＩＦ２Ｃ２、ｅＩＦ２Ｃ１（ＧＥＲｐ９５）／ｈＡｇｏ１、ｅＩＦ２Ｃ２／ｈＡｇｏ２、ｈＡｇｏ３、ｈＡｇｏ４及びｈＡｇｏ５等のアルゴノートタンパク質のＡｇｏ１サブファミリー成員（Carmell et al. Genes Dev. 16（21）:2733-2742 （2002））と、Ｈｉｗｉ１／Ｍｉｗｉ１、Ｈｉｗｉ２／Ｍｉｗｉ２及びＨｉｌｉ／Ｍｉｌｉ等のアルゴノートタンパク質のＰｉｗｉサブファミリー成員（Carmell et al. Genes Dev. 26:2733-2742（2002））とを含むアルゴノートタンパク質、Ｇｅｍｉｎ３等のＲＮＡヘリカーゼ（Mourelatos et al. Genes Dev. 16（6）:720-728 （2002））及びＰ６７８ヘリカーゼ（Ishizuka et al.、前出）並びにＧｅｍｉｎ２、Ｇｅｍｉｎ４、Ｐ１１５／スライサー及びＶＩＧ等の他のＲＩＳＣ／ｍｉＲＮＰ関連タンパク質（Mourelatos et al. Genes Dev. 16（6）:720-728 （2002）、Schwarz and Zamore Genes Dev. 16:1025-1031 （2002）、Caudy et al. Genes Dev. 16:2491-2496 （2002））が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、完全なｓｉＲＮＡの活性に必要であることが当該技術分野で既知である任意の成分が標的となり得る。
【０１０９】
ＲＮＡ干渉活性の抑制が、当該技術分野で既知の任意の方法によって達成され得る。これには、ＲＮＡ干渉の一因となる分子を阻害するためのパッケージング細胞におけるｓｉＲＮＡ分子を発現する構築物の同時トランスフェクション又は安定なトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
一実施形態において、ＲＮＡ干渉を阻害するｓｉＲＮＡ分子、例えばＤｉｃｅｒ活性及び／又はｅＩＦ２Ｃ２活性を阻害するｓｉＲＮＡ分子を発現する１つ又は複数のベクターの同時トランスフェクションによって、パッケージング細胞株からのウイルスの産生が増大する。好ましい実施形態では、ＲＮＡ干渉を阻害する１つ又は複数の分子、例えばＤｉｃｅｒ活性及び／又はｅＩＦ２Ｃ２活性を阻害するｓｉＲＮＡを安定して発現するパッケージング細胞株を作製する。
【０１１１】
次いで、組換えウイルスは、パッケージング細胞から精製され、滴定され、そして所望の濃度に希釈されるのが好ましい。
【０１１２】
ウイルス送達
ウイルスは、ウイルスが細胞に感染することを可能にする任意の方法で細胞に送達され得る。好ましくは、ウイルスは細胞膜と接触させられる。ウイルスを哺乳類細胞へ送達する好適な方法は、直接接触を通じてである。
【０１１３】
一実施形態において、標的細胞は、好ましくは、培養皿でウイルスと接触させられる。ウイルスは培地に懸濁されて培養皿のウェルに加えられ得る。ウイルスを含有する培地は、細胞を平板培養する前に加えられても、細胞を平板培養した後に加えられてもよい。好ましくは、生存性を提供するのに、且つ宿主細胞の感染が生じるように培地中のウイルス濃度を適したものにするのに適切な量の培地で、細胞をインキュベートする。
【０１１４】
細胞は、好ましくは、ウイルスが細胞に感染することを可能にするのに十分な長さの時間、ウイルスと共にインキュベートされる。好ましくは、細胞は、少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも５時間、及びさらにより好ましくは少なくとも１０時間ウイルスと共にインキュベートされる。
【０１１５】
任意のこのような実施形態において、細胞に感染するのに十分な任意の濃度のウイルスが使用され得る。標的細胞が培養される場合、ウイルス粒子の濃度は、少なくとも１ｐｆｕ／μｌ、より好ましくは少なくとも１０ｐｆｕ／μｌ、さらにより好ましくは少なくとも４００ｐｆｕ／μｌ、及びさらにより好ましくは少なくとも１×１０4ｐｆｕ／μｌで
ある。
【０１１６】
ウイルス感染に続いて、細胞は動物に導入され得る。培養細胞の導入位置は、使用される細胞型に依存する。例えば、細胞が造血細胞である場合、細胞は末梢血流中に導入され得る。動物に導入される細胞は、有害な免疫応答を回避するため、その動物由来の細胞であるのが好ましい。同様な免疫構成を有するドナー動物由来の細胞もまた使用され得る。免疫原性応答を回避するように設計されたものを含む他の細胞もまた使用され得る。
【０１１７】
別の実施形態において、適量のウイルスが、例えば身体への注射を通じて、直接動物に導入される。このような一実施形態において、ウイルス粒子は動物の末梢血流に注射される。他の注射位置も適している。ウイルスの型に依存して、導入は他の手段を通じて行うことができ、例えば、吸入又は上皮組織（例えば、目、口、又は皮膚のもの）との直接接触を含む。
【０１１８】
導入細胞を取り込む細胞及び動物は、例えば、ＲＮＡコード領域の組込、組み込まれたＲＮＡコード領域のコピー数、及び組み込み位置について、解析され得る。このような解析は、任意の時点で行われ、当該技術分野で既知の任意の方法により行われ得る。標準方法は、例えば、Hogan et al.（前出）に記載される。
【０１１９】
上記で開示した細胞の感染方法は、細胞の種特異的特性に依存しない。結果として、それらは容易に全ての哺乳類種に拡張される。
【０１２０】
上記されるように、修飾レトロウイルスは、それに対して広い宿主範囲を与えるために偽型であり得る。当業者はまた、特定の動物種で対象の遺伝子の所望の発現を達成するための適切な内在プロモーターを認識する。したがって、当業者は、任意の種由来の細胞を感染させる方法を変更することができる。
【０１２１】
標的細胞での遺伝子発現の下方調節
本明細書中に記載される方法は、細胞でのＲＮＡ分子の発現を可能にし、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターからは容易に発現され得ない小ＲＮＡ分子の発現に特に適している。本発明の好適な実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を低下するように調節するために細胞内で発現される。標的遺伝子を低下するように調節する能力は、特定の遺伝子の生物学的機能を同定することを含む多くの治療及び研究用途を有する。本発明の技法及び組成物を使用して、細胞培養液及び哺乳類生物での両方で大多数の遺伝子の発現をノックダウン（又は下方調節）することが可能になる。詳細には、病原菌（病原性ウイルス等）のライフサイクルに必要な標的細胞の遺伝子を低下するように調節することが望ましい。
【０１２２】
本発明の好適な実施形態において、ＲＮＡ発現カセットはＰｏｌ ＩＩＩプロモーター及びＲＮＡコード領域を含む。ＲＮＡコード領域は、好ましくは特定の遺伝子（単数又は複数）の発現を低下するように調節することが可能なＲＮＡ分子をコードする。コードされるＲＮＡ分子は、例えば、下方調節される遺伝子をコードするＲＮＡ分子の配列と相補的であり得る。このような実施形態において、ＲＮＡ分子は、アンチセンス機構を通じて作用するように設計される。
【０１２３】
より好適な実施形態は、二本鎖ＲＮＡ複合体、又はステムループ若しくはいわゆる「ヘアピン」構造を有するＲＮＡ分子の発現を含む。本明細書中に使用されるように、用語「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ複合体の二本鎖領域及びヘアピン又はステムループ（stem-lop）構造の二本鎖領域の両方を示す。ＲＮＡコード領域は、一本鎖ＲＮＡ、２つ以上の相補的一本鎖ＲＮＡ又はヘアピン形成ＲＮＡをコードし得る。
【０１２４】
二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉又は抑制と呼ばれるプロセスを通じて、相補配列を有する遺伝子の遺伝子発現を阻害することが示されている（例えば、Hammond et al. Nat. Rev.
Genet. 2: 110-119（2001）を参照されたい）。
【０１２５】
本発明によると、下方調節される標的遺伝子の領域に対応するＲＮＡ二本鎖又はｓｉＲＮＡが、細胞で発現される。ＲＮＡ二本鎖は、下方調節の標的となる遺伝子の配列と、配列が実質的に同一である（典型的には少なくとも約８０％同一であり、より典型的には少なくとも約９０％同一である）。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、例えば、Bummelkamp et al. Science 296: 550-553（2202）、Caplen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747
（2001）、及び Paddison et al. Genes & Devel. 16: 948-958（2002）に記載されている。
【０１２６】
ＲＮＡ二本鎖は一般に、少なくとも約１５ヌクレオチド長であり、好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長である。生物によっては、ＲＮＡ二本鎖は著しく長くなり得る。さらに好適な実施形態において、ＲＮＡ二本鎖は、約１９ヌクレオチド長〜２２ヌクレオチド長の間である。ＲＮＡ二本鎖は好ましくは、この領域にわたり標的ヌクレオチド配列と同一である。
【０１２７】
下方調節されることになる遺伝子が高度に保存されている遺伝子のファミリー内にある場合、二本鎖領域の配列は、配列の比較により所望の遺伝子のみを標的とするように選択され得る。生物内の相同遺伝子のファミリー間で十分な同一性がある場合、二本鎖領域は、複数の遺伝子を同時に低下するように調節するように設計され得る。
【０１２８】
二本鎖ＲＮＡは、単一のレトロウイルス構築物由来の細胞で発現され得る。好適な実施形態において、構築物の単一のＲＮＡコード領域は、センス領域と、ループ領域と、アンチセンス領域とを含む自己相補的なヘアピンＲＮＡの発現用のテンプレートとしての役目を果たす。この実施形態は図２に例示されており、図２はセンス領域１１０、ループ領域１２０、アンチセンス領域１３０、及びターミネーター領域１４０を有するＲＮＡコード領域に操作可能に連結されたＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター１００を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。センス領域１１０及びアンチセンス領域１３０は、それぞれ好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長である。ループ領域１２０は、好ましくは約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは約４ヌクレオチド長〜約９ヌクレオチド長である。発現に続いて、センス領域及びアンチセンス領域は二本鎖を形成する。
【０１２９】
別の実施形態において、レトロウイルス構築物は２つのＲＮＡコード領域を含む。第１のコード領域は第１のＲＮＡの発現用テンプレートであり、第２のコード領域は第２のＲＮＡの発現用テンプレートである。発現に続いて、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは二本鎖を形成する。レトロウイルス構築物は、好ましくは、第１のＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第１のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター及び第２のＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第２のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターも含む。この実施形態は図３に図示されており、第１のＲＮＡコード領域１１０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００及び第１のターミネーター配列１４０、並びに第２のＲＮＡコード領域１１５に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５及び第２のターミネーター１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。
【０１３０】
本発明のさらに別の実施形態において、レトロウイルス構築物は、第１のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現がセンス鎖としての第１のＲＮＡ分子の合成をもたらし、第２のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード
領域の発現が第１のＲＮＡ分子と実質的に相補的であるアンチセンス鎖としての第２のＲＮＡ分子の合成をもたらすように、第１のＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第１のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、及び反対方向で同じ第１のＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第２のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。このような一実施形態において、両方のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列、好ましくは５個の連続したＴ残基を有する終結配列によりＲＮＡコード領域と分断されている。図４は、ＲＮＡコード領域１１０に連結した第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００及び第１のターミネーター配列１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。発現カセットは、ＲＮＡコード領域１１５（１１０と逆順で同じ配列）に連結した第２のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５及び第２のターミネーター１４０を有する。
【０１３１】
さらなる実施形態において、ＲＮＡ二本鎖は、２つ以上のレトロウイルス構築物を使用して発現される。一実施形態において、第１のＲＮＡの発現を指示する第１のレトロウイルス構築物が使用され、第１のＲＮＡと相補的である第２のＲＮＡの発現を指示する第２のレトロウイルス構築物が使用される。発現に続いて、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは二本鎖領域を形成する。しかしながら、単一のレトロウイルス構築物由来のレトロウイルス性粒子を使用して全二本鎖領域を導入することが好ましい。上記されるように、単一のウイルス構築物から二本鎖ＲＮＡを発現する複数の戦略が、図２〜図４に示される。
【０１３２】
ＲＮＡ二本鎖は、二本鎖の片側又は両側に一本鎖領域が隣接していてもよい。例えば、ヘアピンの場合、一本鎖ループ領域は１つの末端で二本鎖領域と連結する。
【０１３３】
ＲＮＡコード領域は一般に、ターミネーター配列に操作可能に連結している。ｐｏｌ ＩＩＩターミネーターは、好ましくは４つ以上のチミジン（「Ｔ」）残基のストレッチから成る。好適な実施形態において、５個の連続したＴのクラスターは、ＲＮＡコード領域の直ぐ下流に連結してターミネーターとしての役割を果たす。このような構築物において、ｐｏｌ ＩＩＩ転写はＤＮＡテンプレートの二番目又は三番目のＴで終了し、したがって２個又は３個のウリジン（「Ｕ」）残基のみがコード配列の３’末端に付加される。
【０１３４】
ＲＮＡコード領域の配列、及びしたがってＲＮＡ二本鎖の配列は、好ましくは、発現が細胞又は生物で低下するように調節される遺伝子の配列と相補的であるように選択される。所定の標的遺伝子のために所定のＲＮＡ二本鎖配列で達成される下方調節の程度は、配列により変化する。当業者は、有効な配列を容易に同定することができる。例えば、抑制量を最大にするために、標的細胞を処理する前又はトランスジェニック動物を発生させる前に多数の配列が細胞培養液で試験され得る。ＲＮＡ干渉に関する配列要件の理解が促されるので、ＲＮＡ二本鎖は当業者により選択され得る。
【０１３５】
標的細胞におけるウイルス複製及び／又は遺伝子発現の阻害
本発明の一態様に従って、標的のＲＮＡ二本鎖は、例えば、ウイルスの遺伝子発現、及びウイルス複製に必要な細胞性受容体又は補助受容体の発現を含むウイルスのライフサイクル又は複製に必要な配列である。本発明の一実施形態において、阻害されるウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。特定の実施形態では、標的配列は、Ｒｅｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、Ψ、ａｔｔ、ｐｂｓ、ｐｐｔ、並びに他の本質的なＤＮＡ及びＲＮＡシス調節因子から成る群から選択される。
【０１３６】
本発明はまた、ウイルス感染している患者を治療する方法を含む。一実施形態において、本方法は、通常のウイルス複製に重要であるヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの領域と、少なくとも９０％の相同性を有し、好ましくは同一である少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡをコードする、有効量の組換えレトロウイルス性粒子
（複数可）を患者へ投与することを含む。例えば、二本鎖ＲＮＡは、ウイルスゲノム、ウイルス遺伝子転写物、又はウイルスのライフサイクルに必要な患者の細胞性受容体の遺伝子の核酸と相同性を有し得る。
【０１３７】
一実施形態において、治療される患者は、ヒト免疫不全ウイルスに感染している。組換えウイルス粒子で治療する前に、標的細胞を患者から取り出す。好適な実施形態において、標的細胞は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞である。このような幹細胞は、当業者により精製され得る。このような精製の方法は既知であり、例えば、米国特許第４，９６５，２０４号明細書、同第４，７１４，６８０号明細書、同第５，０６１，６２０号明細書、同第５，６４３，７４１号明細書、同第５，６７７，１３６号明細書、同第５，７１６，８２７号明細書、同第５，７５０，３９７号明細書、及び同第５，７５９，７９３号明細書に教示されている。このようなＣＤ３４陽性幹細胞を精製する方法の１つは、末梢血のサンプルを遠心分離して単核細胞と顆粒球とを分離して蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）により選別することを含む。上記の技法のいずれかによって選別された細胞は、ＣＤ３４＋細胞に富むものであり得る。特定の実施形態において、細胞は磁気分離技術（Miltenyi Biotecから入手可能なもの等）によってＣＤ３４＋細胞に富むものであり、以下の刊行物に記載される：Kogler et al. （1998） Bone Marrow Transplant. 21: 233-241; Pasino et al.（2000） Br. J. Haematol. 108: 793-800。単離ＣＤ３４陽性幹細胞は、ウイルスゲノム内の１つ又は複数の標的及び／又はウイルスのライフサイクルに必要である細胞標的（例えば、病原性ウイルスの侵入に必要な受容体又は補助受容体を含む）に対して指向性を有する二本鎖ＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域を有する組換えレトロウイルス性粒子で処理される。処理された幹細胞は、次いで患者に再導入される。
【０１３８】
本発明の方法は、様々なウイルス性疾患（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎及びＧ型肝炎、ヒト乳頭腫（pailloma）ウイルス（ＨＰＶ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む）を治療するために使用され得る。
【０１３９】
患者に所望の病原菌（ウイルス等）に対する免疫力又は耐性の増加を与える目的で、抗ウイルス性組換えレトロウイルスで患者を治療することもまた可能である。
【０１４０】
細胞性標的
本発明によれば、当業者は、細胞性成分、例えばＲＮＡ、又は病原菌のライフサイクル、特にウイルスのライフサイクルに必要な細胞性タンパク質をコードするＲＮＡを、標的とし得る。好適な実施形態において、選択される細胞性標的は、正常な細胞増殖及び生存に必要であるタンパク質又はＲＮＡではない。ウイルスのライフサイクルを破壊するのに適したタンパク質として、例えば、ウイルス侵入に関係する細胞表面受容体（一次受容体及び二次受容体の両方を含む）、及びウイルスゲノムの転写に関係する転写因子、宿主染色体への組み込みに関係するタンパク質、及びウイルス遺伝子発現の翻訳又は他の調節に関係するタンパク質が挙げられる。
【０１４１】
細胞内へのウイルス侵入のための受容体として、多数の細胞性タンパク質が既知である。このような受容体の幾つかは、E. Baranowski、C. M. Ruiz-Jarabo、及びE. Domingoによる論文"Evolution of Cell Recognition by Viruses" Science 292: 1102-1105に列挙され、これは本明細書中にその全体が参照により援用される。ウイルスよる認識に関係する幾つかの細胞性受容体は、以下に列挙される：アデノウイルス：ＣＡＲ、インテグリン、ＭＨＣ Ｉ、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、シアル酸；サイトメガロウイルス：ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン；コクサッキーウイルス：インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＭＨＣ Ｉ；Ａ型肝炎：マウス様Ｉ型内在性膜糖タンパク質；Ｃ型肝炎：ＣＤ８１、低密度リポタンパク質受容体；ＨＩＶ（レトロウイルス科）：ＣＤ４、ＣＸＣＲ
４、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン；ＨＳＶ：ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、ＰＶＲ、ＨｖｅＢ、ＨｖｅＣ；インフルエンザウイルス：シアル酸；はしか：ＣＤ４６、ＣＤ５５；ポリオウイルス：ＰＶＲ、ＨｖｅＢ、ＨｖｅＣ；ヒトパピローマウイルス：インテグリン。当業者は、本発明が現在既知である受容体と共に使用することに制限されないことを認識する。新規細胞性受容体及び補助受容体が発見されると、本発明の方法はこのような配列に応用され得る。
【０１４２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ＨＩＶウイルス標的：
本発明の一実施形態において、レトロウイルス構築物は、ＨＩＶウイルス性ＲＮＡゲノム、すなわちＨＩＶウイルスゲノムの発現領域に対して（例えば、組み込まれたＨＩＶウイルスの９ｋｂ転写物のうち約１９ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長の任意の領域、又は、ＨＩＶの様々なスプライシングｍＲＮＡ転写物のいずれかに対して）少なくとも９０％相同性を有する二本鎖分子をコードするＲＮＡコード領域を有する（Schwartz, S; Felber, BK; Benko, DM; Fenya, EM; Pavlakis, GN. Cloning and functional analysis of multiply spliced mRNA species of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 1990; 64（6）: 2519-29）。ＨＩＶ転写物中の標的領域は、ウイルス遺伝子（例えば、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、及びｒｅｖを含む）のいずれかに対応するように選択され得る。別の実施形態において、ＲＮＡコード領域は、ＨＩＶウイルスの受容体又は補助受容体と少なくとも９０％相同性を有する二本鎖領域をコードする。例えば、ＨＩＶのＴ細胞侵入の一次受容体はＣＤ４である。好適な実施形態において、補助受容体であるＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）及びＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）は、本発明の方法に従って下方調節される。ＣＸＣＲ４（Feddersppiel et al. Genomics 16: 707-712（1993））は、ＨＩＶのＴ細胞栄養株の主要な補助受容体であるが、ＣＣＲ５（Mummidi et al. J. Biol. Chem. 272: 30662-30671（1997））は、ＨＩＶのマクロファージ栄養株の主要な補助受容体である。ＨＩＶに対する他の細胞性標的は、ＨＩＶライフサイクルに関係するタンパク質のＲＮＡ転写物を含み、これにはシクロフィリン、ＣＲＭ−１、インポーチン−β、ＨＰ６８（Zimmerman C, et al. Identification of a host protein essential for assembly of immature HIV-1 capsids. Nature 415 （6867）: 88-92（2002））、及び依然として未知の他の細胞性要因が挙げられる。
【０１４３】
ＣＣＲ５は、必須のヒト遺伝子ではないが、ＨＩＶ−１のほとんどの株による感染に必須であるために好ましい標的である。ＣＣＲ５細胞表面発現を妨げるＣＣＲ５Δ３２対立遺伝子がホモ接合型である個体は、ＨＩＶ−１感染に耐性であるか、そうでなければ見かけ上正常である（例えばR. Liu et al., Cell 86. 367-377（1996）、M. Samson et al.,
Nature 382, 722-725（1996）、M. Dean et al., Science 273, 1856-1862（1996）、Y.
Huang et al., Nat Med 2, 1240-1243（1996）を参照されたい）。ＨＩＶ−１が主にＴ細胞及びマクロファージに感染するために、ＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡを安定して発現し、ＨＩＶ−１感染の標的である子孫細胞においてＣＣＲ５を低下するように調節するために、造血幹細胞の移植を利用することができる。さらに、ＣＣＲ５に対する非毒性のｓｉＲＮＡは例えば、単独及びＨＩＶに対して指向性を有する他の「遺伝学的免疫付与」試薬との組合せの両方での力価のさらなる最適化の基礎となり得る。ｉｎ ｖｉｖｏ環境下で治療に適用する場合、強いＨＩＶ−１による選択圧によって、低レベルのＣＣＲ５を発現する耐性細胞が長時間にわたって選択される可能性がある。
【０１４４】
標的細胞の細胞毒性の低減
幾つかの実施形態において、小ＲＮＡ分子、例えば小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、標的細胞で発現した後の重要な標的細胞の細胞毒性又は他の有害作用には関連しない。一実施形態では、小ＲＮＡ分子は、細胞標的に対する細胞毒性が許容可能なレベルになるように構築し、またｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｅｘ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで生
体組織に導入される場合、標的遺伝子を安定して低下するように調節することができる。標的遺伝子の特定の標的配列に対して指向性を有するｓｉＲＮＡ等の小ＲＮＡ分子の様々なライブラリをスクリーニングすることによって、（１）標的細胞に対する毒性が比較的低レベルであり、（２）標的細胞の標的遺伝子を安定して低下するように調節することができる小ＲＮＡ分子を同定することができる。このようなスクリーニングの例は以下の実施例９に記載する。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、比較的に非細胞毒性である小ＲＮＡ分子は、病原性ウイルス（例えばＨＩＶ）のゲノム内の遺伝子、病原性ウイルスのライフサイクルに関与する細胞遺伝子、又は疾患若しくは障害を媒介する遺伝子に対して指向性を有する。一実施形態では、形質導入された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する著しい細胞毒性をもたらさずにＣＣＲ５を低下するように調節することができるｓｉＲＮＡを同定する。実施形態によってはｓｈＲＮＡであり得る、比較的に非細胞毒性であるｓｉＲＮＡ（本明細書中で非細胞毒性ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）は、好ましくはレンチウイルスベクターと併用してＨ１プロモーターを使用して、ＰＢＭＣで発現することができる。好ましい実施形態では、形質導入された標的細胞内の非細胞毒性小ＲＮＡ分子の発現は、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、８日、１０日、１２日、１５日、３０日、６０日、９０日、１８０日、３６０日、７２０日、又はそれ以上の間、標的細胞の増殖速度を変えない。この実施形態又は他の実施形態では、小ＲＮＡ分子は、許容可能な細胞毒性であり、又は言い換えればこれまでに記載されたｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）等の他の既知のｓｉＲＮＡに比べて、以下の作用を引き起こさないか、又は比較的少ししか引き起こさない場合、標的細胞に対して比較的に非細胞毒性である（D. S. An et al., Mol.Ther. 14, 494-504 （2006））：インターフェロン応答遺伝子の導入（R. J. Fish and E. K. Kruithof, BMC.Mol.Biol. 5, 9 （2004）を参照されたい）、オフターゲット効果によって引き起こされるｍＲＮＡ発現プロファイルの全体変化（A. L. Jackson et al., RNA. 12, 1179-1187 （2006）を参照されたい）又はｍｉＲＮＡ調節不全による細胞毒性作用（D. Grimm et al., Nature. 441, 537-541 （2006））。ＣＣＲ５に対して指向性を有する、このようなｓｈＲＮＡの非限定的な例は、配列番号１７（ｈｕ１００５）で与えられるｓｈＲＮＡである。
【０１４６】
抗ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ
以下の実施例９で考慮されるように、４００個を超えるｓｈＲＮＡのスクリーニングにおいて、図１６Ａで示されるように、ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）は、これまでに公開されたｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）（配列番号１４）よりも効果的にＣＣＲ５を低減した。ｃＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡは、ＣＣＲ５の標的領域、例えば配列番号１６の領域に相補的な、又は実質的に相補的な領域を含むのが好ましい。幾つかの実施形態では、ｓｉＲＮＡはｓｈＲＮＡであり、したがってヘアピン領域を含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有する。センス領域はアンチセンス領域と実質的に相補的であるのが好ましい。幾つかの実施形態では、ループ領域は、約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長であり得る。ＣＣＲ５に対して指向性を有するｓｉＲＮＡの好ましい実施形態では、小ＲＮＡ分子は、例えば約１ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１０ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長、より好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長の領域、例えば約２０ヌクレオチド長の範囲を含み、この領域は配列番号１７と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上同一である。
【０１４７】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、いかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意図しない。実際、本明細書中に図示及び記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、以下の記載から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【０１４８】
本明細書中で言及される全ての特許及び参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１４９】
実施例１
本実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位へ挿入することにより、ｌａｃＺ遺伝子に対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物を構築した（図５）。ＨＣ−ＦＵＧＷベクター（配列番号３）は、形質導入事象を追跡するための、ヒトユビキチンプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子を含有する。このベクターはまた、ウイルス力価を改善するためのＨＩＶ ＤＮＡフラップ因子、及びウイルス遺伝子の高レベル発現のためのＷＰＲＥも含有する。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター及び小ヘアピンＲＮＡコード領域から成り、これにｐｏｌ ＩＩＩターミネーター部位が続く。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ヒトＨ１−ＲＮＡプロモーターの−２４０〜−８領域に由来し、そして７塩基対のリンカー配列によって下流のＲＮＡコード領域に連結されて、転写がＲＮＡコード配列の最初のヌクレオチドから正確に開始されることを確実にする。小ヘアピンＲＮＡコード領域は、ｌａｃＺ遺伝子コード配列のセンス鎖の１９１５〜１９３３領域に対応する１９ｎｔ配列、及び９ｎｔループ領域により分断された１９ｎｔの完全な逆相補配列を含有する。ターミネーターは、ＲＮＡコード配列の直ぐ下流に連結した５個の連続したチミジン残基から成る。
【０１５０】
実施例２
この実施例は、培養哺乳類細胞へのレトロウイルスベクターの形質導入を実証する（図６）。実施例１に記載される小ヘアピンＲＮＡ分子をコードするレトロウイルスベクターを使用して、ｌａｃＺを発現する培養哺乳類細胞にトランスフェクトし、そして試験遺伝子ｌａｃＺの発現の著しい減少を引き起こした。ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルスを、レトロウイルスベクター、ヘルパーウイルスプラスミド（ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ）、及びＶＳＶｇ発現プラスミドのＨＥＫ２９３細胞における同時トランスフェクションにより産生した。ウイルス粒子を細胞培養液の上清から採取して、超遠心分離により濃縮した。濃縮ウイルス調製物を使用して、ｌａｃＺとホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーター遺伝子との両方を内在する、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）又はＨＥＫ２９３細胞のいずれかに感染させた。感染を、ウイルス性ベクターのマーカー遺伝子カセットから発現するＧＦＰシグナルによりモニタリングした。この実験条件下、９８％を超える試験細胞がＧＰＦ＋であり、したがって首尾よく形質導入された。ｌａｃＺ及びＬｕｃレポーター遺伝子の発現レベルを、市販のキット（Roche製ｌａｃＺアッセイキット及びPromega製Ｌｕｃ）を使用して化学発光アッセイにより測定した。ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルスは、ｌａｃＺの発現のみを阻害し、Ｌｕｃは阻害しなかった。特異的阻害を、ｌａｃＺ活性対Ｌｕｃ活性の比により決定した。未感染の親細胞のｌａｃＺ／Ｌｕｃ比を、任意に１に設定し、これに応じて感染細胞の値を算出した。図６に示されるとおり、ウイルスのトランスフェクションは、ＭＥＫ細胞及びＨＥＫ２９３細胞の両方でｌａｃＺ遺伝子の発現量の劇的な減少をもたらした。
【０１５１】
ｔｅｔ誘導性ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡレンチウイルスベクターをまた、図８に例示されるように調製した。Ｔｅｔリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ、配列番号７）の発現が下流のＧＦＰマーカーによりモニタリングされ得るように、それをヒトユビキチンＣプロモーターの制御下に置いた。抗ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡカセットを、ＰＳＥとＴＡＴＡボックスとの間に単一のＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＯ１）を含有するヒトＵ６−プロモーター（−３２８〜＋１）由来のＴｅｔ誘導性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（配列番号６）により駆動した。ＴｅｔＲコード配列を、大腸菌のＴＯＰ１０株由来のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅して、Ｂｇｌ２−ＥｃｏＲＩ断片としてＦＵＩＧＷの修飾型中にクローニングした。テトラサイクリンの非存在下、ＴｅｔＲはプロモーターに結合してその発現が抑制される。テト
ラサイクリンを添加すると、ＴｅｔＲはプロモーターから移動して転写が開始される。
【０１５２】
Ｔｅｔ誘導性ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ドキシサイクリン処理に応じて遺伝子発現を調節することが可能であった。ウイルスをＴｅｔ誘導性ｌａｃＺ−ｓｉＲＮＡカセット及びユビキチンＣプロモーター制御下のＴｅｔリプレッサーを保有するレトロウイルス構築物から調製し、そしてｌａｃＺ及びルシフェラーゼ（２９３Ｚ＋Ｌｕｃ）の両方を発現するＨＥＫ２９３細胞に形質導入するために使用した。形質導入細胞を、４８時間１０ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理する（Ｐｌｕｓ Ｄｏｘ）か、又は対照としてドキシサイクリン処理を行わなかった（Ｎｏ Ｄｏｘ）。ＬａｃＺ及びルシフェラーゼ活性を先の図に記載されるように測定した。相対抑制活性をｌａｃＺ対ルシフェラーゼの比として算出し、そしてＮｏ Ｄｏｘ対照を任意に１に設定した。図９に見られるとおり、ドキシサイクリンの存在下、ｌａｃＺ活性の抑制は、顕著に向上した。
【０１５３】
実施例３
この実施例は、レンチウイルスベクターによりコードされるｓｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック動物の発生を実証する。実施例１に記載されるｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡ構築物の発現は、ＲＯＳＡ２６＋／−マウスでｌａｃＺ活性の高度抑制をもたらした。ＲＯＳＡ２６＋／−動物は、遍在的に発現されるｌａｃＺレポーター遺伝子のコピーを１つ保有する。実施例２に記載されるｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルス調製物を、ホルモン刺激したＣ５７Ｂ１／６メスドナー×ＲＯＳＡ２６＋／＋種オスから得られたＲＯＳＡ２６＋／−単細胞胚の卵黄周囲注射に使用した。注射単細胞胚を、続いて時期を合わせた偽妊娠メス受容者の卵管へ移した。１５．５日〜１７．５日胚（Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５）の胎児を代理母から取り出した。蛍光顕微鏡下、胎児で観測される陽性ＧＦＰシグナルにより、成功した遺伝子導入を採点した。胎児の肢組織から調製されたタンパク質抽出物を、製造業者の取扱説明書（Roche）に従ってＬａｃＺ化学発光アッセイに使用し、そして組織抽出物のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（BioRad）により決定した。ＬａｃＺ発現レベルは、タンパク質１ｕｇあたりの光単位（ＬＵ）として表した（ＬＵ／ｕｇ）。Ｃ５７Ｂ１／６メス×ＲＯＳＡ２６＋／＋オス、及びＣ５７Ｂ１／６メス×Ｃ５７Ｂ１／６オスの時期を合わせた交配からのＥ１５．５〜Ｅ１７．５胎児を、それぞれ陽性対照及び陰性対照とした。結果を図７に示す。動物Ｇ１〜Ｇ４（ｓｉＲＮＡ構築物をコードするレンチウイルスベクターで処理されたもの）では、未処理の対照動物と比較して、動物はｌａｃＺ遺伝子の顕著に減少した発現を示した。
【０１５４】
実施例４
抗ヒトＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域を含むレンチウイルス構築物を調製した。図１０に例示されるように、ベクターは、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５’ＬＴＲ、ＨＩＶフラップ因子、ヒトＵ６−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター（−３２８〜＋１、配列番号４）、ヒトＣＣＲ５特異的短鎖ヘアピンＲＮＡカセット、内在ユビキチンプロモーター、ユビキチンプロモーターと操作可能に連結したＧＦＰマーカー遺伝子、ＷＲＥ調節因子、及びＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲを含んでいた。抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡの構造及び配列は図１０及び配列番号１で提供される。
【０１５５】
組換えレトロウイルスを、上記のように、抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡベクター構築物から調製した。ヒトＭＡＧＩ−ＣＣＲ５細胞（Deng et al., Nature 381: 661 （1996））に、非特異的対照ｓｉＲＮＡをコードする組換えウイルス又はレトロウイルスを感染させ、そしてＣＣＲ５の細胞表面発現をフローサイトメトリ解析により測定した。平均蛍光強度により相対発現レベルを算出した。図１１に見られるように、抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡは、ＣＣＲ５発現レベルをほぼ完全に減少させたが、非特異的ｓｉＲＮＡは発現をまったく抑制しなかった。
【０１５６】
実施例５
図１２に例示されるように、レンチウイルスベクターをコードするさらなる抗ＨＩＶ−１ ｓｉＲＮＡを構築した。このベクターは、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡ（配列番号２）をコードするＲＮＡコード領域を含んでいた。抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ−１をコードするＲｅｖの８４２０〜８４６８領域を標的とした（nucleotide coordinate of NL4-3 strain; Salminen et al. Virology 213 : 80-86 （1995））。ｓｉＲＮＡコード領域の配列及び構造は、同じく図１２に例示される。抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡの発現は、ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−９、配列番号５）により駆動された。
【０１５７】
抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡの、ヒト細胞におけるＨＩＶ転写の抑制能を測定した。ＨＩＶ−１の転写活性を、本質的にLi et al. J. Virol. 65: 3973（1991））に記載されるように、ｅｎｖ／ｎｅｆ領域で挿入されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性に基づいて測定した。
【０１５８】
上記されるように、ベクター構築物から組換えレトロウイルスを調製し、ＨＩＶ−１を含むヒト細胞にレポーター構築物を感染させるために使用した。形質導入されていない親細胞のルシフェラーゼ活性を任意に１に設定し、これに従って形質導入細胞の相対ＨＩＶ転写レベルを算出した。非特異的ｓｉＲＮＡを対照として使用した。
【０１５９】
図１３に見られるように、ＨＩＶ−１転写は、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡコード領域を含む組換えレトロウイルスを感染させた細胞で顕著に抑制されたが、非特異的ｓｉＲＮＡは明らかな効果を有さなかった。
【０１６０】
実施例６
本実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位へ挿入することにより、ＨＩＶゲノムに対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物を構築する。ＨＣ−ＦＵＧＷベクターは、形質導入事象を追跡するための、ヒトユビキチンプロモーターにより駆動されるＧＦＰマーカー遺伝子を含む。ベクターはまた、ウイルス力価を改善するためのＨＩＶ ＤＮＡフラップ因子、及びウイルス遺伝子の高レベル発現のためのＷＰＲＥを含有する。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター及び小ヘアピンＲＮＡコード領域から成り、これにｐｏｌ ＩＩＩターミネーター部位が続く。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ヒトＨ１−ＲＮＡプロモーターの−２４０〜−８領域に由来し、７塩基対のリンカー配列によって下流のＲＮＡコード領域に連結されて、転写がＲＮＡコード配列の最初のヌクレオチドから正確に開始されることを確実にする。小ヘアピンＲＮＡコード領域は、ＣＣＲ５コード配列の領域に対応する２１ｎｔ配列、及び４ｎｔループ領域により分断された２１ｎｔの完全な逆相補配列を含有する。ターミネーターは、ＲＮＡコード配列の直ぐ下流に連結した５個の連続したチミジン残基から成る。
【０１６１】
レトロウイルス構築物を使用して、パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）に、ヘルパーウイルスプラスミド及びＶＳＶｇ発現プラスミドを共にトランスフェクトする。組換えウイルス粒子が回収される。
【０１６２】
免疫磁気アプローチを使用して、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を患者の骨髄から単離する（例えば、Choi et al. （1995） Blood 85: 402-413、Fehse et al. （1997） Human Gene
Therapy 8: 1815-1824、Di Nicola et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 1117-1121、Servida et al. （1996） Stem Cells 14: 430-438、de Wynter et al. （1995） Stem Cells 13: 524-532、Ye et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 997-1008を参照されたい）。細胞を培養して、組換えウイルス粒子で処理する。感染細胞を、Ｇ
ＦＰの発現に基づいてＦＡＣＳにより選別する。ＧＦＰを発現する細胞を、注射して患者に再導入する。
【０１６３】
実施例７
本実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位に挿入することにより、ＨＩＶゲノムに対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物を構築する。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域に操作可能に連結したヒトＨ１プロモーターを含む。ｓｉＲＮＡ発現カセットはさらに、小抗ＣＣＲ５ヘアピンＲＮＡに操作可能に連結したｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。レトロウイルス構築物は、図１４に例示される。
【０１６４】
レトロウイルス構築物を使用して、パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）に、ヘルパーウイルスプラスミド及びＶＳＶｇ発現プラスミドを共にトランスフェクトする。組換えウイルス粒子が回収される。
【０１６５】
免疫磁気アプローチを使用して、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を患者の骨髄から単離する（例えば、Choi et al. （1995） Blood 85: 402-413、Fehse et al. （1997） Human Gene
Therapy 8: 1815-1824、Di Nicola et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 1117-1121、Servida et al. （1996） Stem Cells 14: 430-438、de Wynter et al. （1995） Stem Cells 13: 524-532、Ye et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 997-1008を参照されたい）。細胞を培養して、組換えウイルス粒子で処理する。感染細胞を、ＧＦＰの発現に基づいてＦＡＣＳにより選別する。ＧＦＰを発現する細胞を、注射して患者に再導入する。
【０１６６】
実施例８
実施例６に記載されたように、２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスベクター、野生型Ｒｅｖ配列（配列番号１１）を含むパッケージングプラスミド（ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、Dull, T.
et al. J Virol. 72（11）: 8463-8471 （1998））及びＶＳＶｇ発現プラスミドを同時トランスフェクションすることによって、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡ発現カセットを保有するレンチウイルスベクターからのウイルス産生を調べた。Ｒｅｖ−ｓｉＲＮＡ媒介性分解に耐性がある変異型のｐＲＳＶ−Ｒｅｖパッケージングプラスミドの使用によって、ウイルス産生の増大能を調べた。このプラスミドでは、変異型Ｒｅｖヌクレオチド配列（配列番号１２）は、Ｒｅｖ ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡ媒介性分解に対して耐性にさせるが、アミノ酸配列を変えない２つのサイレント変異を含む。さらに、ＲＮＡ干渉を阻害する１つ又は複数のｓｉＲＮＡの発現のウイルス産生に対する作用を調べた。
【０１６７】
細胞に、野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ単独、変異型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ＋抗Ｄｉｃｅｒ−１ ｓｉＲＮＡ（配列番号８）の発現を駆動するプラスミド、野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ＋抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡ（配列番号９）の発現を駆動するプラスミド、又は野生型ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ＋抗Ｄｉｃｅｒ−１ ｓｉＲＮＡ及び抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡの発現を駆動するプラスミドのいずれかを同時トランスフェクトした。抗Ｄｉｃｅｒ−１及び抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡ発現は、ヒトＨ１−ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４１〜−９、配列番号１０）の制御下であった。表１及び図１５で見ることができるように、抗Ｄｉｃｅｒ ｓｉＲＮＡ及び抗Ｄｉｃｅｒ ｓｉＲＮＡと抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡとの組合せの存在下でｐＲＳＶ−Ｒｅｖをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のウイルス力価が最も大きかった。
【０１６８】
【表１】
【０１６９】
抗Ｄｉｃｅｒ−１ ｓｉＲＮＡ（配列番号８）及び抗ｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡ（配列番号９）の両方を安定して発現するパッケージング細胞株を作製した。２９３Ｔ細胞に、抗ｅＩＦ２Ｃ２発現カセット及び抗Ｄｉｃｅｒ発現カセットを含むｐｃＤＮＡ４（Invitrogen）ベクター、並びに薬剤選択のためのＺｅｏｃｉｎ耐性遺伝子をトランスフェクトした。
【０１７０】
実施例９〜実施例１１
実験方法
以下に記載される実施例９〜実施例１１に、以下の実験方法を使用した。
【０１７１】
ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡライブラリの構築
ｃＤＮＡからのＲＮＡｉライブラリ酵素産生（enzymatic production of RNAi libraries）（ＥＰＲＩＬ）法（D. Shirane et al., Nat. Genet. 36, 190-196 （2004））を適応することによって、ヒトＣＣＲ５配列に対して指向性を有するランダムｓｈＲＮＡライブラリを作製した。プライマー対（５’ＧＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡ３’）（配列番号２２）；５’ＧＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣ３’）（配列番号２３）とＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）とを使用して、ヒトＣＣＲ５ ｃＤＮＡをｐＢＡＢＥ．ＣＣＲ５プラスミドＤＮＡ（NIHのＡＩＤＳ調査及び参照試薬プログラム）からＰＣＲ増幅した。ＣＣＲ５ ｃＤＮＡをＤＮＡｓｅＩ（Qiagen）で一部消化し、１００ｂｐ〜２００ｂｐのＤＮＡ断片を生成した。ＤＮＡ断片を、ＭｍｅＩ制限酵素部位（５’ＧＴＣＧＧＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＧＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＣＧＡＣ３’）（配列番号２４）を含有するヘアピンアダプタ１（Ａｄ１）ＤＮＡリンカーとライゲートした。それから、ライゲートしたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）で処理した後、大腸菌ＤＮＡリガーゼ処理（NEB）を行い、Ａｄ１の５’末端とＣＣＲ５のＤＮＡ断片の３’末端との間の切れ目を閉じた。Ａｄ１とライゲートしたＤＮＡ（約４０ｎｔ）をＭｍｅＩ（NEB）で消化し、ネイティブＰＡＧＥゲルから精製した。精製したＤＮＡ断片をアダプタ２（Ａｄ２）リンカー（＋鎖：５’ＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＧＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＧＡＧＴＣ３’）（配列番号２５）（−鎖：５’ＴＡＣＣＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＮＮ３’）（ここで、Ｎはそれぞれの位置において任意のヌクレオチドである）（配列番号２６）とライゲートし、ネイティブＰＡＧＥゲルから精製した。精製したＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）で処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって切れ目を
閉じた。プライマー（５’ＧＡＣＴＣＡＣＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＧＡＡＧ３’）（配列番号２７）と、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片（NEB）と、ＰＡＧＥゲルから精製して得られた生成物とを使用して、Ａｄ２とライゲートしたＤＮＡ断片をプライマー伸長反応にかけた。精製したＤＮＡ断片をＢｐｍＩで消化し、クレノウ断片（NEB）で平滑末端化して、ＢａｍＨＩで消化し、ヒトＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと４Ｔ終結シグナルとを含有するｐＢＳｈＨ１〜５のプラスミドＤＮＡとライゲートした。ライゲーション混合物を電気穿孔法で大腸菌（ＸＬ１ ｂｌｕｅ）に導入し、一晩１０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンで２×ＹＴ寒天プレート上で平板培養した。約８０００個のコロニーを合わせて、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡをＢｃｇＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB）で平滑末端化して、再びライゲートし、余分なＤＮＡ配列を除去した。再びライゲートしたプラスミドＤＮＡは、ＭｆｅＩでさらに処理し、ＢｃｇＩで不完全にしか消化されなかったプラスミドの汚染を取り除き、大腸菌を形質転換するのに使用した。プラスミドＤＮＡの２０個のコロニーをシークエンシングし、ＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡ配列がランダムであることを確認した。配列を確認した後、Ｈ１プロモーターと、ｓｈＲＮＡ配列と、４Ｔ終結シグナルとから成るｓｈＲＮＡ発現単位は、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩの消化によってｐＢＳｈＨ１〜５プラスミドＤＮＡから切り取り、ＦＧ１２レンチウイルスベクターのＸｂａＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した（X.
F. Qin, D. S. An, I. S. Chen, D. Baltimore, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 2003. Jan. 7;100（1）:183.-8. 100, 183-188 （2003））。この手順はアカゲザルＣＣＲ５でも行った。
【０１７２】
レンチウイルスベクター産生及びｓｈＲＮＡライブラリスクリーニング
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）−Ｇ偽型レンチウイルスベクターの４００個のクローンを、９６ウェルプレート中の２９３Ｔ細胞で個々に作製した。移植の４８時間後に、各ウェルからベクター上清を回収し、９６ウェルプレート中のＣＣＲ５ＮＫＲＣＥＭ細胞を感染させるのに使用した。ヒトＣＣＲ５（２Ｄ７ ＡＰＣ、BD Biosciences）に対するモノクローナル染色及びフローサイトメトリ解析によって、感染の３日後、ＥＧＦＰ＋細胞におけるＣＣＲ５発現の低減を解析した。それらのＣＣＲ５発現の低減能によって、ｓｉＲＮＡを同定した。
【０１７３】
ヒト及びアカゲザルのＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡ
同定したｓｉＲＮＡの中で、（ｈｕ１００５）で示されるヒトｓｈＲＮＡ、及びＣＣＲ５に対して指向性を有する対応するアカゲザル（ｒｈ１００５）ｓｈＲＮＡは、以下で示される特に望ましい特性を有することが見出された。ヒトＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）配列（ＲＮＡ）を配列番号１７に示す。ｓｈＲＮＡライブラリスクリーニングから同定したヒトＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）の標的配列は、５’ＧＡＧＣＡＡＧＣＵＣＡＧＵＵＵＡＣＡＣＣ３’（配列番号１６）であり、プラスミドＤＮＡにおけるＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）配列は配列番号１８に示す。アカゲザルＣＣＲ５
ｓｈＲＮＡ（ｒｈ１００５）配列（ＲＮＡ）は配列番号２０に示す。アカゲザルのＣＣＲ５ ｍＲＮＡにおける対応するアカゲザルｓｈＲＮＡ ＣＣＲ５（ｒｈ１００５）標的配列は、５’ＧＡＧＣＡＡＧＵＵＣＡＧＵＵＵＡＣＡＣＣ３’（配列番号１９）であり、プラスミドＤＮＡにおけるアカゲザルＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（１００５）配列は配列番号２１に示す。ハイブリッド形成したオリゴＤＮＡ（センス ５’−ｇａｔｃｃｃｃＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣ−ＴＴＧＴＣＣＧＡＣ−ＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＣ−ＴＴＴＴＴｃ−３’）（配列番号２８）（アンチセンス ３’−ｇｇｇＣＴＣＧＴＴＣＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＴＧＧ−ＡＡＣＡＧＧＣＴＧ−ＣＣＡＣＡＴＴＴＧＡＣＴＴＧＡＡＣＧＡＧ−ＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴ−５’）（配列番号２９）をｐＢＳｈＨ１〜３プラスミドＤＮＡに挿入することによって、アカゲザルＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ発現単位を生成した（X. F. Qin, D. S. An, I. S. Chen, D. Baltimore, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2003 Jan. 7;100（1）: 183.-8. 100, 183-188（2003））。シークエンシングに
よって、ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ配列を確認した。
【０１７４】
比較目的で使用したＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）の標的配列（配列番号１３）は、以前に記載されている（D. S. An et al., Mol.Ther. 14, 494-504 （2006）、その全体が参照により本明細書中に援用される）。ヒトＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）配列（ＲＮＡ）は配列番号１４に示し、プラスミドＤＮＡにおけるヒトＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）配列を配列番号１５に示す。
【０１７５】
ＳＩＶｍａｃ２５１ベースのレンチウイルスベクター構築
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入試験のため、ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ発現単位をＳＩＶベースのベクターに挿入するために、ｐＳＩＶ−ｇａｍｅｓ４に由来するｐＳＩＶ−Ｒ４ＳＡＷ１０において、ＣｌａＩ部位にオリゴＤＮＡを挿入することによって、ＸｂａＩ部位及びＸｈｏＩ部位を作製した（P. E. Mangeot et al., J.Virol. 74, 8307-8315 （2000）、P. E. Mangeot et al., Mol.Ther. 5, 283-290 （2002））。ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ発現単位は、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩの消化によってｐＢＳｈＨ１〜３から切り取り、ｐＳＩＶ−Ｒ４ＳＡＷ１０のＸｂａＩ部位及びＸｈｏＩ部位に挿入した。動物移植試験のためのＳＩＶベクターを構築するために、オリゴＤＮＡリンカー（＋鎖 ５’ＣＧＡＴＡＣＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＡＣＧＣ３’）（配列番号３０）（−鎖５’ＧＴＣＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＧＴＡＴ３’）（配列番号３１）を使用して、ｐＣＳ−Ｒｈ−ＭＬＶ−ＥプラスミドＤＮＡ（S. Kung, An D.S., Chen I.S.Y., J. Virol. 74, 3668-3681 （2000））から切り出したＲｈＭＬＶ ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列を含有するＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片をＳＩＶベクター（ｐＳＩＶ−ＲＭＥＳ ＧＡＥ）のＣｌａＩ／ＳａｌＩ部位に挿入した（P. E. Mangeot et al., Mol.Ther. 5, 283-290 （2002））。これにより、ベクターｐＳＩＶ ＧＡＥ ＲｈＭＬＶ−Ｅが得られた。ＥＧＦＰ発現は、ＲｈＭＬＶプロモーターを使用して、非ヒト霊長類のリンパ球で効率的に発現することが示されている（S. Kung, An D.S., Chen I.S.Y., J. Virol. 74, 3668-3681
（2000））。Ｈ１プロモーター−ｓｈＲＮＡ発現単位を含有する、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化したＤＮＡ断片を、ｐＳＩＶ−ＧＡＥ ＲｈＭＬＶ−ＥベクターのＲｈＭＬＶプロモーターの前にあるＡｖｒＩＩ部位及びＳａｌＩ部位に挿入し、最終のｐＳＩＶ ＧＡＥ
ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ ＲｈＭＬＶ−Ｅベクターが得られた。
【０１７６】
レンチウイルスベクター形質導入
ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルス／レンチウイルスベクターストックは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって作製した。要するに、１０％ ＦＣＳと、１００単位のペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを含有するイスコブ改変イーグル培地中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。ベクタープラスミドと、ＭＬＶパッケージングプラスミド（ｐＳＶ−ｐｓｉ−ｅｎｖ−ＭＬＶ）（Landau NR and Littman DR, J. Virol 66, 5110-5113 （1992））と、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド（ｐＨＣＭＶＧ）（J. K. Yee, T. Friedmann, J. C. Burns, Methods Cell Biol. 43 Pt A:99-112, 99-112 （1994））とを同時トランスフェクトすることによって、ｐＢａｂｅ−ｒｈＣＣＲ５レトロウイルスベクターを作製した。ベクタープラスミドと、ＨＩＶ−１レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＲＳＶＲＥＶ及びｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（T. Dull et al., J.Virol. 72, 8463-8471（1998））とを同時トランスフェクトすることによって、ＨＩＶベクターを作製した。記載のリン酸カルシウムトランスフェクションで、ＳＩＶベクター、ＳＩＶパッケージングベクターｐＳＩＶ１５、ｐＧＲＥＶ、ｐＳＩ−ｋ−ＶＰＸプラスミドのＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、ｐＨＣＭＶＧ ＳＩＶベースのベクターを作製した（P. E. Mangeot et al,, Mol.Ther. 5. 283-290 （2002））。トランスフェクションの２日後に、ウイルス培養上清を回収し、超遠心分離によって３００倍に濃縮した。ＥＧＦＰ発現に基づき、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で濃縮したウイルスストックを滴定した。
【０１７７】
細胞
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＶＳＶ−Ｇ偽型ｐＢａｂｅ−ｒｈＣＣＲ５レトロウイルスベクターを感染させた後、ピューロマイシン選択することよって（１ｕｇ／ｍｌ）、ｒｈＣＣＲ５−２９３Ｔ細胞を作製した。NIHのＡＩＤＳ試薬プログラムからＣＣＲ５−ＮＫＲ−ＣＥＭを取得した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（GE healthcare life sciences）によるロイコパックからヒト初代末梢血単核細胞を単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳによって、アカゲザル初代末梢血単核細胞を末梢血から単離した。
【０１７８】
アカゲザル細胞の形質導入及び移植
使用する動物は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（National
Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）（保険社会福祉省［ＤＨＨＳ］公開番号ＮＩＨ８５−２３）のガイドラインに従って維持及び使用された集団飼育したアカゲザル（マカク・ムラット（Macaca mulatto：アカゲザル））であった。このプロトコルは、国立心肺血液研究所の動物実験委員会（Animal Care and Use Committee of National Heart, Lung, and Blood Institute）、ＮＩＨ／ＤＨＨＳで認可された。動物には、特定の病原菌が存在しなかった（サルＴ−リンパ向性ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルレトロウイルス及びヘルペスウイルスＢに対して血清学的に陰性であった）。
【０１７９】
ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞を末梢血（ＰＢ）に動員し、上記のように精製した（W. E. Sander et al., J.Nucl.Med. 47, 1212-1219（2006））。ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ、Cambrex Bio Science）を有するＸ−Ｖｉｖｏ １０血清無含有培地（BioWhittaker）中、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において、２日間１日１回、２．４の感染多重度で、ＶＳＶ−Ｇ偽型ＳＩＶ ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ ＲｈＭＬＶ−Ｅベクターを用いてｅｘ ｖｉｖｏで２匹の動物由来のＰＢのＣＤ３４+細胞（ＲＱ３５７０動物及びＲＱ５４２７動物それぞれに関して、７×１０7個及び１×１０8個）を形質導入した。１回目の形質導入の６４時間後のフローサイトメトリによるＥＧＦＰ発現の定量化によって形質導入効率を解析した。ＲＱ３５７０動物及びＲＱ５４２７動物でそれぞれ、細胞の１８％及び７．４％がＥＧＦＰ陽性であった。２匹の動物に１．６×１０8個の形質導入したＰＢ ＣＤ３４+細胞を自己移植した。全ての動物に、移植前に２日連続して（−１日目及び０日目、０日目は再注入の日である）、５Ｇｙの分割線量で全身に１０Ｇｙのγ線を照射し、動物を抗生物質、血液、及びしたがって流体支持体によって支持した。
【０１８０】
モノクローナル抗体及び染色法及びフローサイトメトリ解析
全血染色法を使用して、末梢血リンパ球中のモノクローナル抗体によって細胞表面上のＣＣＲ５を検出した（B. Lee, M. Sharron, L. J. Montaner, D. Weissman, R. W. Doms,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 96, 5215-5220 （1999））。要するに、ＥＤＴＡ処理全血を遠心分離して、血漿を除去した。濃縮血液（packed blood）５０μｌをモノクローナル抗体と混合し、室温で３０分間染色した後、塩化アンモニウム媒介性の赤血球溶解を行ない、ＰＢＳ中で２％ホルムアルデヒドによって固定した。ｅｘ ｖｉｖｏでのＰＨＡ／ＩＬ２刺激細胞の染色のために、ＰＢＳ １００μｌの入った２％ＦＣＳ中で、細胞（１×１０5個）を抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体（ヒトでは２Ｄ７）（アカゲザルでは３Ａ９）５μｌと混合し、室温で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳの入った２％ＦＣＳで洗浄し、２％ホルムアルデヒドの入ったＰＢＳで固定した。この試験で使用するモノクローナル抗体は、抗ヒトＣＣＲ５（２Ｄ７ ＡＰＣ、５５６９０３、BD Biosciences）、アカゲザルＣＣＲ５（３Ａ９ ＡＰＣ、５５０５８６、BD Biosciences）、ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ（５５０６３１、BD Biosciences）、ＣＤ８ＰＥ（５５５３６７、BD Biosciences）
、ＣＸＣＲ４ ＰＥ（５５５９７４、BD Biosciences）、ＣＤ４５ＲＯ ＰＥ−Ｃｙ７（３３７１６７、BD Biosciences）、ＣＤ９５ ＰＥ（５５６６４１、BD Biosciences）を含んでいた。ＦＡＣＳキャリバー（BD Biosciences）又はＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Beckman Coulter）によって、染色細胞を解析した。
【０１８１】
細胞選別
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（GE Healthcare Life Sciences）によって、末梢血由来の単核細胞を単離し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ細胞選別装置（BD Biosciences）によって、ＥＧＦＰ＋リンパ球集団及びＥＧＦＰ−リンパ球集団を単離した。選別細胞のフローサイトメトリ解析によって求められるように、ＥＧＦＰ＋集団及びＥＧＦＰ−集団の選別純度はそれぞれ、９２％及び９６％であった。
【０１８２】
小ＲＮＡ単離
製造業者の取扱説明書に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Invitrogen）を使用して刺激の９日後に、小ＲＮＡ分画をＰＨＡ／ＩＬ２刺激アカゲザル（rhesus monkey）の末梢血リンパ球（約４×１０8個の細胞）から単離した。
【０１８３】
ｓｉＲＮＡのノーザンブロット解析
分画化した小ＲＮＡ ２５μｇを１５％尿素−アクリルアミド−ＴＢＥゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ、National diagnostics）上に分散させ、０．５×ＴＢＥ中で１時間８０ボルトでナイロン膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ、NEN）に電気移動（electrotransferred：エレクトロトランスファー）させた。膜を乾燥させ、ＵＶ架橋して、１時間８０℃で焼成した。製造業者の取扱説明書に従って、Ｓｔａｒｆｉｒｅオリゴキット（Integrated
DNA Technologies）及びα−32Ｐ ｄＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、PerkinElmer）を使用して、オリゴヌクレオチドプローブ（センス：ＧＡＧ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＡＧ ＴＴＴ ＡＣＡ ＣＣ（配列番号３２）、アンチセンス：ＧＧＴ ＧＴＡ ＡＡＣ ＴＧＡ ＡＣＴ ＴＧＣ ＴＣ）（配列番号３３）を標識した。ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）−オリゴ（Ambion）中で一晩３７℃で、プローブを膜とハイブリッド形成させた。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間３７℃で３回膜を洗浄した。ブロットをホスホルイメージングプレートに曝露した後、標準として合成ｒｈＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡ（ＧＧＵ ＧＵＡ ＡＡＣ ＵＧＡ ＡＣＵ ＵＧＣ ＵＣ（配列番号３４）、Sigma-Proligo）でのホスホルイメージャ（phosphorimager）（ストームシステム、Molecular Dynamics）を使用する解析によって、シグナル検出及びノーザンブロット解析を実施した。
【０１８４】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析
公開されたプライマー対及びプローブを利用して、アカゲザルＣＣＲ５ ｍＲＮＡ及びβ２ミクログロブリンを検出した（J. J. Mattapallil et al.434,1093-1097, Nature, （2005））。トリゾール試薬（Invitrogen）によって、全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を選別したＥＧＦＰ＋アカゲザルＰＢＬ又はＥＧＦＰ−アカゲザルＰＢＬから単離し、Qiagenの一工程ＲＴ−ＰＣＲキット及び以下の条件（ＲＴ反応で５０℃、３０分及び５５℃、１０分、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＲＴ不活性化及び活性化で９５℃、１５分、ＰＣＲで９５℃、１５秒、５５℃、３０秒及び６０℃、９０秒を５０サイクル）を使用して、ＲＴ ＰＣＲ反応にかけた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ
Ｔ７、Ambion）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したアカゲザルＣＣＲ５及びβ２ミクログロブリンのＲＮＡを段階希釈することによって、ＣＣＲ５及びβ２ミクログロブリンのｍＲＮＡ定量化のためのＲＮＡ標準を作製した。
【０１８５】
ｓｉＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析
リアルタイムステム−ループＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、アカゲザルＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のレベルを定量した（C. Chen et al., Nucleic Acids Res.
33, e179 （2005））。トリゾール試薬（Invitrogen）によって、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）をアカゲザルＰＢＬから単離し、ＲＴ反応（１６℃３０分、４２℃３０分、８５℃５分）にかけた後、ＰＣＲ（９５℃１０分を１サイクル、９５℃１５秒及び５８℃１分を５０サイクル）を行った。プライマー及びプローブの配列は以下の通りである。ＲＴステムループプライマー：５’ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡ３’（配列番号３５）、フォワードプライマー：５’ＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＣ３’（配列番号３６）、リバースプライマー：５’ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ（配列番号３７）；プローブ：６−ＦＡＭ−ＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡ−ＭＧＢ（配列番号３８）。ｒｈＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡの段階希釈した合成２２ｎｔアンチセンス鎖の組（ＧＧＵ ＧＵＡ ＡＡＣ ＵＧＡ ＡＣＵ ＵＧＣ ＵＣ、Sigma-Proligo）（配列番号３９）を定量のための標準として使用した。
【０１８６】
ＳＩＶ産生及び感染
選別したＥＧＦＰ＋アカゲザルＰＢＬ又はＥＧＦＰ−アカゲザルＰＢＬをＰＨＡ（５ｕｇ／ｍｌ、Sigma）及びＩＬ２（濃縮）で２日間刺激した。それからＰＨＡを除去し、細胞をＩＬ２でさらに２日間刺激した。細胞（１×１０5個）に、３７℃で１時間ＳＩＶｍａｃ２３９（０．０４の感染多重度）１００ｕｌを感染させ、２％ＦＣＳの入ったＰＢＳで２回洗浄し、媒体で１回洗浄して、ＩＬ２の入ったＲＰＭＩ ２０％ＦＣＳ中で再懸濁し、培養した。
【０１８７】
産生したウイルスをＣＥＭＸ１７４細胞で伝播した。ＳｐｈＩ消化によって線形化したＳＩＶｍａｃ２３９プラスミドＤＮＡの５’側の半分と３’側の半分とをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。記載のように、ＭＡＧＩ ＣＣＲ５細胞で、ウイルスストックの感染力価を求めた（４×１０4感染単位／ｍｌ）（ｐ２７値＝７２ｎｇ／ｍｌ）（B. Chackerian, E. M. Long, P. A. Luciw, J. Overbaugh, J.Virol. 71 , 3932-3939（1997））。
【０１８８】
ＥＬＩＳＡ
製造業者の取扱説明書に従って、ＣＯＵＬＴＥＲ ＳＩＶコア抗原アッセイを使用して、ＳＩＶ感染培養上清におけるＳＩＶ ｐ２７コア抗原のレベルを測定した（カタログ番号６６０４３９５、Beckman Coulter）。
【０１８９】
実施例９
ヒトＣＣＲ５配列に対して指向性を有するｓｈＲＮＡのランダムライブラリをスクリーニングし、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において明確な毒性はなく、図１６Ａ〜図１６Ｂで示されるように、今日までに特徴付けられたｓｈＲＮＡの中でＣＣＲ５を阻害するのに最も強力であった、標的配列を含むｓｉＲＮＡを同定した（標識ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５））（配列番号１６）。これまでに記載の強力なｓｈＲＮＡとは異なり（D. S. An et al., Mol. Ther. 14, 494-504（2006））、このｓｉＲＮＡ（配列番号１７）の発現は、１２日の培養期間にわたり形質導入Ｔリンパ球の増殖速度を変えなかった。
【０１９０】
ＣＥＭ−ＮＫＲ−ＣＣＲ５細胞に、９６ウェルプレートにおいてヒトＣＣＲ５に対してランダムｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを形質導入し、３日間培養して、ＧＦＰ−発現集団におけるＣＣＲ５発現に関して、フローサイトメトリによって解析した。図１６Ａで示されるように、スクリーニングした４００個のｓｈＲＮＡのうち、ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）は、これまでに公開されたｓｈＲＮＡ（ｈｕ１３）（配列番号１４）よりも効率的にＣＣＲ５を低減した。図１６Ｂは、ヒト初代リンパ球（ｈｕＰＢＬ）において内因性ＣＣＲ５発現の効率的な低減を示すデータを示す。ＰＨＡ
／ＩＬ２活性化ｈｕＰＢＬに、ｓｈＲＮＡ（ｈｕ１００５）（配列番号１７）を保有するレンチウイルスベクターを形質導入し、モノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリによって、ＧＦＰ＋集団におけるＣＣＲ５発現に関して感染の８日後に解析した。ＧＦＰ＋集団におけるＣＣＲ５発現の割合を算出し、それぞれのパネルの上部に示した。図１６〜図１７に示されるように、「Ｍｏｃｋ」という表示はベクターの形質導入がないことを示している。「ｓｈＲＮＡなし」という表示は、ｓｈＲＮＡ発現がないベクターの形質導入を示している。
【０１９１】
実施例１０
本実施例において、アカゲザルＣＣＲ５（ｒｈ１００５）（配列番号２０）に対するｓｈＲＮＡをｒｈＣＣＲ５発現２９３Ｔ細胞で調べた。アカゲザルＣＣＲ５（ｒｈ１００５）ｓｈＲＮＡ（配列番号２０）は、ヒトＣＣＲ５（ｈｕ１００５）とは２つのヌクレオチドが異なり、ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれで単一ヌクレオチドの違いがある。アカゲザル造血幹細胞移植モデルはおそらく、ヒトにおける造血幹細胞移植に最も近いモデルである。細胞にｒｈＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡ（１００５）（配列番号２０）を保有するＳＩＶベースのレンチウイルスベクターを形質導入し、形質導入の４日後にモノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリによって、ＣＣＲ５及びＧＦＰの発現に関して解析した。図１７Ａで示されるように、ｒｈＣＣＲ５のｓｈＲＮＡは、ｒｈＣＣＲ５−２９３Ｔ細胞におけるｒｈＣＣＲ５発現を低減したが、図１７Ａで示されるように、標的配列における単一ヌクレオチドミスマッチのために、ヒトＣＣＲ５発現ＣＣＲ５ＮＫＲＣＥＭ細胞においてヒトＣＣＲ５を低減しなかった。同様に、ｈｕＣＣＲ５のｓｈＲＮＡはヒトＣＣＲ５を低減したが、アカゲザルＣＣＲ５は低減しなかった。相同的なヒトＣＣＲ５のｓｈＲＮＡと同じように、明らかな細胞毒性は存在しなかった（データ図示せず）。
【０１９２】
実施例１１
末梢血動員アカゲザルＣＤ３４＋細胞に形質導入した後、骨髄除去動物に自己移植することによって、アカゲザルＣＣＲ５のｓｈＲＮＡ（ｒｈ１００５）（配列番号２０）の機能及び安全性を調べた。本実施例では、ＰＨＡ／ＩＬ２活性化初代アカゲザルリンパ球に、アカゲザルＣＣＲ５（ｒｈ１００５）（配列番号２０）に対するｓｈＲＮＡを発現するＳＩＶベクター発現を感染させ、ＧＦＰ＋細胞及びＧＦＰ−細胞において、フローサイトメトリによって、ＣＣＲ５発現を解析した。ホタルルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを発現するベクターを対照として使用した。また図１７Ｂで示されるように、初代アカゲザルＰＢＭＣにおけるＲｈＣＣＲ５のｓｈＲＮＡによって、ＣＣＲ５発現を阻害した。
【０１９３】
続いて、２匹のアカゲザル（ＲＱ３５７０及びＲＱ５４２７）に、このベクターを形質導入したＣＤ３４＋ ＨＳＣ細胞を移植した。２匹の動物由来の非ヒト霊長類の動員及び免疫選択したＰＢ ＣＤ３４＋細胞に、ｅｘ ｖｉｖｏで血清無含有培地中で、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２日間１日１回、２．４の感染多重度でベクター（ＳＩＶ ｒｈＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ ＲｈＭＬＶ−Ｅ）をｅｘ ｖｉｖｏ形質導入した。１回目の形質導入の６４時間後のフローサイトメトリによるＥＧＦＰ発現の定量化によって形質導入効率を解析した。ＲＱ３５７０動物及びＲＱ５４２７動物でそれぞれ、細胞の１８％及び７．４％がＥＧＦＰ陽性であった。２匹の動物に１．６×１０8個の形質導入したＰＢ ＣＤ３４＋細胞を自己移植した。全ての動物に、移植前に２日連続して（−１日目及び０日目、０日目は再注入の日である）、５Ｇｙの分割線量で全身に１０Ｇｙのγ線を照射した。白血球数は、７日目〜８日目の間に、１０００細胞数／μｌまで回復し、血小板数は５００００個／μｌ未満になることはなかった）。今までベクターにおけるＥＧＦＰレポーターによるフローサイトメトリ解析でモニタリングされたような正常な速度及びマーキングは、１１ヶ月間、顆粒球、単球及びリンパ球系統（それぞれ、白色四角、黒色四角及び黒色三角の集団で示される）で観察された（図１８Ａ
）。
【０１９４】
図１８Ｂで示されるように、ＣＣＲ５の細胞表面発現は、検査した全ての時点（移植後、最大９ヶ月）でＥＧＦＰ−集団に比べてＥＧＦＰ＋集団の方が低減した。ＣＣＲ５下方調節の程度は、３倍〜１０倍の範囲だった。これに対して、ＥＧＦＰを発現するが、ｓｈＲＮＡを有さないレンチウイルスベクターを移植した対照動物２ＲＣ００３は、任意の時点でＣＣＲ５下方調節の痕跡を示していなかった。図１８Ｂは、フローサイトメトリによってモニタリングされたＧＦＰ＋細胞（黒色グラフ）及びＧＦＰ−細胞（灰色グラフ）におけるＣＣＲ５発現の割合を示している。
【０１９５】
移植マカク由来の末梢血をＣＣＲ５に対して染色し、リンパ球集団におけるＣＣＲ５及びＥＧＦＰの発現をフローサイトメトリで解析した。図１８Ｃの（それぞれの象限で示される）それぞれの象限での事象の割合に基づき、ＧＦＰ＋リンパ球集団及びＧＦＰ−リンパ球集団におけるＣＣＲ５発現の割合を算出し、それぞれのパネル図の上部に示す。ＥＧＦＰ＋細胞で、ＣＣＲ５のｍＲＮＡレベルの５倍〜１０倍の低減が見られ、これはＣＣＲ５細胞表面発現のフローサイトメトリ解析に一致していた（データ図示せず）。
【０１９６】
１匹の移植アカゲザル由来のリンパ球のマイクロノーザンブロット解析は、ｓｈＲＮＡ形質導入動物ＲＱ３５７０由来のＰＨＡ／ＩＬ２刺激リンパ球の小ＲＮＡ分画において、ＣＣＲ５のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に対応する２２ヌクレオチドバンドが存在し（図１８Ｄ）、対照動物２ＲＣ００３由来の細胞では存在しなかったことを示した。ＲＴ−ＰＣＲによるｓｉＲＮＡのレベルのさらなる定量は、１つのＥＧＦＰ＋細胞当たりおよそ３×１０4個のｓｉＲＮＡ分子の発現を示し、これは両方の動物で一致していた。この数は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入されたアカゲザルＰＢＬから発現されたｓｉＲＮＡのレベルにも一致する（データ図示せず）。
【０１９７】
重要なことに、造血細胞分化による１１ヶ月間のこの試験にわたるＣＣＲ５のｓｉＲＮＡの発現にもかかわらず、明らかな毒性は見られなかった。正常な速度での移植後に、顕著に細胞レベルが増大し、試験の間、１４ヶ月にわたり安定していた。図１９Ａ〜図１９Ｃに示されるように、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＸＣＲ４ケモカイン（ｃ−ｘ−ｃモチーフ）受容体４、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ９５（ｆａｓ）のフローサイトメトリプロファイルは、ＥＧＦＰ＋亜集団及びＥＧＦＰ−亜集団とほぼ同一である。ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ９５−細胞は、天然Ｔリンパ球集団を表すが、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ９５＋は記憶Ｔリンパ球集団を表す（J. J. Mattapallil et al. 434, 1093-1097, Nature, （2005））。図２０で示されるように、ＥＧＦＰ標識したリンパ球は、培養下で非形質導入細胞と同じ速度でＰＨＡ及びＩＬ２刺激に対して正常に応答し、最大１２日間、同じ頻度で維持される。図２１で示されるように、ＥＧＦＰ−集団ではＣＣＲ５の全体発現が、細胞集団の５％〜３５％増大するにもかかわらず、ＥＧＦＰ＋集団でのＣＣＲ５表面発現の低減は、ｅｘ ｖｉｖｏ培養と同じ期間持続する。
【０１９８】
次に、サル免疫不全ウイルス感染に対するアカゲザルＰＢＬの感受性を調べた。移植の１３ヵ月後のＲＱ３５７０由来の末梢血リンパ球を、ＧＦＰ＋集団及びＧＦＰ−集団で分け、２日間、ＰＨＡ／ＩＬ２で、及び２日間、ＩＬ２で刺激した。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−の選別純度はそれぞれ、９３．４％及び９９．９％であった。刺激後、０．０４の感染多重度（ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５細胞での滴定によるウイルスストックの感染単位は４×１０4／ｍｌであった）で１時間、１×１０5個のＧＦＰ＋細胞又はＧＦＰ−細胞にＳＩＶｍａｃ２３９ １００μｌを感染させ、培養下で、１１日間ｐ２７産生に関してモニタリングした。感染実験を三重で行った。培養上清中の平均ｐ２７産生（ｎｇ／ｍｌ）及び誤差バー（標準偏差）を図２２Ａに示す。細胞数に基づき、同程度の効率で両方の亜集団を増殖した。
【０１９９】
図２２Ｂは、フローサイトメトリ解析によって、ｅｘ ｖｉｖｏ培養中にモニタリングし、ＧＦＰ＋選別リンパ球集団（黒色グラフ）とＧＦＰ−選別リンパ球集団（灰色グラフ）との間で比較したＣＣＲ５発現を示している。感染時でのＣＣＲ５発現の割合及びＭＦＩは、ＧＦＰ＋集団で４％及び９．９％であり、ＧＦＰ−集団で８％及び１６．２％であった。図２２Ｃで示されるように、９日の培養期間にわたって、細胞のＧＦＰ＋集団は、ＧＦＰ−集団よりも約３倍低いレベルのＳＩＶｍａｃ２３９ ｐ２７抗原を産生した。ＣＣＲ５発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＧＦＰ＋選別細胞では黒色グラフで示し、ＧＦＰ−選別細胞（ＰＨＡ／ＩＬ２活性化リンパ球）では灰色グラフで示す。耐性度は比較的軽微であったが（培養中、３倍）、ＣＣＲ５レベルが、レクチン／ＩＬ−２刺激のために、ｅｘ ｖｉｖｏで有意に増大したことに留意することが重要である。さらに、ＣＣＲ５がＳＩＶ侵入に対する主要且つ最も有効な補助受容体として報告されているが、ＣＣＲ５が存在しないとき、ＳＩＶは、他の補助受容体を利用することが報告されている（例えばP. A. Marx and Z. Chen, Semin. Immunol. 10, 215-223（1998）を参照されたい）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッケージング細胞株にレトロウイルス構築物をトランスフェクトすること、
前記パッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収すること、及び
ｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞に前記組換えレトロウイルスを感染させることを含む細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法であって、
前記組換えレトロウイルス構築物が、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、第１のＲＮＡコード領域、及び第１の終結配列を含み、
前記ＲＮＡコード領域の発現によって、標的遺伝子又はゲノム転写物が低下するように調節され、
前記第１のＲＮＡコード領域は、配列番号１６を含むｓｉＲＮＡをコードすることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡコード領域が配列番号１７から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡコード領域がヘアピン領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的細胞内の前記ＲＮＡコード領域の発現が、少なくとも約１０日間、該標的細胞の増殖速度を変えない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えレトロウイルス構築物がさらに、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡコード領域が、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードし、該センス領域は該アンチセンス領域と実質的に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ループ領域は約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡコード領域が、標的領域と実質的に相補的であり、該標的領域が、１５ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡコード領域が、標的領域と実質的に相補的であり、該標的領域が、１８ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記パッケージング細胞株がＨＥＫ２９３細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記５’ＬＴＲ配列がＨＩＶに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記自己不活性化３’ＬＴＲがエンハンサー配列が欠失したＵ３因子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己不活性化３’ＬＴＲが修飾ＨＩＶ３’ＬＴＲである、請求項５に記載の方法
【請求項１４】
前記組換えレトロウイルスが偽型である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えレトロウイルスが水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって偽型となっている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記５’ＬＴＲ配列がモロニーマウス白血病ウイルスに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記５’ＬＴＲ配列がマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的細胞が造血細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的細胞がＣＤ３４陽性造血細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的ＣＤ３４陽性造血細胞を患者から単離することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
感染したＣＤ３４陽性造血細胞を前記患者へ再導入することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が培養細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
患者からＣＤ３４陽性標的細胞を単離すること、及び
前記標的細胞に、レトロウイルス構築物をトランスフェクトしたパッケージング細胞株から回収された組換えレトロウイルスを感染させることを含むＨＩＶに感染した患者を治療する方法であって、
前記組換えレトロウイルス構築物が、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、配列番号１７をコードする第１のＲＮＡコード領域、及び第１の終結配列を含み、
前記ＲＮＡコード領域の発現によって、ＣＣＲ５が低下するように調節されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記ＲＮＡコード領域がヘアピン領域を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的細胞内の前記ＲＮＡコード領域の発現が、少なくとも約１０日間、該標的細胞の増殖速度を変えない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記組換えレトロウイルス構築物がさらに、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡコード領域が、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードし、該センス領域が該アンチセンス領域と実質的に相補的である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的領域は、１８ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と作動可能に連結された配列番号１７をコードする第１のＲＮＡコード領域
、及び第１の終結配列を含む組換えレトロウイルスを標的細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させることを含む細胞内でＲＮＡ分子を発現する方法であって、前記第１のＲＮＡコード領域の発現によって、前記標的細胞においてＣＣＲ５が低下するように調節されることを特徴とする方法。
【請求項３２】
配列番号１７を含む小ＲＮＡ分子。
【請求項３３】
ヒト末梢血単核細胞における前記ｓｉＲＮＡの発現が、少なくとも約１０日間、該細胞の増殖速度を変えない、請求項３２に記載の小ＲＮＡ分子。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡがヘアピン領域を含む、請求項３２に記載の小ＲＮＡ分子。
【請求項３５】
細胞に、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、第１のＲＮＡコード領域、及び第１の終結配列を含む組換えレンチウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトすることを含む細胞においてＣＣＲ５を低下するように調節する方法であって、前記ＲＮＡコード領域が配列番号１７をコードすることを特徴とする方法。
【請求項１】
パッケージング細胞株にレトロウイルス構築物をトランスフェクトすること、
前記パッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収すること、及び
ｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞に前記組換えレトロウイルスを感染させることを含む細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法であって、
前記組換えレトロウイルス構築物が、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、第１のＲＮＡコード領域、及び第１の終結配列を含み、
前記ＲＮＡコード領域の発現によって、標的遺伝子又はゲノム転写物が低下するように調節され、
前記第１のＲＮＡコード領域は、配列番号１６を含むｓｉＲＮＡをコードすることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡコード領域が配列番号１７から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡコード領域がヘアピン領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的細胞内の前記ＲＮＡコード領域の発現が、少なくとも約１０日間、該標的細胞の増殖速度を変えない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えレトロウイルス構築物がさらに、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡコード領域が、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードし、該センス領域は該アンチセンス領域と実質的に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ループ領域は約２ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡコード領域が、標的領域と実質的に相補的であり、該標的領域が、１５ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡコード領域が、標的領域と実質的に相補的であり、該標的領域が、１８ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記パッケージング細胞株がＨＥＫ２９３細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記５’ＬＴＲ配列がＨＩＶに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記自己不活性化３’ＬＴＲがエンハンサー配列が欠失したＵ３因子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己不活性化３’ＬＴＲが修飾ＨＩＶ３’ＬＴＲである、請求項５に記載の方法
【請求項１４】
前記組換えレトロウイルスが偽型である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えレトロウイルスが水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって偽型となっている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記５’ＬＴＲ配列がモロニーマウス白血病ウイルスに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記５’ＬＴＲ配列がマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的細胞が造血細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的細胞がＣＤ３４陽性造血細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的ＣＤ３４陽性造血細胞を患者から単離することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
感染したＣＤ３４陽性造血細胞を前記患者へ再導入することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が培養細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
患者からＣＤ３４陽性標的細胞を単離すること、及び
前記標的細胞に、レトロウイルス構築物をトランスフェクトしたパッケージング細胞株から回収された組換えレトロウイルスを感染させることを含むＨＩＶに感染した患者を治療する方法であって、
前記組換えレトロウイルス構築物が、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、配列番号１７をコードする第１のＲＮＡコード領域、及び第１の終結配列を含み、
前記ＲＮＡコード領域の発現によって、ＣＣＲ５が低下するように調節されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記ＲＮＡコード領域がヘアピン領域を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的細胞内の前記ＲＮＡコード領域の発現が、少なくとも約１０日間、該標的細胞の増殖速度を変えない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記組換えレトロウイルス構築物がさらに、レンチウイルス５’長末端反復（ＬＴＲ）及び自己不活性化レンチウイルス３’ＬＴＲ由来のＲ配列及びＵ５配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡコード領域が、センス領域と、アンチセンス領域と、ループ領域とを有するＲＮＡ分子をコードし、該センス領域が該アンチセンス領域と実質的に相補的である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的領域は、１８ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域と作動可能に連結された配列番号１７をコードする第１のＲＮＡコード領域
、及び第１の終結配列を含む組換えレトロウイルスを標的細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させることを含む細胞内でＲＮＡ分子を発現する方法であって、前記第１のＲＮＡコード領域の発現によって、前記標的細胞においてＣＣＲ５が低下するように調節されることを特徴とする方法。
【請求項３２】
配列番号１７を含む小ＲＮＡ分子。
【請求項３３】
ヒト末梢血単核細胞における前記ｓｉＲＮＡの発現が、少なくとも約１０日間、該細胞の増殖速度を変えない、請求項３２に記載の小ＲＮＡ分子。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡがヘアピン領域を含む、請求項３２に記載の小ＲＮＡ分子。
【請求項３５】
細胞に、第１のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、第１のＲＮＡコード領域、及び第１の終結配列を含む組換えレンチウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトすることを含む細胞においてＣＣＲ５を低下するように調節する方法であって、前記ＲＮＡコード領域が配列番号１７をコードすることを特徴とする方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【公表番号】特表２０１０−５２０７５７（Ｐ２０１０−５２０７５７Ａ）
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５２９１１（Ｐ２００９−５５２９１１）
【出願日】平成２０年３月７日（２００８．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５６２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０９８３７
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０１２７２９３７）カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー (25)
【出願人】（５０９２５３１１４）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月７日（２００８．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５６２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０９８３７
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０１２７２９３７）カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー (25)
【出願人】（５０９２５３１１４）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (1)
【Ｆターム（参考）】
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