細胞培養担体及び細胞培養方法
【課題】間葉系幹細胞を簡便かつ均一な形状で３次元に凝集化させ、生体内組織に性質が一致し、かつ、分化状態が均一な細胞凝集塊を効率的に大量に得ることができる細胞培養担体及びこれを用いた細胞培養方法を提供する。
【解決手段】上面に細胞を培養するための複数のウェルが形成されており、前記上面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であり、前記ウェルは、開口部が円形状又は矩形状であり、開口径が７０〜５５０μｍであり、中心点の間隔が８０〜７００μｍであり、ジルコニアセラミックス焼結体からなり、かつ、該セラミックス焼結体の平均細孔径が０．１５〜０．４５μｍである細胞培養担体、および該担体を用いる細胞培養方法。
【解決手段】上面に細胞を培養するための複数のウェルが形成されており、前記上面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であり、前記ウェルは、開口部が円形状又は矩形状であり、開口径が７０〜５５０μｍであり、中心点の間隔が８０〜７００μｍであり、ジルコニアセラミックス焼結体からなり、かつ、該セラミックス焼結体の平均細孔径が０．１５〜０．４５μｍである細胞培養担体、および該担体を用いる細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞を細胞凝集塊として培養するのに好適に用いることができる細胞培養担体及びこれを用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell）は、間葉系組織中に存在する未分化細胞であり、自己増殖能と、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等の中胚葉系の細胞への分化能とを有していることが知られている。また、近年、間葉系幹細胞は、肝細胞等の中胚葉系以外の細胞や、拍動する心筋にも分化することが分かり、多分化能を有することが報告された。
このため、間葉系幹細胞は、再生医療への利用が期待されており、自己再生が難しい部位に間葉系幹細胞を移植する細胞治療の臨床研究が始まっている。
【０００３】
間葉系幹細胞を特定の組織細胞に分化させるためには、細胞の分化を誘導する因子が必要である。現在、間葉系幹細胞を、骨、脂肪、軟骨、肝臓、心筋等に分化誘導できる因子を特定する研究が進められており、これらの各組織に効率よく分化誘導することができるようになってきている。
【０００４】
間葉系幹細胞の分化誘導は、細胞をシャーレに播種して２次元的な条件で培養することにより行われる。
しかしながら、このような２次元的な環境で間葉系幹細胞を分化誘導した場合、３次元的な構造を有する生体内組織の本来の性質とは異なるものとなる。特に、間葉系幹細胞から軟骨への分化誘導をシャーレで行うと、ほとんどの間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化しないことが知られている。
【０００５】
したがって、間葉系幹細胞から軟骨細胞に分化誘導する場合、３次元凝集塊を形成した間葉系幹細胞を分化誘導する必要がある。
しかしながら、間葉系幹細胞は、シャーレ上では扁平かつ単一でしか増殖せず、肝細胞のように自己凝集する性質は見られない。
【０００６】
そこで、間葉系幹細胞を強制的に凝集化させるための方法として、ペレット培養法等の方法が主に用いられている（非特許文献１参照）。
また、特許文献１に記載されているような、複数の凹部を有する３次元的な形状の培養担体を用いて培養することも検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−３０６９８７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mark F. Pitternger, et al.,Science, 284, 1999, p.143-146
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献１に記載されているペレット培養法は、１５ｍｌ遠心チューブに細胞の懸濁液を入れ、遠心分離によって細胞を強制的に沈降させて凝集化させる方法であり、細胞に与える機械的刺激が強く、細胞を損傷させるため、状態のよい細胞塊を得ることが困難であった。
また、ペレット培養法により、凝集化させた間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化誘導すると、生体内軟骨細胞（硝子軟骨細胞）が発現している遺伝子である、ＴｙｐｅIIコラーゲンやアグリカンの発現が確認できる。
しかしながら、さらに分化が進んだ肥大軟骨細胞が発現しているＴｙｐｅＸコラーゲンや間葉系幹細胞に特異的なＣＤ１０５の発現も確認でき、生体内組織に性質が一致した均一な軟骨組織に該凝集塊を分化誘導することができないという問題が見られた。
さらに、特許文献１に記載されているような複数の凹部を有する３次元培養担体を用いた場合も、凹部のみに間葉系幹細胞を凝集化させることができず、生体内組織に性質が一致し、かつ、分化状態がより均一な組織に分化誘導することができないという問題が見られた。
【００１０】
したがって、間葉系幹細胞を静置培養で細胞凝集塊を形成させて、生体内組織に性質が一致し、かつ、分化状態が均一な組織に分化誘導することができる細胞培養担体及び細胞培養方法が求められている。
【００１１】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、間葉系幹細胞を簡便かつ均一な形状で３次元に凝集化させ、生体内組織に性質が一致し、かつ、分化状態が均一な細胞凝集塊を効率的に大量に得ることができる細胞培養担体及びこれを用いた細胞培養方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る細胞培養担体は、間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に複数のウェルが形成されており、前記上面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることを特徴とする。
上面がこのような表面状態を有する担体を用いることにより、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着しないため、球状を維持することができる。あるいは、間葉系幹細胞の培養初期段階で、間葉系幹細胞が上面に付着して扁平状になった場合においても、ある程度の時間が経過すると、扁平状になった間葉系幹細胞は球状化する。しかも、この上面に複数のウェルが形成されているため、球状の間葉系幹細胞がウェルに移動、凝集し、間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に大量に培養することができるとともに、間葉系幹細胞から、生体内組織と性質が似ている硝子軟骨細胞、脂肪細胞や骨芽細胞等の組織細胞に効率よく分化誘導することができる。
【００１３】
前記細胞培養担体において、ウェルは、開口部が円形状又は矩形状であり、開口径が７０〜５５０μｍであることが好ましい。
このようなウェル形状及びウェル開口径とすることにより、ウェル内において、間葉系幹細胞を培養する際の凝集塊の３次元構造化及びそのサイズをより適切に制御することができ、また、硝子軟骨細胞へ分化誘導する場合においても、分化状態がより均一な軟骨組織等の生体内組織を得ることが可能となる。
【００１４】
前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることが好ましい。
少なくともウェル底面も、担体上面と同様の表面粗さとすることにより、ウェル底面に細胞が扁平状に付着することがなく、ウェル底に接着した細胞が球状になりやすく、細胞凝集塊を形成しやすくなる。
【００１５】
また、近隣する前記ウェルの中心点の間隔が、８０〜７００μｍであることが好ましい。
このような間隔を設けることにより、ウェル内により効率的に細胞を入れることができ、かつ、ウェル内で凝集化した細胞塊に酸素や栄養等を安定して供給できる。
【００１６】
また、前記細胞培養担体は、セラミックス焼結体からなり、かつ、該セラミックス焼結体の平均細孔径が０．１５〜０．４５μｍであることが好ましい。
前記担体をセラミックス焼結体で構成することにより、上記のような表面粗さの上面を形成しやすくなる。また、このような平均細孔径とすることにより、前記ウェルに形成された細胞凝集塊に対し、担体裏面から分化誘導因子、栄養、酸素等をより効率的に供給することができる。
【００１７】
前記セラミックスは、間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に培養する観点から、ジルコニアが使用されることが好ましい。
前記セラミックスにジルコニアを使用することにより、担体表面に対する培養液を介在した状態での間葉系幹細胞の耐変特性を抑制することができる。
【００１８】
また、前記細胞培養担体の上面は、接触するセラミックス粒子の凹凸を認識して形状を変える細胞の性質に鑑みて、平坦性がより低いセラミックス焼結後の非加工面であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る細胞培養方法は、上記の細胞培養担体を用いた細胞培養方法であって、容器内に前記細胞培養担体の上面を上にして配置した後、前記容器内に第１の培養液を供給し、該第１の培養液を前記細胞培養担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる工程と、前記第１の培養液を浸透させた細胞培養担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を播種する工程と、前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記細胞培養担体全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導するための第３の培養液を前記容器内に供給し、前記細胞培養担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞のうちのいずれかの組織細胞に分化誘導する工程とを備えていることを特徴とする。
このような培養方法によれば、間葉系幹細胞の凝集塊の形成、さらに、該凝集塊から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、簡便かつ効率的に行うことができる。
【００２０】
前記第２の培養液中の間葉系幹細胞数は、前記担体１ｃｍ2あたり１×１０4個以上１×１０6個以下とすることが好ましい。
このような培養方法を行うことにより、ウェル内に複数個の細胞が侵入しやすくなり、細胞凝集塊をより効率的に形成することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る細胞培養担体を用いれば、間葉系幹細胞を簡便に均一な３次元形状に凝集化させ、生体内組織に性質が一致した細胞凝集塊を効率的に大量に得ることができる。
また、前記細胞培養担体を用いた本発明に係る細胞培養方法によれば、間葉系幹細胞の凝集塊の形成、及び、該凝集塊から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、簡便かつ効率的に行うことができ、しかも、分化状態が均一な軟骨組織を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】試験例１−１に係るジルコニア原料粉（未焼成粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）の表面骨格の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真（２５０００倍）である。
【図２】試験例１−１に係るジルコニア原料粉（未焼成粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）についての水銀圧入法で測定した細孔径分布を表すグラフである。
【図３】試験例１−１に係る開口径１００μｍのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）で培養したヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図４】試験例１−２に係るジルコニア原料粉（１１５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）の表面骨格のＳＥＭ写真（２５０００倍）である。
【図５】試験例１−２に係るジルコニア原料粉（１１５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）についての水銀圧入法で測定した細孔径分布である。
【図６】試験例１−２に係るジルコニア原料粉（１１５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図７】試験例１−３に係るジルコニア原料粉（１２５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）の表面骨格のＳＥＭ写真（２５０００倍）である。
【図８】試験例１−３に係るジルコニア原料粉（１２５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）についての水銀圧入法で測定した細孔径分布である。
【図９】試験例１−３に係るジルコニア原料粉（１２５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図１０】試験例１−４に係るジルコニア原料粉（１３５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）の表面骨格のＳＥＭ写真（２５０００倍）である。
【図１１】試験例１−４に係るジルコニア原料粉（１３５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）についての水銀圧入法で測定した細孔径分布である。
【図１２】試験例１−４に係るジルコニア原料粉（１３５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図１３】実施例１に係る開口径７８μｍ、１７５μｍ、５１０μｍのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体（１１５０℃焼成）で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（ウェル開口径７８μｍ、１７５μｍ：５００倍、ウェル開口径５１０μｍ：１００倍）である。
【図１４】比較例１に係る開口径１７５μｍのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体（１１５０℃焼成）で培養したＨｅｐＧ２のＳＥＭ写真（担体全域：１００倍、ウェル凹部：５００倍、ウェル凸部：１０００倍）である。
【図１５】比較例２に係るシャーレで培養したｈＭＳＣの透過型顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１６】比較例３に係るジルコニア平板（１１５０℃）上で培養した細胞のＳＥＭ写真である。
【図１７】実施例２、比較例４において、ジルコニア製細胞培養担体又はペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を、１、２、３週間（１Ｗ、２Ｗ、３Ｗ）軟骨細胞に分化誘導した各組織の発現遺伝子と、ヒト由来硝子軟骨細胞の発現遺伝子とのマーカーの比較を示したものである。
【図１８】実施例３において、ウェル開口径７８μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍの細胞培養担体又はペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を軟骨細胞に分化誘導した各組織の発現遺伝子のマーカーの比較を示したものである。
【図１９】実施例４、比較例５において、ジルコニア製細胞培養担体又はペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織をサフラニンＯ染色したものの透過型顕微鏡写真（ａ．ペレット法：１００倍、ｂ．ペレット法（軟骨組織中心部）：４００倍、ｃ．ペレット法（軟骨組織外側）：４００倍、ｄ．ウェル開口径５１０μｍ細胞培養担体：１００倍、ｅ．ウェル開口径５１０μｍ細胞培養担体：４００倍）である。
【図２０】実施例４、比較例５において、ジルコニア製細胞培養担体又はペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織をトルイジンブルー染色したものの透過型顕微鏡写真（ａ．ペレット法：１００倍、ｂ．ペレット法（軟骨組織中心部）：４００倍、ｃ．ペレット法（軟骨組織外側）：４００倍、ｄ．ウェル開口径５１０μｍ細胞培養担体：１００倍、ｅ．ウェル開口径５１０μｍ細胞培養担体：４００倍）である。
【図２１】試験例２において、ウェル開口径３０μｍ、７０μｍ、５４０μｍ、１４１０μｍの細胞培養担体で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（ウェル開口径３０、７０μｍ：２５０倍、ウェル開口径５４０μｍ、１４１０μｍ：１００倍）である。
【図２２】比較例６に係るアルミナ原料粉で作製したアルミナ製細胞培養担体の表面骨格のＳＥＭ写真（２５０００倍）である。
【図２３】比較例６に係る開口径８０μｍのウェルが配列したアルミナ製細胞培養担体で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図２４】実施例５、比較例７において、ジルコニア製細胞培養担体又はシャーレ上で形成したｈＭＳＣの凝集塊を脂肪細胞に分化誘導した各組織の発現遺伝子のマーカーの比較を示したものである。
【図２５】実施例５において、ジルコニア製細胞培養担体で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた脂肪細胞をオイルレッドＯ染色したものの顕微鏡写真（１００倍）である。
【図２６】比較例７において、シャーレ上で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた脂肪細胞をオイルレッドＯ染色したものの透過型顕微鏡写真（１００倍）である。
【図２７】実施例６、比較例８において、ジルコニア製細胞培養担体又はシャーレ上で形成したｈＭＳＣの凝集塊を骨芽細胞に分化誘導した各組織の発現遺伝子のマーカーの比較を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について、図面を参照して、より詳細に説明する。
本発明に係る細胞培養担体は、間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に細胞を培養するための複数のウェルが形成されており、かつ、前記上面が所定の表面粗さを有しているものである。
本発明において適用される細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり、具体的には、骨髄、臍帯血、脂肪等から採取可能な間葉系幹細胞、又は、組織由来の前駆細胞及びこれらの細胞を不死化した細胞である。
本発明に係る細胞培養担体は、このような均一な形状の間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に大量に形成し、また、間葉系幹細胞から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞を効率よく分化誘導することができるものである。
【００２４】
前記担体の上面は、具体的には、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０の表面状態である。
上面がこのような表面状態を有する担体を用いることにより、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着しないため、球状を維持することができる。あるいは、間葉系幹細胞の培養初期段階に、間葉系幹細胞が上面に付着して扁平状になった場合においても、ある程度の時間が経過すると、扁平状になった間葉系幹細胞は球状化する。しかも、この上面に複数のウェルが形成されているため、球状の間葉系幹細胞が、ウェルに移動、凝集し、間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に形成させ、大量に培養することができるとともに、間葉系幹細胞から生体内組織に一致している硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞を効率よく分化誘導することができる。
２乗平均粗さＲｑ及び線密度が上記数値範囲外である場合、細胞が扁平形状となり、該担体上面に接着して、細胞凝集塊を形成しなくなる傾向がある。
【００２５】
この原因については、明確ではないが、下記のような現象に起因するものと予測される。
担体上面が、マクロなフラット面あるいは所定面積のミクロなフラット面を有する表面状態であると、これに伴い、間葉系幹細胞が扁平化して密着してしまう。しかしながら、このようなフラット面が存在せず、上記の特定の凹凸面である場合には、間葉系幹細胞が扁平化することなく球状を維持することができ、かつ、担体上面に複数のウェルが存在するため、当該球状の間葉系幹細胞がウェル内に移動し、凝集化する。特に、担体上面における凹凸形状の凸部上面に、ミクロなフラット面が存在しないことが重要であると推測される。
【００２６】
ここで、２乗平均粗さＲｑ及び線密度は、表面粗さを規定するためのパラメータである。
ここでいう線密度とは、面方向のパラメータであり、長さ１μｍあたりの粗さ曲線が平均面と交差する回数を表している。
なお、本発明における２乗平均粗さＲｑは、ＪＩＳ・Ｂ ０６０１により測定したものである。
また、線密度は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、スケール０．８μｍ、スキャンサイズ１０μｍ×１０μｍにて測定したものである。
【００２７】
前記細胞培養担体上面に形成されているウェルは、開口部が円形状又は矩形状であり、開口径が７０〜５５０μｍであることが好ましい。
ウェル開口部の形状は、細胞の播種や細胞塊の形成が容易であること、また、ウェルの加工容易性等の観点から、円形状又は矩形状であることが好ましい。
ここで、ウェルの開口径は、開口部の形状が円形の場合は、この円の直径を意味し、矩形の場合は、対向する辺の間隔を意味する一方、多角形の場合は、１つの辺とこれに対向する頂点に接する平行線との間隔を意味する。
【００２８】
また、上記範囲内のウェル開口径の担体で培養することにより、間葉系幹細胞の凝集塊を軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞へ分化誘導する際、この担体のウェル内において、そのまま、間葉系幹細胞の凝集塊のサイズをより制御しながら分化誘導することができ、また、ペレット法等の従来の分化誘導法と比較して、生体内軟骨細胞等の組織細胞の性質に近く、複数の種類の細胞が混在することなく、分化状態がより均一な軟骨組織等の生体内組織を得ることが可能となる。
さらに、前記ウェルの深さも、細胞凝集塊のサイズの制御等の観点から、前記ウェル開口径と同様に、７０〜５００μｍであることが好ましい。一方、前記ウェル開口径が７０μｍ未満又は５５０μｍを超える場合は、間葉系幹細胞が所望する３次元細胞凝集塊を形成しにくくなる。
【００２９】
前記担体のウェルの少なくとも底面の表面状態も、該担体の上面の表面粗さと同様に、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることが好ましい。
少なくとも前記ウェル底面も上記のような表面状態であれば、細胞が球状に維持されやすく、ウェル内の空間内で、細胞凝集塊をより形成しやすくなる。
一方、前記２乗平均粗さＲｑ及び線密度が上記数値範囲外である場合、細胞が該ウェル底面に扁平形状に接着して、細胞凝集塊が形成されにくくなる。
なお、前記担体のウェル内は、上記底面のみならず、側壁部も前記担体の上面と同じ２乗平均粗さＲｑと線密度との各数値範囲内であることがより好ましい。
【００３０】
前記細胞培養担体は、所定の表面粗さを有する上面に、上記のような近隣するウェルの中心点の間隔が、８０〜７００μｍの間隔でパターン化して配列されていることが好ましい。
ウェルの中心点の間隔が８０μｍ未満である場合、形成された細胞凝集塊同士の距離が近くなり、培地中の酸素や栄養等が細胞に供給されにくくなる。一方、ウェルの中心点の間隔が７００μｍを超える場合、球状化した細胞のウェル内への移動が困難となる。
また、上記のようなウェルの間隔を設けることにより、ウェル内に細胞を確実に入れることができる。
また、所定数の細胞を担体に確実に播種するために、前記担体の外周に、上面よりも高い壁が形成されていることが好ましい。
【００３１】
また、前記細胞培養担体の材質は、セラミックス焼結体であることが好ましい。
セラミックス焼結体により細胞培養担体を構成することにより、セラミックス粒子が形成する凹凸構造のみで、該細胞培養担体の上面を上記のような表面状態にすることが簡易にできる。
また、セラミックス焼結体は、隣り合うセラミックス粒子間に細孔を有しているが、この細孔は、該細胞培養担体の下面（裏面）からウェル内に、栄養や誘導因子等を毛細管現象によって浸透させて供給する役割を果たす。
なお、前記セラミックス焼結体の気孔率は、上記のような栄養や誘導因子等の浸透性を確保し、また、担体としての強度を保持する等の観点から、１０〜５０％であることがより好ましい。
【００３２】
前記セラミックス焼結体の平均細孔径は、０．１５〜０．４５μｍであることが好ましい。
上記のような平均細孔径であれば、上記セラミックス焼結体による効果がより顕在化する。
なお、前記平均細孔径は、水銀ポロシメータを用いて、水銀圧入法により測定することができる。
【００３３】
また、上述したように、細胞は、接触するセラミックス粒子の凹凸を認識して形状を変えることから、セラミックス焼結体表面を加工すると、その表面の状態や傷等の影響を受けるため、前記担体の上面は、セラミックス焼結後、そのままの表面状態、すなわち、非加工面であることが好ましい。
さらに、セラミックス表面で細胞凝集塊を形成させるためには、細胞と接触するセラミックス粒子の２次粒子の平均粒子径が０．６〜１．２μｍであることが好ましい。
なお、本発明における２次粒子の平均粒子径は、セラミックス原料を純水に懸濁させて、超音波処理を１０分行った後、大塚電子（株）ＥＬＳＺ−２を用いて、粒度分布の平均値を算出（レーザードップラー法）したものである。
【００３４】
上記のようなセラミックス焼結体からなる担体の表面粗さ、平均細孔径及び平均粒子径は、焼結体の製造時に、セラミックス原料粉の仮焼、成形体の焼成温度等の調整をすることによって適宜制御することができる。安定した焼成を行うために、必要に応じて、安定化剤等を添加してもよい。
【００３５】
前記セラミックスの材料としては、生体親和性、生体適合性に優れており、細胞の足場として適しているものとして、ジルコニア、チタニア、アルミナ又はハイドロキシアパタイト等を用いることができる。これらの中でも、本発明においては、間葉系幹細胞の細胞凝集塊を効率的に形成させることができることから、ジルコニアを用いることがより好ましい。
【００３６】
なお、前記担体をジルコニアにより製造する場合には、ジルコニアの安定化剤として、イットリア、酸化マグネシウム、酸化カルシウム又は酸化セリンのうちのいずれか１種以上を３〜１５重量％含有させることが好ましい。
これらの安定化剤を添加することによって、ジルコニアの相転移が抑制され、安定して焼成することができ、上記のような表面粗さを有する担体を好適に得ることができる。
例えば、平均粒子径０．８μｍのジルコニア原料粉に、安定化剤としてイットリアを５．６重量％添加して、１０５０〜１１５０℃で焼成することにより、好適な表面粗さを有する細胞培養担体を作製することができる。
【００３７】
また、前記ウェル底面の形状は、中央部が凹んだ湾曲形状又は半球状であることが好ましい。
このような形状とすることにより、ウェル内に侵入した複数の細胞が凝集化して、細胞凝集塊をより形成しやすくなる。
【００３８】
また、本発明に係る細胞培養方法は、上記のような本発明に係る担体を用いて行う細胞培養方法であり、容器内に前記担体の上面を上にして配置した後、前記容器内に第１の培養液を供給し、これを前記担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる工程と、この担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を培養する工程と、前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記担体全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞等に分化誘導するための第３の培養液を前記容器内に供給し、前記担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞のうちのいずれかの組織細胞に分化誘導する工程とを経ることにより行われる。
上述した本発明に係る担体を用いて、このような工程を経ることにより、間葉系幹細胞の凝集塊の形成及び該細胞凝集塊からの硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、担体上の細胞を移動させることなく行うことができ、硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞の培養を簡便かつ効率的に行うことができる。
本発明の細胞培養方法においては、前記第２の培養液中の間葉系幹細胞数を前記担体１ｃｍ2あたり１×１０4個以上１×１０6個以下とすることが好ましい。
これによって、前記細胞培養担体を用いて所望サイズの３次元細胞凝集塊をより効率的に培養することができる。
【００３９】
以下、上記培養方法を工程順に詳細に説明する。
まず、容器内に前記担体の上面を上にして配置して、前記容器と担体との隙間に第１の培養液を供給する。そして、この培養液を、前記担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる。
上記のようにして、第１の培養液を供給することにより、培養液を前記担体の上面に直に供給するのではなく、該担体の下面（裏面）から担体中の細孔を通じて、毛細管現象により担体に培養液を浸透させることができるため、培養液に培養の阻害要因となり得る気泡を包含させることなく、複数のウェル内に満遍なく培養液を行き渡らせることができる。
【００４０】
前記第１の培養液（培地）の種類は、特に限定されるものではないが、間葉系幹細胞の培養においては、例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好ましい。さらに、これらの培地に、ＦＢＳ（ウシ血清）、グルタミン酸等の細胞を維持するのに必要な物質が添加される。
また、間葉系幹細胞を細胞治療のツールとして用いる場合は、市販されている無血清培地を用いることがより好ましい。
【００４１】
次に、この担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を担体に播種する。
このようにして、間葉系幹細胞を培養液に懸濁させた状態で前記担体の上面に滴下して播種することにより、間葉系幹細胞を負荷なく、担体上面に沈降させることができ、前記ウェル内でのスムーズな凝集化を達成することができる。ここで用いられる培地の種類は、前記第１の培養液と同様のものでよい。
【００４２】
前記担体に播種する間葉系幹細胞数は、担体１ｃｍ2あたり１×１０4個以上１×１０6個以下であることが好ましい。
上記のような密度で間葉系幹細胞を播種することにより、前記細胞培養担体を用いて、所望サイズの３次元細胞凝集塊をより効率的に培養することができる。
【００４３】
次に、前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記担体全体を第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる。
上記の第２の培養液の滴下による播種工程においては、ウェル内外を問わず、担体表面のあらゆる箇所に、細胞が付着しているが、本工程において、第１の培養液中に担体全体を浸漬させて、好ましくは４８時間以上静置することにより、ウェル外の担体上面に付着していた細胞が、担体から離脱することなく、ウェル内に移動し、ウェル内で凝集塊を形成する。
【００４４】
そして、前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、第３の培養液を前記容器内に供給し、担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、ウェル内で凝集塊を形成した間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導する。
このように、間葉系幹細胞の培養に用いた担体のままで、培養液を変えることにより、ウェル内において、間葉系細胞から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を行うことができる。
【００４５】
前記第３の培養液は、凝集化した間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導するための培地であり、基本培地としてはＤＭＥＭを使用することができ、適宜改良して用いてもよい。さらに、ＴＧＦβ、ＢＭＰ等を添加することが好ましく、また、アスコルビン酸、プロリン、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸等の添加剤を添加してもよい。
ＴＧＦβは、ＴＧＦβファミリーに属するものであればいずれでもよいが、ＴＧＦβ−３を用いることが好ましい。また、ＴＧＦβと同様の作用を示す低分子化合物を用いて代替することもできる。添加するＴＧＦβの量は１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
ＢＭＰとしては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６等が用いられ、ＢＭＰ６を用いることが好ましい。また、低分子化合物を用いて代替することもできる。添加するＢＭＰの量は、１００〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍｌである。
また、添加するアスコルビン酸（好ましくはアスコルビン酸２−リン酸）の量は、１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌである。
また、添加するプロリンの量は、１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約４０μｇ／ｍｌである。
また、添加するデキサメタソンの量は、１０〜５００ｎＭ、好ましくは１００ｎＭである。
また、添加するインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸は、市販のＩＴＳ溶液を適正濃度になるように添加する。
なお、間葉系幹細胞から軟骨、脂肪、骨芽細胞に誘導する分化誘導培地が市販されており、これらも使用可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［試験例１−１］ジルコニア原料未焼成粉による細胞培養担体
平均粒子径が０．６〜０．９μｍであるジルコニア原料粉を所望のウェル形状より若干小さいサイズとなるパターン化された複数の凸形状を有する特殊鋳型を用いて、開口径１００μｍ、深さ１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、室温で静置後、前記鋳型から成型体を取り出し、これを所定の温度で２４時間乾燥し、１０５０℃、１１５０℃、１２５０℃、１３５０℃、１５００℃でそれぞれ２時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々８２μｍ、７８μｍ、６４μｍ、６０μｍ、５５μｍであった。
上記開口径の算出方法は、まず、ウェルの中心点を通る８本の直径線をランダムに引き、ウェルの開口径の平均値を算出する。これを、ウェル２０個についてそれぞれ実施した後、ウェル１個あたりの開口径の平均値を算出した。
なお、ウェルの開口径は、マイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００：キーエンス）を用いて測定した。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図１、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図２に示す。
なお、平均粒子径は、セラミックス原料を純水に懸濁後、超音波処理を１０分おこなった後、大塚電子（株）ＥＬＳＺ-２を用いて粒度分布の平均値を算出（レーザードップラー法）した。
【００４７】
図１に示したＳＥＭ写真から分かるように、焼成温度が高くなるにつれて、粒子が焼結して緻密化が進むことが認められた。
また、図２のグラフに示したように、焼成温度が高くなるにつれて、緻密化が進み、微細孔が小さくなることが確認された。平均細孔径は、それぞれ、１０５０℃で焼成したものは０．１７μｍ、１１５０℃で焼成したものは０．１５μｍ、１２５０℃で焼成したものは０．１７μｍであり、１３５０℃及び１５００℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
【００４８】
また、上記において作製した各担体を、滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を１×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図３に示す。
【００４９】
図３に示したＳＥＭ写真から分かるように、１０５０℃及び１１５０℃で焼成した担体を用いた場合、ｈＭＳＣは、ウェル内に集まり、球状の細胞が凝集塊を形成していることが認められ、該担体の上面（ウェル外）には、細胞は接着していなかった。１２５０℃で焼成した担体を用いた場合は、ウェル内で細胞の凝集塊が形成されているが、該担体の上面に扁平な細胞が接着していた。１３５０℃及び１５００℃で焼成した担体を用いた場合は、ウェル内外に扁平細胞が接着していた。
【００５０】
［試験例１−２］ジルコニア原料１１５０℃仮焼粉による細胞培養担体
試験例１−１で用いたジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成して、粒子径の平均値が０．７５〜１．２μｍの２次粒子を得た。この２次粒子を用いて、試験例１−１と同様にして、開口径１００μｍ、深さ１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１０５０℃、１１５０℃、１２５０℃、１３５０℃、１５００℃でそれぞれ２時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々９０μｍ、８５μｍ、７５μｍ、６５μｍ、５５μｍであった。上記開口径の算出方法は上記のとおりである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のＳＥＭ写真を図４、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図５に示す。
【００５１】
図４に示したＳＥＭ写真から分かるように、１１５０℃仮焼成の２次粒子で作製した担体は、未焼成原料粉で作製した担体（試験例１−１）と比較して、大きい粒子で構成されており、また、焼成温度が高くなるにつれて、粒子が焼結して緻密化が進むことが認められた。
また、図５のグラフに示したように、試験例１−１と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、１０５０℃で焼成したものは０．２５μｍ、１１５０℃で焼成したものは０．２２μｍ、１２５０℃で焼成したものは０．２０μｍであり、１３５０℃及び１５００℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
【００５２】
また、上記において作製した各担体を用いて、試験例１−１と同様にして、ｈＭＳＣを培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図６に示す。
【００５３】
図６に示したＳＥＭ写真から分かるように、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃焼成した担体を用いた場合、ｈＭＳＣは、ウェル内に集まり、球状の細胞が凝集塊を形成していることが認められ、該担体の上面（ウェル外）には、細胞は接着していなかった。１３５０℃及び１５００℃で焼成した担体を用いた場合は、ウェル内外に扁平細胞が接着していた。
【００５４】
［試験例１−３］ジルコニア原料１２５０℃仮焼粉による細胞培養担体
試験例１−１で用いたジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成して、粒子径の平均値が０．８〜１．２μｍの２次粒子を得た。この２次粒子を用いて、試験例１−１と同様にして、開口径１００μｍ、深さ１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１０５０、１１５０、１２５０、１３５０、１５００℃でそれぞれ２時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々９２μｍ、８８μｍ、７７μｍ、６５μｍ、５７μｍとなる。上記開口径の算出方法は上記のとおりである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のＳＥＭ写真を図７、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図８に示す。
【００５５】
図７に示したＳＥＭ写真から分かるように、１２５０℃仮焼粉で作製した担体は、未焼成原料粉又は１１５０℃仮焼粉で作製した担体（試験例１−１、１−２）と比較して、大きい粒子で構成されており、また、焼成温度が高くなるにつれて、粒子が焼結して緻密化が進むことが認められた。
また、図８のグラフに示したように、試験例１−１、１−２と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、１０５０℃で焼成したものは０．４５μｍ、１１５０℃で焼成したものは０．３４μｍ、１２５０℃で焼成したものは０．４２μｍであり、１３５０℃及び１５００℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
【００５６】
また、上記において作製した各担体を用いて、試験例１−１と同様にして、ｈＭＳＣを培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図９に示す。
【００５７】
図９に示したＳＥＭ写真から分かるように、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃焼成した担体を用いた場合、ｈＭＳＣは、ウェル内に集まり、球状の細胞が凝集塊を形成していることが認められ、該担体の上面（ウェル外）には、細胞は接着していなかった。１３５０℃及び１５００℃で焼成した担体を用いた場合は、ウェル内外に扁平細胞が接着していた。
【００５８】
［試験例１−４］ジルコニア原料１３５０℃仮焼粉による細胞培養担体
試験例１−１で用いたジルコニア原料粉を１３５０℃で仮焼成して、粒子径の平均値が１．０〜２．５μｍの２次粒子を得た。この２次粒子を用いて、試験例１−１と同様にして、開口径１００μｍ、深さ１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１０５０、１１５０、１２５０、１３５０、１５００℃でそれぞれ２時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々８５μｍ、８２μｍ、７５μｍ、６７μｍ、５８μｍであった。上記開口径の算出方法は上記の通りである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のＳＥＭ写真を図１０、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図１１に示す。
【００５９】
図１０に示したＳＥＭ写真から分かるように、１３５０℃仮焼成の２次粒子で作製した担体は、未焼成原料粉、１１５０℃仮焼成の２次粒子又は１２５０℃仮焼成の２次粒子で作製した担体（試験例１−１、１−２、１−３）と比較して、大きい粒子で構成されており、また、焼成温度が高くなるにつれて、粒子が焼結して緻密化が進むことが認められた。
また、図１１のグラフに示したように、試験例１−１〜１−３と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、１０５０℃で焼成したものは０．６４μｍ、１１５０℃で焼成したものは０．９１μｍ、１２５０℃で焼成したものは０．７２μｍであり、１３５０℃及び１５００℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
【００６０】
また、上記において作製した各担体を用いて、試験例１−１と同様にして、ｈＭＳＣを培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図１２に示す。
【００６１】
図１２に示したＳＥＭ写真から分かるように、すべての焼成温度で、ウェル内外に扁平細胞が接着していた。
【００６２】
また、上記試験例１−１〜１−４で作製した各担体で培養された細胞の形状について、各担体上面の２乗平均粗さＲｑとの関係を表１に、各担体上面の線密度との関係を表２に示す。
なお、２乗平均粗さＲｑは、ＪＩＳ Ｂ ０６０１により測定したものである。
また、線密度は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、スケール０．８μｍ、スキャンサイズ１０μｍ×１０μｍにて測定したものである。
【００６３】
【表１】
【００６４】
【表２】
【００６５】
表１及び２で示した結果から、担体上面の２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下の場合、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３以下の場合にｈＭＳＣは凝集塊を形成する傾向が認められた。
【００６６】
さらに、上述した構成に加え、ウェルの少なくとも底面の２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下の場合、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３以下の場合、ｈＭＳＣは凝集塊をより形成する傾向が認められた。
【００６７】
［実施例１］ｈＭＳＣの培養
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１１５０℃で焼成して作製した、開口径及び深さが７８μｍ、１７５μｍ、５１０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体に、試験例１−１と同様にして、０．５×１０4、１×１０4、２．５×１０4、５×１０4個のｈＭＳＣを播種して培養した。
播種して７日経過後のＳＥＭ写真を図１３に示す。
【００６８】
図１３に示したＳＥＭ写真から分かるように、ウェル開口径７８μｍの場合、ｈＭＳＣを１×１０4個以上播種すると、ウェル内で凝集化する傾向が認められた。
また、ウェル開口径１７５μｍ以上の場合、播種細胞数を５×１０4個以上にすると、細胞が凝集化しやすくなる傾向が認められた。
【００６９】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体についても、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。その結果、これらの各培養担体においても、ウェル内で凝集化する傾向が認められた。
【００７０】
［比較例１］ＨｅｐＧ２の培養
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが１７５μｍのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体を作製した。この担体表面は、２乗平均粗さＲｑ＝１０３．２２ｎｍ、線密度＝２．７１であった。
この担体を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、ヒト肝ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２）を５×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して７日経過後のＳＥＭ写真を図１４に示す。
【００７１】
図１４に示したＳＥＭ写真から分かるように、本発明に係る構成を備えた細胞培養担体では、ＨｅｐＧ２はウェル内（凹部）で凝集塊を形成せず、また、凸部（上面）にも接着していた。
【００７２】
［比較例２］ｈＭＳＣのシャーレでの通常培養
ゼラチンがコーティングされた直径１０ｃｍのシャーレに、不死化されたｈＭＳＣを３×１０5個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日後のシャーレ表面の透過型顕微鏡写真を図１５に示す。
【００７３】
図１５に示した透過型顕微鏡写真から分かるように、シャーレ上では、ｈＭＳＣは凝集塊を形成せず、扁平形状に接着していた。
【００７４】
［比較例３］ｈＭＳＣのジルコニア製平板での培養
成形型を凸形状のないフラットな面を有するものとしたことを除いて、比較例１と同様に、ジルコニア製平板を作製した。この平板表面は、２乗平均粗さＲｑ＝１００．８ｎｍ、線密度＝２．０１であった。
この平板を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたｈＭＳＣを１×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図１６に示す。
【００７５】
図１６に示したＳＥＭ写真から分かるように、ジルコニア製平板でｈＭＳＣを培養すると、細胞が球状化したが、凝集塊の形成は認められなかった。
このことから、ｈＭＳＣの凝集化には、ウェル構造が必要であり、また、効率的な凝集化のためには、ウェル底部も平面でなく、湾曲形状であることが好ましいと考えられる。
【００７６】
［実施例２］ｈＭＳＣの硝子軟骨細胞への分化誘導
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１１５０℃で２時間焼成して、開口径及び深さが７０μｍの担体を作製した。
この担体を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたｈＭＳＣを５×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種してから３日目に、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）に変え、３週間分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて１、２、３週間経過後、それぞれ、担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出には、ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ社）を用い、そのプロトコルに従って、ｍＲＮＡを抽出・精製した。
得られたＲＮＡについて、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、逆転写後、軟骨分化マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＴｙｐｅＸコラーゲン、ＴｙｐｅIIコラーゲン、ＣＯＭＰ、アグリカン、Ｓｏｘ９、ｌｕｎｘ２及びｃｈＭ１の発現をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確認した。
これらの軟骨分化マーカーを図１７に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織、及び、硝子軟骨由来正常細胞についてのマーカーも併せて示す。
【００７７】
ここで、各マーカーの発現は、＋：発現、−：非発現として表すと、ｈＭＳＣは、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１０５＋、ＴｙｐｅＸコラーゲン−、ＴｙｐｅIIコラーゲン−、ＣＯＭＰ−、Ａｇｇｒｅｃａｎ−、Ｓｏｘ９−、ｌｕｎｘ２−、ｃｈＭ１−であり、ヒト由来軟骨細胞（硝子軟骨細胞）は、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１０５−、ＴｙｐｅＸコラーゲン−、ＴｙｐｅIIコラーゲン＋、ＣＯＭＰ＋、Ａｇｇｒｅｃａｎ＋、Ｓｏｘ９＋、ｌｕｎｘ２−、ｃｈＭ１−であり、成熟・肥大軟骨細胞は、ＴｙｐｅＸコラーゲン＋、ＴｙｐｅIIコラーゲン−、ＣＯＭＰ−、Ａｇｇｒｅｃａｎ−、Ｓｏｘ９−、ｌｕｎｘ２＋、ｃｈＭ１＋である。
【００７８】
図１７に示した結果から分かるように、細胞培養担体のウェルによってサイズを制御して培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した場合、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＴｙｐｅIIコラーゲン、ＣＯＭＰ、アグリカン、Ｓｏｘ９が発現し、誘導期間が長くなるほど発現量が多くなった。また、ＴｙｐｅＸコラーゲン、ｌｕｎｘ２、ｃｈＭ１の発現は確認されず、ヒト体内から採取した硝子軟骨細胞の発現遺伝子と同じであることが確認された。
【００７９】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが１７５μｍ及び５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが１７５μｍ及び５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが１７５μｍ及び５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体についても、これらを用いて、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。これらの培養細胞についても、軟骨分化マーカーによって確認したところ、ヒト体内から採取した硝子軟骨細胞の発現遺伝子と同じであることが確認された。
【００８０】
［比較例４］ペレット法によるｈＭＳＣの硝子軟骨細胞への分化誘導
不死化されたｈＭＳＣ２．５×１０5個をＤＭＥＭ５ｍｌで懸濁させて１５ｍｌチューブに入れ、遠心分離によって該チューブの底でペレットを形成した。アスピレータでＤＭＥＭを吸引後、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）に変え、３週間分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて１、２、３週間経過後、それぞれ、担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出及びＰＣＲによる軟骨分化マーカーの確認は、実施例２と同様にして行った。
これらの軟骨分化マーカーを、実施例２の結果と併せて、図１７に示す。
【００８１】
図１７に示した結果から分かるように、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した場合、硝子軟骨細胞が特異的に発現する遺伝子であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＴｙｐｅIIコラーゲン、ＣＯＭＰ、アグリカン及びＳｏｘ９が発現したが、ＴｙｐｅＸコラーゲンの発現も確認された。
このことから、得られた軟骨細胞は、目的の硝子軟骨細胞の他に、成熟・肥大化した軟骨細胞が含まれており、分化状態が均一な軟骨組織ではないことが認められた。
【００８２】
［実施例３］各ウェル開口径でのｈＭＳＣの硝子軟骨細胞への分化誘導
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが１００μｍ、２００μｍ、４００μｍ、６００μｍのウェルが配列したジルコニア製の各細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１１５０℃で２時間焼成して開口径及び深さが７８μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍの担体を作製した。
上記において作製した各担体を用いて、実施例２と同様にして、ｈＭＳＣの培養及び分化誘導を行った。
分化誘導を始めて３週間経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出には、ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ社）を用い、そのプロトコルに従って、ｍＲＮＡを抽出・精製した。
得られたＲＮＡについて、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、逆転写後、間葉系幹細胞マーカーであるＣＤ１０５、成熟・肥大硝子軟骨細胞マーカーであるＴｙｐｅＸコラーゲン、硝子軟骨細胞のマーカーであるＴｙｐｅIIコラーゲンの発現をＰＣＲによって確認した。
これらのマーカーを図１８に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織についてのマーカーも併せて示す。
【００８３】
図１８に示した結果から分かるように、ウェル開口径７８〜５１０μｍの細胞培養担体で培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織は、ＴｙｐｅIIコラーゲンが発現し、ＴｙｐｅＸコラーゲンとＣＤ１０５の発現がなかったことから、均一な硝子軟骨細胞に誘導されていることが認められた。
一方、ペレット法で得られた軟骨組織は、ＴｙｐｅIIコラーゲン、ＴｙｐｅＸコラーゲン及びＣＤ１０５が発現していたことから、間葉系幹細胞、硝子軟骨細胞、成熟・肥大軟骨細胞が混在した組織になっていることが確認された。
【００８４】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体についても、これらを用いて、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。これらの培養細胞について、軟骨分化マーカーによって確認したところ、ヒト体内から採取した硝子軟骨細胞の発現遺伝子と同じであることが確認された。
【００８５】
［実施例４］分化誘導された軟骨組織の染色
実施例３において、分化誘導を３週間行った細胞培養担体（ウェル開口径及び深さが５１０μｍ）から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ社）を用いて固定を行った。その後、エタノールを７０、８０、９０、１００％の順で加えて脱水を行い、キシレンで置換した。
そして、この担体のウェル内から、ピペッティングにより軟骨組織を回収し、パラフィンを用いて包埋した。この包埋したブロックから、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社）を用いて、厚さ５μｍの切片を切り出した。この切片を、スライドガラスに貼り付け、キシレン、１００、９０、８０、７０％エタノールの順で浸液させて脱パラフィン処理を行い、軟骨組織部分を染色できる状態にした。
これを３％酢酸に浸した後、軟骨細胞が産生する細胞外基質であるグリコサミノグリカンを特異的に染色するサフラニンＯ又はトルイジンブルー液にそれぞれ、５分間浸液させた。そして、エタノール、キシレンで脱水処理を行い、封入剤を用いて封入した。
サフラニンＯ染色した組織の透過型顕微鏡写真を図１９、トルイジンブルー染色した組織の透過型顕微鏡写真を図２０に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織の染色状態も併せて示す。
【００８６】
図１９及び図２０に示した透過型顕微鏡写真から分かるように、本発明に係る細胞培養担体で培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織は、サフラニンＯ染色（赤紫色）及びトルイジンブルー染色（青紫色）のいずれも、中心部まで均一に染色されており、得られた軟骨組織は内外ともに均一な軟骨細胞組織が形成されていることが認められた。
【００８７】
また、実施例２、３で述べた各焼成温度で作製して得られた種々の開口径及び深さのジルコニア製細胞培養担体においても、同様の結果が得られた。
【００８８】
［比較例５］ペレット法により分化誘導された軟骨組織の染色
比較例４において、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊からの分化誘導を３週間行った組織から分化誘導培地を除去し、その後の処理は、実施例４と同様にして、サフラニンＯ又はトルイジンブルーによる染色を行った。
サフラニンＯ染色した組織の透過型顕微鏡写真を図１９、トルイジンブルー染色した組織の透過型顕微鏡写真を図２０に、実施例４の結果と併せて示す。
【００８９】
図１９及び図２０に示した透過型顕微鏡写真から分かるように、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した軟骨組織は、組織周辺部は染色されているものの、中心部の組織があまり染色されておらず、内部と表面の軟骨分化度が全く異なり、均一な軟骨組織が形成されていないことが認められた。
【００９０】
［試験例２］各ウェル開口径でのｈＭＳＣの培養
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、平均開口径及び深さが３０μｍ、７０μｍ、５４０μｍ、１４１０μｍのウェルが配列したジルコニア製の各細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１１５０℃で２時間焼成して担体を作製した。
上記において作製した各担体を、滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたｈＭＳＣ）を５×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図２１に示す。
【００９１】
図２１に示したＳＥＭ写真から分かるように、ウェル開口径が７０μｍ、５４０μｍの細胞培養担体では、ウェル内にのみ細胞が集まり細胞凝集塊が形成されていた。
一方、ウェル開口径が３０μｍの細胞培養担体は、ウェル外（担体上面）にも扁平細胞が接着しており、細胞凝集塊は十分に形成されていなかった。また、ウェル開口径１４１０μｍの細胞培養担体は、ウェル内に細胞が集まっていたが、凝集塊は十分に形成されていなかった。
【００９２】
［比較例６］アルミナ製細胞培養担体
原料粉としてアルミナを用いた点、また、２次粒子形成にスプレードライヤーを用いた点を除き、実施例１と同様にして、開口径及び深さが１００μｍのウェルが配列したアルミナ製の細胞培養担体（直径１５ｃｍ）を成形し、１０００℃で２時間焼成して担体を作製した（特許文献１の実施例１記載のアルミナセラミックス多孔体と同等サンプル）。焼成後の担体上面に形成された開口径は、ウェル数１０個の平均値で８０μｍであった。このアルミナ製細胞培養担体について、表面骨格のＳＥＭ写真を図２２に示す。
また、この表面状態について、上記試験例１−１〜１−４の各担体と同様にして測定したところ、２乗平均粗さＲｑ＝４７．４０ｎｍ、線密度＝５．０１であった。
【００９３】
また、この担体を、滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたｈＭＳＣを１×１０4個播種して、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）を図２３に示す。
【００９４】
図２３に示したＳＥＭ写真から分かるように、間葉系幹細胞は、ウェル凹凸部に扁平形状で接着して、凝集体を形成しないことが確認された。
【００９５】
［実施例５］ｈＭＳＣの脂肪細胞への分化誘導
平均粒子径０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが１００、２００、４００、６００μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体を成形し、１１５０℃焼成で２時間焼成した。各ジルコニア製細胞培養担体は、焼成により収縮して開口径及び深さが７５、１７５、３５０、５１０μｍになった。
これらの各担体を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに不死化されたｈＭＳＣを１×１０5個（ウェル開口径７５μｍ）、２×１０5個（ウェル開口径１７５μｍ）、３×１０5個（ウェル開口径３５０μｍ）、４×１０5個（ウェル開口径５１０μｍ）播種して、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種してから４日目に、脂肪細胞分化誘導培地（ＧＩＢＣＯ社）に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて７日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちに、ＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてＲＮＡの抽出を行った。
得られたＲＮＡについて、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、逆転写後、初期脂肪マーカーであるＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）、ＭＳＣマーカーであるＣＤ１０５の発現をＰＣＲによって確認した。
これらのマーカーを図２４に示す。なお、比較のため、シャーレで形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた脂肪細胞についてのマーカーも併せて示す。
【００９６】
図２４に示した結果から分かるように、細胞培養担体のウェルによってサイズを制御して培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した結果、ウェル開口径が小さいほど、ＣＤ１０５の発現が少なく、ＰＰＡＲγの発現が多く、脂肪細胞へ分化誘導が進んでいることが確認された。
【００９７】
また、分化誘導を始めて１０日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、すぐに固定液で細胞を固定した。固定後、脂肪細胞の脂肪滴を染色するオイルレッドＯにより染色した。
これらの染色した細胞の透過型顕微鏡写真を図２５に示す。
図２５に示した顕微鏡写真から分かるように、各細胞培養担体のウェル内で細胞凝集塊が染色されており、脂肪細胞が形成されていることが認められた。
【００９８】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１１５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体についても、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。その結果、これらの各培養担体においても、ウェル内で細胞凝集塊が染色されており、脂肪細胞が形成されていることが認められた。
【００９９】
［比較例７］シャーレ上でのｈＭＳＣの脂肪細胞への分化誘導
ゼラチンがコーティングされた直径１０ｃｍのシャーレに、不死化されたｈＭＳＣを７×１０4個播種して、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
２４時間後、脂肪分化誘導培地（ＧＩＢＣＯ社）に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて７日経過後、この担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出及びＰＣＲによるマーカーの確認は、実施例５と同様にして行った。
これらのマーカーを実施例５の結果と併せて、図２４に示す。
【０１００】
図２４に示した結果から分かるように、シャーレで培養したｈＭＳＣを分化誘導した結果、ＣＤ１０５の発現が、実施例５の細胞培養担体を用いた場合に比べて多く、また、ＰＰＡＲγの発現は、実施例５のウェル開口径７５μｍ、１７５μｍ、３５０μｍの細胞培養担体を用いた場合に比べて少なかった。
このことから、本発明に係る細胞培養担体によれば、脂肪細胞へ効率よく分化誘導可能であることが確認された。
【０１０１】
また、分化誘導を始めて１０日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、すぐに固定液で細胞を固定した。固定後、脂肪細胞の脂肪滴を染色するオイルレッドＯにより染色した。
これらの染色した細胞の透過型顕微鏡写真を図２６に示す。
【０１０２】
図２６に示した透過型顕微鏡写真から分かるように、シャーレ上でｈＭＳＣを脂肪細胞に誘導した場合、分化誘導を始めて１０日経過後でも、オイルレッドＯで染色された細胞はまばらであり、分化があまり進んでいないことが認められた。
【０１０３】
［実施例６］ｈＭＳＣの骨芽細胞への分化誘導
実施例５と同様の各担体を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに不死化されたｈＭＳＣを１×１０5個（ウェル開口径７５μｍ）、２×１０5個（ウェル開口径１７５μｍ）、３×１０5個（ウェル開口径３５０μｍ）、４×１０5個（ウェル開口径５１０μｍ）播種して、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種してから４日目に、骨形成分化誘導培地（ＧＩＢＣＯ社）に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて１４日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちに、ＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてＲＮＡの抽出を行った。
得られたＲＮＡについて、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、逆転写後、骨芽細胞マーカーであるＣｏｌI（１型コラーゲン）、ＳｐｐI（オステオポンチン）、ＭＳＣマーカーであるＣＤ１０５の発現をＰＣＲによって確認した。
これらのマーカーを図２７に示す。なお、比較のため、シャーレで形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた骨芽細胞についてのマーカーも併せて示す。
【０１０４】
図２７に示した結果から分かるように、細胞培養担体のウェルによってサイズを制御して培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した結果、ウェル開口径が大きいほど、ＣｏｌI及びＳｐｐIの発現が多く、骨芽細胞への分化誘導が進んでいることが確認された。
【０１０５】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１１５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体を用いて、これらについても、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。その結果、これらの各細胞培養担体においても、ウェル内で骨芽細胞への分化誘導が進んでいることが確認された。
【０１０６】
［比較例８］シャーレ上でのｈＭＳＣの骨芽細胞への分化誘導
ゼラチンがコーティングされた直径１０ｃｍのシャーレに、不死化されたｈＭＳＣを７×１０4個播種して、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
２４時間後、骨分化誘導培地（ＧＩＢＣＯ社）に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて７日経過後、この担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出及びＰＣＲによるマーカーの確認は、実施例５と同様にして行った。
これらのマーカーを実施例６の結果と併せて、図２７に示す。
【０１０７】
図２７に示した結果から分かるように、シャーレで培養したｈＭＳＣを分化誘導した結果、ＣＤ１０５の発現が、実施例６の細胞培養担体を用いた場合に比べて多く、ＣｏｌI及びＳｐｐIの発現は、実施例６のウェル開口径３５０μｍ、５１０μｍの細胞培養担体を用いた場合に比べて少なかった。
このことから、本発明に係る細胞培養担体によれば、骨芽細胞へ効率よく分化誘導可能であることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞を細胞凝集塊として培養するのに好適に用いることができる細胞培養担体及びこれを用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell）は、間葉系組織中に存在する未分化細胞であり、自己増殖能と、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等の中胚葉系の細胞への分化能とを有していることが知られている。また、近年、間葉系幹細胞は、肝細胞等の中胚葉系以外の細胞や、拍動する心筋にも分化することが分かり、多分化能を有することが報告された。
このため、間葉系幹細胞は、再生医療への利用が期待されており、自己再生が難しい部位に間葉系幹細胞を移植する細胞治療の臨床研究が始まっている。
【０００３】
間葉系幹細胞を特定の組織細胞に分化させるためには、細胞の分化を誘導する因子が必要である。現在、間葉系幹細胞を、骨、脂肪、軟骨、肝臓、心筋等に分化誘導できる因子を特定する研究が進められており、これらの各組織に効率よく分化誘導することができるようになってきている。
【０００４】
間葉系幹細胞の分化誘導は、細胞をシャーレに播種して２次元的な条件で培養することにより行われる。
しかしながら、このような２次元的な環境で間葉系幹細胞を分化誘導した場合、３次元的な構造を有する生体内組織の本来の性質とは異なるものとなる。特に、間葉系幹細胞から軟骨への分化誘導をシャーレで行うと、ほとんどの間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化しないことが知られている。
【０００５】
したがって、間葉系幹細胞から軟骨細胞に分化誘導する場合、３次元凝集塊を形成した間葉系幹細胞を分化誘導する必要がある。
しかしながら、間葉系幹細胞は、シャーレ上では扁平かつ単一でしか増殖せず、肝細胞のように自己凝集する性質は見られない。
【０００６】
そこで、間葉系幹細胞を強制的に凝集化させるための方法として、ペレット培養法等の方法が主に用いられている（非特許文献１参照）。
また、特許文献１に記載されているような、複数の凹部を有する３次元的な形状の培養担体を用いて培養することも検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−３０６９８７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mark F. Pitternger, et al.,Science, 284, 1999, p.143-146
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献１に記載されているペレット培養法は、１５ｍｌ遠心チューブに細胞の懸濁液を入れ、遠心分離によって細胞を強制的に沈降させて凝集化させる方法であり、細胞に与える機械的刺激が強く、細胞を損傷させるため、状態のよい細胞塊を得ることが困難であった。
また、ペレット培養法により、凝集化させた間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化誘導すると、生体内軟骨細胞（硝子軟骨細胞）が発現している遺伝子である、ＴｙｐｅIIコラーゲンやアグリカンの発現が確認できる。
しかしながら、さらに分化が進んだ肥大軟骨細胞が発現しているＴｙｐｅＸコラーゲンや間葉系幹細胞に特異的なＣＤ１０５の発現も確認でき、生体内組織に性質が一致した均一な軟骨組織に該凝集塊を分化誘導することができないという問題が見られた。
さらに、特許文献１に記載されているような複数の凹部を有する３次元培養担体を用いた場合も、凹部のみに間葉系幹細胞を凝集化させることができず、生体内組織に性質が一致し、かつ、分化状態がより均一な組織に分化誘導することができないという問題が見られた。
【００１０】
したがって、間葉系幹細胞を静置培養で細胞凝集塊を形成させて、生体内組織に性質が一致し、かつ、分化状態が均一な組織に分化誘導することができる細胞培養担体及び細胞培養方法が求められている。
【００１１】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、間葉系幹細胞を簡便かつ均一な形状で３次元に凝集化させ、生体内組織に性質が一致し、かつ、分化状態が均一な細胞凝集塊を効率的に大量に得ることができる細胞培養担体及びこれを用いた細胞培養方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る細胞培養担体は、間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に複数のウェルが形成されており、前記上面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることを特徴とする。
上面がこのような表面状態を有する担体を用いることにより、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着しないため、球状を維持することができる。あるいは、間葉系幹細胞の培養初期段階で、間葉系幹細胞が上面に付着して扁平状になった場合においても、ある程度の時間が経過すると、扁平状になった間葉系幹細胞は球状化する。しかも、この上面に複数のウェルが形成されているため、球状の間葉系幹細胞がウェルに移動、凝集し、間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に大量に培養することができるとともに、間葉系幹細胞から、生体内組織と性質が似ている硝子軟骨細胞、脂肪細胞や骨芽細胞等の組織細胞に効率よく分化誘導することができる。
【００１３】
前記細胞培養担体において、ウェルは、開口部が円形状又は矩形状であり、開口径が７０〜５５０μｍであることが好ましい。
このようなウェル形状及びウェル開口径とすることにより、ウェル内において、間葉系幹細胞を培養する際の凝集塊の３次元構造化及びそのサイズをより適切に制御することができ、また、硝子軟骨細胞へ分化誘導する場合においても、分化状態がより均一な軟骨組織等の生体内組織を得ることが可能となる。
【００１４】
前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることが好ましい。
少なくともウェル底面も、担体上面と同様の表面粗さとすることにより、ウェル底面に細胞が扁平状に付着することがなく、ウェル底に接着した細胞が球状になりやすく、細胞凝集塊を形成しやすくなる。
【００１５】
また、近隣する前記ウェルの中心点の間隔が、８０〜７００μｍであることが好ましい。
このような間隔を設けることにより、ウェル内により効率的に細胞を入れることができ、かつ、ウェル内で凝集化した細胞塊に酸素や栄養等を安定して供給できる。
【００１６】
また、前記細胞培養担体は、セラミックス焼結体からなり、かつ、該セラミックス焼結体の平均細孔径が０．１５〜０．４５μｍであることが好ましい。
前記担体をセラミックス焼結体で構成することにより、上記のような表面粗さの上面を形成しやすくなる。また、このような平均細孔径とすることにより、前記ウェルに形成された細胞凝集塊に対し、担体裏面から分化誘導因子、栄養、酸素等をより効率的に供給することができる。
【００１７】
前記セラミックスは、間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に培養する観点から、ジルコニアが使用されることが好ましい。
前記セラミックスにジルコニアを使用することにより、担体表面に対する培養液を介在した状態での間葉系幹細胞の耐変特性を抑制することができる。
【００１８】
また、前記細胞培養担体の上面は、接触するセラミックス粒子の凹凸を認識して形状を変える細胞の性質に鑑みて、平坦性がより低いセラミックス焼結後の非加工面であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る細胞培養方法は、上記の細胞培養担体を用いた細胞培養方法であって、容器内に前記細胞培養担体の上面を上にして配置した後、前記容器内に第１の培養液を供給し、該第１の培養液を前記細胞培養担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる工程と、前記第１の培養液を浸透させた細胞培養担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を播種する工程と、前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記細胞培養担体全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導するための第３の培養液を前記容器内に供給し、前記細胞培養担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞のうちのいずれかの組織細胞に分化誘導する工程とを備えていることを特徴とする。
このような培養方法によれば、間葉系幹細胞の凝集塊の形成、さらに、該凝集塊から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、簡便かつ効率的に行うことができる。
【００２０】
前記第２の培養液中の間葉系幹細胞数は、前記担体１ｃｍ2あたり１×１０4個以上１×１０6個以下とすることが好ましい。
このような培養方法を行うことにより、ウェル内に複数個の細胞が侵入しやすくなり、細胞凝集塊をより効率的に形成することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る細胞培養担体を用いれば、間葉系幹細胞を簡便に均一な３次元形状に凝集化させ、生体内組織に性質が一致した細胞凝集塊を効率的に大量に得ることができる。
また、前記細胞培養担体を用いた本発明に係る細胞培養方法によれば、間葉系幹細胞の凝集塊の形成、及び、該凝集塊から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、簡便かつ効率的に行うことができ、しかも、分化状態が均一な軟骨組織を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】試験例１−１に係るジルコニア原料粉（未焼成粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）の表面骨格の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真（２５０００倍）である。
【図２】試験例１−１に係るジルコニア原料粉（未焼成粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）についての水銀圧入法で測定した細孔径分布を表すグラフである。
【図３】試験例１−１に係る開口径１００μｍのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）で培養したヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図４】試験例１−２に係るジルコニア原料粉（１１５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）の表面骨格のＳＥＭ写真（２５０００倍）である。
【図５】試験例１−２に係るジルコニア原料粉（１１５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）についての水銀圧入法で測定した細孔径分布である。
【図６】試験例１−２に係るジルコニア原料粉（１１５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図７】試験例１−３に係るジルコニア原料粉（１２５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）の表面骨格のＳＥＭ写真（２５０００倍）である。
【図８】試験例１−３に係るジルコニア原料粉（１２５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）についての水銀圧入法で測定した細孔径分布である。
【図９】試験例１−３に係るジルコニア原料粉（１２５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図１０】試験例１−４に係るジルコニア原料粉（１３５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）の表面骨格のＳＥＭ写真（２５０００倍）である。
【図１１】試験例１−４に係るジルコニア原料粉（１３５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）についての水銀圧入法で測定した細孔径分布である。
【図１２】試験例１−４に係るジルコニア原料粉（１３５０℃仮焼粉）で作製したジルコニア製細胞培養担体（１０５０〜１５００℃焼成）で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図１３】実施例１に係る開口径７８μｍ、１７５μｍ、５１０μｍのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体（１１５０℃焼成）で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（ウェル開口径７８μｍ、１７５μｍ：５００倍、ウェル開口径５１０μｍ：１００倍）である。
【図１４】比較例１に係る開口径１７５μｍのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体（１１５０℃焼成）で培養したＨｅｐＧ２のＳＥＭ写真（担体全域：１００倍、ウェル凹部：５００倍、ウェル凸部：１０００倍）である。
【図１５】比較例２に係るシャーレで培養したｈＭＳＣの透過型顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１６】比較例３に係るジルコニア平板（１１５０℃）上で培養した細胞のＳＥＭ写真である。
【図１７】実施例２、比較例４において、ジルコニア製細胞培養担体又はペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を、１、２、３週間（１Ｗ、２Ｗ、３Ｗ）軟骨細胞に分化誘導した各組織の発現遺伝子と、ヒト由来硝子軟骨細胞の発現遺伝子とのマーカーの比較を示したものである。
【図１８】実施例３において、ウェル開口径７８μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍの細胞培養担体又はペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を軟骨細胞に分化誘導した各組織の発現遺伝子のマーカーの比較を示したものである。
【図１９】実施例４、比較例５において、ジルコニア製細胞培養担体又はペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織をサフラニンＯ染色したものの透過型顕微鏡写真（ａ．ペレット法：１００倍、ｂ．ペレット法（軟骨組織中心部）：４００倍、ｃ．ペレット法（軟骨組織外側）：４００倍、ｄ．ウェル開口径５１０μｍ細胞培養担体：１００倍、ｅ．ウェル開口径５１０μｍ細胞培養担体：４００倍）である。
【図２０】実施例４、比較例５において、ジルコニア製細胞培養担体又はペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織をトルイジンブルー染色したものの透過型顕微鏡写真（ａ．ペレット法：１００倍、ｂ．ペレット法（軟骨組織中心部）：４００倍、ｃ．ペレット法（軟骨組織外側）：４００倍、ｄ．ウェル開口径５１０μｍ細胞培養担体：１００倍、ｅ．ウェル開口径５１０μｍ細胞培養担体：４００倍）である。
【図２１】試験例２において、ウェル開口径３０μｍ、７０μｍ、５４０μｍ、１４１０μｍの細胞培養担体で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（ウェル開口径３０、７０μｍ：２５０倍、ウェル開口径５４０μｍ、１４１０μｍ：１００倍）である。
【図２２】比較例６に係るアルミナ原料粉で作製したアルミナ製細胞培養担体の表面骨格のＳＥＭ写真（２５０００倍）である。
【図２３】比較例６に係る開口径８０μｍのウェルが配列したアルミナ製細胞培養担体で培養したｈＭＳＣのＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）である。
【図２４】実施例５、比較例７において、ジルコニア製細胞培養担体又はシャーレ上で形成したｈＭＳＣの凝集塊を脂肪細胞に分化誘導した各組織の発現遺伝子のマーカーの比較を示したものである。
【図２５】実施例５において、ジルコニア製細胞培養担体で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた脂肪細胞をオイルレッドＯ染色したものの顕微鏡写真（１００倍）である。
【図２６】比較例７において、シャーレ上で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた脂肪細胞をオイルレッドＯ染色したものの透過型顕微鏡写真（１００倍）である。
【図２７】実施例６、比較例８において、ジルコニア製細胞培養担体又はシャーレ上で形成したｈＭＳＣの凝集塊を骨芽細胞に分化誘導した各組織の発現遺伝子のマーカーの比較を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について、図面を参照して、より詳細に説明する。
本発明に係る細胞培養担体は、間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に細胞を培養するための複数のウェルが形成されており、かつ、前記上面が所定の表面粗さを有しているものである。
本発明において適用される細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり、具体的には、骨髄、臍帯血、脂肪等から採取可能な間葉系幹細胞、又は、組織由来の前駆細胞及びこれらの細胞を不死化した細胞である。
本発明に係る細胞培養担体は、このような均一な形状の間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に大量に形成し、また、間葉系幹細胞から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞を効率よく分化誘導することができるものである。
【００２４】
前記担体の上面は、具体的には、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０の表面状態である。
上面がこのような表面状態を有する担体を用いることにより、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着しないため、球状を維持することができる。あるいは、間葉系幹細胞の培養初期段階に、間葉系幹細胞が上面に付着して扁平状になった場合においても、ある程度の時間が経過すると、扁平状になった間葉系幹細胞は球状化する。しかも、この上面に複数のウェルが形成されているため、球状の間葉系幹細胞が、ウェルに移動、凝集し、間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に形成させ、大量に培養することができるとともに、間葉系幹細胞から生体内組織に一致している硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞を効率よく分化誘導することができる。
２乗平均粗さＲｑ及び線密度が上記数値範囲外である場合、細胞が扁平形状となり、該担体上面に接着して、細胞凝集塊を形成しなくなる傾向がある。
【００２５】
この原因については、明確ではないが、下記のような現象に起因するものと予測される。
担体上面が、マクロなフラット面あるいは所定面積のミクロなフラット面を有する表面状態であると、これに伴い、間葉系幹細胞が扁平化して密着してしまう。しかしながら、このようなフラット面が存在せず、上記の特定の凹凸面である場合には、間葉系幹細胞が扁平化することなく球状を維持することができ、かつ、担体上面に複数のウェルが存在するため、当該球状の間葉系幹細胞がウェル内に移動し、凝集化する。特に、担体上面における凹凸形状の凸部上面に、ミクロなフラット面が存在しないことが重要であると推測される。
【００２６】
ここで、２乗平均粗さＲｑ及び線密度は、表面粗さを規定するためのパラメータである。
ここでいう線密度とは、面方向のパラメータであり、長さ１μｍあたりの粗さ曲線が平均面と交差する回数を表している。
なお、本発明における２乗平均粗さＲｑは、ＪＩＳ・Ｂ ０６０１により測定したものである。
また、線密度は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、スケール０．８μｍ、スキャンサイズ１０μｍ×１０μｍにて測定したものである。
【００２７】
前記細胞培養担体上面に形成されているウェルは、開口部が円形状又は矩形状であり、開口径が７０〜５５０μｍであることが好ましい。
ウェル開口部の形状は、細胞の播種や細胞塊の形成が容易であること、また、ウェルの加工容易性等の観点から、円形状又は矩形状であることが好ましい。
ここで、ウェルの開口径は、開口部の形状が円形の場合は、この円の直径を意味し、矩形の場合は、対向する辺の間隔を意味する一方、多角形の場合は、１つの辺とこれに対向する頂点に接する平行線との間隔を意味する。
【００２８】
また、上記範囲内のウェル開口径の担体で培養することにより、間葉系幹細胞の凝集塊を軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞へ分化誘導する際、この担体のウェル内において、そのまま、間葉系幹細胞の凝集塊のサイズをより制御しながら分化誘導することができ、また、ペレット法等の従来の分化誘導法と比較して、生体内軟骨細胞等の組織細胞の性質に近く、複数の種類の細胞が混在することなく、分化状態がより均一な軟骨組織等の生体内組織を得ることが可能となる。
さらに、前記ウェルの深さも、細胞凝集塊のサイズの制御等の観点から、前記ウェル開口径と同様に、７０〜５００μｍであることが好ましい。一方、前記ウェル開口径が７０μｍ未満又は５５０μｍを超える場合は、間葉系幹細胞が所望する３次元細胞凝集塊を形成しにくくなる。
【００２９】
前記担体のウェルの少なくとも底面の表面状態も、該担体の上面の表面粗さと同様に、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることが好ましい。
少なくとも前記ウェル底面も上記のような表面状態であれば、細胞が球状に維持されやすく、ウェル内の空間内で、細胞凝集塊をより形成しやすくなる。
一方、前記２乗平均粗さＲｑ及び線密度が上記数値範囲外である場合、細胞が該ウェル底面に扁平形状に接着して、細胞凝集塊が形成されにくくなる。
なお、前記担体のウェル内は、上記底面のみならず、側壁部も前記担体の上面と同じ２乗平均粗さＲｑと線密度との各数値範囲内であることがより好ましい。
【００３０】
前記細胞培養担体は、所定の表面粗さを有する上面に、上記のような近隣するウェルの中心点の間隔が、８０〜７００μｍの間隔でパターン化して配列されていることが好ましい。
ウェルの中心点の間隔が８０μｍ未満である場合、形成された細胞凝集塊同士の距離が近くなり、培地中の酸素や栄養等が細胞に供給されにくくなる。一方、ウェルの中心点の間隔が７００μｍを超える場合、球状化した細胞のウェル内への移動が困難となる。
また、上記のようなウェルの間隔を設けることにより、ウェル内に細胞を確実に入れることができる。
また、所定数の細胞を担体に確実に播種するために、前記担体の外周に、上面よりも高い壁が形成されていることが好ましい。
【００３１】
また、前記細胞培養担体の材質は、セラミックス焼結体であることが好ましい。
セラミックス焼結体により細胞培養担体を構成することにより、セラミックス粒子が形成する凹凸構造のみで、該細胞培養担体の上面を上記のような表面状態にすることが簡易にできる。
また、セラミックス焼結体は、隣り合うセラミックス粒子間に細孔を有しているが、この細孔は、該細胞培養担体の下面（裏面）からウェル内に、栄養や誘導因子等を毛細管現象によって浸透させて供給する役割を果たす。
なお、前記セラミックス焼結体の気孔率は、上記のような栄養や誘導因子等の浸透性を確保し、また、担体としての強度を保持する等の観点から、１０〜５０％であることがより好ましい。
【００３２】
前記セラミックス焼結体の平均細孔径は、０．１５〜０．４５μｍであることが好ましい。
上記のような平均細孔径であれば、上記セラミックス焼結体による効果がより顕在化する。
なお、前記平均細孔径は、水銀ポロシメータを用いて、水銀圧入法により測定することができる。
【００３３】
また、上述したように、細胞は、接触するセラミックス粒子の凹凸を認識して形状を変えることから、セラミックス焼結体表面を加工すると、その表面の状態や傷等の影響を受けるため、前記担体の上面は、セラミックス焼結後、そのままの表面状態、すなわち、非加工面であることが好ましい。
さらに、セラミックス表面で細胞凝集塊を形成させるためには、細胞と接触するセラミックス粒子の２次粒子の平均粒子径が０．６〜１．２μｍであることが好ましい。
なお、本発明における２次粒子の平均粒子径は、セラミックス原料を純水に懸濁させて、超音波処理を１０分行った後、大塚電子（株）ＥＬＳＺ−２を用いて、粒度分布の平均値を算出（レーザードップラー法）したものである。
【００３４】
上記のようなセラミックス焼結体からなる担体の表面粗さ、平均細孔径及び平均粒子径は、焼結体の製造時に、セラミックス原料粉の仮焼、成形体の焼成温度等の調整をすることによって適宜制御することができる。安定した焼成を行うために、必要に応じて、安定化剤等を添加してもよい。
【００３５】
前記セラミックスの材料としては、生体親和性、生体適合性に優れており、細胞の足場として適しているものとして、ジルコニア、チタニア、アルミナ又はハイドロキシアパタイト等を用いることができる。これらの中でも、本発明においては、間葉系幹細胞の細胞凝集塊を効率的に形成させることができることから、ジルコニアを用いることがより好ましい。
【００３６】
なお、前記担体をジルコニアにより製造する場合には、ジルコニアの安定化剤として、イットリア、酸化マグネシウム、酸化カルシウム又は酸化セリンのうちのいずれか１種以上を３〜１５重量％含有させることが好ましい。
これらの安定化剤を添加することによって、ジルコニアの相転移が抑制され、安定して焼成することができ、上記のような表面粗さを有する担体を好適に得ることができる。
例えば、平均粒子径０．８μｍのジルコニア原料粉に、安定化剤としてイットリアを５．６重量％添加して、１０５０〜１１５０℃で焼成することにより、好適な表面粗さを有する細胞培養担体を作製することができる。
【００３７】
また、前記ウェル底面の形状は、中央部が凹んだ湾曲形状又は半球状であることが好ましい。
このような形状とすることにより、ウェル内に侵入した複数の細胞が凝集化して、細胞凝集塊をより形成しやすくなる。
【００３８】
また、本発明に係る細胞培養方法は、上記のような本発明に係る担体を用いて行う細胞培養方法であり、容器内に前記担体の上面を上にして配置した後、前記容器内に第１の培養液を供給し、これを前記担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる工程と、この担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を培養する工程と、前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記担体全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞等に分化誘導するための第３の培養液を前記容器内に供給し、前記担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞のうちのいずれかの組織細胞に分化誘導する工程とを経ることにより行われる。
上述した本発明に係る担体を用いて、このような工程を経ることにより、間葉系幹細胞の凝集塊の形成及び該細胞凝集塊からの硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、担体上の細胞を移動させることなく行うことができ、硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞の培養を簡便かつ効率的に行うことができる。
本発明の細胞培養方法においては、前記第２の培養液中の間葉系幹細胞数を前記担体１ｃｍ2あたり１×１０4個以上１×１０6個以下とすることが好ましい。
これによって、前記細胞培養担体を用いて所望サイズの３次元細胞凝集塊をより効率的に培養することができる。
【００３９】
以下、上記培養方法を工程順に詳細に説明する。
まず、容器内に前記担体の上面を上にして配置して、前記容器と担体との隙間に第１の培養液を供給する。そして、この培養液を、前記担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる。
上記のようにして、第１の培養液を供給することにより、培養液を前記担体の上面に直に供給するのではなく、該担体の下面（裏面）から担体中の細孔を通じて、毛細管現象により担体に培養液を浸透させることができるため、培養液に培養の阻害要因となり得る気泡を包含させることなく、複数のウェル内に満遍なく培養液を行き渡らせることができる。
【００４０】
前記第１の培養液（培地）の種類は、特に限定されるものではないが、間葉系幹細胞の培養においては、例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好ましい。さらに、これらの培地に、ＦＢＳ（ウシ血清）、グルタミン酸等の細胞を維持するのに必要な物質が添加される。
また、間葉系幹細胞を細胞治療のツールとして用いる場合は、市販されている無血清培地を用いることがより好ましい。
【００４１】
次に、この担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を担体に播種する。
このようにして、間葉系幹細胞を培養液に懸濁させた状態で前記担体の上面に滴下して播種することにより、間葉系幹細胞を負荷なく、担体上面に沈降させることができ、前記ウェル内でのスムーズな凝集化を達成することができる。ここで用いられる培地の種類は、前記第１の培養液と同様のものでよい。
【００４２】
前記担体に播種する間葉系幹細胞数は、担体１ｃｍ2あたり１×１０4個以上１×１０6個以下であることが好ましい。
上記のような密度で間葉系幹細胞を播種することにより、前記細胞培養担体を用いて、所望サイズの３次元細胞凝集塊をより効率的に培養することができる。
【００４３】
次に、前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記担体全体を第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる。
上記の第２の培養液の滴下による播種工程においては、ウェル内外を問わず、担体表面のあらゆる箇所に、細胞が付着しているが、本工程において、第１の培養液中に担体全体を浸漬させて、好ましくは４８時間以上静置することにより、ウェル外の担体上面に付着していた細胞が、担体から離脱することなく、ウェル内に移動し、ウェル内で凝集塊を形成する。
【００４４】
そして、前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、第３の培養液を前記容器内に供給し、担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、ウェル内で凝集塊を形成した間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導する。
このように、間葉系幹細胞の培養に用いた担体のままで、培養液を変えることにより、ウェル内において、間葉系細胞から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を行うことができる。
【００４５】
前記第３の培養液は、凝集化した間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導するための培地であり、基本培地としてはＤＭＥＭを使用することができ、適宜改良して用いてもよい。さらに、ＴＧＦβ、ＢＭＰ等を添加することが好ましく、また、アスコルビン酸、プロリン、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸等の添加剤を添加してもよい。
ＴＧＦβは、ＴＧＦβファミリーに属するものであればいずれでもよいが、ＴＧＦβ−３を用いることが好ましい。また、ＴＧＦβと同様の作用を示す低分子化合物を用いて代替することもできる。添加するＴＧＦβの量は１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
ＢＭＰとしては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６等が用いられ、ＢＭＰ６を用いることが好ましい。また、低分子化合物を用いて代替することもできる。添加するＢＭＰの量は、１００〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍｌである。
また、添加するアスコルビン酸（好ましくはアスコルビン酸２−リン酸）の量は、１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌである。
また、添加するプロリンの量は、１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約４０μｇ／ｍｌである。
また、添加するデキサメタソンの量は、１０〜５００ｎＭ、好ましくは１００ｎＭである。
また、添加するインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸は、市販のＩＴＳ溶液を適正濃度になるように添加する。
なお、間葉系幹細胞から軟骨、脂肪、骨芽細胞に誘導する分化誘導培地が市販されており、これらも使用可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［試験例１−１］ジルコニア原料未焼成粉による細胞培養担体
平均粒子径が０．６〜０．９μｍであるジルコニア原料粉を所望のウェル形状より若干小さいサイズとなるパターン化された複数の凸形状を有する特殊鋳型を用いて、開口径１００μｍ、深さ１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、室温で静置後、前記鋳型から成型体を取り出し、これを所定の温度で２４時間乾燥し、１０５０℃、１１５０℃、１２５０℃、１３５０℃、１５００℃でそれぞれ２時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々８２μｍ、７８μｍ、６４μｍ、６０μｍ、５５μｍであった。
上記開口径の算出方法は、まず、ウェルの中心点を通る８本の直径線をランダムに引き、ウェルの開口径の平均値を算出する。これを、ウェル２０個についてそれぞれ実施した後、ウェル１個あたりの開口径の平均値を算出した。
なお、ウェルの開口径は、マイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００：キーエンス）を用いて測定した。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図１、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図２に示す。
なお、平均粒子径は、セラミックス原料を純水に懸濁後、超音波処理を１０分おこなった後、大塚電子（株）ＥＬＳＺ-２を用いて粒度分布の平均値を算出（レーザードップラー法）した。
【００４７】
図１に示したＳＥＭ写真から分かるように、焼成温度が高くなるにつれて、粒子が焼結して緻密化が進むことが認められた。
また、図２のグラフに示したように、焼成温度が高くなるにつれて、緻密化が進み、微細孔が小さくなることが確認された。平均細孔径は、それぞれ、１０５０℃で焼成したものは０．１７μｍ、１１５０℃で焼成したものは０．１５μｍ、１２５０℃で焼成したものは０．１７μｍであり、１３５０℃及び１５００℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
【００４８】
また、上記において作製した各担体を、滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を１×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図３に示す。
【００４９】
図３に示したＳＥＭ写真から分かるように、１０５０℃及び１１５０℃で焼成した担体を用いた場合、ｈＭＳＣは、ウェル内に集まり、球状の細胞が凝集塊を形成していることが認められ、該担体の上面（ウェル外）には、細胞は接着していなかった。１２５０℃で焼成した担体を用いた場合は、ウェル内で細胞の凝集塊が形成されているが、該担体の上面に扁平な細胞が接着していた。１３５０℃及び１５００℃で焼成した担体を用いた場合は、ウェル内外に扁平細胞が接着していた。
【００５０】
［試験例１−２］ジルコニア原料１１５０℃仮焼粉による細胞培養担体
試験例１−１で用いたジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成して、粒子径の平均値が０．７５〜１．２μｍの２次粒子を得た。この２次粒子を用いて、試験例１−１と同様にして、開口径１００μｍ、深さ１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１０５０℃、１１５０℃、１２５０℃、１３５０℃、１５００℃でそれぞれ２時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々９０μｍ、８５μｍ、７５μｍ、６５μｍ、５５μｍであった。上記開口径の算出方法は上記のとおりである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のＳＥＭ写真を図４、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図５に示す。
【００５１】
図４に示したＳＥＭ写真から分かるように、１１５０℃仮焼成の２次粒子で作製した担体は、未焼成原料粉で作製した担体（試験例１−１）と比較して、大きい粒子で構成されており、また、焼成温度が高くなるにつれて、粒子が焼結して緻密化が進むことが認められた。
また、図５のグラフに示したように、試験例１−１と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、１０５０℃で焼成したものは０．２５μｍ、１１５０℃で焼成したものは０．２２μｍ、１２５０℃で焼成したものは０．２０μｍであり、１３５０℃及び１５００℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
【００５２】
また、上記において作製した各担体を用いて、試験例１−１と同様にして、ｈＭＳＣを培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図６に示す。
【００５３】
図６に示したＳＥＭ写真から分かるように、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃焼成した担体を用いた場合、ｈＭＳＣは、ウェル内に集まり、球状の細胞が凝集塊を形成していることが認められ、該担体の上面（ウェル外）には、細胞は接着していなかった。１３５０℃及び１５００℃で焼成した担体を用いた場合は、ウェル内外に扁平細胞が接着していた。
【００５４】
［試験例１−３］ジルコニア原料１２５０℃仮焼粉による細胞培養担体
試験例１−１で用いたジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成して、粒子径の平均値が０．８〜１．２μｍの２次粒子を得た。この２次粒子を用いて、試験例１−１と同様にして、開口径１００μｍ、深さ１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１０５０、１１５０、１２５０、１３５０、１５００℃でそれぞれ２時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々９２μｍ、８８μｍ、７７μｍ、６５μｍ、５７μｍとなる。上記開口径の算出方法は上記のとおりである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のＳＥＭ写真を図７、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図８に示す。
【００５５】
図７に示したＳＥＭ写真から分かるように、１２５０℃仮焼粉で作製した担体は、未焼成原料粉又は１１５０℃仮焼粉で作製した担体（試験例１−１、１−２）と比較して、大きい粒子で構成されており、また、焼成温度が高くなるにつれて、粒子が焼結して緻密化が進むことが認められた。
また、図８のグラフに示したように、試験例１−１、１−２と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、１０５０℃で焼成したものは０．４５μｍ、１１５０℃で焼成したものは０．３４μｍ、１２５０℃で焼成したものは０．４２μｍであり、１３５０℃及び１５００℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
【００５６】
また、上記において作製した各担体を用いて、試験例１−１と同様にして、ｈＭＳＣを培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図９に示す。
【００５７】
図９に示したＳＥＭ写真から分かるように、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃焼成した担体を用いた場合、ｈＭＳＣは、ウェル内に集まり、球状の細胞が凝集塊を形成していることが認められ、該担体の上面（ウェル外）には、細胞は接着していなかった。１３５０℃及び１５００℃で焼成した担体を用いた場合は、ウェル内外に扁平細胞が接着していた。
【００５８】
［試験例１−４］ジルコニア原料１３５０℃仮焼粉による細胞培養担体
試験例１−１で用いたジルコニア原料粉を１３５０℃で仮焼成して、粒子径の平均値が１．０〜２．５μｍの２次粒子を得た。この２次粒子を用いて、試験例１−１と同様にして、開口径１００μｍ、深さ１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１０５０、１１５０、１２５０、１３５０、１５００℃でそれぞれ２時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々８５μｍ、８２μｍ、７５μｍ、６７μｍ、５８μｍであった。上記開口径の算出方法は上記の通りである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のＳＥＭ写真を図１０、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図１１に示す。
【００５９】
図１０に示したＳＥＭ写真から分かるように、１３５０℃仮焼成の２次粒子で作製した担体は、未焼成原料粉、１１５０℃仮焼成の２次粒子又は１２５０℃仮焼成の２次粒子で作製した担体（試験例１−１、１−２、１−３）と比較して、大きい粒子で構成されており、また、焼成温度が高くなるにつれて、粒子が焼結して緻密化が進むことが認められた。
また、図１１のグラフに示したように、試験例１−１〜１−３と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、１０５０℃で焼成したものは０．６４μｍ、１１５０℃で焼成したものは０．９１μｍ、１２５０℃で焼成したものは０．７２μｍであり、１３５０℃及び１５００℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
【００６０】
また、上記において作製した各担体を用いて、試験例１−１と同様にして、ｈＭＳＣを培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図１２に示す。
【００６１】
図１２に示したＳＥＭ写真から分かるように、すべての焼成温度で、ウェル内外に扁平細胞が接着していた。
【００６２】
また、上記試験例１−１〜１−４で作製した各担体で培養された細胞の形状について、各担体上面の２乗平均粗さＲｑとの関係を表１に、各担体上面の線密度との関係を表２に示す。
なお、２乗平均粗さＲｑは、ＪＩＳ Ｂ ０６０１により測定したものである。
また、線密度は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、スケール０．８μｍ、スキャンサイズ１０μｍ×１０μｍにて測定したものである。
【００６３】
【表１】
【００６４】
【表２】
【００６５】
表１及び２で示した結果から、担体上面の２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下の場合、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３以下の場合にｈＭＳＣは凝集塊を形成する傾向が認められた。
【００６６】
さらに、上述した構成に加え、ウェルの少なくとも底面の２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下の場合、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３以下の場合、ｈＭＳＣは凝集塊をより形成する傾向が認められた。
【００６７】
［実施例１］ｈＭＳＣの培養
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１１５０℃で焼成して作製した、開口径及び深さが７８μｍ、１７５μｍ、５１０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体に、試験例１−１と同様にして、０．５×１０4、１×１０4、２．５×１０4、５×１０4個のｈＭＳＣを播種して培養した。
播種して７日経過後のＳＥＭ写真を図１３に示す。
【００６８】
図１３に示したＳＥＭ写真から分かるように、ウェル開口径７８μｍの場合、ｈＭＳＣを１×１０4個以上播種すると、ウェル内で凝集化する傾向が認められた。
また、ウェル開口径１７５μｍ以上の場合、播種細胞数を５×１０4個以上にすると、細胞が凝集化しやすくなる傾向が認められた。
【００６９】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体についても、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。その結果、これらの各培養担体においても、ウェル内で凝集化する傾向が認められた。
【００７０】
［比較例１］ＨｅｐＧ２の培養
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが１７５μｍのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体を作製した。この担体表面は、２乗平均粗さＲｑ＝１０３．２２ｎｍ、線密度＝２．７１であった。
この担体を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、ヒト肝ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２）を５×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して７日経過後のＳＥＭ写真を図１４に示す。
【００７１】
図１４に示したＳＥＭ写真から分かるように、本発明に係る構成を備えた細胞培養担体では、ＨｅｐＧ２はウェル内（凹部）で凝集塊を形成せず、また、凸部（上面）にも接着していた。
【００７２】
［比較例２］ｈＭＳＣのシャーレでの通常培養
ゼラチンがコーティングされた直径１０ｃｍのシャーレに、不死化されたｈＭＳＣを３×１０5個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日後のシャーレ表面の透過型顕微鏡写真を図１５に示す。
【００７３】
図１５に示した透過型顕微鏡写真から分かるように、シャーレ上では、ｈＭＳＣは凝集塊を形成せず、扁平形状に接着していた。
【００７４】
［比較例３］ｈＭＳＣのジルコニア製平板での培養
成形型を凸形状のないフラットな面を有するものとしたことを除いて、比較例１と同様に、ジルコニア製平板を作製した。この平板表面は、２乗平均粗さＲｑ＝１００．８ｎｍ、線密度＝２．０１であった。
この平板を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたｈＭＳＣを１×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図１６に示す。
【００７５】
図１６に示したＳＥＭ写真から分かるように、ジルコニア製平板でｈＭＳＣを培養すると、細胞が球状化したが、凝集塊の形成は認められなかった。
このことから、ｈＭＳＣの凝集化には、ウェル構造が必要であり、また、効率的な凝集化のためには、ウェル底部も平面でなく、湾曲形状であることが好ましいと考えられる。
【００７６】
［実施例２］ｈＭＳＣの硝子軟骨細胞への分化誘導
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが１００μｍのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１１５０℃で２時間焼成して、開口径及び深さが７０μｍの担体を作製した。
この担体を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたｈＭＳＣを５×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種してから３日目に、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）に変え、３週間分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて１、２、３週間経過後、それぞれ、担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出には、ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ社）を用い、そのプロトコルに従って、ｍＲＮＡを抽出・精製した。
得られたＲＮＡについて、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、逆転写後、軟骨分化マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＴｙｐｅＸコラーゲン、ＴｙｐｅIIコラーゲン、ＣＯＭＰ、アグリカン、Ｓｏｘ９、ｌｕｎｘ２及びｃｈＭ１の発現をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確認した。
これらの軟骨分化マーカーを図１７に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織、及び、硝子軟骨由来正常細胞についてのマーカーも併せて示す。
【００７７】
ここで、各マーカーの発現は、＋：発現、−：非発現として表すと、ｈＭＳＣは、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１０５＋、ＴｙｐｅＸコラーゲン−、ＴｙｐｅIIコラーゲン−、ＣＯＭＰ−、Ａｇｇｒｅｃａｎ−、Ｓｏｘ９−、ｌｕｎｘ２−、ｃｈＭ１−であり、ヒト由来軟骨細胞（硝子軟骨細胞）は、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１０５−、ＴｙｐｅＸコラーゲン−、ＴｙｐｅIIコラーゲン＋、ＣＯＭＰ＋、Ａｇｇｒｅｃａｎ＋、Ｓｏｘ９＋、ｌｕｎｘ２−、ｃｈＭ１−であり、成熟・肥大軟骨細胞は、ＴｙｐｅＸコラーゲン＋、ＴｙｐｅIIコラーゲン−、ＣＯＭＰ−、Ａｇｇｒｅｃａｎ−、Ｓｏｘ９−、ｌｕｎｘ２＋、ｃｈＭ１＋である。
【００７８】
図１７に示した結果から分かるように、細胞培養担体のウェルによってサイズを制御して培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した場合、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＴｙｐｅIIコラーゲン、ＣＯＭＰ、アグリカン、Ｓｏｘ９が発現し、誘導期間が長くなるほど発現量が多くなった。また、ＴｙｐｅＸコラーゲン、ｌｕｎｘ２、ｃｈＭ１の発現は確認されず、ヒト体内から採取した硝子軟骨細胞の発現遺伝子と同じであることが確認された。
【００７９】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが１７５μｍ及び５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが１７５μｍ及び５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが１７５μｍ及び５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体についても、これらを用いて、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。これらの培養細胞についても、軟骨分化マーカーによって確認したところ、ヒト体内から採取した硝子軟骨細胞の発現遺伝子と同じであることが確認された。
【００８０】
［比較例４］ペレット法によるｈＭＳＣの硝子軟骨細胞への分化誘導
不死化されたｈＭＳＣ２．５×１０5個をＤＭＥＭ５ｍｌで懸濁させて１５ｍｌチューブに入れ、遠心分離によって該チューブの底でペレットを形成した。アスピレータでＤＭＥＭを吸引後、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）に変え、３週間分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて１、２、３週間経過後、それぞれ、担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出及びＰＣＲによる軟骨分化マーカーの確認は、実施例２と同様にして行った。
これらの軟骨分化マーカーを、実施例２の結果と併せて、図１７に示す。
【００８１】
図１７に示した結果から分かるように、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した場合、硝子軟骨細胞が特異的に発現する遺伝子であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＴｙｐｅIIコラーゲン、ＣＯＭＰ、アグリカン及びＳｏｘ９が発現したが、ＴｙｐｅＸコラーゲンの発現も確認された。
このことから、得られた軟骨細胞は、目的の硝子軟骨細胞の他に、成熟・肥大化した軟骨細胞が含まれており、分化状態が均一な軟骨組織ではないことが認められた。
【００８２】
［実施例３］各ウェル開口径でのｈＭＳＣの硝子軟骨細胞への分化誘導
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが１００μｍ、２００μｍ、４００μｍ、６００μｍのウェルが配列したジルコニア製の各細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１１５０℃で２時間焼成して開口径及び深さが７８μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍの担体を作製した。
上記において作製した各担体を用いて、実施例２と同様にして、ｈＭＳＣの培養及び分化誘導を行った。
分化誘導を始めて３週間経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出には、ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ社）を用い、そのプロトコルに従って、ｍＲＮＡを抽出・精製した。
得られたＲＮＡについて、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、逆転写後、間葉系幹細胞マーカーであるＣＤ１０５、成熟・肥大硝子軟骨細胞マーカーであるＴｙｐｅＸコラーゲン、硝子軟骨細胞のマーカーであるＴｙｐｅIIコラーゲンの発現をＰＣＲによって確認した。
これらのマーカーを図１８に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織についてのマーカーも併せて示す。
【００８３】
図１８に示した結果から分かるように、ウェル開口径７８〜５１０μｍの細胞培養担体で培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織は、ＴｙｐｅIIコラーゲンが発現し、ＴｙｐｅＸコラーゲンとＣＤ１０５の発現がなかったことから、均一な硝子軟骨細胞に誘導されていることが認められた。
一方、ペレット法で得られた軟骨組織は、ＴｙｐｅIIコラーゲン、ＴｙｐｅＸコラーゲン及びＣＤ１０５が発現していたことから、間葉系幹細胞、硝子軟骨細胞、成熟・肥大軟骨細胞が混在した組織になっていることが確認された。
【００８４】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、３５０μｍ、５１０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体についても、これらを用いて、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。これらの培養細胞について、軟骨分化マーカーによって確認したところ、ヒト体内から採取した硝子軟骨細胞の発現遺伝子と同じであることが確認された。
【００８５】
［実施例４］分化誘導された軟骨組織の染色
実施例３において、分化誘導を３週間行った細胞培養担体（ウェル開口径及び深さが５１０μｍ）から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ社）を用いて固定を行った。その後、エタノールを７０、８０、９０、１００％の順で加えて脱水を行い、キシレンで置換した。
そして、この担体のウェル内から、ピペッティングにより軟骨組織を回収し、パラフィンを用いて包埋した。この包埋したブロックから、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社）を用いて、厚さ５μｍの切片を切り出した。この切片を、スライドガラスに貼り付け、キシレン、１００、９０、８０、７０％エタノールの順で浸液させて脱パラフィン処理を行い、軟骨組織部分を染色できる状態にした。
これを３％酢酸に浸した後、軟骨細胞が産生する細胞外基質であるグリコサミノグリカンを特異的に染色するサフラニンＯ又はトルイジンブルー液にそれぞれ、５分間浸液させた。そして、エタノール、キシレンで脱水処理を行い、封入剤を用いて封入した。
サフラニンＯ染色した組織の透過型顕微鏡写真を図１９、トルイジンブルー染色した組織の透過型顕微鏡写真を図２０に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織の染色状態も併せて示す。
【００８６】
図１９及び図２０に示した透過型顕微鏡写真から分かるように、本発明に係る細胞培養担体で培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織は、サフラニンＯ染色（赤紫色）及びトルイジンブルー染色（青紫色）のいずれも、中心部まで均一に染色されており、得られた軟骨組織は内外ともに均一な軟骨細胞組織が形成されていることが認められた。
【００８７】
また、実施例２、３で述べた各焼成温度で作製して得られた種々の開口径及び深さのジルコニア製細胞培養担体においても、同様の結果が得られた。
【００８８】
［比較例５］ペレット法により分化誘導された軟骨組織の染色
比較例４において、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊からの分化誘導を３週間行った組織から分化誘導培地を除去し、その後の処理は、実施例４と同様にして、サフラニンＯ又はトルイジンブルーによる染色を行った。
サフラニンＯ染色した組織の透過型顕微鏡写真を図１９、トルイジンブルー染色した組織の透過型顕微鏡写真を図２０に、実施例４の結果と併せて示す。
【００８９】
図１９及び図２０に示した透過型顕微鏡写真から分かるように、ペレット法で形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した軟骨組織は、組織周辺部は染色されているものの、中心部の組織があまり染色されておらず、内部と表面の軟骨分化度が全く異なり、均一な軟骨組織が形成されていないことが認められた。
【００９０】
［試験例２］各ウェル開口径でのｈＭＳＣの培養
平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、平均開口径及び深さが３０μｍ、７０μｍ、５４０μｍ、１４１０μｍのウェルが配列したジルコニア製の各細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１１５０℃で２時間焼成して担体を作製した。
上記において作製した各担体を、滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたｈＭＳＣ）を５×１０4個播種して、ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真を図２１に示す。
【００９１】
図２１に示したＳＥＭ写真から分かるように、ウェル開口径が７０μｍ、５４０μｍの細胞培養担体では、ウェル内にのみ細胞が集まり細胞凝集塊が形成されていた。
一方、ウェル開口径が３０μｍの細胞培養担体は、ウェル外（担体上面）にも扁平細胞が接着しており、細胞凝集塊は十分に形成されていなかった。また、ウェル開口径１４１０μｍの細胞培養担体は、ウェル内に細胞が集まっていたが、凝集塊は十分に形成されていなかった。
【００９２】
［比較例６］アルミナ製細胞培養担体
原料粉としてアルミナを用いた点、また、２次粒子形成にスプレードライヤーを用いた点を除き、実施例１と同様にして、開口径及び深さが１００μｍのウェルが配列したアルミナ製の細胞培養担体（直径１５ｃｍ）を成形し、１０００℃で２時間焼成して担体を作製した（特許文献１の実施例１記載のアルミナセラミックス多孔体と同等サンプル）。焼成後の担体上面に形成された開口径は、ウェル数１０個の平均値で８０μｍであった。このアルミナ製細胞培養担体について、表面骨格のＳＥＭ写真を図２２に示す。
また、この表面状態について、上記試験例１−１〜１−４の各担体と同様にして測定したところ、２乗平均粗さＲｑ＝４７．４０ｎｍ、線密度＝５．０１であった。
【００９３】
また、この担体を、滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたｈＭＳＣを１×１０4個播種して、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種して３日経過後のＳＥＭ写真（１００、２５０、１０００倍）を図２３に示す。
【００９４】
図２３に示したＳＥＭ写真から分かるように、間葉系幹細胞は、ウェル凹凸部に扁平形状で接着して、凝集体を形成しないことが確認された。
【００９５】
［実施例５］ｈＭＳＣの脂肪細胞への分化誘導
平均粒子径０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが１００、２００、４００、６００μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体を成形し、１１５０℃焼成で２時間焼成した。各ジルコニア製細胞培養担体は、焼成により収縮して開口径及び深さが７５、１７５、３５０、５１０μｍになった。
これらの各担体を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに不死化されたｈＭＳＣを１×１０5個（ウェル開口径７５μｍ）、２×１０5個（ウェル開口径１７５μｍ）、３×１０5個（ウェル開口径３５０μｍ）、４×１０5個（ウェル開口径５１０μｍ）播種して、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種してから４日目に、脂肪細胞分化誘導培地（ＧＩＢＣＯ社）に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて７日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちに、ＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてＲＮＡの抽出を行った。
得られたＲＮＡについて、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、逆転写後、初期脂肪マーカーであるＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）、ＭＳＣマーカーであるＣＤ１０５の発現をＰＣＲによって確認した。
これらのマーカーを図２４に示す。なお、比較のため、シャーレで形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた脂肪細胞についてのマーカーも併せて示す。
【００９６】
図２４に示した結果から分かるように、細胞培養担体のウェルによってサイズを制御して培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した結果、ウェル開口径が小さいほど、ＣＤ１０５の発現が少なく、ＰＰＡＲγの発現が多く、脂肪細胞へ分化誘導が進んでいることが確認された。
【００９７】
また、分化誘導を始めて１０日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、すぐに固定液で細胞を固定した。固定後、脂肪細胞の脂肪滴を染色するオイルレッドＯにより染色した。
これらの染色した細胞の透過型顕微鏡写真を図２５に示す。
図２５に示した顕微鏡写真から分かるように、各細胞培養担体のウェル内で細胞凝集塊が染色されており、脂肪細胞が形成されていることが認められた。
【００９８】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１１５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体についても、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。その結果、これらの各培養担体においても、ウェル内で細胞凝集塊が染色されており、脂肪細胞が形成されていることが認められた。
【００９９】
［比較例７］シャーレ上でのｈＭＳＣの脂肪細胞への分化誘導
ゼラチンがコーティングされた直径１０ｃｍのシャーレに、不死化されたｈＭＳＣを７×１０4個播種して、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
２４時間後、脂肪分化誘導培地（ＧＩＢＣＯ社）に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて７日経過後、この担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出及びＰＣＲによるマーカーの確認は、実施例５と同様にして行った。
これらのマーカーを実施例５の結果と併せて、図２４に示す。
【０１００】
図２４に示した結果から分かるように、シャーレで培養したｈＭＳＣを分化誘導した結果、ＣＤ１０５の発現が、実施例５の細胞培養担体を用いた場合に比べて多く、また、ＰＰＡＲγの発現は、実施例５のウェル開口径７５μｍ、１７５μｍ、３５０μｍの細胞培養担体を用いた場合に比べて少なかった。
このことから、本発明に係る細胞培養担体によれば、脂肪細胞へ効率よく分化誘導可能であることが確認された。
【０１０１】
また、分化誘導を始めて１０日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、すぐに固定液で細胞を固定した。固定後、脂肪細胞の脂肪滴を染色するオイルレッドＯにより染色した。
これらの染色した細胞の透過型顕微鏡写真を図２６に示す。
【０１０２】
図２６に示した透過型顕微鏡写真から分かるように、シャーレ上でｈＭＳＣを脂肪細胞に誘導した場合、分化誘導を始めて１０日経過後でも、オイルレッドＯで染色された細胞はまばらであり、分化があまり進んでいないことが認められた。
【０１０３】
［実施例６］ｈＭＳＣの骨芽細胞への分化誘導
実施例５と同様の各担体を滅菌処理後、２４ウェルプレートに入れた。ここに不死化されたｈＭＳＣを１×１０5個（ウェル開口径７５μｍ）、２×１０5個（ウェル開口径１７５μｍ）、３×１０5個（ウェル開口径３５０μｍ）、４×１０5個（ウェル開口径５１０μｍ）播種して、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
播種してから４日目に、骨形成分化誘導培地（ＧＩＢＣＯ社）に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて１４日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちに、ＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてＲＮＡの抽出を行った。
得られたＲＮＡについて、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、逆転写後、骨芽細胞マーカーであるＣｏｌI（１型コラーゲン）、ＳｐｐI（オステオポンチン）、ＭＳＣマーカーであるＣＤ１０５の発現をＰＣＲによって確認した。
これらのマーカーを図２７に示す。なお、比較のため、シャーレで形成したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導して得られた骨芽細胞についてのマーカーも併せて示す。
【０１０４】
図２７に示した結果から分かるように、細胞培養担体のウェルによってサイズを制御して培養したｈＭＳＣの凝集塊を分化誘導した結果、ウェル開口径が大きいほど、ＣｏｌI及びＳｐｐIの発現が多く、骨芽細胞への分化誘導が進んでいることが確認された。
【０１０５】
また、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１１５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．６〜０．９μｍのジルコニア原料粉を用いて、１０５０℃で焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．７５〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１１５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体と、平均粒子径が０．８〜１．２μｍのジルコニア原料粉を１２５０℃で仮焼成した後、１０５０℃、１１５０℃及び１２５０℃でさらに焼成して作製した開口径及び深さが７０μｍ、１７５μｍ、５５０μｍのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体を用いて、これらについても、上記と同様にしてｈＭＳＣを播種して培養した。その結果、これらの各細胞培養担体においても、ウェル内で骨芽細胞への分化誘導が進んでいることが確認された。
【０１０６】
［比較例８］シャーレ上でのｈＭＳＣの骨芽細胞への分化誘導
ゼラチンがコーティングされた直径１０ｃｍのシャーレに、不死化されたｈＭＳＣを７×１０4個播種して、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
２４時間後、骨分化誘導培地（ＧＩＢＣＯ社）に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は４日おきに行った。
分化誘導を始めて７日経過後、この担体から分化誘導培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出及びＰＣＲによるマーカーの確認は、実施例５と同様にして行った。
これらのマーカーを実施例６の結果と併せて、図２７に示す。
【０１０７】
図２７に示した結果から分かるように、シャーレで培養したｈＭＳＣを分化誘導した結果、ＣＤ１０５の発現が、実施例６の細胞培養担体を用いた場合に比べて多く、ＣｏｌI及びＳｐｐIの発現は、実施例６のウェル開口径３５０μｍ、５１０μｍの細胞培養担体を用いた場合に比べて少なかった。
このことから、本発明に係る細胞培養担体によれば、骨芽細胞へ効率よく分化誘導可能であることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に複数のウェルが形成されており、前記上面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記ウェルは、開口部が円形状又は矩形状であり、開口径が７０〜５５０μｍであることを特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
近隣する前記ウェルの中心点の間隔が、８０〜７００μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【請求項５】
セラミックス焼結体からなり、かつ、該セラミックス焼結体の平均細孔径が０．１５〜０．４５であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
前記セラミックスがジルコニアであることを特徴とする請求項５記載の細胞培養担体。
【請求項７】
前記上面がセラミックス焼結後の非加工面であることを特徴とする請求項５又は６に記載の細胞培養担体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養担体を用いた細胞培養方法であって、
容器内に前記細胞培養担体の上面を上にして配置した後、前記容器内に第１の培養液を供給し、該第１の培養液を前記細胞培養担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる工程と、
前記第１の培養液を浸透させた細胞培養担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を播種する工程と、
前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記細胞培養担体全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、
前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導するための第３の培養液を前記容器内に供給し、前記細胞培養担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞のうちのいずれかの組織細胞に分化誘導する工程と
を備えていることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項９】
前記第２の培養液中の間葉系幹細胞数を前記担体１ｃｍ2あたり１×１０4個以上１×１０6個以下とすることを特徴とする請求項８記載の細胞培養方法。
【請求項１】
間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に複数のウェルが形成されており、前記上面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記ウェルは、開口部が円形状又は矩形状であり、開口径が７０〜５５０μｍであることを特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
近隣する前記ウェルの中心点の間隔が、８０〜７００μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【請求項５】
セラミックス焼結体からなり、かつ、該セラミックス焼結体の平均細孔径が０．１５〜０．４５であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
前記セラミックスがジルコニアであることを特徴とする請求項５記載の細胞培養担体。
【請求項７】
前記上面がセラミックス焼結後の非加工面であることを特徴とする請求項５又は６に記載の細胞培養担体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養担体を用いた細胞培養方法であって、
容器内に前記細胞培養担体の上面を上にして配置した後、前記容器内に第１の培養液を供給し、該第１の培養液を前記細胞培養担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる工程と、
前記第１の培養液を浸透させた細胞培養担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を播種する工程と、
前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記細胞培養担体全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、
前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導するための第３の培養液を前記容器内に供給し、前記細胞培養担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞のうちのいずれかの組織細胞に分化誘導する工程と
を備えていることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項９】
前記第２の培養液中の間葉系幹細胞数を前記担体１ｃｍ2あたり１×１０4個以上１×１０6個以下とすることを特徴とする請求項８記載の細胞培養方法。
【図２】
【図５】
【図８】
【図１１】
【図１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図５】
【図８】
【図１１】
【図１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【公開番号】特開２０１２−５０４２６（Ｐ２０１２−５０４２６Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３０９５３（Ｐ２０１１−１３０９５３）
【出願日】平成２３年６月１３日（２０１１．６．１３）
【出願人】（５０７１８２８０７）コバレントマテリアル株式会社 (506)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月１３日（２０１１．６．１３）
【出願人】（５０７１８２８０７）コバレントマテリアル株式会社 (506)
【Ｆターム（参考）】
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