細胞療法戦略を用いた慢性神経組織損傷の治療方法
製薬上許容される液体に懸濁させた接着骨髄幹細胞を含む組成物を、損傷部位での軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、損傷部位またはその近傍に投与することによる、神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、外傷性または変性の神経または脳の損傷を治療するために接着骨髄細胞集団の治療上有効な量を患者に投与することによる細胞療法の細胞、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
末梢神経および／または脊髄（ＳＣＩ）の外傷性または変性の損傷を含む神経および脳の損傷は、依然として治癒的療法がないままである。例えばＳＣＩについては、脊髄の軽い打撲傷であっても大量の神経細胞およびグリア細胞の損失、脱髄（ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）、キャビテーション（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）、およびグリア性瘢痕をもたらしうる。このような病変は、知覚の損失、末梢運動まひ、および重度の機能障害の原因となる有害な機能的影響を有し、最終的な結果は、軸索温存（ａｘｏｎａｌ ｓｐａｒｉｎｇ）、ミエリン再形成およびおそらくは神経再生に依存する。また、同様の影響が、特にアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、多系統変性症、小脳変性症などを含む多くの神経変性障害とともに観察された。したがって、損傷を受けた組織を修復または再生し、最終的にこのような組織および失われた機能的影響を回復するための１以上の戦略が望まれている。
【０００３】
提案されている戦略のひとつは、患部を治療する目的で多能性細胞または幹細胞を使用することである。特に骨髄間質細胞は、幹細胞の特性の多くを有し、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、さらに筋芽細胞に分化することが示されたため、このような目的には魅力的な候補である。したがって、患者における損傷した神経または脳組織の再生において、これらの細胞の使用の可能性がある。
【０００４】
主な難しさのひとつは、骨髄細胞型は相対的にまれであり、識別が難しいことである。そのため、現在の研究の多くは、興味のある特定の細胞型を単離し、神経細胞分化を達成するための方法論を探索することを中心としてきた。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３１３８７号には、骨髄細胞集団内の顆粒球からの単核細胞の単離が開示されている。また、米国特許第７，０９８，０２７号では、密度勾配遠心分離法を用いて、すなわち、１．０７〜１．０８ｇ／ｍｌの範囲の比重を有する細胞を単離することによって、単核細胞を単離している。２つの場合のいずれも、単離された単核細胞は、髄損傷または他の神経障害の治療のための投与が検討されている。
【０００５】
細胞の単離以上に、インビトロ環境での投与の前またはインビボの投与の後に、ＢＭ細胞を分化させる多くの試みがなされてきた。例えば、米国特許第５，１９７，９８５号には、成熟骨髄（ＢＭ）細胞を用いて間葉組織および神経外胚葉組織を再生する方法が記載されている。細胞分化は、リン酸三カルシウムもしくはヒドロキシアパタイトまたはこれら２つの組み合わせの多孔質セラミック組成物を、骨格異常に移植されると細胞の骨格組織への分化を促進する骨髄由来の間葉細胞のビヒクルまたは担体として用いて達成される。
【０００６】
米国特許第６，５２８，２４５号には、細胞をプラスチックの培地でインキュベートし、プラスチックに接着した間質細胞を除去することによって、骨髄細胞集団中の骨髄間質細胞を特異的に選択する方法が開示されている。次いで、これらの細胞は、レチノイン酸、増殖因子、および胎児の神経細胞の存在下でインビトロで分化され、神経変性障害の治療のために投与される。米国特許出願公開第２００６／０２７５２７２号には、同様に、このような目的に用いる骨髄間質細胞を単離および培養することによる処理方法が示されている。最後に、米国特許第７，２７９，３３１号には、骨髄間質細胞を単離し、次いでこれを抗酸化剤および／またはさまざまな増殖因子を用いて神経細胞中にインビトロで予備分化させる、同様の方法が示されている。
【０００７】
米国特許出願公開第２００６／００２９５８０号には、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を添加した培養液中で骨髄細胞をインキュベートすることによって、神経前駆細胞を発生させる方法がさらに示されている。次いで、前駆細胞は神経病理学的状態を示す患者に投与されうる。
【０００８】
ＢＭ細胞の他に、胎盤または他の出産後組織に由来する細胞もまた、神経再生の目的で検討されている。米国特許出願公開第２００６／０１４７４２６号は、出産後の多分化能誘導性細胞を単離する細胞培養条件に関する。このような培養条件は、細胞外マトリックス基材、酸素圧、増殖因子およびビタミン、細胞密度または細胞の共培養を含む。米国特許出願公開第２００５／００３２２０９号には、分娩後由来細胞を用いて神経組織を再生または修復するための方法および組成物が示されている。これらの細胞は、胎盤または臍帯組織に由来し、５％酸素環境でＬ−バリン培地上で成長する。
【０００９】
上記は、骨髄細胞および同様の多能性細胞型が間葉細胞へ分化しうることの明確な証拠を提示し、さらに、これらの細胞型を神経または脳組織の外傷性または変性損傷の治療（損傷した軸索組織のミエリン再形成または再生など）に適用することの実現可能性および期待を示した。しかしながら、上記で提案された方法論を考慮しても、より断定できる細胞分化のための他の細胞集団および新規な戦略が必要である。加えて、現在神経細胞移植の広範囲な用途を制限している多くの倫理的および技術的制約を回避する必要がある。
【００１０】
本発明は、その実施形態および実施例を通してこれらの必要性に対処する。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
本発明は、外傷性または変性の神経または脳の損傷を治療するために、骨髄細胞集団から単離された接着骨髄細胞の治療上有効な量を患者に投与することを含む、細胞療法の細胞、組成物、および方法に関する。本明細書中に記載されるように、本発明は、接着骨髄細胞（ＡＢＭＣ）が、神経前駆細胞型、ミエリン形成細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、成熟神経細胞、有髄軸索などに分化しうる、および／またはこれらを生成させうることを見出したことに基づく。より具体的には、驚くべきことに、単離されたＡＢＭＣがＳＣＩなどの神経損傷を受けた哺乳類の損傷に導入されると、前記細胞は損傷部位で損傷を受けた神経組織のミエリン再形成および軸索再生の両方をもたらすことを見出した。運動協調の改善および／または標的の神経変性状態の低減もまた、特に理学療法と組み合わせた場合、観察された。
【００１２】
したがって、本発明の一形態によれば、製薬上許容される液体に懸濁させた接着骨髄幹細胞を含む組成物を、損傷部位で軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、損傷部位またはその近傍に投与することによる、神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法が提供される。本発明の形態の一実施形態によれば、前記損傷は脳または脊髄の損傷であり、前記骨髄幹細胞は、前記損傷部位またはその近傍に、腰椎穿刺を通してくも膜下注射によって脳脊髄液に投与される。本発明の他の実施形態によれば、前記損傷は末梢神経の損傷であり、前記骨髄幹細胞は、超音波ガイド下局所送達によって末梢神経根に投与される。
【００１３】
本発明の他の実施形態によれば、前記接着骨髄幹細胞は、前記損傷部位で軸索再生およびミエリン再形成の両方を生じさせる。本発明の他の実施形態によれば、前記骨髄幹細胞は、臍帯血または骨髄穿刺液に由来する。
【００１４】
治療上有効な量の細胞が、神経または脳の損傷を治療するために患者に投与される。一実施形態においては、治療上有効な量は、損傷部位で損傷を受けた神経組織のミエリン再形成および／または軸索再生を生じさせるために、または損傷を受けた神経または脳の組織を修復するために必要な細胞の量を意味する。そして、これは運動協調の改善および／または標的の神経変性状態の低減を促進しうる。治療上有効な投与量は、約１０４〜約１０７ＡＢＭＣ／ｋｇである。以下に例示するように、非制限的な実施形態においては、治療上有効な投与量は約２×１０６ＡＢＭＣ／ｋｇである。
【００１５】
このような治療上有効な投与量は、１回の投与または複数回の累積投与として患者に提供され、ＡＢＭＣの作用または分化に悪影響を与えないかぎり、１以上の製薬上許容される添加剤をさらに含みうる。一実施形態においては、前記骨髄幹細胞の累積投与量は、２回以上の注射で定期的に投与される。より具体的な実施形態においては、前記定期的な注射は月１回行われる。
【００１６】
ＡＢＭＣの単離された亜集団は、多分化能（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、特に神経分化の指標となる、１以上の分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＣＤ）細胞表面マーカーに対して陽性である。本発明の一実施形態によれば、前記骨髄幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ２７１から選択される１以上のマーカーに対して陽性である細胞を含む。より具体的な実施形態によれば、前記骨髄幹細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５に対して陰性である。これらのマーカーの存在（または不在）は、本明細書中で説明する１以上の手順または当業者に公知の他の方法を用いて確認することができる。
【００１７】
以下で例示する他の実施形態においては、ＡＢＭＣは、１以上のミエリン形成細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞、有髄軸索、成熟神経細胞などの生成を含む、またはもたらす。そのため、新たに形成された細胞は、特に制限されないが、ＮＦ７０、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＤＧＦＲ、ＧＦＡＰまたはＴｕＪｌなどの細胞型に関連する１以上のマーカーに対して陽性であることがわかった。
【００１８】
本発明において、骨髄幹細胞を含む生体試料は、はじめに、本明細書中に記載されるように当業者に公知の標準的な方法を用いて、例えば臍帯血または骨髄穿刺液から得られる。次いで、ＡＢＭＣの亜集団は、本発明の方法を用いて単離される。
【００１９】
したがって、本発明の他の形態によれば、以下の段階を含む、脊椎動物における神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法が提供される：
（ａ）ポリ−Ｌ−リシン被覆基板上で、骨髄幹細胞の層が前記基板に接着するように、成熟骨髄幹細胞を含む生体試料を培養する；
（ｂ）前記基板から非接着細胞を洗浄し、前記骨髄幹細胞の層を収集する；
（ｃ）接着骨髄幹細胞を製薬上許容される液体に懸濁させる；および
（ｄ）前記骨髄幹細胞の懸濁液を、損傷部位で軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、前記損傷部位の近傍に投与する。
【００２０】
一実施形態においては、前記培養段階は２〜７２時間行われ、さらなる実施形態においては、その時間は約７２時間である。他の実施形態においては、インキュベーション後、１または複数の洗浄段階を用いて被覆基板を洗い流すことによって非接着細胞を除去する。その後、接着細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆基板から取り外す。
【００２１】
次いで、ＡＢＭＣは、当該分野で理解されている任意の投与形態を用いて、患者の損傷部位またはその近傍に投与される。非制限的な一実施形態においては、ＡＢＭＣは損傷部位またはその近傍への直接注射用に製剤されうる。そのため、前記細胞は、生理食塩水、蒸留水、髄液または他の製薬上許容される液体の１以上を含みうる、滅菌溶液中に懸濁されうる。脊髄損傷の治療のためには、投与はくも膜下注射によって行われる。投与形態の他の実施形態は、本明細書中にさらに提供される、または、当業者によって理解される他の形態である。
【００２２】
本発明のＡＢＭＣおよび組成物は、脊髄または末梢神経の損傷での軸索再生およびミエリン再形成への寄与において有益である。これらは、さらに、損傷を受けた神経または脳の組織の修復に有益である。脊髄損傷、すなわち、運動まひまたは感覚消失を有する患者については、ＡＢＭＣ移植は、特に理学療法による機能訓練と組み合わせた場合、軸索再生およびミエリン再形成の促進ならびに修復の誘導に効果的である。皮質脊髄路線維の再生もまた観察され、機能改善と一致した。また、ＡＢＭＣは、線維性瘢痕組織に新たな神経細胞経路を生成することによって、または、発芽もしくは生成している短い再生した神経細胞線維を増殖させることによって、宿主神経組織を支持する神経栄養因子および抗炎症性メディエータを生成した。
【００２３】
当業者であれば、本明細書中に与えられた教示および例示に基づいて本発明のさらなる利点を理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、イヌの重度ＳＣＩモデルにおけるＡＢＭＣ細胞療法後１６週での組織病理学的所見を示す。（Ａ）Ｈ＆Ｅで染色した対照群のイヌの損傷した脊髄の中心点（ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）であり、著しい空孔形成（挿入）およびグリア性瘢痕を示す。（Ｂ）自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）ＡＢＭＣで治療した群Ｂのイヌの損傷した脊髄の中心点であり、ミエリン再形成およびキャビテーションが少ないことを示す。（Ｃ）キャビティ領域の定量分析であり、自己ＡＢＭＣで治療したイヌにおけるキャビティの有意な減少を示す。（Ｄ〜Ｆ）損傷を受けていないイヌの無傷の脊髄（Ｄ）、対照ＳＣＩのイヌ（Ｅ）、および自己ＡＢＭＣで治療したイヌ（Ｆ）のミエリン塩基性タンパク質免疫染色。（Ｇ）自己ＡＢＭＣで治療した後のイヌにおける、ミエリン塩基性タンパク質染色の無傷のイヌの正常レベル近くまでの回復。（Ｈ）ベースライン、ならびにＳＣＩ後１、４、８、１２および１６週でのイヌの運動（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ）スコアであり、自己ＡＢＭＣで治療したイヌにおいては移植後わずか４週間で有意な改善を示している。（Ｉ）対照と比較した、自己ＡＢＭＣで治療したイヌの後肢運動の向上。
【図２】図２は、自己ＡＢＭＣで治療したイヌからのＳＣＩ切片の多色免疫蛍光染色を示す。（Ａ）脊髄損傷の断面であり、自己ＡＢＭＣで治療したイヌからの切片においてのみ観察された、脊髄の狭間（矢印）をつなぐ秩序立った組織を示す。セクションは、核マーカーであるＤＡＰＩ（青）、移植されたＡＢＭＣのマーカーであるＧＦＰ（緑）および神経細胞マーカーであるＮＦ７０（赤）の明視野像および蛍光像の低出力を重ねたものである。ＧＦＰ発現は、灰白質および白質の両方において広範囲にわたり、神経根を囲んでいる。脊髄の灰白質中の正方形の領域１は、共局在化したＧＦＰおよびＮＦ７０染色を示す。前皮質脊髄路の断面の正方形の領域２は、ＧＦＰ発現（右）の高倍率、およびＮＦ７０と共局在化したＧＦＰを有する軸索を示す。スケールバーは２００μｍである。（Ｂ）中心点からの距離によるＧＦＰ陽性細胞の分布。（Ｃ〜Ｆ）前皮質脊髄路の断面であり、ＧＦＰおよびＮＦ７０の免疫活性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す。（Ｃ）前皮質脊髄路であり、共局在化したＧＦＰおよびＮＦ７０を示し、ＧＦＰ細胞誘導体のかなりの神経細胞分化を示す。（Ｄ）Ｃにおける切片を明視野像に重ねた写真である。（Ｅ）構造的ＮＦ７０発現（挿入）を有するＧＦＰ陽性ミエリン再形成軸索を示す高倍率写真である。（Ｆ）Ｅにおける切片を明視野像に重ねた写真である。（Ｇ）共局在化したＧＦＰおよびネスチン染色。（Ｈ）共局在化したＧＦＰおよびＰＤＧＦＲ染色、挿入部は正方形の領域の拡大を示す。（Ｉ）共局在化したＧＦＰおよびＧＦＡＰ染色、挿入部は正方形の領域の拡大を示す。挿入部の矢印はＧＦＰ陽性軸索を示し、くさび形はＧＦＰ発現のない軸索を示す。（Ｊ）中心管付近の灰白質の領域における共局在化したＧＦＰおよびＧＲＭ１、ＧＡＤ、Ａ２Ｂ５およびＡＥ染色。すべての切片においてＤＡＰＩを核染色に用いた。Ａ中のスケールバーは２００μｍであり、ＤおよびＦ中のスケールバーは１０μｍである。
【図３】図３は、慢性完全脊髄損傷患者におけるＡＢＭＣの自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）くも膜下移植の研究設計を示す。図は、登録、試験対象患者基準、および追跡基準を示す。
【図４】図４は、自己ＡＢＭＣ移植後１８か月に測定した、慢性ＳＣＩ患者の回復を示す。（Ａ）対照と比較した、自己ＡＢＭＣで治療した患者の神経レベル（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｅｖｅｌ）の向上。対照患者は、胸部神経レベルが胸部１〜１２（Ｔ１〜Ｔ１２）レベルのままであったが、自己ＡＢＭＣで治療した患者は、最大Ｓ５までの腰部および仙骨の神経レベルを得た。（Ｂ）対照と比較した、治療した患者におけるＡＳＩＡスコア（左軸）およびＡＳＩＡスケール（右軸）の変化。３人の対照患者は、１８か月後のＡＳＩＡスコアがその患者のベースラインスコアよりも低かったが、細胞療法で治療した患者は、改善されたスコアを示した。（Ｃ）自己ＡＢＭＣ移植の前および１２か月後のＭＲＩ像（頸部ＳＣＩの患者６）であり、Ｃ６〜Ｃ７レベルの脊髄の圧迫および浮腫を示すが、治療１年後の像は最小のグリオーシスを有する治癒された領域を示した。
【図５】図５は、イヌのＡＢＭＣの３能性および神経誘導を示す。（Ａ）７２時間後に単離し、ギムザ染色したイヌの接着ＢＭ細胞（ＡＢＭＣ）。挿入部は細胞の高出力像を示す。（Ｂ）ＧＦＰを用いて９５％の効率でトランスフェクトされたイヌのＡＢＭＣ（この視野のすべての細胞はＧＦＰに対して陽性である）。（Ｃ）１週間後のｃＡＢＭＣの神経細胞誘導であり、神経形態（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）（上部の挿入）および神経球（下部の挿入）を示す。（Ｄ）脂肪細胞が誘導されオイルレッドで染色されたｃＡＢＭＣ。（Ｅ）Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色（上部の挿入）およびアルカリホスファターゼ染色（下部の挿入）での骨細胞分化。（Ｆ）組織培養プレート中（上部の挿入）、または管状３Ｄ培地中（下部の挿入）のコンドロイチン硫酸凝集体（矢印）としての軟骨細胞が誘導されたｃＡＢＭＣのアルシアンブルー染色。(Ｇ〜Ｉ)神経分化が誘導され、ネスチンで染色されたｃＡＢＭＣの明視野およびＧＦＰ像。
【図６】図６は、７２時間後に単離されたヒト接着ＢＭ細胞（ＡＢＭＣ）であり、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への３血球系分化転換、ならびに神経球誘導および神経分化の多能性を示す。（Ａ）脂肪細胞分化が誘導されたｈＡＢＭＣのオイルレッド染色。（Ｂ）アルカリホスファターゼ染色での骨細胞分化。（Ｃ）軟骨細胞が誘導されたｈＡＢＭＣのアルシアンブルー染色。（Ｄ〜Ｆ）４日後のｈＡＢＭＣの神経細胞誘導であり、神経形態を示す。（Ｇ〜Ｉ）１週間後の神経球生成からの神経細胞の誘導。
【図７】図７は、神経分化の７２時間後に単離されたヒトの接着ＢＭ細胞（ＡＢＭＣ）を表す。（Ａ）誘導前のｈＡＢＭＣの明視野像。（Ｂ）ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたｈＡＢＭＣ。（Ｃ）ｈＡＢＭＣにおけるネスチンの発現。（Ｄ）４日後のｈＡＢＭＣの神経細胞誘導であり、神経形態を示す。（Ｅ）Ｄにおける同じ神経細胞がＮＦ７０を発現する。（Ｆ）Ｄにおける同じ神経細胞がＴｕＪｌを発現する。（Ｇ）神経誘導後のアストロサイト様の形態およびＰＤＧＦＲ発現（挿入）。（Ｈ）誘導されたｈＡＢＭＣにおけるＴｕＪｌの発現（上部の挿入は高倍率を示す）、一方下部の挿入は長い樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）を有するＴｕＪｌ陽性細胞を示す。（Ｉ）継代（ｐａｓｓａｇｅ）０（Ｐ０）でのｈＡＢＭＣにおける、継代６の後の同じ患者からの細胞と比較した、ネスチン、ＰＤＧＦＲ、およびＴｕＪｌ細胞の百分率。Ａ中のスケールバーは２０ｍｍであり、ＤおよびＦ中のスケールバーは１０ｍｍである。
【図８】図８は、対照およびＡＢＭＣ移植の１６週での皮質脊髄路切片の免疫蛍光染色を示す。（Ａ〜Ｄ）対照のイヌからの皮質脊髄路切片。（Ｅ〜Ｈ）自己ＡＢＭＣで治療したイヌからの皮質脊髄路切片。（Ａ）外側皮質脊髄路の明視野切片。（Ｂ）核マーカーであるＤＡＰＩ（青）、ＧＦＰ（緑）、およびＮＦ７０（赤）神経細胞マーカーの蛍光像。ＧＦＰの発現は検出されなかったが、弱いＮＦ−７０の発現が検出された。（Ｃ）前皮質脊髄路の明視野。（Ｄ）ＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびＮＦ−７０で染色した、Ｃにおける前皮質脊髄路の蛍光像。（Ｅ）対照のイヌからの外側皮質脊髄路。（Ｆ）外側皮質脊髄路の蛍光切片であり、共局在化したＧＦＰおよびＮＦ−７０を示す。（Ｇ）Ｅにおける明視野にＦにおける蛍光像を重ねた写真である。（Ｈ）Ｇ中の正方形の高倍率であり、共局在化したＮＦ７０発現（黄色）を有する、ＧＦＰ陽性ミエリン再形成軸索を示す。スケールバーは１００μｍである。
【図９】図９は、ＧＦＰおよびＰＤＧＦＲに対して陽性であるＢＭ誘導細胞が中心管を囲み、脊髄内の小血管に関連することを表す。（Ａ）核マーカーＤＡＰＩ（青）、移植されたイヌのＡＢＭＣのマーカーであるＧＦＰ（緑）、およびＰＤＧＦＲ（赤）マーカーの蛍光像。像の左下でＤＡＰＩ核は中心管に並ぶ。（Ｂ）蛍光像を明視野像に重ねたものであり、ＧＦＰ陽性軸索および脊髄小血管を示す。スケールバーは５０μｍである。
【図１０】図１０は、対照のイヌにおけるＳＣＩの切片の電子顕微鏡像を表し、著しい空孔形成、および切片の１％未満を再構成する最小の軸索温存を示す。（Ａ）対照のイヌのＳＣＩの低出力視野における著しい空孔形成および単一の温存された軸索。（Ｂ）正常ミエリン形成を有する温存された軸索。（Ｃ）神経膠瘢痕を有するミエリン形成細胞。（Ｄ）過剰の空孔形成およびミエリン形成細胞を囲む瘢痕であり、ミエリン再形成の証拠はない。（Ｅ）Ｄの高出力像。スケールバーは１μｍである。
【図１１】図１１は、広範囲の軸索再生を示す、ＡＢＭＣで治療したＳＣＩのイヌの切片の電子顕微鏡像を表す。（Ａ）再生した軸索は、直径がより小さく、複数の軸索は多核ミエリン形成細胞を伴い、側部（ｌａｔｅｒａｌ）ミエリン形成を示唆する。ＳＣＩの対照のイヌの低出力視野における限定的な空孔形成および単一の温存された軸索。（Ｂ）厚い周縁を有するミエリン再形成軸索。（Ｃ）より大きいミエリン再形成軸索を囲む、複数の小さい軸索。（Ｄ）複数の軸索を引きつけるミエリン形成細胞。（Ｅ）多小葉性（ｍｕｌｔｉｌｏｂｕｌａｒ）核を有するミエリン形成細胞。（Ｆ）多核の大きいミエリン形成細胞および周囲の基底膜。スケールバーは１μｍである。
【図１２】図１２は、イヌにおけるＭＳＣで治療したＳＣＩの切片のＦＩＳＨ分析を示し、イヌの３５番染色体プローブで標識され、融合の証拠を示さない、正常２倍体細胞（矢印）を表す。（Ａ）ＤＡＰＩ染色核であり、赤色標識プローブで染色された２倍体の３５番染色体（矢印）を示す。（Ｂ）３５番染色体赤色プローブで染色された、ＧＦＰ陽性細胞中の２倍体核の高倍率。
【図１３】図１３は、ＡＢＭＣで治療した患者および対照患者の後脛骨筋において記録された、運動誘発電位反応を示す（それぞれの群から１人の患者からの代表的な記録）。（Ａ）均一な活動を示す対照患者の記録。（Ｂ）治療後１年で記録を行った、ＡＢＭＣで治療した患者。ＡＢＭＣで治療した患者における回復は、後脛骨筋について記録された、２０〜３０ｍｓｅｃの潜伏時間を有する電気的に誘発された反応から明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、神経または脳の外傷性または変性損傷を治療するために、骨髄細胞集団から単離された接着骨髄細胞の治療上有効な量を患者に投与することを含む、細胞療法の細胞、組成物、および方法に関する。本明細書中に記載されるように、本発明は、接着骨髄細胞（ＡＢＭＣ）が、神経前駆細胞型、ミエリン形成細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、成熟神経細胞、有髄軸索などに分化しうる、またはこれらを生成させうることを見出したことに基づく。より具体的には、驚くべきことに、単離されたＡＢＭＣが、例えばＳＣＩなどの神経損傷を受けた哺乳類に導入されると、正味の効果は、損傷部位での、損傷を受けた神経組織のミエリン再形成および軸索再生であることを見出した。これは、運動協調の改善および／または標的の神経変性状態の低減をさらにもたらすことが、特に理学療法と組み合わせた場合に観察された。
【００２６】
本発明の骨髄細胞集団は、公知の任意の方法で得られうる。一実施形態においては、前記骨髄細胞集団は、骨に挿入した針を通して骨髄液および細胞を取り除くことによって吸引されうる。骨髄穿刺は、腸骨稜において行われうるが、この部位に制限されず、穿刺または骨髄細胞を得る他の方法において公知の任意の他の身体の部位で行われうる。特定の実施形態においては、骨髄細胞は罹患患者から同系細胞で（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）得られる。しかしながら、本発明はこれに限定されず、骨髄細胞集団はまた、特に制限されないが、骨髄バンク（または同様のソースまたは患者の非血縁者由来の骨髄）、血縁者からの骨髄、または任意の他の胎児でない動物のソースからの骨髄、臍帯血、脂肪組織、体液、または公知の任意の他のソースなどの、患者に免疫学的に適合する、当業者に公知に任意の他のソースから得られうる。
【００２７】
そのソースにかかわらず、骨髄細胞は穿刺液から公知の標準的な方法を用いて単離される。非制限的な一実施形態においては、骨髄穿刺液は、例えばＲＰＭＩ−１６４０などの緩衝製剤を用いて希釈され、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（商標）（アマシャムバイオサイエンス）などの細胞分離培地の存在下で遠心分離される。上澄みが除去され、ペレットの細胞は再懸濁され、多能性細胞の維持のための標準的な培地を用いて維持される。非制限的な例において、このような培地としては、低グルコース含有量であり、ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、少なくとも１つの広域スペクトル抗生物質およびＣＯ２が添加されたＤＭＥＭが挙げられる。他の培地型もまた他の公知のものとして用いられうる。
【００２８】
この骨髄細胞の集団から、次にＡＢＭＣの亜集団が単離される。非制限的な一実施形態においては、ＡＢＭＣは、細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆基板上で培養することによって、培養液中の細胞を増殖することなく単離される。そのため、細胞は、ポリ−Ｌ−リシンで被覆したディッシュ、フラスコ、バッグ、または多能性細胞の培養のための当業者に公知の他の同様の材料の上に懸濁されうる。非制限的な一実施形態においては、前記細胞は約２．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で懸濁される。被覆した基板は、例えば、Ｌ−グルタミン含有α−ＭＥＭ、１以上の広域抗生物質、およびＦＢＳなどの当業者に公知の骨髄細胞生存用の任意の標準的な培地をさらに含みうる。
【００２９】
骨髄細胞集団は、接着骨髄細胞を非接着骨髄細胞から分離するのに有効な時間、ポリ−−Ｌ−リシン被覆基板上でインキュベートされる。一実施形態においては、このような有効な時間は２〜７２時間である。さらなる実施形態においては、前記有効な時間は約７２時間である。
【００３０】
インキュベーションの後、１または複数の洗浄段階を用いて被覆基板を洗い流すことによって、非接着細胞を除去する。任意の公知の洗浄剤が前記洗浄段階で用いられてもよく、特に制限されないが、生理食塩水、ＰＢＳ、ＦＢＳ、ｄＨ２Ｏ、培地、または公知の同様の洗浄剤が挙げられる。特定の実施形態においては、前記細胞は３回洗い流され、非接着細胞が除去される。
【００３１】
洗浄後、接着細胞は公知の方法を用いてポリ−Ｌ−リシン基板から外される。例えば、一実施形態においては、単離されたＡＢＭＣは、Ａｃｃｕｔａｓｅ存在下で前記基板をインキュベートすることによってポリ−Ｌ−リシン被覆基板から外される。特定の実施形態においては、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを用いた３７℃で５分間のインキュベーションによってリフトする。しかしながら、本発明はこれに制限されず、接着細胞をリフトする同様の方法、または当該分野で理解されている他の方法もまた考えられる。
【００３２】
さらなる実施形態においては、ＡＭＢＣの亜集団はまた、２００９年１０月１６日に出願され、その内容が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許仮出願第６１／２５２，３８９号に開示された１以上の方法を用いて単離されうる。
【００３３】
ＡＢＭＣの単離された亜集団内の細胞は、多分化能、特に神経分化の指標となる、１以上の分化抗原群（ＣＤ）細胞表面マーカーに対して陽性である。このようなマーカーは、特に制限されないが、以下のＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ２７１の１以上から構成されうる。特定の実施形態においては、本発明のＡＭＢＣは、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５の発現を示さない。これらのＣＤ細胞表面マーカーの存在または不在は、当業者に公知の１以上の手順によって同定されうる。一実施形態において、このような手順としては、２〜７２時間のインキュベーションの後のフローサイトメトリーが挙げられる。細胞表面マーカーの同定のための公知の一般的なイムノアッセイもまた用いることができ、当業者に公知である。そのため、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方がアッセイに用いられうる。ここで、当業者に知られているように、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの適当な他のイムノアッセイも用いられうる。適用できるイムノアッセイは、特許文献および学術文献に広範囲に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号、加えて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ（１９８９）を参照。
【００３４】
投与前に、ＡＢＭＣは、分化を生じさせる環境条件および／または培地への曝露を最小にするまたは完全に避ける、最初に単離された形態から最小限に操作されていることが好ましい。別の方法では、しかしながら、本発明はこのような形態に制限されない。特定の実施形態においては、ＡＢＭＣのサブセットの全体は、神経系列に予備分化されていてもよい。非制限的な例においては、ＡＢＭＣのサブセットの全体は、投与の直前に、公知の神経細胞誘導培地上で、約１〜３日インキュベートされうる。このような培地としては、特に制限されないが、２％のＤＭＳＯおよび１ｍＭのホルスコリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
【００３５】
本発明のＡＢＭＣは、患者の損傷を受けた部位に、または近似的に当該部位に投与されうる。細胞投与形態は、治療する損傷／疾患の型、哺乳類の年齢、細胞が分化しているかどうか、細胞がこれに導入された異種ＤＮＡを有するかどうか、などを含むいくつかの因子に依存して変動しうる。脊髄組織に細胞を投与する例は、本明細書の実験的な実施例の欄に記載されている。この例では、細胞は、哺乳類の脳脊髄液に、脊髄損傷部位の近傍にくも膜下（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）導入される。そのため、細胞は患者の損傷部位またはその近傍での脳脊髄液への腰椎穿刺を通して、くも膜下注射のような直接注射によって所望の部位に導入されうる。
【００３６】
しかしながら、本発明は必ずしもくも膜下注射またはこのような方法論に限定されない。手根管症候群に関連する正中神経損傷など、神経損傷が末梢神経の損傷である他の実施形態においては、前記細胞は、超音波ガイド下局所送達によって末梢神経根に投与されうる。前記細胞はまた、公知の１以上の方法を用いて、損傷部位近傍または損傷と同じ身体領域内に投与し、損傷部位に侵出（ｉｎｆｕｓｅ）させることができる。例えば、脳の部位への投与については、細胞をくも膜下に、または本明細書中の１以上の方法を用いて投与し、脳の損傷を受けた組織に侵出させてもよい。
【００３７】
必要に応じて、前記細胞は、例えばペプチドまたは他の生物剤などの血液脳関門を越える輸送を促進する１以上の添付群を備えうる。再び、上記の方法は本発明を制限するものではなく、前記細胞は、前記細胞が安全におよび確実に浸出されうるかぎり、任意の方法によって、例えば、特に制限されないが、経脈管、脳内、非経口、腹腔内、静脈内、硬膜外、髄腔内、胸骨内、関節内、腱滑液鞘内、脳内、動脈内、心臓内、または筋肉内で宿主に投与されうる。上述の任意の形態または他の公知の同様の形態を用いた本発明の細胞の移植もまた、本明細書中に提供される技術または他の公知の方法を用いて達成されうる。
【００３８】
ＡＢＭＣは、一般に、生理食塩水、蒸留水、髄液などの懸濁液の形態の組成物として移植に用いられる。一実施形態においては、例えば、前記組成物は、約１５０ｍｌの生理食塩水に懸濁したＡＢＭＣからなる。再び、本発明は必ずしもこの組成物に限定されず、ＡＢＭＣはまた、ＰＢＳなどの適当な緩衝液または製薬上許容される液体の範囲の他の緩衝液の懸濁液として、投与に適した組成物に製剤されうる。ＡＢＭＣはまた、生理食塩水中で低温保存して、使用前に上記の溶媒に懸濁させることによって再構成してもよい。ＡＢＭＣの単離および保存、ならびに組成物の調製の方法は、細胞移植に関する当業者に公知である。このようなＡＢＭＣの組成物は、ＡＢＭＣを患者から同系細胞で（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）得ることが困難な場合に有用である。
【００３９】
本明細書中に記載されるように、治療上有効な量の細胞が、外傷性または変性の神経または脳の損傷を治療するために患者に投与される。一実施形態においては、治療上有効な量は、損傷部位での損傷を受けた神経組織のミエリン再形成および／または軸索再生を生じさせるために、または損傷を受けた神経または脳の組織を修復するために必要な細胞の量を意味する。そして、これは運動協調の改善および／または標的の神経変性状態の低減を促進しうる。非制限的な一実施形態においては、約１０４〜１０７ＡＭＢＣ／患者の体重ｋｇが治療上有効な量として患者に投与される。さらなる実施形態においては、以下の実施例で例示するように、治療上有効な投与量は、約２×１０６ＡＢＭＣ／患者の体重ｋｇでありうる。
【００４０】
本発明のＡＢＭＣ含有組成物は、神経または脳の損傷を有する患者に、損傷後できるだけ早く投与されうる。しかしながら、以下の実施例に示すように、当業者は、治療の時期などは一般に医師によって決定され、必ずしも本発明に制限されないことを理解するであろう。そのため、患者の状態および他の因子に応じて、後の段階で治療を受けてもよい。
【００４１】
治療上有効な投与量は、１回の投与で、または複数回の投与で、患者に提供されうる。後者の場合には、前記治療上有効な量を、２〜８回の別個の投与など、複数回の投与に分けてもよい。このような投与は、複数日の期間にわたって続けて行ってもよく、毎日、週１回、月１回などで受ける離散的な投与として行ってもよい。再び、当業者は、治療の時期および／または投与の回数は、一般に医師によって決定され、必ずしも本発明に制限されないことを理解するであろう。
【００４２】
前記ＡＢＭＣの組成物は、ＡＢＭＣの作用または分化に悪影響を与えないかぎり、任意の製薬上許容される添加剤をさらに含みうる。例えば、患者が外因性のソースから取得したＡＢＭＣを用いて治療される場合、１以上の公知の免疫抑制剤があらかじめ投与されうる。免疫抑制剤は、特に制限されないが、シクロスポリン、タクロリムス水和物（ＦＫ５０６）、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミゾリビン、およびメトトレキセートなどの、骨髄または器官移植に一般に用いられるものから選択されうる。免疫抑制剤の投与量は、薬剤の種類、投与するＡＢＭＣの由来、患者の耐性などを考慮して適切に決定されうる。
【００４３】
本発明は、脊髄の損傷部位での軸索再生およびミエリン再形成、または他の神経もしくは脳の損傷を受けた部位（例えば、末梢神経損傷、脳損傷など）の修復への寄与において有益である。脊髄損傷、すなわち運動まひまたは感覚消失を有する患者については、ＡＢＭＣ移植は、特に理学療法による機能訓練と組み合わせた場合、軸索再生およびミエリン再形成の促進に有効であり、ＳＣＩ後の修復を誘導する。以下に例示するように、ＡＢＭＣは、１以上のミエリン形成細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞、有髄軸索、成熟神経細胞などの生成を含む、またはもたらす。そのため、新たに形成された細胞は、特に制限されないが、ＮＦ７０、ネスチン、ＰＤＧＦＲ、ＧＦＡＰまたはＴｕＪｌなどの細胞型に関連する１以上のマーカーに対して陽性であることがわかった。皮質脊髄路線維の再生もまた観察され、機能改善と一致した。
【００４４】
理論に拘束されることを意図するものではないが、軸索再生が、直接的に、または中心管（ｃｅｎｔｒａｌ ｃａｎａｌ）周辺の上衣領域におけるシュワン細胞または脊髄組織幹細胞中で成熟する、脳神経堤（ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ）からの神経前駆細胞の採用を通して、主な役割を担う可能性があると推測される。以下の例示においては、この領域は、共局在化した脊髄常在（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｒｅｓｉｄｅｎｔ）前駆細胞マーカーとともに、最も多くの数のＡＢＭＣ誘導細胞がみられた領域であった。ＡＢＭＣはまた、線維性瘢痕組織に新たな神経細胞経路を生成することによって、または、発芽もしくは生成している短い再生した神経細胞線維を増殖させることによって、宿主脊髄組織を支持する神経栄養因子および抗炎症性メディエータを生成する。さらに、ＡＢＭＣは、神経組織の遠位端および近位端との結合のためのガイダンス（誘導）を提供し、移植された細胞の再生を促進しうる。
【００４５】
脊髄および末梢神経の損傷ならびに脳の損傷は、必ずしも物理的な損傷に制限されず、疾患状態ともまた関連しうる。したがって、ＡＢＭＣの使用は、神経変性疾患状態の治療における使用もまた検討されうる。例えば、新生児から小児では、前記細胞は、特に制限されないが、テイーサックス病および関連するサンドホフ病、フルラー症候群および関連するムコ多糖症、ならびにクラッベ病を含む多くの遺伝病の治療に用いられうる。ＣＮＳの成人病については、本発明の細胞は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、てんかんなどの治療に有用である。他の神経変性疾患としては、特に制限されないが、ＡＩＤＳによる認知症；多発性硬化症および急性トランスフェラーゼ脊髄炎などの脱髄疾患；皮質脊髄系の病変などの錯体外路疾患および小脳疾患；大脳基底核障害または小脳疾患；ハンチントン舞踏病および老年性舞踏病などの多動性運動障害；運動低下性運動障害；進行性核上麻痺；小脳の構造的病変；脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、小脳皮質変性症などの脊髄小脳変性症；多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ病、デジェリーヌ−トーマス病、シャイ−ドレーガー病およびマシャド−ジョセフ病）；レフサム病、無βリポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張症などの全身性疾患；およびミトコンドリア多系統疾患；および神経原性筋委縮症などの運動単位の障害；中年のダウン症候群；びまん性レヴィー小体病；レヴィ小体型老年性認知症；ウェルニッケ−コルサコフ症候群；クロイツフェルト−ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン−スパッツ病；および拳闘家認知症などが挙げられる。例えば、当該参照文献およびこれに引用された参照文献が全体として参照により本明細書中に組み込まれる、Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ．ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９８７），Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，（１５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照。
【実施例】
【００４６】
以下の非制限的な実施例によって、本発明の一形態を説明する。
【００４７】
実施例
材料および方法
イヌ接着ＢＭ細胞（ｃＡＢＭＣ）の単離および培養
動物の飼育および処置のすべての形態は、ＮＩＨガイドラインおよび動物愛護委員会のガイドラインに従って行った。ＡＢＭＣは、成犬の大腿骨から単離した。簡潔には、低密度単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて単離し、２ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および０．３％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）−低グルコースに、３７℃で５％ＣＯ２濃度で維持した。ＡＢＭＣは、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．Ｍｕｔｌｉｌｉｎｅａｇｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１４３−７（１９９９）．に記載されているように、フローサイトメトリーを行って純度を決定した。インビトロのＧＦＰ標識は、ｐＣＭＶ−ＡｃＧＦＰプラスミドにリポフェクタミンを２：１の比で混合したものを各プレートに添加することによって行い、移植前に３７℃で６時間インキュベートした。
【００４８】
ヒトＡＢＭＣ（ｈＡＢＭＣ）の単離および培養
ヒトＡＢＭＣは、ＳＣＩ患者の腸骨稜からの骨髄穿刺液を用いて単離した。インフォームドコンセントの署名後、試料を得た。細胞をＲＰＭＩ−１６４０で１：１に希釈し、５０ｍｌのチューブ中で１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓの上に重ね、３０分間、８００ｇで、室温で遠心分離した。細胞界面を培地で約１５ｍｌに希釈し、１０分間、４００ｇで遠心分離した。上澄みを捨てた後、ペレットを１ｍｌの培地に再懸濁させた。有核細胞を計数し、ポリ−Ｌ−リシンを被覆したディッシュ上に、２ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、１％の抗真菌性抗生物質および１０％（ｖ／ｖ）の非加熱不活性化選択プレスクリーニングＦＢＳを添加したα−ＭＥＭを含む標準的な培地中に、２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で懸濁させた。
【００４９】
細胞を３日間インキュベートし、３段階の洗浄段階で培地を交換することによって非接着細胞を除去した。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで、３７℃で５分間インキュベーションすることによってリフトした。比較のためのＭＣＳを生成するための増殖および神経誘導のために、ＡＢＭＣを上述のように調製した。増殖された細胞は、継代させる前に１２〜１６日間静置して成長させ、１：４の比で再平板培養した。骨形成、脂質生成、および軟骨細胞分化は、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１４３−７（１９９９）．に記載されている方法で行った。ＡＢＭＣは、ＣＤ４５−ＰＣ７、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ７３−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＰＥ、ＣＤ１０６−ＰＥ、ＣＤ１６６−ＰＥおよびＣＤ２７１−ＰＥ（すべてＢＤバイオサイエンス社製）で染色した後、フローサイトメトリーで分析した。
【００５０】
神経細胞誘導
神経細胞分化は、Ａｒｎｈｏｌｄ，Ｓ．ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｒｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ａｆｔｅｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｌｉｑｕｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８５，５５１−６５（２００６）に記載される方法を修正して行った。神経球誘導は、２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および増殖因子ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄシステムス）、βＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびヘパリン（５ｍｇ／ｍｌ）を添加した無血清ＤＭＥＭ中の培養によって行った。神経誘導は、Ａｃｃｕｔａｓｅによって調製され、２％のＤＭＳＯおよび１ｍＭのホルスコリンを有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に２０００細胞／ｃｍ２の密度で設置された、単一の細胞を用いて行った。細胞をこれらの条件下で４日間保持し、その後、免疫蛍光顕微鏡によって分析した。
【００５１】
重度の脊髄損傷のイヌモデル
体重３．７７±０．５９ｋｇの健康な雑種の成犬１６頭を、脊髄損傷の実験的な研究に用いた。動物の飼育および処置のすべての形態は、カイロ大学の動物愛護委員会のガイドラインに従って行った。麻酔をかけた（ペントバルビタールナトリウム、４０ｍｇ／ｋｇ）イヌに、Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ， Ｅｖｏｋｅｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ，ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｐｉｎａｌ Ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．５７，６６７−７３（１９８２）にネコモデルについて記載される方法を修正して、Ｌ４レベルの重度の脊髄損傷（ＳＣＩ）を受けさせた。簡潔には、Ｌ４椎弓切除の後、硬膜を開き、脊髄を切断した。脊髄の切断された末端を典型的には約３ｍｍ後退（ｒｅｔｒａｃｔ）させ、外科用顕微鏡下で検査し、完全な切断面を確保した。術後処置としてはイヌを暖かくし、１日２回手動で排尿を行い、予防的抗生剤を与えた。イヌの摂食に困難はなかった。
【００５２】
ＳＣＩ後の治療に従って、イヌを公平に４つの群に割り当てた。イヌＡＢＭＣの移植は、ＳＣＩの１週間後に行った。上記と同様の方法を用いてイヌに麻酔をかけた。対照群は、損傷後なんらの細胞移植も受けなかった。操作していないＡＢＭＣまたは２４時間もしくは７２時間神経分化を誘導したＡＢＭＣを受ける３つの群においては、１５０μｌの生理食塩水に懸濁させた細胞を、腰椎穿刺によってＣＳＦに注射した。後肢の機能回復の行動評価は、ビデオ記録によって行った。それぞれのイヌについて、最低１０歩、側面および背面からビデオテープに記録した。１５点採点システム２５を用いて、それぞれのイヌの歩行を、治療の型に関して盲検化された調査員がビデオテープから採点し、ベースライン、ＳＣＩの１日後、ならびにＳＣＩの４、８、１２および１６週間後での平均スコアを記録した。
【００５３】
免疫染色
細胞を４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、ＰＢＳ下、４℃で染色されるまで保存した。組織病理学的変化を評価するために、すべてのイヌを細胞療法後１６週で安楽死させた。イヌをＰＢＳおよび４％のパラホルムアルデヒドを用いて潅流し、Ｔ１０からＬ５までの脊髄を１０％緩衝中性ホルマリン中に固定し、脱灰溶液中に浸した。切片をパラフィンに埋包し、４μｍ厚さの軸方向断面を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはルクソール−ファスト−ブルーで染色し、ミエリンを識別、または蛍光分析に用いた。損傷を受けた脊髄の中心点からのミエリン形成された領域およびキャビティの体積は、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ画像解析ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて横断面の画像から計算した。キャビテーデョンの最も大きい領域を用いて切片を同定し、それぞれのイヌについてこの領域を測定し、対照および細胞療法で治療したイヌからの平均±ＳＥＭとして表した。免疫蛍光には、脱パラフィン化切片を２分間の抗原賦活化を通して加工し、次いでイヌの交差反応性に適した特異的抗体で染色した。
【００５４】
一次抗体は、モノクローナル抗−ＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（１：１００）；ポリクローナル抗−ＧＦＡＰ，Ｄａｋｏ（１：５００）；モノクローナル抗β−ＩＩＩ−チューブリン，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（１：２００）；ポリクローナル抗−ＰＤＧＦＲα，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（１：８０）；モノクローナル抗−ＧＡＤ６、Ａｂｅａｍ（１：５００）；ポリクローナル抗−Ｎｅｓｔｉｎ，ＬｉｆｅＳｐａｎ（１：１００）；モノクローナル抗−アセチルコリンエステラーゼＡＥ−１，ミリポア（１：５０）；モノクローナル抗−７０ｋＤａ神経フィラメント，ミリポア（１：５０）；モノクローナル抗−Ａ２Ｂ５，ミリポア（１：１００）；およびモノクローナル抗−ＧＲＭｌ，ＢＤ（１：１００）であった。ペルオキシダーゼＡＢＣキットおよびＣｏＣ１２−増強ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を、ミエリン塩基性タンパク質染色のためのクロモーゲンとして用いた。蛍光顕微鏡法には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、５３５、および６１０色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した二次抗体を用いた。ＧＦＰ、ネスチン、ＰＤＧＦＲ、ＴｕＪｌ、およびＮＦ７０のカウントを計算するために、各０．０１ｍｍ２の表面積を有する１００の正方形を計数に用い、標的領域が選択された。値は平均±ＳＥＭとして表した。治療の型に関して盲検化された病理学者がすべての組織学的検査を行った。
【００５５】
ヒトの移植
適格ＳＣＩ患者を評価し、１５９人の患者を初期スクリーニングのために選択した。試験対象患者基準に合致する８０人の患者が登録され（５０人の胸部ＳＣＩおよび３０人の頸部ＳＣＩ）、無作為に対照群および細胞療法群の２つの群に分けられ、両方の群は、独立した物理療法、リハビリテーション、およびリウマチ学のための軍事力センターで、計画的な標準的な理学療法を受けた。試験に対する正式な承認および詳細なインフォームドコンセントへの署名の後、移植群のすべての参加者は、局所麻酔下で骨髄穿刺を受け、ＡＢＭＣを作製した。穿刺液は腸骨部（ｉｌｉａｃ ｒｅｇｉｏｎ）から取り、冷培地中、滅菌容器に直ちに設置し、すべての後続処理は、上述のように、カイロ大学病院の幹細胞センターで完全臨床無菌条件下で行った。患者は２×１０６細胞／ｋｇの累積標的細胞投与量を受け、ＡＢＭＣ細胞数および生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を７２時間の接着後に評価し、この手順を、この標的投与量が達成されるまで月１回繰り返した（中央値は４回であり、１〜８回の範囲であった）。
【００５６】
データおよび統計解析
全てのデータを平均±ＳＥＭとして表した。すべての群の間で、連続データをｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ ＡＮＯＶＡによって、次いで事後（ｐｏｓｔ ｈｏｃ）フィッシャーの保護最小有意差法（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＰＬＳＤ）によって比較した。脊髄における移植したＧＦＰ細胞の定量分析のために、それぞれのイヌの脊髄から４μｍ厚さで、１５０μｍ離して１５の断面を切断した。各切片における平均直径が６μｍであるすべての細胞を計数した。抗体あたり３つの脊髄の切片について二重陽性細胞を調べ、切片あたり４つの領域を計数した。キャビテーション領域を対照と細胞療法群との間でスチューデントｔ−検定を用いて比較した。機能テストには、移植を受けたイヌと対照との間の運動スコア（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ｓｃｏｒｅ）の差を、各時点でＡＮＯＶＡの繰り返し測定を用いて分析した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５のレベルで決定した。
【００５７】
実施例１−ＡＢＭＣのインビトロ分化
６頭のイヌのＢＭ試料を単離し、ポリ−Ｌ−リシン上で、承認されたプロトコル下で７２時間培養した。７２時間後に分離されたイヌのＡＢＭＣは、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１を発現するが、ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＣＤ４５は発現しない、または無視できる程度の発現であることがわかった。イヌのＡＢＭＣは、従来の培養増殖ＭＳＣに多い線維芽細胞様細胞については限られた数である、平坦な長楕円形の形態を有した（図５Ａ）。イヌのＡＢＭＣ（図５Ａ）はＧＦＰ発現プラスミドを用いて９０％近くの効率でトランスフェクトされた（図５Ｂ）。これらの細胞は、その多能性を保持し、直ちに、そして強力に脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞に誘導されうる（図５Ｅ〜Ｇ）。神経誘導培地中でのこれらの細胞の培養は、ヒトの細胞と同様に、神経球の生成、および神経表現型（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に関連するネスチン発現の増加を伴う形態変化をもたらす（図５Ｃ、Ｇ〜Ｉ）。
【００５８】
次に、ポリ−Ｌ−リシンで被覆したフラスコ中で７２時間培養した１０のヒトＢＭ試料からのＡＢＭＣの多分化能を評価した。７２時間でのフローサイトメトリー分析から、ヒトのＡＢＭＣは、９０％超がＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１に対して陽性であるが、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１４を発現しないことが明らかになった。２〜３週間の従来の誘導と比較すると、ヒトＡＢＭＣは、１週間以内に、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への中胚葉３血球系分化を強力に誘導可能であった（図６Ａ〜Ｃ）。神経誘導１８は、神経分化（図６Ｄ〜Ｆ）、複数の一次樹状突起を形成する、細胞における典型的なオリゴデンドログリア形態（図６Ｆ）、および同じ患者からの培養増殖細胞と比較してより強い能力（図７Ｉ）と一致する形態変化をもたらした。
【００５９】
ＡＢＭＣから生じた神経球の数（ｎ＝１２を６穴プレートで３連で行った）は、６〜８週間培養液中で増殖した、同じ患者のＭＳＣから生成したこれらの神経球よりも少し多かったが有意に相違しなかった。しかしながら、培養増殖したＭＳＣと比較すると、ＡＢＭＣは、アストロサイト前駆細胞マーカーであるネスチン（図７Ｃ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーである血小板由来増殖因子受容体−α（ＰＤＧＦＲ−α）（図７Ｇ）、および神経前駆細胞マーカーであるタイプＩＩＩβ−チューブリンエピトープＪｌ（ＴｕＪｌ）（図７Ｈ）に対するアップレギュレートされた免疫活性によって示されるように、脊髄常在神経前駆細胞組織により強く誘導可能であった。
【００６０】
すぐに、または培養増殖後に神経分化を誘導した、同じ患者からの免疫活性細胞の定量分析（ｎ＝６を６穴プレートで３連で行った）から、ネスチン発現においては有意な差がないことがわかったが、ＰＤＧＦＲαおよびＴｕＪｌの両方は、ＡＢＭＣにおいて、培養増殖したＭＳＣよりも有意に高かった（図７Ｉ）。したがって、これらのインビトロの研究は、移植された細胞のインビボの挙動を反映しない条件で行われたものであるが、培養増殖したＭＳＣと比較して、ＡＢＭＣを用いることの有益性を示している。
【００６１】
実施例２−イヌモデルにおけるＡＢＭＣのインビボ分化
前臨床モデルにおける細胞療法戦略を確立するために、重度ＳＣＩのイヌモデルにおいて自己ＡＢＭＣをくも膜下に移植した。イヌの脊髄の重度の打撲症は、確立されたネコの重度ＳＣＩモデル２４と同様に、１６頭のイヌに実施し、全ての損傷を受けたイヌ（ｎ＝１６）において感覚消失および後肢まひが生じた（図１Ｈ）。損傷の１週間後、動物をランダムに４つの群に分け（ｎ＝４／群）、群Ａを細胞治療を受けない対照群とした。群Ｂ、Ｃ、およびＤのイヌは、腸骨稜からＢＭ吸引し、プレートに７２時間接着させることによってＡＢＭＣを単離した。１５０μｌの生理食塩水中に２×１０６ＡＢＭＣ／ｋｇに調製されたＧＦＰ発現プラスミドを用いて細胞をトランスフェクトし、腰椎穿刺によって注射した。群Ｂの動物は、操作していないＡＢＭＣを受けた。ＡＢＭＣの神経系列へのインビトロの予備分化によって、これらのインビボの神経ポテンシャルが増加するかどうかを調べるために、群ＣおよびＤの動物は、７２時間で単離したＡＢＭＣであって、最後の２４時間（群Ｃ）または全７２時間（群Ｄ）、神経分化を誘導したＡＢＭＣを受けた。
【００６２】
後肢の運動能力および機能回復は、移植後１６週間の間、４週間ごとに、イヌのＳＣＩ２５のために開発された１５点ビデオテープスコアリングシステムを用いて評価した。後肢の運動機能は、ＳＣＩの前はすべての動物において損なわれておらず、すべて１４〜１５点のスコアであった（図１Ｈ）。損傷後、イヌは対まひであって深い痛みの感覚がなく、後肢のスコアはゼロであった。操作していないＡＢＭＣ（ｎ＝４）、または２４時間（ｎ＝４）もしくは７２時間（ｎ＝４）、神経細胞分化が誘導されたＡＢＭＣを受けたＢ、ＣおよびＤの３つの群のイヌの間で、有意な差は測定されなかった（Ｐ＝０．７５）。群Ａの対照治療のイヌと異なって、自己ＡＢＭＣ移植を受けたイヌ（ｎ＝１２）は、移植後８週で最大近くの回復に達し、１６週でその運動機能の有意な回復がみられ（図１Ｈおよび表１）、最初の週のうちに自発的な後肢の運動が検出され（図１Ｉ）、これはＡＢＭＣの早期の局所的神経保護的効果を示唆する。治療後１６週で、イヌを安楽死させて脊髄を固定し、組織学および免疫染色によって分析した。対照のイヌからの切片は、ＡＢＭＣで治療した切片における最小のキャビテーションとは対照的に、重大な空孔形成を示した（図１Ａ〜Ｃ）。抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体を用いた免疫染色から、ＡＢＭＣで治療したイヌにおいて、対照と比較して、有意なミエリン再形成がみられることが明らかになった（図１Ｄ−Ｇ）。ＡＢＭＣ切片におけるＭＢＰ染色は、損傷を受けていない脊髄におけるＭＢＰレベルの８５％までに達し（図１Ｄ〜Ｇ）、実質的なミエリン再形成を示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
ミエリン再形成の機構、およびＡＢＭＣ移植が損傷した軸索の再生を向上させるのかどうかを調べるために、ＧＦＰを移植されたＡＢＭＣのマーカーとして、脊髄常在前駆細胞マーカーとともに用いて、多色免疫組織化学試験を行った。ＧＦＰ−陽性細胞はＳＣＩ損傷の境界内で検出され（図２Ａ）、対照のイヌからの切片では検出されなかった（図８Ａ〜Ｄ）。多数のＧＦＰ陽性細胞が中心点から広く分布し（図２Ｂ）、損傷した脊髄の灰白質および白質中に見られ、損傷の境界領域、中心管周辺、および対側灰白質内（図２Ａ）に分布し、くも膜下に注射されたＢＭ細胞が損傷部位に吻側移動したことを示す。ＧＦＰおよびＰＤＧＦＲに対して陽性であるＢＭ誘導細胞は、中心管を囲んでみられ、おそらく新血管形成を通して成長する脊髄内の小血管と関連する（図９）。加えて、灰白質中の少なくとも３０％のＧＦＰ−陽性細胞もまた、成熟神経細胞の特異的マーカーである７０ｋＤａ神経フィラメント（ＮＦ７０）に対して陽性であった（図２Ａ）。
【００６５】
脊髄の後索は主に有髄軸索からなる。強いＧＦＰ染色が大きな核および細胞質境界を有するいくつかの細胞を有する後索において観察され、周辺ミエリン形成を示した。対照動物からの切片では、電子顕微鏡写真においてアストログリオ−シスのない細胞外環境における脱髄軸索、広範囲の空孔形成、およびグリア性瘢痕を示した（図１０）。ＡＢＭＣ移植したイヌからの切片の電子顕微鏡写真における中枢対末梢ミエリン形成の定量分析から、ミエリン再形成軸索は主に末梢様ミエリン形成細胞からであることが示された（図１１Ａ〜Ｃ）。全ミエリン再形成軸索の１／３近くにおいて、中枢ミエリン形成を有するオリゴデンドロサイト−有髄軸索および特徴的な薄いミエリン鞘が、より小さい軸索において観察された（図１１Ｄ〜Ｆ）。
【００６６】
これらのミエリン再形成軸索はＧＦＰおよびＧＦＡＰに対して二重陽性であることがわかり（図２Ｉ）、多小葉性核および複数のミエリン再形成軸索まで拡張される大きな中間径フィラメントリッチ工程によって特徴づけられるアストロサイトに関連する（図１１）。ＧＦＰ−標識ＡＢＭＣ由来のアストロサイトおよびミエリン形成細胞もまた回復した脊髄損傷において検出された。さらに、ＡＢＭＣで治療したイヌにおける前皮質脊髄路の切断面内に、ＮＦ７０を発現する有意により多くのＧＦＰ陽性軸索（図２Ｃ〜Ｆ）を、ミエリン再形成軸索を明らかにマーキングするＧＦＰ発現（図８Ｅ〜Ｈおよび図２Ｆ中の挿入）とともに検出したが、一方で対照では検出されなかった（図８Ａ〜Ｄ）。
【００６７】
随意運動を制御する前皮質脊髄路および外側皮質脊髄路のＧＦＰ陽性ＡＢＭＣからの再生により、移植を受けたイヌの損傷部位内でのより強い軸索再生が示唆され、これらの管は従来から少なくとも再生可能と評価されていたため、ＡＢＭＣの神経再生能が示された。さらに、神経前駆細胞マーカーを発現するＧＦＰ陽性細胞の二重標識プロファイルの優位性は、灰白質および白質における貪欲な神経分化と整合した。ＧＦＰ陽性細胞は、高密度シナプス接合における神経前駆細胞マーカーであるネスチン（図２Ｇ）、低密度シナプス接合におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーであるＰＤＧＦＲ（図２Ｈ）、および神経束におけるアストロサイト前駆細胞マーカーであるＧＦＡＰ（図２Ｉ）を含む、常在神経前駆細胞組織のマーカーを発現した。
【００６８】
ＧＦＰ陽性ＡＢＭＣは、興奮性、阻害性（ＧＡＢＡ）およびコリン作用性神経伝達物質マーカーを用いた免疫活性によって示されるように共局在化したＧＦＰ陽性細胞の検出によって示されるように、末端神経細胞の運命に貢献した。ＧＦＰと興奮性代謝調節型グルタミン酸受容体−１（ＧＲＭ１）、ＧＡＢＡ作動性シグナルのマーカーである阻害性グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）およびコリン作用性アセチルコリンエステラーゼ（ＡＥ−１）のいずれかで二重標識された細胞のシグナルが再生された脊髄において検出された（図２Ｊ）。加えて、神経幹細胞の特徴を有する共通のグリア前駆細胞Ｏ−２Ａ（図２Ｊ）中に存在するガングリオシド抗原であるＡ２Ｂ５との免疫活性によって示されるように、共局在化した低頻度のＧＦＰ陽性細胞が観察された。まとめると、これらのデータは、脊髄微小環境内のＡＢＭＣ誘導神経再生を示す。
【００６９】
再生の機構として融合事象の発生の可能性を排除するために、移植実験を受けたイヌの脊髄の切片を分析した。ＤＡＰＩ核染色したＧＦＰ発現細胞を、イヌの３５番染色体の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブを用いて調べた。調査した細胞（ｎ＝５００）はすべて２倍体であった（図１２）。
【００７０】
実施例３−ヒトにおけるＡＢＭＣのインビボ分化
重度のＳＣＩイヌモデルにおける前臨床試験から、くも膜下に移植された自己ＡＢＭＣは損傷部位に戻り、白質および灰白質の温存、神経細胞および軸索の再生、新血管形成、有意なミエリン再形成を伴うアストロサイト増殖、および運動スコアにおける機能改善をもたらし、副作用が検出されないことが明らかになった。
【００７１】
これらのデータから、頸部および胸部の完全なレベルのＳＣＩ患者における、ＡＢＭＣの自己くも膜下移植の安全性および有効性を調査するための、無作為化された第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を始めた。選択基準（図３）は、損傷後、少なくとも６か月の理学療法を完了し、自然回復していない患者を含んでいた。試験した患者は、９人の女性および７１人の男性であり、１６〜４５歳であった。患者の損傷からの期間は、１２〜３６か月であり、完全なＡＳＩＡ Ａ外傷性ＳＣＩを有し、Ｃ３からＴ１２の神経レベルであり、少なくとも６か月間、神経学的改善の証拠がなく、付随する全身性疾患がなかった（図３）。登録期間の間、完全慢性ＳＣＩを有する１５９人の患者が評価され、全部で８０人の患者が、カイロ大学およびアル＝アズハル大学の臨床試験審査委員会によって承認されたプロトコルにしたがって、署名およびインフォームドコンセントの後、登録された。
【００７２】
患者は２つのバランスのとれた群に無作為化された：５０人の患者；４０人の胸部ＳＣＩ患者および１０人の頸部ＳＣＩ患者は、標準的な理学療法と組み合わせた自己ＡＢＭＣ移植に割り当てられ、一方、３０人の合致した患者（２０人の胸部ＳＣＩ患者および１０人の頸部ＳＣＩ患者）は、対照群として標準的な理学療法のみに割り当てられた。細胞療法治療の前に患者を評価してベースライン測定を確立した。治療を受けた患者、および平行する対照患者の両方がモニターされ、ＡＳＩＡスケール測定は、独立した物理療法、リハビリテーション、およびリウマチ学のための軍事力センターで、試験期間にわたって、盲検化された観察者によって行われた。腰椎穿刺および細胞注射に伴う危険性は、偽薬を注射した対照群の包含を制限する重要な倫理的な問題を生じる。
【００７３】
患者は神経障害性の痛み、嚢胞、脊髄空洞症または細胞異常増殖の発生の臨床試験によって評価された。すべての移植患者は、次にＢＭ吸引を受け、ここから自己の最小限に操作されたＢＭ細胞を、カイロ大学病院の幹細胞ユニットで、滅菌条件下で７２時間接着させた（ＡＢＭＣ）。ＡＢＭＣの移植の前に、試料の細胞表現型、生存率および滅菌性を検査した。腰椎穿刺を通したくも膜下移植による自己ＡＢＭＣ細胞療法で治療した５０人の患者はすべて、２×１０６細胞／ｋｇの累積標的細胞投与量を受け、この手順を、この標的投与量が達成されるまで月１回繰り返した（中央値は４回であり、１〜８回の範囲であった）。ＡＳＩＡおよびＦＩＭスコアの測定およびＳＳＥＰを試験し、脊髄のＭＲＩは、ＭＲＩを承諾し、これに耐えられるすべての患者において、移植前のベースラインおよび１８か月間、６か月ごとに行った。
【００７４】
試験データは、エジプト保健省審査委員会によって、および独立したドイツの審査委員会によって手続きにしたがって審査された。細胞療法を受けた５０人の患者は、頭痛（３０人の患者；６０％）、腰痛（５人の患者；１０％）、不随意運動（８人の患者、１６％）、および視力障害（１人の患者、２％）を含む、腰椎穿刺に共通の軽い副作用があった。上記の副作用はすべて一時的なものであり、腰椎穿刺後１２時間から数日続き、対症療法によって完全に解消した。移植後１８か月まで、ＡＢＭＣで治療した患者において長期間の副作用は検出されず、治療を受けた患者のいずれもが、感染症、脳脊髄液の漏れ、さらなる神経障害性の痛み、脊髄奇形を経験せず、ＭＲＩ像上に塊状物の発生はみられなかった。
【００７５】
標準的な理学療法に加えて、自己ＡＢＭＣ療法を受けたすべての患者は、理学療法のみを受けた対照の患者と比較して、良好な応答をし、その神経機能が有意に改善した（図４）。自己ＡＢＭＣで治療した患者は、移植後６か月で、そのＡＳＩＡスコアおよびＦＩＭスコアが有意に向上し、電気生理学的筋機能が回復した（図４Ａ〜Ｂ）。
【００７６】
移植後１８か月で（表２）、２０人の胸部ＳＣＩ患者（５０％）は、ＡＳＩＡスケールが、グレードＡからグレードＣへの改善を示し、１５人の患者（３７．５％）は、グレードＡからグレードＢに改善したが、５人の患者（１２．５％）は、グレードＡのままであった（胸部ＳＣＩ患者の基準の詳細を表３に示す）。ＡＢＭＣ細胞療法で治療した１０人の頸部ＳＣＩ患者については、２人の患者（２０％）はグレードＡからグレードＣに改善し、３人の患者はグレードＡからグレードＢに改善し、５人の患者はグレードＡのままであった（頸部ＳＣＩ患者の基準の詳細を表４に示す）。これらの変化により脊髄の圧迫および浮腫が回復した（図４ＣにＣ６〜Ｃ７の頸部ＳＣＩを有する患者６の移植後１年でのＭＲＩ像を示す）。さらに、これらの変化により日常活動が向上し生活の質が有意に改善した。２人の代表的な患者；患者１（Ｃ６の頸部ＳＣＩを有する）は細胞療法前は四肢まひであり、患者（Ｔ９の胸部ＳＣＩを有する）は片まひであったが、細胞療法後９か月〜１年で両者とも歩けるようになり、運動性を取り戻した。
【００７７】
スケール測定にかかわらず、自己ＡＢＭＣで治療したすべての患者は、ＡＳＩＡグレードがＡのままであった患者を含めて、移植後わずか４〜６週で神経機能の改善に気付いた。患者は、始めに触覚および感覚的刺激に対する応答の向上を、後に、最初に下肢の遠位筋において、次いで大腿筋において記録された筋肉強度の増加を経験した。ＡＳＩＡグレードの改善があった患者は、ベッドに座ったり向きを変えたりできるような、よりよい体幹運動を示した。加えて、筋肉強度の改善によって性的能力が向上し、さらに、腸および膀胱括約筋の制御が強くなって、これらの患者がカテーテルを用いずに生活できるようになった。これらの効果は、対照と比較して、ＡＢＭＣで治療した患者において、神経レベルおよびＦＩＭの改善に反映された（図４Ａおよび表３〜４）。すべての患者は治療前には皮質のＳＳＥＰを示さなかったが、移植後６か月から１年で、ＡＢＭＣで治療した患者の６５％が皮質インパルスの再発を示し、対照の患者のいずれもが示さなかった（図１３）。したがって、自己ＡＢＭＣ細胞療法により、慢性の完全なＳＣＩ患者において運動機能および感覚機能が有意に改善された。
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】
【表４】
【００８１】
上述の実施例および好ましい形態の説明は、特許請求の範囲で定義される本発明を制限するものではなく、説明のためのものであると解されるべきである。容易に理解されるように、上述した特徴の多数の変形および組み合わせは、特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく利用されうる。このような変形は本発明の精神および処方から逸脱するものではないとみなされ、このような変形はすべて、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、外傷性または変性の神経または脳の損傷を治療するために接着骨髄細胞集団の治療上有効な量を患者に投与することによる細胞療法の細胞、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
末梢神経および／または脊髄（ＳＣＩ）の外傷性または変性の損傷を含む神経および脳の損傷は、依然として治癒的療法がないままである。例えばＳＣＩについては、脊髄の軽い打撲傷であっても大量の神経細胞およびグリア細胞の損失、脱髄（ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）、キャビテーション（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）、およびグリア性瘢痕をもたらしうる。このような病変は、知覚の損失、末梢運動まひ、および重度の機能障害の原因となる有害な機能的影響を有し、最終的な結果は、軸索温存（ａｘｏｎａｌ ｓｐａｒｉｎｇ）、ミエリン再形成およびおそらくは神経再生に依存する。また、同様の影響が、特にアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、多系統変性症、小脳変性症などを含む多くの神経変性障害とともに観察された。したがって、損傷を受けた組織を修復または再生し、最終的にこのような組織および失われた機能的影響を回復するための１以上の戦略が望まれている。
【０００３】
提案されている戦略のひとつは、患部を治療する目的で多能性細胞または幹細胞を使用することである。特に骨髄間質細胞は、幹細胞の特性の多くを有し、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、さらに筋芽細胞に分化することが示されたため、このような目的には魅力的な候補である。したがって、患者における損傷した神経または脳組織の再生において、これらの細胞の使用の可能性がある。
【０００４】
主な難しさのひとつは、骨髄細胞型は相対的にまれであり、識別が難しいことである。そのため、現在の研究の多くは、興味のある特定の細胞型を単離し、神経細胞分化を達成するための方法論を探索することを中心としてきた。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３１３８７号には、骨髄細胞集団内の顆粒球からの単核細胞の単離が開示されている。また、米国特許第７，０９８，０２７号では、密度勾配遠心分離法を用いて、すなわち、１．０７〜１．０８ｇ／ｍｌの範囲の比重を有する細胞を単離することによって、単核細胞を単離している。２つの場合のいずれも、単離された単核細胞は、髄損傷または他の神経障害の治療のための投与が検討されている。
【０００５】
細胞の単離以上に、インビトロ環境での投与の前またはインビボの投与の後に、ＢＭ細胞を分化させる多くの試みがなされてきた。例えば、米国特許第５，１９７，９８５号には、成熟骨髄（ＢＭ）細胞を用いて間葉組織および神経外胚葉組織を再生する方法が記載されている。細胞分化は、リン酸三カルシウムもしくはヒドロキシアパタイトまたはこれら２つの組み合わせの多孔質セラミック組成物を、骨格異常に移植されると細胞の骨格組織への分化を促進する骨髄由来の間葉細胞のビヒクルまたは担体として用いて達成される。
【０００６】
米国特許第６，５２８，２４５号には、細胞をプラスチックの培地でインキュベートし、プラスチックに接着した間質細胞を除去することによって、骨髄細胞集団中の骨髄間質細胞を特異的に選択する方法が開示されている。次いで、これらの細胞は、レチノイン酸、増殖因子、および胎児の神経細胞の存在下でインビトロで分化され、神経変性障害の治療のために投与される。米国特許出願公開第２００６／０２７５２７２号には、同様に、このような目的に用いる骨髄間質細胞を単離および培養することによる処理方法が示されている。最後に、米国特許第７，２７９，３３１号には、骨髄間質細胞を単離し、次いでこれを抗酸化剤および／またはさまざまな増殖因子を用いて神経細胞中にインビトロで予備分化させる、同様の方法が示されている。
【０００７】
米国特許出願公開第２００６／００２９５８０号には、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を添加した培養液中で骨髄細胞をインキュベートすることによって、神経前駆細胞を発生させる方法がさらに示されている。次いで、前駆細胞は神経病理学的状態を示す患者に投与されうる。
【０００８】
ＢＭ細胞の他に、胎盤または他の出産後組織に由来する細胞もまた、神経再生の目的で検討されている。米国特許出願公開第２００６／０１４７４２６号は、出産後の多分化能誘導性細胞を単離する細胞培養条件に関する。このような培養条件は、細胞外マトリックス基材、酸素圧、増殖因子およびビタミン、細胞密度または細胞の共培養を含む。米国特許出願公開第２００５／００３２２０９号には、分娩後由来細胞を用いて神経組織を再生または修復するための方法および組成物が示されている。これらの細胞は、胎盤または臍帯組織に由来し、５％酸素環境でＬ−バリン培地上で成長する。
【０００９】
上記は、骨髄細胞および同様の多能性細胞型が間葉細胞へ分化しうることの明確な証拠を提示し、さらに、これらの細胞型を神経または脳組織の外傷性または変性損傷の治療（損傷した軸索組織のミエリン再形成または再生など）に適用することの実現可能性および期待を示した。しかしながら、上記で提案された方法論を考慮しても、より断定できる細胞分化のための他の細胞集団および新規な戦略が必要である。加えて、現在神経細胞移植の広範囲な用途を制限している多くの倫理的および技術的制約を回避する必要がある。
【００１０】
本発明は、その実施形態および実施例を通してこれらの必要性に対処する。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
本発明は、外傷性または変性の神経または脳の損傷を治療するために、骨髄細胞集団から単離された接着骨髄細胞の治療上有効な量を患者に投与することを含む、細胞療法の細胞、組成物、および方法に関する。本明細書中に記載されるように、本発明は、接着骨髄細胞（ＡＢＭＣ）が、神経前駆細胞型、ミエリン形成細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、成熟神経細胞、有髄軸索などに分化しうる、および／またはこれらを生成させうることを見出したことに基づく。より具体的には、驚くべきことに、単離されたＡＢＭＣがＳＣＩなどの神経損傷を受けた哺乳類の損傷に導入されると、前記細胞は損傷部位で損傷を受けた神経組織のミエリン再形成および軸索再生の両方をもたらすことを見出した。運動協調の改善および／または標的の神経変性状態の低減もまた、特に理学療法と組み合わせた場合、観察された。
【００１２】
したがって、本発明の一形態によれば、製薬上許容される液体に懸濁させた接着骨髄幹細胞を含む組成物を、損傷部位で軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、損傷部位またはその近傍に投与することによる、神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法が提供される。本発明の形態の一実施形態によれば、前記損傷は脳または脊髄の損傷であり、前記骨髄幹細胞は、前記損傷部位またはその近傍に、腰椎穿刺を通してくも膜下注射によって脳脊髄液に投与される。本発明の他の実施形態によれば、前記損傷は末梢神経の損傷であり、前記骨髄幹細胞は、超音波ガイド下局所送達によって末梢神経根に投与される。
【００１３】
本発明の他の実施形態によれば、前記接着骨髄幹細胞は、前記損傷部位で軸索再生およびミエリン再形成の両方を生じさせる。本発明の他の実施形態によれば、前記骨髄幹細胞は、臍帯血または骨髄穿刺液に由来する。
【００１４】
治療上有効な量の細胞が、神経または脳の損傷を治療するために患者に投与される。一実施形態においては、治療上有効な量は、損傷部位で損傷を受けた神経組織のミエリン再形成および／または軸索再生を生じさせるために、または損傷を受けた神経または脳の組織を修復するために必要な細胞の量を意味する。そして、これは運動協調の改善および／または標的の神経変性状態の低減を促進しうる。治療上有効な投与量は、約１０４〜約１０７ＡＢＭＣ／ｋｇである。以下に例示するように、非制限的な実施形態においては、治療上有効な投与量は約２×１０６ＡＢＭＣ／ｋｇである。
【００１５】
このような治療上有効な投与量は、１回の投与または複数回の累積投与として患者に提供され、ＡＢＭＣの作用または分化に悪影響を与えないかぎり、１以上の製薬上許容される添加剤をさらに含みうる。一実施形態においては、前記骨髄幹細胞の累積投与量は、２回以上の注射で定期的に投与される。より具体的な実施形態においては、前記定期的な注射は月１回行われる。
【００１６】
ＡＢＭＣの単離された亜集団は、多分化能（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、特に神経分化の指標となる、１以上の分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＣＤ）細胞表面マーカーに対して陽性である。本発明の一実施形態によれば、前記骨髄幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ２７１から選択される１以上のマーカーに対して陽性である細胞を含む。より具体的な実施形態によれば、前記骨髄幹細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５に対して陰性である。これらのマーカーの存在（または不在）は、本明細書中で説明する１以上の手順または当業者に公知の他の方法を用いて確認することができる。
【００１７】
以下で例示する他の実施形態においては、ＡＢＭＣは、１以上のミエリン形成細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞、有髄軸索、成熟神経細胞などの生成を含む、またはもたらす。そのため、新たに形成された細胞は、特に制限されないが、ＮＦ７０、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＤＧＦＲ、ＧＦＡＰまたはＴｕＪｌなどの細胞型に関連する１以上のマーカーに対して陽性であることがわかった。
【００１８】
本発明において、骨髄幹細胞を含む生体試料は、はじめに、本明細書中に記載されるように当業者に公知の標準的な方法を用いて、例えば臍帯血または骨髄穿刺液から得られる。次いで、ＡＢＭＣの亜集団は、本発明の方法を用いて単離される。
【００１９】
したがって、本発明の他の形態によれば、以下の段階を含む、脊椎動物における神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法が提供される：
（ａ）ポリ−Ｌ−リシン被覆基板上で、骨髄幹細胞の層が前記基板に接着するように、成熟骨髄幹細胞を含む生体試料を培養する；
（ｂ）前記基板から非接着細胞を洗浄し、前記骨髄幹細胞の層を収集する；
（ｃ）接着骨髄幹細胞を製薬上許容される液体に懸濁させる；および
（ｄ）前記骨髄幹細胞の懸濁液を、損傷部位で軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、前記損傷部位の近傍に投与する。
【００２０】
一実施形態においては、前記培養段階は２〜７２時間行われ、さらなる実施形態においては、その時間は約７２時間である。他の実施形態においては、インキュベーション後、１または複数の洗浄段階を用いて被覆基板を洗い流すことによって非接着細胞を除去する。その後、接着細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆基板から取り外す。
【００２１】
次いで、ＡＢＭＣは、当該分野で理解されている任意の投与形態を用いて、患者の損傷部位またはその近傍に投与される。非制限的な一実施形態においては、ＡＢＭＣは損傷部位またはその近傍への直接注射用に製剤されうる。そのため、前記細胞は、生理食塩水、蒸留水、髄液または他の製薬上許容される液体の１以上を含みうる、滅菌溶液中に懸濁されうる。脊髄損傷の治療のためには、投与はくも膜下注射によって行われる。投与形態の他の実施形態は、本明細書中にさらに提供される、または、当業者によって理解される他の形態である。
【００２２】
本発明のＡＢＭＣおよび組成物は、脊髄または末梢神経の損傷での軸索再生およびミエリン再形成への寄与において有益である。これらは、さらに、損傷を受けた神経または脳の組織の修復に有益である。脊髄損傷、すなわち、運動まひまたは感覚消失を有する患者については、ＡＢＭＣ移植は、特に理学療法による機能訓練と組み合わせた場合、軸索再生およびミエリン再形成の促進ならびに修復の誘導に効果的である。皮質脊髄路線維の再生もまた観察され、機能改善と一致した。また、ＡＢＭＣは、線維性瘢痕組織に新たな神経細胞経路を生成することによって、または、発芽もしくは生成している短い再生した神経細胞線維を増殖させることによって、宿主神経組織を支持する神経栄養因子および抗炎症性メディエータを生成した。
【００２３】
当業者であれば、本明細書中に与えられた教示および例示に基づいて本発明のさらなる利点を理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、イヌの重度ＳＣＩモデルにおけるＡＢＭＣ細胞療法後１６週での組織病理学的所見を示す。（Ａ）Ｈ＆Ｅで染色した対照群のイヌの損傷した脊髄の中心点（ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）であり、著しい空孔形成（挿入）およびグリア性瘢痕を示す。（Ｂ）自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）ＡＢＭＣで治療した群Ｂのイヌの損傷した脊髄の中心点であり、ミエリン再形成およびキャビテーションが少ないことを示す。（Ｃ）キャビティ領域の定量分析であり、自己ＡＢＭＣで治療したイヌにおけるキャビティの有意な減少を示す。（Ｄ〜Ｆ）損傷を受けていないイヌの無傷の脊髄（Ｄ）、対照ＳＣＩのイヌ（Ｅ）、および自己ＡＢＭＣで治療したイヌ（Ｆ）のミエリン塩基性タンパク質免疫染色。（Ｇ）自己ＡＢＭＣで治療した後のイヌにおける、ミエリン塩基性タンパク質染色の無傷のイヌの正常レベル近くまでの回復。（Ｈ）ベースライン、ならびにＳＣＩ後１、４、８、１２および１６週でのイヌの運動（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ）スコアであり、自己ＡＢＭＣで治療したイヌにおいては移植後わずか４週間で有意な改善を示している。（Ｉ）対照と比較した、自己ＡＢＭＣで治療したイヌの後肢運動の向上。
【図２】図２は、自己ＡＢＭＣで治療したイヌからのＳＣＩ切片の多色免疫蛍光染色を示す。（Ａ）脊髄損傷の断面であり、自己ＡＢＭＣで治療したイヌからの切片においてのみ観察された、脊髄の狭間（矢印）をつなぐ秩序立った組織を示す。セクションは、核マーカーであるＤＡＰＩ（青）、移植されたＡＢＭＣのマーカーであるＧＦＰ（緑）および神経細胞マーカーであるＮＦ７０（赤）の明視野像および蛍光像の低出力を重ねたものである。ＧＦＰ発現は、灰白質および白質の両方において広範囲にわたり、神経根を囲んでいる。脊髄の灰白質中の正方形の領域１は、共局在化したＧＦＰおよびＮＦ７０染色を示す。前皮質脊髄路の断面の正方形の領域２は、ＧＦＰ発現（右）の高倍率、およびＮＦ７０と共局在化したＧＦＰを有する軸索を示す。スケールバーは２００μｍである。（Ｂ）中心点からの距離によるＧＦＰ陽性細胞の分布。（Ｃ〜Ｆ）前皮質脊髄路の断面であり、ＧＦＰおよびＮＦ７０の免疫活性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す。（Ｃ）前皮質脊髄路であり、共局在化したＧＦＰおよびＮＦ７０を示し、ＧＦＰ細胞誘導体のかなりの神経細胞分化を示す。（Ｄ）Ｃにおける切片を明視野像に重ねた写真である。（Ｅ）構造的ＮＦ７０発現（挿入）を有するＧＦＰ陽性ミエリン再形成軸索を示す高倍率写真である。（Ｆ）Ｅにおける切片を明視野像に重ねた写真である。（Ｇ）共局在化したＧＦＰおよびネスチン染色。（Ｈ）共局在化したＧＦＰおよびＰＤＧＦＲ染色、挿入部は正方形の領域の拡大を示す。（Ｉ）共局在化したＧＦＰおよびＧＦＡＰ染色、挿入部は正方形の領域の拡大を示す。挿入部の矢印はＧＦＰ陽性軸索を示し、くさび形はＧＦＰ発現のない軸索を示す。（Ｊ）中心管付近の灰白質の領域における共局在化したＧＦＰおよびＧＲＭ１、ＧＡＤ、Ａ２Ｂ５およびＡＥ染色。すべての切片においてＤＡＰＩを核染色に用いた。Ａ中のスケールバーは２００μｍであり、ＤおよびＦ中のスケールバーは１０μｍである。
【図３】図３は、慢性完全脊髄損傷患者におけるＡＢＭＣの自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）くも膜下移植の研究設計を示す。図は、登録、試験対象患者基準、および追跡基準を示す。
【図４】図４は、自己ＡＢＭＣ移植後１８か月に測定した、慢性ＳＣＩ患者の回復を示す。（Ａ）対照と比較した、自己ＡＢＭＣで治療した患者の神経レベル（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｅｖｅｌ）の向上。対照患者は、胸部神経レベルが胸部１〜１２（Ｔ１〜Ｔ１２）レベルのままであったが、自己ＡＢＭＣで治療した患者は、最大Ｓ５までの腰部および仙骨の神経レベルを得た。（Ｂ）対照と比較した、治療した患者におけるＡＳＩＡスコア（左軸）およびＡＳＩＡスケール（右軸）の変化。３人の対照患者は、１８か月後のＡＳＩＡスコアがその患者のベースラインスコアよりも低かったが、細胞療法で治療した患者は、改善されたスコアを示した。（Ｃ）自己ＡＢＭＣ移植の前および１２か月後のＭＲＩ像（頸部ＳＣＩの患者６）であり、Ｃ６〜Ｃ７レベルの脊髄の圧迫および浮腫を示すが、治療１年後の像は最小のグリオーシスを有する治癒された領域を示した。
【図５】図５は、イヌのＡＢＭＣの３能性および神経誘導を示す。（Ａ）７２時間後に単離し、ギムザ染色したイヌの接着ＢＭ細胞（ＡＢＭＣ）。挿入部は細胞の高出力像を示す。（Ｂ）ＧＦＰを用いて９５％の効率でトランスフェクトされたイヌのＡＢＭＣ（この視野のすべての細胞はＧＦＰに対して陽性である）。（Ｃ）１週間後のｃＡＢＭＣの神経細胞誘導であり、神経形態（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）（上部の挿入）および神経球（下部の挿入）を示す。（Ｄ）脂肪細胞が誘導されオイルレッドで染色されたｃＡＢＭＣ。（Ｅ）Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色（上部の挿入）およびアルカリホスファターゼ染色（下部の挿入）での骨細胞分化。（Ｆ）組織培養プレート中（上部の挿入）、または管状３Ｄ培地中（下部の挿入）のコンドロイチン硫酸凝集体（矢印）としての軟骨細胞が誘導されたｃＡＢＭＣのアルシアンブルー染色。(Ｇ〜Ｉ)神経分化が誘導され、ネスチンで染色されたｃＡＢＭＣの明視野およびＧＦＰ像。
【図６】図６は、７２時間後に単離されたヒト接着ＢＭ細胞（ＡＢＭＣ）であり、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への３血球系分化転換、ならびに神経球誘導および神経分化の多能性を示す。（Ａ）脂肪細胞分化が誘導されたｈＡＢＭＣのオイルレッド染色。（Ｂ）アルカリホスファターゼ染色での骨細胞分化。（Ｃ）軟骨細胞が誘導されたｈＡＢＭＣのアルシアンブルー染色。（Ｄ〜Ｆ）４日後のｈＡＢＭＣの神経細胞誘導であり、神経形態を示す。（Ｇ〜Ｉ）１週間後の神経球生成からの神経細胞の誘導。
【図７】図７は、神経分化の７２時間後に単離されたヒトの接着ＢＭ細胞（ＡＢＭＣ）を表す。（Ａ）誘導前のｈＡＢＭＣの明視野像。（Ｂ）ＧＦＰを用いてトランスフェクトされたｈＡＢＭＣ。（Ｃ）ｈＡＢＭＣにおけるネスチンの発現。（Ｄ）４日後のｈＡＢＭＣの神経細胞誘導であり、神経形態を示す。（Ｅ）Ｄにおける同じ神経細胞がＮＦ７０を発現する。（Ｆ）Ｄにおける同じ神経細胞がＴｕＪｌを発現する。（Ｇ）神経誘導後のアストロサイト様の形態およびＰＤＧＦＲ発現（挿入）。（Ｈ）誘導されたｈＡＢＭＣにおけるＴｕＪｌの発現（上部の挿入は高倍率を示す）、一方下部の挿入は長い樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）を有するＴｕＪｌ陽性細胞を示す。（Ｉ）継代（ｐａｓｓａｇｅ）０（Ｐ０）でのｈＡＢＭＣにおける、継代６の後の同じ患者からの細胞と比較した、ネスチン、ＰＤＧＦＲ、およびＴｕＪｌ細胞の百分率。Ａ中のスケールバーは２０ｍｍであり、ＤおよびＦ中のスケールバーは１０ｍｍである。
【図８】図８は、対照およびＡＢＭＣ移植の１６週での皮質脊髄路切片の免疫蛍光染色を示す。（Ａ〜Ｄ）対照のイヌからの皮質脊髄路切片。（Ｅ〜Ｈ）自己ＡＢＭＣで治療したイヌからの皮質脊髄路切片。（Ａ）外側皮質脊髄路の明視野切片。（Ｂ）核マーカーであるＤＡＰＩ（青）、ＧＦＰ（緑）、およびＮＦ７０（赤）神経細胞マーカーの蛍光像。ＧＦＰの発現は検出されなかったが、弱いＮＦ−７０の発現が検出された。（Ｃ）前皮質脊髄路の明視野。（Ｄ）ＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびＮＦ−７０で染色した、Ｃにおける前皮質脊髄路の蛍光像。（Ｅ）対照のイヌからの外側皮質脊髄路。（Ｆ）外側皮質脊髄路の蛍光切片であり、共局在化したＧＦＰおよびＮＦ−７０を示す。（Ｇ）Ｅにおける明視野にＦにおける蛍光像を重ねた写真である。（Ｈ）Ｇ中の正方形の高倍率であり、共局在化したＮＦ７０発現（黄色）を有する、ＧＦＰ陽性ミエリン再形成軸索を示す。スケールバーは１００μｍである。
【図９】図９は、ＧＦＰおよびＰＤＧＦＲに対して陽性であるＢＭ誘導細胞が中心管を囲み、脊髄内の小血管に関連することを表す。（Ａ）核マーカーＤＡＰＩ（青）、移植されたイヌのＡＢＭＣのマーカーであるＧＦＰ（緑）、およびＰＤＧＦＲ（赤）マーカーの蛍光像。像の左下でＤＡＰＩ核は中心管に並ぶ。（Ｂ）蛍光像を明視野像に重ねたものであり、ＧＦＰ陽性軸索および脊髄小血管を示す。スケールバーは５０μｍである。
【図１０】図１０は、対照のイヌにおけるＳＣＩの切片の電子顕微鏡像を表し、著しい空孔形成、および切片の１％未満を再構成する最小の軸索温存を示す。（Ａ）対照のイヌのＳＣＩの低出力視野における著しい空孔形成および単一の温存された軸索。（Ｂ）正常ミエリン形成を有する温存された軸索。（Ｃ）神経膠瘢痕を有するミエリン形成細胞。（Ｄ）過剰の空孔形成およびミエリン形成細胞を囲む瘢痕であり、ミエリン再形成の証拠はない。（Ｅ）Ｄの高出力像。スケールバーは１μｍである。
【図１１】図１１は、広範囲の軸索再生を示す、ＡＢＭＣで治療したＳＣＩのイヌの切片の電子顕微鏡像を表す。（Ａ）再生した軸索は、直径がより小さく、複数の軸索は多核ミエリン形成細胞を伴い、側部（ｌａｔｅｒａｌ）ミエリン形成を示唆する。ＳＣＩの対照のイヌの低出力視野における限定的な空孔形成および単一の温存された軸索。（Ｂ）厚い周縁を有するミエリン再形成軸索。（Ｃ）より大きいミエリン再形成軸索を囲む、複数の小さい軸索。（Ｄ）複数の軸索を引きつけるミエリン形成細胞。（Ｅ）多小葉性（ｍｕｌｔｉｌｏｂｕｌａｒ）核を有するミエリン形成細胞。（Ｆ）多核の大きいミエリン形成細胞および周囲の基底膜。スケールバーは１μｍである。
【図１２】図１２は、イヌにおけるＭＳＣで治療したＳＣＩの切片のＦＩＳＨ分析を示し、イヌの３５番染色体プローブで標識され、融合の証拠を示さない、正常２倍体細胞（矢印）を表す。（Ａ）ＤＡＰＩ染色核であり、赤色標識プローブで染色された２倍体の３５番染色体（矢印）を示す。（Ｂ）３５番染色体赤色プローブで染色された、ＧＦＰ陽性細胞中の２倍体核の高倍率。
【図１３】図１３は、ＡＢＭＣで治療した患者および対照患者の後脛骨筋において記録された、運動誘発電位反応を示す（それぞれの群から１人の患者からの代表的な記録）。（Ａ）均一な活動を示す対照患者の記録。（Ｂ）治療後１年で記録を行った、ＡＢＭＣで治療した患者。ＡＢＭＣで治療した患者における回復は、後脛骨筋について記録された、２０〜３０ｍｓｅｃの潜伏時間を有する電気的に誘発された反応から明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、神経または脳の外傷性または変性損傷を治療するために、骨髄細胞集団から単離された接着骨髄細胞の治療上有効な量を患者に投与することを含む、細胞療法の細胞、組成物、および方法に関する。本明細書中に記載されるように、本発明は、接着骨髄細胞（ＡＢＭＣ）が、神経前駆細胞型、ミエリン形成細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、成熟神経細胞、有髄軸索などに分化しうる、またはこれらを生成させうることを見出したことに基づく。より具体的には、驚くべきことに、単離されたＡＢＭＣが、例えばＳＣＩなどの神経損傷を受けた哺乳類に導入されると、正味の効果は、損傷部位での、損傷を受けた神経組織のミエリン再形成および軸索再生であることを見出した。これは、運動協調の改善および／または標的の神経変性状態の低減をさらにもたらすことが、特に理学療法と組み合わせた場合に観察された。
【００２６】
本発明の骨髄細胞集団は、公知の任意の方法で得られうる。一実施形態においては、前記骨髄細胞集団は、骨に挿入した針を通して骨髄液および細胞を取り除くことによって吸引されうる。骨髄穿刺は、腸骨稜において行われうるが、この部位に制限されず、穿刺または骨髄細胞を得る他の方法において公知の任意の他の身体の部位で行われうる。特定の実施形態においては、骨髄細胞は罹患患者から同系細胞で（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）得られる。しかしながら、本発明はこれに限定されず、骨髄細胞集団はまた、特に制限されないが、骨髄バンク（または同様のソースまたは患者の非血縁者由来の骨髄）、血縁者からの骨髄、または任意の他の胎児でない動物のソースからの骨髄、臍帯血、脂肪組織、体液、または公知の任意の他のソースなどの、患者に免疫学的に適合する、当業者に公知に任意の他のソースから得られうる。
【００２７】
そのソースにかかわらず、骨髄細胞は穿刺液から公知の標準的な方法を用いて単離される。非制限的な一実施形態においては、骨髄穿刺液は、例えばＲＰＭＩ−１６４０などの緩衝製剤を用いて希釈され、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（商標）（アマシャムバイオサイエンス）などの細胞分離培地の存在下で遠心分離される。上澄みが除去され、ペレットの細胞は再懸濁され、多能性細胞の維持のための標準的な培地を用いて維持される。非制限的な例において、このような培地としては、低グルコース含有量であり、ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、少なくとも１つの広域スペクトル抗生物質およびＣＯ２が添加されたＤＭＥＭが挙げられる。他の培地型もまた他の公知のものとして用いられうる。
【００２８】
この骨髄細胞の集団から、次にＡＢＭＣの亜集団が単離される。非制限的な一実施形態においては、ＡＢＭＣは、細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆基板上で培養することによって、培養液中の細胞を増殖することなく単離される。そのため、細胞は、ポリ−Ｌ−リシンで被覆したディッシュ、フラスコ、バッグ、または多能性細胞の培養のための当業者に公知の他の同様の材料の上に懸濁されうる。非制限的な一実施形態においては、前記細胞は約２．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で懸濁される。被覆した基板は、例えば、Ｌ−グルタミン含有α−ＭＥＭ、１以上の広域抗生物質、およびＦＢＳなどの当業者に公知の骨髄細胞生存用の任意の標準的な培地をさらに含みうる。
【００２９】
骨髄細胞集団は、接着骨髄細胞を非接着骨髄細胞から分離するのに有効な時間、ポリ−−Ｌ−リシン被覆基板上でインキュベートされる。一実施形態においては、このような有効な時間は２〜７２時間である。さらなる実施形態においては、前記有効な時間は約７２時間である。
【００３０】
インキュベーションの後、１または複数の洗浄段階を用いて被覆基板を洗い流すことによって、非接着細胞を除去する。任意の公知の洗浄剤が前記洗浄段階で用いられてもよく、特に制限されないが、生理食塩水、ＰＢＳ、ＦＢＳ、ｄＨ２Ｏ、培地、または公知の同様の洗浄剤が挙げられる。特定の実施形態においては、前記細胞は３回洗い流され、非接着細胞が除去される。
【００３１】
洗浄後、接着細胞は公知の方法を用いてポリ−Ｌ−リシン基板から外される。例えば、一実施形態においては、単離されたＡＢＭＣは、Ａｃｃｕｔａｓｅ存在下で前記基板をインキュベートすることによってポリ−Ｌ−リシン被覆基板から外される。特定の実施形態においては、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを用いた３７℃で５分間のインキュベーションによってリフトする。しかしながら、本発明はこれに制限されず、接着細胞をリフトする同様の方法、または当該分野で理解されている他の方法もまた考えられる。
【００３２】
さらなる実施形態においては、ＡＭＢＣの亜集団はまた、２００９年１０月１６日に出願され、その内容が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許仮出願第６１／２５２，３８９号に開示された１以上の方法を用いて単離されうる。
【００３３】
ＡＢＭＣの単離された亜集団内の細胞は、多分化能、特に神経分化の指標となる、１以上の分化抗原群（ＣＤ）細胞表面マーカーに対して陽性である。このようなマーカーは、特に制限されないが、以下のＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ２７１の１以上から構成されうる。特定の実施形態においては、本発明のＡＭＢＣは、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５の発現を示さない。これらのＣＤ細胞表面マーカーの存在または不在は、当業者に公知の１以上の手順によって同定されうる。一実施形態において、このような手順としては、２〜７２時間のインキュベーションの後のフローサイトメトリーが挙げられる。細胞表面マーカーの同定のための公知の一般的なイムノアッセイもまた用いることができ、当業者に公知である。そのため、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方がアッセイに用いられうる。ここで、当業者に知られているように、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの適当な他のイムノアッセイも用いられうる。適用できるイムノアッセイは、特許文献および学術文献に広範囲に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号、加えて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ（１９８９）を参照。
【００３４】
投与前に、ＡＢＭＣは、分化を生じさせる環境条件および／または培地への曝露を最小にするまたは完全に避ける、最初に単離された形態から最小限に操作されていることが好ましい。別の方法では、しかしながら、本発明はこのような形態に制限されない。特定の実施形態においては、ＡＢＭＣのサブセットの全体は、神経系列に予備分化されていてもよい。非制限的な例においては、ＡＢＭＣのサブセットの全体は、投与の直前に、公知の神経細胞誘導培地上で、約１〜３日インキュベートされうる。このような培地としては、特に制限されないが、２％のＤＭＳＯおよび１ｍＭのホルスコリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
【００３５】
本発明のＡＢＭＣは、患者の損傷を受けた部位に、または近似的に当該部位に投与されうる。細胞投与形態は、治療する損傷／疾患の型、哺乳類の年齢、細胞が分化しているかどうか、細胞がこれに導入された異種ＤＮＡを有するかどうか、などを含むいくつかの因子に依存して変動しうる。脊髄組織に細胞を投与する例は、本明細書の実験的な実施例の欄に記載されている。この例では、細胞は、哺乳類の脳脊髄液に、脊髄損傷部位の近傍にくも膜下（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）導入される。そのため、細胞は患者の損傷部位またはその近傍での脳脊髄液への腰椎穿刺を通して、くも膜下注射のような直接注射によって所望の部位に導入されうる。
【００３６】
しかしながら、本発明は必ずしもくも膜下注射またはこのような方法論に限定されない。手根管症候群に関連する正中神経損傷など、神経損傷が末梢神経の損傷である他の実施形態においては、前記細胞は、超音波ガイド下局所送達によって末梢神経根に投与されうる。前記細胞はまた、公知の１以上の方法を用いて、損傷部位近傍または損傷と同じ身体領域内に投与し、損傷部位に侵出（ｉｎｆｕｓｅ）させることができる。例えば、脳の部位への投与については、細胞をくも膜下に、または本明細書中の１以上の方法を用いて投与し、脳の損傷を受けた組織に侵出させてもよい。
【００３７】
必要に応じて、前記細胞は、例えばペプチドまたは他の生物剤などの血液脳関門を越える輸送を促進する１以上の添付群を備えうる。再び、上記の方法は本発明を制限するものではなく、前記細胞は、前記細胞が安全におよび確実に浸出されうるかぎり、任意の方法によって、例えば、特に制限されないが、経脈管、脳内、非経口、腹腔内、静脈内、硬膜外、髄腔内、胸骨内、関節内、腱滑液鞘内、脳内、動脈内、心臓内、または筋肉内で宿主に投与されうる。上述の任意の形態または他の公知の同様の形態を用いた本発明の細胞の移植もまた、本明細書中に提供される技術または他の公知の方法を用いて達成されうる。
【００３８】
ＡＢＭＣは、一般に、生理食塩水、蒸留水、髄液などの懸濁液の形態の組成物として移植に用いられる。一実施形態においては、例えば、前記組成物は、約１５０ｍｌの生理食塩水に懸濁したＡＢＭＣからなる。再び、本発明は必ずしもこの組成物に限定されず、ＡＢＭＣはまた、ＰＢＳなどの適当な緩衝液または製薬上許容される液体の範囲の他の緩衝液の懸濁液として、投与に適した組成物に製剤されうる。ＡＢＭＣはまた、生理食塩水中で低温保存して、使用前に上記の溶媒に懸濁させることによって再構成してもよい。ＡＢＭＣの単離および保存、ならびに組成物の調製の方法は、細胞移植に関する当業者に公知である。このようなＡＢＭＣの組成物は、ＡＢＭＣを患者から同系細胞で（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）得ることが困難な場合に有用である。
【００３９】
本明細書中に記載されるように、治療上有効な量の細胞が、外傷性または変性の神経または脳の損傷を治療するために患者に投与される。一実施形態においては、治療上有効な量は、損傷部位での損傷を受けた神経組織のミエリン再形成および／または軸索再生を生じさせるために、または損傷を受けた神経または脳の組織を修復するために必要な細胞の量を意味する。そして、これは運動協調の改善および／または標的の神経変性状態の低減を促進しうる。非制限的な一実施形態においては、約１０４〜１０７ＡＭＢＣ／患者の体重ｋｇが治療上有効な量として患者に投与される。さらなる実施形態においては、以下の実施例で例示するように、治療上有効な投与量は、約２×１０６ＡＢＭＣ／患者の体重ｋｇでありうる。
【００４０】
本発明のＡＢＭＣ含有組成物は、神経または脳の損傷を有する患者に、損傷後できるだけ早く投与されうる。しかしながら、以下の実施例に示すように、当業者は、治療の時期などは一般に医師によって決定され、必ずしも本発明に制限されないことを理解するであろう。そのため、患者の状態および他の因子に応じて、後の段階で治療を受けてもよい。
【００４１】
治療上有効な投与量は、１回の投与で、または複数回の投与で、患者に提供されうる。後者の場合には、前記治療上有効な量を、２〜８回の別個の投与など、複数回の投与に分けてもよい。このような投与は、複数日の期間にわたって続けて行ってもよく、毎日、週１回、月１回などで受ける離散的な投与として行ってもよい。再び、当業者は、治療の時期および／または投与の回数は、一般に医師によって決定され、必ずしも本発明に制限されないことを理解するであろう。
【００４２】
前記ＡＢＭＣの組成物は、ＡＢＭＣの作用または分化に悪影響を与えないかぎり、任意の製薬上許容される添加剤をさらに含みうる。例えば、患者が外因性のソースから取得したＡＢＭＣを用いて治療される場合、１以上の公知の免疫抑制剤があらかじめ投与されうる。免疫抑制剤は、特に制限されないが、シクロスポリン、タクロリムス水和物（ＦＫ５０６）、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミゾリビン、およびメトトレキセートなどの、骨髄または器官移植に一般に用いられるものから選択されうる。免疫抑制剤の投与量は、薬剤の種類、投与するＡＢＭＣの由来、患者の耐性などを考慮して適切に決定されうる。
【００４３】
本発明は、脊髄の損傷部位での軸索再生およびミエリン再形成、または他の神経もしくは脳の損傷を受けた部位（例えば、末梢神経損傷、脳損傷など）の修復への寄与において有益である。脊髄損傷、すなわち運動まひまたは感覚消失を有する患者については、ＡＢＭＣ移植は、特に理学療法による機能訓練と組み合わせた場合、軸索再生およびミエリン再形成の促進に有効であり、ＳＣＩ後の修復を誘導する。以下に例示するように、ＡＢＭＣは、１以上のミエリン形成細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞、有髄軸索、成熟神経細胞などの生成を含む、またはもたらす。そのため、新たに形成された細胞は、特に制限されないが、ＮＦ７０、ネスチン、ＰＤＧＦＲ、ＧＦＡＰまたはＴｕＪｌなどの細胞型に関連する１以上のマーカーに対して陽性であることがわかった。皮質脊髄路線維の再生もまた観察され、機能改善と一致した。
【００４４】
理論に拘束されることを意図するものではないが、軸索再生が、直接的に、または中心管（ｃｅｎｔｒａｌ ｃａｎａｌ）周辺の上衣領域におけるシュワン細胞または脊髄組織幹細胞中で成熟する、脳神経堤（ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ）からの神経前駆細胞の採用を通して、主な役割を担う可能性があると推測される。以下の例示においては、この領域は、共局在化した脊髄常在（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｒｅｓｉｄｅｎｔ）前駆細胞マーカーとともに、最も多くの数のＡＢＭＣ誘導細胞がみられた領域であった。ＡＢＭＣはまた、線維性瘢痕組織に新たな神経細胞経路を生成することによって、または、発芽もしくは生成している短い再生した神経細胞線維を増殖させることによって、宿主脊髄組織を支持する神経栄養因子および抗炎症性メディエータを生成する。さらに、ＡＢＭＣは、神経組織の遠位端および近位端との結合のためのガイダンス（誘導）を提供し、移植された細胞の再生を促進しうる。
【００４５】
脊髄および末梢神経の損傷ならびに脳の損傷は、必ずしも物理的な損傷に制限されず、疾患状態ともまた関連しうる。したがって、ＡＢＭＣの使用は、神経変性疾患状態の治療における使用もまた検討されうる。例えば、新生児から小児では、前記細胞は、特に制限されないが、テイーサックス病および関連するサンドホフ病、フルラー症候群および関連するムコ多糖症、ならびにクラッベ病を含む多くの遺伝病の治療に用いられうる。ＣＮＳの成人病については、本発明の細胞は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、てんかんなどの治療に有用である。他の神経変性疾患としては、特に制限されないが、ＡＩＤＳによる認知症；多発性硬化症および急性トランスフェラーゼ脊髄炎などの脱髄疾患；皮質脊髄系の病変などの錯体外路疾患および小脳疾患；大脳基底核障害または小脳疾患；ハンチントン舞踏病および老年性舞踏病などの多動性運動障害；運動低下性運動障害；進行性核上麻痺；小脳の構造的病変；脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、小脳皮質変性症などの脊髄小脳変性症；多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ病、デジェリーヌ−トーマス病、シャイ−ドレーガー病およびマシャド−ジョセフ病）；レフサム病、無βリポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張症などの全身性疾患；およびミトコンドリア多系統疾患；および神経原性筋委縮症などの運動単位の障害；中年のダウン症候群；びまん性レヴィー小体病；レヴィ小体型老年性認知症；ウェルニッケ−コルサコフ症候群；クロイツフェルト−ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン−スパッツ病；および拳闘家認知症などが挙げられる。例えば、当該参照文献およびこれに引用された参照文献が全体として参照により本明細書中に組み込まれる、Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ．ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９８７），Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，（１５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照。
【実施例】
【００４６】
以下の非制限的な実施例によって、本発明の一形態を説明する。
【００４７】
実施例
材料および方法
イヌ接着ＢＭ細胞（ｃＡＢＭＣ）の単離および培養
動物の飼育および処置のすべての形態は、ＮＩＨガイドラインおよび動物愛護委員会のガイドラインに従って行った。ＡＢＭＣは、成犬の大腿骨から単離した。簡潔には、低密度単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて単離し、２ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および０．３％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）−低グルコースに、３７℃で５％ＣＯ２濃度で維持した。ＡＢＭＣは、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．Ｍｕｔｌｉｌｉｎｅａｇｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１４３−７（１９９９）．に記載されているように、フローサイトメトリーを行って純度を決定した。インビトロのＧＦＰ標識は、ｐＣＭＶ−ＡｃＧＦＰプラスミドにリポフェクタミンを２：１の比で混合したものを各プレートに添加することによって行い、移植前に３７℃で６時間インキュベートした。
【００４８】
ヒトＡＢＭＣ（ｈＡＢＭＣ）の単離および培養
ヒトＡＢＭＣは、ＳＣＩ患者の腸骨稜からの骨髄穿刺液を用いて単離した。インフォームドコンセントの署名後、試料を得た。細胞をＲＰＭＩ−１６４０で１：１に希釈し、５０ｍｌのチューブ中で１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓの上に重ね、３０分間、８００ｇで、室温で遠心分離した。細胞界面を培地で約１５ｍｌに希釈し、１０分間、４００ｇで遠心分離した。上澄みを捨てた後、ペレットを１ｍｌの培地に再懸濁させた。有核細胞を計数し、ポリ−Ｌ−リシンを被覆したディッシュ上に、２ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、１％の抗真菌性抗生物質および１０％（ｖ／ｖ）の非加熱不活性化選択プレスクリーニングＦＢＳを添加したα−ＭＥＭを含む標準的な培地中に、２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で懸濁させた。
【００４９】
細胞を３日間インキュベートし、３段階の洗浄段階で培地を交換することによって非接着細胞を除去した。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで、３７℃で５分間インキュベーションすることによってリフトした。比較のためのＭＣＳを生成するための増殖および神経誘導のために、ＡＢＭＣを上述のように調製した。増殖された細胞は、継代させる前に１２〜１６日間静置して成長させ、１：４の比で再平板培養した。骨形成、脂質生成、および軟骨細胞分化は、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１４３−７（１９９９）．に記載されている方法で行った。ＡＢＭＣは、ＣＤ４５−ＰＣ７、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ７３−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＰＥ、ＣＤ１０６−ＰＥ、ＣＤ１６６−ＰＥおよびＣＤ２７１−ＰＥ（すべてＢＤバイオサイエンス社製）で染色した後、フローサイトメトリーで分析した。
【００５０】
神経細胞誘導
神経細胞分化は、Ａｒｎｈｏｌｄ，Ｓ．ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｒｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ａｆｔｅｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｌｉｑｕｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８５，５５１−６５（２００６）に記載される方法を修正して行った。神経球誘導は、２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および増殖因子ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄシステムス）、βＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびヘパリン（５ｍｇ／ｍｌ）を添加した無血清ＤＭＥＭ中の培養によって行った。神経誘導は、Ａｃｃｕｔａｓｅによって調製され、２％のＤＭＳＯおよび１ｍＭのホルスコリンを有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に２０００細胞／ｃｍ２の密度で設置された、単一の細胞を用いて行った。細胞をこれらの条件下で４日間保持し、その後、免疫蛍光顕微鏡によって分析した。
【００５１】
重度の脊髄損傷のイヌモデル
体重３．７７±０．５９ｋｇの健康な雑種の成犬１６頭を、脊髄損傷の実験的な研究に用いた。動物の飼育および処置のすべての形態は、カイロ大学の動物愛護委員会のガイドラインに従って行った。麻酔をかけた（ペントバルビタールナトリウム、４０ｍｇ／ｋｇ）イヌに、Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ， Ｅｖｏｋｅｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ，ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｐｉｎａｌ Ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．５７，６６７−７３（１９８２）にネコモデルについて記載される方法を修正して、Ｌ４レベルの重度の脊髄損傷（ＳＣＩ）を受けさせた。簡潔には、Ｌ４椎弓切除の後、硬膜を開き、脊髄を切断した。脊髄の切断された末端を典型的には約３ｍｍ後退（ｒｅｔｒａｃｔ）させ、外科用顕微鏡下で検査し、完全な切断面を確保した。術後処置としてはイヌを暖かくし、１日２回手動で排尿を行い、予防的抗生剤を与えた。イヌの摂食に困難はなかった。
【００５２】
ＳＣＩ後の治療に従って、イヌを公平に４つの群に割り当てた。イヌＡＢＭＣの移植は、ＳＣＩの１週間後に行った。上記と同様の方法を用いてイヌに麻酔をかけた。対照群は、損傷後なんらの細胞移植も受けなかった。操作していないＡＢＭＣまたは２４時間もしくは７２時間神経分化を誘導したＡＢＭＣを受ける３つの群においては、１５０μｌの生理食塩水に懸濁させた細胞を、腰椎穿刺によってＣＳＦに注射した。後肢の機能回復の行動評価は、ビデオ記録によって行った。それぞれのイヌについて、最低１０歩、側面および背面からビデオテープに記録した。１５点採点システム２５を用いて、それぞれのイヌの歩行を、治療の型に関して盲検化された調査員がビデオテープから採点し、ベースライン、ＳＣＩの１日後、ならびにＳＣＩの４、８、１２および１６週間後での平均スコアを記録した。
【００５３】
免疫染色
細胞を４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、ＰＢＳ下、４℃で染色されるまで保存した。組織病理学的変化を評価するために、すべてのイヌを細胞療法後１６週で安楽死させた。イヌをＰＢＳおよび４％のパラホルムアルデヒドを用いて潅流し、Ｔ１０からＬ５までの脊髄を１０％緩衝中性ホルマリン中に固定し、脱灰溶液中に浸した。切片をパラフィンに埋包し、４μｍ厚さの軸方向断面を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはルクソール−ファスト−ブルーで染色し、ミエリンを識別、または蛍光分析に用いた。損傷を受けた脊髄の中心点からのミエリン形成された領域およびキャビティの体積は、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ画像解析ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて横断面の画像から計算した。キャビテーデョンの最も大きい領域を用いて切片を同定し、それぞれのイヌについてこの領域を測定し、対照および細胞療法で治療したイヌからの平均±ＳＥＭとして表した。免疫蛍光には、脱パラフィン化切片を２分間の抗原賦活化を通して加工し、次いでイヌの交差反応性に適した特異的抗体で染色した。
【００５４】
一次抗体は、モノクローナル抗−ＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（１：１００）；ポリクローナル抗−ＧＦＡＰ，Ｄａｋｏ（１：５００）；モノクローナル抗β−ＩＩＩ−チューブリン，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（１：２００）；ポリクローナル抗−ＰＤＧＦＲα，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（１：８０）；モノクローナル抗−ＧＡＤ６、Ａｂｅａｍ（１：５００）；ポリクローナル抗−Ｎｅｓｔｉｎ，ＬｉｆｅＳｐａｎ（１：１００）；モノクローナル抗−アセチルコリンエステラーゼＡＥ−１，ミリポア（１：５０）；モノクローナル抗−７０ｋＤａ神経フィラメント，ミリポア（１：５０）；モノクローナル抗−Ａ２Ｂ５，ミリポア（１：１００）；およびモノクローナル抗−ＧＲＭｌ，ＢＤ（１：１００）であった。ペルオキシダーゼＡＢＣキットおよびＣｏＣ１２−増強ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を、ミエリン塩基性タンパク質染色のためのクロモーゲンとして用いた。蛍光顕微鏡法には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、５３５、および６１０色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した二次抗体を用いた。ＧＦＰ、ネスチン、ＰＤＧＦＲ、ＴｕＪｌ、およびＮＦ７０のカウントを計算するために、各０．０１ｍｍ２の表面積を有する１００の正方形を計数に用い、標的領域が選択された。値は平均±ＳＥＭとして表した。治療の型に関して盲検化された病理学者がすべての組織学的検査を行った。
【００５５】
ヒトの移植
適格ＳＣＩ患者を評価し、１５９人の患者を初期スクリーニングのために選択した。試験対象患者基準に合致する８０人の患者が登録され（５０人の胸部ＳＣＩおよび３０人の頸部ＳＣＩ）、無作為に対照群および細胞療法群の２つの群に分けられ、両方の群は、独立した物理療法、リハビリテーション、およびリウマチ学のための軍事力センターで、計画的な標準的な理学療法を受けた。試験に対する正式な承認および詳細なインフォームドコンセントへの署名の後、移植群のすべての参加者は、局所麻酔下で骨髄穿刺を受け、ＡＢＭＣを作製した。穿刺液は腸骨部（ｉｌｉａｃ ｒｅｇｉｏｎ）から取り、冷培地中、滅菌容器に直ちに設置し、すべての後続処理は、上述のように、カイロ大学病院の幹細胞センターで完全臨床無菌条件下で行った。患者は２×１０６細胞／ｋｇの累積標的細胞投与量を受け、ＡＢＭＣ細胞数および生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を７２時間の接着後に評価し、この手順を、この標的投与量が達成されるまで月１回繰り返した（中央値は４回であり、１〜８回の範囲であった）。
【００５６】
データおよび統計解析
全てのデータを平均±ＳＥＭとして表した。すべての群の間で、連続データをｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ ＡＮＯＶＡによって、次いで事後（ｐｏｓｔ ｈｏｃ）フィッシャーの保護最小有意差法（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＰＬＳＤ）によって比較した。脊髄における移植したＧＦＰ細胞の定量分析のために、それぞれのイヌの脊髄から４μｍ厚さで、１５０μｍ離して１５の断面を切断した。各切片における平均直径が６μｍであるすべての細胞を計数した。抗体あたり３つの脊髄の切片について二重陽性細胞を調べ、切片あたり４つの領域を計数した。キャビテーション領域を対照と細胞療法群との間でスチューデントｔ−検定を用いて比較した。機能テストには、移植を受けたイヌと対照との間の運動スコア（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ｓｃｏｒｅ）の差を、各時点でＡＮＯＶＡの繰り返し測定を用いて分析した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５のレベルで決定した。
【００５７】
実施例１−ＡＢＭＣのインビトロ分化
６頭のイヌのＢＭ試料を単離し、ポリ−Ｌ−リシン上で、承認されたプロトコル下で７２時間培養した。７２時間後に分離されたイヌのＡＢＭＣは、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１を発現するが、ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＣＤ４５は発現しない、または無視できる程度の発現であることがわかった。イヌのＡＢＭＣは、従来の培養増殖ＭＳＣに多い線維芽細胞様細胞については限られた数である、平坦な長楕円形の形態を有した（図５Ａ）。イヌのＡＢＭＣ（図５Ａ）はＧＦＰ発現プラスミドを用いて９０％近くの効率でトランスフェクトされた（図５Ｂ）。これらの細胞は、その多能性を保持し、直ちに、そして強力に脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞に誘導されうる（図５Ｅ〜Ｇ）。神経誘導培地中でのこれらの細胞の培養は、ヒトの細胞と同様に、神経球の生成、および神経表現型（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に関連するネスチン発現の増加を伴う形態変化をもたらす（図５Ｃ、Ｇ〜Ｉ）。
【００５８】
次に、ポリ−Ｌ−リシンで被覆したフラスコ中で７２時間培養した１０のヒトＢＭ試料からのＡＢＭＣの多分化能を評価した。７２時間でのフローサイトメトリー分析から、ヒトのＡＢＭＣは、９０％超がＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１に対して陽性であるが、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１４を発現しないことが明らかになった。２〜３週間の従来の誘導と比較すると、ヒトＡＢＭＣは、１週間以内に、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への中胚葉３血球系分化を強力に誘導可能であった（図６Ａ〜Ｃ）。神経誘導１８は、神経分化（図６Ｄ〜Ｆ）、複数の一次樹状突起を形成する、細胞における典型的なオリゴデンドログリア形態（図６Ｆ）、および同じ患者からの培養増殖細胞と比較してより強い能力（図７Ｉ）と一致する形態変化をもたらした。
【００５９】
ＡＢＭＣから生じた神経球の数（ｎ＝１２を６穴プレートで３連で行った）は、６〜８週間培養液中で増殖した、同じ患者のＭＳＣから生成したこれらの神経球よりも少し多かったが有意に相違しなかった。しかしながら、培養増殖したＭＳＣと比較すると、ＡＢＭＣは、アストロサイト前駆細胞マーカーであるネスチン（図７Ｃ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーである血小板由来増殖因子受容体−α（ＰＤＧＦＲ−α）（図７Ｇ）、および神経前駆細胞マーカーであるタイプＩＩＩβ−チューブリンエピトープＪｌ（ＴｕＪｌ）（図７Ｈ）に対するアップレギュレートされた免疫活性によって示されるように、脊髄常在神経前駆細胞組織により強く誘導可能であった。
【００６０】
すぐに、または培養増殖後に神経分化を誘導した、同じ患者からの免疫活性細胞の定量分析（ｎ＝６を６穴プレートで３連で行った）から、ネスチン発現においては有意な差がないことがわかったが、ＰＤＧＦＲαおよびＴｕＪｌの両方は、ＡＢＭＣにおいて、培養増殖したＭＳＣよりも有意に高かった（図７Ｉ）。したがって、これらのインビトロの研究は、移植された細胞のインビボの挙動を反映しない条件で行われたものであるが、培養増殖したＭＳＣと比較して、ＡＢＭＣを用いることの有益性を示している。
【００６１】
実施例２−イヌモデルにおけるＡＢＭＣのインビボ分化
前臨床モデルにおける細胞療法戦略を確立するために、重度ＳＣＩのイヌモデルにおいて自己ＡＢＭＣをくも膜下に移植した。イヌの脊髄の重度の打撲症は、確立されたネコの重度ＳＣＩモデル２４と同様に、１６頭のイヌに実施し、全ての損傷を受けたイヌ（ｎ＝１６）において感覚消失および後肢まひが生じた（図１Ｈ）。損傷の１週間後、動物をランダムに４つの群に分け（ｎ＝４／群）、群Ａを細胞治療を受けない対照群とした。群Ｂ、Ｃ、およびＤのイヌは、腸骨稜からＢＭ吸引し、プレートに７２時間接着させることによってＡＢＭＣを単離した。１５０μｌの生理食塩水中に２×１０６ＡＢＭＣ／ｋｇに調製されたＧＦＰ発現プラスミドを用いて細胞をトランスフェクトし、腰椎穿刺によって注射した。群Ｂの動物は、操作していないＡＢＭＣを受けた。ＡＢＭＣの神経系列へのインビトロの予備分化によって、これらのインビボの神経ポテンシャルが増加するかどうかを調べるために、群ＣおよびＤの動物は、７２時間で単離したＡＢＭＣであって、最後の２４時間（群Ｃ）または全７２時間（群Ｄ）、神経分化を誘導したＡＢＭＣを受けた。
【００６２】
後肢の運動能力および機能回復は、移植後１６週間の間、４週間ごとに、イヌのＳＣＩ２５のために開発された１５点ビデオテープスコアリングシステムを用いて評価した。後肢の運動機能は、ＳＣＩの前はすべての動物において損なわれておらず、すべて１４〜１５点のスコアであった（図１Ｈ）。損傷後、イヌは対まひであって深い痛みの感覚がなく、後肢のスコアはゼロであった。操作していないＡＢＭＣ（ｎ＝４）、または２４時間（ｎ＝４）もしくは７２時間（ｎ＝４）、神経細胞分化が誘導されたＡＢＭＣを受けたＢ、ＣおよびＤの３つの群のイヌの間で、有意な差は測定されなかった（Ｐ＝０．７５）。群Ａの対照治療のイヌと異なって、自己ＡＢＭＣ移植を受けたイヌ（ｎ＝１２）は、移植後８週で最大近くの回復に達し、１６週でその運動機能の有意な回復がみられ（図１Ｈおよび表１）、最初の週のうちに自発的な後肢の運動が検出され（図１Ｉ）、これはＡＢＭＣの早期の局所的神経保護的効果を示唆する。治療後１６週で、イヌを安楽死させて脊髄を固定し、組織学および免疫染色によって分析した。対照のイヌからの切片は、ＡＢＭＣで治療した切片における最小のキャビテーションとは対照的に、重大な空孔形成を示した（図１Ａ〜Ｃ）。抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体を用いた免疫染色から、ＡＢＭＣで治療したイヌにおいて、対照と比較して、有意なミエリン再形成がみられることが明らかになった（図１Ｄ−Ｇ）。ＡＢＭＣ切片におけるＭＢＰ染色は、損傷を受けていない脊髄におけるＭＢＰレベルの８５％までに達し（図１Ｄ〜Ｇ）、実質的なミエリン再形成を示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
ミエリン再形成の機構、およびＡＢＭＣ移植が損傷した軸索の再生を向上させるのかどうかを調べるために、ＧＦＰを移植されたＡＢＭＣのマーカーとして、脊髄常在前駆細胞マーカーとともに用いて、多色免疫組織化学試験を行った。ＧＦＰ−陽性細胞はＳＣＩ損傷の境界内で検出され（図２Ａ）、対照のイヌからの切片では検出されなかった（図８Ａ〜Ｄ）。多数のＧＦＰ陽性細胞が中心点から広く分布し（図２Ｂ）、損傷した脊髄の灰白質および白質中に見られ、損傷の境界領域、中心管周辺、および対側灰白質内（図２Ａ）に分布し、くも膜下に注射されたＢＭ細胞が損傷部位に吻側移動したことを示す。ＧＦＰおよびＰＤＧＦＲに対して陽性であるＢＭ誘導細胞は、中心管を囲んでみられ、おそらく新血管形成を通して成長する脊髄内の小血管と関連する（図９）。加えて、灰白質中の少なくとも３０％のＧＦＰ−陽性細胞もまた、成熟神経細胞の特異的マーカーである７０ｋＤａ神経フィラメント（ＮＦ７０）に対して陽性であった（図２Ａ）。
【００６５】
脊髄の後索は主に有髄軸索からなる。強いＧＦＰ染色が大きな核および細胞質境界を有するいくつかの細胞を有する後索において観察され、周辺ミエリン形成を示した。対照動物からの切片では、電子顕微鏡写真においてアストログリオ−シスのない細胞外環境における脱髄軸索、広範囲の空孔形成、およびグリア性瘢痕を示した（図１０）。ＡＢＭＣ移植したイヌからの切片の電子顕微鏡写真における中枢対末梢ミエリン形成の定量分析から、ミエリン再形成軸索は主に末梢様ミエリン形成細胞からであることが示された（図１１Ａ〜Ｃ）。全ミエリン再形成軸索の１／３近くにおいて、中枢ミエリン形成を有するオリゴデンドロサイト−有髄軸索および特徴的な薄いミエリン鞘が、より小さい軸索において観察された（図１１Ｄ〜Ｆ）。
【００６６】
これらのミエリン再形成軸索はＧＦＰおよびＧＦＡＰに対して二重陽性であることがわかり（図２Ｉ）、多小葉性核および複数のミエリン再形成軸索まで拡張される大きな中間径フィラメントリッチ工程によって特徴づけられるアストロサイトに関連する（図１１）。ＧＦＰ−標識ＡＢＭＣ由来のアストロサイトおよびミエリン形成細胞もまた回復した脊髄損傷において検出された。さらに、ＡＢＭＣで治療したイヌにおける前皮質脊髄路の切断面内に、ＮＦ７０を発現する有意により多くのＧＦＰ陽性軸索（図２Ｃ〜Ｆ）を、ミエリン再形成軸索を明らかにマーキングするＧＦＰ発現（図８Ｅ〜Ｈおよび図２Ｆ中の挿入）とともに検出したが、一方で対照では検出されなかった（図８Ａ〜Ｄ）。
【００６７】
随意運動を制御する前皮質脊髄路および外側皮質脊髄路のＧＦＰ陽性ＡＢＭＣからの再生により、移植を受けたイヌの損傷部位内でのより強い軸索再生が示唆され、これらの管は従来から少なくとも再生可能と評価されていたため、ＡＢＭＣの神経再生能が示された。さらに、神経前駆細胞マーカーを発現するＧＦＰ陽性細胞の二重標識プロファイルの優位性は、灰白質および白質における貪欲な神経分化と整合した。ＧＦＰ陽性細胞は、高密度シナプス接合における神経前駆細胞マーカーであるネスチン（図２Ｇ）、低密度シナプス接合におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーであるＰＤＧＦＲ（図２Ｈ）、および神経束におけるアストロサイト前駆細胞マーカーであるＧＦＡＰ（図２Ｉ）を含む、常在神経前駆細胞組織のマーカーを発現した。
【００６８】
ＧＦＰ陽性ＡＢＭＣは、興奮性、阻害性（ＧＡＢＡ）およびコリン作用性神経伝達物質マーカーを用いた免疫活性によって示されるように共局在化したＧＦＰ陽性細胞の検出によって示されるように、末端神経細胞の運命に貢献した。ＧＦＰと興奮性代謝調節型グルタミン酸受容体−１（ＧＲＭ１）、ＧＡＢＡ作動性シグナルのマーカーである阻害性グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）およびコリン作用性アセチルコリンエステラーゼ（ＡＥ−１）のいずれかで二重標識された細胞のシグナルが再生された脊髄において検出された（図２Ｊ）。加えて、神経幹細胞の特徴を有する共通のグリア前駆細胞Ｏ−２Ａ（図２Ｊ）中に存在するガングリオシド抗原であるＡ２Ｂ５との免疫活性によって示されるように、共局在化した低頻度のＧＦＰ陽性細胞が観察された。まとめると、これらのデータは、脊髄微小環境内のＡＢＭＣ誘導神経再生を示す。
【００６９】
再生の機構として融合事象の発生の可能性を排除するために、移植実験を受けたイヌの脊髄の切片を分析した。ＤＡＰＩ核染色したＧＦＰ発現細胞を、イヌの３５番染色体の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブを用いて調べた。調査した細胞（ｎ＝５００）はすべて２倍体であった（図１２）。
【００７０】
実施例３−ヒトにおけるＡＢＭＣのインビボ分化
重度のＳＣＩイヌモデルにおける前臨床試験から、くも膜下に移植された自己ＡＢＭＣは損傷部位に戻り、白質および灰白質の温存、神経細胞および軸索の再生、新血管形成、有意なミエリン再形成を伴うアストロサイト増殖、および運動スコアにおける機能改善をもたらし、副作用が検出されないことが明らかになった。
【００７１】
これらのデータから、頸部および胸部の完全なレベルのＳＣＩ患者における、ＡＢＭＣの自己くも膜下移植の安全性および有効性を調査するための、無作為化された第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を始めた。選択基準（図３）は、損傷後、少なくとも６か月の理学療法を完了し、自然回復していない患者を含んでいた。試験した患者は、９人の女性および７１人の男性であり、１６〜４５歳であった。患者の損傷からの期間は、１２〜３６か月であり、完全なＡＳＩＡ Ａ外傷性ＳＣＩを有し、Ｃ３からＴ１２の神経レベルであり、少なくとも６か月間、神経学的改善の証拠がなく、付随する全身性疾患がなかった（図３）。登録期間の間、完全慢性ＳＣＩを有する１５９人の患者が評価され、全部で８０人の患者が、カイロ大学およびアル＝アズハル大学の臨床試験審査委員会によって承認されたプロトコルにしたがって、署名およびインフォームドコンセントの後、登録された。
【００７２】
患者は２つのバランスのとれた群に無作為化された：５０人の患者；４０人の胸部ＳＣＩ患者および１０人の頸部ＳＣＩ患者は、標準的な理学療法と組み合わせた自己ＡＢＭＣ移植に割り当てられ、一方、３０人の合致した患者（２０人の胸部ＳＣＩ患者および１０人の頸部ＳＣＩ患者）は、対照群として標準的な理学療法のみに割り当てられた。細胞療法治療の前に患者を評価してベースライン測定を確立した。治療を受けた患者、および平行する対照患者の両方がモニターされ、ＡＳＩＡスケール測定は、独立した物理療法、リハビリテーション、およびリウマチ学のための軍事力センターで、試験期間にわたって、盲検化された観察者によって行われた。腰椎穿刺および細胞注射に伴う危険性は、偽薬を注射した対照群の包含を制限する重要な倫理的な問題を生じる。
【００７３】
患者は神経障害性の痛み、嚢胞、脊髄空洞症または細胞異常増殖の発生の臨床試験によって評価された。すべての移植患者は、次にＢＭ吸引を受け、ここから自己の最小限に操作されたＢＭ細胞を、カイロ大学病院の幹細胞ユニットで、滅菌条件下で７２時間接着させた（ＡＢＭＣ）。ＡＢＭＣの移植の前に、試料の細胞表現型、生存率および滅菌性を検査した。腰椎穿刺を通したくも膜下移植による自己ＡＢＭＣ細胞療法で治療した５０人の患者はすべて、２×１０６細胞／ｋｇの累積標的細胞投与量を受け、この手順を、この標的投与量が達成されるまで月１回繰り返した（中央値は４回であり、１〜８回の範囲であった）。ＡＳＩＡおよびＦＩＭスコアの測定およびＳＳＥＰを試験し、脊髄のＭＲＩは、ＭＲＩを承諾し、これに耐えられるすべての患者において、移植前のベースラインおよび１８か月間、６か月ごとに行った。
【００７４】
試験データは、エジプト保健省審査委員会によって、および独立したドイツの審査委員会によって手続きにしたがって審査された。細胞療法を受けた５０人の患者は、頭痛（３０人の患者；６０％）、腰痛（５人の患者；１０％）、不随意運動（８人の患者、１６％）、および視力障害（１人の患者、２％）を含む、腰椎穿刺に共通の軽い副作用があった。上記の副作用はすべて一時的なものであり、腰椎穿刺後１２時間から数日続き、対症療法によって完全に解消した。移植後１８か月まで、ＡＢＭＣで治療した患者において長期間の副作用は検出されず、治療を受けた患者のいずれもが、感染症、脳脊髄液の漏れ、さらなる神経障害性の痛み、脊髄奇形を経験せず、ＭＲＩ像上に塊状物の発生はみられなかった。
【００７５】
標準的な理学療法に加えて、自己ＡＢＭＣ療法を受けたすべての患者は、理学療法のみを受けた対照の患者と比較して、良好な応答をし、その神経機能が有意に改善した（図４）。自己ＡＢＭＣで治療した患者は、移植後６か月で、そのＡＳＩＡスコアおよびＦＩＭスコアが有意に向上し、電気生理学的筋機能が回復した（図４Ａ〜Ｂ）。
【００７６】
移植後１８か月で（表２）、２０人の胸部ＳＣＩ患者（５０％）は、ＡＳＩＡスケールが、グレードＡからグレードＣへの改善を示し、１５人の患者（３７．５％）は、グレードＡからグレードＢに改善したが、５人の患者（１２．５％）は、グレードＡのままであった（胸部ＳＣＩ患者の基準の詳細を表３に示す）。ＡＢＭＣ細胞療法で治療した１０人の頸部ＳＣＩ患者については、２人の患者（２０％）はグレードＡからグレードＣに改善し、３人の患者はグレードＡからグレードＢに改善し、５人の患者はグレードＡのままであった（頸部ＳＣＩ患者の基準の詳細を表４に示す）。これらの変化により脊髄の圧迫および浮腫が回復した（図４ＣにＣ６〜Ｃ７の頸部ＳＣＩを有する患者６の移植後１年でのＭＲＩ像を示す）。さらに、これらの変化により日常活動が向上し生活の質が有意に改善した。２人の代表的な患者；患者１（Ｃ６の頸部ＳＣＩを有する）は細胞療法前は四肢まひであり、患者（Ｔ９の胸部ＳＣＩを有する）は片まひであったが、細胞療法後９か月〜１年で両者とも歩けるようになり、運動性を取り戻した。
【００７７】
スケール測定にかかわらず、自己ＡＢＭＣで治療したすべての患者は、ＡＳＩＡグレードがＡのままであった患者を含めて、移植後わずか４〜６週で神経機能の改善に気付いた。患者は、始めに触覚および感覚的刺激に対する応答の向上を、後に、最初に下肢の遠位筋において、次いで大腿筋において記録された筋肉強度の増加を経験した。ＡＳＩＡグレードの改善があった患者は、ベッドに座ったり向きを変えたりできるような、よりよい体幹運動を示した。加えて、筋肉強度の改善によって性的能力が向上し、さらに、腸および膀胱括約筋の制御が強くなって、これらの患者がカテーテルを用いずに生活できるようになった。これらの効果は、対照と比較して、ＡＢＭＣで治療した患者において、神経レベルおよびＦＩＭの改善に反映された（図４Ａおよび表３〜４）。すべての患者は治療前には皮質のＳＳＥＰを示さなかったが、移植後６か月から１年で、ＡＢＭＣで治療した患者の６５％が皮質インパルスの再発を示し、対照の患者のいずれもが示さなかった（図１３）。したがって、自己ＡＢＭＣ細胞療法により、慢性の完全なＳＣＩ患者において運動機能および感覚機能が有意に改善された。
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】
【表４】
【００８１】
上述の実施例および好ましい形態の説明は、特許請求の範囲で定義される本発明を制限するものではなく、説明のためのものであると解されるべきである。容易に理解されるように、上述した特徴の多数の変形および組み合わせは、特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく利用されうる。このような変形は本発明の精神および処方から逸脱するものではないとみなされ、このような変形はすべて、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬上許容される液体に懸濁させた接着骨髄幹細胞を含む組成物を、損傷部位で軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、損傷部位またはその近傍に投与することを含む、神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法。
【請求項２】
前記損傷は脳または脊髄の損傷であり、前記骨髄幹細胞は、前記損傷部位またはその近傍に、腰椎穿刺を通してくも膜下注射によって脳脊髄液に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記損傷は末梢神経の損傷であり、前記骨髄幹細胞は、超音波ガイド下局所送達によって末梢神経根に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記外傷性損傷は、脊髄損傷または末梢神経損傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変性損傷は、筋萎縮性側索硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記接着骨髄幹細胞は、前記損傷部位で軸索再生およびミエリン再形成を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記骨髄幹細胞は、臍帯血または骨髄穿刺液に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
約１０４〜約１０７骨髄幹細胞／ｋｇが累積的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記骨髄幹細胞の累積投与量は、２回以上の注射で定期的に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記定期的な注射は月１回行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記骨髄幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ２７１からなる群から選択される１以上のマーカーに対して陽性である細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記骨髄幹細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５に対して陰性である細胞から実質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨髄幹細胞は、ミエリン形成細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞、有髄軸索、および成熟神経細胞からなる群から選択される細胞型を分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨髄幹細胞は、ＮＦ−７０に対して陽性である細胞型を分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨髄幹細胞は、ネスチンを発現させるアストロサイト前駆細胞を分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記骨髄幹細胞は、ＰＤＧＦＲ−αを発現させるオリゴデンドロサイト前駆細胞を分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記骨髄幹細胞は、ＧＦＡＰを発現させるアストロサイト前駆細胞を分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）ポリ−Ｌ−リシン被覆基板上で、骨髄幹細胞の層が前記基板に接着するように、成熟骨髄幹細胞を含む生体試料を培養する；
（ｂ）前記基板から非接着細胞を洗浄し、前記骨髄幹細胞の層を収集する；
（ｃ）接着骨髄幹細胞を製薬上許容される液体に懸濁させる；および
（ｄ）前記骨髄幹細胞の懸濁液を、損傷部位で軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、前記損傷部位の近傍に投与する；
を含む、脊椎動物における神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法。
【請求項１９】
前記生体試料は、臍帯血または骨髄穿刺液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記懸濁液は、前記損傷部位の近傍に、腰椎穿刺を通してくも膜下注射によって脳脊髄液に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
約１０４〜約１０７骨髄幹細胞／ｋｇが累積的に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記骨髄幹細胞の累積投与量は、２回以上の注射で定期的に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記定期的な注射は月１回行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨髄幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ２７１からなる群から選択される１以上のマーカーに対して陽性である細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記骨髄幹細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５に対して陰性である細胞から実質的になる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記骨髄幹細胞は、ミエリン形成細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞、有髄軸索、および成熟神経細胞からなる群から選択される細胞型を分化させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨髄幹細胞は、ＮＦ−７０に対して陽性である細胞型を分化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記骨髄幹細胞は、ネスチンを発現させるアストロサイト前駆細胞を分化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記骨髄幹細胞は、ＰＤＧＦＲ−αを発現させるオリゴデンドロサイト前駆細胞を分化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記骨髄幹細胞は、ＧＦＡＰを発現させるアストロサイト前駆細胞を分化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
製薬上許容される液体に懸濁させた接着骨髄幹細胞を含む組成物を、損傷部位で軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、損傷部位またはその近傍に投与することを含む、神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法。
【請求項２】
前記損傷は脳または脊髄の損傷であり、前記骨髄幹細胞は、前記損傷部位またはその近傍に、腰椎穿刺を通してくも膜下注射によって脳脊髄液に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記損傷は末梢神経の損傷であり、前記骨髄幹細胞は、超音波ガイド下局所送達によって末梢神経根に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記外傷性損傷は、脊髄損傷または末梢神経損傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変性損傷は、筋萎縮性側索硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記接着骨髄幹細胞は、前記損傷部位で軸索再生およびミエリン再形成を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記骨髄幹細胞は、臍帯血または骨髄穿刺液に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
約１０４〜約１０７骨髄幹細胞／ｋｇが累積的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記骨髄幹細胞の累積投与量は、２回以上の注射で定期的に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記定期的な注射は月１回行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記骨髄幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ２７１からなる群から選択される１以上のマーカーに対して陽性である細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記骨髄幹細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５に対して陰性である細胞から実質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨髄幹細胞は、ミエリン形成細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞、有髄軸索、および成熟神経細胞からなる群から選択される細胞型を分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨髄幹細胞は、ＮＦ−７０に対して陽性である細胞型を分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨髄幹細胞は、ネスチンを発現させるアストロサイト前駆細胞を分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記骨髄幹細胞は、ＰＤＧＦＲ−αを発現させるオリゴデンドロサイト前駆細胞を分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記骨髄幹細胞は、ＧＦＡＰを発現させるアストロサイト前駆細胞を分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）ポリ−Ｌ−リシン被覆基板上で、骨髄幹細胞の層が前記基板に接着するように、成熟骨髄幹細胞を含む生体試料を培養する；
（ｂ）前記基板から非接着細胞を洗浄し、前記骨髄幹細胞の層を収集する；
（ｃ）接着骨髄幹細胞を製薬上許容される液体に懸濁させる；および
（ｄ）前記骨髄幹細胞の懸濁液を、損傷部位で軸索再生またはミエリン再形成を生じさせるために有効な量で、前記損傷部位の近傍に投与する；
を含む、脊椎動物における神経組織または脳の変性または外傷性損傷を治療する方法。
【請求項１９】
前記生体試料は、臍帯血または骨髄穿刺液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記懸濁液は、前記損傷部位の近傍に、腰椎穿刺を通してくも膜下注射によって脳脊髄液に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
約１０４〜約１０７骨髄幹細胞／ｋｇが累積的に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記骨髄幹細胞の累積投与量は、２回以上の注射で定期的に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記定期的な注射は月１回行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨髄幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＣＤ２７１からなる群から選択される１以上のマーカーに対して陽性である細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記骨髄幹細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５に対して陰性である細胞から実質的になる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記骨髄幹細胞は、ミエリン形成細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞、有髄軸索、および成熟神経細胞からなる群から選択される細胞型を分化させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨髄幹細胞は、ＮＦ−７０に対して陽性である細胞型を分化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記骨髄幹細胞は、ネスチンを発現させるアストロサイト前駆細胞を分化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記骨髄幹細胞は、ＰＤＧＦＲ−αを発現させるオリゴデンドロサイト前駆細胞を分化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記骨髄幹細胞は、ＧＦＡＰを発現させるアストロサイト前駆細胞を分化させる、請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１３−５０８０１３（Ｐ２０１３−５０８０１３Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４１５１（Ｐ２０１２−５３４１５１）
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１０９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４６５７０
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５１２０９９８７３）ザ ユニバーシティ オブ メディスン アンド デンティストリー オブ ニュー ジャージー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１０９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４６５７０
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５１２０９９８７３）ザ ユニバーシティ オブ メディスン アンド デンティストリー オブ ニュー ジャージー (1)
【Ｆターム（参考）】
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