細胞膜透過性ペプチド
本発明は、細胞膜透過性ペプチド、有効成分として細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、細胞膜透過性ペプチドおよび標的物質を含むトランスフェクションキット、膜透過性コンプレックスの製造における細胞膜透過性ペプチドの使用、医薬の製造における膜透過性コンプレックスの使用、および膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与することを特徴とする細胞内部への標的物質の輸送方法、を提供する。本発明の細胞膜透過性ペプチドは以前のTAT由来ペプチドの活性に比べて顕著な透過能を有しており、そのため、該ペプチドは高い効率で薬剤を標的とすることが必要とされる特定の疾病の治療だけでなく、様々な研究分野における細胞内輸送に応用される。それ故に、細胞膜透過性ペプチド、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドおよび本発明の膜透過性コンプレックスを用いた細胞内への標的物質輸送方法は、ドラッグデリバリーシステムとしてとても有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性ペプチド、有効成分として細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、細胞膜透過性ペプチドおよび標的物質を含むトランスフェクションキット、膜透過性コンプレックスの製造における細胞膜透過性ペプチドの使用、医薬の製造における膜透過性コンプレックスの使用、および膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与することを特徴とする細胞内部への標的物質の輸送方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、治療薬剤、ペプチドおよびタンパク質のような高分子をin vitroやin vivoで細胞内に輸送する様々な方法が開発されている。
【０００３】
in vitroの方法には、エレクトロポレーション、リポソームによる膜融合、DNAコーティングマイクロプロジェクタイルによる高速ボンバードメント、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物によるインキュベーション、DEAE−デキストラントランスフェクション、組換えウイルス核酸の注入、および単一細胞へのダイレクトマイクロインジェクションが含まれる。しかし、このような方法は、タンパク質輸送の実用性が極めて制限されている。
【０００４】
in vivoにおける細胞内への高分子の輸送は、スクレープローディング(scrape loading)、リン酸カルシウム共沈法およびリポソーム法により可能となってきた。しかしながら、現在までのこれらの技術は、in vivoでの細胞輸送に対する有用性に限界がみられている。
【０００５】
in vitroおよびin vivoにおける無傷細胞への生物活性タンパクの効率的な輸送の一般的な方法には、リポペプチド（P.Hoffmannら、１９８８）あるいは、ポリリシンやポリアルギニンなどのようなベーシックポリマー（W−C.Chenら、１９７８）の化学的付加が含まれる。
【０００６】
葉酸は輸送担体として用いられてきた（C.P.LeamonとLow、１９９１）。しかしながら、高い信頼性あるいは一般的な有用性が立証されてこなかった。
【０００７】
最近、タンパク質のような高分子を細胞内部に導入する遺伝子治療が脚光をあびているが、これもまた標的ミスという問題を抱えている。別の方法として、タンパク質導入あるいはタンパク療法の研究が活発に進展している。
【０００８】
タンパク質導入ドメイン（PTD）は、精製ヒト免疫不全ウイルス１型（“HIV”）TATタンパクを、培地で培養したヒト細胞へ添加することにより、それが周辺の培地から取り込まれるという報告が最初であった（Greenら、１９８８、Frankelら、１９８８）。この報告の後、ショウジョウバエのホメオティック転写因子、アンテナペディア（Antp）（Joliotら、１９９１）および単純ヘルペスウイルス−１ DNA−結合タンパク、VP２２（Elliotら、１９９７）も同定された。
【０００９】
TAT、AntpおよびVP２２のようなPTDのアミノ酸配列を比べると、アルギニンおよびリジンのような塩基性アミノ酸がほとんどの部分に存在しており（表１）、この配列はマイナス荷電したリン脂質二重層への接近および細胞内部への貫通を可能にする。透過性タンパク質の配列はタンパク質導入ドメイン（PTDs）と名付けられている。
【表１】
【００１０】
特に、組換え発現ベクターはTAT４７−５７の１１のアミノ酸を含むペプチドを用いて開発され、TAT融合タンパク質はTATペプチドを他のペプチドあるいはタンパク質に連結させることにより作製され、そのことによって、全長タンパク質の細胞内区画への導入が、サイズあるいは機能の制限なしで可能となった（ナガハラら、１９８８）。
【００１１】
PTDは、融合タンパク質になるように他のペプチドあるいはタンパク質に連結し得、さらに細胞内部に形質導入しうるので、PTDを用いた治療薬剤、ペプチド、タンパク質などの細胞内部への形質導入が多く試みられた。
【００１２】
最近、塩基性アミノ酸残基を多くは含まないPTDが知られるようになっている。また、へリックス構造により細胞膜のリン脂質二重層を貫通することが報告されている。
【００１３】
TCTP（翻訳により調節される腫瘍タンパク質）は、MacDonaldら（１９９５）により報告されたIgE依存性ヒスタミン放出因子（HRF）として知られているタンパク質である。TCTPは、１９８０年代まで腫瘍特異的タンパク質として知られており、その一群は腫瘍の増殖期に関与すると推定されていた。TCTPは、マウス赤白血病細胞株において、２１kDaの腫瘍タンパク質p２１として報告された（Chitpatimaら、１９８８）。また、エールリッヒ腹水腫瘍の細胞増殖に関与するp２３はTCTP／HRFと同一であることが明らかにされた（Bohmら、１９８９）。
【００１４】
TCTPは腫瘍細胞、特に活発に増殖している腫瘍細胞で頻繁に見られ、細胞質に存在している。それは、１７２のアミノ酸から成る既知のタンパク質−（NCBI登録#P１３６９３（Homo sapiens））であり、種間において高い相同性を示す。そのC末端の４５のアミノ酸は塩基性ドメインを形成する。そのようなドメインは微小管結合タンパク質のMAP−１Bと約４６％の相同性を有していることから、HRFは微小管結合タンパク質であるとも推定された。Gachetら（１９９７）は、HRFが細胞骨格系に沿ってある程度一貫して分布していることを、共焦点顕微鏡を用いて見いだし、そのことはHRFが細胞骨格に結合することを示唆している。
【００１５】
TCTP発現はmRNAが通常レベルに維持されていることにより特徴づけられるが、血清の存在のような外部刺激がある場合は、ポリソームに変化して翻訳される。その特徴により、‘翻訳により調節される腫瘍タンパク質（TCTP）’（Thomasら、１９８１； ThomasとThomas、１９８６）と名付けられた。また、TCTP mRNAは翻訳中に抑制されるが、そのとき細胞分裂シグナルを受け、活性化されてタンパク質に翻訳されることも報告された（ThomasとThomas、１９８６）。
【００１６】
TCTP／HRFは好塩基球あるいはマスト細胞と相互作用をもつヒスタミン放出物質と考えられており、アレルギー炎症反応に関与している。
【００１７】
MacDonaldら（１９９５）はまた、HRFは細胞内タンパク質であるが、細胞外のHRFはIgE感作好塩基球を刺激してヒスタミンを放出させる（Schroederら、１９９６）ことを見いだした。Schroederら（１９９７）は、HRFは、IgEの非存在に関係なく、全ての好塩基球から放出される抗IgE誘導ヒスタミンを増強しうることを見いだし、それにより、HRFはIgEとの結合ではなく細胞膜受容体への結合によりその機能を発揮することを示唆した。
【００１８】
本発明者らは、TCTP／HRFが（Na，K）ATPアーゼのサブユニットの第３細胞質ドメイン（CD３）と相互作用し、それにより（Na，K）ATPアーゼの活性を抑制していることを以前に報告した（韓国特許出願No.１０−２００１−００２７８９６に示されるように）（Jungら、２００４）。
【００１９】
同時に本発明者らは、TCTP／HRFが細胞膜を透過しうることを報告する。TCTP／HRFのアミノ酸配列には、典型的なPTDの特徴である、十分な量の塩基性アミノ酸（アルギニンあるいはリジン）から成る部分や他のPTDのそれに類似するアミノ酸配列がないため、本発明者らは、TCTPはタンパク質の構造の面で他の既知のPTDと異なっているドメインを有すると考えた。
【００２０】
TCTPの全体構造において、ＮおよびＣ末端は緩んで露呈しており、中間部分は球状を形作っている。
【００２１】
第３に構造の予測については、３つのへリックスがあり、ここで第１へリックス（H１）はとても短く、第２へリックス（H２）および第３へリックス（H３）は外部に露呈している。シゾサッカロミセス・ポンベにおけるTCTPのH２およびH３構造では、塩基性アミノ酸はへリックスの外側に分布しており（Thawら、２００１）、それゆえにH２およびH３はタンパク導入能に関与すると推測された。しかしながら、試験結果によると、このへリックス部分は輸送とは無関係であった。
【００２２】
従って、TCTP／HRFにおけるタンパク導入機能を有するアミノ酸配列を同定すれば、新しいタイプのPTDの発見だけでなく、新しいドラッグデリバリーシステムの確立（もっとも、これらを用いた新規のベクター開発であるけれども）を可能にしうる。
【００２３】
本発明者らはTCTPにおけるPTDの探索に絶え間ない努力をした結果、周知のPTDとは全く異なるアミノ酸から成るタンパク質導入ドメインを特定した。この結果に基づいて、本発明者らは、このドメインが周知のPTDよりも顕著に高い細胞透過能を示すことを確認することにより本発明を確立した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
（技術的課題）
本発明のひとつの目的は、細胞膜透過性ペプチド、有効な要素としての細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性コンプレックス、細胞膜透過性ペプチドとその標的物質を含むトランスフェクションキット、膜透過性コンプレックスの製造における細胞膜透過性ペプチドの使用、医薬の製造における膜透過性コンプレックスの使用、および膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性コンプレックスを標的に投与することを含む細胞内部への標的物質の輸送方法、を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
（技術的解決法）
本発明は、以下のアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドを提供する。:
R１−R２−R３−R４−R５−R６−R７−R８−R９−R１０
【００２６】
上記の式中、
R１は、欠失しうるか、またはM、A、Q、C、F、LあるいはWから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R２は、欠失しうるか、またはIあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R３は、IあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R４は、Y、A、F、SあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R５は、R、AあるいはKから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R６は、D、A、IあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R７は、欠失しうるか、またはL、K、A、EあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R８は、欠失しうるか、またはI、KあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R９は、欠失しうるか、またはA、S、E、YあるいはTから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R１０は、欠失しうるか、またはA、H、KあるいはEから選択されるひとつのアミノ酸であり、そしてR１０がKあるいはHであるときは、K、KK、R、RRあるいはHHから選択されるアミノ酸が付加していてもよい。
【００２７】
本発明の一態様において、そのアミノ酸配列は配列番号１である。
【００２８】
本発明の一態様において、そのアミノ酸配列は配列番号２−７である。
【００２９】
また、本発明の一態様において、そのアミノ酸配列は配列番号２のひとつのアミノ酸がアラニンと置き換わりうる。例えば、その上記のアミノ酸配列は配列番号８−１６、特に配列番号１３から選択されるひとつのアミノ酸配列である。
【００３０】
さらに、本発明の一態様において、そのアミノ酸配列は配列番号２０−５４から選択されるひとつのアミノ酸配列でありうる。例えば、その上記配列は配列番号２２、２６、２７あるいは配列番号３１−５４から選択されるひとつのアミノ酸配列である。
【００３１】
本発明において、'細胞膜透過タンパク質ドメイン'は、原形質膜を通して細胞内部（細胞質、細胞核）にまで透過する機能を持つタンパク質配列を意味する。
【００３２】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、周知のTAT、VP２２およびAntp PTDs（タンパク質導入ドメイン）と配列の類似性を有しない新規の細胞膜透過タンパク質ドメインである。
【００３３】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号２−７から選択されるひとつのアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドを提供する。
【００３４】
本発明の一実施例によると、配列番号１、２、３あるいは４のアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドは、標準的なTATと比べて非常に優れた細胞透過能を示しており、細胞内透過能は、処理濃度が高くインキュベーション時間も長くなると急速な増加様態を示す。
【００３５】
詳しくは、細胞透過能をTCTPの１番から１０番［TCTP（１−１０）、配列番号１］残基を用いて測定した場合、TCTP（１−１０）の細胞透過能はTATの場合に比べて、５０μMで１５分処理したときは３倍を超える活性、１００μMで１５分処理したときは６倍の活性を示す。２時間処理した場合、TCTP（１−１０）の濃度が５０μMおよび１００μMのときの細胞透過能はそれぞれ、TATの場合の約２９倍および３０倍高かった。
【００３６】
また、１５分処理の場合に比べて、２時間インキュベートにおいては細胞透過能が増加する傾向を示した。
【００３７】
さらに、TCTP（１−９）（配列番号２）、TCTP（１−８）（配列番号３）あるいはTCTP（２−１０）（配列番号４）のアミノ酸残基を含むペプチドは、周知のTAT（４７−５８）より優れた透過能を示した。そのうち、細胞透過能はTCTP（１−１０）（配列番号１）、TCTP（１−９）（配列番号２）、TCTP（１−８）（配列番号３）およびTCTP（２−１０）（配列番号４）の順に優れており、TCTPの１番目のアミノ酸が存在しているときに、細胞透過能はさらに優れていた。
【００３８】
ペプチドの長さは、この技術分野における細胞膜透過タンパク質ドメインの一般的な長さとして、望ましくは９−１５残基の範囲、より望ましくは９−１０残基の範囲で変化しうる。
【００３９】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、人工合成、あるいはTCTPからTCTP（１−１０）（配列番号１）、TCTP（１−９）（配列番号２）、TCTP（１−８）（配列番号３）あるいはTCTP（２−１０）（配列番号４）の配列を単離することで作られうる。
【００４０】
本発明のペプチドの合成は、例えば、機器あるいは遺伝子工学を用いて実施されうる。
【００４１】
機器を用いた合成の場合、自動ペプチド合成機（PeptrEX−R４８、ペプトロン）でFmoc固相法を用いて合成されうる。樹脂から合成されたペプチドを精製した後、該ペプチドは、資生堂カプセルパックＣ１８（Shiseido capcell pak C１８）分析用RPカラムを用いた逆相HPLC（Prominence LC−２０AB、島津、日本）により精製および解析されうる。合成が完了した後、該ペプチドは、質量分析計（HP １１００ Series LC／MSD、ヒューレット・パッカード、Roseville、USA）により同定されうる。
【００４２】
遺伝子工学による単離の場合、目的のペプチドに相当する核酸配列がタンパク質発現の組換えベクターに導入され、ついで、ペプチドコード領域の発現がBL２１（λDE３）あるいはBL２１（λDE３）pLysのようなプロテアーゼ欠損大腸菌においてIPTGにより誘導され、該ペプチドが精製される。
【００４３】
本発明はまた、配列番号８−１６のアミノ酸配列から成る、細胞膜透過性ペプチドを提供する。
【００４４】
本発明の一実施例によると、配列番号２の一つのアミノ酸がアラニン、第６残基のアラニン置換体、アスパラギン酸（配列番号１３）に置換しているアミノ酸配列では、１０μMの低濃度において、WT（野生型）ペプチドよりも２.５倍増大した透過能を示し、また第５および第７−９残基（R、L、I、S）（配列番号１２、１４−１６）のアラニン置換体はわずかな減衰を示したが、まだ活性を示していた。第１−第４残基（M、I、I、Y）（配列番号８−１１）のアラニン置換体の活性は急激に減少したが、WTペプチド様機能は維持していた。従って、本発明の細胞膜透過性ペプチドは、配列番号８−１６から選択される一つのアミノ酸配列から成るペプチドを含む。
【００４５】
本発明はまた、配列番号２２、２６、２７、あるいは３１−５４から選択される一つのアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドを提供する。
【００４６】
本発明の一実施例において、配列番号２０−３０のペプチドは、配列番号１における１以上のアミノ酸の欠損、置換あるいは付加により作られた。その結果、配列番号２２、２６あるいは２７から成るペプチドはTAT（１００μM）よりも良好な透過能を示した。これらの透過データに基づいて、配列番号３１−４５のペプチドは繰り返し合成され、これら全てのペプチドは１０μMにおいてTATよりも良好な透過能を示した。上記のデータに基づいて、配列番号４６−５４のペプチドを配列番号１の様々な変異型として作製し、細胞透過能を測定した。その結果、配列番号４９のペプチドはTATに比べて非常に優れた活性を有し、配列番号４６−５４のペプチドは、TATと比べて同等以上の活性を示し、TCTP（１−１０）（配列番号１）に比べて非常に優れた活性を示した。従って、本発明の細胞膜透過性ペプチドは、配列番号２２、２６、２７および３１−５４から成るペプチドを含む。
【００４７】
ペプチドの長さは、この技術分野における細胞膜透過タンパク質ドメインの一般的な長さとして、好ましくは５−１５残基、そしてより好ましくは８−１０残基の範囲内で変化しうる。
【００４８】
本発明のペプチドは、人工合成あるいはTCTP（１−１０）（配列番号１）、TCTP（１−９）（配列番号２）、TCTP（１−８）（配列番号３）あるいはTCTP（２−１０）（配列番号４）の配列の単離、およびこれらの配列の修飾により作製される。
【００４９】
該ペプチドの合成は、上記と同一の合成方法により行われる。
【００５０】
本発明はまた、有効成分として細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体を提供する。該細胞膜透過性ペプチドは、原形質膜を通して標的物質を輸送する膜透過性担体としての使用を提供する。
【００５１】
さらに、本発明は標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを提供する。
【００５２】
本発明における'標的物質'という用語は、生理活性の制御に関与し、薬理作用をもたらし、あるいは細胞内区画における生物活性を維持しうる分子を意味する。
【００５３】
本発明の標的物質は、例えば、非タンパク質性分子として、DNAおよびRNAを含む核酸、薬剤のような化合物、炭水化物、脂質あるいは糖脂質などを含み、タンパク質性分子として酵素、制御因子、成長因子、抗体、細胞骨格要素を含みうる。
【００５４】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは結合や融合状態において、物理的／化学的な共有結合あるいは非共有結合により、あるいはメディエーターにより、１以上の標的物質と結合しうる。
【００５５】
詳細には、標的物質が非タンパク質性分子である場合、本発明の細胞膜透過性ペプチドは共有結合により標的物質と結合し、該複合体は標的細胞グループに接触しうる。別の例では、該標的物質は本発明の細胞膜透過性ペプチドと非共有結合しうる。例えば、標的物質が核酸である場合、脂質ベースの担体タイプでは、本発明の細胞膜透過性ペプチドと結合し、標的細胞グループに接触しうる。
【００５６】
標的物質がタンパク質である場合、本発明の細胞膜透過性ペプチドと結合した融合タンパク質は、PCRおよびベクターを用いたcDNAクローニングを経て、該タンパク質（該標的物質）のcDNAを得ることにより作製される。それが不可能ならば、該タンパク質は化学的に融合される。例えば、融合タンパク質は、標的物質をリンカーに結合させ、ついで細胞膜透過性ペプチドと反応させてリンケージを形成することにより作製される。
【００５７】
特に、該標的物質がタンパク質である場合は、該複合体は融合タンパク質の形で透過される。この場合、本発明の細胞透過性コンプレックスは、以下のように作製される。
【００５８】
はじめに、細胞膜透過性ペプチド−標的物質複合体をコードする融合遺伝子を作るために組換え発現ベクターを作製する。
【００５９】
上記融合タンパク質をコードする核酸は、細胞膜透過性ペプチドをコードする該核酸配列および標的物質のようなタンパク質をコードする該核酸配列を含む。例えば、これらの核酸配列は、配列番号１７−１８あるいは５５−８１から成る配列を含みうる。
【００６０】
配列番号１７−１８あるいは５５−８１の核酸配列は以下のとおりである。
【表２】
【００６１】
一つのアミノ酸をコードするコドンはいくつかあるので、本発明のペプチドをコードする核酸配列は、上記の表に掲載された核酸配列の他に本発明のペプチドをコードする全ての核酸配列を含む。
【００６２】
本発明の組換え発現ベクターは、発現の汎用プロモーター、終結因子、選択マーカー、レポーター遺伝子、タグ配列、制限酵素認識サイト、マルチクローニングサイトなどを含みうる。
【００６３】
本発明の組換え発現ベクターを用いた宿主へのトランスフェクション方法は、この分野では既知の、熱ショックあるいはエレクトロポレーションなどである。
【００６４】
上記のようにトランスフェクトされた宿主細胞において、適切な条件の下で融合タンパク質が発現されると、細胞膜透過性ペプチドおよび標的物質のようなタンパク質から成る融合タンパク質はその分野で既知の従来の方法により精製される。
【００６５】
さらに、本発明は、細胞膜透過性ペプチドおよび該標的物質を含むトランスフェクションキットを提供する。トランスフェクションキットは、DNA／RNAをほ乳類細胞の細胞内区画に容易に導入するために最適化された方法である。これまでにカルシウム−リン酸塩法、脂質複合体あるいはデキストラン錯体を用いた方法があるが、これらの方法の効率は１／１０６から１／１０２であり、また細胞のタイプに依存するという制限がある。これらの制限を克服するために、該細胞膜透過性ペプチドを用いたトランスフェクションキットが有用となりうる。
【００６６】
本発明の該トランスフェクションキットはさらに、標的物質とペプチドを結合する結合因子を含みうる。該結合因子は、転写因子、ウイルスタンパク質、あるいは標的物質を結合しうるタンパク質の全体または一部、を含む特異的DNA／RNA配列を意味する。例えば、Gal４はDNA結合因子である。Gal４は、真核生物、原核生物およびウイルスで広く発現している転写因子である。DNA／RNA結合因子は、in vivoおよびin vitroで、PTDsおよび融合タンパク質の発現するベクターにより用いられうる。また、DNA／RNA結合因子とPTD間の結合は、化学的相互作用、物理的相互作用あるいは非共有相互作用により成し遂げられる。
【００６７】
本発明の細胞膜透過性ペプチドとDNA／RNA間のが融合複合体が細胞外部で処理されれば、効率および細胞タイプに依存した制限の両者を克服する。本発明の細胞膜透過性ペプチドおよびDNA／RNA結合因子の両者を用いることで、DNA／RNAをさまざまな細胞の細胞質および核に導入することが可能である。特に、導入方法は、筋肉内、腹腔内、静脈内、口腔内、皮下、皮内、鼻腔内への導入および吸入を含む様々な経路で成し遂げられる。
【００６８】
さらに、標的物質は、タンパク質、脂質、炭水化物あるいは化学物質から成るグループから選択される１以上の生体調節物質を含み、また本発明のトランスフェクションキットは、in vivoおよびin vitroにおいて様々な細胞の細胞質および核に上記標的物質を導入しうる。PTDと標的物質間の融合は、化学的、物理的共有相互作用あるいは非共有相互作用により成し遂げられる。
【００６９】
本発明のトランスフェクションキットは、本発明の方法により遺伝子治療およびDNA／RNAワクチンに関する新しい技術を提供し、一時的あるいは恒久的に開示され、基礎的研究だけでく、遺伝子治療およびDNA／RNAワクチンのような臨床応用に用いられうる。
【００７０】
また、本発明は、膜透過性コンプレックスの製造における細胞膜透過性ペプチドの使用、および、細胞膜透過性ペプチドと標的物質の結合による膜透過性コンプレックスの作製方法を提供する。
【００７１】
さらに、本発明は、医薬の製造における標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドを含む該膜透過性コンプレックスの使用、および、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスと医薬的に許容できる担体とを混合する、医薬の製造方法を提供する。医薬的に許容できる担体は当業者によく知られており、当業者は生体への導入に適した医薬的に許容できる担体の選択と使用が可能である。
【００７２】
さらに、本発明は、膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与することを特徴とする細胞内部への標的物質の輸送方法、を提供する。
【００７３】
標的物質が、本発明の細胞膜透過性ペプチドに共有的に結合しうる、非タンパク質性分子であるならば、該複合体は標的細胞グループに接触しうる。別の例においては、該標的物質は本発明の細胞膜透過性ペプチドに非共有的に結合し、例えば、該標的物質が核酸ならば、該複合体は本発明の細胞膜透過性ペプチドと結合した脂質ベースの担体形態の標的細胞グループに接触しうる。
【００７４】
該‘対象’はヒトを含むほ乳類である。該膜透過性コンプレックスは、筋肉内、腹腔内、静脈内、口腔内、皮下、皮内、粘膜投与および吸入を含む様々な経路により投与される。
【００７５】
標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスの投与量は、標的物質およびペプチドの透過能が治療効果を有する量に従って変化し、それ故に特定の用量に制限されない。ただし、例えば、標的物質が核酸であるなら、標的物質の投与量は１０〜１０００μg／kgで、本発明のペプチドの投与量は０.１mg−１０mg／kgである。
【００７６】
さらに、本発明は、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与して標的物質を細胞内に導入することによる、関連疾病の治療方法を提供する。
【００７７】
治療が望まれる疾病の種類は、細胞内部への投与用の該標的物質に依存して変化しうる。
【００７８】
該‘対象’はヒトを含むほ乳類である。該膜透過性コンプレックスは、筋肉内、腹腔内、静脈内、口腔内、皮下、皮内、粘膜投与および吸入を含む様々な経路により投与される。
【００７９】
また、本発明は細胞膜透過性ペプチドをコードする核酸配列を提供する。例えば、本発明は、配列番号１、２、２２、２６、２７あるいは３１−５４から選択されるアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドをコードする核酸を提供する。
【００８０】
該核酸は、DNAあるいは一本鎖あるいは二本鎖のRNAであり、人工合成あるいは生物由来のTCTP遺伝子から単離することにより作製される。例えば、配列番号１、２、２２、２６、２７あるいは３１−５４から成るペプチドをコードする核酸は各々、配列番号１７−１８、あるいは５５−８１の核酸配列に相当する。
【００８１】
ひとつのアミノ酸をコードするコドンはいくつかあるので、本発明のペプチドをコードする核酸配列は、本発明のペプチドをコードする全ての核酸配列を含み、上記の表に記載された核酸配列に限定されない。例えば、アミノ酸配列のアラニンをコードする配列はgca、gcc、gcgあるいはgctである。
【００８２】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、TAT由来のペプチドに比べて輸送において顕著な効果を有する。従って、本発明の細胞膜透過性ペプチド、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、および膜透過性コンプレックスを用いた細胞内への標的物質輸送方法は、高い効率で薬剤を標的に向けることが要求される特定の疾病の治療だけでなく、様々な研究分野における細胞内輸送に応用される。それ故に、本発明の細胞膜透過性ペプチド、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、および膜透過性コンプレックスを用いた細胞内への標的物質輸送方法は、ドラッグデリバリーシステムとしてとても有用である。
【００８３】
ここに記載された発明は、より十分に理解されうるように、以下の実施例を示す。これらの実施例はただの例示であり、どんな方法によっても、この発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【発明の効果】
【００８４】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、TAT由来ペプチドの活性に比べて顕著な透過能を有しており、それ故に該ペプチドは、高い効率で薬剤を標的とする必要のある特定の疾病の治療だけでなく、様々な研究分野における細胞内輸送に応用されている。 それ故に、本発明の細胞膜透過性ペプチド、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、および膜透過性コンプレックスを用いた細胞内への標的物質輸送方法は、ドラッグデリバリーシステムとしてとても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
（実施例１）TCTPの様々な欠損型によるPTDのマッピング
【００８６】
PTDのように機能するTCTPの領域を確かめるために、様々な欠損型が作製され、ついで以下のような実験に用いられた。
【００８７】
１）欠損型TCTPの単離および精製
それぞれの欠損型TCTP（図１aおよび１c）が過剰発現するように、標識しうる６つのヒスチジンであるpRSETベクターが用いられた。TCTPのそれぞれの欠損型に相当するDNA配列のサブ・クローニングがベクターのマルチクローニングサイトで実施された。その後、該組換え発現ベクターは、E.coli BL２１（DE３）（Novagen）あるいはBL２１（DE３）pLysS（Novagen）に導入された。欠損型TCTPの発現はIPTG（isopropyl β−D−thiogalactoside）により３時間誘導され、その後、タンパク質は、ポリヒスチジンと結合するニッケルカラムを用いて単離、精製された。
【００８８】
２）細胞培養およびタンパクによる処理
BEAS−２B細胞は、１５μg／mlの濃度で１時間あるいは２４時間、欠損型TCTPの処理を施された。その後、上澄みと細胞溶解物が得られ、抗TCTP抗体によるウエスタンブロッティングを行った（図１b）。
【００８９】
図１bに示されるように、１時間の培養後の細胞上清には全長TCTPが存在した（レーン１）が、このタンパク質は２４時間後（レーン６）には消失した。また、C末端のないDel−C１１２HRFを含む細胞上清において、該タンパク質は２４時間後に消失した（レーン９）。一方、残りのN末端のない欠損型のTCTP、Del−N１１、N３５およびN３９C１１０HRFは２４時間後の細胞上清にまだ存在していた（レーン７、８、１０）。
【００９０】
それ故に、TCTPのPDTはＮ末端に存在することを知り得た。特に、Del−N１１HRFは２４時間後に細胞上清にまだ存在していたことから（レーン７）、TCTP１−１０はPDTのような役割を果たすと思われる。
【００９１】
さらに、本発明のTCTPタンパク質が、５分あるいは３０分という短時間で細胞内部に輸送されうるかどうかが調べられた。該実験は上記と同じ方法で実施された（図１d）。
【００９２】
図１dに示すように、HRFのN末端を有するDel−C３８HRFは、３０分後に上清では認められなかった（レーン４）が一方、これらのタンパク質は、５分後（レーン１）および３０分後（レーン４）に細胞溶解物で認められた。
【００９３】
従って、本発明のTCTPタンパク質を含むN末端はたった数分から数十分という短時間で細胞内部に輸送されうる。
【００９４】
（実施例２）本発明のペプチドの細胞透過能の確認
【００９５】
実施例１に示すように、TCTPのN末端がPTDのような機能をもつことを確かめるために、TCTPのN末端から成る該ペプチドを構築し、細胞透過能を調べた。
【００９６】
１）TCTPのN末端アミノ酸に相当する様々なペプチドの合成
TCTP由来ペプチドおよび対照ペプチド、TAT４８−５７を以下のように合成した。
【表３】
【００９７】
各ペプチドのN末端は蛍光染料ローダミンで標識し、C末端は保護した。HPLCによりペプチド純度（＞９５％）が決定された。ペプチドの合成はペプトロン社（PEPTRON，Inc）に依頼した。
【００９８】
ネガティブコントロールは蛍光染料、ローダミン（分子プローブ）が全てのペプチドの標識に用いられた。
【００９９】
２）細胞培養およびペプチドのインキュベーション
ヒーラ細胞株（ATCC）を、１０％FBS（GIBCO）および１００units／mLペニシリン−ストレプトマイシンを添加したDMEM（GIBCO）で培養した。細胞は、５％CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１００】
ヒーラ細胞を、実験の日の前に７０〜８０％成熟するまで４８−wellプレートで培養した。該細胞を３７℃のDMEMで2回洗浄し、実施例２−１）で合成したTCTP由来ペプチドを用量依存的方法で（０、１、５、１０、５０、１００μM）培地に処理し、ついで該細胞を１５分間あるいは２時間、CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１０１】
培養後、細胞を冷たいPBSで3回洗浄し、細胞内取り込みマーカーのローダミンの測定のために、蛍光マイクロプレートリーダー（BIO−TEK instruments，Inc.，Vermont，USA）を用いて、蛍光波長（emission）５３０nmおよび最大励起（excitation）５９０nmで、直ちに測定した。リーダーの感度は基本モードとして１００に設定したが、蛍光シグナルが強すぎる場合には７５まで下げた。全ての実験は、再現性確認のため３回繰り返して公正に実施した（図２および図３）。
【０１０２】
図２および図３に示すように、TAT、コントロールペプチドは、用量と時間に依存した既知の方法で、細胞内に形質導入した。
【０１０３】
本発明のTCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）ペプチドは、１−１０μMではなく５０−１００μMにおいて、１５分（図２）あるいは２時間（図３）で輸送された。５０−１００μMにおいては、細胞内輸送がとても高いことが認められ、特に２時間処理後には蛍光が強すぎて検出できなかったため、リーダーの感度を７５に下げた。
【０１０４】
図３において、TCTP（１−１０）ペプチド濃度が５０μMと１００μMの間で、２時間処理における輸送能に差はないという事実から判断すると、TCTP（１−１０）ペプチドは５０μMで飽和状態にあると思われた。一方、TAT（４８−５７）ペプチドは、１μM以上で飽和状態にあった。
【０１０５】
TCTP（２−１０）ペプチドは１μMから１０μMの濃度では輸送がなされなかったが、このペプチドを１００μMで１５分処理した後においては、より効率的に輸送された。２時間後、このペプチドは、コントロールペプチド、TAT（４８−５７）、と同様の細胞膜透過能を有し、１００μMではコントロールペプチドよりも効率的に輸送された。
【０１０６】
そのように、本発明のTCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）および（２−１０）細胞膜透過性ペプチドは、それらの輸送効率において、よく知られたPTD、TATよりも優れた能力を有していることが確認できた。
【０１０７】
TCTP由来ペプチドについて、高濃度での輸送能力の急増が示されてきており、これらの結果は輸送メカニズムの違いによって引き起こされるのかもしれない。
【０１０８】
その結果、本発明のTCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）および（２−１０）細胞膜透過性ペプチドはそれらの輸送効率において、よく知られたPTD、TATよりも優れた能力を有していることが確認できた。これらのペプチドの中から、輸送効率はTCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）そして（２−１０）ペプチドの順で優れており、TCTP N末端のメチオニン（第１アミノ酸残基）の存在が重要であった。
【０１０９】
（実施例３）蛍光顕微鏡によるTCTP由来ペプチドの細胞内輸送の同定
【０１１０】
該ペプチドの細胞内輸送は蛍光顕微鏡により同定された。
【０１１１】
ヒーラ細胞は、実施例２−２）と同一の方法により、１０μMおよび１００μMの濃度でTCTP（１−９）（配列番号２）処理された。相違点は、プラスチックプレートは蛍光を阻害する特性を持っていたために、ヒーラ細胞をガラスで覆われた１２wellプレートに播種した点であった。洗浄後、細胞をスライドグラスに載せカバーグラスで覆い、観察した（図４）。
【０１１２】
図４に示すように、本発明のペプチドは、１０μMの低濃度では弱い輸送能であり、１００μMの高濃度では強い輸送能であった。該ペプチドは細胞質および細胞の核に広く分布していることを見い出した。
【０１１３】
（実施例４）ペプチド置換体の細胞内輸送の同定
【０１１４】
本ペプチドの置換体がPTDのような機能をしうることを確かめるために、該ペプチドの置換体を構築し、細胞透過能を調べた。
【０１１５】
１）ペプチド置換体の構築
TCTP（１−９）（配列番号２）とアラニンの連続置換は以下のように合成された。
【表４】
【０１１６】
各ペプチドのN末端は蛍光染料ローダミンで標識し、C末端は保護した。HPLCによりペプチド純度（＞９５％）を決定した。ペプチドの合成はペプトロン社（PEPTRON，Inc）に依頼した。
【０１１７】
２）細胞培養およびペプチドのインキュベーション
ヒーラ細胞株は、１０％FBSおよび１００units／mLペニシリン−ストレプトマイシンを添加したDMEMで培養増殖させた。細胞は、５％CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１１８】
ヒーラ細胞を、実験の日の前に７０〜８０％成熟するまで４８−wellプレートで培養した。該細胞を３７℃のDMEMで2回洗浄し、実施例４−１）で合成したTCTP由来ペプチドを用量依存的方法（０、１、１０、１００μM）で培地に処理し、ついで該細胞を１５分間あるいは２時間、CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１１９】
培養後、細胞を冷たいPBSで3回洗浄し、細胞内取り込みマーカーのローダミンの測定のために、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、蛍光波長（emission）５３０nmおよび最大励起（excitation）５９０nmで、直ちに測定した。リーダーの感度は基本モードとして１００に設定したが、蛍光シグナルが強すぎる場合には７５まで下げた。全ての実験は、再現性確認のため３回繰り返して公正に実施した（図５および図６）。
【０１２０】
図５に示すように、１００μMでのTCTP（１−９）の蛍光強度を１００％としたとき、取り込みにおける最大の減少を示す該アラニン置換体は、TCTP（１−９）（各配列番号８、９、１０、１１）のアミノ酸残基１、２、３、４（各々M、I、I、Y）に対するアラニン置換体であり、８０−９０パーセント減であった。
【０１２１】
一方、TCTP（１−９）（各配列番号１２、１３、１４、１５、１６）のアミノ酸残基５、６、７、８、９（各々R、D、L、I、S）に対するアラニン置換体は取り込みが約５０パーセント減少したが、我々はこれらのペプチドはまだ輸送能力を維持していると判断した。従って、TCTPのN末端の４つのアミノ酸（M、I、I、Y）は細胞透過能に必要であるとわかった。
【０１２２】
その一方で、KC４プレートリーダーの感度の設定を７５に下げると、１あるいは１０μMの比較的低濃度における細胞透過能の結果が分析できなかったため、リーダーの感度は１００に固定した（図６）。このとき、１００μMでの蛍光強度は非常に強かったため、同じグラフに表示できなかった。
【０１２３】
図６に示すように、１０μMでのTCTP（１−９）の蛍光強度を１としたとき、アミノ酸残基６番目、TCTP（１−９）（配列番号１３）のアスパラギン酸、のアラニン置換体は、天然ペプチド、TCTP（１−９）、よりも２.５倍高い透過能を有していた。アスパラギン酸は、負電荷のアミノ酸で、TCTP（１−９）で負電荷を持つ唯一の残基である。従って、負電荷のアミノ酸は、TCTPの細胞透過能を減少させると考えられた。
【０１２４】
TCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）、（２−１０）の天然ペプチドは高濃度で効率的に輸送されたが、これらのペプチドは、１μMおよび１０μM（実施例２）の比較的低濃度においては、コントロールペプチド、TATよりも低い効率であった。しかしながら、上記の結果から、第６残基の欠失、付加あるいは置換の類似体は、低濃度で非常に優れた透過能を有することが示された。
【０１２５】
上記の全ての結果から、TCTPのＮ末端上の４つのアミノ酸（M、I、I、Y）は細胞透過能において不可欠な役割を果たし、特に第６残基、アスパラギン酸のアラニン置換体は、低濃度（１０μM）での細胞透過能を急激に増加させる。このとき、透過能が低濃度では増加するが高濃度で減少するのは、疎水性であるアラニン置換体の難溶解性によるものと推測した。
【０１２６】
（実施例５）突然変異ペプチドの細胞透過能
【０１２７】
実施例４に示すように、本発明の置換体ペプチドは細胞膜透過能を有していることが確認された。そこで、本ペプチドの突然変異体が透過能を持つことを確認するために、突然変異ペプチドの輸送効率を調べた。
【０１２８】
１）突然変異ペプチドの構築
実施例４の結果から、様々な突然変異ペプチドがTCTP（１−１０）（配列番号１）のフレームで構築された。
【表５】
【０１２９】
各ペプチドのN末端は蛍光染料FITCで標識し、C末端は保護した。HPLCによりペプチド純度（＞９５％）を決定した。本発明のペプチドの合成はペプトロン社（PEPTRON，Inc）に依頼した。
【０１３０】
２）細胞培養およびペプチドのインキュベーション
ヒーラ細胞株は、１０％FBSおよび１００units／mLペニシリン−ストレプトマイシンを添加したDMEMで培養増殖した。細胞は、５％CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１３１】
ヒーラ細胞を、実験の日の前に７０〜８０％成熟するまで６−wellプレートで培養した。該細胞を３７℃のDMEMで2回洗浄し、実施例５−１）で合成したTCTP由来ペプチドを用量依存的方法（０、１、１０、１００μM）で培地に処理し、ついで該細胞を２時間、CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１３２】
培養後、細胞を冷たいPBSで２回洗浄し、１mg／mlトリプシンにより３７℃で１５分処理して細胞膜に付着しているペプチドを消化し、再度PBSで2回洗浄した。その後、該細胞を、細胞内取り込みマーカーのFITCを測定するために、FACSを用いて、蛍光波長（emission）５１０nmおよび最大励起（excitation）５３０nmで分析した（図７、８および９）。突然変異ペプチド、TCTP−CPP#１−３５（配列番号２０−５４）の細胞内輸送能を、野生型（WT）、TCTP（１−１０）（配列番号１）およびコントロールペプチド、TAT（４８−５７）と比較した。
【０１３３】
３）ペプチド変異体と細胞透過能の関係
突然変異ペプチドを設計する場合、各ポジションの残基はアラニン置換のように全２０のアミノ酸で置換されうるが、変化後の他の隣接するアミノ酸の完全ペプチドの電荷および等電点もまた考慮されなければならないので、これは全てのペプチドの中から最も効果的な突然変異を探し出すのに効率的でない。従って、我々は、初期の変化後に推定される結果に基づいて新たな改良を試み、決定的な役割を担うアミノ酸を検証するために新たな変異体ペプチドを設計した。新しい突然変異ペプチドおよび配列は実施例５−１）の表にまとめた。各１０の野生型（WT）（配列番号１）アミノ酸にIからX（N末端から）まで番号を付けることで、突然変異ポジションを簡単に説明できるようにした。溶解性および細胞膜に対するWTの結合能を増大させるために（ポリアルギニンおよびポリリシンの使用と同じ理由で）、ポジションWT−Xでのリジン置換、および、同じポジション（配列番号２０）でのリジンの同時付加、WT−VII，VIII（配列番号２１）のポジションでの２つのリジン置換、WT（配列番号２６）（配列番号２７）への２つのリジン付加を行った。これらの変異体のうち配列番号２６および配列番号２７のみが細胞透過能を増大した。平均蛍光強度（MFI）の比較と分析の結果によると、濃度１０μMにおけるWTのMFIを１とした場合、TAT、配列番号２６および配列番号２７は、濃度１０μMにおいてはWTより、各々６.１倍、６.０４倍、１.７３倍高く、１００μMの濃度においてはWTより、各々９４.７５倍、１４４.６倍、３４２.９倍細胞透過能が高かった。それ故に、WTのC末端に２つのリジンを付加した全１２のアミノ酸の変異体ペプチドは、続いて設計された変異体ペプチド（配列番号３１から）において維持し、リジンよりも他の塩基性アミノ酸との置換および塩基性アミノ酸の数の変化を調べた（配列番号４８−５２）。その結果、C末端における１あるいは２の塩基性アミノ酸の付加がWTよりも高い効率を示した。
【０１３４】
ポジションWT−Iにおけるメチオニンの硫黄の役割を分析するために、メチオニン（M）をグルタミン（Q）あるいはシステイン（C）（配列番号２３および配列番号２４−２５との比較）に置換した。その結果、硫黄は決定的な役割を担ってはいなかったことから、メチオニンの疎水性の役割を調べるために、メチオニンをフェニルアラニン（F）、ロイシン（L）あるいはトリプトファン（W）（配列番号３１および配列番号３４−３６との比較、配列番号３２および配列番号３８との比較、配列番号３３および配列番号３７との比較、配列番号３９および配列番号４０との比較、配列番号４１および配列番号４２との比較、配列番号４３および配列番号４４との比較、配列番号４６配列番号４７との比較）により置換した。その結果、配列番号３７、３８および３９の細胞透過能は、１００μMの濃度において配列番号３４より低かったが、１０μMの濃度においてはWTよりもそれぞれ５２.０倍、５５.６倍および２５.０倍高かったことから、これらのペプチドは、配列番号３１（WTより２９倍高い）と比べて非常に優れた効率を有していた。配列番号３８と配列番号３２の比較および配列番号３７と配列番号３３の比較の結果、トリプトファンへの置換は輸送能を増大させなかった。この結果は、１００μMの濃度におけるトリプトファン置換体の細胞毒性に関連しているのかもしれない（図１１）。配列番号３９と４０、配列番号４１と４２、配列番号４３と４４、との間の比較において、メチオニンの代わりにトリプトファンへ置換しても、効率および細胞毒性の面における重大な変化はもたらされなかった。フェニルアラニン（配列番号３４）あるいはロイシン（配列番号３５）への置換は、配列番号３１に比べて、１０μMの濃度において輸送能の増大をもたらし、１００μMにおいては減衰をもたらした。配列番号３１、３４、３５および３６におけるロイシン置換は、１０μMでの最大の増大をもたらし、１００μMでわずかな減衰をもたらした。１００μMにおいて、配列番号３５の細胞毒性は配列番号３１よりも弱かった。配列番号４６（１０μMでWTのMFIより３.７５倍高い）および配列番号４７（１０μMでWTのMFIより７.０４倍高い）において、ロイシンへの置換は透過能の減少をもたらしたが、配列番号４６の毒性は配列番号４７の毒性よりも弱かった。細胞毒性および減衰の不安定さを有するメチオニンの問題を考慮すると、メチオニンがロイシンにより置換され、それによりロイシンがペプチド変異体に導入されるのが最も適当であると判断した（配列番号４８から）。
【０１３５】
ポジションWT−IVのチロシン（Y）の役割を調べるために、チロシンを、水酸基は有しないがチロシンのように等電であるフェニルアラニン（F）あるいはチロシンのように水酸基を有するセリン（S）に置換することにより、このポジションにおける疎水性の重要性および水酸基の作用などを調べた。配列番号２２および２５はWTよりも各々、１０μMにおいて１９.６３倍および０.９１倍高く、１００μMにおいて２１６.７５倍および１.８１倍高かった。この結果から、疎水性の増大はこのポジションにおける細胞透過能を高めることがわかったので、この実験後、我々はペプチド変異体のポジションWT−IVにフェニルアラニンを導入した（配列番号３１から）。
【０１３６】
我々は、ポジションWT−Vにおいて、アルギニン（R）をリジン（配列番号３１と４３の比較、および配列番号３６と４４の比較）あるいはアラニン（配列番号３１と４５の比較および配列番号３５と５３の比較）に置換することにより、塩基性アミノ酸への置換を比較した。その結果、１０μMにおいて、配列番号３１（WTと比べて２６.７７倍増大）の輸送能は配列番号４３（１２.１倍増大）よりも低く、配列番号３６（WTに比べて１８.４倍増大）の効率は配列番号４４（１５.０４倍増大）よりも低かった。配列番号４５（WTに比べて１１.４７倍増大）および配列番号５３（WTに比べて８.２４倍増大）の輸送能は、１０μMにおいて、配列番号３１および３５（２９.５３倍増大）より低かった。これらの結果から、ポジションWT−Vにおけるアルギニンの維持は有用であると考えられた。
【０１３７】
配列番号１３は低濃度において良好な効率を有した（実施例４）ので、ポジションWT−VIのアスパラギン酸を、疎水性を高めるためにアラニンあるいはイソロイシンで置換した。配列番号３１（WT−VI:I）と３３（WT−VI:A）の比較において、両者の輸送能は１００μMにおいて同様の増大であったが、配列番号３１（WTに比べて２９倍増大）の透過能の増大は、１０μMにおける配列番号３３（WTに比べて３.２倍増大）よりもはるかに良好であったことから、イソロイシン置換はアラニン置換よりも効果的であった。これらの結果から、この実験後、イソロイシンをペプチド変異体（配列番号３１、３４−３６、３９から）のポジションWT−VIに導入した。
【０１３８】
ポジションWT−VIIおよびVIIIのロイシンおよびイソロイシンをそれぞれアラニンで置換すると（配列番号１４と１５）細胞透過能は減衰し、両者を塩基性アミノ酸で置換すると、この機能は2倍減衰し（配列番号１と２１の比較）、ポジションWT−VIIのロイシンのみを負電荷で強い親水性を有するグルタミン酸（E）で置換するとこの機能はアラニン置換と同程度の減衰であった（配列番号１と２９の比較）ことから、両ポジションにおいて最も効率的なアミノ酸はロイシンおよびイソロイシンであると結論づけた。
【０１３９】
このポジションのみをそれぞれチロシンおよびトレオニンで置換した配列番号３９（WT−IX:Y）および４１（WT−IX:T）と配列番号３１（WT−IX:S）の細胞透過能を比較すると、ポジションWT−IXのセリンは最も効果的に維持される必要がある。その一方で、ポジションWT−Iのメチオニンの代わりにトリプトファンで置換した全てのケースで、配列番号３６（WT−IX:S）の効率は、１０μMにおいてのみ、配列番号４０（WT−IX:Y）および配列番号４２（WT−IX:T）より強かった。
【０１４０】
ポジションWT−Xのヒスチジン（H）を維持するのが効果的であった。配列番号１と２（配列番号１からのヒスチジン欠失）の細胞透過能の比較において、配列番号１は、５０μMの濃度で配列番号２よりも効率的で（図２および３参照）、ヒスチジンをグルタミン酸で置換すると（配列番号１と２８と３０の比較、図７、８、９参照）、配列番号２８および配列番号３０は、１０μMでWTと同様であり、高濃度では４−５倍減衰した。
【０１４１】
（実施例６）突然変異ペプチドの細胞毒性の同定
【０１４２】
本発明のペプチドの細胞透過能が、細胞毒性を受けての細胞膜の弱さによるものなのかどうか確かめるために、以下のように細胞毒性を測定した。ヒーラ細胞を、実験の日の前に７０％成熟するまで９６−wellプレートで培養した。０、１、１０、１００μMの濃度で、コントロールTAT４８−５７および該突然変異ペプチドを、１０％FBSを添加したDMEMに、２４および４８時間処理した。各wellに１０μlのCCK−８を添加した２時間後、４５０nmでの吸光度を、KC４プレートリーダー（図１０、１１および１２）で測定した。１００μMで２４時間処理の毒性の結果として、配列番号１、TCTP（１−１０）の細胞毒性はコントロールに比べて約１４％であり、他のペプチド、TCTP−CPP#３、７および８、の細胞毒性は、標準偏差を考慮するとわずかであった。４８時間処理の場合、全てのペプチドは、１および１０μMにおいて細胞毒性を有しなかった一方、TAT、TCTP（１−１０）、TCTP−CPP#３、７および８の細胞毒性はそれぞれ、約５３.８、２８.３、４６.２、８.２および２５.６％であった。TCTP−CPP#１２−２６は全て、１および１０μMでは細胞毒性を有しなかったが、１００μMにおいてTCTP−CPP#２６のみのそばに細胞毒性を有していた。また、TCTP−CPP#２７−３５は全て、１μMおよび１０μMでは細胞毒性を有しなかったが、１００μMでは細胞毒性を有していた。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１aおよび図１cは、本発明における様々な欠損型のTCTPを示す概略図であり、図１bおよび図１dは、BEAS−２B細胞株における、図１aおよび図１cの様々な欠損型のTCTPの細胞内への取り込みを、ウエスタンブロットにより分析した結果である。
【０１４４】
【図２】図２は、様々な濃度のヒーラ細胞株における、TCTP由来ペプチド処理１５分後の用量依存的細胞内取り込みを示している。
【０１４５】
【図３】図３は、様々な濃度のヒーラ細胞株における、TCTP由来ペプチド処理２時間後の細胞内取り込みを示している。
【０１４６】
【図４】図４は、様々な濃度のヒーラ細胞株における、TCTP由来ペプチド処理２時間後の細胞内取り込みを表す蛍光顕微鏡画像を示している。
【０１４７】
【図５】図５は、感度７５での様々な濃度における、TCTP由来ペプチド処理２時間後の細胞内取り込みを示している。
【０１４８】
【図６】図６は、図５と同じ結果の感度１００の場合を示している。
【０１４９】
【図７】図７は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド2時間処理の突然変異ペプチドの細胞内取り込みを表す平均蛍光強度を、FACSを用いて示している。
【０１５０】
【図８】図８は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド2時間処理の突然変異ペプチドの細胞内取り込みを表す平均蛍光強度を、FACSを用いて示している。
【０１５１】
【図９】図９は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド2時間処理の突然変異ペプチドの細胞内取り込みを表す平均蛍光強度を、FACSを用いて示している。
【０１５２】
【図１０】図１０は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド処理２４あるいは４８時間後の突然変異ペプチドの細胞毒性を示している。
【０１５３】
【図１１】図１１は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド処理２４あるいは４８時間後の突然変異ペプチドの細胞毒性を示している。
【０１５４】
【図１２】図１２は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド処理２４あるいは４８時間後の突然変異ペプチドの細胞毒性を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性ペプチド、有効成分として細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、細胞膜透過性ペプチドおよび標的物質を含むトランスフェクションキット、膜透過性コンプレックスの製造における細胞膜透過性ペプチドの使用、医薬の製造における膜透過性コンプレックスの使用、および膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与することを特徴とする細胞内部への標的物質の輸送方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、治療薬剤、ペプチドおよびタンパク質のような高分子をin vitroやin vivoで細胞内に輸送する様々な方法が開発されている。
【０００３】
in vitroの方法には、エレクトロポレーション、リポソームによる膜融合、DNAコーティングマイクロプロジェクタイルによる高速ボンバードメント、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物によるインキュベーション、DEAE−デキストラントランスフェクション、組換えウイルス核酸の注入、および単一細胞へのダイレクトマイクロインジェクションが含まれる。しかし、このような方法は、タンパク質輸送の実用性が極めて制限されている。
【０００４】
in vivoにおける細胞内への高分子の輸送は、スクレープローディング(scrape loading)、リン酸カルシウム共沈法およびリポソーム法により可能となってきた。しかしながら、現在までのこれらの技術は、in vivoでの細胞輸送に対する有用性に限界がみられている。
【０００５】
in vitroおよびin vivoにおける無傷細胞への生物活性タンパクの効率的な輸送の一般的な方法には、リポペプチド（P.Hoffmannら、１９８８）あるいは、ポリリシンやポリアルギニンなどのようなベーシックポリマー（W−C.Chenら、１９７８）の化学的付加が含まれる。
【０００６】
葉酸は輸送担体として用いられてきた（C.P.LeamonとLow、１９９１）。しかしながら、高い信頼性あるいは一般的な有用性が立証されてこなかった。
【０００７】
最近、タンパク質のような高分子を細胞内部に導入する遺伝子治療が脚光をあびているが、これもまた標的ミスという問題を抱えている。別の方法として、タンパク質導入あるいはタンパク療法の研究が活発に進展している。
【０００８】
タンパク質導入ドメイン（PTD）は、精製ヒト免疫不全ウイルス１型（“HIV”）TATタンパクを、培地で培養したヒト細胞へ添加することにより、それが周辺の培地から取り込まれるという報告が最初であった（Greenら、１９８８、Frankelら、１９８８）。この報告の後、ショウジョウバエのホメオティック転写因子、アンテナペディア（Antp）（Joliotら、１９９１）および単純ヘルペスウイルス−１ DNA−結合タンパク、VP２２（Elliotら、１９９７）も同定された。
【０００９】
TAT、AntpおよびVP２２のようなPTDのアミノ酸配列を比べると、アルギニンおよびリジンのような塩基性アミノ酸がほとんどの部分に存在しており（表１）、この配列はマイナス荷電したリン脂質二重層への接近および細胞内部への貫通を可能にする。透過性タンパク質の配列はタンパク質導入ドメイン（PTDs）と名付けられている。
【表１】
【００１０】
特に、組換え発現ベクターはTAT４７−５７の１１のアミノ酸を含むペプチドを用いて開発され、TAT融合タンパク質はTATペプチドを他のペプチドあるいはタンパク質に連結させることにより作製され、そのことによって、全長タンパク質の細胞内区画への導入が、サイズあるいは機能の制限なしで可能となった（ナガハラら、１９８８）。
【００１１】
PTDは、融合タンパク質になるように他のペプチドあるいはタンパク質に連結し得、さらに細胞内部に形質導入しうるので、PTDを用いた治療薬剤、ペプチド、タンパク質などの細胞内部への形質導入が多く試みられた。
【００１２】
最近、塩基性アミノ酸残基を多くは含まないPTDが知られるようになっている。また、へリックス構造により細胞膜のリン脂質二重層を貫通することが報告されている。
【００１３】
TCTP（翻訳により調節される腫瘍タンパク質）は、MacDonaldら（１９９５）により報告されたIgE依存性ヒスタミン放出因子（HRF）として知られているタンパク質である。TCTPは、１９８０年代まで腫瘍特異的タンパク質として知られており、その一群は腫瘍の増殖期に関与すると推定されていた。TCTPは、マウス赤白血病細胞株において、２１kDaの腫瘍タンパク質p２１として報告された（Chitpatimaら、１９８８）。また、エールリッヒ腹水腫瘍の細胞増殖に関与するp２３はTCTP／HRFと同一であることが明らかにされた（Bohmら、１９８９）。
【００１４】
TCTPは腫瘍細胞、特に活発に増殖している腫瘍細胞で頻繁に見られ、細胞質に存在している。それは、１７２のアミノ酸から成る既知のタンパク質−（NCBI登録#P１３６９３（Homo sapiens））であり、種間において高い相同性を示す。そのC末端の４５のアミノ酸は塩基性ドメインを形成する。そのようなドメインは微小管結合タンパク質のMAP−１Bと約４６％の相同性を有していることから、HRFは微小管結合タンパク質であるとも推定された。Gachetら（１９９７）は、HRFが細胞骨格系に沿ってある程度一貫して分布していることを、共焦点顕微鏡を用いて見いだし、そのことはHRFが細胞骨格に結合することを示唆している。
【００１５】
TCTP発現はmRNAが通常レベルに維持されていることにより特徴づけられるが、血清の存在のような外部刺激がある場合は、ポリソームに変化して翻訳される。その特徴により、‘翻訳により調節される腫瘍タンパク質（TCTP）’（Thomasら、１９８１； ThomasとThomas、１９８６）と名付けられた。また、TCTP mRNAは翻訳中に抑制されるが、そのとき細胞分裂シグナルを受け、活性化されてタンパク質に翻訳されることも報告された（ThomasとThomas、１９８６）。
【００１６】
TCTP／HRFは好塩基球あるいはマスト細胞と相互作用をもつヒスタミン放出物質と考えられており、アレルギー炎症反応に関与している。
【００１７】
MacDonaldら（１９９５）はまた、HRFは細胞内タンパク質であるが、細胞外のHRFはIgE感作好塩基球を刺激してヒスタミンを放出させる（Schroederら、１９９６）ことを見いだした。Schroederら（１９９７）は、HRFは、IgEの非存在に関係なく、全ての好塩基球から放出される抗IgE誘導ヒスタミンを増強しうることを見いだし、それにより、HRFはIgEとの結合ではなく細胞膜受容体への結合によりその機能を発揮することを示唆した。
【００１８】
本発明者らは、TCTP／HRFが（Na，K）ATPアーゼのサブユニットの第３細胞質ドメイン（CD３）と相互作用し、それにより（Na，K）ATPアーゼの活性を抑制していることを以前に報告した（韓国特許出願No.１０−２００１−００２７８９６に示されるように）（Jungら、２００４）。
【００１９】
同時に本発明者らは、TCTP／HRFが細胞膜を透過しうることを報告する。TCTP／HRFのアミノ酸配列には、典型的なPTDの特徴である、十分な量の塩基性アミノ酸（アルギニンあるいはリジン）から成る部分や他のPTDのそれに類似するアミノ酸配列がないため、本発明者らは、TCTPはタンパク質の構造の面で他の既知のPTDと異なっているドメインを有すると考えた。
【００２０】
TCTPの全体構造において、ＮおよびＣ末端は緩んで露呈しており、中間部分は球状を形作っている。
【００２１】
第３に構造の予測については、３つのへリックスがあり、ここで第１へリックス（H１）はとても短く、第２へリックス（H２）および第３へリックス（H３）は外部に露呈している。シゾサッカロミセス・ポンベにおけるTCTPのH２およびH３構造では、塩基性アミノ酸はへリックスの外側に分布しており（Thawら、２００１）、それゆえにH２およびH３はタンパク導入能に関与すると推測された。しかしながら、試験結果によると、このへリックス部分は輸送とは無関係であった。
【００２２】
従って、TCTP／HRFにおけるタンパク導入機能を有するアミノ酸配列を同定すれば、新しいタイプのPTDの発見だけでなく、新しいドラッグデリバリーシステムの確立（もっとも、これらを用いた新規のベクター開発であるけれども）を可能にしうる。
【００２３】
本発明者らはTCTPにおけるPTDの探索に絶え間ない努力をした結果、周知のPTDとは全く異なるアミノ酸から成るタンパク質導入ドメインを特定した。この結果に基づいて、本発明者らは、このドメインが周知のPTDよりも顕著に高い細胞透過能を示すことを確認することにより本発明を確立した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
（技術的課題）
本発明のひとつの目的は、細胞膜透過性ペプチド、有効な要素としての細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性コンプレックス、細胞膜透過性ペプチドとその標的物質を含むトランスフェクションキット、膜透過性コンプレックスの製造における細胞膜透過性ペプチドの使用、医薬の製造における膜透過性コンプレックスの使用、および膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性コンプレックスを標的に投与することを含む細胞内部への標的物質の輸送方法、を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
（技術的解決法）
本発明は、以下のアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドを提供する。:
R１−R２−R３−R４−R５−R６−R７−R８−R９−R１０
【００２６】
上記の式中、
R１は、欠失しうるか、またはM、A、Q、C、F、LあるいはWから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R２は、欠失しうるか、またはIあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R３は、IあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R４は、Y、A、F、SあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R５は、R、AあるいはKから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R６は、D、A、IあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R７は、欠失しうるか、またはL、K、A、EあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R８は、欠失しうるか、またはI、KあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R９は、欠失しうるか、またはA、S、E、YあるいはTから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R１０は、欠失しうるか、またはA、H、KあるいはEから選択されるひとつのアミノ酸であり、そしてR１０がKあるいはHであるときは、K、KK、R、RRあるいはHHから選択されるアミノ酸が付加していてもよい。
【００２７】
本発明の一態様において、そのアミノ酸配列は配列番号１である。
【００２８】
本発明の一態様において、そのアミノ酸配列は配列番号２−７である。
【００２９】
また、本発明の一態様において、そのアミノ酸配列は配列番号２のひとつのアミノ酸がアラニンと置き換わりうる。例えば、その上記のアミノ酸配列は配列番号８−１６、特に配列番号１３から選択されるひとつのアミノ酸配列である。
【００３０】
さらに、本発明の一態様において、そのアミノ酸配列は配列番号２０−５４から選択されるひとつのアミノ酸配列でありうる。例えば、その上記配列は配列番号２２、２６、２７あるいは配列番号３１−５４から選択されるひとつのアミノ酸配列である。
【００３１】
本発明において、'細胞膜透過タンパク質ドメイン'は、原形質膜を通して細胞内部（細胞質、細胞核）にまで透過する機能を持つタンパク質配列を意味する。
【００３２】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、周知のTAT、VP２２およびAntp PTDs（タンパク質導入ドメイン）と配列の類似性を有しない新規の細胞膜透過タンパク質ドメインである。
【００３３】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号２−７から選択されるひとつのアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドを提供する。
【００３４】
本発明の一実施例によると、配列番号１、２、３あるいは４のアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドは、標準的なTATと比べて非常に優れた細胞透過能を示しており、細胞内透過能は、処理濃度が高くインキュベーション時間も長くなると急速な増加様態を示す。
【００３５】
詳しくは、細胞透過能をTCTPの１番から１０番［TCTP（１−１０）、配列番号１］残基を用いて測定した場合、TCTP（１−１０）の細胞透過能はTATの場合に比べて、５０μMで１５分処理したときは３倍を超える活性、１００μMで１５分処理したときは６倍の活性を示す。２時間処理した場合、TCTP（１−１０）の濃度が５０μMおよび１００μMのときの細胞透過能はそれぞれ、TATの場合の約２９倍および３０倍高かった。
【００３６】
また、１５分処理の場合に比べて、２時間インキュベートにおいては細胞透過能が増加する傾向を示した。
【００３７】
さらに、TCTP（１−９）（配列番号２）、TCTP（１−８）（配列番号３）あるいはTCTP（２−１０）（配列番号４）のアミノ酸残基を含むペプチドは、周知のTAT（４７−５８）より優れた透過能を示した。そのうち、細胞透過能はTCTP（１−１０）（配列番号１）、TCTP（１−９）（配列番号２）、TCTP（１−８）（配列番号３）およびTCTP（２−１０）（配列番号４）の順に優れており、TCTPの１番目のアミノ酸が存在しているときに、細胞透過能はさらに優れていた。
【００３８】
ペプチドの長さは、この技術分野における細胞膜透過タンパク質ドメインの一般的な長さとして、望ましくは９−１５残基の範囲、より望ましくは９−１０残基の範囲で変化しうる。
【００３９】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、人工合成、あるいはTCTPからTCTP（１−１０）（配列番号１）、TCTP（１−９）（配列番号２）、TCTP（１−８）（配列番号３）あるいはTCTP（２−１０）（配列番号４）の配列を単離することで作られうる。
【００４０】
本発明のペプチドの合成は、例えば、機器あるいは遺伝子工学を用いて実施されうる。
【００４１】
機器を用いた合成の場合、自動ペプチド合成機（PeptrEX−R４８、ペプトロン）でFmoc固相法を用いて合成されうる。樹脂から合成されたペプチドを精製した後、該ペプチドは、資生堂カプセルパックＣ１８（Shiseido capcell pak C１８）分析用RPカラムを用いた逆相HPLC（Prominence LC−２０AB、島津、日本）により精製および解析されうる。合成が完了した後、該ペプチドは、質量分析計（HP １１００ Series LC／MSD、ヒューレット・パッカード、Roseville、USA）により同定されうる。
【００４２】
遺伝子工学による単離の場合、目的のペプチドに相当する核酸配列がタンパク質発現の組換えベクターに導入され、ついで、ペプチドコード領域の発現がBL２１（λDE３）あるいはBL２１（λDE３）pLysのようなプロテアーゼ欠損大腸菌においてIPTGにより誘導され、該ペプチドが精製される。
【００４３】
本発明はまた、配列番号８−１６のアミノ酸配列から成る、細胞膜透過性ペプチドを提供する。
【００４４】
本発明の一実施例によると、配列番号２の一つのアミノ酸がアラニン、第６残基のアラニン置換体、アスパラギン酸（配列番号１３）に置換しているアミノ酸配列では、１０μMの低濃度において、WT（野生型）ペプチドよりも２.５倍増大した透過能を示し、また第５および第７−９残基（R、L、I、S）（配列番号１２、１４−１６）のアラニン置換体はわずかな減衰を示したが、まだ活性を示していた。第１−第４残基（M、I、I、Y）（配列番号８−１１）のアラニン置換体の活性は急激に減少したが、WTペプチド様機能は維持していた。従って、本発明の細胞膜透過性ペプチドは、配列番号８−１６から選択される一つのアミノ酸配列から成るペプチドを含む。
【００４５】
本発明はまた、配列番号２２、２６、２７、あるいは３１−５４から選択される一つのアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドを提供する。
【００４６】
本発明の一実施例において、配列番号２０−３０のペプチドは、配列番号１における１以上のアミノ酸の欠損、置換あるいは付加により作られた。その結果、配列番号２２、２６あるいは２７から成るペプチドはTAT（１００μM）よりも良好な透過能を示した。これらの透過データに基づいて、配列番号３１−４５のペプチドは繰り返し合成され、これら全てのペプチドは１０μMにおいてTATよりも良好な透過能を示した。上記のデータに基づいて、配列番号４６−５４のペプチドを配列番号１の様々な変異型として作製し、細胞透過能を測定した。その結果、配列番号４９のペプチドはTATに比べて非常に優れた活性を有し、配列番号４６−５４のペプチドは、TATと比べて同等以上の活性を示し、TCTP（１−１０）（配列番号１）に比べて非常に優れた活性を示した。従って、本発明の細胞膜透過性ペプチドは、配列番号２２、２６、２７および３１−５４から成るペプチドを含む。
【００４７】
ペプチドの長さは、この技術分野における細胞膜透過タンパク質ドメインの一般的な長さとして、好ましくは５−１５残基、そしてより好ましくは８−１０残基の範囲内で変化しうる。
【００４８】
本発明のペプチドは、人工合成あるいはTCTP（１−１０）（配列番号１）、TCTP（１−９）（配列番号２）、TCTP（１−８）（配列番号３）あるいはTCTP（２−１０）（配列番号４）の配列の単離、およびこれらの配列の修飾により作製される。
【００４９】
該ペプチドの合成は、上記と同一の合成方法により行われる。
【００５０】
本発明はまた、有効成分として細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体を提供する。該細胞膜透過性ペプチドは、原形質膜を通して標的物質を輸送する膜透過性担体としての使用を提供する。
【００５１】
さらに、本発明は標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを提供する。
【００５２】
本発明における'標的物質'という用語は、生理活性の制御に関与し、薬理作用をもたらし、あるいは細胞内区画における生物活性を維持しうる分子を意味する。
【００５３】
本発明の標的物質は、例えば、非タンパク質性分子として、DNAおよびRNAを含む核酸、薬剤のような化合物、炭水化物、脂質あるいは糖脂質などを含み、タンパク質性分子として酵素、制御因子、成長因子、抗体、細胞骨格要素を含みうる。
【００５４】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは結合や融合状態において、物理的／化学的な共有結合あるいは非共有結合により、あるいはメディエーターにより、１以上の標的物質と結合しうる。
【００５５】
詳細には、標的物質が非タンパク質性分子である場合、本発明の細胞膜透過性ペプチドは共有結合により標的物質と結合し、該複合体は標的細胞グループに接触しうる。別の例では、該標的物質は本発明の細胞膜透過性ペプチドと非共有結合しうる。例えば、標的物質が核酸である場合、脂質ベースの担体タイプでは、本発明の細胞膜透過性ペプチドと結合し、標的細胞グループに接触しうる。
【００５６】
標的物質がタンパク質である場合、本発明の細胞膜透過性ペプチドと結合した融合タンパク質は、PCRおよびベクターを用いたcDNAクローニングを経て、該タンパク質（該標的物質）のcDNAを得ることにより作製される。それが不可能ならば、該タンパク質は化学的に融合される。例えば、融合タンパク質は、標的物質をリンカーに結合させ、ついで細胞膜透過性ペプチドと反応させてリンケージを形成することにより作製される。
【００５７】
特に、該標的物質がタンパク質である場合は、該複合体は融合タンパク質の形で透過される。この場合、本発明の細胞透過性コンプレックスは、以下のように作製される。
【００５８】
はじめに、細胞膜透過性ペプチド−標的物質複合体をコードする融合遺伝子を作るために組換え発現ベクターを作製する。
【００５９】
上記融合タンパク質をコードする核酸は、細胞膜透過性ペプチドをコードする該核酸配列および標的物質のようなタンパク質をコードする該核酸配列を含む。例えば、これらの核酸配列は、配列番号１７−１８あるいは５５−８１から成る配列を含みうる。
【００６０】
配列番号１７−１８あるいは５５−８１の核酸配列は以下のとおりである。
【表２】
【００６１】
一つのアミノ酸をコードするコドンはいくつかあるので、本発明のペプチドをコードする核酸配列は、上記の表に掲載された核酸配列の他に本発明のペプチドをコードする全ての核酸配列を含む。
【００６２】
本発明の組換え発現ベクターは、発現の汎用プロモーター、終結因子、選択マーカー、レポーター遺伝子、タグ配列、制限酵素認識サイト、マルチクローニングサイトなどを含みうる。
【００６３】
本発明の組換え発現ベクターを用いた宿主へのトランスフェクション方法は、この分野では既知の、熱ショックあるいはエレクトロポレーションなどである。
【００６４】
上記のようにトランスフェクトされた宿主細胞において、適切な条件の下で融合タンパク質が発現されると、細胞膜透過性ペプチドおよび標的物質のようなタンパク質から成る融合タンパク質はその分野で既知の従来の方法により精製される。
【００６５】
さらに、本発明は、細胞膜透過性ペプチドおよび該標的物質を含むトランスフェクションキットを提供する。トランスフェクションキットは、DNA／RNAをほ乳類細胞の細胞内区画に容易に導入するために最適化された方法である。これまでにカルシウム−リン酸塩法、脂質複合体あるいはデキストラン錯体を用いた方法があるが、これらの方法の効率は１／１０６から１／１０２であり、また細胞のタイプに依存するという制限がある。これらの制限を克服するために、該細胞膜透過性ペプチドを用いたトランスフェクションキットが有用となりうる。
【００６６】
本発明の該トランスフェクションキットはさらに、標的物質とペプチドを結合する結合因子を含みうる。該結合因子は、転写因子、ウイルスタンパク質、あるいは標的物質を結合しうるタンパク質の全体または一部、を含む特異的DNA／RNA配列を意味する。例えば、Gal４はDNA結合因子である。Gal４は、真核生物、原核生物およびウイルスで広く発現している転写因子である。DNA／RNA結合因子は、in vivoおよびin vitroで、PTDsおよび融合タンパク質の発現するベクターにより用いられうる。また、DNA／RNA結合因子とPTD間の結合は、化学的相互作用、物理的相互作用あるいは非共有相互作用により成し遂げられる。
【００６７】
本発明の細胞膜透過性ペプチドとDNA／RNA間のが融合複合体が細胞外部で処理されれば、効率および細胞タイプに依存した制限の両者を克服する。本発明の細胞膜透過性ペプチドおよびDNA／RNA結合因子の両者を用いることで、DNA／RNAをさまざまな細胞の細胞質および核に導入することが可能である。特に、導入方法は、筋肉内、腹腔内、静脈内、口腔内、皮下、皮内、鼻腔内への導入および吸入を含む様々な経路で成し遂げられる。
【００６８】
さらに、標的物質は、タンパク質、脂質、炭水化物あるいは化学物質から成るグループから選択される１以上の生体調節物質を含み、また本発明のトランスフェクションキットは、in vivoおよびin vitroにおいて様々な細胞の細胞質および核に上記標的物質を導入しうる。PTDと標的物質間の融合は、化学的、物理的共有相互作用あるいは非共有相互作用により成し遂げられる。
【００６９】
本発明のトランスフェクションキットは、本発明の方法により遺伝子治療およびDNA／RNAワクチンに関する新しい技術を提供し、一時的あるいは恒久的に開示され、基礎的研究だけでく、遺伝子治療およびDNA／RNAワクチンのような臨床応用に用いられうる。
【００７０】
また、本発明は、膜透過性コンプレックスの製造における細胞膜透過性ペプチドの使用、および、細胞膜透過性ペプチドと標的物質の結合による膜透過性コンプレックスの作製方法を提供する。
【００７１】
さらに、本発明は、医薬の製造における標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドを含む該膜透過性コンプレックスの使用、および、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスと医薬的に許容できる担体とを混合する、医薬の製造方法を提供する。医薬的に許容できる担体は当業者によく知られており、当業者は生体への導入に適した医薬的に許容できる担体の選択と使用が可能である。
【００７２】
さらに、本発明は、膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与することを特徴とする細胞内部への標的物質の輸送方法、を提供する。
【００７３】
標的物質が、本発明の細胞膜透過性ペプチドに共有的に結合しうる、非タンパク質性分子であるならば、該複合体は標的細胞グループに接触しうる。別の例においては、該標的物質は本発明の細胞膜透過性ペプチドに非共有的に結合し、例えば、該標的物質が核酸ならば、該複合体は本発明の細胞膜透過性ペプチドと結合した脂質ベースの担体形態の標的細胞グループに接触しうる。
【００７４】
該‘対象’はヒトを含むほ乳類である。該膜透過性コンプレックスは、筋肉内、腹腔内、静脈内、口腔内、皮下、皮内、粘膜投与および吸入を含む様々な経路により投与される。
【００７５】
標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスの投与量は、標的物質およびペプチドの透過能が治療効果を有する量に従って変化し、それ故に特定の用量に制限されない。ただし、例えば、標的物質が核酸であるなら、標的物質の投与量は１０〜１０００μg／kgで、本発明のペプチドの投与量は０.１mg−１０mg／kgである。
【００７６】
さらに、本発明は、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与して標的物質を細胞内に導入することによる、関連疾病の治療方法を提供する。
【００７７】
治療が望まれる疾病の種類は、細胞内部への投与用の該標的物質に依存して変化しうる。
【００７８】
該‘対象’はヒトを含むほ乳類である。該膜透過性コンプレックスは、筋肉内、腹腔内、静脈内、口腔内、皮下、皮内、粘膜投与および吸入を含む様々な経路により投与される。
【００７９】
また、本発明は細胞膜透過性ペプチドをコードする核酸配列を提供する。例えば、本発明は、配列番号１、２、２２、２６、２７あるいは３１−５４から選択されるアミノ酸配列から成る細胞膜透過性ペプチドをコードする核酸を提供する。
【００８０】
該核酸は、DNAあるいは一本鎖あるいは二本鎖のRNAであり、人工合成あるいは生物由来のTCTP遺伝子から単離することにより作製される。例えば、配列番号１、２、２２、２６、２７あるいは３１−５４から成るペプチドをコードする核酸は各々、配列番号１７−１８、あるいは５５−８１の核酸配列に相当する。
【００８１】
ひとつのアミノ酸をコードするコドンはいくつかあるので、本発明のペプチドをコードする核酸配列は、本発明のペプチドをコードする全ての核酸配列を含み、上記の表に記載された核酸配列に限定されない。例えば、アミノ酸配列のアラニンをコードする配列はgca、gcc、gcgあるいはgctである。
【００８２】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、TAT由来のペプチドに比べて輸送において顕著な効果を有する。従って、本発明の細胞膜透過性ペプチド、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、および膜透過性コンプレックスを用いた細胞内への標的物質輸送方法は、高い効率で薬剤を標的に向けることが要求される特定の疾病の治療だけでなく、様々な研究分野における細胞内輸送に応用される。それ故に、本発明の細胞膜透過性ペプチド、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、および膜透過性コンプレックスを用いた細胞内への標的物質輸送方法は、ドラッグデリバリーシステムとしてとても有用である。
【００８３】
ここに記載された発明は、より十分に理解されうるように、以下の実施例を示す。これらの実施例はただの例示であり、どんな方法によっても、この発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【発明の効果】
【００８４】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、TAT由来ペプチドの活性に比べて顕著な透過能を有しており、それ故に該ペプチドは、高い効率で薬剤を標的とする必要のある特定の疾病の治療だけでなく、様々な研究分野における細胞内輸送に応用されている。 それ故に、本発明の細胞膜透過性ペプチド、標的物質と結合した細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス、および膜透過性コンプレックスを用いた細胞内への標的物質輸送方法は、ドラッグデリバリーシステムとしてとても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
（実施例１）TCTPの様々な欠損型によるPTDのマッピング
【００８６】
PTDのように機能するTCTPの領域を確かめるために、様々な欠損型が作製され、ついで以下のような実験に用いられた。
【００８７】
１）欠損型TCTPの単離および精製
それぞれの欠損型TCTP（図１aおよび１c）が過剰発現するように、標識しうる６つのヒスチジンであるpRSETベクターが用いられた。TCTPのそれぞれの欠損型に相当するDNA配列のサブ・クローニングがベクターのマルチクローニングサイトで実施された。その後、該組換え発現ベクターは、E.coli BL２１（DE３）（Novagen）あるいはBL２１（DE３）pLysS（Novagen）に導入された。欠損型TCTPの発現はIPTG（isopropyl β−D−thiogalactoside）により３時間誘導され、その後、タンパク質は、ポリヒスチジンと結合するニッケルカラムを用いて単離、精製された。
【００８８】
２）細胞培養およびタンパクによる処理
BEAS−２B細胞は、１５μg／mlの濃度で１時間あるいは２４時間、欠損型TCTPの処理を施された。その後、上澄みと細胞溶解物が得られ、抗TCTP抗体によるウエスタンブロッティングを行った（図１b）。
【００８９】
図１bに示されるように、１時間の培養後の細胞上清には全長TCTPが存在した（レーン１）が、このタンパク質は２４時間後（レーン６）には消失した。また、C末端のないDel−C１１２HRFを含む細胞上清において、該タンパク質は２４時間後に消失した（レーン９）。一方、残りのN末端のない欠損型のTCTP、Del−N１１、N３５およびN３９C１１０HRFは２４時間後の細胞上清にまだ存在していた（レーン７、８、１０）。
【００９０】
それ故に、TCTPのPDTはＮ末端に存在することを知り得た。特に、Del−N１１HRFは２４時間後に細胞上清にまだ存在していたことから（レーン７）、TCTP１−１０はPDTのような役割を果たすと思われる。
【００９１】
さらに、本発明のTCTPタンパク質が、５分あるいは３０分という短時間で細胞内部に輸送されうるかどうかが調べられた。該実験は上記と同じ方法で実施された（図１d）。
【００９２】
図１dに示すように、HRFのN末端を有するDel−C３８HRFは、３０分後に上清では認められなかった（レーン４）が一方、これらのタンパク質は、５分後（レーン１）および３０分後（レーン４）に細胞溶解物で認められた。
【００９３】
従って、本発明のTCTPタンパク質を含むN末端はたった数分から数十分という短時間で細胞内部に輸送されうる。
【００９４】
（実施例２）本発明のペプチドの細胞透過能の確認
【００９５】
実施例１に示すように、TCTPのN末端がPTDのような機能をもつことを確かめるために、TCTPのN末端から成る該ペプチドを構築し、細胞透過能を調べた。
【００９６】
１）TCTPのN末端アミノ酸に相当する様々なペプチドの合成
TCTP由来ペプチドおよび対照ペプチド、TAT４８−５７を以下のように合成した。
【表３】
【００９７】
各ペプチドのN末端は蛍光染料ローダミンで標識し、C末端は保護した。HPLCによりペプチド純度（＞９５％）が決定された。ペプチドの合成はペプトロン社（PEPTRON，Inc）に依頼した。
【００９８】
ネガティブコントロールは蛍光染料、ローダミン（分子プローブ）が全てのペプチドの標識に用いられた。
【００９９】
２）細胞培養およびペプチドのインキュベーション
ヒーラ細胞株（ATCC）を、１０％FBS（GIBCO）および１００units／mLペニシリン−ストレプトマイシンを添加したDMEM（GIBCO）で培養した。細胞は、５％CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１００】
ヒーラ細胞を、実験の日の前に７０〜８０％成熟するまで４８−wellプレートで培養した。該細胞を３７℃のDMEMで2回洗浄し、実施例２−１）で合成したTCTP由来ペプチドを用量依存的方法で（０、１、５、１０、５０、１００μM）培地に処理し、ついで該細胞を１５分間あるいは２時間、CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１０１】
培養後、細胞を冷たいPBSで3回洗浄し、細胞内取り込みマーカーのローダミンの測定のために、蛍光マイクロプレートリーダー（BIO−TEK instruments，Inc.，Vermont，USA）を用いて、蛍光波長（emission）５３０nmおよび最大励起（excitation）５９０nmで、直ちに測定した。リーダーの感度は基本モードとして１００に設定したが、蛍光シグナルが強すぎる場合には７５まで下げた。全ての実験は、再現性確認のため３回繰り返して公正に実施した（図２および図３）。
【０１０２】
図２および図３に示すように、TAT、コントロールペプチドは、用量と時間に依存した既知の方法で、細胞内に形質導入した。
【０１０３】
本発明のTCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）ペプチドは、１−１０μMではなく５０−１００μMにおいて、１５分（図２）あるいは２時間（図３）で輸送された。５０−１００μMにおいては、細胞内輸送がとても高いことが認められ、特に２時間処理後には蛍光が強すぎて検出できなかったため、リーダーの感度を７５に下げた。
【０１０４】
図３において、TCTP（１−１０）ペプチド濃度が５０μMと１００μMの間で、２時間処理における輸送能に差はないという事実から判断すると、TCTP（１−１０）ペプチドは５０μMで飽和状態にあると思われた。一方、TAT（４８−５７）ペプチドは、１μM以上で飽和状態にあった。
【０１０５】
TCTP（２−１０）ペプチドは１μMから１０μMの濃度では輸送がなされなかったが、このペプチドを１００μMで１５分処理した後においては、より効率的に輸送された。２時間後、このペプチドは、コントロールペプチド、TAT（４８−５７）、と同様の細胞膜透過能を有し、１００μMではコントロールペプチドよりも効率的に輸送された。
【０１０６】
そのように、本発明のTCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）および（２−１０）細胞膜透過性ペプチドは、それらの輸送効率において、よく知られたPTD、TATよりも優れた能力を有していることが確認できた。
【０１０７】
TCTP由来ペプチドについて、高濃度での輸送能力の急増が示されてきており、これらの結果は輸送メカニズムの違いによって引き起こされるのかもしれない。
【０１０８】
その結果、本発明のTCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）および（２−１０）細胞膜透過性ペプチドはそれらの輸送効率において、よく知られたPTD、TATよりも優れた能力を有していることが確認できた。これらのペプチドの中から、輸送効率はTCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）そして（２−１０）ペプチドの順で優れており、TCTP N末端のメチオニン（第１アミノ酸残基）の存在が重要であった。
【０１０９】
（実施例３）蛍光顕微鏡によるTCTP由来ペプチドの細胞内輸送の同定
【０１１０】
該ペプチドの細胞内輸送は蛍光顕微鏡により同定された。
【０１１１】
ヒーラ細胞は、実施例２−２）と同一の方法により、１０μMおよび１００μMの濃度でTCTP（１−９）（配列番号２）処理された。相違点は、プラスチックプレートは蛍光を阻害する特性を持っていたために、ヒーラ細胞をガラスで覆われた１２wellプレートに播種した点であった。洗浄後、細胞をスライドグラスに載せカバーグラスで覆い、観察した（図４）。
【０１１２】
図４に示すように、本発明のペプチドは、１０μMの低濃度では弱い輸送能であり、１００μMの高濃度では強い輸送能であった。該ペプチドは細胞質および細胞の核に広く分布していることを見い出した。
【０１１３】
（実施例４）ペプチド置換体の細胞内輸送の同定
【０１１４】
本ペプチドの置換体がPTDのような機能をしうることを確かめるために、該ペプチドの置換体を構築し、細胞透過能を調べた。
【０１１５】
１）ペプチド置換体の構築
TCTP（１−９）（配列番号２）とアラニンの連続置換は以下のように合成された。
【表４】
【０１１６】
各ペプチドのN末端は蛍光染料ローダミンで標識し、C末端は保護した。HPLCによりペプチド純度（＞９５％）を決定した。ペプチドの合成はペプトロン社（PEPTRON，Inc）に依頼した。
【０１１７】
２）細胞培養およびペプチドのインキュベーション
ヒーラ細胞株は、１０％FBSおよび１００units／mLペニシリン−ストレプトマイシンを添加したDMEMで培養増殖させた。細胞は、５％CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１１８】
ヒーラ細胞を、実験の日の前に７０〜８０％成熟するまで４８−wellプレートで培養した。該細胞を３７℃のDMEMで2回洗浄し、実施例４−１）で合成したTCTP由来ペプチドを用量依存的方法（０、１、１０、１００μM）で培地に処理し、ついで該細胞を１５分間あるいは２時間、CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１１９】
培養後、細胞を冷たいPBSで3回洗浄し、細胞内取り込みマーカーのローダミンの測定のために、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、蛍光波長（emission）５３０nmおよび最大励起（excitation）５９０nmで、直ちに測定した。リーダーの感度は基本モードとして１００に設定したが、蛍光シグナルが強すぎる場合には７５まで下げた。全ての実験は、再現性確認のため３回繰り返して公正に実施した（図５および図６）。
【０１２０】
図５に示すように、１００μMでのTCTP（１−９）の蛍光強度を１００％としたとき、取り込みにおける最大の減少を示す該アラニン置換体は、TCTP（１−９）（各配列番号８、９、１０、１１）のアミノ酸残基１、２、３、４（各々M、I、I、Y）に対するアラニン置換体であり、８０−９０パーセント減であった。
【０１２１】
一方、TCTP（１−９）（各配列番号１２、１３、１４、１５、１６）のアミノ酸残基５、６、７、８、９（各々R、D、L、I、S）に対するアラニン置換体は取り込みが約５０パーセント減少したが、我々はこれらのペプチドはまだ輸送能力を維持していると判断した。従って、TCTPのN末端の４つのアミノ酸（M、I、I、Y）は細胞透過能に必要であるとわかった。
【０１２２】
その一方で、KC４プレートリーダーの感度の設定を７５に下げると、１あるいは１０μMの比較的低濃度における細胞透過能の結果が分析できなかったため、リーダーの感度は１００に固定した（図６）。このとき、１００μMでの蛍光強度は非常に強かったため、同じグラフに表示できなかった。
【０１２３】
図６に示すように、１０μMでのTCTP（１−９）の蛍光強度を１としたとき、アミノ酸残基６番目、TCTP（１−９）（配列番号１３）のアスパラギン酸、のアラニン置換体は、天然ペプチド、TCTP（１−９）、よりも２.５倍高い透過能を有していた。アスパラギン酸は、負電荷のアミノ酸で、TCTP（１−９）で負電荷を持つ唯一の残基である。従って、負電荷のアミノ酸は、TCTPの細胞透過能を減少させると考えられた。
【０１２４】
TCTP（１−１０）、（１−９）、（１−８）、（２−１０）の天然ペプチドは高濃度で効率的に輸送されたが、これらのペプチドは、１μMおよび１０μM（実施例２）の比較的低濃度においては、コントロールペプチド、TATよりも低い効率であった。しかしながら、上記の結果から、第６残基の欠失、付加あるいは置換の類似体は、低濃度で非常に優れた透過能を有することが示された。
【０１２５】
上記の全ての結果から、TCTPのＮ末端上の４つのアミノ酸（M、I、I、Y）は細胞透過能において不可欠な役割を果たし、特に第６残基、アスパラギン酸のアラニン置換体は、低濃度（１０μM）での細胞透過能を急激に増加させる。このとき、透過能が低濃度では増加するが高濃度で減少するのは、疎水性であるアラニン置換体の難溶解性によるものと推測した。
【０１２６】
（実施例５）突然変異ペプチドの細胞透過能
【０１２７】
実施例４に示すように、本発明の置換体ペプチドは細胞膜透過能を有していることが確認された。そこで、本ペプチドの突然変異体が透過能を持つことを確認するために、突然変異ペプチドの輸送効率を調べた。
【０１２８】
１）突然変異ペプチドの構築
実施例４の結果から、様々な突然変異ペプチドがTCTP（１−１０）（配列番号１）のフレームで構築された。
【表５】
【０１２９】
各ペプチドのN末端は蛍光染料FITCで標識し、C末端は保護した。HPLCによりペプチド純度（＞９５％）を決定した。本発明のペプチドの合成はペプトロン社（PEPTRON，Inc）に依頼した。
【０１３０】
２）細胞培養およびペプチドのインキュベーション
ヒーラ細胞株は、１０％FBSおよび１００units／mLペニシリン−ストレプトマイシンを添加したDMEMで培養増殖した。細胞は、５％CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１３１】
ヒーラ細胞を、実験の日の前に７０〜８０％成熟するまで６−wellプレートで培養した。該細胞を３７℃のDMEMで2回洗浄し、実施例５−１）で合成したTCTP由来ペプチドを用量依存的方法（０、１、１０、１００μM）で培地に処理し、ついで該細胞を２時間、CO２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【０１３２】
培養後、細胞を冷たいPBSで２回洗浄し、１mg／mlトリプシンにより３７℃で１５分処理して細胞膜に付着しているペプチドを消化し、再度PBSで2回洗浄した。その後、該細胞を、細胞内取り込みマーカーのFITCを測定するために、FACSを用いて、蛍光波長（emission）５１０nmおよび最大励起（excitation）５３０nmで分析した（図７、８および９）。突然変異ペプチド、TCTP−CPP#１−３５（配列番号２０−５４）の細胞内輸送能を、野生型（WT）、TCTP（１−１０）（配列番号１）およびコントロールペプチド、TAT（４８−５７）と比較した。
【０１３３】
３）ペプチド変異体と細胞透過能の関係
突然変異ペプチドを設計する場合、各ポジションの残基はアラニン置換のように全２０のアミノ酸で置換されうるが、変化後の他の隣接するアミノ酸の完全ペプチドの電荷および等電点もまた考慮されなければならないので、これは全てのペプチドの中から最も効果的な突然変異を探し出すのに効率的でない。従って、我々は、初期の変化後に推定される結果に基づいて新たな改良を試み、決定的な役割を担うアミノ酸を検証するために新たな変異体ペプチドを設計した。新しい突然変異ペプチドおよび配列は実施例５−１）の表にまとめた。各１０の野生型（WT）（配列番号１）アミノ酸にIからX（N末端から）まで番号を付けることで、突然変異ポジションを簡単に説明できるようにした。溶解性および細胞膜に対するWTの結合能を増大させるために（ポリアルギニンおよびポリリシンの使用と同じ理由で）、ポジションWT−Xでのリジン置換、および、同じポジション（配列番号２０）でのリジンの同時付加、WT−VII，VIII（配列番号２１）のポジションでの２つのリジン置換、WT（配列番号２６）（配列番号２７）への２つのリジン付加を行った。これらの変異体のうち配列番号２６および配列番号２７のみが細胞透過能を増大した。平均蛍光強度（MFI）の比較と分析の結果によると、濃度１０μMにおけるWTのMFIを１とした場合、TAT、配列番号２６および配列番号２７は、濃度１０μMにおいてはWTより、各々６.１倍、６.０４倍、１.７３倍高く、１００μMの濃度においてはWTより、各々９４.７５倍、１４４.６倍、３４２.９倍細胞透過能が高かった。それ故に、WTのC末端に２つのリジンを付加した全１２のアミノ酸の変異体ペプチドは、続いて設計された変異体ペプチド（配列番号３１から）において維持し、リジンよりも他の塩基性アミノ酸との置換および塩基性アミノ酸の数の変化を調べた（配列番号４８−５２）。その結果、C末端における１あるいは２の塩基性アミノ酸の付加がWTよりも高い効率を示した。
【０１３４】
ポジションWT−Iにおけるメチオニンの硫黄の役割を分析するために、メチオニン（M）をグルタミン（Q）あるいはシステイン（C）（配列番号２３および配列番号２４−２５との比較）に置換した。その結果、硫黄は決定的な役割を担ってはいなかったことから、メチオニンの疎水性の役割を調べるために、メチオニンをフェニルアラニン（F）、ロイシン（L）あるいはトリプトファン（W）（配列番号３１および配列番号３４−３６との比較、配列番号３２および配列番号３８との比較、配列番号３３および配列番号３７との比較、配列番号３９および配列番号４０との比較、配列番号４１および配列番号４２との比較、配列番号４３および配列番号４４との比較、配列番号４６配列番号４７との比較）により置換した。その結果、配列番号３７、３８および３９の細胞透過能は、１００μMの濃度において配列番号３４より低かったが、１０μMの濃度においてはWTよりもそれぞれ５２.０倍、５５.６倍および２５.０倍高かったことから、これらのペプチドは、配列番号３１（WTより２９倍高い）と比べて非常に優れた効率を有していた。配列番号３８と配列番号３２の比較および配列番号３７と配列番号３３の比較の結果、トリプトファンへの置換は輸送能を増大させなかった。この結果は、１００μMの濃度におけるトリプトファン置換体の細胞毒性に関連しているのかもしれない（図１１）。配列番号３９と４０、配列番号４１と４２、配列番号４３と４４、との間の比較において、メチオニンの代わりにトリプトファンへ置換しても、効率および細胞毒性の面における重大な変化はもたらされなかった。フェニルアラニン（配列番号３４）あるいはロイシン（配列番号３５）への置換は、配列番号３１に比べて、１０μMの濃度において輸送能の増大をもたらし、１００μMにおいては減衰をもたらした。配列番号３１、３４、３５および３６におけるロイシン置換は、１０μMでの最大の増大をもたらし、１００μMでわずかな減衰をもたらした。１００μMにおいて、配列番号３５の細胞毒性は配列番号３１よりも弱かった。配列番号４６（１０μMでWTのMFIより３.７５倍高い）および配列番号４７（１０μMでWTのMFIより７.０４倍高い）において、ロイシンへの置換は透過能の減少をもたらしたが、配列番号４６の毒性は配列番号４７の毒性よりも弱かった。細胞毒性および減衰の不安定さを有するメチオニンの問題を考慮すると、メチオニンがロイシンにより置換され、それによりロイシンがペプチド変異体に導入されるのが最も適当であると判断した（配列番号４８から）。
【０１３５】
ポジションWT−IVのチロシン（Y）の役割を調べるために、チロシンを、水酸基は有しないがチロシンのように等電であるフェニルアラニン（F）あるいはチロシンのように水酸基を有するセリン（S）に置換することにより、このポジションにおける疎水性の重要性および水酸基の作用などを調べた。配列番号２２および２５はWTよりも各々、１０μMにおいて１９.６３倍および０.９１倍高く、１００μMにおいて２１６.７５倍および１.８１倍高かった。この結果から、疎水性の増大はこのポジションにおける細胞透過能を高めることがわかったので、この実験後、我々はペプチド変異体のポジションWT−IVにフェニルアラニンを導入した（配列番号３１から）。
【０１３６】
我々は、ポジションWT−Vにおいて、アルギニン（R）をリジン（配列番号３１と４３の比較、および配列番号３６と４４の比較）あるいはアラニン（配列番号３１と４５の比較および配列番号３５と５３の比較）に置換することにより、塩基性アミノ酸への置換を比較した。その結果、１０μMにおいて、配列番号３１（WTと比べて２６.７７倍増大）の輸送能は配列番号４３（１２.１倍増大）よりも低く、配列番号３６（WTに比べて１８.４倍増大）の効率は配列番号４４（１５.０４倍増大）よりも低かった。配列番号４５（WTに比べて１１.４７倍増大）および配列番号５３（WTに比べて８.２４倍増大）の輸送能は、１０μMにおいて、配列番号３１および３５（２９.５３倍増大）より低かった。これらの結果から、ポジションWT−Vにおけるアルギニンの維持は有用であると考えられた。
【０１３７】
配列番号１３は低濃度において良好な効率を有した（実施例４）ので、ポジションWT−VIのアスパラギン酸を、疎水性を高めるためにアラニンあるいはイソロイシンで置換した。配列番号３１（WT−VI:I）と３３（WT−VI:A）の比較において、両者の輸送能は１００μMにおいて同様の増大であったが、配列番号３１（WTに比べて２９倍増大）の透過能の増大は、１０μMにおける配列番号３３（WTに比べて３.２倍増大）よりもはるかに良好であったことから、イソロイシン置換はアラニン置換よりも効果的であった。これらの結果から、この実験後、イソロイシンをペプチド変異体（配列番号３１、３４−３６、３９から）のポジションWT−VIに導入した。
【０１３８】
ポジションWT−VIIおよびVIIIのロイシンおよびイソロイシンをそれぞれアラニンで置換すると（配列番号１４と１５）細胞透過能は減衰し、両者を塩基性アミノ酸で置換すると、この機能は2倍減衰し（配列番号１と２１の比較）、ポジションWT−VIIのロイシンのみを負電荷で強い親水性を有するグルタミン酸（E）で置換するとこの機能はアラニン置換と同程度の減衰であった（配列番号１と２９の比較）ことから、両ポジションにおいて最も効率的なアミノ酸はロイシンおよびイソロイシンであると結論づけた。
【０１３９】
このポジションのみをそれぞれチロシンおよびトレオニンで置換した配列番号３９（WT−IX:Y）および４１（WT−IX:T）と配列番号３１（WT−IX:S）の細胞透過能を比較すると、ポジションWT−IXのセリンは最も効果的に維持される必要がある。その一方で、ポジションWT−Iのメチオニンの代わりにトリプトファンで置換した全てのケースで、配列番号３６（WT−IX:S）の効率は、１０μMにおいてのみ、配列番号４０（WT−IX:Y）および配列番号４２（WT−IX:T）より強かった。
【０１４０】
ポジションWT−Xのヒスチジン（H）を維持するのが効果的であった。配列番号１と２（配列番号１からのヒスチジン欠失）の細胞透過能の比較において、配列番号１は、５０μMの濃度で配列番号２よりも効率的で（図２および３参照）、ヒスチジンをグルタミン酸で置換すると（配列番号１と２８と３０の比較、図７、８、９参照）、配列番号２８および配列番号３０は、１０μMでWTと同様であり、高濃度では４−５倍減衰した。
【０１４１】
（実施例６）突然変異ペプチドの細胞毒性の同定
【０１４２】
本発明のペプチドの細胞透過能が、細胞毒性を受けての細胞膜の弱さによるものなのかどうか確かめるために、以下のように細胞毒性を測定した。ヒーラ細胞を、実験の日の前に７０％成熟するまで９６−wellプレートで培養した。０、１、１０、１００μMの濃度で、コントロールTAT４８−５７および該突然変異ペプチドを、１０％FBSを添加したDMEMに、２４および４８時間処理した。各wellに１０μlのCCK−８を添加した２時間後、４５０nmでの吸光度を、KC４プレートリーダー（図１０、１１および１２）で測定した。１００μMで２４時間処理の毒性の結果として、配列番号１、TCTP（１−１０）の細胞毒性はコントロールに比べて約１４％であり、他のペプチド、TCTP−CPP#３、７および８、の細胞毒性は、標準偏差を考慮するとわずかであった。４８時間処理の場合、全てのペプチドは、１および１０μMにおいて細胞毒性を有しなかった一方、TAT、TCTP（１−１０）、TCTP−CPP#３、７および８の細胞毒性はそれぞれ、約５３.８、２８.３、４６.２、８.２および２５.６％であった。TCTP−CPP#１２−２６は全て、１および１０μMでは細胞毒性を有しなかったが、１００μMにおいてTCTP−CPP#２６のみのそばに細胞毒性を有していた。また、TCTP−CPP#２７−３５は全て、１μMおよび１０μMでは細胞毒性を有しなかったが、１００μMでは細胞毒性を有していた。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１aおよび図１cは、本発明における様々な欠損型のTCTPを示す概略図であり、図１bおよび図１dは、BEAS−２B細胞株における、図１aおよび図１cの様々な欠損型のTCTPの細胞内への取り込みを、ウエスタンブロットにより分析した結果である。
【０１４４】
【図２】図２は、様々な濃度のヒーラ細胞株における、TCTP由来ペプチド処理１５分後の用量依存的細胞内取り込みを示している。
【０１４５】
【図３】図３は、様々な濃度のヒーラ細胞株における、TCTP由来ペプチド処理２時間後の細胞内取り込みを示している。
【０１４６】
【図４】図４は、様々な濃度のヒーラ細胞株における、TCTP由来ペプチド処理２時間後の細胞内取り込みを表す蛍光顕微鏡画像を示している。
【０１４７】
【図５】図５は、感度７５での様々な濃度における、TCTP由来ペプチド処理２時間後の細胞内取り込みを示している。
【０１４８】
【図６】図６は、図５と同じ結果の感度１００の場合を示している。
【０１４９】
【図７】図７は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド2時間処理の突然変異ペプチドの細胞内取り込みを表す平均蛍光強度を、FACSを用いて示している。
【０１５０】
【図８】図８は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド2時間処理の突然変異ペプチドの細胞内取り込みを表す平均蛍光強度を、FACSを用いて示している。
【０１５１】
【図９】図９は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド2時間処理の突然変異ペプチドの細胞内取り込みを表す平均蛍光強度を、FACSを用いて示している。
【０１５２】
【図１０】図１０は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド処理２４あるいは４８時間後の突然変異ペプチドの細胞毒性を示している。
【０１５３】
【図１１】図１１は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド処理２４あるいは４８時間後の突然変異ペプチドの細胞毒性を示している。
【０１５４】
【図１２】図１２は、様々な濃度におけるTCTP由来ペプチド処理２４あるいは４８時間後の突然変異ペプチドの細胞毒性を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列から成る、細胞膜透過性ペプチド:
R１−R２−R３−R４−R５−R６−R７−R８−R９−R１０
上記の式中、
R１は、欠失しうるか、またはM、A、Q、C、F、LあるいはWから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R２は、欠失しうるか、またはIあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R３は、IあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R４は、Y、A、F、SあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R５は、R、AあるいはKから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R６は、D、A、IあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R７は、欠失しうるか、またはL、K、A、EあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R８は、欠失しうるか、またはI、KあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R９は、欠失しうるか、またはA、S、E、YあるいはTから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R１０は、欠失しうるか、またはA、H、KあるいはEから選択されるひとつのアミノ酸であり、そしてR１０がKあるいはHであるときは、K、KK、R、RRあるいはHHから選択されるアミノ酸が付加していてもよい。
【請求項２】
該アミノ酸配列が配列番号１である、請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項３】
該アミノ酸配列が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、あるいは配列番号１３から選択されるひとつである、請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項４】
該アミノ酸配列が配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３あるいは配列番号５４から選択されるひとつである、請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項５】
該アミノ酸配列が配列番号２２である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項６】
該アミノ酸配列が配列番号２６である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項７】
該アミノ酸配列が配列番号２７である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項８】
該アミノ酸配列が配列番号３１である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項９】
該アミノ酸配列が配列番号３２である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１０】
該アミノ酸配列が配列番号３３である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１１】
該アミノ酸配列が配列番号３４である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１２】
該アミノ酸配列が配列番号３５である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１３】
該アミノ酸配列が配列番号３６である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１４】
該アミノ酸配列が配列番号３７である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１５】
該アミノ酸配列が配列番号３８である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１６】
該アミノ酸配列が配列番号３９である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１７】
該アミノ酸配列が配列番号４０である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１８】
該アミノ酸配列が配列番号４１である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１９】
該アミノ酸配列が配列番号４２である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２０】
該アミノ酸配列が配列番号４３である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２１】
該アミノ酸配列が配列番号４４である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２２】
該アミノ酸配列が配列番号４５である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２３】
該アミノ酸配列が配列番号４６である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２４】
該アミノ酸配列が配列番号４７である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２５】
該アミノ酸配列が配列番号４８である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２６】
該アミノ酸配列が配列番号４９である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２７】
該アミノ酸配列が配列番号５０である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２８】
該アミノ酸配列が配列番号５１である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２９】
該アミノ酸配列が配列番号５２である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項３０】
該アミノ酸配列が配列番号５３である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項３１】
該アミノ酸配列が配列番号５４である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項３２】
有効成分として請求項１から３１のいずれかひとつに記載される細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体。
【請求項３３】
標的物質と結合した請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス。
【請求項３４】
該標的物質が、核酸、薬剤、化合物、炭水化物、脂質、糖脂質、酵素、制御因子、生長因子あるいは抗体から選択される１以上のものである、請求項３３の膜透過性コンプレックス。
【請求項３５】
請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドおよび標的物質を含むトランスフェクションキット。
【請求項３６】
該ペプチドと標的物質を結合する結合因子をさらに含む請求項３５のトランスフェクションキット。
【請求項３７】
膜透過性コンプレックスの製造における、請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドの使用。
【請求項３８】
標的物質と請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドを結合させることを特徴とする膜透過性コンプレックスの作製方法。
【請求項３９】
標的物質と結合した請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスの、医薬の製造における使用。
【請求項４０】
標的物質と結合した請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスと医薬的に許容できるキャリアとを混合することを特徴とする医薬の製造方法。
【請求項４１】
膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために、標的物質と結合した請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与することを特徴とする、細胞内部への標的物質の輸送方法。
【請求項４２】
配列番号１、２、２２、２６、２７、あるいは３１−５４から選択されるひとつのアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項４３】
該核酸が各々配列番号１７、１８、あるいは５５−８１から選択されるひとつである、請求項４２の核酸。
【請求項１】
以下のアミノ酸配列から成る、細胞膜透過性ペプチド:
R１−R２−R３−R４−R５−R６−R７−R８−R９−R１０
上記の式中、
R１は、欠失しうるか、またはM、A、Q、C、F、LあるいはWから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R２は、欠失しうるか、またはIあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R３は、IあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R４は、Y、A、F、SあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R５は、R、AあるいはKから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R６は、D、A、IあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R７は、欠失しうるか、またはL、K、A、EあるいはRから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R８は、欠失しうるか、またはI、KあるいはAから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R９は、欠失しうるか、またはA、S、E、YあるいはTから選択されるひとつのアミノ酸であり、
R１０は、欠失しうるか、またはA、H、KあるいはEから選択されるひとつのアミノ酸であり、そしてR１０がKあるいはHであるときは、K、KK、R、RRあるいはHHから選択されるアミノ酸が付加していてもよい。
【請求項２】
該アミノ酸配列が配列番号１である、請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項３】
該アミノ酸配列が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、あるいは配列番号１３から選択されるひとつである、請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項４】
該アミノ酸配列が配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３あるいは配列番号５４から選択されるひとつである、請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項５】
該アミノ酸配列が配列番号２２である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項６】
該アミノ酸配列が配列番号２６である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項７】
該アミノ酸配列が配列番号２７である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項８】
該アミノ酸配列が配列番号３１である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項９】
該アミノ酸配列が配列番号３２である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１０】
該アミノ酸配列が配列番号３３である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１１】
該アミノ酸配列が配列番号３４である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１２】
該アミノ酸配列が配列番号３５である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１３】
該アミノ酸配列が配列番号３６である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１４】
該アミノ酸配列が配列番号３７である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１５】
該アミノ酸配列が配列番号３８である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１６】
該アミノ酸配列が配列番号３９である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１７】
該アミノ酸配列が配列番号４０である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１８】
該アミノ酸配列が配列番号４１である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項１９】
該アミノ酸配列が配列番号４２である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２０】
該アミノ酸配列が配列番号４３である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２１】
該アミノ酸配列が配列番号４４である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２２】
該アミノ酸配列が配列番号４５である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２３】
該アミノ酸配列が配列番号４６である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２４】
該アミノ酸配列が配列番号４７である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２５】
該アミノ酸配列が配列番号４８である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２６】
該アミノ酸配列が配列番号４９である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２７】
該アミノ酸配列が配列番号５０である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２８】
該アミノ酸配列が配列番号５１である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２９】
該アミノ酸配列が配列番号５２である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項３０】
該アミノ酸配列が配列番号５３である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項３１】
該アミノ酸配列が配列番号５４である、請求項４に記載の細胞膜透過性ペプチド。
【請求項３２】
有効成分として請求項１から３１のいずれかひとつに記載される細胞膜透過性ペプチドを含む膜透過性担体。
【請求項３３】
標的物質と結合した請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックス。
【請求項３４】
該標的物質が、核酸、薬剤、化合物、炭水化物、脂質、糖脂質、酵素、制御因子、生長因子あるいは抗体から選択される１以上のものである、請求項３３の膜透過性コンプレックス。
【請求項３５】
請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドおよび標的物質を含むトランスフェクションキット。
【請求項３６】
該ペプチドと標的物質を結合する結合因子をさらに含む請求項３５のトランスフェクションキット。
【請求項３７】
膜透過性コンプレックスの製造における、請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドの使用。
【請求項３８】
標的物質と請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドを結合させることを特徴とする膜透過性コンプレックスの作製方法。
【請求項３９】
標的物質と結合した請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスの、医薬の製造における使用。
【請求項４０】
標的物質と結合した請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスと医薬的に許容できるキャリアとを混合することを特徴とする医薬の製造方法。
【請求項４１】
膜透過性コンプレックスの細胞内部への形質導入を誘導するために、標的物質と結合した請求項１から３１のいずれかひとつに記載の細胞膜透過性ペプチドから成る膜透過性コンプレックスを対象に投与することを特徴とする、細胞内部への標的物質の輸送方法。
【請求項４２】
配列番号１、２、２２、２６、２７、あるいは３１−５４から選択されるひとつのアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項４３】
該核酸が各々配列番号１７、１８、あるいは５５−８１から選択されるひとつである、請求項４２の核酸。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５２７２５１（Ｐ２００９−５２７２５１Ａ）
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５６２４４（Ｐ２００８−５５６２４４）
【出願日】平成１９年２月２０日（２００７．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／０００８８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９７５６１
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０５４６９５４０）エファ・ユニバーシティ・インダストリー・コラボレイション・ファウンデイション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＥＷＨＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２０日（２００７．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／０００８８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９７５６１
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０５４６９５４０）エファ・ユニバーシティ・インダストリー・コラボレイション・ファウンデイション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＥＷＨＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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