細胞表面分子に対する抗体の生産方法
【課題】患者における抗体介在性疾患を予防または治療すること。
【解決手段】患者における抗体介在性疾患を予防または治療するための、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトCD40抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を含む組成物であって、該組成物は、そのような治療を必要とする患者に、薬学的に受容可能な賦形剤中で、該組成物を投与する工程を包含する方法において使用され、ここで該CD40抗原への該抗体の結合が、該Ｂ細胞の増殖または分化を妨げる、組成物。
【解決手段】患者における抗体介在性疾患を予防または治療するための、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトCD40抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を含む組成物であって、該組成物は、そのような治療を必要とする患者に、薬学的に受容可能な賦形剤中で、該組成物を投与する工程を包含する方法において使用され、ここで該CD40抗原への該抗体の結合が、該Ｂ細胞の増殖または分化を妨げる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、膜関連抗原分子に特異的である抗体を生産する方法に関する。さらに詳細には、本発明では、宿主動物の免疫化および宿主動物から単離した抗体のスクリーニングに、これらの膜関連抗原を使用する方法を記載する。さらに、本発明は、免疫系疾患を治療する新規な方法に関する。特に、本発明は、（１）移植組織拒絶反応、移植片対宿主病、および、異物としての特異抗原の認識により生じるその他の免疫学的症状；ならびに、（２）ＩｇＥ介在性疾患（アレルギー）、および、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含む自己免疫疾患のような、抗体介在性疾患；の予防または治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｉ．モノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体は、免疫学的研究の有力な手段であることが立証されている。一般的には、モノクローナル抗体は、免疫原組成物中に存在するその他の抗原に対する抗体から、目的の抗原に対する抗体を判別するスクリーニングアッセイが可能であれば、免疫原として混合抗原を使用して産生し得る。目的の抗原が細胞表面分子であるときは、膜環境による高次構造制限を保持するために、免疫原として目的の分子を含有する細胞あるいは膜画分を使用するのが好ましい。
【０００３】
全細胞によるマウスの免疫化では、通常は、多くの異なる分子に対する抗体を生産する、強い免疫応答を示す。この広範な免疫応答は、次の、マウス脾臓細胞あるいはリンパ球細胞由来のハイブリドーマクローンによる特異的抗体の産生についてのスクリーニングでの、この免疫原細胞の使用を妨害する。
【０００４】
さらに、目的の抗原が低濃度で発現される場合には、その抗原に特異的なマウスＢ細胞の頻度は比較的低い。この低頻度により、目的の抗原に対する抗体を産生するクローンを同定するために、膨大な数のハイブリドーマクローンのスクリーニングが必要とされる。
【０００５】
ヒト細胞表面抗原を発現する同系移植ネズミの線維芽細胞は、特異的抗体を産生するために、マウスを免疫化するのに使用されてきた（ＤｉＳａｎｔｏら、１９９１）。適切なマウス株に注射すると、線維芽細胞に存在するバックグラウンドの抗原タンパク質が免疫原性にはならず、免疫応答が異種移植組換えタンパク質に集中する。しかし、この方法には、抗体産生が望まれる各々の種あるいは株に対する特異的な組換え細胞の構築が必要である。
【０００６】
ＩＩ．移植片拒絶反応およびＣＤ２８−Ｂ７系
移植後の移植片拒絶反応の防止のための最近の戦略は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６、およびコルチコステロイドのような広域作用免疫抑制剤に基づく。これらの薬剤は、しばしば長期間摂取しなければならないので、重篤な感染、腎毒性および癌の危険性を増す。さらに、全ての被験体が、これらの免疫抑制剤の高用量に耐え得るわけではなく、しばしば移植片拒絶反応あるいは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を生じる。移植片拒絶反応の最適な予防は、ドナー組織に対して特異的耐性を誘導することに基づく。従って、移植組織の拒絶反応を予防するための理想的な薬剤は、長期間の免疫抑制の必要性のない、ドナー反応性Ｔ細胞のクローン性非応答、すなわち、アネルギーを誘導すべきである。アネルギーは、「共刺激性」シグナルの非存在下の、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とペ
プチド提示主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原との間の相互作用後の、細胞間シグナル化によると考えられている。非特許文献１。この共刺激性シグナルは、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面により提供される。非特許文献２；および非特許文献３。
【０００７】
Ｔ細胞は、インビボでの正常な免疫応答時に重要な役割をなす。それらには、細胞毒性、遅延型過敏、およびＢ細胞によるＴ細胞依存性抗体産生が含まれる。さらに、Ｔ細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、リンホトキシン、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような広範囲の種々のリンホカインを産生し得る。
【０００８】
Ｔ細胞の活性化は、リガンド−レセプター相互作用に起因する。生理学的条件下で、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ＡＰＣのＭＨＣ分子により提示される抗原性ペプチドに結合する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、抗原誘導活性化において２つの役割をなす。第一は、抗原提示ＭＨＣ分子成分中の特異的抗原の認識である。第二は、その認識事象が、シグナル化機構により形質膜を通って伝達される。しかし、抗原のＴＣＲのみへの結合は、最大のＴ細胞活性化には十分ではない。Ｔ細胞表面のその他の多くの補助分子が、付着あるいはシグナル化または両方に重要な役割をなすことは周知である。例えば、Ｔ細胞上のＣＤ２分子は、ＡＰＣのＬＦＡ−３に結合し得るが、さらに、抗体のＣＤ２への結合は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体により示されるシグナルを増大し得ることもまた示された。Ｔ細胞活性化に関するその他のリガンドペアーは、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４／ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ、および、最も重要なＣＤ２８／Ｂ７である。
【０００９】
ＴＣＲ刺激が、全Ｔ細胞活性化あるいはＴ細胞アネルギーを導くかを決定する共刺激性シグナルの適当な候補物は、Ｔ細胞上のＣＤ２８とＡＰＣのＢ７との相互作用により生産される。ＣＤ２８分子の架橋結合が、Ｔ細胞のアネルギー性になるのを救い得ることが、インビトロにおいて実証された。非特許文献４。ＣＤ２８は、見かけの分子量が４４ ｋＤａである、ホモダイマーのトランスメンブラン糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（非特許文献５）。ＣＤ２８分子は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の約９５％、および、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の５０％に発現する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体およびＣＤ２８に対するモノクローナル抗体によるＴ細胞の共刺激により、Ｔ細胞は非常に活性化される。非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８。この効果には、ＩＬ−２を含む数種のリンホカインのｍＲＮＡの安定化に明らかに関連し、これらのリンホカインの産生を大いに促進する。非特許文献７（前出）；および非特許文献８（前出）。さらに、ＣＤ２８応答要素は、ＩＬ−２遺伝子のエンハンサーで実証され、このことは、転写レベルでの調節もまた存在することを示唆している。非特許文献９、および、非特許文献１０。ＣＤ２８に介在されるＴ細胞活性化のある種のモデルが、ＣｓＡによる阻害に対して比較的に耐性であることが報告された。非特許文献１１。
【００１０】
Ｂ７は、見かけの分子量が４５−６５ ｋＤａである、トランスメンブラン糖タンパク質であり、ＣＤ２８のように免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。非特許文献１２。Ｂ７発現ＣＨＯ細胞は、ＴＣＲ刺激と相乗作用し得、このことによりＩＬ−２分泌およびＴ細胞増殖をもたらす。非特許文献１３；および、非特許文献１４。Ｂ７はまた、ＣＴＬＡ−４分子の組換え融合タンパク質に結合する。非特許文献１５。ＣＴＬＡ−４もまた免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、そしてＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の細胞質領域は、有意に相同である。非特許文献１６。Ｂ７分子は、活性化Ｂ細胞（非特許文献１２、前出）、ＩＦＮ−γで刺激された単球（非特許文献１７）、および、単離された末梢血樹枝状細胞（非特許文献１８）で発現される。免疫組織化学の研究によれば、Ｂ７分子はまた、インビボにおいて、リンパ組織および非リンパ組織の両方の樹枝状細胞上に構成的に発現される。非特許文献１９。
【００１１】
インビボにおいて、Ｂ７抗原は、移植組織拒絶反応時にＴ細胞活性化に関連する。Ｌｅｎｓｃｈｏｗおよび共同研究者は、ヒトＣＴＬＡ−４と免疫グロブリンＧ１ Ｆｃ領域との可溶性融合タンパク質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）（これは、マウスおよびヒトＢ７の両方に強く結合する）を使用して、マウスヘの移植後の、ヒト膵島の拒絶反応を予防した（非特許文献２０）。ここでＣＴＬＡ４Ｉｇは、異種移植（Ｔ細胞が由来する種に対する外来抗原）の拒絶反応を遮断する。
【００１２】
Ｂ７とＣＤ２８抗原間の相互作用を妨害する分子は公知である。可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、この相互作用を部分的に遮断することが知られている。非特許文献２１。抗ＣＤ２８抗体もまたこの相互作用を遮断することが知られている。さらに、抗Ｂ７抗体が当該分野において公知である。非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４。
【００１３】
ＩＩＩ．Ｂ細胞活性化およびＣＤ４０抗原−リガンド系
Ｂ細胞は、インビボにおける正常な免疫応答時に重要な役割をなす。外来抗原は、特異的Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンに結合し、このことにより、エンドサイトーシス、プロセシング、ＭＨＣクラスＩＩ分子上のプロセスされたペプチドの提示、および、Ｂ細胞表面のＢ７抗原の上昇調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を含む一連の事象の引金となる。次に、特異的Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されたプロセス抗原のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）認識を介してＢ細胞に結合する。ＴＣＲを介する刺激は、Ｔ細胞の活性化を開始し、Ｔ細胞のサイトカイン産生を始める。Ｔ細胞のＣＤ２８抗原とＢ細胞のＢ７抗原との間の相互作用は、さらにＴ細胞を活性化する第二のシグナルを提供し得、高レベルのサイトカイン分泌をもたらす。さらに、休止ヒトＴ細胞では発現されないＣＤ４０リガンドは、上記のシグナルを受けると、Ｔ細胞表面で上昇調節される。次に、Ｂ細胞は、Ｂ細胞表面のＣＤ４０抗原を介してＣＤ４０リガンドにより刺激され、そしてまた、可溶性サイトカインによっても刺激されて、このＢ細胞は成熟化して高レベルの可溶性免疫グロブリンを分泌する形質細胞になる。
【００１４】
数年前に、非特許文献２５では、ＥＬ４Ｂ５として知られるマウス胸腺腫ＥＬ−４系の変異体サブクローンは、ネズミおよびヒト起源の両方のＢ細胞を強く刺激して増殖し、インビトロにおいて免疫グロブリンを分泌する形質細胞に分化し得た。この活性化は、抗原非依存的であり、ＭＨＣ制限されないことが見いだされた。ヒトＢ細胞の最適刺激には、活性化ヒトＴ細胞由来の上清液の存在が必要であるが、ＥＬ４Ｂ５細胞がホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）あるいはＩＬ−１で予め活性化されているときには、Ｂ細胞応答もまた生じた。非特許文献２６；および、非特許文献２７。この培養系でのＢ細胞活性化は効率がよい−−制限希釈実験は、ヒトＢ細胞の大部分が、活性化されて増殖し、抗体分泌細胞に分化し得ることを示した。非特許文献２８。
【００１５】
これらの変異体ＥＬ−４細胞が、ネズミおよびヒト両方のＢ細胞を活性化する機構は、以前には解明されなかった。しかし、ＥＬ４Ｂ５に誘導されるＢ細胞の活性化には、細胞−細胞接触が必要であることは明らかである。第一に、Ｂ細胞は、ＰＭＡに刺激されるＥＬ４Ｂ５細胞に由来の上清液の存在下では増殖しない。Ｚｕｂｌｅｒら、（１９８５）前出。第二に、Ｂ細胞は、半透過濾過膜により、ＰＭＡで処理したＥＬ４Ｂ５細胞から分離されると、増殖しない。Ｚｈａｎｇら、前出。マウスＬＦＡ−１、ヒトＬＦＡ−１あるいはヒトＬＦＡ−３に対する抗体、および、マウスあるいはヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に対する抗体は、ヒトあるいはネズミＢ細胞のＥＬ４Ｂ５に誘導される増殖を抑制しない。Ｚｕｂｌｅｒら、（１９８７）およびＺｈａｎｇら、前出。
【００１６】
ＣＤ４０抗原は、Ｂ細胞の細胞表面に発現される糖タンパク質である。Ｂ細胞の分化のときに、この分子はまず前Ｂ細胞上に発現され、次いで、Ｂ細胞が形質細胞になるときに
、その細胞表面から消える。ＣＤ４０分子の抗ＣＤ４０抗体との架橋は、Ｂ細胞に種々の効果を媒介する。ＣＤ４０抗原はヒト神経成長因子（ＮＧＦ）レセプターおよび腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）レセプターに関連することは周知であり、このことは、ＣＤ４０がＢ細胞活性化における重要な機能を有するリガンドに対するレセプターであることを示唆する。
【００１７】
ＣＤ４０のリガンドは、活性化Ｔ細胞の細胞表面で同定された。非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１。ＣＤ４０リガンドのｃＤＮＡクローニングは、ＴＮＦ−αと相同であるＩＩ型トランスメンブラン糖タンパク質の特性を有する分子を明らかにした。非特許文献３２、および、非特許文献３３。ＣＤ４０リガンドの細胞外ドメインは、トランスメンブラン領域に近接した２つのアルギニン残基を含有し、これらはタンパク質分解的切断を受けてリガンドの可溶性形態を生じ得る可能性のある部位を提供する。組換えＣＤ４０リガンドの発現は、この分子が精製Ｂ細胞の増殖を刺激し、そしてＩＬ−４と共同してＩｇＥの分泌を媒介し得ることを示した。非特許文献３２、および非特許文献３３、前出。結果として活性化Ｔ細胞上の機能性分子がなくなる、ＣＤ４０リガンドの遺伝子の異常のせいで、被験体がＩｇＭ以外の抗体イソ型を正常なレベルで産生できないことに特徴があるまれな病気であるＸ連鎖性高ＩｇＭ症候群が起こることが報告された。非特許文献３４；および、非特許文献３５。
【００１８】
当業者に公知の全ての抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＢ細胞に刺激効果を有する。公知の抗ＣＤ４０抗体を用いるＢ細胞表面上へのＣＤ４０分子の架橋は、Ｂ細胞に種々の効果を媒介する。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、細胞間接着、増殖、および、ある種のサイトカインと共同して、抗体を分泌する細胞への成熟化を誘導し得る。例えば、公知の抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、Ｂ細胞活性化においてＴヘルパー細胞の効果を模倣することを示した。ＦｃγＲＩＩを発現する付着細胞上にもたらされると、これらの抗体はＢ細胞の増殖を誘導する。非特許文献３６。さらに、公知のＣＤ４０ ｍＡｂは、ＩＬ−４の存在下で、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＥの分泌のためのＴヘルパーシグナルに代わり得る。非特許文献３７。さらに、公知の抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、リンパ節から単離されたＢ細胞のプログラムされた細胞死（アポートシス）を防止し得る。
【００１９】
【非特許文献１】Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）７：４４５
【非特許文献２】Ｈａｗｒｙｌｏｗｉｃｚ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：４０８３
【非特許文献３】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）５：２２３
【非特許文献４】Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６：６０７
【非特許文献５】Ａｒｕｆｆｏ，Ａ、およびＳｅｅｄ，Ｂ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９８７）８４：８５７３
【非特許文献６】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９８９）８６：１３３３−１３３７
【非特許文献７】Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３：１５３−１６１
【非特許文献８】Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３３９−３４３
【非特許文献９】Ｆｒａｓｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：３１３
【非特許文献１０】Ｖｅｒｗｅｙ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：１４１７９−１４１８２
【非特許文献１１】Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）７：４４７２−４４８１
【非特許文献１２】Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３：２７１４−２７２２
【非特許文献１３】Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１３７：７２１−７３０
【非特許文献１４】Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９９１）８８：６５７５
【非特許文献１５】Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１７４：５６１−５６９
【非特許文献１６】Ｈａｒｐｅｒ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７：１０３７
【非特許文献１７】Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１３７：４２９−４３７
【非特許文献１８】Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９２）９０：２２９−２３７
【非特許文献１９】Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｐ．ら、”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（１９９３）
【非特許文献２０】Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５７：７８９−７９２
【非特許文献２１】Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）７４：５６１
【非特許文献２２】Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８２）１２８：８２３
【非特許文献２３】Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：３２６０
【非特許文献２４】Ｖａｌｌｅ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９０）６９：５３１
【非特許文献２５】Ｚｕｂｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）１３４：３６６２
【非特許文献２６】Ｚｕｂｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９８７）９９：２８１
【非特許文献２７】Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９０）１４４：２９５５
【非特許文献２８】Ｗｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１７：８８７
【非特許文献２９】Ｆｅｎｓｌｏｗ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１４９：６５５
【非特許文献３０】Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２２：２５７３
【非特許文献３１】Ｎｏｅｌｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９２）８９：６５５０
【非特許文献３２】Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５７：８０
【非特許文献３３】Ｓｐｒｉｇｇｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６：１５４３
【非特許文献３４】Ａｌｌｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２５９：９９０
【非特許文献３５】Ｋｏｒｔｈａｕｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６１：５３９
【非特許文献３６】Ｊ．Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２５１：７０
【非特許文献３７】Ｈ．Ｇａｓｃａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７：８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、モノクローナル抗体産生細胞を生産する方法を提供する。この抗体は、特定の細胞表面分子に対して結合特異性を有する；この方法は、上記の方法の制限を克服する。本発明はまた、抗Ｂ７抗体あるいはＢ７抗原に結合する分子を、その他の免疫抑制剤と共に使用して、Ｔ細胞アネルギーを引き起こし、そしてそのことにより移植片拒絶反応あるいはＧＶＨＤを予防あるいは治療する方法を提供する。さらに、本発明はまた、（１）Ｂ細胞応答を阻害し得、そして、（２）抗体介在性疾患の予防あるいは治療に使用し得る新しい抗ＣＤ４０抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、選択された膜関連抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗原を産生し得る不死化細胞系を生産する方法を提供する。この方法では、典型的には、バキュロウイルスベクターを用いる抗原コーディング配列の組換え発現を経て、膜関連抗原は、昆虫細胞の細胞表面に産生される。これらの昆虫細胞を、宿主動物に注射する。膜関連抗原に対する抗体を産生し得る細胞を回収する；そのような細胞を、細胞培養において増殖するために不死化する。不死化細胞を、膜関連抗原に特異的な抗体の産生についてスクリーニングする。典型的には表面に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を使用する結合アッセイを用いてスクリーニングを行う。上記非昆虫細胞表面の膜関連抗原に結合する抗体を産生する不死化細胞を、選択する。
【００２２】
１つの実施態様では、膜関連抗原をコードするＤＮＡ配列を、選択された昆虫細胞での抗原発現に適したバキュロウイルスベクター中に、作動可能に挿入する。抗原をコードするＤＮＡ配列を有するベクターを、例えばベクターのトランスフェクションにより、昆虫細胞へ導入する。細胞表面の膜関連抗原を産生するベクターで形質転換された昆虫細胞を、選択する。
【００２３】
目的の膜関連抗原をコードする標的ＤＮＡ配列を単離する１つの方法は、標的ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡあるいはＲＮＡテンプレートのいずれかを使用するポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。本発明の実施に有用な昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから得られ得る。膜関連抗原に対する抗体分子を産生し得る、一般的に使用される動物細胞は、脾細胞あるいはリンパ球である；宿主動物細胞の不死化を、標準的な方法により完了する。本発明の１つの実施態様では、宿主動物はマウスである。
【００２４】
上記の方法では、表面に膜関連抗原を有する、ヒト細胞を含む多くの非昆虫細胞を使用し得る。このような非昆虫細胞は、初代細胞あるいは培養細胞であり得る。１つの実施態様では、非昆虫細胞は、培養ヒトリンパ球、特に形質転換Ｂ細胞であり得る。
【００２５】
本発明の方法において、有用な膜関連抗原には、以下のものが含まれる：ヒト細胞表面タンパク質；末梢血単核細胞の抗原標識タンパク質、例えば、ＣＤ４０あるいはＢ７；および、ヒト細胞表面に存在するウイルス抗原タンパク質。
【００２６】
本発明ではまた、選択された膜関連抗原に特異的な抗体を含有する血清を産生する方法を記載する。この方法おいて、膜関連抗原は昆虫細胞の細胞表面に存在し、この細胞を宿主動物に注射し、そして、膜関連抗原に特異的な抗体の存在について動物由来の血清をスクリーニングする。このようなスクリーニングには、典型的には、細胞表面に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合アッセイを使用する。
【００２７】
また、スクリーニングアッセイで、抗原を発現する組換え非昆虫細胞を用いて、選択された膜関連抗原に対する抗体の存在について、血清およびハイブリドーマ上清液を試験し得る。
【００２８】
本発明はまた、Ｂ７抗原に結合する分子（上記の方法により産生された抗Ｂ７モノクローナル抗体のような）と、免疫抑制剤との、被験体への共投与が、アロ抗原（Ｔ細胞と同種の細胞固有の抗原）に対して長期間継続するＴ細胞アネルギーを誘導し得るという発見に基づいている。
【００２９】
従って、本発明は、被験体における移植組織拒絶反応を予防する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（１）Ｂ７抗原に結合する分子、および（２）シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤の治療上有効な量を投与することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ７抗原に結合する分子は抗Ｂ７抗体である。
【００３０】
さらに、本発明は、被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防あるいは治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（１）Ｂ７抗原に結合する分子、および（２）シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤の治療上有効な量を投与することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ７抗原に結合する分子は抗Ｂ７抗体である。
【００３１】
さらに、本発明は、被験体のリウマチ様関節炎の予防および治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（１）Ｂ７抗原に結合する分子、および（２）シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤の治療上有効な量を投与することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ７抗原に結合する分子は抗Ｂ７抗体である。
【００３２】
上記の方法のさらに好ましい実施態様では、抗Ｂ７抗体は、本明細書に記載されているように産生された、モノクローナル抗体であり、最も好ましくはＢ７−２４モノクローナル抗体である。
【００３３】
本発明はさらに、上記の方法により産生されたヒトＢ細胞の成長および分化を刺激しない抗ＣＤ４０抗体の発見に基づく。逆に、これらの抗体は、比較的低濃度で、ヒトＢ細胞応答を阻害し得る。従って、ヒトＢ細胞応答により産生される抗体に介在される疾患あるいは症状を、予防あるいは治療するためにこれらの抗体を使用し得る。これらの抗体はまた、Ｂ細胞応答を調節するのに有用な、ＣＤ４０抗原上の新規なエピトープを認識する。
【００３４】
従って、本発明は、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体を提供し、ＣＤ４０抗原への抗体の結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を抑制する。
【００３５】
さらに、本発明は、被験体の抗体介在性疾患を予防あるいは治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含する。ここにおいて、抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を妨げる。
【００３６】
さらに、本発明は、被験体のアレルギーのようなＩｇＥ介在性疾患を予防あるいは治療
する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここにおいて、抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を妨げる。
【００３７】
さらに、本発明は、被験体の抗体介在性自己免疫疾患を予防あるいは治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここにおいて、抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を妨げる。この方法によって治療が期待される特定の自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）が含まれる。
【００３８】
さらに、本発明は、ＣＤ４０抗原の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体への結合と競合し得るＣＤ４０抗原エピトープを提供し、ここにおいて、この抗体のヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を抑制する。
【００３９】
上記目的のさらに好ましい実施態様では、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、上記の方法により産生され、そして５Ｄ１２、３Ａ８あるいは３Ｃ６のいずれかである。
【００４０】
本発明はまた、選択された膜関連抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生する不死化細胞系を生産する方法であって、該方法が以下の工程を包含する、方法を提供し、この方法は、昆虫細胞の細胞表面上で膜関連抗原を産生する工程；該昆虫細胞を宿主動物内に注入する工程；抗体分子を産生し得る細胞を該宿主動物から回収する工程；細胞培養における増殖のために該抗体分子を産生し得る細胞を不死化する工程；非昆虫細胞の表面上に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合アッセイで、膜関連抗原に特異的な抗体の産生に対して該不死化細胞をスクリーニングする工程；および該非昆虫細胞の表面上で膜関連抗原に結合する抗体を産生するこれらの不死化細胞を選別する工程を包含する。
【００４１】
好ましい実施形態においては、前記産生する工程が、以下の工程：選択された昆虫細胞内で前記抗原の発現に適するバキュロウイルスベクター内に、前記膜関連抗原をコードするＤＮＡ配列を作動可能に挿入する工程；該ベクターを用いて昆虫細胞をトランスフェクトする工程；および該昆虫細胞の細胞表面上で膜関連抗原を産生する該ベクターで形質転換された昆虫細胞を選別する工程をさらに包含する。
【００４２】
本発明はさらに、選択された膜関連抗原に対して特異的な抗体を含有する血清を生産する方法であって、該方法が以下の工程を含む、方法を提供する：昆虫細胞の細胞表面上で膜関連抗原を産生する工程；該昆虫細胞を宿主動物内に注入する工程；および細胞表面上に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合アッセイにおいて、膜関連抗原に特異的な抗体の産生に対して該動物から血清をスクリーニングする工程。
【００４３】
本発明はさらに、被験体における移植組織の拒絶反応を予防する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（ａ）Ｂ７抗原に結合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００４４】
本発明さらに、被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（ａ）Ｂ７抗原に結合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００４５】
本発明さらに、被験体におけるリウマチ様関節炎を予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（ａ）Ｂ７抗原に結合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００４６】
好ましい実施態様において、前記Ｂ７抗原に結合する分子は、抗−Ｂ７抗体である。
【００４７】
さらに好ましい実施態様では、上記方法において、前記免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。
【００４８】
本発明はさらに、被験体における抗体介在性疾患を予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与する工程を包含し、ここで該ＣＤ４０抗原への該抗体の結合が、該Ｂ細胞の成長または分化を妨げる、方法を提供する。
【００４９】
好ましい実施形態において、前記抗体介在性疾患は、ＩｇＥ介在性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）からなる群より選択される。
【００５０】
さらに好ましい実施形態では、前記モノクローナル抗体は、５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６からなる群より選択される。
【００５１】
本発明はさらに、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免疫反応するＣＤ４０抗原エピトープであって、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原への該モノクローナル抗体の結合が、該Ｂ細胞の成長または分化を妨げる、ＣＤ４０抗原エピトープを提供する。
【００５２】
本発明さらに、モノクローナル抗体Ｂ７−２４を提供する。
【００５３】
本発明さらに、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体であって、該ＣＤ４０抗原への該抗体の結合が、該Ｂ細胞の成長または分化を妨げる、モノクローナル抗体を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６からなる群より選択されるモノクローナル抗体を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載されている発明は、以前に公表された刊行物および係属中の特許出願を引用する。例えば、このような刊行物は、科学報文、特許、あるいは係属中の出願からなる。以上あるいは以下に掲載されたこれらの全刊行物および出願は、本明細書中で参考として援用されている。
【００５６】
Ｉ．定義：
本明細書で使用される用語「膜関連抗原」、「細胞表面分子」および「細胞表面抗原」とはすべて、タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドのことであり、このタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドの少なくとも１つの抗原性部分が、生物学的膜の表面に露出し、以下に示す１つまたはそれ以上の共有結合された部分を有し得る：１つまたはそ
れ以上の単糖あるいは複合糖部分（糖タンパク質として）、脂質部分（リポタンパク質として）、脂質および糖の組合せ部分、あるいは、その他翻訳後の改変。
【００５７】
「タンパク質」とは、典型的にはアミノ酸の長い鎖に基づくポリマー（ポリペプチド）のことである。タンパク質は、１つ、２つ、あるいはそれ以上のポリペプチド鎖から構成され得、さらに、炭水化物のようなポリペプチド鎖に関連するその他の型の物質を含有し得る。タンパク質の大きさは、（任意の数である）５，０００から数十万ｇ／ｍｏｌｅの広範囲におよぶ。５，０００の数は、およそ４０−４５個のアミノ酸の存在に対応する。約５，０００ｇ／ｍｏｌｅ未満のタンパク質は、典型的にはポリペプチドあるいは単にペプチドと呼ばれる（Ｂｏｈｉｎｓｋｉ）。
【００５８】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体、および、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶのようなそれらのフラグメント、ならびに、親抗体の抗原結合機能をとどめているその他のフラグメントのことである。
【００５９】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体分布を有する抗体組成物のことである。この用語は、抗体の種あるいは起源に関して限定されず、さらに産生される様式により限定されることも意図されない。この用語は、全免疫グロブリン、および、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶ、およびその抗体の抗原結合機能をとどめているその他のフラグメントのことを指す。いかなる哺乳類種のモノクローナル抗体でも、本発明に使用され得る。しかし実際問題として、モノクローナル抗体を産生するために要求されるハイブリッド細胞系あるいはハイブリドーマをつくるのに使用するラットあるいはネズミ細胞の入手可能性の理由により、抗体は典型的にはラットあるいはネズミ起源となる。
【００６０】
本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」とは、免疫グロブリンの枠組み構造領域の少なくとも一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
【００６１】
本明細書で使用される用語「１本鎖抗体」とは、結合抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）を決定し、結合機能を保存し得る連結部分を供給することにより調製される抗体のことである。本質的にこれは、抗原への結合に必要な可変領域部分のみを有する、根本的に短縮された抗体の形をとる。１本鎖抗体の決定および構築は、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００６２】
本明細書で使用される用語「Ｂ７抗原に結合する分子」とは、同じ環境下ではその他の物質がＢ７抗原に複合体化されない環境下で、Ｂ７抗原と複合体を形成し得る分子を意味する。その複合体は、ＣＤ２８あるいはＣＴＬＡ４抗原を介する、Ｂ７の正常なシグナル変換経路を遮断する様式で形成される。Ｂ７抗原に結合する分子には、Ｄ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗Ｂ７抗体が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される用語「ＣＤ４０抗原エピトープ」とは、ＣＤ４０抗原それ自身を除いた、本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免疫反応し得る分子のことである。ＣＤ４０抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメンント、ペプチド、炭水化物、脂質、およびその他の分子を含み得るが、本発明の目的に対しては、最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド擬似体（すなわち、ＣＤ４０抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）、あるいはそれらの組合せである。適切なオリゴペプチド擬似体は、特に、ＰＣＴ出願ＵＳ９１／０４２８２に記載されている。
【００６４】
ＩＩ．膜関連抗原分子に対する抗体の生産
この章では、免疫原としてトランスフェクトされた昆虫細胞を使用する、細胞表面分子に対する抗体の生産および選択の方法を記載する。本発明のトランスフェクトされた昆虫細胞はまた、スクリーニングアッセイに使用され得る。
【００６５】
１つの実施態様では、本発明は、細胞表面抗原に対するポリクローナル抗体を産生する方法を包含する。この方法は以下の工程を包含する：（ｉ）目的の抗原をコードする核酸コーディング配列の選択および単離、（ｉｉ）コーディング配列の効率よい発現を得るための、バキュロウイルス発現ベクターヘのコーディング配列の挿入、（ｉｉｉ）選択された抗原を発現する組換え昆虫細胞を得るための、発現ベクターの昆虫細胞へのトランスフェクト、および（ｉｖ）膜関連抗原を発現する昆虫細胞を用いた宿主動物の免疫；を包含する、免疫工程。
【００６６】
免疫後に、宿主動物の血清を、目的の抗原を発現する、昆虫細胞以外の細胞に対してスクリーニングする。あるいは、目的の抗原を含有する膜画分、またはある場合には、精製した組換え産生抗原自体を、血清をスクリーニングするために使用し得る。典型的には、（ａ）予め採血された血清、（ｂ）目的の抗原を発現しない昆虫細胞で免疫した宿主動物の血清、および（ｃ）組換え昆虫細胞で免疫した宿主動物の血清を、スクリーニングする。目的の抗原に特異的な抗体の存在は、血清（ａ）および（ｂ）による陰性反応、および血清（ｃ）による陽性反応によって示される。
【００６７】
本発明の別の実施態様では、本発明は、細胞表面タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマの生産方法を包含する。この方法には、上記の（ｉ）から（ｉｖ）の工程が包含される。組換え昆虫細胞を用いた宿主動物の免疫後に、抗体産生細胞を、動物から単離する。本発明の好ましい実施態様では、このような抗体産生細胞は、ハイブリドーマ細胞を生産するために使用され、このハイブリドーマ細胞はクローン化されてモノクローナル抗体の産生に使用される。このようなハイブリドーマ細胞由来の上清液を、例えば、以下に記載されている細胞に基づくスクリーニングアッセイにより、特異的な抗体産生についてスクリーニングする。
【００６８】
Ａ．膜分子に対するコーディング配列の単離
選択された膜関連抗原に対する核酸コーディング配列は、公知の上記抗原のタンパク質成分に対するアミノ酸および／またはＤＮＡコーディング配列に基づいて単離され得る。このコーディング配列は、生物学的ソースから標準の方法で単離され得る（Ａｕｓｕｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓａｍｂｒｏｏｋら）（例えば、ハイブリダイゼーション、分化ハイブリダイゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、クローニングおよびプラークスクリーニングなど）。また、目的の抗原をコーディングする合成オリゴヌクレオチド配列は、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得、または、例えばＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入され得る。大きなコーディング配列の場合、上記オリゴヌクレオチドコーディング配列は、このコーディング配列に対応した多数のオリゴヌクレオチドフラグメントの縦列配列を包含する一連のクローニング工程を経て合成され得る（Ｃｒｅａ；Ｙｏｓｈｉｏら；Ｅａｔｏｎら）。オリゴヌクレオチドコーディング配列は、標準の組換え方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ａｕｓｕｂｅｌら）で、または、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら）で増幅され単離され得る。
【００６９】
上記膜関連抗原の配列が公知のまたは一部公知の場合、特異的な抗原コーディング配列が単離され得る。典型的には、この抗原コーディング配列は、ｃＤＮＡライブラリーから単離され、ＤＮＡフラグメントを、選択されたソースからベクターへ挿入することによって生産され得る。膜抗原含有ソース由来のＤＮＡフラグメントを含有するｃＤＮＡライブラリーは、標的ＲＮＡ分子から生産されたランダムフラグメントｃＤＮＡ分子を用いて組
み立てられ得る。このようなｃＤＮＡライブラリーは、一般にバクテリア系（例えば、ラムダｇｔ１０（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を用いて組み立てられ得るだけでなく、従来技術を用いて、酵母または真核性発現系においても組み立てられ得る（Ａｕｓｕｂｅｌ）。
【００７０】
このライブラリーは、典型的には、プローブとして、公知の、または、抗原コーディング領域とハイブリダイゼーション可能なコンセンサス配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、膜関連抗原ＤＮＡ配列の存在に対してスクリーニングされる（通常はハイブリダイゼーションによる；Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら）。上記プローブは、放射性同位元素、ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む多くの検出部分を有し得る。また、核酸プローブ配列が利用できない場合、目的のコーディング領域を有するクローンのスクリーニングは、例えば、免疫スクリーニングを用いて実行され得る（Ｐｒｏｍｅｇａ社製”ＰＲＯＴＯＣＬＯＮＥ”ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１系を使用；Ｙｏｕｎｇら；Ｈｕｙｎｈら）。
【００７１】
コーディング領域は、正のシグナルを与える組換え型単離体から（ハイブリダイゼーションまたは免疫学的スクリーニングのいずれかによって）単離される。典型的には、コーディング領域を含有するＤＮＡフラグメントは、制限消化によって単離され、次いでサイズ分画およびフラグメント精製される。このような核酸コーディング領域は、次いで、以下のＢ項に記述されるｐＡｃＣ８ベクター（図１Ａ）のようなバキュロウイルス転移ベクターに挿入するために加工され得る。また、ｐＶＬ１３９３ベクター（Ｌｕｃｋｏｗら）およびｐＡｃ３Ｔ３ベクター（Ｓｕｍｍｅｒｓら）を含有するバキュロウイルスベクターが利用できる。
【００７２】
また、コーディング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら）によっても単離され得る。上記ＰＣＲに有用なプライマーは、公知の核酸配列いずれからも誘導され得る。正確な配列が公知でない場合、縮重プライマーが使用され得る（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら）。典型的には、これらのプライマーは、８個またはそれ以上の共直線ヌクレオチドからなる２つの核酸配列であり、ここで、この２つの配列は、標的配列を生産するために、ある一定の間隔で分割され（実施例１）、対向するストランドに相補的である。
【００７３】
典型的なＰＣＲサイクルは以下の工程を包含した：高温での溶融、続いてアニーリング、および伸張。この反応を２５−３０サイクル繰り返す。ＰＣＲ生成物は制限酵素によって消化され得、そして、分離用１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動で分析され得る。クローンに特異的な、増幅されたフラグメントは、典型的には電気泳動ゲルサイズ分画法によって同定される。このクローンされた特異的なＤＮＡフラグメントは、次いで、例えば”ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ”系（ＢＩＯ １０１，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を用いて、上記ゲルから回収される。必要であれば、このＤＮＡは、フェノールおよび／またはフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出され得る。単離されたＤＮＡは、エタノールで沈澱する。沈澱後、このＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクターに挿入するために使用される。
【００７４】
ヒトＣＤ４０またはＢ７抗原を発現するＳｆ９細胞の生産を、模式的に図１Ｂに示す。図に示すように、ＲＮＡは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換ヒト脾臓細胞群から、標準の方法を用いて単離される（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら）。総ＲＮＡは、確立した方法によるランダムヘキサマープライミングを用いて、ｃＤＮＡに転化される（詳細は実施例１に示す）。目的の膜関連抗原分子をコーディングするＤＮＡ分子は、５’末端におけるクローニングに対する制限部分を有する順方向および逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅によって生産される。ヒトＣＤ４０およびヒトＢ７抗原に対するコーディング
領域の調製に使用されるこのようなｃＤＮＡプライマーを、図２に示す。これらのプライマーは、ＣＤ４０およびＢ７抗原に対する確立された完全なＤＮＡコーディング配列に基づいて構築された（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、１９８９）。
【００７５】
さらに図１Ｂに関して、ｃＤＮＡは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｓから得られたポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼ、等モルのデオキシヌクレオチドの混合物、および緩衝液系の存在下で、順方向プライマーおよび逆方向プライマーと混合される（実施例１）。この混合物は、熱循環器中で増幅され、得られたＰＣＲ産物は、バキュロウイルス転移ベクターのポリリンカー中でサブクローニングされる。このようなベクターの１つであるｐＡｃＣ８を、図１Ａに図形的に示す。ポリヘドリンプロモーター（Ｍｉｌｌｅｒ）（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の下流に独特な制限エンドヌクレアーゼ部分を含有する多くのこのようなバキュロウイルス転移ベクターはいずれも、本発明の実施に使用され得る：Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）（Ｗｕら；Ｍａｔｓｕｕｒａら；Ｔａｋｅｈａｒａら）、または、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス（ｐＢｍＮＰＶ）ポリヘドリンｍＲＮＡ（Ｎｙｕｎｏｙａら；Ｓｅｋｉｎｅら）。
【００７６】
バキュロウイルス中の発現前に、ＤＮＡの挿入は、典型的には配列決定分析によってＰＣＲ誘導突然変異について検査される。
【００７７】
Ｂ．抗原コーディング配列のバキュロウイルスベクターへの挿入
膜関連抗原コーディング配列のバキュロウイルスベクターヘの挿入は、確立した方法に従って実行される（Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。ヒトＢ７およびヒトＣＤ４０をコーディングする全長ｃＤＮＡは、クローニングに対する制限部分を有するプライマーを用いたＰＣＲによって生産された。ＰＣＲ増幅に対する鋳型は、ＥＢＶ形質転換ヒト脾臓Ｂ細胞ＲＮＡから生産されたｃＤＮＡであった。手短に言えば、単離されたＤＮＡコーディング領域は、バキュロウイルス転移ベクター、または、ｐＡｃＣ８プラスミドのようなプラスミドに連結され、その結果、膜関連コーディング領域はポリヘドロンプロモーターの下流となる。このポリヘドロン遺伝子ＡＴＧはＡＴＴに突然変異し（図１Ａ）、機能性ＡＴＧを有するコーディング配列を含有しない組換え型クローンにおける翻訳開始が起こらないようにする。生じるプラスミドＤＮＡは、野生型バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）で、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９細胞）由来の昆虫細胞にトランスフェクションされ、野生型ウイルスと膜関連抗原遺伝子を運搬する組換え型ベクターとの間の生体内組換えを経て、組換え型ウイルス粒子を創造する。
【００７８】
実施例１−２は、ＤＮＡの異形セグメントを含有する組換え型バキュロウイルスベクターの単離を記述する：すなわち、ｐＡｃＣＤ４０（全長ＣＤ４０分子をコーディングする）、ｐＡｃＣＤ４０−ＥＤ／Ｇｌｕ（ＣＤ４０の細胞外ドメインをコーディングする）、ｐＡｃＢ７（全長Ｂ７分子をコーディングする）、およびｐＣｃＢ７−ＥＤ／Ｇｌｕ（Ｂ７分子の細胞ドメインをコーディングする）の単離を記述する。
【００７９】
Ｃ．昆虫細胞のバキュロウイルスベクターによる感染
上記の組換え型ウイルスは、次いで、昆虫細胞を共感染させるために使用された（実施例２）。これらの細胞は、次いで、異形のＤＮＡ挿入によってコーディングされた抗原を発現させた。
【００８０】
Ｓｆ９細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；Ｓｕｍｍｅｒｓら）は、１０６細胞／ｍｌの密度で、組換え型ウイルスで感染させた。組換え型バキュロウイルス
に感染したＳｆ９細胞は、同定され、そしてクローン精製された（Ｓｕｍｍｅｒｓら）。
【００８１】
細胞表面抗原を発現させる細胞は、４８時間後に収穫され、そして宿主動物の免疫化に使用された。分泌組換えタンパク質の生産のために、上記細胞は７２時間の培養後収穫された。
【００８２】
Ｓｆ９細胞表面上の組換え型分子の発現（実施例３）は、ＥＬＩＳＡシステム（Ｈａｒｌｏｗら）を用いて試験された。図３は、抗（Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＢ−１は、ＡｃＢ７ウイルスに感染したＳｆ９細胞のみと反応し、ヒトＣＤ２６を発現させるＳｆ９細胞とは反応しなかったことを示す。対照的に、抗（ＣＤ２６）モノクローナル抗体Ｔａ−１は、ＣＤ４０を発現させるＳｆ９細胞のみと反応した。図４は、抗（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｓ２Ｃ６が、ＣＤ４０を発現させるＳｆ９細胞のみと反応し、Ｂ７を発現させるＳｆ９細胞とは反応しなかったことを示す。これらの結果は、バキュロウイルス系における選択された膜関連抗原の生産に対する本発明の方法の特異性を示す。これらの結果は、膜関連抗原がＳｆ９細胞表面上でさらされることも示す。
【００８３】
さらに、これらの結果は、選択された膜関連抗原を発現させるＳｆ９細胞が、選択された抗原に対する反応性を有する抗体の存在に対して、血清およびハイブリドーマ上清液をスクリーニングするために使用され得ることを示唆する。
【００８４】
Ｄ．膜関連抗原を発現する昆虫細胞の宿主動物への注入
ポリクローナル抗体の生産に適当な宿主動物には、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、チンパンジー、およびイヌが挙げられる。本発明の１つの利点は、免疫化アジュバントが一般に必要とされないことである。
【００８５】
モノクローナル抗体の生産に使用される適当な宿主動物には、通常、ラット、ハムスター、およびマウスが挙げられる。しかし、ヒトに免疫的に近い抗体の生産を所望する場合、このような抗体のソースは、チンパンジーのような高等な霊長類を含み得る。ヘテロミエローマ融合パートナーとの融合は、モノクローナル抗体の生産に使用され得る（Ｃａｒｒｏｌｌ；Ｐｅｒｋｉｎｓ，１９９１）。このような融合は、混合した細胞のポリエチレングリコールヘの曝露、および、細胞の強い電場への曝露（電気融合）を含む多くの当業者に公知の方法によって達成され得る（Ｈａｒｌｏｗら）。ハイブリドーマは、選択培地中での増殖によって選択され、次いで、以下に記載のように抗原特異性について試験される。
【００８６】
ＣＤ４０およびＢ７に対するモノクローナル抗体の生産について、マウスが、細胞表面上に上記分子を発現させるＳｆ９細胞によって免疫化された（実施例５）。２回目の免疫化の１週間後、マウスは採血され、そして、血清は、特異性抗体の存在に対してＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の蛍光細胞染色により分析された（実施例３）。図５は、上記細胞染色の結果を示す。この細胞染色は、ＣＤ４０またはＢ７を発現させるＳｆ９細胞によって免疫化されたマウスが、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ ２０８５２）に対するＣＤ４０およびＢ７の双方に対し陽性である血清力価（ｔｉｔｒｅ）を有したことを示す。これに対して、対照Ｓｆ９細胞によって免疫化されたマウスは、上記ＡＲＣ細胞に対する活性を示さなかった。この結果は、宿主動物が、選択の膜関連抗原を発現させるＳｆ９細胞によって免疫化され得ることを示し、免疫化の結果、組換え型抗原に対する抗体を含む免疫応答が起こることを示す。上記の免疫化は、Ｓｆ９昆虫細胞中でクローンされた組換え型ヒトタンパク質以外のヒトタンパク質と相互反応性である抗体を生じない。
【００８７】
あるマウスにはＳｆ９細胞を発現させるＣＤ４０を、あるマウスにはＳＦ９細胞を発現させるＢ７を、最終ブースター注射で投与した。ブースター注射の３日後、脾臓は除去され、そして脾細胞はＳＰ２／０ネズミミエローマ細胞と融合された。
【００８８】
Ｅ．特異的な抗体産生リンパ球の単離および不死化
モノクローナル抗体産生のための抗体産生リンパ球は、好ましくは、免疫化された宿主動物の骨髄、脾臓またはリンパ節から単離され得るようなＢ−リンパ球である（Ｈａｒｌｏｗら）。
【００８９】
また、Ｂ−リンパ球は末梢循環から単離され得る。この場合、血液試料は遠心分離され、そして勾配分離法（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって粗（ｃｒｕｄｅ）末梢血リンパ球（ＰＢＬ）混合物を産生する。単球およびＴ−リンパ球は、確立した手法によって、選択的にこの細胞混合物から除去される（Ｍｉｓｈｅｌｌ）。上記の残りの細胞には、「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」手続のような選択手続がとられ得る。この手続中に、抗原親和性を有する細胞は、抗原を含有する親和性マトリックスによる選択的捕捉によって濃縮される。本発明の意味からは、このようなマトリックスは、膜関連抗原を発現させる細胞を含有する。
【００９０】
Ｂ−リンパ球が上記の循環から単離される場合、エプスタイン−バーウイルスのような形質転換ウイルスによる形質転換が有利であり得る。形質転換細胞（リンパ芽球様細胞）は、継代培養ウェル中で分配され、そして培地中で数週間維持され、特異性抗体産生に対して試験される。このような特異性抗体産生を示す培地は、拡張され、そして、上記のようなポリエチレングリコールまたは電気融合を含む１つまたはそれ以上の標準の融合プロトコルを用いて、種に適するミエローマパートナー細胞と融合される。種々のソース由来のＢ−リンパ球の単離および不死化の方法は、当業者に周知である。
【００９１】
本発明を支持すべく実行された実験において、免疫化されたマウス由来の脾細胞は、以前にｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８８）によって記述されたように、ＳＰ２／０ネズミミエローマ細胞ポリエチレングリコールと融合された。ハイブリドーマクローンは実施例６に記載のように処理された。
【００９２】
表１（実施例６）は、融合データを要約する。ＣＤ４０融合の後、細胞の半分のみが、４８０ウェル中でシードされた。この結果、ハイブリドーマが３５１ウェル中で増殖した。Ｂ７融合の後、この細胞は９６０のウェル中に分配され、そして、この融合によりハイブリドーマが３１２ウェル中で増殖した。融合の１４日後、１２ウェルの上清液がプールされ、このプールは、ＡＲＣ細胞反応性である抗体の存在について試験された。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ４０融合由来の４つのプールおよびＢ７融合由来の１つのプールがＡＲＣ細胞に対して反応性であることを明らかにした。反応性を示すプール由来の個々の上清液が再試験され、ＣＤ４０反応性の４ウェルおよびＢ７反応性の１ウェルが同定された。上記の反応性ウェル由来の細胞は、限界希釈によってクローニングされ、そして、３回の細胞増殖の後、４つの安定な抗−（ＣＤ４０）ハイブリドーマクローン（ＣＤ４０−３Ａ８、ＣＤ４０−３Ｃ６、ＣＤ４０−５Ｄ１２、ＣＤ４０−５）および１つの安定な抗−（Ｂ７）ハイブリドーマクローン（Ｂ７−２４）が確立された。これらの結果は、選択された膜関連抗原に対するモノクローナル抗体を分泌する安定なハイブリドーマクローンを達成する能力を示す。
【００９３】
ハイブリドーマ融合物をスクリーニングする多くの方法が利用でき（Ｈａｒｌｏｗら）、これらは以下を包含する：（ｉ）例えば、放射性標識された一部精製または精製抗原のような標識された抗原、（ｉｉ）例えば、組換え型抗原を発現させるＳｆ９細胞のような全細胞または透過細胞、を用いる抗体捕捉、および、（ｉ）溶液中の抗体／抗原、（ｉｉ
）固相の抗体／抗原、を用いる抗原捕捉。
【００９４】
Ｆ．モノクローナル抗体の特異性の試験
ＥＢＶ−形質転換細胞を、１次ハイブリドーマ上清液のスクリーニングに用い、そして限界希釈クローニングの後の生成物のスクリーニングに用いた。以下に示す複数の証拠は、４種の抗−（ＣＤ４０）および１種の抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体が生成されたことを示唆する。
【００９５】
第１に、５種のハイブリドーマクローン全部からの上清液は、ＡＲＣ細胞および他のＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系と反応したが、Ｔ細胞系のＨＳＢ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）およびＣＥＭＭ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）とは反応しなかった。
【００９６】
第２に、競合結合実験を、本発明のモノクローナル抗体および可溶形標的抗原を用いて行った（実施例７）。ハイブリドーマ上清液を可溶形ＣＤ４０およびＢ７とあらかじめインキュベートした（実施例７）。続いて、混合物を蛍光細胞染色のためにＡＲＣ細胞に添加した。競合実験の結果を図６に示す。データは、可溶性Ｂ７が、ＡＲＣ細胞に対する抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体Ｂ７−２４の結合を遮断し得たが、可溶性ＣＤ４０はし得なかったことを示す。逆に、可溶性ＣＤ４０は、ＡＲＣ細胞に対する抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体ＣＤ４０−３Ａ８の結合を遮断し得たが、可溶性Ｂ７はし得なかったことを示す。別の３種の抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体でも、類似の結果を得た。さらに、可溶性ＣＤ如４０が抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体に及ぼす効果、および可溶性Ｂ７が抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体に及ぼす効果は、濃度に依存するものであった。可溶性タンパク質の量が減少すると、ＡＲＣ細胞に対する抗体の結合の遮断が減少した。
【００９７】
さらに分析するために、抗−（ＣＤ４０）および抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体を、それらの扁桃Ｂ細胞に結合する能力について試験した（実施例８）。表２は、新たに単離した扁桃Ｂ細胞の８９−９５パーセントが、４種の抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体で陽性に染色されたことを示す。ほぼ同じパーセントの細胞が、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｇ２８．５に陽性であった（Ｃｌａｒｋら）。表３は、新たに単離した扁桃Ｂ細胞の１２−１７パーセントが、抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＴ−２４で陽性に染色されたことを示す。しかし、扁桃Ｂ細胞を固定化抗−（ＩｇＭ）抗体およびＩＬ−２の存在下で、５日間インキュベートした場合、Ｂ７−２４に対する陽性細胞のパーセントは、約２５パーセントまで増加した。
【００９８】
さらに、扁桃Ｂ細胞が抗−（ＩｇＭ）抗体およびＩＬ−２で刺激された場合、Ｂ７−２４に陽性のＢ細胞の数が増加するだけでなく、細胞１個当りの蛍光染色量にも著しい増加がみられ、これは刺激後、Ｂ７の発現が増加することを示唆した。
【００９９】
上記のデータは、膜関連抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を単離する手段が、本発明の方法によって与えられることを示唆する。本発明の方法により得られたモノクローナル抗体は、上記のように類型され得る（Ｈａｒｌｏｗら）。
【０１００】
Ｇ．用途
モノクローナル抗体の生成のためには、精製した物質でマウスを免疫化することが最も望ましい。しかし、膜抗原の精製には専門的で複雑な技術を要し、そしてさらに膜からの抽出は、分子構造を改変させ得る。それに加えて、タンパク質を可溶化すると、その免疫原性がしばしば減少する。それ故に、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体のほとんどは、全細胞または膜画分でマウスを免疫化した後に、得てきた。多くの場合、特異的なリンパ球のサブセットをマウスに注射し、モノクローナル抗体の一団を得てきた。これら
の抗体を、それらが結合する抗原の単離および特徴付けに用いてきた。マウスを全細胞で免疫化したとき、多数の異分子に対して抗体が作り出される。それ故、ハイブリドーマクローンによって生成された特異的抗体をスクリーニングするために、同じ細胞を用いることは困難である。
【０１０１】
上記で触れた問題を避けるために、本発明の方法は、昆虫細胞中の膜関連抗原の発現、および宿主動物を免疫化するためのこれら昆虫細胞の使用を包含する。ＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉら、１９８５；Ｓａｉｋｉら、１９８８；Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ，ら）を導入して以来、コードする核酸のコード配列がすでに公開されているタンパク質に対するｃＤＮＡをクローン化することは比較的直接的になった。発現ベクターヘのクローニングを容易にするために、完全なコード領域のみにわたるＰＣＲプライマーを使用し得、そしてこのプライマー中に制限部位を取り込ませ得る。
【０１０２】
ヒトの細胞内、分泌、およびトランスメンブランタンパク質は、ポリヘドリンタンパク質に対する必須でないバキュロウイルス遺伝子での調節下の細胞内において発現する場合、昆虫細胞中で高レベルで発現し得る（Ｗｅｂｂら、１９８９；Ｌｕｃｋｏｗにより再検討、１９９０）。本発明を支持すべく行った実験では、ヒトＣＤ４０またはヒトＢ７を発現する５Ｘ１０６個のＳｆ９細胞を２回だけ注射すると、これらの抗原に対する良好な血清力価（ｔｉｔｒｅｓ）を得られることが示された。さらに、昆虫細胞自体は、ヒト細胞と相互反応性の免疫応答を誘起しなかった。これは、ハイブリドーマクローンによる特異的抗体産生のスクリーニングに、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を使用することを可能にした。ここで、偽陽性の結果を得る危険は最小であった。本発明の方法によって得た全ての陽性１次ウェルは、実際、免疫化に用いられた抗原に特異的であった。
【０１０３】
本発明の方法により得た抗体は、膜関連抗原に対するものであり、膜関連抗原を検出するための診断試薬として使用するのに有利である。例えば、細胞表面マーカータンパク質に対する抗体、または細胞表面から突き出ているウイルスのタンパク質に対する抗体である。
【０１０４】
１種の診断上の構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は、ウイルス特異的抗原の検出能力を有する抗ウイルス抗体の使用を包含する。例えば、抗原は、抗原捕獲アッセイによって検出される。このアッセイでは、被験体の血清試料中に存在するウイルス抗原は、抗原特異的モノクローナル抗体、または抗原特異的ポリクローナル抗体と反応する。抗体は固体基質に結合し、次いで、抗原は、抗−ウイルス抗体に対する、第２の異なった標識をした抗体によって検出される。
【０１０５】
本発明の方法によって得た抗ウイルス抗体は、抗ウイルス免疫応答を強化する手段として使用され得る。それは、抗体−ウイルス複合体が、マクロファージおよび他のエフェクター細胞によって、典型的に認識されるからである。抗体は、他の治療で用いる抗体の投与量と同量を投与し得る。例えば、狂犬病、はしかおよびＢ型肝炎のようなウイルス性疾患の早期インキュベーション中に、プールしたガンマグロブリンを、０．０２−０．１ｍｌ／ポンド体重で投与して、ウイルスが細胞内に入り込むことを阻害する。このように、膜関連ウイルス抗原と反応する抗体は、単独で、他の抗ウイルス抗体の入った「カクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）」で、または他の抗ウイルス薬剤との複合体中で、受動的に投与され得、免疫応答および／または抗ウイルス薬剤の効力を強化する。
【０１０６】
ＩＩＩ．抗体を使用する組成物
本発明は、上記の方法によって生成されるような抗体を使用することを意図する。本発明の抗体は、以下の内のどちらかである。（１）ヒトＢ細胞の表面のヒトＣＤ４０抗原と結合し、Ｂ細胞の分化、成長を刺激しない、または（２）Ｂ７抗原に結合する。しかし、
これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、一本鎖抗体、およびそれらのフラグメントであり得る。抗−ＣＤ４０抗体は、単独で用いられる。一方、抗−Ｂ７抗体は、免疫抑制剤をも含有する組成物中で用いられる。
【０１０７】
Ａ．抗体の調整
モノクローナル抗体５Ｄ１２、３Ａ８、３Ｃ６、およびＢ７−２４を、本明細書中の詳細な説明の第ＩＩ節および実施例１−７のように調製する。本発明の他のモノクローナル抗体も、これと同様に、または以下のように調製する。第１に、ポリクローナル抗体を、ＣＤ４０またはＢ７抗原に対して生じさせる。第２に、ＣＤ４０またはＢ７に特異的なモノクローナル抗体を選択する。
【０１０８】
１．ポリクローナル血清
ポリクローナル血清は、従来の方法により調製する。一般的に、まずＣＤ４０またはＢ７抗原を含有する溶液を用いて、適切な動物、特にマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫化する。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清量、および標識した抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の有用性のために、ポリクローナル血清の調製に好適である。一般的に、免疫化は、生理食塩水中、好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント中に、抗体含有溶液を混合、または乳化し、そしてその混合液または乳化液を、（一般的には、皮下または筋肉内）注射することにより行う。５０−２００μｇ／注射で、典型的には十分である。一般的に免疫化は、生理食塩水中のタンパク質を、１回またはそれ以上注射することにより、２−６週間後に高められる。この場合、フロイント不完全アジュバントを用いるのが好ましい。あるいは、当該分野で周知の方法を用いる、インビトロでの免疫化により抗体を生成し得る。本発明の目的では、インビトロでの上記の方法は、インビボでの免疫化と同等と考えられる。
【０１０９】
ポリクローナル抗血清を、以下のようにして得る。免疫化した動物から採血し、ガラスまたはプラスチックの容器に入れて、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、次いで、４℃で２−１８時間インキュベートする。血清を遠心分離（例えば、１，０００Ｘｇで１０分間）により回収する。ウサギから１回の採血当り約２０−５０ｍｌを得る。
【０１１０】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６の方法、またはその改変方法を用いて調製する。典型的に、マウスまたはラットを、上記のように免疫化する。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりはむしろ、脾臓（および任意に数個の大きなリンパ節）を取り出し、単細胞に分離する方が良い。所望であれば、脾臓細胞を（非特異的付着細胞を取り除いた後）、細胞懸濁液をタンパク質抗原でコートしたプレートまたはウェルに注ぐことによりスクリーニングし得る。抗原に対して特異的な膜関連免疫グロブリンを発現するＢ細胞はプレートに結合し、そして懸濁液の残りと共には洗い流されない。次いで、得られたＢ細胞、または全ての解離した脾臓細胞は、ミエローマ細胞との融合を誘導され、ハイブリドーマを形成する、そして選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）中で培養される。得られたハイブリドーマは、限界希釈によりプレーティングし、そして所望の免疫化細胞表面抗原に対して特異的に結合する（そして無関係の抗原には結合しない）抗体の生成についてアッセイされる。次いで、選択したｍＡｂ分泌ハイブリドーマは、（例えば、組織培養ビン、または中空ファイバーリアクターのような）インビトロ、または（マウスの腹水のような）インビボのどちらかで培養される。
【０１１１】
所望であれば、（ポリクローナルまたはモノクローナル）抗体は、従来技術を用いて標識し得る。好適な標識は、発蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）
、電子濃密試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドである。酵素は、典型的に、それらの活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量可能な青い色素に変換する能力によって検出される。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原とそれに対する特異性を有するモノクローナル抗体との場合のように、高い特異性でリガンド分子に結合する能力を有するタンパク質を指す。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および当該分野で周知のおびただしいレセプター−リガンドカップルを包含する。同じ標識でも幾つもの異なる様式で作用するので、上の試薬は、種々の標識を個々のクラスに分類することを意味するのではないことを理解すべきである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識として、または電子濃密試薬として働く。ＨＲＰは、ｍＡｂに対する酵素または抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために様々な標識を組合せ得る。例えば、ｍＡｂおよびアビジンもまた、本発明の実施において標識を必要とする：従って、ビオチンでｍＡｂを標識するならば、１２５Ｉで標識したアビジンで、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンｍＡｂで、ｍＡｂの存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内で、同等物と考えられる。
【０１１２】
ＩＶ．免疫抑制剤を含有する組成物
本発明の組成物は、２つの成分を含有する。２つの成分は、共同して、移植片拒絶反応、ＧＶＨＤ、またはリウマチ様関節炎を予防し、治療することに治療学的効果を有する。２つの成分は：（１）ＭＡｂ Ｂ７−２４のようなＢ７抗原に結合する分子；および（２）免疫抑制剤である。Ｂ７抗原に結合する分子は、上記第ＩＩＩ節に記載のように、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、および抗Ｂ７抗体を包含する。
【０１１３】
本発明の抗Ｂ７抗体（またはＢ７抗原に結合する他の分子）は、１つ、またはそれ以上の免疫抑制剤との組合せにより与えられる。免疫抑制剤は、Ｔ細胞の活性化または増殖を、遮断または阻害する薬剤である。本発明の免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、コルチコステロイド（メトトレキサート、プレドニゾロン、デキサメタゾン）、ＦＫ５０６、およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を、包含する。好ましくは、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、またはコルチコステロイドであり、最も好ましくは、シクロスポリンＡである。
【０１１４】
Ｖ．ＣＤ４０抗原エピトープ
本発明のＣＤ４０抗原エピトープは、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体との免疫反応性を有する分子である。この抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の、ヒトＢ細胞の表面にあるヒトＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長または分化を妨げる。すなわち、こういったエピトープは、ＣＤ４０抗原に対する該抗体の結合と競合する。これらのエピトープを同定するための系統だった技術は、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎによる、米国特許第４，７０８，８７１号（これは、本明細書中に参考として援用されている）に記載されているように、当該分野では周知である。典型的に、これらのエピトープは、短いアミノ酸配列である。これらの配列は、アクセスが可能な限り、より長いペプチドまたはタンパク質配列中にはめ込み得る。
【０１１５】
本発明のエピトープは、固相合成法のような標準ペプチド合成技術により調製され得る。あるいは、本発明の配列は、組換え法によって、より大きなペプチドまたはタンパク質に組み込み得る。これは、目的の配列をコードするＤＮＡカセットを調製すること、および、適切な部位において修飾されるべきタンパク質をコードしているＤＮＡ中にそのカセットを連結することにより、最も容易に達成し得る。配列ＤＮＡは、標準合成技術によって合成され得、または、好適な制限酵素を用いて、ファージｐＩＩＩ遺伝子から切り取られ得る。
【０１１６】
本明細書中、同定したエピトープは、簡単な固相技術によって調製し得る。最小の結合配列は、例えば、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎによる米国特許第４，７０８，８７１号に記載の方法を用いる標準技術によって、各エピトープについて系統的に決定し得る。簡単に言えば、それぞれのピン上のただ一つのオリゴペプチドによって、各ピン上に独特のオリゴペプチドを有するピンの固相配列に結合するＣＤ４０抗原由来の重複オリゴペプチドの１セットを合成し得る。ピンを、９６−ウェルのマイクロタイタープレートのフォーマットに合うように並べることで、例えば、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体への結合に対して、全てのピンを同時にアッセイすることが、可能になる。本方法を用いることにより、連続したアミノ酸の可能なサブセット全部に対する結合親和性を容易に決定し得る。
【０１１７】
本発明のアナログも、標準固相方法により調製され、そしてそれらの方法は、ＰＣＴ出願米国第９１／０４２８２号に記載されている。
【０１１８】
ＶＩ．処方物および投与方法
本発明の抗体および組成物は、移植組織拒絶反応を抑止するために、または（１）ＧＶＨＤ、あるいはリウマチ様の関節炎、または（２）アレルギー、ＳＬＥ、ＰＢＣ、およびＩＴＰのような抗体介在性疾患を予防あるいは治療するために治療上有効な濃度で投与される。この目的を達するために、抗体または組成物は、公知の様々な受容可能な賦形剤を用いて処方され得る。代表的には、抗体または組成物は、静脈または腹腔内のどちらかに注射することにより投与される。この投与を行うための方法は、当業者に公知である。局所的または経口的に投与、または粘膜を通じて送達され得る組成物を得ることもまた可能で有り得る。
【０１１９】
被験体に投与する前に、処方成分が抗体に添加され得る。液体の処方物が好ましい。例えば、これらの処方成分は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、あるいは充填剤を含有し得る。好ましくは、炭水化物は、モノ、ジ、またはポリサッカライドのような糖または糖アルコール、あるいは水溶性グルカンを包含する。サッカライドまたはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキシメチルセルロース、またはそれの混合物を包含し得る。スクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、−ＯＨ基を有するＣ４からＣ８の炭化水素として定義され、そしてガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを包含する。マンニトールが最も好ましい。上記のこれらの糖または糖アルコールは、個別にまたは組み合わせて用いられ得る。糖または糖アルコールは、水性調製物で可溶性である限り、使用される量に固定された制限はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％の間であり、より好ましくは２．０〜６．０ｗ／ｖ％の間である。好ましくはアミノ酸は、カルチニン、アルギニン、およびベタインの左旋性（Ｌ）型を包含するが、他のアミノ酸も添加され得る。好ましいポリマーは、平均分子量が２，０００〜３，０００の間であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量が３，０００〜５，０００の間であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。凍結乾燥前、または再構成後に溶液中のｐＨ変化を最小にするために組成物中で緩衝液を用いることも好ましい。ほとんどの生理的緩衝液が用いられ得るが、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、およびグルタミン酸塩の緩衝液、またはそれの混合物が好ましい。最も好ましいのはクエン酸塩緩衝液である。好ましくはその濃度は、０．０１〜０．３ｍｏｌ／リットルでる。処方物に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第２７０，７９９号、および第２６８，１１０号に示される。
【０１２０】
さらに抗体は、例えば、ポリマーヘの共有結合により、化学的に改変され得、その循環半減期を増加する。好ましいポリマー、およびペプチドにそれらを付着する方法は、本明細書中で参考としてそのすべてが援用される、米国特許第４，７６６，１０６号；第４，１７９，３３７号；第４，４９５，２８５号；および第４，６０９，５４６号に示されている。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化されたポリオール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水に可溶性であり、そして一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有する。ここでＲは、水素あるいはアルキルまたはアルカノール基のような保護基で有り得る。好ましくは、その保護基は、１〜８の炭素を有し、より好ましくは、それはメチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは１〜１，０００の間、より好ましくは２〜５００の間である。ＰＥＧは、好ましくは１０００〜４０，０００の間の平均分子量を有し、より好ましくは２０００〜２０，０００の間の、最も好ましくは３，０００〜１２，０００の間の平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１つの水酸基を有し、より好ましくはそれは末端の水酸基である。この水酸基は、好ましくは活性化されインヒビター上の遊離アミノ基と反応する。しかし反応基の型と量は、変動され得、本発明の共有結合的に結合されたＰＥＧ／抗体を達成し得ることが理解され得る。
【０１２１】
水溶性のポリオキシエチル化されたポリオールがまた、本発明において有用である。それらはポリオキシエチル化されたソルビトール、ポリオキシエチル化されたグルコース、ポリオキシエチル化されたグルコース、ポリオキシエチル化されたグリセロール（ＰＯＧ）などを包含する。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化されたグリセロールの骨格が、例えば、動物およびヒトで天然にモノ−、ジ−、トリグリセリドで存在する骨格と同一だからである。従って、この分枝は必ずしも身体で異質な物質として見られない。ＰＯＧは、好ましくはＰＥＧと同一の範囲の分子量を有し得る。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４〜１５０７０に示され、そしてＰＯＧ／ＩＬ−２結合体の議論が、米国特許第４，７６６，１０６号で見い出される。その両者は、参考として本明細書に援用されている。
【０１２２】
循環半減期の増加のための他の薬剤送達系は、リポソームである。リポソーム送達系の調製方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（１９８１）６４９：１２９；およびＳｚｏｋａ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｅｎｇ（１９８０）９：４６７で議論されている。他の薬剤送達系は、当該技術で公知であり、そして例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら、ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．１９８０）ｐｐ．２５３〜３１５；Ｍ．Ｌ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｖｓ（１９８４）３６：２７７に記載されている。
【０１２３】
液体薬学的組成物が調製された後、好ましくは、分解を予防し、そして無菌状態を維持するために、凍結乾燥される。液体組成物を凍結乾燥する方法は、当業者に公知である。使用する直前に、組成物は付加成分を含有し得る無菌の希釈液（例えば、リンガー液、蒸留水、または無菌の生理食塩水）で再構成され得る。再構成に際し、組成物は、好ましくは当業者に公知の方法を用いて被験者に投与される。
【０１２４】
上述したように、本発明の抗ＣＤ４０抗体および組成物は、ヒトの被験体を治療するために用いられ、アレルギー、ＳＬＥ、ＰＢＣおよびＩＴＰのような抗体介在性疾患を予防または治療する。抗Ｂ７抗体は、好ましくは移植組織拒絶反応、ＧＶＨＤ、またはリウマチ様の関節炎の予防または治療に用いられる。これらの抗体の好ましい投与経路は、非経口である。非経口投与において、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な非経口賦形剤と組み合わせて溶液、懸濁液、またはエマルジョンのような注射可能な形態で単位用量で処方され得る。そのような賦形剤は、本来、非毒性であり、そして非治療的である。そのよ
うな賦形剤の例は、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。不揮発油およびオレイン酸エチルのような非水賦形剤がまた用いられ得る。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の５％デキストロースである。賦形剤は、緩衝液および防腐剤を含む、等張性および化学的安定性を増強する物質のような小量の添加剤を含有し得る。
【０１２５】
投与の用量および様式は、個体に依存し得る。一般的に組成物は、抗体が１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは２０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは１〜７ｍｇ／ｋｇの間の投与量で与えられるように投与される。好ましくは、それは瞬時投与で与えられ、瞬時投与後、４〜６時間の間循環レベルを１０〜２０倍増加する。瞬時投与の後、連続注入がまた使用され得る。その場合、抗体は５〜２０μｇ／ｋｇ／分の投与で、より好ましくは７〜１５μｇ／ｋｇ／分の投与で注入され得る。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は本発明を例示し、本発明を制限する意図ではない。
【０１２７】
材料および方法
Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｅａｇｌｅ培地（ＩＭＤＭ）、および胎仔ウシ血清を、ＪＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）より得た；ペニシリンおよびストレプトマイシンを、Ｉｒｖｉｎｅ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）より得た；そしてポリエチレングリコール（分子量１５００）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）より得た。
【０１２８】
培養培地。 ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞、精製されたＴ細胞、ＥＢＶ形質転換されたＢ細胞、および細胞系をストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（２００Ｕ／ｍｌ）および１０％の熱不活性化した胎仔ウシ血清を補足したＩＭＤＭ（完全ＩＭＤＭ）内で培養した。Ｓｆ９昆虫細胞を、撹拌された（１２５〜１５０ｒｐｍ）シェイカーフラスコで、０．５％の胎仔ウシ血清を補足したＭａｉｏｒｅｌｌａら（１９８９）に記載された培地を用いて培養した。３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ細胞を、アミノプテリン（０．２μｇ．／ｍｌ）、チミジン（５μｇ／ｍｌ）、キサンチン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒポキサンチン（１５μｇ／ｍｌ）、マイコフェノール酸（２０μｇ／ｍｌ）、デオキシシチジン（２．３μｇ／ｍｌ）、および１０％の熱不活性化した胎仔ウシ血清で補足した５０％のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地、および、５０％のＨＡＭ−Ｆ１０培地からなる培地（完全ＤＭＥ／ＨＡＭ−Ｆ１０）で培養した。３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ／Ｂ７細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有する完全ＤＭＥ／ＨＡＭ−Ｆ１０培地で培養した。
【０１２９】
細胞および細胞系。 抹消血単核細胞を、フィコール−ハイパック密度差遠心分離により、ヘパリン化された血液（健康なボランティアより得た）から単離した。Ｔ細胞をＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋ（Ｌａｍｂｄａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（１λ）を用いて単核細胞およびＢ細胞を除去することにより濃縮した。ＥＢＶ形質転換されたＢ細胞系ＡＲＣ、およびＰ８１５細胞系、Ｆｃγ ＲＩＩおよびＦｃγ ＲＩＩＩを発現するＮＫ耐性マウス肥胖細胞腫細胞系（Ｒａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：７５２）を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）より得た。Ｗａｒｍｅｒｄａｍ，Ｐ．Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９０）１７２：１９に記載されたように３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ、ＣＤ３２を発現するマウスの線維芽細胞細胞系、ヒトのＦｃγ ＲＩＩ高応答性対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、Ｄｒ．Ｊ．ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より快く供与された。突然変異型のマウスの胸腺腫ＥＬ−４サブクローンＥＬ４Ｂ５は、Ｄｒ．Ｒ．
Ｈ．Ｚｕｂｌｅｒ、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｃａｎｔｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ、Ｇｅｎｅｖａより供与された。ヒトＦｃγ ＲＩＩａのＨＲ（高応答性）対立遺伝子形態のハイブリッド分子を発現するマウス３Ｔ６の形質転換体細胞は、Ｄｒ．Ｐ．Ａ．Ｍ．Ｗａｒｍｅｒｄａｍ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより供与された。Ｗａｒｍｅｒｄａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７：１３３８。両細胞系をゲンタマイシン（８０μｇ／ｍｌ）および１０％の熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）で補足したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）で培養した。Ｂ細胞活性化能力の欠失の可能性を避けるために、４〜８週間毎にＥＬ４Ｂ５細胞の新規のバッチを解かして用いた。細胞系を、マイコプラズマリボソームＲＮＡ（ＧｅｎＰｒｏｂｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）用の３ＨラベルされたＤＮＡプローブの使用により、マイコプラズマ汚染を定期的にテストし、そして実験の経過の間、マイコプラズマは検出されなかった。
【０１３０】
ヒトＢリンパ球 Ｂリンパ球を、本質的にＤｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９０）９：３２１に記載されているように、扁桃腺摘出を受けた子供から得た扁桃腺から単離した。要約すれば、組織をメスの刃で離散させ、食細胞およびＮＫ細胞を５ｍＭのＬ−ロイシンメチルエステル処理で減らし、そしてＴ細胞を２−アミノエチルイソチオウロニウムブロマイドで処理したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）とのロゼッティングの１サイクルにより除去した。得られたＢリンパ球調製物の純度は、抗（ＣＤ２０）ｍＡｂ Ｂ１（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｌｏｎｅ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＡ）、または抗（ＣＤ３）ｍＡｂ ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）、ならびにウサギ抗（マウスＩｇ）（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）のＦＩＴＣが結合したＦ（ａｂ’）２フラグメントを用いた間接的な免疫蛍光のラベリング、およびＦＡＣＳ分析で調査した。Ｂ細胞調製物は、以下を含有した（６つの単離物の平均±ＳＤ）：９５±４％ ＣＤ２０−陽性細胞、および２±１％ ＣＤ３−陽性細胞。
【０１３１】
抗体
抗（ヒト Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＢ−１（Ｙｏｋｏｃｈｉら、１９８２）をＤｒ．Ｅ．Ａ．Ｃｌａｒｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から得、そして精製された抗体として用いた。抗（ヒトＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｇ２７．５（Ｃｌａｒｋら、１９８６）をＤｒ．Ｊ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ（Ｏｎｃｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から得、そして精製された抗体として用いた。抗（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｓ２Ｃ６（Ｐａｕｌｉｅら、１９８５）をＤｒ．Ｓ．Ｐａｕｌｉｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）から得、そして精製された抗体として用いた。抗（ヒトＣＤ２６）モノクローナル抗体Ｔａ−１、および抗（ＣＤ２０）モノクローナル抗体Ｂ１をＣｏｕｌｔｅｒ（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）から得た。抗（ＣＤ３）モノクローナル抗体ＯＫＴ３を、Ｏｒｔｈｏ（Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）から得、そして抗（−ＬｅｕＭ３）モノクローナル抗体をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から得た。ビーズ（Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄｓ）に結合した抗（ＩｇＭ）抗体をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）から得た。
【０１３２】
抗Ｂ７ Ｍａｂ Ｂ７−２４（ＩｇＧ２ａ、κ）、ならびに抗ＣＤ４０ ｍＡｂｓ ５Ｄ１２、３Ｃ６および３Ａ８を上記のＩＩ節に記載したように得、そして精製された抗体として用いた。抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＣＬＢ−Ｔ３／４．１（ＩｇＧ１、κ）を希釈された組織培養の上清液として用い、そしてそれは好意によりＤｒ．Ｌ．Ａａｒｄｅｎ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌ
ａｎｄｓ）から供与された。抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＵＣＨＴ１（ＩｇＧ、κ）を精製された抗体として用い、そしてそれはＤｒ．Ｐ．Ｂｅｖｅｒｌｅｙ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｎｃｅｒ Ｆｕｎｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）から供与された。抗ＣＤ７２ Ｍａｂ ＷＬ２２５（ＩｇＧ２ａ、κ）を精製された抗体として用い、そしてそれはＤｒ．Ｋ．Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ（Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）により供与された。抗ＩＣＡＭ−１ Ｍａｂ ８４Ｈ１０を希釈された腹水として用いた。抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６は、Ｄｒ．Ｓ．Ｐａｕｌｉｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）より供与された。Ｐａｕｌｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４２：５９０。抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｇ２８．５は、Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ（Ｏｎｃｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）より供与された。Ｃｌａｒｋら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９８６）８３：４４９４。コントロールの抗体は以下のものであった：抗（β−グルコセレブロシダーゼ） ｍＡｂ ８Ｅ４ （ＩｇＧ１）、Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８３）１３４：５８５、ならびにミエローマ免疫グロブリンＭＯＰＣ−２１（ＩｇＧ１）およびＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。すべてのｍＡｂを精製された抗体調製物として用いた。ｈＣＤ４０．Ｈμ融合タンパク質は、Ｄｒ．Ｐ．Ｌａｎｅ（Ｂａｓｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より供与され、そしてそれをトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞の５倍に濃縮された上清液として用いた。Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２２：２５７３。
【０１３３】
本発明のモノクローナル抗体は、以下を包含する多くのリポーター部分を用いて、標準方法によりラベルされ得る：蛍光ラベル（一般にアビジンをリンクされた、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン（ＴＭＲＩＴＣ）、ローダミン６００（ＸＲＩＴＣ）、「テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ）」など）；放射活性部分（１２５Ｉなど）；発光物（ルシフェラーゼなど）；酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）。さらに、リポーター抗体（本発明のモノクローナル抗体に結合特異性を有する抗体、例えばヤギの抗マウスＩｇＧ）がまた、上記に記載したラベル性部分を用い得る。
【０１３４】
酵素およびオリゴヌクレオチド Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ （ＢＭＢ）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）より得た；ニトロセルロースフィルターをＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）より得る。合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーを、市販されている自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製した。または、注文設計された合成オリゴヌクレオチドを、例えばＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）より購入し得る。ｃＤＮＡ合成キットおよびランダムプライミングラベリングキットを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＢＭＢ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）より得る。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列は、上述したようにいずれかで合成され得る。または、ペプチドは、標準のインビトロ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）によって直接合成され得る。
【０１３５】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作業で行った通常の操作は、抗体の精製を含めて、標準の手順（Ｈａｒｌｏｗら）により行った。
【０１３６】
蛍光細胞染色（ＦＡＣＳ）アッセイ 細胞（１０６／試料）を１０μｌの一次抗体中で（１％ ＢＳＡおよび０．０５％ アジ化ナトリウムで補足したＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨ
ＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中の１０μｌ／ｍｌ）４℃で２０分間、インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄した後、細胞を４℃で２０分間、ヤギの抗（マウス ＩｇＧ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）のＦＩＴＣラベルしたＦａｂ’２フラグメント１００μｌ中でインキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄し、そしてＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ中で再度懸濁した。分析をＦＡＣＳＳＣＡＮ Ｖ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で行った。
【０１３７】
Ｂ７介在性Ｔ細胞増殖アッセイ
精製Ｔ細胞を、Ｆｃγ ＲＩＩａ高等応答動物（ｈｉｇｈ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）の対立遺伝子でトランスフェクトされた３Ｔ６線維芽細胞およびＢ７分子と共に培養した（ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２２：３０７１−３０７５）。３Ｈ−チミジンの取り込みにより増殖を測定した。簡単に言えば、９６ウェル平底組織培養プレートにおいて、抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＣＬＢ−Ｔ３／４．１含有または未含有の２００μｌ／ウェルの完全ＩＭＤＭ中で、１０４個の放射線照射（２５００ラド）された３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ／Ｂ７細胞と共に、４Ｘ１０４個のＴ細胞を培養した。７２時間の培養期間のうち最後の１６時間の間は、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンでその細胞をパルスした。Ｔ細胞の増殖を３つのウェルの平均ｃｐｍとして表す。
【０１３８】
細胞毒性Ｔ細胞アッセイ
精製Ｔ細胞を、Ｆｃγ ＲＩＩａ高等応答動物の対立遺伝子でトランスフェクトされた３Ｔ６線維芽細胞およびＢ７分子と共に培養した。簡単に言えば、２４ウェル平底組織培養プレートにおいて、抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＵＣＨＴ１の存在下で１ｍｌ／ウェルの完全ＩＭＤＭ中で、０．２Ｘ１０６個の放射線照射（２５００ラド）された３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ／Ｂ７細胞と共に、１０６個のＴ細胞を３〜４日間培養した。抗ＣＤ３再方向性細胞毒性アッセイにおいて、リンパ球の細胞毒活性を下記のように分析した。
【０１３９】
混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ
混合リンパ球培養（ＭＬＣ）において、刺激細胞としてＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用いて、精製Ｔ細胞の増殖を測定した。９６ウェル丸底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、２００μｌ／ウェルの完全ＩＭＤＭ培地中で、５Ｘ１０４個の放射線照射（５０００ラド）された刺激細胞と共に、５Ｘ１０４個のＴ細胞を培養した。７２時間の培養期間のうち最後の１６時間の間は、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンでその細胞をパルスした。Ｔ細胞の増殖を３つのウェルの平均ｃｐｍとして表す。二次ＭＬＣに対しては、一次ＭＬＣに対する上記のように細胞を刺激した。二次ＭＬＣに対するＴ細胞芽細胞を、５〜７日の一次ＭＬＣ中で、続いて刺激細胞の非存在下で２〜４日間培養して生産した。一次または二次ＭＬＣ中に生産されるＴ細胞の細胞毒活性を、マウスＰ８１５細胞を用いた抗ＣＤ３再方向性細胞毒性アッセイにおいて下記のように分析した。あるいは、ＣＴＬ活性を誘導するのに用いられるＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞は、標的細胞として役立った。
【０１４０】
細胞毒性アッセイ
標的として、Ｐ８１５ネズミ肥満細胞腫細胞またはＡＲＣ ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を用いて、４時間の標的細胞溶解アッセイにおいて、ＣＴＬ活性を測定した。Ｐ８１５標的細胞の場合には、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＯＫＴ３を用いて、ＣＴＬを標的細胞に非特異的に架橋させた。標的細胞としてＡＲＣ細胞を用いた場合には、アロ抗原特異性ＣＴＬのみがキリング工程（ｋｉｌｌｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）において関与する。１０６個の標的細胞を、２００μＣｉの５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム（Ａｍｓｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と共に１時間培養し、続いて洗浄した。９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートにおいて、種々の量のエフェクター細胞と共に５０００の５
１Ｃｒ標識の標的細胞を用いて総容量２００μｌ／ウェルでＣＴＬアッセイを行った。（それぞれ、自然放出及び最大放出の評価のために）、４個のウェルを２００μｌ培地単独の５Ｘ１０３個の標的細胞で満たし、そして４個のウェルを１００μｌ培地および１００μｌサポニンの５Ｘ１０３個の標的細胞で満たした。Ｐ８１５の場合には、（バックグラウンドの実験的溶解を測定するために）、３個のウェルを抗ＣＤ３ Ｍａｂの非存在下でエフェクター細胞および標的細胞で満たした。他の３個のウェルもまた、抗ＣＤ３の存在下で総溶解量を測定するために、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ Ｍａｂを含有した。プレートを２００Ｘｇで１０分間遠心分離し、そして３７℃で４時間インキュベートした。その後、各ウェルの上清液１００μｌをガンマカウンターでカウントした。結果を、Ｐ８１５標的細胞に対する抗ＣＤ３依存性特異性放出の百分率、すなわちＡＲＣ標的細胞に対するアロ抗原特異性放出の百分率として表す。
【０１４１】
Ｂ細胞増殖アッセイ
平底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１０％ウシ胎児血清を補足した２００μｌのＩＭＤＭ中で、Ｂ細胞（１ウェル当り４Ｘ１０４個）を培養した。固定化した抗−（ＩｇＭ）抗体（イムノビーズ；５μｇ／ｍｌ；ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を加えることによりＢ細胞を刺激した。指示されたところに１００ Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を加えた。さまざまな濃度のｍＡｂを微量培養の開始時に加え、そして１８時間のパルシング後、３日目の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定することにより、増殖を評価した。
【０１４２】
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞増殖アッセイ
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕらによって、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２５１：７０に記載されたのと類似の培養系において、抗ＣＤ４０ ｍＡｂがＢ細胞増殖を刺激する能力を試験するために、ヒトＦｃγ ＲＩＩのＨＲ対立遺伝子形を発現するマウス３Ｔ６トランスフェクタント細胞を用いた。Ｂ細胞（１ウェル当り２Ｘ１０４個）を、平底マイクロウェルにおいて（５０００ラドで放射線照射された）１Ｘ１０４個のトランスフェクタント細胞の存在下、１０％ウシ胎児血清および１００ Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−４を補足した２００μｌのＩＭＤＭ中で培養した。そのＢ細胞を加える前に、３Ｔ６細胞を培養プラスチックに少なくとも５時間固着させた。抗ＣＤ４０ｍ Ａｂを１５ｎｇ／ｍｌから２０００ｎｇ／ｍｌまでのさまざまな濃度で加え、そして［３Ｈ］−チミジンで１８時間パルシングして７日目にチミジンの取り込みを測定することにより、Ｂ細胞の増殖を評価した。
【０１４３】
ＥＬ４Ｂ５細胞とのＢ細胞活性化アッセイ
Ｂ細胞（１ウェル当り１０００個）を、放射線照射（５０００ラド）されたＥＬ４Ｂ５細胞（１ウェル当り５Ｘ１０４個）と共に、平底マイクロタイタープレートおいて、熱処理により不活性化した１０％ウシ胎児血清、５ｎｇ／ｍｌのホルボール−１２−ミリステート １３−アセテート（Ｓｉｇｍａ）および５％ヒトＴ細胞上清液を補足した２００μｌのＩＭＤＭ中で培養した。さまざまな濃度のｍＡｂを培養の開始時に加え、そして［３Ｈ］−チミジンで１８時間のパルシング後６日目にチミジンの取り込みを評価した。Ｔ細胞上清液を調製するために、１μｇ／ｍｌのＰＨＡおよび１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在下、精製Ｔ細胞を１０６個／ｍｌの密度で３６時間培養した。Ｗｅｎら、上述。その細胞を遠心分離することによりＴ細胞上清液を得て、そしてそれを−２０℃で貯蔵した。Ｔ細胞上清液がＥＬ４Ｂ５−Ｂ細胞培養液中でヒトＢ細胞の増殖を高める効力を試験し、そして最も効力のある上清液をプールし、そして実験に用いた。
【０１４４】
Ｂ細胞による抗体産生に対するヒトＴ細胞ヘルパーアッセイ
９６ウェル組織培養プレートを、抗ＣＤ３ ｍＡｂ ＣＬＢ−Ｔ３／３（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の腹水液の１：５００希釈液でコートした。示されるように、共刺激性ｍＡｂを加えた：抗ＣＤ２
ｍＡｂ ＣＬＢ−Ｔ１１．１／１およびＣＬＢ−Ｔ１１．２／１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、共に腹水１：１０００および抗ＣＤ２８
ｍＡｂ ＣＬＢ−２８／１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。次いで、扁桃（ｔｏｎｓｉｌｌａｒ）のＴ細胞（３０００ラド放射線照射；１ウェル当り１０５個）、扁桃のＢ細胞（１ウェル当り１０４個）およびｒＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を加えた。各細胞培養の最終容量は２００μｌであった。８日後、細胞を遠心し、そして細胞を含まない上清液を集めた。（希釈された）試料中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度を以下のようにＥＬＩＳＡにより算出した。
【０１４５】
免疫グロブリンの定量に対するＥＬＩＳＡアッセイ
ヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。４μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ ＭＨ １６−０１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）または１．２μｇ／ｍ１のマウス抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ ４１０２（Ｔａｇｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）の０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて、４℃で１６時間インキュベーションすることにより、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、そしてＢＳＡで１時間飽和させた。２回洗浄後、試験試料の種々の希釈液でプレートを３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、１μｇ／ｍｌのベルオキシダーゼ標識のマウス抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ ＭＨ １６−０１（ＣＬＢ）またはマウス抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ ＭＨ １５−０１（ＣＬＢ）で３７℃で１時間インキュベーションすることにより、結合したＩｇを検出した。プレートを４回洗浄し、そして基質としてＯ−フェニレンジアミンを加えることにより、結合したペルオキシダーゼ活性を示した。各アッセイに対して標準曲線を作成するために、ヒトの標準血清（ＨＯＯ，ＣＬＢ）を用いた。
【０１４６】
流動細胞蛍光定量アッセイ
ＡＲＣ細胞（１０６個／試料）を１００μｌの一次抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ、または、１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを補足したＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中１０μｇ／ｍｌ）中で４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄後、ヤギ抗（マウスＩｇＧ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）のＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメント１００μｌ中で細胞を４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄し、そしてＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を０．５ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。ＦＡＣＳＣＡＮＶ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡにより分析を行った。
【０１４７】
あるいは、ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＴ細胞上清液（５％）を含む培地中で培養する前に、および培養中の異なった時点でＥＬ４Ｂ５細胞を集めた。０．０５％アジ化ナトリウムを補足したＨａｎｋ平衡塩類溶液（４℃）１００μｌ中で希釈されたｈＣＤ４０−Ｈμを含む、トランスフェクトされた細胞の上清液１０μｌを用いて、細胞を３０分間インキュベートした。これに続いて、ウサギ抗（ヒトＩｇＭ）のＦＩＴＣ−複合Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でインキュベーションした。コントロールとして、ＦＩＴＣ−−複合体のみで細胞をインキュベートした。分析のために、ＦＡＣＳｃａｎ−４細胞蛍光分析機（ＢｅｃｔｏｎおよびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた。ヨウ化プロピジウムの使用により、分析から非生存細胞を除外した。
【０１４８】
実施例１
ＣＤ４０およびＢ７のＰＣＲクローニング
Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）により本質的に記載されるように、ＥＢＶ−形質転換ヒト脾臓細胞集団からＲＮＡを単離した。簡単に言えば、細胞を、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして０．７ Ｍ ２−メルカプトエタノールの存在下で５Ｍグアニジウム チオシアネート中で溶解した。細胞溶解物を、不連続ＣｓＣｌ勾配（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら）上で層化し、そしてＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローターを用いて２６，０００ｒｐｍで１６時間遠心分離した。ペレットをＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶かすことによりＲＮＡを回収した。ＲＮＡをエタノールで１回沈澱させ、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに再懸濁し、そして−７０℃で貯蔵した。
【０１４９】
５００単位のＬＭＶ−ＲＴ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、５μＭランダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１ｍＭ ＤＴＴ、ｄＮＴＰ混合物（０．５ ｍＭ）、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３、５０
ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍ ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む反応緩衝液５０μｌ中でランダムヘキサマープライミングを用いて、全ＲＮＡ（１０μｇ／反応）をｃＤＮＡに変換した。３７℃で１時間インキュベーションした後、試料を３分間煮沸し、そして−７０℃で貯蔵した。既知のＣＤ４０およびＢ７の配列に相同性を有する配列を含んだプライマーを用いて、ＣＤ４０およびＢ７分子をコードするＤＮＡをＰＣＲにより生産し、そこでプライマーはまたクローニングに有用な制限部位をコードした（図２）。これらのプライマーは、Ｂ７およびＣＤ４０に対する公知のｃＤＮＡコード配列に基づいていた（Ｆｒｅｅｍａｎら，１９８９；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら，１９８９）。すべてのプライマーは、５’末端で、続いてクローニングのための制限部位でＣ−Ｇクランプにより開始する（図２において太字で示される）。可溶形のＢ７およびＣＤ４０のクローニングのための、逆方向プライマーにおける下線の配列は、アフィニティ精製に用いられるモノクローナル抗体により認識されるエピトープを表す。括弧内の数字は、ＣＤ４０およびＢ７に対する公知のｃＤＮＡに関するプライマーの位置を表す。
【０１５０】
ＰＣＲ増幅に対して、１μｌのｃＤＮＡは、１μｌ（１０ピコモル）の順方向プライマー、１μｌ（１０ピコモル）の逆方向プライマー、および４７μｌのＰＣＲ混合物を混合して作られた。ＰＣＲ混合物は、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、ｄＮＴＰ混合物（各０．２ｍＭ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｃＨＬ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡから成っていた。７０μｌの鉱油を５０μｌのＰＣＲ混合物にかぶせ、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で増幅を２５サイクル行った（９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のプライマーアニーリングおよび７２℃で１．５分の伸張反応）。増幅を２５サイクル行った後、ＰＣＲ産物を得た。
【０１５１】
増幅産物を、ＢｇＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化し（図１Ｂ）、そしてサイズ分画により単離した。バキュロウイルスでの発現前に、ＰＣＲ誘発の変異の導入を防ぐために、配列分析により各フラグメントのＤＮＡ配列を確認した。バキュロウイルス転移ベクターｐＡｃＣ８もまたＢｇＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化した（図１Ｂ）。
【０１５２】
増幅されたフラグメントを線状ｐＡｃＣ８ベクターに連結した（挿入片：ベクターの比は３：１であった）。連結産物を細菌株ＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）内に形質転換し、そして組換えｐＡｃＣ８ベクターをアンピシリン耐性に基づいて選別した。組換えプラスミドを細菌クローン（Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ａｕｓｕｂｅｌら）から単離し、そして目的の挿入片の存在をポリメラーゼ連鎖反応を用いて確認した（上記参照）。標準的手法により、プラスミドの大量調製を行った（Ａｕｓｕｂｅ
ｌら：Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。
【０１５３】
実施例２
ヒトＣＤ４０およびＢ７のバキュロウイルス発現
転移ベクターのｐＡｃＣＤ４０（全長ＣＤ４０分子をコードする）、ｐＡｃＣＤ４０−ＥＤ／Ｇｌｕ（ＣＤ４０の細胞外ドメインをコードする）、ｐＡｃＢ７（全長Ｂ７分子をコードする）およびｐＣｃＢ７−ＥＤ／Ｇｌｕ（Ｂ７分子の細胞ドメインをコードする）を用いて、ヒトＣＤ４０およびヒトＢ７をコードする配列をＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）中に組換えした。
【０１５４】
プラスミドを野生型バキュロウイルスＤＮＡ（２−１０ ｐｆｕ）（ＡｃＮＰＶ：Ｓｕｍｍｅｒら）と共に、１０６細胞／ｍｌの密度でＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内にトランスフェクトした（Ｓｕｍｍｅｒｓら）。組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を同定し、そしてクローン精製した（Ｓｕｍｍｅｒｓら）。
【０１５５】
組換えタンパクの細胞表面の発現のために、培養の４８時間後に細胞を集めた；分泌された組換えタンパクの産生のために、培養の７２時間後に細胞を集めた。
【０１５６】
実施例３
Ｓｆ９細胞ＥＬＩＳＡ
組換えウイルスで感染されたＳｆ９昆虫細胞を２４ウェルプレート内で４８時間培養した。組織培養培地を除去後、抗体を含む１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）０．２５ｍｌを用いて、室温（ＲＴ）で４５分間プレートをインキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに複合化したヤギ抗（マウス全Ｉｇ）免疫グロブリン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）のＰＢＳ−ＢＳＡによる１／２５０希釈液２５０μｌを用いて、ＲＴで３５分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡで５回洗浄することにより、未結合のペルオキシダーゼ活性を除去した。２ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンのエタノール液０．５ｍｌを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ｍｌまで希釈し、そして０．０３（Ｖ／Ｖ）Ｈ２Ｏ２を加えることにより調製されたアッセイ混合物を加えることにより、結合したペルオキシダーゼ活性を表した。１０分後に、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４ １００μｌを加えることにより反応を停止した。
【０１５７】
生存Ｓｆ９細胞に関して行われた上記のＥＬＩＳＡアッセイは、以下の結果を与えた。図３は、２４ウェルプレート内で４８時間培養したｐＡｃＢ７およびｐＡｃＣＤ２６で感染したＳｆ９細胞に対するデータを表している。ＥＬＩＳＡに使用される抗体は以下の通りであった：Ｂ７−２４、抗−（Ｂ７）（白抜き棒）、Ｔａ−１、抗−（ＣＤ２６）（線影棒）、および非一次抗体（灰色棒）。
【０１５８】
図４は、２４ウェルプレート内で４８時間培養したｐＡｃＢ７およびｐＡｃＣＤ４０で感染した生存Ｓｆ９細胞に対するデータを表している。ＥＬＩＳＡに使用される抗体は以下の通りであった：Ｓ２Ｃ６、抗−（ＣＤ４０（白抜き棒）および非一次抗体（線影棒）。
【０１５９】
実施例４
蛍光性細胞染色
Ａ．傾向性細胞染色
１０μｌの一次抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ、または１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを補足したＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中 １０μｇ／ｍｌ）中で細胞（１０６個／試料）を４℃で
２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄後、ヤギ抗−（マウスＩｇＧ）抗体のＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）１００μｌ中で、細胞を４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄して、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳ ０．５ｍｌ中で細胞を再懸濁した。ＦＡＣＳＳＣＡＮ Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析を行った。
【０１６０】
流動細胞定量分析の一般プロトコルおよび流動細胞定量法の臨床データ分析は、ＫｅｒｅｎらおよびＣｏｏｎらによって詳細に記載されている。一般血液細胞カウンティング技術およびＤＮＡ定量は、Ｐｏｗｅｒｓ，ＫｅｒｅｎらおよびＣｏｏｎらにより記載されている。
【０１６１】
ＡＲＣ ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の蛍光性細胞染色のデータを、図５に表す。図５Ａにおいて、Ｂ７発現Ｓｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の１：１００希釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染色の結果を示す。
【０１６２】
図５Ｂにおいて、ＣＤ４０発現Ｓｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の１：１００希釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染色の結果を示す。
【０１６３】
図５Ｃにおいて、コントロールのＳｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の１：１００希釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染色の結果を示す。
【０１６４】
Ｂ．可溶性抗原競合アッセイ
可溶性Ｂ７および可溶性ＣＤ４０の存在下および非存在下で、抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体および抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体で、ＡＲＣ ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を染色した。ＡＲＣ細胞を加える前に、抗体と、可溶性Ｂ７、可溶性ＣＤ４０またはコントロールとをＲＴで２０分間プレインキュベートした。
【０１６５】
図６Ａは、Ｂ７−２４（点線）または二次抗体単独（実線）による染色の結果を示す。図６Ｂは、Ｂ７−２４単独（点線）または可溶性Ｂ７でプレインキュベートしたＢ７−２４（実線）による染色の結果を示す。図６Ｃは、Ｂ７−２４単独（点線）または可溶性ＣＤ４０でプレインキュベートしたＢ７−２４による染色の結果を示す。図６Ｄは、ＣＤ４０−３Ａ８（点線）または二次抗体単独（実線）による染色の結果を示す。図６Ｅは、ＣＤ４０７Ａ８単独（点線）または可溶性Ｂ７でプレインキュベートしたＣＤ４０３Ａ８（実線）による染色の結果を示す。図６Ｆは、ＣＤ４０３Ａ８単独（点線）または可溶性ＣＤ４０でプレインキュベートしたＣＤ４０３Ａ８（実線）による染色の結果を示す。
【０１６６】
実施例５
宿主動物免疫化
０日目および１４日目に、ＡｃＣＤ４０ウイルスＡｃＢ７ウイルスまたはＡｃＣｄ３ウイルス（コントロールのウイルス）で感染された５Ｘ１０６個のＳｆ９細胞を、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入した。２１日目に、特異的抗体の存在を試験するために１００μｌの血清を得た。残りの期間が少なくとも２週間となった後、マウスに、ＡｃＣＤ４０ウイルスまたはＡｃＢ７ウイルスで感染された５Ｘ１０６個の細胞による最終の注入を行った。この最終の注入後３日目に、細胞融合のために脾臓細胞を用いた。
【０１６７】
実施例６
ハイブリードマクローンの生産
Ｂｏｅｒら（１９８８）により以前に記載されているように、５０％ポリエチレングリ
コールを用いて、免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た脾細胞をＳＰ２／０ネズミミエローマ細胞と１０：１の割合で融合した。ヒポキサンチン（０．１ｍＭ）、アミノプテリン（０．０１ｍＭ）、チミジン（０．０１６ｍＭ）および０．５ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を補足した完全ＩＭＤＭ培地中に、融合細胞を再懸濁した。次いで、各ウェルが平均１個の成長するハイブリッドを含むように、融合細胞を９６ウェル組織培養プレートのウェル間に分配した。
【０１６８】
１０〜１４日後、特異的抗体の産生に対してハイブリドーマ集団の上清液をスクリーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体の産生をスクリーニングするために、１２ウェルの上清液をプールし、そして実施例４に記載のように、それをＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞の蛍光性細胞染色のために用いた。次いで、陽性プールの上清液を別々に試験した。０．５ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−６含有ＩＭＤＭ／ＦＢＳ中での希釈を制限することにより、陽性ハイブリドーマ細胞を３回クローン化した。分析の結果を表１に表す。
【０１６９】
【表１】
実施例７
扁桃Ｂ細胞の試験
ｄｅＧｒｏｏｔら（１９９０）により記載のように、扁桃摘出を受けている子供から得た扁桃から、扁桃Ｂ細胞リンパ球を単離した。簡単に言えば、メスの刃身で組織を散らし、５ｍＭ Ｌ−ロイシンメチルエステルで処理することにより食細胞およびＮＫ細胞を除去し、そして臭化２−アミノエチルイソチオウロニウムで処理されたヒツジ赤血球を用いて１サイクルのロゼット形成させることにより、Ｔ細胞を除去した。
【０１７０】
上記の実施例４に記載のように、蛍光性細胞染色を用いて、扁桃Ｂ細胞に結合する能力に対して、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体および抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体を試験した。培養された扁桃Ｂ細胞の蛍光染色分析に対して、死細胞を除外するためにヨウ化プロピジウムを用いた。
【０１７１】
表２は、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体の高純度扁桃Ｂ細胞への結合に対する上記分析の結果を示す。
【０１７２】
【表２】
これらのデータは、新鮮な単離された扁桃Ｂ細胞の８９〜９５パーセントが、４つの抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体を用いて陽性に染色したことを示す。
【０１７３】
本質的に同様の方法により、扁桃Ｂ細胞とモノクローナル抗体Ｇ２８．５（Ｃｌａｒｋら）との反応を試験した：すなわち、本発明の抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体に対するのとおよそ同じパーセントの細胞が、Ｇ２８．５に対して陽性であった。
【０１７４】
表３は、抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体Ｂ７−２４の高純度扁桃Ｂ細胞への結合を、実施例４に記載の蛍光性細胞標識により測定した結果を示す。
【０１７５】
【表３】
これらのデータは、新鮮な単離された扁桃Ｂ細胞の１２〜１７パーセントが、抗−（Ｂ
７）モノクローナル抗体Ｂ７−２４を用いて陽性に染色したことを示す。
【０１７６】
実施例８
Ｍａｂ Ｂ７−２４によるＴ細胞増殖の遮断
Ｔ細胞増殖および上記のＭＬＣアッセイを用いて、Ｔ細胞活性化におけるＢ７分子の役割を研究した。Ｂ７−２４ Ｆａｂフラグメントの非存在下での増殖は、２０，０００〜６０，０００ ｃｐｍの範囲であった。図７は、このＭａｂがＴ細胞増殖の抗−ＣＤ３誘導性Ｂ７介在性の誘導を完全に遮断し得るので、このＭａｂがそのＢ７分子の機能的に重要なドメインに結合するということ、を示す。データは、別々のドナーのＴ細胞を用いた４名の各実験の±Ｓ．Ｄ．を示す。
【０１７７】
図８は、抗−Ｂ７ Ｍａｂ Ｂ７−２４（四角）またはＢＢ−１（三角）によるＴ細胞の抗−ＣＤ３誘導性Ｂ７介在注増殖の阻害を示す。従って、驚くべきことに、刺激細胞としてＢ７−陽性ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を用いて、Ｍａｂ Ｂ７−２４は、一次ＭＬＣ中でＴ細胞活性化を阻害し得ないことが見い出された。図９は、一次ＭＬＣ（黒塗り符号）および二次ＭＬＣ（白抜き符号）の間、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用を遮断する効果を示す。異なった濃度のＭａＢ ７−２４（図９Ａ）またはＢＢ−１（図９Ｂ）の存在下または非存在下、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用いて、精製Ｔ細胞を３日間刺激した。抗体の非存在下の増殖は、一次ＭＬＣでは１５，０００〜３０，０００の範囲であり、そして二次ＭＬＣでは２０，０００〜６０，０００の範囲であった。データは、別々のドナーからのＴ細胞を用いた４名の各実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【０１７８】
この実験から、抗Ｂ７−モノクローナル抗体は、明らかに、一次ＭＬＣを完全には遮断し得ない。しかし、同一の実験条件下では、ＣＤ３に対するＭａｂは、一次ＭＬＣにおいてＴ細胞の活性化をほとんど完全に遮断し得た。興味深いことに、プレ活性化したＴ細胞を用いて、二次混合リンパ球培養においてその阻害能力に対してＭａｂ Ｂ７−２４を試験したところ、そのＭａｂ Ｂ７−２４はＴ細胞の活性化を阻害し得た。
【０１７９】
実施例９
シクロスポリンＡおよび／またはＭａｂ Ｂ７−２４を用いるＴ細胞増殖の遮断
上記Ｔ細胞増殖アッセイを使用して、Ｂ７によるＴ細胞の共刺激が、ＣｓＡを用いる阻害に対しても抵抗性があるかどうか測定した。図１０は、Ｔ細胞が抗ＣＤ ３Ｍａｂにより増殖を誘導されると、Ｂ７による共刺激が、用量に依存するようにＣｓＡよって阻害され得ることを示す。しかし、有毒でないＣｓＡ濃度でＴ細胞の活性化を完全に遮断することは不可能であった。一次ＭＬＣ（結果は示さず）または二次ＭＬＣ（表４を参照のこと）を遮断するためにＣｓＡを使用しても、同様の結果が得られた。これらの実験は、Ｂ７−ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４介在Ｔ細胞増殖が、ＣｓＡの阻害作用に対し、部分的にのみ感受性であることを明確に示す。このように、インビトロでＴ細胞がＢ７と共刺激されるときに、完全に阻害されないことは、移植片拒絶または急性ＧＶＨＤの際に、ＣｓＡによる治療にもかかわらずインビボで起こることに類似し得た。
【０１８０】
【表４】
表４は、ＣｓＡ単独またはｍＡｂ Ｂ７−２４単独では、Ｔ細胞活性化が用量依存的に、しかし、不完全に阻害されることを示す。しかし、ＣｓＡおよびＢ７−２４を共に用いると、Ｔ細胞活性化は、完全に遮断された。興味深いことに、０．０２５μｇ／ｍｌのＢ７−２４の添加は、２．５μｇ／ｍｌの添加とほとんど同量の遮断を起こした。さらに、０．０２５μｇ／ｍｌのＢ７−２４の存在下で、ＣｓＡ濃度を６０倍に減少させても、Ｔ細胞活性化は９０％以上阻害された。この阻害は、最高濃度のＣｓＡ単独で最大に阻害されたときよりも大きかった。
【０１８１】
表５中に示すように、同一の増殖アッセイにおいて、ＩＣＡＭ−１またはＣＤ７２のどちらか一方にＭａｂを用いても相乗効果は観察されなかったので、Ｍａｂ Ｂ７−２４とＣｓＡとの間のこの相乗効果は、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用に対して特異的であった。
【０１８２】
【表５】
実施例１０
Ｍａｂ Ｂ７−２４および他の免疫抑制剤でのＴ細胞増殖の遮断
他の免疫抑制剤と共にＭａｂ Ｂ７−２４を用いてＴ細胞増殖の遮断を示すために、上記の実施例９のプロトコルを用いる。（Ａ）ＦＫ５０６、（Ｂ）ラパマイシン、（Ｃ）メトトレキセート、（Ｄ）プレドニソロン、または（Ｅ）デキタメタゾンをＣｓＡの代わりに用い、実施例９の増殖アッセイプロトコルと同様にして行った。
【０１８３】
実施例１１
シクロスポリンＡおよび／またはＭａｂ Ｂ７−２４での細胞毒性Ｔリンパ球活性の遮断
ＣｓＡおよびＢ７−２４がまた、Ｔ細胞のアロ抗原特異的活性化においても、ＣＴＬ活性の誘導を遮断することに共に作用し得たかどうかを試験するために、上記の細胞毒性アッセイを用いた。精製Ｔ細胞を、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣで６日間刺激し、引続き培地のみで２日間培養した。培地のみの存在下で、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣと共に３日間の再刺激した後、図１１に示すようにＴ細胞のＣＴＬ活性を分析した；４００μｇ／ｍｌのＣｓＡ；１０μｇ／ｍｌのＭａｂ Ｂ７−２４；または４００μｇ／ｍｌのＣｓＡおよび１０μｇ／ｍｌのＭａｂ Ｂ７−２４。約５０％のＡＲＣ標的細胞が、４時間のアッセイで溶解され得たので、これらの培地中でアロ抗原により活性化されたＴ細胞は、効果的に誘導され細胞溶解性となった。二次ＭＬＣにおける、ＣＴＬ活性のこの誘導は、４００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡでは若干阻害され得るのみであった。ニ次ＭＬＣの間の１０μｇ／ｍｌのＭａｂ Ｂ７−２４の添加は、約４０％の阻害を引き起こした。しかしながら、ＣｓＡとＭａｂ Ｂ７−２４とを組み合わせると、ＣＴＬ活性化のほとんど完全な
遮断をもたらした。
【０１８４】
実施例１２
Ｍａｂ Ｂ７−２４および他の免疫抑制剤での細胞毒性Ｔリンパ球活生の遮断
他の免疫抑制剤と共にＭａｂ Ｂ７−２４を用いて細胞毒性Ｔリンパ球活性の遮断を示すために、上記の実施例１１のプロトコルを用いる。（Ａ）ＦＫ５０６、（Ｂ）ラパマイシン、（Ｃ）メトトレキセート、（Ｄ）プレドニソロン、または（Ｅ）デキタメタゾンをＣｓＡの代わりに用いて、実施例１１の細胞毒性アッセイプロトコルと同様に行った。
【０１８５】
実施例１３
アロ抗原特異的Ｔ細胞活性化の際のＣｓＡとＭａｂ Ｂ７−２４との組み合せ
一次ＭＬＣアッセイ中に、ＣｓＡおよびＭａｂ Ｂ７−２４の存在下で、アロ抗原により（上記のように）刺激されたＴ細胞が、二次抗原刺激に応答し得るかどうかを調べた。精製Ｔ細胞を、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用い、６日間、１０μｇ／ｍｌのＭａｂ Ｂ７−２４および４００μｇ／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で刺激し、引続き培地のみで２日間培養した。ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用いて３日間の再刺激をした後、Ｔ細胞のＣＴＬ活性を分抗した。表６のデータは、代表的な実験のデータであり、ＣｓＡまたはＭａｂ Ｂ７−２４単独の存在下ではなくて、ＣｓＡおよびＭａｂ Ｂ７−２４の両方の存在下で、アロ抗原に６日間曝すことは、二次ＭＬＣにおけるアロ抗原によるその後の誘発に対する全体の非応答性を生じたことを示す。対照実験では、固定化抗ＣＤ３ Ｍａｂまたは無関係なアロ抗原を発現している細胞を用いて刺激した後でも、その細胞群が細胞毒性になるように誘導され得たことから、この非応答性は、一次ＭＬＣ後における細胞の生存力の欠如によるものではなかった（結果は示さず）。
【０１８６】
【表６】
実施例１４
アロ抗原特異的Ｔ細胞活性化の際のＭａｂ Ｂ７−２４と免疫抑制剤との組み合せ
他の免疫抑制剤と共にＭａｂ Ｂ７−２４を用いて二次抗原刺激を遮断する能力を示すために、上記の実施例１３のプロトコルを用いる。（Ａ）ＦＫ５０６、（Ｂ）ラパマイシン、（Ｃ）メトトレキセート、（Ｄ）プレドニソロン、または（Ｅ）デキタメタゾンをＣ
ｓＡの代わりに用いて、実施例１３のＣＴＬアッセイプロトコルと同様に行った。
【０１８７】
実施例１５
抗ＣＤ４０ ｍＡｂを用いるＢ細胞増殖の共刺激
ヒトＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を産生している４種のハイブリドーマを、実施例１〜７に記載のようにして生産した。これらのｍＡｂは、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｇ２８．５が結合すると同様の割合の扁桃Ｂ細胞に結合することが示された。ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９２）１５２：１５。これらのモノクローナル抗体の内、ＩｇＧ２ｂサブクラスである３種（５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６）を、上記のＢ細胞増殖アッセイにおいて、ヒトＢ細胞に対して活性化シグナルを発する能力について試験した。
【０１８８】
ヒト扁桃Ｂ細胞（４Ｘ１０４／ウェル）を、セファロースビーズ（５μ／ｍｌ）に結合した抗ＩｇＭの存在下（図１２Ａ）、または抗ＩｇＭ＋ｒＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下（図１２Ｂ）で、マイクロウェル中において２００μｌを培養した。濃度の異なる抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６、５Ｄ１２、３Ｃ６または３Ａ８を添加し、そして［３Ｈ］チミジンの取り込みを、１８時間のパルシングの３日後に測定した。図１２Ａに示したデータは、３つの異なるドナーからのＢ細胞調製物を用いたデュプリケートインキュベーション（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を伴う実験から導かれた平均値である。図１２Ｂのデータは、共通する結果を有する２つの実験の内の１つの実験から得られたデュプリケートインキュベーションの平均値である。
【０１８９】
どの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂも、固定化抗ＩｇＭの存在下、または固定化抗ＩｇＭおよびＩＬ−２の存在下で、ヒトＢ細胞増殖を実質的には共刺激し得なかった。対照的に、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６は、ヒトＢ細胞増殖を濃度依存的な様式で共刺激した。
【０１９０】
実施例１６
抗ＣＤ４０ ｍＡｂを用いるＢ細胞増殖の誘導
実施例１５で試験したｍＡｂを、ヒトＢ細胞の増殖を誘導するそれらの能力について、上記Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様アッセイで、すなわち、ＦｃγＲＩＩを発現する接着細胞上の抗ＣＤ４０ ｍＡｂを提示することにより試験した。抗体提示細胞として、ヒトＦｃγＲＩＩのＨＲ対立遺伝子形を発現するマウス３Ｔ６トランスフェクタント細胞を用いた。上記の系において、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６は、ＩＬ−４と共に、扁桃ヒトＢ細胞の実質的な増殖を誘導することを観察し、それを［３Ｈ］チミジンの取り込みの測定により評価した。しかし、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６または３Ａ８は、上記の培養系において、ヒトＢ細胞の増殖を誘導しなかった（データは示さず）。
【０１９１】
実施例１７
抗ＣＤ４０ ｍＡｂをいるＳ２Ｃ６刺激Ｂ細胞増殖の阻害
抗ＣＤ４０ ｍＡｂをまた、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６によるヒトＢ細胞増殖の共刺激を阻害する能力について、上記のＢ細胞増殖アッセイを用いて試験した。ヒト扁桃Ｂ細胞（４Ｘ１０４／ウェル）を、セファロースビーズ（５μｇ／ｍｌ）に結合した抗ＩｇＭおよび抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６（１．２５μｇ／ｍｌ）の存在下で、マイクロウェル中において２００μ１を培養した。濃度の異なる抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６または３Ａ８を添加し、［３Ｈ］チミジンの取り込みを、３日後に評価した。コントロールとして、抗−（グルコセレブロシダーゼ）ｍＡｂ ８Ｅ４を、同濃度で添加した。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８３）１３４；５８５。データは、デュプリケートインキュベーションした２つの異なるドナー由来のＢ細胞を用いた実験から導かれた平均値±標準偏差である。
【０１９２】
抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６の各々が、抗ＩｇＭ誘導ヒトＢ細胞増殖の共刺激を、ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６により阻害し得ることが見出された（図１３）。対照的に、β−グルコセレブロシダーゼに対して、同量の非関連であるｍＡｂ ８Ｅ４では、有意な阻害は見られなかった。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら、上記。このように、上記の抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、ヒトＢ細胞の増殖を刺激するシグナルを発しないが、それとは逆に、他のｍＡｂで抗ＣＤ４０を引き起こすことにより働く刺激シグナルを阻害し得る結論に達した。従って、これらのｍＡｂは、ＣＤ４０を介するシグナル化が、ＥＬ４Ｂ５細胞によるヒトＢ細胞増殖を刺激する役割を有するかどうかを調べるための優れた道具であると考えられた。
【０１９３】
実施例１８
ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖への抗ＣＤ４０ ｍＡｂの効果
抗ＣＤ４０ ｍＡｂのＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対する効果を、上記のＢ細胞活性化アッセイを用いて試験した。ヒト扁桃Ｂ細胞（１，０００／ウェル）を、活性化ヒトＴ細胞の５％上清液および５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在下で、放射線照射ＥＬ４Ｂ５細胞（５０，０００／ウェル）と共に培養した。抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６または３Ａ８を、種々の濃度で添加した。コントロールとして、ｍＡｂ ＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）を添加した。６日間の培養の後、［３Ｈ］チミジンの取り込みを評価した。
【０１９４】
図１４は、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６または３ＡＢの添加が、濃度に依存してヒトＢ細胞増殖の阻害をもたらしたことを示す。データは、デュプリケートインキュベーションをした４つの異なるドナー由来のＢ細胞を用いた実験から導かれた平均値±標準偏差である。ｍＡｂなしでのインキュベーションで得られた［３Ｈ］チミジンの取り込み値は、４つの異なる実験で、それぞれ１０４６０±１８４３ｃｐｍ、６９８２±１７２９ｃｐｍ、４３６２±１０２０ｃｐｍおよび１５４３±３１９０（平均値±標準偏差）であった。Ｂ細胞単独での［３Ｈ］チミジンの取り込みは、４０±５ｃｐｍの総量であり、放射線照射ＥＬ４Ｂ５細胞単独では、３１±１５ｃｐｍであった。
【０１９５】
非常に有効な阻害が生じた。各々１０ｎｇ／ｍｌという低い濃度で、３つの抗ＣＤ４０
ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６および３Ａ８は、ヒトＢ細胞増殖を、
完全に阻害した。最大の阻害の半分が、約１ｎｇ／ｍｌで見出された。対照的に、アイソタイプ一致性ＩｇＧ２ｂマウスミエローマタンパク質ＭＯＰＣ−１４１は、［３Ｈ］チミジンの取り込みに有意な効果を示さなかった。同様の阻害を、［３Ｈ］チミジンの取り込みを、６日目ではなく培養の４日目に評価した際に観察した。このように、観察された効果が、抗ＣＤ４０ ｍＡｂの影響下での増殖の速度論的変化によるものであるという可能性は、排除された（データは示さず）。
【０１９６】
比較のために、他のＢ細胞表面構造に対する、いくつかのｍＡｂの影響を調べた。抗ＣＤ２０ ｍＡｂ Ｂ１および抗Ｂ７ ｍＡｂ Ｂ７−２４（後者のｍＡｂを、図１４で用いた抗ＣＤ４０ ｍＡｂを生産するために用いた手順と同様の手順により、抗ＣＤ４０ ｍＡｂを用いた実験において使用した濃度と同一の濃度で生産した）のどちらも、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対し如何なる影響も与えなかった（データは示さず）。従って、抗ＣＤ４０ ｍＡｂのＥＬ４Ｂ５誘導Ｂ細胞増殖に対する阻害効果が、Ｂ細胞表面のマスキングによるものではない結論に達し得る。
【０１９７】
実施例１９
ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖への、ｈＣＤ４０．Ｈμの効果
ＥＬ４Ｂ５細胞が、ＣＤ４０に結合する膜構造を発現し得るかどうかを調べるために、ＣＤ４０の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＭの定常ドメインＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４（ｈＣＤ４０．Ｈμ）からなる融合タンパク質を、流動螢光定量分析に用いた。Ｌａｎｅ
ら、上記。非活性化ＥＬ４Ｂ５細胞は、融合タンパク質に結合しなかった。しかし、ＥＬ４Ｂ５細胞を、ヒトＢ細胞の活性化に必要な条件であるＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）および５％のヒトＴ細胞上清液と共に培養すると、軽度のｈＣＤ４０．Ｈμの結合が見出された（データは示さず）。この螢光の小さいシフトは、３回の独立した実験で常に見出された。ＣＤ４０結合の誘導に必要な最短の活性化期間は、２４時間であった。抗ＣＤ４０ ｍＡｂが阻害したように、ＥＬ４Ｂ５細胞に対するｈＣＤ４０．Ｈμの結合が、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖を阻害するかどうかを決定するために、上記のＢ細胞活性化アッセイを用いて、融合タンパク質を、ヒトＢ細胞とＥＬ４Ｂ５細胞との共培養物中で滴定した。図１５は、融合タンパク質が、まさに全く、［３Ｈ］チミジンの取り込みを濃度依存的に阻害し、そして、図１４に示される実験で使用された抗ＣＤ４０ ｍＡｂと同様に、ＥＬ４Ｂ５細胞により誘導されたＢ細胞増殖を完全に阻害し得たことを示す。
【０１９８】
実施例２０
ヒトＢ細胞による、ヒトＴ細胞誘導抗体産生への、抗ＣＤ４０ ｍＡｂの効果
上記のＴ細胞ヘルパーアッセイを用いて、活性化Ｔ細胞により接触依存的に刺激されたＢ細胞による免疫グロブリン産生を阻害する能力についても、抗体を試験した。抗ＣＤ３
ｍＡｂでコートされ、かつＴ細胞を共刺激する異なったｍＡｂでコートされるか、または、コートされない９６ウェルプレートにおいて、ヒト扁桃Ｂ細胞（１０４／ウェル）を、放射線照射された精製Ｔ細胞（３，０００ラド、１０５／ウェル）と共に培養した。培養８日後に、Ｂ細胞による免疫グロブリンの産生の測定のために、上清液を採取した。Ｂ細胞による免疫グロブリン産生は、上記のＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２を、培養当初から種々の濃度で添加した。コントロールとして、ｍＡｂ ＭＯＰＣ−１４１を添加した。図１６Ａは、Ｔ細胞が、固定化抗ＣＤ３ ｍＡｂにより刺激され、可溶性の抗ＣＤ２および抗ＣＤ２８ ｍＡｂにより共刺激されると、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２の添加が、ヒトＢ細胞によるＩｇＧ産生の阻害を濃度に依存して引き起こしたことを示す。Ｂ細胞によるＩｇＭ産生は、同程度に阻害された。同様の結果を、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ３Ｃ６および３Ａ８で、ならびにｈＣＤ４０．Ｈμ融合タンパク質で得た。
【０１９９】
本発明の抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、非常に有効な阻害を示した。約３０ｎｇ／ｍｌ程度の低い濃度で、３つの抗ＣＤ４０ ｍＡｂの各々が、５０％の最大阻害を示した。対照的に、アイソタイプ一致性のＩｇＧ２ｂマウスミエローマタンパク質ＭＯＰＣ−１４１は、免疫グロブリンの産生に影響しなかった。
【０２００】
３つの抗ＣＤ４０ ｍＡｂによる阻害効果は、ＣＤ４０リガンドヘルパー活性を提供しているＴ細胞の活性化の様式に対し特異的でなかった。図１６Ｂは、全てのＴ細胞増殖条件下（抗ＣＤ３単独；抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２；抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８；および抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２＋抗ＣＤ２８）で、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ５Ｄ１２の添加が、ヒトＢ細胞による免疫グロブリン産生の強度の阻害をもたらしたことを示す。この阻害は、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド相互作用を完全に遮断することで知られるｈＣＤ４０．Ｈμ融合タンパク質による阻害の量に匹敵する。阻害の百分率は、Ｔ細胞活性化条件に依存して、４０〜７０％に変化した。対照的に、アイソタイプ一致性のＩｇＧ２ｂマウスミエローマタンパク質ＭＯＰＣ−１４１、あるいはヒトＩｇＭ（ｈＣＤ４０．Ｈμ融合タンパク質のコントロールとして）は、ヒトＢ細胞による免疫グロブリンの産生に影響しなかった。
【０２０１】
培養の寄託
上記の実施例中で使用されたハイブリドーマは、ブダペスト条約の条項に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡに寄託され、受理された。この寄託は、これらのハイブリドーマが、上記の発明または下記の
請求項に記載の発明を実施するのに必須であることを示すものではない。
【０２０２】
ハイブリドーマ 寄託日 アクセス番号
Ｂ７−２４ １９９３年５月６日 ＨＢ １１３４１
３Ｃ６ １９９３年５月６日 ＨＢ １１３４０
５Ｄ１２ １９９３年５月６日 ＨＢ １１３３９
本発明は、特定の実施態様を参考にして記載した。しかし、本出願は、添付の請求の範囲の意図および範囲から離れることなく、当業者により行われ得る変更および置換を、包含することが意図される。
【０２０３】
本発明は、細胞表面抗原に対して特異的な抗体を生産する方法に関し、そしてそれは免疫原として組換え昆虫細胞を用いる。昆虫細胞は、細胞表面抗原を含有する分子のコード領域でトランスフェクトされ、そしてこれらの抗原は、昆虫細胞の表面上で発現される。宿主動物は、これらのトランスフェクトされた昆虫細胞で免疫化されて、細胞表面抗原に対して特異的な抗体を生産する。宿主動物からの抗体産生細胞は、モノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ細胞を生産するために用いられる。血清およびハイブリドーマ上清液は、スクリーニングアッセイにおいてトランスフェクトされた細胞を用いて、表面抗原に対する抗体の存在に対して試験され得る。本方法により生産された特異的抗体は、抗Ｂ７抗体および抗ＣＤ４０抗体であり、そしてそれらは被験体における抗体介在性疾患または免疫系疾患を予防または治療するために用いられ得る。抗Ｂ７抗体は、Ｔ細胞アネルギーの誘導、同種移植片移植組織拒絶反応の治療、移植片対宿主病の治療、およびリウマチ様関節炎の予防または治療に用いられ得る。免疫抑制剤は、抗体と一緒に投与され得る。ＣＤ４０抗原に結合する抗ＣＤ４０抗体は、Ｂ細胞の成長または分化を妨げるのに用いられ得る。これらの方法において有用なモノクローナル抗体、およびそのようなモノクローナル抗体と免疫反応するエピトープもまた提供される。
【０２０４】
（参考文献）
【０２０５】
【化１】
【０２０６】
【化２】
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１Ａ】図１Ａは、バキュロウイルス転移ベクターｐＡｃＣ８および多重クローニング部位の配列の図解を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の方法に従って、ヒトＣＤ４０あるいはＢ７抗原を発現するＳｆ９細胞生産の図解を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＤ４０およびヒトＢ７抗原のコーディング領域を調製するのに使用する、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーの配列を示す。これらのプライマーは、抗原Ｂ７およびＣＤ４０の公表されている全ＤＮＡコーディング配列（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、１９８９）に基づいて構築した。
【図３】図３は、抗（Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＢ−１と、ＡｃＢ７ウイルスに感染させたＳｆ９細胞およびヒトＣＤ２６を発現するＳｆ９細胞との反応を試験する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、抗（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｓ２Ｃ６と、ＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞およびＢ７を発現するＳｆ９細胞との反応を試験する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａ−Ｃは、ＣＤ４０あるいはＢ７を発現する、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞の蛍光細胞染色の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ−Ｃは、ＣＤ４０あるいはＢ７を発現する、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞の蛍光細胞染色の結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ−Ｃは、ＣＤ４０あるいはＢ７を発現する、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞の蛍光細胞染色の結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図７】図７は、抗Ｂ７ Ｍａｂ Ｂ７−２４のＦａｂフラグメントによる、Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導Ｂ７介在性増殖の阻害を示す。
【図８】図８は、抗Ｂ７ Ｍａｂｓ Ｂ７−２４（四角）あるいはＢＢ−１（三角）による、Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導Ｂ７介在性増殖の阻害を示す。
【図９Ａ】図９は、（Ａ）ＭＡｂ Ｂ７−２４あるいは（Ｂ）ＭＡｂ ＢＢ−１による、３日間の一次ＭＬＣ（黒丸）および３日間の二次ＭＬＣ（白丸）時の、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用のブロッキング効果を示す。
【図９Ｂ】図９は、（Ａ）ＭＡｂ Ｂ７−２４あるいは（Ｂ）ＭＡｂ ＢＢ−１による、３日間の一次ＭＬＣ（黒丸）および３日間の二次ＭＬＣ（白丸）時の、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用のブロッキング効果を示す。
【図１０】図１０は、ＣｓＡによる、Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導Ｂ７介在性増殖の抑制を示す。データは、異なるドナーのＴ細胞を用いた、３回の個別実験の平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【図１１】図１１は、二次ＭＬＣ時のアロ抗原誘導ＣＴＬ活性のブロッキングにおける、抗Ｂ７ Ｍａｂ Ｂ７−２４とＣｓＡとの相乗効果を示す。Ｔ細胞のＣＴＬ活性は、培地のみ；４００μｇ／ｍｌ ＣｓＡ；１０μｇ／ｍｌ Ｍａｂ Ｂ７−２４；あるいは、４００μｇ／ｍｌ ＣｓＡおよび１０μｇ／ｍｌ Ｍａｂ Ｂ７−２４の存在下での、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣによる３日間の再刺激後に測定した。
【図１２Ａ】図１２Ａは、３つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂおよび１つの従来の抗ＣＤ４０ ｍＡｂの、抗ＩｇＭ誘導ヒトＢ細胞増殖を共刺激する能力の比較である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）の存在下での、図５Ａの実験の繰り返しを示す。
【図１３】図１３は、３つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂの、固定化抗ＩｇＭおよび抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５２Ｃ６との共刺激により誘導されたヒトＢ細胞増殖を阻害する能力を示す。
【図１４】図１４は、３つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂの、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対する効果を示す。
【図１５】図１５は、可溶性ＣＤ４０（ｈＣＤ４０．μ）の、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対する効果を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａおよび１６Ｂは、１つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２の、ヒトＢ細胞による、ヒトＴ細胞誘導免疫グロブリン産生に対する効果を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび１６Ｂは、１つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２の、ヒトＢ細胞による、ヒトＴ細胞誘導免疫グロブリン産生に対する効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、膜関連抗原分子に特異的である抗体を生産する方法に関する。さらに詳細には、本発明では、宿主動物の免疫化および宿主動物から単離した抗体のスクリーニングに、これらの膜関連抗原を使用する方法を記載する。さらに、本発明は、免疫系疾患を治療する新規な方法に関する。特に、本発明は、（１）移植組織拒絶反応、移植片対宿主病、および、異物としての特異抗原の認識により生じるその他の免疫学的症状；ならびに、（２）ＩｇＥ介在性疾患（アレルギー）、および、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含む自己免疫疾患のような、抗体介在性疾患；の予防または治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｉ．モノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体は、免疫学的研究の有力な手段であることが立証されている。一般的には、モノクローナル抗体は、免疫原組成物中に存在するその他の抗原に対する抗体から、目的の抗原に対する抗体を判別するスクリーニングアッセイが可能であれば、免疫原として混合抗原を使用して産生し得る。目的の抗原が細胞表面分子であるときは、膜環境による高次構造制限を保持するために、免疫原として目的の分子を含有する細胞あるいは膜画分を使用するのが好ましい。
【０００３】
全細胞によるマウスの免疫化では、通常は、多くの異なる分子に対する抗体を生産する、強い免疫応答を示す。この広範な免疫応答は、次の、マウス脾臓細胞あるいはリンパ球細胞由来のハイブリドーマクローンによる特異的抗体の産生についてのスクリーニングでの、この免疫原細胞の使用を妨害する。
【０００４】
さらに、目的の抗原が低濃度で発現される場合には、その抗原に特異的なマウスＢ細胞の頻度は比較的低い。この低頻度により、目的の抗原に対する抗体を産生するクローンを同定するために、膨大な数のハイブリドーマクローンのスクリーニングが必要とされる。
【０００５】
ヒト細胞表面抗原を発現する同系移植ネズミの線維芽細胞は、特異的抗体を産生するために、マウスを免疫化するのに使用されてきた（ＤｉＳａｎｔｏら、１９９１）。適切なマウス株に注射すると、線維芽細胞に存在するバックグラウンドの抗原タンパク質が免疫原性にはならず、免疫応答が異種移植組換えタンパク質に集中する。しかし、この方法には、抗体産生が望まれる各々の種あるいは株に対する特異的な組換え細胞の構築が必要である。
【０００６】
ＩＩ．移植片拒絶反応およびＣＤ２８−Ｂ７系
移植後の移植片拒絶反応の防止のための最近の戦略は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６、およびコルチコステロイドのような広域作用免疫抑制剤に基づく。これらの薬剤は、しばしば長期間摂取しなければならないので、重篤な感染、腎毒性および癌の危険性を増す。さらに、全ての被験体が、これらの免疫抑制剤の高用量に耐え得るわけではなく、しばしば移植片拒絶反応あるいは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を生じる。移植片拒絶反応の最適な予防は、ドナー組織に対して特異的耐性を誘導することに基づく。従って、移植組織の拒絶反応を予防するための理想的な薬剤は、長期間の免疫抑制の必要性のない、ドナー反応性Ｔ細胞のクローン性非応答、すなわち、アネルギーを誘導すべきである。アネルギーは、「共刺激性」シグナルの非存在下の、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とペ
プチド提示主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原との間の相互作用後の、細胞間シグナル化によると考えられている。非特許文献１。この共刺激性シグナルは、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面により提供される。非特許文献２；および非特許文献３。
【０００７】
Ｔ細胞は、インビボでの正常な免疫応答時に重要な役割をなす。それらには、細胞毒性、遅延型過敏、およびＢ細胞によるＴ細胞依存性抗体産生が含まれる。さらに、Ｔ細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、リンホトキシン、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような広範囲の種々のリンホカインを産生し得る。
【０００８】
Ｔ細胞の活性化は、リガンド−レセプター相互作用に起因する。生理学的条件下で、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ＡＰＣのＭＨＣ分子により提示される抗原性ペプチドに結合する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、抗原誘導活性化において２つの役割をなす。第一は、抗原提示ＭＨＣ分子成分中の特異的抗原の認識である。第二は、その認識事象が、シグナル化機構により形質膜を通って伝達される。しかし、抗原のＴＣＲのみへの結合は、最大のＴ細胞活性化には十分ではない。Ｔ細胞表面のその他の多くの補助分子が、付着あるいはシグナル化または両方に重要な役割をなすことは周知である。例えば、Ｔ細胞上のＣＤ２分子は、ＡＰＣのＬＦＡ−３に結合し得るが、さらに、抗体のＣＤ２への結合は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体により示されるシグナルを増大し得ることもまた示された。Ｔ細胞活性化に関するその他のリガンドペアーは、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４／ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ、および、最も重要なＣＤ２８／Ｂ７である。
【０００９】
ＴＣＲ刺激が、全Ｔ細胞活性化あるいはＴ細胞アネルギーを導くかを決定する共刺激性シグナルの適当な候補物は、Ｔ細胞上のＣＤ２８とＡＰＣのＢ７との相互作用により生産される。ＣＤ２８分子の架橋結合が、Ｔ細胞のアネルギー性になるのを救い得ることが、インビトロにおいて実証された。非特許文献４。ＣＤ２８は、見かけの分子量が４４ ｋＤａである、ホモダイマーのトランスメンブラン糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（非特許文献５）。ＣＤ２８分子は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の約９５％、および、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の５０％に発現する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体およびＣＤ２８に対するモノクローナル抗体によるＴ細胞の共刺激により、Ｔ細胞は非常に活性化される。非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８。この効果には、ＩＬ−２を含む数種のリンホカインのｍＲＮＡの安定化に明らかに関連し、これらのリンホカインの産生を大いに促進する。非特許文献７（前出）；および非特許文献８（前出）。さらに、ＣＤ２８応答要素は、ＩＬ−２遺伝子のエンハンサーで実証され、このことは、転写レベルでの調節もまた存在することを示唆している。非特許文献９、および、非特許文献１０。ＣＤ２８に介在されるＴ細胞活性化のある種のモデルが、ＣｓＡによる阻害に対して比較的に耐性であることが報告された。非特許文献１１。
【００１０】
Ｂ７は、見かけの分子量が４５−６５ ｋＤａである、トランスメンブラン糖タンパク質であり、ＣＤ２８のように免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。非特許文献１２。Ｂ７発現ＣＨＯ細胞は、ＴＣＲ刺激と相乗作用し得、このことによりＩＬ−２分泌およびＴ細胞増殖をもたらす。非特許文献１３；および、非特許文献１４。Ｂ７はまた、ＣＴＬＡ−４分子の組換え融合タンパク質に結合する。非特許文献１５。ＣＴＬＡ−４もまた免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、そしてＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の細胞質領域は、有意に相同である。非特許文献１６。Ｂ７分子は、活性化Ｂ細胞（非特許文献１２、前出）、ＩＦＮ−γで刺激された単球（非特許文献１７）、および、単離された末梢血樹枝状細胞（非特許文献１８）で発現される。免疫組織化学の研究によれば、Ｂ７分子はまた、インビボにおいて、リンパ組織および非リンパ組織の両方の樹枝状細胞上に構成的に発現される。非特許文献１９。
【００１１】
インビボにおいて、Ｂ７抗原は、移植組織拒絶反応時にＴ細胞活性化に関連する。Ｌｅｎｓｃｈｏｗおよび共同研究者は、ヒトＣＴＬＡ−４と免疫グロブリンＧ１ Ｆｃ領域との可溶性融合タンパク質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）（これは、マウスおよびヒトＢ７の両方に強く結合する）を使用して、マウスヘの移植後の、ヒト膵島の拒絶反応を予防した（非特許文献２０）。ここでＣＴＬＡ４Ｉｇは、異種移植（Ｔ細胞が由来する種に対する外来抗原）の拒絶反応を遮断する。
【００１２】
Ｂ７とＣＤ２８抗原間の相互作用を妨害する分子は公知である。可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、この相互作用を部分的に遮断することが知られている。非特許文献２１。抗ＣＤ２８抗体もまたこの相互作用を遮断することが知られている。さらに、抗Ｂ７抗体が当該分野において公知である。非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４。
【００１３】
ＩＩＩ．Ｂ細胞活性化およびＣＤ４０抗原−リガンド系
Ｂ細胞は、インビボにおける正常な免疫応答時に重要な役割をなす。外来抗原は、特異的Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンに結合し、このことにより、エンドサイトーシス、プロセシング、ＭＨＣクラスＩＩ分子上のプロセスされたペプチドの提示、および、Ｂ細胞表面のＢ７抗原の上昇調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を含む一連の事象の引金となる。次に、特異的Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されたプロセス抗原のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）認識を介してＢ細胞に結合する。ＴＣＲを介する刺激は、Ｔ細胞の活性化を開始し、Ｔ細胞のサイトカイン産生を始める。Ｔ細胞のＣＤ２８抗原とＢ細胞のＢ７抗原との間の相互作用は、さらにＴ細胞を活性化する第二のシグナルを提供し得、高レベルのサイトカイン分泌をもたらす。さらに、休止ヒトＴ細胞では発現されないＣＤ４０リガンドは、上記のシグナルを受けると、Ｔ細胞表面で上昇調節される。次に、Ｂ細胞は、Ｂ細胞表面のＣＤ４０抗原を介してＣＤ４０リガンドにより刺激され、そしてまた、可溶性サイトカインによっても刺激されて、このＢ細胞は成熟化して高レベルの可溶性免疫グロブリンを分泌する形質細胞になる。
【００１４】
数年前に、非特許文献２５では、ＥＬ４Ｂ５として知られるマウス胸腺腫ＥＬ−４系の変異体サブクローンは、ネズミおよびヒト起源の両方のＢ細胞を強く刺激して増殖し、インビトロにおいて免疫グロブリンを分泌する形質細胞に分化し得た。この活性化は、抗原非依存的であり、ＭＨＣ制限されないことが見いだされた。ヒトＢ細胞の最適刺激には、活性化ヒトＴ細胞由来の上清液の存在が必要であるが、ＥＬ４Ｂ５細胞がホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）あるいはＩＬ−１で予め活性化されているときには、Ｂ細胞応答もまた生じた。非特許文献２６；および、非特許文献２７。この培養系でのＢ細胞活性化は効率がよい−−制限希釈実験は、ヒトＢ細胞の大部分が、活性化されて増殖し、抗体分泌細胞に分化し得ることを示した。非特許文献２８。
【００１５】
これらの変異体ＥＬ−４細胞が、ネズミおよびヒト両方のＢ細胞を活性化する機構は、以前には解明されなかった。しかし、ＥＬ４Ｂ５に誘導されるＢ細胞の活性化には、細胞−細胞接触が必要であることは明らかである。第一に、Ｂ細胞は、ＰＭＡに刺激されるＥＬ４Ｂ５細胞に由来の上清液の存在下では増殖しない。Ｚｕｂｌｅｒら、（１９８５）前出。第二に、Ｂ細胞は、半透過濾過膜により、ＰＭＡで処理したＥＬ４Ｂ５細胞から分離されると、増殖しない。Ｚｈａｎｇら、前出。マウスＬＦＡ−１、ヒトＬＦＡ−１あるいはヒトＬＦＡ−３に対する抗体、および、マウスあるいはヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に対する抗体は、ヒトあるいはネズミＢ細胞のＥＬ４Ｂ５に誘導される増殖を抑制しない。Ｚｕｂｌｅｒら、（１９８７）およびＺｈａｎｇら、前出。
【００１６】
ＣＤ４０抗原は、Ｂ細胞の細胞表面に発現される糖タンパク質である。Ｂ細胞の分化のときに、この分子はまず前Ｂ細胞上に発現され、次いで、Ｂ細胞が形質細胞になるときに
、その細胞表面から消える。ＣＤ４０分子の抗ＣＤ４０抗体との架橋は、Ｂ細胞に種々の効果を媒介する。ＣＤ４０抗原はヒト神経成長因子（ＮＧＦ）レセプターおよび腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）レセプターに関連することは周知であり、このことは、ＣＤ４０がＢ細胞活性化における重要な機能を有するリガンドに対するレセプターであることを示唆する。
【００１７】
ＣＤ４０のリガンドは、活性化Ｔ細胞の細胞表面で同定された。非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１。ＣＤ４０リガンドのｃＤＮＡクローニングは、ＴＮＦ−αと相同であるＩＩ型トランスメンブラン糖タンパク質の特性を有する分子を明らかにした。非特許文献３２、および、非特許文献３３。ＣＤ４０リガンドの細胞外ドメインは、トランスメンブラン領域に近接した２つのアルギニン残基を含有し、これらはタンパク質分解的切断を受けてリガンドの可溶性形態を生じ得る可能性のある部位を提供する。組換えＣＤ４０リガンドの発現は、この分子が精製Ｂ細胞の増殖を刺激し、そしてＩＬ−４と共同してＩｇＥの分泌を媒介し得ることを示した。非特許文献３２、および非特許文献３３、前出。結果として活性化Ｔ細胞上の機能性分子がなくなる、ＣＤ４０リガンドの遺伝子の異常のせいで、被験体がＩｇＭ以外の抗体イソ型を正常なレベルで産生できないことに特徴があるまれな病気であるＸ連鎖性高ＩｇＭ症候群が起こることが報告された。非特許文献３４；および、非特許文献３５。
【００１８】
当業者に公知の全ての抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＢ細胞に刺激効果を有する。公知の抗ＣＤ４０抗体を用いるＢ細胞表面上へのＣＤ４０分子の架橋は、Ｂ細胞に種々の効果を媒介する。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、細胞間接着、増殖、および、ある種のサイトカインと共同して、抗体を分泌する細胞への成熟化を誘導し得る。例えば、公知の抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、Ｂ細胞活性化においてＴヘルパー細胞の効果を模倣することを示した。ＦｃγＲＩＩを発現する付着細胞上にもたらされると、これらの抗体はＢ細胞の増殖を誘導する。非特許文献３６。さらに、公知のＣＤ４０ ｍＡｂは、ＩＬ−４の存在下で、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＥの分泌のためのＴヘルパーシグナルに代わり得る。非特許文献３７。さらに、公知の抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、リンパ節から単離されたＢ細胞のプログラムされた細胞死（アポートシス）を防止し得る。
【００１９】
【非特許文献１】Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）７：４４５
【非特許文献２】Ｈａｗｒｙｌｏｗｉｃｚ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：４０８３
【非特許文献３】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）５：２２３
【非特許文献４】Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６：６０７
【非特許文献５】Ａｒｕｆｆｏ，Ａ、およびＳｅｅｄ，Ｂ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９８７）８４：８５７３
【非特許文献６】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９８９）８６：１３３３−１３３７
【非特許文献７】Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３：１５３−１６１
【非特許文献８】Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３３９−３４３
【非特許文献９】Ｆｒａｓｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：３１３
【非特許文献１０】Ｖｅｒｗｅｙ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：１４１７９−１４１８２
【非特許文献１１】Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）７：４４７２−４４８１
【非特許文献１２】Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３：２７１４−２７２２
【非特許文献１３】Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１３７：７２１−７３０
【非特許文献１４】Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９９１）８８：６５７５
【非特許文献１５】Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１７４：５６１−５６９
【非特許文献１６】Ｈａｒｐｅｒ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７：１０３７
【非特許文献１７】Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１３７：４２９−４３７
【非特許文献１８】Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９２）９０：２２９−２３７
【非特許文献１９】Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｐ．ら、”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（１９９３）
【非特許文献２０】Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５７：７８９−７９２
【非特許文献２１】Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）７４：５６１
【非特許文献２２】Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８２）１２８：８２３
【非特許文献２３】Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：３２６０
【非特許文献２４】Ｖａｌｌｅ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９０）６９：５３１
【非特許文献２５】Ｚｕｂｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）１３４：３６６２
【非特許文献２６】Ｚｕｂｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９８７）９９：２８１
【非特許文献２７】Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９０）１４４：２９５５
【非特許文献２８】Ｗｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１７：８８７
【非特許文献２９】Ｆｅｎｓｌｏｗ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１４９：６５５
【非特許文献３０】Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２２：２５７３
【非特許文献３１】Ｎｏｅｌｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９２）８９：６５５０
【非特許文献３２】Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５７：８０
【非特許文献３３】Ｓｐｒｉｇｇｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６：１５４３
【非特許文献３４】Ａｌｌｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２５９：９９０
【非特許文献３５】Ｋｏｒｔｈａｕｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６１：５３９
【非特許文献３６】Ｊ．Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２５１：７０
【非特許文献３７】Ｈ．Ｇａｓｃａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７：８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、モノクローナル抗体産生細胞を生産する方法を提供する。この抗体は、特定の細胞表面分子に対して結合特異性を有する；この方法は、上記の方法の制限を克服する。本発明はまた、抗Ｂ７抗体あるいはＢ７抗原に結合する分子を、その他の免疫抑制剤と共に使用して、Ｔ細胞アネルギーを引き起こし、そしてそのことにより移植片拒絶反応あるいはＧＶＨＤを予防あるいは治療する方法を提供する。さらに、本発明はまた、（１）Ｂ細胞応答を阻害し得、そして、（２）抗体介在性疾患の予防あるいは治療に使用し得る新しい抗ＣＤ４０抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、選択された膜関連抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗原を産生し得る不死化細胞系を生産する方法を提供する。この方法では、典型的には、バキュロウイルスベクターを用いる抗原コーディング配列の組換え発現を経て、膜関連抗原は、昆虫細胞の細胞表面に産生される。これらの昆虫細胞を、宿主動物に注射する。膜関連抗原に対する抗体を産生し得る細胞を回収する；そのような細胞を、細胞培養において増殖するために不死化する。不死化細胞を、膜関連抗原に特異的な抗体の産生についてスクリーニングする。典型的には表面に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を使用する結合アッセイを用いてスクリーニングを行う。上記非昆虫細胞表面の膜関連抗原に結合する抗体を産生する不死化細胞を、選択する。
【００２２】
１つの実施態様では、膜関連抗原をコードするＤＮＡ配列を、選択された昆虫細胞での抗原発現に適したバキュロウイルスベクター中に、作動可能に挿入する。抗原をコードするＤＮＡ配列を有するベクターを、例えばベクターのトランスフェクションにより、昆虫細胞へ導入する。細胞表面の膜関連抗原を産生するベクターで形質転換された昆虫細胞を、選択する。
【００２３】
目的の膜関連抗原をコードする標的ＤＮＡ配列を単離する１つの方法は、標的ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡあるいはＲＮＡテンプレートのいずれかを使用するポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。本発明の実施に有用な昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから得られ得る。膜関連抗原に対する抗体分子を産生し得る、一般的に使用される動物細胞は、脾細胞あるいはリンパ球である；宿主動物細胞の不死化を、標準的な方法により完了する。本発明の１つの実施態様では、宿主動物はマウスである。
【００２４】
上記の方法では、表面に膜関連抗原を有する、ヒト細胞を含む多くの非昆虫細胞を使用し得る。このような非昆虫細胞は、初代細胞あるいは培養細胞であり得る。１つの実施態様では、非昆虫細胞は、培養ヒトリンパ球、特に形質転換Ｂ細胞であり得る。
【００２５】
本発明の方法において、有用な膜関連抗原には、以下のものが含まれる：ヒト細胞表面タンパク質；末梢血単核細胞の抗原標識タンパク質、例えば、ＣＤ４０あるいはＢ７；および、ヒト細胞表面に存在するウイルス抗原タンパク質。
【００２６】
本発明ではまた、選択された膜関連抗原に特異的な抗体を含有する血清を産生する方法を記載する。この方法おいて、膜関連抗原は昆虫細胞の細胞表面に存在し、この細胞を宿主動物に注射し、そして、膜関連抗原に特異的な抗体の存在について動物由来の血清をスクリーニングする。このようなスクリーニングには、典型的には、細胞表面に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合アッセイを使用する。
【００２７】
また、スクリーニングアッセイで、抗原を発現する組換え非昆虫細胞を用いて、選択された膜関連抗原に対する抗体の存在について、血清およびハイブリドーマ上清液を試験し得る。
【００２８】
本発明はまた、Ｂ７抗原に結合する分子（上記の方法により産生された抗Ｂ７モノクローナル抗体のような）と、免疫抑制剤との、被験体への共投与が、アロ抗原（Ｔ細胞と同種の細胞固有の抗原）に対して長期間継続するＴ細胞アネルギーを誘導し得るという発見に基づいている。
【００２９】
従って、本発明は、被験体における移植組織拒絶反応を予防する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（１）Ｂ７抗原に結合する分子、および（２）シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤の治療上有効な量を投与することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ７抗原に結合する分子は抗Ｂ７抗体である。
【００３０】
さらに、本発明は、被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防あるいは治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（１）Ｂ７抗原に結合する分子、および（２）シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤の治療上有効な量を投与することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ７抗原に結合する分子は抗Ｂ７抗体である。
【００３１】
さらに、本発明は、被験体のリウマチ様関節炎の予防および治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（１）Ｂ７抗原に結合する分子、および（２）シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤の治療上有効な量を投与することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ７抗原に結合する分子は抗Ｂ７抗体である。
【００３２】
上記の方法のさらに好ましい実施態様では、抗Ｂ７抗体は、本明細書に記載されているように産生された、モノクローナル抗体であり、最も好ましくはＢ７−２４モノクローナル抗体である。
【００３３】
本発明はさらに、上記の方法により産生されたヒトＢ細胞の成長および分化を刺激しない抗ＣＤ４０抗体の発見に基づく。逆に、これらの抗体は、比較的低濃度で、ヒトＢ細胞応答を阻害し得る。従って、ヒトＢ細胞応答により産生される抗体に介在される疾患あるいは症状を、予防あるいは治療するためにこれらの抗体を使用し得る。これらの抗体はまた、Ｂ細胞応答を調節するのに有用な、ＣＤ４０抗原上の新規なエピトープを認識する。
【００３４】
従って、本発明は、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体を提供し、ＣＤ４０抗原への抗体の結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を抑制する。
【００３５】
さらに、本発明は、被験体の抗体介在性疾患を予防あるいは治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含する。ここにおいて、抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を妨げる。
【００３６】
さらに、本発明は、被験体のアレルギーのようなＩｇＥ介在性疾患を予防あるいは治療
する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここにおいて、抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を妨げる。
【００３７】
さらに、本発明は、被験体の抗体介在性自己免疫疾患を予防あるいは治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここにおいて、抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を妨げる。この方法によって治療が期待される特定の自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）が含まれる。
【００３８】
さらに、本発明は、ＣＤ４０抗原の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体への結合と競合し得るＣＤ４０抗原エピトープを提供し、ここにおいて、この抗体のヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を抑制する。
【００３９】
上記目的のさらに好ましい実施態様では、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、上記の方法により産生され、そして５Ｄ１２、３Ａ８あるいは３Ｃ６のいずれかである。
【００４０】
本発明はまた、選択された膜関連抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生する不死化細胞系を生産する方法であって、該方法が以下の工程を包含する、方法を提供し、この方法は、昆虫細胞の細胞表面上で膜関連抗原を産生する工程；該昆虫細胞を宿主動物内に注入する工程；抗体分子を産生し得る細胞を該宿主動物から回収する工程；細胞培養における増殖のために該抗体分子を産生し得る細胞を不死化する工程；非昆虫細胞の表面上に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合アッセイで、膜関連抗原に特異的な抗体の産生に対して該不死化細胞をスクリーニングする工程；および該非昆虫細胞の表面上で膜関連抗原に結合する抗体を産生するこれらの不死化細胞を選別する工程を包含する。
【００４１】
好ましい実施形態においては、前記産生する工程が、以下の工程：選択された昆虫細胞内で前記抗原の発現に適するバキュロウイルスベクター内に、前記膜関連抗原をコードするＤＮＡ配列を作動可能に挿入する工程；該ベクターを用いて昆虫細胞をトランスフェクトする工程；および該昆虫細胞の細胞表面上で膜関連抗原を産生する該ベクターで形質転換された昆虫細胞を選別する工程をさらに包含する。
【００４２】
本発明はさらに、選択された膜関連抗原に対して特異的な抗体を含有する血清を生産する方法であって、該方法が以下の工程を含む、方法を提供する：昆虫細胞の細胞表面上で膜関連抗原を産生する工程；該昆虫細胞を宿主動物内に注入する工程；および細胞表面上に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合アッセイにおいて、膜関連抗原に特異的な抗体の産生に対して該動物から血清をスクリーニングする工程。
【００４３】
本発明はさらに、被験体における移植組織の拒絶反応を予防する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（ａ）Ｂ７抗原に結合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００４４】
本発明さらに、被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（ａ）Ｂ７抗原に結合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００４５】
本発明さらに、被験体におけるリウマチ様関節炎を予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（ａ）Ｂ７抗原に結合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００４６】
好ましい実施態様において、前記Ｂ７抗原に結合する分子は、抗−Ｂ７抗体である。
【００４７】
さらに好ましい実施態様では、上記方法において、前記免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。
【００４８】
本発明はさらに、被験体における抗体介在性疾患を予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与する工程を包含し、ここで該ＣＤ４０抗原への該抗体の結合が、該Ｂ細胞の成長または分化を妨げる、方法を提供する。
【００４９】
好ましい実施形態において、前記抗体介在性疾患は、ＩｇＥ介在性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）からなる群より選択される。
【００５０】
さらに好ましい実施形態では、前記モノクローナル抗体は、５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６からなる群より選択される。
【００５１】
本発明はさらに、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免疫反応するＣＤ４０抗原エピトープであって、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原への該モノクローナル抗体の結合が、該Ｂ細胞の成長または分化を妨げる、ＣＤ４０抗原エピトープを提供する。
【００５２】
本発明さらに、モノクローナル抗体Ｂ７−２４を提供する。
【００５３】
本発明さらに、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体であって、該ＣＤ４０抗原への該抗体の結合が、該Ｂ細胞の成長または分化を妨げる、モノクローナル抗体を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６からなる群より選択されるモノクローナル抗体を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載されている発明は、以前に公表された刊行物および係属中の特許出願を引用する。例えば、このような刊行物は、科学報文、特許、あるいは係属中の出願からなる。以上あるいは以下に掲載されたこれらの全刊行物および出願は、本明細書中で参考として援用されている。
【００５６】
Ｉ．定義：
本明細書で使用される用語「膜関連抗原」、「細胞表面分子」および「細胞表面抗原」とはすべて、タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドのことであり、このタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドの少なくとも１つの抗原性部分が、生物学的膜の表面に露出し、以下に示す１つまたはそれ以上の共有結合された部分を有し得る：１つまたはそ
れ以上の単糖あるいは複合糖部分（糖タンパク質として）、脂質部分（リポタンパク質として）、脂質および糖の組合せ部分、あるいは、その他翻訳後の改変。
【００５７】
「タンパク質」とは、典型的にはアミノ酸の長い鎖に基づくポリマー（ポリペプチド）のことである。タンパク質は、１つ、２つ、あるいはそれ以上のポリペプチド鎖から構成され得、さらに、炭水化物のようなポリペプチド鎖に関連するその他の型の物質を含有し得る。タンパク質の大きさは、（任意の数である）５，０００から数十万ｇ／ｍｏｌｅの広範囲におよぶ。５，０００の数は、およそ４０−４５個のアミノ酸の存在に対応する。約５，０００ｇ／ｍｏｌｅ未満のタンパク質は、典型的にはポリペプチドあるいは単にペプチドと呼ばれる（Ｂｏｈｉｎｓｋｉ）。
【００５８】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体、および、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶのようなそれらのフラグメント、ならびに、親抗体の抗原結合機能をとどめているその他のフラグメントのことである。
【００５９】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体分布を有する抗体組成物のことである。この用語は、抗体の種あるいは起源に関して限定されず、さらに産生される様式により限定されることも意図されない。この用語は、全免疫グロブリン、および、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶ、およびその抗体の抗原結合機能をとどめているその他のフラグメントのことを指す。いかなる哺乳類種のモノクローナル抗体でも、本発明に使用され得る。しかし実際問題として、モノクローナル抗体を産生するために要求されるハイブリッド細胞系あるいはハイブリドーマをつくるのに使用するラットあるいはネズミ細胞の入手可能性の理由により、抗体は典型的にはラットあるいはネズミ起源となる。
【００６０】
本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」とは、免疫グロブリンの枠組み構造領域の少なくとも一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
【００６１】
本明細書で使用される用語「１本鎖抗体」とは、結合抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）を決定し、結合機能を保存し得る連結部分を供給することにより調製される抗体のことである。本質的にこれは、抗原への結合に必要な可変領域部分のみを有する、根本的に短縮された抗体の形をとる。１本鎖抗体の決定および構築は、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００６２】
本明細書で使用される用語「Ｂ７抗原に結合する分子」とは、同じ環境下ではその他の物質がＢ７抗原に複合体化されない環境下で、Ｂ７抗原と複合体を形成し得る分子を意味する。その複合体は、ＣＤ２８あるいはＣＴＬＡ４抗原を介する、Ｂ７の正常なシグナル変換経路を遮断する様式で形成される。Ｂ７抗原に結合する分子には、Ｄ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗Ｂ７抗体が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される用語「ＣＤ４０抗原エピトープ」とは、ＣＤ４０抗原それ自身を除いた、本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免疫反応し得る分子のことである。ＣＤ４０抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメンント、ペプチド、炭水化物、脂質、およびその他の分子を含み得るが、本発明の目的に対しては、最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド擬似体（すなわち、ＣＤ４０抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）、あるいはそれらの組合せである。適切なオリゴペプチド擬似体は、特に、ＰＣＴ出願ＵＳ９１／０４２８２に記載されている。
【００６４】
ＩＩ．膜関連抗原分子に対する抗体の生産
この章では、免疫原としてトランスフェクトされた昆虫細胞を使用する、細胞表面分子に対する抗体の生産および選択の方法を記載する。本発明のトランスフェクトされた昆虫細胞はまた、スクリーニングアッセイに使用され得る。
【００６５】
１つの実施態様では、本発明は、細胞表面抗原に対するポリクローナル抗体を産生する方法を包含する。この方法は以下の工程を包含する：（ｉ）目的の抗原をコードする核酸コーディング配列の選択および単離、（ｉｉ）コーディング配列の効率よい発現を得るための、バキュロウイルス発現ベクターヘのコーディング配列の挿入、（ｉｉｉ）選択された抗原を発現する組換え昆虫細胞を得るための、発現ベクターの昆虫細胞へのトランスフェクト、および（ｉｖ）膜関連抗原を発現する昆虫細胞を用いた宿主動物の免疫；を包含する、免疫工程。
【００６６】
免疫後に、宿主動物の血清を、目的の抗原を発現する、昆虫細胞以外の細胞に対してスクリーニングする。あるいは、目的の抗原を含有する膜画分、またはある場合には、精製した組換え産生抗原自体を、血清をスクリーニングするために使用し得る。典型的には、（ａ）予め採血された血清、（ｂ）目的の抗原を発現しない昆虫細胞で免疫した宿主動物の血清、および（ｃ）組換え昆虫細胞で免疫した宿主動物の血清を、スクリーニングする。目的の抗原に特異的な抗体の存在は、血清（ａ）および（ｂ）による陰性反応、および血清（ｃ）による陽性反応によって示される。
【００６７】
本発明の別の実施態様では、本発明は、細胞表面タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマの生産方法を包含する。この方法には、上記の（ｉ）から（ｉｖ）の工程が包含される。組換え昆虫細胞を用いた宿主動物の免疫後に、抗体産生細胞を、動物から単離する。本発明の好ましい実施態様では、このような抗体産生細胞は、ハイブリドーマ細胞を生産するために使用され、このハイブリドーマ細胞はクローン化されてモノクローナル抗体の産生に使用される。このようなハイブリドーマ細胞由来の上清液を、例えば、以下に記載されている細胞に基づくスクリーニングアッセイにより、特異的な抗体産生についてスクリーニングする。
【００６８】
Ａ．膜分子に対するコーディング配列の単離
選択された膜関連抗原に対する核酸コーディング配列は、公知の上記抗原のタンパク質成分に対するアミノ酸および／またはＤＮＡコーディング配列に基づいて単離され得る。このコーディング配列は、生物学的ソースから標準の方法で単離され得る（Ａｕｓｕｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓａｍｂｒｏｏｋら）（例えば、ハイブリダイゼーション、分化ハイブリダイゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、クローニングおよびプラークスクリーニングなど）。また、目的の抗原をコーディングする合成オリゴヌクレオチド配列は、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得、または、例えばＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入され得る。大きなコーディング配列の場合、上記オリゴヌクレオチドコーディング配列は、このコーディング配列に対応した多数のオリゴヌクレオチドフラグメントの縦列配列を包含する一連のクローニング工程を経て合成され得る（Ｃｒｅａ；Ｙｏｓｈｉｏら；Ｅａｔｏｎら）。オリゴヌクレオチドコーディング配列は、標準の組換え方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ａｕｓｕｂｅｌら）で、または、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら）で増幅され単離され得る。
【００６９】
上記膜関連抗原の配列が公知のまたは一部公知の場合、特異的な抗原コーディング配列が単離され得る。典型的には、この抗原コーディング配列は、ｃＤＮＡライブラリーから単離され、ＤＮＡフラグメントを、選択されたソースからベクターへ挿入することによって生産され得る。膜抗原含有ソース由来のＤＮＡフラグメントを含有するｃＤＮＡライブラリーは、標的ＲＮＡ分子から生産されたランダムフラグメントｃＤＮＡ分子を用いて組
み立てられ得る。このようなｃＤＮＡライブラリーは、一般にバクテリア系（例えば、ラムダｇｔ１０（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を用いて組み立てられ得るだけでなく、従来技術を用いて、酵母または真核性発現系においても組み立てられ得る（Ａｕｓｕｂｅｌ）。
【００７０】
このライブラリーは、典型的には、プローブとして、公知の、または、抗原コーディング領域とハイブリダイゼーション可能なコンセンサス配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、膜関連抗原ＤＮＡ配列の存在に対してスクリーニングされる（通常はハイブリダイゼーションによる；Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら）。上記プローブは、放射性同位元素、ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む多くの検出部分を有し得る。また、核酸プローブ配列が利用できない場合、目的のコーディング領域を有するクローンのスクリーニングは、例えば、免疫スクリーニングを用いて実行され得る（Ｐｒｏｍｅｇａ社製”ＰＲＯＴＯＣＬＯＮＥ”ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１系を使用；Ｙｏｕｎｇら；Ｈｕｙｎｈら）。
【００７１】
コーディング領域は、正のシグナルを与える組換え型単離体から（ハイブリダイゼーションまたは免疫学的スクリーニングのいずれかによって）単離される。典型的には、コーディング領域を含有するＤＮＡフラグメントは、制限消化によって単離され、次いでサイズ分画およびフラグメント精製される。このような核酸コーディング領域は、次いで、以下のＢ項に記述されるｐＡｃＣ８ベクター（図１Ａ）のようなバキュロウイルス転移ベクターに挿入するために加工され得る。また、ｐＶＬ１３９３ベクター（Ｌｕｃｋｏｗら）およびｐＡｃ３Ｔ３ベクター（Ｓｕｍｍｅｒｓら）を含有するバキュロウイルスベクターが利用できる。
【００７２】
また、コーディング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら）によっても単離され得る。上記ＰＣＲに有用なプライマーは、公知の核酸配列いずれからも誘導され得る。正確な配列が公知でない場合、縮重プライマーが使用され得る（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら）。典型的には、これらのプライマーは、８個またはそれ以上の共直線ヌクレオチドからなる２つの核酸配列であり、ここで、この２つの配列は、標的配列を生産するために、ある一定の間隔で分割され（実施例１）、対向するストランドに相補的である。
【００７３】
典型的なＰＣＲサイクルは以下の工程を包含した：高温での溶融、続いてアニーリング、および伸張。この反応を２５−３０サイクル繰り返す。ＰＣＲ生成物は制限酵素によって消化され得、そして、分離用１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動で分析され得る。クローンに特異的な、増幅されたフラグメントは、典型的には電気泳動ゲルサイズ分画法によって同定される。このクローンされた特異的なＤＮＡフラグメントは、次いで、例えば”ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ”系（ＢＩＯ １０１，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を用いて、上記ゲルから回収される。必要であれば、このＤＮＡは、フェノールおよび／またはフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出され得る。単離されたＤＮＡは、エタノールで沈澱する。沈澱後、このＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクターに挿入するために使用される。
【００７４】
ヒトＣＤ４０またはＢ７抗原を発現するＳｆ９細胞の生産を、模式的に図１Ｂに示す。図に示すように、ＲＮＡは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換ヒト脾臓細胞群から、標準の方法を用いて単離される（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら）。総ＲＮＡは、確立した方法によるランダムヘキサマープライミングを用いて、ｃＤＮＡに転化される（詳細は実施例１に示す）。目的の膜関連抗原分子をコーディングするＤＮＡ分子は、５’末端におけるクローニングに対する制限部分を有する順方向および逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅によって生産される。ヒトＣＤ４０およびヒトＢ７抗原に対するコーディング
領域の調製に使用されるこのようなｃＤＮＡプライマーを、図２に示す。これらのプライマーは、ＣＤ４０およびＢ７抗原に対する確立された完全なＤＮＡコーディング配列に基づいて構築された（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、１９８９）。
【００７５】
さらに図１Ｂに関して、ｃＤＮＡは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｓから得られたポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼ、等モルのデオキシヌクレオチドの混合物、および緩衝液系の存在下で、順方向プライマーおよび逆方向プライマーと混合される（実施例１）。この混合物は、熱循環器中で増幅され、得られたＰＣＲ産物は、バキュロウイルス転移ベクターのポリリンカー中でサブクローニングされる。このようなベクターの１つであるｐＡｃＣ８を、図１Ａに図形的に示す。ポリヘドリンプロモーター（Ｍｉｌｌｅｒ）（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の下流に独特な制限エンドヌクレアーゼ部分を含有する多くのこのようなバキュロウイルス転移ベクターはいずれも、本発明の実施に使用され得る：Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）（Ｗｕら；Ｍａｔｓｕｕｒａら；Ｔａｋｅｈａｒａら）、または、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス（ｐＢｍＮＰＶ）ポリヘドリンｍＲＮＡ（Ｎｙｕｎｏｙａら；Ｓｅｋｉｎｅら）。
【００７６】
バキュロウイルス中の発現前に、ＤＮＡの挿入は、典型的には配列決定分析によってＰＣＲ誘導突然変異について検査される。
【００７７】
Ｂ．抗原コーディング配列のバキュロウイルスベクターへの挿入
膜関連抗原コーディング配列のバキュロウイルスベクターヘの挿入は、確立した方法に従って実行される（Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。ヒトＢ７およびヒトＣＤ４０をコーディングする全長ｃＤＮＡは、クローニングに対する制限部分を有するプライマーを用いたＰＣＲによって生産された。ＰＣＲ増幅に対する鋳型は、ＥＢＶ形質転換ヒト脾臓Ｂ細胞ＲＮＡから生産されたｃＤＮＡであった。手短に言えば、単離されたＤＮＡコーディング領域は、バキュロウイルス転移ベクター、または、ｐＡｃＣ８プラスミドのようなプラスミドに連結され、その結果、膜関連コーディング領域はポリヘドロンプロモーターの下流となる。このポリヘドロン遺伝子ＡＴＧはＡＴＴに突然変異し（図１Ａ）、機能性ＡＴＧを有するコーディング配列を含有しない組換え型クローンにおける翻訳開始が起こらないようにする。生じるプラスミドＤＮＡは、野生型バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）で、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９細胞）由来の昆虫細胞にトランスフェクションされ、野生型ウイルスと膜関連抗原遺伝子を運搬する組換え型ベクターとの間の生体内組換えを経て、組換え型ウイルス粒子を創造する。
【００７８】
実施例１−２は、ＤＮＡの異形セグメントを含有する組換え型バキュロウイルスベクターの単離を記述する：すなわち、ｐＡｃＣＤ４０（全長ＣＤ４０分子をコーディングする）、ｐＡｃＣＤ４０−ＥＤ／Ｇｌｕ（ＣＤ４０の細胞外ドメインをコーディングする）、ｐＡｃＢ７（全長Ｂ７分子をコーディングする）、およびｐＣｃＢ７−ＥＤ／Ｇｌｕ（Ｂ７分子の細胞ドメインをコーディングする）の単離を記述する。
【００７９】
Ｃ．昆虫細胞のバキュロウイルスベクターによる感染
上記の組換え型ウイルスは、次いで、昆虫細胞を共感染させるために使用された（実施例２）。これらの細胞は、次いで、異形のＤＮＡ挿入によってコーディングされた抗原を発現させた。
【００８０】
Ｓｆ９細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；Ｓｕｍｍｅｒｓら）は、１０６細胞／ｍｌの密度で、組換え型ウイルスで感染させた。組換え型バキュロウイルス
に感染したＳｆ９細胞は、同定され、そしてクローン精製された（Ｓｕｍｍｅｒｓら）。
【００８１】
細胞表面抗原を発現させる細胞は、４８時間後に収穫され、そして宿主動物の免疫化に使用された。分泌組換えタンパク質の生産のために、上記細胞は７２時間の培養後収穫された。
【００８２】
Ｓｆ９細胞表面上の組換え型分子の発現（実施例３）は、ＥＬＩＳＡシステム（Ｈａｒｌｏｗら）を用いて試験された。図３は、抗（Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＢ−１は、ＡｃＢ７ウイルスに感染したＳｆ９細胞のみと反応し、ヒトＣＤ２６を発現させるＳｆ９細胞とは反応しなかったことを示す。対照的に、抗（ＣＤ２６）モノクローナル抗体Ｔａ−１は、ＣＤ４０を発現させるＳｆ９細胞のみと反応した。図４は、抗（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｓ２Ｃ６が、ＣＤ４０を発現させるＳｆ９細胞のみと反応し、Ｂ７を発現させるＳｆ９細胞とは反応しなかったことを示す。これらの結果は、バキュロウイルス系における選択された膜関連抗原の生産に対する本発明の方法の特異性を示す。これらの結果は、膜関連抗原がＳｆ９細胞表面上でさらされることも示す。
【００８３】
さらに、これらの結果は、選択された膜関連抗原を発現させるＳｆ９細胞が、選択された抗原に対する反応性を有する抗体の存在に対して、血清およびハイブリドーマ上清液をスクリーニングするために使用され得ることを示唆する。
【００８４】
Ｄ．膜関連抗原を発現する昆虫細胞の宿主動物への注入
ポリクローナル抗体の生産に適当な宿主動物には、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、チンパンジー、およびイヌが挙げられる。本発明の１つの利点は、免疫化アジュバントが一般に必要とされないことである。
【００８５】
モノクローナル抗体の生産に使用される適当な宿主動物には、通常、ラット、ハムスター、およびマウスが挙げられる。しかし、ヒトに免疫的に近い抗体の生産を所望する場合、このような抗体のソースは、チンパンジーのような高等な霊長類を含み得る。ヘテロミエローマ融合パートナーとの融合は、モノクローナル抗体の生産に使用され得る（Ｃａｒｒｏｌｌ；Ｐｅｒｋｉｎｓ，１９９１）。このような融合は、混合した細胞のポリエチレングリコールヘの曝露、および、細胞の強い電場への曝露（電気融合）を含む多くの当業者に公知の方法によって達成され得る（Ｈａｒｌｏｗら）。ハイブリドーマは、選択培地中での増殖によって選択され、次いで、以下に記載のように抗原特異性について試験される。
【００８６】
ＣＤ４０およびＢ７に対するモノクローナル抗体の生産について、マウスが、細胞表面上に上記分子を発現させるＳｆ９細胞によって免疫化された（実施例５）。２回目の免疫化の１週間後、マウスは採血され、そして、血清は、特異性抗体の存在に対してＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の蛍光細胞染色により分析された（実施例３）。図５は、上記細胞染色の結果を示す。この細胞染色は、ＣＤ４０またはＢ７を発現させるＳｆ９細胞によって免疫化されたマウスが、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ ２０８５２）に対するＣＤ４０およびＢ７の双方に対し陽性である血清力価（ｔｉｔｒｅ）を有したことを示す。これに対して、対照Ｓｆ９細胞によって免疫化されたマウスは、上記ＡＲＣ細胞に対する活性を示さなかった。この結果は、宿主動物が、選択の膜関連抗原を発現させるＳｆ９細胞によって免疫化され得ることを示し、免疫化の結果、組換え型抗原に対する抗体を含む免疫応答が起こることを示す。上記の免疫化は、Ｓｆ９昆虫細胞中でクローンされた組換え型ヒトタンパク質以外のヒトタンパク質と相互反応性である抗体を生じない。
【００８７】
あるマウスにはＳｆ９細胞を発現させるＣＤ４０を、あるマウスにはＳＦ９細胞を発現させるＢ７を、最終ブースター注射で投与した。ブースター注射の３日後、脾臓は除去され、そして脾細胞はＳＰ２／０ネズミミエローマ細胞と融合された。
【００８８】
Ｅ．特異的な抗体産生リンパ球の単離および不死化
モノクローナル抗体産生のための抗体産生リンパ球は、好ましくは、免疫化された宿主動物の骨髄、脾臓またはリンパ節から単離され得るようなＢ−リンパ球である（Ｈａｒｌｏｗら）。
【００８９】
また、Ｂ−リンパ球は末梢循環から単離され得る。この場合、血液試料は遠心分離され、そして勾配分離法（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって粗（ｃｒｕｄｅ）末梢血リンパ球（ＰＢＬ）混合物を産生する。単球およびＴ−リンパ球は、確立した手法によって、選択的にこの細胞混合物から除去される（Ｍｉｓｈｅｌｌ）。上記の残りの細胞には、「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」手続のような選択手続がとられ得る。この手続中に、抗原親和性を有する細胞は、抗原を含有する親和性マトリックスによる選択的捕捉によって濃縮される。本発明の意味からは、このようなマトリックスは、膜関連抗原を発現させる細胞を含有する。
【００９０】
Ｂ−リンパ球が上記の循環から単離される場合、エプスタイン−バーウイルスのような形質転換ウイルスによる形質転換が有利であり得る。形質転換細胞（リンパ芽球様細胞）は、継代培養ウェル中で分配され、そして培地中で数週間維持され、特異性抗体産生に対して試験される。このような特異性抗体産生を示す培地は、拡張され、そして、上記のようなポリエチレングリコールまたは電気融合を含む１つまたはそれ以上の標準の融合プロトコルを用いて、種に適するミエローマパートナー細胞と融合される。種々のソース由来のＢ−リンパ球の単離および不死化の方法は、当業者に周知である。
【００９１】
本発明を支持すべく実行された実験において、免疫化されたマウス由来の脾細胞は、以前にｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８８）によって記述されたように、ＳＰ２／０ネズミミエローマ細胞ポリエチレングリコールと融合された。ハイブリドーマクローンは実施例６に記載のように処理された。
【００９２】
表１（実施例６）は、融合データを要約する。ＣＤ４０融合の後、細胞の半分のみが、４８０ウェル中でシードされた。この結果、ハイブリドーマが３５１ウェル中で増殖した。Ｂ７融合の後、この細胞は９６０のウェル中に分配され、そして、この融合によりハイブリドーマが３１２ウェル中で増殖した。融合の１４日後、１２ウェルの上清液がプールされ、このプールは、ＡＲＣ細胞反応性である抗体の存在について試験された。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ４０融合由来の４つのプールおよびＢ７融合由来の１つのプールがＡＲＣ細胞に対して反応性であることを明らかにした。反応性を示すプール由来の個々の上清液が再試験され、ＣＤ４０反応性の４ウェルおよびＢ７反応性の１ウェルが同定された。上記の反応性ウェル由来の細胞は、限界希釈によってクローニングされ、そして、３回の細胞増殖の後、４つの安定な抗−（ＣＤ４０）ハイブリドーマクローン（ＣＤ４０−３Ａ８、ＣＤ４０−３Ｃ６、ＣＤ４０−５Ｄ１２、ＣＤ４０−５）および１つの安定な抗−（Ｂ７）ハイブリドーマクローン（Ｂ７−２４）が確立された。これらの結果は、選択された膜関連抗原に対するモノクローナル抗体を分泌する安定なハイブリドーマクローンを達成する能力を示す。
【００９３】
ハイブリドーマ融合物をスクリーニングする多くの方法が利用でき（Ｈａｒｌｏｗら）、これらは以下を包含する：（ｉ）例えば、放射性標識された一部精製または精製抗原のような標識された抗原、（ｉｉ）例えば、組換え型抗原を発現させるＳｆ９細胞のような全細胞または透過細胞、を用いる抗体捕捉、および、（ｉ）溶液中の抗体／抗原、（ｉｉ
）固相の抗体／抗原、を用いる抗原捕捉。
【００９４】
Ｆ．モノクローナル抗体の特異性の試験
ＥＢＶ−形質転換細胞を、１次ハイブリドーマ上清液のスクリーニングに用い、そして限界希釈クローニングの後の生成物のスクリーニングに用いた。以下に示す複数の証拠は、４種の抗−（ＣＤ４０）および１種の抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体が生成されたことを示唆する。
【００９５】
第１に、５種のハイブリドーマクローン全部からの上清液は、ＡＲＣ細胞および他のＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系と反応したが、Ｔ細胞系のＨＳＢ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）およびＣＥＭＭ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）とは反応しなかった。
【００９６】
第２に、競合結合実験を、本発明のモノクローナル抗体および可溶形標的抗原を用いて行った（実施例７）。ハイブリドーマ上清液を可溶形ＣＤ４０およびＢ７とあらかじめインキュベートした（実施例７）。続いて、混合物を蛍光細胞染色のためにＡＲＣ細胞に添加した。競合実験の結果を図６に示す。データは、可溶性Ｂ７が、ＡＲＣ細胞に対する抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体Ｂ７−２４の結合を遮断し得たが、可溶性ＣＤ４０はし得なかったことを示す。逆に、可溶性ＣＤ４０は、ＡＲＣ細胞に対する抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体ＣＤ４０−３Ａ８の結合を遮断し得たが、可溶性Ｂ７はし得なかったことを示す。別の３種の抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体でも、類似の結果を得た。さらに、可溶性ＣＤ如４０が抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体に及ぼす効果、および可溶性Ｂ７が抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体に及ぼす効果は、濃度に依存するものであった。可溶性タンパク質の量が減少すると、ＡＲＣ細胞に対する抗体の結合の遮断が減少した。
【００９７】
さらに分析するために、抗−（ＣＤ４０）および抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体を、それらの扁桃Ｂ細胞に結合する能力について試験した（実施例８）。表２は、新たに単離した扁桃Ｂ細胞の８９−９５パーセントが、４種の抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体で陽性に染色されたことを示す。ほぼ同じパーセントの細胞が、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｇ２８．５に陽性であった（Ｃｌａｒｋら）。表３は、新たに単離した扁桃Ｂ細胞の１２−１７パーセントが、抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＴ−２４で陽性に染色されたことを示す。しかし、扁桃Ｂ細胞を固定化抗−（ＩｇＭ）抗体およびＩＬ−２の存在下で、５日間インキュベートした場合、Ｂ７−２４に対する陽性細胞のパーセントは、約２５パーセントまで増加した。
【００９８】
さらに、扁桃Ｂ細胞が抗−（ＩｇＭ）抗体およびＩＬ−２で刺激された場合、Ｂ７−２４に陽性のＢ細胞の数が増加するだけでなく、細胞１個当りの蛍光染色量にも著しい増加がみられ、これは刺激後、Ｂ７の発現が増加することを示唆した。
【００９９】
上記のデータは、膜関連抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を単離する手段が、本発明の方法によって与えられることを示唆する。本発明の方法により得られたモノクローナル抗体は、上記のように類型され得る（Ｈａｒｌｏｗら）。
【０１００】
Ｇ．用途
モノクローナル抗体の生成のためには、精製した物質でマウスを免疫化することが最も望ましい。しかし、膜抗原の精製には専門的で複雑な技術を要し、そしてさらに膜からの抽出は、分子構造を改変させ得る。それに加えて、タンパク質を可溶化すると、その免疫原性がしばしば減少する。それ故に、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体のほとんどは、全細胞または膜画分でマウスを免疫化した後に、得てきた。多くの場合、特異的なリンパ球のサブセットをマウスに注射し、モノクローナル抗体の一団を得てきた。これら
の抗体を、それらが結合する抗原の単離および特徴付けに用いてきた。マウスを全細胞で免疫化したとき、多数の異分子に対して抗体が作り出される。それ故、ハイブリドーマクローンによって生成された特異的抗体をスクリーニングするために、同じ細胞を用いることは困難である。
【０１０１】
上記で触れた問題を避けるために、本発明の方法は、昆虫細胞中の膜関連抗原の発現、および宿主動物を免疫化するためのこれら昆虫細胞の使用を包含する。ＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉら、１９８５；Ｓａｉｋｉら、１９８８；Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ，ら）を導入して以来、コードする核酸のコード配列がすでに公開されているタンパク質に対するｃＤＮＡをクローン化することは比較的直接的になった。発現ベクターヘのクローニングを容易にするために、完全なコード領域のみにわたるＰＣＲプライマーを使用し得、そしてこのプライマー中に制限部位を取り込ませ得る。
【０１０２】
ヒトの細胞内、分泌、およびトランスメンブランタンパク質は、ポリヘドリンタンパク質に対する必須でないバキュロウイルス遺伝子での調節下の細胞内において発現する場合、昆虫細胞中で高レベルで発現し得る（Ｗｅｂｂら、１９８９；Ｌｕｃｋｏｗにより再検討、１９９０）。本発明を支持すべく行った実験では、ヒトＣＤ４０またはヒトＢ７を発現する５Ｘ１０６個のＳｆ９細胞を２回だけ注射すると、これらの抗原に対する良好な血清力価（ｔｉｔｒｅｓ）を得られることが示された。さらに、昆虫細胞自体は、ヒト細胞と相互反応性の免疫応答を誘起しなかった。これは、ハイブリドーマクローンによる特異的抗体産生のスクリーニングに、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を使用することを可能にした。ここで、偽陽性の結果を得る危険は最小であった。本発明の方法によって得た全ての陽性１次ウェルは、実際、免疫化に用いられた抗原に特異的であった。
【０１０３】
本発明の方法により得た抗体は、膜関連抗原に対するものであり、膜関連抗原を検出するための診断試薬として使用するのに有利である。例えば、細胞表面マーカータンパク質に対する抗体、または細胞表面から突き出ているウイルスのタンパク質に対する抗体である。
【０１０４】
１種の診断上の構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は、ウイルス特異的抗原の検出能力を有する抗ウイルス抗体の使用を包含する。例えば、抗原は、抗原捕獲アッセイによって検出される。このアッセイでは、被験体の血清試料中に存在するウイルス抗原は、抗原特異的モノクローナル抗体、または抗原特異的ポリクローナル抗体と反応する。抗体は固体基質に結合し、次いで、抗原は、抗−ウイルス抗体に対する、第２の異なった標識をした抗体によって検出される。
【０１０５】
本発明の方法によって得た抗ウイルス抗体は、抗ウイルス免疫応答を強化する手段として使用され得る。それは、抗体−ウイルス複合体が、マクロファージおよび他のエフェクター細胞によって、典型的に認識されるからである。抗体は、他の治療で用いる抗体の投与量と同量を投与し得る。例えば、狂犬病、はしかおよびＢ型肝炎のようなウイルス性疾患の早期インキュベーション中に、プールしたガンマグロブリンを、０．０２−０．１ｍｌ／ポンド体重で投与して、ウイルスが細胞内に入り込むことを阻害する。このように、膜関連ウイルス抗原と反応する抗体は、単独で、他の抗ウイルス抗体の入った「カクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）」で、または他の抗ウイルス薬剤との複合体中で、受動的に投与され得、免疫応答および／または抗ウイルス薬剤の効力を強化する。
【０１０６】
ＩＩＩ．抗体を使用する組成物
本発明は、上記の方法によって生成されるような抗体を使用することを意図する。本発明の抗体は、以下の内のどちらかである。（１）ヒトＢ細胞の表面のヒトＣＤ４０抗原と結合し、Ｂ細胞の分化、成長を刺激しない、または（２）Ｂ７抗原に結合する。しかし、
これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、一本鎖抗体、およびそれらのフラグメントであり得る。抗−ＣＤ４０抗体は、単独で用いられる。一方、抗−Ｂ７抗体は、免疫抑制剤をも含有する組成物中で用いられる。
【０１０７】
Ａ．抗体の調整
モノクローナル抗体５Ｄ１２、３Ａ８、３Ｃ６、およびＢ７−２４を、本明細書中の詳細な説明の第ＩＩ節および実施例１−７のように調製する。本発明の他のモノクローナル抗体も、これと同様に、または以下のように調製する。第１に、ポリクローナル抗体を、ＣＤ４０またはＢ７抗原に対して生じさせる。第２に、ＣＤ４０またはＢ７に特異的なモノクローナル抗体を選択する。
【０１０８】
１．ポリクローナル血清
ポリクローナル血清は、従来の方法により調製する。一般的に、まずＣＤ４０またはＢ７抗原を含有する溶液を用いて、適切な動物、特にマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫化する。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清量、および標識した抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の有用性のために、ポリクローナル血清の調製に好適である。一般的に、免疫化は、生理食塩水中、好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント中に、抗体含有溶液を混合、または乳化し、そしてその混合液または乳化液を、（一般的には、皮下または筋肉内）注射することにより行う。５０−２００μｇ／注射で、典型的には十分である。一般的に免疫化は、生理食塩水中のタンパク質を、１回またはそれ以上注射することにより、２−６週間後に高められる。この場合、フロイント不完全アジュバントを用いるのが好ましい。あるいは、当該分野で周知の方法を用いる、インビトロでの免疫化により抗体を生成し得る。本発明の目的では、インビトロでの上記の方法は、インビボでの免疫化と同等と考えられる。
【０１０９】
ポリクローナル抗血清を、以下のようにして得る。免疫化した動物から採血し、ガラスまたはプラスチックの容器に入れて、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、次いで、４℃で２−１８時間インキュベートする。血清を遠心分離（例えば、１，０００Ｘｇで１０分間）により回収する。ウサギから１回の採血当り約２０−５０ｍｌを得る。
【０１１０】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６の方法、またはその改変方法を用いて調製する。典型的に、マウスまたはラットを、上記のように免疫化する。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりはむしろ、脾臓（および任意に数個の大きなリンパ節）を取り出し、単細胞に分離する方が良い。所望であれば、脾臓細胞を（非特異的付着細胞を取り除いた後）、細胞懸濁液をタンパク質抗原でコートしたプレートまたはウェルに注ぐことによりスクリーニングし得る。抗原に対して特異的な膜関連免疫グロブリンを発現するＢ細胞はプレートに結合し、そして懸濁液の残りと共には洗い流されない。次いで、得られたＢ細胞、または全ての解離した脾臓細胞は、ミエローマ細胞との融合を誘導され、ハイブリドーマを形成する、そして選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）中で培養される。得られたハイブリドーマは、限界希釈によりプレーティングし、そして所望の免疫化細胞表面抗原に対して特異的に結合する（そして無関係の抗原には結合しない）抗体の生成についてアッセイされる。次いで、選択したｍＡｂ分泌ハイブリドーマは、（例えば、組織培養ビン、または中空ファイバーリアクターのような）インビトロ、または（マウスの腹水のような）インビボのどちらかで培養される。
【０１１１】
所望であれば、（ポリクローナルまたはモノクローナル）抗体は、従来技術を用いて標識し得る。好適な標識は、発蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）
、電子濃密試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドである。酵素は、典型的に、それらの活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量可能な青い色素に変換する能力によって検出される。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原とそれに対する特異性を有するモノクローナル抗体との場合のように、高い特異性でリガンド分子に結合する能力を有するタンパク質を指す。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および当該分野で周知のおびただしいレセプター−リガンドカップルを包含する。同じ標識でも幾つもの異なる様式で作用するので、上の試薬は、種々の標識を個々のクラスに分類することを意味するのではないことを理解すべきである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識として、または電子濃密試薬として働く。ＨＲＰは、ｍＡｂに対する酵素または抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために様々な標識を組合せ得る。例えば、ｍＡｂおよびアビジンもまた、本発明の実施において標識を必要とする：従って、ビオチンでｍＡｂを標識するならば、１２５Ｉで標識したアビジンで、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンｍＡｂで、ｍＡｂの存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内で、同等物と考えられる。
【０１１２】
ＩＶ．免疫抑制剤を含有する組成物
本発明の組成物は、２つの成分を含有する。２つの成分は、共同して、移植片拒絶反応、ＧＶＨＤ、またはリウマチ様関節炎を予防し、治療することに治療学的効果を有する。２つの成分は：（１）ＭＡｂ Ｂ７−２４のようなＢ７抗原に結合する分子；および（２）免疫抑制剤である。Ｂ７抗原に結合する分子は、上記第ＩＩＩ節に記載のように、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、および抗Ｂ７抗体を包含する。
【０１１３】
本発明の抗Ｂ７抗体（またはＢ７抗原に結合する他の分子）は、１つ、またはそれ以上の免疫抑制剤との組合せにより与えられる。免疫抑制剤は、Ｔ細胞の活性化または増殖を、遮断または阻害する薬剤である。本発明の免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、コルチコステロイド（メトトレキサート、プレドニゾロン、デキサメタゾン）、ＦＫ５０６、およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を、包含する。好ましくは、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、またはコルチコステロイドであり、最も好ましくは、シクロスポリンＡである。
【０１１４】
Ｖ．ＣＤ４０抗原エピトープ
本発明のＣＤ４０抗原エピトープは、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体との免疫反応性を有する分子である。この抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の、ヒトＢ細胞の表面にあるヒトＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長または分化を妨げる。すなわち、こういったエピトープは、ＣＤ４０抗原に対する該抗体の結合と競合する。これらのエピトープを同定するための系統だった技術は、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎによる、米国特許第４，７０８，８７１号（これは、本明細書中に参考として援用されている）に記載されているように、当該分野では周知である。典型的に、これらのエピトープは、短いアミノ酸配列である。これらの配列は、アクセスが可能な限り、より長いペプチドまたはタンパク質配列中にはめ込み得る。
【０１１５】
本発明のエピトープは、固相合成法のような標準ペプチド合成技術により調製され得る。あるいは、本発明の配列は、組換え法によって、より大きなペプチドまたはタンパク質に組み込み得る。これは、目的の配列をコードするＤＮＡカセットを調製すること、および、適切な部位において修飾されるべきタンパク質をコードしているＤＮＡ中にそのカセットを連結することにより、最も容易に達成し得る。配列ＤＮＡは、標準合成技術によって合成され得、または、好適な制限酵素を用いて、ファージｐＩＩＩ遺伝子から切り取られ得る。
【０１１６】
本明細書中、同定したエピトープは、簡単な固相技術によって調製し得る。最小の結合配列は、例えば、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎによる米国特許第４，７０８，８７１号に記載の方法を用いる標準技術によって、各エピトープについて系統的に決定し得る。簡単に言えば、それぞれのピン上のただ一つのオリゴペプチドによって、各ピン上に独特のオリゴペプチドを有するピンの固相配列に結合するＣＤ４０抗原由来の重複オリゴペプチドの１セットを合成し得る。ピンを、９６−ウェルのマイクロタイタープレートのフォーマットに合うように並べることで、例えば、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体への結合に対して、全てのピンを同時にアッセイすることが、可能になる。本方法を用いることにより、連続したアミノ酸の可能なサブセット全部に対する結合親和性を容易に決定し得る。
【０１１７】
本発明のアナログも、標準固相方法により調製され、そしてそれらの方法は、ＰＣＴ出願米国第９１／０４２８２号に記載されている。
【０１１８】
ＶＩ．処方物および投与方法
本発明の抗体および組成物は、移植組織拒絶反応を抑止するために、または（１）ＧＶＨＤ、あるいはリウマチ様の関節炎、または（２）アレルギー、ＳＬＥ、ＰＢＣ、およびＩＴＰのような抗体介在性疾患を予防あるいは治療するために治療上有効な濃度で投与される。この目的を達するために、抗体または組成物は、公知の様々な受容可能な賦形剤を用いて処方され得る。代表的には、抗体または組成物は、静脈または腹腔内のどちらかに注射することにより投与される。この投与を行うための方法は、当業者に公知である。局所的または経口的に投与、または粘膜を通じて送達され得る組成物を得ることもまた可能で有り得る。
【０１１９】
被験体に投与する前に、処方成分が抗体に添加され得る。液体の処方物が好ましい。例えば、これらの処方成分は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、あるいは充填剤を含有し得る。好ましくは、炭水化物は、モノ、ジ、またはポリサッカライドのような糖または糖アルコール、あるいは水溶性グルカンを包含する。サッカライドまたはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキシメチルセルロース、またはそれの混合物を包含し得る。スクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、−ＯＨ基を有するＣ４からＣ８の炭化水素として定義され、そしてガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを包含する。マンニトールが最も好ましい。上記のこれらの糖または糖アルコールは、個別にまたは組み合わせて用いられ得る。糖または糖アルコールは、水性調製物で可溶性である限り、使用される量に固定された制限はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％の間であり、より好ましくは２．０〜６．０ｗ／ｖ％の間である。好ましくはアミノ酸は、カルチニン、アルギニン、およびベタインの左旋性（Ｌ）型を包含するが、他のアミノ酸も添加され得る。好ましいポリマーは、平均分子量が２，０００〜３，０００の間であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量が３，０００〜５，０００の間であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。凍結乾燥前、または再構成後に溶液中のｐＨ変化を最小にするために組成物中で緩衝液を用いることも好ましい。ほとんどの生理的緩衝液が用いられ得るが、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、およびグルタミン酸塩の緩衝液、またはそれの混合物が好ましい。最も好ましいのはクエン酸塩緩衝液である。好ましくはその濃度は、０．０１〜０．３ｍｏｌ／リットルでる。処方物に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第２７０，７９９号、および第２６８，１１０号に示される。
【０１２０】
さらに抗体は、例えば、ポリマーヘの共有結合により、化学的に改変され得、その循環半減期を増加する。好ましいポリマー、およびペプチドにそれらを付着する方法は、本明細書中で参考としてそのすべてが援用される、米国特許第４，７６６，１０６号；第４，１７９，３３７号；第４，４９５，２８５号；および第４，６０９，５４６号に示されている。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化されたポリオール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水に可溶性であり、そして一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有する。ここでＲは、水素あるいはアルキルまたはアルカノール基のような保護基で有り得る。好ましくは、その保護基は、１〜８の炭素を有し、より好ましくは、それはメチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは１〜１，０００の間、より好ましくは２〜５００の間である。ＰＥＧは、好ましくは１０００〜４０，０００の間の平均分子量を有し、より好ましくは２０００〜２０，０００の間の、最も好ましくは３，０００〜１２，０００の間の平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１つの水酸基を有し、より好ましくはそれは末端の水酸基である。この水酸基は、好ましくは活性化されインヒビター上の遊離アミノ基と反応する。しかし反応基の型と量は、変動され得、本発明の共有結合的に結合されたＰＥＧ／抗体を達成し得ることが理解され得る。
【０１２１】
水溶性のポリオキシエチル化されたポリオールがまた、本発明において有用である。それらはポリオキシエチル化されたソルビトール、ポリオキシエチル化されたグルコース、ポリオキシエチル化されたグルコース、ポリオキシエチル化されたグリセロール（ＰＯＧ）などを包含する。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化されたグリセロールの骨格が、例えば、動物およびヒトで天然にモノ−、ジ−、トリグリセリドで存在する骨格と同一だからである。従って、この分枝は必ずしも身体で異質な物質として見られない。ＰＯＧは、好ましくはＰＥＧと同一の範囲の分子量を有し得る。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４〜１５０７０に示され、そしてＰＯＧ／ＩＬ−２結合体の議論が、米国特許第４，７６６，１０６号で見い出される。その両者は、参考として本明細書に援用されている。
【０１２２】
循環半減期の増加のための他の薬剤送達系は、リポソームである。リポソーム送達系の調製方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（１９８１）６４９：１２９；およびＳｚｏｋａ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｅｎｇ（１９８０）９：４６７で議論されている。他の薬剤送達系は、当該技術で公知であり、そして例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら、ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．１９８０）ｐｐ．２５３〜３１５；Ｍ．Ｌ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｖｓ（１９８４）３６：２７７に記載されている。
【０１２３】
液体薬学的組成物が調製された後、好ましくは、分解を予防し、そして無菌状態を維持するために、凍結乾燥される。液体組成物を凍結乾燥する方法は、当業者に公知である。使用する直前に、組成物は付加成分を含有し得る無菌の希釈液（例えば、リンガー液、蒸留水、または無菌の生理食塩水）で再構成され得る。再構成に際し、組成物は、好ましくは当業者に公知の方法を用いて被験者に投与される。
【０１２４】
上述したように、本発明の抗ＣＤ４０抗体および組成物は、ヒトの被験体を治療するために用いられ、アレルギー、ＳＬＥ、ＰＢＣおよびＩＴＰのような抗体介在性疾患を予防または治療する。抗Ｂ７抗体は、好ましくは移植組織拒絶反応、ＧＶＨＤ、またはリウマチ様の関節炎の予防または治療に用いられる。これらの抗体の好ましい投与経路は、非経口である。非経口投与において、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な非経口賦形剤と組み合わせて溶液、懸濁液、またはエマルジョンのような注射可能な形態で単位用量で処方され得る。そのような賦形剤は、本来、非毒性であり、そして非治療的である。そのよ
うな賦形剤の例は、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。不揮発油およびオレイン酸エチルのような非水賦形剤がまた用いられ得る。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の５％デキストロースである。賦形剤は、緩衝液および防腐剤を含む、等張性および化学的安定性を増強する物質のような小量の添加剤を含有し得る。
【０１２５】
投与の用量および様式は、個体に依存し得る。一般的に組成物は、抗体が１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは２０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは１〜７ｍｇ／ｋｇの間の投与量で与えられるように投与される。好ましくは、それは瞬時投与で与えられ、瞬時投与後、４〜６時間の間循環レベルを１０〜２０倍増加する。瞬時投与の後、連続注入がまた使用され得る。その場合、抗体は５〜２０μｇ／ｋｇ／分の投与で、より好ましくは７〜１５μｇ／ｋｇ／分の投与で注入され得る。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は本発明を例示し、本発明を制限する意図ではない。
【０１２７】
材料および方法
Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｅａｇｌｅ培地（ＩＭＤＭ）、および胎仔ウシ血清を、ＪＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）より得た；ペニシリンおよびストレプトマイシンを、Ｉｒｖｉｎｅ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）より得た；そしてポリエチレングリコール（分子量１５００）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）より得た。
【０１２８】
培養培地。 ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞、精製されたＴ細胞、ＥＢＶ形質転換されたＢ細胞、および細胞系をストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（２００Ｕ／ｍｌ）および１０％の熱不活性化した胎仔ウシ血清を補足したＩＭＤＭ（完全ＩＭＤＭ）内で培養した。Ｓｆ９昆虫細胞を、撹拌された（１２５〜１５０ｒｐｍ）シェイカーフラスコで、０．５％の胎仔ウシ血清を補足したＭａｉｏｒｅｌｌａら（１９８９）に記載された培地を用いて培養した。３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ細胞を、アミノプテリン（０．２μｇ．／ｍｌ）、チミジン（５μｇ／ｍｌ）、キサンチン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒポキサンチン（１５μｇ／ｍｌ）、マイコフェノール酸（２０μｇ／ｍｌ）、デオキシシチジン（２．３μｇ／ｍｌ）、および１０％の熱不活性化した胎仔ウシ血清で補足した５０％のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地、および、５０％のＨＡＭ−Ｆ１０培地からなる培地（完全ＤＭＥ／ＨＡＭ−Ｆ１０）で培養した。３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ／Ｂ７細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有する完全ＤＭＥ／ＨＡＭ−Ｆ１０培地で培養した。
【０１２９】
細胞および細胞系。 抹消血単核細胞を、フィコール−ハイパック密度差遠心分離により、ヘパリン化された血液（健康なボランティアより得た）から単離した。Ｔ細胞をＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋ（Ｌａｍｂｄａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（１λ）を用いて単核細胞およびＢ細胞を除去することにより濃縮した。ＥＢＶ形質転換されたＢ細胞系ＡＲＣ、およびＰ８１５細胞系、Ｆｃγ ＲＩＩおよびＦｃγ ＲＩＩＩを発現するＮＫ耐性マウス肥胖細胞腫細胞系（Ｒａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：７５２）を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）より得た。Ｗａｒｍｅｒｄａｍ，Ｐ．Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９０）１７２：１９に記載されたように３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ、ＣＤ３２を発現するマウスの線維芽細胞細胞系、ヒトのＦｃγ ＲＩＩ高応答性対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、Ｄｒ．Ｊ．ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より快く供与された。突然変異型のマウスの胸腺腫ＥＬ−４サブクローンＥＬ４Ｂ５は、Ｄｒ．Ｒ．
Ｈ．Ｚｕｂｌｅｒ、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｃａｎｔｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ、Ｇｅｎｅｖａより供与された。ヒトＦｃγ ＲＩＩａのＨＲ（高応答性）対立遺伝子形態のハイブリッド分子を発現するマウス３Ｔ６の形質転換体細胞は、Ｄｒ．Ｐ．Ａ．Ｍ．Ｗａｒｍｅｒｄａｍ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより供与された。Ｗａｒｍｅｒｄａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７：１３３８。両細胞系をゲンタマイシン（８０μｇ／ｍｌ）および１０％の熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）で補足したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）で培養した。Ｂ細胞活性化能力の欠失の可能性を避けるために、４〜８週間毎にＥＬ４Ｂ５細胞の新規のバッチを解かして用いた。細胞系を、マイコプラズマリボソームＲＮＡ（ＧｅｎＰｒｏｂｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）用の３ＨラベルされたＤＮＡプローブの使用により、マイコプラズマ汚染を定期的にテストし、そして実験の経過の間、マイコプラズマは検出されなかった。
【０１３０】
ヒトＢリンパ球 Ｂリンパ球を、本質的にＤｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９０）９：３２１に記載されているように、扁桃腺摘出を受けた子供から得た扁桃腺から単離した。要約すれば、組織をメスの刃で離散させ、食細胞およびＮＫ細胞を５ｍＭのＬ−ロイシンメチルエステル処理で減らし、そしてＴ細胞を２−アミノエチルイソチオウロニウムブロマイドで処理したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）とのロゼッティングの１サイクルにより除去した。得られたＢリンパ球調製物の純度は、抗（ＣＤ２０）ｍＡｂ Ｂ１（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｌｏｎｅ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＡ）、または抗（ＣＤ３）ｍＡｂ ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）、ならびにウサギ抗（マウスＩｇ）（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）のＦＩＴＣが結合したＦ（ａｂ’）２フラグメントを用いた間接的な免疫蛍光のラベリング、およびＦＡＣＳ分析で調査した。Ｂ細胞調製物は、以下を含有した（６つの単離物の平均±ＳＤ）：９５±４％ ＣＤ２０−陽性細胞、および２±１％ ＣＤ３−陽性細胞。
【０１３１】
抗体
抗（ヒト Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＢ−１（Ｙｏｋｏｃｈｉら、１９８２）をＤｒ．Ｅ．Ａ．Ｃｌａｒｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から得、そして精製された抗体として用いた。抗（ヒトＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｇ２７．５（Ｃｌａｒｋら、１９８６）をＤｒ．Ｊ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ（Ｏｎｃｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から得、そして精製された抗体として用いた。抗（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｓ２Ｃ６（Ｐａｕｌｉｅら、１９８５）をＤｒ．Ｓ．Ｐａｕｌｉｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）から得、そして精製された抗体として用いた。抗（ヒトＣＤ２６）モノクローナル抗体Ｔａ−１、および抗（ＣＤ２０）モノクローナル抗体Ｂ１をＣｏｕｌｔｅｒ（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）から得た。抗（ＣＤ３）モノクローナル抗体ＯＫＴ３を、Ｏｒｔｈｏ（Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）から得、そして抗（−ＬｅｕＭ３）モノクローナル抗体をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から得た。ビーズ（Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄｓ）に結合した抗（ＩｇＭ）抗体をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）から得た。
【０１３２】
抗Ｂ７ Ｍａｂ Ｂ７−２４（ＩｇＧ２ａ、κ）、ならびに抗ＣＤ４０ ｍＡｂｓ ５Ｄ１２、３Ｃ６および３Ａ８を上記のＩＩ節に記載したように得、そして精製された抗体として用いた。抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＣＬＢ−Ｔ３／４．１（ＩｇＧ１、κ）を希釈された組織培養の上清液として用い、そしてそれは好意によりＤｒ．Ｌ．Ａａｒｄｅｎ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌ
ａｎｄｓ）から供与された。抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＵＣＨＴ１（ＩｇＧ、κ）を精製された抗体として用い、そしてそれはＤｒ．Ｐ．Ｂｅｖｅｒｌｅｙ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｎｃｅｒ Ｆｕｎｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）から供与された。抗ＣＤ７２ Ｍａｂ ＷＬ２２５（ＩｇＧ２ａ、κ）を精製された抗体として用い、そしてそれはＤｒ．Ｋ．Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ（Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）により供与された。抗ＩＣＡＭ−１ Ｍａｂ ８４Ｈ１０を希釈された腹水として用いた。抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６は、Ｄｒ．Ｓ．Ｐａｕｌｉｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）より供与された。Ｐａｕｌｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４２：５９０。抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｇ２８．５は、Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ（Ｏｎｃｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）より供与された。Ｃｌａｒｋら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９８６）８３：４４９４。コントロールの抗体は以下のものであった：抗（β−グルコセレブロシダーゼ） ｍＡｂ ８Ｅ４ （ＩｇＧ１）、Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８３）１３４：５８５、ならびにミエローマ免疫グロブリンＭＯＰＣ−２１（ＩｇＧ１）およびＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。すべてのｍＡｂを精製された抗体調製物として用いた。ｈＣＤ４０．Ｈμ融合タンパク質は、Ｄｒ．Ｐ．Ｌａｎｅ（Ｂａｓｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より供与され、そしてそれをトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞の５倍に濃縮された上清液として用いた。Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２２：２５７３。
【０１３３】
本発明のモノクローナル抗体は、以下を包含する多くのリポーター部分を用いて、標準方法によりラベルされ得る：蛍光ラベル（一般にアビジンをリンクされた、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン（ＴＭＲＩＴＣ）、ローダミン６００（ＸＲＩＴＣ）、「テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ）」など）；放射活性部分（１２５Ｉなど）；発光物（ルシフェラーゼなど）；酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）。さらに、リポーター抗体（本発明のモノクローナル抗体に結合特異性を有する抗体、例えばヤギの抗マウスＩｇＧ）がまた、上記に記載したラベル性部分を用い得る。
【０１３４】
酵素およびオリゴヌクレオチド Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ （ＢＭＢ）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）より得た；ニトロセルロースフィルターをＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）より得る。合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーを、市販されている自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製した。または、注文設計された合成オリゴヌクレオチドを、例えばＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）より購入し得る。ｃＤＮＡ合成キットおよびランダムプライミングラベリングキットを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＢＭＢ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）より得る。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列は、上述したようにいずれかで合成され得る。または、ペプチドは、標準のインビトロ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）によって直接合成され得る。
【０１３５】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作業で行った通常の操作は、抗体の精製を含めて、標準の手順（Ｈａｒｌｏｗら）により行った。
【０１３６】
蛍光細胞染色（ＦＡＣＳ）アッセイ 細胞（１０６／試料）を１０μｌの一次抗体中で（１％ ＢＳＡおよび０．０５％ アジ化ナトリウムで補足したＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨ
ＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中の１０μｌ／ｍｌ）４℃で２０分間、インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄した後、細胞を４℃で２０分間、ヤギの抗（マウス ＩｇＧ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）のＦＩＴＣラベルしたＦａｂ’２フラグメント１００μｌ中でインキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄し、そしてＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ中で再度懸濁した。分析をＦＡＣＳＳＣＡＮ Ｖ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で行った。
【０１３７】
Ｂ７介在性Ｔ細胞増殖アッセイ
精製Ｔ細胞を、Ｆｃγ ＲＩＩａ高等応答動物（ｈｉｇｈ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）の対立遺伝子でトランスフェクトされた３Ｔ６線維芽細胞およびＢ７分子と共に培養した（ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２２：３０７１−３０７５）。３Ｈ−チミジンの取り込みにより増殖を測定した。簡単に言えば、９６ウェル平底組織培養プレートにおいて、抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＣＬＢ−Ｔ３／４．１含有または未含有の２００μｌ／ウェルの完全ＩＭＤＭ中で、１０４個の放射線照射（２５００ラド）された３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ／Ｂ７細胞と共に、４Ｘ１０４個のＴ細胞を培養した。７２時間の培養期間のうち最後の１６時間の間は、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンでその細胞をパルスした。Ｔ細胞の増殖を３つのウェルの平均ｃｐｍとして表す。
【０１３８】
細胞毒性Ｔ細胞アッセイ
精製Ｔ細胞を、Ｆｃγ ＲＩＩａ高等応答動物の対立遺伝子でトランスフェクトされた３Ｔ６線維芽細胞およびＢ７分子と共に培養した。簡単に言えば、２４ウェル平底組織培養プレートにおいて、抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＵＣＨＴ１の存在下で１ｍｌ／ウェルの完全ＩＭＤＭ中で、０．２Ｘ１０６個の放射線照射（２５００ラド）された３Ｔ６−Ｆｃγ ＲＩＩ／Ｂ７細胞と共に、１０６個のＴ細胞を３〜４日間培養した。抗ＣＤ３再方向性細胞毒性アッセイにおいて、リンパ球の細胞毒活性を下記のように分析した。
【０１３９】
混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ
混合リンパ球培養（ＭＬＣ）において、刺激細胞としてＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用いて、精製Ｔ細胞の増殖を測定した。９６ウェル丸底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、２００μｌ／ウェルの完全ＩＭＤＭ培地中で、５Ｘ１０４個の放射線照射（５０００ラド）された刺激細胞と共に、５Ｘ１０４個のＴ細胞を培養した。７２時間の培養期間のうち最後の１６時間の間は、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンでその細胞をパルスした。Ｔ細胞の増殖を３つのウェルの平均ｃｐｍとして表す。二次ＭＬＣに対しては、一次ＭＬＣに対する上記のように細胞を刺激した。二次ＭＬＣに対するＴ細胞芽細胞を、５〜７日の一次ＭＬＣ中で、続いて刺激細胞の非存在下で２〜４日間培養して生産した。一次または二次ＭＬＣ中に生産されるＴ細胞の細胞毒活性を、マウスＰ８１５細胞を用いた抗ＣＤ３再方向性細胞毒性アッセイにおいて下記のように分析した。あるいは、ＣＴＬ活性を誘導するのに用いられるＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞は、標的細胞として役立った。
【０１４０】
細胞毒性アッセイ
標的として、Ｐ８１５ネズミ肥満細胞腫細胞またはＡＲＣ ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を用いて、４時間の標的細胞溶解アッセイにおいて、ＣＴＬ活性を測定した。Ｐ８１５標的細胞の場合には、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ Ｍａｂ ＯＫＴ３を用いて、ＣＴＬを標的細胞に非特異的に架橋させた。標的細胞としてＡＲＣ細胞を用いた場合には、アロ抗原特異性ＣＴＬのみがキリング工程（ｋｉｌｌｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）において関与する。１０６個の標的細胞を、２００μＣｉの５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム（Ａｍｓｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と共に１時間培養し、続いて洗浄した。９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートにおいて、種々の量のエフェクター細胞と共に５０００の５
１Ｃｒ標識の標的細胞を用いて総容量２００μｌ／ウェルでＣＴＬアッセイを行った。（それぞれ、自然放出及び最大放出の評価のために）、４個のウェルを２００μｌ培地単独の５Ｘ１０３個の標的細胞で満たし、そして４個のウェルを１００μｌ培地および１００μｌサポニンの５Ｘ１０３個の標的細胞で満たした。Ｐ８１５の場合には、（バックグラウンドの実験的溶解を測定するために）、３個のウェルを抗ＣＤ３ Ｍａｂの非存在下でエフェクター細胞および標的細胞で満たした。他の３個のウェルもまた、抗ＣＤ３の存在下で総溶解量を測定するために、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ Ｍａｂを含有した。プレートを２００Ｘｇで１０分間遠心分離し、そして３７℃で４時間インキュベートした。その後、各ウェルの上清液１００μｌをガンマカウンターでカウントした。結果を、Ｐ８１５標的細胞に対する抗ＣＤ３依存性特異性放出の百分率、すなわちＡＲＣ標的細胞に対するアロ抗原特異性放出の百分率として表す。
【０１４１】
Ｂ細胞増殖アッセイ
平底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１０％ウシ胎児血清を補足した２００μｌのＩＭＤＭ中で、Ｂ細胞（１ウェル当り４Ｘ１０４個）を培養した。固定化した抗−（ＩｇＭ）抗体（イムノビーズ；５μｇ／ｍｌ；ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を加えることによりＢ細胞を刺激した。指示されたところに１００ Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を加えた。さまざまな濃度のｍＡｂを微量培養の開始時に加え、そして１８時間のパルシング後、３日目の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定することにより、増殖を評価した。
【０１４２】
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞増殖アッセイ
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕらによって、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２５１：７０に記載されたのと類似の培養系において、抗ＣＤ４０ ｍＡｂがＢ細胞増殖を刺激する能力を試験するために、ヒトＦｃγ ＲＩＩのＨＲ対立遺伝子形を発現するマウス３Ｔ６トランスフェクタント細胞を用いた。Ｂ細胞（１ウェル当り２Ｘ１０４個）を、平底マイクロウェルにおいて（５０００ラドで放射線照射された）１Ｘ１０４個のトランスフェクタント細胞の存在下、１０％ウシ胎児血清および１００ Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−４を補足した２００μｌのＩＭＤＭ中で培養した。そのＢ細胞を加える前に、３Ｔ６細胞を培養プラスチックに少なくとも５時間固着させた。抗ＣＤ４０ｍ Ａｂを１５ｎｇ／ｍｌから２０００ｎｇ／ｍｌまでのさまざまな濃度で加え、そして［３Ｈ］−チミジンで１８時間パルシングして７日目にチミジンの取り込みを測定することにより、Ｂ細胞の増殖を評価した。
【０１４３】
ＥＬ４Ｂ５細胞とのＢ細胞活性化アッセイ
Ｂ細胞（１ウェル当り１０００個）を、放射線照射（５０００ラド）されたＥＬ４Ｂ５細胞（１ウェル当り５Ｘ１０４個）と共に、平底マイクロタイタープレートおいて、熱処理により不活性化した１０％ウシ胎児血清、５ｎｇ／ｍｌのホルボール−１２−ミリステート １３−アセテート（Ｓｉｇｍａ）および５％ヒトＴ細胞上清液を補足した２００μｌのＩＭＤＭ中で培養した。さまざまな濃度のｍＡｂを培養の開始時に加え、そして［３Ｈ］−チミジンで１８時間のパルシング後６日目にチミジンの取り込みを評価した。Ｔ細胞上清液を調製するために、１μｇ／ｍｌのＰＨＡおよび１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在下、精製Ｔ細胞を１０６個／ｍｌの密度で３６時間培養した。Ｗｅｎら、上述。その細胞を遠心分離することによりＴ細胞上清液を得て、そしてそれを−２０℃で貯蔵した。Ｔ細胞上清液がＥＬ４Ｂ５−Ｂ細胞培養液中でヒトＢ細胞の増殖を高める効力を試験し、そして最も効力のある上清液をプールし、そして実験に用いた。
【０１４４】
Ｂ細胞による抗体産生に対するヒトＴ細胞ヘルパーアッセイ
９６ウェル組織培養プレートを、抗ＣＤ３ ｍＡｂ ＣＬＢ−Ｔ３／３（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の腹水液の１：５００希釈液でコートした。示されるように、共刺激性ｍＡｂを加えた：抗ＣＤ２
ｍＡｂ ＣＬＢ−Ｔ１１．１／１およびＣＬＢ−Ｔ１１．２／１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、共に腹水１：１０００および抗ＣＤ２８
ｍＡｂ ＣＬＢ−２８／１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。次いで、扁桃（ｔｏｎｓｉｌｌａｒ）のＴ細胞（３０００ラド放射線照射；１ウェル当り１０５個）、扁桃のＢ細胞（１ウェル当り１０４個）およびｒＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を加えた。各細胞培養の最終容量は２００μｌであった。８日後、細胞を遠心し、そして細胞を含まない上清液を集めた。（希釈された）試料中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度を以下のようにＥＬＩＳＡにより算出した。
【０１４５】
免疫グロブリンの定量に対するＥＬＩＳＡアッセイ
ヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度をＥＬＩＳＡにより算出した。４μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ ＭＨ １６−０１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）または１．２μｇ／ｍ１のマウス抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ ４１０２（Ｔａｇｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）の０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて、４℃で１６時間インキュベーションすることにより、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、そしてＢＳＡで１時間飽和させた。２回洗浄後、試験試料の種々の希釈液でプレートを３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、１μｇ／ｍｌのベルオキシダーゼ標識のマウス抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ ＭＨ １６−０１（ＣＬＢ）またはマウス抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ ＭＨ １５−０１（ＣＬＢ）で３７℃で１時間インキュベーションすることにより、結合したＩｇを検出した。プレートを４回洗浄し、そして基質としてＯ−フェニレンジアミンを加えることにより、結合したペルオキシダーゼ活性を示した。各アッセイに対して標準曲線を作成するために、ヒトの標準血清（ＨＯＯ，ＣＬＢ）を用いた。
【０１４６】
流動細胞蛍光定量アッセイ
ＡＲＣ細胞（１０６個／試料）を１００μｌの一次抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ、または、１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを補足したＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中１０μｇ／ｍｌ）中で４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄後、ヤギ抗（マウスＩｇＧ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）のＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメント１００μｌ中で細胞を４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄し、そしてＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を０．５ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。ＦＡＣＳＣＡＮＶ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡにより分析を行った。
【０１４７】
あるいは、ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＴ細胞上清液（５％）を含む培地中で培養する前に、および培養中の異なった時点でＥＬ４Ｂ５細胞を集めた。０．０５％アジ化ナトリウムを補足したＨａｎｋ平衡塩類溶液（４℃）１００μｌ中で希釈されたｈＣＤ４０−Ｈμを含む、トランスフェクトされた細胞の上清液１０μｌを用いて、細胞を３０分間インキュベートした。これに続いて、ウサギ抗（ヒトＩｇＭ）のＦＩＴＣ−複合Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でインキュベーションした。コントロールとして、ＦＩＴＣ−−複合体のみで細胞をインキュベートした。分析のために、ＦＡＣＳｃａｎ−４細胞蛍光分析機（ＢｅｃｔｏｎおよびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた。ヨウ化プロピジウムの使用により、分析から非生存細胞を除外した。
【０１４８】
実施例１
ＣＤ４０およびＢ７のＰＣＲクローニング
Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）により本質的に記載されるように、ＥＢＶ−形質転換ヒト脾臓細胞集団からＲＮＡを単離した。簡単に言えば、細胞を、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして０．７ Ｍ ２−メルカプトエタノールの存在下で５Ｍグアニジウム チオシアネート中で溶解した。細胞溶解物を、不連続ＣｓＣｌ勾配（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら）上で層化し、そしてＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローターを用いて２６，０００ｒｐｍで１６時間遠心分離した。ペレットをＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶かすことによりＲＮＡを回収した。ＲＮＡをエタノールで１回沈澱させ、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに再懸濁し、そして−７０℃で貯蔵した。
【０１４９】
５００単位のＬＭＶ−ＲＴ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、５μＭランダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１ｍＭ ＤＴＴ、ｄＮＴＰ混合物（０．５ ｍＭ）、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３、５０
ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍ ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む反応緩衝液５０μｌ中でランダムヘキサマープライミングを用いて、全ＲＮＡ（１０μｇ／反応）をｃＤＮＡに変換した。３７℃で１時間インキュベーションした後、試料を３分間煮沸し、そして−７０℃で貯蔵した。既知のＣＤ４０およびＢ７の配列に相同性を有する配列を含んだプライマーを用いて、ＣＤ４０およびＢ７分子をコードするＤＮＡをＰＣＲにより生産し、そこでプライマーはまたクローニングに有用な制限部位をコードした（図２）。これらのプライマーは、Ｂ７およびＣＤ４０に対する公知のｃＤＮＡコード配列に基づいていた（Ｆｒｅｅｍａｎら，１９８９；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら，１９８９）。すべてのプライマーは、５’末端で、続いてクローニングのための制限部位でＣ−Ｇクランプにより開始する（図２において太字で示される）。可溶形のＢ７およびＣＤ４０のクローニングのための、逆方向プライマーにおける下線の配列は、アフィニティ精製に用いられるモノクローナル抗体により認識されるエピトープを表す。括弧内の数字は、ＣＤ４０およびＢ７に対する公知のｃＤＮＡに関するプライマーの位置を表す。
【０１５０】
ＰＣＲ増幅に対して、１μｌのｃＤＮＡは、１μｌ（１０ピコモル）の順方向プライマー、１μｌ（１０ピコモル）の逆方向プライマー、および４７μｌのＰＣＲ混合物を混合して作られた。ＰＣＲ混合物は、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、ｄＮＴＰ混合物（各０．２ｍＭ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｃＨＬ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡから成っていた。７０μｌの鉱油を５０μｌのＰＣＲ混合物にかぶせ、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で増幅を２５サイクル行った（９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のプライマーアニーリングおよび７２℃で１．５分の伸張反応）。増幅を２５サイクル行った後、ＰＣＲ産物を得た。
【０１５１】
増幅産物を、ＢｇＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化し（図１Ｂ）、そしてサイズ分画により単離した。バキュロウイルスでの発現前に、ＰＣＲ誘発の変異の導入を防ぐために、配列分析により各フラグメントのＤＮＡ配列を確認した。バキュロウイルス転移ベクターｐＡｃＣ８もまたＢｇＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化した（図１Ｂ）。
【０１５２】
増幅されたフラグメントを線状ｐＡｃＣ８ベクターに連結した（挿入片：ベクターの比は３：１であった）。連結産物を細菌株ＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）内に形質転換し、そして組換えｐＡｃＣ８ベクターをアンピシリン耐性に基づいて選別した。組換えプラスミドを細菌クローン（Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ａｕｓｕｂｅｌら）から単離し、そして目的の挿入片の存在をポリメラーゼ連鎖反応を用いて確認した（上記参照）。標準的手法により、プラスミドの大量調製を行った（Ａｕｓｕｂｅ
ｌら：Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。
【０１５３】
実施例２
ヒトＣＤ４０およびＢ７のバキュロウイルス発現
転移ベクターのｐＡｃＣＤ４０（全長ＣＤ４０分子をコードする）、ｐＡｃＣＤ４０−ＥＤ／Ｇｌｕ（ＣＤ４０の細胞外ドメインをコードする）、ｐＡｃＢ７（全長Ｂ７分子をコードする）およびｐＣｃＢ７−ＥＤ／Ｇｌｕ（Ｂ７分子の細胞ドメインをコードする）を用いて、ヒトＣＤ４０およびヒトＢ７をコードする配列をＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）中に組換えした。
【０１５４】
プラスミドを野生型バキュロウイルスＤＮＡ（２−１０ ｐｆｕ）（ＡｃＮＰＶ：Ｓｕｍｍｅｒら）と共に、１０６細胞／ｍｌの密度でＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内にトランスフェクトした（Ｓｕｍｍｅｒｓら）。組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を同定し、そしてクローン精製した（Ｓｕｍｍｅｒｓら）。
【０１５５】
組換えタンパクの細胞表面の発現のために、培養の４８時間後に細胞を集めた；分泌された組換えタンパクの産生のために、培養の７２時間後に細胞を集めた。
【０１５６】
実施例３
Ｓｆ９細胞ＥＬＩＳＡ
組換えウイルスで感染されたＳｆ９昆虫細胞を２４ウェルプレート内で４８時間培養した。組織培養培地を除去後、抗体を含む１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）０．２５ｍｌを用いて、室温（ＲＴ）で４５分間プレートをインキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに複合化したヤギ抗（マウス全Ｉｇ）免疫グロブリン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）のＰＢＳ−ＢＳＡによる１／２５０希釈液２５０μｌを用いて、ＲＴで３５分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡで５回洗浄することにより、未結合のペルオキシダーゼ活性を除去した。２ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンのエタノール液０．５ｍｌを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ｍｌまで希釈し、そして０．０３（Ｖ／Ｖ）Ｈ２Ｏ２を加えることにより調製されたアッセイ混合物を加えることにより、結合したペルオキシダーゼ活性を表した。１０分後に、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４ １００μｌを加えることにより反応を停止した。
【０１５７】
生存Ｓｆ９細胞に関して行われた上記のＥＬＩＳＡアッセイは、以下の結果を与えた。図３は、２４ウェルプレート内で４８時間培養したｐＡｃＢ７およびｐＡｃＣＤ２６で感染したＳｆ９細胞に対するデータを表している。ＥＬＩＳＡに使用される抗体は以下の通りであった：Ｂ７−２４、抗−（Ｂ７）（白抜き棒）、Ｔａ−１、抗−（ＣＤ２６）（線影棒）、および非一次抗体（灰色棒）。
【０１５８】
図４は、２４ウェルプレート内で４８時間培養したｐＡｃＢ７およびｐＡｃＣＤ４０で感染した生存Ｓｆ９細胞に対するデータを表している。ＥＬＩＳＡに使用される抗体は以下の通りであった：Ｓ２Ｃ６、抗−（ＣＤ４０（白抜き棒）および非一次抗体（線影棒）。
【０１５９】
実施例４
蛍光性細胞染色
Ａ．傾向性細胞染色
１０μｌの一次抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ、または１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを補足したＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中 １０μｇ／ｍｌ）中で細胞（１０６個／試料）を４℃で
２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄後、ヤギ抗−（マウスＩｇＧ）抗体のＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）１００μｌ中で、細胞を４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄して、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳ ０．５ｍｌ中で細胞を再懸濁した。ＦＡＣＳＳＣＡＮ Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析を行った。
【０１６０】
流動細胞定量分析の一般プロトコルおよび流動細胞定量法の臨床データ分析は、ＫｅｒｅｎらおよびＣｏｏｎらによって詳細に記載されている。一般血液細胞カウンティング技術およびＤＮＡ定量は、Ｐｏｗｅｒｓ，ＫｅｒｅｎらおよびＣｏｏｎらにより記載されている。
【０１６１】
ＡＲＣ ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の蛍光性細胞染色のデータを、図５に表す。図５Ａにおいて、Ｂ７発現Ｓｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の１：１００希釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染色の結果を示す。
【０１６２】
図５Ｂにおいて、ＣＤ４０発現Ｓｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の１：１００希釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染色の結果を示す。
【０１６３】
図５Ｃにおいて、コントロールのＳｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の１：１００希釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染色の結果を示す。
【０１６４】
Ｂ．可溶性抗原競合アッセイ
可溶性Ｂ７および可溶性ＣＤ４０の存在下および非存在下で、抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体および抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体で、ＡＲＣ ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を染色した。ＡＲＣ細胞を加える前に、抗体と、可溶性Ｂ７、可溶性ＣＤ４０またはコントロールとをＲＴで２０分間プレインキュベートした。
【０１６５】
図６Ａは、Ｂ７−２４（点線）または二次抗体単独（実線）による染色の結果を示す。図６Ｂは、Ｂ７−２４単独（点線）または可溶性Ｂ７でプレインキュベートしたＢ７−２４（実線）による染色の結果を示す。図６Ｃは、Ｂ７−２４単独（点線）または可溶性ＣＤ４０でプレインキュベートしたＢ７−２４による染色の結果を示す。図６Ｄは、ＣＤ４０−３Ａ８（点線）または二次抗体単独（実線）による染色の結果を示す。図６Ｅは、ＣＤ４０７Ａ８単独（点線）または可溶性Ｂ７でプレインキュベートしたＣＤ４０３Ａ８（実線）による染色の結果を示す。図６Ｆは、ＣＤ４０３Ａ８単独（点線）または可溶性ＣＤ４０でプレインキュベートしたＣＤ４０３Ａ８（実線）による染色の結果を示す。
【０１６６】
実施例５
宿主動物免疫化
０日目および１４日目に、ＡｃＣＤ４０ウイルスＡｃＢ７ウイルスまたはＡｃＣｄ３ウイルス（コントロールのウイルス）で感染された５Ｘ１０６個のＳｆ９細胞を、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入した。２１日目に、特異的抗体の存在を試験するために１００μｌの血清を得た。残りの期間が少なくとも２週間となった後、マウスに、ＡｃＣＤ４０ウイルスまたはＡｃＢ７ウイルスで感染された５Ｘ１０６個の細胞による最終の注入を行った。この最終の注入後３日目に、細胞融合のために脾臓細胞を用いた。
【０１６７】
実施例６
ハイブリードマクローンの生産
Ｂｏｅｒら（１９８８）により以前に記載されているように、５０％ポリエチレングリ
コールを用いて、免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た脾細胞をＳＰ２／０ネズミミエローマ細胞と１０：１の割合で融合した。ヒポキサンチン（０．１ｍＭ）、アミノプテリン（０．０１ｍＭ）、チミジン（０．０１６ｍＭ）および０．５ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を補足した完全ＩＭＤＭ培地中に、融合細胞を再懸濁した。次いで、各ウェルが平均１個の成長するハイブリッドを含むように、融合細胞を９６ウェル組織培養プレートのウェル間に分配した。
【０１６８】
１０〜１４日後、特異的抗体の産生に対してハイブリドーマ集団の上清液をスクリーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体の産生をスクリーニングするために、１２ウェルの上清液をプールし、そして実施例４に記載のように、それをＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞の蛍光性細胞染色のために用いた。次いで、陽性プールの上清液を別々に試験した。０．５ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−６含有ＩＭＤＭ／ＦＢＳ中での希釈を制限することにより、陽性ハイブリドーマ細胞を３回クローン化した。分析の結果を表１に表す。
【０１６９】
【表１】
実施例７
扁桃Ｂ細胞の試験
ｄｅＧｒｏｏｔら（１９９０）により記載のように、扁桃摘出を受けている子供から得た扁桃から、扁桃Ｂ細胞リンパ球を単離した。簡単に言えば、メスの刃身で組織を散らし、５ｍＭ Ｌ−ロイシンメチルエステルで処理することにより食細胞およびＮＫ細胞を除去し、そして臭化２−アミノエチルイソチオウロニウムで処理されたヒツジ赤血球を用いて１サイクルのロゼット形成させることにより、Ｔ細胞を除去した。
【０１７０】
上記の実施例４に記載のように、蛍光性細胞染色を用いて、扁桃Ｂ細胞に結合する能力に対して、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体および抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体を試験した。培養された扁桃Ｂ細胞の蛍光染色分析に対して、死細胞を除外するためにヨウ化プロピジウムを用いた。
【０１７１】
表２は、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体の高純度扁桃Ｂ細胞への結合に対する上記分析の結果を示す。
【０１７２】
【表２】
これらのデータは、新鮮な単離された扁桃Ｂ細胞の８９〜９５パーセントが、４つの抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体を用いて陽性に染色したことを示す。
【０１７３】
本質的に同様の方法により、扁桃Ｂ細胞とモノクローナル抗体Ｇ２８．５（Ｃｌａｒｋら）との反応を試験した：すなわち、本発明の抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体に対するのとおよそ同じパーセントの細胞が、Ｇ２８．５に対して陽性であった。
【０１７４】
表３は、抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体Ｂ７−２４の高純度扁桃Ｂ細胞への結合を、実施例４に記載の蛍光性細胞標識により測定した結果を示す。
【０１７５】
【表３】
これらのデータは、新鮮な単離された扁桃Ｂ細胞の１２〜１７パーセントが、抗−（Ｂ
７）モノクローナル抗体Ｂ７−２４を用いて陽性に染色したことを示す。
【０１７６】
実施例８
Ｍａｂ Ｂ７−２４によるＴ細胞増殖の遮断
Ｔ細胞増殖および上記のＭＬＣアッセイを用いて、Ｔ細胞活性化におけるＢ７分子の役割を研究した。Ｂ７−２４ Ｆａｂフラグメントの非存在下での増殖は、２０，０００〜６０，０００ ｃｐｍの範囲であった。図７は、このＭａｂがＴ細胞増殖の抗−ＣＤ３誘導性Ｂ７介在性の誘導を完全に遮断し得るので、このＭａｂがそのＢ７分子の機能的に重要なドメインに結合するということ、を示す。データは、別々のドナーのＴ細胞を用いた４名の各実験の±Ｓ．Ｄ．を示す。
【０１７７】
図８は、抗−Ｂ７ Ｍａｂ Ｂ７−２４（四角）またはＢＢ−１（三角）によるＴ細胞の抗−ＣＤ３誘導性Ｂ７介在注増殖の阻害を示す。従って、驚くべきことに、刺激細胞としてＢ７−陽性ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を用いて、Ｍａｂ Ｂ７−２４は、一次ＭＬＣ中でＴ細胞活性化を阻害し得ないことが見い出された。図９は、一次ＭＬＣ（黒塗り符号）および二次ＭＬＣ（白抜き符号）の間、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用を遮断する効果を示す。異なった濃度のＭａＢ ７−２４（図９Ａ）またはＢＢ−１（図９Ｂ）の存在下または非存在下、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用いて、精製Ｔ細胞を３日間刺激した。抗体の非存在下の増殖は、一次ＭＬＣでは１５，０００〜３０，０００の範囲であり、そして二次ＭＬＣでは２０，０００〜６０，０００の範囲であった。データは、別々のドナーからのＴ細胞を用いた４名の各実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【０１７８】
この実験から、抗Ｂ７−モノクローナル抗体は、明らかに、一次ＭＬＣを完全には遮断し得ない。しかし、同一の実験条件下では、ＣＤ３に対するＭａｂは、一次ＭＬＣにおいてＴ細胞の活性化をほとんど完全に遮断し得た。興味深いことに、プレ活性化したＴ細胞を用いて、二次混合リンパ球培養においてその阻害能力に対してＭａｂ Ｂ７−２４を試験したところ、そのＭａｂ Ｂ７−２４はＴ細胞の活性化を阻害し得た。
【０１７９】
実施例９
シクロスポリンＡおよび／またはＭａｂ Ｂ７−２４を用いるＴ細胞増殖の遮断
上記Ｔ細胞増殖アッセイを使用して、Ｂ７によるＴ細胞の共刺激が、ＣｓＡを用いる阻害に対しても抵抗性があるかどうか測定した。図１０は、Ｔ細胞が抗ＣＤ ３Ｍａｂにより増殖を誘導されると、Ｂ７による共刺激が、用量に依存するようにＣｓＡよって阻害され得ることを示す。しかし、有毒でないＣｓＡ濃度でＴ細胞の活性化を完全に遮断することは不可能であった。一次ＭＬＣ（結果は示さず）または二次ＭＬＣ（表４を参照のこと）を遮断するためにＣｓＡを使用しても、同様の結果が得られた。これらの実験は、Ｂ７−ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４介在Ｔ細胞増殖が、ＣｓＡの阻害作用に対し、部分的にのみ感受性であることを明確に示す。このように、インビトロでＴ細胞がＢ７と共刺激されるときに、完全に阻害されないことは、移植片拒絶または急性ＧＶＨＤの際に、ＣｓＡによる治療にもかかわらずインビボで起こることに類似し得た。
【０１８０】
【表４】
表４は、ＣｓＡ単独またはｍＡｂ Ｂ７−２４単独では、Ｔ細胞活性化が用量依存的に、しかし、不完全に阻害されることを示す。しかし、ＣｓＡおよびＢ７−２４を共に用いると、Ｔ細胞活性化は、完全に遮断された。興味深いことに、０．０２５μｇ／ｍｌのＢ７−２４の添加は、２．５μｇ／ｍｌの添加とほとんど同量の遮断を起こした。さらに、０．０２５μｇ／ｍｌのＢ７−２４の存在下で、ＣｓＡ濃度を６０倍に減少させても、Ｔ細胞活性化は９０％以上阻害された。この阻害は、最高濃度のＣｓＡ単独で最大に阻害されたときよりも大きかった。
【０１８１】
表５中に示すように、同一の増殖アッセイにおいて、ＩＣＡＭ−１またはＣＤ７２のどちらか一方にＭａｂを用いても相乗効果は観察されなかったので、Ｍａｂ Ｂ７−２４とＣｓＡとの間のこの相乗効果は、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用に対して特異的であった。
【０１８２】
【表５】
実施例１０
Ｍａｂ Ｂ７−２４および他の免疫抑制剤でのＴ細胞増殖の遮断
他の免疫抑制剤と共にＭａｂ Ｂ７−２４を用いてＴ細胞増殖の遮断を示すために、上記の実施例９のプロトコルを用いる。（Ａ）ＦＫ５０６、（Ｂ）ラパマイシン、（Ｃ）メトトレキセート、（Ｄ）プレドニソロン、または（Ｅ）デキタメタゾンをＣｓＡの代わりに用い、実施例９の増殖アッセイプロトコルと同様にして行った。
【０１８３】
実施例１１
シクロスポリンＡおよび／またはＭａｂ Ｂ７−２４での細胞毒性Ｔリンパ球活性の遮断
ＣｓＡおよびＢ７−２４がまた、Ｔ細胞のアロ抗原特異的活性化においても、ＣＴＬ活性の誘導を遮断することに共に作用し得たかどうかを試験するために、上記の細胞毒性アッセイを用いた。精製Ｔ細胞を、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣで６日間刺激し、引続き培地のみで２日間培養した。培地のみの存在下で、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣと共に３日間の再刺激した後、図１１に示すようにＴ細胞のＣＴＬ活性を分析した；４００μｇ／ｍｌのＣｓＡ；１０μｇ／ｍｌのＭａｂ Ｂ７−２４；または４００μｇ／ｍｌのＣｓＡおよび１０μｇ／ｍｌのＭａｂ Ｂ７−２４。約５０％のＡＲＣ標的細胞が、４時間のアッセイで溶解され得たので、これらの培地中でアロ抗原により活性化されたＴ細胞は、効果的に誘導され細胞溶解性となった。二次ＭＬＣにおける、ＣＴＬ活性のこの誘導は、４００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡでは若干阻害され得るのみであった。ニ次ＭＬＣの間の１０μｇ／ｍｌのＭａｂ Ｂ７−２４の添加は、約４０％の阻害を引き起こした。しかしながら、ＣｓＡとＭａｂ Ｂ７−２４とを組み合わせると、ＣＴＬ活性化のほとんど完全な
遮断をもたらした。
【０１８４】
実施例１２
Ｍａｂ Ｂ７−２４および他の免疫抑制剤での細胞毒性Ｔリンパ球活生の遮断
他の免疫抑制剤と共にＭａｂ Ｂ７−２４を用いて細胞毒性Ｔリンパ球活性の遮断を示すために、上記の実施例１１のプロトコルを用いる。（Ａ）ＦＫ５０６、（Ｂ）ラパマイシン、（Ｃ）メトトレキセート、（Ｄ）プレドニソロン、または（Ｅ）デキタメタゾンをＣｓＡの代わりに用いて、実施例１１の細胞毒性アッセイプロトコルと同様に行った。
【０１８５】
実施例１３
アロ抗原特異的Ｔ細胞活性化の際のＣｓＡとＭａｂ Ｂ７−２４との組み合せ
一次ＭＬＣアッセイ中に、ＣｓＡおよびＭａｂ Ｂ７−２４の存在下で、アロ抗原により（上記のように）刺激されたＴ細胞が、二次抗原刺激に応答し得るかどうかを調べた。精製Ｔ細胞を、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用い、６日間、１０μｇ／ｍｌのＭａｂ Ｂ７−２４および４００μｇ／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で刺激し、引続き培地のみで２日間培養した。ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用いて３日間の再刺激をした後、Ｔ細胞のＣＴＬ活性を分抗した。表６のデータは、代表的な実験のデータであり、ＣｓＡまたはＭａｂ Ｂ７−２４単独の存在下ではなくて、ＣｓＡおよびＭａｂ Ｂ７−２４の両方の存在下で、アロ抗原に６日間曝すことは、二次ＭＬＣにおけるアロ抗原によるその後の誘発に対する全体の非応答性を生じたことを示す。対照実験では、固定化抗ＣＤ３ Ｍａｂまたは無関係なアロ抗原を発現している細胞を用いて刺激した後でも、その細胞群が細胞毒性になるように誘導され得たことから、この非応答性は、一次ＭＬＣ後における細胞の生存力の欠如によるものではなかった（結果は示さず）。
【０１８６】
【表６】
実施例１４
アロ抗原特異的Ｔ細胞活性化の際のＭａｂ Ｂ７−２４と免疫抑制剤との組み合せ
他の免疫抑制剤と共にＭａｂ Ｂ７−２４を用いて二次抗原刺激を遮断する能力を示すために、上記の実施例１３のプロトコルを用いる。（Ａ）ＦＫ５０６、（Ｂ）ラパマイシン、（Ｃ）メトトレキセート、（Ｄ）プレドニソロン、または（Ｅ）デキタメタゾンをＣ
ｓＡの代わりに用いて、実施例１３のＣＴＬアッセイプロトコルと同様に行った。
【０１８７】
実施例１５
抗ＣＤ４０ ｍＡｂを用いるＢ細胞増殖の共刺激
ヒトＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を産生している４種のハイブリドーマを、実施例１〜７に記載のようにして生産した。これらのｍＡｂは、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｇ２８．５が結合すると同様の割合の扁桃Ｂ細胞に結合することが示された。ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９２）１５２：１５。これらのモノクローナル抗体の内、ＩｇＧ２ｂサブクラスである３種（５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６）を、上記のＢ細胞増殖アッセイにおいて、ヒトＢ細胞に対して活性化シグナルを発する能力について試験した。
【０１８８】
ヒト扁桃Ｂ細胞（４Ｘ１０４／ウェル）を、セファロースビーズ（５μ／ｍｌ）に結合した抗ＩｇＭの存在下（図１２Ａ）、または抗ＩｇＭ＋ｒＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下（図１２Ｂ）で、マイクロウェル中において２００μｌを培養した。濃度の異なる抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６、５Ｄ１２、３Ｃ６または３Ａ８を添加し、そして［３Ｈ］チミジンの取り込みを、１８時間のパルシングの３日後に測定した。図１２Ａに示したデータは、３つの異なるドナーからのＢ細胞調製物を用いたデュプリケートインキュベーション（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を伴う実験から導かれた平均値である。図１２Ｂのデータは、共通する結果を有する２つの実験の内の１つの実験から得られたデュプリケートインキュベーションの平均値である。
【０１８９】
どの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂも、固定化抗ＩｇＭの存在下、または固定化抗ＩｇＭおよびＩＬ−２の存在下で、ヒトＢ細胞増殖を実質的には共刺激し得なかった。対照的に、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６は、ヒトＢ細胞増殖を濃度依存的な様式で共刺激した。
【０１９０】
実施例１６
抗ＣＤ４０ ｍＡｂを用いるＢ細胞増殖の誘導
実施例１５で試験したｍＡｂを、ヒトＢ細胞の増殖を誘導するそれらの能力について、上記Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様アッセイで、すなわち、ＦｃγＲＩＩを発現する接着細胞上の抗ＣＤ４０ ｍＡｂを提示することにより試験した。抗体提示細胞として、ヒトＦｃγＲＩＩのＨＲ対立遺伝子形を発現するマウス３Ｔ６トランスフェクタント細胞を用いた。上記の系において、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６は、ＩＬ−４と共に、扁桃ヒトＢ細胞の実質的な増殖を誘導することを観察し、それを［３Ｈ］チミジンの取り込みの測定により評価した。しかし、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６または３Ａ８は、上記の培養系において、ヒトＢ細胞の増殖を誘導しなかった（データは示さず）。
【０１９１】
実施例１７
抗ＣＤ４０ ｍＡｂをいるＳ２Ｃ６刺激Ｂ細胞増殖の阻害
抗ＣＤ４０ ｍＡｂをまた、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６によるヒトＢ細胞増殖の共刺激を阻害する能力について、上記のＢ細胞増殖アッセイを用いて試験した。ヒト扁桃Ｂ細胞（４Ｘ１０４／ウェル）を、セファロースビーズ（５μｇ／ｍｌ）に結合した抗ＩｇＭおよび抗ＣＤ４０ ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６（１．２５μｇ／ｍｌ）の存在下で、マイクロウェル中において２００μ１を培養した。濃度の異なる抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６または３Ａ８を添加し、［３Ｈ］チミジンの取り込みを、３日後に評価した。コントロールとして、抗−（グルコセレブロシダーゼ）ｍＡｂ ８Ｅ４を、同濃度で添加した。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８３）１３４；５８５。データは、デュプリケートインキュベーションした２つの異なるドナー由来のＢ細胞を用いた実験から導かれた平均値±標準偏差である。
【０１９２】
抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６の各々が、抗ＩｇＭ誘導ヒトＢ細胞増殖の共刺激を、ｍＡｂ Ｓ２Ｃ６により阻害し得ることが見出された（図１３）。対照的に、β−グルコセレブロシダーゼに対して、同量の非関連であるｍＡｂ ８Ｅ４では、有意な阻害は見られなかった。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら、上記。このように、上記の抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、ヒトＢ細胞の増殖を刺激するシグナルを発しないが、それとは逆に、他のｍＡｂで抗ＣＤ４０を引き起こすことにより働く刺激シグナルを阻害し得る結論に達した。従って、これらのｍＡｂは、ＣＤ４０を介するシグナル化が、ＥＬ４Ｂ５細胞によるヒトＢ細胞増殖を刺激する役割を有するかどうかを調べるための優れた道具であると考えられた。
【０１９３】
実施例１８
ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖への抗ＣＤ４０ ｍＡｂの効果
抗ＣＤ４０ ｍＡｂのＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対する効果を、上記のＢ細胞活性化アッセイを用いて試験した。ヒト扁桃Ｂ細胞（１，０００／ウェル）を、活性化ヒトＴ細胞の５％上清液および５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在下で、放射線照射ＥＬ４Ｂ５細胞（５０，０００／ウェル）と共に培養した。抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６または３Ａ８を、種々の濃度で添加した。コントロールとして、ｍＡｂ ＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）を添加した。６日間の培養の後、［３Ｈ］チミジンの取り込みを評価した。
【０１９４】
図１４は、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６または３ＡＢの添加が、濃度に依存してヒトＢ細胞増殖の阻害をもたらしたことを示す。データは、デュプリケートインキュベーションをした４つの異なるドナー由来のＢ細胞を用いた実験から導かれた平均値±標準偏差である。ｍＡｂなしでのインキュベーションで得られた［３Ｈ］チミジンの取り込み値は、４つの異なる実験で、それぞれ１０４６０±１８４３ｃｐｍ、６９８２±１７２９ｃｐｍ、４３６２±１０２０ｃｐｍおよび１５４３±３１９０（平均値±標準偏差）であった。Ｂ細胞単独での［３Ｈ］チミジンの取り込みは、４０±５ｃｐｍの総量であり、放射線照射ＥＬ４Ｂ５細胞単独では、３１±１５ｃｐｍであった。
【０１９５】
非常に有効な阻害が生じた。各々１０ｎｇ／ｍｌという低い濃度で、３つの抗ＣＤ４０
ｍＡｂ ５Ｄ１２、３Ｃ６および３Ａ８は、ヒトＢ細胞増殖を、
完全に阻害した。最大の阻害の半分が、約１ｎｇ／ｍｌで見出された。対照的に、アイソタイプ一致性ＩｇＧ２ｂマウスミエローマタンパク質ＭＯＰＣ−１４１は、［３Ｈ］チミジンの取り込みに有意な効果を示さなかった。同様の阻害を、［３Ｈ］チミジンの取り込みを、６日目ではなく培養の４日目に評価した際に観察した。このように、観察された効果が、抗ＣＤ４０ ｍＡｂの影響下での増殖の速度論的変化によるものであるという可能性は、排除された（データは示さず）。
【０１９６】
比較のために、他のＢ細胞表面構造に対する、いくつかのｍＡｂの影響を調べた。抗ＣＤ２０ ｍＡｂ Ｂ１および抗Ｂ７ ｍＡｂ Ｂ７−２４（後者のｍＡｂを、図１４で用いた抗ＣＤ４０ ｍＡｂを生産するために用いた手順と同様の手順により、抗ＣＤ４０ ｍＡｂを用いた実験において使用した濃度と同一の濃度で生産した）のどちらも、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対し如何なる影響も与えなかった（データは示さず）。従って、抗ＣＤ４０ ｍＡｂのＥＬ４Ｂ５誘導Ｂ細胞増殖に対する阻害効果が、Ｂ細胞表面のマスキングによるものではない結論に達し得る。
【０１９７】
実施例１９
ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖への、ｈＣＤ４０．Ｈμの効果
ＥＬ４Ｂ５細胞が、ＣＤ４０に結合する膜構造を発現し得るかどうかを調べるために、ＣＤ４０の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＭの定常ドメインＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４（ｈＣＤ４０．Ｈμ）からなる融合タンパク質を、流動螢光定量分析に用いた。Ｌａｎｅ
ら、上記。非活性化ＥＬ４Ｂ５細胞は、融合タンパク質に結合しなかった。しかし、ＥＬ４Ｂ５細胞を、ヒトＢ細胞の活性化に必要な条件であるＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）および５％のヒトＴ細胞上清液と共に培養すると、軽度のｈＣＤ４０．Ｈμの結合が見出された（データは示さず）。この螢光の小さいシフトは、３回の独立した実験で常に見出された。ＣＤ４０結合の誘導に必要な最短の活性化期間は、２４時間であった。抗ＣＤ４０ ｍＡｂが阻害したように、ＥＬ４Ｂ５細胞に対するｈＣＤ４０．Ｈμの結合が、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖を阻害するかどうかを決定するために、上記のＢ細胞活性化アッセイを用いて、融合タンパク質を、ヒトＢ細胞とＥＬ４Ｂ５細胞との共培養物中で滴定した。図１５は、融合タンパク質が、まさに全く、［３Ｈ］チミジンの取り込みを濃度依存的に阻害し、そして、図１４に示される実験で使用された抗ＣＤ４０ ｍＡｂと同様に、ＥＬ４Ｂ５細胞により誘導されたＢ細胞増殖を完全に阻害し得たことを示す。
【０１９８】
実施例２０
ヒトＢ細胞による、ヒトＴ細胞誘導抗体産生への、抗ＣＤ４０ ｍＡｂの効果
上記のＴ細胞ヘルパーアッセイを用いて、活性化Ｔ細胞により接触依存的に刺激されたＢ細胞による免疫グロブリン産生を阻害する能力についても、抗体を試験した。抗ＣＤ３
ｍＡｂでコートされ、かつＴ細胞を共刺激する異なったｍＡｂでコートされるか、または、コートされない９６ウェルプレートにおいて、ヒト扁桃Ｂ細胞（１０４／ウェル）を、放射線照射された精製Ｔ細胞（３，０００ラド、１０５／ウェル）と共に培養した。培養８日後に、Ｂ細胞による免疫グロブリンの産生の測定のために、上清液を採取した。Ｂ細胞による免疫グロブリン産生は、上記のＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２を、培養当初から種々の濃度で添加した。コントロールとして、ｍＡｂ ＭＯＰＣ−１４１を添加した。図１６Ａは、Ｔ細胞が、固定化抗ＣＤ３ ｍＡｂにより刺激され、可溶性の抗ＣＤ２および抗ＣＤ２８ ｍＡｂにより共刺激されると、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２の添加が、ヒトＢ細胞によるＩｇＧ産生の阻害を濃度に依存して引き起こしたことを示す。Ｂ細胞によるＩｇＭ産生は、同程度に阻害された。同様の結果を、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ３Ｃ６および３Ａ８で、ならびにｈＣＤ４０．Ｈμ融合タンパク質で得た。
【０１９９】
本発明の抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、非常に有効な阻害を示した。約３０ｎｇ／ｍｌ程度の低い濃度で、３つの抗ＣＤ４０ ｍＡｂの各々が、５０％の最大阻害を示した。対照的に、アイソタイプ一致性のＩｇＧ２ｂマウスミエローマタンパク質ＭＯＰＣ−１４１は、免疫グロブリンの産生に影響しなかった。
【０２００】
３つの抗ＣＤ４０ ｍＡｂによる阻害効果は、ＣＤ４０リガンドヘルパー活性を提供しているＴ細胞の活性化の様式に対し特異的でなかった。図１６Ｂは、全てのＴ細胞増殖条件下（抗ＣＤ３単独；抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２；抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８；および抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２＋抗ＣＤ２８）で、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ５Ｄ１２の添加が、ヒトＢ細胞による免疫グロブリン産生の強度の阻害をもたらしたことを示す。この阻害は、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド相互作用を完全に遮断することで知られるｈＣＤ４０．Ｈμ融合タンパク質による阻害の量に匹敵する。阻害の百分率は、Ｔ細胞活性化条件に依存して、４０〜７０％に変化した。対照的に、アイソタイプ一致性のＩｇＧ２ｂマウスミエローマタンパク質ＭＯＰＣ−１４１、あるいはヒトＩｇＭ（ｈＣＤ４０．Ｈμ融合タンパク質のコントロールとして）は、ヒトＢ細胞による免疫グロブリンの産生に影響しなかった。
【０２０１】
培養の寄託
上記の実施例中で使用されたハイブリドーマは、ブダペスト条約の条項に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡに寄託され、受理された。この寄託は、これらのハイブリドーマが、上記の発明または下記の
請求項に記載の発明を実施するのに必須であることを示すものではない。
【０２０２】
ハイブリドーマ 寄託日 アクセス番号
Ｂ７−２４ １９９３年５月６日 ＨＢ １１３４１
３Ｃ６ １９９３年５月６日 ＨＢ １１３４０
５Ｄ１２ １９９３年５月６日 ＨＢ １１３３９
本発明は、特定の実施態様を参考にして記載した。しかし、本出願は、添付の請求の範囲の意図および範囲から離れることなく、当業者により行われ得る変更および置換を、包含することが意図される。
【０２０３】
本発明は、細胞表面抗原に対して特異的な抗体を生産する方法に関し、そしてそれは免疫原として組換え昆虫細胞を用いる。昆虫細胞は、細胞表面抗原を含有する分子のコード領域でトランスフェクトされ、そしてこれらの抗原は、昆虫細胞の表面上で発現される。宿主動物は、これらのトランスフェクトされた昆虫細胞で免疫化されて、細胞表面抗原に対して特異的な抗体を生産する。宿主動物からの抗体産生細胞は、モノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ細胞を生産するために用いられる。血清およびハイブリドーマ上清液は、スクリーニングアッセイにおいてトランスフェクトされた細胞を用いて、表面抗原に対する抗体の存在に対して試験され得る。本方法により生産された特異的抗体は、抗Ｂ７抗体および抗ＣＤ４０抗体であり、そしてそれらは被験体における抗体介在性疾患または免疫系疾患を予防または治療するために用いられ得る。抗Ｂ７抗体は、Ｔ細胞アネルギーの誘導、同種移植片移植組織拒絶反応の治療、移植片対宿主病の治療、およびリウマチ様関節炎の予防または治療に用いられ得る。免疫抑制剤は、抗体と一緒に投与され得る。ＣＤ４０抗原に結合する抗ＣＤ４０抗体は、Ｂ細胞の成長または分化を妨げるのに用いられ得る。これらの方法において有用なモノクローナル抗体、およびそのようなモノクローナル抗体と免疫反応するエピトープもまた提供される。
【０２０４】
（参考文献）
【０２０５】
【化１】
【０２０６】
【化２】
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１Ａ】図１Ａは、バキュロウイルス転移ベクターｐＡｃＣ８および多重クローニング部位の配列の図解を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の方法に従って、ヒトＣＤ４０あるいはＢ７抗原を発現するＳｆ９細胞生産の図解を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＤ４０およびヒトＢ７抗原のコーディング領域を調製するのに使用する、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーの配列を示す。これらのプライマーは、抗原Ｂ７およびＣＤ４０の公表されている全ＤＮＡコーディング配列（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、１９８９）に基づいて構築した。
【図３】図３は、抗（Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＢ−１と、ＡｃＢ７ウイルスに感染させたＳｆ９細胞およびヒトＣＤ２６を発現するＳｆ９細胞との反応を試験する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、抗（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｓ２Ｃ６と、ＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞およびＢ７を発現するＳｆ９細胞との反応を試験する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａ−Ｃは、ＣＤ４０あるいはＢ７を発現する、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞の蛍光細胞染色の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ−Ｃは、ＣＤ４０あるいはＢ７を発現する、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞の蛍光細胞染色の結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ−Ｃは、ＣＤ４０あるいはＢ７を発現する、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞の蛍光細胞染色の結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセイの結果を示す。
【図７】図７は、抗Ｂ７ Ｍａｂ Ｂ７−２４のＦａｂフラグメントによる、Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導Ｂ７介在性増殖の阻害を示す。
【図８】図８は、抗Ｂ７ Ｍａｂｓ Ｂ７−２４（四角）あるいはＢＢ−１（三角）による、Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導Ｂ７介在性増殖の阻害を示す。
【図９Ａ】図９は、（Ａ）ＭＡｂ Ｂ７−２４あるいは（Ｂ）ＭＡｂ ＢＢ−１による、３日間の一次ＭＬＣ（黒丸）および３日間の二次ＭＬＣ（白丸）時の、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用のブロッキング効果を示す。
【図９Ｂ】図９は、（Ａ）ＭＡｂ Ｂ７−２４あるいは（Ｂ）ＭＡｂ ＢＢ−１による、３日間の一次ＭＬＣ（黒丸）および３日間の二次ＭＬＣ（白丸）時の、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用のブロッキング効果を示す。
【図１０】図１０は、ＣｓＡによる、Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導Ｂ７介在性増殖の抑制を示す。データは、異なるドナーのＴ細胞を用いた、３回の個別実験の平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【図１１】図１１は、二次ＭＬＣ時のアロ抗原誘導ＣＴＬ活性のブロッキングにおける、抗Ｂ７ Ｍａｂ Ｂ７−２４とＣｓＡとの相乗効果を示す。Ｔ細胞のＣＴＬ活性は、培地のみ；４００μｇ／ｍｌ ＣｓＡ；１０μｇ／ｍｌ Ｍａｂ Ｂ７−２４；あるいは、４００μｇ／ｍｌ ＣｓＡおよび１０μｇ／ｍｌ Ｍａｂ Ｂ７−２４の存在下での、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣによる３日間の再刺激後に測定した。
【図１２Ａ】図１２Ａは、３つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂおよび１つの従来の抗ＣＤ４０ ｍＡｂの、抗ＩｇＭ誘導ヒトＢ細胞増殖を共刺激する能力の比較である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）の存在下での、図５Ａの実験の繰り返しを示す。
【図１３】図１３は、３つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂの、固定化抗ＩｇＭおよび抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５２Ｃ６との共刺激により誘導されたヒトＢ細胞増殖を阻害する能力を示す。
【図１４】図１４は、３つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂの、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対する効果を示す。
【図１５】図１５は、可溶性ＣＤ４０（ｈＣＤ４０．μ）の、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対する効果を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａおよび１６Ｂは、１つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２の、ヒトＢ細胞による、ヒトＴ細胞誘導免疫グロブリン産生に対する効果を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび１６Ｂは、１つの新規な抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ５Ｄ１２の、ヒトＢ細胞による、ヒトＴ細胞誘導免疫グロブリン産生に対する効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【公開番号】特開２００８−２６０７７１（Ｐ２００８−２６０７７１Ａ）
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１６４３８（Ｐ２００８−１１６４３８）
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【分割の表示】特願２００７−４８１５７（Ｐ２００７−４８１５７）の分割
【原出願日】平成５年７月８日（１９９３．７．８）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【分割の表示】特願２００７−４８１５７（Ｐ２００７−４８１５７）の分割
【原出願日】平成５年７月８日（１９９３．７．８）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
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