細菌の同定用培地組成物及びその利用
【課題】細菌の同定を迅速かつ簡易に行うための技術を提供する。
【解決手段】１００重量部の炭素源に対し１重量部以下のアミノ酸を含む、細菌同定用組成物を用いて細菌を培養する。この培養液のｐＨを測定することにより、糖代謝能等を迅速に判定し、これにより菌種を迅速かつ簡易に同定できる。
【解決手段】１００重量部の炭素源に対し１重量部以下のアミノ酸を含む、細菌同定用組成物を用いて細菌を培養する。この培養液のｐＨを測定することにより、糖代謝能等を迅速に判定し、これにより菌種を迅速かつ簡易に同定できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性大腸菌など細菌の同定のための細菌同定用栄養組成物、この組成物を用いた細菌の同定方法及び同定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症の原因である可能性のある食品や、感染症に罹患した可能性のある患者から採取した検体から原因微生物を検出し同定することは、汚染した環境に対する適切な処置や感染症に罹患した患者に対して適切な薬剤を投与して的確な治療を行うのに必要である。
【０００３】
また、近年、ポイントオブケア検査（Point of Care Testing,POCT）など迅速診断の要請が大きくなったため、細菌検出及び同定の迅速診断も各種の試みがなされている。微生物を検出する方法としては、各種の代謝能など生化学的性質に基づく方法のほか、ＡＴＰ法、インピーダンス法、誘電電気泳動法、ＣＯ2ガスセンサー法、ディジタル顕微鏡方式、蛍光測定法などがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これら各種の方法を用いても菌の検出のみならず同定を迅速に行うのは極めて困難であった。これは、一般に、菌を同定するためには増菌培養を要するからであった。例えば、食品のように検体中に菌数が多い場合であっても一晩程度の増菌を有するほか、感染症に罹患した患者からの検体の場合には正確な菌種同定を行うには十分な菌の増殖を必要とし、1日から数日かかっていた。また、増菌せず判定用プレート上に直接試料を滴下する場合であっても、試薬により検出が可能な程度にまでプレート上において菌を増殖させる必要があるからであった。
【０００５】
また、菌の同定を簡易に行うことも困難であった。すなわち、菌の同定を顕微鏡観察等で行う場合には人的作業を必要とするため作業者を確保する必要があるほか自動化が不可能であった。加えて、菌の生化学性質に基づく呈色反応等を確実に行うには、菌が十分に増殖したかどうかを別途菌数測定装置によってモニタリングする必要があり、装置が大型化あるいは高価になる傾向があった。
【０００６】
以上のことから、現在までのところ、細菌等を迅速かつ簡易に定量する方法は見出されていない。そこで、本発明は、細菌の同定を迅速かつ簡易に行うための技術を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、迅速同定のための培地、当該培地を用いた菌類の迅速同定方法及び同定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、病原性大腸菌などの細菌の各種の糖代謝能による菌種の同定手法を利用することとし、培地として一定の組成を用いることで、ｐＨ変化を糖代謝能の指標とし、ｐＨの変化傾向によりリアルタイムで糖代謝能を判定して菌種を同定できることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明によれば、１００重量部の炭素源に対し１重量部以下のアミノ酸を含む、細菌同定用培地組成物が提供される。好ましくは、１００重量部の炭素源に対して０．１重量部以上０．６重量部以下のアミノ酸を含有している。本組成物においては、前記炭素源は、グルコース、スクロース及びラクトースから選択されるいずれかであることが好ましい。また、本組成物は、前記炭素源による糖代謝能に基づく細菌同定用とすることができる。さらに、本組成物は、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能の判定のための成分を含有することができる。本組成物は、前記細菌同定用培地組成物中のｐＨ又はｐＨの変化の検出用とすることが好ましい。
【０００９】
本組成物は、前記炭素源を、５ｇ／ｌ以上２０ｇ／ｌ以下含有し、前記アミノ酸を０．００５ｇ／ｌ以上０．１２ｇ／ｌ以下含有することができる。また、前記アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン及びバリンからなる第１のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンからなる第２のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、システイン、ヒスチジン及びメチオニンからなる第３のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上とを含むことができる。
【００１０】
さらに、前記アミノ酸は、第１のアミノ酸群の全てのアミノ酸と、前記第２のアミノ酸群の全てのアミノ酸群と、前記第３のアミノ酸群の全てのアミノ酸とを含むことができる。
【００１１】
本組成物は、また、前記アミノ酸は、カザミノ酸を含むことができる。本組成物は、さらに、ビタミン及び／又はミネラルを含有することができる。
【００１２】
本組成物においては、前記細菌は病原性細菌であることが好ましく、前記細菌は、E.coli, E.cloacae, S.marcescens, P.mirabilis,P.vulgaris, K.pneumoniae, S.sonnci及び S.flexncriからなる群から選択されてもよい。
【００１３】
本発明によれば、細菌同定用培地組成物であって、同定対象細菌の糖代謝能、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上の代謝能の測定のための代謝成分を含有し、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化を抑制しない組成を有する、組成物が提供される。この組成物においては、アミノ酸を、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化に対する当該アミノ酸の緩衝作用を抑制可能な範囲（ｐＨの変化を抑制しない範囲）で含有していてもよい。また、前記アミノ酸を、前記同定対象細菌の測定しようとする代謝能による培養液の識別可能なｐＨの変化を５時間以内に検出できる程度の量含有することもできる。
【００１４】
本発明によれば、細菌同定用培地組成物のキットであって、上記いずれかに記載の細菌同定用培地組成物を１種類以上、好ましくは２種類以上含む、キットが提供される。
【００１５】
本発明によれば、細菌の同定方法であって、同定対象細菌を含む被験試料を準備する工程と、前記被験試料に対して、上記いずれかに記載の細菌同定用培地組成物を供給して培養する培養工程と、前記培養工程の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出工程と、を備える、同定方法が提供される。この方法において、前記培養工程は、５００μｌ以下の容積で実施することができる。また、前記培養工程は、一つの同定対象細菌に対して２種類以上の前記細菌同定用培地組成物を別個に供給して培養する工程とすることもできる。さらに、前記ｐＨ検出工程は、前記ｐＨ変化量を検出する工程としてもよい。
【００１６】
本発明によれば、細菌の同定装置であって、同定対象細菌を含む被験試料と請求項１〜１４のいずれかに記載の細菌同定用培地組成物とを含む培養液を培養キャビティと、前記培養キャビティ中の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出器と、を備える、装置が提供される。また、前記培養キャビティは１ｍｌ以下の培養液による培養用とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の細菌同定用培地組成物は、１００重量部の炭素源に対し１重量部以下のアミノ酸を含むことができる。本発明の培地組成物は、炭素源に対して上記のように少ないアミノ酸を含有することにより、細菌が利用可能な炭素源を含む本培地組成物を利用して培養したとき、炭素源の代謝により培養液のｐＨが培養開始から早期に変化する。このため、細菌の炭素源代謝能を迅速に判定することができる。アミノ酸が炭素源よりも相当程度少ないことにより、アミノ酸によるバッファーアクションが抑制されるために、微量な代謝活動をpHやpH変化量として検出することができるようになる。好ましくは、アミノ酸は、１００重量部の炭素源に対して０．１重量部以上である。アミノ酸が上記量未満であると、ｐＨが安定せず、逆に菌での代謝活動を、ｐＨの変動として検知することができにくくなるからである。また、本発明の培地組成物は、ｐＨを指標とすることができるため簡易に代謝能を判定できる。さらに、培養液のｐＨをリアルタイムでモニタリングすることによっても迅速な判定が可能となる。さらにまた、急速にｐＨが変化することでｐＨ変化量が大きくなるため、精度よく炭素源代謝能を判定することができる。したがって、本組成物によれば、細菌を迅速にかつ簡易に同定できる。
【００１８】
さらに、本組成物は、同定対象細菌のリジンの脱炭酸反応、尿素の代謝（分解）及びクエン酸の代謝（分解）のための代謝成分も含むよう構成することもできる。このため、本組成物は、こうした代謝能に基づいて細菌を同定することができる。なお、本組成物は、糖代謝能によらないで、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上によるｐＨ変化によって細菌を同定するよう組成することもできる。この場合には、炭素源に替えてこれらの代謝成分（リジン、尿素及びクエン酸）を組成物に含むことになる。
【００１９】
また、本発明の細菌同定用培地組成物を用いて微量の被験試料を５００μｌ以下レベルの小さいスケールで培養するときには、細菌による炭素源の代謝による結果が培養液に速やかに反映されるため、より迅速に炭素源代謝能を判定し、これにより細菌を迅速に同定できる。
【００２０】
本組成物は、特に、感染症に対する適切な薬剤を選択するのに都合がよい。培養開始から早期であっても的確な抗菌性物質の選択が可能な程度に菌種を同定できるからである。感染症患者に投与すべき抗菌性物質等は、一定の作用機作に基づく抗菌スペクトルを有している。したがって、菌種をおおよそ特定することで適切な抗菌性物質を選択して投与することができる。
【００２１】
本発明の細菌同定用培地組成物は、同定対象細菌の糖代謝能、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上の代謝能の測定のための代謝成分を含有し、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化を抑制しない組成を有する組成物とすることができる。培養液のｐＨ変化を抑制しない範囲、すなわち、バッファーアクションを奏しない組成とすることで、細菌の代謝活動を確実にｐＨ変化として把握することができる。また、細菌の代謝活動によるｐＨ変化を早期に検出し識別できるため、細菌の同定時間の短縮の要請に応じられる時間内でｐＨ変化を検出・識別できる。本組成物は、例えば、糖など代謝成分のみで構成されていてもよいし、アミノ酸などその他の成分を、細菌の代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化に対するその成分の緩衝作用を発揮しない範囲（ｐＨ変化を抑制しない範囲）で含んでいてもよい。こうしたアミノ酸量は、炭素源とアミノ酸とを各種濃度比で組み合わせた組成の培地を調製して実験することにより取得することができる。例えば、細菌同定のために許容される時間が５時間であれば、５時間以内にｐＨの変化が現われるように炭素源とアミノ酸との含有量を決定すればよい。また、この他、代謝能の測定に必要な成分も組成物に含めることができる。また、こうした代謝成分もｐＨのバッファーアクションを抑制できる範囲で添加されていることが好ましい。
【００２２】
本発明は、さらに本組成物を利用した細菌の同定方法及び同定装置等に関する。以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２３】
（細菌同定用培地組成物）
本発明の組成物は細菌の同定を対象とすることができる。同定対象細菌としては特に限定されないが、迅速診断等の要請を考慮すると病原性細菌とすることが好ましい。病原性細菌としては、食中毒を含む感染症の原因菌等が挙げられる。本発明は、病原性細菌のなかでも、E.coli, E.cloacae, S.marcescens, P.mirabilis,P.vulgaris, K.pneumoniae, S.sonnci及び S.flexneriを同定対象細菌とすることが好ましい。これらの細菌は、臨床上の要請が大きいとともに、本発明が意図する糖代謝能等による同定が容易であるからである。
【００２４】
本組成物は、上記のとおり、炭素源による糖代謝能に基づく細菌同定用とすることが好ましい。本組成物の有する組成は、細菌の糖代謝能の相違を培養早期においてｐＨの変化として顕在化させることができる。また、本組成物は、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能の判定のための成分を含有することができる。既に記載したように、本組成物は糖代謝能のほか、これらの代謝能による細菌の相違を顕在化させるのにも適している。したがって、本組成物は、これらの代謝能のいずれかに基づく細菌同定用として使用することもできる。
【００２５】
本組成物は、培養液中のｐＨ又はｐＨの変化を検出して細菌を同定するのに用いることができる。培養液中のｐＨ及びｐＨの変化は、各種のｐＨ測定法によって測定することができる。なお、ｐＨ測定法としては、指示薬法、金属電極法（水素電極法、キンヒドロン電極法、アンチモン電極法）、ガラス電極法、ケミカルＣＣＤ（Charge Coupled device）法等を用いることができる。なお、ケミカルＣＣＤ法は水素イオン濃度に応じて表面電位が変化する表面を有するＣＣＤセンサーを用い、当該表面電位の変化に基づく電子の蓄積量変化により水素イオン濃度を測定する方法である。これらの測定法のうち、一般的にはガラス電極法を用いることが好ましい。また、ケミカルＣＣＤ法は、特に、１ｍｌ以下、好ましくは５００μｌ以下の小スケールでの培養液ｐＨの測定に適している。
【００２６】
本組成物は、炭素源１００重量部に対してアミノ酸が１重量部以下であることが好ましい。アミノ酸が上記量以下であると、アミノ酸によるバッファーアクションが抑制されるために、微量な代謝活動をpHやpH変化量として検出することができるようになる。好ましくは、アミノ酸は、１００重量部の炭素源に対して０．１重量部以上である。アミノ酸が上記量未満であると、ｐＨが安定せず、逆に菌での代謝活動を、ｐＨの変動として検知することができにくくなるからである。また、アミノ酸は好ましくは同０．６重量部以下である。アミノ酸が同０．６重量部以下であると、培養開始から早期にpHが変化するため、迅速に細菌の代謝活動によるｐＨ及びｐＨ変化量に基づいて細菌を同定することができる。
【００２７】
また、炭素源は、５ｇ／ｌ以上２０ｇ／ｌ以下含有し、アミノ酸を０．００５ｇ／ｌ以上０．１２ｇ／ｌ以下含有することができる。この範囲であると、１０７〜１０１２CFU／ｍl程度の細胞を培養したとき、識別できるｐＨ変化を早期に得やすいからである。炭素源はより好ましくは、８ｇ／ｌ以上１２ｇ／ｌ以下であり、アミノ酸はより好ましくは、０．００８ｇ／ｌ以上０．０７２ｇ／ｌ以下である。
【００２８】
炭素源は、同定対象細菌を他の細菌と区別するために選択される。したがって、同定対象細菌の種類に応じて選択される。例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、ガラクトース等が挙げられる。病原性細菌には、グルコース、スクロース及びラクトースから選択されることが好ましい。本組成物は、炭素源を１種類のみ含有することが好ましい。特定の炭素源についての代謝能の有無が細菌の同定に有効だからである。なお、一つの同定対象細菌について、複数種類の糖に対する代謝能に基づいて菌を同定することが好ましい。したがって、細菌の同定には、２種類以上の本組成物を用いることが好ましい。
【００２９】
アミノ酸は、アラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等から選択することができる。好ましくは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン及びバリンからなる第１のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンからなる第２のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、システイン、ヒスチジン及びメチオニンからなる第３のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上とを含むことが好ましい。これら３種類の群のそれぞれのアミノ酸を含有することで、本組成物に含まれるアミノ酸の種類により細菌の糖代謝能が影響されることが抑制又は回避される。好ましくは、これら３群の全てのアミノ酸を含有する。
【００３０】
第１のアミノ酸群の各アミノ酸の濃度、第２のアミノ酸群の各アミノ酸の濃度及び第３のアミノ酸群の各アミノ酸の濃度は、組成物の一定体積あたりにおいて重量比で約２：約１：約０．５であることが好ましい。
【００３１】
第１のアミノ酸群のアミノ酸は、それぞれ４００μｇ／ｌ以上９０００μｇ／ｌ以下含有することが好ましく、第２のアミノ酸群のアミノ酸は、それぞれ２００μｇ／ｌ以上４５０μｇ／ｌ以下含有し、第３のアミノ酸群のアミノ酸は、それぞれ１００μｇ／ｌ以上２２５μｇ／ｌ以下含有することが好ましい。この範囲で各アミノ酸を含有すると、菌の代謝活動に必要な量を含んでいるだけでなく、バッファーアクション（緩衝作用）を抑制して、安定した菌の代謝活動の測定が可能となる。
【００３２】
また、アミノ酸としては、カザミノ酸を含むことができる。カザミノ酸は、カゼインが加水分解されたアミノ酸混合物であり、各種アミノ酸を本発明において好ましい組成で含んでいる。したがって、他の各種の単体のアミノ酸と併用せずに、アミノ酸としてカザミノ酸を単独で用いることができる。菌種によっては、カザミノ酸を用いることで糖代謝能に相違が出やすくなる場合がある。
【００３３】
本組成物は、炭素源とアミノ酸のほか、ビタミンを含有していてもよい。ビタミンとしては、細菌用培地に含まれる一般的なものから適宜選択すればよい。例えば、チアミン、チミジン、リボフラビン、パントテン酸、ニコチン酸、イノシトール、コリン、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキシン、ビオチン、葉酸等から適宜選択することができる。本組成物は好ましくは、２種類以上のビタミンを含有する。ビタミンの含有量は特に限定されないが、例えば、チアミン、チミジン、リボフラビン、パントテン酸、ニコチン酸、イノシトール、コリン、ｐ−アミノ安息香酸及びピリドキシンについては、それぞれ５μｇ／ｌ以上２０μｇ／ｌ以下とすることが好ましい。また、ビオチン及び葉酸については、０．５μｇ／ｌ以上２μｇ／ｌ以下とすることが好ましい。
【００３４】
本組成物は、ミネラルを含むことができる。ミネラルとしては、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、マンガン、鉄、亜鉛、コバルト及び銅などが挙げられる。好ましくは、少なくともマグネシウム及びカリウムを塩基として含む塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩又は硝酸塩等の形態で含有する。ミネラルの含有量は特に限定されないが、例えば、ＭｇＣｌ2については０．０１ｇ／ｌ程度、ＫＣｌについては、０．５ｇ／ｌ程度、Ｋ2ＨＰＯ4については０．０５ｇ／ｌ程度とすることができる。
【００３５】
本組成物のｐＨは、同定対象細菌の種類に応じて適宜調整される。通常は、ｐＨ６．８以上７．４以下程度に調整される。なお、本発明の組成物は、液体で使用するものであるため、液体組成物とすることができるほか、こうした組成を用時溶解により得ることができる用時溶解性の固形組成物（粉末であってもよいし、タブレット等であってもよい）とすることができる。また、用時希釈によりこうした組成を得ることができる高濃度液とすることもできる。さらに、こうした組成を得ることができる液体及び／又は固体（粉末）のキットとすることもできる。
【００３６】
また、本組成物は、上記組成に限定されることなく、同定対象細菌の糖代謝能、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上の代謝能の測定のための代謝成分を含有し、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化を抑制しない組成を有することができる。したがって、こうした代謝成分のみを含むことができるほか、前記代謝能の発揮による培養液ｐＨの変化を抑制しない範囲、換言すれば、培養液のｐＨの変化に対する添加成分（アミノ酸やビタミンなど代謝成分以外）の緩衝作用を抑制可能な範囲で、アミノ酸やビタミン等の成分を含むことができる。アミノ酸は、同定対象細菌の測定しようとする代謝能による培養液の識別可能なｐＨの変化を５時間以内に検出できる程度の量含有するようにすることが好ましい。より好ましくは４時間以内にｐＨ変化を検出できるのがよく、より好ましくは３時間以内にｐＨ変化を検出できるのがよい。
【００３７】
（細菌同定用培地組成物のキット）
本発明のキットは、本組成物を１種類以上、好ましくは２種類以上含むキットとすることができる。被験試料中の細菌の菌種を同定するには、２種類以上の糖代謝能に基づくことが好ましいからである。被験試料において、複数の同定対象細菌が含まれる可能性があるのが通常であるからである。本キットは、炭素源としてグルコースを含む本組成物、ラクトースを含む本組成物、スクロースを含む本組成物から選択される２種類あるいは全種類を含むことが好ましい。さらに、本キットは、培養に適したウェル容器あるいは複数個のウェルを有する固相担体を備えることもできる。
【００３８】
（細菌同定方法）
本発明の細菌の同定方法は、同定対象細菌を含む可能性のある被験試料を準備する工程と、前記被験試料と本組成物とを混合して培養する培養工程と、前記培養工程の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出工程と、を備えることができる。
【００３９】
本組成物の調製方法については特に限定しない。アミノ酸及びビタミンについては、それぞれ高濃度の原液を予め調製しておき、適宜希釈して用いることが好ましい。
【００４０】
培養工程は、細菌一般の培養条件を採用することができる。適宜、同定対象細菌の種類に応じて、酸素要求性、温度、ｐＨ等を調整することができる。一般的には、温度は、３０℃〜４０℃程度とし、ｐＨ６．８以上７．４以下程度とし、培養は、酸素要求性等に応じて静地培養、振とう培養、回転培養、静地培養下での酸素供給法などから適宜選択することができる。培養液における菌濃度は、１０７CFU／ｍl以上１０１２CFU／ｍl以下とすることができる。この範囲であると、迅速なｐＨ低下を期待することができる。より好ましくは、１０９CFU／ｍl以上１０１1CFU／ｍl以下とすることができる。ただし、被験試料中の菌濃度を予め取得するのが困難な場合には、食品や患者等から採取した検体を複数段階に希釈したものを被験試料として用いることができる。
【００４１】
培養スケールは、通常は固形培地を用い、その量を液体として換算すると約２０ｍｌ程度とすることができるが、本発明では、１ｍｌ以下程度（好ましくは５００μｌ以下、より好ましくは３００μｌ以下、一層好ましくは２００μｌ以下である。）の液体培地による小スケールとすることもできる。このような小スケール下では、被験試料も微量ですみ、また、培養液が小容量であるため細菌の糖代謝の結果が培養液に速やかに反映されるため、より迅速に糖代謝能の有無の判定及び菌種の同定が可能となる。こうした小スケールでの培養のためのキャビティの形成には、例えば、マイクロマシンやMEMS（micro Electro Mechanical System）の製作技術を適用することができる。また、各種のエッチング技術、リソグラフィ技術、接合技術、成膜技術、レーザ等による精密微細加工技術、超音波技術等を適宜組み合わせて用いることができる。さらに、マイクロ塑性加工技術、マイクロ射出成形技術、マイクロ光造形技術などのマイクロ成形技術を用いることもできる。なお、用いる成形・加工技術に応じて、被加工体である固相基材を適宜選択することができる。
【００４２】
ｐＨ検出工程は、培養液のｐＨを測定する。ｐＨ測定法としては、既に説明したように、指示薬法、金属電極法（水素電極法、キンヒドロン電極法、アンチモン電極法）、ガラス電極法、ケミカルＣＣＤ法等を用いることができる。一般には、ガラス電極法を用い、小スケールでは、ケミカルＣＣＤ法を用いることが好ましい。
【００４３】
ｐＨ検出工程におけるｐＨ検出は、培養開始から連続的に行うこともできるが、一定期間毎に断続的に行うこともできるし、特定した時間経過後においてのみ行うこともできる。ｐＨ検出のタイミング等は、必要に応じ選択することができるが、時間当たりのｐＨ変化量を検出する場合には、継続的又は断続的にｐＨを測定することが好ましい。
【００４４】
ｐＨ検出工程で検出したｐＨ又はｐＨ変化量に基づいて、被験試料中の細菌の菌種を同定することができる。すなわち、被験試料中の細菌が同定対象細菌であるかどうかを判定できる。判定の基礎は、あるタイミングにおけるｐＨであってもよいし、時間当たりのｐＨ変化量であってもよい。特に、迅速診断の要請に応えるためには、培養早期の比較的ｐＨ変化の大きい時期におけるｐＨ変化量を判定基礎とすることが好ましい。なお、菌種及び同定に用いる代謝能の種類によっては、培養後期において大きくｐＨが変化する場合もありうる。
【００４５】
また、判定にあたっては、同定対象細菌（コントロール）について被験試料中の細菌の同定に用いたのと同じ組成の本組成物による培養を実施して得られたｐＨ傾向に関するｐＨ情報に基づくことができる。こうしたｐＨ情報は、予め取得しておいてもよいし、さらにデータベース化しておいてもよい。また、被験試料と同時にコントロールについても培養を実施してもよい。
【００４６】
（細菌同定装置）
本発明の細菌の同定装置は、同定対象細菌を含む可能性のある被験試料と本組成物とを含む培養液を培養キャビティと、前記培養キャビティ中の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出器と、を備えることができる。培養キャビティは、通常のチューブ状であってもよいし、ガラス又はプラスチックプレート上に成形あるいはエッチング等の加工をすることにより形成されたウェルであってもよいし、ガラスやＰＰなどのプラスチック製の固相担体にウェルを区画する壁体となる部材を接着して形成した凹部であってもよい。本同定装置は、こうした培養キャビティ、好ましくは複数個の培養キャビティを、着脱可能なモジュールとして備えることができる。培養キャビティは、１ｍｌ以下の培養液による培養用であることが好ましい。より好ましくは、５００μｌ以下の培養液による培養用である。こうした容積範囲の培養液による培養用のキャビティを備えることで、より迅速な同定を容易に行えるようになる。さらに好ましくは３００μｌ以下、一層好ましくは２００μｌ以下である。
【００４７】
本同定装置は、こうした培養キャビティに本組成物を供給する培地供給装置を備えることもできる。このような培地供給装置を備えることで、容易に本組成物と被験試料とを混合して培養を開始することができる。培地供給装置は、個々の培養キャビティに培地を供給可能にＸ−Ｙプロッタ等による可動性を備えていることが好ましい。あるいは、培養キャビティ側にＸ−Ｙプロッタにより可動性を備えるようにしてもよい。
【００４８】
ｐＨ検出器としては、上記した各種ｐＨ測定方法に基づく検出装置を備えることができる。なお、指示薬法の場合には、少なくとも比色計を備えることができる。
【実施例１】
【００４９】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
（培地の調製１）
細菌の同定に適した培地の調製について説明する。
＜アミノ酸＞
まず下記表に示す各アミノ酸のストック液 (10 mg/ml)を調製し、使用時に１０倍希釈して1ｍｇ／ｍｌの希釈液を調製する。この各希釈液を培地100mlあたり下記含量となるよう、カッコ内の体積を蒸留水に加えた。
【００５１】
第１群(200 μl)
Alanine 200 μg
Arginine 200 μg
Aspartic acid 200 μg
Glutamic acid 200 μg
Glycine 200 g
Isoleucine 200 μg
Leucine 200 μg
Lysine 200 μg
Valine 200 μg
第２群(１00 l)
Phenylalanine 100 μg
Proline 100 μg
Serine 100 μg
Threonine 100 μg
Tryptophan 100 μg
Tyrosine 100 μg
第３群(50 l)
Cystine 50 μg
Histidine 50 μg
Methionine 50 μg
【００５２】
＜ビタミン＞
ビタミンについては、各ビタミンのストック液 (10 mg/ml)を調製し（銀紙で包んで冷暗所保存、２週間以後は使用不可とする）、これを１０００倍希釈して各希釈液を調製する。この各希釈液を培地100mlあたり下記含量となるようカッコ内の体積を蒸留水に加えた。
＜Aグループ（100μl）＞
Thiamine 1 μｇ
Thymidine 1 μｇ
Riboflavin 1 μｇ
pantothenic acid 1 μｇ
nicotinic acid 1 μｇ
inositol 1 μｇ
choline-Cl 1 μｇ
PABA 1 μｇ
Pyridoxine 1 μｇ
＜Bグループ（10μl）＞
biotin 0.1 μｇ
folic acid 0.1 μｇ
【００５３】
さらに、上記培地には、MgCl20.001%, KCl 0.05%, K2HPO40.005%を含有するように、これらのストック液を添加した。こうして調製した培地は、蒸留水で１００ｍｌとし、オートクレーブで滅菌した。この培地は、後段の実施例で示すように、最終的に、各種炭素源が１０ｇ／ｌとなるように添加して使用された。
【００５４】
なお、上記培地を１倍濃度の培地として、上記各希釈液の添加量を半減させた１／２培濃度の培地と、上記各希釈液の添加量を倍増させた２倍濃度の培地とをそれぞれ調製した。
【実施例２】
【００５５】
E.coli 臨床株３、E.cloacae 臨床株１、P.mirabilis 臨床株１、P.vulgaris 臨床株１及びS.sonnei 臨床株１につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した１倍濃度の培地（炭素源添加前）に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表１及び図１に示す。なお、E.coli はグルコース及びラクトース代謝能を有し、E.cloacaeはグルコース代謝能を有するがラクトース代謝能は変動的であり、P.mirabilis、P.vulgaris及びS.sonneiはグルコース代謝能を有しラクトース代謝能を有さない。
【００５６】
【表１】
【００５７】
表１及び図１に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例３】
【００５８】
実施例２で用いたのと同一のE.coli 臨床株３、E.cloacae 臨床株１、P.mirabilis 臨床株１、P.vulgaris 臨床株１及びS.sonnei 臨床株１につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した１倍濃度の培地（炭素源添加前）に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、ラクトースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表２及び図２に示す。
【表２】
【００５９】
表２及び図２に示すように、培養開始後４０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例４】
【００６０】
実施例２で用いたのと同一の臨床株群につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）を１／２倍濃度の培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表３及び図３に示す。
【表３】
【００６１】
表３及び図３に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例５】
【００６２】
実施例２で用いたのと同一の臨床株群につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）を１／２倍濃度の培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、ラクトースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表４及び図４に示す。
【表４】
【００６３】
表４及び図４に示すように、培養開始後４０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例６】
【００６４】
実施例２で用いたのと同一の臨床株群につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）の２倍濃度の培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表５及び図５に示す。
【表５】
【００６５】
表５及び図５に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例７】
【００６６】
実施例２で用いたのと同一の臨床株群につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）の２倍濃度の培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表６及び図６に示す。
【表６】
【００６７】
表６及び図６に示すように、培養開始後４０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例８】
【００６８】
（培地の調製２）
細菌の同定に適した他の培地の調製について説明する。本実施例では、アミノ酸としてカザミノ酸を用いて、０．０２ｇ／ｌ及び０．０５ｇ／ｌとなるようにそれぞれ調製し、さらに、これらの各液にMgCl2 0.001%, KCl 0.05%, K2HPO40.005%を含有するように調製し、蒸留水を加えて最終濃度としたのち、オートクレーブで滅菌した。これらの培地は、それぞれ後段の実施例で示すように、最終的に、各種炭素源が１０ｇ／ｌとなるように添加して使用された。
【実施例９】
【００６９】
E.coli 臨床株３、E.cloacae 臨床株１、P.mirabilis 臨床株１、P.vulgaris 臨床株１及びS.sonnei 臨床株１につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製したカザミノ酸０．０２ｇ／ｌの培地（炭素源添加前）に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表７及び図７に示す。
【００７０】
【表７】
【００７１】
表７及び図７に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例１０】
【００７２】
実施例９で用いたのと同一のE.coli 臨床株３、E.cloacae 臨床株１、P.mirabilis 臨床株１、P.vulgaris 臨床株１、及びS.sonnei 臨床株１につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製したカザミノ酸０．０２ｇ／ｌの培地（炭素源添加前）に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、ラクトースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表８及び図８に示す。
【表８】
【００７３】
表８及び図８に示すように、培養開始後６０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例１１】
【００７４】
実施例９で用いたのと同一の臨床株及びS.marcesence臨床株２につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）をカザミノ酸０．０５ｇ／ｌの培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表９及び図９に示す。
【表９】
【００７５】
表９及び図９に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例１２】
【００７６】
実施例２で用いたのと同一の臨床株及びS.marcesence臨床株２につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）をカザミノ酸０．０５ｇ／ｌの培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、ラクトースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表１０及び図１０に示す。
【表１０】
【００７７】
表１０及び図１０に示すように、培養開始後４０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【００７８】
以上のことから、特定培地により極めて短時間で細菌の糖代謝能プロファイリングが可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】実施例２での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図２】実施例３での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図３】実施例４での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図４】実施例５での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図５】実施例６での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図６】実施例７での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図７】実施例９での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図８】実施例１０での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図９】実施例１１での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図１０】実施例１２での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性大腸菌など細菌の同定のための細菌同定用栄養組成物、この組成物を用いた細菌の同定方法及び同定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症の原因である可能性のある食品や、感染症に罹患した可能性のある患者から採取した検体から原因微生物を検出し同定することは、汚染した環境に対する適切な処置や感染症に罹患した患者に対して適切な薬剤を投与して的確な治療を行うのに必要である。
【０００３】
また、近年、ポイントオブケア検査（Point of Care Testing,POCT）など迅速診断の要請が大きくなったため、細菌検出及び同定の迅速診断も各種の試みがなされている。微生物を検出する方法としては、各種の代謝能など生化学的性質に基づく方法のほか、ＡＴＰ法、インピーダンス法、誘電電気泳動法、ＣＯ2ガスセンサー法、ディジタル顕微鏡方式、蛍光測定法などがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これら各種の方法を用いても菌の検出のみならず同定を迅速に行うのは極めて困難であった。これは、一般に、菌を同定するためには増菌培養を要するからであった。例えば、食品のように検体中に菌数が多い場合であっても一晩程度の増菌を有するほか、感染症に罹患した患者からの検体の場合には正確な菌種同定を行うには十分な菌の増殖を必要とし、1日から数日かかっていた。また、増菌せず判定用プレート上に直接試料を滴下する場合であっても、試薬により検出が可能な程度にまでプレート上において菌を増殖させる必要があるからであった。
【０００５】
また、菌の同定を簡易に行うことも困難であった。すなわち、菌の同定を顕微鏡観察等で行う場合には人的作業を必要とするため作業者を確保する必要があるほか自動化が不可能であった。加えて、菌の生化学性質に基づく呈色反応等を確実に行うには、菌が十分に増殖したかどうかを別途菌数測定装置によってモニタリングする必要があり、装置が大型化あるいは高価になる傾向があった。
【０００６】
以上のことから、現在までのところ、細菌等を迅速かつ簡易に定量する方法は見出されていない。そこで、本発明は、細菌の同定を迅速かつ簡易に行うための技術を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、迅速同定のための培地、当該培地を用いた菌類の迅速同定方法及び同定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、病原性大腸菌などの細菌の各種の糖代謝能による菌種の同定手法を利用することとし、培地として一定の組成を用いることで、ｐＨ変化を糖代謝能の指標とし、ｐＨの変化傾向によりリアルタイムで糖代謝能を判定して菌種を同定できることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明によれば、１００重量部の炭素源に対し１重量部以下のアミノ酸を含む、細菌同定用培地組成物が提供される。好ましくは、１００重量部の炭素源に対して０．１重量部以上０．６重量部以下のアミノ酸を含有している。本組成物においては、前記炭素源は、グルコース、スクロース及びラクトースから選択されるいずれかであることが好ましい。また、本組成物は、前記炭素源による糖代謝能に基づく細菌同定用とすることができる。さらに、本組成物は、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能の判定のための成分を含有することができる。本組成物は、前記細菌同定用培地組成物中のｐＨ又はｐＨの変化の検出用とすることが好ましい。
【０００９】
本組成物は、前記炭素源を、５ｇ／ｌ以上２０ｇ／ｌ以下含有し、前記アミノ酸を０．００５ｇ／ｌ以上０．１２ｇ／ｌ以下含有することができる。また、前記アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン及びバリンからなる第１のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンからなる第２のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、システイン、ヒスチジン及びメチオニンからなる第３のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上とを含むことができる。
【００１０】
さらに、前記アミノ酸は、第１のアミノ酸群の全てのアミノ酸と、前記第２のアミノ酸群の全てのアミノ酸群と、前記第３のアミノ酸群の全てのアミノ酸とを含むことができる。
【００１１】
本組成物は、また、前記アミノ酸は、カザミノ酸を含むことができる。本組成物は、さらに、ビタミン及び／又はミネラルを含有することができる。
【００１２】
本組成物においては、前記細菌は病原性細菌であることが好ましく、前記細菌は、E.coli, E.cloacae, S.marcescens, P.mirabilis,P.vulgaris, K.pneumoniae, S.sonnci及び S.flexncriからなる群から選択されてもよい。
【００１３】
本発明によれば、細菌同定用培地組成物であって、同定対象細菌の糖代謝能、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上の代謝能の測定のための代謝成分を含有し、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化を抑制しない組成を有する、組成物が提供される。この組成物においては、アミノ酸を、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化に対する当該アミノ酸の緩衝作用を抑制可能な範囲（ｐＨの変化を抑制しない範囲）で含有していてもよい。また、前記アミノ酸を、前記同定対象細菌の測定しようとする代謝能による培養液の識別可能なｐＨの変化を５時間以内に検出できる程度の量含有することもできる。
【００１４】
本発明によれば、細菌同定用培地組成物のキットであって、上記いずれかに記載の細菌同定用培地組成物を１種類以上、好ましくは２種類以上含む、キットが提供される。
【００１５】
本発明によれば、細菌の同定方法であって、同定対象細菌を含む被験試料を準備する工程と、前記被験試料に対して、上記いずれかに記載の細菌同定用培地組成物を供給して培養する培養工程と、前記培養工程の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出工程と、を備える、同定方法が提供される。この方法において、前記培養工程は、５００μｌ以下の容積で実施することができる。また、前記培養工程は、一つの同定対象細菌に対して２種類以上の前記細菌同定用培地組成物を別個に供給して培養する工程とすることもできる。さらに、前記ｐＨ検出工程は、前記ｐＨ変化量を検出する工程としてもよい。
【００１６】
本発明によれば、細菌の同定装置であって、同定対象細菌を含む被験試料と請求項１〜１４のいずれかに記載の細菌同定用培地組成物とを含む培養液を培養キャビティと、前記培養キャビティ中の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出器と、を備える、装置が提供される。また、前記培養キャビティは１ｍｌ以下の培養液による培養用とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の細菌同定用培地組成物は、１００重量部の炭素源に対し１重量部以下のアミノ酸を含むことができる。本発明の培地組成物は、炭素源に対して上記のように少ないアミノ酸を含有することにより、細菌が利用可能な炭素源を含む本培地組成物を利用して培養したとき、炭素源の代謝により培養液のｐＨが培養開始から早期に変化する。このため、細菌の炭素源代謝能を迅速に判定することができる。アミノ酸が炭素源よりも相当程度少ないことにより、アミノ酸によるバッファーアクションが抑制されるために、微量な代謝活動をpHやpH変化量として検出することができるようになる。好ましくは、アミノ酸は、１００重量部の炭素源に対して０．１重量部以上である。アミノ酸が上記量未満であると、ｐＨが安定せず、逆に菌での代謝活動を、ｐＨの変動として検知することができにくくなるからである。また、本発明の培地組成物は、ｐＨを指標とすることができるため簡易に代謝能を判定できる。さらに、培養液のｐＨをリアルタイムでモニタリングすることによっても迅速な判定が可能となる。さらにまた、急速にｐＨが変化することでｐＨ変化量が大きくなるため、精度よく炭素源代謝能を判定することができる。したがって、本組成物によれば、細菌を迅速にかつ簡易に同定できる。
【００１８】
さらに、本組成物は、同定対象細菌のリジンの脱炭酸反応、尿素の代謝（分解）及びクエン酸の代謝（分解）のための代謝成分も含むよう構成することもできる。このため、本組成物は、こうした代謝能に基づいて細菌を同定することができる。なお、本組成物は、糖代謝能によらないで、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上によるｐＨ変化によって細菌を同定するよう組成することもできる。この場合には、炭素源に替えてこれらの代謝成分（リジン、尿素及びクエン酸）を組成物に含むことになる。
【００１９】
また、本発明の細菌同定用培地組成物を用いて微量の被験試料を５００μｌ以下レベルの小さいスケールで培養するときには、細菌による炭素源の代謝による結果が培養液に速やかに反映されるため、より迅速に炭素源代謝能を判定し、これにより細菌を迅速に同定できる。
【００２０】
本組成物は、特に、感染症に対する適切な薬剤を選択するのに都合がよい。培養開始から早期であっても的確な抗菌性物質の選択が可能な程度に菌種を同定できるからである。感染症患者に投与すべき抗菌性物質等は、一定の作用機作に基づく抗菌スペクトルを有している。したがって、菌種をおおよそ特定することで適切な抗菌性物質を選択して投与することができる。
【００２１】
本発明の細菌同定用培地組成物は、同定対象細菌の糖代謝能、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上の代謝能の測定のための代謝成分を含有し、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化を抑制しない組成を有する組成物とすることができる。培養液のｐＨ変化を抑制しない範囲、すなわち、バッファーアクションを奏しない組成とすることで、細菌の代謝活動を確実にｐＨ変化として把握することができる。また、細菌の代謝活動によるｐＨ変化を早期に検出し識別できるため、細菌の同定時間の短縮の要請に応じられる時間内でｐＨ変化を検出・識別できる。本組成物は、例えば、糖など代謝成分のみで構成されていてもよいし、アミノ酸などその他の成分を、細菌の代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化に対するその成分の緩衝作用を発揮しない範囲（ｐＨ変化を抑制しない範囲）で含んでいてもよい。こうしたアミノ酸量は、炭素源とアミノ酸とを各種濃度比で組み合わせた組成の培地を調製して実験することにより取得することができる。例えば、細菌同定のために許容される時間が５時間であれば、５時間以内にｐＨの変化が現われるように炭素源とアミノ酸との含有量を決定すればよい。また、この他、代謝能の測定に必要な成分も組成物に含めることができる。また、こうした代謝成分もｐＨのバッファーアクションを抑制できる範囲で添加されていることが好ましい。
【００２２】
本発明は、さらに本組成物を利用した細菌の同定方法及び同定装置等に関する。以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２３】
（細菌同定用培地組成物）
本発明の組成物は細菌の同定を対象とすることができる。同定対象細菌としては特に限定されないが、迅速診断等の要請を考慮すると病原性細菌とすることが好ましい。病原性細菌としては、食中毒を含む感染症の原因菌等が挙げられる。本発明は、病原性細菌のなかでも、E.coli, E.cloacae, S.marcescens, P.mirabilis,P.vulgaris, K.pneumoniae, S.sonnci及び S.flexneriを同定対象細菌とすることが好ましい。これらの細菌は、臨床上の要請が大きいとともに、本発明が意図する糖代謝能等による同定が容易であるからである。
【００２４】
本組成物は、上記のとおり、炭素源による糖代謝能に基づく細菌同定用とすることが好ましい。本組成物の有する組成は、細菌の糖代謝能の相違を培養早期においてｐＨの変化として顕在化させることができる。また、本組成物は、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能の判定のための成分を含有することができる。既に記載したように、本組成物は糖代謝能のほか、これらの代謝能による細菌の相違を顕在化させるのにも適している。したがって、本組成物は、これらの代謝能のいずれかに基づく細菌同定用として使用することもできる。
【００２５】
本組成物は、培養液中のｐＨ又はｐＨの変化を検出して細菌を同定するのに用いることができる。培養液中のｐＨ及びｐＨの変化は、各種のｐＨ測定法によって測定することができる。なお、ｐＨ測定法としては、指示薬法、金属電極法（水素電極法、キンヒドロン電極法、アンチモン電極法）、ガラス電極法、ケミカルＣＣＤ（Charge Coupled device）法等を用いることができる。なお、ケミカルＣＣＤ法は水素イオン濃度に応じて表面電位が変化する表面を有するＣＣＤセンサーを用い、当該表面電位の変化に基づく電子の蓄積量変化により水素イオン濃度を測定する方法である。これらの測定法のうち、一般的にはガラス電極法を用いることが好ましい。また、ケミカルＣＣＤ法は、特に、１ｍｌ以下、好ましくは５００μｌ以下の小スケールでの培養液ｐＨの測定に適している。
【００２６】
本組成物は、炭素源１００重量部に対してアミノ酸が１重量部以下であることが好ましい。アミノ酸が上記量以下であると、アミノ酸によるバッファーアクションが抑制されるために、微量な代謝活動をpHやpH変化量として検出することができるようになる。好ましくは、アミノ酸は、１００重量部の炭素源に対して０．１重量部以上である。アミノ酸が上記量未満であると、ｐＨが安定せず、逆に菌での代謝活動を、ｐＨの変動として検知することができにくくなるからである。また、アミノ酸は好ましくは同０．６重量部以下である。アミノ酸が同０．６重量部以下であると、培養開始から早期にpHが変化するため、迅速に細菌の代謝活動によるｐＨ及びｐＨ変化量に基づいて細菌を同定することができる。
【００２７】
また、炭素源は、５ｇ／ｌ以上２０ｇ／ｌ以下含有し、アミノ酸を０．００５ｇ／ｌ以上０．１２ｇ／ｌ以下含有することができる。この範囲であると、１０７〜１０１２CFU／ｍl程度の細胞を培養したとき、識別できるｐＨ変化を早期に得やすいからである。炭素源はより好ましくは、８ｇ／ｌ以上１２ｇ／ｌ以下であり、アミノ酸はより好ましくは、０．００８ｇ／ｌ以上０．０７２ｇ／ｌ以下である。
【００２８】
炭素源は、同定対象細菌を他の細菌と区別するために選択される。したがって、同定対象細菌の種類に応じて選択される。例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、ガラクトース等が挙げられる。病原性細菌には、グルコース、スクロース及びラクトースから選択されることが好ましい。本組成物は、炭素源を１種類のみ含有することが好ましい。特定の炭素源についての代謝能の有無が細菌の同定に有効だからである。なお、一つの同定対象細菌について、複数種類の糖に対する代謝能に基づいて菌を同定することが好ましい。したがって、細菌の同定には、２種類以上の本組成物を用いることが好ましい。
【００２９】
アミノ酸は、アラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等から選択することができる。好ましくは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン及びバリンからなる第１のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンからなる第２のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、システイン、ヒスチジン及びメチオニンからなる第３のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上とを含むことが好ましい。これら３種類の群のそれぞれのアミノ酸を含有することで、本組成物に含まれるアミノ酸の種類により細菌の糖代謝能が影響されることが抑制又は回避される。好ましくは、これら３群の全てのアミノ酸を含有する。
【００３０】
第１のアミノ酸群の各アミノ酸の濃度、第２のアミノ酸群の各アミノ酸の濃度及び第３のアミノ酸群の各アミノ酸の濃度は、組成物の一定体積あたりにおいて重量比で約２：約１：約０．５であることが好ましい。
【００３１】
第１のアミノ酸群のアミノ酸は、それぞれ４００μｇ／ｌ以上９０００μｇ／ｌ以下含有することが好ましく、第２のアミノ酸群のアミノ酸は、それぞれ２００μｇ／ｌ以上４５０μｇ／ｌ以下含有し、第３のアミノ酸群のアミノ酸は、それぞれ１００μｇ／ｌ以上２２５μｇ／ｌ以下含有することが好ましい。この範囲で各アミノ酸を含有すると、菌の代謝活動に必要な量を含んでいるだけでなく、バッファーアクション（緩衝作用）を抑制して、安定した菌の代謝活動の測定が可能となる。
【００３２】
また、アミノ酸としては、カザミノ酸を含むことができる。カザミノ酸は、カゼインが加水分解されたアミノ酸混合物であり、各種アミノ酸を本発明において好ましい組成で含んでいる。したがって、他の各種の単体のアミノ酸と併用せずに、アミノ酸としてカザミノ酸を単独で用いることができる。菌種によっては、カザミノ酸を用いることで糖代謝能に相違が出やすくなる場合がある。
【００３３】
本組成物は、炭素源とアミノ酸のほか、ビタミンを含有していてもよい。ビタミンとしては、細菌用培地に含まれる一般的なものから適宜選択すればよい。例えば、チアミン、チミジン、リボフラビン、パントテン酸、ニコチン酸、イノシトール、コリン、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキシン、ビオチン、葉酸等から適宜選択することができる。本組成物は好ましくは、２種類以上のビタミンを含有する。ビタミンの含有量は特に限定されないが、例えば、チアミン、チミジン、リボフラビン、パントテン酸、ニコチン酸、イノシトール、コリン、ｐ−アミノ安息香酸及びピリドキシンについては、それぞれ５μｇ／ｌ以上２０μｇ／ｌ以下とすることが好ましい。また、ビオチン及び葉酸については、０．５μｇ／ｌ以上２μｇ／ｌ以下とすることが好ましい。
【００３４】
本組成物は、ミネラルを含むことができる。ミネラルとしては、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、マンガン、鉄、亜鉛、コバルト及び銅などが挙げられる。好ましくは、少なくともマグネシウム及びカリウムを塩基として含む塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩又は硝酸塩等の形態で含有する。ミネラルの含有量は特に限定されないが、例えば、ＭｇＣｌ2については０．０１ｇ／ｌ程度、ＫＣｌについては、０．５ｇ／ｌ程度、Ｋ2ＨＰＯ4については０．０５ｇ／ｌ程度とすることができる。
【００３５】
本組成物のｐＨは、同定対象細菌の種類に応じて適宜調整される。通常は、ｐＨ６．８以上７．４以下程度に調整される。なお、本発明の組成物は、液体で使用するものであるため、液体組成物とすることができるほか、こうした組成を用時溶解により得ることができる用時溶解性の固形組成物（粉末であってもよいし、タブレット等であってもよい）とすることができる。また、用時希釈によりこうした組成を得ることができる高濃度液とすることもできる。さらに、こうした組成を得ることができる液体及び／又は固体（粉末）のキットとすることもできる。
【００３６】
また、本組成物は、上記組成に限定されることなく、同定対象細菌の糖代謝能、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上の代謝能の測定のための代謝成分を含有し、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化を抑制しない組成を有することができる。したがって、こうした代謝成分のみを含むことができるほか、前記代謝能の発揮による培養液ｐＨの変化を抑制しない範囲、換言すれば、培養液のｐＨの変化に対する添加成分（アミノ酸やビタミンなど代謝成分以外）の緩衝作用を抑制可能な範囲で、アミノ酸やビタミン等の成分を含むことができる。アミノ酸は、同定対象細菌の測定しようとする代謝能による培養液の識別可能なｐＨの変化を５時間以内に検出できる程度の量含有するようにすることが好ましい。より好ましくは４時間以内にｐＨ変化を検出できるのがよく、より好ましくは３時間以内にｐＨ変化を検出できるのがよい。
【００３７】
（細菌同定用培地組成物のキット）
本発明のキットは、本組成物を１種類以上、好ましくは２種類以上含むキットとすることができる。被験試料中の細菌の菌種を同定するには、２種類以上の糖代謝能に基づくことが好ましいからである。被験試料において、複数の同定対象細菌が含まれる可能性があるのが通常であるからである。本キットは、炭素源としてグルコースを含む本組成物、ラクトースを含む本組成物、スクロースを含む本組成物から選択される２種類あるいは全種類を含むことが好ましい。さらに、本キットは、培養に適したウェル容器あるいは複数個のウェルを有する固相担体を備えることもできる。
【００３８】
（細菌同定方法）
本発明の細菌の同定方法は、同定対象細菌を含む可能性のある被験試料を準備する工程と、前記被験試料と本組成物とを混合して培養する培養工程と、前記培養工程の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出工程と、を備えることができる。
【００３９】
本組成物の調製方法については特に限定しない。アミノ酸及びビタミンについては、それぞれ高濃度の原液を予め調製しておき、適宜希釈して用いることが好ましい。
【００４０】
培養工程は、細菌一般の培養条件を採用することができる。適宜、同定対象細菌の種類に応じて、酸素要求性、温度、ｐＨ等を調整することができる。一般的には、温度は、３０℃〜４０℃程度とし、ｐＨ６．８以上７．４以下程度とし、培養は、酸素要求性等に応じて静地培養、振とう培養、回転培養、静地培養下での酸素供給法などから適宜選択することができる。培養液における菌濃度は、１０７CFU／ｍl以上１０１２CFU／ｍl以下とすることができる。この範囲であると、迅速なｐＨ低下を期待することができる。より好ましくは、１０９CFU／ｍl以上１０１1CFU／ｍl以下とすることができる。ただし、被験試料中の菌濃度を予め取得するのが困難な場合には、食品や患者等から採取した検体を複数段階に希釈したものを被験試料として用いることができる。
【００４１】
培養スケールは、通常は固形培地を用い、その量を液体として換算すると約２０ｍｌ程度とすることができるが、本発明では、１ｍｌ以下程度（好ましくは５００μｌ以下、より好ましくは３００μｌ以下、一層好ましくは２００μｌ以下である。）の液体培地による小スケールとすることもできる。このような小スケール下では、被験試料も微量ですみ、また、培養液が小容量であるため細菌の糖代謝の結果が培養液に速やかに反映されるため、より迅速に糖代謝能の有無の判定及び菌種の同定が可能となる。こうした小スケールでの培養のためのキャビティの形成には、例えば、マイクロマシンやMEMS（micro Electro Mechanical System）の製作技術を適用することができる。また、各種のエッチング技術、リソグラフィ技術、接合技術、成膜技術、レーザ等による精密微細加工技術、超音波技術等を適宜組み合わせて用いることができる。さらに、マイクロ塑性加工技術、マイクロ射出成形技術、マイクロ光造形技術などのマイクロ成形技術を用いることもできる。なお、用いる成形・加工技術に応じて、被加工体である固相基材を適宜選択することができる。
【００４２】
ｐＨ検出工程は、培養液のｐＨを測定する。ｐＨ測定法としては、既に説明したように、指示薬法、金属電極法（水素電極法、キンヒドロン電極法、アンチモン電極法）、ガラス電極法、ケミカルＣＣＤ法等を用いることができる。一般には、ガラス電極法を用い、小スケールでは、ケミカルＣＣＤ法を用いることが好ましい。
【００４３】
ｐＨ検出工程におけるｐＨ検出は、培養開始から連続的に行うこともできるが、一定期間毎に断続的に行うこともできるし、特定した時間経過後においてのみ行うこともできる。ｐＨ検出のタイミング等は、必要に応じ選択することができるが、時間当たりのｐＨ変化量を検出する場合には、継続的又は断続的にｐＨを測定することが好ましい。
【００４４】
ｐＨ検出工程で検出したｐＨ又はｐＨ変化量に基づいて、被験試料中の細菌の菌種を同定することができる。すなわち、被験試料中の細菌が同定対象細菌であるかどうかを判定できる。判定の基礎は、あるタイミングにおけるｐＨであってもよいし、時間当たりのｐＨ変化量であってもよい。特に、迅速診断の要請に応えるためには、培養早期の比較的ｐＨ変化の大きい時期におけるｐＨ変化量を判定基礎とすることが好ましい。なお、菌種及び同定に用いる代謝能の種類によっては、培養後期において大きくｐＨが変化する場合もありうる。
【００４５】
また、判定にあたっては、同定対象細菌（コントロール）について被験試料中の細菌の同定に用いたのと同じ組成の本組成物による培養を実施して得られたｐＨ傾向に関するｐＨ情報に基づくことができる。こうしたｐＨ情報は、予め取得しておいてもよいし、さらにデータベース化しておいてもよい。また、被験試料と同時にコントロールについても培養を実施してもよい。
【００４６】
（細菌同定装置）
本発明の細菌の同定装置は、同定対象細菌を含む可能性のある被験試料と本組成物とを含む培養液を培養キャビティと、前記培養キャビティ中の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出器と、を備えることができる。培養キャビティは、通常のチューブ状であってもよいし、ガラス又はプラスチックプレート上に成形あるいはエッチング等の加工をすることにより形成されたウェルであってもよいし、ガラスやＰＰなどのプラスチック製の固相担体にウェルを区画する壁体となる部材を接着して形成した凹部であってもよい。本同定装置は、こうした培養キャビティ、好ましくは複数個の培養キャビティを、着脱可能なモジュールとして備えることができる。培養キャビティは、１ｍｌ以下の培養液による培養用であることが好ましい。より好ましくは、５００μｌ以下の培養液による培養用である。こうした容積範囲の培養液による培養用のキャビティを備えることで、より迅速な同定を容易に行えるようになる。さらに好ましくは３００μｌ以下、一層好ましくは２００μｌ以下である。
【００４７】
本同定装置は、こうした培養キャビティに本組成物を供給する培地供給装置を備えることもできる。このような培地供給装置を備えることで、容易に本組成物と被験試料とを混合して培養を開始することができる。培地供給装置は、個々の培養キャビティに培地を供給可能にＸ−Ｙプロッタ等による可動性を備えていることが好ましい。あるいは、培養キャビティ側にＸ−Ｙプロッタにより可動性を備えるようにしてもよい。
【００４８】
ｐＨ検出器としては、上記した各種ｐＨ測定方法に基づく検出装置を備えることができる。なお、指示薬法の場合には、少なくとも比色計を備えることができる。
【実施例１】
【００４９】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
（培地の調製１）
細菌の同定に適した培地の調製について説明する。
＜アミノ酸＞
まず下記表に示す各アミノ酸のストック液 (10 mg/ml)を調製し、使用時に１０倍希釈して1ｍｇ／ｍｌの希釈液を調製する。この各希釈液を培地100mlあたり下記含量となるよう、カッコ内の体積を蒸留水に加えた。
【００５１】
第１群(200 μl)
Alanine 200 μg
Arginine 200 μg
Aspartic acid 200 μg
Glutamic acid 200 μg
Glycine 200 g
Isoleucine 200 μg
Leucine 200 μg
Lysine 200 μg
Valine 200 μg
第２群(１00 l)
Phenylalanine 100 μg
Proline 100 μg
Serine 100 μg
Threonine 100 μg
Tryptophan 100 μg
Tyrosine 100 μg
第３群(50 l)
Cystine 50 μg
Histidine 50 μg
Methionine 50 μg
【００５２】
＜ビタミン＞
ビタミンについては、各ビタミンのストック液 (10 mg/ml)を調製し（銀紙で包んで冷暗所保存、２週間以後は使用不可とする）、これを１０００倍希釈して各希釈液を調製する。この各希釈液を培地100mlあたり下記含量となるようカッコ内の体積を蒸留水に加えた。
＜Aグループ（100μl）＞
Thiamine 1 μｇ
Thymidine 1 μｇ
Riboflavin 1 μｇ
pantothenic acid 1 μｇ
nicotinic acid 1 μｇ
inositol 1 μｇ
choline-Cl 1 μｇ
PABA 1 μｇ
Pyridoxine 1 μｇ
＜Bグループ（10μl）＞
biotin 0.1 μｇ
folic acid 0.1 μｇ
【００５３】
さらに、上記培地には、MgCl20.001%, KCl 0.05%, K2HPO40.005%を含有するように、これらのストック液を添加した。こうして調製した培地は、蒸留水で１００ｍｌとし、オートクレーブで滅菌した。この培地は、後段の実施例で示すように、最終的に、各種炭素源が１０ｇ／ｌとなるように添加して使用された。
【００５４】
なお、上記培地を１倍濃度の培地として、上記各希釈液の添加量を半減させた１／２培濃度の培地と、上記各希釈液の添加量を倍増させた２倍濃度の培地とをそれぞれ調製した。
【実施例２】
【００５５】
E.coli 臨床株３、E.cloacae 臨床株１、P.mirabilis 臨床株１、P.vulgaris 臨床株１及びS.sonnei 臨床株１につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した１倍濃度の培地（炭素源添加前）に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表１及び図１に示す。なお、E.coli はグルコース及びラクトース代謝能を有し、E.cloacaeはグルコース代謝能を有するがラクトース代謝能は変動的であり、P.mirabilis、P.vulgaris及びS.sonneiはグルコース代謝能を有しラクトース代謝能を有さない。
【００５６】
【表１】
【００５７】
表１及び図１に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例３】
【００５８】
実施例２で用いたのと同一のE.coli 臨床株３、E.cloacae 臨床株１、P.mirabilis 臨床株１、P.vulgaris 臨床株１及びS.sonnei 臨床株１につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した１倍濃度の培地（炭素源添加前）に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、ラクトースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表２及び図２に示す。
【表２】
【００５９】
表２及び図２に示すように、培養開始後４０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例４】
【００６０】
実施例２で用いたのと同一の臨床株群につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）を１／２倍濃度の培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表３及び図３に示す。
【表３】
【００６１】
表３及び図３に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例５】
【００６２】
実施例２で用いたのと同一の臨床株群につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）を１／２倍濃度の培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、ラクトースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表４及び図４に示す。
【表４】
【００６３】
表４及び図４に示すように、培養開始後４０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例６】
【００６４】
実施例２で用いたのと同一の臨床株群につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）の２倍濃度の培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐHメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表５及び図５に示す。
【表５】
【００６５】
表５及び図５に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例７】
【００６６】
実施例２で用いたのと同一の臨床株群につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）の２倍濃度の培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表６及び図６に示す。
【表６】
【００６７】
表６及び図６に示すように、培養開始後４０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例８】
【００６８】
（培地の調製２）
細菌の同定に適した他の培地の調製について説明する。本実施例では、アミノ酸としてカザミノ酸を用いて、０．０２ｇ／ｌ及び０．０５ｇ／ｌとなるようにそれぞれ調製し、さらに、これらの各液にMgCl2 0.001%, KCl 0.05%, K2HPO40.005%を含有するように調製し、蒸留水を加えて最終濃度としたのち、オートクレーブで滅菌した。これらの培地は、それぞれ後段の実施例で示すように、最終的に、各種炭素源が１０ｇ／ｌとなるように添加して使用された。
【実施例９】
【００６９】
E.coli 臨床株３、E.cloacae 臨床株１、P.mirabilis 臨床株１、P.vulgaris 臨床株１及びS.sonnei 臨床株１につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製したカザミノ酸０．０２ｇ／ｌの培地（炭素源添加前）に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表７及び図７に示す。
【００７０】
【表７】
【００７１】
表７及び図７に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例１０】
【００７２】
実施例９で用いたのと同一のE.coli 臨床株３、E.cloacae 臨床株１、P.mirabilis 臨床株１、P.vulgaris 臨床株１、及びS.sonnei 臨床株１につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製したカザミノ酸０．０２ｇ／ｌの培地（炭素源添加前）に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、ラクトースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表８及び図８に示す。
【表８】
【００７３】
表８及び図８に示すように、培養開始後６０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例１１】
【００７４】
実施例９で用いたのと同一の臨床株及びS.marcesence臨床株２につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）をカザミノ酸０．０５ｇ／ｌの培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてグルコースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、グルコースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表９及び図９に示す。
【表９】
【００７５】
表９及び図９に示すように、培養開始後４０分以内、特に２０分以内に急激に培養液ｐＨが低下した。用いた臨床株の菌種は、いずれもグルコース代謝性を有していることが本実施例でも確認できた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【実施例１２】
【００７６】
実施例２で用いたのと同一の臨床株及びS.marcesence臨床株２につき、ＬＢ寒天培地で一晩培養した１コロニーをＬＢ培地２ｍｌに溶かし、振とう培養で１８時間培養した。この菌液を遠心して、菌を採取し、１ｍｌの実施例１で調製した培地（炭素源添加前）をカザミノ酸０．０５ｇ／ｌの培地に懸濁して１０１０CFU/mlの菌液とした。この菌液に１０ｇ／ｌとなるよう炭素源としてラクトースを加え、ｐＨを７．５とし、３７℃で振とう培養しながら、ラクトースを加えた直後、20分後、40分後、1時間後、2時間後、3時間後にｐＨメータ（ガラス電極製）で測定した。結果を表１０及び図１０に示す。
【表１０】
【００７７】
表１０及び図１０に示すように、培養開始後４０分以内に一部の菌についてｐＨが低下した。ｐＨが低下した菌は、いずれもラクトース代謝性であり、ｐＨが維持された菌はラクトース非代謝性であった。したがって、本実施例により、用いた臨床株の菌種のラクトース代謝能を適切に確認することができた。また、菌株間において大きな差は認められなかった。
【００７８】
以上のことから、特定培地により極めて短時間で細菌の糖代謝能プロファイリングが可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】実施例２での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図２】実施例３での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図３】実施例４での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図４】実施例５での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図５】実施例６での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図６】実施例７での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図７】実施例９での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図８】実施例１０での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図９】実施例１１での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【図１０】実施例１２での培養液ｐＨの時間経過を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００重量部の炭素源に対し１重量部以下のアミノ酸を含む、細菌同定用培地組成物。
【請求項２】
１００重量部の炭素源に対し０．１重量部以上０．６重量部以下のアミノ酸を含む、請求項１に記載の細菌同定用培地組成物。
【請求項３】
前記炭素源は、グルコース、スクロース及びラクトースから選択されるいずれかである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記炭素源による糖代謝能に基づく細菌同定用である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能の判定のための成分を含有する、請求項1又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記細菌同定用培地組成物中のｐＨ又はｐＨの変化を検出するための請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記炭素源を、５ｇ／ｌ以上２０ｇ／ｌ以下含有し、前記アミノ酸を０．００５ｇ／ｌ以上０．１２ｇ／ｌ以下含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記アミノ酸は、
アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン及びバリンからなる第１のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、
フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンからなる第２のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、
システイン、ヒスチジン及びメチオニンからなる第３のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と
を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記第１のアミノ酸群、第２のアミノ酸群及び第３のアミノ酸群を全て含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アミノ酸は、第１のアミノ酸群の全てのアミノ酸と、前記第２のアミノ酸群の全てのアミノ酸群と、前記第３のアミノ酸群の全てのアミノ酸とを含む、請求項７〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記アミノ酸は、カザミノ酸を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
ビタミン及び／又はミネラルを含有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記細菌は、病原性細菌である、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記細菌は、E.coli, E.cloacae, S.marcescens, P.mirabilis, P.vulgaris, K.pneumoniae, S.sonnci及び S.flexncriからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
細菌同定用培地組成物であって、
同定対象細菌の糖代謝能、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上の代謝能の測定のための代謝成分を含有し、
前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化を抑制しない組成を有する、組成物。
【請求項１６】
アミノ酸を、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化に対する当該アミノ酸の緩衝作用を抑制可能な範囲で含有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アミノ酸を、前記同定対象細菌の測定しようとする代謝能による培養液の識別可能なｐＨの変化を５時間以内に検出できる程度の量含有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
細菌同定用培地組成物のキットであって、
請求項１〜１７のいずれかに記載の細菌同定用培地組成物を含む、キット。
【請求項１９】
細菌の同定方法であって、
同定対象細菌を含む被験試料を準備する工程と、
前記被験試料と請求項１〜１７のいずれかに記載の細菌同定用培地組成物とを混合して、前記同定対象細菌を培養する培養工程と、
前記培養工程の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出工程と、
を備える、同定方法。
【請求項２０】
前記培養工程は、１ｍｌ以下の容積で実施する、請求項１９の記載の同定方法。
【請求項２１】
前記培養工程は、一つの同定対象細菌に対して２種類以上の前記細菌同定用培地組成物を別個に供給して培養する工程である、請求項１９又は２０に記載の同定方法。
【請求項２２】
前記ｐＨ検出工程は、前記ｐＨ変化量を検出する工程である、請求項１９〜２１に記載の同定方法。
【請求項２３】
細菌の同定装置であって、
同定対象細菌を含む被験試料と請求項１〜１７のいずれかに記載の細菌同定用培地組成物とを含む培養液を培養キャビティと、
前記培養キャビティ中の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出器と、
を備える、装置。
【請求項２４】
前記培養キャビティは５００μｌ以下の培養液による培養用である、請求項２３に記載の装置。
【請求項１】
１００重量部の炭素源に対し１重量部以下のアミノ酸を含む、細菌同定用培地組成物。
【請求項２】
１００重量部の炭素源に対し０．１重量部以上０．６重量部以下のアミノ酸を含む、請求項１に記載の細菌同定用培地組成物。
【請求項３】
前記炭素源は、グルコース、スクロース及びラクトースから選択されるいずれかである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記炭素源による糖代謝能に基づく細菌同定用である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能の判定のための成分を含有する、請求項1又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記細菌同定用培地組成物中のｐＨ又はｐＨの変化を検出するための請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記炭素源を、５ｇ／ｌ以上２０ｇ／ｌ以下含有し、前記アミノ酸を０．００５ｇ／ｌ以上０．１２ｇ／ｌ以下含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記アミノ酸は、
アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン及びバリンからなる第１のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、
フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンからなる第２のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と、
システイン、ヒスチジン及びメチオニンからなる第３のアミノ酸群から選択される１種又は２種以上と
を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記第１のアミノ酸群、第２のアミノ酸群及び第３のアミノ酸群を全て含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アミノ酸は、第１のアミノ酸群の全てのアミノ酸と、前記第２のアミノ酸群の全てのアミノ酸群と、前記第３のアミノ酸群の全てのアミノ酸とを含む、請求項７〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記アミノ酸は、カザミノ酸を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
ビタミン及び／又はミネラルを含有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記細菌は、病原性細菌である、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記細菌は、E.coli, E.cloacae, S.marcescens, P.mirabilis, P.vulgaris, K.pneumoniae, S.sonnci及び S.flexncriからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
細菌同定用培地組成物であって、
同定対象細菌の糖代謝能、リジン脱炭酸能、尿素分解能及びクエン酸分解能から選択される１種又は２種以上の代謝能の測定のための代謝成分を含有し、
前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化を抑制しない組成を有する、組成物。
【請求項１６】
アミノ酸を、前記代謝能の発揮による培養液のｐＨの変化に対する当該アミノ酸の緩衝作用を抑制可能な範囲で含有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アミノ酸を、前記同定対象細菌の測定しようとする代謝能による培養液の識別可能なｐＨの変化を５時間以内に検出できる程度の量含有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
細菌同定用培地組成物のキットであって、
請求項１〜１７のいずれかに記載の細菌同定用培地組成物を含む、キット。
【請求項１９】
細菌の同定方法であって、
同定対象細菌を含む被験試料を準備する工程と、
前記被験試料と請求項１〜１７のいずれかに記載の細菌同定用培地組成物とを混合して、前記同定対象細菌を培養する培養工程と、
前記培養工程の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出工程と、
を備える、同定方法。
【請求項２０】
前記培養工程は、１ｍｌ以下の容積で実施する、請求項１９の記載の同定方法。
【請求項２１】
前記培養工程は、一つの同定対象細菌に対して２種類以上の前記細菌同定用培地組成物を別個に供給して培養する工程である、請求項１９又は２０に記載の同定方法。
【請求項２２】
前記ｐＨ検出工程は、前記ｐＨ変化量を検出する工程である、請求項１９〜２１に記載の同定方法。
【請求項２３】
細菌の同定装置であって、
同定対象細菌を含む被験試料と請求項１〜１７のいずれかに記載の細菌同定用培地組成物とを含む培養液を培養キャビティと、
前記培養キャビティ中の培養液のｐＨを検出するｐＨ検出器と、
を備える、装置。
【請求項２４】
前記培養キャビティは５００μｌ以下の培養液による培養用である、請求項２３に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−８６２４０（Ｐ２００８−８６２４０Ａ）
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２６９９１６（Ｐ２００６−２６９９１６）
【出願日】平成１８年９月２９日（２００６．９．２９）
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２９日（２００６．９．２９）
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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