細菌細胞壁骨格成分製剤
新規な細菌細胞壁骨格成分製剤、および細菌の細胞壁骨格成分の分析方法の提供。細菌細胞壁骨格成分（細菌−ＣＷＳ）および油からなるペーストであり、０．２〜０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する細菌−ＣＷＳ含有ペースト、該ペーストを含有するエマルジョン、および凍結乾燥製剤を提供することが可能となった。また、細菌細胞壁骨格成分に含まれる高級脂肪酸またはその誘導体を分析することによって、細菌の細胞壁骨格成分を有効成分として含有する医薬組成物およびその製造中間体の品質を評価し、力価を検定し、有効成分を同定することが可能となった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、細菌の細胞壁骨格成分（細菌−ＣＷＳ）を有効成分として含有する凍結乾燥製剤、該凍結乾燥製剤の製造中間体および該凍結乾燥製剤、該製造中間体の調製方法、ならびにミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬品の分析方法等に関する。
【背景技術】
微生物死菌、細菌の細胞壁骨格成分（以下細菌−ＣＷＳと略する）は、免疫賦活作用を有し、例えば動物モデルを用いた実験的腫瘍系、およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている。
細胞壁骨格成分を油成分中に分散、乳化させ、水中油型エマルジョン製剤として投与した場合、免疫賦活作用による抗腫瘍効果などが著しく高まることが知られている。例えばウシ型結核菌の細胞壁骨格成分（以下、ＢＣＧ−ＣＷＳと略す）の水中油型エマルジョンを用いた癌免疫療法では、ヒトの癌治療において優れた成績が得られたことが報告されている（Ｐｒｏ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，７０，Ｓｅｒ．Ｂ ２０５−２０９（１９９４）、Ｐｒｏ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，７４，Ｓｅｒ．Ｂ ２０５５０−５５（１９９８））。この水中油型エマルジョン製剤は、細菌−ＣＷＳを油中に分散したペースト状の原体に、界面活性剤を含む水を加えてエマルジョン化する等して調製することができる（Ｊ．Ｎａｔ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．４８，８３１−８３５（１９７２）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，９２，８６９−８７９（１９６６）、Ｇａｎｎ，６９，６１９−６２６（１９７８））。
一般に、細菌−ＣＷＳを含有する水中油型エマルジョン製剤は非常に不安定であり、数日で不溶性凝集物が生成する。その傾向は油成分の量が少ない場合、特に顕著である。一方、油成分の多い水中油型エマルジョン製剤は、投与された生体への負担が大きく、副作用をもたらす可能性がある。そのため、現在、臨床現場では、使用時に必要な量の水中油型エマルジョン製剤を手作業にて用時調製している。しかし、手作業による用時調製では、常に一定規格を有する製剤を調製することは困難である。よって、水中油型エマルジョン製剤を凍結乾燥して保存安定性の高い凍結乾燥製剤とし、使用時に注射用蒸留水等の水性溶媒を加えて水中油型エマルジョン製剤を再懸濁させる方法が、臨床現場での使い易さ、製剤の保存安定性の点から好ましい。このように、事実上医薬品として実用化できる、恒常的生産が可能な、安定な水中油型エマルジョン製剤やその凍結乾燥製剤が求められている。
一方、細菌−ＣＷＳを有効成分とする製剤が調製できたとしても、医薬品として上市するには、その生物学的力価を評価し、有効成分の同一性を確認しなければならない。通常、化学物質を有効成分とする医薬品は有効成分が化学分析により測定できるため、その同一性や含量を評価できる。
しかしながら、細菌−ＣＷＳはミコール酸等の高級脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンからなる３層構造を有する生体高分子であり、水や有機溶媒に不溶であるため、化学物質を測定するために通常用いられるＨＰＬＣ、ＧＣ等の分析方法では測定することができない。
細菌は、属、種および株によって構成成分が異なるが、結核菌、ＢＣＧ菌等のミコバクテリウム属細菌の同定方法として、遺伝子解析による方法のほか、ミコバクテリウム属細菌等に特徴的に存在するミコール酸を分析する方法が知られている。すなわち、ミコバクテリウム属細菌等をアルカリ加水分解した後、有機溶媒でミコール酸を抽出し、これをＨＰＬＣで分析することにより、その溶出パターンから、属、種の同定が可能であることが報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３２７−１３３０，Ｍａｙ １９９２）。
しかし、細菌−ＣＷＳ中のミコール酸を正確に定量する方法は知られていない。
【発明の開示】
本発明の課題は、細菌の細胞壁骨格成分を有効成分とする、安定で凍結乾燥可能な水中油型エマルジョン、本発明の水中油型エマルジョンの凍結乾燥製剤、本発明製剤の原料である細菌−ＣＷＳやその製造中間体に当たる細菌−ＣＷＳ含有ペースト、これらの調製方法、および本発明製剤中の有効成分を同定しその力価を定量的に測定する方法、有効成分として用いられる細菌−ＣＷＳの由来細菌の属、種および株を同定する方法、ならびに本発明の製剤およびその製造中間体が標準品と同一であることを検定する方法を提供することにある。
本発明者らは、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する安定性に富む水中油型エマルジョン、および凍結乾燥製剤を得るべく、細菌−ＣＷＳ、油、界面活性剤、および安定化剤等の組成、および調製工程について、鋭意検討を行った。まず、安定な水中油型エマルジョンおよび、優れた再懸濁安定性を有するエマルジョンの凍結乾燥製剤を良好に調製するには、製造中間体となる細胞壁骨格成分および油からなるペーストの性状が重要であると考えた。そこで、油の種類、油の組成、および油と細胞壁骨格成分の比率等を指標として、詳細に検討を進めたところ、安定な水中油型エマルジョンの性状を左右する大きなファクターは、細菌−ＣＷＳと油からなる細胞壁骨格成分含有ペーストの粘度であることを見出した。また、良好な粘度を得るための、細胞壁骨格成分と油の比率を明らかにした。
すなわち、細菌−ＣＷＳは、水、油のいずれにも溶解しないため、均一な粒度分布を有するエマルジョンとするのが困難である。特に、油の粘度が高い場合および油の量が少ない場合、混合攪拌時に均一に細菌−ＣＷＳを油中に拡散させることができないことがわかった。種々の油を用いて検討したところ、油の種類によらず、ある一定の粘度以下で、エマルジョン化に適した細菌−ＣＷＳ含有ペーストが得られることがわかった。具体的には粘度約０．７ｐｏｉｓｅ以下の細菌−ＣＷＳ含有ペーストを用いて乳化工程を行えば、良好な粒度分布を示すエマルジョンが得られることがわかった。
一方で、細菌−ＣＷＳに対する油の割合が高く、低い粘度を有する細菌−ＣＷＳ含有ペーストを用いた場合、問題なくエマルジョンを得ることができるものの、凍結乾燥後に水を加えて再懸濁した場合、好適な粒度分布のエマルジョンが再現できないことも判明した。鋭意検討した結果、粘度約０．２ｐｏｉｓｅ以上の細菌−ＣＷＳ含有ペーストであれば、凍結乾燥後の再懸濁安定性も維持できることがわかった。
また、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する凍結乾燥製剤においては、上記細菌−ＣＷＳ含有ペーストの性状の他、界面活性剤および安定化剤によって、その安定性、および再懸濁した後に得られる水中油型製剤の安定性（再懸濁安定性）等の製剤品の品質は異なる。
上記国際公開パンフレットＷＯ００／３７２４には、グリシンを安定化剤として用いる方法が知られているが、安定な凍結乾燥製剤を得るためには、約９００ｍＭ〜１２００ｍＭ（約６．９％〜９．２％）のグリシンが必要であることが記載されている。しかし、グリシンの場合３００ｍＭ（２．３％）が生体にとって等張濃度であるため、このような高濃度では生体への負担が懸念される。
そこで、鋭意検討した結果、安定化剤としてマンニトールを用いることにより、再懸濁安定性に富む凍結乾燥製剤を調製できることがわかった。
本発明者は鋭意検討した結果、前記本発明の細菌−ＣＷＳ含有ペーストの水中油型エマルジョンにおいて、１〜１０％、好ましくは１〜５％のマンニトールを安定化剤として用いることによって、凍結乾燥製剤の安定性、および再懸濁した後の水中油型エマルジョンの安定性が高まることがわかった。
さらに、発明者は、該細菌−ＣＷＳ含有ペーストの調製工程について検討した。
既に、細菌−ＣＷＳと油を混合する際、有機溶媒で一旦希釈して攪拌した後、溶媒を留去する方法が、前記国際公開パンフレットＷＯ００／３７２４に記載されている。
発明者らは、種々の有機溶媒を分散補助溶媒として用いて鋭意検討を行ったところ、非極性溶媒を用いることによって、極性溶媒のみを用いた場合よりも優れた細菌細胞壁骨格成分含有ペーストが得られることを見出した。
本発明は、上記の知見に基づき、完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、
［１］細菌−ＣＷＳおよび油からなる細菌−ＣＷＳ含有ペーストであり、０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）以下の粘度を有するペースト、
［２］０．２〜０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する［１］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［３］０．２８〜０．５５ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する［１］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［４］細菌−ＣＷＳの粒子径が、０．１５μｍ〜６μｍであることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［５］細菌−ＣＷＳの粒子径において、Ｄ１０％：０．３８μｍ以上、Ｄ９０％：０．７０μｍ以下であることを特徴とする［４］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［６］細菌−ＣＷＳがＢＣＧ−ＣＷＳである、［１］〜［５］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［７］油が、スクワラン、スクワレン、シンセラン４、落花生油、ツバキ油、大豆油、流動パラフィン、およびオレイン酸エチルの中から選ばれる１または複数の油の混合物である、［１］〜［６］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［８］油が、スクワラン、スクワレン、大豆油、流動パラフィンおよびオレイン酸エチルの中から選ばれる２種類の油の混合物である、［７］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［９］油が、大豆油、流動パラフィンおよびオレイン酸エチルの中から選ばれる１種の油とスクワランとの混合物である、［８］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［１０］油が、オレイン酸エチルとスクワランとの１：１の混合物である、［９］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［１１］油が、スクワランである、［７］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［１２］細菌−ＣＷＳがＢＣＧ−ＣＷＳであって、ＢＣＧ−ＣＷＳ約０．６７ｇに対して、スクワラン６．６ｇ〜３５．２ｇを含有することを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［１３］以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする、細菌−ＣＷＳ含有ペーストの調製方法、
（１）細菌−ＣＷＳおよび油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合する工程、
（２）（１）の有機溶媒を留去する工程、
［１４］有機溶媒がエーテル系溶媒である、［１３］記載の調製方法、
［１５］ 有機溶媒が炭化水素系溶媒、またはハロゲン化炭化水素系溶媒である、［１３］記載の調製方法、
［１６］ 有機溶媒がハロゲン化炭化水素系溶媒であって、該ハロゲン化炭化水素系溶媒が、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、またはジクロロエタンである、［１５］記載の調製方法、
［１７］ 有機溶媒が炭化水素系溶媒であって、該炭化水素系溶媒が、ヘプタン、またはヘキサンである、［１５］記載の調製方法、
［１８］ 有機溶媒が、５〜２０％（Ｖ／Ｖ）のアルコール系溶媒を含むことを特徴とする、［１５］〜［１７］のいずれか記載の調製方法、
［１９］ ［１３］〜［１８］のいずれか記載の調製方法によって得られる細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［２０］細菌がＢＣＧ菌であることを特徴とする［１９］記載のペースト、
［２１］油がスクワラン、または流動パラフィンであることを特徴とする、［１９］または［２０］記載のペースト、
［２２］［１］〜［１２］、および［１９］〜［２１］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有することを特徴とする水中油型エマルジョン、
［２３］水２Ｌあたり、０．６６ｇ〜３．３５ｇの細菌−ＣＷＳ、および０．４％〜８重量％の油を含有することを特徴とする、［２２］記載の水中油型エマルジョン、
［２４］安定化剤として１〜１０％のマンニトールを含有する［２２］または［２３］記載の水中油型エマルジョン、
［２５］界面活性剤として０．０１％〜３％のポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルを含有する［２２］〜［２４］のいずれか記載の水中油型エマルジョン、
［２６］ポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン８０である［２５］記載の水中油型エマルジョン、
［２７］以下の▲１▼〜▲２▼の特徴を有する［２２］〜［２６］のいずれか記載の水中油型エマルジョン、
▲１▼エマルジョン油滴粒子径が、０．２〜３０μｍである。
▲２▼細菌−ＣＷＳが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性を示す。
［２８］エマルジョン油滴粒子径において、Ｄ１０％：０．５μｍ以上、Ｄ９０％：２０μｍ以下であることを特徴とする［２７］記載の水中油型エマルジョン、
［２９］ 以下の（１）〜（２）の工程を含むことを特徴とする、［２２］〜［２８］のいずれか記載の水中油型エマルジョンの調製方法、
（１）［１］〜［１２］、および［１９］〜［２１］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペーストと、界面活性剤を含む水溶液の混合液を、曇点以上の温度で乳化する工程、
（２）安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程、
［３０］前項（２）の工程が、曇点以下の温度で実施されることを特徴とする［２９］記載の調製方法。
［３１］ 前項の（１）における乳化する工程が、以下の（３）〜（４）の工程を含むことを特徴とする［２９］または［３０］記載の調製方法、
（３）［１］〜［１２］、および［１９］〜［２１］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペーストと、０．０２％〜０．８％の界面活性剤を含む水溶液の混合液を乳化する工程（粗乳化工程）、
（４）（３）の混合液に界面活性剤を含む水溶液を加えて界面活性剤濃度を調整し、強攪拌して本乳化を行う工程、
［３２］界面活性剤がポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルである［３１］記載の調製方法、
［３３］記載のポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン８０である［３２］記載の水中油型エマルジョンの調製方法、
［３４］安定化剤がマンニトールである［２９］〜［３３］のいずれか記載の水中油型エマルジョンの調製方法、
［３５］［２２］〜［２８］のいずれか記載のエマルジョンを凍結乾燥することによって得られる、凍結乾燥製剤、
［３６］ 粒度分布において、粒子径が、０．１５〜６μｍであることを特徴とする、細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌−ＣＷＳ粒子集合体）、
［３７］ 粒度分布において、粒子径が、０．２〜２μｍであることを特徴とする、細菌−ＣＷＳ粒子集合体、
［３８］ 粒度分布において、Ｄ１０％が０．２以上であり、Ｄ９０％が０．７以下であり、かつ、単一ピークを有することをことを特徴とする［３６］または［３７］記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体、
［３９］ 粒度分布において、Ｄ１０％が０．２３±０．０５であり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５であり、かつ、単一ピークを有することをことを特徴とする［３６］〜［３８］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体、
［４０］ 脂肪族炭化水素系溶媒を含む溶媒中で分散することを特徴とする、［３６］〜［３９］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体の調製方法、
［４１］ 溶媒が、脂肪族炭化水素系溶媒と、アルコール系溶媒の混合物であることを特徴とする［４０］記載の調製方法、
［４２］ 溶媒が、５〜２０％エタノールを含むヘプタンであることを特徴とする［４１］記載の調製方法、
［４２−２］ ［４０］〜［４２］のいずれか記載の調製方法により得られることを特徴とする細菌−ＣＷＳ、
に関する。
さらに、本発明はこの態様において、
［４２−３］ 粒度分布において、粒子径が０．１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．１５〜６μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ〜２μｍである細菌−ＣＷＳ粒子集合体を含有する、本発明の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［４２−４］ 細菌−ＣＷＳ粒子集合体が粒度分布においてＤ１０％が０．２３±０．０５であり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５であり、かつ単一ピークを有する、［４２−３］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［４２−５］ ［４２−３］または［４２−４］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型エマルジョン、
［４２−６］ ［４２−５］記載のエマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。
［４２−７］ 本発明のエマルジョンからなる医薬組成物、に関する。
また、ミコバクテリウム属のＣＷＳには構成成分として約３０〜４５％の高級脂肪酸が含まれ、高級脂肪酸のパターンによって細菌の属、種等を同定する方法が知られていた。しかし、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳに含まれる高級脂肪酸の量を正確に定量する方法や、該高級脂肪酸によって細菌−ＣＷＳの由来細菌の属、種または株を同定する方法は知られていなかった。発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳに含まれる高級脂肪酸を抽出して分析することによって、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌の菌種・菌株が同定され、該細菌のＣＷＳの力価を評価できることを見出した。さらに、検出感度を上げるべく誘導体へ変換した後、ＨＰＬＣ等で分析することによって、高級脂肪酸の定量を効率的に行う方法を確立した。
一方、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳは、ミコール酸等の高級脂肪酸、糖類、ペプチドグリカン等からなる生体高分子であるが、力価に影響を与えるその成分、成分比および分子量は、細菌の培養条件により異なる。そのため、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳについては、その製造ロットごとの同等性および力価を評価する必要がある。
発明者らは、鋭意検討した結果、ＢＣＧ菌のＣＷＳ（ＢＣＧ−ＣＷＳ）において、ＣＷＳに含まれるミコール酸の量と、ＢＣＧ−ＣＷＳの生物活性が相関していることを見出し、簡便な力価評価方法を確立した。具体的には、ＢＣＧ−ＣＷＳ標準品において、ミコール酸含量と、ＢＣＧ−ＣＷＳの生物活性、すなわち免疫賦活能の一つであるＴＮＦ−α産生誘導活性が比例関係を示すことがわかった（図８）。すなわち、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌の、ＣＷＳの構成成分である高級脂肪酸を定量することにより、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳの免疫賦活剤、および／または、抗腫瘍剤としての力価を評価できることがわかった。また、菌体、原薬および製剤から得た高級脂肪酸のクロマトグラムから、細菌の属、種および株を同定できることがわかった。
本発明は、上記の知見を基に完成するに至ったものである。すなわち本発明は、
［４３］ 細菌の細胞壁骨格成分（Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ、以下ＣＷＳと称する。）の菌種・菌株の同定方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法；
（１）細菌のＣＷＳ中に含まれる、高級脂肪酸を分離および／または抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（２）（１）の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程、
（３）（２）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの菌種・菌株を評価する工程、
［４４］ 前項の工程（２）が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、［４３］記載の方法、
［４５］ 前記［４３］における工程（３）が、細菌のＣＷＳの標準品と比較することを含む、［４３］または［４４］記載の方法、
［４６］ 細菌の細胞壁骨格成分（Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ、以下ＣＷＳと称する。）の力価検定方法であって、以下の工程（１）、（４）、および（５）を含むことを特徴とする方法；
（１）細菌のＣＷＳ中に含まれる、高級脂肪酸を分離・抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（４）（１）の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、
（５）（４）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの免疫賦活能を評価する工程、
［４７］ 高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する（４）の工程が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を蛍光標識化して蛍光標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、［４６］記載の方法、
［４８］ 細菌のＣＷＳの免疫賦活能を評価する（５）の工程が、細菌のＣＷＳの標準品と比較することを含む、［４６］または［４７］記載の方法、
［４９］ 高級脂肪酸誘導体が高級脂肪酸エステルであることを特徴とする、［４３］〜［４８］のいずれか記載の方法、
［５０］ 高級脂肪酸誘導体が、蛍光標識された誘導体であることを特徴とする［４９］記載の方法、
［５１］ 細菌がミコバクテリウム属またはノカルジア属の細菌であることを特徴とする、［４３］〜［５０］のいずれかに記載の方法、
［５２］ ミコバクテリウム属の細菌がＢＣＧ菌であることを特徴とする、［５１］記載の方法、
［５３］ 高級脂肪酸がミコール酸であることを特徴とする、［４３］〜［５２］のいずれかに記載の方法、
に関するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、分散補助溶媒にヘプタンを用いた場合のペースト中のＢＣＧ−ＣＷＳの粒度分布を示した。
図２は、分散補助溶媒に９０％ヘプタン／１０％エタノールを用いた場合のペーストの粒度分布を示した。
図３は、凍結乾燥前のスクワラン１．６％処方製剤における、水中油型エマルジョンの粒度分布を示した。
図４は、凍結乾燥後のスクワラン１．６％処方製剤における、水中油型エマルジョンの粒度分布を示した。
図５は、被験サンプルのクロマトグラムを示す図であり、横軸はＨＰＬＣの保持時間、縦軸は蛍光強度を示す。
図６は、ＢＣＧ−ＣＷＳ原薬の標準品の検量線を示す図である。
図７は、細菌の菌株による違いで、クロマトグラムから同定できる（上図：ＢＣＧ菌の東京株、下図：ＢＣＧ菌のパスツール株）ことを示す図である。
図８は、被験物質のミコール酸量と生物活性の相関関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明において、細菌−ＣＷＳの由来微生物としては、グラム陽性棹菌のミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌（プロプリオネバクテリウム属）、ロドコッカス属細菌、ボルデテラ属、リステリア属、またはゴルドナ属細菌などが挙げられ、好ましくはミコバクテリウム属細菌およびノカルジア属細菌が挙げられる。「ミコバクテリウム属細菌」とは、抗酸菌のミコバクテリウム属の細菌を表し、具体的には、結核菌群細菌のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ウシ型結核菌、ＢＣＧ菌を含む）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ（アフリカ菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ（ネズミ型結核菌）があり、この他、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ（ライ菌）、非結核性抗酸菌群であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ等が挙げられる。ノカルジア属細菌として具体的には、ノカルジア・ルブラなどが挙げられる。細菌−ＣＷＳは、物理的に細菌を粉砕した後、除核酸、除蛋白、脱脂等の精製工程を経て、不溶性残渣として得られ、その製法自体は公知である（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，５２，９５−１０１（１９７４））。
なお、細胞壁骨格成分の濃度は、エマルジョンとして０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌになるように使用される。好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである。
本発明の「油」としては、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２７巻、第３１１〜３２９項（１９７４年）に記載されているような鉱物油、動植物油が挙げられる。鉱物油としては、例えば、流動パラフィン（ドレコール６ＶＲ、モレスコバイオレスＵ−６、モレスコバイオレスＵ−８等）、バイオール（Ｂａｙｏｌ Ｆ）、などが挙げられる。植物油としては、例えば、大豆油、シンセラン４、オレイン酸エチル、落花生油、椿油、ゴマ油、ＡＤ−６５（落花生油とアラセルとアルミニウムモノステアレートの混合物）等が挙げられる。動物油としては、例えば、スクワラン、スクワレンのようなテルペノイド誘導体が挙げられる。また、これら、動植物油、鉱物油の中から選ばれる複数の油の混合物を挙げることができる。好ましいものとしては、スクワランあるいは例えば、大豆油、オレイン酸エチル、オレイン酸等の植物油（またはそれに由来する油）とスクワランとの混合物、例えば、ドレコール６ＶＲ、各種流動パラフィン等の鉱物油とスクワランの混合物が挙げられる。
より好ましくは、スクワラン、ドレコール６ＶＲ、スクワランと大豆油の混合物、スクワランとオレイン酸エチルの混合物、またはスクワランとドレコール６ＶＲの混合物を挙げることができる。
本発明の「粘度」とは、動的粘弾性法により測定されるものであり、例えば、共軸二重円筒型の粘度測定装置を使用して得られる値を言う。本発明では、（株）レオロジ社製共軸二重円筒型の粘度測定装置（ＭＲ−３００ ソリキッドメータ）を使用し、窒素雰囲気下２５℃で粘度を測定することができる。１ｐｏｉｓｅは、０．１Ｐａ・ｓ（パスカル・秒）を表す。
本発明のペーストを調製する際に使用可能な「分散補助溶媒としての有機溶媒」は、窒素気流下加熱あるいは減圧下などで留去可能な有機溶媒が挙げられ、２種類以上の溶媒の混合物であってもよい。具体的には、大気圧での沸点が３０℃〜１４０℃の溶媒が挙げられる。
本発明のペースト調製にエタノール等のアルコール系溶媒を単独で用いた場合、細菌−ＣＷＳは十分に分散されず、他方トルエン等の芳香族炭化水素、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、またはテトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒といった非極性溶媒を用いると、均一な分散溶液が得られ、均一性に優れたペーストが得られることが判明した。さらに、一部にアルコール系溶媒を含む非極性溶媒を用いると、非極性溶媒のみを用いた場合よりもさらに優れた細菌−ＣＷＳ含有ペーストを得られることがわかった。非極性溶媒を単独で用いた場合、粒子径が約１０μｍの巨大粒子が若干混在し、ペースト内の細菌−ＣＷＳの粒度分布は２つのピークを示し（図１）、水中油型エマルジョンを調製した場合、ロット間のばらつきを生じやすい傾向があったが、アルコール系溶媒を混合させると、均一な粒度分布が得られることが判明した。
そこで、本発明のペースト調製にとって好ましい分散補助溶媒としては、非極性溶媒、および非極性溶媒とアルコール系溶媒の混合溶媒を挙げることができる。ここで溶媒としては、ＩＣＨの残留溶媒ガイドラインに記載のクラス２、クラス３の溶媒を選択することが好ましい。
非極性溶媒としては具体的には、例えばトルエン等の芳香族炭化水素、例えばシクロペンタン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素、例えばジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素等、およびテトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒が挙げられる。非極性溶媒は一種類に限らず、適宜数種類組み合わせて使用することができる。
アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、またはブタノール等が挙げられ、特に好ましくはエタノールが挙げられる。
分散補助溶媒がアルコール系溶媒と非極性溶媒の混合物である場合、アルコール系溶媒は５〜３０％、好ましくは５〜２０％、さらに好ましくは５〜１５％含有する。
より好ましくは溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン、オクタン等の脂肪族炭化水素、０〜２０％のエタノールを含む方芳香族炭化水素もしくは脂肪族炭化水素が挙げられる。具体的には、５〜２０％エタノール−ヘプタン、５〜２０％エタノール−ヘキサン、５〜２０％エタノール−トルエン、５〜２０％エタノール−シクロヘキサン、５〜２０％プロパノール−ヘプタン、５〜２０％イソプロパノール−ヘプタン等を例示することができ、好ましくは、１０％エタノール−ヘプタンが挙げられる。
本発明で使用可能な「界面活性剤」としては、医薬品製剤に使用される界面活性剤であれば特に制限されるものではない。例えばリン脂質、非イオン性界面活性剤などを挙げることができる。リン脂質としては、ホスファチジルアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、またはレシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も使用することができる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、同モノパルミテート（ポリソルベート４０）、同モノステアレート（ポリソルベート６０）、または同モノオレート（ポリソルベート８０）等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０）、同モノパルミネート（Ｓｐａｎ４０）、同モノステアレート（Ｓｐａｎ６０）、同モノオレート（Ｓｐａｎ８０）等のソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げることができる。好ましい界面活性剤としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（ＨＣＯ−５０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）を挙げることができる。より好ましくは、ポリソルベート８０が挙げられる。
界面活性剤の濃度は、水中油型エマルジョンにおいて０．０１〜１０％ｗ／ｗの範囲が適当であり、０．０１〜３％が好ましい。これら界面活性剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
「安定化剤」とは、上記エマルジョンのエマルジョンとしての安定性を維持・向上する目的で使用される成分である。本発明で使用可能な安定化剤としては、単糖類、糖アルコール、多糖類、アミノ酸、タンパク質、ウレア、または無機塩などが挙げられる。単糖類および二糖類としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース等が挙げられる。糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられ、より好ましい糖アルコールとしてはマンニトールが挙げられる。多糖類としては、デキストラン、でんぷん、マルトデキストリン、セルロース、ポリビニルピロリドン、またはアルギン酸ナトリウム等が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸としては、アラニン、グリシン、プロリン等の中性アミノ酸が好ましく、より好ましい中性アミノ酸としてグリシンを挙げることができる。タンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン等が好ましいものとして挙げられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
好ましい安定化剤としては単糖類、または糖アルコールが挙げられ、特に好ましい安定化剤としてはマンニトールが挙げられる。
これら安定化剤は、１種類に限らず、適宜、数種類組み合わせて使用することができる。
安定化剤の濃度は、水中油型エマルジョンにおいて０．１〜２０％ｗ／ｗの範囲が適当であり、０．１〜１０％ｗ／ｗが好ましい。安定化剤の好適な濃度は、安定化剤の種類によって異なるが、製造スケールや各含有成分の含有量に応じて、適宜調整することができる。グリシン等のアミノ酸の場合、２．２５％（３００ｍＭ）〜１１．２５％（１５００ｍＭ）、好ましくは約６．７５％（９００ｍＭ）である。マンニトールの場合、水中油型エマルジョンにおける濃度は、好ましくは１〜１０％、さらに好ましくは１〜８％、より好ましくは約３〜６％である。マンニトールを安定化剤として用いることにより、等張と同程度の濃度で用いることができるので、より生体に負担の少ない安定な製剤を調製することができる。
本発明における凍結乾燥製剤を再懸濁するために使用される水性溶媒は、エマルジョン粒子の分散媒体となるものであり、注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられるが、注射可能な水性溶媒であれば特に限定されない。
「高級脂肪酸」とは、ミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌等の細胞壁に特徴的に存在する高級脂肪酸を表す。高級脂肪酸としては、例えばミコール酸が挙げられ、該ミコール酸とは、α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸を表し、総炭素数約２２〜９０を有する。このうちミコバクテリウム属におけるミコール酸の総炭素数は約６０〜９０であり、ノカルジア属では約４４〜６０であり、通常複数種類の分子の混合物として単離される。ミコール酸のα鎖は、直鎖の炭化水素からなり、その長さは属・種によって異なり、Ｃ２２〜Ｃ２６を中心とし、幅広い分布を有する。一方、β鎖にはすべてのミコバクテリアに共通するα−ミコール酸（シクロプロピル基および／または二重結合が存在）の他、菌株によって種々サブミコール酸（メトキシ基、ケト基、エポキシ基、メチル基等）の官能基が存在することがわかっている。例えば、ＢＣＧ−東京株ではα−、メトキシ−およびケト−ミコール酸が存在する。
本明細書において、「力価」とは、一定重量、または一定容量の、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳもしくは該ＣＷＳを含有する医薬品の生物活性の強さ、または検定された標準品との相対的な値を表す。
該医薬品としては、ＣＷＳの水性溶媒懸濁液；ＣＷＳと鉱物油、スクワランまたはスクワレン等の油とを含有するペースト；該ペーストから再懸濁されたエマルジョン溶液；または、前記水性溶媒懸濁液もしくはエマルジョン溶液を凍結乾燥して得られる凍結乾燥製剤等が挙げられる。
ここで、生物活性とは、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳの免疫賦活活性、および／または抗腫瘍活性を表し、当業者に公知の、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの任意の活性が挙げられる。具体的には、インターフェロンγ誘導活性、ＴＮＦ−α誘導活性、実験的腫瘍動物モデルに対する抗腫瘍活性等が挙げられる。
本発明に係る第１の態様は、水中油型エマルジョン、および凍結乾燥製剤を調製する際に好適な製造中間体となる、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有するペーストである。すなわち、細菌−ＣＷＳと油とのペースト（混合油状物）であり、約０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）以下の粘度、好ましくは約０．２〜約０．６ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を示すことを特徴とする、細菌−ＣＷＳ含有ペーストである。さらに好ましくは、約０．２８〜０．５５ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を示す細菌−ＣＷＳ含有ペーストである。
油としてスクワランを用いた場合、約０．３５〜０．５５ｐｏｉｓｅ（２５℃）、さらに好ましくは約０．３９〜０．５１ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する細菌−ＣＷＳ含有ペーストが好適である。例えばＢＣＧ−ＣＷＳ：１ｇに対して２６．７ｇのスクワランを用いたＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペースト（粘度値：０．４３ｐｏｉｓｅに相当）から、後述する手順により、水中油型エマルジョンを調製して凍結乾燥を行ったところ、凍結乾燥品を再度懸濁して得られる水中油型エマルジョンにおける油滴の粒度分布は平均粒子径２〜３μｍの、半値幅の小さい単一ピークを与えた（図４を参照）。一方、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度値が上昇するに従って、凍結乾燥品を再度懸濁して得られる水中油型エマルジョンの油滴の粒度分布は、平均粒子径２〜３μｍの主分布以外に、粒子径約１０〜５０μｍの粒子が増え、粒子の均一性が損なわれた。また、前記凍結乾燥品の長期保存安定性についても、容器の器壁への付着物の生成およびそれに伴う再懸濁水中油型エマルジョン中の原薬濃度の観点から、前記粘度値：０．４３ｐｏｉｓｅのＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストが製造中間体としてより優れていた。具体的なＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの態様として、約０．４３±０．３ｐｏｉｓｅの粘度を有するものを好適な組成として例示することができる。
また、粒度分布において、粒子径が０．１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．１５〜６μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ〜２μｍである細菌−ＣＷＳ粒子集合体を含有する細菌−ＣＷＳ含有ペースト、および細菌−ＣＷＳ粒子集合体が粒度分布においてＤ１０％が０．２３±０．０５であり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５であり、かつ単一ピークを有する細菌−ＣＷＳ含有ペーストが好ましい。
複数の油との混合物を使用する場合、それぞれの油を適切な組成比で混合して使用できるが、細菌−ＣＷＳとの混合時の粘度が約０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）以下の粘度になるような組成比であることが望ましい。さらに、懸濁後安定な凍結乾燥製剤を作成するためには、それぞれの油の組成比が、細菌−ＣＷＳとの混合時の粘度が約０．２ｐｏｉｓｅ（２５℃）以上になるような組成比であることが望ましい。具体的には、細菌−ＣＷＳ約０．６６ｇに対して、スクワランであれば、約６．６ｇ〜３５．２ｇ、好ましくは約８．４ｇ〜３５．２ｇ等の組成が挙げられる。
前記のペーストは、（１）細菌−ＣＷＳ、油、および有機溶媒を混合撹拌する工程、および、（２）前記（１）の有機溶媒を留去し、細菌−ＣＷＳ含有ペーストを得る工程を経て、大量スケールで調製することができる。
前記（１）において用いられる有機溶媒の量としては、細菌−ＣＷＳ０．６７ｇあたり、５０ｍｌ〜５００ｍｌが挙げられる。原料を加える順序については特に限定は無い。また、これらの原料を混合攪拌する時間は特に限定されないが、１０分間〜１時間が好ましい。
前記（２）において、溶媒を留去するための加熱温度としては、溶媒の沸点、蒸気圧に応じて適宜選択することが可能である。なお、高温になれば細胞壁骨格成分の失活が生じるため、失活の生じない１００℃以下の温度が望ましい。好ましくは８０℃以下である。
溶媒を留去する工程は、常圧下もしくは減圧下に行うことができる。
また、本発明の細菌−ＣＷＳ含有ペーストは、細菌−ＣＷＳ粒子集合体の粒子径が０．１μｍ〜２０μｍであり、好ましくは０．１５〜６μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ〜２μｍである。すなわち、（１）粘度が約０．２〜０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）であり、（２）細菌−ＣＷＳ粒子集合体の粒子径が０．１５μｍ〜６μｍである細菌−ＣＷＳ含有ペースト等もまた、本発明の好ましい態様である。
本発明に係る第２の態様は、均一な、粒度分布を有する、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する水中油型エマルジョン、および該水中油型エマルジョンからなる医薬組成物である。すなわち、前記細菌−ＣＷＳ含有ペーストを含み、かつ、０．１％〜２０％、好ましくは１％〜１０％の安定化剤、０．０１％〜１０％、好ましくは０．０１％〜３％の界面活性剤を含むことを特徴とする、水中油型エマルジョンおよびその医薬組成物である。
具体的には、２Ｌあたり、０．６７ｇ〜３．３５ｇの細菌−ＣＷＳおよび、０．１〜１０％ｗ／ｗ、好ましくは０．４〜８％ｗ／ｗ、さらに好ましくは０．６〜５％のスクワランを含み、かつ、１％〜１０％ｗ／ｗの安定化剤、０．０１％〜３％ｗ／ｗの界面活性剤を含むことを特徴とする、水中油型エマルジョンが挙げられる。
本発明の水中油型エマルジョンを調製する方法については特に限定されないが、国際公開パンフレット（ＷＯ００／３７２４）に記載された方法等を用いることができる。例えば、前記の方法で調製した細菌細胞壁骨格成分含有ペーストを、２段階乳化方法等を用いて乳化する方法、すなわち、下記の乳化方法１、および乳化方法２が挙げられる。
乳化方法１：
１）細菌細胞壁骨格成分油状混合物（ペースト）に、低濃度（油濃度の約１０％以下）の界面活性剤を含む水溶液を加えて、緩やかに攪拌して粗乳化を行う工程、
２）前記１）の粗乳化エマルジョン溶液に、所望の濃度を得るべく、目的の最終濃度となる量の界面活性剤、および安定化剤を加えて、エマルジョン溶液の濃度を調整し、室温〜１００℃で、分散・乳化機器で強く攪拌して本乳化を行う工程、
を経て、本発明の水中油型エマルジョンを調製することができる。
本発明で使用可能な分散・乳化機器としては、例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザー、ホモミキサー、超音波ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、マントン−ガウリンホモジナイザー型高圧ホモジナイザー等の分散・乳化機により、分散もしくは乳化を行って所望の水中油型エマルジョンを得ることが出来る。調製上の都合によっては、水中油型エマルジョンを調製後、賦形剤、安定化剤等の添加剤を添加しても良い。
乳化方法２
４）細菌細胞壁骨格成分油状混合物（ペースト）に、低濃度（油濃度の約１０％以下）の界面活性剤を含む水溶液を加えて、緩やかに攪拌して粗乳化を行う工程、
５）前記４）の粗乳化エマルジョン溶液に、最終濃度が約０．１％〜３％となるような界面活性剤を加えて、エマルジョン溶液の濃度を調整し、室温〜１００℃で、分散・乳化機器で強く攪拌して本乳化を行う工程、
６）前記５）のエマルジョン溶液を、使用する安定化剤がアミノ酸・無機塩等の電解質である場合は必要に応じて曇点以下の温度まで冷却した後、所望の濃度を得るべく、最終濃度が約０．１％〜３％となるような界面活性剤、および最終濃度が１．０％〜１０％となるような安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程、
を経て、本発明の水中油型エマルジョンを調製することができる。前記６）において、好ましくは、前記５）で得られるエマルジョン溶液を２倍〜１０倍に希釈して水中油型エマルジョンを調製することができる。
前記乳化方法２を用いて、本発明の水中油型エマルジョンを調製することにより、乳化方法１を用いた調製方法においては、安定化剤としてアミノ酸、無機塩などの電解質を含むエマルジョンを調製する場合に懸念される、界面活性剤の析出が避けられる。しかも乳化方法２の６）で表される希釈工程によって、エマルジョンの粒度分布は全く変化しない。また、乳化方法１を用いて大量調製を実施する場合、調製スケールに応じた乳化機器が必要であり、調製スケールの限界であった。しかし、乳化方法２を用いて、高濃度エマルジョン溶液を中間体として用いることにより、１回あたりに調製できる水中油型エマルジョン量が増大するという利点がある。
上記の乳化方法１、または乳化方法２等の水中油型エマルジョンの調製工程においては、必要に応じて、等張化剤を加えてもよい。これら等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。該等張化剤は、凍結乾燥品を凍乾ケーキとして形成させるための賦形剤を兼ねることができる。該等張化剤もしくは賦形剤としては、糖類、アミノ酸、ウレア、無機塩等が挙げられる。糖類としては、単糖類、二糖類、糖アルコールが挙げられる。単糖類としては、グルコース、フルクトース等、二糖類としては、マルトース、ラクトース、トレハロース、スクロース等、糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。アミノ酸としては、アラニン、グリシン、リシン、アルギニン、プロリン等が挙げられる。これらの等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。等張化剤としては、上記安定化剤として挙げられた物質を使用することができ、安定化剤は等張化剤を兼ねていてもよい。また、等張化剤として、安定化剤とは異なる物質を選択することも可能である。尚、等張化剤の濃度は、他の成分の含有量に応じて適宜設定されるが、通常０．１％〜３０％ｗ／ｗの範囲が適当である。
本発明の水中油型エマルジョンは、エマルジョンの油滴の粒子径が０．２〜３０μｍ、好ましくは０．２〜２０μｍであり、平均粒子径としては２〜３μｍが好ましい。細菌−ＣＷＳは油滴中に包含される。
本発明の水中油型エマルジョンにおいて、細菌−ＣＷＳが油に包含されているか否かは、レクチンによる細胞壁骨格成分の凝集反応を利用して検定することができる。該検定方法については、国際公開パンフレットＷＯ００／３７２４に記載された方法等を用いることができる。
すなわち、（１）エマルジョン油滴の粒子径が０．２〜１０μｍ、平均粒子径が、２〜３μｍであり、（２）細菌−ＣＷＳが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性を示すことを特徴とする水中油型エマルジョンもまた、本発明の態様として挙げられる。また、該エマルジョン油滴の粒子径において、好ましくはＤ１０％：０．５μｍ以上、Ｄ９０％：２０μｍ以下である。
本発明に係る第３の態様は、前記水中油型エマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤である。
前記凍結乾燥製剤は、前記水中油型エマルジョンを、凍結乾燥させることにより、調製することができる。すなわち本発明に係る凍結乾燥製剤は、水中油型エマルジョンを凍結乾燥処理し、最後に通常はバイアル内部を窒素置換し、打栓を行うことにより得ることができる。
水中油型エマルジョンを凍結乾燥する際、凍結乾燥温度、および時間等は特に限定されず、例えば、国際公開パンフレットＷＯ００／３７２４に記載された方法を挙げることができる。
該凍結乾燥製剤を再懸濁させて水中油型エマルジョンを調製するために用いる水性溶媒としては、前記等張液等を用いることができる。該凍結乾燥製剤は、適当な水性溶媒の添加により速やかに再懸濁し、凍結乾燥前と同等の粒度分布、および安定性を有する水中油型エマルジョンが得られる。
本発明の第４の態様は、粒度分布において、粒子径が０．１５〜６μｍであり、好ましくは粒子径が０．２〜２μｍであることを特徴とする、細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌−ＣＷＳ粒子集合体）に関する。また、粒子径において、
Ｄ１０％：０．２μｍ（ここで「Ｄ１０％：０．２μｍ」とは、粒度分布において、粒子径の小さい側から積算して１０％に達した時の粒子径を表す。すなわち、細菌−ＣＷＳ粒子集合体の９０％までが粒子径０．２μｍ以上であることを意味する。）以上であり、かつＤ９０％：０．７μｍ（ここで「Ｄ９０％：０．７μｍ」とは、粒度分布において、粒子径の大きい側から積算して１０％に達した時の粒子径を表す。すなわち、細菌−ＣＷＳ粒子集合体の９０％までが粒子径０．７μｍ以下であることを意味する。）以下の細菌−ＣＷＳ粒子集合体であり、さらに好ましくは、Ｄ１０％：０．２３±０．０５μｍでありかつＤ９０％：０．６±０．０５μｍである。
また本発明には、前記粒子径を有する細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌−ＣＷＳ粒子集合体）を含有するペーストや、該ペーストから調製されるエマルジョン、および凍結乾燥製剤も含まれる。すなわち、上記細菌−ＣＷＳを含有したエマルジョン（油滴）の粒子径が０．２〜３０μｍ、好ましくは０．３〜２０μｍ、さらに好ましくは、１〜１０μｍであることを特徴とする、エマルジョンや凍結乾燥製剤が挙げられる。
本明細書において、粒子径は、粒度分布を測定することにより得られる。該粒度分布は、当業者に公知の方法で測定することができるが、具体的には、細菌−ＣＷＳの溶媒懸濁液の場合は、レーザー回折式粒度測定装置（ＳＡＬＤ３０００；島津製作所製）や、マイクロトラックＵＰＡ（ハネウェル社製）を用いて、測定する。細菌−ＣＷＳの粒子径が１μｍ以下の場合には好ましくはマイクロトラックＵＰＡを用いて測定することができる。具体的には、ＢＣＧ−ＣＷＳを、約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶媒に懸濁したものを測定サンプルとする。
また、細菌−ＣＷＳ含有ペーストや、エマルジョンの場合には、レーザー回折式粒度測定装置（ＳＡＬＤ３０００；島津製作所製）を用いて測定することができる。具体的には、本発明の細菌−ＣＷＳ含有ペーストを、約３００倍以上に油で希釈して測定サンプルとすることができ、好ましくは０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬの細菌−ＣＷＳ濃度となるように測定サンプルを調製すればよい。
本発明に係る水中油型エマルジョンは、注射など非経口で投与される。投与形態は、治療目的などにより異なり、特に制限されるものではない。通常用いられる投与形態として例えば、注射剤として皮膚より投与すること等ができる。エマルジョン中の細菌−ＣＷＳの量は通常０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌの濃度である。本発明の凍結乾燥製剤は適量の水性溶媒、例えば前記等張液等を用いて本発明エマルジョンに再懸濁して用いる。凍結乾燥製剤を再懸濁して生体に投与する場合の水中油型エマルジョンにおける各成分の濃度は、凍結乾燥前の、製造中間体としての水中油型エマルジョンにおける各成分の濃度と異なっていてもよい。水性溶媒の適量とは、凍結乾燥前の液量の、好ましくは０．５〜４倍量の範囲であればよい。
投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によって異なるが、非経口投与する場合、特に注射剤として使用する場合には、通常は成人に対して週１回若しくは４週１回の投与で１回当たり１０〜２５０μｇの範囲、好ましくは２５〜２００μｇの範囲を投与することができる。
本発明の第５の実施の態様は、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳに含まれる高級脂肪酸のクロマトグラムから定性的にその菌種・菌株を同定、確認する方法であり、以下の工程（１）〜（３）を含む方法である。すなわち、
（１） ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳに含まれる、高級脂肪酸を分離・抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程
（２） （１）の高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程、
（３） （２）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの菌種・菌株を評価する工程。
以下、各工程について詳細に説明する。
（１） ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳより、高級脂肪酸を分離・抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程
試料として一定質量のミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳを秤量し、溶媒中で、１０℃〜溶媒の沸点の範囲内で塩基を反応させることにより、加水分解を行う。ここで用いられる溶媒としては、加水分解を行うに十分な水を含む有機溶媒であれば特に限定されないが、具体的な有機溶媒としては、例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール、エチレングリコール等のアルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン等のエーテル系溶媒、アセトン、ジメチルスルホキシド等の親水性溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、またはこれらの有機溶媒の任意の溶媒の混合物が挙げられる。
前記有機溶媒として、好ましくは、エタノール等のアルコール系溶媒、あるいは、前記アルコール系溶媒および疎水性有機溶媒の混合物が挙げられ、具体的には、エタノール−トルエン−水混液等が挙げられる。
反応温度は、用いられる有機溶媒の種類によって適当な温度を選択することができるが、好ましくは、室温〜溶媒の沸点で加温するか、あるいは１０５℃〜１３５℃でオートクレーブを用いる方法が挙げられる。
加温の場合の反応時間としては、５分〜７２時間が挙げられ、高級脂肪酸のパターンを分析する場合の反応時間としては、好ましくは５分〜５時間、高級脂肪酸量を定量的に分析する場合の反応時間としては、好ましくは３０分〜５時間が挙げられる。オートクレーブの場合の反応時間としては、５分から８時間が挙げられ、好ましくは、パターンを分析する場合は５分〜３時間、定量的に分析する場合は１０分〜５時間が挙げられる。
使用される塩基としては、当業者に知られたものであれば任意の塩基を用いることができるが、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸バリウム、炭酸セシウム等の無機塩基が挙げられる。
ここで、被験サンプルが細菌−ＣＷＳの場合、反応効率を上げるために、試料をそのまま一定質量秤量するか、またはトルエン、クロロホルム、ヘプタンおよびエタノール等から選択される有機溶媒、またはこれらの溶媒の混液等に懸濁し、必要量を採取し、該有機溶媒を留去した後、加水分解に供することが好ましい。また、被験サンプルが「細菌」または「菌体」である場合は、水に懸濁した状態で、原薬と同様に加水分解を行うほか、反応効率を上げるために温度を沸点まで上げて５分〜７２時間反応させるか、オートクレーブを用いて５分〜８時間反応させることが好ましい。医薬品製剤の場合は、水を加えてエマルジョンを形成させ、その全部または一部を採取して加水分解反応させるほか、反応効率を上げるために、一旦水でエマルジョンとするのではなく、直接加水分解試液を加えて、反応させることが好ましい。
加水分解反応終了後、酸を加えて反応溶液を酸性とした後、疎水性有機溶媒を用いて高級脂肪酸画分を抽出する。ここで用いられる酸としては、当業者に知られたものであれば任意の酸を用いることができるが、具体的には、塩酸、硫酸、燐酸等の無機酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸、スルホン基を有する酸性イオン交換樹脂等を用いることができる。疎水性溶媒は、水層との分離が可能な溶媒であれば特に限定はないが、具体的には、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、トルエン、クロロホルム等が挙げられる。
（２） （１）の高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程
（１）において得られた高級脂肪酸画分に含まれる高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムを得、その溶出パターンを確認する。該溶出パターンとは、溶出ピークの形状、各溶出ピークの保持時間（リテンションタイム）、ピーク面積、ピーク幅、もしくは極大値等のパラメーター、および、各溶出ピーク間の該パラメーターの比等、クロマトグラムにおける任意の性質を表す。その確認方法は、当業者に公知の方法であれば、任意の方法を用いることができる。高級脂肪酸、または、高級脂肪酸をエステル化もしくはアミド化することにより調製される、高級脂肪酸の誘導体を、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＴＬＣ等で分析し、高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムを得ることができる。ここで、高級脂肪酸または高級脂肪酸の標識化誘導体におけるクロマトグラムは、ＨＰＬＣもしくはＧＣにおけるクロマトグラム、すなわちピークの溶出パターンや、ＴＬＣにおけるスポットの検出パターン等を表す。また、検出方法としては、特に限定はないが、蛍光、ＵＶ−ＶＩＳ、ラジオアイソトープ、ＲＩ（示差屈折計）、質量分析、電気化学、化学発光、エバポレイティブ光散乱、またはレーザー励起吸光等を用いることができる。
好ましくは、高級脂肪酸に標識化試薬を作用させることにより、標識化高級脂肪酸誘導体を調製した後、その溶出パターンを分析する方法等が挙げられる。
高級脂肪酸の標識化方法としては、高級脂肪酸のカルボン酸または水酸基を、蛍光、ＵＶ−ＶＩＳ、ラジオアイソトープ、ＲＩ（示差屈折計）、質量分析、電気化学、化学発光、エバポレイティブ光散乱、レーザー励起吸光等で検出可能な原子もしくは部分構造を有する高級脂肪酸エステル、または高級脂肪酸アミドへ導く方法が挙げられる。
具体的な標識化高級脂肪酸誘導体としては、高級脂肪酸のカルボキシル基と反応するブロモメチル（ブロモアセチル）基、ジアゾメチル基、アミノ基、ヒドラジノ基などを有するとともに、同時に紫外、可視または蛍光で検出可能な置換基を有する９−アントリルメチルエステル、ｐ−ブロモフェナシルエステル、６，７−ジメトキシ−４−クマリニルメチルエステル、２−（２，３−ナフタルイミド）エチルエステル、２−（２，３−アントラセンジカルボキシイミド）エチルエステル等が挙げられる。
誘導化反応条件としては、個々の標識化高級脂肪酸誘導体に適当な条件を、当業者によく知られた方法から選択することができるが、通常は、必要に応じて塩基もしくは酸等の補助試薬の存在下、−１０℃〜溶媒の沸点で５分〜７２時間標識化試薬と反応させることにより、標識化高級脂肪酸誘導体を調製することができる。具体的には、９−アントリルメチルエステルの場合、高級脂肪酸画分を、ＡＤＡＭ（９−アントリルジアゾメタン）等の蛍光標識化試薬を用いて、−１０℃〜溶媒の沸点で５分〜７２時間、好ましくは２０℃〜６０℃で３時間〜１２時間反応させることによって、高級脂肪酸９−アントラニルメチルエステルを得ることができる。
分析方法としては、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＴＬＣ等、当業者によく知られた方法を用いることができる。例えば、分析される高級脂肪酸、もしくは標識化高級脂肪酸誘導体の性質に応じて、ＨＰＬＣの逆相クロマトグラフ法、順相クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、イオン交換クロマトグラフ法、イオンクロマトグラフ法、サイズ排除クロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラフ法において、溶出される高級脂肪酸もしくは標識化高級脂肪酸誘導体を含有する複数のピークのパターンを得ることができる。ここで検出方法としては、前記標識化方法に応じて、蛍光分析、ＵＶ−ＶＩＳ分析、ラジオアイソトープ分析、ＲＩ（示差屈折計）分析、質量分析、電気化学分析、化学発光、エバポレイティブ光散乱、またはレーザー励起吸光等が挙げられる。
（３） （２）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの菌種・菌株を評価する工程
一般的には、被験サンプル、すなわち評価対象の細菌のＣＷＳにおける（２）のクロマトグラムと、基準となる該細菌のＣＷＳの標準品における（２）のクロマトグラムのパターンを比較することにより、被験サンプルの菌種・菌株を同定、確認することができる。また、被験サンプルである細菌のＣＷＳが、同種同株の標準サンプルと、ＣＷＳの構成成分において等価であるか否かを評価することができる。すなわち、細菌の培養条件によって、同種同株である場合でも該構成成分は変化する可能性があるが、（２）の分析結果を標準品と比較することにより、ＣＷＳの構成成分において等価な菌株であることを同定することができる。
具体的には、例えば高級脂肪酸がミコール酸である場合、逆相ＨＰＬＣカラム（オクタデシル基（Ｃ１８）を有するカラムまたはトリアコンチル基（Ｃ３０）を有するカラム（２〜１０ｍｍφ×５〜３０ｃｍ、粒径２〜１０μｍ）を使用し、水および／またはメタノールおよび２−プロパノールを用いたグラジエント条件、メタノールおよびトルエンを用いたグラジエント条件、または、メタノールおよびジクロロメタンのグラジエント条件で分析した場合は約５〜約１２０分に溶出する特徴的なピークが、それぞれ高級脂肪酸のパターンに相当する。
本発明の、第６の実施の態様は、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳを含む被験サンプルにおけるＣＷＳの含量を定量して評価するとともに、有効成分量すなわち力価を検定、評価する方法であり、以下の工程（１）、（４）、および（５）を含む方法である。すなわち、
（１）細菌のＣＷＳ中に含まれる、高級脂肪酸を分離・抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（４）（１）の高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、
（５）（４）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの免疫賦活能を評価する工程。
以下、それぞれの工程について具体的に述べる。
（１） ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳより、高級脂肪酸を抽出してその含有画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程
この工程については前記のとおりである。
（４） （１）の高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程
（１）で得られる高級脂肪酸を含む画分を、前記（２）に記載された方法で分析し、得られたクロマトグラムより高級脂肪酸または高級脂肪酸誘導体の量を定量すればよい。すなわち、前記（２）のクロマトグラムにおいて、高級脂肪酸または高級脂肪酸誘導体に相当する複数のピークの、面積値の総和を算出することにより、高級脂肪酸を定量することができる。
なお、細菌、または、細菌のＣＷＳを有効成分として含有する医薬品の原薬もしくは製剤の定量分析において、内部標準を使用する場合、該内部標準としては、ＨＰＬＣ等の分析において、被験サンプルもしくは標準品と分離して、検出可能であれば、特に限定されない。また、上記（１）、（２）、および（４）のいずれの工程で添加してもよい。
（５） （４）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの免疫賦活能を評価する工程
一般的には、被験サンプル、すなわち評価対象の細菌のＣＷＳにおける（４）の値と、基準となる該細菌（被験サンプルと同種・同株の細菌）におけるＣＷＳの標準品における（４）の値を比較することによって、被験サンプルの力価を評価することができる。例えば、ＢＣＧ−ＣＷＳ・東京株の場合、高級脂肪酸はミコール酸であり、被験サンプルのミコール酸の含量を前記（１）および（４）の工程によって分析した結果を、ＢＣＧ−ＣＷＳ・東京株の標準品におけるミコール酸の含量と比較することにより、被験サンプルの力価を定量することができる。
被験サンプル、すなわち評価対象の細菌のＣＷＳにおける（４）の値と、基準となる該細菌のＣＷＳの標準品における（４）の値を比較することにより、被験サンプルの力価を評価することができる。
具体的には、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳの標準品における（４）の値：Ｖｓｔｄを、被験サンプルにおける（４）の値：Ｖｓａｍと比較することにより、被験サンプルの力価を、標準品に対して、下式（％）：
Ｖｓａｍ／Ｖｓｔｄ×１００ （％）で表すことができる。
ここで、好ましくは、標準品における（４）の値を、複数の濃度で、複数回数測定し、標準品の濃度と、高級脂肪酸量の相関関係を表す検量線を作成し、該検量線に被験サンプルにおける高級脂肪酸量の測定値（すなわち（４）の値）を当てはめることにより、被験サンプルにおける有効成分量、すなわち力価を逆算することができる。
本発明の方法により、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳだけでなく、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳを含有する医薬品の有効成分を同定、確認するとともに、力価を評価することも可能である。すなわち、前記と同様の方法で、一定量の菌体、または医薬品から、水または有機溶媒等の懸濁液を調製し、該菌体または医薬品中の高級脂肪酸の量を測定することができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの調製
Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，５２，９５−１０１（１９７４）に記載されているようにして調製した細胞壁骨格成分としてのＢＣＧ−ＣＷＳ６７０ｍｇを、油として使用するスクワラン８．４ｇとトルエン２００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下６０〜７０℃に加熱しトルエンを留去し、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストを得た。
このペーストに関して、共軸二重円筒型粘度測定器（ＭＲ−３００ソリキッドメータ：（株）レオロジ社製）を用いて２５℃での粘度を測定した。その結果、０．５４５ｐｏｉｓｅであることが示された。
また、同様にして、油としてスクワランとオレイン酸エチルの混合物を８．４ｇ使用し、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストを得た。同様に、共軸二重円筒型粘度測定器（ＭＲ−３００ソリキッドメータ：（株）レオロジ社製）を用いて２５℃での粘度を測定した。これらの結果を表１に示す。
表１に示されるように、スクワラン自体の粘度は０．２３６であり、これに細胞壁骨格成分のＢＣＧ−ＣＷＳが上記のように混合された場合、そのペーストの粘度は０．５４５となる。より粘度の低いオレイン酸エチルの割合を増やすと、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度は次第に低くなった。
【実施例２】
ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの調製
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ６７０ｍｇを用い、油として大豆油８．４ｇを使用し、実施例１と同様にして油状混合物（ペースト）を調製し、粘度を測定した。
また、油としてシンセラン４、ドラケオールを使用し、同様にペーストを調製し、粘度を測定した。
以上の結果を表２に示す。
表２に示されるように、スクワラン以外の油を使用した場合のＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度は、使用する油によって大きく変動する。
【実施例３】
スクワランの量の変化と粘度の変化
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ６７０ｍｇを用い、油として使用するスクワランの量を４．２ｇから３３．６ｇへと変化させる以外は実施例１と同様にしてペーストを調製し、その粘度変化を測定した。
その結果を表３に示す。
表３に示されるように、ＢＣＧ−ＣＷＳに対するスクワランの量比が小さくなれば粘度が増加し、スクワランの量比が大きくなれば粘度が減少する傾向にある。
【実施例４】
スクワランの量比の変化とエマルジョン製剤化の可否
実施例３の▲３▼のペーストに０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液２８１．５ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さらに、５．２ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化を行った。最後に、２０４．２ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し、ポリソルベート８０最終濃度を１．０ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、４ｗ／ｗ％マンニトール水溶液１５００ｍＬを添加し、２Ｌの最終製剤を得た。これは、ＢＣＧ−ＣＷＳの原体濃度０．３ｍｇ／ｍｌのエマルジョンである。
同様にして、▲３▼以外の実施例３のペーストを用いてエマルジョンを調製し、エマルジョンの製剤化の可否に対するスクワラン量の影響を調べた。エマルジョン製剤化の可否は、▲１▼乳化中の凝集物出現の有無、▲２▼乳化直後の粒度分布、▲３▼凍結乾燥前後での粒度分布維持性、▲４▼凍結乾燥品再懸濁後の性状）を基準とした。
その結果を表４に示す。表中、「○」は上記▲１▼〜▲４▼をすべて満たすことを示し、「×」はこれらを満たさないことを示し、そして「△」は▲２▼の粒度分布の均一性が若干劣ることを示す。
実施例３記載のＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストを使用してエマルジョンを調製する場合、表４に示されるように、約０．７ｐｏｉｓｅ以下のペーストを使用した場合では良好なエマルジョンが調製される。一方、それより粘度が高い▲１▼の場合、（０．８８８ｐｏｉｓｅ）、良好なエマルジョンは製剤化できないことがわかった。これは、粘度の上昇に伴い、一部の油滴において過乳化が起こり、非常に少量の油に包埋された原薬の塊（均一に懸濁されずに凝集する物質）が出現し、製剤の性状と安定性を著しく低下させることを示唆している。
一方、粘度：０．６７０ｐｏｉｓｅ程度では、原薬の塊が出現することはないが、エマルジョンの油滴の粒度分布は、均一性が乏しかった。また、粘度０．５４５ｐｏｉｓｅ以下の製剤では、エマルジョンの油滴は均一性に富むシャープな粒度分布を示した（データは示していない）。
【実施例５】
油の種類とエマルジョン製剤化の可否
油として実施例２の種類のものを使用し、実施例４と同様にしてエマルジョンを調製し、製剤化の可否を評価した。その結果を表５に示す。
表５に示されるように、油の種類に関係なく、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度が約０．５５ｐｏｉｓｅ以下のものを使用して、エマルジョンを調製すれば、エマルジョンとして良好なものが得られた。表中、「○」は、▲１▼乳化直後の粒度分布が平均粒子径２〜３μｍでありシャープな単一ピーク、▲２▼凍結乾燥前後において粒度分布に変化が無い、▲３▼凍結乾燥品を再懸濁した後にバイアルへの製剤付着やそれに伴う製剤中原薬濃度低下が認められない、ことを示している。特に、粘度：０．４９〜０．５５ｐｏｉｓｅである▲２▼および▲３▼の製剤が良好な結果を示した。
【実施例６】
油の組成とエマルジョン製剤化の可否
油として実施例１の組成のものを使用し、実施例４と同様にしてエマルジョンを調製し、製剤化の可否を評価した。その結果を表６に示す。
表６は、油の組成（スクワランとオレイン酸エチルの混合比）が変化してもエマルジョンの性質にはあまり大きな影響を与えず、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度が０．５４５以下であれば、良好なエマルジョンが調製されることを示している。
【実施例７】
ペーストにおけるスクワランの量の変化と凍結乾燥製剤化の可否
実施例４にて調製した水中油型エマルジョンをバイアルに１０ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製）を用いて行った。次いで、凍結乾燥製剤の再懸濁安定性、粒度分布等の面で調製の可否を判断した。その結果を表７に示す。
表７で示されるように、エマルジョンの凍結乾燥製剤の良否もＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度によって影響を受ける。ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度が０．６７２以下の場合であれば良好な凍結乾燥製剤が調製される。０．５４５以下の場合であれば、さらに良好な凍結乾燥製剤が調製されることがわかった。
【実施例８】
油の組成と凍結乾燥製剤化の可否
実施例６にて調製したエマルジョンの凍結乾燥製剤を調製し、凍結乾燥製剤の再懸濁安定性、粒度分布等の面で調製の可否を判断した。
その結果を表８に示す。
実施例７では、エマルジョンの凍結乾燥製剤は、使用されるＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度に影響を受け、良好な凍結乾燥製剤はペーストの粘度が０．５４５以下であることが示された。上記表８は、ペーストの粘度が低すぎても良好な凍結乾燥製剤が得られないことを示している。従って、良好なエマルジョンの凍結乾燥製剤が得られるための、好適なペーストの粘度は、０．２５８から０．５４５の範囲であることが分かる。
【実施例９】
油の種類とエマルジョンの凍結乾燥製剤化の可否
油として実施例２の種類のものを使用し、実施例７と同様にしてエマルジョンの凍結乾燥製剤を調製し、その製剤の可否を評価した。その結果を表９に示す。
表９に示されるように、油の種類が相違してもエマルジョンの凍結乾燥製剤化には大きな影響は与えず、使用するＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度の大きく影響されることが分かった。また、実施例８を参考にすれば、良好な凍結乾燥製剤が得られるところのＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの好適な粘度は０．２８から０．５５であることが示されている。
【実施例１０】
製剤例
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ２６４０ｍｇを用いて、スクワラン３５．２ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン４００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下６０℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液９２４ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（７，０００ｒｐｍ（逆回転）／ｍｉｎ×５分間）を行い、さらに、３６．６ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化（１２，０００ｒｐｍ（正転）／ｍｉｎ×１０分間）を行った。最後に、１．５ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し攪拌（７，０００ｒｐｍ（逆回転）×１分間）し、ポリソルベート８０最終濃度を０．４ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、４ｗ／ｗ％マンニトール水溶液３５００ｇを添加し、４０００ｇの最終製剤を得た。（このときの処方は、ＣＷＳ：０．６ｍｇ／ｍＬ、ＳＱＡ：０．８ｗ／ｗ％、Ｔｗｅｅｎ８０：０．１ｗ／ｗ％、マンニトール：３ｗ／ｗ％）
この水中油型エマルジョンをバイアルに２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製あるいはＵＬＶＡＣ１３Ａ、日本真空社製）を用いて行った。
【実施例１１】
分散補助溶媒についての検討
ＢＣＧ−ＣＷＳ（２１０ｍｇ）を各種有機溶媒（トルエン、ヘキサン、ヘプタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン；各２０ｍｌ）中に、超音波処理により分散し、分散原薬を調製した後、さらに、必要に応じてポッター型ホモジナイザー（２０ｍｌ型）により攪拌（３０００ｒｐｍ ｘ５分）した。得られた分散原薬について粒度分布評価を行った。さらに、実施例１０と同様に、上記分散原液にスクワラン（２．６４ｇ）を混合し、さらに有機溶媒を留去することにより調製したペーストの粒度分布評価を行った。
粒度分布は、分散原薬については、０．１ｍｇＣＷＳ／ｍＬの濃度で、マイクロトラックＵＰＡ（ハネウェル社製）、およびレーザー回折式粒度測定装置（ＳＡＬＤ３０００；島津製作所製）を用いて測定した。また、ペーストは、スクワランで希釈し、０．１〜０．２ｍｇＣＷＳ／ｍＬＳＱＡの濃度で、レーザー回折式粒度測定装置（ＳＡＬＤ３０００；島津製作所製）を用いて測定した。
［結果］
トルエン中に分散された分散原薬の粒度分布を調べた結果、４００〜６００ｎｍに分布するサブミクロンでのピークと、１０μｍを中心とした大きな粒子の分布の二つに分かれた。
次に、上記トルエン分散原薬にスクワランを混合した混合物の粒度分布、およびこれをさらにポッター型ホモジナイザーでさらに分散して調製したペーストの粒度分布を調べた結果、これらはいずれもスクワランを混合する前の粒度分布をほぼ維持していた。
一方、分散補助溶媒として、ヘキサン、ヘプタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン等において、トルエン分散で見られた数十μｍを中心とした粒度分布は減少した（図１）。９０％ヘプタン／１０％エタノールを用いた場合の、ペースト内のＢＣＧ−ＣＷＳ原薬の粒度分布結果を図２に示す。図２のとおり、サブピークは無く、０．３〜２μｍに単一ピークを持つ均一な混合物が得られていることがわかった。
表１０には、各溶媒における溶媒に分散したＢＣＧ−ＣＷＳ原薬をマイクロトラックＵＰＡで測定した場合の、Ｄ１０％値、Ｄ９０％値、および平均粒子径の実測値を示す。
以下の表１１には、各溶媒における溶媒に分散したＢＣＧ−ＣＷＳ原薬をＳＡＬＤ３０００で測定した場合の、Ｄ１０％値、Ｄ９０％値、および平均粒子径の実測値を示す。
以下の表１２には、各溶媒における溶媒にＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストをスクワランで希釈し、ＳＡＬＤ３０００で粒子径を測定した場合の、Ｄ１０％値、Ｄ９０％値、および平均粒子径の実測値を示す。
【実施例１２】
製剤例
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ１３２０ｍｇを用いて、スクワラン１７．６ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン２００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下６０〜７０℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液４６２．０ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（７，０００ｒｐｍ（逆回転）／ｍｉｎ×５分間）を行い、さらに、１８．３ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化（１２，０００ｒｐｍ（正転）／ｍｉｎ×５分間）を行った。最後に、０．７６ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し攪拌（７，０００ｒｐｍ（逆回転）×１分間）し、ポリソルベート８０最終濃度を０．４ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、４ｗ／ｗ％マンニトール水溶液１５００ｇを添加し、２０００ｇの最終製剤を得た。（このときの処方は、ＣＷＳ：０．６ｍｇ／ｍＬ、ＳＱＡ：０．８ｗ／ｗ％、Ｔｗｅｅｎ８０：０．１ｗ／ｗ％、マンニトール：３ｗ／ｗ％）
この水中油型エマルジョンをバイアルに１ｍＬまたは２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製あるいはＵＬＶＡＣ１３Ａ、日本真空社製）を用いて行った。
【実施例１３】
製剤例
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ２６４０ｍｇを用いて、スクワラン７０．４ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン４００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下６０〜７０℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液８８８．７ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（７，０００ｒｐｍ（逆回転）／ｍｉｎ×５分間）を行い、さらに、３６．７ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化（１２，０００ｒｐｍ（正転）／ｍｉｎ×１０分間）を行った。最後に、１．５ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し攪拌（７，０００ｒｐｍ（逆回転）×１分間）し、ポリソルベート８０最終濃度を０．４ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、１．２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０／６．７ｗ／ｗ％マンニトール水溶液３０００ｇを添加し、４０００ｇの最終製剤を得た。（このときの処方は、ＣＷＳ：０．６ｍｇ／ｍＬ、ＳＱＡ：１．６ｗ／ｗ％、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｗ／ｗ％、マンニトール：５ｗ／ｗ％）
この水中油型エマルジョンをバイアルに１ｍＬまたは２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製あるいはＵＬＶＡＣ１３Ａ、日本真空社製）を用いて行った。
【実施例１４】
製剤例
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ１３２０ｍｇを用いて、スクワラン３５．２ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン２００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下６０〜７０℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液４４４．３ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（７，０００ｒｐｍ（逆回転）／ｍｉｎ×５分間）を行い、さらに、１８．４ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化（１２，０００ｒｐｍ（正転）／ｍｉｎ×５分間）を行った。最後に、０．７６ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し攪拌（７，０００ｒｐｍ（逆回転）×１分間）し、ポリソルベート８０最終濃度を０．４ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、１．２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０／６．７ｗ／ｗ％マンニトール水溶液１５００ｇを添加し、２０００ｇの最終製剤を得た。（このときの処方は、ＣＷＳ：０．６ｍｇ／ｍＬ、ＳＱＡ：１．６ｗ／ｗ％、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｗ／ｗ％、マンニトール：５ｗ／ｗ％）
この水中油型エマルジョンをバイアルに１ｍＬまたは２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製あるいはＵＬＶＡＣ１３Ａ、日本真空社製）を用いて行った。
【実施例１５】
速結乾燥後における粒度分布変化
実施例１２で調製したスクワラン１．６％処方（ＢＣＧ−ＣＷＳ１ｇに対して、スクワラン２６．７ｇを含むもの；粘度値：０．４３ｐｏｉｓｅ）の凍結乾燥品について、凍結乾燥前後における粒度分布変化を、実施例１１と同様の方法で評価した。
その結果、図４に示すように、凍結乾燥製剤を再懸濁した場合も、凍結乾燥前の水中油型エマルジョン（図３）と同様に、平均粒子径２〜３μｍの単一ピークの粒度分布を維持し、９０％径値が約５μｍであった。一方、スクワランの含量を減らした処方では、さらに粒子径が大きい（１０μｍ〜５０μｍ）粒子が混在した。凍結乾燥後の粒度分布については、大きな粒子の存在比率の指標となる９０％径値が、１．６％処方では５μｍ前後となった。
以上の結果から、実施例１２の製剤は凍結乾燥前後における粒度分布維持性が高いことが判った。
【実施例１６】
凍乾製剤保存による性状および懸濁液中原薬濃度変化
実施例１２で調製したスクワラン１．６％処方（ＢＣＧ−ＣＷＳ１ｇに対して、スクワラン２６．７ｇを含むもの；粘度値：０．４３ｐｏｉｓｅ）製剤について、長期・加速保存条件として５℃、２５℃、４０℃、および苛酷条件として６０℃、８０℃での安定性を検討した。評価基準は、実施例１７に記載の懸濁液原薬濃度をミコール酸定量法により算出し、懸濁液の溶状を目視により評価した。
その結果、表１３に示すように、スクワラン１．６％処方製剤において、４０℃Ｘ３ヶ月保存品で懸濁後における付着物の生成およびそれに伴う懸濁液原薬濃度の低下は認められなかった。また、表１４に示すように、６０℃、８０℃Ｘ１ヶ月保存の苛酷条件下においても、付着物の生成および懸濁液原薬濃度の低下は全く認められなかった。
以上の結果から、実施例１２の製剤は、優れた保存安定性を示すことが判った。
【実施例１７】
ＢＣＧ−ＣＷＳに含まれるミコール酸の定量
（１）溶液の調製
▲１▼ ＢＣＧ−ＣＷＳは、ＢＣＧ菌東京株（日本ビーシージー製）から公知の方法（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，５２，９５−１０１（１９７４）））で調製した。ＢＣＧ−ＣＷＳの被験サンプル、および生物活性が確認されているＢＣＧ−ＣＷＳの標準品約１５ｍｇをそれぞれ精密に量り、トルエンまたはヘプタン／エタノール（９９．５）混液（９：１）を加えて正確に２５ｍＬとし、超音波を１５分間照射し、試料原液および標準原液とした。試料原液２ｍＬを正確に量り、溶媒を留去した。また、標準原液１、２および３ｍＬを正確に量り、同様に溶媒を留去した。
▲３▼ 試料溶液および標準溶液にそれぞれ内標準溶液（エルカ酸（アルドリッチ製）のトルエン溶液（１ｇ／５０００ｍＬ）またはトリコセン酸（東京化成製）のトルエン溶液（３ｇ／１０００ｍＬ））１００μＬを正確に加えた。
▲４▼ ０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／トルエン／水混液（１０：１０：１）溶液１ｍＬを加え、超音波を１分間照射した。
▲５▼ ６５℃の恒温槽で３時間加熱し、放冷後、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸５００μＬを正確に加え、よく振り混ぜた。さらにヘキサン２ｍＬを加え、よく振り混ぜた後静置し、上層（有機層）をサンプル瓶に移した。同操作を、ヘキサン１ｍＬずつを用いて、さらに２回繰り返した。
▲６▼ 集めた上層に水１ｍＬ加え、よく混ぜ、遠心分離を行ったのち、水層（下層）を除去した。前記操作をさらに１回繰り返した。
▲７▼遠心型エバポレーターまたは窒素を用いて上層の溶媒を留去した。
▲８▼残渣にトルエン４ｍＬを加えて溶かした後、この溶液２００μＬをサンプル瓶に正確に量り、さらにトルエン３００μＬおよび蛍光標識化試液（ＡＤＡＭ（９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ；フナコシ製）のアセトン溶液（１ｇ／２５０ｍＬ）をさらにメタノールで正確に１０倍に希釈したもの）５００μＬを加え、４０℃で５時間以上反応させた。反応終了後、すみやかに５℃に冷却した。これらをそれぞれ試料溶液および標準溶液として分析に供した。
（２）分析
試料溶液および標準溶液の各１０μＬをＨＰＬＣにて以下の条件で分析した。
試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、内標準物質のピーク面積に対するミコール酸誘導体のピーク面積比を求め、標準溶液から得られた検量線を用いて、被験サンプルの力価を求めた。
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の設定条件］
カラム温度：５０℃
カラム：関東化学製Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ（登録商標）ＲＰ−１８ ＧＰ １５０−４．６（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ）、または住化分析センター製ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１１（５μｍ、４．６ｍｍφ×２５ｃｍ）
または野村化学製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ（登録商標）（３μｍ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、または５μｍ、４．６ｍｍφ×２５ｃｍ）
溶媒：Ａ液：メタノール／水混液（９：１）Ｂ液：２−プロパノールグラジエント条件またはＡ液：メタノール Ｂ液：トルエングラジエント条件を表１５に示した。
移動相の流速：１．０または１．５ｍＬ／ｍｉｎ
蛍光検出条件：
励起波長：３６５ｎｍ
検出波長：４１２ｎｍ
（３）結果
図５に代表的なクロマトグラム、図６に標準品について複数濃度でミコール酸含量を測定した結果をプロットして作成した検量線を示した。
試料溶液のミコール酸の溶出パターンは、標準溶液と比較し、同様の位置に同様の強度のピークを認めることを確認した。また、被験サンプルの測定結果から図６の検量線を用いて力価を算出した結果を、表１６に示した。
上記のように、ＢＣＧ−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬品の製造中間体となるＢＣＧ−ＣＷＳの各製造ロットにおける力価を評価することができた。
【実施例１８】
菌株の同定および定量
（１）溶液の調製
▲１▼ＢＣＧ菌東京株（日本ビーシージー製）を公知の方法で死滅したものを約１０ｍｇ（ＣＷＳ量に換算して）を精密に量り、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／水混液（１：１）溶液２ｍＬを加えて、１００℃で２時間反応させた。放冷後、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸１．５ｍＬを加えて酸性にし、よく振り混ぜた。
▲２▼ 別に、生物活性が確認されているＢＣＧ−ＣＷＳの標準品約１５ｍｇを精密に量り、トルエンまたはヘプタン／エタノール（９９．５）混液（９：１）を加えて正確に２５ｍＬとし、超音波を１５分間照射し、標準原液とした。標準原液１、２および３ｍＬを正確に量り、溶媒を留去した。０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／トルエン／水混液（１０：１０：１）溶液１ｍＬを加え、超音波を１分間照射した。６５℃の恒温槽で３時間加熱し、放冷後、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸５００μＬを正確に加え、よく振り混ぜた。
▲３▼ 試料溶液および標準溶液にそれぞれヘキサン２ｍＬを加え、よく振り混ぜた後静置し、上層（有機層）をサンプル瓶に移した。同操作を、ヘキサン１ｍＬずつを用いて、さらに２回繰り返した。
▲４▼ 集めた上層に水１ｍＬ加え、よく混ぜ、遠心分離を行ったのち、水層（下層）を除去した。前記操作をさらに１回繰り返した。
▲５▼ 遠心型エバポレーターまたは窒素を用いて上層の溶媒を留去した。
▲６▼ 残渣にトルエンを約０．３ｍｇ／ｍＬ（ＣＷＳ量に換算して）となるよう一定量を正確に加えて溶かし、この溶液２００μＬをサンプル瓶に正確に量り、さらにトルエン３００μＬおよび蛍光標識化試薬（ＡＤＡＭ（９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ）；フナコシ製）５００μＬを加え、４０℃で５時間以上反応させた。反応終了後、すみやかに５℃に冷却した。これらをそれぞれ試料溶液および標準溶液として分析に供した。
（２）分析
試料溶液および標準溶液の各１０μＬをＢＣＧ−ＣＷＳのＨＰＬＣと同じ試験条件で分析した。試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、試料溶液のミコール酸誘導体のピーク面積を求め、標準溶液のミコール酸誘導体のピーク面積から得られた検量線を用いて、被験サンプル（菌体）におけるＣＷＳ含量（％）を求めた。
（３）結果
被験サンプルの測定結果を表１７に示した。
上記のように、ＢＣＧ−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬品の製造中間体となるＢＣＧ菌・東京株の菌体について、各製造ロットにおける有効成分量を評価することができた。
【実施例１９】
凍結乾燥製剤の分析例
（１）溶液の調製
▲１▼ ＢＣＧ−ＣＷＳ凍結乾燥製剤は実施例１０に記載された方法で調製した。生物活性が確認されているＢＣＧ−ＣＷＳ凍結乾燥製剤の標準品約１５ｍｇを精密に量り、トルエンまたはヘプタン／エタノール（９９．５）混液（９：１）を加えて正確に２５ｍＬとし、超音波を１５分間照射し、標準原液とした。標準原液１、２および３ｍＬを正確に量り、溶媒を留去した。標準原液に内標準溶液（エルカ酸（アルドリッチ製）のトルエン溶液（１ｍＬ／５０００ｍＬ）またはトリコセン酸（東京化成製）のトルエン溶液（３ｇ／１０００ｍＬ）））１００μＬを正確に加え、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／トルエン／水混液（２０：１０：１）溶液１ｍＬを加え、超音波を１分間照射した。▲２▼ ＢＣＧ−ＣＷＳ凍結乾燥製剤の被験サンプルを精密に量り、内標準溶液１００μＬを正確に加え、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／トルエン／水混液（１０：１０：１）溶液１ｍＬを加え、超音波を１分間照射した。
以下、実施例１と同様に加水分解を行い、ミコール酸を溶媒抽出し、標識化を行った。ただし、用いる標識化試薬は１０倍濃度が濃いものを用いた。
（２）分析
試料溶液および標準溶液の各１０μＬをＨＰＬＣにて以下の条件で分析した。
試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、内標準物質のピーク面積に対するミコール酸誘導体のピーク面積比を求め、標準溶液から得られた検量線を用いて、被験サンプルの力価を求めた。
（３）結果
被験サンプルの測定結果を表１８に示した。
上記のように、ＢＣＧ−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬品について、各製造ロットにおける力価を評価することができた。
【実施例２０】
ＢＣＧ−ＣＷＳの菌株の同定
実施例１と同様の方法でＢＣＧ菌東京株のＣＷＳと、ＢＣＧ菌パスツール株のＣＷＳの、ミコール酸の溶出パターンをＨＰＬＣで分析した。結果を図７に示した。
図７からわかるように、ＢＣＧ菌の株の種類によって、含まれるミコール酸の分子種およびミコール酸分子の量比が異なり、クロマトグラムで判別できることが明らかとなった。
参考例１ ＢＣＧ−ＣＷＳ標準品の生物活性評価
（１）方法
ＲＡＷ２６４．７細胞を９６穴プレートに播種後３７℃、５％二酸化炭素、湿条件で５時間培養し、複数濃度のＢＣＧ−ＣＷＳ（標準品）の生理食塩水懸濁液を添加して、さらに約１５時間培養した。培養上清のＴＮＦ−□量をＡＮ’ＡＬＹＺＡ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−□□Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキットを用いてＥＬＩＳＡ測定を行った。付属の手順書に従い、４５０ｎｍの吸光度を測定することによって測定した。上記ＢＣＧ−ＣＷＳの生理食塩水懸濁液のミコール酸含量を、実施例１７記載の方法で測定した。
（２）結果
測定したＢＣＧ−ＣＷＳのミコール酸含量とＴＮＦ−α量をプロットした結果を図８に示した。
上記の結果から、ＢＣＧ−ＣＷＳ標準品において、本発明の方法で検定したミコール酸含量の分析値と、実際の生物活性値（ＴＮＦ−α産生誘導活性）が相関していることがわかった。すなわち、ミコール酸含量を生物活性の力価の指標として用いることができることが確認できた。
【発明の効果】
本発明により、安定な水中油型エマルジョン製剤が提供できる。また、固体成分を油中に含有する安定で凍結乾燥可能な水中油型エマルジョン製剤とその凍結乾燥製剤が提供できることから、この方法を用いて、ＢＣＧ−ＣＷＳ製剤を創出でき、免疫賦活抗がん療法が、より効果的に実施できるようになった。
本発明により、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳに含まれる高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムのパターンから細菌−ＣＷＳ、および該細菌−ＣＷＳを含む製剤等における細菌の属、種および株を同定、確認することができた。また、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳを含有する製造中間体菌体、原薬および製剤の力価を定量的に評価することが可能になった。このことにより、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳおよびそれを有効成分とする医薬品の品質を一定に保ち、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳを含有する医薬品を提供することが可能になった。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【技術分野】
本発明は、細菌の細胞壁骨格成分（細菌−ＣＷＳ）を有効成分として含有する凍結乾燥製剤、該凍結乾燥製剤の製造中間体および該凍結乾燥製剤、該製造中間体の調製方法、ならびにミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬品の分析方法等に関する。
【背景技術】
微生物死菌、細菌の細胞壁骨格成分（以下細菌−ＣＷＳと略する）は、免疫賦活作用を有し、例えば動物モデルを用いた実験的腫瘍系、およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている。
細胞壁骨格成分を油成分中に分散、乳化させ、水中油型エマルジョン製剤として投与した場合、免疫賦活作用による抗腫瘍効果などが著しく高まることが知られている。例えばウシ型結核菌の細胞壁骨格成分（以下、ＢＣＧ−ＣＷＳと略す）の水中油型エマルジョンを用いた癌免疫療法では、ヒトの癌治療において優れた成績が得られたことが報告されている（Ｐｒｏ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，７０，Ｓｅｒ．Ｂ ２０５−２０９（１９９４）、Ｐｒｏ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，７４，Ｓｅｒ．Ｂ ２０５５０−５５（１９９８））。この水中油型エマルジョン製剤は、細菌−ＣＷＳを油中に分散したペースト状の原体に、界面活性剤を含む水を加えてエマルジョン化する等して調製することができる（Ｊ．Ｎａｔ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．４８，８３１−８３５（１９７２）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，９２，８６９−８７９（１９６６）、Ｇａｎｎ，６９，６１９−６２６（１９７８））。
一般に、細菌−ＣＷＳを含有する水中油型エマルジョン製剤は非常に不安定であり、数日で不溶性凝集物が生成する。その傾向は油成分の量が少ない場合、特に顕著である。一方、油成分の多い水中油型エマルジョン製剤は、投与された生体への負担が大きく、副作用をもたらす可能性がある。そのため、現在、臨床現場では、使用時に必要な量の水中油型エマルジョン製剤を手作業にて用時調製している。しかし、手作業による用時調製では、常に一定規格を有する製剤を調製することは困難である。よって、水中油型エマルジョン製剤を凍結乾燥して保存安定性の高い凍結乾燥製剤とし、使用時に注射用蒸留水等の水性溶媒を加えて水中油型エマルジョン製剤を再懸濁させる方法が、臨床現場での使い易さ、製剤の保存安定性の点から好ましい。このように、事実上医薬品として実用化できる、恒常的生産が可能な、安定な水中油型エマルジョン製剤やその凍結乾燥製剤が求められている。
一方、細菌−ＣＷＳを有効成分とする製剤が調製できたとしても、医薬品として上市するには、その生物学的力価を評価し、有効成分の同一性を確認しなければならない。通常、化学物質を有効成分とする医薬品は有効成分が化学分析により測定できるため、その同一性や含量を評価できる。
しかしながら、細菌−ＣＷＳはミコール酸等の高級脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンからなる３層構造を有する生体高分子であり、水や有機溶媒に不溶であるため、化学物質を測定するために通常用いられるＨＰＬＣ、ＧＣ等の分析方法では測定することができない。
細菌は、属、種および株によって構成成分が異なるが、結核菌、ＢＣＧ菌等のミコバクテリウム属細菌の同定方法として、遺伝子解析による方法のほか、ミコバクテリウム属細菌等に特徴的に存在するミコール酸を分析する方法が知られている。すなわち、ミコバクテリウム属細菌等をアルカリ加水分解した後、有機溶媒でミコール酸を抽出し、これをＨＰＬＣで分析することにより、その溶出パターンから、属、種の同定が可能であることが報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３２７−１３３０，Ｍａｙ １９９２）。
しかし、細菌−ＣＷＳ中のミコール酸を正確に定量する方法は知られていない。
【発明の開示】
本発明の課題は、細菌の細胞壁骨格成分を有効成分とする、安定で凍結乾燥可能な水中油型エマルジョン、本発明の水中油型エマルジョンの凍結乾燥製剤、本発明製剤の原料である細菌−ＣＷＳやその製造中間体に当たる細菌−ＣＷＳ含有ペースト、これらの調製方法、および本発明製剤中の有効成分を同定しその力価を定量的に測定する方法、有効成分として用いられる細菌−ＣＷＳの由来細菌の属、種および株を同定する方法、ならびに本発明の製剤およびその製造中間体が標準品と同一であることを検定する方法を提供することにある。
本発明者らは、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する安定性に富む水中油型エマルジョン、および凍結乾燥製剤を得るべく、細菌−ＣＷＳ、油、界面活性剤、および安定化剤等の組成、および調製工程について、鋭意検討を行った。まず、安定な水中油型エマルジョンおよび、優れた再懸濁安定性を有するエマルジョンの凍結乾燥製剤を良好に調製するには、製造中間体となる細胞壁骨格成分および油からなるペーストの性状が重要であると考えた。そこで、油の種類、油の組成、および油と細胞壁骨格成分の比率等を指標として、詳細に検討を進めたところ、安定な水中油型エマルジョンの性状を左右する大きなファクターは、細菌−ＣＷＳと油からなる細胞壁骨格成分含有ペーストの粘度であることを見出した。また、良好な粘度を得るための、細胞壁骨格成分と油の比率を明らかにした。
すなわち、細菌−ＣＷＳは、水、油のいずれにも溶解しないため、均一な粒度分布を有するエマルジョンとするのが困難である。特に、油の粘度が高い場合および油の量が少ない場合、混合攪拌時に均一に細菌−ＣＷＳを油中に拡散させることができないことがわかった。種々の油を用いて検討したところ、油の種類によらず、ある一定の粘度以下で、エマルジョン化に適した細菌−ＣＷＳ含有ペーストが得られることがわかった。具体的には粘度約０．７ｐｏｉｓｅ以下の細菌−ＣＷＳ含有ペーストを用いて乳化工程を行えば、良好な粒度分布を示すエマルジョンが得られることがわかった。
一方で、細菌−ＣＷＳに対する油の割合が高く、低い粘度を有する細菌−ＣＷＳ含有ペーストを用いた場合、問題なくエマルジョンを得ることができるものの、凍結乾燥後に水を加えて再懸濁した場合、好適な粒度分布のエマルジョンが再現できないことも判明した。鋭意検討した結果、粘度約０．２ｐｏｉｓｅ以上の細菌−ＣＷＳ含有ペーストであれば、凍結乾燥後の再懸濁安定性も維持できることがわかった。
また、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する凍結乾燥製剤においては、上記細菌−ＣＷＳ含有ペーストの性状の他、界面活性剤および安定化剤によって、その安定性、および再懸濁した後に得られる水中油型製剤の安定性（再懸濁安定性）等の製剤品の品質は異なる。
上記国際公開パンフレットＷＯ００／３７２４には、グリシンを安定化剤として用いる方法が知られているが、安定な凍結乾燥製剤を得るためには、約９００ｍＭ〜１２００ｍＭ（約６．９％〜９．２％）のグリシンが必要であることが記載されている。しかし、グリシンの場合３００ｍＭ（２．３％）が生体にとって等張濃度であるため、このような高濃度では生体への負担が懸念される。
そこで、鋭意検討した結果、安定化剤としてマンニトールを用いることにより、再懸濁安定性に富む凍結乾燥製剤を調製できることがわかった。
本発明者は鋭意検討した結果、前記本発明の細菌−ＣＷＳ含有ペーストの水中油型エマルジョンにおいて、１〜１０％、好ましくは１〜５％のマンニトールを安定化剤として用いることによって、凍結乾燥製剤の安定性、および再懸濁した後の水中油型エマルジョンの安定性が高まることがわかった。
さらに、発明者は、該細菌−ＣＷＳ含有ペーストの調製工程について検討した。
既に、細菌−ＣＷＳと油を混合する際、有機溶媒で一旦希釈して攪拌した後、溶媒を留去する方法が、前記国際公開パンフレットＷＯ００／３７２４に記載されている。
発明者らは、種々の有機溶媒を分散補助溶媒として用いて鋭意検討を行ったところ、非極性溶媒を用いることによって、極性溶媒のみを用いた場合よりも優れた細菌細胞壁骨格成分含有ペーストが得られることを見出した。
本発明は、上記の知見に基づき、完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、
［１］細菌−ＣＷＳおよび油からなる細菌−ＣＷＳ含有ペーストであり、０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）以下の粘度を有するペースト、
［２］０．２〜０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する［１］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［３］０．２８〜０．５５ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する［１］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［４］細菌−ＣＷＳの粒子径が、０．１５μｍ〜６μｍであることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［５］細菌−ＣＷＳの粒子径において、Ｄ１０％：０．３８μｍ以上、Ｄ９０％：０．７０μｍ以下であることを特徴とする［４］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［６］細菌−ＣＷＳがＢＣＧ−ＣＷＳである、［１］〜［５］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［７］油が、スクワラン、スクワレン、シンセラン４、落花生油、ツバキ油、大豆油、流動パラフィン、およびオレイン酸エチルの中から選ばれる１または複数の油の混合物である、［１］〜［６］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［８］油が、スクワラン、スクワレン、大豆油、流動パラフィンおよびオレイン酸エチルの中から選ばれる２種類の油の混合物である、［７］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［９］油が、大豆油、流動パラフィンおよびオレイン酸エチルの中から選ばれる１種の油とスクワランとの混合物である、［８］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［１０］油が、オレイン酸エチルとスクワランとの１：１の混合物である、［９］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［１１］油が、スクワランである、［７］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［１２］細菌−ＣＷＳがＢＣＧ−ＣＷＳであって、ＢＣＧ−ＣＷＳ約０．６７ｇに対して、スクワラン６．６ｇ〜３５．２ｇを含有することを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［１３］以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする、細菌−ＣＷＳ含有ペーストの調製方法、
（１）細菌−ＣＷＳおよび油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合する工程、
（２）（１）の有機溶媒を留去する工程、
［１４］有機溶媒がエーテル系溶媒である、［１３］記載の調製方法、
［１５］ 有機溶媒が炭化水素系溶媒、またはハロゲン化炭化水素系溶媒である、［１３］記載の調製方法、
［１６］ 有機溶媒がハロゲン化炭化水素系溶媒であって、該ハロゲン化炭化水素系溶媒が、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、またはジクロロエタンである、［１５］記載の調製方法、
［１７］ 有機溶媒が炭化水素系溶媒であって、該炭化水素系溶媒が、ヘプタン、またはヘキサンである、［１５］記載の調製方法、
［１８］ 有機溶媒が、５〜２０％（Ｖ／Ｖ）のアルコール系溶媒を含むことを特徴とする、［１５］〜［１７］のいずれか記載の調製方法、
［１９］ ［１３］〜［１８］のいずれか記載の調製方法によって得られる細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［２０］細菌がＢＣＧ菌であることを特徴とする［１９］記載のペースト、
［２１］油がスクワラン、または流動パラフィンであることを特徴とする、［１９］または［２０］記載のペースト、
［２２］［１］〜［１２］、および［１９］〜［２１］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有することを特徴とする水中油型エマルジョン、
［２３］水２Ｌあたり、０．６６ｇ〜３．３５ｇの細菌−ＣＷＳ、および０．４％〜８重量％の油を含有することを特徴とする、［２２］記載の水中油型エマルジョン、
［２４］安定化剤として１〜１０％のマンニトールを含有する［２２］または［２３］記載の水中油型エマルジョン、
［２５］界面活性剤として０．０１％〜３％のポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルを含有する［２２］〜［２４］のいずれか記載の水中油型エマルジョン、
［２６］ポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン８０である［２５］記載の水中油型エマルジョン、
［２７］以下の▲１▼〜▲２▼の特徴を有する［２２］〜［２６］のいずれか記載の水中油型エマルジョン、
▲１▼エマルジョン油滴粒子径が、０．２〜３０μｍである。
▲２▼細菌−ＣＷＳが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性を示す。
［２８］エマルジョン油滴粒子径において、Ｄ１０％：０．５μｍ以上、Ｄ９０％：２０μｍ以下であることを特徴とする［２７］記載の水中油型エマルジョン、
［２９］ 以下の（１）〜（２）の工程を含むことを特徴とする、［２２］〜［２８］のいずれか記載の水中油型エマルジョンの調製方法、
（１）［１］〜［１２］、および［１９］〜［２１］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペーストと、界面活性剤を含む水溶液の混合液を、曇点以上の温度で乳化する工程、
（２）安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程、
［３０］前項（２）の工程が、曇点以下の温度で実施されることを特徴とする［２９］記載の調製方法。
［３１］ 前項の（１）における乳化する工程が、以下の（３）〜（４）の工程を含むことを特徴とする［２９］または［３０］記載の調製方法、
（３）［１］〜［１２］、および［１９］〜［２１］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペーストと、０．０２％〜０．８％の界面活性剤を含む水溶液の混合液を乳化する工程（粗乳化工程）、
（４）（３）の混合液に界面活性剤を含む水溶液を加えて界面活性剤濃度を調整し、強攪拌して本乳化を行う工程、
［３２］界面活性剤がポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルである［３１］記載の調製方法、
［３３］記載のポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン８０である［３２］記載の水中油型エマルジョンの調製方法、
［３４］安定化剤がマンニトールである［２９］〜［３３］のいずれか記載の水中油型エマルジョンの調製方法、
［３５］［２２］〜［２８］のいずれか記載のエマルジョンを凍結乾燥することによって得られる、凍結乾燥製剤、
［３６］ 粒度分布において、粒子径が、０．１５〜６μｍであることを特徴とする、細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌−ＣＷＳ粒子集合体）、
［３７］ 粒度分布において、粒子径が、０．２〜２μｍであることを特徴とする、細菌−ＣＷＳ粒子集合体、
［３８］ 粒度分布において、Ｄ１０％が０．２以上であり、Ｄ９０％が０．７以下であり、かつ、単一ピークを有することをことを特徴とする［３６］または［３７］記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体、
［３９］ 粒度分布において、Ｄ１０％が０．２３±０．０５であり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５であり、かつ、単一ピークを有することをことを特徴とする［３６］〜［３８］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体、
［４０］ 脂肪族炭化水素系溶媒を含む溶媒中で分散することを特徴とする、［３６］〜［３９］のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体の調製方法、
［４１］ 溶媒が、脂肪族炭化水素系溶媒と、アルコール系溶媒の混合物であることを特徴とする［４０］記載の調製方法、
［４２］ 溶媒が、５〜２０％エタノールを含むヘプタンであることを特徴とする［４１］記載の調製方法、
［４２−２］ ［４０］〜［４２］のいずれか記載の調製方法により得られることを特徴とする細菌−ＣＷＳ、
に関する。
さらに、本発明はこの態様において、
［４２−３］ 粒度分布において、粒子径が０．１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．１５〜６μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ〜２μｍである細菌−ＣＷＳ粒子集合体を含有する、本発明の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［４２−４］ 細菌−ＣＷＳ粒子集合体が粒度分布においてＤ１０％が０．２３±０．０５であり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５であり、かつ単一ピークを有する、［４２−３］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、
［４２−５］ ［４２−３］または［４２−４］記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型エマルジョン、
［４２−６］ ［４２−５］記載のエマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。
［４２−７］ 本発明のエマルジョンからなる医薬組成物、に関する。
また、ミコバクテリウム属のＣＷＳには構成成分として約３０〜４５％の高級脂肪酸が含まれ、高級脂肪酸のパターンによって細菌の属、種等を同定する方法が知られていた。しかし、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳに含まれる高級脂肪酸の量を正確に定量する方法や、該高級脂肪酸によって細菌−ＣＷＳの由来細菌の属、種または株を同定する方法は知られていなかった。発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳに含まれる高級脂肪酸を抽出して分析することによって、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌の菌種・菌株が同定され、該細菌のＣＷＳの力価を評価できることを見出した。さらに、検出感度を上げるべく誘導体へ変換した後、ＨＰＬＣ等で分析することによって、高級脂肪酸の定量を効率的に行う方法を確立した。
一方、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳは、ミコール酸等の高級脂肪酸、糖類、ペプチドグリカン等からなる生体高分子であるが、力価に影響を与えるその成分、成分比および分子量は、細菌の培養条件により異なる。そのため、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳについては、その製造ロットごとの同等性および力価を評価する必要がある。
発明者らは、鋭意検討した結果、ＢＣＧ菌のＣＷＳ（ＢＣＧ−ＣＷＳ）において、ＣＷＳに含まれるミコール酸の量と、ＢＣＧ−ＣＷＳの生物活性が相関していることを見出し、簡便な力価評価方法を確立した。具体的には、ＢＣＧ−ＣＷＳ標準品において、ミコール酸含量と、ＢＣＧ−ＣＷＳの生物活性、すなわち免疫賦活能の一つであるＴＮＦ−α産生誘導活性が比例関係を示すことがわかった（図８）。すなわち、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌の、ＣＷＳの構成成分である高級脂肪酸を定量することにより、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳの免疫賦活剤、および／または、抗腫瘍剤としての力価を評価できることがわかった。また、菌体、原薬および製剤から得た高級脂肪酸のクロマトグラムから、細菌の属、種および株を同定できることがわかった。
本発明は、上記の知見を基に完成するに至ったものである。すなわち本発明は、
［４３］ 細菌の細胞壁骨格成分（Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ、以下ＣＷＳと称する。）の菌種・菌株の同定方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法；
（１）細菌のＣＷＳ中に含まれる、高級脂肪酸を分離および／または抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（２）（１）の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程、
（３）（２）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの菌種・菌株を評価する工程、
［４４］ 前項の工程（２）が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、［４３］記載の方法、
［４５］ 前記［４３］における工程（３）が、細菌のＣＷＳの標準品と比較することを含む、［４３］または［４４］記載の方法、
［４６］ 細菌の細胞壁骨格成分（Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ、以下ＣＷＳと称する。）の力価検定方法であって、以下の工程（１）、（４）、および（５）を含むことを特徴とする方法；
（１）細菌のＣＷＳ中に含まれる、高級脂肪酸を分離・抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（４）（１）の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、
（５）（４）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの免疫賦活能を評価する工程、
［４７］ 高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する（４）の工程が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を蛍光標識化して蛍光標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、［４６］記載の方法、
［４８］ 細菌のＣＷＳの免疫賦活能を評価する（５）の工程が、細菌のＣＷＳの標準品と比較することを含む、［４６］または［４７］記載の方法、
［４９］ 高級脂肪酸誘導体が高級脂肪酸エステルであることを特徴とする、［４３］〜［４８］のいずれか記載の方法、
［５０］ 高級脂肪酸誘導体が、蛍光標識された誘導体であることを特徴とする［４９］記載の方法、
［５１］ 細菌がミコバクテリウム属またはノカルジア属の細菌であることを特徴とする、［４３］〜［５０］のいずれかに記載の方法、
［５２］ ミコバクテリウム属の細菌がＢＣＧ菌であることを特徴とする、［５１］記載の方法、
［５３］ 高級脂肪酸がミコール酸であることを特徴とする、［４３］〜［５２］のいずれかに記載の方法、
に関するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、分散補助溶媒にヘプタンを用いた場合のペースト中のＢＣＧ−ＣＷＳの粒度分布を示した。
図２は、分散補助溶媒に９０％ヘプタン／１０％エタノールを用いた場合のペーストの粒度分布を示した。
図３は、凍結乾燥前のスクワラン１．６％処方製剤における、水中油型エマルジョンの粒度分布を示した。
図４は、凍結乾燥後のスクワラン１．６％処方製剤における、水中油型エマルジョンの粒度分布を示した。
図５は、被験サンプルのクロマトグラムを示す図であり、横軸はＨＰＬＣの保持時間、縦軸は蛍光強度を示す。
図６は、ＢＣＧ−ＣＷＳ原薬の標準品の検量線を示す図である。
図７は、細菌の菌株による違いで、クロマトグラムから同定できる（上図：ＢＣＧ菌の東京株、下図：ＢＣＧ菌のパスツール株）ことを示す図である。
図８は、被験物質のミコール酸量と生物活性の相関関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明において、細菌−ＣＷＳの由来微生物としては、グラム陽性棹菌のミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌（プロプリオネバクテリウム属）、ロドコッカス属細菌、ボルデテラ属、リステリア属、またはゴルドナ属細菌などが挙げられ、好ましくはミコバクテリウム属細菌およびノカルジア属細菌が挙げられる。「ミコバクテリウム属細菌」とは、抗酸菌のミコバクテリウム属の細菌を表し、具体的には、結核菌群細菌のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ウシ型結核菌、ＢＣＧ菌を含む）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ（アフリカ菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ（ネズミ型結核菌）があり、この他、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ（ライ菌）、非結核性抗酸菌群であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ等が挙げられる。ノカルジア属細菌として具体的には、ノカルジア・ルブラなどが挙げられる。細菌−ＣＷＳは、物理的に細菌を粉砕した後、除核酸、除蛋白、脱脂等の精製工程を経て、不溶性残渣として得られ、その製法自体は公知である（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，５２，９５−１０１（１９７４））。
なお、細胞壁骨格成分の濃度は、エマルジョンとして０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌになるように使用される。好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである。
本発明の「油」としては、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２７巻、第３１１〜３２９項（１９７４年）に記載されているような鉱物油、動植物油が挙げられる。鉱物油としては、例えば、流動パラフィン（ドレコール６ＶＲ、モレスコバイオレスＵ−６、モレスコバイオレスＵ−８等）、バイオール（Ｂａｙｏｌ Ｆ）、などが挙げられる。植物油としては、例えば、大豆油、シンセラン４、オレイン酸エチル、落花生油、椿油、ゴマ油、ＡＤ−６５（落花生油とアラセルとアルミニウムモノステアレートの混合物）等が挙げられる。動物油としては、例えば、スクワラン、スクワレンのようなテルペノイド誘導体が挙げられる。また、これら、動植物油、鉱物油の中から選ばれる複数の油の混合物を挙げることができる。好ましいものとしては、スクワランあるいは例えば、大豆油、オレイン酸エチル、オレイン酸等の植物油（またはそれに由来する油）とスクワランとの混合物、例えば、ドレコール６ＶＲ、各種流動パラフィン等の鉱物油とスクワランの混合物が挙げられる。
より好ましくは、スクワラン、ドレコール６ＶＲ、スクワランと大豆油の混合物、スクワランとオレイン酸エチルの混合物、またはスクワランとドレコール６ＶＲの混合物を挙げることができる。
本発明の「粘度」とは、動的粘弾性法により測定されるものであり、例えば、共軸二重円筒型の粘度測定装置を使用して得られる値を言う。本発明では、（株）レオロジ社製共軸二重円筒型の粘度測定装置（ＭＲ−３００ ソリキッドメータ）を使用し、窒素雰囲気下２５℃で粘度を測定することができる。１ｐｏｉｓｅは、０．１Ｐａ・ｓ（パスカル・秒）を表す。
本発明のペーストを調製する際に使用可能な「分散補助溶媒としての有機溶媒」は、窒素気流下加熱あるいは減圧下などで留去可能な有機溶媒が挙げられ、２種類以上の溶媒の混合物であってもよい。具体的には、大気圧での沸点が３０℃〜１４０℃の溶媒が挙げられる。
本発明のペースト調製にエタノール等のアルコール系溶媒を単独で用いた場合、細菌−ＣＷＳは十分に分散されず、他方トルエン等の芳香族炭化水素、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、またはテトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒といった非極性溶媒を用いると、均一な分散溶液が得られ、均一性に優れたペーストが得られることが判明した。さらに、一部にアルコール系溶媒を含む非極性溶媒を用いると、非極性溶媒のみを用いた場合よりもさらに優れた細菌−ＣＷＳ含有ペーストを得られることがわかった。非極性溶媒を単独で用いた場合、粒子径が約１０μｍの巨大粒子が若干混在し、ペースト内の細菌−ＣＷＳの粒度分布は２つのピークを示し（図１）、水中油型エマルジョンを調製した場合、ロット間のばらつきを生じやすい傾向があったが、アルコール系溶媒を混合させると、均一な粒度分布が得られることが判明した。
そこで、本発明のペースト調製にとって好ましい分散補助溶媒としては、非極性溶媒、および非極性溶媒とアルコール系溶媒の混合溶媒を挙げることができる。ここで溶媒としては、ＩＣＨの残留溶媒ガイドラインに記載のクラス２、クラス３の溶媒を選択することが好ましい。
非極性溶媒としては具体的には、例えばトルエン等の芳香族炭化水素、例えばシクロペンタン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素、例えばジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素等、およびテトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒が挙げられる。非極性溶媒は一種類に限らず、適宜数種類組み合わせて使用することができる。
アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、またはブタノール等が挙げられ、特に好ましくはエタノールが挙げられる。
分散補助溶媒がアルコール系溶媒と非極性溶媒の混合物である場合、アルコール系溶媒は５〜３０％、好ましくは５〜２０％、さらに好ましくは５〜１５％含有する。
より好ましくは溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン、オクタン等の脂肪族炭化水素、０〜２０％のエタノールを含む方芳香族炭化水素もしくは脂肪族炭化水素が挙げられる。具体的には、５〜２０％エタノール−ヘプタン、５〜２０％エタノール−ヘキサン、５〜２０％エタノール−トルエン、５〜２０％エタノール−シクロヘキサン、５〜２０％プロパノール−ヘプタン、５〜２０％イソプロパノール−ヘプタン等を例示することができ、好ましくは、１０％エタノール−ヘプタンが挙げられる。
本発明で使用可能な「界面活性剤」としては、医薬品製剤に使用される界面活性剤であれば特に制限されるものではない。例えばリン脂質、非イオン性界面活性剤などを挙げることができる。リン脂質としては、ホスファチジルアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、またはレシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も使用することができる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、同モノパルミテート（ポリソルベート４０）、同モノステアレート（ポリソルベート６０）、または同モノオレート（ポリソルベート８０）等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０）、同モノパルミネート（Ｓｐａｎ４０）、同モノステアレート（Ｓｐａｎ６０）、同モノオレート（Ｓｐａｎ８０）等のソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げることができる。好ましい界面活性剤としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（ＨＣＯ−５０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）を挙げることができる。より好ましくは、ポリソルベート８０が挙げられる。
界面活性剤の濃度は、水中油型エマルジョンにおいて０．０１〜１０％ｗ／ｗの範囲が適当であり、０．０１〜３％が好ましい。これら界面活性剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
「安定化剤」とは、上記エマルジョンのエマルジョンとしての安定性を維持・向上する目的で使用される成分である。本発明で使用可能な安定化剤としては、単糖類、糖アルコール、多糖類、アミノ酸、タンパク質、ウレア、または無機塩などが挙げられる。単糖類および二糖類としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース等が挙げられる。糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられ、より好ましい糖アルコールとしてはマンニトールが挙げられる。多糖類としては、デキストラン、でんぷん、マルトデキストリン、セルロース、ポリビニルピロリドン、またはアルギン酸ナトリウム等が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸としては、アラニン、グリシン、プロリン等の中性アミノ酸が好ましく、より好ましい中性アミノ酸としてグリシンを挙げることができる。タンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン等が好ましいものとして挙げられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
好ましい安定化剤としては単糖類、または糖アルコールが挙げられ、特に好ましい安定化剤としてはマンニトールが挙げられる。
これら安定化剤は、１種類に限らず、適宜、数種類組み合わせて使用することができる。
安定化剤の濃度は、水中油型エマルジョンにおいて０．１〜２０％ｗ／ｗの範囲が適当であり、０．１〜１０％ｗ／ｗが好ましい。安定化剤の好適な濃度は、安定化剤の種類によって異なるが、製造スケールや各含有成分の含有量に応じて、適宜調整することができる。グリシン等のアミノ酸の場合、２．２５％（３００ｍＭ）〜１１．２５％（１５００ｍＭ）、好ましくは約６．７５％（９００ｍＭ）である。マンニトールの場合、水中油型エマルジョンにおける濃度は、好ましくは１〜１０％、さらに好ましくは１〜８％、より好ましくは約３〜６％である。マンニトールを安定化剤として用いることにより、等張と同程度の濃度で用いることができるので、より生体に負担の少ない安定な製剤を調製することができる。
本発明における凍結乾燥製剤を再懸濁するために使用される水性溶媒は、エマルジョン粒子の分散媒体となるものであり、注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられるが、注射可能な水性溶媒であれば特に限定されない。
「高級脂肪酸」とは、ミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌等の細胞壁に特徴的に存在する高級脂肪酸を表す。高級脂肪酸としては、例えばミコール酸が挙げられ、該ミコール酸とは、α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸を表し、総炭素数約２２〜９０を有する。このうちミコバクテリウム属におけるミコール酸の総炭素数は約６０〜９０であり、ノカルジア属では約４４〜６０であり、通常複数種類の分子の混合物として単離される。ミコール酸のα鎖は、直鎖の炭化水素からなり、その長さは属・種によって異なり、Ｃ２２〜Ｃ２６を中心とし、幅広い分布を有する。一方、β鎖にはすべてのミコバクテリアに共通するα−ミコール酸（シクロプロピル基および／または二重結合が存在）の他、菌株によって種々サブミコール酸（メトキシ基、ケト基、エポキシ基、メチル基等）の官能基が存在することがわかっている。例えば、ＢＣＧ−東京株ではα−、メトキシ−およびケト−ミコール酸が存在する。
本明細書において、「力価」とは、一定重量、または一定容量の、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳもしくは該ＣＷＳを含有する医薬品の生物活性の強さ、または検定された標準品との相対的な値を表す。
該医薬品としては、ＣＷＳの水性溶媒懸濁液；ＣＷＳと鉱物油、スクワランまたはスクワレン等の油とを含有するペースト；該ペーストから再懸濁されたエマルジョン溶液；または、前記水性溶媒懸濁液もしくはエマルジョン溶液を凍結乾燥して得られる凍結乾燥製剤等が挙げられる。
ここで、生物活性とは、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳの免疫賦活活性、および／または抗腫瘍活性を表し、当業者に公知の、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの任意の活性が挙げられる。具体的には、インターフェロンγ誘導活性、ＴＮＦ−α誘導活性、実験的腫瘍動物モデルに対する抗腫瘍活性等が挙げられる。
本発明に係る第１の態様は、水中油型エマルジョン、および凍結乾燥製剤を調製する際に好適な製造中間体となる、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有するペーストである。すなわち、細菌−ＣＷＳと油とのペースト（混合油状物）であり、約０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）以下の粘度、好ましくは約０．２〜約０．６ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を示すことを特徴とする、細菌−ＣＷＳ含有ペーストである。さらに好ましくは、約０．２８〜０．５５ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を示す細菌−ＣＷＳ含有ペーストである。
油としてスクワランを用いた場合、約０．３５〜０．５５ｐｏｉｓｅ（２５℃）、さらに好ましくは約０．３９〜０．５１ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する細菌−ＣＷＳ含有ペーストが好適である。例えばＢＣＧ−ＣＷＳ：１ｇに対して２６．７ｇのスクワランを用いたＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペースト（粘度値：０．４３ｐｏｉｓｅに相当）から、後述する手順により、水中油型エマルジョンを調製して凍結乾燥を行ったところ、凍結乾燥品を再度懸濁して得られる水中油型エマルジョンにおける油滴の粒度分布は平均粒子径２〜３μｍの、半値幅の小さい単一ピークを与えた（図４を参照）。一方、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度値が上昇するに従って、凍結乾燥品を再度懸濁して得られる水中油型エマルジョンの油滴の粒度分布は、平均粒子径２〜３μｍの主分布以外に、粒子径約１０〜５０μｍの粒子が増え、粒子の均一性が損なわれた。また、前記凍結乾燥品の長期保存安定性についても、容器の器壁への付着物の生成およびそれに伴う再懸濁水中油型エマルジョン中の原薬濃度の観点から、前記粘度値：０．４３ｐｏｉｓｅのＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストが製造中間体としてより優れていた。具体的なＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの態様として、約０．４３±０．３ｐｏｉｓｅの粘度を有するものを好適な組成として例示することができる。
また、粒度分布において、粒子径が０．１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．１５〜６μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ〜２μｍである細菌−ＣＷＳ粒子集合体を含有する細菌−ＣＷＳ含有ペースト、および細菌−ＣＷＳ粒子集合体が粒度分布においてＤ１０％が０．２３±０．０５であり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５であり、かつ単一ピークを有する細菌−ＣＷＳ含有ペーストが好ましい。
複数の油との混合物を使用する場合、それぞれの油を適切な組成比で混合して使用できるが、細菌−ＣＷＳとの混合時の粘度が約０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）以下の粘度になるような組成比であることが望ましい。さらに、懸濁後安定な凍結乾燥製剤を作成するためには、それぞれの油の組成比が、細菌−ＣＷＳとの混合時の粘度が約０．２ｐｏｉｓｅ（２５℃）以上になるような組成比であることが望ましい。具体的には、細菌−ＣＷＳ約０．６６ｇに対して、スクワランであれば、約６．６ｇ〜３５．２ｇ、好ましくは約８．４ｇ〜３５．２ｇ等の組成が挙げられる。
前記のペーストは、（１）細菌−ＣＷＳ、油、および有機溶媒を混合撹拌する工程、および、（２）前記（１）の有機溶媒を留去し、細菌−ＣＷＳ含有ペーストを得る工程を経て、大量スケールで調製することができる。
前記（１）において用いられる有機溶媒の量としては、細菌−ＣＷＳ０．６７ｇあたり、５０ｍｌ〜５００ｍｌが挙げられる。原料を加える順序については特に限定は無い。また、これらの原料を混合攪拌する時間は特に限定されないが、１０分間〜１時間が好ましい。
前記（２）において、溶媒を留去するための加熱温度としては、溶媒の沸点、蒸気圧に応じて適宜選択することが可能である。なお、高温になれば細胞壁骨格成分の失活が生じるため、失活の生じない１００℃以下の温度が望ましい。好ましくは８０℃以下である。
溶媒を留去する工程は、常圧下もしくは減圧下に行うことができる。
また、本発明の細菌−ＣＷＳ含有ペーストは、細菌−ＣＷＳ粒子集合体の粒子径が０．１μｍ〜２０μｍであり、好ましくは０．１５〜６μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ〜２μｍである。すなわち、（１）粘度が約０．２〜０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）であり、（２）細菌−ＣＷＳ粒子集合体の粒子径が０．１５μｍ〜６μｍである細菌−ＣＷＳ含有ペースト等もまた、本発明の好ましい態様である。
本発明に係る第２の態様は、均一な、粒度分布を有する、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する水中油型エマルジョン、および該水中油型エマルジョンからなる医薬組成物である。すなわち、前記細菌−ＣＷＳ含有ペーストを含み、かつ、０．１％〜２０％、好ましくは１％〜１０％の安定化剤、０．０１％〜１０％、好ましくは０．０１％〜３％の界面活性剤を含むことを特徴とする、水中油型エマルジョンおよびその医薬組成物である。
具体的には、２Ｌあたり、０．６７ｇ〜３．３５ｇの細菌−ＣＷＳおよび、０．１〜１０％ｗ／ｗ、好ましくは０．４〜８％ｗ／ｗ、さらに好ましくは０．６〜５％のスクワランを含み、かつ、１％〜１０％ｗ／ｗの安定化剤、０．０１％〜３％ｗ／ｗの界面活性剤を含むことを特徴とする、水中油型エマルジョンが挙げられる。
本発明の水中油型エマルジョンを調製する方法については特に限定されないが、国際公開パンフレット（ＷＯ００／３７２４）に記載された方法等を用いることができる。例えば、前記の方法で調製した細菌細胞壁骨格成分含有ペーストを、２段階乳化方法等を用いて乳化する方法、すなわち、下記の乳化方法１、および乳化方法２が挙げられる。
乳化方法１：
１）細菌細胞壁骨格成分油状混合物（ペースト）に、低濃度（油濃度の約１０％以下）の界面活性剤を含む水溶液を加えて、緩やかに攪拌して粗乳化を行う工程、
２）前記１）の粗乳化エマルジョン溶液に、所望の濃度を得るべく、目的の最終濃度となる量の界面活性剤、および安定化剤を加えて、エマルジョン溶液の濃度を調整し、室温〜１００℃で、分散・乳化機器で強く攪拌して本乳化を行う工程、
を経て、本発明の水中油型エマルジョンを調製することができる。
本発明で使用可能な分散・乳化機器としては、例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザー、ホモミキサー、超音波ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、マントン−ガウリンホモジナイザー型高圧ホモジナイザー等の分散・乳化機により、分散もしくは乳化を行って所望の水中油型エマルジョンを得ることが出来る。調製上の都合によっては、水中油型エマルジョンを調製後、賦形剤、安定化剤等の添加剤を添加しても良い。
乳化方法２
４）細菌細胞壁骨格成分油状混合物（ペースト）に、低濃度（油濃度の約１０％以下）の界面活性剤を含む水溶液を加えて、緩やかに攪拌して粗乳化を行う工程、
５）前記４）の粗乳化エマルジョン溶液に、最終濃度が約０．１％〜３％となるような界面活性剤を加えて、エマルジョン溶液の濃度を調整し、室温〜１００℃で、分散・乳化機器で強く攪拌して本乳化を行う工程、
６）前記５）のエマルジョン溶液を、使用する安定化剤がアミノ酸・無機塩等の電解質である場合は必要に応じて曇点以下の温度まで冷却した後、所望の濃度を得るべく、最終濃度が約０．１％〜３％となるような界面活性剤、および最終濃度が１．０％〜１０％となるような安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程、
を経て、本発明の水中油型エマルジョンを調製することができる。前記６）において、好ましくは、前記５）で得られるエマルジョン溶液を２倍〜１０倍に希釈して水中油型エマルジョンを調製することができる。
前記乳化方法２を用いて、本発明の水中油型エマルジョンを調製することにより、乳化方法１を用いた調製方法においては、安定化剤としてアミノ酸、無機塩などの電解質を含むエマルジョンを調製する場合に懸念される、界面活性剤の析出が避けられる。しかも乳化方法２の６）で表される希釈工程によって、エマルジョンの粒度分布は全く変化しない。また、乳化方法１を用いて大量調製を実施する場合、調製スケールに応じた乳化機器が必要であり、調製スケールの限界であった。しかし、乳化方法２を用いて、高濃度エマルジョン溶液を中間体として用いることにより、１回あたりに調製できる水中油型エマルジョン量が増大するという利点がある。
上記の乳化方法１、または乳化方法２等の水中油型エマルジョンの調製工程においては、必要に応じて、等張化剤を加えてもよい。これら等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。該等張化剤は、凍結乾燥品を凍乾ケーキとして形成させるための賦形剤を兼ねることができる。該等張化剤もしくは賦形剤としては、糖類、アミノ酸、ウレア、無機塩等が挙げられる。糖類としては、単糖類、二糖類、糖アルコールが挙げられる。単糖類としては、グルコース、フルクトース等、二糖類としては、マルトース、ラクトース、トレハロース、スクロース等、糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。アミノ酸としては、アラニン、グリシン、リシン、アルギニン、プロリン等が挙げられる。これらの等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。等張化剤としては、上記安定化剤として挙げられた物質を使用することができ、安定化剤は等張化剤を兼ねていてもよい。また、等張化剤として、安定化剤とは異なる物質を選択することも可能である。尚、等張化剤の濃度は、他の成分の含有量に応じて適宜設定されるが、通常０．１％〜３０％ｗ／ｗの範囲が適当である。
本発明の水中油型エマルジョンは、エマルジョンの油滴の粒子径が０．２〜３０μｍ、好ましくは０．２〜２０μｍであり、平均粒子径としては２〜３μｍが好ましい。細菌−ＣＷＳは油滴中に包含される。
本発明の水中油型エマルジョンにおいて、細菌−ＣＷＳが油に包含されているか否かは、レクチンによる細胞壁骨格成分の凝集反応を利用して検定することができる。該検定方法については、国際公開パンフレットＷＯ００／３７２４に記載された方法等を用いることができる。
すなわち、（１）エマルジョン油滴の粒子径が０．２〜１０μｍ、平均粒子径が、２〜３μｍであり、（２）細菌−ＣＷＳが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性を示すことを特徴とする水中油型エマルジョンもまた、本発明の態様として挙げられる。また、該エマルジョン油滴の粒子径において、好ましくはＤ１０％：０．５μｍ以上、Ｄ９０％：２０μｍ以下である。
本発明に係る第３の態様は、前記水中油型エマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤である。
前記凍結乾燥製剤は、前記水中油型エマルジョンを、凍結乾燥させることにより、調製することができる。すなわち本発明に係る凍結乾燥製剤は、水中油型エマルジョンを凍結乾燥処理し、最後に通常はバイアル内部を窒素置換し、打栓を行うことにより得ることができる。
水中油型エマルジョンを凍結乾燥する際、凍結乾燥温度、および時間等は特に限定されず、例えば、国際公開パンフレットＷＯ００／３７２４に記載された方法を挙げることができる。
該凍結乾燥製剤を再懸濁させて水中油型エマルジョンを調製するために用いる水性溶媒としては、前記等張液等を用いることができる。該凍結乾燥製剤は、適当な水性溶媒の添加により速やかに再懸濁し、凍結乾燥前と同等の粒度分布、および安定性を有する水中油型エマルジョンが得られる。
本発明の第４の態様は、粒度分布において、粒子径が０．１５〜６μｍであり、好ましくは粒子径が０．２〜２μｍであることを特徴とする、細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌−ＣＷＳ粒子集合体）に関する。また、粒子径において、
Ｄ１０％：０．２μｍ（ここで「Ｄ１０％：０．２μｍ」とは、粒度分布において、粒子径の小さい側から積算して１０％に達した時の粒子径を表す。すなわち、細菌−ＣＷＳ粒子集合体の９０％までが粒子径０．２μｍ以上であることを意味する。）以上であり、かつＤ９０％：０．７μｍ（ここで「Ｄ９０％：０．７μｍ」とは、粒度分布において、粒子径の大きい側から積算して１０％に達した時の粒子径を表す。すなわち、細菌−ＣＷＳ粒子集合体の９０％までが粒子径０．７μｍ以下であることを意味する。）以下の細菌−ＣＷＳ粒子集合体であり、さらに好ましくは、Ｄ１０％：０．２３±０．０５μｍでありかつＤ９０％：０．６±０．０５μｍである。
また本発明には、前記粒子径を有する細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌−ＣＷＳ粒子集合体）を含有するペーストや、該ペーストから調製されるエマルジョン、および凍結乾燥製剤も含まれる。すなわち、上記細菌−ＣＷＳを含有したエマルジョン（油滴）の粒子径が０．２〜３０μｍ、好ましくは０．３〜２０μｍ、さらに好ましくは、１〜１０μｍであることを特徴とする、エマルジョンや凍結乾燥製剤が挙げられる。
本明細書において、粒子径は、粒度分布を測定することにより得られる。該粒度分布は、当業者に公知の方法で測定することができるが、具体的には、細菌−ＣＷＳの溶媒懸濁液の場合は、レーザー回折式粒度測定装置（ＳＡＬＤ３０００；島津製作所製）や、マイクロトラックＵＰＡ（ハネウェル社製）を用いて、測定する。細菌−ＣＷＳの粒子径が１μｍ以下の場合には好ましくはマイクロトラックＵＰＡを用いて測定することができる。具体的には、ＢＣＧ−ＣＷＳを、約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶媒に懸濁したものを測定サンプルとする。
また、細菌−ＣＷＳ含有ペーストや、エマルジョンの場合には、レーザー回折式粒度測定装置（ＳＡＬＤ３０００；島津製作所製）を用いて測定することができる。具体的には、本発明の細菌−ＣＷＳ含有ペーストを、約３００倍以上に油で希釈して測定サンプルとすることができ、好ましくは０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬの細菌−ＣＷＳ濃度となるように測定サンプルを調製すればよい。
本発明に係る水中油型エマルジョンは、注射など非経口で投与される。投与形態は、治療目的などにより異なり、特に制限されるものではない。通常用いられる投与形態として例えば、注射剤として皮膚より投与すること等ができる。エマルジョン中の細菌−ＣＷＳの量は通常０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌの濃度である。本発明の凍結乾燥製剤は適量の水性溶媒、例えば前記等張液等を用いて本発明エマルジョンに再懸濁して用いる。凍結乾燥製剤を再懸濁して生体に投与する場合の水中油型エマルジョンにおける各成分の濃度は、凍結乾燥前の、製造中間体としての水中油型エマルジョンにおける各成分の濃度と異なっていてもよい。水性溶媒の適量とは、凍結乾燥前の液量の、好ましくは０．５〜４倍量の範囲であればよい。
投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によって異なるが、非経口投与する場合、特に注射剤として使用する場合には、通常は成人に対して週１回若しくは４週１回の投与で１回当たり１０〜２５０μｇの範囲、好ましくは２５〜２００μｇの範囲を投与することができる。
本発明の第５の実施の態様は、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳに含まれる高級脂肪酸のクロマトグラムから定性的にその菌種・菌株を同定、確認する方法であり、以下の工程（１）〜（３）を含む方法である。すなわち、
（１） ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳに含まれる、高級脂肪酸を分離・抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程
（２） （１）の高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程、
（３） （２）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの菌種・菌株を評価する工程。
以下、各工程について詳細に説明する。
（１） ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳより、高級脂肪酸を分離・抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程
試料として一定質量のミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳを秤量し、溶媒中で、１０℃〜溶媒の沸点の範囲内で塩基を反応させることにより、加水分解を行う。ここで用いられる溶媒としては、加水分解を行うに十分な水を含む有機溶媒であれば特に限定されないが、具体的な有機溶媒としては、例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール、エチレングリコール等のアルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン等のエーテル系溶媒、アセトン、ジメチルスルホキシド等の親水性溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、またはこれらの有機溶媒の任意の溶媒の混合物が挙げられる。
前記有機溶媒として、好ましくは、エタノール等のアルコール系溶媒、あるいは、前記アルコール系溶媒および疎水性有機溶媒の混合物が挙げられ、具体的には、エタノール−トルエン−水混液等が挙げられる。
反応温度は、用いられる有機溶媒の種類によって適当な温度を選択することができるが、好ましくは、室温〜溶媒の沸点で加温するか、あるいは１０５℃〜１３５℃でオートクレーブを用いる方法が挙げられる。
加温の場合の反応時間としては、５分〜７２時間が挙げられ、高級脂肪酸のパターンを分析する場合の反応時間としては、好ましくは５分〜５時間、高級脂肪酸量を定量的に分析する場合の反応時間としては、好ましくは３０分〜５時間が挙げられる。オートクレーブの場合の反応時間としては、５分から８時間が挙げられ、好ましくは、パターンを分析する場合は５分〜３時間、定量的に分析する場合は１０分〜５時間が挙げられる。
使用される塩基としては、当業者に知られたものであれば任意の塩基を用いることができるが、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸バリウム、炭酸セシウム等の無機塩基が挙げられる。
ここで、被験サンプルが細菌−ＣＷＳの場合、反応効率を上げるために、試料をそのまま一定質量秤量するか、またはトルエン、クロロホルム、ヘプタンおよびエタノール等から選択される有機溶媒、またはこれらの溶媒の混液等に懸濁し、必要量を採取し、該有機溶媒を留去した後、加水分解に供することが好ましい。また、被験サンプルが「細菌」または「菌体」である場合は、水に懸濁した状態で、原薬と同様に加水分解を行うほか、反応効率を上げるために温度を沸点まで上げて５分〜７２時間反応させるか、オートクレーブを用いて５分〜８時間反応させることが好ましい。医薬品製剤の場合は、水を加えてエマルジョンを形成させ、その全部または一部を採取して加水分解反応させるほか、反応効率を上げるために、一旦水でエマルジョンとするのではなく、直接加水分解試液を加えて、反応させることが好ましい。
加水分解反応終了後、酸を加えて反応溶液を酸性とした後、疎水性有機溶媒を用いて高級脂肪酸画分を抽出する。ここで用いられる酸としては、当業者に知られたものであれば任意の酸を用いることができるが、具体的には、塩酸、硫酸、燐酸等の無機酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸、スルホン基を有する酸性イオン交換樹脂等を用いることができる。疎水性溶媒は、水層との分離が可能な溶媒であれば特に限定はないが、具体的には、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、トルエン、クロロホルム等が挙げられる。
（２） （１）の高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程
（１）において得られた高級脂肪酸画分に含まれる高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムを得、その溶出パターンを確認する。該溶出パターンとは、溶出ピークの形状、各溶出ピークの保持時間（リテンションタイム）、ピーク面積、ピーク幅、もしくは極大値等のパラメーター、および、各溶出ピーク間の該パラメーターの比等、クロマトグラムにおける任意の性質を表す。その確認方法は、当業者に公知の方法であれば、任意の方法を用いることができる。高級脂肪酸、または、高級脂肪酸をエステル化もしくはアミド化することにより調製される、高級脂肪酸の誘導体を、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＴＬＣ等で分析し、高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムを得ることができる。ここで、高級脂肪酸または高級脂肪酸の標識化誘導体におけるクロマトグラムは、ＨＰＬＣもしくはＧＣにおけるクロマトグラム、すなわちピークの溶出パターンや、ＴＬＣにおけるスポットの検出パターン等を表す。また、検出方法としては、特に限定はないが、蛍光、ＵＶ−ＶＩＳ、ラジオアイソトープ、ＲＩ（示差屈折計）、質量分析、電気化学、化学発光、エバポレイティブ光散乱、またはレーザー励起吸光等を用いることができる。
好ましくは、高級脂肪酸に標識化試薬を作用させることにより、標識化高級脂肪酸誘導体を調製した後、その溶出パターンを分析する方法等が挙げられる。
高級脂肪酸の標識化方法としては、高級脂肪酸のカルボン酸または水酸基を、蛍光、ＵＶ−ＶＩＳ、ラジオアイソトープ、ＲＩ（示差屈折計）、質量分析、電気化学、化学発光、エバポレイティブ光散乱、レーザー励起吸光等で検出可能な原子もしくは部分構造を有する高級脂肪酸エステル、または高級脂肪酸アミドへ導く方法が挙げられる。
具体的な標識化高級脂肪酸誘導体としては、高級脂肪酸のカルボキシル基と反応するブロモメチル（ブロモアセチル）基、ジアゾメチル基、アミノ基、ヒドラジノ基などを有するとともに、同時に紫外、可視または蛍光で検出可能な置換基を有する９−アントリルメチルエステル、ｐ−ブロモフェナシルエステル、６，７−ジメトキシ−４−クマリニルメチルエステル、２−（２，３−ナフタルイミド）エチルエステル、２−（２，３−アントラセンジカルボキシイミド）エチルエステル等が挙げられる。
誘導化反応条件としては、個々の標識化高級脂肪酸誘導体に適当な条件を、当業者によく知られた方法から選択することができるが、通常は、必要に応じて塩基もしくは酸等の補助試薬の存在下、−１０℃〜溶媒の沸点で５分〜７２時間標識化試薬と反応させることにより、標識化高級脂肪酸誘導体を調製することができる。具体的には、９−アントリルメチルエステルの場合、高級脂肪酸画分を、ＡＤＡＭ（９−アントリルジアゾメタン）等の蛍光標識化試薬を用いて、−１０℃〜溶媒の沸点で５分〜７２時間、好ましくは２０℃〜６０℃で３時間〜１２時間反応させることによって、高級脂肪酸９−アントラニルメチルエステルを得ることができる。
分析方法としては、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＴＬＣ等、当業者によく知られた方法を用いることができる。例えば、分析される高級脂肪酸、もしくは標識化高級脂肪酸誘導体の性質に応じて、ＨＰＬＣの逆相クロマトグラフ法、順相クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、イオン交換クロマトグラフ法、イオンクロマトグラフ法、サイズ排除クロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラフ法において、溶出される高級脂肪酸もしくは標識化高級脂肪酸誘導体を含有する複数のピークのパターンを得ることができる。ここで検出方法としては、前記標識化方法に応じて、蛍光分析、ＵＶ−ＶＩＳ分析、ラジオアイソトープ分析、ＲＩ（示差屈折計）分析、質量分析、電気化学分析、化学発光、エバポレイティブ光散乱、またはレーザー励起吸光等が挙げられる。
（３） （２）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの菌種・菌株を評価する工程
一般的には、被験サンプル、すなわち評価対象の細菌のＣＷＳにおける（２）のクロマトグラムと、基準となる該細菌のＣＷＳの標準品における（２）のクロマトグラムのパターンを比較することにより、被験サンプルの菌種・菌株を同定、確認することができる。また、被験サンプルである細菌のＣＷＳが、同種同株の標準サンプルと、ＣＷＳの構成成分において等価であるか否かを評価することができる。すなわち、細菌の培養条件によって、同種同株である場合でも該構成成分は変化する可能性があるが、（２）の分析結果を標準品と比較することにより、ＣＷＳの構成成分において等価な菌株であることを同定することができる。
具体的には、例えば高級脂肪酸がミコール酸である場合、逆相ＨＰＬＣカラム（オクタデシル基（Ｃ１８）を有するカラムまたはトリアコンチル基（Ｃ３０）を有するカラム（２〜１０ｍｍφ×５〜３０ｃｍ、粒径２〜１０μｍ）を使用し、水および／またはメタノールおよび２−プロパノールを用いたグラジエント条件、メタノールおよびトルエンを用いたグラジエント条件、または、メタノールおよびジクロロメタンのグラジエント条件で分析した場合は約５〜約１２０分に溶出する特徴的なピークが、それぞれ高級脂肪酸のパターンに相当する。
本発明の、第６の実施の態様は、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳを含む被験サンプルにおけるＣＷＳの含量を定量して評価するとともに、有効成分量すなわち力価を検定、評価する方法であり、以下の工程（１）、（４）、および（５）を含む方法である。すなわち、
（１）細菌のＣＷＳ中に含まれる、高級脂肪酸を分離・抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（４）（１）の高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、
（５）（４）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの免疫賦活能を評価する工程。
以下、それぞれの工程について具体的に述べる。
（１） ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳより、高級脂肪酸を抽出してその含有画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程
この工程については前記のとおりである。
（４） （１）の高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程
（１）で得られる高級脂肪酸を含む画分を、前記（２）に記載された方法で分析し、得られたクロマトグラムより高級脂肪酸または高級脂肪酸誘導体の量を定量すればよい。すなわち、前記（２）のクロマトグラムにおいて、高級脂肪酸または高級脂肪酸誘導体に相当する複数のピークの、面積値の総和を算出することにより、高級脂肪酸を定量することができる。
なお、細菌、または、細菌のＣＷＳを有効成分として含有する医薬品の原薬もしくは製剤の定量分析において、内部標準を使用する場合、該内部標準としては、ＨＰＬＣ等の分析において、被験サンプルもしくは標準品と分離して、検出可能であれば、特に限定されない。また、上記（１）、（２）、および（４）のいずれの工程で添加してもよい。
（５） （４）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの免疫賦活能を評価する工程
一般的には、被験サンプル、すなわち評価対象の細菌のＣＷＳにおける（４）の値と、基準となる該細菌（被験サンプルと同種・同株の細菌）におけるＣＷＳの標準品における（４）の値を比較することによって、被験サンプルの力価を評価することができる。例えば、ＢＣＧ−ＣＷＳ・東京株の場合、高級脂肪酸はミコール酸であり、被験サンプルのミコール酸の含量を前記（１）および（４）の工程によって分析した結果を、ＢＣＧ−ＣＷＳ・東京株の標準品におけるミコール酸の含量と比較することにより、被験サンプルの力価を定量することができる。
被験サンプル、すなわち評価対象の細菌のＣＷＳにおける（４）の値と、基準となる該細菌のＣＷＳの標準品における（４）の値を比較することにより、被験サンプルの力価を評価することができる。
具体的には、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳの標準品における（４）の値：Ｖｓｔｄを、被験サンプルにおける（４）の値：Ｖｓａｍと比較することにより、被験サンプルの力価を、標準品に対して、下式（％）：
Ｖｓａｍ／Ｖｓｔｄ×１００ （％）で表すことができる。
ここで、好ましくは、標準品における（４）の値を、複数の濃度で、複数回数測定し、標準品の濃度と、高級脂肪酸量の相関関係を表す検量線を作成し、該検量線に被験サンプルにおける高級脂肪酸量の測定値（すなわち（４）の値）を当てはめることにより、被験サンプルにおける有効成分量、すなわち力価を逆算することができる。
本発明の方法により、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳだけでなく、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌のＣＷＳを含有する医薬品の有効成分を同定、確認するとともに、力価を評価することも可能である。すなわち、前記と同様の方法で、一定量の菌体、または医薬品から、水または有機溶媒等の懸濁液を調製し、該菌体または医薬品中の高級脂肪酸の量を測定することができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの調製
Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，５２，９５−１０１（１９７４）に記載されているようにして調製した細胞壁骨格成分としてのＢＣＧ−ＣＷＳ６７０ｍｇを、油として使用するスクワラン８．４ｇとトルエン２００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下６０〜７０℃に加熱しトルエンを留去し、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストを得た。
このペーストに関して、共軸二重円筒型粘度測定器（ＭＲ−３００ソリキッドメータ：（株）レオロジ社製）を用いて２５℃での粘度を測定した。その結果、０．５４５ｐｏｉｓｅであることが示された。
また、同様にして、油としてスクワランとオレイン酸エチルの混合物を８．４ｇ使用し、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストを得た。同様に、共軸二重円筒型粘度測定器（ＭＲ−３００ソリキッドメータ：（株）レオロジ社製）を用いて２５℃での粘度を測定した。これらの結果を表１に示す。
表１に示されるように、スクワラン自体の粘度は０．２３６であり、これに細胞壁骨格成分のＢＣＧ−ＣＷＳが上記のように混合された場合、そのペーストの粘度は０．５４５となる。より粘度の低いオレイン酸エチルの割合を増やすと、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度は次第に低くなった。
【実施例２】
ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの調製
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ６７０ｍｇを用い、油として大豆油８．４ｇを使用し、実施例１と同様にして油状混合物（ペースト）を調製し、粘度を測定した。
また、油としてシンセラン４、ドラケオールを使用し、同様にペーストを調製し、粘度を測定した。
以上の結果を表２に示す。
表２に示されるように、スクワラン以外の油を使用した場合のＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度は、使用する油によって大きく変動する。
【実施例３】
スクワランの量の変化と粘度の変化
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ６７０ｍｇを用い、油として使用するスクワランの量を４．２ｇから３３．６ｇへと変化させる以外は実施例１と同様にしてペーストを調製し、その粘度変化を測定した。
その結果を表３に示す。
表３に示されるように、ＢＣＧ−ＣＷＳに対するスクワランの量比が小さくなれば粘度が増加し、スクワランの量比が大きくなれば粘度が減少する傾向にある。
【実施例４】
スクワランの量比の変化とエマルジョン製剤化の可否
実施例３の▲３▼のペーストに０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液２８１．５ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さらに、５．２ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化を行った。最後に、２０４．２ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し、ポリソルベート８０最終濃度を１．０ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、４ｗ／ｗ％マンニトール水溶液１５００ｍＬを添加し、２Ｌの最終製剤を得た。これは、ＢＣＧ−ＣＷＳの原体濃度０．３ｍｇ／ｍｌのエマルジョンである。
同様にして、▲３▼以外の実施例３のペーストを用いてエマルジョンを調製し、エマルジョンの製剤化の可否に対するスクワラン量の影響を調べた。エマルジョン製剤化の可否は、▲１▼乳化中の凝集物出現の有無、▲２▼乳化直後の粒度分布、▲３▼凍結乾燥前後での粒度分布維持性、▲４▼凍結乾燥品再懸濁後の性状）を基準とした。
その結果を表４に示す。表中、「○」は上記▲１▼〜▲４▼をすべて満たすことを示し、「×」はこれらを満たさないことを示し、そして「△」は▲２▼の粒度分布の均一性が若干劣ることを示す。
実施例３記載のＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストを使用してエマルジョンを調製する場合、表４に示されるように、約０．７ｐｏｉｓｅ以下のペーストを使用した場合では良好なエマルジョンが調製される。一方、それより粘度が高い▲１▼の場合、（０．８８８ｐｏｉｓｅ）、良好なエマルジョンは製剤化できないことがわかった。これは、粘度の上昇に伴い、一部の油滴において過乳化が起こり、非常に少量の油に包埋された原薬の塊（均一に懸濁されずに凝集する物質）が出現し、製剤の性状と安定性を著しく低下させることを示唆している。
一方、粘度：０．６７０ｐｏｉｓｅ程度では、原薬の塊が出現することはないが、エマルジョンの油滴の粒度分布は、均一性が乏しかった。また、粘度０．５４５ｐｏｉｓｅ以下の製剤では、エマルジョンの油滴は均一性に富むシャープな粒度分布を示した（データは示していない）。
【実施例５】
油の種類とエマルジョン製剤化の可否
油として実施例２の種類のものを使用し、実施例４と同様にしてエマルジョンを調製し、製剤化の可否を評価した。その結果を表５に示す。
表５に示されるように、油の種類に関係なく、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度が約０．５５ｐｏｉｓｅ以下のものを使用して、エマルジョンを調製すれば、エマルジョンとして良好なものが得られた。表中、「○」は、▲１▼乳化直後の粒度分布が平均粒子径２〜３μｍでありシャープな単一ピーク、▲２▼凍結乾燥前後において粒度分布に変化が無い、▲３▼凍結乾燥品を再懸濁した後にバイアルへの製剤付着やそれに伴う製剤中原薬濃度低下が認められない、ことを示している。特に、粘度：０．４９〜０．５５ｐｏｉｓｅである▲２▼および▲３▼の製剤が良好な結果を示した。
【実施例６】
油の組成とエマルジョン製剤化の可否
油として実施例１の組成のものを使用し、実施例４と同様にしてエマルジョンを調製し、製剤化の可否を評価した。その結果を表６に示す。
表６は、油の組成（スクワランとオレイン酸エチルの混合比）が変化してもエマルジョンの性質にはあまり大きな影響を与えず、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度が０．５４５以下であれば、良好なエマルジョンが調製されることを示している。
【実施例７】
ペーストにおけるスクワランの量の変化と凍結乾燥製剤化の可否
実施例４にて調製した水中油型エマルジョンをバイアルに１０ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製）を用いて行った。次いで、凍結乾燥製剤の再懸濁安定性、粒度分布等の面で調製の可否を判断した。その結果を表７に示す。
表７で示されるように、エマルジョンの凍結乾燥製剤の良否もＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度によって影響を受ける。ＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度が０．６７２以下の場合であれば良好な凍結乾燥製剤が調製される。０．５４５以下の場合であれば、さらに良好な凍結乾燥製剤が調製されることがわかった。
【実施例８】
油の組成と凍結乾燥製剤化の可否
実施例６にて調製したエマルジョンの凍結乾燥製剤を調製し、凍結乾燥製剤の再懸濁安定性、粒度分布等の面で調製の可否を判断した。
その結果を表８に示す。
実施例７では、エマルジョンの凍結乾燥製剤は、使用されるＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度に影響を受け、良好な凍結乾燥製剤はペーストの粘度が０．５４５以下であることが示された。上記表８は、ペーストの粘度が低すぎても良好な凍結乾燥製剤が得られないことを示している。従って、良好なエマルジョンの凍結乾燥製剤が得られるための、好適なペーストの粘度は、０．２５８から０．５４５の範囲であることが分かる。
【実施例９】
油の種類とエマルジョンの凍結乾燥製剤化の可否
油として実施例２の種類のものを使用し、実施例７と同様にしてエマルジョンの凍結乾燥製剤を調製し、その製剤の可否を評価した。その結果を表９に示す。
表９に示されるように、油の種類が相違してもエマルジョンの凍結乾燥製剤化には大きな影響は与えず、使用するＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの粘度の大きく影響されることが分かった。また、実施例８を参考にすれば、良好な凍結乾燥製剤が得られるところのＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストの好適な粘度は０．２８から０．５５であることが示されている。
【実施例１０】
製剤例
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ２６４０ｍｇを用いて、スクワラン３５．２ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン４００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下６０℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液９２４ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（７，０００ｒｐｍ（逆回転）／ｍｉｎ×５分間）を行い、さらに、３６．６ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化（１２，０００ｒｐｍ（正転）／ｍｉｎ×１０分間）を行った。最後に、１．５ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し攪拌（７，０００ｒｐｍ（逆回転）×１分間）し、ポリソルベート８０最終濃度を０．４ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、４ｗ／ｗ％マンニトール水溶液３５００ｇを添加し、４０００ｇの最終製剤を得た。（このときの処方は、ＣＷＳ：０．６ｍｇ／ｍＬ、ＳＱＡ：０．８ｗ／ｗ％、Ｔｗｅｅｎ８０：０．１ｗ／ｗ％、マンニトール：３ｗ／ｗ％）
この水中油型エマルジョンをバイアルに２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製あるいはＵＬＶＡＣ１３Ａ、日本真空社製）を用いて行った。
【実施例１１】
分散補助溶媒についての検討
ＢＣＧ−ＣＷＳ（２１０ｍｇ）を各種有機溶媒（トルエン、ヘキサン、ヘプタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン；各２０ｍｌ）中に、超音波処理により分散し、分散原薬を調製した後、さらに、必要に応じてポッター型ホモジナイザー（２０ｍｌ型）により攪拌（３０００ｒｐｍ ｘ５分）した。得られた分散原薬について粒度分布評価を行った。さらに、実施例１０と同様に、上記分散原液にスクワラン（２．６４ｇ）を混合し、さらに有機溶媒を留去することにより調製したペーストの粒度分布評価を行った。
粒度分布は、分散原薬については、０．１ｍｇＣＷＳ／ｍＬの濃度で、マイクロトラックＵＰＡ（ハネウェル社製）、およびレーザー回折式粒度測定装置（ＳＡＬＤ３０００；島津製作所製）を用いて測定した。また、ペーストは、スクワランで希釈し、０．１〜０．２ｍｇＣＷＳ／ｍＬＳＱＡの濃度で、レーザー回折式粒度測定装置（ＳＡＬＤ３０００；島津製作所製）を用いて測定した。
［結果］
トルエン中に分散された分散原薬の粒度分布を調べた結果、４００〜６００ｎｍに分布するサブミクロンでのピークと、１０μｍを中心とした大きな粒子の分布の二つに分かれた。
次に、上記トルエン分散原薬にスクワランを混合した混合物の粒度分布、およびこれをさらにポッター型ホモジナイザーでさらに分散して調製したペーストの粒度分布を調べた結果、これらはいずれもスクワランを混合する前の粒度分布をほぼ維持していた。
一方、分散補助溶媒として、ヘキサン、ヘプタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン等において、トルエン分散で見られた数十μｍを中心とした粒度分布は減少した（図１）。９０％ヘプタン／１０％エタノールを用いた場合の、ペースト内のＢＣＧ−ＣＷＳ原薬の粒度分布結果を図２に示す。図２のとおり、サブピークは無く、０．３〜２μｍに単一ピークを持つ均一な混合物が得られていることがわかった。
表１０には、各溶媒における溶媒に分散したＢＣＧ−ＣＷＳ原薬をマイクロトラックＵＰＡで測定した場合の、Ｄ１０％値、Ｄ９０％値、および平均粒子径の実測値を示す。
以下の表１１には、各溶媒における溶媒に分散したＢＣＧ−ＣＷＳ原薬をＳＡＬＤ３０００で測定した場合の、Ｄ１０％値、Ｄ９０％値、および平均粒子径の実測値を示す。
以下の表１２には、各溶媒における溶媒にＢＣＧ−ＣＷＳ含有ペーストをスクワランで希釈し、ＳＡＬＤ３０００で粒子径を測定した場合の、Ｄ１０％値、Ｄ９０％値、および平均粒子径の実測値を示す。
【実施例１２】
製剤例
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ１３２０ｍｇを用いて、スクワラン１７．６ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン２００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下６０〜７０℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液４６２．０ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（７，０００ｒｐｍ（逆回転）／ｍｉｎ×５分間）を行い、さらに、１８．３ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化（１２，０００ｒｐｍ（正転）／ｍｉｎ×５分間）を行った。最後に、０．７６ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し攪拌（７，０００ｒｐｍ（逆回転）×１分間）し、ポリソルベート８０最終濃度を０．４ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、４ｗ／ｗ％マンニトール水溶液１５００ｇを添加し、２０００ｇの最終製剤を得た。（このときの処方は、ＣＷＳ：０．６ｍｇ／ｍＬ、ＳＱＡ：０．８ｗ／ｗ％、Ｔｗｅｅｎ８０：０．１ｗ／ｗ％、マンニトール：３ｗ／ｗ％）
この水中油型エマルジョンをバイアルに１ｍＬまたは２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製あるいはＵＬＶＡＣ１３Ａ、日本真空社製）を用いて行った。
【実施例１３】
製剤例
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ２６４０ｍｇを用いて、スクワラン７０．４ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン４００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下６０〜７０℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液８８８．７ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（７，０００ｒｐｍ（逆回転）／ｍｉｎ×５分間）を行い、さらに、３６．７ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化（１２，０００ｒｐｍ（正転）／ｍｉｎ×１０分間）を行った。最後に、１．５ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し攪拌（７，０００ｒｐｍ（逆回転）×１分間）し、ポリソルベート８０最終濃度を０．４ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、１．２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０／６．７ｗ／ｗ％マンニトール水溶液３０００ｇを添加し、４０００ｇの最終製剤を得た。（このときの処方は、ＣＷＳ：０．６ｍｇ／ｍＬ、ＳＱＡ：１．６ｗ／ｗ％、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｗ／ｗ％、マンニトール：５ｗ／ｗ％）
この水中油型エマルジョンをバイアルに１ｍＬまたは２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製あるいはＵＬＶＡＣ１３Ａ、日本真空社製）を用いて行った。
【実施例１４】
製剤例
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ１３２０ｍｇを用いて、スクワラン３５．２ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン２００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下６０〜７０℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液４４４．３ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（７，０００ｒｐｍ（逆回転）／ｍｉｎ×５分間）を行い、さらに、１８．４ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化（１２，０００ｒｐｍ（正転）／ｍｉｎ×５分間）を行った。最後に、０．７６ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し攪拌（７，０００ｒｐｍ（逆回転）×１分間）し、ポリソルベート８０最終濃度を０．４ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、１．２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０／６．７ｗ／ｗ％マンニトール水溶液１５００ｇを添加し、２０００ｇの最終製剤を得た。（このときの処方は、ＣＷＳ：０．６ｍｇ／ｍＬ、ＳＱＡ：１．６ｗ／ｗ％、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｗ／ｗ％、マンニトール：５ｗ／ｗ％）
この水中油型エマルジョンをバイアルに１ｍＬまたは２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＴ−６、フィンテック社製あるいはＵＬＶＡＣ１３Ａ、日本真空社製）を用いて行った。
【実施例１５】
速結乾燥後における粒度分布変化
実施例１２で調製したスクワラン１．６％処方（ＢＣＧ−ＣＷＳ１ｇに対して、スクワラン２６．７ｇを含むもの；粘度値：０．４３ｐｏｉｓｅ）の凍結乾燥品について、凍結乾燥前後における粒度分布変化を、実施例１１と同様の方法で評価した。
その結果、図４に示すように、凍結乾燥製剤を再懸濁した場合も、凍結乾燥前の水中油型エマルジョン（図３）と同様に、平均粒子径２〜３μｍの単一ピークの粒度分布を維持し、９０％径値が約５μｍであった。一方、スクワランの含量を減らした処方では、さらに粒子径が大きい（１０μｍ〜５０μｍ）粒子が混在した。凍結乾燥後の粒度分布については、大きな粒子の存在比率の指標となる９０％径値が、１．６％処方では５μｍ前後となった。
以上の結果から、実施例１２の製剤は凍結乾燥前後における粒度分布維持性が高いことが判った。
【実施例１６】
凍乾製剤保存による性状および懸濁液中原薬濃度変化
実施例１２で調製したスクワラン１．６％処方（ＢＣＧ−ＣＷＳ１ｇに対して、スクワラン２６．７ｇを含むもの；粘度値：０．４３ｐｏｉｓｅ）製剤について、長期・加速保存条件として５℃、２５℃、４０℃、および苛酷条件として６０℃、８０℃での安定性を検討した。評価基準は、実施例１７に記載の懸濁液原薬濃度をミコール酸定量法により算出し、懸濁液の溶状を目視により評価した。
その結果、表１３に示すように、スクワラン１．６％処方製剤において、４０℃Ｘ３ヶ月保存品で懸濁後における付着物の生成およびそれに伴う懸濁液原薬濃度の低下は認められなかった。また、表１４に示すように、６０℃、８０℃Ｘ１ヶ月保存の苛酷条件下においても、付着物の生成および懸濁液原薬濃度の低下は全く認められなかった。
以上の結果から、実施例１２の製剤は、優れた保存安定性を示すことが判った。
【実施例１７】
ＢＣＧ−ＣＷＳに含まれるミコール酸の定量
（１）溶液の調製
▲１▼ ＢＣＧ−ＣＷＳは、ＢＣＧ菌東京株（日本ビーシージー製）から公知の方法（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，５２，９５−１０１（１９７４）））で調製した。ＢＣＧ−ＣＷＳの被験サンプル、および生物活性が確認されているＢＣＧ−ＣＷＳの標準品約１５ｍｇをそれぞれ精密に量り、トルエンまたはヘプタン／エタノール（９９．５）混液（９：１）を加えて正確に２５ｍＬとし、超音波を１５分間照射し、試料原液および標準原液とした。試料原液２ｍＬを正確に量り、溶媒を留去した。また、標準原液１、２および３ｍＬを正確に量り、同様に溶媒を留去した。
▲３▼ 試料溶液および標準溶液にそれぞれ内標準溶液（エルカ酸（アルドリッチ製）のトルエン溶液（１ｇ／５０００ｍＬ）またはトリコセン酸（東京化成製）のトルエン溶液（３ｇ／１０００ｍＬ））１００μＬを正確に加えた。
▲４▼ ０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／トルエン／水混液（１０：１０：１）溶液１ｍＬを加え、超音波を１分間照射した。
▲５▼ ６５℃の恒温槽で３時間加熱し、放冷後、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸５００μＬを正確に加え、よく振り混ぜた。さらにヘキサン２ｍＬを加え、よく振り混ぜた後静置し、上層（有機層）をサンプル瓶に移した。同操作を、ヘキサン１ｍＬずつを用いて、さらに２回繰り返した。
▲６▼ 集めた上層に水１ｍＬ加え、よく混ぜ、遠心分離を行ったのち、水層（下層）を除去した。前記操作をさらに１回繰り返した。
▲７▼遠心型エバポレーターまたは窒素を用いて上層の溶媒を留去した。
▲８▼残渣にトルエン４ｍＬを加えて溶かした後、この溶液２００μＬをサンプル瓶に正確に量り、さらにトルエン３００μＬおよび蛍光標識化試液（ＡＤＡＭ（９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ；フナコシ製）のアセトン溶液（１ｇ／２５０ｍＬ）をさらにメタノールで正確に１０倍に希釈したもの）５００μＬを加え、４０℃で５時間以上反応させた。反応終了後、すみやかに５℃に冷却した。これらをそれぞれ試料溶液および標準溶液として分析に供した。
（２）分析
試料溶液および標準溶液の各１０μＬをＨＰＬＣにて以下の条件で分析した。
試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、内標準物質のピーク面積に対するミコール酸誘導体のピーク面積比を求め、標準溶液から得られた検量線を用いて、被験サンプルの力価を求めた。
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の設定条件］
カラム温度：５０℃
カラム：関東化学製Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ（登録商標）ＲＰ−１８ ＧＰ １５０−４．６（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ）、または住化分析センター製ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１１（５μｍ、４．６ｍｍφ×２５ｃｍ）
または野村化学製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ（登録商標）（３μｍ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、または５μｍ、４．６ｍｍφ×２５ｃｍ）
溶媒：Ａ液：メタノール／水混液（９：１）Ｂ液：２−プロパノールグラジエント条件またはＡ液：メタノール Ｂ液：トルエングラジエント条件を表１５に示した。
移動相の流速：１．０または１．５ｍＬ／ｍｉｎ
蛍光検出条件：
励起波長：３６５ｎｍ
検出波長：４１２ｎｍ
（３）結果
図５に代表的なクロマトグラム、図６に標準品について複数濃度でミコール酸含量を測定した結果をプロットして作成した検量線を示した。
試料溶液のミコール酸の溶出パターンは、標準溶液と比較し、同様の位置に同様の強度のピークを認めることを確認した。また、被験サンプルの測定結果から図６の検量線を用いて力価を算出した結果を、表１６に示した。
上記のように、ＢＣＧ−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬品の製造中間体となるＢＣＧ−ＣＷＳの各製造ロットにおける力価を評価することができた。
【実施例１８】
菌株の同定および定量
（１）溶液の調製
▲１▼ＢＣＧ菌東京株（日本ビーシージー製）を公知の方法で死滅したものを約１０ｍｇ（ＣＷＳ量に換算して）を精密に量り、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／水混液（１：１）溶液２ｍＬを加えて、１００℃で２時間反応させた。放冷後、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸１．５ｍＬを加えて酸性にし、よく振り混ぜた。
▲２▼ 別に、生物活性が確認されているＢＣＧ−ＣＷＳの標準品約１５ｍｇを精密に量り、トルエンまたはヘプタン／エタノール（９９．５）混液（９：１）を加えて正確に２５ｍＬとし、超音波を１５分間照射し、標準原液とした。標準原液１、２および３ｍＬを正確に量り、溶媒を留去した。０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／トルエン／水混液（１０：１０：１）溶液１ｍＬを加え、超音波を１分間照射した。６５℃の恒温槽で３時間加熱し、放冷後、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸５００μＬを正確に加え、よく振り混ぜた。
▲３▼ 試料溶液および標準溶液にそれぞれヘキサン２ｍＬを加え、よく振り混ぜた後静置し、上層（有機層）をサンプル瓶に移した。同操作を、ヘキサン１ｍＬずつを用いて、さらに２回繰り返した。
▲４▼ 集めた上層に水１ｍＬ加え、よく混ぜ、遠心分離を行ったのち、水層（下層）を除去した。前記操作をさらに１回繰り返した。
▲５▼ 遠心型エバポレーターまたは窒素を用いて上層の溶媒を留去した。
▲６▼ 残渣にトルエンを約０．３ｍｇ／ｍＬ（ＣＷＳ量に換算して）となるよう一定量を正確に加えて溶かし、この溶液２００μＬをサンプル瓶に正確に量り、さらにトルエン３００μＬおよび蛍光標識化試薬（ＡＤＡＭ（９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ）；フナコシ製）５００μＬを加え、４０℃で５時間以上反応させた。反応終了後、すみやかに５℃に冷却した。これらをそれぞれ試料溶液および標準溶液として分析に供した。
（２）分析
試料溶液および標準溶液の各１０μＬをＢＣＧ−ＣＷＳのＨＰＬＣと同じ試験条件で分析した。試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、試料溶液のミコール酸誘導体のピーク面積を求め、標準溶液のミコール酸誘導体のピーク面積から得られた検量線を用いて、被験サンプル（菌体）におけるＣＷＳ含量（％）を求めた。
（３）結果
被験サンプルの測定結果を表１７に示した。
上記のように、ＢＣＧ−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬品の製造中間体となるＢＣＧ菌・東京株の菌体について、各製造ロットにおける有効成分量を評価することができた。
【実施例１９】
凍結乾燥製剤の分析例
（１）溶液の調製
▲１▼ ＢＣＧ−ＣＷＳ凍結乾燥製剤は実施例１０に記載された方法で調製した。生物活性が確認されているＢＣＧ−ＣＷＳ凍結乾燥製剤の標準品約１５ｍｇを精密に量り、トルエンまたはヘプタン／エタノール（９９．５）混液（９：１）を加えて正確に２５ｍＬとし、超音波を１５分間照射し、標準原液とした。標準原液１、２および３ｍＬを正確に量り、溶媒を留去した。標準原液に内標準溶液（エルカ酸（アルドリッチ製）のトルエン溶液（１ｍＬ／５０００ｍＬ）またはトリコセン酸（東京化成製）のトルエン溶液（３ｇ／１０００ｍＬ）））１００μＬを正確に加え、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／トルエン／水混液（２０：１０：１）溶液１ｍＬを加え、超音波を１分間照射した。▲２▼ ＢＣＧ−ＣＷＳ凍結乾燥製剤の被験サンプルを精密に量り、内標準溶液１００μＬを正確に加え、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムのエタノール（９９．５）／トルエン／水混液（１０：１０：１）溶液１ｍＬを加え、超音波を１分間照射した。
以下、実施例１と同様に加水分解を行い、ミコール酸を溶媒抽出し、標識化を行った。ただし、用いる標識化試薬は１０倍濃度が濃いものを用いた。
（２）分析
試料溶液および標準溶液の各１０μＬをＨＰＬＣにて以下の条件で分析した。
試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、内標準物質のピーク面積に対するミコール酸誘導体のピーク面積比を求め、標準溶液から得られた検量線を用いて、被験サンプルの力価を求めた。
（３）結果
被験サンプルの測定結果を表１８に示した。
上記のように、ＢＣＧ−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬品について、各製造ロットにおける力価を評価することができた。
【実施例２０】
ＢＣＧ−ＣＷＳの菌株の同定
実施例１と同様の方法でＢＣＧ菌東京株のＣＷＳと、ＢＣＧ菌パスツール株のＣＷＳの、ミコール酸の溶出パターンをＨＰＬＣで分析した。結果を図７に示した。
図７からわかるように、ＢＣＧ菌の株の種類によって、含まれるミコール酸の分子種およびミコール酸分子の量比が異なり、クロマトグラムで判別できることが明らかとなった。
参考例１ ＢＣＧ−ＣＷＳ標準品の生物活性評価
（１）方法
ＲＡＷ２６４．７細胞を９６穴プレートに播種後３７℃、５％二酸化炭素、湿条件で５時間培養し、複数濃度のＢＣＧ−ＣＷＳ（標準品）の生理食塩水懸濁液を添加して、さらに約１５時間培養した。培養上清のＴＮＦ−□量をＡＮ’ＡＬＹＺＡ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−□□Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキットを用いてＥＬＩＳＡ測定を行った。付属の手順書に従い、４５０ｎｍの吸光度を測定することによって測定した。上記ＢＣＧ−ＣＷＳの生理食塩水懸濁液のミコール酸含量を、実施例１７記載の方法で測定した。
（２）結果
測定したＢＣＧ−ＣＷＳのミコール酸含量とＴＮＦ−α量をプロットした結果を図８に示した。
上記の結果から、ＢＣＧ−ＣＷＳ標準品において、本発明の方法で検定したミコール酸含量の分析値と、実際の生物活性値（ＴＮＦ−α産生誘導活性）が相関していることがわかった。すなわち、ミコール酸含量を生物活性の力価の指標として用いることができることが確認できた。
【発明の効果】
本発明により、安定な水中油型エマルジョン製剤が提供できる。また、固体成分を油中に含有する安定で凍結乾燥可能な水中油型エマルジョン製剤とその凍結乾燥製剤が提供できることから、この方法を用いて、ＢＣＧ−ＣＷＳ製剤を創出でき、免疫賦活抗がん療法が、より効果的に実施できるようになった。
本発明により、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳに含まれる高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムのパターンから細菌−ＣＷＳ、および該細菌−ＣＷＳを含む製剤等における細菌の属、種および株を同定、確認することができた。また、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳを含有する製造中間体菌体、原薬および製剤の力価を定量的に評価することが可能になった。このことにより、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳおよびそれを有効成分とする医薬品の品質を一定に保ち、ミコバクテリウム属およびノカルジア属等の細菌−ＣＷＳを含有する医薬品を提供することが可能になった。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌−ＣＷＳおよび油からなる細菌−ＣＷＳ含有ペーストであって、０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）以下の粘度を有するペースト。
【請求項２】
０．２〜０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する請求項１記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項３】
０．２８〜０．５５ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する請求項１記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項４】
細菌−ＣＷＳがＢＣＧ−ＣＷＳである、請求項１〜３のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項５】
油がスクワランである、請求項１〜４のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項６】
細菌−ＣＷＳがＢＣＧ−ＣＷＳであり、ＢＣＧ−ＣＷＳ約０．６７ｇに対してスクワラン６．６ｇ〜３５．２ｇを含有することを特徴とする細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項７】
（１）細菌−ＣＷＳおよび油を分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合する工程、および
（２）得られた（１）の混合物から有機溶媒を留去する工程を含む、細菌−ＣＷＳ含有ペーストの調製方法。
【請求項８】
有機溶媒が炭化水素系溶媒、またはハロゲン化炭化水素系溶媒を含む、請求項７記載の調製方法。
【請求項９】
有機溶媒が、５〜２０％（Ｖ／Ｖ）のアルコール系溶媒を含む炭化水素系溶媒である、請求項８記載の調製方法。
【請求項１０】
炭化水素系溶媒がヘプタンまたはヘキサンである、請求項８または９記載の調製方法。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか記載の調製方法によって得られる細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項１２】
細菌がＢＣＧ菌である請求項１１記載のペースト。
【請求項１３】
油がスクワランである、請求項７〜１２のいずれか記載のペースト。
【請求項１４】
請求項１〜６および１１〜１３のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型エマルジョン。
【請求項１５】
水２Ｌあたり、０．６６ｇ〜３．３５ｇの細菌−ＣＷＳ、および０．４〜８重量％の油を含有することを特徴とする、請求項１４記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１６】
安定化剤が１〜１０％のマンニトールである、請求項１４または１５記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１７】
界面活性剤が０．０１％〜３％のポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１４〜１６のいずれか記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１８】
ポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン８０である請求項１７記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１９】
以下の（１）および（２）の特徴を有する請求項１４〜１８のいずれか記載の水中油型エマルジョン：
（１）エマルジョン油滴粒子径が０．２〜３０μｍ；および
（２）細菌−ＣＷＳが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性。
【請求項２０】
以下の（１）および（２）の工程を含む、請求項１４〜１９のいずれか記載の水中油型エマルジョンの調製方法：
（１）請求項１〜１０および１７〜１９のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペーストと、界面活性剤を含む水溶液の混合液を、曇点以上の温度で乳化する工程、および
（２）安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程。
【請求項２１】
前項の（１）における乳化工程が、以下の（３）および（４）の工程を含む請求項２０記載の調製方法：
（３）請求項１〜６および１１〜１３のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペーストと、０．０２％〜０．８％の界面活性剤を含む水溶液の混合液を乳化する工程（粗乳化工程）、
（４）（３）の粗乳化液に界面活性剤を含む水溶液を加え、界面活性剤濃度を調整し、強攪拌して本乳化を行う工程。
【請求項２２】
請求項１４〜１９のいずれか記載のエマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。
【請求項２３】
エマルジョンが請求項２０または２１記載の調製方法で得られることを特徴とする、請求項２２記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２４】
粒度分布において、粒子径が０．１５〜６μｍである細菌−ＣＷＳ粒子集合体。
【請求項２５】
粒度分布において、Ｄ１０％が０．２３±０．０５μｍであり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５μｍであり、かつ単一ピークを有する、請求項２４記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体。
【請求項２６】
脂肪族炭化水素系溶媒を含む溶媒中に細菌−ＣＷＳを分散することを特徴とする、請求項２４または２５記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体の調製方法。
【請求項２７】
溶媒が、脂肪族炭化水素系溶媒とアルコール系溶媒との混合物である、請求項２６記載の調製方法。
【請求項２８】
溶媒が、５〜２０％エタノールを含むヘプタンである請求項２７記載の調製方法。
【請求項２９】
細菌−ＣＷＳの菌種および／または菌株の同定方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法；
（１）細菌−ＣＷＳ中に含まれる、高級脂肪酸を分離および／または抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（２）（１）の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程、および
（３）（２）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの菌種および／または菌株を同定する工程。
【請求項３０】
前項の工程（１）が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
細菌−ＣＷＳの力価検定方法であって、以下の工程（１）、（４）および（５）を含むことを特徴とする方法；
（１）細菌−ＣＷＳ中に含まれる高級脂肪酸を分離および／または抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（４）（１）の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、
（５）（４）の分析結果に基づき、細菌−ＣＷＳの免疫賦活能を評価する工程。
【請求項３２】
高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する（１）の工程が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
高級脂肪酸の誘導体が高級脂肪酸エステルであることを特徴とする、請求項３０または３２記載の方法。
【請求項３４】
細菌がミコバクテリウム属またはノカルジア属の細菌である、請求項２９〜３３のいずれか記載の方法。
【請求項３５】
ミコバクテリウム属の細菌がＢＣＧ菌である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
高級脂肪酸がミコール酸である、請求項２９〜３５のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
粒度分布において、粒子径が０．１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．１５〜６μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ〜２μｍである細菌−ＣＷＳ粒子集合体を含有する、請求項１から６および１１から１３までのいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項３８】
細菌−ＣＷＳ粒子集合体が粒度分布においてＤ１０％が０．２３±０．０５μｍであり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５μｍであり、かつ単一ピークを有する、請求項３７記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項３９】
請求項３７または３８記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型エマルジョン。
【請求項４０】
請求項３９記載のエマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。
【請求項４１】
請求項１４〜１９および３９のいずれか記載のエマルジョンからなる医薬組成物。
【請求項１】
細菌−ＣＷＳおよび油からなる細菌−ＣＷＳ含有ペーストであって、０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）以下の粘度を有するペースト。
【請求項２】
０．２〜０．７ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する請求項１記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項３】
０．２８〜０．５５ｐｏｉｓｅ（２５℃）の粘度を有する請求項１記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項４】
細菌−ＣＷＳがＢＣＧ−ＣＷＳである、請求項１〜３のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項５】
油がスクワランである、請求項１〜４のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項６】
細菌−ＣＷＳがＢＣＧ−ＣＷＳであり、ＢＣＧ−ＣＷＳ約０．６７ｇに対してスクワラン６．６ｇ〜３５．２ｇを含有することを特徴とする細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項７】
（１）細菌−ＣＷＳおよび油を分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合する工程、および
（２）得られた（１）の混合物から有機溶媒を留去する工程を含む、細菌−ＣＷＳ含有ペーストの調製方法。
【請求項８】
有機溶媒が炭化水素系溶媒、またはハロゲン化炭化水素系溶媒を含む、請求項７記載の調製方法。
【請求項９】
有機溶媒が、５〜２０％（Ｖ／Ｖ）のアルコール系溶媒を含む炭化水素系溶媒である、請求項８記載の調製方法。
【請求項１０】
炭化水素系溶媒がヘプタンまたはヘキサンである、請求項８または９記載の調製方法。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか記載の調製方法によって得られる細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項１２】
細菌がＢＣＧ菌である請求項１１記載のペースト。
【請求項１３】
油がスクワランである、請求項７〜１２のいずれか記載のペースト。
【請求項１４】
請求項１〜６および１１〜１３のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型エマルジョン。
【請求項１５】
水２Ｌあたり、０．６６ｇ〜３．３５ｇの細菌−ＣＷＳ、および０．４〜８重量％の油を含有することを特徴とする、請求項１４記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１６】
安定化剤が１〜１０％のマンニトールである、請求項１４または１５記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１７】
界面活性剤が０．０１％〜３％のポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１４〜１６のいずれか記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１８】
ポリエチレンオキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン８０である請求項１７記載の水中油型エマルジョン。
【請求項１９】
以下の（１）および（２）の特徴を有する請求項１４〜１８のいずれか記載の水中油型エマルジョン：
（１）エマルジョン油滴粒子径が０．２〜３０μｍ；および
（２）細菌−ＣＷＳが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性。
【請求項２０】
以下の（１）および（２）の工程を含む、請求項１４〜１９のいずれか記載の水中油型エマルジョンの調製方法：
（１）請求項１〜１０および１７〜１９のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペーストと、界面活性剤を含む水溶液の混合液を、曇点以上の温度で乳化する工程、および
（２）安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程。
【請求項２１】
前項の（１）における乳化工程が、以下の（３）および（４）の工程を含む請求項２０記載の調製方法：
（３）請求項１〜６および１１〜１３のいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペーストと、０．０２％〜０．８％の界面活性剤を含む水溶液の混合液を乳化する工程（粗乳化工程）、
（４）（３）の粗乳化液に界面活性剤を含む水溶液を加え、界面活性剤濃度を調整し、強攪拌して本乳化を行う工程。
【請求項２２】
請求項１４〜１９のいずれか記載のエマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。
【請求項２３】
エマルジョンが請求項２０または２１記載の調製方法で得られることを特徴とする、請求項２２記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２４】
粒度分布において、粒子径が０．１５〜６μｍである細菌−ＣＷＳ粒子集合体。
【請求項２５】
粒度分布において、Ｄ１０％が０．２３±０．０５μｍであり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５μｍであり、かつ単一ピークを有する、請求項２４記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体。
【請求項２６】
脂肪族炭化水素系溶媒を含む溶媒中に細菌−ＣＷＳを分散することを特徴とする、請求項２４または２５記載の細菌−ＣＷＳ粒子集合体の調製方法。
【請求項２７】
溶媒が、脂肪族炭化水素系溶媒とアルコール系溶媒との混合物である、請求項２６記載の調製方法。
【請求項２８】
溶媒が、５〜２０％エタノールを含むヘプタンである請求項２７記載の調製方法。
【請求項２９】
細菌−ＣＷＳの菌種および／または菌株の同定方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法；
（１）細菌−ＣＷＳ中に含まれる、高級脂肪酸を分離および／または抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（２）（１）の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程、および
（３）（２）の分析結果に基づき、細菌のＣＷＳの菌種および／または菌株を同定する工程。
【請求項３０】
前項の工程（１）が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
細菌−ＣＷＳの力価検定方法であって、以下の工程（１）、（４）および（５）を含むことを特徴とする方法；
（１）細菌−ＣＷＳ中に含まれる高級脂肪酸を分離および／または抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、
（４）（１）の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、
（５）（４）の分析結果に基づき、細菌−ＣＷＳの免疫賦活能を評価する工程。
【請求項３２】
高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する（１）の工程が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
高級脂肪酸の誘導体が高級脂肪酸エステルであることを特徴とする、請求項３０または３２記載の方法。
【請求項３４】
細菌がミコバクテリウム属またはノカルジア属の細菌である、請求項２９〜３３のいずれか記載の方法。
【請求項３５】
ミコバクテリウム属の細菌がＢＣＧ菌である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
高級脂肪酸がミコール酸である、請求項２９〜３５のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
粒度分布において、粒子径が０．１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．１５〜６μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ〜２μｍである細菌−ＣＷＳ粒子集合体を含有する、請求項１から６および１１から１３までのいずれか記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項３８】
細菌−ＣＷＳ粒子集合体が粒度分布においてＤ１０％が０．２３±０．０５μｍであり、Ｄ９０％が０．６０±０．０５μｍであり、かつ単一ピークを有する、請求項３７記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト。
【請求項３９】
請求項３７または３８記載の細菌−ＣＷＳ含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型エマルジョン。
【請求項４０】
請求項３９記載のエマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。
【請求項４１】
請求項１４〜１９および３９のいずれか記載のエマルジョンからなる医薬組成物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１２７５１
【国際公開日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【発行日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２５８１５（Ｐ２００４−５２５８１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００９８０１
【国際出願日】平成１５年８月１日（２００３．８．１）
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【発行日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００９８０１
【国際出願日】平成１５年８月１日（２００３．８．１）
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
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