組換えウシ血清アルブミン（ｒＢＳＡ）の発現、分泌及び精製、並びにその使用
（ａ）ｒＢＳＡを直鎖ＤＮＡとともに一晩温置し、ゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；及び（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、組換えＢＳＡ（ｒＢＳＡ）が提供される。ｒＢＳＡを作製し、これを使用して酵素を安定化するための方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ブロット及び免疫組織化学を含む数多くの用途において、希釈剤又はブロッキング剤として使用される。さらに、未変性ＢＳＡは、タンパク質の精製中若しくは精製後に、若しくは生物アッセイにおいて、前記タンパク質の安定性を増大させるために、又は反応用試験管及び他の容器に対する酵素の接着を防止するために日常的に使用されている。
【０００２】
近年、ウシ由来のＢＳＡ中に動物ウイルス及び伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ；狂牛病の原因）の脅威が存在し得るため、多くの医薬及び生物工学産業での用途において、動物生成物の使用に対する懸念が高まっている。ＢＳＡの調製に関する最新の方法は、ウシ血漿からタンパク質を精製すること、及びこれらの混入物質の存在について検査することを包含する。しかしながら、検査は、公知のウイルス又はＴＳＥを検出することができるに過ぎず、現在発見されていない感染性病原体を対象としていない。それゆえ、動物由来の全ての感染性病原体が含まれていないことが確実なＢＳＡを大規模に供給する別の方法は現在存在していない。さらに、本発明までは、組換えＢＳＡ（ｒＢＳＡ）が、その未変性対応物と同一のタンパク質安定化特性を有するかどうかは不明であった。
【発明の開示】
【０００３】
（発明の概要）
一実施形態において、（ａ）ｒＢＳＡを直鎖ＤＮＡとともに一晩温置し、ゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；及び（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、ｒＢＳＡ調製物が提供される。ｒＢＳＡは、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）等の酵母生成系によって発現及び分泌され、本明細書では、クルイベロミセス・ラクチスが例示される。さらに、ｒＢＳＡ調製物には、さらに、リン酸塩緩衝液が含まれ得る。
【０００４】
本発明の一実施形態において、反応混合物には、上述のｒＢＳＡ、及び制限エンドヌクレアーゼ等のＤＮＡタンパク質が含まれ得る。反応混合物には、５０％グリセロールも含まれ得る。
【０００５】
本発明の一実施形態において、（ａ）組換えウシ血清アルブミン（ｒＢＳＡ）を直鎖ＤＮＡとともに一晩温置し、及びゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；並びに（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、ｒＢＳＡ調製物をＤＮＡタンパク質の調製物へ添加することを含む、ＤＮＡタンパク質を安定化するための方法が提供される。
【０００６】
本発明の一実施形態において、（ａ）動物由来のものを含まない培地中で、クルイベロミセス・ラクチス等のクルイベロミセス系においてｒＢＳＡを組換え的に発現すること；及び（ｂ）精製されたｒＢＳＡを熱処理することを含む、ＤＮＡタンパク質を安定化するためのｒＢＳＡ調製物を調製するための方法が提供される。
【０００７】
（発明の詳細な記述）
本発明の一実施形態において、ｒＢＳＡの存在下で一晩の温置した後のＤＮＡ調製物のゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性が実質的に存在せず、さらに、動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルス混入物を欠如しているｒＢＳＡの調製が提供される。ｒＢＳＡは、このような酵素を安定化するために、ＤＮＡ結合酵素への添加に適した緩衝液中で提供される。調製物中で使用するのに適した緩衝液の一例は、ｐＨ６ないし８のリン酸塩緩衝液である。本明細書に記載されるｒＢＳＡは、クルイベロミセス種等の酵母細胞中で、産業規模への拡大に適した量で作製可能である。
【０００８】
本発明の一実施形態において、クルイベロミセスは、ｒＢＳＡを発現し、これを細胞培地中へ分泌するための宿主細胞として選択される。クルイベロミセスは、ＤＮＡと共に一晩温置することによって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼを分泌しないように見受けられるので、クルイベロミセスには、他の真菌類を含む他の宿主生物体を上回る利点がある。これに対して、宿主細胞として使用される糸状真菌であるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（ＷＯ２００６／０６６５９５）は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを分泌するように見受けられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：４２５−３１（１９９５））。
【０００９】
驚くべきことに、分泌されたデオキシリボヌクレアーゼがクルイベロミセス中で見かけ上欠如しているにもかかわらず、本発明において、ＤＮＡを特異的に切断するのに使用される制限エンドヌクレアーゼ調製物にｒＢＳＡを添加した場合、ＤＮＡの非特異的分解を生じる１つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレアーゼとともに、クルイベロミセス・ラクチス由来のｒＢＳＡが共精製することが発見された（図３）。理論に拘泥するものではないが、デオキシリボヌクレアーゼ活性は、組換えＢＳＡタンパク質の本質的な特性であるか、又は宿主細胞からのｒＢＳＡの分泌の間に、ｒＢＳＡと物理的に結合され得る細胞内デオキシリボヌクレアーゼから生じるかの何れかであることが、本発明において示唆される。
【００１０】
アセチル化を使用した未変性ＢＳＡからのデオキシリボヌクレアーゼ活性の除去が報告されている（Ｔｒｕｇｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：６２０−２（１９９０））。アセチル化されたＢＳＡは、特定の好熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性のインビトロでの安定化に関して問題であり得る。このような反応において、アセチル基は、ＢＳＡから、ＤＮＡ重合を触媒する酵素の能力を除去するポリメラーゼへと転移され得る。
【００１１】
実施例２は、精製されたｒＢＳＡの熱処理を包含するｒＢＳＡからデオキシリボヌクレアーゼを除去する方法を提供する。これは、アセチル化によるタンパク質の化学的修飾を必要とせずに、デオキシリボヌクレアーゼ活性を除去する。この方法を介して生成されるｒＢＳＡは、デオキシリボヌクレアーゼによるＤＮＡ基質の分解を生じずに、制限エンドヌクレアーゼを安定化できる（実施例３）。
【００１２】
ヒト血清由来のＨＳＡなどのウシ血清由来の未変性ＢＳＡは、血中のステロイドホルモン、脂肪酸、疎水性小分子及びイオン等の無数の分子を非特異的に結合及び輸送することが長く公知である。ＨＳＡとは異なり、ＢＳＡに関する主な使用は、ＢＳＡがその通常の生物学的機能とは異なる目的に利用される分子生物学の適用に関するものである。ＢＳＡがこれらの機能をどのように発揮し、未変性のＢＳＡが、天然では通常遭遇しない酵素の活性をどのように安定化できるかについては知られていない。例えば、ウシ血清から精製されたＢＳＡは、かなり多くの細菌の制限エンドヌクレアーゼのインビトロでの活性を安定化及び増大することが可能である。未変性のＢＳＡの構造−機能の関係に関する不確実性の点において、（ａ）ウシ以外の宿主細胞において作製された精製済みのｒＢＳＡが、ウシ血清から精製されたタンパク質と同一の酵素安定化能を保持し得るかどうか；（ｂ）ウシ血清中に存在する特定の分子の機能を発揮するために、前記分子が、未変性のＢＳＡに関して相加的に又は相乗的に必要とされるかどうか；及び（ｃ）酵母によって生成され、動物由来のものを含有しない培地中で増殖されるｒＢＳＡが、ＤＮＡタンパク質を安定化するなどの分子生物学の用途において使用されうるかどうかは、予測不可能である。「ＤＮＡタンパク質」は、本発明において、ＤＮＡに作用するそれらのタンパク質又は酵素を含むよう企図される。ＤＮＡタンパク質の例には、制限エンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ及び刊行された米国の刊行された出願ＵＳ−２００６−００８８８６８−Ａ１に記載されるものなどのＤＮＡ修復酵素が含まれる。
【００１３】
ＢＳＡに関して興味のある別の特徴は、ＨＳＡとＢＳＡとの間のアミノ酸配列同一性の程度が高いことである（７６％）。それにもかかわらず、これら２つのタンパク質の機能的特性は、有意に異なるようである。例えば、未変性ＨＳＡ及び未変性ＢＳＡは、これらを固定化する色素を結合する能力に関する挙動が異なる（Ａｎｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１００−６（１９８２））。さらに、長鎖脂肪酸の存在下で、固定化された色素からのＨＳＡの解離は、３倍増大するのに対し、ＢＳＡの解離は、約１５倍増大する（Ｍｅｔｃａｌｆ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９：４６５−７２（１９８１））。これらの差異は、クルイベロミセス・ラクチスにより発現されるｒＢＳＡが、クルイベロミセス・ラクチスにより発現されるｒＨＳＡを欠失するデオキシリボヌクレアーゼ活性とともに共精製するという実施例４における知見と一致している。さらに、ＤＮＡが、熱処理されていないｒＨＳＡの存在下で安定であるのに対し、ＤＮＡは、熱処理されていないｒＢＳＡの存在下で破壊された（図２Ａ（ｉｉｉ）及びＢ（ｉｉｉ））。
【００１４】
総合して考慮すると、これらの知見は、アミノ酸配列同一性の程度が高いにもかかわらず、ｒＨＳＡとｒＢＳＡとの間に固有の測定可能な生化学的及び物理的差異があることを示している。従って、組換え発現されたＨＳＡ若しくはＢＳＡが、非特異的酵素安定剤として未変性のＨＳＡ若しくはＢＳＡのようにどの程度十分に機能し得るかを、又はたとえそうであるとしても推定することは不可能であった。実際、本発明者は、図２において、精製された熱処理済みのｒＢＳＡ及びｒＨＳＡが、ＤＮＡ基質を分解せずに、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩの活性を安定化することが可能であることを示している。
【００１５】
動物由来のものを含まない培地中でクルイベロミセス種によって発現されるｒＢＳＡは、ＤＮＡタンパク質を安定化するための改良された組成物及び方法を提供する。
２００６年４月３日に出願された米国仮出願第６０／７８８，８５０号、及び２００６年１２月２０日に出願された第６０／８７５，９１７号を含む、上述及び後述で引用される参考文献は全て、参照により組み入れられる。
【００１６】
実施例
【実施例１】
【００１７】
クルイベロミセス・ラクチスにおけるｒＢＳＡの発現及び分泌
それぞれ、次の順方向及び逆方向プライマー：５’−
【００１８】
【化１】
を用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＢＳＡをコードする遺伝子をウシ肝臓ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から増幅した。順方向及び逆方向プライマーは、操作された制限酵素部位ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ（下線部）を含有する。さらに、順方向プライマーは、二塩基性のクルイベロミセス・ラクチスＫｅｘ１プロテアーゼ切断部位ＫＲ（太字）をコードするＤＮＡ配列を組み込む。逆方向プライマーはまた、終止コドン（太字のイタリック体）を組み込み、両プライマー中のＤＮＡをコードするＢＳＡは、イタリック体で表される。ＳｉｇｎａｌＰソフトウェアを使用して、ＢＳＡシグナル配列を同定した。シグナルペプチドの改良された予測（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−７９５（２００４）及びＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６（１９９７））は、シグナルペプチダーゼによる切断が、１８番目のアミノ酸と１９番目のアミノ酸との間（Ｓｅｒ１８−Ａｒｇ１９）で生じることを予測する。従って、順方向プライマー中のＢＳＡをコードするＤＮＡ配列は、Ａｒｇ１９コドンで開始した。以下の周期条件下で、高い忠実度のＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、ＢＳＡのＤＮＡ増幅を実施した：９４℃で５分、８０℃で１分、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分を３０周期、及び最後に７２℃で１０分。クルイベロミセス・ラクチス発現ベクターｐＫＬＡＣ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位中に、ＢＳＡをコードする遺伝子をクローン化し、ＳａｃＩＩで直線化し、化学的に形質転換受容性のクルイベロミセス・ラクチスＧＧ７９９細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中に形質転換した。５ｍＭアセトアミドを含有するアガープレート上で、形質転換体を３０℃で４日間選択した。発現カセットのゲノム組込み分析のため、５ｍＭアセトアミドを含有するアガープレート上で、多くのコロニーを再度画線した。発現カセットの複数の組み込まれたコピーを含有する系の同定に特異的なプライマーを使用して、再度画線された形質転換体に関して全細胞ＰＣＲを実施した。１Ｍソルビトール中の１０ｍｇ／ｍＬリチカーゼ溶液２５μＬ中で、形質転換細胞を前処理した。１００μＬの全反応容積中で組込みプライマー２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，カタログ番号Ｓ１２７８Ｓ）及び組込みプライマー３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，カタログ番号Ｓ１２７９Ｓ）を含有するＰＣＲ反応のためのテンプレートとして、リチカーゼ処理された細胞１５μＬを使用した。ＰＣＲ反応混合物を９５℃で１０分間の後、８０℃で２分間温置し、８０℃で２分間温置する時点でＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を添加した。次に、ＰＣＲは、以下の周期条件で進行した：９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３分を３０周期、及び最後に７２℃で１０分。ＢＳＡ発現カセットの複数の組み込まれたコピーを含有するものとして同定された形質転換体をさらに、前記形質転換体がｒＢＳＡを分泌する能力に関して評価した。クルイベロミセス・ラクチスの系を、３０℃の振盪プラットフォーム恒温器で４日間、２ｍＬのＹＰＧａｌ培養物中で増殖した。消費された培地を、３×タンパク質負荷緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と混合し、４ないし２０％のトリス−グリシンポリアクリルアミド勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質を分離した。クーマシー染色後、６７ｋＤａタンパク質としてＢＳＡを同定した。
【００１９】
５Ｌの作業容積の卓上発酵槽中で、ｒＢＳＡを生成する系の発酵によって、ｒＢＳＡの生成を実施した。−８０℃で保存された貯蔵培養物を融解し、規定された発酵培地（組成については以下参照）１００ｍＬへ播種するために使用した。前培養物を３０℃で、約８の細胞密度（ＯＤ６００）まで増殖し、発酵を開始するために使用した。規定されたバッチ発酵培地は、動物由来の成分がなく、ＫＨ２ＰＯ４８．８７３ｇ／Ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４１．７２４ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）ＳＯ４１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１ｇ／Ｌ、ＫＣｌ１ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．００５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０．０３ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ０．００８ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２０．０１ｇ／Ｌ、ＫＩ０．００１ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．００２ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３０．０００４ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．０１５ｇ／Ｌ、ビオチン０．０００８ｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテナート０．０２ｇ／Ｌ、チアミン０．０１５ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．０１６ｇ／Ｌ、ニコチン酸０．０１０ｇ／Ｌ、及びピリドキシン０．００４ｇ／Ｌから構成された。前培養ブロス６０ｍＬを使用して、バッチ培地３Ｌに播種した。発酵中のｐＨ及び温度をそれぞれ６℃及び３０℃で維持した。定常速度（５ｒｐｍ）で空気を発酵槽中に散布し、撹拌速度を変動させることによって、溶存酸素（ＤＯ）を飽和の３０％で維持した。バッチ培地中のグルコースを約１７時間で完全に消費し、その時点で、グルコース供給段階を開始した。供給培地は、動物由来の成分がなく、グルコース４４８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ１．６５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１ｇ／Ｌ、ＫＣｌ１ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．００７５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０．０４５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ０．０１２ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２０．０１５ｇ／Ｌ、ＫＩ０．００１５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．００３ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３０．０００６ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．０２２５ｇ／Ｌ、ビオチン０．００３２ｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテナート０．０８０ｇ／Ｌ、チアミン０．０６０ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．０６４ｇ／Ｌ、ニコチン酸０．０４０ｇ／Ｌ、及びピリドキシン０．０１６ｇ／Ｌから構成された。指数関数的に増大する速度でグルコース供給を導入し、約０．１２／時で増殖速度を調節した。グルコース供給約１．１Ｌを添加した。この後、ガラクトース供給段階が続いた。ガラクトース供給培地は、グルコース供給培地と同一であったが、例外は、ガラクトースが、グルコースの代わりに４４８ｇ／Ｌで存在していることであった。植物（サトウダイコン）由来のガラクトースを、牛乳由来のガラクトースに代わりに使用した。ガラクトース供給約１．１Ｌを４０ｍＬ／時の定常速度で添加した。総発酵時間は、６５時間であった。
【００２０】
クルイベロミセスの他の生成系の例には、クルイベロミセス・マルキアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）種フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）が含まれる。他の酵母生成系には、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。
【実施例２】
【００２１】
ｒＢＳＡの精製
イオン交換及び分子ふるいクロマトグラフィーによって、クルイベロミセス・ラクチスにより消費された培地から、ｒＢＳＡを精製した。特に、ｒＢＳＡをまず、ＤＥＡＥカラムに結合させ、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ及び５％グリセロール）中の５０ｍＭないし１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる溶出済みのタンパク質の分離及びクーマシー染色によるｒＢＳＡの可視化の後、ｒＢＳＡを含有する画分を同定した。ｒＢＳＡを含有する画分をプールし、ソースＱカラムを通過させた。緩衝液Ａ中の５０ｍＭないし１Ｍ ＮａＣｌ勾配中で、結合したタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる溶出済みタンパク質の分離及びクーマシー染色によるｒＢＳＡの可視化の後、ｒＢＳＡを含有する画分を同定した。ｒＢＳＡを含有する画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５分子ふるいカラムを通過させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる画分試料の分離及びクーマシー染色による可視化の後、ｒＢＳＡを含有する画分を同定した。１ｍｇ／ｍＬの作業溶液にｒＢＳＡを濃縮した。図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されるとき、精製済みｒＢＳＡが、ウシ由来のＢＳＡと同様に移動することを示す。ｒＢＳＡと共精製したヌクレアーゼ活性を不活性化するため、精製済みｒＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を８０℃で２時間熱処理した。ｒＢＳＡをその後０．２２μＭフィルターで濾過した。
【実施例３】
【００２２】
ｒＢＳＡを使用する制限エンドヌクレアーゼ機能の安定化
ｒＢＳＡが、未変性ウシ由来ＢＳＡと同一の様式で酵素安定剤として挙動し得るかどうかを決定するため、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩを使用して安定化アッセイを実施した。本アッセイにおいて、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の基質としてＨｉｎｄＩＩＩで消化されたλＤＮＡ１μｇを含有する制限消化物の２倍連続希釈にＰｖｕＩ１単位を供した。各希釈シリーズを含む反応物に、０．１μｇ／ｍＬの終濃度の精製済み未変性ＢＳＡ（図２Ａ（ｉｉ））、精製済みの熱処理されていないｒＢＳＡ（図２Ａ（ｉｉｉ））又は精製済みの熱処理されたｒＢＳＡを補充した。反応物を３７℃で一晩温置し、１％アガロースゲル上での消化済みＤＮＡの分解及び臭化エチジウム染色による可視化の後、酵素の効率性を測定した。標的ＤＮＡ基質の不完全な消化は、２３００ｂｐバンドの出現によって最も良好に観察された（図２中の矢印によって示された。）。
【００２３】
ＰｖｕＩ安定性は、ＢＳＡの非存在下で損なわれ、ＤＮＡ切断の効率性の低下に至る（図２Ａ（ｉｉ））。精製済みの熱処理されていないｒＢＳＡの添加によって、全てのレーンでＤＮＡ基質のヌクレアーゼによる分解が生じた（図２Ａ（ｉｉｉ））。精製済みの熱処理されたｒＢＳＡの存在によって、ＰｖｕＩ活性は、精製済みの未変性ＢＳＡと同一の程度まで安定化された。
【００２４】
精製済みの熱処理されていないｒＨＳＡ（図２Ｂの左から３番目のパネル）及び精製済みの熱処理されたＨＳＡ（図２Ｂの右のパネル）を使用して、消化物の同一のシリーズも実施した。熱処理されていないｒＨＳＡは、前記ｒＨＳＡと結合しているヌクレアーゼ活性を有さなかった（図２Ｂ（ｉｉｉ））が、熱処理されない限り、ＰｖｕＩ活性も安定化しなかった（図２Ｂ（ｉｖ））。
【００２５】
これらの結果は、クルイベロミセス・ラクチスにおいて生じ、消費された培地から精製された精製済みの熱処理されたｒＢＳＡが、ウシ由来のＢＳＡと関連した潜在的な危険性なく、未変性のウシ由来ＢＳＡと同程度の効率的に酵素安定剤として作用することを示している。
【実施例４】
【００２６】
ｒＢＳＡとｒＨＳＡとの比較
実施例１に記載のとおり、ｒＢＳＡを調製及び精製した。
【００２７】
ｒＨＳＡを産生するクルイベロミセス・ラクチスの系の構築は、既に記載されていた（Ｃｏｌｕｓｓｉ ＆ Ｔａｒｏｎ Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７０９２−８（２００５））。５Ｌの作業容積の卓上発酵槽において、本系の発酵を実施した。−８０℃で保存された貯蔵培養物を融解し、規定された発酵培地１００ｍＬへ播種するために使用した。前培養物を３０℃で、約８の細胞密度（ＯＤ６００）まで増殖し、発酵を開始するために使用した。前培養物にも使用される規定されたバッチ発酵培地は、ｒＢＳＡ発酵物に関して使用されるものと同一であったが、例外は、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ／Ｌが存在することであった。前培養ブロス４０ｍＬを使用して、バッチ培地２Ｌに播種した。発酵中のｐＨ及び温度をそれぞれ６℃及び３０℃で維持した。定常速度（５ｌｐｍ）で空気を発酵槽中に散布し、撹拌速度を変動させることによって、溶存酸素（ＤＯ）を飽和の３０％で維持した。バッチ培地中のグルコースを約１７時間で完全に消費し、その時点で、グルコース供給段階を開始した。供給培地は、ｒＢＳＡ発酵に使用されるものと同一であった。グルコース供給は、直線的に増大する速度で導入し、グルコース供給物約１．１Ｌを添加した。この後、ガラクトース供給段階が続いた。ガラクトース供給培地は、ｒＢＳＡ発酵に使用されるものと同一であった。ガラクトース供給物約１．１Ｌを直線的に増大する速度で添加した。総発酵時間は、６４時間であった。
【００２８】
イオン交換及び分子ふるいクロマトグラフィーによって、クルイベロミセス・ラクチスにより消費された発酵培地から、ｒＨＳＡを精製した。特に、まず、ｒＨＳＡは、２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ及び５％グリセロール中で平衡化されたＤＥＡＥ ＨｙｐｅｒＤ樹脂の５００ｍＬベッド容積を通過した。さらに緩衝液５００ｍＬでカラムを洗浄し、カラムを通じて空隙を洗浄した。４℃で１２時間固体ＰＥＧ８０００の５００ｇで覆った５０ｍｍ透析チューブを使用して、試料約２Ｌを、容積を減少させる透析に供した。次に、２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ及び５％グリセロール中で平衡化されたＢｉｏｓｅｐ ＤＥＡＥ樹脂の４４ｍＬベッド容積に、試料を負荷した。ｒＨＳＡは、樹脂に結合し、２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０及び５％グリセロール中の５０ないし７００ｍＭの範囲のＮａＣｌの線形勾配を使用して、前記ｒＨＳＡを溶出した。ｒＨＳＡの大部分は、２００ｍＭＮａＣｌでの単一画分中で溶出した。２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭＮａＣｌ及び５０％グリセロールに対して、本画分を４℃で一晩透析した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇＸＲ５０／１００樹脂の１７００ｍＬベッド容積を使用するゲル濾過へ供した。ｒＨＳＡピークは、最初に、このカラムから溶出した。図３は、４ないし２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、クーマシーによる染色によって可視化されると、精製されたｒＨＳＡが均質であったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、組換えＢＳＡの純度が、野生型タンパク質の純度と比較されるゲルを示す。ｒＢＳＡ２μｇ及び５μｇ並びに未変性ＢＳＡ（ＮＥＢ Ｂ９００１Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）２μｇを、４ないし２０％トリス−グリシンゲル上で分離し、クーマシーブルーで染色すると、ｒＢＳＡが、添加されたタンパク質全体の量と同量の量を含有する単一のバンドを形成することを示した。
【図２】図２Ａ（ｉないしｉｖ）及び２Ｂ（ｉないしｉｖ）は、各ゲルに７個のレーンがある８枚の一連のゲルを示す。レーンは、ＰｖｕＩの連続希釈を示す。ゲルの左側から、ＤＮＡに添加されたＰｖｕＩの量が、５単位、１単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位、０．０６単位、ＰｖｕＩなし及びＤＮＡマーカーである。図２Ａ（ｉ）において、アルブミンは添加されておらず、切断が、ＰｖｕＩ酵素０．２５単位を使用することで効果的に生じないように、酵素は、熱処理されたアルブミンの存在下にあるよりも不安定である。２Ａ（ｉｉ）において、熱処理された未変性ＢＳＡを添加すると、ＰｖｕＩ酵素０．０６単位を使用して切断される。２Ａ（ｉｉｉ）において、熱処理されていないｒＢＳＡの結果、ＤＮＡの非特異的ヌクレアーゼ切断が生じる。２Ａ（ｉｖ）において、熱処理されたｒＢＳＡの結果、ＰｖｕＩ０．０６単位による切断が生じる。図２Ｂ（ｉ）及び（ｉｉ）は、２Ａ（ｉ）及び２Ａ（ｉｉ）と同一である。２Ｂ（ｉｉｉ）は、ＰｖｕＩへ添加された熱処理されていない組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）であり、ヌクレアーゼ活性は生じないようであるが、ＰｖｕＩは、２Ａ（ｉ）及び２Ｂ（ｉ）に関して観察される安定性を同様に欠如していることを示す。熱処理されたｒＨＳＡは、ＰｖｕＩの安定性を保護する。
【図３】図３は、ｒＨＳＡの純度が評価されているゲルを示す。ｒＨＳＡを含有する消費された発酵ブロス５μＬ、ｒＨＳＡ２μｇ及び未変性ＢＳＡ（ＮＥＢ Ｂ９００１Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）２μｇを、４ないし２０％トリス−グリシンゲル上で分離し、クーマシーブルーで染色すると、ｒＨＳＡが、添加されたタンパク質全体の量と同量の量を含有する単一のバンドを形成することを示した。
【背景技術】
【０００１】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ブロット及び免疫組織化学を含む数多くの用途において、希釈剤又はブロッキング剤として使用される。さらに、未変性ＢＳＡは、タンパク質の精製中若しくは精製後に、若しくは生物アッセイにおいて、前記タンパク質の安定性を増大させるために、又は反応用試験管及び他の容器に対する酵素の接着を防止するために日常的に使用されている。
【０００２】
近年、ウシ由来のＢＳＡ中に動物ウイルス及び伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ；狂牛病の原因）の脅威が存在し得るため、多くの医薬及び生物工学産業での用途において、動物生成物の使用に対する懸念が高まっている。ＢＳＡの調製に関する最新の方法は、ウシ血漿からタンパク質を精製すること、及びこれらの混入物質の存在について検査することを包含する。しかしながら、検査は、公知のウイルス又はＴＳＥを検出することができるに過ぎず、現在発見されていない感染性病原体を対象としていない。それゆえ、動物由来の全ての感染性病原体が含まれていないことが確実なＢＳＡを大規模に供給する別の方法は現在存在していない。さらに、本発明までは、組換えＢＳＡ（ｒＢＳＡ）が、その未変性対応物と同一のタンパク質安定化特性を有するかどうかは不明であった。
【発明の開示】
【０００３】
（発明の概要）
一実施形態において、（ａ）ｒＢＳＡを直鎖ＤＮＡとともに一晩温置し、ゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；及び（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、ｒＢＳＡ調製物が提供される。ｒＢＳＡは、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）等の酵母生成系によって発現及び分泌され、本明細書では、クルイベロミセス・ラクチスが例示される。さらに、ｒＢＳＡ調製物には、さらに、リン酸塩緩衝液が含まれ得る。
【０００４】
本発明の一実施形態において、反応混合物には、上述のｒＢＳＡ、及び制限エンドヌクレアーゼ等のＤＮＡタンパク質が含まれ得る。反応混合物には、５０％グリセロールも含まれ得る。
【０００５】
本発明の一実施形態において、（ａ）組換えウシ血清アルブミン（ｒＢＳＡ）を直鎖ＤＮＡとともに一晩温置し、及びゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；並びに（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、ｒＢＳＡ調製物をＤＮＡタンパク質の調製物へ添加することを含む、ＤＮＡタンパク質を安定化するための方法が提供される。
【０００６】
本発明の一実施形態において、（ａ）動物由来のものを含まない培地中で、クルイベロミセス・ラクチス等のクルイベロミセス系においてｒＢＳＡを組換え的に発現すること；及び（ｂ）精製されたｒＢＳＡを熱処理することを含む、ＤＮＡタンパク質を安定化するためのｒＢＳＡ調製物を調製するための方法が提供される。
【０００７】
（発明の詳細な記述）
本発明の一実施形態において、ｒＢＳＡの存在下で一晩の温置した後のＤＮＡ調製物のゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性が実質的に存在せず、さらに、動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルス混入物を欠如しているｒＢＳＡの調製が提供される。ｒＢＳＡは、このような酵素を安定化するために、ＤＮＡ結合酵素への添加に適した緩衝液中で提供される。調製物中で使用するのに適した緩衝液の一例は、ｐＨ６ないし８のリン酸塩緩衝液である。本明細書に記載されるｒＢＳＡは、クルイベロミセス種等の酵母細胞中で、産業規模への拡大に適した量で作製可能である。
【０００８】
本発明の一実施形態において、クルイベロミセスは、ｒＢＳＡを発現し、これを細胞培地中へ分泌するための宿主細胞として選択される。クルイベロミセスは、ＤＮＡと共に一晩温置することによって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼを分泌しないように見受けられるので、クルイベロミセスには、他の真菌類を含む他の宿主生物体を上回る利点がある。これに対して、宿主細胞として使用される糸状真菌であるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（ＷＯ２００６／０６６５９５）は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを分泌するように見受けられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：４２５−３１（１９９５））。
【０００９】
驚くべきことに、分泌されたデオキシリボヌクレアーゼがクルイベロミセス中で見かけ上欠如しているにもかかわらず、本発明において、ＤＮＡを特異的に切断するのに使用される制限エンドヌクレアーゼ調製物にｒＢＳＡを添加した場合、ＤＮＡの非特異的分解を生じる１つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレアーゼとともに、クルイベロミセス・ラクチス由来のｒＢＳＡが共精製することが発見された（図３）。理論に拘泥するものではないが、デオキシリボヌクレアーゼ活性は、組換えＢＳＡタンパク質の本質的な特性であるか、又は宿主細胞からのｒＢＳＡの分泌の間に、ｒＢＳＡと物理的に結合され得る細胞内デオキシリボヌクレアーゼから生じるかの何れかであることが、本発明において示唆される。
【００１０】
アセチル化を使用した未変性ＢＳＡからのデオキシリボヌクレアーゼ活性の除去が報告されている（Ｔｒｕｇｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：６２０−２（１９９０））。アセチル化されたＢＳＡは、特定の好熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性のインビトロでの安定化に関して問題であり得る。このような反応において、アセチル基は、ＢＳＡから、ＤＮＡ重合を触媒する酵素の能力を除去するポリメラーゼへと転移され得る。
【００１１】
実施例２は、精製されたｒＢＳＡの熱処理を包含するｒＢＳＡからデオキシリボヌクレアーゼを除去する方法を提供する。これは、アセチル化によるタンパク質の化学的修飾を必要とせずに、デオキシリボヌクレアーゼ活性を除去する。この方法を介して生成されるｒＢＳＡは、デオキシリボヌクレアーゼによるＤＮＡ基質の分解を生じずに、制限エンドヌクレアーゼを安定化できる（実施例３）。
【００１２】
ヒト血清由来のＨＳＡなどのウシ血清由来の未変性ＢＳＡは、血中のステロイドホルモン、脂肪酸、疎水性小分子及びイオン等の無数の分子を非特異的に結合及び輸送することが長く公知である。ＨＳＡとは異なり、ＢＳＡに関する主な使用は、ＢＳＡがその通常の生物学的機能とは異なる目的に利用される分子生物学の適用に関するものである。ＢＳＡがこれらの機能をどのように発揮し、未変性のＢＳＡが、天然では通常遭遇しない酵素の活性をどのように安定化できるかについては知られていない。例えば、ウシ血清から精製されたＢＳＡは、かなり多くの細菌の制限エンドヌクレアーゼのインビトロでの活性を安定化及び増大することが可能である。未変性のＢＳＡの構造−機能の関係に関する不確実性の点において、（ａ）ウシ以外の宿主細胞において作製された精製済みのｒＢＳＡが、ウシ血清から精製されたタンパク質と同一の酵素安定化能を保持し得るかどうか；（ｂ）ウシ血清中に存在する特定の分子の機能を発揮するために、前記分子が、未変性のＢＳＡに関して相加的に又は相乗的に必要とされるかどうか；及び（ｃ）酵母によって生成され、動物由来のものを含有しない培地中で増殖されるｒＢＳＡが、ＤＮＡタンパク質を安定化するなどの分子生物学の用途において使用されうるかどうかは、予測不可能である。「ＤＮＡタンパク質」は、本発明において、ＤＮＡに作用するそれらのタンパク質又は酵素を含むよう企図される。ＤＮＡタンパク質の例には、制限エンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ及び刊行された米国の刊行された出願ＵＳ−２００６−００８８８６８−Ａ１に記載されるものなどのＤＮＡ修復酵素が含まれる。
【００１３】
ＢＳＡに関して興味のある別の特徴は、ＨＳＡとＢＳＡとの間のアミノ酸配列同一性の程度が高いことである（７６％）。それにもかかわらず、これら２つのタンパク質の機能的特性は、有意に異なるようである。例えば、未変性ＨＳＡ及び未変性ＢＳＡは、これらを固定化する色素を結合する能力に関する挙動が異なる（Ａｎｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１００−６（１９８２））。さらに、長鎖脂肪酸の存在下で、固定化された色素からのＨＳＡの解離は、３倍増大するのに対し、ＢＳＡの解離は、約１５倍増大する（Ｍｅｔｃａｌｆ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９：４６５−７２（１９８１））。これらの差異は、クルイベロミセス・ラクチスにより発現されるｒＢＳＡが、クルイベロミセス・ラクチスにより発現されるｒＨＳＡを欠失するデオキシリボヌクレアーゼ活性とともに共精製するという実施例４における知見と一致している。さらに、ＤＮＡが、熱処理されていないｒＨＳＡの存在下で安定であるのに対し、ＤＮＡは、熱処理されていないｒＢＳＡの存在下で破壊された（図２Ａ（ｉｉｉ）及びＢ（ｉｉｉ））。
【００１４】
総合して考慮すると、これらの知見は、アミノ酸配列同一性の程度が高いにもかかわらず、ｒＨＳＡとｒＢＳＡとの間に固有の測定可能な生化学的及び物理的差異があることを示している。従って、組換え発現されたＨＳＡ若しくはＢＳＡが、非特異的酵素安定剤として未変性のＨＳＡ若しくはＢＳＡのようにどの程度十分に機能し得るかを、又はたとえそうであるとしても推定することは不可能であった。実際、本発明者は、図２において、精製された熱処理済みのｒＢＳＡ及びｒＨＳＡが、ＤＮＡ基質を分解せずに、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩの活性を安定化することが可能であることを示している。
【００１５】
動物由来のものを含まない培地中でクルイベロミセス種によって発現されるｒＢＳＡは、ＤＮＡタンパク質を安定化するための改良された組成物及び方法を提供する。
２００６年４月３日に出願された米国仮出願第６０／７８８，８５０号、及び２００６年１２月２０日に出願された第６０／８７５，９１７号を含む、上述及び後述で引用される参考文献は全て、参照により組み入れられる。
【００１６】
実施例
【実施例１】
【００１７】
クルイベロミセス・ラクチスにおけるｒＢＳＡの発現及び分泌
それぞれ、次の順方向及び逆方向プライマー：５’−
【００１８】
【化１】
を用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＢＳＡをコードする遺伝子をウシ肝臓ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から増幅した。順方向及び逆方向プライマーは、操作された制限酵素部位ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ（下線部）を含有する。さらに、順方向プライマーは、二塩基性のクルイベロミセス・ラクチスＫｅｘ１プロテアーゼ切断部位ＫＲ（太字）をコードするＤＮＡ配列を組み込む。逆方向プライマーはまた、終止コドン（太字のイタリック体）を組み込み、両プライマー中のＤＮＡをコードするＢＳＡは、イタリック体で表される。ＳｉｇｎａｌＰソフトウェアを使用して、ＢＳＡシグナル配列を同定した。シグナルペプチドの改良された予測（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−７９５（２００４）及びＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６（１９９７））は、シグナルペプチダーゼによる切断が、１８番目のアミノ酸と１９番目のアミノ酸との間（Ｓｅｒ１８−Ａｒｇ１９）で生じることを予測する。従って、順方向プライマー中のＢＳＡをコードするＤＮＡ配列は、Ａｒｇ１９コドンで開始した。以下の周期条件下で、高い忠実度のＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、ＢＳＡのＤＮＡ増幅を実施した：９４℃で５分、８０℃で１分、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分を３０周期、及び最後に７２℃で１０分。クルイベロミセス・ラクチス発現ベクターｐＫＬＡＣ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位中に、ＢＳＡをコードする遺伝子をクローン化し、ＳａｃＩＩで直線化し、化学的に形質転換受容性のクルイベロミセス・ラクチスＧＧ７９９細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中に形質転換した。５ｍＭアセトアミドを含有するアガープレート上で、形質転換体を３０℃で４日間選択した。発現カセットのゲノム組込み分析のため、５ｍＭアセトアミドを含有するアガープレート上で、多くのコロニーを再度画線した。発現カセットの複数の組み込まれたコピーを含有する系の同定に特異的なプライマーを使用して、再度画線された形質転換体に関して全細胞ＰＣＲを実施した。１Ｍソルビトール中の１０ｍｇ／ｍＬリチカーゼ溶液２５μＬ中で、形質転換細胞を前処理した。１００μＬの全反応容積中で組込みプライマー２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，カタログ番号Ｓ１２７８Ｓ）及び組込みプライマー３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，カタログ番号Ｓ１２７９Ｓ）を含有するＰＣＲ反応のためのテンプレートとして、リチカーゼ処理された細胞１５μＬを使用した。ＰＣＲ反応混合物を９５℃で１０分間の後、８０℃で２分間温置し、８０℃で２分間温置する時点でＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を添加した。次に、ＰＣＲは、以下の周期条件で進行した：９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３分を３０周期、及び最後に７２℃で１０分。ＢＳＡ発現カセットの複数の組み込まれたコピーを含有するものとして同定された形質転換体をさらに、前記形質転換体がｒＢＳＡを分泌する能力に関して評価した。クルイベロミセス・ラクチスの系を、３０℃の振盪プラットフォーム恒温器で４日間、２ｍＬのＹＰＧａｌ培養物中で増殖した。消費された培地を、３×タンパク質負荷緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と混合し、４ないし２０％のトリス−グリシンポリアクリルアミド勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質を分離した。クーマシー染色後、６７ｋＤａタンパク質としてＢＳＡを同定した。
【００１９】
５Ｌの作業容積の卓上発酵槽中で、ｒＢＳＡを生成する系の発酵によって、ｒＢＳＡの生成を実施した。−８０℃で保存された貯蔵培養物を融解し、規定された発酵培地（組成については以下参照）１００ｍＬへ播種するために使用した。前培養物を３０℃で、約８の細胞密度（ＯＤ６００）まで増殖し、発酵を開始するために使用した。規定されたバッチ発酵培地は、動物由来の成分がなく、ＫＨ２ＰＯ４８．８７３ｇ／Ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４１．７２４ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）ＳＯ４１０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１ｇ／Ｌ、ＫＣｌ１ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．００５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０．０３ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ０．００８ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２０．０１ｇ／Ｌ、ＫＩ０．００１ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．００２ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３０．０００４ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．０１５ｇ／Ｌ、ビオチン０．０００８ｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテナート０．０２ｇ／Ｌ、チアミン０．０１５ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．０１６ｇ／Ｌ、ニコチン酸０．０１０ｇ／Ｌ、及びピリドキシン０．００４ｇ／Ｌから構成された。前培養ブロス６０ｍＬを使用して、バッチ培地３Ｌに播種した。発酵中のｐＨ及び温度をそれぞれ６℃及び３０℃で維持した。定常速度（５ｒｐｍ）で空気を発酵槽中に散布し、撹拌速度を変動させることによって、溶存酸素（ＤＯ）を飽和の３０％で維持した。バッチ培地中のグルコースを約１７時間で完全に消費し、その時点で、グルコース供給段階を開始した。供給培地は、動物由来の成分がなく、グルコース４４８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ１．６５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１ｇ／Ｌ、ＫＣｌ１ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．００７５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０．０４５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ０．０１２ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２０．０１５ｇ／Ｌ、ＫＩ０．００１５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．００３ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３０．０００６ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．０２２５ｇ／Ｌ、ビオチン０．００３２ｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテナート０．０８０ｇ／Ｌ、チアミン０．０６０ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．０６４ｇ／Ｌ、ニコチン酸０．０４０ｇ／Ｌ、及びピリドキシン０．０１６ｇ／Ｌから構成された。指数関数的に増大する速度でグルコース供給を導入し、約０．１２／時で増殖速度を調節した。グルコース供給約１．１Ｌを添加した。この後、ガラクトース供給段階が続いた。ガラクトース供給培地は、グルコース供給培地と同一であったが、例外は、ガラクトースが、グルコースの代わりに４４８ｇ／Ｌで存在していることであった。植物（サトウダイコン）由来のガラクトースを、牛乳由来のガラクトースに代わりに使用した。ガラクトース供給約１．１Ｌを４０ｍＬ／時の定常速度で添加した。総発酵時間は、６５時間であった。
【００２０】
クルイベロミセスの他の生成系の例には、クルイベロミセス・マルキアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）種フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）が含まれる。他の酵母生成系には、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。
【実施例２】
【００２１】
ｒＢＳＡの精製
イオン交換及び分子ふるいクロマトグラフィーによって、クルイベロミセス・ラクチスにより消費された培地から、ｒＢＳＡを精製した。特に、ｒＢＳＡをまず、ＤＥＡＥカラムに結合させ、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ及び５％グリセロール）中の５０ｍＭないし１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる溶出済みのタンパク質の分離及びクーマシー染色によるｒＢＳＡの可視化の後、ｒＢＳＡを含有する画分を同定した。ｒＢＳＡを含有する画分をプールし、ソースＱカラムを通過させた。緩衝液Ａ中の５０ｍＭないし１Ｍ ＮａＣｌ勾配中で、結合したタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる溶出済みタンパク質の分離及びクーマシー染色によるｒＢＳＡの可視化の後、ｒＢＳＡを含有する画分を同定した。ｒＢＳＡを含有する画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５分子ふるいカラムを通過させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる画分試料の分離及びクーマシー染色による可視化の後、ｒＢＳＡを含有する画分を同定した。１ｍｇ／ｍＬの作業溶液にｒＢＳＡを濃縮した。図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されるとき、精製済みｒＢＳＡが、ウシ由来のＢＳＡと同様に移動することを示す。ｒＢＳＡと共精製したヌクレアーゼ活性を不活性化するため、精製済みｒＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を８０℃で２時間熱処理した。ｒＢＳＡをその後０．２２μＭフィルターで濾過した。
【実施例３】
【００２２】
ｒＢＳＡを使用する制限エンドヌクレアーゼ機能の安定化
ｒＢＳＡが、未変性ウシ由来ＢＳＡと同一の様式で酵素安定剤として挙動し得るかどうかを決定するため、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩを使用して安定化アッセイを実施した。本アッセイにおいて、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の基質としてＨｉｎｄＩＩＩで消化されたλＤＮＡ１μｇを含有する制限消化物の２倍連続希釈にＰｖｕＩ１単位を供した。各希釈シリーズを含む反応物に、０．１μｇ／ｍＬの終濃度の精製済み未変性ＢＳＡ（図２Ａ（ｉｉ））、精製済みの熱処理されていないｒＢＳＡ（図２Ａ（ｉｉｉ））又は精製済みの熱処理されたｒＢＳＡを補充した。反応物を３７℃で一晩温置し、１％アガロースゲル上での消化済みＤＮＡの分解及び臭化エチジウム染色による可視化の後、酵素の効率性を測定した。標的ＤＮＡ基質の不完全な消化は、２３００ｂｐバンドの出現によって最も良好に観察された（図２中の矢印によって示された。）。
【００２３】
ＰｖｕＩ安定性は、ＢＳＡの非存在下で損なわれ、ＤＮＡ切断の効率性の低下に至る（図２Ａ（ｉｉ））。精製済みの熱処理されていないｒＢＳＡの添加によって、全てのレーンでＤＮＡ基質のヌクレアーゼによる分解が生じた（図２Ａ（ｉｉｉ））。精製済みの熱処理されたｒＢＳＡの存在によって、ＰｖｕＩ活性は、精製済みの未変性ＢＳＡと同一の程度まで安定化された。
【００２４】
精製済みの熱処理されていないｒＨＳＡ（図２Ｂの左から３番目のパネル）及び精製済みの熱処理されたＨＳＡ（図２Ｂの右のパネル）を使用して、消化物の同一のシリーズも実施した。熱処理されていないｒＨＳＡは、前記ｒＨＳＡと結合しているヌクレアーゼ活性を有さなかった（図２Ｂ（ｉｉｉ））が、熱処理されない限り、ＰｖｕＩ活性も安定化しなかった（図２Ｂ（ｉｖ））。
【００２５】
これらの結果は、クルイベロミセス・ラクチスにおいて生じ、消費された培地から精製された精製済みの熱処理されたｒＢＳＡが、ウシ由来のＢＳＡと関連した潜在的な危険性なく、未変性のウシ由来ＢＳＡと同程度の効率的に酵素安定剤として作用することを示している。
【実施例４】
【００２６】
ｒＢＳＡとｒＨＳＡとの比較
実施例１に記載のとおり、ｒＢＳＡを調製及び精製した。
【００２７】
ｒＨＳＡを産生するクルイベロミセス・ラクチスの系の構築は、既に記載されていた（Ｃｏｌｕｓｓｉ ＆ Ｔａｒｏｎ Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７０９２−８（２００５））。５Ｌの作業容積の卓上発酵槽において、本系の発酵を実施した。−８０℃で保存された貯蔵培養物を融解し、規定された発酵培地１００ｍＬへ播種するために使用した。前培養物を３０℃で、約８の細胞密度（ＯＤ６００）まで増殖し、発酵を開始するために使用した。前培養物にも使用される規定されたバッチ発酵培地は、ｒＢＳＡ発酵物に関して使用されるものと同一であったが、例外は、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ／Ｌが存在することであった。前培養ブロス４０ｍＬを使用して、バッチ培地２Ｌに播種した。発酵中のｐＨ及び温度をそれぞれ６℃及び３０℃で維持した。定常速度（５ｌｐｍ）で空気を発酵槽中に散布し、撹拌速度を変動させることによって、溶存酸素（ＤＯ）を飽和の３０％で維持した。バッチ培地中のグルコースを約１７時間で完全に消費し、その時点で、グルコース供給段階を開始した。供給培地は、ｒＢＳＡ発酵に使用されるものと同一であった。グルコース供給は、直線的に増大する速度で導入し、グルコース供給物約１．１Ｌを添加した。この後、ガラクトース供給段階が続いた。ガラクトース供給培地は、ｒＢＳＡ発酵に使用されるものと同一であった。ガラクトース供給物約１．１Ｌを直線的に増大する速度で添加した。総発酵時間は、６４時間であった。
【００２８】
イオン交換及び分子ふるいクロマトグラフィーによって、クルイベロミセス・ラクチスにより消費された発酵培地から、ｒＨＳＡを精製した。特に、まず、ｒＨＳＡは、２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ及び５％グリセロール中で平衡化されたＤＥＡＥ ＨｙｐｅｒＤ樹脂の５００ｍＬベッド容積を通過した。さらに緩衝液５００ｍＬでカラムを洗浄し、カラムを通じて空隙を洗浄した。４℃で１２時間固体ＰＥＧ８０００の５００ｇで覆った５０ｍｍ透析チューブを使用して、試料約２Ｌを、容積を減少させる透析に供した。次に、２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ及び５％グリセロール中で平衡化されたＢｉｏｓｅｐ ＤＥＡＥ樹脂の４４ｍＬベッド容積に、試料を負荷した。ｒＨＳＡは、樹脂に結合し、２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０及び５％グリセロール中の５０ないし７００ｍＭの範囲のＮａＣｌの線形勾配を使用して、前記ｒＨＳＡを溶出した。ｒＨＳＡの大部分は、２００ｍＭＮａＣｌでの単一画分中で溶出した。２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭＮａＣｌ及び５０％グリセロールに対して、本画分を４℃で一晩透析した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇＸＲ５０／１００樹脂の１７００ｍＬベッド容積を使用するゲル濾過へ供した。ｒＨＳＡピークは、最初に、このカラムから溶出した。図３は、４ないし２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、クーマシーによる染色によって可視化されると、精製されたｒＨＳＡが均質であったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、組換えＢＳＡの純度が、野生型タンパク質の純度と比較されるゲルを示す。ｒＢＳＡ２μｇ及び５μｇ並びに未変性ＢＳＡ（ＮＥＢ Ｂ９００１Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）２μｇを、４ないし２０％トリス−グリシンゲル上で分離し、クーマシーブルーで染色すると、ｒＢＳＡが、添加されたタンパク質全体の量と同量の量を含有する単一のバンドを形成することを示した。
【図２】図２Ａ（ｉないしｉｖ）及び２Ｂ（ｉないしｉｖ）は、各ゲルに７個のレーンがある８枚の一連のゲルを示す。レーンは、ＰｖｕＩの連続希釈を示す。ゲルの左側から、ＤＮＡに添加されたＰｖｕＩの量が、５単位、１単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位、０．０６単位、ＰｖｕＩなし及びＤＮＡマーカーである。図２Ａ（ｉ）において、アルブミンは添加されておらず、切断が、ＰｖｕＩ酵素０．２５単位を使用することで効果的に生じないように、酵素は、熱処理されたアルブミンの存在下にあるよりも不安定である。２Ａ（ｉｉ）において、熱処理された未変性ＢＳＡを添加すると、ＰｖｕＩ酵素０．０６単位を使用して切断される。２Ａ（ｉｉｉ）において、熱処理されていないｒＢＳＡの結果、ＤＮＡの非特異的ヌクレアーゼ切断が生じる。２Ａ（ｉｖ）において、熱処理されたｒＢＳＡの結果、ＰｖｕＩ０．０６単位による切断が生じる。図２Ｂ（ｉ）及び（ｉｉ）は、２Ａ（ｉ）及び２Ａ（ｉｉ）と同一である。２Ｂ（ｉｉｉ）は、ＰｖｕＩへ添加された熱処理されていない組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）であり、ヌクレアーゼ活性は生じないようであるが、ＰｖｕＩは、２Ａ（ｉ）及び２Ｂ（ｉ）に関して観察される安定性を同様に欠如していることを示す。熱処理されたｒＨＳＡは、ＰｖｕＩの安定性を保護する。
【図３】図３は、ｒＨＳＡの純度が評価されているゲルを示す。ｒＨＳＡを含有する消費された発酵ブロス５μＬ、ｒＨＳＡ２μｇ及び未変性ＢＳＡ（ＮＥＢ Ｂ９００１Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）２μｇを、４ないし２０％トリス−グリシンゲル上で分離し、クーマシーブルーで染色すると、ｒＨＳＡが、添加されたタンパク質全体の量と同量の量を含有する単一のバンドを形成することを示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）組換えウシ血清アルブミン（ｒＢＳＡ）を直鎖ＤＮＡとともに一晩温置することによって及びゲル電気泳動によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；及び（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、ｒＢＳＡ調製物。
【請求項２】
調製物がリン酸塩緩衝液を含む、請求項１に記載のｒＢＳＡ調製物。
【請求項３】
ｒＢＳＡがＫ．ｌａｃｔｉｓによって発現される、請求項１に記載のｒＢＳＡ調製物。
【請求項４】
請求項１に記載のｒＢＳＡ及び制限エンドヌクレアーゼを含む、反応混合物。
【請求項５】
５０％グリセロールをさらに含む、請求項４に記載の反応混合物。
【請求項６】
（ａ）組換えウシ血清アルブミン（ｒＢＳＡ）を直鎖ＤＮＡとともに一晩温置することによって及びゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；並びに（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、ｒＢＳＡ調製物をＤＮＡタンパク質の調製物へ添加すること、
を含む、ＤＮＡタンパク質を安定化するための方法。
【請求項７】
（ａ）動物を含まない培地中でＫ．ｌａｃｔｉｓにおいてｒＢＳＡを組換え的に発現すること；及び
（ｂ）精製されたｒＢＳＡを熱処理すること
を含む、ＤＮＡタンパク質を安定化するためのｒＢＳＡ調製物を調製するための方法。
【請求項１】
（ａ）組換えウシ血清アルブミン（ｒＢＳＡ）を直鎖ＤＮＡとともに一晩温置することによって及びゲル電気泳動によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；及び（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、ｒＢＳＡ調製物。
【請求項２】
調製物がリン酸塩緩衝液を含む、請求項１に記載のｒＢＳＡ調製物。
【請求項３】
ｒＢＳＡがＫ．ｌａｃｔｉｓによって発現される、請求項１に記載のｒＢＳＡ調製物。
【請求項４】
請求項１に記載のｒＢＳＡ及び制限エンドヌクレアーゼを含む、反応混合物。
【請求項５】
５０％グリセロールをさらに含む、請求項４に記載の反応混合物。
【請求項６】
（ａ）組換えウシ血清アルブミン（ｒＢＳＡ）を直鎖ＤＮＡとともに一晩温置することによって及びゲル電気泳動法によって測定された場合に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し；（ｂ）動物由来の細胞増殖補助剤と結合した動物ウイルスを欠如し；並びに（ｃ）ＤＮＡタンパク質を安定化できる、ｒＢＳＡ調製物をＤＮＡタンパク質の調製物へ添加すること、
を含む、ＤＮＡタンパク質を安定化するための方法。
【請求項７】
（ａ）動物を含まない培地中でＫ．ｌａｃｔｉｓにおいてｒＢＳＡを組換え的に発現すること；及び
（ｂ）精製されたｒＢＳＡを熱処理すること
を含む、ＤＮＡタンパク質を安定化するためのｒＢＳＡ調製物を調製するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５３２０６１（Ｐ２００９−５３２０６１Ａ）
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０４２１７（Ｐ２００９−５０４２１７）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００７９２１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２３６８９
【国際公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（５９１０２１９７０）ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００７９２１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２３６８９
【国際公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（５９１０２１９７０）ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド (18)
【Ｆターム（参考）】
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