組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチド
【課題】糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ、該ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られた組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを提供する。
【解決手段】ヒトプラスミノーゲンの１−４６０番目のアミノ酸をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、高い効率で組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを生産する細胞を、選択薬剤メトトレキセートの濃度を段階的に増加させる適応法を用いて選抜した。選抜した細胞を用い、天然型ＢＬアンジオスタチンに匹敵する生物活性を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを生産した。
【解決手段】ヒトプラスミノーゲンの１−４６０番目のアミノ酸をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、高い効率で組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを生産する細胞を、選択薬剤メトトレキセートの濃度を段階的に増加させる適応法を用いて選抜した。選抜した細胞を用い、天然型ＢＬアンジオスタチンに匹敵する生物活性を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを生産した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−結合型糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチド、Ｏ−結合型糖鎖およびＮ−結合型糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチド、該ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られた組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは既存の血管から新しい血管が形成される過程であり、血小板や血管内皮細胞から放出される成長因子等の促進物質と種々の阻害因子により調節される（Ｂｒｏｗｄｅｒ，Ｔ．，Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．＆Ｐｉｒｉｅ−Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｓ．（２０００）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１５２１−４）。脊椎動物における血管新生は非常に厳密に制御されており、分化・成長過程および成熟個体における妊娠、創傷治癒のような限られた場合にしか生じない。例外的に、慢性炎症や糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎、固形腫瘍といった病的な素因がある場合に血管新生が亢進していることが知られており、これらの病態進行と血管新生は深く関与している（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．（２００３）．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，６５３−６０）。
【０００３】
固形腫瘍は、一定の大きさまでは既存の血管から得られる栄養素だけで成長できるが、それ以上に成長するためには新生血管を構築し、そこから増殖に必要な酸素や栄養素を獲得する必要がある。つまり、腫瘍の成長は血管新生に依存的であると言え、この過程を効果的に阻害することにより、腫瘍の成長、転移を阻害できる可能性が示されている。さらに、血管新生阻害剤の標的となるのは、がん細胞自身ではなく血管内皮細胞であり、薬剤耐性や副作用が生じにくいといった長所があり、新規の抗がん剤として期待されている。近年、血管内非細胞増殖因子のひとつであるＶＥＧＦを阻害する抗体医薬アバスチンが承認されている。
【０００４】
アンジオスタチンは、血漿中の線溶因子プラスミノーゲンが部分分解して生じる内因性の血管新生阻害因子である（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｃｅｌｌ ７９，３１５−２８）。生理的条件下におけるアンジオスタチンの産生は、腫瘍の存在によって活性の亢進した各種のプロテアーゼによって分解を受けて生じる。典型的なアンジオスタチン分子はプラスミンの最初の４つのクリングルドメイン（Ｋ１−４）からなるが、その派生物であるＫ１−３、Ｋ１−４１／２やＡ６１などについても、血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成の阻害、さらにｉｎ ｖｉｖｏにおいて、これらのアンジオスタチン分子が原発巣および転移巣の成長を抑制することも判明している。（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｃｅｌｌ ７９，３１５−２８，７．Ｃａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２９４６１−７）
【０００５】
アンジオスタチンの製造法としては、（１）エラスターゼによるプラスミノーゲンの加水分解（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２，６８９−６９２（１９９６））及び（２）遺伝子組換え技術を用いた大腸菌や酵母による生産（Ｂ．Ｋ．Ｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７，１３２９−１３３４（１９９７））の２種類が知られていた。しかし、（１）では、エラスターゼの基質特異性の低さのため、副生成物が多く生じ、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを選択的に生成させることが困難であることから、アンジオスタチンの活性の再現性が低いという欠点があった。また、（２）では、天然型に匹敵する活性が得られていない。これは異種生物での発現の過程で、タンパク質フォールディングの差に基づく立体構造の変化や、特に糖鎖修飾の差などが原因と考えられる。（Ｃａｏ，Ｙ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３３，３５７−６９（２００１）、Ｄｅｌｌ’Ｅｖａ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ９，３−１０（２００２））。事実、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗらは、アンジオスタチンの糖鎖末端のシアル酸の除去により、アンジオスタチンの活性が大きく低下することを報告している（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，３０３，２２−３１，（２００５））。
【０００６】
ＢＬアンジオスタチン（ＢＬＡＳ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株が産生するプロテアーゼであるバシロライシンＭＡを用いて、ヒトプラスミノーゲンを特異的に切断したアンジオスタチン様断片である（特開２００２−２７２４５３号公報）。ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列は公知であり、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴに受入番号Ｐ００７４７として登録されている。なお、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列は、シグナルペプチド（Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９）を含む。ＢＬアンジオスタチンは、ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ（ヒトプラスミノーゲンのＧｌｕ２０−Ｓｅｒ４６０からなるポリペプチド）を主成分として構成される組成物である。ＢＬアンジオスタチンは、親水性アミノ酸に富むＮ末端領域、およびプラスミノーゲンに由来する天然型糖鎖を有し、水に対する溶解性も非常に高い。これまでの組み換え型アンジオスタチン分子と比較して、より低濃度から抗腫瘍活性、内皮細胞の管腔形成阻害といった作用が見出され、優れたアンジオスタチン分子であることが示された。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ、該ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られた組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡに関する。
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、従来の技術では、十分な生物活性を有するアンジオスタチンを生産することを達成できていない。また、ＢＬアンジオスタチンは上記のように優れた生物活性を有するが、活性に必須の糖鎖を有する遺伝子組換え体の生産には至っていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ（ｒＢＬＡＳ）の生産方法および、がんに対する効果について鋭意研究を行なった結果、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下ＣＨＯ−Ｋ１）を用いた系によって、２種類の糖鎖を有する組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの発現および生産に成功した。さらに、得られた組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡには、天然型アンジオスタチンと同等の極めて優れた血管新生阻害効果を有することを発見して、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、糖鎖を有することにより高い活性を示す、組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】 細胞株樹立の際に用いたヒトプラスミノーゲンのｃＤＮＡシークエンスを示す。
【図２】 天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの各分子に対する糖鎖付加を確認した。
【図３】 Ｎ型糖鎖を特異的に脱離するＰＮＧａｓｅを用い、天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを処理したところ、Ｎ型糖鎖がついている高分子量のバンドが消失し、低分子量のバンドに集約した
【図４】 組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのＮ型糖鎖中性糖のＴＯＦ−ＭＳデータを示す。中性糖３ピーク（ｍ／ｚ １４４２．３、１５５６．９、１８６６，９）が観測された。
【図５】 組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのＮ型糖鎖酸性糖のＴＯＦ−ＭＳデータを示す。酸性糖２ピーク（ｍ／ｚ ２１５６．１、２４４７．５）が観測された。
【図６】 組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのＯ型糖鎖中性糖のＴＯＦ−ＭＳデータを示す。中性糖４ピーク（ｍ／ｚ ７５３．２、９０２．７、９９９．７、１０６４．０）が観測された
【図７】 組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのＯ型糖鎖酸性糖のＴＯＦ−ＭＳデータを示す。酸性糖２ピーク（ｍ／ｚ ７３１．７、７８８．７）が観測された。
【図８】 天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの血管新生抑制試験の結果を示す。天然型、組換え型とも濃度依存的に申請血管数が減少し、３．５ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ有意な抑制作用が得られた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを製造するには、当該タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを作製し、これを好適な発現系に導入することにより目的タンパク質を製造することができる。
【００１３】
本発明の組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの塩基配列を有するＤＮＡは、ヒト由来（例えば、ＨｅｐＧ２細胞由来など）のｃＤＮＡライブラリーを、ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列の情報に基づいて設計した好適なプライマー又はプローブを用いてスクリーニングすることにより入手できる。スクリーニングはプラークハイブリダイゼーション等で行うことができる。あるいは、ヒト由来（例えば、ＨｅｐＧ２細胞由来など）のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、上記塩基配列の情報に基づいて設計した好適なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子を直接クローニングすることもできる。
組み換えタンパク質を発現させるための発現系（遺伝子を含む発現ベクターとその宿主）は当業者に公知である。ＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、該ＤＮＡを発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いでこの組み換え発現ベクターを、当該発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００１４】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
動物細胞用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、アデノウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、ＣＨＯ−Ｋ１などの動物細胞、Ｓｆ２１細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。
【００１５】
組換えベクターの宿主への導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法などが挙げられ、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
形質転換体の培養物から、目的の組み換えタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。例えば、組み換えタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、イオン交換グロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法を単独、又は組み合わせて用い、精製することができる。
【００１７】
本発明の制がん剤は、一般的には、有効成分としての組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡと賦形剤などの製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で提供される。
本発明の制がん剤は、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。
本発明の薬剤の投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡは、先行技術の組換え型アンジオスタチン分子とは異なり、水に対する溶解度が高いことから、本発明の制がん剤は、静脈内投与によって投与することができるという特徴を有する。
本発明の制がん剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。本発明の薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択することができる。
【００１８】
本発明の薬剤の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
本発明の制がん剤は、乳がん、肺がん、咽頭がん、胃がん、膵がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん、等の治療に用いることができる。
【実施例】
【００１９】
細胞株の樹立
ＨｅｐＧ２細胞からＴｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をもちいてトータルＲＮＡを抽出した。その一部３９５．２μｇ／ｍｌ（９０μｌ）を鋳型に逆転写反応を行い、以下のＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒを用いてプラスミノーゲンの部分配列をコードするｃＤＮＡを得た。各反応は、ＴａＫａＲａＢＩＯ社ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｓｙｓｔｅｍ及びＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
用いたｐｒｉｍｅｒの配列を以下に示す。なお、ヒトプラスミノーゲンの配列は公知であり（図１）、ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを発現するためのｃＤＮＡはプラスミノーゲンの１〜４６０番目のアミノ酸配列をコードする。（図１）
ＲＴ−ＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒ：
５‘−ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＣＣＣＴＣ−３’
ＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒ：
Ｆｏｒｗａｒｄ（３６ｍｅｒ）：
５’−ＴＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＣ−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ（３７ｍｅｒ）：
５’−ＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＧＣ−３’
得られたｃＤＮＡ断片の末端を平滑処理後、ｐＣＡＧＧＳ１．ｄｈｆｒ．ｎｅｏベクター（財団法人化学及び血清療法研究所）のＳａｌＩサイトにクローニングし、ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを発現するためのプラスミノーゲン部分配列のプラスミド構築物ＳＹＮ１３００−１を得た。
それぞれの挿入部位及び近傍の塩基配列解析を行った（図１）。その結果、挿入部位について４箇所のｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎが認められた（３４４Ｔ→Ｃ、７８５Ｃ→Ｔ、８８７Ｇ→Ｔ、１０９７Ｇ→Ａ）。これらはｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎであり、コードするアミノ酸の変化を伴うものではなかったため、得られた配列を用いて次の作業を進めた。
【００２０】
発現プラスミドＤＮＡベクターの調製
目的遺伝子発現プラスミドクローンＳＹＮ１３００−１について、トランスフェクション用プラスミドＤＮＡの大量調製をおこなった。４０ｍＬの大腸菌培養液より、ＥｎｄｏＦｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ ｃａｔ．Ｎｏ．１２３６２）を用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。
【００２１】
ヒトプラスミノーゲン部分タンパク質安定発現株の樹立
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−９０９６）にプラスミドクローンＳＹＮ１３００−１を導入し、ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを安定発現する細胞株の樹立を試みた。６ウエルプレートに３ｘ１０５個／ウエルでＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を播種し、２４時間培養した後、トランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯ（Ｍｉｒｕｓ ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＩＲ２１７４）を用いて目的遺伝子発現プラスミドＤＮＡ（２μｇ）を細胞に導入した。導入方法はＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯのｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｎｕａｌに従った。
ＤＮＡトランスフェクションから４８時間培養の後、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地（培地：ＳＩＧＭＡ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ３３９０，ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ６７７０）で細胞懸濁液を作製し、１００分の１、２００分の１、４００分の１及び、８００分の１量の細胞を新しい６ｃｍディッシュに播種し、欠損培地による選択を開始した。３〜４日毎に新鮮なＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地に交換しながら、７日間培養した後、０．０３μＭ ＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）添加／ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地に交換し、更に４日間選択培養をした。選択開始から１１日後に、欠損培地耐性となり増殖してきた細胞コロニーをクローニングカップにより、４２個ピックアップし、４８ウエルプレートに継代した。増殖した３４クローンについて、１０分の１量の細胞を６ウエルプレートに播種し、ＭＴＸ濃度を０．３μＭに上げたＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地を用いて遺伝子増幅培養を試みた。７〜１０日間の培養の後、増殖した３２クローンについて、３０分の１量の細胞を６ウエルプレートに播種し、ＭＴＸ濃度を１．０μＭに上げたＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地を用いて再度遺伝子増幅培養を試みた。７〜１３日間の培養の後、１．０μＭＭＴＸで増殖した３２クローンのうち、増殖の遅い２クローンを除いた３０クローンについて、６ｃｍディッシュに拡大培養した。これらの培養上清に含まれる組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ量をウエスタンブロットによって定量し、この３０クローンのうち、生産性の良かったクローン、２２，２３，２４，２５，２６を組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ生産基本株とした。
【００２２】
高生産株の取得
上記安定発現ＣＨＯ細胞のクローン、２２，２３，２４，２５，２６を、６０ｍｍディッシュで１μＭ ＭＴＸおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ４ｍｌ中３７℃，５％ ＣＯ２下で培養した。９０ｍｍディッシュ（１０ｍｌ培地）に拡大した後、６穴プレートに播き（およそ２０，０００／ｃｍ２）１μＭ ＭＴＸ／１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で１日培養後、１ｍｌのＤＭＥＭに換え４８時間後の培養液を回収し、１６，０００ｘｇ，１０分間遠心した上清に存在する組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡをＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで検出した。定量の結果、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの発現量はクローン間で大きな差はなく、５クローンのうち生育の遅いＮＯ．２５についてＭＴＸによる選択を行った。
【００２３】
クローンＮｏ．２５を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中３７℃，５％ＣＯ２下において、３μＭ ＭＴＸ（７日間、培地交換１回）、３０μＭ ＭＴＸ（８日間、培地交換２回）、１００μＭ ＭＴＸ（３７日間、培地交換７回・継代３回）条件でそれぞれ培養した。これらのうち１００μＭ ＭＴＸ中で生存した細胞は発現量が約３倍に上昇し（１０ｍｇ／Ｌ培地）、本細胞集団をＭ１００とした。
さらにＭ１００細胞について、限界希釈法によるクローニングを実施し、９６穴プレート（Ｃｏｓｔｅｒ ３５９５）中で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中条件、２２日間培養後１００μｌのＤＭＥＭに換え、４８時間培養後、生育の良かったクローン１２個について５０μｌの培地を回収し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ量を定量した。得られた１２個のクローンの発現量はいずれもＭ１００細胞集団と同等かそれ以下であり、発現量が同等であった２つのクローンをそれぞれＭ１００−１，Ｍ１００−２とし、これを組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ高生産株とした。
【００２４】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ産生細胞の無血清培地馴化および浮遊化検討
上記で得られた選択株Ｍ１００，Ｍ１００−１，Ｍ１００−２ 計３クローンについて無血清培地への馴化検討および浮遊化検討を行った。
無血清馴化には、市販のＡｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ 培地である３種類の培地を選択し使用した。具体的にはＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地（Ｉｒｖｉｎｅ、９１９７）、ＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ＋ＳＯＹ（Ｉｒｖｉｎｅ、特注品ｌｏｔ：ＩＳＪ００５−０４３）、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ（ＳＡＦＣ、１４３６０Ｃ−１０００Ｍ）である。これらの培地１Ｌに対して、２００ｍＭグルタミン酸を４０ｍｌまたは８０ｍｌ（ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地のみ）添加したものを無血清馴化培地とした。これら無血清馴化培地３種類を用いて、上記で得られた細胞３種（Ｍ１００，Ｍ１００−１，Ｍ１００−２）を用いての馴化培養を行った。馴化培養は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で凍結細胞を蘇生後、１μＭ ＭＴＸ含有の１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養された細胞を用いて行った。１０％ＦＢＳ含有培地から順次、ＦＢＳ濃度を１０％→５％→１％→０．５％→０％（無血清）と低下させ、各ＦＢＳ濃度で一定期間培養を行いながら培養を継続した。５％、１％、０．５％ＦＢＳ濃度の培地は、１μＭ ＭＴＸ含有の１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と１μＭ ＭＴＸを含有した各無血清培地を濃度比率で混和させて使用した。細胞の播種密度は、本報告書で特筆しない場合、基本を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、細胞状態によっては、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上を播種して培養を行った。
検討の結果、Ｍ１００−１細胞は他の２種と比較して、無血清培地馴化による増殖率および生産性が劣る結果が得られた。またＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ＋ＳＯＹ培地は、いずれの細胞においても増殖性は優れるものの、生産性が低いという結果が得られた。
【００２５】
細胞の浮遊化検討は、３種の細胞ともほぼ同様の推移を示し、１％ＦＢＳ濃度の培地から、浮遊細胞と接着細胞（明らかな接着様態）の混在状態となり、ＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ＋ＳＯＹ培地では、１％ＦＢＳ含有培地から、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地では、０．５％ＦＢＳ含有培地から、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地では、０％ＦＢＳ培地への移行時から浮遊細胞化が認められた。ただし、Ｍ１００−１細胞は、０％ＦＢＳのＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地においても、細胞播種後、接着細胞様態を示し、培養を継続することにより接着細胞が剥離し、浮遊化（分散細胞群と凝集魂が混在）する傾向が見られた。全般的に細胞の浮遊化の傾向に関しては、Ｍ１００−２≧Ｍ１００＞Ｍ１００−１の順で浮遊化がし易いことが観察された。
【００２６】
これらの結果により、大量生産培養の検討に用いる細胞株としてＭ１００およびＭ１００−２、無血清馴化培地としてはＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地を選択した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ生産のための基本培地の検討
前項で得た無血清培地馴化済みのＭ１００およびＭ１００−２細胞を、それぞれＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて（Ｉｒｖｉｎｅ社製培地を基本培地として使用する場合はＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地、ＳＡＦＣ社製培地を基本培地として使用する場合はＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地を蘇生・継代培養に用いた。培地組成は、前述・無血清培地馴化と同）蘇生・継代培養を行うことによって、基礎培地検討に要する細胞数へ拡大培養を行った。その後、無血清馴化培地と候補基本培地を等量混和した培地で、１継代行った。その後、候補基本培地で培養を２継代以上行った。増殖性が適切であると判断した候補基本培地を選択し、基本培地選択のための培養を行った。培養開始後、３、５、７、１０日目の生細胞数、細胞生存率を測定、さらに組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ産生量を、５、７、１０日目の培養上清を用いて測定した。生細胞数が播種時に対し２〜５日培養後、２倍以上達しない場合、または細胞浮遊状態を維持できない場合は、培養を中止した。
候補基本培地としては、Ｉｒｖｉｎｅ社製培地としてＩＳ ＣＨＯ Ｖ培地（９１９７）、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ１培地（特注ＩＳＪ００５−１４６Ａ）、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ２培地（特注ＩＳＪ００５−１４６Ｂ）ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｘ１培地（特注ＩＳＪ００５−１４７Ａ）、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｘ２培地（特注ＩＳＪ００５−１４７Ｂ）、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ１培地（特注ＩＳＪ００５−１４７Ｃ）、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地（特注ＩＳＪ００５−１４７Ｄ）の７種類、ＳＡＦＣ社製培地として、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地（１４３６０Ｃ−１０００Ｍ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地（Ｃ５４６７）、ｉｍＭＥＤＩＡｔｅ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ６５９０４培地（特注６５９０４−１０００Ｍ）、ｉｍＭＥＤＩＡｔｅ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ６５８９８培地（特注６５８９８−１０００Ｍ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ−３培地（Ｃ１４９０−１Ｌ）の５種類、計１２種類の培地を使用した。各基本培地は、Ｌ−グルタミン（終濃度４ｍＭ、ＩＳ ＣＨＯ Ｖ培地のみ終濃度８ｍＭ）、メソトレキセート（終濃度１μＭ）をそれぞれ添加したものを用いた。なお、これら１２種のうち、各培地への馴化培養を進める段階の振とう培養過程で、ＳＡＦＣ系培地のＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ、ｉｍＭＥＤＩＡｔｅ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ６５９０４、ｉｍＭＥＤＩＡｔｅ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ６５８９８培地の増殖性が低下した。ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地は増殖が止まったので、増殖性培養試験は行わなかった。
【００２９】
培養はいずれも、細胞培養液をよく攪拌、懸濁した後、培地で１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、新しい培養フラスコ（Ｔ２５、Ｔ７５、Ｔ２２５、エレンマイヤーフラスコ（Ｅ１２５、Ｅ２５０）など）に加え、５％ＣＯ２インキュベーター（以下ＣＯ２インキュベーター）に入れ培養を継続した。Ｔフラスコによる培養は、ＣＯ２インキュベーターに入れ、静置培養、エレンマイヤーフラスコ（Ｅ２５０）による培養は、空気にＣＯ２が５ ｖｏｌ％の割合で含まれる混合ガス（流量１Ｌ／ｍｉｎ）を４５秒間エレンマイヤーフラスコ内に通気し、キャップを密閉後、３６．５±０．５℃、８０ｒｐｍの旋回振とう速度条件下で培養を行った。細胞密度を上げる必要のある場合、培地全量交換する必要のある場合は、１，０００ｒｐｍ（１８０Ｇ）の条件で５分間遠心分離後、上清を除去したのち、培地を加え０．５〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製して継代培養を進めた。
増殖性培養試験を行った結果、Ｍ１００細胞、Ｍ１００−２細胞ともに、ＳＡＦＣ社ＥＸ−ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地の増殖性がもっとも良く生細胞密度も高かったが、ＳＡＦＣ社の培地は、ＡＤ４、ＡＤ８培地を除き、ほぼ同等の増殖性を示した。組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ濃度測定の結果、各培地において、Ｍ１００細胞の方が、Ｍ１００−２細胞より組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの蓄積量が高い傾向が見られた。培養１０日目の組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ蓄積量において、Ｍ１００細胞では、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地、Ｍ１００−２細胞では、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地が、それぞれ約４５ｍｇ／Ｌであり、高い組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ蓄積量を示した。また、生細胞密度あたりの生産量としては、培養十日目においていずれの細胞もＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地＞ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ１培地＞ＥＸ−ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地の順であった。（表２〜５）
【００３０】
以上の結果から、Ｍ１００−２細胞、無血清培地としてＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地（Ｉｒｖｉｎｅ、９１９７）、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地（Ｉｒｖｉｎｅ、特注 ＩＳＪ００３−０６１）が組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの生産に適していると判断した。
【００３１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００３２】
大量培養検討
前項で確立した条件を用い、スピナーフラスコを用いた攪拌培養確認、および流加培養検討を行った。
上記と同様に調整した培地を用い、無血清培地（ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地）を用いて蘇生培養を行い、同培地で１継代培養を行った後、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地とＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地を等量混和した培地で、１継代行った。その後、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地による培養を３継代行うことにより、拡大培養を行い、攪拌培養に使用する細胞を取得した。
５Ｌの培養槽を高圧蒸気滅菌し、放熱後４０００ｍＬのＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地を加え、ＣＯ２が５ ｖｏｌ％の割合で含まれる混合ガス（流量２００ｍＬ／ｍｉｎ）を通気しながら、温度３６．７℃、攪拌数７２ｒｐｍ（先端速度０．４５ｍ／ｓ）、溶存酸素濃度（ＤＯ）４０％設定し、約２０時間運転放置した（前培養）。放置後、ｐＨおよび溶存酸素濃度を調整した。細胞播種前の培養状態は、攪拌数７２ｒｐｍ（先端速度０．４５ｍ／ｓ）、温度３６．６℃、ｐＨ７．１８、ＤＯ １００．４％だった。
前培養後、培養槽に播種細胞密度が、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、細胞培養液を加えたのち、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地を加え、培養液量を５，０００ｍＬとした。培養条件は、５Ｌ培養槽の各設定値を、温度３６．７℃、上面通気量２００ｍＬ／ｍｉｎ、ｐＨ７．２、ＤＯ ４０％、攪拌数７２ｒｐｍとし、培養を開始した。培養開始後、ｐＨが下がった場合は、炭酸ナトリウム溶液を注入し、ｐＨを補正、培養を継続した。
培養３日目から５，７，１０，１２日目に生細胞数および生存率を測定し、１２日目において生存率が５０％を下回ったため、培養を終了した。
培養終了後、細胞ろ過フィルター（ザルトブランＰ３００）による除細胞ろ過をおこない、４，６５０ｍＬの培養上清を回収した。
組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ濃度は、培養５日目より７、１０、１２日目に測定し、培養５日目は、７ｍｇ／Ｌ、７日目は、１４．７ｍｇ／Ｌ、１０日目は、２３．６ｍｇ／Ｌ、１２日目は、３０．１ｍｇ／Ｌだった。なお、フィルターへの吸着は確認されなかった。
【００３３】
流加培養検討は、基本培地をＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地（Ｉｒｖｉｎｅ、特注 ＩＳＪ００３−０６１、ＩＳＪ００３−０６４）、流加培地として基本培地メーカー推奨の培地６種、ＩＳ ＣＨＯ ＦＥＥＤ−ＣＤ（Ｉｒｖｉｎｅ、９１１０８）、ＣＨＯ ＦＥＥＤ ＭＥＤＩＵＭ（Ｉｒｖｉｖｅ、特注ＩＳＪ００３−０６０）、Ｓｏｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ＵＦ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０×（ＳＡＦＣ、５８９０３Ｃ）、Ｙｅａｓｔ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ＵＦ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０×（ＳＡＦＣ、５８９０２Ｃ）、Ｙｅａｓｔ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ＵＦ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０×（Ｉｒｖｉｎｅ、ＩＳＪ００５−０８２）、Ｗｈｅａｔ Ｈｙｄｏｒｏｌｙｓａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＩＳＪ００３−０７１）を用いた。
【００３４】
【表６】
【００３５】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの精製
リジンセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケア）を充填したカラムを０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化し、そこにカラムの７０培量の細胞培養液の遠心上清をアプライした。カラムの２０倍量の０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄した後、０．２ＭのＥＡＣＡ（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含む０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出した。回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル）によって分離し、５０−５４ｋＤａの組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ分子を含む画分をまとめ、硫酸アンモニウムを添加して、たんぱく質を沈殿させた。得られた沈殿物４．８ｍｇを２ｍｌの３０％飽和硫安を含む０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．０）に溶解し、これを３０％飽和硫安を含む０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＳＯＵＲＣＥ １５ＰＨＥ４．６／１００ＰＥ（ｐｈｅｎｙｌ）（ＧＥヘルスケア）にアプライした。カラムの２０倍量のボリュームで０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．０）へグラジエント溶出を行い、その後カラム２倍量の０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．０）で溶出し、２ｍｌずつ溶出画分を集めた。溶出画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、高純度組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ標品を得た。
【００３６】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの糖鎖付加確認および糖鎖分析
上記疎水カラムクロマト処理後の高純度標品、およびヒト血漿より得られた天然型ＢＬアンジオスタチンをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ニトロセルロース膜にブロッティングした。ブロッティング後のメンブレンを糖タンパク検出キット（ＧＥ社 ＥＣＬ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いてビオチン標識し、これをＨＲＰ標識のストレプトアビジンを用いて検出することにより、糖鎖修飾の有無を確認した。その結果、天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを構成する、分子量の異なる２つの分子は、いずれも糖鎖を有していることが明らかとなった。（図２）
【００３７】
天然型プラスミノーゲンは、Ｎ型、Ｏ型糖鎖が１つずつ付加したＩ型プラスミノーゲンと、Ｏ型糖鎖が１つ付加したＩＩ型プラスミノーゲンが存在する。天然型アンジオスタチンは、プラスミノーゲンの部分分解産物であるため、これらの糖鎖を有している。組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡに付加された糖鎖を確認するため、Ｎ型糖鎖を特異的に分解するＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ Ｓ０４０７Ｓ）で反応させることにより、アンジオスタチン分子に付加していると予測されるＮ型糖鎖の脱離を試みた。
１μｇの天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組み換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを５００ユニットのＰＮＧａｓｅＦと１％のＮＰ−４０、４０ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ中、３７℃で１時間インキュベーションし、その後、電気泳動で評価した。その結果、組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡをＰＮＧａｓｅＦで処理すると、天然型と同様に、２本のバンドのうち分子量の多い上のバンドが消失し、下のバンドのみが検出された。これらの結果により、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを構成する２つの分子のうち、高分子量のタンパク断片については、Ｎ型糖鎖を有し、下のバンドに相当する分子はＮ型糖鎖が付加して異なことが示唆された。（図３）
【００３８】
さらに、分子に付加した糖鎖を構成する糖の推定を行うため、糖鎖分析を試みた。上記疎水カラムクロマト処理後の高純度標品を、精製水に対して４℃下、一晩透析を行い、回収したサンプルを凍結乾燥して試料を粉末状にした。得られた試料に無水ヒドラジンを加え、１００℃で１０時間反応させた後、トルエンの共沸留去によってヒドラジンを除去した。Ｎ−アセチル化試薬を加え、氷上で３０分間反応させ、そこに陽イオン交換樹脂を加え、ミニカラムでろ液を回収、乾固させた。
分離した糖鎖をカップリング試薬（２−アミニピリジンを酢酸で溶解）に溶解し、９０℃１時間反応させた後、還元剤（ジメチルアミンボランを酢酸と精製水に溶解）を加え８０℃、３５分間反応させることにより糖鎖のピリジルアミノ化（ＰＡ化）を行った。反応後に、溶液をセルロースカラムに通し、ＰＡ化糖鎖と余剰の２−アミノピリジンを分離した。得られたＰＡ化糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにかけ、分子量を測定した。マトリックスは２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄを用い、中性糖についてはｌｉｎｅａｒモード、酸性糖についてはｌｉｎｅａｒ ｎｅｇａｔｉｖｅモードで測定した。
得られたマススペクトルから、Ｎ型およびＯ型糖鎖を構成する構成糖を推定した。Ｎ型糖鎖は中性糖３ピークと酸性糖２ピーク、Ｏ型糖鎖では中性糖４ピークと酸性糖２ピークが検出された。（図４〜７、表７）検出されたピークについてＥｘＰＡＳｙ−ＧｌｙｃｏＭｏｄ ｔｏｏｌで分子量から構成糖を推定した。
【００３９】
【表７】
【００４０】
糖含量およびシアル酸定量
糖定量は、ガラクトースを標品として用い、フェノール硫酸法にて行った。標品および組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ０．５ｍｌに５％フェノール溶液を０．５ｍｌ加えた後、濃硫酸２．５ｍｌを勢い良く加え、混合、室温で１０分反応させた。反応後、４９０ｎｍの吸光度を測定することで、検量線より糖の定量を行った。その結果、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの糖含量は、タンパク質１μｇあたり、３４．３５ｎｇであった。
シアル酸定量は、シアル酸を標品として用い、レゾルシノール法にて実施した。レゾルシノール０．２ｇを２０ｍｌのミリＱ水に溶かし、濃硫酸８０ｍｌと０．１Ｍ ＣｕＳＯ４ ０．２５ｍｌを加える。標品および組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡサンプル０．５ｍｌに前述で調整したレゾルシノール試薬０．５ｍｌを加え、１００℃で１５分間反応させた後、流水で冷やし、メチルセロソルブを２ｍｌ加えて混合し、５８０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡは、タンパク質１μｇあたりシアル酸２１．３２ｎｇであった。
【００４１】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの血管新生阻害作用
組み換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの血管新生阻害作用を、アフィニティートラップリアクターで製造・精製した天然型ＢＬアンジオスタチン組成物（調製法はＷＯ２００４／０６５５９５）と比較した。
天然型ＢＬアンジオスタチンポリペプチド組成物は、アフィニティートラップリアクターを用い、ヒト血漿から調製した。組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡは、上記の高生産株Ｍ１００細胞を用いて生産し、リジンセファロース４Ｂによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。両サンプルは生理食塩水に溶解して、フィルター滅菌した（ポアサイズ０．２μｍ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）。
マウスはＣｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）を用いた。Ｓａｒｃｏｍａ １８０腫瘍細胞は、シャーレで培養した後に、細胞を適当な量のハンクス液に浮遊させ、その一部を等量の０．４％トリパンブルーと混合し、細胞数及び生存率を求めた。この細胞懸濁液を１×１０６ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬ／ｂｏｄｙの条件で細胞増殖用Ｃｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスの腹腔内に接種した。
細胞移植後５〜７日に細胞増殖用マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。その後、腹腔内にハンクス液を約１ｍＬ注入してＳａｒｃｏｍａ １８０腫瘍細胞を含む腹水を回収した。
移植用のチャンバーは、ミリポアリング（ミリポア株式会社）の両側にＭＦセメント（ミリポア株式会社）でフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ，ミリポア株式会社）を装着することにより調製した。風乾後、完成したチャンバーをエチレンオキサイドガスで滅菌した。
滅菌済みチャンバーにＳａｒｃｏｍａ １８０腫瘍細胞懸濁液［Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはＰＢＳ（−）］を２３Ｇの注射針を用いて０．１５ｍＬずつリングの注入孔からチャンバー内部に注入し、注入口をナイロン棒（ミリポア株式会社）で塞いだ（５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．１５ｍＬ／ｃｈａｍｂｅｒ）。
作成した移植用チャンバーを、ペントバルビタールナトリウム（５５ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与による麻酔下で、剃毛後、マウス尾根部へ２６Ｇの注射針を装着した注射器を用いて空気を約８ｍＬ皮下に注入した。尾根部より頭側１．５ｃｍ程度のところで皮膚を１．５ｃｍ程度水平切開し，細胞懸濁液［Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはＰＢＳ（−）］を注入したチャンバーをピンセットを用いて背部まで挿入した。チャンバーを封入したマウスにｄａｙ ０（腫瘍細胞移植後）〜ｄａｙ ４に１日１回（計５回）、尾静脈から、生理食塩水（対照群）、天然型ＢＬアンジオスタチンポリペプチド組成物、あるいは組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを投与した。それぞれの薬剤の投与量は、０．３５および３．５ｍｇ／ｋｇとした。
Ｄａｙ ５にエーテル麻酔下でマウス背部を広く切開し、皮膚側のチャンバー接触部分にリングと同じ内径の黒色ゴムリング（三興化学工業株式会社，内径と外径の厚さ：約２ｍｍ）を置き、顕微鏡下で観察し、写真撮影する。長さ３ｍｍ以上の蛇行彎曲している血管を新生血管として計測した。
その結果、天然型・組換え型とも、ほぼ同等の血管新生阻害作用を示し、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡが十分な薬理作用を有していることが示された。（図８）
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の制がん剤は、血管新生を伴う疾患に用いることができる。特に、乳がん、肺がん、咽頭がん、胃がん、膵がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん等のがんの治療に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−結合型糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチド、Ｏ−結合型糖鎖およびＮ−結合型糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチド、該ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られた組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは既存の血管から新しい血管が形成される過程であり、血小板や血管内皮細胞から放出される成長因子等の促進物質と種々の阻害因子により調節される（Ｂｒｏｗｄｅｒ，Ｔ．，Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．＆Ｐｉｒｉｅ−Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｓ．（２０００）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１５２１−４）。脊椎動物における血管新生は非常に厳密に制御されており、分化・成長過程および成熟個体における妊娠、創傷治癒のような限られた場合にしか生じない。例外的に、慢性炎症や糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎、固形腫瘍といった病的な素因がある場合に血管新生が亢進していることが知られており、これらの病態進行と血管新生は深く関与している（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．（２００３）．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，６５３−６０）。
【０００３】
固形腫瘍は、一定の大きさまでは既存の血管から得られる栄養素だけで成長できるが、それ以上に成長するためには新生血管を構築し、そこから増殖に必要な酸素や栄養素を獲得する必要がある。つまり、腫瘍の成長は血管新生に依存的であると言え、この過程を効果的に阻害することにより、腫瘍の成長、転移を阻害できる可能性が示されている。さらに、血管新生阻害剤の標的となるのは、がん細胞自身ではなく血管内皮細胞であり、薬剤耐性や副作用が生じにくいといった長所があり、新規の抗がん剤として期待されている。近年、血管内非細胞増殖因子のひとつであるＶＥＧＦを阻害する抗体医薬アバスチンが承認されている。
【０００４】
アンジオスタチンは、血漿中の線溶因子プラスミノーゲンが部分分解して生じる内因性の血管新生阻害因子である（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｃｅｌｌ ７９，３１５−２８）。生理的条件下におけるアンジオスタチンの産生は、腫瘍の存在によって活性の亢進した各種のプロテアーゼによって分解を受けて生じる。典型的なアンジオスタチン分子はプラスミンの最初の４つのクリングルドメイン（Ｋ１−４）からなるが、その派生物であるＫ１−３、Ｋ１−４１／２やＡ６１などについても、血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成の阻害、さらにｉｎ ｖｉｖｏにおいて、これらのアンジオスタチン分子が原発巣および転移巣の成長を抑制することも判明している。（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｃｅｌｌ ７９，３１５−２８，７．Ｃａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２９４６１−７）
【０００５】
アンジオスタチンの製造法としては、（１）エラスターゼによるプラスミノーゲンの加水分解（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２，６８９−６９２（１９９６））及び（２）遺伝子組換え技術を用いた大腸菌や酵母による生産（Ｂ．Ｋ．Ｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７，１３２９−１３３４（１９９７））の２種類が知られていた。しかし、（１）では、エラスターゼの基質特異性の低さのため、副生成物が多く生じ、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを選択的に生成させることが困難であることから、アンジオスタチンの活性の再現性が低いという欠点があった。また、（２）では、天然型に匹敵する活性が得られていない。これは異種生物での発現の過程で、タンパク質フォールディングの差に基づく立体構造の変化や、特に糖鎖修飾の差などが原因と考えられる。（Ｃａｏ，Ｙ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３３，３５７−６９（２００１）、Ｄｅｌｌ’Ｅｖａ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ９，３−１０（２００２））。事実、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗらは、アンジオスタチンの糖鎖末端のシアル酸の除去により、アンジオスタチンの活性が大きく低下することを報告している（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，３０３，２２−３１，（２００５））。
【０００６】
ＢＬアンジオスタチン（ＢＬＡＳ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株が産生するプロテアーゼであるバシロライシンＭＡを用いて、ヒトプラスミノーゲンを特異的に切断したアンジオスタチン様断片である（特開２００２−２７２４５３号公報）。ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列は公知であり、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴに受入番号Ｐ００７４７として登録されている。なお、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列は、シグナルペプチド（Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９）を含む。ＢＬアンジオスタチンは、ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ（ヒトプラスミノーゲンのＧｌｕ２０−Ｓｅｒ４６０からなるポリペプチド）を主成分として構成される組成物である。ＢＬアンジオスタチンは、親水性アミノ酸に富むＮ末端領域、およびプラスミノーゲンに由来する天然型糖鎖を有し、水に対する溶解性も非常に高い。これまでの組み換え型アンジオスタチン分子と比較して、より低濃度から抗腫瘍活性、内皮細胞の管腔形成阻害といった作用が見出され、優れたアンジオスタチン分子であることが示された。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ、該ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られた組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡに関する。
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、従来の技術では、十分な生物活性を有するアンジオスタチンを生産することを達成できていない。また、ＢＬアンジオスタチンは上記のように優れた生物活性を有するが、活性に必須の糖鎖を有する遺伝子組換え体の生産には至っていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ（ｒＢＬＡＳ）の生産方法および、がんに対する効果について鋭意研究を行なった結果、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下ＣＨＯ−Ｋ１）を用いた系によって、２種類の糖鎖を有する組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの発現および生産に成功した。さらに、得られた組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡには、天然型アンジオスタチンと同等の極めて優れた血管新生阻害効果を有することを発見して、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、糖鎖を有することにより高い活性を示す、組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】 細胞株樹立の際に用いたヒトプラスミノーゲンのｃＤＮＡシークエンスを示す。
【図２】 天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの各分子に対する糖鎖付加を確認した。
【図３】 Ｎ型糖鎖を特異的に脱離するＰＮＧａｓｅを用い、天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを処理したところ、Ｎ型糖鎖がついている高分子量のバンドが消失し、低分子量のバンドに集約した
【図４】 組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのＮ型糖鎖中性糖のＴＯＦ−ＭＳデータを示す。中性糖３ピーク（ｍ／ｚ １４４２．３、１５５６．９、１８６６，９）が観測された。
【図５】 組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのＮ型糖鎖酸性糖のＴＯＦ−ＭＳデータを示す。酸性糖２ピーク（ｍ／ｚ ２１５６．１、２４４７．５）が観測された。
【図６】 組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのＯ型糖鎖中性糖のＴＯＦ−ＭＳデータを示す。中性糖４ピーク（ｍ／ｚ ７５３．２、９０２．７、９９９．７、１０６４．０）が観測された
【図７】 組換え型ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのＯ型糖鎖酸性糖のＴＯＦ−ＭＳデータを示す。酸性糖２ピーク（ｍ／ｚ ７３１．７、７８８．７）が観測された。
【図８】 天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの血管新生抑制試験の結果を示す。天然型、組換え型とも濃度依存的に申請血管数が減少し、３．５ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ有意な抑制作用が得られた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを製造するには、当該タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを作製し、これを好適な発現系に導入することにより目的タンパク質を製造することができる。
【００１３】
本発明の組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの塩基配列を有するＤＮＡは、ヒト由来（例えば、ＨｅｐＧ２細胞由来など）のｃＤＮＡライブラリーを、ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡのアミノ酸配列をコードする塩基配列の情報に基づいて設計した好適なプライマー又はプローブを用いてスクリーニングすることにより入手できる。スクリーニングはプラークハイブリダイゼーション等で行うことができる。あるいは、ヒト由来（例えば、ＨｅｐＧ２細胞由来など）のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、上記塩基配列の情報に基づいて設計した好適なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子を直接クローニングすることもできる。
組み換えタンパク質を発現させるための発現系（遺伝子を含む発現ベクターとその宿主）は当業者に公知である。ＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、該ＤＮＡを発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いでこの組み換え発現ベクターを、当該発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００１４】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
動物細胞用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、アデノウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、ＣＨＯ−Ｋ１などの動物細胞、Ｓｆ２１細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。
【００１５】
組換えベクターの宿主への導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法などが挙げられ、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
形質転換体の培養物から、目的の組み換えタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。例えば、組み換えタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、イオン交換グロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法を単独、又は組み合わせて用い、精製することができる。
【００１７】
本発明の制がん剤は、一般的には、有効成分としての組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡと賦形剤などの製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で提供される。
本発明の制がん剤は、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。
本発明の薬剤の投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡは、先行技術の組換え型アンジオスタチン分子とは異なり、水に対する溶解度が高いことから、本発明の制がん剤は、静脈内投与によって投与することができるという特徴を有する。
本発明の制がん剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。本発明の薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択することができる。
【００１８】
本発明の薬剤の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
本発明の制がん剤は、乳がん、肺がん、咽頭がん、胃がん、膵がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん、等の治療に用いることができる。
【実施例】
【００１９】
細胞株の樹立
ＨｅｐＧ２細胞からＴｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をもちいてトータルＲＮＡを抽出した。その一部３９５．２μｇ／ｍｌ（９０μｌ）を鋳型に逆転写反応を行い、以下のＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒを用いてプラスミノーゲンの部分配列をコードするｃＤＮＡを得た。各反応は、ＴａＫａＲａＢＩＯ社ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｓｙｓｔｅｍ及びＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
用いたｐｒｉｍｅｒの配列を以下に示す。なお、ヒトプラスミノーゲンの配列は公知であり（図１）、ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを発現するためのｃＤＮＡはプラスミノーゲンの１〜４６０番目のアミノ酸配列をコードする。（図１）
ＲＴ−ＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒ：
５‘−ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＣＣＣＴＣ−３’
ＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒ：
Ｆｏｒｗａｒｄ（３６ｍｅｒ）：
５’−ＴＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＣ−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ（３７ｍｅｒ）：
５’−ＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＧＣ−３’
得られたｃＤＮＡ断片の末端を平滑処理後、ｐＣＡＧＧＳ１．ｄｈｆｒ．ｎｅｏベクター（財団法人化学及び血清療法研究所）のＳａｌＩサイトにクローニングし、ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを発現するためのプラスミノーゲン部分配列のプラスミド構築物ＳＹＮ１３００−１を得た。
それぞれの挿入部位及び近傍の塩基配列解析を行った（図１）。その結果、挿入部位について４箇所のｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎが認められた（３４４Ｔ→Ｃ、７８５Ｃ→Ｔ、８８７Ｇ→Ｔ、１０９７Ｇ→Ａ）。これらはｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎであり、コードするアミノ酸の変化を伴うものではなかったため、得られた配列を用いて次の作業を進めた。
【００２０】
発現プラスミドＤＮＡベクターの調製
目的遺伝子発現プラスミドクローンＳＹＮ１３００−１について、トランスフェクション用プラスミドＤＮＡの大量調製をおこなった。４０ｍＬの大腸菌培養液より、ＥｎｄｏＦｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ ｃａｔ．Ｎｏ．１２３６２）を用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。
【００２１】
ヒトプラスミノーゲン部分タンパク質安定発現株の樹立
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−９０９６）にプラスミドクローンＳＹＮ１３００−１を導入し、ヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを安定発現する細胞株の樹立を試みた。６ウエルプレートに３ｘ１０５個／ウエルでＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を播種し、２４時間培養した後、トランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯ（Ｍｉｒｕｓ ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＩＲ２１７４）を用いて目的遺伝子発現プラスミドＤＮＡ（２μｇ）を細胞に導入した。導入方法はＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯのｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｎｕａｌに従った。
ＤＮＡトランスフェクションから４８時間培養の後、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地（培地：ＳＩＧＭＡ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ３３９０，ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ６７７０）で細胞懸濁液を作製し、１００分の１、２００分の１、４００分の１及び、８００分の１量の細胞を新しい６ｃｍディッシュに播種し、欠損培地による選択を開始した。３〜４日毎に新鮮なＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地に交換しながら、７日間培養した後、０．０３μＭ ＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）添加／ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地に交換し、更に４日間選択培養をした。選択開始から１１日後に、欠損培地耐性となり増殖してきた細胞コロニーをクローニングカップにより、４２個ピックアップし、４８ウエルプレートに継代した。増殖した３４クローンについて、１０分の１量の細胞を６ウエルプレートに播種し、ＭＴＸ濃度を０．３μＭに上げたＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地を用いて遺伝子増幅培養を試みた。７〜１０日間の培養の後、増殖した３２クローンについて、３０分の１量の細胞を６ウエルプレートに播種し、ＭＴＸ濃度を１．０μＭに上げたＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加／１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ培地を用いて再度遺伝子増幅培養を試みた。７〜１３日間の培養の後、１．０μＭＭＴＸで増殖した３２クローンのうち、増殖の遅い２クローンを除いた３０クローンについて、６ｃｍディッシュに拡大培養した。これらの培養上清に含まれる組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ量をウエスタンブロットによって定量し、この３０クローンのうち、生産性の良かったクローン、２２，２３，２４，２５，２６を組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ生産基本株とした。
【００２２】
高生産株の取得
上記安定発現ＣＨＯ細胞のクローン、２２，２３，２４，２５，２６を、６０ｍｍディッシュで１μＭ ＭＴＸおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ４ｍｌ中３７℃，５％ ＣＯ２下で培養した。９０ｍｍディッシュ（１０ｍｌ培地）に拡大した後、６穴プレートに播き（およそ２０，０００／ｃｍ２）１μＭ ＭＴＸ／１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で１日培養後、１ｍｌのＤＭＥＭに換え４８時間後の培養液を回収し、１６，０００ｘｇ，１０分間遠心した上清に存在する組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡをＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで検出した。定量の結果、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの発現量はクローン間で大きな差はなく、５クローンのうち生育の遅いＮＯ．２５についてＭＴＸによる選択を行った。
【００２３】
クローンＮｏ．２５を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中３７℃，５％ＣＯ２下において、３μＭ ＭＴＸ（７日間、培地交換１回）、３０μＭ ＭＴＸ（８日間、培地交換２回）、１００μＭ ＭＴＸ（３７日間、培地交換７回・継代３回）条件でそれぞれ培養した。これらのうち１００μＭ ＭＴＸ中で生存した細胞は発現量が約３倍に上昇し（１０ｍｇ／Ｌ培地）、本細胞集団をＭ１００とした。
さらにＭ１００細胞について、限界希釈法によるクローニングを実施し、９６穴プレート（Ｃｏｓｔｅｒ ３５９５）中で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中条件、２２日間培養後１００μｌのＤＭＥＭに換え、４８時間培養後、生育の良かったクローン１２個について５０μｌの培地を回収し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ量を定量した。得られた１２個のクローンの発現量はいずれもＭ１００細胞集団と同等かそれ以下であり、発現量が同等であった２つのクローンをそれぞれＭ１００−１，Ｍ１００−２とし、これを組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ高生産株とした。
【００２４】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ産生細胞の無血清培地馴化および浮遊化検討
上記で得られた選択株Ｍ１００，Ｍ１００−１，Ｍ１００−２ 計３クローンについて無血清培地への馴化検討および浮遊化検討を行った。
無血清馴化には、市販のＡｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ 培地である３種類の培地を選択し使用した。具体的にはＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地（Ｉｒｖｉｎｅ、９１９７）、ＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ＋ＳＯＹ（Ｉｒｖｉｎｅ、特注品ｌｏｔ：ＩＳＪ００５−０４３）、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ（ＳＡＦＣ、１４３６０Ｃ−１０００Ｍ）である。これらの培地１Ｌに対して、２００ｍＭグルタミン酸を４０ｍｌまたは８０ｍｌ（ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地のみ）添加したものを無血清馴化培地とした。これら無血清馴化培地３種類を用いて、上記で得られた細胞３種（Ｍ１００，Ｍ１００−１，Ｍ１００−２）を用いての馴化培養を行った。馴化培養は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で凍結細胞を蘇生後、１μＭ ＭＴＸ含有の１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養された細胞を用いて行った。１０％ＦＢＳ含有培地から順次、ＦＢＳ濃度を１０％→５％→１％→０．５％→０％（無血清）と低下させ、各ＦＢＳ濃度で一定期間培養を行いながら培養を継続した。５％、１％、０．５％ＦＢＳ濃度の培地は、１μＭ ＭＴＸ含有の１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と１μＭ ＭＴＸを含有した各無血清培地を濃度比率で混和させて使用した。細胞の播種密度は、本報告書で特筆しない場合、基本を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、細胞状態によっては、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上を播種して培養を行った。
検討の結果、Ｍ１００−１細胞は他の２種と比較して、無血清培地馴化による増殖率および生産性が劣る結果が得られた。またＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ＋ＳＯＹ培地は、いずれの細胞においても増殖性は優れるものの、生産性が低いという結果が得られた。
【００２５】
細胞の浮遊化検討は、３種の細胞ともほぼ同様の推移を示し、１％ＦＢＳ濃度の培地から、浮遊細胞と接着細胞（明らかな接着様態）の混在状態となり、ＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ＋ＳＯＹ培地では、１％ＦＢＳ含有培地から、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地では、０．５％ＦＢＳ含有培地から、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地では、０％ＦＢＳ培地への移行時から浮遊細胞化が認められた。ただし、Ｍ１００−１細胞は、０％ＦＢＳのＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地においても、細胞播種後、接着細胞様態を示し、培養を継続することにより接着細胞が剥離し、浮遊化（分散細胞群と凝集魂が混在）する傾向が見られた。全般的に細胞の浮遊化の傾向に関しては、Ｍ１００−２≧Ｍ１００＞Ｍ１００−１の順で浮遊化がし易いことが観察された。
【００２６】
これらの結果により、大量生産培養の検討に用いる細胞株としてＭ１００およびＭ１００−２、無血清馴化培地としてはＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地を選択した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ生産のための基本培地の検討
前項で得た無血清培地馴化済みのＭ１００およびＭ１００−２細胞を、それぞれＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて（Ｉｒｖｉｎｅ社製培地を基本培地として使用する場合はＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地、ＳＡＦＣ社製培地を基本培地として使用する場合はＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地を蘇生・継代培養に用いた。培地組成は、前述・無血清培地馴化と同）蘇生・継代培養を行うことによって、基礎培地検討に要する細胞数へ拡大培養を行った。その後、無血清馴化培地と候補基本培地を等量混和した培地で、１継代行った。その後、候補基本培地で培養を２継代以上行った。増殖性が適切であると判断した候補基本培地を選択し、基本培地選択のための培養を行った。培養開始後、３、５、７、１０日目の生細胞数、細胞生存率を測定、さらに組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ産生量を、５、７、１０日目の培養上清を用いて測定した。生細胞数が播種時に対し２〜５日培養後、２倍以上達しない場合、または細胞浮遊状態を維持できない場合は、培養を中止した。
候補基本培地としては、Ｉｒｖｉｎｅ社製培地としてＩＳ ＣＨＯ Ｖ培地（９１９７）、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ１培地（特注ＩＳＪ００５−１４６Ａ）、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ２培地（特注ＩＳＪ００５−１４６Ｂ）ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｘ１培地（特注ＩＳＪ００５−１４７Ａ）、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｘ２培地（特注ＩＳＪ００５−１４７Ｂ）、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ１培地（特注ＩＳＪ００５−１４７Ｃ）、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地（特注ＩＳＪ００５−１４７Ｄ）の７種類、ＳＡＦＣ社製培地として、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地（１４３６０Ｃ−１０００Ｍ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地（Ｃ５４６７）、ｉｍＭＥＤＩＡｔｅ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ６５９０４培地（特注６５９０４−１０００Ｍ）、ｉｍＭＥＤＩＡｔｅ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ６５８９８培地（特注６５８９８−１０００Ｍ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ−３培地（Ｃ１４９０−１Ｌ）の５種類、計１２種類の培地を使用した。各基本培地は、Ｌ−グルタミン（終濃度４ｍＭ、ＩＳ ＣＨＯ Ｖ培地のみ終濃度８ｍＭ）、メソトレキセート（終濃度１μＭ）をそれぞれ添加したものを用いた。なお、これら１２種のうち、各培地への馴化培養を進める段階の振とう培養過程で、ＳＡＦＣ系培地のＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ、ｉｍＭＥＤＩＡｔｅ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ６５９０４、ｉｍＭＥＤＩＡｔｅ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ６５８９８培地の増殖性が低下した。ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ培地は増殖が止まったので、増殖性培養試験は行わなかった。
【００２９】
培養はいずれも、細胞培養液をよく攪拌、懸濁した後、培地で１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、新しい培養フラスコ（Ｔ２５、Ｔ７５、Ｔ２２５、エレンマイヤーフラスコ（Ｅ１２５、Ｅ２５０）など）に加え、５％ＣＯ２インキュベーター（以下ＣＯ２インキュベーター）に入れ培養を継続した。Ｔフラスコによる培養は、ＣＯ２インキュベーターに入れ、静置培養、エレンマイヤーフラスコ（Ｅ２５０）による培養は、空気にＣＯ２が５ ｖｏｌ％の割合で含まれる混合ガス（流量１Ｌ／ｍｉｎ）を４５秒間エレンマイヤーフラスコ内に通気し、キャップを密閉後、３６．５±０．５℃、８０ｒｐｍの旋回振とう速度条件下で培養を行った。細胞密度を上げる必要のある場合、培地全量交換する必要のある場合は、１，０００ｒｐｍ（１８０Ｇ）の条件で５分間遠心分離後、上清を除去したのち、培地を加え０．５〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製して継代培養を進めた。
増殖性培養試験を行った結果、Ｍ１００細胞、Ｍ１００−２細胞ともに、ＳＡＦＣ社ＥＸ−ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地の増殖性がもっとも良く生細胞密度も高かったが、ＳＡＦＣ社の培地は、ＡＤ４、ＡＤ８培地を除き、ほぼ同等の増殖性を示した。組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ濃度測定の結果、各培地において、Ｍ１００細胞の方が、Ｍ１００−２細胞より組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの蓄積量が高い傾向が見られた。培養１０日目の組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ蓄積量において、Ｍ１００細胞では、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地、Ｍ１００−２細胞では、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地が、それぞれ約４５ｍｇ／Ｌであり、高い組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ蓄積量を示した。また、生細胞密度あたりの生産量としては、培養十日目においていずれの細胞もＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地＞ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ１培地＞ＥＸ−ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地の順であった。（表２〜５）
【００３０】
以上の結果から、Ｍ１００−２細胞、無血清培地としてＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地（Ｉｒｖｉｎｅ、９１９７）、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地（Ｉｒｖｉｎｅ、特注 ＩＳＪ００３−０６１）が組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの生産に適していると判断した。
【００３１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００３２】
大量培養検討
前項で確立した条件を用い、スピナーフラスコを用いた攪拌培養確認、および流加培養検討を行った。
上記と同様に調整した培地を用い、無血清培地（ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地）を用いて蘇生培養を行い、同培地で１継代培養を行った後、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地とＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地を等量混和した培地で、１継代行った。その後、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地による培養を３継代行うことにより、拡大培養を行い、攪拌培養に使用する細胞を取得した。
５Ｌの培養槽を高圧蒸気滅菌し、放熱後４０００ｍＬのＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地を加え、ＣＯ２が５ ｖｏｌ％の割合で含まれる混合ガス（流量２００ｍＬ／ｍｉｎ）を通気しながら、温度３６．７℃、攪拌数７２ｒｐｍ（先端速度０．４５ｍ／ｓ）、溶存酸素濃度（ＤＯ）４０％設定し、約２０時間運転放置した（前培養）。放置後、ｐＨおよび溶存酸素濃度を調整した。細胞播種前の培養状態は、攪拌数７２ｒｐｍ（先端速度０．４５ｍ／ｓ）、温度３６．６℃、ｐＨ７．１８、ＤＯ １００．４％だった。
前培養後、培養槽に播種細胞密度が、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、細胞培養液を加えたのち、ＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地を加え、培養液量を５，０００ｍＬとした。培養条件は、５Ｌ培養槽の各設定値を、温度３６．７℃、上面通気量２００ｍＬ／ｍｉｎ、ｐＨ７．２、ＤＯ ４０％、攪拌数７２ｒｐｍとし、培養を開始した。培養開始後、ｐＨが下がった場合は、炭酸ナトリウム溶液を注入し、ｐＨを補正、培養を継続した。
培養３日目から５，７，１０，１２日目に生細胞数および生存率を測定し、１２日目において生存率が５０％を下回ったため、培養を終了した。
培養終了後、細胞ろ過フィルター（ザルトブランＰ３００）による除細胞ろ過をおこない、４，６５０ｍＬの培養上清を回収した。
組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ濃度は、培養５日目より７、１０、１２日目に測定し、培養５日目は、７ｍｇ／Ｌ、７日目は、１４．７ｍｇ／Ｌ、１０日目は、２３．６ｍｇ／Ｌ、１２日目は、３０．１ｍｇ／Ｌだった。なお、フィルターへの吸着は確認されなかった。
【００３３】
流加培養検討は、基本培地をＩＳ ＣＨＯ ＣＤ−Ｍ２培地（Ｉｒｖｉｎｅ、特注 ＩＳＪ００３−０６１、ＩＳＪ００３−０６４）、流加培地として基本培地メーカー推奨の培地６種、ＩＳ ＣＨＯ ＦＥＥＤ−ＣＤ（Ｉｒｖｉｎｅ、９１１０８）、ＣＨＯ ＦＥＥＤ ＭＥＤＩＵＭ（Ｉｒｖｉｖｅ、特注ＩＳＪ００３−０６０）、Ｓｏｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ＵＦ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０×（ＳＡＦＣ、５８９０３Ｃ）、Ｙｅａｓｔ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ＵＦ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０×（ＳＡＦＣ、５８９０２Ｃ）、Ｙｅａｓｔ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ＵＦ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０×（Ｉｒｖｉｎｅ、ＩＳＪ００５−０８２）、Ｗｈｅａｔ Ｈｙｄｏｒｏｌｙｓａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＩＳＪ００３−０７１）を用いた。
【００３４】
【表６】
【００３５】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの精製
リジンセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケア）を充填したカラムを０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化し、そこにカラムの７０培量の細胞培養液の遠心上清をアプライした。カラムの２０倍量の０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄した後、０．２ＭのＥＡＣＡ（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含む０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出した。回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル）によって分離し、５０−５４ｋＤａの組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ分子を含む画分をまとめ、硫酸アンモニウムを添加して、たんぱく質を沈殿させた。得られた沈殿物４．８ｍｇを２ｍｌの３０％飽和硫安を含む０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．０）に溶解し、これを３０％飽和硫安を含む０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＳＯＵＲＣＥ １５ＰＨＥ４．６／１００ＰＥ（ｐｈｅｎｙｌ）（ＧＥヘルスケア）にアプライした。カラムの２０倍量のボリュームで０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．０）へグラジエント溶出を行い、その後カラム２倍量の０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．０）で溶出し、２ｍｌずつ溶出画分を集めた。溶出画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、高純度組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ標品を得た。
【００３６】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの糖鎖付加確認および糖鎖分析
上記疎水カラムクロマト処理後の高純度標品、およびヒト血漿より得られた天然型ＢＬアンジオスタチンをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ニトロセルロース膜にブロッティングした。ブロッティング後のメンブレンを糖タンパク検出キット（ＧＥ社 ＥＣＬ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いてビオチン標識し、これをＨＲＰ標識のストレプトアビジンを用いて検出することにより、糖鎖修飾の有無を確認した。その結果、天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを構成する、分子量の異なる２つの分子は、いずれも糖鎖を有していることが明らかとなった。（図２）
【００３７】
天然型プラスミノーゲンは、Ｎ型、Ｏ型糖鎖が１つずつ付加したＩ型プラスミノーゲンと、Ｏ型糖鎖が１つ付加したＩＩ型プラスミノーゲンが存在する。天然型アンジオスタチンは、プラスミノーゲンの部分分解産物であるため、これらの糖鎖を有している。組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡに付加された糖鎖を確認するため、Ｎ型糖鎖を特異的に分解するＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ Ｓ０４０７Ｓ）で反応させることにより、アンジオスタチン分子に付加していると予測されるＮ型糖鎖の脱離を試みた。
１μｇの天然型ＢＬアンジオスタチンおよび組み換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを５００ユニットのＰＮＧａｓｅＦと１％のＮＰ−４０、４０ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ中、３７℃で１時間インキュベーションし、その後、電気泳動で評価した。その結果、組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡをＰＮＧａｓｅＦで処理すると、天然型と同様に、２本のバンドのうち分子量の多い上のバンドが消失し、下のバンドのみが検出された。これらの結果により、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを構成する２つの分子のうち、高分子量のタンパク断片については、Ｎ型糖鎖を有し、下のバンドに相当する分子はＮ型糖鎖が付加して異なことが示唆された。（図３）
【００３８】
さらに、分子に付加した糖鎖を構成する糖の推定を行うため、糖鎖分析を試みた。上記疎水カラムクロマト処理後の高純度標品を、精製水に対して４℃下、一晩透析を行い、回収したサンプルを凍結乾燥して試料を粉末状にした。得られた試料に無水ヒドラジンを加え、１００℃で１０時間反応させた後、トルエンの共沸留去によってヒドラジンを除去した。Ｎ−アセチル化試薬を加え、氷上で３０分間反応させ、そこに陽イオン交換樹脂を加え、ミニカラムでろ液を回収、乾固させた。
分離した糖鎖をカップリング試薬（２−アミニピリジンを酢酸で溶解）に溶解し、９０℃１時間反応させた後、還元剤（ジメチルアミンボランを酢酸と精製水に溶解）を加え８０℃、３５分間反応させることにより糖鎖のピリジルアミノ化（ＰＡ化）を行った。反応後に、溶液をセルロースカラムに通し、ＰＡ化糖鎖と余剰の２−アミノピリジンを分離した。得られたＰＡ化糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにかけ、分子量を測定した。マトリックスは２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄを用い、中性糖についてはｌｉｎｅａｒモード、酸性糖についてはｌｉｎｅａｒ ｎｅｇａｔｉｖｅモードで測定した。
得られたマススペクトルから、Ｎ型およびＯ型糖鎖を構成する構成糖を推定した。Ｎ型糖鎖は中性糖３ピークと酸性糖２ピーク、Ｏ型糖鎖では中性糖４ピークと酸性糖２ピークが検出された。（図４〜７、表７）検出されたピークについてＥｘＰＡＳｙ−ＧｌｙｃｏＭｏｄ ｔｏｏｌで分子量から構成糖を推定した。
【００３９】
【表７】
【００４０】
糖含量およびシアル酸定量
糖定量は、ガラクトースを標品として用い、フェノール硫酸法にて行った。標品および組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ０．５ｍｌに５％フェノール溶液を０．５ｍｌ加えた後、濃硫酸２．５ｍｌを勢い良く加え、混合、室温で１０分反応させた。反応後、４９０ｎｍの吸光度を測定することで、検量線より糖の定量を行った。その結果、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの糖含量は、タンパク質１μｇあたり、３４．３５ｎｇであった。
シアル酸定量は、シアル酸を標品として用い、レゾルシノール法にて実施した。レゾルシノール０．２ｇを２０ｍｌのミリＱ水に溶かし、濃硫酸８０ｍｌと０．１Ｍ ＣｕＳＯ４ ０．２５ｍｌを加える。標品および組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡサンプル０．５ｍｌに前述で調整したレゾルシノール試薬０．５ｍｌを加え、１００℃で１５分間反応させた後、流水で冷やし、メチルセロソルブを２ｍｌ加えて混合し、５８０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡは、タンパク質１μｇあたりシアル酸２１．３２ｎｇであった。
【００４１】
組換えＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの血管新生阻害作用
組み換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡの血管新生阻害作用を、アフィニティートラップリアクターで製造・精製した天然型ＢＬアンジオスタチン組成物（調製法はＷＯ２００４／０６５５９５）と比較した。
天然型ＢＬアンジオスタチンポリペプチド組成物は、アフィニティートラップリアクターを用い、ヒト血漿から調製した。組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡは、上記の高生産株Ｍ１００細胞を用いて生産し、リジンセファロース４Ｂによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。両サンプルは生理食塩水に溶解して、フィルター滅菌した（ポアサイズ０．２μｍ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）。
マウスはＣｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）を用いた。Ｓａｒｃｏｍａ １８０腫瘍細胞は、シャーレで培養した後に、細胞を適当な量のハンクス液に浮遊させ、その一部を等量の０．４％トリパンブルーと混合し、細胞数及び生存率を求めた。この細胞懸濁液を１×１０６ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬ／ｂｏｄｙの条件で細胞増殖用Ｃｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスの腹腔内に接種した。
細胞移植後５〜７日に細胞増殖用マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。その後、腹腔内にハンクス液を約１ｍＬ注入してＳａｒｃｏｍａ １８０腫瘍細胞を含む腹水を回収した。
移植用のチャンバーは、ミリポアリング（ミリポア株式会社）の両側にＭＦセメント（ミリポア株式会社）でフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ，ミリポア株式会社）を装着することにより調製した。風乾後、完成したチャンバーをエチレンオキサイドガスで滅菌した。
滅菌済みチャンバーにＳａｒｃｏｍａ １８０腫瘍細胞懸濁液［Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはＰＢＳ（−）］を２３Ｇの注射針を用いて０．１５ｍＬずつリングの注入孔からチャンバー内部に注入し、注入口をナイロン棒（ミリポア株式会社）で塞いだ（５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．１５ｍＬ／ｃｈａｍｂｅｒ）。
作成した移植用チャンバーを、ペントバルビタールナトリウム（５５ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与による麻酔下で、剃毛後、マウス尾根部へ２６Ｇの注射針を装着した注射器を用いて空気を約８ｍＬ皮下に注入した。尾根部より頭側１．５ｃｍ程度のところで皮膚を１．５ｃｍ程度水平切開し，細胞懸濁液［Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはＰＢＳ（−）］を注入したチャンバーをピンセットを用いて背部まで挿入した。チャンバーを封入したマウスにｄａｙ ０（腫瘍細胞移植後）〜ｄａｙ ４に１日１回（計５回）、尾静脈から、生理食塩水（対照群）、天然型ＢＬアンジオスタチンポリペプチド組成物、あるいは組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡを投与した。それぞれの薬剤の投与量は、０．３５および３．５ｍｇ／ｋｇとした。
Ｄａｙ ５にエーテル麻酔下でマウス背部を広く切開し、皮膚側のチャンバー接触部分にリングと同じ内径の黒色ゴムリング（三興化学工業株式会社，内径と外径の厚さ：約２ｍｍ）を置き、顕微鏡下で観察し、写真撮影する。長さ３ｍｍ以上の蛇行彎曲している血管を新生血管として計測した。
その結果、天然型・組換え型とも、ほぼ同等の血管新生阻害作用を示し、組換え型ＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡが十分な薬理作用を有していることが示された。（図８）
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の制がん剤は、血管新生を伴う疾患に用いることができる。特に、乳がん、肺がん、咽頭がん、胃がん、膵がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん等のがんの治療に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏ−結合型糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ。
【請求項２】
Ｏ−結合型糖鎖およびＮ−結合型糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドおよび／あるいは請求項２のポリペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項４】
請求項１のポリペプチドおよび／あるいは請求項２のポリペプチドを含有する、血管新生を伴う疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項５】
請求項１のポリペプチドおよび／あるいは請求項２のポリペプチドを含有する、がんの治療のための医薬組成物。
【請求項１】
Ｏ−結合型糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ。
【請求項２】
Ｏ−結合型糖鎖およびＮ−結合型糖鎖を有する組換えヒトＢＬアンジオスタチンポリペプチドＡ。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドおよび／あるいは請求項２のポリペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項４】
請求項１のポリペプチドおよび／あるいは請求項２のポリペプチドを含有する、血管新生を伴う疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項５】
請求項１のポリペプチドおよび／あるいは請求項２のポリペプチドを含有する、がんの治療のための医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−２３１０９０（Ｐ２０１１−２３１０９０Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１２６１０（Ｐ２０１０−１１２６１０）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【出願人】（５０７０５１７３２）株式会社ティムス (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【出願人】（５０７０５１７３２）株式会社ティムス (5)
【Ｆターム（参考）】
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