組換え的に改変されたプラスミン
組換え的に改変したプラスミ（ノーゲ）ン分子に関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドが提供される。該プラスミ（ノーゲ）ン分子は、天然のヒトプラスミノーゲン分子中に存在する活性化部位に対しＮ末端の単一のクリングルドメインを有し、そして、天然の酵素に関連するリシン結合および有意の酵素の特徴を表す。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトプラスミノーゲンは、７９１アミノ酸残基を含有する一本鎖タンパク質である。プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化は、酵素前駆体中のＡｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２ペプチド結合の単一切断から生じる。生じるプラスミン分子は、トリプシン様の特異性（ＬｙｓおよびＡｒｇの後で切断する）をもつ二本鎖のジスルフィド結合したセリンプロテアーゼである。
【０００２】
プラスミンのアミノ末端のＨ鎖（残基１−５６１、約６０ｋＤａ）は、それぞれおよそ８０アミノ酸残基を含有する５個のクリングルドメインから構成される。クリングルドメインは、活性化阻害剤例えばＣｌ−１イオン；活性化刺激物質例えばε−アミノカプロン酸；哺乳動物および細菌細胞；ならびにプラスミンの生理学的基質フィブリンおよびプラスミン阻害剤α２−アンチプラスミンのような他のタンパク質との相互作用のようなプラスミノーゲンの調節特性を司る。全５個のクリングルのうち、クリングル１は最も多機能のものの１つであり、すなわち、そのリシン結合活性は、α２−アンチプラスミンおよびフィブリンとのプラスミンの相互作用を司ることが示されている。非特許文献１；および非特許文献２を参照されたい。
【０００３】
プラスミンのＣ末端Ｌ鎖（残基５６２−７９１、約２５ｋＤａ）は、トリプシンに相同かつ古典的セリンプロテアーゼの触媒性三つ組残基すなわちＨｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６およびＳｅｒ７４１を含有する典型的なセリンプロテアーゼである。プラスミノーゲンは、２４個のジスルフィド架橋、ならびにＡｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６の２個のグリコシル化部位を含有する。
【０００４】
エラスターゼによるプラスミノーゲンの制限タンパク質分解が３フラグメントをもたらすことが示されている（非特許文献３）。第一のフラグメントＫ１−３は最初の３クリングルを包含し、そして２バージョンすなわちＴｙｒ７９−Ｖａｌ３３８およびＴｙｒ７９−Ｖａｌ３５４で単離され得る。第二のフラグメントＫ４は第四のクリングルに対応し、そして残基Ｖａｌ３５５−Ａｓｎ４４０を包含する。最後のＣ末端フラグメント（いわゆるミニプラスミノーゲン）は残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１を包含し、そして第五のクリングルおよびセリンプロテアーゼドメインよりなる。ミニプラスミノーゲンはプラスミノーゲンと同一の方法で活性化されてミニプラスミンを形成し得る。
【０００５】
完全長のプラスミノーゲン分子の複雑な構造のため、細菌発現系は組換えプラスミノーゲン産生に有用と判明していない。プラスミノーゲンは不溶性の封入体の形態で産生され、そしてその状態から再フォールディング可能でない。さらに、哺乳動物細胞中でのプラスミノーゲンの発現は、プラスミノーゲンのプラスミンへの細胞内活性化および生じる細胞傷害性により複雑にされる。昆虫細胞を使用する完全に活性なプラスミノーゲンの産生は可能であるが、しかしながらこの系は低収量により大スケール製造に適さない。
【０００６】
従って、ある種の負の特徴を欠きかつ昆虫細胞中で実質的な量での産生が可能である一方で、プラスミン／プラスミノーゲンの望ましい特徴を有する、改変された組換えタンパク質が望ましい。
【非特許文献１】Ｗｉｍａｎ，Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５７９：１４２−１５４（１９７９）
【非特許文献２】Ｌｕｃａｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：４２４９−４２５６（１９８３）
【非特許文献３】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌ．、３：１９１−２０９（１９７８）
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
本発明は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供し；該ポリペプチドは固定されたリシンに結合する。該Ｎ末端クリングルドメインは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４に相同であり得る。
【０００８】
いくつかの態様において、コードされるポリペプチドは、配列番号２に示される配列に最低９０％、９５％若しくは９８％同一である。さらに、コードされるポリペプチドは配列番号２に示される配列であり得る。
【０００９】
該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列、若しくはその縮重バリアントであり得る。該ヌクレオチド配列は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに相同なＮ末端クリングルドメイン；ならびに、ヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部分およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドをコードし得る。該ヌクレオチド配列はまた、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに最低９０％同一な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに最低９０％同一なＣ末端ドメインを有するポリペプチドもコードし得る。コードされるポリペプチドは固定されたリシンを結合し得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同なＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドを提供する。
【００１１】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４に相同な１個のＮ末端クリングルドメインを有し得る。
【００１２】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、α２−アンチプラスミンによるミニプラスミンの線維素溶解活性の阻害速度より最低約５倍より速い速度でα２−アンチプラスミンにより阻害される線維素溶解活性を表し得る。α２−アンチプラスミンによる阻害速度はまた、ミニプラスミンの阻害の速度より最低約１０倍、２０倍、３０倍若しくは４０倍より速いこともできる。
【００１３】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは固定されたリシンを結合し得る。固定されたリシンは、リシン−アガロース、リシン−ＢＩＯＧＥＬ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）、リシン−ＨＹＰＥＲＤ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニューヨーク州イーストヒルズ、リシン−ヒドロゲル）、リシン−セファロース（セファロースは架橋アガロースである）よりなる群から選択される固体支持体マトリックスに結合されたリシンであり得る。固定されたリシンはリシン−セファロースであり得る。
【００１４】
いくつかの態様において、該ポリペプチドはミニプラスミンのフィブリノーゲンに対する結合親和性より低いフィブリノーゲンに対する結合親和性を表し得る。
【００１５】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、ミニプラスミンの部分的に切断されたフ
ィブリンに対する結合親和性より高い、部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性を表し得る。
【００１６】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、プラスミノーゲン活性化部位およびプラスミノーゲンセリンプロテアーゼドメインに対しＮ末端に位置する単一のクリングルドメインを有し得、該クリングルドメインは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４との最低１残基より大きいアミノ酸配列の同一性を有する。これらの態様について、ヒトプラスミノーゲンのクリングル１および４の天然の配列に関しての本発明のポリペプチドのクリングル領域の保存的置換が、クリングル５との同一性比較の目的上天然の配列と異なると考えられないとみられることが理解されるであろう。
【００１７】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、配列番号２に示されるところのアミノ酸配列およびその保存的置換を有し得る。該ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の位置７６（アルギニンである）の相対位置に類似の相対位置に１残基を有し得る。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および該ベクターを含んでなる培養宿主細胞を包含する。
【００１９】
［発明の詳細な記述］
完全長プラスミンのフィブリンおよびアンチプラスミン結合特性を有する単純なグリコシル化されていない分子を提供するため、本発明はプラスミノーゲンの欠失変異体を提供する。本明細書でδ−プラスミノーゲンと称される本変異体中で、クリングル１に相同なドメインと活性化部位の間の天然のアミノ酸配列の少なくとも一部分が欠失されている。一局面において、ヒトプラスミノーゲンの天然のクリングル１ドメインに相同なドメインを、実質的に、該ドメイン間に残存するプラスミノーゲン活性化部位を含有する介在する天然の配列のみを用い、プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼ部分、若しくはその相同な機能的アナログに直接結合し得る。
【００２０】
本発明のδ−プラスミ（ノーゲ）ンは：より低分子量（３７，１９８Ｄａ）のδ−プラスミンが、増大された比活性（タンパク質１ｍｇあたり）をもたらし得；天然のタンパク質中で見出される最低２個のグリコシル化部位の欠如（図３を参照されたい）が、比較的低分子量と組合さって、比較的安価な細菌および酵母発現系を使用するこのタンパク質の組換え産生を助長し得；δ−プラスミノーゲンが、プラスミノーゲンアクチベーターｔＰＡ、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼにより活性化され得；天然のクリングル１に相同なドメインの存在が、血栓溶解効果に重要であり得るプラスミンのフィブリン結合特性を保存し；クリングル１に相同なドメイン上のα２−アンチプラスミン結合部位の存在が、δ−プラスミンがプラスミンのこの生理学的阻害剤により迅速に阻害される（出血を予防し得る特徴）ことを可能にし得；より小さい大きさのδ−プラスミンが、α２−マクログロブリンによるその阻害を助長して出血の合併症の機会を天然のプラスミンに関してさらに少なくし得る、ことを特徴とし得る。特定の態様において、無傷の消化されないフィブリ（ノーゲ）ンに対する主要な結合部位を保持するクリングル５の非存在は、循環するフィブリノーゲンの低下された枯渇を伴うδ−プラスミンの使用を可能にし得る。
【００２１】
一般に、本発明は、ミニプラスミ（ノーゲ）ンに関してある種の利点を有する、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに対しＮ末端の単一のクリングル領域を有する組換えプラスミ（ノーゲ）ン分子を提供する。本発明のδ−プラスミノーゲンポリペプチドは、活性化部位に対しＮ末端のもののような１個のクリングル領域を有するのみとは言え、いくつかの態様は活性化部位に対しＮ末端の付加的な配列を包含する。付加的なＮ末端配列はプラスミノーゲンの天然のクリングル領域のものに由来し得る。
【００２２】
本発明のＮ−末端クリングルドメインは、天然のプラスミ（ノーゲ）ンおよびその機能的同等物のクリングル１および４のクリングル配列を包含する。とりわけ、リシン結合に参画するか若しくは影響する残基の保存を包含するポリペプチドバリアント中の機能の保存に関する指針を提供する下の論考を参照されたい。
【００２３】
定義
ポリペプチドの「ドメイン」および「領域」という用語は、別の方法で逆に示されない限り、本明細書で使用されるとおり一般に同義である。「クリングル」若しくは「セリンプロテアーゼ」などのような十分に認識された構造若しくは機能の呼称と一緒に列挙される場合、こうした用語は、こうした呼称に対応するポリペプチド構造に関連することが普遍的に認識かつ理解される、少なくとも何らかの特徴（１種若しくは複数）に関するポリペプチドの特徴を紹介することができる。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「培養宿主細胞」は、いずれかの手段、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、微小注入法、形質転換、ウイルス感染などにより細胞に導入された異種ＤＮＡを含有する原核生物若しくは真核生物細胞を指す。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「異種」は、「異なる天然の起源のもの」すなわち非天然の状態を表すことを意味している。例えば、培養宿主細胞を別の生物体、とりわけ別の種由来のＤＮＡ若しくは遺伝子で形質転換する場合、その遺伝子は、その培養宿主細胞に関して、およびその遺伝子を運搬する培養宿主細胞の子孫に関してもまた異種である。同様に、「異種」は、同一の天然の元の細胞型由来かつそれに導入されたが、しかし非天然の状態、例えば異なるコピー数若しくは異なる調節エレメントの制御下で存在するヌクレオチド配列を指す。
【００２６】
「ベクター」分子は、異種核酸を挿入し得その後適切な培養宿主細胞に導入し得る核酸分子である。ベクターは、好ましくは１個若しくはそれ以上の複製起点、および組換えＤＮＡを挿入し得る１個若しくはそれ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを含む細胞を含まないものから選択し得る便宜的手段を有し、例えばそれらは薬剤耐性遺伝子をコードする。普遍的なベクターはプラスミド、ウイルスゲノムならびに（主として酵母および細菌中で）「人工染色体」を包含する。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「転写制御配列」という用語は、それらが作動可能に連結されているタンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導、抑制若しくは別の方法で制御する、イニシエータ配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列のような核酸配列を指す。
【００２８】
「ポリペプチド」という用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と本明細書で互換性に使用される。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は本明細書で互換性に使用され、そして、文脈により示される目的上必要な情報を含有するいかなる核酸も指すことができる。すなわち、該核酸は、該ポリマーが例えばコードされるペプチドに関して適切な情報を表すことが可能でありかつ相補配列、例えば核酸ポリマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖を包含し得る限り、一本鎖若しくは二本鎖いずれかのＤＮＡ若しくはＲＮＡ、または他の核酸であり得る。
【００３０】
ポリペプチドの「バリアント」という用語は、１個若しくはそれ以上のアミノ酸により変えられているアミノ酸配列を指す。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似の構造若
しくは化学特性を有する「保存的」変化、例えばイソロイシンでのロイシンの置換を有し得る。あるいは、バリアントは「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンでの置換を有し得る。類似の小さな変動は、アミノ酸の欠失若しくは挿入、または双方もまた包含し得る。「バリアント」ポリペプチドの特定の一形態は「機能的に同等な」ポリペプチド、すなわち、より詳細に下述されるところの本発明のポリペプチドの例と実質的に類似のｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を表すポリペプチドである。どのアミノ酸残基を生物学的若しくは免疫学的活性を除外することなく置換、挿入若しくは欠失し得るかの決定における指針は、当該技術分野で公知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）を使用して見出し得る。さらに、引用することにより本明細書に完全に組み込まれる引用される参考文献内に提供されるものを包含する特定の指針が下に提供される。
【００３１】
「Ｎ末端の」および「Ｃ末端の」という用語は、それらが適用されるいずれかのアミノ酸配列若しくはポリペプチドのドメイン若しくは構造の相対位置を指定するのに本明細書で使用する。相対位置決めは文脈から明らかであろう。すなわち、「Ｎ末端の」特徴は、同一の文脈で論考される別の特徴よりも該ポリペプチド分子のＮ末端に少なくともより近くに位置することができる（他の可能な特徴は第一の特徴に対し「Ｃ末端の」と称される）。同様に、「５’−」および「３’−」という用語を、ポリヌクレオチドの特徴の相対位置を指定するのに本明細書で使用し得る。
【００３２】
「天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な」Ｎ末端ドメインを有すると本明細書で称されるδ−プラスミノーゲン／プラスミンポリペプチドは、プラスミノーゲンの天然のクリングルドメインに類似の構造および機能の特徴を表す。さらに、「クリングル１に相同な」Ｎ末端ドメインを有すると本明細書で称されるδ−プラスミノーゲン／プラスミンポリペプチドは、少なくとも、該ポリペプチドがクリングル５よりも高いω−アミノカルボン酸（およびｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸（ある環状酸）のような機能的ホモログ）に対する親和性を有し得る程度まで、天然のクリングル１に類似の特徴を表す。５−アミノペンタン酸（５−ＡＰｎＡ）；ε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）としてもまた知られる６−アミノヘキサン酸（６−ＡＨｘＡ）；７−アミノヘプタン酸（７−ＡＨｐＡ）；およびｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸（ｔ−ＡＭＣＨＡ）への単離されたクリングルドメインポリペプチドの結合の比較のための条件およびプロトコルについては、例えばＣｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：３２５８−３２７１（１９９８）を参照されたい。
【００３３】
「クリングル４に相同な」クリングルドメインへの言及は、「クリングル１に相同な」という句に関して上で示されたと同様に定義される。すなわち、それらは、上で論考されたところの天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１に類似の機能的特徴を表す。これらのポリペプチドもまた、上述されたとおり、固定されたリシンを結合する。
【００３４】
本発明のポリペプチドは固定されたリシンを結合する。本明細書で使用されるところの「固定されたリシンを結合すること」という句は、そのように特徴づけられるポリペプチドが、クロマトグラフィー媒体としてリシン−セファロースを使用するカラムクロマトグラフィーにかけられる場合に、ミニプラスミノーゲンに関してそれらの進行が遅らされることを意味している。典型的には、本発明のポリペプチドは、特異的リガンド、例えばεＡＣＡを含有する溶液を溶離液として使用して、こうしたクロマトグラフィー媒体（リシンアフィニティー樹脂）から溶出され得る。
【００３５】
さらに、Ｃｈａｎｇら、上記に加え、本発明の範囲内の欠失変異体を生じるための保存的若しくは非保存的置換、欠失若しくは付加によりどの残基が変えられ得るかを決定する
ために、他の参考文献が当業者により調べられ得る。例えば、以下の参考文献は、ωアミノカルボン酸の結合に重要でありうる天然のクリングルドメインの特定の残基に関する情報を提供する：Ｊｉらへの米国特許第６，５３８，１０３号明細書；Ｓｕｚｕｋｉへの米国特許第６，２１８，５１７号明細書；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（１０）：３３０２−１０（２００２）；Ｚａｊｉｃｅｋ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０１（２）：３３３−４７（２０００）；Ｌｅｅ，Ｈ．ら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３７５（２）：３５９−６３（２０００）；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｆ．とＳ．ＭｃＣａｎｃｅ、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．２１２：４６−６０（１９９７）；ＭｃＣａｎｃｅ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：３２４０５−３２４１０（１９９４）；Ｒｅｊａｎｔｅ，Ｍ．Ｒ．とＭ．Ｌｌｉｎａｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２１（３）：９３９−４９（１９９４）；Ｗｕ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、５（２）：１５７−６６（１９９４）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２（４１）：１０９３６−４３（１９９３）；Ｍｅｎｈａｒｔ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：８７９９−８８０６（１９９３）；Ｔｈｅｗｅｓ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５（７）：３９０６−３９１５（１９９０）；Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．、５３（３）：２４３−５２（１９８９）；Ｍｏｔｔａ，Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６（１３）：３８２７−３６（１９８７）；Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７９：２１５−２３２（１９８４）；Ｌｅｒｃｈ，Ｐ．Ｇ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７（１）：７−１３（１９８０）；Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌ．、３：１９１−２０９（１９７８）；およびＷｉｍａｎ，Ｂ．とＤ．Ｃｏｌｌｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２７２、５４９−５４５（１９７８）（全部はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００３６】
本発明者は、（本明細書に記述されるところの固定されたリシンの結合について試験することにより部分的に評価し得る）有利な機能的特徴を有するＮ末端クリングルドメインを有する価値のある単純化されたプラスミ（ノーゲ）ン分子を製造し得ることを認識したため、本発明は、活性化部位に対しＮ末端の他のフィブリン結合ドメイン若しくは領域を包含し得る。例えば、本発明は、プラスミンのセリンプロテアーゼドメインが、限定されるものでないがヒトプラスミノーゲンのクリングル４、ｔＰＡのクリングル２若しくはアポリポタンパク質（ａ）のクリングルを挙げることができる群から選択されるフィブリン結合クリングルに結合されているポリペプチドを包含し得る。さらに、本発明は、プラスミンのセリンプロテアーゼドメインが、ｔＰＡ若しくはフィブロネクチンの「フィンガー」ドメインまたはフィブリン特異的ＩｇＧのＦＡＢフラグメントのようないずれかの他の既知のフィブリン結合モジュールに結合されているポリペプチドを包含し得る。
【００３７】
特定の態様において、δ−プラスミノーゲンのＮ末端クリングルドメインのある位置の残基は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１に関して保存されている。これらはリシン結合に関連する位置の残基であり得、そして、Ｐｒｏ１３６−Ｐｒｏ１４０、Ｐｒｏ１４３−Ｔｙｒ１４６およびＡｒｇ１５３−Ｔｙｒ１５６（図３に示されるとおり番号付けされる位置）を包含する。本発明のδ−プラスミノーゲンのいくつかの態様は、位置１５３にＡｒｇを有し得る。他の態様において、命名される残基の特定の位置は、構造的および機能的に類似の位置（すなわちＮ末端ドメインのクリングル構造に関して；上で論考されたところのＣｈａｎｇ，Ｙ．らを参照されたい）になお存在しつついくぶん変動し得る。いくつかの態様において、δ−プラスミ（ノーゲ）ンポリペプチドのＮ末端クリングル領域は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも最低１残基より大きい、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４との同一性パーセントを有する。
【００３８】
加えて、本発明の特定の態様は、類似のドメイン組成すなわちクリングル−セリンプロテアーゼ（Ｋ−ＳＰ）を有するミニプラスミ（ノーゲ）ンと対照的に、機能的に特徴付け得る（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ、Ｖｏｌ．３、（編：Ｊ．Ｆ．Ｄａｖｉｄｓｏｎら）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９７８）を参照されたい）。好ましい態様において、本発明のδ−プラスミンは、例えば、ミニプラスミンの阻害速度よりも約１若しくは２桁より速いと同じくらいのα２−アンチプラスミンによる阻害の増大された速度を表す。さらに、特定の態様において、δ−プラスミンは固定されたリシン（例えばリシン−セファロース）を結合する。
【００３９】
「Ｎ末端の」としてのδ−プラスミノーゲンのクリングルドメインの特徴付けは、該ドメインが活性化部位に対しＮ末端に存在することのみを意味し、そして、該ドメインそれ自身に対しＮ末端の付加的なアミノ酸残基が存在しないことを意味しない。さらに、プラスミノーゲンのクリングル１に相同なドメインと活性化部位の間に置かれた残基の数および同一性は、本発明の範囲から離れることなく変動させ得る。当業者は、クリングル１の機能および構造に関する指針についての本明細書の開示および本明細書に引用される参考文献に基づき、過度の実験を伴わずに本発明の利益（欠失変異体の大きさの実質的な増大若しくは潜在的に問題の多いグリコシル化部位の導入を伴わないωアミノカルボン酸のクリングル１様の結合）を達成するこれらの変形物を決定することが可能であろう。
【００４０】
従って、本発明は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、該ポリペプチドの組換え製造方法、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ポリペプチドを産生するための発現系、およびこうした発現系を含んでなる培養宿主細胞に関する。
【００４１】
示されたとおり、一局面において、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチド若しくはその保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「保存的」アミノ酸置換の選択に関する指針は下により詳細に提供される。一態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
【００４２】
別の局面において、本発明は、ベクター中に本発明のポリヌクレオチドを挿入することを含んでなるベクターの作成方法に関する。別の局面において、本発明は本発明の方法により製造されるベクターに関する。
【００４３】
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを培養宿主細胞に導入することを含んでなる培養宿主細胞の作成方法に関する。別の局面において、本発明は本発明の方法により製造される培養宿主細胞に関する。
【００４４】
別の局面において、本発明は：（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを培養宿主細胞に導入すること；（ｂ）該宿主細胞を培養すること；および（ｃ）ポリペプチドを回収することを含んでなる方法により製造される、本発明の単離されたポリペプチドに関する。別の局面において、本発明は：（ａ）ベクターが発現される条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；および（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる、ポリペプチドの製造方法に関する。
【００４５】
別の局面において、本発明は本発明の最低１種のポリヌクレオチドを含有する細胞に関する。
【００４６】
一態様において、ポリヌクレオチドは配列番号１に示されるところのヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、ポリペプチドは、配列番号２に示されるところのアミノ酸配列を含んでなる。
【００４７】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、１個若しくはそれ以上のヌクレオチドを巻き込み得る置換、欠失および／若しくは付加を有するバリアントを包含する。バリアントはコーディング領域、非コーディング領域若しくは双方で変えることができる。コーディング領域中の変化は、保存的若しくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を生じ得る。δ−プラスミ（ノーゲ）ンタンパク質若しくはその部分の特性および活性を変えない、サイレント置換、付加および欠失が、これらのうちでとりわけ好ましい。この点に関して、保存的置換（下を参照されたい）もまたとりわけ好ましい。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、（ａ）配列番号２の完全なアミノ酸配列を有するδ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２中のアミノ酸配列を有するδ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｃ）上の（ａ）若しくは（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列に最低９０％同一、およびより好ましくは最低９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる核酸分子を包含する。
【００４９】
δ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも例えば９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、該ポリヌクレオチド配列がδ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５個までの点突然変異を包含し得ることを除き、参照配列に同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に最低９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までを欠失若しくは別のヌクレオチドで置換し得るか、または、参照配列中の全ヌクレオチドの５％までのある数のヌクレオチドを参照配列に挿入し得る。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置に、あるいは、参照配列中のヌクレオチドの間に個別にまたは参照配列内の１個若しくはそれ以上の連続する群中のいずれかに散在して、それらの末端位置の間のどこかに存在し得る。
【００５０】
上で示されたとおり、２種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド配列を、それらの同一性パーセントを決定することにより比較し得る。２種若しくはそれ以上のアミノ酸配列を、同様に、それらの同一性パーセントを決定することにより比較し得る。２配列（核酸であろうとペプチド配列であろうと）の同一性パーセントは、一般に、より短い配列の長さにより除算しかつ１００により乗算した、２種の整列した配列の間の正確な一致の数として記述される。核酸配列の適切なアライメントは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、国立生物医学研究財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、米国ワシントンＤＣにより開発されかつＧｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化されたスコアリングマトリックスを使用して、ペプチド配列での使用に拡張し得る。核酸およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実行は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ウィスコンシン州マディソン）によりそれらのＢＥＳＴＦＩＴユーティリティアプリケーションで提供される。この方法のデフォルトのパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージプログラムマニュアル、バージョン８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソンから入手可能）に記述されている。
【００５１】
もちろん、遺伝暗号の縮重により、当業者は、配列番号１に示される核酸配列の核酸配列に最低９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一な配列を有する多数の核酸分子がδ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードすることができることを即座に認識するであろう。事実、これらのヌクレオチド配列の縮重バリアントは全部同一のポリペプチドをコードするため、これは、本明細書に記述されるいかなる機能アッセイ若しくは測定も実施することさえなく当業者に明らかであろう。縮重バリアントでないこうした核酸分子について、合理的な数もまたδ−プラスミノーゲンポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードすることができることが、当該技術分野でさらに認識されるであろう。これは、タンパク質の機能に有意に影響を及ぼすことがより少なさそうであるか若しくは全くありそうでないかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば１個の脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者が十分に知っているからである。
【００５２】
最近、より長いポリヌクレオチド配列の合成製造の進歩が、伝統的なクローニング技術の使用を伴わずに有意により長いポリペプチドをコードする核酸の合成製造を可能にした。こうしたサービスの商業的提供元はＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．、ワイオミング州ボセル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ）を包含する。Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃにより利用される技術は、米国特許第６，６６４，１１２号；同第６，６２３，９２８号；同第６，６１３，５０８号；同第６，４４４，４２２号；同第６，３１２，８９３号；同第４，６５２，６３９号明細書；米国特許出願公開第２００２０１１９４５６Ａ１号；同第２００２００７７４７１Ａ１号明細書；ならびに公開国際特許出願（公開番号）第ＷＯ０３０５４２３２Ａ３号；同第ＷＯ０１９４３６６Ａ１号；同第ＷＯ９７２７３３１Ａ２号；および同第ＷＯ９９０５３２２Ａ１号（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００５３】
もちろん、分子生物学、微生物学および組換え核酸の伝統的技術もまた、本発明のポリヌクレオチドを製造するのに使用し得る。これらの技術は公知であり、そして、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｅｂｅｌ編、Ｖｏｌ．Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ編（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８４）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒとＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、それぞれＷｕとＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｕ、Ｖｏｌ．１５４および１５５（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に説明されている。
【００５４】
ベクターおよび培養宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を包含するベクター、該組換えベクターで
遺伝子的に工作されている培養宿主細胞、および組換え技術によるδ−プラスミ（ノーゲ）ンポリペプチドの製造にも関する。
【００５５】
組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法および形質転換のような公知の技術を使用して培養宿主細胞に導入し得る。ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルス若しくはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは複製コンピテント若しくは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般に、補完する培養宿主細胞中でのみ起こることができる。
【００５６】
ポリヌクレオチドは、培養宿主中での増殖のための選択可能なマーカーを含有するベクターに結合し得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿のような沈殿物、若しくは荷電した脂質との複合体中で導入する。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してそれをｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングし得、そしてその後培養宿主細胞に形質導入し得る。
【００５７】
目的のポリヌクレオチドに対しｃｉｓ作用性の制御領域を含んでなるベクターが好ましい。適切なｔｒａｎｓ活性化因子は、培養細胞により供給され得るか、補完するベクターにより供給され得るか、若しくは培養宿主中への導入に際してベクターそれ自身により供給され得る。
【００５８】
ある態様においては、この点に関して、ベクターは、誘導可能かつ／若しくは細胞型特異的であり得る特異的発現を提供する。温度および栄養素添加物のような操作するのが容易である環境因子により誘導可能なものが、こうしたベクターのなかでとりわけ好ましい。
【００５９】
本発明で有用な発現ベクターは、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素由来のベクター、バキュロウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、禽痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス、ならびにコスミドおよびファージミドのようなそれらの組合せ由来のベクターを包含する。
【００６０】
ＤＮＡ挿入物は、いくつかを挙げれば、ファージλ ＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスのＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターに効果的に連結すべきである。他の適するプロモーターは当業者に既知であろう。発現構築物は、転写開始、終止の部位、および転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することができる。構築物により発現される成熟転写物のコーディング部分は、好ましくは、最初の翻訳開始部および翻訳されるべきポリペプチドの端に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ若しくはＵＡＧ）を包含することができる。
【００６１】
示されるとおり、発現ベクターは好ましくは最低１個の選択可能なマーカーを包含することができる。こうしたマーカーは、真核生物の細胞培養物のためのジヒドロ葉酸還元酵素若しくはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌での培養のためのテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性遺伝子を包含する。適切な培養宿主の代表的な例は、限定されるものでないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、放線菌類（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞のような細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ属（Ｓｐｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；ならびに植物
細胞を挙げることができる。上述の培養宿主細胞に適切な培地および培養条件は当該技術分野で公知である。
【００６２】
細菌での使用に好ましいベクターには、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシアから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤから入手可能なｐＢＳベクター、ＰＨＡＧＥＳＣＲＩＰＴベクター、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（現在Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を包含する。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬが好ましい真核生物ベクターのひとつである。他の適するベクターは当業者に容易に明らかであろう。
【００６３】
本発明での使用に適する細菌プロモーターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λ ＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターを包含する。適する真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のもののようなレトロウイルスのＬＴＲのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを包含する。
【００６４】
培養宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染若しくは他の方法により遂げることができる。こうした方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９９５）のような多くの標準的実験室手引書に記述されている。
【００６５】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大させ得る。エンハンサーは、所定の培養宿主細胞型中でのプロモーターの転写活性を増大させるように作用する、通常約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのｃｉｓ作用性要素である。エンハンサーの例は、ｂｐ１００ないし２７０の複製起点の後側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイスル初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【００６６】
小胞体の管腔、細胞膜周辺腔若しくは細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のため、適切な分泌シグナルを発現されるポリペプチドに組込み得る。該シグナルは該ポリペプチドに対し内因性であり得るか、若しくはそれらは異種シグナルであり得る。
【００６７】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現させ得、そして分泌シグナルのみならず、しかし付加的な異種機能的領域もまた包含し得る。例えば、培養宿主細胞中、精製の間、若しくはその後の取扱および貯蔵の間の安定性および難分解性を向上させるために、付加的なアミノ酸、とりわけ荷電したアミノ酸の一領域をポリペプチドのＮ末端に付加し得る。また、精製を容易にするためにペプチド部分をポリペプチドに付加し得る。こうした領域はポリペプチドの最終精製前に除去し得る。とりわけ、分泌若しくは排出を発生させるため、安定性を向上させるため、および精製を容易にするためのポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該技術分野で馴染みがありかつ慣例の技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するのに有用である免疫グロブリンからの異種領域を含んでなる。例えば、第ＥＰ ０ ４６４ ５３３ Ａ１号（カナダの対照物第２，０４５，８６９号）は、別のヒトタンパク質若しくはその部分と一緒になって免疫グロブリン分子の定常領域の多様な部分を含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は治療および診断での使用のため全面的に有利であり、そして、従って、例えば改良された薬物動態特性をもたらす。他方、いくつかの用途について、融合タンパク質を記述された有利な様式で発現、検出かつ精製した後にＦｃ部分を欠失させることが可能であることが望ましいとみられる。これは、Ｆｃ部分が治療および診断で使用するための妨害であることが判明している場合、例えば免疫化のための抗原として該融合タンパク質を使用するはずである場合に真実である。例えば薬物発見において、ハイスループットスクリーニングアッセイの目的上、ヒトタンパク質がＦｃ部分と融合された（ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのｈＩＬ５受容体のような）。Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、８：５２−５８（１９９５）およびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照されたい。
【００６８】
δ−プラスミノーゲンタンパク質は、本明細書の実施例にとりわけ記述されるものを包含する公知の方法により組換え細胞培養物から回収かつ精製し得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、化学合成処置の生成物、ならびに例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を包含する原核生物若しくは真核生物の培養宿主から組換え技術により製造された生成物を包含する。加えて、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合には宿主媒介性の過程の結果として、最初の修飾メチオニン残基も包含し得る。
【００６９】
ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの変形物および特定の例をコードするものを包含する。例えば、表現型上サイレントのアミノ酸置換の作成方法に関する指針はＢｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで著者はタンパク質が驚くべきことにアミノ酸置換に寛容であることを示している。本発明の範囲内のいかなる数の置換もこうした一般的原則の応用により得ることができるとは言え、置換に関する特定の指針について、クリングル１ドメインの構造および機能に関する本明細書で引用される参考文献が当業者により調べられ得る。
【００７０】
使用される基準に依存して、δ−プラスミノーゲンポリペプチドのクリングル１、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインの正確な「位置」は、本発明の範囲内の特定の変形物でわずかに異なり得ることが、さらに認識されるであろう。例えば、活性化部位に関するクリングル１ドメインの正確な場所はわずかに変動し得、かつ／若しくは、クリングル１ドメインに対しＮ末端の配列は長さが変動し得る。従って、本発明は、本明細書に開示されるところのδ−プラスミノーゲンポリペプチド活性を表すδ−プラスミノーゲンポリペプチドのこうした変形物を包含する。こうしたバリアントは欠失、挿入、反転、反復および置換を包含する。上に示されるとおり、どのアミノ酸変化が表現的にサイレントであることがありそうであるかに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出し得る。
【００７１】
従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体若しくはアナログは、（ｉ）アミノ酸残基の１個若しくはそれ以上（例えば３、５、８、１０、１５若しくは２０）が保存された若しくは保存されないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されているもの。こうした置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされるものであっても若しくはなくてもよい。あるいは、（ｉｉ）アミノ酸残基の１個若しくはそれ以上が置換基を包含する（例えば３、５、８、１０、１５若しくは２０）もの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増大させるための化合物（例えばポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド若しくはリーダーすなわち分泌配列、または成熟ポリペプチド若しくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列のような付加的なアミノ酸が、成熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。こうしたフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると思われる。
【００７２】
示されるとおり、変化は、好ましくは、タンパク質のフォールディング若しくは活性に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換のような軽度のものである。もちろん、当業者が行いうるアミノ酸置換の数は、上述されたものを包含する多くの因子に依存する。一般的に言って、いずれかの所定のδ−プラスミノーゲンポリペプチドの置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５若しくは３を超えないことができる。
【００７３】
機能に不可欠である本発明のδ−プラスミノーゲンポリペプチド中のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発若しくはアラニン走査突然変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような当該技術分野で既知の方法により同定し得る。後者の処置は分子中のすべての残基に単一のアラニン突然変異を導入する。生じる変異体分子をその後、例えば本明細書に提供される実施例で示されるとおり、生物学的活性について試験する。リガンド結合に決定的に重要である部位は、結晶化、核磁気共鳴若しくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：３９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））のような構造分析によってもまた決定し得る。タンパク質のＮ末端からの１個若しくはそれ以上のアミノ酸の欠失が該タンパク質の１種若しくはそれ以上の生物学的機能の改変若しくは喪失をもたらす場合であっても、他の生物学的活性はなお保持され得る。
【００７４】
本発明の「単離されたポリペプチド」の製造で有用なポリペプチドを固相合成法により製造し得ることもまた企図している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；およびＨｏｕｇｈｔｅｎらへの米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）を参照されたい。
【００７５】
本発明のポリペプチドは単離された形態で提供され得る。「単離されたポリペプチド」により、その天然の環境から取り出されたポリペプチドを意図している。従って、組換え培養宿主細胞内で産生かつ／若しくは含有されるポリペプチドは、本発明の目的上単離されたとみなされる。組換え培養宿主から部分的に若しくは本質的に精製されたポリペプチドもまた「単離されたポリペプチド」として意図している。
【００７６】
δ−プラスミノーゲンポリペプチドの参照アミノ酸配列に対する示される同一性パーセントのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリヌクレオチドに関して上に示されたコンピュータ支援の方法を包含する方法を使用して決定し得る。前述の論考でヌクレオチド配列がまさにそうであるように、ポリペプチドのアミノ酸配列を検査かつ比較する。当業者は、ポリヌクレオチドについて論考された分子の終点としてのこうした概念が、ポリペプチド分析のためのこうした方法およびプログラムの対応する使用を考慮する場合に直接のアナログを有することができることを認識するであろう。例えば、ポリヌクレオチドに関して論考された人的補正は核酸の５’および３’の終点を指すが、しかし、同一の論考はポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に応用可能と認識されるであろう。
【００７７】
本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子若しくは他の細胞リガンドへの結合などにより翻訳の間若しくは後に示差的に修飾されるδ−プラスミノーゲンポリペプチドを包含する。多数の化学修飾のいずれも、限定されるものでないが臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝的合成；などを挙げることができる既知技術により実施し得る。
【００７８】
本発明により包含される付加的な翻訳後修飾は、例えば、原核生物培養宿主細胞中でのδ−プラスミノーゲンポリペプチドの発現に適合されたベクターおよび構築物の結果としての、例えばＮ−結合若しくはＯ−結合した炭水化物鎖、Ｎ末端若しくはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸バックボーンへの化学的部分の結合、Ｎ−結合若しくはＯ−結合した炭水化物鎖の化学修飾、およびＮ末端メチオニン残基の付加を包含する。該ポリペプチドは、該タンパク質の検出および単位を見込むための酵素、蛍光、同位体若しくはアフィニティー標識のような検出可能な標識でもまた修飾し得る。
【００７９】
製薬学的組成物および処置方法
δ−プラスミ（ノーゲ）ンは、米国第２００３／００１２７７８ Ａ１号明細書；およびＮｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１（５）：１０３４−４１（２００３）（双方は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される方法および組成物に従って、治療的使用のため処方し得る。例えば、低ｐＨ（約２．５から約４まで）、低緩衝能力の緩衝液をδ−プラスミンの製剤に使用し得る。加えて、プラスミン、ミニプラスミンおよび／若しくはマイクロプラスミンで実施されるところの当業者に既知の他の方法および処方を使用して、本発明のδ−プラスミンを治療的投与のため処方し得る。
【００８０】
δ−プラスミ（ノーゲ）ンを使用して、例えば、米国特許第６，３５５，２４３号；および公開米国特許出願第２００３／００２６７９８ Ａ１号；同第２００３／０１７５２６４ Ａ１号明細書（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところの方法に従って、多様な血栓症若しくは状態を処置し得る。再度、δ−プラスミンに応用可能な、可能な製薬学的製剤でのように、δ−プラスミンは、当該技術分野で既知の方法、例えばプラスミン、ミニプラスミンおよび／若しくはマイクロプラスミンで現在実施されうるものにより治療的にもまた投与し得る。
【実施例】
【００８１】
発現ベクターの設計
δ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列番号２に示す。δ−プラスミノーゲンをコードする推定の配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現およびｍＲＮＡの安定性のためコドンを最適化して、配列番号１に示されるところのＤＮＡ配列を生じた。
【００８２】
このＤＮＡを化学合成し（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．）、そして細胞質タンパク質を産生させるため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ；ウィスコンシン州マディソン）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。この構築物は、付加的な非天然のＮ末端メチオニンを伴うδ−プラスミノーゲンを産生する。（ｐＥＴ−２２ｂ（＋）＝ｐＥＴ発現系２２ｂ（カタログ番号７０７６５）、ＥＭＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｇｅｎ銘柄、ウィスコンシン州マディソン；ベクターに関する詳細については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍのｐＥＴ−２２ｂに関する製品情報の節を参照されたい）。
【００８３】
δ−プラスミノーゲンの発現および精製
δ−プラスミノーゲン配列をコードするＤＮＡを多様な細胞に形質転換し、そして、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による誘導後のタンパク質の過剰発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ａｒｇ、ＩｌｅおよびＬｅｕをコードする希な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡを発現するよう工作した細胞型ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）細胞を、δ−プラスミノーゲンの産生に使用した。
【００８４】
δ−プラスミノーゲンの産生を大スケール発現で確認し、ここで細胞を溶解しかつ可溶性タンパク質および精製した封入体双方をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞は、有意のδ−プラスミノーゲンタンパク質を封入体の形態で産生した。発現の推定量は５０〜８０ｍｇ／Ｌ細胞培養物であった。
【００８５】
以下の典型的なプロトコルをδ−プラスミノーゲンの発現に使用した：
δ−プラスミノーゲンベクターを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞の単一コロニーを使用して、５ｍｌのＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）に接種し、そして振とう機上３７℃で８時間インキュベートした。その後、５０μｌのアリコートを、新鮮培地中でのさらなる増殖のため、培養細菌懸濁液から採取した。該処置を、６ｍｌの細菌培養物および２５０ｍｌの培地を用いて１６時間後に反復した。培養物を振とうしながら３７℃で約１．０のＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、そしてＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加した。培養物を追加の５時間増殖させた。細胞を５，０００×ｇでの遠心分離により収集し、そして細胞ペレットを２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭトリス ｐＨ８．０に溶解しかつ−８０℃で凍結させた。
【００８６】
δ−プラスミノーゲンを精製するため、細胞ペレットを融解し、そして溶液の容量が元の細胞培養物の容量のおよそ１／２０の容量になるまで緩衝液を添加した。その後、リゾチームを０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、そして細胞を４℃で１０〜１５分間急速に攪拌した。その後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１％の最終濃度まで添加し、そして攪拌を別の１０分間継続した。ＤＮアーゼＩ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）およびＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）を添加し、そして、溶液がもはや粘性でなくなるまで攪拌を４℃で３０分間継続した。最終的な溶液を１５，０００×ｇで４℃で３０分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。
【００８７】
細胞ペレットを、洗浄溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および０．５Ｍ尿素を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、そして最終的なペレットを４０ｍｌの抽出緩衝液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解しかつ４℃で一夜保存した。１６時間後に溶液を１５，０００×ｇで３０分間遠心分離して固形物を除去し、そして上清を４℃で攪拌しつつ再フォールディング溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３．５ＭグアニジンＨＣｌ、０．５ＭアルギニンＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＧＳＨ、０．３ｍＭ ＧＳＳＧ）にゆっくりと添加した。再フォールディング処置は０．０３ｍｇ／ｍｌ若しくはそれ未満のタンパク質濃度で実施した。
【００８８】
再フォールディング溶液を４℃で２日間乱されないまま保ち、そしてその後、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍアルギニン−ＨＣｌを含有する８倍容量の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０に対し、緩衝溶液の頻繁な交換を伴い８〜１０時間にわたり透析した。
【００８９】
タンパク質溶液をその後透析から取り出し、そして１０ｋＤａのメンブレンカットオフ
を伴うＡＭＩＣＯＮフィルターを使用しておよそ１０〜２０ｍｌに濃縮し、そして１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１００倍容量の０．１Ｍトリス ｐＨ８．０に対し一夜透析した。この物質を遠心分離して微粒子を除去し、その後リシンアフィニティー樹脂（リシン−セファロース４Ｂ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を通過させた。δ−プラスミノーゲンは、０．２Ｍのε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）を含有するトリス緩衝生理的食塩水、ｐＨ８．０を使用して樹脂から溶出した。
【００９０】
典型的には、８０ｍｇの封入体を１リットルの細胞培養物から単離し得、また、４０ｍｇをリシン−セファロースクロマトグラフィー段階で溶出し得た。
【００９１】
δ−プラスミノーゲンの特性
精製したδ−プラスミノーゲンは、還元（ジチオスレイトール処理）および非還元タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３５〜４０ｋＤａの領域の単一バンドとして出現した（図５を参照されたい）。ＭＡＬＤＩ質量分析により測定されたその正確な分子量は、３７，１９８Ｄａという期待された値に非常に近い３７，０８９Ｄａであった。
【００９２】
δ−プラスミノーゲン（ΔＰｇ）がδ−プラスミンに活性化され得たかどうかを試験するために、δ−プラスミノーゲンをウロキナーゼ（１：１０００のモル比）とともにインキュベートし、そして、セリンプロテアーゼ活性の増大を、Ｓ−２２５１の加水分解の速度の増大を測定することによりモニターした（Ｓ−２２５１＝Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド、ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、オハイオ州ウエストチェスター）。図６に見られるとおり、結合された活性化反応に典型的な活性の放物線状の増大（酵素前駆体が活性の酵素に転化され（１）；そして酵素が色素生産性の基質を切断する（２））が観察される。δ−プラスミノーゲンのδ−プラスミンへの活性化は、これらの条件下で３分以内に完了した。非常に類似の結果が、ｔＰＡおよびストレプトキナーゼで得られた。
【００９３】
δ−プラスミノーゲンのウロキナーゼ活性化のキネティクスを、Ｗｈｏｌらの方法（Ｗｈｏｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｌ．，Ａｒｚａｄｏｎ，Ｌ．とＲｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１４０２−１４０７（１９７８）（引用することにより完全に組み込まれる））を使用して、完全長のプラスミノーゲンのものと比較した。この目的上、５．８ｎＭのウロキナーゼを、３７℃、ｐＨ７．５で１ｍＭのＳ−２２５１基質の存在下に多様な濃度のプラスミン種を含有する溶液に添加した。４０５ｎｍでの吸光度の増大をモニターし、そしてＳ−２２５１の生成物の形成の加速的速度を、放物型方程式（式中、速度＝ｋ・ｔ２）を使用して計算した。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ解析を使用して、データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎのキネティクスモデルに当てはめて、下の値をもたらした：
【００９４】
【表１】
【００９５】
完全長のプラスミノーゲンは、文献中で見出される値（１．７μＭ；Ｗｏｈｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｌ．とＲｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５５（５）：２００５−２０１３（１９８０））に類似のＫｍ値、および同等のｋｃａｔ値を伴い、ウロキナーゼにより十分に活性化された。
【００９６】
δ−プラスミノーゲンのウロキナーゼ活性化のＫｍ値は、プラスミノーゲンについてよりもおよそ３０倍より高く、おそらく、プラスミノーゲンのこの変異体に対するウロキナーゼのより低い親和性を示す。同時に、δ−プラスミノーゲンの活性化のｋｃａｔ値はプラスミノーゲンについてよりはるかにより高かった。ｋｃａｔおよびＫｍの前述の差違にもかかわらず、それらの比すなわち触媒効率は、ウロキナーゼによる天然および組換えで改変されたプラスミノーゲン種の活性化についてほぼ同一である。従って、これらのデータは、「外来の」クリングル１の存在が、δ−プラスミノーゲン中のセリンプロテアーゼドメインの活性化特性に大きく影響を及ぼさないことを示す。
【００９７】
なお別の活性化実験において、δ−プラスミノーゲンをストレプトキナーゼ、ｔＰＡおよびウロキナーゼとともにインキュベートし、そして二本鎖δ−プラスミン中の一本鎖δ−プラスミノーゲン分子の転化を観察するために還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図５、レーン３−５を参照されたい）。全３つの場合で、δ−プラスミンの二本の鎖（約１２ｋＤａのクリングル１および約２５ｋＤａのセリンプロテアーゼ鎖）を見ることができ、δ−プラスミノーゲンが実際に全３種のプラスミノーゲン活性化物質により活性化され得ることを示唆した。
【００９８】
期待されたとおり、δ−プラスミノーゲンはクリングル１を介してリシン−セファロースに結合し、そしてεＡＣＡの勾配によりカラムから単一ピークとして溶出され得た（図７を参照されたい）。再フォールディングされたδ−プラスミノーゲンのリシン−セファロースに結合する能力は、該分子のクリングルドメインが適正にフォールディングされ、また、リシン結合部位が完全に活性であることを示す。
【００９９】
クリングル１の機能性をさらに確認するため、δ−プラスミノーゲンへのεＡＣＡの結合を、Ｍａｔｓｕｋａら（Ｍａｔｓｕｋａ，Ｙ．Ｖ．，Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．Ｖ．とＫｕｄｉｎｏｖ、Ｓ．Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９０：９３−９７（１９９０））およびＤｏｕｇｌａｓら（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．，ｖｏｎ Ｈａｌｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｌｌｉｎａｓ，Ｍ．とＳｃｈａｌｌｅｒ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３３０２−３３１０（２００２））（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されたとおり、タンパク質の蛍光の関連した変化をモニターすることにより測定した。δ−プラスミノーゲンのクリングル１へのεＡＣＡの結合は、ありそうにはリシン結合部位の一部であるトリプトファン残基の消光により、蛍光の減少をもたらす。
【０１００】
この過程をモニターするため、εＡＣＡの濃縮した溶液の４μｌないし１６μｌのアリコートを、２０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、２５℃中５μＭのδ−プラスミノーゲン２ｍｌに添加した。蛍光は、ＦＬＵＯＲＯＭＡＸ蛍光分光光度計（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州エディソン）にて２９８ｎｍの励起波長および３４０ｎｍの測定波長でモニターし；εＡＣＡの各添加後に、蛍光のさらなる変化が観察されなくなるまで溶液を平衡化させた。
【０１０１】
生じる蛍光の値を希釈について補正し、そして０〜５０μＭのεＡＣＡの範囲にわたりεＡＣＡの濃度に対しプロットした。データを非直線回帰により当てはめて、３．２μＭ（Ｍａｔｓｕｋａら）および１３μＭ（Ｄｏｕｇｌａｓら）というεＡＣＡのクリングル１親和性の文献値と良好に一致する１１．１±２．３μＭというＫｄを得た。
【０１０２】
プラスミンの一特性はフィブリンを結合するその能力である。δ−プラスミノーゲンが
フィブリンと相互作用する能力を保持するかどうかを決定するため、δ−プラスミノーゲンのフィブリンへの結合をｔＰＡによるそのその後の活性化および生じる血餅溶解により評価したマイクロタイタープレートアッセイで、そのフィブリン結合特性を試験した。この目的上、１００μｌの５ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを、マイクロタイタープレートの各ウェル中でトロンビンと重合させた。多様な濃度のδ−プラスミノーゲンをフィブリン塊の上面に添加しかつ３７℃で１時間インキュベートした。フィブリン塊が未だ無傷でありかつウェルに付着していた間に、プレートをＰＢＳで徹底的に洗浄した。洗浄後、ｔＰＡの０．１〜ｍｇ／ｍｌ溶液を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。結果として塊のいくつかが完全に溶解され、そしていくつかは部分的に溶解された一方、非常に少量のδ−プラスミノーゲンを含むウェルおよび対照ウェルは事実上無傷のままであった。線維素溶解の程度を、１Ｍ ＮａＯＨ中で再構成した最初の塊の残部の２８０ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。吸光度の値を、δ−プラスミノーゲン濃度の関数としてプロットした。
【０１０３】
図８に見られるとおり、δ−プラスミノーゲンのフィブリンへの結合は古典的なＳ字状結合曲線に従う。このアッセイを使用して、δ−プラスミノーゲンが完全長のプラスミノーゲンの親和性に匹敵する親和性でフィブリンを結合し、またこの相互作用のＣ５０（約０．２μＭ）が完全長のプラスミノーゲンのフィブリン結合のＫｄに匹敵することが見出された（Ｌｕｃａｓ，Ｍ．Ａ．，Ｆｒｅｔｔｏ，Ｌ．Ｊ．とＭｃＫｅｅ，Ｐ．Ａ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（７）：４２４９−４２５６（１９８３））。これらの実験は、δ−プラスミノーゲンがフィブリンを結合し得ることを示す。
【０１０４】
従って、δ−プラスミノーゲンのリシン−セファロースとの相互作用、期待されるＫｄでεＡＣＡを結合するその能力、フィブリンを結合するその能力、全部の主要なプラスミノーゲン活性化物質により活性化されるその能力、および色素産生性のプラスミン基質Ｓ−２２５１に対するδ−プラスミンの効力は、全部、この分子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系中で完全に機能的な形態で産生されたことを示した。
【０１０５】
δ−プラスミンの精製および製剤
１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０に対し透析したδ−プラスミノーゲンを、本質的にプラスミンについて以前に記述された（Ｍａｒｄｅｒ，Ｖ．Ｊ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．、８６（３）：７３９−４５（２００１）（引用することにより組み込まれる））とおり、セファロース４Ｂに固定したウロキナーゼを使用して、δ−プラスミンに活性化した。活性化は室温で起こり、そしてＳ−２２５１の活性の増大によりリアルタイムでモニターした。バッチごとに変動した（典型的には１〜２ｍｇ／ｍｌ）δ−プラスミノーゲンの量に依存して、インキュベーション時間は３０〜６０分であった。Ｓ−２２５１の活性がプラトーに達した活性化の完了に際して、ウロキナーゼ−セファロースを濾過し、そして活性のδ−プラスミンをベンズアミジン−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に捕捉した。δ−プラスミンは、低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン、ｐＨ３．０、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ εＡＣＡ）を使用して樹脂から溶出した。
【０１０６】
溶出画分中のタンパク質濃度およびＳ−２２５１の活性を測定した。高特異的活性画分をプールし、そして０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ３．６の複数回の交換に対し４℃で透析した。非還元のδ−プラスミンサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図９、レーン３を参照されたい）は、この物質の純度が通常９５％以上であることを示す。還元条件下（図９、レーン４）で、セリンプロテアーゼおよびクリングル鎖のほかに、クリングルのバンドの上および下に２本の淡いバンドが存在する。これらのバンドは、そのポリペプチド鎖の内的切断から生じるセリンプロテアーゼドメインの自己分解生成物を表し；それらは通常ジスルフィド結合により一緒に保持されるが、しかし還元条件下でのＰＡＧＥで見えるよう
になる。典型的には１０％を超えなかった自己分解生成物の量は、ベンズアミジン−セファロース精製段階をカラム形式の代わりにバッチ様式で実施することにより大きく低下された。
【０１０７】
δ−プラスミンは完全長のプラスミンと同様に生理学的ｐＨで自己分解する傾向があるため、最終製剤にｐＨ３．６を選んだ（酢酸−生理的食塩水で酸性化する）。プラスミンについて以前に示され（Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．、１（５）：１０３４−４１（２００３）（引用することにより組み込まれる））かつδ−プラスミンを用いる実験で確認されたとおり、この低緩衝能力の低ｐＨ製剤は、長時間の活性のプラスミンの安全な貯蔵を可能にするのみならず、しかしまたこれらの直接血栓溶解薬の非経口投与とも適合性である。血漿若しくは中性のｐＨ緩衝液と混合される場合に、δ−プラスミンは迅速に再活性化される。
【０１０８】
δ−プラスミンの酵素特性
δ−プラスミンのアミド分解活性を、プラスミン基質Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２５１）（ＤｉａＰｈａｒｍａ、オハイオ州ウエストチェスター）を使用して検査した。ＰＢＳ緩衝液中ｐＨ７．４、２５℃で、Ｓ−２２５１のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数（Ｋｍ）は１３８μＭであることが見出された（表２）。該製剤のｋｃａｔは５１０ｍｉｎ−１であることが見出された。４−グアニジノ安息香酸４−ニトロフェニル塩酸塩（ｐＮＰＧＢ）滴定（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．とＥ．Ｓｈａｗ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７：２０−２７（１９７０））を使用して、機能的活性部位のパーセントは６７％であることが見出された。活性部位のパーセントについてｋｃａｔを補正して、７５５±４５ｍｉｎ−１のｋｃａｔを決定した。この値は、完全長のプラスミンについて（７６０±２３ｍｉｎ−１）およびマイクロプラスミン（全５個のクリングルを欠く）について（７９５±２４ｍｉｎ−１）同一アッセイで決定された値に非常に近かった（図９を参照されたい）。これらのデータは、クリングルの存在若しくは非存在が、セリンプロテアーゼドメインの触媒活性に影響を及ぼさないことを示す。
【０１０９】
α２−マクログロブリンによるδ−プラスミンの阻害速度を、Ａｎｏｎｉｃｋらの方法（Ａｎｏｎｉｃｋ，Ｐ．ら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９−４６２（１９９０））を使用して測定した。阻害速度は、ＰＢＳ緩衝液中２２℃で７．６±０．６×１０５Ｍ−１ｓ−１であることが見出された。
【０１１０】
α２−アンチプラスミンによるδ−プラスミンの阻害速度は、プラスミンおよびα２−アンチプラスミンを混合し、その後特定の時間点でＳ−２２５１の活性についてアッセイするＷｉｍａｎとＣｏｌｌｅｎの方法（Ｗｉｍａｎ，Ｂ．とＤ．Ｃｏｌｌｅｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４：５７３−５７８（１９７８））を使用して、１．１×１０７Ｍ−１ｓ−１であることが決定された（表３）。この値は、２．５×１０７Ｍ−１ｓ−１（Ａｎｏｎｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９（１９９０）から）というプラスミンの報告値に匹敵する。
【０１１１】
マイクロプラスミンを用いて実施した同一の実験は、２回の別個の実験で１．８×１０５Ｍ−１ｓ−１および３．１×１０５Ｍ−１ｓ−１というα２−アンチプラスミン阻害速度を示した。ミニプラスミンのα２−アンチプラスミン阻害の速度（ミニプラスミンドメイン組成物、Ｋ５−ＳＰ）は２．４×１０５Ｍ−１ｓ−１であることが決定された。これらのデータは、マイクロおよびミニプラスミンの文献値と合理的に一致し、そして、α２−アンチプラスミンによるδ−プラスミンの阻害がマイクロプラスミン若しくはミニプラスミンいずれかの阻害より４０倍より速いことを示す。従って、これらの結果は、δ−プラスミンが、その構造中のクリングル１の存在によりα２−アンチプラスミンにより迅速に阻害されるはずであることを示す。
【０１１２】
全体として、この節に提示されるデータは、δ−プラスミンの酵素および阻害特性が完全長のプラスミンに類似であることを示す。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
文献値はＡｎｏｎｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９（１９９０）から採用している。全部の速度はＡｎｏｎｉｃｋらに発表された方法に従って測定した。
【０１１６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ血栓溶解効率
δ−プラスミンの血栓溶解効率を、以下の実験プロトコルを使用して、カテーテル補助（ｃａｔｈｅｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）血栓溶解のｉｎ ｖｉｔｒｏモデル（Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．、１（５）：１０３４−４１（２００３）（引用することにより組み込まれる））で試験した。
【０１１７】
新鮮なヒト全血を２０×０．９５ｃｍガラスチューブに収集し、そして添加物を用いずに自発的に凝固させた。チューブを３７℃で２０時間インキュベートして完全な収縮を可能にした。収縮した凝血塊を、１４メッシュを伴う米国標準試験篩を使用して血清から分離し、そしてそれらの重量を測定した。血餅を、収縮させた凝血塊がきつく嵌るより小さい直径のガラスチューブ（０．８×７ｃｍ）に移した。凝血塊の平均重量は約３．６ｇであった。
【０１１８】
単一の１ｍｌ用量の酸性化した生理的食塩水、プラスミン若しくはδ−プラスミンを、シリンジを使用して凝血塊に注入した。凝血塊をＴＨＥＬＣＯ実験室オーブン（Ｊｏｕａｎ，Ｉｎｃ．、バージニア州ウィンチェスター）中３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に凝血塊を再度篩の上に置いて液化した物質を除去し、そして消化された凝血塊の重量を測定した。凝血塊の溶解の程度を最初の凝血塊重量と残余の凝血塊の重量の間の差違から決定し、そして凝血塊重量の減少のパーセントとして表した。
【０１１９】
図１０は、このモデルでのδ−プラスミンを用いた溶解実験の結果を示す。単一の０．４４ｍｇ（モル濃度に基づき１ｍｇ／ｍｌのプラスミンに同等）用量のδ−プラスミンの注入は、６０分以内に３６％の凝血塊重量の減少をもたらした。同時に、生理的食塩水を注入した凝血塊の重量は４％のみ減少した。プラスミン（１．０ｍｇ）は、同一の時間で５０％の凝血塊重量の減少をもたらした。従って、これらのデータは、δ−プラスミンが血栓溶解効力を表し、そして直接血栓溶解剤として使用され得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】タンパク質分解的切断による活性化後の天然のプラスミンの図解である。Ｋ１−Ｋ５はクリングル領域１−５であり；また、ＳＰはセリンプロテアーゼドメインである。「α２−ＡＰ」は、クリングル１のα２−アンチプラスミン結合部位である。
【図２】図１中と同一の命名法を使用しかつＫ２−５の欠失を示す、本発明のプラスミノーゲン欠失変異体の図解である。
【図３】−１９ないし−１として番号付けされた１９残基のリーダー配列、および残基１−７９１として示されるプラスミノーゲン配列を示す、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す（図３に示されるところの配列番号３（ヒトプラスミノーゲンのｃＤＮＡ配列；および配列番号４、コードされるアミノ酸配列を参照されたい）。以下、すなわちδ−プラスミノーゲン配列（影付）；クリングルドメイン１−５（二重下線）；グリコシル化部位Ａｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６（太字で）；プラスミノーゲン活性化のＡｒｇ−Ｖａｌ活性化部位（太字で）；ならびにクリングル１中のリシン結合部位（下線および特別の位置の番号付けで）を包含する多数の特徴を示す。
【図４】天然のヒトプラスミ（ノーゲ）ンの５個のクリングルドメイン（１−５）間のポリペプチド配列の比較を示す。クリングル１中の同一の相対位置のものに同一であるアミノ酸残基を下線で示す。
【図５】非還元（レーン１）および還元（レーン２）δ−プラスミノーゲン調製物の８−２５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ストレプトキナーゼ（レーン３）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）（レーン４）およびウロキナーゼ（レーン５）でのδ−プラスミノーゲンのδ−プラスミンへの活性化は、２個のジスルフィド架橋により結合されたクリングル１（Ｋ１）およびセリンプロテアーゼドメイン（ＳＰ）よりなる二本鎖分子の形成をもたらす。
【図６】ウロキナーゼによるδ−プラスミノーゲンの活性化の図解である。ウロキナーゼ（５．８ｎＭ）を、１．０ｍＭのＳ−２２５１を含有するＰＢＳ中５μＭのδ−プラスミノーゲンの溶液に３７℃で添加した。吸光度の増大を４０５ｎｍでモニターした。
【図７】リシン−セファロース４Ｂへのδ−プラスミノーゲンの結合を示すクロマトグラムである。すなわち、０．５ｍｇの精製したδ−プラスミノーゲンを、トリス緩衝生理的食塩水、ｐＨ７．４で平衡化したリシン−セファロース４Ｂカラム（１×３ｃｍ）に適用した。結合したタンパク質は、ε−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）の０〜２０ｍＭ勾配により単一ピークとしてカラムから溶出された。２８０ｎｍの吸光度、および溶出液容量の関数としてのε−ＡＣＡの濃度をグラフ上に提示する。
【図８】δ−プラスミノーゲンのフィブリンへの結合を示す。変動する濃度のδ−プラスミノーゲンを、マイクロタイタープレート中でフィブリン塊とともに３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に塊をＰＢＳで徹底的に洗浄し、そしてｔＰＡの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液を各ウェルに添加した。３７℃での２時間インキュベーション後に液体を除去し、そして残存する固体の塊を１００μｌの１Ｍ ＮａＯＨで再構成した。残存するフィブリンの量を、これらの再構成した塊の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。フィブリンへのδ−プラスミノーゲンの結合の結果である線維素溶解の程度を、δ−プラスミノーゲン濃度の関数としてグラフにプロットした（実線）。点線は、結合方程式への実験データの最良適合を表す。
【図９】非還元（レーン１）および還元条件（レーン２）下の出発δ−プラスミノーゲン、ならびにまた非還元（レーン３）および還元（レーン４）条件下の最終的なδ−プラスミン調製物の８−２５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１０】酵素活性の対応する特徴付け（基質Ｓ−２２５１（Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド、ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、オハイオ州ウエストチェスター）に関するｋｃａｔおよびＫＭ）と一緒になったプラスミン、ミニプラスミン、マイクロプラスミンおよびδ−プラスミンの図解を示す。
【図１１】収縮全血塊のδ−プラスミン誘発性の溶解の図解である。各凝血塊（０．８×７ｃｍ）に１ｍｌ容量のベヒクル（酸性化した生理的食塩水、ｐＨ３．６）、プラスミン（１．０ｍｇ／ｍｌ）若しくはδ−プラスミン（０．４４ｍｇ／ｍｌ）を注入し、そして凝血塊の溶解を３７℃で１時間進行させた。
【背景技術】
【０００１】
ヒトプラスミノーゲンは、７９１アミノ酸残基を含有する一本鎖タンパク質である。プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化は、酵素前駆体中のＡｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２ペプチド結合の単一切断から生じる。生じるプラスミン分子は、トリプシン様の特異性（ＬｙｓおよびＡｒｇの後で切断する）をもつ二本鎖のジスルフィド結合したセリンプロテアーゼである。
【０００２】
プラスミンのアミノ末端のＨ鎖（残基１−５６１、約６０ｋＤａ）は、それぞれおよそ８０アミノ酸残基を含有する５個のクリングルドメインから構成される。クリングルドメインは、活性化阻害剤例えばＣｌ−１イオン；活性化刺激物質例えばε−アミノカプロン酸；哺乳動物および細菌細胞；ならびにプラスミンの生理学的基質フィブリンおよびプラスミン阻害剤α２−アンチプラスミンのような他のタンパク質との相互作用のようなプラスミノーゲンの調節特性を司る。全５個のクリングルのうち、クリングル１は最も多機能のものの１つであり、すなわち、そのリシン結合活性は、α２−アンチプラスミンおよびフィブリンとのプラスミンの相互作用を司ることが示されている。非特許文献１；および非特許文献２を参照されたい。
【０００３】
プラスミンのＣ末端Ｌ鎖（残基５６２−７９１、約２５ｋＤａ）は、トリプシンに相同かつ古典的セリンプロテアーゼの触媒性三つ組残基すなわちＨｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６およびＳｅｒ７４１を含有する典型的なセリンプロテアーゼである。プラスミノーゲンは、２４個のジスルフィド架橋、ならびにＡｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６の２個のグリコシル化部位を含有する。
【０００４】
エラスターゼによるプラスミノーゲンの制限タンパク質分解が３フラグメントをもたらすことが示されている（非特許文献３）。第一のフラグメントＫ１−３は最初の３クリングルを包含し、そして２バージョンすなわちＴｙｒ７９−Ｖａｌ３３８およびＴｙｒ７９−Ｖａｌ３５４で単離され得る。第二のフラグメントＫ４は第四のクリングルに対応し、そして残基Ｖａｌ３５５−Ａｓｎ４４０を包含する。最後のＣ末端フラグメント（いわゆるミニプラスミノーゲン）は残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１を包含し、そして第五のクリングルおよびセリンプロテアーゼドメインよりなる。ミニプラスミノーゲンはプラスミノーゲンと同一の方法で活性化されてミニプラスミンを形成し得る。
【０００５】
完全長のプラスミノーゲン分子の複雑な構造のため、細菌発現系は組換えプラスミノーゲン産生に有用と判明していない。プラスミノーゲンは不溶性の封入体の形態で産生され、そしてその状態から再フォールディング可能でない。さらに、哺乳動物細胞中でのプラスミノーゲンの発現は、プラスミノーゲンのプラスミンへの細胞内活性化および生じる細胞傷害性により複雑にされる。昆虫細胞を使用する完全に活性なプラスミノーゲンの産生は可能であるが、しかしながらこの系は低収量により大スケール製造に適さない。
【０００６】
従って、ある種の負の特徴を欠きかつ昆虫細胞中で実質的な量での産生が可能である一方で、プラスミン／プラスミノーゲンの望ましい特徴を有する、改変された組換えタンパク質が望ましい。
【非特許文献１】Ｗｉｍａｎ，Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５７９：１４２−１５４（１９７９）
【非特許文献２】Ｌｕｃａｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：４２４９−４２５６（１９８３）
【非特許文献３】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌ．、３：１９１−２０９（１９７８）
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
本発明は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供し；該ポリペプチドは固定されたリシンに結合する。該Ｎ末端クリングルドメインは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４に相同であり得る。
【０００８】
いくつかの態様において、コードされるポリペプチドは、配列番号２に示される配列に最低９０％、９５％若しくは９８％同一である。さらに、コードされるポリペプチドは配列番号２に示される配列であり得る。
【０００９】
該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列、若しくはその縮重バリアントであり得る。該ヌクレオチド配列は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに相同なＮ末端クリングルドメイン；ならびに、ヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部分およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドをコードし得る。該ヌクレオチド配列はまた、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに最低９０％同一な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに最低９０％同一なＣ末端ドメインを有するポリペプチドもコードし得る。コードされるポリペプチドは固定されたリシンを結合し得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同なＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドを提供する。
【００１１】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４に相同な１個のＮ末端クリングルドメインを有し得る。
【００１２】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、α２−アンチプラスミンによるミニプラスミンの線維素溶解活性の阻害速度より最低約５倍より速い速度でα２−アンチプラスミンにより阻害される線維素溶解活性を表し得る。α２−アンチプラスミンによる阻害速度はまた、ミニプラスミンの阻害の速度より最低約１０倍、２０倍、３０倍若しくは４０倍より速いこともできる。
【００１３】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは固定されたリシンを結合し得る。固定されたリシンは、リシン−アガロース、リシン−ＢＩＯＧＥＬ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）、リシン−ＨＹＰＥＲＤ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニューヨーク州イーストヒルズ、リシン−ヒドロゲル）、リシン−セファロース（セファロースは架橋アガロースである）よりなる群から選択される固体支持体マトリックスに結合されたリシンであり得る。固定されたリシンはリシン−セファロースであり得る。
【００１４】
いくつかの態様において、該ポリペプチドはミニプラスミンのフィブリノーゲンに対する結合親和性より低いフィブリノーゲンに対する結合親和性を表し得る。
【００１５】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、ミニプラスミンの部分的に切断されたフ
ィブリンに対する結合親和性より高い、部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性を表し得る。
【００１６】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、プラスミノーゲン活性化部位およびプラスミノーゲンセリンプロテアーゼドメインに対しＮ末端に位置する単一のクリングルドメインを有し得、該クリングルドメインは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４との最低１残基より大きいアミノ酸配列の同一性を有する。これらの態様について、ヒトプラスミノーゲンのクリングル１および４の天然の配列に関しての本発明のポリペプチドのクリングル領域の保存的置換が、クリングル５との同一性比較の目的上天然の配列と異なると考えられないとみられることが理解されるであろう。
【００１７】
いくつかの態様において、該ポリペプチドは、配列番号２に示されるところのアミノ酸配列およびその保存的置換を有し得る。該ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の位置７６（アルギニンである）の相対位置に類似の相対位置に１残基を有し得る。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および該ベクターを含んでなる培養宿主細胞を包含する。
【００１９】
［発明の詳細な記述］
完全長プラスミンのフィブリンおよびアンチプラスミン結合特性を有する単純なグリコシル化されていない分子を提供するため、本発明はプラスミノーゲンの欠失変異体を提供する。本明細書でδ−プラスミノーゲンと称される本変異体中で、クリングル１に相同なドメインと活性化部位の間の天然のアミノ酸配列の少なくとも一部分が欠失されている。一局面において、ヒトプラスミノーゲンの天然のクリングル１ドメインに相同なドメインを、実質的に、該ドメイン間に残存するプラスミノーゲン活性化部位を含有する介在する天然の配列のみを用い、プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼ部分、若しくはその相同な機能的アナログに直接結合し得る。
【００２０】
本発明のδ−プラスミ（ノーゲ）ンは：より低分子量（３７，１９８Ｄａ）のδ−プラスミンが、増大された比活性（タンパク質１ｍｇあたり）をもたらし得；天然のタンパク質中で見出される最低２個のグリコシル化部位の欠如（図３を参照されたい）が、比較的低分子量と組合さって、比較的安価な細菌および酵母発現系を使用するこのタンパク質の組換え産生を助長し得；δ−プラスミノーゲンが、プラスミノーゲンアクチベーターｔＰＡ、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼにより活性化され得；天然のクリングル１に相同なドメインの存在が、血栓溶解効果に重要であり得るプラスミンのフィブリン結合特性を保存し；クリングル１に相同なドメイン上のα２−アンチプラスミン結合部位の存在が、δ−プラスミンがプラスミンのこの生理学的阻害剤により迅速に阻害される（出血を予防し得る特徴）ことを可能にし得；より小さい大きさのδ−プラスミンが、α２−マクログロブリンによるその阻害を助長して出血の合併症の機会を天然のプラスミンに関してさらに少なくし得る、ことを特徴とし得る。特定の態様において、無傷の消化されないフィブリ（ノーゲ）ンに対する主要な結合部位を保持するクリングル５の非存在は、循環するフィブリノーゲンの低下された枯渇を伴うδ−プラスミンの使用を可能にし得る。
【００２１】
一般に、本発明は、ミニプラスミ（ノーゲ）ンに関してある種の利点を有する、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに対しＮ末端の単一のクリングル領域を有する組換えプラスミ（ノーゲ）ン分子を提供する。本発明のδ−プラスミノーゲンポリペプチドは、活性化部位に対しＮ末端のもののような１個のクリングル領域を有するのみとは言え、いくつかの態様は活性化部位に対しＮ末端の付加的な配列を包含する。付加的なＮ末端配列はプラスミノーゲンの天然のクリングル領域のものに由来し得る。
【００２２】
本発明のＮ−末端クリングルドメインは、天然のプラスミ（ノーゲ）ンおよびその機能的同等物のクリングル１および４のクリングル配列を包含する。とりわけ、リシン結合に参画するか若しくは影響する残基の保存を包含するポリペプチドバリアント中の機能の保存に関する指針を提供する下の論考を参照されたい。
【００２３】
定義
ポリペプチドの「ドメイン」および「領域」という用語は、別の方法で逆に示されない限り、本明細書で使用されるとおり一般に同義である。「クリングル」若しくは「セリンプロテアーゼ」などのような十分に認識された構造若しくは機能の呼称と一緒に列挙される場合、こうした用語は、こうした呼称に対応するポリペプチド構造に関連することが普遍的に認識かつ理解される、少なくとも何らかの特徴（１種若しくは複数）に関するポリペプチドの特徴を紹介することができる。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「培養宿主細胞」は、いずれかの手段、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、微小注入法、形質転換、ウイルス感染などにより細胞に導入された異種ＤＮＡを含有する原核生物若しくは真核生物細胞を指す。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「異種」は、「異なる天然の起源のもの」すなわち非天然の状態を表すことを意味している。例えば、培養宿主細胞を別の生物体、とりわけ別の種由来のＤＮＡ若しくは遺伝子で形質転換する場合、その遺伝子は、その培養宿主細胞に関して、およびその遺伝子を運搬する培養宿主細胞の子孫に関してもまた異種である。同様に、「異種」は、同一の天然の元の細胞型由来かつそれに導入されたが、しかし非天然の状態、例えば異なるコピー数若しくは異なる調節エレメントの制御下で存在するヌクレオチド配列を指す。
【００２６】
「ベクター」分子は、異種核酸を挿入し得その後適切な培養宿主細胞に導入し得る核酸分子である。ベクターは、好ましくは１個若しくはそれ以上の複製起点、および組換えＤＮＡを挿入し得る１個若しくはそれ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを含む細胞を含まないものから選択し得る便宜的手段を有し、例えばそれらは薬剤耐性遺伝子をコードする。普遍的なベクターはプラスミド、ウイルスゲノムならびに（主として酵母および細菌中で）「人工染色体」を包含する。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「転写制御配列」という用語は、それらが作動可能に連結されているタンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導、抑制若しくは別の方法で制御する、イニシエータ配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列のような核酸配列を指す。
【００２８】
「ポリペプチド」という用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と本明細書で互換性に使用される。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は本明細書で互換性に使用され、そして、文脈により示される目的上必要な情報を含有するいかなる核酸も指すことができる。すなわち、該核酸は、該ポリマーが例えばコードされるペプチドに関して適切な情報を表すことが可能でありかつ相補配列、例えば核酸ポリマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖を包含し得る限り、一本鎖若しくは二本鎖いずれかのＤＮＡ若しくはＲＮＡ、または他の核酸であり得る。
【００３０】
ポリペプチドの「バリアント」という用語は、１個若しくはそれ以上のアミノ酸により変えられているアミノ酸配列を指す。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似の構造若
しくは化学特性を有する「保存的」変化、例えばイソロイシンでのロイシンの置換を有し得る。あるいは、バリアントは「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンでの置換を有し得る。類似の小さな変動は、アミノ酸の欠失若しくは挿入、または双方もまた包含し得る。「バリアント」ポリペプチドの特定の一形態は「機能的に同等な」ポリペプチド、すなわち、より詳細に下述されるところの本発明のポリペプチドの例と実質的に類似のｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を表すポリペプチドである。どのアミノ酸残基を生物学的若しくは免疫学的活性を除外することなく置換、挿入若しくは欠失し得るかの決定における指針は、当該技術分野で公知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）を使用して見出し得る。さらに、引用することにより本明細書に完全に組み込まれる引用される参考文献内に提供されるものを包含する特定の指針が下に提供される。
【００３１】
「Ｎ末端の」および「Ｃ末端の」という用語は、それらが適用されるいずれかのアミノ酸配列若しくはポリペプチドのドメイン若しくは構造の相対位置を指定するのに本明細書で使用する。相対位置決めは文脈から明らかであろう。すなわち、「Ｎ末端の」特徴は、同一の文脈で論考される別の特徴よりも該ポリペプチド分子のＮ末端に少なくともより近くに位置することができる（他の可能な特徴は第一の特徴に対し「Ｃ末端の」と称される）。同様に、「５’−」および「３’−」という用語を、ポリヌクレオチドの特徴の相対位置を指定するのに本明細書で使用し得る。
【００３２】
「天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な」Ｎ末端ドメインを有すると本明細書で称されるδ−プラスミノーゲン／プラスミンポリペプチドは、プラスミノーゲンの天然のクリングルドメインに類似の構造および機能の特徴を表す。さらに、「クリングル１に相同な」Ｎ末端ドメインを有すると本明細書で称されるδ−プラスミノーゲン／プラスミンポリペプチドは、少なくとも、該ポリペプチドがクリングル５よりも高いω−アミノカルボン酸（およびｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸（ある環状酸）のような機能的ホモログ）に対する親和性を有し得る程度まで、天然のクリングル１に類似の特徴を表す。５−アミノペンタン酸（５−ＡＰｎＡ）；ε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）としてもまた知られる６−アミノヘキサン酸（６−ＡＨｘＡ）；７−アミノヘプタン酸（７−ＡＨｐＡ）；およびｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸（ｔ−ＡＭＣＨＡ）への単離されたクリングルドメインポリペプチドの結合の比較のための条件およびプロトコルについては、例えばＣｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：３２５８−３２７１（１９９８）を参照されたい。
【００３３】
「クリングル４に相同な」クリングルドメインへの言及は、「クリングル１に相同な」という句に関して上で示されたと同様に定義される。すなわち、それらは、上で論考されたところの天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１に類似の機能的特徴を表す。これらのポリペプチドもまた、上述されたとおり、固定されたリシンを結合する。
【００３４】
本発明のポリペプチドは固定されたリシンを結合する。本明細書で使用されるところの「固定されたリシンを結合すること」という句は、そのように特徴づけられるポリペプチドが、クロマトグラフィー媒体としてリシン−セファロースを使用するカラムクロマトグラフィーにかけられる場合に、ミニプラスミノーゲンに関してそれらの進行が遅らされることを意味している。典型的には、本発明のポリペプチドは、特異的リガンド、例えばεＡＣＡを含有する溶液を溶離液として使用して、こうしたクロマトグラフィー媒体（リシンアフィニティー樹脂）から溶出され得る。
【００３５】
さらに、Ｃｈａｎｇら、上記に加え、本発明の範囲内の欠失変異体を生じるための保存的若しくは非保存的置換、欠失若しくは付加によりどの残基が変えられ得るかを決定する
ために、他の参考文献が当業者により調べられ得る。例えば、以下の参考文献は、ωアミノカルボン酸の結合に重要でありうる天然のクリングルドメインの特定の残基に関する情報を提供する：Ｊｉらへの米国特許第６，５３８，１０３号明細書；Ｓｕｚｕｋｉへの米国特許第６，２１８，５１７号明細書；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（１０）：３３０２−１０（２００２）；Ｚａｊｉｃｅｋ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０１（２）：３３３−４７（２０００）；Ｌｅｅ，Ｈ．ら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３７５（２）：３５９−６３（２０００）；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｆ．とＳ．ＭｃＣａｎｃｅ、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．２１２：４６−６０（１９９７）；ＭｃＣａｎｃｅ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：３２４０５−３２４１０（１９９４）；Ｒｅｊａｎｔｅ，Ｍ．Ｒ．とＭ．Ｌｌｉｎａｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２１（３）：９３９−４９（１９９４）；Ｗｕ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、５（２）：１５７−６６（１９９４）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２（４１）：１０９３６−４３（１９９３）；Ｍｅｎｈａｒｔ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：８７９９−８８０６（１９９３）；Ｔｈｅｗｅｓ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５（７）：３９０６−３９１５（１９９０）；Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．、５３（３）：２４３−５２（１９８９）；Ｍｏｔｔａ，Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６（１３）：３８２７−３６（１９８７）；Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７９：２１５−２３２（１９８４）；Ｌｅｒｃｈ，Ｐ．Ｇ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７（１）：７−１３（１９８０）；Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌ．、３：１９１−２０９（１９７８）；およびＷｉｍａｎ，Ｂ．とＤ．Ｃｏｌｌｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２７２、５４９−５４５（１９７８）（全部はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００３６】
本発明者は、（本明細書に記述されるところの固定されたリシンの結合について試験することにより部分的に評価し得る）有利な機能的特徴を有するＮ末端クリングルドメインを有する価値のある単純化されたプラスミ（ノーゲ）ン分子を製造し得ることを認識したため、本発明は、活性化部位に対しＮ末端の他のフィブリン結合ドメイン若しくは領域を包含し得る。例えば、本発明は、プラスミンのセリンプロテアーゼドメインが、限定されるものでないがヒトプラスミノーゲンのクリングル４、ｔＰＡのクリングル２若しくはアポリポタンパク質（ａ）のクリングルを挙げることができる群から選択されるフィブリン結合クリングルに結合されているポリペプチドを包含し得る。さらに、本発明は、プラスミンのセリンプロテアーゼドメインが、ｔＰＡ若しくはフィブロネクチンの「フィンガー」ドメインまたはフィブリン特異的ＩｇＧのＦＡＢフラグメントのようないずれかの他の既知のフィブリン結合モジュールに結合されているポリペプチドを包含し得る。
【００３７】
特定の態様において、δ−プラスミノーゲンのＮ末端クリングルドメインのある位置の残基は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１に関して保存されている。これらはリシン結合に関連する位置の残基であり得、そして、Ｐｒｏ１３６−Ｐｒｏ１４０、Ｐｒｏ１４３−Ｔｙｒ１４６およびＡｒｇ１５３−Ｔｙｒ１５６（図３に示されるとおり番号付けされる位置）を包含する。本発明のδ−プラスミノーゲンのいくつかの態様は、位置１５３にＡｒｇを有し得る。他の態様において、命名される残基の特定の位置は、構造的および機能的に類似の位置（すなわちＮ末端ドメインのクリングル構造に関して；上で論考されたところのＣｈａｎｇ，Ｙ．らを参照されたい）になお存在しつついくぶん変動し得る。いくつかの態様において、δ−プラスミ（ノーゲ）ンポリペプチドのＮ末端クリングル領域は、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも最低１残基より大きい、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４との同一性パーセントを有する。
【００３８】
加えて、本発明の特定の態様は、類似のドメイン組成すなわちクリングル−セリンプロテアーゼ（Ｋ−ＳＰ）を有するミニプラスミ（ノーゲ）ンと対照的に、機能的に特徴付け得る（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ、Ｖｏｌ．３、（編：Ｊ．Ｆ．Ｄａｖｉｄｓｏｎら）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９７８）を参照されたい）。好ましい態様において、本発明のδ−プラスミンは、例えば、ミニプラスミンの阻害速度よりも約１若しくは２桁より速いと同じくらいのα２−アンチプラスミンによる阻害の増大された速度を表す。さらに、特定の態様において、δ−プラスミンは固定されたリシン（例えばリシン−セファロース）を結合する。
【００３９】
「Ｎ末端の」としてのδ−プラスミノーゲンのクリングルドメインの特徴付けは、該ドメインが活性化部位に対しＮ末端に存在することのみを意味し、そして、該ドメインそれ自身に対しＮ末端の付加的なアミノ酸残基が存在しないことを意味しない。さらに、プラスミノーゲンのクリングル１に相同なドメインと活性化部位の間に置かれた残基の数および同一性は、本発明の範囲から離れることなく変動させ得る。当業者は、クリングル１の機能および構造に関する指針についての本明細書の開示および本明細書に引用される参考文献に基づき、過度の実験を伴わずに本発明の利益（欠失変異体の大きさの実質的な増大若しくは潜在的に問題の多いグリコシル化部位の導入を伴わないωアミノカルボン酸のクリングル１様の結合）を達成するこれらの変形物を決定することが可能であろう。
【００４０】
従って、本発明は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、該ポリペプチドの組換え製造方法、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ポリペプチドを産生するための発現系、およびこうした発現系を含んでなる培養宿主細胞に関する。
【００４１】
示されたとおり、一局面において、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチド若しくはその保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「保存的」アミノ酸置換の選択に関する指針は下により詳細に提供される。一態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
【００４２】
別の局面において、本発明は、ベクター中に本発明のポリヌクレオチドを挿入することを含んでなるベクターの作成方法に関する。別の局面において、本発明は本発明の方法により製造されるベクターに関する。
【００４３】
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを培養宿主細胞に導入することを含んでなる培養宿主細胞の作成方法に関する。別の局面において、本発明は本発明の方法により製造される培養宿主細胞に関する。
【００４４】
別の局面において、本発明は：（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを培養宿主細胞に導入すること；（ｂ）該宿主細胞を培養すること；および（ｃ）ポリペプチドを回収することを含んでなる方法により製造される、本発明の単離されたポリペプチドに関する。別の局面において、本発明は：（ａ）ベクターが発現される条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；および（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる、ポリペプチドの製造方法に関する。
【００４５】
別の局面において、本発明は本発明の最低１種のポリヌクレオチドを含有する細胞に関する。
【００４６】
一態様において、ポリヌクレオチドは配列番号１に示されるところのヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、ポリペプチドは、配列番号２に示されるところのアミノ酸配列を含んでなる。
【００４７】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、１個若しくはそれ以上のヌクレオチドを巻き込み得る置換、欠失および／若しくは付加を有するバリアントを包含する。バリアントはコーディング領域、非コーディング領域若しくは双方で変えることができる。コーディング領域中の変化は、保存的若しくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を生じ得る。δ−プラスミ（ノーゲ）ンタンパク質若しくはその部分の特性および活性を変えない、サイレント置換、付加および欠失が、これらのうちでとりわけ好ましい。この点に関して、保存的置換（下を参照されたい）もまたとりわけ好ましい。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、（ａ）配列番号２の完全なアミノ酸配列を有するδ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２中のアミノ酸配列を有するδ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｃ）上の（ａ）若しくは（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列に最低９０％同一、およびより好ましくは最低９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる核酸分子を包含する。
【００４９】
δ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも例えば９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、該ポリヌクレオチド配列がδ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５個までの点突然変異を包含し得ることを除き、参照配列に同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に最低９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までを欠失若しくは別のヌクレオチドで置換し得るか、または、参照配列中の全ヌクレオチドの５％までのある数のヌクレオチドを参照配列に挿入し得る。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置に、あるいは、参照配列中のヌクレオチドの間に個別にまたは参照配列内の１個若しくはそれ以上の連続する群中のいずれかに散在して、それらの末端位置の間のどこかに存在し得る。
【００５０】
上で示されたとおり、２種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド配列を、それらの同一性パーセントを決定することにより比較し得る。２種若しくはそれ以上のアミノ酸配列を、同様に、それらの同一性パーセントを決定することにより比較し得る。２配列（核酸であろうとペプチド配列であろうと）の同一性パーセントは、一般に、より短い配列の長さにより除算しかつ１００により乗算した、２種の整列した配列の間の正確な一致の数として記述される。核酸配列の適切なアライメントは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、国立生物医学研究財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、米国ワシントンＤＣにより開発されかつＧｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化されたスコアリングマトリックスを使用して、ペプチド配列での使用に拡張し得る。核酸およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実行は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ウィスコンシン州マディソン）によりそれらのＢＥＳＴＦＩＴユーティリティアプリケーションで提供される。この方法のデフォルトのパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージプログラムマニュアル、バージョン８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソンから入手可能）に記述されている。
【００５１】
もちろん、遺伝暗号の縮重により、当業者は、配列番号１に示される核酸配列の核酸配列に最低９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一な配列を有する多数の核酸分子がδ−プラスミノーゲンポリペプチドをコードすることができることを即座に認識するであろう。事実、これらのヌクレオチド配列の縮重バリアントは全部同一のポリペプチドをコードするため、これは、本明細書に記述されるいかなる機能アッセイ若しくは測定も実施することさえなく当業者に明らかであろう。縮重バリアントでないこうした核酸分子について、合理的な数もまたδ−プラスミノーゲンポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードすることができることが、当該技術分野でさらに認識されるであろう。これは、タンパク質の機能に有意に影響を及ぼすことがより少なさそうであるか若しくは全くありそうでないかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば１個の脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者が十分に知っているからである。
【００５２】
最近、より長いポリヌクレオチド配列の合成製造の進歩が、伝統的なクローニング技術の使用を伴わずに有意により長いポリペプチドをコードする核酸の合成製造を可能にした。こうしたサービスの商業的提供元はＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．、ワイオミング州ボセル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ）を包含する。Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃにより利用される技術は、米国特許第６，６６４，１１２号；同第６，６２３，９２８号；同第６，６１３，５０８号；同第６，４４４，４２２号；同第６，３１２，８９３号；同第４，６５２，６３９号明細書；米国特許出願公開第２００２０１１９４５６Ａ１号；同第２００２００７７４７１Ａ１号明細書；ならびに公開国際特許出願（公開番号）第ＷＯ０３０５４２３２Ａ３号；同第ＷＯ０１９４３６６Ａ１号；同第ＷＯ９７２７３３１Ａ２号；および同第ＷＯ９９０５３２２Ａ１号（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００５３】
もちろん、分子生物学、微生物学および組換え核酸の伝統的技術もまた、本発明のポリヌクレオチドを製造するのに使用し得る。これらの技術は公知であり、そして、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｅｂｅｌ編、Ｖｏｌ．Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ編（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８４）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒとＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、それぞれＷｕとＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｕ、Ｖｏｌ．１５４および１５５（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に説明されている。
【００５４】
ベクターおよび培養宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を包含するベクター、該組換えベクターで
遺伝子的に工作されている培養宿主細胞、および組換え技術によるδ−プラスミ（ノーゲ）ンポリペプチドの製造にも関する。
【００５５】
組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法および形質転換のような公知の技術を使用して培養宿主細胞に導入し得る。ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルス若しくはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは複製コンピテント若しくは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般に、補完する培養宿主細胞中でのみ起こることができる。
【００５６】
ポリヌクレオチドは、培養宿主中での増殖のための選択可能なマーカーを含有するベクターに結合し得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿のような沈殿物、若しくは荷電した脂質との複合体中で導入する。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してそれをｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングし得、そしてその後培養宿主細胞に形質導入し得る。
【００５７】
目的のポリヌクレオチドに対しｃｉｓ作用性の制御領域を含んでなるベクターが好ましい。適切なｔｒａｎｓ活性化因子は、培養細胞により供給され得るか、補完するベクターにより供給され得るか、若しくは培養宿主中への導入に際してベクターそれ自身により供給され得る。
【００５８】
ある態様においては、この点に関して、ベクターは、誘導可能かつ／若しくは細胞型特異的であり得る特異的発現を提供する。温度および栄養素添加物のような操作するのが容易である環境因子により誘導可能なものが、こうしたベクターのなかでとりわけ好ましい。
【００５９】
本発明で有用な発現ベクターは、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素由来のベクター、バキュロウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、禽痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス、ならびにコスミドおよびファージミドのようなそれらの組合せ由来のベクターを包含する。
【００６０】
ＤＮＡ挿入物は、いくつかを挙げれば、ファージλ ＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスのＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターに効果的に連結すべきである。他の適するプロモーターは当業者に既知であろう。発現構築物は、転写開始、終止の部位、および転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することができる。構築物により発現される成熟転写物のコーディング部分は、好ましくは、最初の翻訳開始部および翻訳されるべきポリペプチドの端に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ若しくはＵＡＧ）を包含することができる。
【００６１】
示されるとおり、発現ベクターは好ましくは最低１個の選択可能なマーカーを包含することができる。こうしたマーカーは、真核生物の細胞培養物のためのジヒドロ葉酸還元酵素若しくはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌での培養のためのテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性遺伝子を包含する。適切な培養宿主の代表的な例は、限定されるものでないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、放線菌類（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞のような細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ属（Ｓｐｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；ならびに植物
細胞を挙げることができる。上述の培養宿主細胞に適切な培地および培養条件は当該技術分野で公知である。
【００６２】
細菌での使用に好ましいベクターには、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシアから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤから入手可能なｐＢＳベクター、ＰＨＡＧＥＳＣＲＩＰＴベクター、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（現在Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を包含する。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬが好ましい真核生物ベクターのひとつである。他の適するベクターは当業者に容易に明らかであろう。
【００６３】
本発明での使用に適する細菌プロモーターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λ ＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターを包含する。適する真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のもののようなレトロウイルスのＬＴＲのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを包含する。
【００６４】
培養宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染若しくは他の方法により遂げることができる。こうした方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９９５）のような多くの標準的実験室手引書に記述されている。
【００６５】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大させ得る。エンハンサーは、所定の培養宿主細胞型中でのプロモーターの転写活性を増大させるように作用する、通常約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのｃｉｓ作用性要素である。エンハンサーの例は、ｂｐ１００ないし２７０の複製起点の後側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイスル初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【００６６】
小胞体の管腔、細胞膜周辺腔若しくは細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のため、適切な分泌シグナルを発現されるポリペプチドに組込み得る。該シグナルは該ポリペプチドに対し内因性であり得るか、若しくはそれらは異種シグナルであり得る。
【００６７】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現させ得、そして分泌シグナルのみならず、しかし付加的な異種機能的領域もまた包含し得る。例えば、培養宿主細胞中、精製の間、若しくはその後の取扱および貯蔵の間の安定性および難分解性を向上させるために、付加的なアミノ酸、とりわけ荷電したアミノ酸の一領域をポリペプチドのＮ末端に付加し得る。また、精製を容易にするためにペプチド部分をポリペプチドに付加し得る。こうした領域はポリペプチドの最終精製前に除去し得る。とりわけ、分泌若しくは排出を発生させるため、安定性を向上させるため、および精製を容易にするためのポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該技術分野で馴染みがありかつ慣例の技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するのに有用である免疫グロブリンからの異種領域を含んでなる。例えば、第ＥＰ ０ ４６４ ５３３ Ａ１号（カナダの対照物第２，０４５，８６９号）は、別のヒトタンパク質若しくはその部分と一緒になって免疫グロブリン分子の定常領域の多様な部分を含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は治療および診断での使用のため全面的に有利であり、そして、従って、例えば改良された薬物動態特性をもたらす。他方、いくつかの用途について、融合タンパク質を記述された有利な様式で発現、検出かつ精製した後にＦｃ部分を欠失させることが可能であることが望ましいとみられる。これは、Ｆｃ部分が治療および診断で使用するための妨害であることが判明している場合、例えば免疫化のための抗原として該融合タンパク質を使用するはずである場合に真実である。例えば薬物発見において、ハイスループットスクリーニングアッセイの目的上、ヒトタンパク質がＦｃ部分と融合された（ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのｈＩＬ５受容体のような）。Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、８：５２−５８（１９９５）およびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照されたい。
【００６８】
δ−プラスミノーゲンタンパク質は、本明細書の実施例にとりわけ記述されるものを包含する公知の方法により組換え細胞培養物から回収かつ精製し得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、化学合成処置の生成物、ならびに例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を包含する原核生物若しくは真核生物の培養宿主から組換え技術により製造された生成物を包含する。加えて、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合には宿主媒介性の過程の結果として、最初の修飾メチオニン残基も包含し得る。
【００６９】
ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの変形物および特定の例をコードするものを包含する。例えば、表現型上サイレントのアミノ酸置換の作成方法に関する指針はＢｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで著者はタンパク質が驚くべきことにアミノ酸置換に寛容であることを示している。本発明の範囲内のいかなる数の置換もこうした一般的原則の応用により得ることができるとは言え、置換に関する特定の指針について、クリングル１ドメインの構造および機能に関する本明細書で引用される参考文献が当業者により調べられ得る。
【００７０】
使用される基準に依存して、δ−プラスミノーゲンポリペプチドのクリングル１、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインの正確な「位置」は、本発明の範囲内の特定の変形物でわずかに異なり得ることが、さらに認識されるであろう。例えば、活性化部位に関するクリングル１ドメインの正確な場所はわずかに変動し得、かつ／若しくは、クリングル１ドメインに対しＮ末端の配列は長さが変動し得る。従って、本発明は、本明細書に開示されるところのδ−プラスミノーゲンポリペプチド活性を表すδ−プラスミノーゲンポリペプチドのこうした変形物を包含する。こうしたバリアントは欠失、挿入、反転、反復および置換を包含する。上に示されるとおり、どのアミノ酸変化が表現的にサイレントであることがありそうであるかに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出し得る。
【００７１】
従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体若しくはアナログは、（ｉ）アミノ酸残基の１個若しくはそれ以上（例えば３、５、８、１０、１５若しくは２０）が保存された若しくは保存されないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されているもの。こうした置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされるものであっても若しくはなくてもよい。あるいは、（ｉｉ）アミノ酸残基の１個若しくはそれ以上が置換基を包含する（例えば３、５、８、１０、１５若しくは２０）もの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増大させるための化合物（例えばポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド若しくはリーダーすなわち分泌配列、または成熟ポリペプチド若しくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列のような付加的なアミノ酸が、成熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。こうしたフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると思われる。
【００７２】
示されるとおり、変化は、好ましくは、タンパク質のフォールディング若しくは活性に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換のような軽度のものである。もちろん、当業者が行いうるアミノ酸置換の数は、上述されたものを包含する多くの因子に依存する。一般的に言って、いずれかの所定のδ−プラスミノーゲンポリペプチドの置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５若しくは３を超えないことができる。
【００７３】
機能に不可欠である本発明のδ−プラスミノーゲンポリペプチド中のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発若しくはアラニン走査突然変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような当該技術分野で既知の方法により同定し得る。後者の処置は分子中のすべての残基に単一のアラニン突然変異を導入する。生じる変異体分子をその後、例えば本明細書に提供される実施例で示されるとおり、生物学的活性について試験する。リガンド結合に決定的に重要である部位は、結晶化、核磁気共鳴若しくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：３９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））のような構造分析によってもまた決定し得る。タンパク質のＮ末端からの１個若しくはそれ以上のアミノ酸の欠失が該タンパク質の１種若しくはそれ以上の生物学的機能の改変若しくは喪失をもたらす場合であっても、他の生物学的活性はなお保持され得る。
【００７４】
本発明の「単離されたポリペプチド」の製造で有用なポリペプチドを固相合成法により製造し得ることもまた企図している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；およびＨｏｕｇｈｔｅｎらへの米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）を参照されたい。
【００７５】
本発明のポリペプチドは単離された形態で提供され得る。「単離されたポリペプチド」により、その天然の環境から取り出されたポリペプチドを意図している。従って、組換え培養宿主細胞内で産生かつ／若しくは含有されるポリペプチドは、本発明の目的上単離されたとみなされる。組換え培養宿主から部分的に若しくは本質的に精製されたポリペプチドもまた「単離されたポリペプチド」として意図している。
【００７６】
δ−プラスミノーゲンポリペプチドの参照アミノ酸配列に対する示される同一性パーセントのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリヌクレオチドに関して上に示されたコンピュータ支援の方法を包含する方法を使用して決定し得る。前述の論考でヌクレオチド配列がまさにそうであるように、ポリペプチドのアミノ酸配列を検査かつ比較する。当業者は、ポリヌクレオチドについて論考された分子の終点としてのこうした概念が、ポリペプチド分析のためのこうした方法およびプログラムの対応する使用を考慮する場合に直接のアナログを有することができることを認識するであろう。例えば、ポリヌクレオチドに関して論考された人的補正は核酸の５’および３’の終点を指すが、しかし、同一の論考はポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に応用可能と認識されるであろう。
【００７７】
本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子若しくは他の細胞リガンドへの結合などにより翻訳の間若しくは後に示差的に修飾されるδ−プラスミノーゲンポリペプチドを包含する。多数の化学修飾のいずれも、限定されるものでないが臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝的合成；などを挙げることができる既知技術により実施し得る。
【００７８】
本発明により包含される付加的な翻訳後修飾は、例えば、原核生物培養宿主細胞中でのδ−プラスミノーゲンポリペプチドの発現に適合されたベクターおよび構築物の結果としての、例えばＮ−結合若しくはＯ−結合した炭水化物鎖、Ｎ末端若しくはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸バックボーンへの化学的部分の結合、Ｎ−結合若しくはＯ−結合した炭水化物鎖の化学修飾、およびＮ末端メチオニン残基の付加を包含する。該ポリペプチドは、該タンパク質の検出および単位を見込むための酵素、蛍光、同位体若しくはアフィニティー標識のような検出可能な標識でもまた修飾し得る。
【００７９】
製薬学的組成物および処置方法
δ−プラスミ（ノーゲ）ンは、米国第２００３／００１２７７８ Ａ１号明細書；およびＮｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１（５）：１０３４−４１（２００３）（双方は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される方法および組成物に従って、治療的使用のため処方し得る。例えば、低ｐＨ（約２．５から約４まで）、低緩衝能力の緩衝液をδ−プラスミンの製剤に使用し得る。加えて、プラスミン、ミニプラスミンおよび／若しくはマイクロプラスミンで実施されるところの当業者に既知の他の方法および処方を使用して、本発明のδ−プラスミンを治療的投与のため処方し得る。
【００８０】
δ−プラスミ（ノーゲ）ンを使用して、例えば、米国特許第６，３５５，２４３号；および公開米国特許出願第２００３／００２６７９８ Ａ１号；同第２００３／０１７５２６４ Ａ１号明細書（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところの方法に従って、多様な血栓症若しくは状態を処置し得る。再度、δ−プラスミンに応用可能な、可能な製薬学的製剤でのように、δ−プラスミンは、当該技術分野で既知の方法、例えばプラスミン、ミニプラスミンおよび／若しくはマイクロプラスミンで現在実施されうるものにより治療的にもまた投与し得る。
【実施例】
【００８１】
発現ベクターの設計
δ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列番号２に示す。δ−プラスミノーゲンをコードする推定の配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現およびｍＲＮＡの安定性のためコドンを最適化して、配列番号１に示されるところのＤＮＡ配列を生じた。
【００８２】
このＤＮＡを化学合成し（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．）、そして細胞質タンパク質を産生させるため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ；ウィスコンシン州マディソン）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。この構築物は、付加的な非天然のＮ末端メチオニンを伴うδ−プラスミノーゲンを産生する。（ｐＥＴ−２２ｂ（＋）＝ｐＥＴ発現系２２ｂ（カタログ番号７０７６５）、ＥＭＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｇｅｎ銘柄、ウィスコンシン州マディソン；ベクターに関する詳細については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍのｐＥＴ−２２ｂに関する製品情報の節を参照されたい）。
【００８３】
δ−プラスミノーゲンの発現および精製
δ−プラスミノーゲン配列をコードするＤＮＡを多様な細胞に形質転換し、そして、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による誘導後のタンパク質の過剰発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ａｒｇ、ＩｌｅおよびＬｅｕをコードする希な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡを発現するよう工作した細胞型ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）細胞を、δ−プラスミノーゲンの産生に使用した。
【００８４】
δ−プラスミノーゲンの産生を大スケール発現で確認し、ここで細胞を溶解しかつ可溶性タンパク質および精製した封入体双方をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞は、有意のδ−プラスミノーゲンタンパク質を封入体の形態で産生した。発現の推定量は５０〜８０ｍｇ／Ｌ細胞培養物であった。
【００８５】
以下の典型的なプロトコルをδ−プラスミノーゲンの発現に使用した：
δ−プラスミノーゲンベクターを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞の単一コロニーを使用して、５ｍｌのＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）に接種し、そして振とう機上３７℃で８時間インキュベートした。その後、５０μｌのアリコートを、新鮮培地中でのさらなる増殖のため、培養細菌懸濁液から採取した。該処置を、６ｍｌの細菌培養物および２５０ｍｌの培地を用いて１６時間後に反復した。培養物を振とうしながら３７℃で約１．０のＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、そしてＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加した。培養物を追加の５時間増殖させた。細胞を５，０００×ｇでの遠心分離により収集し、そして細胞ペレットを２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭトリス ｐＨ８．０に溶解しかつ−８０℃で凍結させた。
【００８６】
δ−プラスミノーゲンを精製するため、細胞ペレットを融解し、そして溶液の容量が元の細胞培養物の容量のおよそ１／２０の容量になるまで緩衝液を添加した。その後、リゾチームを０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、そして細胞を４℃で１０〜１５分間急速に攪拌した。その後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１％の最終濃度まで添加し、そして攪拌を別の１０分間継続した。ＤＮアーゼＩ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）およびＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）を添加し、そして、溶液がもはや粘性でなくなるまで攪拌を４℃で３０分間継続した。最終的な溶液を１５，０００×ｇで４℃で３０分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。
【００８７】
細胞ペレットを、洗浄溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および０．５Ｍ尿素を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、そして最終的なペレットを４０ｍｌの抽出緩衝液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解しかつ４℃で一夜保存した。１６時間後に溶液を１５，０００×ｇで３０分間遠心分離して固形物を除去し、そして上清を４℃で攪拌しつつ再フォールディング溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３．５ＭグアニジンＨＣｌ、０．５ＭアルギニンＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＧＳＨ、０．３ｍＭ ＧＳＳＧ）にゆっくりと添加した。再フォールディング処置は０．０３ｍｇ／ｍｌ若しくはそれ未満のタンパク質濃度で実施した。
【００８８】
再フォールディング溶液を４℃で２日間乱されないまま保ち、そしてその後、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍアルギニン−ＨＣｌを含有する８倍容量の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０に対し、緩衝溶液の頻繁な交換を伴い８〜１０時間にわたり透析した。
【００８９】
タンパク質溶液をその後透析から取り出し、そして１０ｋＤａのメンブレンカットオフ
を伴うＡＭＩＣＯＮフィルターを使用しておよそ１０〜２０ｍｌに濃縮し、そして１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１００倍容量の０．１Ｍトリス ｐＨ８．０に対し一夜透析した。この物質を遠心分離して微粒子を除去し、その後リシンアフィニティー樹脂（リシン−セファロース４Ｂ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を通過させた。δ−プラスミノーゲンは、０．２Ｍのε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）を含有するトリス緩衝生理的食塩水、ｐＨ８．０を使用して樹脂から溶出した。
【００９０】
典型的には、８０ｍｇの封入体を１リットルの細胞培養物から単離し得、また、４０ｍｇをリシン−セファロースクロマトグラフィー段階で溶出し得た。
【００９１】
δ−プラスミノーゲンの特性
精製したδ−プラスミノーゲンは、還元（ジチオスレイトール処理）および非還元タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３５〜４０ｋＤａの領域の単一バンドとして出現した（図５を参照されたい）。ＭＡＬＤＩ質量分析により測定されたその正確な分子量は、３７，１９８Ｄａという期待された値に非常に近い３７，０８９Ｄａであった。
【００９２】
δ−プラスミノーゲン（ΔＰｇ）がδ−プラスミンに活性化され得たかどうかを試験するために、δ−プラスミノーゲンをウロキナーゼ（１：１０００のモル比）とともにインキュベートし、そして、セリンプロテアーゼ活性の増大を、Ｓ−２２５１の加水分解の速度の増大を測定することによりモニターした（Ｓ−２２５１＝Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド、ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、オハイオ州ウエストチェスター）。図６に見られるとおり、結合された活性化反応に典型的な活性の放物線状の増大（酵素前駆体が活性の酵素に転化され（１）；そして酵素が色素生産性の基質を切断する（２））が観察される。δ−プラスミノーゲンのδ−プラスミンへの活性化は、これらの条件下で３分以内に完了した。非常に類似の結果が、ｔＰＡおよびストレプトキナーゼで得られた。
【００９３】
δ−プラスミノーゲンのウロキナーゼ活性化のキネティクスを、Ｗｈｏｌらの方法（Ｗｈｏｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｌ．，Ａｒｚａｄｏｎ，Ｌ．とＲｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１４０２−１４０７（１９７８）（引用することにより完全に組み込まれる））を使用して、完全長のプラスミノーゲンのものと比較した。この目的上、５．８ｎＭのウロキナーゼを、３７℃、ｐＨ７．５で１ｍＭのＳ−２２５１基質の存在下に多様な濃度のプラスミン種を含有する溶液に添加した。４０５ｎｍでの吸光度の増大をモニターし、そしてＳ−２２５１の生成物の形成の加速的速度を、放物型方程式（式中、速度＝ｋ・ｔ２）を使用して計算した。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ解析を使用して、データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎのキネティクスモデルに当てはめて、下の値をもたらした：
【００９４】
【表１】
【００９５】
完全長のプラスミノーゲンは、文献中で見出される値（１．７μＭ；Ｗｏｈｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｌ．とＲｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５５（５）：２００５−２０１３（１９８０））に類似のＫｍ値、および同等のｋｃａｔ値を伴い、ウロキナーゼにより十分に活性化された。
【００９６】
δ−プラスミノーゲンのウロキナーゼ活性化のＫｍ値は、プラスミノーゲンについてよりもおよそ３０倍より高く、おそらく、プラスミノーゲンのこの変異体に対するウロキナーゼのより低い親和性を示す。同時に、δ−プラスミノーゲンの活性化のｋｃａｔ値はプラスミノーゲンについてよりはるかにより高かった。ｋｃａｔおよびＫｍの前述の差違にもかかわらず、それらの比すなわち触媒効率は、ウロキナーゼによる天然および組換えで改変されたプラスミノーゲン種の活性化についてほぼ同一である。従って、これらのデータは、「外来の」クリングル１の存在が、δ−プラスミノーゲン中のセリンプロテアーゼドメインの活性化特性に大きく影響を及ぼさないことを示す。
【００９７】
なお別の活性化実験において、δ−プラスミノーゲンをストレプトキナーゼ、ｔＰＡおよびウロキナーゼとともにインキュベートし、そして二本鎖δ−プラスミン中の一本鎖δ−プラスミノーゲン分子の転化を観察するために還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図５、レーン３−５を参照されたい）。全３つの場合で、δ−プラスミンの二本の鎖（約１２ｋＤａのクリングル１および約２５ｋＤａのセリンプロテアーゼ鎖）を見ることができ、δ−プラスミノーゲンが実際に全３種のプラスミノーゲン活性化物質により活性化され得ることを示唆した。
【００９８】
期待されたとおり、δ−プラスミノーゲンはクリングル１を介してリシン−セファロースに結合し、そしてεＡＣＡの勾配によりカラムから単一ピークとして溶出され得た（図７を参照されたい）。再フォールディングされたδ−プラスミノーゲンのリシン−セファロースに結合する能力は、該分子のクリングルドメインが適正にフォールディングされ、また、リシン結合部位が完全に活性であることを示す。
【００９９】
クリングル１の機能性をさらに確認するため、δ−プラスミノーゲンへのεＡＣＡの結合を、Ｍａｔｓｕｋａら（Ｍａｔｓｕｋａ，Ｙ．Ｖ．，Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．Ｖ．とＫｕｄｉｎｏｖ、Ｓ．Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９０：９３−９７（１９９０））およびＤｏｕｇｌａｓら（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．，ｖｏｎ Ｈａｌｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｌｌｉｎａｓ，Ｍ．とＳｃｈａｌｌｅｒ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３３０２−３３１０（２００２））（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されたとおり、タンパク質の蛍光の関連した変化をモニターすることにより測定した。δ−プラスミノーゲンのクリングル１へのεＡＣＡの結合は、ありそうにはリシン結合部位の一部であるトリプトファン残基の消光により、蛍光の減少をもたらす。
【０１００】
この過程をモニターするため、εＡＣＡの濃縮した溶液の４μｌないし１６μｌのアリコートを、２０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、２５℃中５μＭのδ−プラスミノーゲン２ｍｌに添加した。蛍光は、ＦＬＵＯＲＯＭＡＸ蛍光分光光度計（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州エディソン）にて２９８ｎｍの励起波長および３４０ｎｍの測定波長でモニターし；εＡＣＡの各添加後に、蛍光のさらなる変化が観察されなくなるまで溶液を平衡化させた。
【０１０１】
生じる蛍光の値を希釈について補正し、そして０〜５０μＭのεＡＣＡの範囲にわたりεＡＣＡの濃度に対しプロットした。データを非直線回帰により当てはめて、３．２μＭ（Ｍａｔｓｕｋａら）および１３μＭ（Ｄｏｕｇｌａｓら）というεＡＣＡのクリングル１親和性の文献値と良好に一致する１１．１±２．３μＭというＫｄを得た。
【０１０２】
プラスミンの一特性はフィブリンを結合するその能力である。δ−プラスミノーゲンが
フィブリンと相互作用する能力を保持するかどうかを決定するため、δ−プラスミノーゲンのフィブリンへの結合をｔＰＡによるそのその後の活性化および生じる血餅溶解により評価したマイクロタイタープレートアッセイで、そのフィブリン結合特性を試験した。この目的上、１００μｌの５ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを、マイクロタイタープレートの各ウェル中でトロンビンと重合させた。多様な濃度のδ−プラスミノーゲンをフィブリン塊の上面に添加しかつ３７℃で１時間インキュベートした。フィブリン塊が未だ無傷でありかつウェルに付着していた間に、プレートをＰＢＳで徹底的に洗浄した。洗浄後、ｔＰＡの０．１〜ｍｇ／ｍｌ溶液を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。結果として塊のいくつかが完全に溶解され、そしていくつかは部分的に溶解された一方、非常に少量のδ−プラスミノーゲンを含むウェルおよび対照ウェルは事実上無傷のままであった。線維素溶解の程度を、１Ｍ ＮａＯＨ中で再構成した最初の塊の残部の２８０ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。吸光度の値を、δ−プラスミノーゲン濃度の関数としてプロットした。
【０１０３】
図８に見られるとおり、δ−プラスミノーゲンのフィブリンへの結合は古典的なＳ字状結合曲線に従う。このアッセイを使用して、δ−プラスミノーゲンが完全長のプラスミノーゲンの親和性に匹敵する親和性でフィブリンを結合し、またこの相互作用のＣ５０（約０．２μＭ）が完全長のプラスミノーゲンのフィブリン結合のＫｄに匹敵することが見出された（Ｌｕｃａｓ，Ｍ．Ａ．，Ｆｒｅｔｔｏ，Ｌ．Ｊ．とＭｃＫｅｅ，Ｐ．Ａ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（７）：４２４９−４２５６（１９８３））。これらの実験は、δ−プラスミノーゲンがフィブリンを結合し得ることを示す。
【０１０４】
従って、δ−プラスミノーゲンのリシン−セファロースとの相互作用、期待されるＫｄでεＡＣＡを結合するその能力、フィブリンを結合するその能力、全部の主要なプラスミノーゲン活性化物質により活性化されるその能力、および色素産生性のプラスミン基質Ｓ−２２５１に対するδ−プラスミンの効力は、全部、この分子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系中で完全に機能的な形態で産生されたことを示した。
【０１０５】
δ−プラスミンの精製および製剤
１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０に対し透析したδ−プラスミノーゲンを、本質的にプラスミンについて以前に記述された（Ｍａｒｄｅｒ，Ｖ．Ｊ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．、８６（３）：７３９−４５（２００１）（引用することにより組み込まれる））とおり、セファロース４Ｂに固定したウロキナーゼを使用して、δ−プラスミンに活性化した。活性化は室温で起こり、そしてＳ−２２５１の活性の増大によりリアルタイムでモニターした。バッチごとに変動した（典型的には１〜２ｍｇ／ｍｌ）δ−プラスミノーゲンの量に依存して、インキュベーション時間は３０〜６０分であった。Ｓ−２２５１の活性がプラトーに達した活性化の完了に際して、ウロキナーゼ−セファロースを濾過し、そして活性のδ−プラスミンをベンズアミジン−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に捕捉した。δ−プラスミンは、低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン、ｐＨ３．０、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ εＡＣＡ）を使用して樹脂から溶出した。
【０１０６】
溶出画分中のタンパク質濃度およびＳ−２２５１の活性を測定した。高特異的活性画分をプールし、そして０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ３．６の複数回の交換に対し４℃で透析した。非還元のδ−プラスミンサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図９、レーン３を参照されたい）は、この物質の純度が通常９５％以上であることを示す。還元条件下（図９、レーン４）で、セリンプロテアーゼおよびクリングル鎖のほかに、クリングルのバンドの上および下に２本の淡いバンドが存在する。これらのバンドは、そのポリペプチド鎖の内的切断から生じるセリンプロテアーゼドメインの自己分解生成物を表し；それらは通常ジスルフィド結合により一緒に保持されるが、しかし還元条件下でのＰＡＧＥで見えるよう
になる。典型的には１０％を超えなかった自己分解生成物の量は、ベンズアミジン−セファロース精製段階をカラム形式の代わりにバッチ様式で実施することにより大きく低下された。
【０１０７】
δ−プラスミンは完全長のプラスミンと同様に生理学的ｐＨで自己分解する傾向があるため、最終製剤にｐＨ３．６を選んだ（酢酸−生理的食塩水で酸性化する）。プラスミンについて以前に示され（Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．、１（５）：１０３４−４１（２００３）（引用することにより組み込まれる））かつδ−プラスミンを用いる実験で確認されたとおり、この低緩衝能力の低ｐＨ製剤は、長時間の活性のプラスミンの安全な貯蔵を可能にするのみならず、しかしまたこれらの直接血栓溶解薬の非経口投与とも適合性である。血漿若しくは中性のｐＨ緩衝液と混合される場合に、δ−プラスミンは迅速に再活性化される。
【０１０８】
δ−プラスミンの酵素特性
δ−プラスミンのアミド分解活性を、プラスミン基質Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２５１）（ＤｉａＰｈａｒｍａ、オハイオ州ウエストチェスター）を使用して検査した。ＰＢＳ緩衝液中ｐＨ７．４、２５℃で、Ｓ−２２５１のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数（Ｋｍ）は１３８μＭであることが見出された（表２）。該製剤のｋｃａｔは５１０ｍｉｎ−１であることが見出された。４−グアニジノ安息香酸４−ニトロフェニル塩酸塩（ｐＮＰＧＢ）滴定（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．とＥ．Ｓｈａｗ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７：２０−２７（１９７０））を使用して、機能的活性部位のパーセントは６７％であることが見出された。活性部位のパーセントについてｋｃａｔを補正して、７５５±４５ｍｉｎ−１のｋｃａｔを決定した。この値は、完全長のプラスミンについて（７６０±２３ｍｉｎ−１）およびマイクロプラスミン（全５個のクリングルを欠く）について（７９５±２４ｍｉｎ−１）同一アッセイで決定された値に非常に近かった（図９を参照されたい）。これらのデータは、クリングルの存在若しくは非存在が、セリンプロテアーゼドメインの触媒活性に影響を及ぼさないことを示す。
【０１０９】
α２−マクログロブリンによるδ−プラスミンの阻害速度を、Ａｎｏｎｉｃｋらの方法（Ａｎｏｎｉｃｋ，Ｐ．ら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９−４６２（１９９０））を使用して測定した。阻害速度は、ＰＢＳ緩衝液中２２℃で７．６±０．６×１０５Ｍ−１ｓ−１であることが見出された。
【０１１０】
α２−アンチプラスミンによるδ−プラスミンの阻害速度は、プラスミンおよびα２−アンチプラスミンを混合し、その後特定の時間点でＳ−２２５１の活性についてアッセイするＷｉｍａｎとＣｏｌｌｅｎの方法（Ｗｉｍａｎ，Ｂ．とＤ．Ｃｏｌｌｅｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４：５７３−５７８（１９７８））を使用して、１．１×１０７Ｍ−１ｓ−１であることが決定された（表３）。この値は、２．５×１０７Ｍ−１ｓ−１（Ａｎｏｎｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９（１９９０）から）というプラスミンの報告値に匹敵する。
【０１１１】
マイクロプラスミンを用いて実施した同一の実験は、２回の別個の実験で１．８×１０５Ｍ−１ｓ−１および３．１×１０５Ｍ−１ｓ−１というα２−アンチプラスミン阻害速度を示した。ミニプラスミンのα２−アンチプラスミン阻害の速度（ミニプラスミンドメイン組成物、Ｋ５−ＳＰ）は２．４×１０５Ｍ−１ｓ−１であることが決定された。これらのデータは、マイクロおよびミニプラスミンの文献値と合理的に一致し、そして、α２−アンチプラスミンによるδ−プラスミンの阻害がマイクロプラスミン若しくはミニプラスミンいずれかの阻害より４０倍より速いことを示す。従って、これらの結果は、δ−プラスミンが、その構造中のクリングル１の存在によりα２−アンチプラスミンにより迅速に阻害されるはずであることを示す。
【０１１２】
全体として、この節に提示されるデータは、δ−プラスミンの酵素および阻害特性が完全長のプラスミンに類似であることを示す。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
文献値はＡｎｏｎｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９（１９９０）から採用している。全部の速度はＡｎｏｎｉｃｋらに発表された方法に従って測定した。
【０１１６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ血栓溶解効率
δ−プラスミンの血栓溶解効率を、以下の実験プロトコルを使用して、カテーテル補助（ｃａｔｈｅｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）血栓溶解のｉｎ ｖｉｔｒｏモデル（Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．ら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．、１（５）：１０３４−４１（２００３）（引用することにより組み込まれる））で試験した。
【０１１７】
新鮮なヒト全血を２０×０．９５ｃｍガラスチューブに収集し、そして添加物を用いずに自発的に凝固させた。チューブを３７℃で２０時間インキュベートして完全な収縮を可能にした。収縮した凝血塊を、１４メッシュを伴う米国標準試験篩を使用して血清から分離し、そしてそれらの重量を測定した。血餅を、収縮させた凝血塊がきつく嵌るより小さい直径のガラスチューブ（０．８×７ｃｍ）に移した。凝血塊の平均重量は約３．６ｇであった。
【０１１８】
単一の１ｍｌ用量の酸性化した生理的食塩水、プラスミン若しくはδ−プラスミンを、シリンジを使用して凝血塊に注入した。凝血塊をＴＨＥＬＣＯ実験室オーブン（Ｊｏｕａｎ，Ｉｎｃ．、バージニア州ウィンチェスター）中３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に凝血塊を再度篩の上に置いて液化した物質を除去し、そして消化された凝血塊の重量を測定した。凝血塊の溶解の程度を最初の凝血塊重量と残余の凝血塊の重量の間の差違から決定し、そして凝血塊重量の減少のパーセントとして表した。
【０１１９】
図１０は、このモデルでのδ−プラスミンを用いた溶解実験の結果を示す。単一の０．４４ｍｇ（モル濃度に基づき１ｍｇ／ｍｌのプラスミンに同等）用量のδ−プラスミンの注入は、６０分以内に３６％の凝血塊重量の減少をもたらした。同時に、生理的食塩水を注入した凝血塊の重量は４％のみ減少した。プラスミン（１．０ｍｇ）は、同一の時間で５０％の凝血塊重量の減少をもたらした。従って、これらのデータは、δ−プラスミンが血栓溶解効力を表し、そして直接血栓溶解剤として使用され得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】タンパク質分解的切断による活性化後の天然のプラスミンの図解である。Ｋ１−Ｋ５はクリングル領域１−５であり；また、ＳＰはセリンプロテアーゼドメインである。「α２−ＡＰ」は、クリングル１のα２−アンチプラスミン結合部位である。
【図２】図１中と同一の命名法を使用しかつＫ２−５の欠失を示す、本発明のプラスミノーゲン欠失変異体の図解である。
【図３】−１９ないし−１として番号付けされた１９残基のリーダー配列、および残基１−７９１として示されるプラスミノーゲン配列を示す、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す（図３に示されるところの配列番号３（ヒトプラスミノーゲンのｃＤＮＡ配列；および配列番号４、コードされるアミノ酸配列を参照されたい）。以下、すなわちδ−プラスミノーゲン配列（影付）；クリングルドメイン１−５（二重下線）；グリコシル化部位Ａｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６（太字で）；プラスミノーゲン活性化のＡｒｇ−Ｖａｌ活性化部位（太字で）；ならびにクリングル１中のリシン結合部位（下線および特別の位置の番号付けで）を包含する多数の特徴を示す。
【図４】天然のヒトプラスミ（ノーゲ）ンの５個のクリングルドメイン（１−５）間のポリペプチド配列の比較を示す。クリングル１中の同一の相対位置のものに同一であるアミノ酸残基を下線で示す。
【図５】非還元（レーン１）および還元（レーン２）δ−プラスミノーゲン調製物の８−２５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ストレプトキナーゼ（レーン３）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）（レーン４）およびウロキナーゼ（レーン５）でのδ−プラスミノーゲンのδ−プラスミンへの活性化は、２個のジスルフィド架橋により結合されたクリングル１（Ｋ１）およびセリンプロテアーゼドメイン（ＳＰ）よりなる二本鎖分子の形成をもたらす。
【図６】ウロキナーゼによるδ−プラスミノーゲンの活性化の図解である。ウロキナーゼ（５．８ｎＭ）を、１．０ｍＭのＳ−２２５１を含有するＰＢＳ中５μＭのδ−プラスミノーゲンの溶液に３７℃で添加した。吸光度の増大を４０５ｎｍでモニターした。
【図７】リシン−セファロース４Ｂへのδ−プラスミノーゲンの結合を示すクロマトグラムである。すなわち、０．５ｍｇの精製したδ−プラスミノーゲンを、トリス緩衝生理的食塩水、ｐＨ７．４で平衡化したリシン−セファロース４Ｂカラム（１×３ｃｍ）に適用した。結合したタンパク質は、ε−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）の０〜２０ｍＭ勾配により単一ピークとしてカラムから溶出された。２８０ｎｍの吸光度、および溶出液容量の関数としてのε−ＡＣＡの濃度をグラフ上に提示する。
【図８】δ−プラスミノーゲンのフィブリンへの結合を示す。変動する濃度のδ−プラスミノーゲンを、マイクロタイタープレート中でフィブリン塊とともに３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に塊をＰＢＳで徹底的に洗浄し、そしてｔＰＡの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液を各ウェルに添加した。３７℃での２時間インキュベーション後に液体を除去し、そして残存する固体の塊を１００μｌの１Ｍ ＮａＯＨで再構成した。残存するフィブリンの量を、これらの再構成した塊の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。フィブリンへのδ−プラスミノーゲンの結合の結果である線維素溶解の程度を、δ−プラスミノーゲン濃度の関数としてグラフにプロットした（実線）。点線は、結合方程式への実験データの最良適合を表す。
【図９】非還元（レーン１）および還元条件（レーン２）下の出発δ−プラスミノーゲン、ならびにまた非還元（レーン３）および還元（レーン４）条件下の最終的なδ−プラスミン調製物の８−２５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１０】酵素活性の対応する特徴付け（基質Ｓ−２２５１（Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド、ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、オハイオ州ウエストチェスター）に関するｋｃａｔおよびＫＭ）と一緒になったプラスミン、ミニプラスミン、マイクロプラスミンおよびδ−プラスミンの図解を示す。
【図１１】収縮全血塊のδ−プラスミン誘発性の溶解の図解である。各凝血塊（０．８×７ｃｍ）に１ｍｌ容量のベヒクル（酸性化した生理的食塩水、ｐＨ３．６）、プラスミン（１．０ｍｇ／ｍｌ）若しくはδ−プラスミン（０．４４ｍｇ／ｍｌ）を注入し、そして凝血塊の溶解を３７℃で１時間進行させた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドであって、固定されたリシンに結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
Ｎ末端クリングルドメインが、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４に相同である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
コードされるポリペプチドが、配列番号２に示される配列に最低９０％若しくは９５％、または９８％同一である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
コードされるポリペプチドが、配列番号２に示される配列に最低９８％同一である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
コードされるポリペプチドが配列番号２に示される配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号１に示される配列、若しくはその縮重バリアントである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに相同な１個のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに最低９０％同一な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに最低９０％同一なＣ末端ドメインを有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを含んでなるポリペプチドであって、該ポリペプチドが固定されたリシンに結合する、上記ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｎ末端クリングルドメインが、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４に相同である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドが、ミニプラスミンの線維素溶解活性のα２−アンチプラスミンによる阻害速度より最低約５倍より速い阻害速度の、α２−アンチプラスミンにより阻害される線維素溶解活性を表す、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
阻害速度が、ミニプラスミンの阻害速度より最低約１０倍、２０倍、３０倍若しくは４０倍より速い、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
固定されたリシンが、リシン−アガロース、リシン−ヒドロゲル、リシン−架橋アガロースよりなる群から選択される固体支持体マトリックスに結合されたリシンである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
固定されたリシンがリシン−架橋アガロースである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドが、ミニプラスミンのフィブリノーゲンに対する結合親和性よりも低いフィブリノーゲンに対する結合親和性を表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが、ミニプラスミンの部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性よりも高い、部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性を表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
プラスミノーゲン活性化部位およびプラスミノーゲンセリンプロテアーゼドメインに対しＮ末端に位置する単一のクリングルドメインを含んでなるポリペプチドであって、該クリングルドメインは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４との最低１残基より大きいアミノ酸配列の同一性を有し、かつ、ヒトプラスミノーゲンのクリングル１および４の天然の配列に関しての該単一のクリングル領域の保存的置換が、クリングル５との同一性比較の目的上天然の配列と異なると考えられない、上記ポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドが、配列番号２に示されるところのアミノ酸配列、およびその保存的置換を有する、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列の位置７６の相対位置に類似の相対位置に１アルギニン残基を有する、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０の発現ベクターを含んでなる培養細胞。
【請求項１】
天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドであって、固定されたリシンに結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
Ｎ末端クリングルドメインが、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４に相同である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
コードされるポリペプチドが、配列番号２に示される配列に最低９０％若しくは９５％、または９８％同一である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
コードされるポリペプチドが、配列番号２に示される配列に最低９８％同一である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
コードされるポリペプチドが配列番号２に示される配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号１に示される配列、若しくはその縮重バリアントである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに相同な１個のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４ドメインに最低９０％同一な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに最低９０％同一なＣ末端ドメインを有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
天然のヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン；ならびにヒトプラスミノーゲン中の対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを含んでなるポリペプチドであって、該ポリペプチドが固定されたリシンに結合する、上記ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｎ末端クリングルドメインが、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４に相同である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドが、ミニプラスミンの線維素溶解活性のα２−アンチプラスミンによる阻害速度より最低約５倍より速い阻害速度の、α２−アンチプラスミンにより阻害される線維素溶解活性を表す、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
阻害速度が、ミニプラスミンの阻害速度より最低約１０倍、２０倍、３０倍若しくは４０倍より速い、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
固定されたリシンが、リシン−アガロース、リシン−ヒドロゲル、リシン−架橋アガロースよりなる群から選択される固体支持体マトリックスに結合されたリシンである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
固定されたリシンがリシン−架橋アガロースである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドが、ミニプラスミンのフィブリノーゲンに対する結合親和性よりも低いフィブリノーゲンに対する結合親和性を表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが、ミニプラスミンの部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性よりも高い、部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性を表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
プラスミノーゲン活性化部位およびプラスミノーゲンセリンプロテアーゼドメインに対しＮ末端に位置する単一のクリングルドメインを含んでなるポリペプチドであって、該クリングルドメインは、天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然のヒトプラスミノーゲンのクリングル１若しくはクリングル４との最低１残基より大きいアミノ酸配列の同一性を有し、かつ、ヒトプラスミノーゲンのクリングル１および４の天然の配列に関しての該単一のクリングル領域の保存的置換が、クリングル５との同一性比較の目的上天然の配列と異なると考えられない、上記ポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドが、配列番号２に示されるところのアミノ酸配列、およびその保存的置換を有する、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列の位置７６の相対位置に類似の相対位置に１アルギニン残基を有する、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０の発現ベクターを含んでなる培養細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００７−５３３３２７（Ｐ２００７−５３３３２７Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０９６１６（Ｐ２００７−５０９６１６）
【出願日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１３５６２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５９９０
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（５０６０７４４８４）タレクリス・バイオセラピユーテイクス・インコーポレーテツド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１３５６２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５９９０
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（５０６０７４４８４）タレクリス・バイオセラピユーテイクス・インコーポレーテツド (10)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]