組換えＡＡＶビリオン産生における使用のための補助機能
【課題】有意のレベルの感染性アデノウイルスビリオン、または他の混入する副産物をも産生することなく、商業的に有意のレベルのrAAVビリオン粒子を産生し得る補助機能系を提供すること。
【解決手段】宿主細胞において組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持するに十分な、１つ以上の補助機能を提供する核酸分子であって、該分子が、（i）アデノウイルスVARNAを提供する配列、（ii）アデノウイルスE4ORF6コード領域、（iii）アデノウイルスE2aの72kDコード領域、ならびに（i）、（ii）、および（iii）の任意の組合せ、からなる群よ
り選択されることを特徴とする核酸分子。
【解決手段】宿主細胞において組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持するに十分な、１つ以上の補助機能を提供する核酸分子であって、該分子が、（i）アデノウイルスVARNAを提供する配列、（ii）アデノウイルスE4ORF6コード領域、（iii）アデノウイルスE2aの72kDコード領域、ならびに（i）、（ii）、および（iii）の任意の組合せ、からなる群よ
り選択されることを特徴とする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、アデノ随伴ウイルス（AAV）ビリオン産生における使用のための補助機能（accessory function）に関する。より詳細には、本発明は、適切な宿主細胞における効率的な組換えAAVビリオン産生を補助し得る補助機能を提供するベクター、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子送達は、後天性および遺伝性疾患の処置のために有望な方法である。遺伝子導入の目的のためのウイルスに基づく系（例えば、現在、この目的のための最も広く使用されるウイルスベクター系であるレトロウイルス系）が多数記載されてきた。種々のレトロウイルス系の記載については、例えば、米国特許第5,219,740号；MillerおよびRosman(1989) BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpaら(1991)Virology 180:849-852；Burnsら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；および、Boris-LawrieおよびTemin(1993)Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109を参照のこと。
【０００３】
アデノ随伴ウイルス(AAV）系もまた、遺伝子送達のために使用されている。AAVは、Dependovirus属に属するヘルパー依存性DNAパルボウイルスである。AAVは、増殖性感染を生じるためには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアのいずれかの、関連のないヘルパーウイルスの感染を必要とする。ヘルパーウイルスは、AAV複製における多くの段階に必要な補助機能を提供する。このような感染の非存在下では、AAVは、そのゲノムの宿主細胞染色体への挿入によって潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによる次の感染は、組み込まれたコピーをレスキューし、これは次いで感染性のウイルスの子孫を産生するために複製し得る。AAVは広範な宿主範囲を有し、そしてこのような細胞が適切なヘルパーウイルスで首尾良く感染される限り、任意の種由来の細胞中で複製し得る。従って、例えば、ヒトAAVは、イヌアデノウイルスで同時感染したイヌ細胞中で複製する。AAVは、ヒトまたは動物の疾患のいずれとも関連しておらず、そして組込みの際に宿主細胞の生物学的特性を変更しないようである。AAVの総説については、例えば、BernsおよびBohenzky(1987)Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307を参照のこと。
【０００４】
AAVゲノムは、4681塩基を含む直鎖状の一本鎖DNA分子から構成される（BernsおよびBohenzky、前出）。ゲノムは、DNA複製起点としておよびウイルスのパッケージングシグナルとして、cisで機能する逆方向末端反復配列（ITR）を各末端に含む。ITRは約145bpの長さである。ゲノムの内部非反復部分は、それぞれAAVrepおよびcap領域として知られる２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケージングに関連するウイルス性タンパク質をコードする。特に、少なくとも４つのウイルス性タンパク質のファミリーが、見かけの分子量に従って命名された、AAVrep領域、Rep78、Rep 68、Rep 52、およびRep 40から合成される。AAV cap領域は、少なくとも３つの部分（VP1、VP2、およびVP3）をコードする。AAVゲノムの詳細な記載については、例えば、Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129を参照のこと。
【０００５】
組換えAAVビリオンの構築が記載されている。例えば、米国特許第5,173,414号および同第5,139,941号；国際公開番号WO92/01070（1992年1月23日公開）およびWO93/03769（1993年3月4日公開）；Lebkowskiら (1988) Molec.Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincentら(1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter, B.J. (1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N. (1992) CurrentTopics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；およびKotin,R.M. (1994) HumanGene Therapy 5:793-801を参照のこと。
【０００６】
現在の組換えAAV（rAAV）ビリオンの産生は、AAVベクタープラスミドおよびAAVベクタープラスミドから失われている機能を相補するAAVヘルパー機能を提供する構築物を用いる宿主細胞への同時トランスフェクションを含む。この様式において、宿主細胞は、AAV複製およびパッケージングに必要なAAVタンパク質を発現し得る。次いで、宿主細胞は、補助機能を提供するヘルパーウイルスに感染させられる。ヘルパーウイルスは、一般に、感染性アデノウイルス（２型もしくは５型）またはヘルペスウイルスである。
【０００７】
AAVヘルパー機能は、AAVrepおよび／またはcapコード領域を含むが、AAV ITRを欠いているAAVヘルパープラスミドを介して提供され得る。従って、ヘルパープラスミドは、それ自身、複製もパッケージングもし得ない。以下に記載されているベクターを含むrepコード領域を含む多くのベクターが公知である：ATCC受託番号第53222号、同第53223号、同第53224号、同第53225号、および同第53226号を有する米国特許第5,139,941。同様に、AAVrepHHV-6のホモログを含むベクターを得る方法は、Thomsonら (1994) Virology 204:304-311に記載されている。米国特許第5,139,941号に記載されるベクターを含むcapコード領域を含む多くのベクターがまた記載されている。
【０００８】
AAVベクタープラスミドは、AAV複製およびパッケージング機能を提供するAAV ITRによって隣接される、機能的に関連する目的のヌクレオチド配列（例えば、選択された遺伝子、アンチセンス核酸分子、リボザイムなど）を含むように設計され得る。AAVヘルパープラスミドおよびヌクレオチド配列を有するAAVベクタープラスミドが一過性トランスフェクションによって宿主細胞に導入された後、トランスフェクションされた細胞は、AAVrepおよびAAVcap領域の転写および翻訳を指向するヘルパープラスミド上に存在するAAVプロモーターを他の機能の中からトランス活性化するヘルパーウイルス（最も代表的には、アデノウイルス）に感染させられ得る。続く宿主細胞の培養の際に、rAAVビリオン（目的のヌクレオチド配列を有する）およびヘルパーウイルス粒子が産生される。
【０００９】
宿主細胞が採取され、そして粗製抽出物が産生される場合、得られる調製物は、他の成分の中でも特に、ほぼ等量のrAAVビリオン粒子および感染性ヘルパービリオンを含む。rAAVビリオン粒子は、公知の技術を使用して混入しているヘルパーウイルス、組み立てられていないウイルス性タンパク質（ヘルパーウイルスおよびAAVのカプシド由来）および宿主細胞タンパク質の多くから精製され得る。２型アデノウイルスでの感染を用いて産生された精製されたrAAVビリオン調製物は、高いレベルの混入物を含む。詳細には、そのようなrAAVビリオン調製物において得られた総タンパク質の50％以上は、遊離のアデノウイルス線維タンパク質である。種々の量のいくつかの同定されていないアデノウイルスおよび宿主細胞タンパク質がまた存在する。さらに、有意なレベルの感染性アデノウイルスビリオンが得られ、熱不活性を必要とする。混入感染性アデノウイルスは熱処理（56℃で１時間）によって不活性化され得、そして感度の高いアデノウイルス増殖アッセイによって（例えば、許容細胞株における細胞変性効果（CPE）によって）検出不可能にされ得る。しかし、熱処理はまた、機能的rAAVビリオンの力価において約50％の低下を生じる。
【００１０】
補助機能を提供する感染性ヘルパーウイルス（例えば、２型アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）を使用するrAAVビリオンの産生は、いくつかの理由のために望ましくない。ヘルパーウイルスを使用するAAVベクター産生法は、特にヘルペスウイルスの使用に関して、多くの健康および安全の懸念を示す大量の高力価感染性ヘルパーウイルスの使用および操作を必要とする。また、rAAVビリオン産生細胞におけるヘルパーウイルス粒子の付随的な産生は、大量の細胞性の資源をrAAVビリオン産生から流用する。恐らく、このことは、より低いrAAVビリオン収量を生じる。
【００１１】
より詳細には、２型アデノウイルスでの細胞の感染が補助機能を提供するために使用される方法において、精製されたrAAVビリオン調製物において見出される95％を超える混入物はアデノウイルス由来である。主な混入物である、遊離のアデノウイルス線維タンパク質は、そのタンパク質とrAAVビリオン間の非共有結合のために、CsCl密度勾配上でrAAVビリオンと共精製される傾向がある。この結合は、特に２つの分離を非常に困難にするし、このことはrAAVビリオンの精製効率を低下させる。線維タンパク質を含む多くのアデノウイルス性タンパク質が、細胞傷害性であり得（通常、高濃度において）、従って、標的細胞に有害に影響するか、または標的細胞を殺傷し得ることが示されているので、そのような混入物は重要な問題であり得る。従って、必要な補助機能を提供する感染性ヘルパーウイルスの使用なしにrAAVビリオンを産生する方法が有利である。
【００１２】
多くの研究者が補助機能の遺伝子的根拠（特にアデノウイルス由来の機能）を研究してきた。一般に、以下の２つのアプローチがAAV複製に関与するアデノウイルス遺伝子を同定する試みのために使用されてきた：補助機能を提供する種々のアデノウイルス変異体の能力の試験；およびアデノウイルス感染非存在下でのAAV複製に対する、トランスフェクトされたアデノウイルス遺伝子、または領域の効果の研究。
【００１３】
野生型アデノウイルスでの感染によって得られるレベルまたはほぼそのレベルでAAV複製を（例えば、必要な補助機能を提供することによって）補助し得る種々のアデノウイルス変異体を用いる研究は、特定のアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域が、AAV複製に関与しないことを示してきた。しかし、アデノウイルス遺伝子および制御領域の多くが重なり合っておよび／または不完全にマップされているので、そのような研究による機能欠失データは、特定の遺伝子領域がAAV複製に関与しているという決定的な情報を提供する
ことはできなかった。
【００１４】
特に、以下の遺伝子または遺伝子領域における十分に良く特徴付けられた変異体を有するアデノウイルス変異体が、AAVウイルス複製に必要な補助機能を提供するそれらの能力について試験されてきた：E1a(Laughlinら、(1982) J.Virol. 41:868, Janikら、(1981)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:1925);E1b(Laughlinら、(1982), 前出, Janikら、(1981), 前出, Ostroveら、(1980)Virology 104:502);E2a(Handaら、(1975) J. Gen. Viorl.29:239, Strausら、(1976)J. Virol. 17:140,Myersら、(1980) J. Virol. 35:665, Jayら、(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927,Myersら、(1981) J. Biol. Chem. 256:567);E2b(Carter, B.J. (1990)"Adeno-Associated Virus Helper Functions", in CRCHandbook of Parvoviruses, vol. I (P. Tijssen編);E3 (Carterら、(1983) Virology 126:505);およびE4(Carterら、(1983),前出, Carter, B.J., (1995), 前出）。DNA複製不能および後期遺伝子合成不能である不完全に特徴付けられたアデノウイルス変異体がまた試験された（Itoら、(1970)J.Gen. Virol. 9:243, Ishibashiら、(1971) Virology 45:317)。
【００１５】
E2bおよびE3領域に欠損を有するアデノウイルス変異体は、AAV複製を補助することを示されてきた。このことは、E2bおよびE3領域が補助的機能を提供することにおそらく関与しないことを示す（Carterら、(1983),前出）。E1a領域を欠損しているか、または欠失されたE4領域を有する変異体アデノウイルスは、直接的または間接的であれいずれにおいてもAAV複製を補助することが出来ず、このことは、E1aおよびE4領域がAAV複製に必要であることを示す（Laughlinら、(1982),前出,Janikら、(1981), 前出, Carterら、(1983), 前出）。E1bおよびE2a変異体を用いる研究は、矛盾する結果を生じている。さらに、DNA複製不能および後期遺伝子合成不能であるアデノウイルス変異体は、AAV複製を許容することが示されている（Itoら、(1970),前出,Ishibashiら、(1971), 前出)。これらの結果は、アデノウイルスのDNA複製およびアデノウイルス後期遺伝子のいずれもAAV複製に必要ではないことを示す。
【００１６】
選択されたアデノウイルス遺伝子を用いるトランスフェクション研究が、トランフェクトされた１組のアデノウイルス遺伝子が、アデノウイルス感染によって提供されるレベルと同じレベルのAAV複製のための補助機能を提供し得るかどうかを立証するための試みにおいて使用されてきた。詳細には、インビトロのAAV複製が、単一アデノウイルス遺伝子または遺伝子の群をコードするアデノウイルス制限フラグメントの種々の組み合わせで一過性にトランスフェクションされたヒト293細胞を使用して評価されてきた（Janikら、(1981),前出）。上記のトランスフェクション研究は、アデノウイルスE1aおよびE1bを安定に発現する細胞中で行われたので、それら領域の必要性は、試験され得なかった。しかし、三つのアデノウイルス遺伝子領域（VAIRNA、E2aおよびE4）の組み合わせが、実質的にバックグランドを超えるレベルで補助機能（例えば、AAV複製を支持する）を提供し得る
ことが推定された。しかし、それは、アデノウイルスでの感染によって提供されるレベルよりなお約8,000倍低かった。３つの遺伝子の２つの組み合わせの全てが試験された場合
、補助機能レベルは、アデノウイルスでの感染によって提供されるレベルより10,000〜100,000倍低い範囲にあった。
【００１７】
選択された１型単純ヘルペスウイルス（HSV-1)遺伝子を用いたトランフェクション研究がまた、トランフェクトされた１組のHSV-1遺伝子が、HSV-1感染によって提供されるレベルと同じレベルのAAV複製の補助機能を提供し得るかどうかを立証するための試みにおいて行われてきた。Weindlerら、(1991)J.Virol.65:2476-2483。しかし、そのような研究
は、rAAVの産生ではなく、野生型AAV複製を支持するために必要なHSV-1遺伝子のみを同定することに限られていた。さらに、同定されたHSV-1補助機能は、AAVの複製を支持するにおいてアデノウイルス由来の機能より有意に効果的でなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、当該分野において、rAAVビリオン産生のために必要とされる補助機能のみを含むアデノウイルスゲノムのサブセット、またはアデノウイルスゲノムの機能的なホモログを同定する必要性は残存する。従って、サブセットは、適切な宿主細胞に導入された場合に、アデノウイルス感染を使用して産生される量に実質的に等価またはそれより多くの量でrAAVビリオンの産生を支持する、補助機能ベクターまたは補助機能系に含まれ得る。さらに、有意のレベルの感染性アデノウイルスビリオン、または他の混入する副産物をも産生することなく、商業的に有意のレベルのrAAVビリオン粒子を産生し得る補助機能系を提供する必要性は残存する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（項目１）適切な宿主細胞において組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持するための、１つ以上の補助機能を提供し、少なくとも１つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する、核酸分子であって、該分子が、（i）アデノウイルスVARNAを提供する配列、（ii）アデノウイルスE4 ORF6コード領域、（iii）アデノウイルスE2aの72kDコード領域、ならびに（i）、（ii）、および（iii）の任意の組合せ、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
（項目２）適切な宿主細胞において効率的な組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持するに十分な補助機能を提供し、そして少なくとも１つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する核酸分子。
（項目３）項目２に記載の核酸分子であって、該分子がアデノウイルス初期遺伝子領域2bおよび３を欠失することを特徴とする、核酸分子。
（項目４）ヒト293宿主細胞において効率的にrAAVビリオン産生を支持するに十分な補助機能を提供する、項目２または３に記載の核酸分子。
（項目５）項目４に記載の核酸分子であって、以下：
アデノウイルスVA RNAを提供する第１のヌクレオチド配列；
ORF 6を含むアデノウイルスE4コード領域を含む第２のヌクレオチド配列；および
アデノウイルスE2aコード領域を含む第３のヌクレオチド配列
を含む、核酸分子。
（項目６）項目２に記載の核酸分子であって、該分子はアデノウイルスによって感染し得ないか、またはアデノウイルスの複製を支持し得ない適切な宿主細胞において、効率的な組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持するための補助機能を提供することを特徴とする
、核酸分子。
（項目７）項目６に記載の核酸分子であって、以下：
アデノウイルスVA RNAを提供する第１のヌクレオチド配列；
ORF 6を含むアデノウイルスE4コード領域を含む第２のヌクレオチド配列；
アデノウイルスE2aコード領域を含む第３のヌクレオチド配列；および
アデノウイルスE1aおよびE1bコード領域を含む第４のヌクレオチド配列、
を含む、核酸分子。
（項目８）２型または５型アデノウイルスゲノム由来の１つ以上のヌクレオチド配列を含む、項目４または６に記載の核酸分子。
（項目９）項目１、２、または６のいずれかに記載の核酸分子を含む、補助機能ベクター。
（項目１０）前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする、項目９に記載の補助機能ベクター。
（項目１１）選択遺伝子マーカーをさらに含む、項目１０に記載の補助機能ベクター。
（項目１２）前記選択遺伝子マーカーが抗生物質耐性遺伝子を含むことを特徴とする、項目１１に記載の補助機能ベクター。
（項目１３）少なくとも１つの異種プロモーター領域をさらに含む、項目１０に記載の補助機能ベクター。
（項目１４）前記の少なくとも１つの異種プロモーター領域が、サイトメガロウイルス（CMV）即時初期プロモーター領域に対して実質的に相同であるヌクレオチド配列を含むこ
とを特徴とする、項目１３に記載の補助機能ベクター。
（項目１５）第１、第２、および第３の補助機能ベクターを含む、組換えAAV（rAAV）ビ
リオン産生のための補助機能系であって、ここで；
（ａ）該第１補助機能ベクターは、アデノウイルスVA RNAを提供するヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）該第２補助機能ベクターは、アデノウイルスE4 ORF6コード領域を含み；そして
（ｃ）該第３補助機能ベクターは、アデノウイルスE2aの72kDコード領域を含む、補助
機能系。
（項目１６）前記第１補助機能ベクターが、プラスミドpBSII-VA RNA（ATCC受託番号第98233号）であり、前記第２補助機能ベクターが、p3）3cE4ORF6（ATCC受託番号第98234号）であり、そして前記第３補助機能ベクターが、p3）3cE2A（ATCC受託番号第98235号）であることを特徴とする、項目１５に記載の補助機能系。
（項目１７）項目９に記載の補助機能ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
（項目１８）AAVベクターでトランスフェクトされた場合、組換えAAV（rAAV）ビリオンを産生し得る細胞であって、該細胞は、該細胞において発現され、AAVヘルパー機能を提供し得るAAVヘルパー構築物で同時トランスフェクトされた、項目１７に記載の宿主細胞を含む、細胞。
（項目１９）組換えAAV（rAAV）ビリオンを産生する方法であって、以下；
（ａ）適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程；
（ｂ）AAVヘルパー構築物を宿主細胞に導入する工程であって、該ヘルパー構築物は、該AAVベクターから欠失したAAVヘルパー機能を補完するために該宿主細胞において発現されるAAVコード領域を含む、工程；
（ｃ）項目１５に記載の補助機能系を該宿主細胞に導入する工程であって、該補助機能系は、該宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持するための補助機能を提供する、工程；および
（ｄ）該宿主細胞を培養してrAAVビリオンを産生する工程、
を包含する、方法。
（項目２０）組換えAAV（rAAV）ビリオンを産生する方法であって、以下；
（ａ）適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程；
（ｂ）AAVヘルパー構築物を該宿主細胞に導入する工程であって、該ヘルパー構築物は
、該AAVベクターから欠失したAAVヘルパー機能を補完するために該宿主細胞において発現されるAAVコード領域を含む、工程；
（ｃ）項目９に記載の補助機能系を該宿主細胞に導入する工程であって、該補助機能系は、該宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持するための該補助機能を提供する、工程；および
（ｄ）該宿主細胞を培養してrAAVビリオンを産生する工程、
を包含する、方法。
（項目２１）項目１９または２０に記載の方法によって産生される、組換えAAVビリオン。
【００２０】
発明の要旨
本発明は、適切な宿主細胞において効率的なAAV複製を支持するために必要とされる補助機能の同定に基づく。本発明は、このような機能を含み、そしてヘルパーウイルスの使用なしにrAAVビリオンの産生を可能にする系を提供する。
【００２１】
特定の実施態様において、本発明は、補助機能をコードし、そして少なくとも１つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する核酸分子に関する。その分子は、２型もしくは５型ゲノムアデノウイルス、またはその機能的なホモログ由来のヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターにおいて提供され得る。従って、１つの局面において、本発明は、(i)アデノウイルスのVARNAを提供する配列、(ii)アデノウイルスE4 ORF6のコード領域、(iii)アデノウイルスのE2aの72kDコード領域（E2aの72kDのDNA結合タンパク質をコードする）、およびヌクレオチド配列(i)、(ii)、(iii)の任意の組み合わせ、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むベクターに関する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、適切な宿主細胞において効率的な組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持し得る補助機能を提供し、そして少なくも１つのアデノウイルスの後期遺伝子領域を欠く核酸分子、ならびにその核酸分子を含むベクターに関する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、多数のヌクレオチド配列（アデノウイルスVA RNAを提供する配列、アデノウイルスE4コード領域を含む配列、およびアデノウイルスのE2aのコード領域を含む配列を含む）を含むベクターに関する。
【００２４】
本発明のさらに別の局面において、アデノウイルスVA RNAを提供する配列、アデノウイルスE4コード領域を含む配列、アデノウイルスE2aコード領域を含む配列、ならびにアデノウイルスのE1aおよびE1bコード領域を含む配列を含むベクターが提供される。
【００２５】
本発明の別の実施態様において、rAAVビリオン産生のための補助機能系が提供され、ここでこの系は適切な宿主細胞において効率的なAAVビリオン産生を支持するために適切な補助機能成分を提供する、多数の補助機能ベクターを含む。
【００２６】
本発明のなお別の実施態様において、rAAVビリオンを産生するための方法が提供される。この方法は、一般に、（１）適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程；（２）この細胞にAAVヘルパー構築物を導入する工程であって、ここでこのヘルパー構築物が、AAVベクターから欠失しているAAVヘルパー機能を補完するために宿主細胞において発現され
得る工程；（３）宿主細胞に１つ以上の補助機能ベクターを導入する工程であって、ここで１つ以上の補助機能ベクターは宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る補助機能を提供する工程；および（４）rAAVビリオンを産生する細胞を培養する工程、を包含する。
【００２７】
さらなる実施態様において、本発明の方法によって産生される組換えAAVビリオンもまた提供される。
【００２８】
本発明のこれらの、および他の実施態様は、本明細書中における開示を考慮して当業者に容易に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術範囲内のウイルス学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技法の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に十
分に説明されている。例えば、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual (最新版)；DNACloning: A Practical Approach, 第Ｉ巻および第II巻(D. Glover編）；Oligonucleotide Synthesis(N. Gait編、最新版)；Nucleic Acid Hybridization (B. HamesおよびS. Higgins編、最新版)；Transcriptionand Translation (B.HamesおよびS. Higgins編、最新版)；CRC Handbook of Parvoviruses, 第Ｉ巻および第II巻(P. Tijessen編)；Fundamental Virology、第2版, 第Ｉ巻および第II巻 (B.N. FieldsおよびD.M. Knipe編)を参照のこと。
【００３０】
本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、その内容が明らかに他を指図しない限り、複数の言及を含む。
【００３１】
Ａ．定義
本発明の記載において、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【００３２】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、宿主細胞中に外来DNAを確実に挿入するための方法または系をいう。このような方法は、組み込まれていない移入されたDNAの一過性発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製および発現、または宿主細胞のゲノムDNA中への移入された遺伝物質の組込みを生じ得る。遺伝子移入は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための独特のアプローチを提供する。多数の系が、哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発されている。例えば、米国特許第5,399,346号
を参照のこと。
【００３３】
「ベクター」により、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどのような、任意の遺伝子エレメントが意味され、これは、適正な制御エレメントに伴われる場合に複製可能であり、そして細胞間で遺伝子配列を移行させ得る。従って、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００３４】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「AAV ITR」により、AAVゲノムの各末端で見出される当該分野で認識される領域が意味され、これは、一緒にシスで、DNAの複製起点としておよびウイルスのためのパッケージングシグナルとして機能する。AAVITRは、AAV repコード領域と一緒に、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切り出しおよびレスキュー、ならびに２つの隣接するITR間にはさまれたヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノムへの組込みを提供する。
【００３５】
AAV ITR領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、AAV-2配列については、Kotin,R.M. (1994) Human Gene Therapy5:793-801；Berns, K.I.「パルボウイルス科およびその複製」Fundamental Virology、第2版、(B.N.FieldsおよびD.M. Knipe編)を参照のこと。本明細書中で使用される場合、「AAV ITR」は、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。さらに、AAVITRは、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むがそれらに限定されない、任意のいくつかのAAV血清型に由来し得る。さらに、AAVベクターにおいて、選択されたヌクレオチド配列に隣接する5'および3'ITRは、それらが意図するように、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にするように、ならびにAAVRep遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノム中への異種配列の組込みを可能にするように機能する限り、必ずしも同じAAV血清型もしくは単離株と同一であるかまたはそれに由来する必要はない。
【００３６】
「AAV repコード領域」により、ウイルスゲノムを複製させるために、および潜在的感染の間の宿主ゲノムへのウイルスゲノムの挿入のために集合的に必要とされるウイルスの複製タンパク質をコードする、当該分野で認識される、AAVゲノムの領域、またはその機能的ホモログ（例えば、AAV-2DNA複製を媒介することも知られているヒトヘルペスウイルス６（HHV-6）rep遺伝子（Thomsonら(1994) Virology 204:304-311））が意味される。従って、repコード領域は、AAVRep 78およびRep 68（「長形態のRep」）、ならびにRep52およびRep 40（「短形態のRep」）、またはその機能的ホモログをコードする遺伝子を少なくとも含む。AAVrepコード領域のさらなる記載については、例えば、Muzyczka,N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；およびKotin,R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801を参照のこと。本明細書中で使用する場合、repコード領域は、上記のAAV血清型のような任意のウイルス血清型に由来し得る。この領域は野生型遺伝子のすべてを含む必要はなく、適切なレシピエント細胞中で発現される場合に、存在するrep遺伝子が十分な組み込み機能を提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。
【００３７】
「AAV capコード領域」により、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされる、ウイルスのコートタンパク質をコードする、AAVゲノムの当該分野で認識される領域が意味される。従って、capコード領域は、コートタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする遺伝子を少なくとも含む。capコード領域のさらなる記載については、例えば、Muzyczka,N.(1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；およびKotin,R.M.(1994) Human Gene Therapy 5:793-801を参照のこと。本明細書中で使用される場合、AAV capコード領域は、上記のように、任意のAAV血清型に由来し得る。この領域は野生型cap遺伝子のすべてを含む必要はなく、AAVベクターとともに宿主細胞中に存在する場合に遺伝子が十分なパッケージング機能を提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。
【００３８】
「AAVベクター」により、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むがそれらに限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターが意味される。AAVベクターは、全体または一部が欠失した１つ以上のAAV野生型遺伝子、好ましくはrepおよび／またはcap遺伝子を有し得るが、機能的な隣接するITR配列を保持し得る。機能的ITR配列は、AAVビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングのために必要である。従って、AAVベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされるこれらの配列（例えば、機能的ITR）を少なくとも含むことが、本明細書中で定義される。ITRは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、そして、配列が機能的なレスキュー、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変更され得る。
【００３９】
「AAVヘルパー機能」は、発現されて、次に増殖性AAV複製のためにトランスで機能するAAV遺伝子産物を提供し得るAAV由来コード配列をいう。従って、AAVヘルパー機能は、主要なAAVオープンリーディングフレーム（ORF）（repおよびcap）の両方を含む。Rep発現産物は、とりわけ：AAVのDNA複製起点の認識、結合、およびニッキング；DNAヘリカーゼ活性；ならびにAAV（または他の異種の）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を有することが示されている。Cap発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。AAVヘルパー機能は、本明細書中では、AAVベクターから失われているAAV機能を、トランスで相補することに使用される。
【００４０】
用語「AAVヘルパー構築物」は、一般に、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入ベクターを産生するために使用される、AAVベクターから欠失したAAV機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。AAVヘルパー構築物は、一般に、溶菌性AAV複製に必要である、失われているAAV機能を相補するためにAAVrepおよび／またはcap遺伝子の一過性発現を提供するために使用される；しかし、ヘルパー構築物は、AAVITRを欠き、そしてそれ自体複製もパッケージングもし得ない。AAVヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。多くのAAVヘルパー構築物が記載されている（例えば、RepおよびCap発現産物の両方をコードする一般に使用されるプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45）。例えば、Samulskiら(1989)J. Virol. 63:3822-3828；およびMcCartyら (1991) J. Virol. 65:2936-2945を参照のこと。Repおよび／またはCap発現産物をコードする多くの他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第5,139,941号を参照のこと。
【００４１】
用語「補助機能（accessory function）」は、AAVがその複製のために依存する、非AAV由来ウイルス性および／または細胞性機能をいう。従って、この用語は、AAV複製のために必要とされるタンパク質およびRNA（AAV遺伝子転写の活性化、時期特異的AAVmRNAスプライシング、AAV DNA複製、Cap発現産物の合成およびAAVキャプシドアセンブリに関与する部分を含む）を捕らえる。ウイルスに基づく補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（１型単純ヘルペスウイルス以外）およびワクシニアウイルスのような任意の公知のヘルパーウイルスに由来し得る。
【００４２】
例えば、アデノウイルス由来補助機能は広く研究されており、そして補助機能に関与する多数のアデノウイルス遺伝子が同定され、そして部分的に特徴付けられている。例えば、Carter,B.J. (1990)「アデノ随伴ウイルスヘルパー機能」CRC Handbook of Parvoviruses、第Ｉ巻（P.Tijssen編）、およびMuzyczka,N. (1992) Curr. Topics. Microbiol. and Immun. 158:97-129を参照のこと。詳細には、初期アデノウイルス遺伝子領域E1a、E2a、E4、VAIRNAおよびおそらくE1bは、補助プロセスに関与すると考えられている。Janikら、(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925-1929。ヘルペスウイルス由来補助機能は、記載されている。例えば、Youngら、(1979)Prog.Med. Virol. 25:113を参照のこと。ワクシニアウイルス由来補助機能もまた記載されている。例えば、Carter,B.J.(1990)、前出、Schlehoferら、(1986) Virology 152:110-117を参照のこと。
【００４３】
用語「補助機能ベクター」は、一般に、補助機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。補助機能ベクターは、適切な宿主細胞中にトランスフェクトされ得、ここで次いでベクターは、宿主細胞におけるAAVビリオン産生を支持し得る。天然に存在するままの感染性ウイルス粒子（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス粒子）は、明白にこの用語から排除される。従って、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾンまたはコスミドの形態であり得る。
【００４４】
「効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る」により、宿主細胞のアデノウイルスヘルパーウイルスでの感染に際して得られ得るレベルと実質的に等価なまたはそれより高いレベルで、特定の宿主細胞におけるrAAVビリオン産生を相補するに十分である補助機能を提供する、補助機能ベクターまたは系の能力をいう。従って、効率的なrAAVビリオン産生を支持する、補助機能ベクターまたは系の能力は、補助ベクターまたは系を使用して得られるrAAVビリオン力価を、感染性アデノウイルスでの感染を使用して得られる力価と比較することにより決定され得る。より特定すると、等価な数の宿主細胞から得られるビリオンの量が、アデノウイルス感染を使用して得られる量の約200分の１以上、より好ましくは約100分の１以上、そして最も好ましくはアデノウイルス感染を使用して得られる量に等しいかまたはそれより多い場合、補助機能ベクターまたは系は、感染性アデノウイルスを使用して得られると実質的に同一またはそれより多い効率的なrAAVビリオン産生を支持する。
【００４５】
「組換えウイルス」により、例えば、粒子中への異種核酸構築物の付加または挿入によって、遺伝子的に改変されているウイルスが意味される。
【００４６】
「AAVビリオン」により、野生型（wt）AAVウイルス粒子（AAVキャプシドタンパク質コートと結合した直鎖状、一本鎖AAV核酸ゲノムを含む）のような完全なウイルス粒子が意味される。これに関して、いずれかの相補的センス（sense）の一本鎖AAV核酸分子（例えば、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）は、任意の１つのAAVビリオンにパッケージされ得、そして両鎖は等しく感染性である。
【００４７】
「組換えAAVビリオン」または「rAAVビリオン」は、本明細書中では、両側においてAAVITRにより隣接される、目的の異種ヌクレオチド配列を包膜するAAVタンパク質外皮から構成される感染性、複製欠損性ウイルスとして定義される。rAAVビリオンは、その中に導入されたAAVベクター、AAVヘルパー機能および補助機能を有している適切な宿主細胞において産生される。この方法において、宿主細胞は、AAVベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）をその後の遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子中にパッケージングするために必要とされるAAVポリペプチドをコードし得るようにされる。
【００４８】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来DNAの取り込みをいうように使用され、そして外因性DNAが細胞膜の内側に導入されている場合に、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が当該分野で一般に公知である。例えば、Grahamら(1973)Virology, 52:456、Sambrookら (1989) Molecular Cloning, a laboratorymanual,Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davisら (1986) Basic MethodsinMolecular Biology, Elsevier、およびChuら (1981) Gene 13:197を参照のこと。このような技術は、適切な宿主細胞中に、１つ以上の外因性DNA部分（例えば、ヌクレオチド組み込みベクターおよびその他の核酸分子）を導入するために使用され得る。
【００４９】
用語「宿主細胞」は、AAVヘルパー構築物、AAVベクタープラスミド、補助機能ベクター、または他の移入DNAのレシピエントとして使用され得る、または使用されている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を示す。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、一般に、外因性DNA配列でトランスフェクトされている細胞をいう。単一の親細胞の子孫が、自然の変異、偶発的な変異、または故意の変異によって、元の親と形態においてまたはゲノムDNA相補（complement）もしくは全DNA相補において必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「細胞株」は、インビトロにおける連続的または延長された増殖および分裂が可能である細胞の集団をいう。しばしば、細胞株は、単一の始原細胞に由来するクローン性集団である。自発的な変化または誘導された変化が、このようなクローン性集団の貯蔵または移入の間に、核型において生じ得ることは、当該分野でさらに公知である。それゆえ、言及される細胞株に由来する細胞は、先祖細胞または先祖培養物と正確に同一でなくてもよく、そして言及される細胞株はこのような変異体を含む。
【００５１】
用語「異種」は、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、通常は一緒には連結されていない、および／または通常は特定の細胞に伴われていない配列を示す。従って、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、天然では他の分子に結合して見出されない別の核酸分子の内の、またはこれに結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではコード配列に結合して見出されない配列により隣接されるコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見出されない構築物である（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞中に通常には存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種であると考えられる。対立遺伝子変異または天然に生じる変異事象は、本明細書で使用される場合、異種DNAを生じない。
【００５２】
「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボにおいて転写され（DNAの場合）そしてポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端における開始コドンおよび3'（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物のDNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえも含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の3'側に位置する。
【００５３】
「核酸」配列は、DNAまたはRNA配列をいう。この用語は、以下のような、しかしそれらに限定されない任意の公知のDNAおよびRNAの塩基アナログを含む配列を捕らえる：4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルシュードウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシ-アミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、お
よび2,6-ジアミノプリン。
【００５４】
用語DNA「制御配列」は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「IRES」）、エンハンサーなどを集合的にいい、これらはレシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。
【００５５】
用語「プロモーター領域」は、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域をいうためのその普通の意味で本明細書において使用され、ここで、調節配列は、RNAポリメラーゼを結合し得、そして下流（3'方向）のコード配列の転写を開始し得る遺伝子に由来する。
【００５６】
「作動可能に連結」は、そのように記載される成分がそれらの通常の機能を実行するように配置されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらし得る。制御配列は、それがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結」されていると考えられ得る。
【００５７】
ヌクレオチド配列に言及する場合、「単離された」により、示される分子が、同じタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下で存在することが意味される。従って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう；しかし、この分子は、組成物の基本的特徴に有害な影響を与えないいくらかのさらなる塩基または部分を含み得る。
【００５８】
本出願を通して特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的のために、例えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に関して「上流」、「下流」、「3'」、または「5'」に位置すると記載される場合、これは、当該分野において慣習的であるようにいわれる、DNA分子の「センス」鎖または「コード」鎖における配列の位置であると理解されるべきである。
【００５９】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分間の同一性の割合をいう。１つの部分由来の配列と別の部分由来の配列との間の対応は、当該分野で公知の技術によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報をアラインさせ、そして容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することによって、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較により決定され得る。あるいは、相同性は、相同性領域間での安定な二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数または複数）での消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定によって決定され得る。上記の方法を使用して決定したところ、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、および最も好ましくは少なくとも約95％のヌクレオチドまたはアミノ酸が、規定された長さの分子にわたってマッチする場合、２つのDNAまたは２つのポリペプチド配列は、互いに「実質的に相同」である。
【００６０】
所定のポリペプチドの「機能的ホモログ」または「機能的等価物」は、天然のポリペプチド配列に由来する分子、および、所望の結果を達成するように参照分子と同様の様式で機能する、組換えで産生される、または化学的に合成されるポリペプチドを含む。従って、AAVRep68またはRep78の機能的ホモログは、組み込み活性が残存する限り、これらのポリペプチドの誘導体およびアナログ（その内部でまたはアミノ末端もしくはカルボキシ末端で生じる、任意の単一のまたは複数のアミノ酸の付加、置換、および／または欠失を含む）を含む。
【００６１】
所定のアデノウイルスヌクレオチド領域の「機能的ホモログ」または「機能的等価物」は、異種アデノウイルス血清型に由来する類似の領域、別のウイルスまたは細胞性供給源に由来するヌクレオチド領域、ならびに、所望の結果を達成するように参照ヌクレオチド領域と同様の様式で機能する、組換えで産生される、または化学的に合成されるポリヌクレオチドを含む。従って、アデノウイルスVARNA遺伝子領域またはアデノウイルスE2a遺伝子領域の機能的ホモログは、ホモログが、バックグランドより上の検出可能なレベルでAAVビリオン産生を支持するためにその固有の補助機能を提供する能力を保持する限り、このような遺伝子領域の誘導体およびアナログ（領域内で生じる、任意の単一のまたは複数のヌクレオチド塩基の付加、置換、および／または欠失を含む）を含む。
【００６２】
Ｂ.一般的方法
本発明の中心は、ヘルパーウイルスによる感染なしに効率的にrAAVビリオンを産生させる補助機能系の開発である。従来の産生方法と異なり、補助機能は、rAAVビリオン産生を補うために必要な遺伝子を含む一つ以上のベクター（例えば、プラスミド）を宿主細胞へ導入することにより提供される。この様式で、本補助機能系は、有意なレベルのヘルパーウイルス粒子または他のウイルス産生物（例えば、アデノウイルス繊維タンパク質）に汚染されずに産業的に有意なレベルのrAAVビリオンの産生を支持し得る。rAAVビリオンの効率的な産生は、rAAVビリオンの収量が、補助機能を提供するための２型アデノウイルス感染を用いたときに得られるレベルより、約200倍より低くないレベルで得られる場合に達成される。
【００６３】
補助機能は、一つ以上のベクター上で提供される。ベクターは、rAAVビリオンの産生のために必要なアデノウイルス由来のヌクレオチド配列を含む。以下にさらに記載されるように、補助機能構築物上に存在する配列は、使用される宿主細胞によって決定され、そしてE1a、E1b、E2a、E4、およびVARNA領域を含み得る。
【００６４】
任意の特定の理論に拘束されることなく、アデノウイルスE1b、E2a、およびE4初期遺伝子によって提供される補助機能は、AAVのDNA複製において必要とされると考えられる。アデノウイルスE1b、E4、およびVARNA遺伝子領域によって提供される補助機能は、AAVの生活環において転写後事象または翻訳事象に関与するようである。E4によって提供される補助機能に関しては、E4コード領域のオープンリーディングフレーム６(ORF6)によってコードされるE434kDタンパク質のみが、明らかにAAV複製に必要とされる。アデノウイルス遺伝子領域E1aによって提供される補助機能は、他のアデノウイルス遺伝子領域（E1b、E2a
、E4およびVA RNAを含む）の転写または発現を活性化する調節因子として必要であると考えられる。
【００６５】
あるいは、本発明の補助機能ベクターは、それぞれのホモログが、置換されたアデノウイルス遺伝子の補助機能を提供する能力を保有する限り、アデノウイルス遺伝子配列を置換する一つ以上のポリヌクレオチドホモログを含み得る。従って、相同なヌクレオチド配列は、別のアデノウイルス血清型（例えば、２型アデノウイルス）、別のヘルパーウイルス部分（例えば、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス）に由来し得、または任意の他の好適な供給源に由来し得る。
【００６６】
さらに、本発明に従って構築された補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、またはコスミドの形態であり得る。あるいは、ベクターは、適切な制御エレメントおよび酵素と結合される場合、宿主細胞において補助機能を提供するために転写または発現され得る一つ以上の線状化されたDNAまたはRNAフラグメントの形態であり得る。上記のベクターの全ては、当該分野に公知のトランスフェクション技術を使用して、好適な宿主細胞に容易に導入され得る。このようなトランスフェクション方法は、カルシウムリン酸供沈(Grahamら、(1973)Virol.52:456-467)、培養細胞への直接マイクロインジェ
クション(Capecchi, M.R. (1980) Cell 22:479-488)、エレクトロポレーション(Shigekawaら、(1988)BioTechniques6:742-751)、リポソーム媒介遺伝子導入(Manninoら、(1988) BioTechniques 6:682-690)、脂質媒介トランスフェクション(Felgnerら、(1987)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417)および、高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達(Kleinら、(1987)Nature327:70-73)を含み、これら文献に記載されている。
【００６７】
補助機能ベクターは従来の組換え技術を使用して操作され得る。詳細には、核酸分子は、例えば、ポリリンカーオリゴヌクレオチドなどを使用してクローニングベクターに制限酵素フラグメントを連結することによって、一つ以上の補助機能ヌクレオチド配列を構築物に挿入することにより、任意の所望される順序で容易にアセンブリされ得る。次いで、新たに形成された核酸分子は、ベクターから切り出され得、そして制限酵素または当該分野に周知の他の技術を使用して適切な発現構築物中に配置され得る。
【００６８】
より詳細には、選択されたアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域（例えば、E1a、E1b、E2a、E4、およびVA RNA）、あるいはそれらの機能的ホモログは、ウイルスゲノムから、または同じものを含むベクターから切り出され得、そして標準の連結技術（例えば、Sambrookら、前出、に記載）を使用して、好適なベクターに個々に、または共に連結されて挿入されて補助機能構築物を提供し得る。図２に関連して、そのような構築物の一つは、５型アデノウイルスゲノム由来の４つの核酸分子（VARNAを含む領域；E2aを含む領域；E4を含む領域、およびE1a、E1bを含む領域）を含むように操作され得る。詳細には、図２
は以下を示す：1,724bpのSalI-HinDIIIフラグメントであるVA RNAを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約9,831から約11,555の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；5,962bpのSrfI-BamHIフラグメントであるE2aを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約21,606から約27,568の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；3,669bpのHphI-HinDIIIフラグメントであるE4を含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約32,172から約36,841の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；および4,102bpのBsrGI-Eco47IIIフラグメントであるE1a、E1bを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約192から約4294の位置にわたるヌクレオチドに対応する）、ここで核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能の完全な相補を提供する。連結は、20mMTris-Cl pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM〜50mM NaCl、および40μMATP、０℃で0.01〜0.02(Weiss)ユニットのT4DNAリガーゼ（「付着末端」連結のため）、または1mM ATP、14℃で0.3〜0.6(Weiss)ユニットのT4DNAリガーゼ（「平滑末端」連結のため）のいずれか中で達成され得る。分子内「付着末端」連結は、通常、30〜100μg/mlの総DNA濃度で実施される（５〜100nMの最終濃度）。次いで、アセンブリされた分子は、補助機能構築物を細胞間で転移し得る発現ベクターに容易に挿入され得る。
【００６９】
あるいは、一つ以上の補助機能を含む核酸分子は、当該分野の従来の固相直接オリゴヌクレオチド合成化学および酵素連結方法の組合せを使用して、合成的に得られ得る。合成配列は、制限酵素部位のような特徴を有するように構築され得、そして市販のオリゴヌクレオチド合成装置（例えば、AppliedBiosystems, Inc.(Foster City, CA)から入手可能の装置）でホスホルアミダイト方法を使用して調製され得る。例えば、Beaucageら、(1981)TetrahedronLett. 22:1859-1862を参照のこと。２型アデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、一般的に公知であり、そして公的に入手可能である（例えば、GeneBank参照名：ADRCG、アクセス番号：J01917；およびNCBI同定番号：209811）。５型アデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、２型アデノウイルスゲノムと99％相同であると考えられている。哺乳動物細胞における合成分子の発現に好ましいコドンもまた、容易に合成され得る。次いで、完全な核酸分子が、上記の方法によって調製された重複したオリゴヌクレオチドからアセンブリされる。例えば、Edge,Nature(1981)292:756; Nambairら、Science (1984) 223:1299; Jayら、J. Biol.Chem.(1984) 259:6311を参照のこと。
【００７０】
アデノウイルス遺伝子領域が、補助機能を提供するために本発明のベクターにおいて使用される場合、これらの領域は、これらの転写または発現を指向する制御配列に作動可能に連結される。このような制御配列は、通常、野生型アデノウイルスゲノム中の遺伝子領域と結合されたこれらのアデノウイルス制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が所望される場合、使用され得る。有用な異種プロモーター配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するプロモーター配列を含む。例として、相同なアデノウイルスプロモーター、SV40初期プロモーター、マウス乳ガンウイルスLTRプロモ
ーター；アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)；単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター（例えば、CMV即時初期プロモーター領域）、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが含まれるが、これらに制限されない。さらにマウスメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、本明細書中において使用が見出される。このようなプロモーター配列は、例えば、Stratagene(SanDiego, CA)から市販されている。
【００７１】
さらに、本発明のベクターはまた、選択マーカーを含むように構築され得る。好適なマーカーは、核酸構築物でトランスフェクトされた細胞が適切な選択培地で増殖される場合に、抗生物質耐性、または感受性を与える遺伝子、または色を与える遺伝子、または抗原的特徴を変化する遺伝子を含む。本発明の実施において有用な特定の選択マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドリン酸転移酵素(APH)をコードする）を含み、これはG418に対する耐性を与えることにより哺乳動物細胞における選択を可能にする（Sigma,St.Louis, MO.から入手可能）。他の好適なマーカーは当業者に公知である。
【００７２】
アデノウイルスの補助機能遺伝子または遺伝子領域（例えば、E1a、E1b、E2a、E4、VA RNA、および／またはそれらの機能的ホモログ）の完全な相補物を含む補助機能ベクターは、ヘルパーウイルスに寛容でない宿主細胞（例えば、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスによって感染可能でない、またはヘルパーウイルスの複製を支持し得ない）を含む宿主細胞に補助機能を提供するために使用され得る。この様式で、rAAVビリオン産生は、以前はそのような産生の支持に対しては屈折していた宿主細胞を含む広範な宿主細胞において実施され得る。
【００７３】
あるいは、補助機能ベクターは、補助機能の完全相補を下回るものを含むように構築され得る。このようなベクターは、すでに一つ以上の補助機能を与え得る細胞、例えば、一つ以上の補助機能を遺伝的に（例えば、細胞が補助機能のホモログを発現する場合）、または形質転換事象によって与えられる細胞において使用され得る。補助機能の完全相補を下回るものを含む補助機能ベクターはまた、他の補助的な補助機能構築物と組み合わせて使用され得る。
【００７４】
詳細には、好適な宿主細胞は、通常の組換え技術を使用して操作されて、一つ以上の補助機能を提供する細胞を産生し得る。例えば、ヒト細胞株293は、５型アデノウイルスDNAフラグメントで形質転換されたヒト胚腎臓細胞株(Grahamら、(1977)J. Gen.Virol. 36:59)であり、そしてアデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子を発現する(Aielloら、(1979)Virology 94:460)。293細胞株は、容易にトランスフェクトされ、そしてrAAVビリオンの産生のための特に便利なプラットフォームを提供する。従って、本発明の特に好ましい一つの実施態様において、アデノウイルスE2a、E4およびVARNA遺伝子領域、またはそれらの機能的ホモログのみを有する補助機能ベクターが提供される。
【００７５】
図１に関連して、一つのそのような構築物が、５型アデノウイルスゲノム由来の３つの核酸分子：1,724bpのSalI-HinDIIIフラグメントであるVARNAを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約9,831から約11,555の位置にわたるヌクレオチドに対応する）;5,962bpのSrfI-BamHIフラグメントであるE2aを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約21,606から約27,568の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；および3,669bpのHphI-HinDIIIフラグメントであるE4を含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約32,172から約36,841の位置にわたるヌクレオチドに対応する）を含むように操作され得、ここで核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能の切形の相補を提供する。
【００７６】
図３に関連して、別の構築物が、２型アデノウイルスゲノム由来の３つの核酸分子：732bpのEcoRV-SacIIフラグメントであるVA RNAを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約10,423から約11,155の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；5,962bpのSrfI-KpnIフラグメントであるE2を含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約21,606から約27,568の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；および3,192bpのSrfI-SpeI改変フラグメントであるE4ORF6を含む改変フラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約32,644から約34,120の位置にわたるヌクレオチドに対応する）を含むように操作され得る。核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能のなおさらなる切形の相補を提供する。
【００７７】
これらのベクターは組換えおよび／または合成技術を使用して上記のように構築され得、そして異種プロモーター領域、選択マーカーなどのような種々の補助構成成分を含み得る。293宿主細胞へのトランスフェクションに際して、ベクターは、rAAVビリオンの効率的な産生を支持し得る補助機能を提供する。
【００７８】
一旦操作されると、本発明の補助機能ベクターは、rAAVビリオン産生のための種々の系に使用され得る。例えば、AAVヘルパー機能を提供するために、細胞において発現され得るAAVベクターおよびAAVヘルパー構築物で同時トランスフェクトされた場合、一つ以上の補助機能ベクターでトランスフェクトされた好適な宿主細胞は、これらによってrAAVビリオンを産生し得る。
【００７９】
AAVベクター、AAVヘルパー構築物、および補助機能ベクターは、同時に、または連続的のいずれかで、上記のトランスフェクション技術を使用して宿主細胞に導入され得るようになる。
【００８０】
目的のヌクレオチド配列を送達するためのrAAVビリオンを産生するために使用されるAAVベクターは、両方の末端（５’末端および３’末端）で機能的AAV ITRと連結した、一つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むように構築され得る。本発明の実施において、AAVベクターは、一般に、少なくとも一つのAAVITRおよび異種ヌクレオチド配列に関して好適
に位置された適切なプロモーター配列、ならびに異種配列の下流に位置された少なくとも一つのAAV ITRを含む。５’および３’ITRは、これらが意図されたように機能する限り、同じAAV単離物と必ずしも同一である、またはこれに由来する必要はない。
【００８１】
AAVベクターにおいて使用するための好適な異種ヌクレオチド配列は、任意の機能的に
関連したヌクレオチド配列を含む。従って、本発明の実施において使用するためのAAVベクターは、受容細胞のゲノムから欠損または欠失するタンパク質をコードする任意の所望の遺伝子、または所望の生物学的もしくは治療効果（例えば、抗ウイルス機能）を有する非天然のタンパク質をコードする任意の所望の遺伝子のいずれか、あるいはアンチセンスまたはリボザイム機能を有する分子に対応し得る配列を含み得る。好適な遺伝子は、以下の処置のために使用され得る遺伝子を含むが、これらに限定されない：AIDS、ガン、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症のような疾患を含む炎症性疾患、自己免疫、慢性および感染性疾患；種々の貧血、サラセミア、および血友病を含む種々の血液疾患；嚢包性線維症、ゴーシェ病、アデノシンジアミナーゼ(ADA)欠損、気腫などのような遺伝的欠損。ガン、心血管疾患、およびウイルス性疾患のアンチセンス治療において有用である多くのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、mRNAの翻訳開始部位(AUGコドン)の周囲の配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド）が、当該分野において記載されている。例えば、Hanら、(1991)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:4313-4317;Uhlmannら、(1990) Chem. Rev. 90:543-584;Heleneら、(1990)Biochim.Biophys. Acta. 1049:99-125;Agarwalら、(1988) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:7079-7083;およびHeikkilaら、(1987)Nature 328:445-449を参照のこと。好適なリボザイムの論議については、例えば、Cechら、(1992)J. Biol. Chem.267:17479-17482、およびGoldbergらの米国特許第5,225,347号を参照のこと。
【００８２】
AAVベクターはまた、プロモーターおよびポリアデニル化部位のような制御配列、ならびに選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列、および転写の誘導を可能にする他の制御エレメントを含み得る。このようなAAVベクターは、当該分野で周知の技術を用いて構築され得る。例えば、米国特許第5,173,414号；国際公開番号第WO92/01070号（1992年１月23日に公開された）および同第WO93/03769号（1993年３月４日に公開された）；Lebkowskiら、(1988)Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincentら、(1990)Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter、B.J. (1992) CurrentOpinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N. (1992) Current Topics inMicrobiol. and Immunol. 158:97-129；Kotin,R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801；ShellingおよびSmith(1994) GeneTherapy 1:165-169；ならびにZhouら（1994）J. Exp. Med. 179:1867-1875を参照のこと。
【００８３】
本発明の方法において、AAVヘルパー構築物を使用して、AAVベクターから欠失されたAAV機能を相補する。以下を含む多くの適切なAAVヘルパー構築物が記載されている：例えば、repおよびcap発現産物の両方をコードするプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45（例えば、Samulskiら（1989）J.Virol.63:3822-3828およびMcCartyら（1991）J. Virol. 65:2936-2945を参照のこと）。この様式においてrAAVビリオン産生を支持する相補性AAVヘルパー機能は、当該分野で容認された技術である。しかし、AAVベクター中に存在するAAVITR配列と、ヘルパー構築物中に存在するAAVヘルパー機能配列との間での相同組換え事象によって、このような技術はまた、rAAVビリオンストック中に野生型AAVビリオンの混入を生じる。AAVに基づくベクター系中の野生型AAV粒子の存在は、組換えAAVビリオンの意図されない拡大を潜在的に導き得、そして外来遺伝子の効率的な発現を妨げ得る。
【００８４】
Ｃ．実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、例示の目的でのみ提供され、そして本発明の範囲をいかなるようにも限定することを意図しない。
【００８５】
使用された数字（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にする努力が行われたが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん許容されるべきである。
【００８６】
プラスミド構築
プラスミドJM17（McGroryら（1988）Virology163:614-617）（５型アデノウイルスの環状単離物を、アデノウイルスE1a遺伝子の末端の唯一のXbaI部位に挿入されたプラスミドベクターpBR322Xとともに含む）を、アデノウイルス遺伝子の供給源として使用した。５型アデノウイルスおよびpJM17の両方とも完全には配列決定されていない。従って、以下に記載される５型アデノウイルスのフラグメントのサイズはほぼ正確である。２型アデノウイルスが完全に配列決定されており、そして２型および５型アデノウイルスが約99％相同であると考えられているので、５型アデノウイルスのフラグメントのサイズは、対応する２型アデノウイルスのフラグメントに基づいて近似される。
【００８７】
プラスミドpBSII-VARNA（ATCCアクセス番号98233）を以下のように構築した。約5,324bpのHinDIII-HinDIIIフラグメント（５型アデノウイルスVA RNAIおよびIIコード領域を含む）をプラスミドpJM17から得た。5,324bpのフラグメントを、プラスミドベクターpBIIs/k-（Stratageneから入手した）のHinDIII部位に挿入した。5,324bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノム（例えば、GeneBank参照名称：ADRCG、アクセス番号：J01917；およびNCBI同定番号：209811として公に入手可能）の6,231位から11,555位（HinDIII部位）に伸びるヌクレオチドに対応する。
【００８８】
プラスミドpBSII-E2a+E4を以下のように構築した。約15,667bpのBamHI-XbaIフラグメント（５型アデノウイルスE2a、E3、およびE4コード領域、頭と頭で連結されたアデノウイルス末端反復、ならびに５型アデノウイルスE1aコード領域の一部を含む）をプラスミドpJM17から得た。プラスミドベクターpBSIIs/k-を、BamHIおよびXbaIで切断し、そして15,667bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。15,667bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの21,606位（BamHI部位）から35,937位（3'末端の遠位末端）に伸びるヌクレオチド、および１位（5'末端の最初）から1,336位（XbaI部位）に伸びるヌ
クレオチドに対応する。
【００８９】
プラスミドpBSII-E2aを以下のように構築した。約5,935bpのBamHI-EcoRIフラグメント（５型アデノウイルスE2aコード領域を含む）をプラスミドpJM17から得た。プラスミドベクターpBSIIs/k-をBamHIおよびEcoRIで切断し、そして5,935bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。5,935bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの15,403位（BamHI部位）から21,338位（EcoRI部位）に伸びるヌクレオチドに対応する。
【００９０】
プラスミドpBSII-E4を以下のように構築した。約5,111bpのXhoI-XbaIフラグメント（５型アデノウイルスE4コード領域、頭と頭で連結されたアデノウイルス末端反復、および５型アデノウイルスE1コード領域の一部を含む）をプラスミドpJA17から得た。プラスミドベクターpBSIIs/k-を、XhoIおよびXbaIで切断し、そして5,111bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。5,111bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの29,788位（XhoI部位）から35,937位（3'末端の遠位末端）に伸びるヌクレオチド、および１位（5'末端の最初）から1,336位（XbaI部位）に伸びるヌクレオチドに対応する。
【００９１】
プラスミドpWadhlacZを以下のように構築した。プラスミドpUC119（GeneBank参照番号：U07649、GeneBankアクセス番号：U07649）を、AflIIIおよびBspHIで部分的に消化し、クレノウ酵素を用いて平滑末端に改変し、次いで連結して、細菌の起点およびamp遺伝子のみを含む（ポリリンカーおよびF1起点を取り除いた）を含む環状の1732bpのプラスミドを形成した。平滑末端化し、そして連結したAflIIIおよびBspHIの連結部は唯一のNspI部位を形成する。1732bpのプラスミドをNspIで切断し、T4ポリメラーゼを用いて平滑末端に改変し、そしてpUC119ポリリンカーから得た20bpのHinDIIIーHinCIIフラグメント（クレノウ酵素を用いて平滑末端に改変した）を、プラスミドの平滑化したNspI部位に連結した。平滑化したポリリンカー由来のHinDIII部位を再度作製し、次いで細菌の複製起点に隣接して配置した。次いで、得られたプラスミドを唯一のPstI/Sse8387I部位で切断し、そしてSse8387I-PvuII-Sse8387Iオリゴヌクレオチド（5'-GGCAGCTGCCTGCA-3'（配列番号１)）をそこに連結した。残っている唯一のBspHI部位を切断し、クレノウ酵素を用いて平滑末端に改変し、そしてAscIリンカーを含むオリゴヌクレオチド（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号２)）をそこに連結し、BspHI部位を排除した。得られたプラスミドをpWeeと称した。
【００９２】
pWadhlacZ構築物を作製するために、CMVlacZ発現カセット（AAV ITRによって5'および3'が隣接されたヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は以下のエレメントを含む：CMVプロモーター、hGHの第１のイントロン、adhlacZフラグメント、およびSV40初期ポリアデニル化部位を含む）を、複数の工程を用いてpWeeの唯一のPvuII部位に挿入し、その結果CMVプロモーターは、pWeeの細菌のamp遺伝子に隣接して配置された。
【００９３】
より詳細には、CMVlacZ発現カセットは、プラスミドpsub201CMVから誘導され、以下のように構築された。制限酵素部位：NotI-MluI-SnaBI-AgeI-BstBI-BssHII-NcoI-HpaI-BspEI-PmlI-RsrII-NotIをコードし、そして以下のヌクレオチド配列：5'-GCGGCCGCACGCGTACGTACCGGTTCGAAGCGCGCACGGCCGACCATGGTTAACTCCGGACACGTGCGGACCGCGGCCGC-3'（配列番号３）
を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてpUC119の平滑末端に改変したKasI-EarI部位（部分的）にクローン化して、2757bpのベクターフラグメントを得た。CMV即時初期プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む653bpのSpeI-SacIIフラグメントを、2,757bpのベクターフラグメントのSnaBI部位にクローン化した。さらに、hGHの第１のイントロンをコードするヌクレオチド配列を含む、269bpのPCRで作製したBstBI-BstBIフラグメント（これは以下のプライマーを用いて得られた：5'-AAAATTCGAACCTGGGGAGAAACCAGAG-3'（配列番号４）および3'-aaaattcgaacaggtaagcgcccctTTG-5'（配列番号５)）を、2,757bpのベクターフラグメントのBstBI部位にクローン化し、そしてpCMV-βプラスミド（Clonetechから入手した）由来のSV40初期ポリアデニル化部位を含む、135bpのHpaI-BamHI（平滑末端に改変した）フラグメントを、目的のベクターフラグメントのHpaI部位にクローン化して、p1.1cと称されるプラスミドを得た。次いで、p1.1cプラスミドをNotIで切断して、第１のCMV発現カセットを得た。
【００９４】
プラスミドpsub201（Samulskiら、（1987）J.Virol 61:3096-3101）をXbaIで切断し、平滑末端に改変し、そしてNotIリンカー（5'-TTGCGGCCGCAA-3'（配列番号６)）をその末端に連結して、細菌の複製起点およびamp遺伝子を含むベクターフラグメントを得た。ここで、ベクターフラグメントはNotI部位に両側で隣接されている。NotIで切断した後、第１のCMV発現カセットをpsub201ベクターフラグメントにクローン化して、psub201CMVを作製した。このプラスミド由来のITRに結合された発現カセットを、PvuIIでの切断によって単離し、そしてpWeeをPvuIIで切断した後、このプラスミドに連結して、pWCMVを作製した。次いで、pWCMVをBssHIIで切断し（部分的）、そしてadhlacZ遺伝子を含む3246bpのフラグメント（プラスミドpCMV-βから得たSmaI-DraIヌクレオチドフラグメントの末端にAscIリンカー（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号７))を連結して3246bpのフラグメントを得た）を、pWCMVのBssHII部位に連結して、pWadhlacZ構築物を得た。
【００９５】
プラスミドpW1909adhlacZを以下のように構築した。AAVrepおよびcapコード領域を含む4723bpのSpeI-EcoRVフラグメントを、プラスミドpGN1909（ATCCアクセス番号69871）から得た。pGN1909プラスミドは、repコード領域についてその通常の位置（野生型AAVゲノムにおける位置）から下流になるような構築物に配置されるAAVp5プロモーター領域とともに、AAVrepおよびcap遺伝子を有する高効率AAVヘルパープラスミドである。4723bpのフラグメントを平滑末端に改変し、そしてAscIリンカー（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号８)）を平滑末端に連結した。次いで、得られたフラグメントをpWadhlacZの唯一のAscI部位に連結し、そしてAAVコード配列が構築物中の細菌の複製開始点に隣接して配置されるように方向付けした。
【００９６】
プラスミドpW620adhlacZを以下のように構築した。AAVrepおよびcapコード領域を含む4439bpのMscIフラグメントを、プラスミドpSM620（Samulskiら（1982）Proc.Natl.Acad. Sci. USA 79:2077-2081）から得た。4439bpのフラグメントを平滑末端に改変し、そしてAscIリンカー（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号９)）を平滑末端に連結した。次いで、得られたフラグメントをpWadhlacZの唯一のAscI部位に連結し、そしてAAVコード配列が構築物中の細菌の複製開始点に隣接して配置されるように方向付けした。
【００９７】
プラスミドpW1909を以下のように構築した。pW1909adhlacZプラスミドをSse8387で切断し、そして6506bpのSse8387I-Sse8387Iフラグメント（アンピシリン耐性遺伝子、coli1複製起点、およびAAVヘルパー配列を含む）を、分子内連結により再環化して、pW1909構築物を得た。
【００９８】
pVlacZベクタープラスミドは、pUC119プラスミド中にクローン化されたpW1909adhlacZから得られるSse8387I-Sse8371Iフラグメントの改変バージョンである。pVlacZのSse8387I-Sse8371Iは、AAV逆方向末端反復（ITR）由来ではない全てのAAV配列が排除されている点で、pW1909のSse8387I-Sse8371Iフラグメントとは異なる。プラスミドpVlacZを以下のように構築した。AAV血清型２の塩基対122〜145を下流のNotI適合性末端と組み合わせることによって形成されたDNAの合成断片を構築し、全てのＤループを含むAAVITR配列を含むMscI-NotIフラグメントを得た。合成DNAを、pW1909adhlacZプラスミド由来の4384bpのNotIフラグメントの両末端に連結した。4384bpのフラグメントはCMVlacZ配列を含む。次いで、得られたフラグメントをpW1909adhlacZの6732bpのMscIフラグメントに連結して組立て（assembly）構築物を得た。組立て構築物をSse8387Iで切断して4666bpのSse8387I-Sse8371Iフラグメント（CMVlacZ配列を含む）を得、そして4666bpのフラグメントをpUC119中にSse8387I部位で連結してpVlacZベクタープラスミドを得た。
【実施例】
【００９９】
実施例１
補助機能を供給するためのトランスフェクトされたアデノウイルス遺伝子を用いるrAAVビリオンの産生
トランスフェクションによって適切な宿主細胞中に導入されたアデノウイルス遺伝子が、AAV複製の状況におけるアデニウイルス感染によって提供される補助機能に類似の補助機能を提供し得るかどうかを決定するために、以下の実験を行った。
【０１００】
安定なヒト細胞株由来の細胞である293（例えば、アクセス番号CRL1573のもとでATCCを通じて容易に入手可能）を、10cmの組織培養ディッシュに1×106細胞／ディッシュでプレートし、４回の二連の実験群を提供した。次いで、細胞を37℃で増殖させ、トランスフェクションの前の約24〜48時間にわたって90％のコンフルエントに到達させた。各群において、プラスミドpW1909adhlacZを、レスキュー可能なAAVlacZベクター、ならびにAAVrepおよびcapコード領域の供給源として使用した。
【０１０１】
トランスフェクションを、改変されたリン酸カルシウム法を用いて、計20μgのDNAで５時間行った。より詳細には、トランスフェクションの１〜４時間前に組織培養プレート中の培地を、10％のFCS、１％のpen/strep、および１％のグルタミンを含有する新鮮なDME/F12培養培地で置き換えた。１以上のベクターを含む計20μgのDNAを、１mLの滅菌した300mMのCaCl2に添加し、次いでこれを１mLの滅菌した２×HBS溶液（280mMのNaCl、50mMのHEPES緩衝液、1.5mMのNa2HPO4を混合し、そして10MのNaOHでpH7.1に調製することによって形成される）に添加し、そして穏やかに逆さにすることによってすぐに混合した。得られた混合物をすぐに10cmプレートの90％のコンフルエント細胞（10mLの上記の培養培地中）にピペッティングし、そして回転させて均質な溶液を作製した。プレートを５％のCO2インキュベーターに移し、そして撹拌せずに約５時間37℃で培養した。トランスフェクション後、培地をプレートから取り除き、細胞を滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で１回洗浄した。
【０１０２】
アデノウイルス作用（working）ストックを、２型アデノウイルスのマスターストックを、10％のFCS、１％のpen/strep、１％のグルタミン、および25mMの滅菌したHEPES緩衝液（pH7.4）を加えたDME/F12中で106pfu/mlの濃度に希釈することによって調製した。
【０１０３】
第１群由来の細胞培養物を、各10μgのプラスミドpW1909adhlacZおよびpBSII s/k-でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、１感染多重度（moi）で２型アデノウイルスを含有する10mLの培地を添加し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１０４】
第２群由来の細胞培養物を、各10μgのプラスミドpW1909adhlacZおよびpJM17でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１０５】
第３群由来の細胞培養物を、各10μgのpBSII s/k-およびpJM17でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１０６】
第４群由来の細胞培養物を、各10μgのpW1909adhlacZおよびpBSII s/k-でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１０７】
各実験群由来の細胞を回集し、培地を遠心分離（1000×g、10分間）によって取り除き、そして１mLの溶解物を、３回の凍結／解凍サイクル（ドライアイス−エタノールと37℃との湯浴の交替）を用いて得た。溶解物を遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まないようにした。rAAVlacZビリオン産物を、293細胞について凍結／解凍抽出物を力価測定すること、およびlacZについてアッセイすることによって評価した。
【０１０８】
詳細には、293細胞を12ウェルプレートに（ウェルあたり1×105細胞で）プレートし、そして上記の凍結／解凍溶解物の容量範囲（10〜0.01μL）で接種し、そして37℃で24時間インキュベートした。次いで、培地の除去、２％のホルムアルデヒドおよび0.2％のグルタルアルデヒドを含有するPBS中での５分間の細胞のインキュベーション、PBSで１回の洗浄、次いで５mMのフェロシアン化カリウム、５mMのフェリシアン化カリウム、２mMの塩化マグネシウム、および１mg/mlのX-Galを含有するPBS中での一晩の細胞のインキュベーションによって、細胞を固定し、そして染色した（Sanesら、(1986）EMBO5:3133-3142）。次いで、rAAVビリオン力価を光学顕微鏡を用いて青色細胞の数を定量することによって計算した。
【０１０９】
混入している感染性アデノウイルス産物を以下のようにアッセイした。細胞溶解物由来のサンプルを、50％コンフルエントの293細胞（12ウェルディッシュ中で1×105細胞／ウェルで培養した）に添加し、そして培養物を30日間（例えば、培養物を３日毎に１〜５に分ける）、または培養物がアデノウイルスの感染によって100％のCPEを示すまで経過させた。培養物を毎日CPEについて試験し、そして各実験培養物が100％のCPEを示す日を記録した。２型アデノウイルスの既知の量の範囲（０〜1×107pfu／培養物）で感染させた参照293細胞培養物をまた調製し、そして同じ様式で処理した。次いで標準曲線を、参照培養物から得たデータによって調製した。ここでアデノウイルスのpfu数を100％CPEの日の対してプロットした。次いで、各実験培養物における感染性２型アデノウイルスの力価を、標準曲線から決定されるように容易に得た。アッセイにおける検出限界は100pfu/mLであった。
【０１１０】
実験の結果を以下の表１に示す。
【０１１１】
【数１】
【０１１２】
表１の結果によって見られ得るように、トランスフェクションによって宿主細胞中に導入され、そしてアデノウイルス感染の非存在下で発現されるアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルス感染によって提供される補助機能のレベルの有効性の約20％（すなわち、５倍少ない）レベルで補助機能を提供し得る。
【０１１３】
実施例２
補助機能を担うアデノウイルス遺伝子領域の同定
どのアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域は、補助機能の提供において必要かつ十分であるかを決定する目的で、以下の実験を行った。
【０１１４】
293細胞を、１×10６細胞／皿で12の10-cm組織培養皿にプレートして６組の二重実験群を提供した。次いで、細胞を、トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで増殖させた。各群において、プラスミドpW1909adhlacZを、レスキュー可能なAAVlacZベクターならびにAAVrepおよびcapコード領
域の供給源として用いた。トランスフェクションを、上記実施例１に記載のように行った。また、アデノウイルス作業ストックを、前述のように調製した。
【０１１５】
各293細胞培養物を、プラスミドpW1909adhlacZおよびプラスミドpBSIIs/k-（コントロールとして）、または単離されたアデノウイルス遺伝子の種々の組み合わせのいずれかでトランスフェクトした。
【０１１６】
より詳細には、第一の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）および15μgのプラスミドpBSII s/k-で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの期間後、培地を交換し、そして細胞を２型アデノウイルス（moi＝１）を含む10mLの培地を用いて感染させた。次いで培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１１７】
第２の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）および15μgのプラスミドpJM17で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１１８】
第３の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4、および５μgのプラスミドpBSIIs/k-で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１１９】
第４の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4、および５μgのプラスミドpBSII-VARNAで同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１２０】
第５の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）、５μgのプラスミドpBSII-E2a、５μgのプラスミドpBSII-E4および５μgのプラスミドpBSIIs/k-で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１２１】
第６の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）、５μgのプラスミドpBSII-E2a、５μgのプラスミドpBSII+E4および５μgのプラスミドpBSII-VARNAsで同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１２２】
次いで、各実験群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離（1000×g、10分間）によって除去し、そして１mLの溶解物を３回の冷凍／解凍サイクル（ドライアイス−エタノール浴と37℃浴との交替）を用いて産生した。遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでrAAVlacZビリオンの産生を、実施例１に記載の技法を用いて評価し、そしてrAVVゲノムの量を以下のアッセイ法によって定量した。
【０１２３】
50λの各実験群由来の溶解物を、50U/mLのDNAseIを含むDMEM培地（Sigma, St. Louis, MOより入手可能）の100λアリコートに加え、アッセイ試料を作成した。試料を37℃で約１時間インキュベートした後に、２×プロテイナーゼＫ緩衝液（20mMTris Cl、20 mM EDTA、１％SDS、pHを8.0に調節した）中の100λのプロテイナーゼＫ（１mg/mL）を各試料に加え、次いで、37℃でさらに１時間インキュベートした。各試料由来のDNAをフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール中で沈殿させ、次いで、５℃で15分間遠心分離することによって回収した。次いで、DNAペレットを、200λのTE中に再溶解させて、DNA試料を提供した。次いで、ドットプロットアッセイを、以下のように行った。ζプローブ（ZetaProbe（登録商標）)膜（BioRad, Richmond, CA）をサイズにカットし、そしてドットプロット装置にアセンブリした。DNA試料を、200λの２×アルカリ性溶液（0.8MNaOH、20 mM EDTA）を用いて変性させ、そして、５分後に、膜を２×SSC溶液中で１分間リンスし、濾紙上で乾燥させ、次いで、80℃で約30分間真空下でベーキングした。ハイブリダイゼーション緩衝液（１mMEDTA、40mM Na2HPO4（pH 7.2）、７％ SDS）中で65℃30分間ハイブリダイゼーションを行った。次いで、フィルターを洗浄し、そして約20時間オートラジオグラフし、放射活性をシンチレーションカウンティングを用いて決定した。
【０１２４】
実験の結果を、以下の表２に示す。
【０１２５】
【表２】
【０１２６】
表２に示される結果から見られ得るように、単離されたアデノウイルス遺伝子領域は、首尾良く宿主細胞にトランスフェクトされて、rAAVビリオン複製にとって必要かつ十分な補助機能を提供し得る。さらに、第３群および第５群で得られた結果は、アデノウイルスVARNA領域はrAAVビリオンの複製にとって必須ではないことを示している。しかし、この領域は、アデノウイルス感染を用いて得られるrAAV力価に匹敵するrAAV力価を得るために必要である。
【０１２７】
実施例３
rAAVビリオン産生に対するアデノウイルスVARNA投薬量の相関
宿主細胞に供したトランスフェクトされたアデノウイルスVA RNA遺伝子領域の量と、宿主細胞中の補体rAAV複製へ提供された補助機能のレベルとの間に相関が存在するか否かを調査する目的で、以下の実験を行った。
【０１２８】
293細胞を、10-cmの組織培養皿に１×10６細胞／皿でプレートし、そしてトランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで培養した。トランスフェクションを、上記実施例１に記載のように行った。
【０１２９】
詳細には、293細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4および０〜25μgのプラスミドpBSII-VARNAでトランスフェクトして、プラスミドを有するVARNAの（他のプラスミドに対する）モル比を０〜５の範囲にわたって変動した。トランスフェクション期間の後、培地を交換し、そして細胞を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１３０】
次いで各実験群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離（1000×g、10分間）によって除
去し、そして１mLの溶解物を、３回の冷凍／解凍サイクル（ドライアイス−エタノール浴と37℃浴との交替）を用いて産生した。遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでAAVlacZベクターの産生を、実施例１に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表３に示す。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
表３から見られ得るように、アデノウイルスVA RNAは、アデノウイルス感染で得られるレベルと実質的に等価なレベルでrAAVビリオン産生を得るのに必要とされるにもかかわらず、調製された範囲におけるVARNA／他のアデノウイルス遺伝子領域の比の変動はrAAVビリオンの産生に著しく影響を及ぼさない。
【０１３３】
実施例４
補助機能におけるアデノウイルスE2a、E4およびVA RNA遺伝子領域
に対する要求の実証
rAAVビリオン産生についての補助機能の提供におけるアデノウイルスE2a、E4およびVA RNA遺伝子領域の相対的寄与を確率する目的で、以下の実験を行った。
【０１３４】
293細胞を、10-cmの組織培養皿に１×10６細胞／皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記実施例１に記載のように行った。
【０１３５】
293細胞培養物を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ、および15μg（全体）の以下のプラスミドの全ての組み合わせまたはその一対の組み合わせのいずれかで同時トランスフェクトして、E2a、E4およびVARNAをコードする各アデノウイルス遺伝子領域を同時トランスフェクションから排除する培養物を提供した：pBSII-E2a；pBSII-E4；およびpBSII-VARNA。トランスフェクション期間後に、培地を交換し、そして細胞を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１３６】
次いで各同時トランスフェクション群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離（1000×g、10分間）によって除去し、そして１mLの溶解物を、３回の冷凍／解凍サイクル（ドライアイス−エタノール浴と37℃浴との交替）を用いて産生した。遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでrAAVlacZビリオンの産生を、実施例１に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表４に示す。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
表４に示された結果から見られ得るように、各アデノウイルス遺伝子領域E2a、E4およびVA RNAは、rAAVビリオン産生を支持するのに必要な補助機能を提供する必要は全くない。しかし、全ての遺伝子領域は、アデノウイルス感染で得られるレベルに匹敵するrAAVビリオンのレベルを産生するために必要である。より詳細には、プラスミド含有VARNAを同時トランスフェクションから省略することにより、rAAVビリオン産生の７倍の低下（７×10８機能的単位／10cm皿）をもたらした。rAAVビリオンの産生は、E4およびE2a含有プラスミドの同時トランスフェクションからの省略によって、さらに著しく影響された。E4構築物の省略により、産生の83倍の低下（６×10７機能的単位／10cm皿）になり、そしてE2構築物の省略により、rAAVビリオン産生の10,000倍の低下（５×10５機能的単位／10cm皿）になった。
【０１３９】
実施例５
pW1909adhlacZまたはpW620adhlacZに基づくAAVヘルプを用いた
rAAVビリオン産生の比較
野生型または改変型AAVヘルプ機能（AAV repおよびcapコーディング領域）のいずれかを含むAAVヘルパー構築物とともに非ウイルス補助機能系を用いて、宿主細胞中のrAAVビリオン産生の効率を比較する目的で、以下の実験を行った。
【０１４０】
293細胞を、10-cmの組織培養皿に１×10６細胞／皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記の実施例１に記載のように行った。
【０１４１】
第一セットの293細胞培養物を、５μgのプラスミドpW620adhlacZ（野生型AAVヘルプ機能を含む）、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4および５μgのプラスミドpBSII-VARNAで同時トランスフェクトした。第２セットの293培養物を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（改変型AAVヘルプ機能を含む）、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4および５μgのプラスミドpBSII-VARNAで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を交換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１４２】
次いで各同時トランスフェクション群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離（1000×g
、10分間）によって除去し、そして１mLの溶解物を、３回の冷凍／解凍サイクル（ドライアイス／エタノール浴と37℃浴との交替）を用いて産生した。遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでrAAVlacZビリオンの産生を、実施例１に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表５に示す。
【０１４３】
【表５】
【０１４４】
表５に示された結果から見られ得るように、 AAVヘルプの野生型と改変型の両方はrAAVビリオンの産生をほぼ同レベルで支持した。
【０１４５】
実施例６
プラスミドに基づく補助機能のrAAVビリオンの産生効率の比較
プラスミドに基づく単離された補助機能、それらの組み合わせ、ならびにアデノウイルスVA RNA、E4およびE2a遺伝子領域（上記のpladeno１プラスミド）を含有する単一の構築物を用いて宿主細胞中のrAAVビリオン産生の効率と、２型アデノウイルス（ad-2）感染を用いて得られるrAAVビリオン産生の効率とを比較する目的で、以下の実験を行った。
【０１４６】
１．pladeno１およびpladeno１E1の構築：
pladeno１プラスミド（アデノウイルスVA RNA、E4およびE2a遺伝子領域を含む）を、５型アデノウイルス遺伝子をpBSII s/k-のPvuII部位の間に挿入された慣例のポリリンカーにクローニングすることによってアセンブリした。pladeno１構築物の地図は、図１に示される。より詳細には、制限酵素部位SalI-XbaI-EcoRV-SrfI-BamHI（5'-GTCGACAAATCTAGATATCGCCCGGGCGGATCC-3'：配列番号１０）をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドポリリンカーを、pBSIIs/k-の2513bpのPvuIIベクターフラグメントに連結して、アセンブリプラスミドを提供した。次いで、５型アデノウイルス遺伝子または遺伝子領域を含む以下のフラグメントを、pJM17プラスミドから得た：1,724bpのSalI-HinDIIIVA RNA含有フラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約9,831〜約11,555位にわたるヌクレオチドに対応する）；5,962bpのSrfI-BamHIE2a含有フラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約21,606〜約27,568位にわたるヌクレオチドに対応する）；および3,669bpのHphI-HinDIIIE4含有フラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約32,172〜約36,841位にわたるヌクレオチドに対応する）。XbaI部位を、E4を含むフラグメントのHphI末端に、クローニングベクターのHpaI部位に3,669bpのHphI-HinDIIIフラグメントをクローニングし、次いでそのフラグメントをXbaIおよびHinDIIIで切除する（部分切断）ことによって加えた。5,962E2aを含むフラグメントを、アセンブリプラスミドのSrfI部位とBamHI部位の間にクローン化し、そして1,724bpのVARNA含有フラグメントおよび改変型3,669bpのE4含有ラグメントを、それらの共通HinDIII末端によって結合させ、そしてアセンブリプラスミドのSalIとXbaI
部位との間に連結して、pladeno１構築物を得た。
【０１４７】
図２に参照されるように、pladeno１E1プラスミドを以下のようにアセンブリした。4,102bpのBsrGI-Eco47IIIフラグメント（５型アデノウイルスのElaおよびElbコード領域を含む）を、pJK17プラスミドから得た。被験体フラグメントは、２型アデノウイルスゲノム
の約192〜約4,294位にわたるヌクレオチドに対応する。4,102bpのフラグメントを、平滑
末端改変し、そして次いで、pladeno１プラスミドのVA RNAフラグメント中のHpaI部位に
挿入して、pladeno１E１プラスミドを得た。
【０１４８】
２．rAAVビリオン産生のアッセイ：
293細胞を、10-cmの組織培養皿に１×10６細胞／皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記の実施例１に記載のように行った。
【０１４９】
全ての293細胞培養物を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZでトランスフェクトした。また、培養物の実験群を、補助機能含有プラスミドまたはコントロールプラスミド（pBSIIs/k-）のそれぞれの５μgの種々の組み合わせで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を交換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。比較として、２型アデノウイルス（moi＝１）を含む10mLの培地を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZでトランスフェクトされた293細胞に加え、そして37℃で約72時間インキュベートした。
【０１５０】
次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離（1000×g 10分間)により培地を除去し
た。そして、３回の凍結／融解サイクル（ドライアイス−エタノール浴および37℃浴を交互にする）を使用して１mLの溶解産物を生成した。遠心分離（10,000×g10分間）により
、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例１に記載される技術を使用して、rAAV lacZビリオン産生を評価した。実験の結果を、以下の表６に示す。
【０１５１】
【表６】
【０１５２】
表６の結果が示し得るように、pladeno 1構築物は、効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る（２型アデノウイルス感染を使用して得られるレベルと実質的に同じレベル）。補助機能構築物pBSII-E2a、pBSII-E4、およびpBSII-VARNAの組み合わせはまた、ad-2感染と実質的に等価なレベルの効率的なrAAVビリオン産生を支持し得た。補助機能構築物pBSII-E2a+E4およびpBSII-VARNAの組み合わせは、rAAV産生を支持し得た（ad-2感染レベルより10倍下回る）；そして、E2aを含む構築物（pBSII-E2a）は、ad-2感染を使用して得られるレベルより約200倍下回るレベルのrAAV産生を支持した。
【０１５３】
実施例７
アデノウイルスに基づくかまたはプラスミドに基づく補助機能を使用して得られる大規模rAAVビリオン産生の比較
２型アデノウイルス（ad-2）に基づくか、またはpladeno 1に基づく補助機能のいずれかを使用して産生されるrAAVビリオンの大規模調製を比較するために、次の実験を行った。
【０１５４】
実施例１に記載のトランスフェクション方法を使用して、ヒトエリスロポエチン遺伝子を含むAAVベクターで約10９個の293細胞をトランスフェクトした。補助機能の供給源として、一方の調製物はpladeno1構築物で同時トランスフェクトし、他方の調製物は２型アデノウイルスで感染させた。
【０１５５】
適切なインキュベーション期間の後に、次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離（1000×g 10分間）により増殖培地を除去した。そして、３回の凍結／融解サイクル（ドライアイス−エタノール浴および37℃浴を交互にする）を使用して溶解産物を生成した。遠心分離（10,000×g10分間）により溶解産物から破片を無くして、粗溶解産物を得た。精製した試料を得るために、粗溶解産物を密度勾配遠心分離に供した。
【０１５６】
各調製により産生されるrAAVゲノムの量を、実施例２に記載のドットブロットアッセイにより定量した。実験の結果を以下の表７に示す。
【０１５７】
【表７】
【０１５８】
表７の結果が示し得るように、pladeno 1に基づく補助機能を使用した調製は、２型アデノウイルスに基づく補助機能を使用した調製から得られた収率より2.4倍大きなrAAVビリオン収率を提供した。
【０１５９】
実施例８
rAAVビリオン産生における個々のアデノウイルス補助機能の相対的な寄与の決定
rAAVビリオン産生における個々のアデノウイルス補助機能の相対的な寄与を決定するために、以下の実験を行った。個々のアデノウイルス補助機能（単独または組み合わせのいずれか）を使用して、宿主細胞におけるrAAVビリオン産生を補助した。さらに、E2aおよびE4ORF6領域全体を含み、そして相同プロモーターにより駆動される構築物（pBSII-E2aおよびpBSII-E4構築物）を、CMVで駆動されるE2aまたはE4ORF6構築物（p3.3cE2Aおよびp3.3cE4ORF6構築物、下記）に置換した効果を評価した。
【０１６０】
１． p3.3cE2Aおよびp3.3cE4ORF6の構築：
５型アデノウイルス E2a 72kD DNA結合タンパク質および５型アデノウイルス E4 オープンリーディングフレーム６（ORF6）タンパク質をコードする構造遺伝子を、それぞれ、CMVで駆動される発現構築物（p3.3c）にクローニングし、それぞれ、p3.3cE2Aプラスミド構築物およびp3.3E4ORF6プラスミド構築物を提供した。
【０１６１】
プラスミドp3.3cを以下のように構築した。pUC119ベクター配列を含む、p1.1c由来2732bpNotIフラグメントを、以下の制限部位を含む合成DNAフラグメントに連結した：NotI;MluI;Ecl136II;SacII;BstBI;BssHII;SrfI;BssHII;BglII;SnaBI;BstEII;PmlI;RsrII;およびNotI。合成DNAフラグメントの配列は：5'-GCGGCCGCACGCGTGAGCTCCGCGGTTCGAAGCGCGCAAAGCCCGGGCAAAGCGCGCAGATCTACGTAGGTAACCACGTGCGGACCGGCGGCCGC-3'（配列番号：１１）である。サイトメガロウイルス前初期（CMVIE)プロモーターを含む653bpSpeI-SacIIフラグメント；以下のプライマー5'-AAAATTCGAACAGGTAAGCGCCCCTTTG-3'（配列番号：１２）および3'-AAAATTCGAATCCTGGGGAGAAACCAGAG-5'（配列番号：１３）を使用して得られた、hGH第一イントロンをコードする、269bpのPCR産生BstBI-BstBIフラグメント；ならびにpCMV-β（Clonetechより入手）由来SV40後期ポリアデニル化部位を含む213bpBamHI-BamHI（平滑化）フラグメントを、それぞれ、合成リンカーのEcl136II、BstBI、およびSnaBI部位にクローニングし、p3.3c発現構築物を生じた。
【０１６２】
プラスミドp3.3cE4ORF6（ATCC受託番号98234）を、以下のように調製した。５型アデノウイルスE4 ORF6をコードする配列を含む、pBSII-E4由来の1024bpBglII-SmaIフラグメントを入手し、そして平滑末端に改変した。このフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの33,309位（SmaI部位）から34,115位（BglII部位）に相当する。次いで、改変したフラグメントをp3.3cのSrfI部位にクローニングし、p3.3cE4ORF6プラスミドを提供した。
【０１６３】
プラスミドp3.3cE2A（ATCC受託番号98235）を、以下のように調製した。pBSII-E2a由来の2467bpMscI（部分的）-BamHIフラグメントを入手した。このフラグメントは、５型アデノウイルスE2aコード配列を含み、そして２型アデノウイルスゲノムの24,073位（MscI部位）から21,606位（BamHI部位）に相当する。2467bpフラグメントをpCITE2A（Novageneより入手）のMscI部位とBamHI部位との間にサブクローニングし、pCITE2AE2A構築物を提供
した。次いで、1636bpNcoI（部分的）-BsrGIフラグメントをpCITE2AE2Aから切り出した。このフラグメントは、E2a 72kDタンパク質をコードする配列を含み、そして２型アデノウイルスゲノムの24,076位（MscI/NcoI部位）から22,440位（BsrGI部位）に相当する。1636bpフラグメントを平滑末端に改変し、そしてp3.3cにクローニングし、p3.3cE2Aプラスミ
ドを提供した。
【０１６４】
２． rAAVビリオン産生アッセイ：
293細胞を10cm組織培養ディッシュに２×106細胞／ディッシュでプレートし、そして、同時トランスフェクションの前に約48時間の期間にわたって、約90％コンフルエンシーに達するまで37℃で培養した。全てのトランスフェクションは、以下のDNAの組み合わせで、CaPO4法を使用して行った。全ての293細胞培養物を、５μgのプラスミドpW620adhlacZを用いてトランスフェクトした。５μgの種々の補助機能構築物（以下の表８に示す通り）を使用して、１ディッシュあたり総量20μgのDNAを提供した。４個未満の構築物を入れる試料については、pBSIIDNAを使用してトランスフェクトされるDNAの総量を20μgにした。トランスフェクションの後に、培地を取り替え、そして補助機能のためにアデノウイルスを使用する培養物は、５のMOIで２型アデノウイルスを受けた。次いで、全ての培養物を、収集前に約72時間、37℃でインキュベートした。
【０１６５】
次いで、各ディッシュから細胞を回収し、遠心分離（1000×g 10分間）により培地を除去した。そして、３回の凍結／融解サイクル（ドライアイス−エタノール浴および37℃浴を交互にする）を使用して１mLの溶解産物を生成した。遠心分離（10,000×g10分間）に
より、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例１に記載の技術を使用して、rAAV lacZビリオン産生を評価した。lac Zの力価測定（titering）を、アデノウイルスの存在下で行った。全ての試料は、２連でアッセイした。実験の結果を、以下の表８に示す。
【０１６６】
【表８】
【０１６７】
表８に示す結果が示し得るように、アデノウイルスのE2a、E4、およびVA RNA領域は、
効率的なrAAVビリオン産生（補助機能を提供するためにアデノウイルス感染を使用して得たレベルと実質的に等価なレベル）を提供するために全て必要である。しかし、これらの領域の一つが、rAAVビリオン産生のために絶対的に必要であるというわけではない。
【０１６８】
pBSII-E2aおよびpBSII-E4構築物中にサブクローニングされたE2aおよびE4領域は、いくつかのオープンリーディングフレーム（ORF）を、72kDE2aDNA結合タンパク質およびE4 ORF6タンパク質のためのORFに加えて含む。上記の研究において、pBSII-E2aおよびpBSII-E4構築物を、CMVで駆動されるp3.3cE2Aおよびp3.3cE4ORF6構築物で置換することにより、E2a72kDDNA結合タンパク質およびE4 ORF6タンパク質は、他の全てのオープンリーディン
グフレームがそれらのそれぞれのコード領域に存在しないときに、完全なE2aまたはE4補
助機能を提供し得ることが確証された。
【０１６９】
実施例９
pladeno 1プラスミドの再構築およびrAAVビリオン産生効率の比較
pladeno1の構築に使用したpJM17由来アデノウイルス遺伝子の代わりに、アデノウイル
ス遺伝子の供給源として精製された２型アデノウイルスDNAを使用して、pladeno1プラス
ミドを再構築した。再構築したプラスミドはpladeno 5と名付けられ、以下に詳細に記載
される。この再構築を、プラスミドのサイズ全体を減少させるために行った。さらに、再構築したプラスミド（pladeno5）はアデノウイルスプロテアーゼをコードしないが、pladeno1はアデノウイルスプロテアーゼをコードする。
【０１７０】
１． pladeno5の構築：
pladeno5プラスミドを以下のように構築した。精製された２型アデノウイルスDNA（Gibco/BRLより入手）より単離した、E2a、E4、およびVARNA領域をコードするDNAフラグメントを、pAmpscriptと呼ばれるプラスミド中に連結した。pAmpscriptプラスミドを、以下のように組立てた：オリゴヌクレオチド指定変異誘発（oligonucleotide-directedmutagenesis）を使用して、pBSII s/k+（Stratageneより入手）からポリリンカーおよびα相補発現カセット（complementationexpression cassette）を含む623bp領域を除去し、そしてこれをEcoRV部位で置換した。オリゴヌクレオチド指定変異誘発に使用した変異誘発性オ
リゴ（oligo）の配列は、5'-CCGCTACAGGGCGCGATATCAGCTCACTCAA-3'（配列番号：１４）であった。ポリリンカー（以下の制限部位を含む：BamHI;KpnI;SrfI;XbaI;ClaI;Bst1107I;SalI;PmeI;およびNdeI）を合成し、そして上記で作製したEcoRV部位へ挿入し、その結果、リンカーのBamHI部位を、改変されたプラスミドにおいてf1開始点の近位にして、pAmpscriptプラスミドを提供した。ポリリンカーの配列は、5'-GGATCCGGTACCGCCCGGGCTCTAGAATCGATGTATACGTCGACGTTTAAACCATATG-3'（配列番号１５）であった。
【０１７１】
２型アデノウイルス E2aおよびVA RNA配列を含むDNAフラグメントを、pAmpscriptに直接的にクローニングした。特に、E2a領域を含む5962bpSrfI-KpnI（部分的）フラグメントを、pAmpscriptのSrfI部位とKpnI部位との間にクローニングした。5962bpフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの21,606〜27,568塩基対を含む。VARNAを含む732bp EcoRV-SacII（平滑化）フラグメントを、pAmpscriptのBst1107I部位にクローニングした。732bpフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの10,423〜11,155塩基対と等価である。
【０１７２】
pAmpscriptポリリンカーに挿入し得る前に、２型アデノウイルスE4配列を含むDNAを改変しなければならなかった。特に、PCR変異誘発を使用してE4の近位のアデノウイルス末端反復をSrfI部位で置換した。このSrfI部位の位置は、２型アデノウイルスゲノムの35,836〜35,844塩基対と等価である。変異誘発において使用したオリゴヌクレオチドの配列は：5'-AGAGGCCCGGGCGTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC-3'（配列番号１６）；および5'-ACATACCCGCAGGCGTAGAGAC-3'（配列番号：１７）であった。上記の改変されたE4遺伝子をSrfIおよびSpeIを用いて切断することにより生成した3,192bpE4フラグメントを、既にE2aおよびVARNA配列を含むpAmpscriptのSrfI部位とXbaI部位との間に連結し、pladeno 5プラスミドを生じた。3,192bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの32,644〜35,836塩基対と等価である。
【０１７３】
２． rAAVビリオン産生アッセイ：
293細胞を10cm組織培養ディッシュに１×106細胞／ディッシュでプレートし、そして、同時トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、約90％コンフルエンシーに達するまで37℃で培養した。全てのトランスフェクションを、上記実施例１に記載のように行った。
【０１７４】
293細胞培養物を、５μgのpVlacZベクタープラスミド、５μgのプラスミドpW1909、および５μgのpladeno1またはpladeno 5のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの後に、培地を取り替え、そして、培養物を収集前に約72時間、37℃でインキュベートした。
【０１７５】
次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離（1000×g 10分間）により培地を除去した。そして、３回の凍結／融解サイクル（ドライアイス−エタノール浴および37℃浴を交互にする）を使用して１mLの溶解産物を生成した。遠心分離（10,000×g10分間）により、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例１に記載の技術を使用して、rAAVlacZビリオン産生を評価した。実験の結果を、以下の表９に示す。
【０１７６】
【表９】
【０１７７】
表９に報告された結果が示し得るように、pladeno 5を使用した場合に、より大きなrAAVビリオン産生効率が見られた（pladeno 5の産生は、pladeno1の産生より2.5倍多いrAAVビリオンを生じた）。
【０１７８】
従って、効率的な組換えAAVビリオン産生を支持し得る、新規な補助機能を記載した。本発明の好ましい実施態様をいくぶん詳細に記載したが、添付の請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな変形がなされ得ることが理解される。
【０１７９】
本発明の実施において有用な株の寄託
以下の株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、ブダペスト条約の規定の下に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Parklawn Drive,Rockville,Marylandで行った。示された受託番号は、好結果の生存試験後に交付され、そして必要な手数料を払った。この培養物へのアクセスは、米国特許法施行規則1.14および米国特許法122条に基づいて権利を与えられる特許庁長官によって決定されたものに対して、特許出願の係属中は利用可能である。本出願に特許が許可された際は、寄託された生物学的物質の公衆への利用可能性について寄託者により課される全ての制限は、米国特許法施行規則§1.808(b)に明記されるように、以下の一つの例外はあるが、変更不能に取り除かれる。その例外は、発行された特許の存続期間の間は、試料の請求が以下の３つの条件のいずれか一つまたは全てを満たす場合のみ、寄託物の試料が分譲されることを要求することを寄託機関との間に契約する権利を寄託者が留保することである：（１）請求は、書面または具体的な形式であり、日付がある；および／または（２）請求は、請求する当事者の名称およびあて名ならびに寄託物の受託番号を含む；および／または（３）請求は、寄託機関から寄託者に、試料を分譲した日付ならびに試料の分譲を受けた当事者の名称およびあて名とともに書面で通知される。さらに、示された寄託物は、寄託の日から30年間、もしくは当該寄託物の最終請求の後５年間；または米国特許の実施可能期間のいずれがより長期であっても、維持される。培養物が生存不可能になるか、もしくは不注意に破壊されるか、またはプラスミド含有株の場合にそのプラスミドが失われた際には、培養物は、同一の分類学的記載の生存能力のある培養物（単数または複数）で置き換えられる。
【０１８０】
これらの寄託物は、当業者への便宜のためにのみ提供され、そして寄託が必要とされることを認めるわけではない。これらのプラスミドの核酸配列、ならびにそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の記載と何らかの矛盾がある場合をコントロールしている。寄託物を製造、使用、または販売するためにライセンスが必要とされ得、そしてこのようなライセンスはこれによって承諾されるわけではない。
【０１８１】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１は、pBSIIs/k-ベクタープラスミドに挿入された５型アデノウイルス由来のVARNA、E4（ORF 6を含む）およびE2aアデノウイルス遺伝子領域を含むプラスミド構築物pladeno 1を示す。
【図２】図２は、4,102bpのBsrGI-Eco47IIIフラグメント（５型アデノウイルスE1aおよびE1bコード領域を含む）をpladeno 1構築物に挿入することによって形成されたプラスミド構築物pladeno 1 E1を示す。
【図３】図３は、２型アデノウイルスゲノム由来のVA RNA、E4 ORF 6、およびE2aアデノウイルス遺伝子領域を含むプラスミド構築物pladeno 5を示す。
【０１８３】
（配列表）
【０１８４】
【数１】
【０１８５】
【数２】
【０１８６】
【数３】
【０１８７】
【数４】
【０１８８】
【数４】
【０１８９】
【数５】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、アデノ随伴ウイルス（AAV）ビリオン産生における使用のための補助機能（accessory function）に関する。より詳細には、本発明は、適切な宿主細胞における効率的な組換えAAVビリオン産生を補助し得る補助機能を提供するベクター、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子送達は、後天性および遺伝性疾患の処置のために有望な方法である。遺伝子導入の目的のためのウイルスに基づく系（例えば、現在、この目的のための最も広く使用されるウイルスベクター系であるレトロウイルス系）が多数記載されてきた。種々のレトロウイルス系の記載については、例えば、米国特許第5,219,740号；MillerおよびRosman(1989) BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpaら(1991)Virology 180:849-852；Burnsら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；および、Boris-LawrieおよびTemin(1993)Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109を参照のこと。
【０００３】
アデノ随伴ウイルス(AAV）系もまた、遺伝子送達のために使用されている。AAVは、Dependovirus属に属するヘルパー依存性DNAパルボウイルスである。AAVは、増殖性感染を生じるためには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアのいずれかの、関連のないヘルパーウイルスの感染を必要とする。ヘルパーウイルスは、AAV複製における多くの段階に必要な補助機能を提供する。このような感染の非存在下では、AAVは、そのゲノムの宿主細胞染色体への挿入によって潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによる次の感染は、組み込まれたコピーをレスキューし、これは次いで感染性のウイルスの子孫を産生するために複製し得る。AAVは広範な宿主範囲を有し、そしてこのような細胞が適切なヘルパーウイルスで首尾良く感染される限り、任意の種由来の細胞中で複製し得る。従って、例えば、ヒトAAVは、イヌアデノウイルスで同時感染したイヌ細胞中で複製する。AAVは、ヒトまたは動物の疾患のいずれとも関連しておらず、そして組込みの際に宿主細胞の生物学的特性を変更しないようである。AAVの総説については、例えば、BernsおよびBohenzky(1987)Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307を参照のこと。
【０００４】
AAVゲノムは、4681塩基を含む直鎖状の一本鎖DNA分子から構成される（BernsおよびBohenzky、前出）。ゲノムは、DNA複製起点としておよびウイルスのパッケージングシグナルとして、cisで機能する逆方向末端反復配列（ITR）を各末端に含む。ITRは約145bpの長さである。ゲノムの内部非反復部分は、それぞれAAVrepおよびcap領域として知られる２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケージングに関連するウイルス性タンパク質をコードする。特に、少なくとも４つのウイルス性タンパク質のファミリーが、見かけの分子量に従って命名された、AAVrep領域、Rep78、Rep 68、Rep 52、およびRep 40から合成される。AAV cap領域は、少なくとも３つの部分（VP1、VP2、およびVP3）をコードする。AAVゲノムの詳細な記載については、例えば、Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129を参照のこと。
【０００５】
組換えAAVビリオンの構築が記載されている。例えば、米国特許第5,173,414号および同第5,139,941号；国際公開番号WO92/01070（1992年1月23日公開）およびWO93/03769（1993年3月4日公開）；Lebkowskiら (1988) Molec.Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincentら(1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter, B.J. (1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N. (1992) CurrentTopics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；およびKotin,R.M. (1994) HumanGene Therapy 5:793-801を参照のこと。
【０００６】
現在の組換えAAV（rAAV）ビリオンの産生は、AAVベクタープラスミドおよびAAVベクタープラスミドから失われている機能を相補するAAVヘルパー機能を提供する構築物を用いる宿主細胞への同時トランスフェクションを含む。この様式において、宿主細胞は、AAV複製およびパッケージングに必要なAAVタンパク質を発現し得る。次いで、宿主細胞は、補助機能を提供するヘルパーウイルスに感染させられる。ヘルパーウイルスは、一般に、感染性アデノウイルス（２型もしくは５型）またはヘルペスウイルスである。
【０００７】
AAVヘルパー機能は、AAVrepおよび／またはcapコード領域を含むが、AAV ITRを欠いているAAVヘルパープラスミドを介して提供され得る。従って、ヘルパープラスミドは、それ自身、複製もパッケージングもし得ない。以下に記載されているベクターを含むrepコード領域を含む多くのベクターが公知である：ATCC受託番号第53222号、同第53223号、同第53224号、同第53225号、および同第53226号を有する米国特許第5,139,941。同様に、AAVrepHHV-6のホモログを含むベクターを得る方法は、Thomsonら (1994) Virology 204:304-311に記載されている。米国特許第5,139,941号に記載されるベクターを含むcapコード領域を含む多くのベクターがまた記載されている。
【０００８】
AAVベクタープラスミドは、AAV複製およびパッケージング機能を提供するAAV ITRによって隣接される、機能的に関連する目的のヌクレオチド配列（例えば、選択された遺伝子、アンチセンス核酸分子、リボザイムなど）を含むように設計され得る。AAVヘルパープラスミドおよびヌクレオチド配列を有するAAVベクタープラスミドが一過性トランスフェクションによって宿主細胞に導入された後、トランスフェクションされた細胞は、AAVrepおよびAAVcap領域の転写および翻訳を指向するヘルパープラスミド上に存在するAAVプロモーターを他の機能の中からトランス活性化するヘルパーウイルス（最も代表的には、アデノウイルス）に感染させられ得る。続く宿主細胞の培養の際に、rAAVビリオン（目的のヌクレオチド配列を有する）およびヘルパーウイルス粒子が産生される。
【０００９】
宿主細胞が採取され、そして粗製抽出物が産生される場合、得られる調製物は、他の成分の中でも特に、ほぼ等量のrAAVビリオン粒子および感染性ヘルパービリオンを含む。rAAVビリオン粒子は、公知の技術を使用して混入しているヘルパーウイルス、組み立てられていないウイルス性タンパク質（ヘルパーウイルスおよびAAVのカプシド由来）および宿主細胞タンパク質の多くから精製され得る。２型アデノウイルスでの感染を用いて産生された精製されたrAAVビリオン調製物は、高いレベルの混入物を含む。詳細には、そのようなrAAVビリオン調製物において得られた総タンパク質の50％以上は、遊離のアデノウイルス線維タンパク質である。種々の量のいくつかの同定されていないアデノウイルスおよび宿主細胞タンパク質がまた存在する。さらに、有意なレベルの感染性アデノウイルスビリオンが得られ、熱不活性を必要とする。混入感染性アデノウイルスは熱処理（56℃で１時間）によって不活性化され得、そして感度の高いアデノウイルス増殖アッセイによって（例えば、許容細胞株における細胞変性効果（CPE）によって）検出不可能にされ得る。しかし、熱処理はまた、機能的rAAVビリオンの力価において約50％の低下を生じる。
【００１０】
補助機能を提供する感染性ヘルパーウイルス（例えば、２型アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）を使用するrAAVビリオンの産生は、いくつかの理由のために望ましくない。ヘルパーウイルスを使用するAAVベクター産生法は、特にヘルペスウイルスの使用に関して、多くの健康および安全の懸念を示す大量の高力価感染性ヘルパーウイルスの使用および操作を必要とする。また、rAAVビリオン産生細胞におけるヘルパーウイルス粒子の付随的な産生は、大量の細胞性の資源をrAAVビリオン産生から流用する。恐らく、このことは、より低いrAAVビリオン収量を生じる。
【００１１】
より詳細には、２型アデノウイルスでの細胞の感染が補助機能を提供するために使用される方法において、精製されたrAAVビリオン調製物において見出される95％を超える混入物はアデノウイルス由来である。主な混入物である、遊離のアデノウイルス線維タンパク質は、そのタンパク質とrAAVビリオン間の非共有結合のために、CsCl密度勾配上でrAAVビリオンと共精製される傾向がある。この結合は、特に２つの分離を非常に困難にするし、このことはrAAVビリオンの精製効率を低下させる。線維タンパク質を含む多くのアデノウイルス性タンパク質が、細胞傷害性であり得（通常、高濃度において）、従って、標的細胞に有害に影響するか、または標的細胞を殺傷し得ることが示されているので、そのような混入物は重要な問題であり得る。従って、必要な補助機能を提供する感染性ヘルパーウイルスの使用なしにrAAVビリオンを産生する方法が有利である。
【００１２】
多くの研究者が補助機能の遺伝子的根拠（特にアデノウイルス由来の機能）を研究してきた。一般に、以下の２つのアプローチがAAV複製に関与するアデノウイルス遺伝子を同定する試みのために使用されてきた：補助機能を提供する種々のアデノウイルス変異体の能力の試験；およびアデノウイルス感染非存在下でのAAV複製に対する、トランスフェクトされたアデノウイルス遺伝子、または領域の効果の研究。
【００１３】
野生型アデノウイルスでの感染によって得られるレベルまたはほぼそのレベルでAAV複製を（例えば、必要な補助機能を提供することによって）補助し得る種々のアデノウイルス変異体を用いる研究は、特定のアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域が、AAV複製に関与しないことを示してきた。しかし、アデノウイルス遺伝子および制御領域の多くが重なり合っておよび／または不完全にマップされているので、そのような研究による機能欠失データは、特定の遺伝子領域がAAV複製に関与しているという決定的な情報を提供する
ことはできなかった。
【００１４】
特に、以下の遺伝子または遺伝子領域における十分に良く特徴付けられた変異体を有するアデノウイルス変異体が、AAVウイルス複製に必要な補助機能を提供するそれらの能力について試験されてきた：E1a(Laughlinら、(1982) J.Virol. 41:868, Janikら、(1981)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:1925);E1b(Laughlinら、(1982), 前出, Janikら、(1981), 前出, Ostroveら、(1980)Virology 104:502);E2a(Handaら、(1975) J. Gen. Viorl.29:239, Strausら、(1976)J. Virol. 17:140,Myersら、(1980) J. Virol. 35:665, Jayら、(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927,Myersら、(1981) J. Biol. Chem. 256:567);E2b(Carter, B.J. (1990)"Adeno-Associated Virus Helper Functions", in CRCHandbook of Parvoviruses, vol. I (P. Tijssen編);E3 (Carterら、(1983) Virology 126:505);およびE4(Carterら、(1983),前出, Carter, B.J., (1995), 前出）。DNA複製不能および後期遺伝子合成不能である不完全に特徴付けられたアデノウイルス変異体がまた試験された（Itoら、(1970)J.Gen. Virol. 9:243, Ishibashiら、(1971) Virology 45:317)。
【００１５】
E2bおよびE3領域に欠損を有するアデノウイルス変異体は、AAV複製を補助することを示されてきた。このことは、E2bおよびE3領域が補助的機能を提供することにおそらく関与しないことを示す（Carterら、(1983),前出）。E1a領域を欠損しているか、または欠失されたE4領域を有する変異体アデノウイルスは、直接的または間接的であれいずれにおいてもAAV複製を補助することが出来ず、このことは、E1aおよびE4領域がAAV複製に必要であることを示す（Laughlinら、(1982),前出,Janikら、(1981), 前出, Carterら、(1983), 前出）。E1bおよびE2a変異体を用いる研究は、矛盾する結果を生じている。さらに、DNA複製不能および後期遺伝子合成不能であるアデノウイルス変異体は、AAV複製を許容することが示されている（Itoら、(1970),前出,Ishibashiら、(1971), 前出)。これらの結果は、アデノウイルスのDNA複製およびアデノウイルス後期遺伝子のいずれもAAV複製に必要ではないことを示す。
【００１６】
選択されたアデノウイルス遺伝子を用いるトランスフェクション研究が、トランフェクトされた１組のアデノウイルス遺伝子が、アデノウイルス感染によって提供されるレベルと同じレベルのAAV複製のための補助機能を提供し得るかどうかを立証するための試みにおいて使用されてきた。詳細には、インビトロのAAV複製が、単一アデノウイルス遺伝子または遺伝子の群をコードするアデノウイルス制限フラグメントの種々の組み合わせで一過性にトランスフェクションされたヒト293細胞を使用して評価されてきた（Janikら、(1981),前出）。上記のトランスフェクション研究は、アデノウイルスE1aおよびE1bを安定に発現する細胞中で行われたので、それら領域の必要性は、試験され得なかった。しかし、三つのアデノウイルス遺伝子領域（VAIRNA、E2aおよびE4）の組み合わせが、実質的にバックグランドを超えるレベルで補助機能（例えば、AAV複製を支持する）を提供し得る
ことが推定された。しかし、それは、アデノウイルスでの感染によって提供されるレベルよりなお約8,000倍低かった。３つの遺伝子の２つの組み合わせの全てが試験された場合
、補助機能レベルは、アデノウイルスでの感染によって提供されるレベルより10,000〜100,000倍低い範囲にあった。
【００１７】
選択された１型単純ヘルペスウイルス（HSV-1)遺伝子を用いたトランフェクション研究がまた、トランフェクトされた１組のHSV-1遺伝子が、HSV-1感染によって提供されるレベルと同じレベルのAAV複製の補助機能を提供し得るかどうかを立証するための試みにおいて行われてきた。Weindlerら、(1991)J.Virol.65:2476-2483。しかし、そのような研究
は、rAAVの産生ではなく、野生型AAV複製を支持するために必要なHSV-1遺伝子のみを同定することに限られていた。さらに、同定されたHSV-1補助機能は、AAVの複製を支持するにおいてアデノウイルス由来の機能より有意に効果的でなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、当該分野において、rAAVビリオン産生のために必要とされる補助機能のみを含むアデノウイルスゲノムのサブセット、またはアデノウイルスゲノムの機能的なホモログを同定する必要性は残存する。従って、サブセットは、適切な宿主細胞に導入された場合に、アデノウイルス感染を使用して産生される量に実質的に等価またはそれより多くの量でrAAVビリオンの産生を支持する、補助機能ベクターまたは補助機能系に含まれ得る。さらに、有意のレベルの感染性アデノウイルスビリオン、または他の混入する副産物をも産生することなく、商業的に有意のレベルのrAAVビリオン粒子を産生し得る補助機能系を提供する必要性は残存する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（項目１）適切な宿主細胞において組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持するための、１つ以上の補助機能を提供し、少なくとも１つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する、核酸分子であって、該分子が、（i）アデノウイルスVARNAを提供する配列、（ii）アデノウイルスE4 ORF6コード領域、（iii）アデノウイルスE2aの72kDコード領域、ならびに（i）、（ii）、および（iii）の任意の組合せ、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
（項目２）適切な宿主細胞において効率的な組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持するに十分な補助機能を提供し、そして少なくとも１つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する核酸分子。
（項目３）項目２に記載の核酸分子であって、該分子がアデノウイルス初期遺伝子領域2bおよび３を欠失することを特徴とする、核酸分子。
（項目４）ヒト293宿主細胞において効率的にrAAVビリオン産生を支持するに十分な補助機能を提供する、項目２または３に記載の核酸分子。
（項目５）項目４に記載の核酸分子であって、以下：
アデノウイルスVA RNAを提供する第１のヌクレオチド配列；
ORF 6を含むアデノウイルスE4コード領域を含む第２のヌクレオチド配列；および
アデノウイルスE2aコード領域を含む第３のヌクレオチド配列
を含む、核酸分子。
（項目６）項目２に記載の核酸分子であって、該分子はアデノウイルスによって感染し得ないか、またはアデノウイルスの複製を支持し得ない適切な宿主細胞において、効率的な組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持するための補助機能を提供することを特徴とする
、核酸分子。
（項目７）項目６に記載の核酸分子であって、以下：
アデノウイルスVA RNAを提供する第１のヌクレオチド配列；
ORF 6を含むアデノウイルスE4コード領域を含む第２のヌクレオチド配列；
アデノウイルスE2aコード領域を含む第３のヌクレオチド配列；および
アデノウイルスE1aおよびE1bコード領域を含む第４のヌクレオチド配列、
を含む、核酸分子。
（項目８）２型または５型アデノウイルスゲノム由来の１つ以上のヌクレオチド配列を含む、項目４または６に記載の核酸分子。
（項目９）項目１、２、または６のいずれかに記載の核酸分子を含む、補助機能ベクター。
（項目１０）前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする、項目９に記載の補助機能ベクター。
（項目１１）選択遺伝子マーカーをさらに含む、項目１０に記載の補助機能ベクター。
（項目１２）前記選択遺伝子マーカーが抗生物質耐性遺伝子を含むことを特徴とする、項目１１に記載の補助機能ベクター。
（項目１３）少なくとも１つの異種プロモーター領域をさらに含む、項目１０に記載の補助機能ベクター。
（項目１４）前記の少なくとも１つの異種プロモーター領域が、サイトメガロウイルス（CMV）即時初期プロモーター領域に対して実質的に相同であるヌクレオチド配列を含むこ
とを特徴とする、項目１３に記載の補助機能ベクター。
（項目１５）第１、第２、および第３の補助機能ベクターを含む、組換えAAV（rAAV）ビ
リオン産生のための補助機能系であって、ここで；
（ａ）該第１補助機能ベクターは、アデノウイルスVA RNAを提供するヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）該第２補助機能ベクターは、アデノウイルスE4 ORF6コード領域を含み；そして
（ｃ）該第３補助機能ベクターは、アデノウイルスE2aの72kDコード領域を含む、補助
機能系。
（項目１６）前記第１補助機能ベクターが、プラスミドpBSII-VA RNA（ATCC受託番号第98233号）であり、前記第２補助機能ベクターが、p3）3cE4ORF6（ATCC受託番号第98234号）であり、そして前記第３補助機能ベクターが、p3）3cE2A（ATCC受託番号第98235号）であることを特徴とする、項目１５に記載の補助機能系。
（項目１７）項目９に記載の補助機能ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
（項目１８）AAVベクターでトランスフェクトされた場合、組換えAAV（rAAV）ビリオンを産生し得る細胞であって、該細胞は、該細胞において発現され、AAVヘルパー機能を提供し得るAAVヘルパー構築物で同時トランスフェクトされた、項目１７に記載の宿主細胞を含む、細胞。
（項目１９）組換えAAV（rAAV）ビリオンを産生する方法であって、以下；
（ａ）適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程；
（ｂ）AAVヘルパー構築物を宿主細胞に導入する工程であって、該ヘルパー構築物は、該AAVベクターから欠失したAAVヘルパー機能を補完するために該宿主細胞において発現されるAAVコード領域を含む、工程；
（ｃ）項目１５に記載の補助機能系を該宿主細胞に導入する工程であって、該補助機能系は、該宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持するための補助機能を提供する、工程；および
（ｄ）該宿主細胞を培養してrAAVビリオンを産生する工程、
を包含する、方法。
（項目２０）組換えAAV（rAAV）ビリオンを産生する方法であって、以下；
（ａ）適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程；
（ｂ）AAVヘルパー構築物を該宿主細胞に導入する工程であって、該ヘルパー構築物は
、該AAVベクターから欠失したAAVヘルパー機能を補完するために該宿主細胞において発現されるAAVコード領域を含む、工程；
（ｃ）項目９に記載の補助機能系を該宿主細胞に導入する工程であって、該補助機能系は、該宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持するための該補助機能を提供する、工程；および
（ｄ）該宿主細胞を培養してrAAVビリオンを産生する工程、
を包含する、方法。
（項目２１）項目１９または２０に記載の方法によって産生される、組換えAAVビリオン。
【００２０】
発明の要旨
本発明は、適切な宿主細胞において効率的なAAV複製を支持するために必要とされる補助機能の同定に基づく。本発明は、このような機能を含み、そしてヘルパーウイルスの使用なしにrAAVビリオンの産生を可能にする系を提供する。
【００２１】
特定の実施態様において、本発明は、補助機能をコードし、そして少なくとも１つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する核酸分子に関する。その分子は、２型もしくは５型ゲノムアデノウイルス、またはその機能的なホモログ由来のヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターにおいて提供され得る。従って、１つの局面において、本発明は、(i)アデノウイルスのVARNAを提供する配列、(ii)アデノウイルスE4 ORF6のコード領域、(iii)アデノウイルスのE2aの72kDコード領域（E2aの72kDのDNA結合タンパク質をコードする）、およびヌクレオチド配列(i)、(ii)、(iii)の任意の組み合わせ、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むベクターに関する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、適切な宿主細胞において効率的な組換えAAV（rAAV）ビリオン産生を支持し得る補助機能を提供し、そして少なくも１つのアデノウイルスの後期遺伝子領域を欠く核酸分子、ならびにその核酸分子を含むベクターに関する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、多数のヌクレオチド配列（アデノウイルスVA RNAを提供する配列、アデノウイルスE4コード領域を含む配列、およびアデノウイルスのE2aのコード領域を含む配列を含む）を含むベクターに関する。
【００２４】
本発明のさらに別の局面において、アデノウイルスVA RNAを提供する配列、アデノウイルスE4コード領域を含む配列、アデノウイルスE2aコード領域を含む配列、ならびにアデノウイルスのE1aおよびE1bコード領域を含む配列を含むベクターが提供される。
【００２５】
本発明の別の実施態様において、rAAVビリオン産生のための補助機能系が提供され、ここでこの系は適切な宿主細胞において効率的なAAVビリオン産生を支持するために適切な補助機能成分を提供する、多数の補助機能ベクターを含む。
【００２６】
本発明のなお別の実施態様において、rAAVビリオンを産生するための方法が提供される。この方法は、一般に、（１）適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程；（２）この細胞にAAVヘルパー構築物を導入する工程であって、ここでこのヘルパー構築物が、AAVベクターから欠失しているAAVヘルパー機能を補完するために宿主細胞において発現され
得る工程；（３）宿主細胞に１つ以上の補助機能ベクターを導入する工程であって、ここで１つ以上の補助機能ベクターは宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る補助機能を提供する工程；および（４）rAAVビリオンを産生する細胞を培養する工程、を包含する。
【００２７】
さらなる実施態様において、本発明の方法によって産生される組換えAAVビリオンもまた提供される。
【００２８】
本発明のこれらの、および他の実施態様は、本明細書中における開示を考慮して当業者に容易に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術範囲内のウイルス学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技法の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に十
分に説明されている。例えば、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual (最新版)；DNACloning: A Practical Approach, 第Ｉ巻および第II巻(D. Glover編）；Oligonucleotide Synthesis(N. Gait編、最新版)；Nucleic Acid Hybridization (B. HamesおよびS. Higgins編、最新版)；Transcriptionand Translation (B.HamesおよびS. Higgins編、最新版)；CRC Handbook of Parvoviruses, 第Ｉ巻および第II巻(P. Tijessen編)；Fundamental Virology、第2版, 第Ｉ巻および第II巻 (B.N. FieldsおよびD.M. Knipe編)を参照のこと。
【００３０】
本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、その内容が明らかに他を指図しない限り、複数の言及を含む。
【００３１】
Ａ．定義
本発明の記載において、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【００３２】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、宿主細胞中に外来DNAを確実に挿入するための方法または系をいう。このような方法は、組み込まれていない移入されたDNAの一過性発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製および発現、または宿主細胞のゲノムDNA中への移入された遺伝物質の組込みを生じ得る。遺伝子移入は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための独特のアプローチを提供する。多数の系が、哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発されている。例えば、米国特許第5,399,346号
を参照のこと。
【００３３】
「ベクター」により、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどのような、任意の遺伝子エレメントが意味され、これは、適正な制御エレメントに伴われる場合に複製可能であり、そして細胞間で遺伝子配列を移行させ得る。従って、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００３４】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「AAV ITR」により、AAVゲノムの各末端で見出される当該分野で認識される領域が意味され、これは、一緒にシスで、DNAの複製起点としておよびウイルスのためのパッケージングシグナルとして機能する。AAVITRは、AAV repコード領域と一緒に、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切り出しおよびレスキュー、ならびに２つの隣接するITR間にはさまれたヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノムへの組込みを提供する。
【００３５】
AAV ITR領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、AAV-2配列については、Kotin,R.M. (1994) Human Gene Therapy5:793-801；Berns, K.I.「パルボウイルス科およびその複製」Fundamental Virology、第2版、(B.N.FieldsおよびD.M. Knipe編)を参照のこと。本明細書中で使用される場合、「AAV ITR」は、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。さらに、AAVITRは、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むがそれらに限定されない、任意のいくつかのAAV血清型に由来し得る。さらに、AAVベクターにおいて、選択されたヌクレオチド配列に隣接する5'および3'ITRは、それらが意図するように、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にするように、ならびにAAVRep遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノム中への異種配列の組込みを可能にするように機能する限り、必ずしも同じAAV血清型もしくは単離株と同一であるかまたはそれに由来する必要はない。
【００３６】
「AAV repコード領域」により、ウイルスゲノムを複製させるために、および潜在的感染の間の宿主ゲノムへのウイルスゲノムの挿入のために集合的に必要とされるウイルスの複製タンパク質をコードする、当該分野で認識される、AAVゲノムの領域、またはその機能的ホモログ（例えば、AAV-2DNA複製を媒介することも知られているヒトヘルペスウイルス６（HHV-6）rep遺伝子（Thomsonら(1994) Virology 204:304-311））が意味される。従って、repコード領域は、AAVRep 78およびRep 68（「長形態のRep」）、ならびにRep52およびRep 40（「短形態のRep」）、またはその機能的ホモログをコードする遺伝子を少なくとも含む。AAVrepコード領域のさらなる記載については、例えば、Muzyczka,N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；およびKotin,R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801を参照のこと。本明細書中で使用する場合、repコード領域は、上記のAAV血清型のような任意のウイルス血清型に由来し得る。この領域は野生型遺伝子のすべてを含む必要はなく、適切なレシピエント細胞中で発現される場合に、存在するrep遺伝子が十分な組み込み機能を提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。
【００３７】
「AAV capコード領域」により、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされる、ウイルスのコートタンパク質をコードする、AAVゲノムの当該分野で認識される領域が意味される。従って、capコード領域は、コートタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする遺伝子を少なくとも含む。capコード領域のさらなる記載については、例えば、Muzyczka,N.(1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；およびKotin,R.M.(1994) Human Gene Therapy 5:793-801を参照のこと。本明細書中で使用される場合、AAV capコード領域は、上記のように、任意のAAV血清型に由来し得る。この領域は野生型cap遺伝子のすべてを含む必要はなく、AAVベクターとともに宿主細胞中に存在する場合に遺伝子が十分なパッケージング機能を提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。
【００３８】
「AAVベクター」により、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むがそれらに限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターが意味される。AAVベクターは、全体または一部が欠失した１つ以上のAAV野生型遺伝子、好ましくはrepおよび／またはcap遺伝子を有し得るが、機能的な隣接するITR配列を保持し得る。機能的ITR配列は、AAVビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングのために必要である。従って、AAVベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされるこれらの配列（例えば、機能的ITR）を少なくとも含むことが、本明細書中で定義される。ITRは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、そして、配列が機能的なレスキュー、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変更され得る。
【００３９】
「AAVヘルパー機能」は、発現されて、次に増殖性AAV複製のためにトランスで機能するAAV遺伝子産物を提供し得るAAV由来コード配列をいう。従って、AAVヘルパー機能は、主要なAAVオープンリーディングフレーム（ORF）（repおよびcap）の両方を含む。Rep発現産物は、とりわけ：AAVのDNA複製起点の認識、結合、およびニッキング；DNAヘリカーゼ活性；ならびにAAV（または他の異種の）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を有することが示されている。Cap発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。AAVヘルパー機能は、本明細書中では、AAVベクターから失われているAAV機能を、トランスで相補することに使用される。
【００４０】
用語「AAVヘルパー構築物」は、一般に、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入ベクターを産生するために使用される、AAVベクターから欠失したAAV機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。AAVヘルパー構築物は、一般に、溶菌性AAV複製に必要である、失われているAAV機能を相補するためにAAVrepおよび／またはcap遺伝子の一過性発現を提供するために使用される；しかし、ヘルパー構築物は、AAVITRを欠き、そしてそれ自体複製もパッケージングもし得ない。AAVヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。多くのAAVヘルパー構築物が記載されている（例えば、RepおよびCap発現産物の両方をコードする一般に使用されるプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45）。例えば、Samulskiら(1989)J. Virol. 63:3822-3828；およびMcCartyら (1991) J. Virol. 65:2936-2945を参照のこと。Repおよび／またはCap発現産物をコードする多くの他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第5,139,941号を参照のこと。
【００４１】
用語「補助機能（accessory function）」は、AAVがその複製のために依存する、非AAV由来ウイルス性および／または細胞性機能をいう。従って、この用語は、AAV複製のために必要とされるタンパク質およびRNA（AAV遺伝子転写の活性化、時期特異的AAVmRNAスプライシング、AAV DNA複製、Cap発現産物の合成およびAAVキャプシドアセンブリに関与する部分を含む）を捕らえる。ウイルスに基づく補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（１型単純ヘルペスウイルス以外）およびワクシニアウイルスのような任意の公知のヘルパーウイルスに由来し得る。
【００４２】
例えば、アデノウイルス由来補助機能は広く研究されており、そして補助機能に関与する多数のアデノウイルス遺伝子が同定され、そして部分的に特徴付けられている。例えば、Carter,B.J. (1990)「アデノ随伴ウイルスヘルパー機能」CRC Handbook of Parvoviruses、第Ｉ巻（P.Tijssen編）、およびMuzyczka,N. (1992) Curr. Topics. Microbiol. and Immun. 158:97-129を参照のこと。詳細には、初期アデノウイルス遺伝子領域E1a、E2a、E4、VAIRNAおよびおそらくE1bは、補助プロセスに関与すると考えられている。Janikら、(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925-1929。ヘルペスウイルス由来補助機能は、記載されている。例えば、Youngら、(1979)Prog.Med. Virol. 25:113を参照のこと。ワクシニアウイルス由来補助機能もまた記載されている。例えば、Carter,B.J.(1990)、前出、Schlehoferら、(1986) Virology 152:110-117を参照のこと。
【００４３】
用語「補助機能ベクター」は、一般に、補助機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。補助機能ベクターは、適切な宿主細胞中にトランスフェクトされ得、ここで次いでベクターは、宿主細胞におけるAAVビリオン産生を支持し得る。天然に存在するままの感染性ウイルス粒子（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス粒子）は、明白にこの用語から排除される。従って、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾンまたはコスミドの形態であり得る。
【００４４】
「効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る」により、宿主細胞のアデノウイルスヘルパーウイルスでの感染に際して得られ得るレベルと実質的に等価なまたはそれより高いレベルで、特定の宿主細胞におけるrAAVビリオン産生を相補するに十分である補助機能を提供する、補助機能ベクターまたは系の能力をいう。従って、効率的なrAAVビリオン産生を支持する、補助機能ベクターまたは系の能力は、補助ベクターまたは系を使用して得られるrAAVビリオン力価を、感染性アデノウイルスでの感染を使用して得られる力価と比較することにより決定され得る。より特定すると、等価な数の宿主細胞から得られるビリオンの量が、アデノウイルス感染を使用して得られる量の約200分の１以上、より好ましくは約100分の１以上、そして最も好ましくはアデノウイルス感染を使用して得られる量に等しいかまたはそれより多い場合、補助機能ベクターまたは系は、感染性アデノウイルスを使用して得られると実質的に同一またはそれより多い効率的なrAAVビリオン産生を支持する。
【００４５】
「組換えウイルス」により、例えば、粒子中への異種核酸構築物の付加または挿入によって、遺伝子的に改変されているウイルスが意味される。
【００４６】
「AAVビリオン」により、野生型（wt）AAVウイルス粒子（AAVキャプシドタンパク質コートと結合した直鎖状、一本鎖AAV核酸ゲノムを含む）のような完全なウイルス粒子が意味される。これに関して、いずれかの相補的センス（sense）の一本鎖AAV核酸分子（例えば、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）は、任意の１つのAAVビリオンにパッケージされ得、そして両鎖は等しく感染性である。
【００４７】
「組換えAAVビリオン」または「rAAVビリオン」は、本明細書中では、両側においてAAVITRにより隣接される、目的の異種ヌクレオチド配列を包膜するAAVタンパク質外皮から構成される感染性、複製欠損性ウイルスとして定義される。rAAVビリオンは、その中に導入されたAAVベクター、AAVヘルパー機能および補助機能を有している適切な宿主細胞において産生される。この方法において、宿主細胞は、AAVベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）をその後の遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子中にパッケージングするために必要とされるAAVポリペプチドをコードし得るようにされる。
【００４８】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来DNAの取り込みをいうように使用され、そして外因性DNAが細胞膜の内側に導入されている場合に、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が当該分野で一般に公知である。例えば、Grahamら(1973)Virology, 52:456、Sambrookら (1989) Molecular Cloning, a laboratorymanual,Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davisら (1986) Basic MethodsinMolecular Biology, Elsevier、およびChuら (1981) Gene 13:197を参照のこと。このような技術は、適切な宿主細胞中に、１つ以上の外因性DNA部分（例えば、ヌクレオチド組み込みベクターおよびその他の核酸分子）を導入するために使用され得る。
【００４９】
用語「宿主細胞」は、AAVヘルパー構築物、AAVベクタープラスミド、補助機能ベクター、または他の移入DNAのレシピエントとして使用され得る、または使用されている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を示す。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、一般に、外因性DNA配列でトランスフェクトされている細胞をいう。単一の親細胞の子孫が、自然の変異、偶発的な変異、または故意の変異によって、元の親と形態においてまたはゲノムDNA相補（complement）もしくは全DNA相補において必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「細胞株」は、インビトロにおける連続的または延長された増殖および分裂が可能である細胞の集団をいう。しばしば、細胞株は、単一の始原細胞に由来するクローン性集団である。自発的な変化または誘導された変化が、このようなクローン性集団の貯蔵または移入の間に、核型において生じ得ることは、当該分野でさらに公知である。それゆえ、言及される細胞株に由来する細胞は、先祖細胞または先祖培養物と正確に同一でなくてもよく、そして言及される細胞株はこのような変異体を含む。
【００５１】
用語「異種」は、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、通常は一緒には連結されていない、および／または通常は特定の細胞に伴われていない配列を示す。従って、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、天然では他の分子に結合して見出されない別の核酸分子の内の、またはこれに結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではコード配列に結合して見出されない配列により隣接されるコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見出されない構築物である（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞中に通常には存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種であると考えられる。対立遺伝子変異または天然に生じる変異事象は、本明細書で使用される場合、異種DNAを生じない。
【００５２】
「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボにおいて転写され（DNAの場合）そしてポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端における開始コドンおよび3'（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物のDNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえも含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の3'側に位置する。
【００５３】
「核酸」配列は、DNAまたはRNA配列をいう。この用語は、以下のような、しかしそれらに限定されない任意の公知のDNAおよびRNAの塩基アナログを含む配列を捕らえる：4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルシュードウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシ-アミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、お
よび2,6-ジアミノプリン。
【００５４】
用語DNA「制御配列」は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「IRES」）、エンハンサーなどを集合的にいい、これらはレシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。
【００５５】
用語「プロモーター領域」は、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域をいうためのその普通の意味で本明細書において使用され、ここで、調節配列は、RNAポリメラーゼを結合し得、そして下流（3'方向）のコード配列の転写を開始し得る遺伝子に由来する。
【００５６】
「作動可能に連結」は、そのように記載される成分がそれらの通常の機能を実行するように配置されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらし得る。制御配列は、それがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結」されていると考えられ得る。
【００５７】
ヌクレオチド配列に言及する場合、「単離された」により、示される分子が、同じタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下で存在することが意味される。従って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう；しかし、この分子は、組成物の基本的特徴に有害な影響を与えないいくらかのさらなる塩基または部分を含み得る。
【００５８】
本出願を通して特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的のために、例えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に関して「上流」、「下流」、「3'」、または「5'」に位置すると記載される場合、これは、当該分野において慣習的であるようにいわれる、DNA分子の「センス」鎖または「コード」鎖における配列の位置であると理解されるべきである。
【００５９】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分間の同一性の割合をいう。１つの部分由来の配列と別の部分由来の配列との間の対応は、当該分野で公知の技術によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報をアラインさせ、そして容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することによって、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較により決定され得る。あるいは、相同性は、相同性領域間での安定な二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数または複数）での消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定によって決定され得る。上記の方法を使用して決定したところ、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、および最も好ましくは少なくとも約95％のヌクレオチドまたはアミノ酸が、規定された長さの分子にわたってマッチする場合、２つのDNAまたは２つのポリペプチド配列は、互いに「実質的に相同」である。
【００６０】
所定のポリペプチドの「機能的ホモログ」または「機能的等価物」は、天然のポリペプチド配列に由来する分子、および、所望の結果を達成するように参照分子と同様の様式で機能する、組換えで産生される、または化学的に合成されるポリペプチドを含む。従って、AAVRep68またはRep78の機能的ホモログは、組み込み活性が残存する限り、これらのポリペプチドの誘導体およびアナログ（その内部でまたはアミノ末端もしくはカルボキシ末端で生じる、任意の単一のまたは複数のアミノ酸の付加、置換、および／または欠失を含む）を含む。
【００６１】
所定のアデノウイルスヌクレオチド領域の「機能的ホモログ」または「機能的等価物」は、異種アデノウイルス血清型に由来する類似の領域、別のウイルスまたは細胞性供給源に由来するヌクレオチド領域、ならびに、所望の結果を達成するように参照ヌクレオチド領域と同様の様式で機能する、組換えで産生される、または化学的に合成されるポリヌクレオチドを含む。従って、アデノウイルスVARNA遺伝子領域またはアデノウイルスE2a遺伝子領域の機能的ホモログは、ホモログが、バックグランドより上の検出可能なレベルでAAVビリオン産生を支持するためにその固有の補助機能を提供する能力を保持する限り、このような遺伝子領域の誘導体およびアナログ（領域内で生じる、任意の単一のまたは複数のヌクレオチド塩基の付加、置換、および／または欠失を含む）を含む。
【００６２】
Ｂ.一般的方法
本発明の中心は、ヘルパーウイルスによる感染なしに効率的にrAAVビリオンを産生させる補助機能系の開発である。従来の産生方法と異なり、補助機能は、rAAVビリオン産生を補うために必要な遺伝子を含む一つ以上のベクター（例えば、プラスミド）を宿主細胞へ導入することにより提供される。この様式で、本補助機能系は、有意なレベルのヘルパーウイルス粒子または他のウイルス産生物（例えば、アデノウイルス繊維タンパク質）に汚染されずに産業的に有意なレベルのrAAVビリオンの産生を支持し得る。rAAVビリオンの効率的な産生は、rAAVビリオンの収量が、補助機能を提供するための２型アデノウイルス感染を用いたときに得られるレベルより、約200倍より低くないレベルで得られる場合に達成される。
【００６３】
補助機能は、一つ以上のベクター上で提供される。ベクターは、rAAVビリオンの産生のために必要なアデノウイルス由来のヌクレオチド配列を含む。以下にさらに記載されるように、補助機能構築物上に存在する配列は、使用される宿主細胞によって決定され、そしてE1a、E1b、E2a、E4、およびVARNA領域を含み得る。
【００６４】
任意の特定の理論に拘束されることなく、アデノウイルスE1b、E2a、およびE4初期遺伝子によって提供される補助機能は、AAVのDNA複製において必要とされると考えられる。アデノウイルスE1b、E4、およびVARNA遺伝子領域によって提供される補助機能は、AAVの生活環において転写後事象または翻訳事象に関与するようである。E4によって提供される補助機能に関しては、E4コード領域のオープンリーディングフレーム６(ORF6)によってコードされるE434kDタンパク質のみが、明らかにAAV複製に必要とされる。アデノウイルス遺伝子領域E1aによって提供される補助機能は、他のアデノウイルス遺伝子領域（E1b、E2a
、E4およびVA RNAを含む）の転写または発現を活性化する調節因子として必要であると考えられる。
【００６５】
あるいは、本発明の補助機能ベクターは、それぞれのホモログが、置換されたアデノウイルス遺伝子の補助機能を提供する能力を保有する限り、アデノウイルス遺伝子配列を置換する一つ以上のポリヌクレオチドホモログを含み得る。従って、相同なヌクレオチド配列は、別のアデノウイルス血清型（例えば、２型アデノウイルス）、別のヘルパーウイルス部分（例えば、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス）に由来し得、または任意の他の好適な供給源に由来し得る。
【００６６】
さらに、本発明に従って構築された補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、またはコスミドの形態であり得る。あるいは、ベクターは、適切な制御エレメントおよび酵素と結合される場合、宿主細胞において補助機能を提供するために転写または発現され得る一つ以上の線状化されたDNAまたはRNAフラグメントの形態であり得る。上記のベクターの全ては、当該分野に公知のトランスフェクション技術を使用して、好適な宿主細胞に容易に導入され得る。このようなトランスフェクション方法は、カルシウムリン酸供沈(Grahamら、(1973)Virol.52:456-467)、培養細胞への直接マイクロインジェ
クション(Capecchi, M.R. (1980) Cell 22:479-488)、エレクトロポレーション(Shigekawaら、(1988)BioTechniques6:742-751)、リポソーム媒介遺伝子導入(Manninoら、(1988) BioTechniques 6:682-690)、脂質媒介トランスフェクション(Felgnerら、(1987)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417)および、高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達(Kleinら、(1987)Nature327:70-73)を含み、これら文献に記載されている。
【００６７】
補助機能ベクターは従来の組換え技術を使用して操作され得る。詳細には、核酸分子は、例えば、ポリリンカーオリゴヌクレオチドなどを使用してクローニングベクターに制限酵素フラグメントを連結することによって、一つ以上の補助機能ヌクレオチド配列を構築物に挿入することにより、任意の所望される順序で容易にアセンブリされ得る。次いで、新たに形成された核酸分子は、ベクターから切り出され得、そして制限酵素または当該分野に周知の他の技術を使用して適切な発現構築物中に配置され得る。
【００６８】
より詳細には、選択されたアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域（例えば、E1a、E1b、E2a、E4、およびVA RNA）、あるいはそれらの機能的ホモログは、ウイルスゲノムから、または同じものを含むベクターから切り出され得、そして標準の連結技術（例えば、Sambrookら、前出、に記載）を使用して、好適なベクターに個々に、または共に連結されて挿入されて補助機能構築物を提供し得る。図２に関連して、そのような構築物の一つは、５型アデノウイルスゲノム由来の４つの核酸分子（VARNAを含む領域；E2aを含む領域；E4を含む領域、およびE1a、E1bを含む領域）を含むように操作され得る。詳細には、図２
は以下を示す：1,724bpのSalI-HinDIIIフラグメントであるVA RNAを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約9,831から約11,555の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；5,962bpのSrfI-BamHIフラグメントであるE2aを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約21,606から約27,568の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；3,669bpのHphI-HinDIIIフラグメントであるE4を含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約32,172から約36,841の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；および4,102bpのBsrGI-Eco47IIIフラグメントであるE1a、E1bを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約192から約4294の位置にわたるヌクレオチドに対応する）、ここで核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能の完全な相補を提供する。連結は、20mMTris-Cl pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM〜50mM NaCl、および40μMATP、０℃で0.01〜0.02(Weiss)ユニットのT4DNAリガーゼ（「付着末端」連結のため）、または1mM ATP、14℃で0.3〜0.6(Weiss)ユニットのT4DNAリガーゼ（「平滑末端」連結のため）のいずれか中で達成され得る。分子内「付着末端」連結は、通常、30〜100μg/mlの総DNA濃度で実施される（５〜100nMの最終濃度）。次いで、アセンブリされた分子は、補助機能構築物を細胞間で転移し得る発現ベクターに容易に挿入され得る。
【００６９】
あるいは、一つ以上の補助機能を含む核酸分子は、当該分野の従来の固相直接オリゴヌクレオチド合成化学および酵素連結方法の組合せを使用して、合成的に得られ得る。合成配列は、制限酵素部位のような特徴を有するように構築され得、そして市販のオリゴヌクレオチド合成装置（例えば、AppliedBiosystems, Inc.(Foster City, CA)から入手可能の装置）でホスホルアミダイト方法を使用して調製され得る。例えば、Beaucageら、(1981)TetrahedronLett. 22:1859-1862を参照のこと。２型アデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、一般的に公知であり、そして公的に入手可能である（例えば、GeneBank参照名：ADRCG、アクセス番号：J01917；およびNCBI同定番号：209811）。５型アデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、２型アデノウイルスゲノムと99％相同であると考えられている。哺乳動物細胞における合成分子の発現に好ましいコドンもまた、容易に合成され得る。次いで、完全な核酸分子が、上記の方法によって調製された重複したオリゴヌクレオチドからアセンブリされる。例えば、Edge,Nature(1981)292:756; Nambairら、Science (1984) 223:1299; Jayら、J. Biol.Chem.(1984) 259:6311を参照のこと。
【００７０】
アデノウイルス遺伝子領域が、補助機能を提供するために本発明のベクターにおいて使用される場合、これらの領域は、これらの転写または発現を指向する制御配列に作動可能に連結される。このような制御配列は、通常、野生型アデノウイルスゲノム中の遺伝子領域と結合されたこれらのアデノウイルス制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が所望される場合、使用され得る。有用な異種プロモーター配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するプロモーター配列を含む。例として、相同なアデノウイルスプロモーター、SV40初期プロモーター、マウス乳ガンウイルスLTRプロモ
ーター；アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)；単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター（例えば、CMV即時初期プロモーター領域）、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが含まれるが、これらに制限されない。さらにマウスメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、本明細書中において使用が見出される。このようなプロモーター配列は、例えば、Stratagene(SanDiego, CA)から市販されている。
【００７１】
さらに、本発明のベクターはまた、選択マーカーを含むように構築され得る。好適なマーカーは、核酸構築物でトランスフェクトされた細胞が適切な選択培地で増殖される場合に、抗生物質耐性、または感受性を与える遺伝子、または色を与える遺伝子、または抗原的特徴を変化する遺伝子を含む。本発明の実施において有用な特定の選択マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドリン酸転移酵素(APH)をコードする）を含み、これはG418に対する耐性を与えることにより哺乳動物細胞における選択を可能にする（Sigma,St.Louis, MO.から入手可能）。他の好適なマーカーは当業者に公知である。
【００７２】
アデノウイルスの補助機能遺伝子または遺伝子領域（例えば、E1a、E1b、E2a、E4、VA RNA、および／またはそれらの機能的ホモログ）の完全な相補物を含む補助機能ベクターは、ヘルパーウイルスに寛容でない宿主細胞（例えば、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスによって感染可能でない、またはヘルパーウイルスの複製を支持し得ない）を含む宿主細胞に補助機能を提供するために使用され得る。この様式で、rAAVビリオン産生は、以前はそのような産生の支持に対しては屈折していた宿主細胞を含む広範な宿主細胞において実施され得る。
【００７３】
あるいは、補助機能ベクターは、補助機能の完全相補を下回るものを含むように構築され得る。このようなベクターは、すでに一つ以上の補助機能を与え得る細胞、例えば、一つ以上の補助機能を遺伝的に（例えば、細胞が補助機能のホモログを発現する場合）、または形質転換事象によって与えられる細胞において使用され得る。補助機能の完全相補を下回るものを含む補助機能ベクターはまた、他の補助的な補助機能構築物と組み合わせて使用され得る。
【００７４】
詳細には、好適な宿主細胞は、通常の組換え技術を使用して操作されて、一つ以上の補助機能を提供する細胞を産生し得る。例えば、ヒト細胞株293は、５型アデノウイルスDNAフラグメントで形質転換されたヒト胚腎臓細胞株(Grahamら、(1977)J. Gen.Virol. 36:59)であり、そしてアデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子を発現する(Aielloら、(1979)Virology 94:460)。293細胞株は、容易にトランスフェクトされ、そしてrAAVビリオンの産生のための特に便利なプラットフォームを提供する。従って、本発明の特に好ましい一つの実施態様において、アデノウイルスE2a、E4およびVARNA遺伝子領域、またはそれらの機能的ホモログのみを有する補助機能ベクターが提供される。
【００７５】
図１に関連して、一つのそのような構築物が、５型アデノウイルスゲノム由来の３つの核酸分子：1,724bpのSalI-HinDIIIフラグメントであるVARNAを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約9,831から約11,555の位置にわたるヌクレオチドに対応する）;5,962bpのSrfI-BamHIフラグメントであるE2aを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約21,606から約27,568の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；および3,669bpのHphI-HinDIIIフラグメントであるE4を含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約32,172から約36,841の位置にわたるヌクレオチドに対応する）を含むように操作され得、ここで核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能の切形の相補を提供する。
【００７６】
図３に関連して、別の構築物が、２型アデノウイルスゲノム由来の３つの核酸分子：732bpのEcoRV-SacIIフラグメントであるVA RNAを含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約10,423から約11,155の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；5,962bpのSrfI-KpnIフラグメントであるE2を含むフラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約21,606から約27,568の位置にわたるヌクレオチドに対応する）；および3,192bpのSrfI-SpeI改変フラグメントであるE4ORF6を含む改変フラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約32,644から約34,120の位置にわたるヌクレオチドに対応する）を含むように操作され得る。核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能のなおさらなる切形の相補を提供する。
【００７７】
これらのベクターは組換えおよび／または合成技術を使用して上記のように構築され得、そして異種プロモーター領域、選択マーカーなどのような種々の補助構成成分を含み得る。293宿主細胞へのトランスフェクションに際して、ベクターは、rAAVビリオンの効率的な産生を支持し得る補助機能を提供する。
【００７８】
一旦操作されると、本発明の補助機能ベクターは、rAAVビリオン産生のための種々の系に使用され得る。例えば、AAVヘルパー機能を提供するために、細胞において発現され得るAAVベクターおよびAAVヘルパー構築物で同時トランスフェクトされた場合、一つ以上の補助機能ベクターでトランスフェクトされた好適な宿主細胞は、これらによってrAAVビリオンを産生し得る。
【００７９】
AAVベクター、AAVヘルパー構築物、および補助機能ベクターは、同時に、または連続的のいずれかで、上記のトランスフェクション技術を使用して宿主細胞に導入され得るようになる。
【００８０】
目的のヌクレオチド配列を送達するためのrAAVビリオンを産生するために使用されるAAVベクターは、両方の末端（５’末端および３’末端）で機能的AAV ITRと連結した、一つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むように構築され得る。本発明の実施において、AAVベクターは、一般に、少なくとも一つのAAVITRおよび異種ヌクレオチド配列に関して好適
に位置された適切なプロモーター配列、ならびに異種配列の下流に位置された少なくとも一つのAAV ITRを含む。５’および３’ITRは、これらが意図されたように機能する限り、同じAAV単離物と必ずしも同一である、またはこれに由来する必要はない。
【００８１】
AAVベクターにおいて使用するための好適な異種ヌクレオチド配列は、任意の機能的に
関連したヌクレオチド配列を含む。従って、本発明の実施において使用するためのAAVベクターは、受容細胞のゲノムから欠損または欠失するタンパク質をコードする任意の所望の遺伝子、または所望の生物学的もしくは治療効果（例えば、抗ウイルス機能）を有する非天然のタンパク質をコードする任意の所望の遺伝子のいずれか、あるいはアンチセンスまたはリボザイム機能を有する分子に対応し得る配列を含み得る。好適な遺伝子は、以下の処置のために使用され得る遺伝子を含むが、これらに限定されない：AIDS、ガン、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症のような疾患を含む炎症性疾患、自己免疫、慢性および感染性疾患；種々の貧血、サラセミア、および血友病を含む種々の血液疾患；嚢包性線維症、ゴーシェ病、アデノシンジアミナーゼ(ADA)欠損、気腫などのような遺伝的欠損。ガン、心血管疾患、およびウイルス性疾患のアンチセンス治療において有用である多くのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、mRNAの翻訳開始部位(AUGコドン)の周囲の配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド）が、当該分野において記載されている。例えば、Hanら、(1991)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:4313-4317;Uhlmannら、(1990) Chem. Rev. 90:543-584;Heleneら、(1990)Biochim.Biophys. Acta. 1049:99-125;Agarwalら、(1988) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:7079-7083;およびHeikkilaら、(1987)Nature 328:445-449を参照のこと。好適なリボザイムの論議については、例えば、Cechら、(1992)J. Biol. Chem.267:17479-17482、およびGoldbergらの米国特許第5,225,347号を参照のこと。
【００８２】
AAVベクターはまた、プロモーターおよびポリアデニル化部位のような制御配列、ならびに選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列、および転写の誘導を可能にする他の制御エレメントを含み得る。このようなAAVベクターは、当該分野で周知の技術を用いて構築され得る。例えば、米国特許第5,173,414号；国際公開番号第WO92/01070号（1992年１月23日に公開された）および同第WO93/03769号（1993年３月４日に公開された）；Lebkowskiら、(1988)Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincentら、(1990)Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter、B.J. (1992) CurrentOpinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N. (1992) Current Topics inMicrobiol. and Immunol. 158:97-129；Kotin,R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801；ShellingおよびSmith(1994) GeneTherapy 1:165-169；ならびにZhouら（1994）J. Exp. Med. 179:1867-1875を参照のこと。
【００８３】
本発明の方法において、AAVヘルパー構築物を使用して、AAVベクターから欠失されたAAV機能を相補する。以下を含む多くの適切なAAVヘルパー構築物が記載されている：例えば、repおよびcap発現産物の両方をコードするプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45（例えば、Samulskiら（1989）J.Virol.63:3822-3828およびMcCartyら（1991）J. Virol. 65:2936-2945を参照のこと）。この様式においてrAAVビリオン産生を支持する相補性AAVヘルパー機能は、当該分野で容認された技術である。しかし、AAVベクター中に存在するAAVITR配列と、ヘルパー構築物中に存在するAAVヘルパー機能配列との間での相同組換え事象によって、このような技術はまた、rAAVビリオンストック中に野生型AAVビリオンの混入を生じる。AAVに基づくベクター系中の野生型AAV粒子の存在は、組換えAAVビリオンの意図されない拡大を潜在的に導き得、そして外来遺伝子の効率的な発現を妨げ得る。
【００８４】
Ｃ．実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、例示の目的でのみ提供され、そして本発明の範囲をいかなるようにも限定することを意図しない。
【００８５】
使用された数字（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にする努力が行われたが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん許容されるべきである。
【００８６】
プラスミド構築
プラスミドJM17（McGroryら（1988）Virology163:614-617）（５型アデノウイルスの環状単離物を、アデノウイルスE1a遺伝子の末端の唯一のXbaI部位に挿入されたプラスミドベクターpBR322Xとともに含む）を、アデノウイルス遺伝子の供給源として使用した。５型アデノウイルスおよびpJM17の両方とも完全には配列決定されていない。従って、以下に記載される５型アデノウイルスのフラグメントのサイズはほぼ正確である。２型アデノウイルスが完全に配列決定されており、そして２型および５型アデノウイルスが約99％相同であると考えられているので、５型アデノウイルスのフラグメントのサイズは、対応する２型アデノウイルスのフラグメントに基づいて近似される。
【００８７】
プラスミドpBSII-VARNA（ATCCアクセス番号98233）を以下のように構築した。約5,324bpのHinDIII-HinDIIIフラグメント（５型アデノウイルスVA RNAIおよびIIコード領域を含む）をプラスミドpJM17から得た。5,324bpのフラグメントを、プラスミドベクターpBIIs/k-（Stratageneから入手した）のHinDIII部位に挿入した。5,324bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノム（例えば、GeneBank参照名称：ADRCG、アクセス番号：J01917；およびNCBI同定番号：209811として公に入手可能）の6,231位から11,555位（HinDIII部位）に伸びるヌクレオチドに対応する。
【００８８】
プラスミドpBSII-E2a+E4を以下のように構築した。約15,667bpのBamHI-XbaIフラグメント（５型アデノウイルスE2a、E3、およびE4コード領域、頭と頭で連結されたアデノウイルス末端反復、ならびに５型アデノウイルスE1aコード領域の一部を含む）をプラスミドpJM17から得た。プラスミドベクターpBSIIs/k-を、BamHIおよびXbaIで切断し、そして15,667bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。15,667bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの21,606位（BamHI部位）から35,937位（3'末端の遠位末端）に伸びるヌクレオチド、および１位（5'末端の最初）から1,336位（XbaI部位）に伸びるヌ
クレオチドに対応する。
【００８９】
プラスミドpBSII-E2aを以下のように構築した。約5,935bpのBamHI-EcoRIフラグメント（５型アデノウイルスE2aコード領域を含む）をプラスミドpJM17から得た。プラスミドベクターpBSIIs/k-をBamHIおよびEcoRIで切断し、そして5,935bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。5,935bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの15,403位（BamHI部位）から21,338位（EcoRI部位）に伸びるヌクレオチドに対応する。
【００９０】
プラスミドpBSII-E4を以下のように構築した。約5,111bpのXhoI-XbaIフラグメント（５型アデノウイルスE4コード領域、頭と頭で連結されたアデノウイルス末端反復、および５型アデノウイルスE1コード領域の一部を含む）をプラスミドpJA17から得た。プラスミドベクターpBSIIs/k-を、XhoIおよびXbaIで切断し、そして5,111bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。5,111bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの29,788位（XhoI部位）から35,937位（3'末端の遠位末端）に伸びるヌクレオチド、および１位（5'末端の最初）から1,336位（XbaI部位）に伸びるヌクレオチドに対応する。
【００９１】
プラスミドpWadhlacZを以下のように構築した。プラスミドpUC119（GeneBank参照番号：U07649、GeneBankアクセス番号：U07649）を、AflIIIおよびBspHIで部分的に消化し、クレノウ酵素を用いて平滑末端に改変し、次いで連結して、細菌の起点およびamp遺伝子のみを含む（ポリリンカーおよびF1起点を取り除いた）を含む環状の1732bpのプラスミドを形成した。平滑末端化し、そして連結したAflIIIおよびBspHIの連結部は唯一のNspI部位を形成する。1732bpのプラスミドをNspIで切断し、T4ポリメラーゼを用いて平滑末端に改変し、そしてpUC119ポリリンカーから得た20bpのHinDIIIーHinCIIフラグメント（クレノウ酵素を用いて平滑末端に改変した）を、プラスミドの平滑化したNspI部位に連結した。平滑化したポリリンカー由来のHinDIII部位を再度作製し、次いで細菌の複製起点に隣接して配置した。次いで、得られたプラスミドを唯一のPstI/Sse8387I部位で切断し、そしてSse8387I-PvuII-Sse8387Iオリゴヌクレオチド（5'-GGCAGCTGCCTGCA-3'（配列番号１)）をそこに連結した。残っている唯一のBspHI部位を切断し、クレノウ酵素を用いて平滑末端に改変し、そしてAscIリンカーを含むオリゴヌクレオチド（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号２)）をそこに連結し、BspHI部位を排除した。得られたプラスミドをpWeeと称した。
【００９２】
pWadhlacZ構築物を作製するために、CMVlacZ発現カセット（AAV ITRによって5'および3'が隣接されたヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は以下のエレメントを含む：CMVプロモーター、hGHの第１のイントロン、adhlacZフラグメント、およびSV40初期ポリアデニル化部位を含む）を、複数の工程を用いてpWeeの唯一のPvuII部位に挿入し、その結果CMVプロモーターは、pWeeの細菌のamp遺伝子に隣接して配置された。
【００９３】
より詳細には、CMVlacZ発現カセットは、プラスミドpsub201CMVから誘導され、以下のように構築された。制限酵素部位：NotI-MluI-SnaBI-AgeI-BstBI-BssHII-NcoI-HpaI-BspEI-PmlI-RsrII-NotIをコードし、そして以下のヌクレオチド配列：5'-GCGGCCGCACGCGTACGTACCGGTTCGAAGCGCGCACGGCCGACCATGGTTAACTCCGGACACGTGCGGACCGCGGCCGC-3'（配列番号３）
を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてpUC119の平滑末端に改変したKasI-EarI部位（部分的）にクローン化して、2757bpのベクターフラグメントを得た。CMV即時初期プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む653bpのSpeI-SacIIフラグメントを、2,757bpのベクターフラグメントのSnaBI部位にクローン化した。さらに、hGHの第１のイントロンをコードするヌクレオチド配列を含む、269bpのPCRで作製したBstBI-BstBIフラグメント（これは以下のプライマーを用いて得られた：5'-AAAATTCGAACCTGGGGAGAAACCAGAG-3'（配列番号４）および3'-aaaattcgaacaggtaagcgcccctTTG-5'（配列番号５)）を、2,757bpのベクターフラグメントのBstBI部位にクローン化し、そしてpCMV-βプラスミド（Clonetechから入手した）由来のSV40初期ポリアデニル化部位を含む、135bpのHpaI-BamHI（平滑末端に改変した）フラグメントを、目的のベクターフラグメントのHpaI部位にクローン化して、p1.1cと称されるプラスミドを得た。次いで、p1.1cプラスミドをNotIで切断して、第１のCMV発現カセットを得た。
【００９４】
プラスミドpsub201（Samulskiら、（1987）J.Virol 61:3096-3101）をXbaIで切断し、平滑末端に改変し、そしてNotIリンカー（5'-TTGCGGCCGCAA-3'（配列番号６)）をその末端に連結して、細菌の複製起点およびamp遺伝子を含むベクターフラグメントを得た。ここで、ベクターフラグメントはNotI部位に両側で隣接されている。NotIで切断した後、第１のCMV発現カセットをpsub201ベクターフラグメントにクローン化して、psub201CMVを作製した。このプラスミド由来のITRに結合された発現カセットを、PvuIIでの切断によって単離し、そしてpWeeをPvuIIで切断した後、このプラスミドに連結して、pWCMVを作製した。次いで、pWCMVをBssHIIで切断し（部分的）、そしてadhlacZ遺伝子を含む3246bpのフラグメント（プラスミドpCMV-βから得たSmaI-DraIヌクレオチドフラグメントの末端にAscIリンカー（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号７))を連結して3246bpのフラグメントを得た）を、pWCMVのBssHII部位に連結して、pWadhlacZ構築物を得た。
【００９５】
プラスミドpW1909adhlacZを以下のように構築した。AAVrepおよびcapコード領域を含む4723bpのSpeI-EcoRVフラグメントを、プラスミドpGN1909（ATCCアクセス番号69871）から得た。pGN1909プラスミドは、repコード領域についてその通常の位置（野生型AAVゲノムにおける位置）から下流になるような構築物に配置されるAAVp5プロモーター領域とともに、AAVrepおよびcap遺伝子を有する高効率AAVヘルパープラスミドである。4723bpのフラグメントを平滑末端に改変し、そしてAscIリンカー（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号８)）を平滑末端に連結した。次いで、得られたフラグメントをpWadhlacZの唯一のAscI部位に連結し、そしてAAVコード配列が構築物中の細菌の複製開始点に隣接して配置されるように方向付けした。
【００９６】
プラスミドpW620adhlacZを以下のように構築した。AAVrepおよびcapコード領域を含む4439bpのMscIフラグメントを、プラスミドpSM620（Samulskiら（1982）Proc.Natl.Acad. Sci. USA 79:2077-2081）から得た。4439bpのフラグメントを平滑末端に改変し、そしてAscIリンカー（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号９)）を平滑末端に連結した。次いで、得られたフラグメントをpWadhlacZの唯一のAscI部位に連結し、そしてAAVコード配列が構築物中の細菌の複製開始点に隣接して配置されるように方向付けした。
【００９７】
プラスミドpW1909を以下のように構築した。pW1909adhlacZプラスミドをSse8387で切断し、そして6506bpのSse8387I-Sse8387Iフラグメント（アンピシリン耐性遺伝子、coli1複製起点、およびAAVヘルパー配列を含む）を、分子内連結により再環化して、pW1909構築物を得た。
【００９８】
pVlacZベクタープラスミドは、pUC119プラスミド中にクローン化されたpW1909adhlacZから得られるSse8387I-Sse8371Iフラグメントの改変バージョンである。pVlacZのSse8387I-Sse8371Iは、AAV逆方向末端反復（ITR）由来ではない全てのAAV配列が排除されている点で、pW1909のSse8387I-Sse8371Iフラグメントとは異なる。プラスミドpVlacZを以下のように構築した。AAV血清型２の塩基対122〜145を下流のNotI適合性末端と組み合わせることによって形成されたDNAの合成断片を構築し、全てのＤループを含むAAVITR配列を含むMscI-NotIフラグメントを得た。合成DNAを、pW1909adhlacZプラスミド由来の4384bpのNotIフラグメントの両末端に連結した。4384bpのフラグメントはCMVlacZ配列を含む。次いで、得られたフラグメントをpW1909adhlacZの6732bpのMscIフラグメントに連結して組立て（assembly）構築物を得た。組立て構築物をSse8387Iで切断して4666bpのSse8387I-Sse8371Iフラグメント（CMVlacZ配列を含む）を得、そして4666bpのフラグメントをpUC119中にSse8387I部位で連結してpVlacZベクタープラスミドを得た。
【実施例】
【００９９】
実施例１
補助機能を供給するためのトランスフェクトされたアデノウイルス遺伝子を用いるrAAVビリオンの産生
トランスフェクションによって適切な宿主細胞中に導入されたアデノウイルス遺伝子が、AAV複製の状況におけるアデニウイルス感染によって提供される補助機能に類似の補助機能を提供し得るかどうかを決定するために、以下の実験を行った。
【０１００】
安定なヒト細胞株由来の細胞である293（例えば、アクセス番号CRL1573のもとでATCCを通じて容易に入手可能）を、10cmの組織培養ディッシュに1×106細胞／ディッシュでプレートし、４回の二連の実験群を提供した。次いで、細胞を37℃で増殖させ、トランスフェクションの前の約24〜48時間にわたって90％のコンフルエントに到達させた。各群において、プラスミドpW1909adhlacZを、レスキュー可能なAAVlacZベクター、ならびにAAVrepおよびcapコード領域の供給源として使用した。
【０１０１】
トランスフェクションを、改変されたリン酸カルシウム法を用いて、計20μgのDNAで５時間行った。より詳細には、トランスフェクションの１〜４時間前に組織培養プレート中の培地を、10％のFCS、１％のpen/strep、および１％のグルタミンを含有する新鮮なDME/F12培養培地で置き換えた。１以上のベクターを含む計20μgのDNAを、１mLの滅菌した300mMのCaCl2に添加し、次いでこれを１mLの滅菌した２×HBS溶液（280mMのNaCl、50mMのHEPES緩衝液、1.5mMのNa2HPO4を混合し、そして10MのNaOHでpH7.1に調製することによって形成される）に添加し、そして穏やかに逆さにすることによってすぐに混合した。得られた混合物をすぐに10cmプレートの90％のコンフルエント細胞（10mLの上記の培養培地中）にピペッティングし、そして回転させて均質な溶液を作製した。プレートを５％のCO2インキュベーターに移し、そして撹拌せずに約５時間37℃で培養した。トランスフェクション後、培地をプレートから取り除き、細胞を滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で１回洗浄した。
【０１０２】
アデノウイルス作用（working）ストックを、２型アデノウイルスのマスターストックを、10％のFCS、１％のpen/strep、１％のグルタミン、および25mMの滅菌したHEPES緩衝液（pH7.4）を加えたDME/F12中で106pfu/mlの濃度に希釈することによって調製した。
【０１０３】
第１群由来の細胞培養物を、各10μgのプラスミドpW1909adhlacZおよびpBSII s/k-でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、１感染多重度（moi）で２型アデノウイルスを含有する10mLの培地を添加し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１０４】
第２群由来の細胞培養物を、各10μgのプラスミドpW1909adhlacZおよびpJM17でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１０５】
第３群由来の細胞培養物を、各10μgのpBSII s/k-およびpJM17でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１０６】
第４群由来の細胞培養物を、各10μgのpW1909adhlacZおよびpBSII s/k-でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１０７】
各実験群由来の細胞を回集し、培地を遠心分離（1000×g、10分間）によって取り除き、そして１mLの溶解物を、３回の凍結／解凍サイクル（ドライアイス−エタノールと37℃との湯浴の交替）を用いて得た。溶解物を遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まないようにした。rAAVlacZビリオン産物を、293細胞について凍結／解凍抽出物を力価測定すること、およびlacZについてアッセイすることによって評価した。
【０１０８】
詳細には、293細胞を12ウェルプレートに（ウェルあたり1×105細胞で）プレートし、そして上記の凍結／解凍溶解物の容量範囲（10〜0.01μL）で接種し、そして37℃で24時間インキュベートした。次いで、培地の除去、２％のホルムアルデヒドおよび0.2％のグルタルアルデヒドを含有するPBS中での５分間の細胞のインキュベーション、PBSで１回の洗浄、次いで５mMのフェロシアン化カリウム、５mMのフェリシアン化カリウム、２mMの塩化マグネシウム、および１mg/mlのX-Galを含有するPBS中での一晩の細胞のインキュベーションによって、細胞を固定し、そして染色した（Sanesら、(1986）EMBO5:3133-3142）。次いで、rAAVビリオン力価を光学顕微鏡を用いて青色細胞の数を定量することによって計算した。
【０１０９】
混入している感染性アデノウイルス産物を以下のようにアッセイした。細胞溶解物由来のサンプルを、50％コンフルエントの293細胞（12ウェルディッシュ中で1×105細胞／ウェルで培養した）に添加し、そして培養物を30日間（例えば、培養物を３日毎に１〜５に分ける）、または培養物がアデノウイルスの感染によって100％のCPEを示すまで経過させた。培養物を毎日CPEについて試験し、そして各実験培養物が100％のCPEを示す日を記録した。２型アデノウイルスの既知の量の範囲（０〜1×107pfu／培養物）で感染させた参照293細胞培養物をまた調製し、そして同じ様式で処理した。次いで標準曲線を、参照培養物から得たデータによって調製した。ここでアデノウイルスのpfu数を100％CPEの日の対してプロットした。次いで、各実験培養物における感染性２型アデノウイルスの力価を、標準曲線から決定されるように容易に得た。アッセイにおける検出限界は100pfu/mLであった。
【０１１０】
実験の結果を以下の表１に示す。
【０１１１】
【数１】
【０１１２】
表１の結果によって見られ得るように、トランスフェクションによって宿主細胞中に導入され、そしてアデノウイルス感染の非存在下で発現されるアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルス感染によって提供される補助機能のレベルの有効性の約20％（すなわち、５倍少ない）レベルで補助機能を提供し得る。
【０１１３】
実施例２
補助機能を担うアデノウイルス遺伝子領域の同定
どのアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域は、補助機能の提供において必要かつ十分であるかを決定する目的で、以下の実験を行った。
【０１１４】
293細胞を、１×10６細胞／皿で12の10-cm組織培養皿にプレートして６組の二重実験群を提供した。次いで、細胞を、トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで増殖させた。各群において、プラスミドpW1909adhlacZを、レスキュー可能なAAVlacZベクターならびにAAVrepおよびcapコード領
域の供給源として用いた。トランスフェクションを、上記実施例１に記載のように行った。また、アデノウイルス作業ストックを、前述のように調製した。
【０１１５】
各293細胞培養物を、プラスミドpW1909adhlacZおよびプラスミドpBSIIs/k-（コントロールとして）、または単離されたアデノウイルス遺伝子の種々の組み合わせのいずれかでトランスフェクトした。
【０１１６】
より詳細には、第一の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）および15μgのプラスミドpBSII s/k-で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの期間後、培地を交換し、そして細胞を２型アデノウイルス（moi＝１）を含む10mLの培地を用いて感染させた。次いで培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１１７】
第２の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）および15μgのプラスミドpJM17で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１１８】
第３の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4、および５μgのプラスミドpBSIIs/k-で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１１９】
第４の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4、および５μgのプラスミドpBSII-VARNAで同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１２０】
第５の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）、５μgのプラスミドpBSII-E2a、５μgのプラスミドpBSII-E4および５μgのプラスミドpBSIIs/k-で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１２１】
第６の実験群の細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（AAV補助機能を提供する）、５μgのプラスミドpBSII-E2a、５μgのプラスミドpBSII+E4および５μgのプラスミドpBSII-VARNAsで同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を交換し、そして培養物を、37℃で約72時間インキュベートした。
【０１２２】
次いで、各実験群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離（1000×g、10分間）によって除去し、そして１mLの溶解物を３回の冷凍／解凍サイクル（ドライアイス−エタノール浴と37℃浴との交替）を用いて産生した。遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでrAAVlacZビリオンの産生を、実施例１に記載の技法を用いて評価し、そしてrAVVゲノムの量を以下のアッセイ法によって定量した。
【０１２３】
50λの各実験群由来の溶解物を、50U/mLのDNAseIを含むDMEM培地（Sigma, St. Louis, MOより入手可能）の100λアリコートに加え、アッセイ試料を作成した。試料を37℃で約１時間インキュベートした後に、２×プロテイナーゼＫ緩衝液（20mMTris Cl、20 mM EDTA、１％SDS、pHを8.0に調節した）中の100λのプロテイナーゼＫ（１mg/mL）を各試料に加え、次いで、37℃でさらに１時間インキュベートした。各試料由来のDNAをフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール中で沈殿させ、次いで、５℃で15分間遠心分離することによって回収した。次いで、DNAペレットを、200λのTE中に再溶解させて、DNA試料を提供した。次いで、ドットプロットアッセイを、以下のように行った。ζプローブ（ZetaProbe（登録商標）)膜（BioRad, Richmond, CA）をサイズにカットし、そしてドットプロット装置にアセンブリした。DNA試料を、200λの２×アルカリ性溶液（0.8MNaOH、20 mM EDTA）を用いて変性させ、そして、５分後に、膜を２×SSC溶液中で１分間リンスし、濾紙上で乾燥させ、次いで、80℃で約30分間真空下でベーキングした。ハイブリダイゼーション緩衝液（１mMEDTA、40mM Na2HPO4（pH 7.2）、７％ SDS）中で65℃30分間ハイブリダイゼーションを行った。次いで、フィルターを洗浄し、そして約20時間オートラジオグラフし、放射活性をシンチレーションカウンティングを用いて決定した。
【０１２４】
実験の結果を、以下の表２に示す。
【０１２５】
【表２】
【０１２６】
表２に示される結果から見られ得るように、単離されたアデノウイルス遺伝子領域は、首尾良く宿主細胞にトランスフェクトされて、rAAVビリオン複製にとって必要かつ十分な補助機能を提供し得る。さらに、第３群および第５群で得られた結果は、アデノウイルスVARNA領域はrAAVビリオンの複製にとって必須ではないことを示している。しかし、この領域は、アデノウイルス感染を用いて得られるrAAV力価に匹敵するrAAV力価を得るために必要である。
【０１２７】
実施例３
rAAVビリオン産生に対するアデノウイルスVARNA投薬量の相関
宿主細胞に供したトランスフェクトされたアデノウイルスVA RNA遺伝子領域の量と、宿主細胞中の補体rAAV複製へ提供された補助機能のレベルとの間に相関が存在するか否かを調査する目的で、以下の実験を行った。
【０１２８】
293細胞を、10-cmの組織培養皿に１×10６細胞／皿でプレートし、そしてトランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで培養した。トランスフェクションを、上記実施例１に記載のように行った。
【０１２９】
詳細には、293細胞を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4および０〜25μgのプラスミドpBSII-VARNAでトランスフェクトして、プラスミドを有するVARNAの（他のプラスミドに対する）モル比を０〜５の範囲にわたって変動した。トランスフェクション期間の後、培地を交換し、そして細胞を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１３０】
次いで各実験群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離（1000×g、10分間）によって除
去し、そして１mLの溶解物を、３回の冷凍／解凍サイクル（ドライアイス−エタノール浴と37℃浴との交替）を用いて産生した。遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでAAVlacZベクターの産生を、実施例１に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表３に示す。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
表３から見られ得るように、アデノウイルスVA RNAは、アデノウイルス感染で得られるレベルと実質的に等価なレベルでrAAVビリオン産生を得るのに必要とされるにもかかわらず、調製された範囲におけるVARNA／他のアデノウイルス遺伝子領域の比の変動はrAAVビリオンの産生に著しく影響を及ぼさない。
【０１３３】
実施例４
補助機能におけるアデノウイルスE2a、E4およびVA RNA遺伝子領域
に対する要求の実証
rAAVビリオン産生についての補助機能の提供におけるアデノウイルスE2a、E4およびVA RNA遺伝子領域の相対的寄与を確率する目的で、以下の実験を行った。
【０１３４】
293細胞を、10-cmの組織培養皿に１×10６細胞／皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記実施例１に記載のように行った。
【０１３５】
293細胞培養物を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ、および15μg（全体）の以下のプラスミドの全ての組み合わせまたはその一対の組み合わせのいずれかで同時トランスフェクトして、E2a、E4およびVARNAをコードする各アデノウイルス遺伝子領域を同時トランスフェクションから排除する培養物を提供した：pBSII-E2a；pBSII-E4；およびpBSII-VARNA。トランスフェクション期間後に、培地を交換し、そして細胞を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１３６】
次いで各同時トランスフェクション群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離（1000×g、10分間）によって除去し、そして１mLの溶解物を、３回の冷凍／解凍サイクル（ドライアイス−エタノール浴と37℃浴との交替）を用いて産生した。遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでrAAVlacZビリオンの産生を、実施例１に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表４に示す。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
表４に示された結果から見られ得るように、各アデノウイルス遺伝子領域E2a、E4およびVA RNAは、rAAVビリオン産生を支持するのに必要な補助機能を提供する必要は全くない。しかし、全ての遺伝子領域は、アデノウイルス感染で得られるレベルに匹敵するrAAVビリオンのレベルを産生するために必要である。より詳細には、プラスミド含有VARNAを同時トランスフェクションから省略することにより、rAAVビリオン産生の７倍の低下（７×10８機能的単位／10cm皿）をもたらした。rAAVビリオンの産生は、E4およびE2a含有プラスミドの同時トランスフェクションからの省略によって、さらに著しく影響された。E4構築物の省略により、産生の83倍の低下（６×10７機能的単位／10cm皿）になり、そしてE2構築物の省略により、rAAVビリオン産生の10,000倍の低下（５×10５機能的単位／10cm皿）になった。
【０１３９】
実施例５
pW1909adhlacZまたはpW620adhlacZに基づくAAVヘルプを用いた
rAAVビリオン産生の比較
野生型または改変型AAVヘルプ機能（AAV repおよびcapコーディング領域）のいずれかを含むAAVヘルパー構築物とともに非ウイルス補助機能系を用いて、宿主細胞中のrAAVビリオン産生の効率を比較する目的で、以下の実験を行った。
【０１４０】
293細胞を、10-cmの組織培養皿に１×10６細胞／皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記の実施例１に記載のように行った。
【０１４１】
第一セットの293細胞培養物を、５μgのプラスミドpW620adhlacZ（野生型AAVヘルプ機能を含む）、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4および５μgのプラスミドpBSII-VARNAで同時トランスフェクトした。第２セットの293培養物を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZ（改変型AAVヘルプ機能を含む）、10μgのプラスミドpBSII-E2a+E4および５μgのプラスミドpBSII-VARNAで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を交換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。
【０１４２】
次いで各同時トランスフェクション群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離（1000×g
、10分間）によって除去し、そして１mLの溶解物を、３回の冷凍／解凍サイクル（ドライアイス／エタノール浴と37℃浴との交替）を用いて産生した。遠心分離（10,000×g、10分間）によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでrAAVlacZビリオンの産生を、実施例１に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表５に示す。
【０１４３】
【表５】
【０１４４】
表５に示された結果から見られ得るように、 AAVヘルプの野生型と改変型の両方はrAAVビリオンの産生をほぼ同レベルで支持した。
【０１４５】
実施例６
プラスミドに基づく補助機能のrAAVビリオンの産生効率の比較
プラスミドに基づく単離された補助機能、それらの組み合わせ、ならびにアデノウイルスVA RNA、E4およびE2a遺伝子領域（上記のpladeno１プラスミド）を含有する単一の構築物を用いて宿主細胞中のrAAVビリオン産生の効率と、２型アデノウイルス（ad-2）感染を用いて得られるrAAVビリオン産生の効率とを比較する目的で、以下の実験を行った。
【０１４６】
１．pladeno１およびpladeno１E1の構築：
pladeno１プラスミド（アデノウイルスVA RNA、E4およびE2a遺伝子領域を含む）を、５型アデノウイルス遺伝子をpBSII s/k-のPvuII部位の間に挿入された慣例のポリリンカーにクローニングすることによってアセンブリした。pladeno１構築物の地図は、図１に示される。より詳細には、制限酵素部位SalI-XbaI-EcoRV-SrfI-BamHI（5'-GTCGACAAATCTAGATATCGCCCGGGCGGATCC-3'：配列番号１０）をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドポリリンカーを、pBSIIs/k-の2513bpのPvuIIベクターフラグメントに連結して、アセンブリプラスミドを提供した。次いで、５型アデノウイルス遺伝子または遺伝子領域を含む以下のフラグメントを、pJM17プラスミドから得た：1,724bpのSalI-HinDIIIVA RNA含有フラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約9,831〜約11,555位にわたるヌクレオチドに対応する）；5,962bpのSrfI-BamHIE2a含有フラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約21,606〜約27,568位にわたるヌクレオチドに対応する）；および3,669bpのHphI-HinDIIIE4含有フラグメント（２型アデノウイルスゲノムの約32,172〜約36,841位にわたるヌクレオチドに対応する）。XbaI部位を、E4を含むフラグメントのHphI末端に、クローニングベクターのHpaI部位に3,669bpのHphI-HinDIIIフラグメントをクローニングし、次いでそのフラグメントをXbaIおよびHinDIIIで切除する（部分切断）ことによって加えた。5,962E2aを含むフラグメントを、アセンブリプラスミドのSrfI部位とBamHI部位の間にクローン化し、そして1,724bpのVARNA含有フラグメントおよび改変型3,669bpのE4含有ラグメントを、それらの共通HinDIII末端によって結合させ、そしてアセンブリプラスミドのSalIとXbaI
部位との間に連結して、pladeno１構築物を得た。
【０１４７】
図２に参照されるように、pladeno１E1プラスミドを以下のようにアセンブリした。4,102bpのBsrGI-Eco47IIIフラグメント（５型アデノウイルスのElaおよびElbコード領域を含む）を、pJK17プラスミドから得た。被験体フラグメントは、２型アデノウイルスゲノム
の約192〜約4,294位にわたるヌクレオチドに対応する。4,102bpのフラグメントを、平滑
末端改変し、そして次いで、pladeno１プラスミドのVA RNAフラグメント中のHpaI部位に
挿入して、pladeno１E１プラスミドを得た。
【０１４８】
２．rAAVビリオン産生のアッセイ：
293細胞を、10-cmの組織培養皿に１×10６細胞／皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、37℃で約90％のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記の実施例１に記載のように行った。
【０１４９】
全ての293細胞培養物を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZでトランスフェクトした。また、培養物の実験群を、補助機能含有プラスミドまたはコントロールプラスミド（pBSIIs/k-）のそれぞれの５μgの種々の組み合わせで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を交換し、そして培養物を37℃で約72時間インキュベートした。比較として、２型アデノウイルス（moi＝１）を含む10mLの培地を、５μgのプラスミドpW1909adhlacZでトランスフェクトされた293細胞に加え、そして37℃で約72時間インキュベートした。
【０１５０】
次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離（1000×g 10分間)により培地を除去し
た。そして、３回の凍結／融解サイクル（ドライアイス−エタノール浴および37℃浴を交互にする）を使用して１mLの溶解産物を生成した。遠心分離（10,000×g10分間）により
、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例１に記載される技術を使用して、rAAV lacZビリオン産生を評価した。実験の結果を、以下の表６に示す。
【０１５１】
【表６】
【０１５２】
表６の結果が示し得るように、pladeno 1構築物は、効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る（２型アデノウイルス感染を使用して得られるレベルと実質的に同じレベル）。補助機能構築物pBSII-E2a、pBSII-E4、およびpBSII-VARNAの組み合わせはまた、ad-2感染と実質的に等価なレベルの効率的なrAAVビリオン産生を支持し得た。補助機能構築物pBSII-E2a+E4およびpBSII-VARNAの組み合わせは、rAAV産生を支持し得た（ad-2感染レベルより10倍下回る）；そして、E2aを含む構築物（pBSII-E2a）は、ad-2感染を使用して得られるレベルより約200倍下回るレベルのrAAV産生を支持した。
【０１５３】
実施例７
アデノウイルスに基づくかまたはプラスミドに基づく補助機能を使用して得られる大規模rAAVビリオン産生の比較
２型アデノウイルス（ad-2）に基づくか、またはpladeno 1に基づく補助機能のいずれかを使用して産生されるrAAVビリオンの大規模調製を比較するために、次の実験を行った。
【０１５４】
実施例１に記載のトランスフェクション方法を使用して、ヒトエリスロポエチン遺伝子を含むAAVベクターで約10９個の293細胞をトランスフェクトした。補助機能の供給源として、一方の調製物はpladeno1構築物で同時トランスフェクトし、他方の調製物は２型アデノウイルスで感染させた。
【０１５５】
適切なインキュベーション期間の後に、次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離（1000×g 10分間）により増殖培地を除去した。そして、３回の凍結／融解サイクル（ドライアイス−エタノール浴および37℃浴を交互にする）を使用して溶解産物を生成した。遠心分離（10,000×g10分間）により溶解産物から破片を無くして、粗溶解産物を得た。精製した試料を得るために、粗溶解産物を密度勾配遠心分離に供した。
【０１５６】
各調製により産生されるrAAVゲノムの量を、実施例２に記載のドットブロットアッセイにより定量した。実験の結果を以下の表７に示す。
【０１５７】
【表７】
【０１５８】
表７の結果が示し得るように、pladeno 1に基づく補助機能を使用した調製は、２型アデノウイルスに基づく補助機能を使用した調製から得られた収率より2.4倍大きなrAAVビリオン収率を提供した。
【０１５９】
実施例８
rAAVビリオン産生における個々のアデノウイルス補助機能の相対的な寄与の決定
rAAVビリオン産生における個々のアデノウイルス補助機能の相対的な寄与を決定するために、以下の実験を行った。個々のアデノウイルス補助機能（単独または組み合わせのいずれか）を使用して、宿主細胞におけるrAAVビリオン産生を補助した。さらに、E2aおよびE4ORF6領域全体を含み、そして相同プロモーターにより駆動される構築物（pBSII-E2aおよびpBSII-E4構築物）を、CMVで駆動されるE2aまたはE4ORF6構築物（p3.3cE2Aおよびp3.3cE4ORF6構築物、下記）に置換した効果を評価した。
【０１６０】
１． p3.3cE2Aおよびp3.3cE4ORF6の構築：
５型アデノウイルス E2a 72kD DNA結合タンパク質および５型アデノウイルス E4 オープンリーディングフレーム６（ORF6）タンパク質をコードする構造遺伝子を、それぞれ、CMVで駆動される発現構築物（p3.3c）にクローニングし、それぞれ、p3.3cE2Aプラスミド構築物およびp3.3E4ORF6プラスミド構築物を提供した。
【０１６１】
プラスミドp3.3cを以下のように構築した。pUC119ベクター配列を含む、p1.1c由来2732bpNotIフラグメントを、以下の制限部位を含む合成DNAフラグメントに連結した：NotI;MluI;Ecl136II;SacII;BstBI;BssHII;SrfI;BssHII;BglII;SnaBI;BstEII;PmlI;RsrII;およびNotI。合成DNAフラグメントの配列は：5'-GCGGCCGCACGCGTGAGCTCCGCGGTTCGAAGCGCGCAAAGCCCGGGCAAAGCGCGCAGATCTACGTAGGTAACCACGTGCGGACCGGCGGCCGC-3'（配列番号：１１）である。サイトメガロウイルス前初期（CMVIE)プロモーターを含む653bpSpeI-SacIIフラグメント；以下のプライマー5'-AAAATTCGAACAGGTAAGCGCCCCTTTG-3'（配列番号：１２）および3'-AAAATTCGAATCCTGGGGAGAAACCAGAG-5'（配列番号：１３）を使用して得られた、hGH第一イントロンをコードする、269bpのPCR産生BstBI-BstBIフラグメント；ならびにpCMV-β（Clonetechより入手）由来SV40後期ポリアデニル化部位を含む213bpBamHI-BamHI（平滑化）フラグメントを、それぞれ、合成リンカーのEcl136II、BstBI、およびSnaBI部位にクローニングし、p3.3c発現構築物を生じた。
【０１６２】
プラスミドp3.3cE4ORF6（ATCC受託番号98234）を、以下のように調製した。５型アデノウイルスE4 ORF6をコードする配列を含む、pBSII-E4由来の1024bpBglII-SmaIフラグメントを入手し、そして平滑末端に改変した。このフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの33,309位（SmaI部位）から34,115位（BglII部位）に相当する。次いで、改変したフラグメントをp3.3cのSrfI部位にクローニングし、p3.3cE4ORF6プラスミドを提供した。
【０１６３】
プラスミドp3.3cE2A（ATCC受託番号98235）を、以下のように調製した。pBSII-E2a由来の2467bpMscI（部分的）-BamHIフラグメントを入手した。このフラグメントは、５型アデノウイルスE2aコード配列を含み、そして２型アデノウイルスゲノムの24,073位（MscI部位）から21,606位（BamHI部位）に相当する。2467bpフラグメントをpCITE2A（Novageneより入手）のMscI部位とBamHI部位との間にサブクローニングし、pCITE2AE2A構築物を提供
した。次いで、1636bpNcoI（部分的）-BsrGIフラグメントをpCITE2AE2Aから切り出した。このフラグメントは、E2a 72kDタンパク質をコードする配列を含み、そして２型アデノウイルスゲノムの24,076位（MscI/NcoI部位）から22,440位（BsrGI部位）に相当する。1636bpフラグメントを平滑末端に改変し、そしてp3.3cにクローニングし、p3.3cE2Aプラスミ
ドを提供した。
【０１６４】
２． rAAVビリオン産生アッセイ：
293細胞を10cm組織培養ディッシュに２×106細胞／ディッシュでプレートし、そして、同時トランスフェクションの前に約48時間の期間にわたって、約90％コンフルエンシーに達するまで37℃で培養した。全てのトランスフェクションは、以下のDNAの組み合わせで、CaPO4法を使用して行った。全ての293細胞培養物を、５μgのプラスミドpW620adhlacZを用いてトランスフェクトした。５μgの種々の補助機能構築物（以下の表８に示す通り）を使用して、１ディッシュあたり総量20μgのDNAを提供した。４個未満の構築物を入れる試料については、pBSIIDNAを使用してトランスフェクトされるDNAの総量を20μgにした。トランスフェクションの後に、培地を取り替え、そして補助機能のためにアデノウイルスを使用する培養物は、５のMOIで２型アデノウイルスを受けた。次いで、全ての培養物を、収集前に約72時間、37℃でインキュベートした。
【０１６５】
次いで、各ディッシュから細胞を回収し、遠心分離（1000×g 10分間）により培地を除去した。そして、３回の凍結／融解サイクル（ドライアイス−エタノール浴および37℃浴を交互にする）を使用して１mLの溶解産物を生成した。遠心分離（10,000×g10分間）に
より、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例１に記載の技術を使用して、rAAV lacZビリオン産生を評価した。lac Zの力価測定（titering）を、アデノウイルスの存在下で行った。全ての試料は、２連でアッセイした。実験の結果を、以下の表８に示す。
【０１６６】
【表８】
【０１６７】
表８に示す結果が示し得るように、アデノウイルスのE2a、E4、およびVA RNA領域は、
効率的なrAAVビリオン産生（補助機能を提供するためにアデノウイルス感染を使用して得たレベルと実質的に等価なレベル）を提供するために全て必要である。しかし、これらの領域の一つが、rAAVビリオン産生のために絶対的に必要であるというわけではない。
【０１６８】
pBSII-E2aおよびpBSII-E4構築物中にサブクローニングされたE2aおよびE4領域は、いくつかのオープンリーディングフレーム（ORF）を、72kDE2aDNA結合タンパク質およびE4 ORF6タンパク質のためのORFに加えて含む。上記の研究において、pBSII-E2aおよびpBSII-E4構築物を、CMVで駆動されるp3.3cE2Aおよびp3.3cE4ORF6構築物で置換することにより、E2a72kDDNA結合タンパク質およびE4 ORF6タンパク質は、他の全てのオープンリーディン
グフレームがそれらのそれぞれのコード領域に存在しないときに、完全なE2aまたはE4補
助機能を提供し得ることが確証された。
【０１６９】
実施例９
pladeno 1プラスミドの再構築およびrAAVビリオン産生効率の比較
pladeno1の構築に使用したpJM17由来アデノウイルス遺伝子の代わりに、アデノウイル
ス遺伝子の供給源として精製された２型アデノウイルスDNAを使用して、pladeno1プラス
ミドを再構築した。再構築したプラスミドはpladeno 5と名付けられ、以下に詳細に記載
される。この再構築を、プラスミドのサイズ全体を減少させるために行った。さらに、再構築したプラスミド（pladeno5）はアデノウイルスプロテアーゼをコードしないが、pladeno1はアデノウイルスプロテアーゼをコードする。
【０１７０】
１． pladeno5の構築：
pladeno5プラスミドを以下のように構築した。精製された２型アデノウイルスDNA（Gibco/BRLより入手）より単離した、E2a、E4、およびVARNA領域をコードするDNAフラグメントを、pAmpscriptと呼ばれるプラスミド中に連結した。pAmpscriptプラスミドを、以下のように組立てた：オリゴヌクレオチド指定変異誘発（oligonucleotide-directedmutagenesis）を使用して、pBSII s/k+（Stratageneより入手）からポリリンカーおよびα相補発現カセット（complementationexpression cassette）を含む623bp領域を除去し、そしてこれをEcoRV部位で置換した。オリゴヌクレオチド指定変異誘発に使用した変異誘発性オ
リゴ（oligo）の配列は、5'-CCGCTACAGGGCGCGATATCAGCTCACTCAA-3'（配列番号：１４）であった。ポリリンカー（以下の制限部位を含む：BamHI;KpnI;SrfI;XbaI;ClaI;Bst1107I;SalI;PmeI;およびNdeI）を合成し、そして上記で作製したEcoRV部位へ挿入し、その結果、リンカーのBamHI部位を、改変されたプラスミドにおいてf1開始点の近位にして、pAmpscriptプラスミドを提供した。ポリリンカーの配列は、5'-GGATCCGGTACCGCCCGGGCTCTAGAATCGATGTATACGTCGACGTTTAAACCATATG-3'（配列番号１５）であった。
【０１７１】
２型アデノウイルス E2aおよびVA RNA配列を含むDNAフラグメントを、pAmpscriptに直接的にクローニングした。特に、E2a領域を含む5962bpSrfI-KpnI（部分的）フラグメントを、pAmpscriptのSrfI部位とKpnI部位との間にクローニングした。5962bpフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの21,606〜27,568塩基対を含む。VARNAを含む732bp EcoRV-SacII（平滑化）フラグメントを、pAmpscriptのBst1107I部位にクローニングした。732bpフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの10,423〜11,155塩基対と等価である。
【０１７２】
pAmpscriptポリリンカーに挿入し得る前に、２型アデノウイルスE4配列を含むDNAを改変しなければならなかった。特に、PCR変異誘発を使用してE4の近位のアデノウイルス末端反復をSrfI部位で置換した。このSrfI部位の位置は、２型アデノウイルスゲノムの35,836〜35,844塩基対と等価である。変異誘発において使用したオリゴヌクレオチドの配列は：5'-AGAGGCCCGGGCGTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC-3'（配列番号１６）；および5'-ACATACCCGCAGGCGTAGAGAC-3'（配列番号：１７）であった。上記の改変されたE4遺伝子をSrfIおよびSpeIを用いて切断することにより生成した3,192bpE4フラグメントを、既にE2aおよびVARNA配列を含むpAmpscriptのSrfI部位とXbaI部位との間に連結し、pladeno 5プラスミドを生じた。3,192bpのフラグメントは、２型アデノウイルスゲノムの32,644〜35,836塩基対と等価である。
【０１７３】
２． rAAVビリオン産生アッセイ：
293細胞を10cm組織培養ディッシュに１×106細胞／ディッシュでプレートし、そして、同時トランスフェクション前に約24〜48時間の期間にわたって、約90％コンフルエンシーに達するまで37℃で培養した。全てのトランスフェクションを、上記実施例１に記載のように行った。
【０１７４】
293細胞培養物を、５μgのpVlacZベクタープラスミド、５μgのプラスミドpW1909、および５μgのpladeno1またはpladeno 5のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの後に、培地を取り替え、そして、培養物を収集前に約72時間、37℃でインキュベートした。
【０１７５】
次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離（1000×g 10分間）により培地を除去した。そして、３回の凍結／融解サイクル（ドライアイス−エタノール浴および37℃浴を交互にする）を使用して１mLの溶解産物を生成した。遠心分離（10,000×g10分間）により、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例１に記載の技術を使用して、rAAVlacZビリオン産生を評価した。実験の結果を、以下の表９に示す。
【０１７６】
【表９】
【０１７７】
表９に報告された結果が示し得るように、pladeno 5を使用した場合に、より大きなrAAVビリオン産生効率が見られた（pladeno 5の産生は、pladeno1の産生より2.5倍多いrAAVビリオンを生じた）。
【０１７８】
従って、効率的な組換えAAVビリオン産生を支持し得る、新規な補助機能を記載した。本発明の好ましい実施態様をいくぶん詳細に記載したが、添付の請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな変形がなされ得ることが理解される。
【０１７９】
本発明の実施において有用な株の寄託
以下の株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、ブダペスト条約の規定の下に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Parklawn Drive,Rockville,Marylandで行った。示された受託番号は、好結果の生存試験後に交付され、そして必要な手数料を払った。この培養物へのアクセスは、米国特許法施行規則1.14および米国特許法122条に基づいて権利を与えられる特許庁長官によって決定されたものに対して、特許出願の係属中は利用可能である。本出願に特許が許可された際は、寄託された生物学的物質の公衆への利用可能性について寄託者により課される全ての制限は、米国特許法施行規則§1.808(b)に明記されるように、以下の一つの例外はあるが、変更不能に取り除かれる。その例外は、発行された特許の存続期間の間は、試料の請求が以下の３つの条件のいずれか一つまたは全てを満たす場合のみ、寄託物の試料が分譲されることを要求することを寄託機関との間に契約する権利を寄託者が留保することである：（１）請求は、書面または具体的な形式であり、日付がある；および／または（２）請求は、請求する当事者の名称およびあて名ならびに寄託物の受託番号を含む；および／または（３）請求は、寄託機関から寄託者に、試料を分譲した日付ならびに試料の分譲を受けた当事者の名称およびあて名とともに書面で通知される。さらに、示された寄託物は、寄託の日から30年間、もしくは当該寄託物の最終請求の後５年間；または米国特許の実施可能期間のいずれがより長期であっても、維持される。培養物が生存不可能になるか、もしくは不注意に破壊されるか、またはプラスミド含有株の場合にそのプラスミドが失われた際には、培養物は、同一の分類学的記載の生存能力のある培養物（単数または複数）で置き換えられる。
【０１８０】
これらの寄託物は、当業者への便宜のためにのみ提供され、そして寄託が必要とされることを認めるわけではない。これらのプラスミドの核酸配列、ならびにそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の記載と何らかの矛盾がある場合をコントロールしている。寄託物を製造、使用、または販売するためにライセンスが必要とされ得、そしてこのようなライセンスはこれによって承諾されるわけではない。
【０１８１】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１は、pBSIIs/k-ベクタープラスミドに挿入された５型アデノウイルス由来のVARNA、E4（ORF 6を含む）およびE2aアデノウイルス遺伝子領域を含むプラスミド構築物pladeno 1を示す。
【図２】図２は、4,102bpのBsrGI-Eco47IIIフラグメント（５型アデノウイルスE1aおよびE1bコード領域を含む）をpladeno 1構築物に挿入することによって形成されたプラスミド構築物pladeno 1 E1を示す。
【図３】図３は、２型アデノウイルスゲノム由来のVA RNA、E4 ORF 6、およびE2aアデノウイルス遺伝子領域を含むプラスミド構築物pladeno 5を示す。
【０１８３】
（配列表）
【０１８４】
【数１】
【０１８５】
【数２】
【０１８６】
【数３】
【０１８７】
【数４】
【０１８８】
【数４】
【０１８９】
【数５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−７７７３７（Ｐ２００９−７７７３７Ａ）
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３５３０１（Ｐ２００８−３３５３０１）
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【分割の表示】特願２００５−３０６４４７（Ｐ２００５−３０６４４７）の分割
【原出願日】平成８年１１月８日（１９９６．１１．８）
【出願人】（５００５７９８８８）ジェンザイム・コーポレーション (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【分割の表示】特願２００５−３０６４４７（Ｐ２００５−３０６４４７）の分割
【原出願日】平成８年１１月８日（１９９６．１１．８）
【出願人】（５００５７９８８８）ジェンザイム・コーポレーション (34)
【Ｆターム（参考）】
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