経鼻投与用医薬組成物
【課題】
従来は注射でしか投与出来なかった経粘膜吸収性の悪い親水性生理活性物質を経鼻投与することにより、注射投与に伴う患者の苦痛、不便を改善する医薬組成物を提供する。
【解決手段】
親水性生理活性物質と下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含有する経鼻投与用医薬組成物。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
従来は注射でしか投与出来なかった経粘膜吸収性の悪い親水性生理活性物質を経鼻投与することにより、注射投与に伴う患者の苦痛、不便を改善する医薬組成物を提供する。
【解決手段】
親水性生理活性物質と下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含有する経鼻投与用医薬組成物。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性生理活性物質をその活性を保持した状態で鼻腔より血中に移行させるための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、これまで主流を占めていた低分子で疎水性の薬物に加えて、ペプチドや核酸などの親水性生理活性物質が臨床現場に登場し、医薬品として使用されて顕著な治療効果を示している。しかしながら今のところその投与方法はほとんどの場合、注射剤に限られている。これは親水性物質が、既存の薬物と異なり粘膜の上皮細胞層を通過することが出来ないことが理由である。上皮細胞層は、体外の異物が生体内に進入しないために細胞同士が密に結びついており、親水性を持つ物質はほとんど通過することはできず、一般的に用いられている薬物の投与方法である経口投与では体内に作用させることができない。
【０００３】
薬剤の注射による投与は、特に治療が頻回、長期にわたる場合には患者および医師にとって大きな負担であり、このような親水性生理活性物質を注射以外の方法で投与可能にするための様々な方法が検討されてきた。
【０００４】
一般的な薬物の投与方法として広く用いられている経口投与において、親水性生理活性物質を吸収させる技術は多数の試みが存在する。特に、経口投与時の主要な吸収部位である腸管上皮細胞層の透過性を向上させるために、界面活性物質や上皮細胞付着物質、細胞透過ペプチドなどを用いる試みがなされている。
【０００５】
細胞透過ペプチドは細胞膜を破壊せずに細胞外から細胞内へと移行する性質をもつペプチドの総称である。有名なものとしてはアルギニンがつらなったオリゴアルギニン、ＨＩＶ−１ウイルスのペプチドＴａｔ（特許文献１）、本発明の配列番号１のアミノ酸配列を持つペネトラチン（特許文献２、３）など、様々な種類が知られている。これらは単純な塩基性を特徴とするもの、疎水性ドメインを有するもの、ペプチドの一次構造あるいは二次構造の両親媒性を特徴とするもの、メカニズムが明確ではないものなど様々である。これらのペプチドは、自身の細胞内移行性に加えて、自身をビークルとして連結した遺伝子等を細胞内部に送達する用途に関する研究が盛んに行われている。
【０００６】
さらに、この特性を用い上皮細胞層透過を促進し、経口投与時の吸収促進を目指す検討も行われている（特許文献４、５）。しかし、これらの検討に用いられている細胞透過ペプチドの吸収促進効果は、洗浄した腸管による評価などに基づいており、実際の経口投与時の効果は明らかではない。また、胃における消化分解、食物摂取による消化管内環境の変化のため、安定した吸収を実現させることは難しく、親水性生理活性物質の経口投与は実用化には至っていない。
【０００７】
経口投与以外での吸収を実現させる方法として、鼻腔の粘膜層を利用する投与方法も考案されている。鼻腔粘膜と消化管粘膜には粘膜層を構成する細胞種類の相違や、個々の細胞の特性の違いがあり、また管腔内に存在する分解酵素の種類、量など種々の違いがあるため、経鼻吸収の促進には、消化管吸収促進とは異なる技術が求められる。
【０００８】
鼻腔粘膜は投与が容易であり、また鼻腔粘膜の下には血管、リンパ管が発達しており薬物の吸収には適した特性を有している。さらに、鼻腔より吸収された薬物は、吸収された後、直接体循環に移行するため、肝臓による初回通過効果を回避することが出来ると考えられ、消化管や肝臓で代謝されやすい薬物の投与部位として有効と考えられる。しかし、他の吸収部位と同様に親水性生理活性物質の鼻腔粘膜透過性は低く、また、吸収部位の面積も小さいため、鼻腔からの親水性生理活性物質吸収を実現させるためには吸収促進技術が必要である。
【０００９】
これまで複数の製薬メーカーにより界面活性剤を吸収促進剤として利用した経鼻製剤で臨床試験を行った例があるが、いずれも鼻粘膜への刺激性が強く断念する結果に終わっている。また、界面活性剤を用いない方法としては、研究段階においてペプチドを用いた吸収促進が試みられており、特許文献６には薬物に直接、ペプチドを連結させることで経鼻吸収性を促進させる試みが開示されている。しかしながら、この技術は薬物への化学修飾を必要とするため、必然的に薬物の薬理活性の低下や、体内動態の変化、生産コストの上昇、投与薬物の抗原性などの多くの解決すべき課題を有している。
【００１０】
また、ペネトラチンまたはその改変体による経鼻吸収促進の可能性に関して特許文献２または３で言及されているが、これは透過させる薬物とペネトラチン改変体の共有結合を必要とするため、親水性生理活性物質とペネトラチンまたはその改変体が共有結合していない本発明とは異なる技術である。さらに、細胞透過ペプチドを用いた鼻腔吸収促進の実現には、細胞外部から細胞内部への移行に加え、細胞からの離脱が効率よく起こることが必要であることが知られており、また、鼻腔粘膜吸収においては、鼻腔粘膜組織に存在する種々分解酵素によるペプチドの分解され易さなど、細胞透過性とは異なる様々な要因が吸収性に影響するため、細胞透過ペプチドが鼻腔粘膜透過性を有するかどうかについてはモデル動物等を使用した実験により確認される必要があることは当業者の技術常識であるが、特許文献２または３にはペネトラチンまたはその改変体の鼻腔粘膜透過性に関しての実験的証明は開示されていないため、当業者にとって特許文献２または３からペネトラチンまたはその改変体が鼻腔粘膜透過性を有することを類推することは容易ではない。
【００１１】
また、鼻腔吸収促進物質として薬物と共有結合されていないオリゴアルギニンを薬物と同時に投与する試み（特許文献７）もあるが、高濃度のオリゴアルギニンを必要とし、また蛍光標識デキストランという単一のモデル薬物のみでしかその効果が実証されておらず、ペプチド性の親水性生理活性物質の透過性については不明である。
【００１２】
このように、親水性生理活性物質を高い効率で経鼻吸収させる実用性の高い技術は未だ見出されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平１０−３３１８６号公報
【特許文献２】特表２００２−５３００５９号公報
【特許文献３】特表２００２−５１９３９２号公報
【特許文献４】特開２００６−２５７０７４号公報
【特許文献５】特開２００８−７４４８号公報
【特許文献６】ＷＯ２００４／０３７８５９号
【特許文献７】特開平１０−９５７３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、経鼻投与した親水性生理活性物質を血中に移行させる医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を克服するために、本発明者は通常の条件では経粘膜からの血中移行性の低い親水性生理活性物質に対して、その吸収効率を向上させる手段を検討した結果、親水性生理活性物質と（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチドまたは（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、鼻腔粘膜透過性を有するペプチドを含有する医薬組成物が有効であり、経鼻投与において高効率での親水性生理活性物質の血中移行を実現出来ることを見いだした。すなわち、本発明は、以下のような構成を有する。
【００１６】
（１）親水性生理活性物質と下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含有する経鼻投与用医薬組成物。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
【００１７】
（２）前記（ｂ）のペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個の塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチドである、（１）に記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００１８】
（３）前記（ｂ）のペプチドが、配列番号３〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１または２に記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００１９】
（４）前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００２０】
（５）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを０．２〜２．０ｍＭの濃度で含有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００２１】
（６）親水性生理活性物質がペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００２２】
（７）親水性生理活性物質がインスリンまたはインターフェロンβである、（１）〜（６）のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、経鼻投与した親水性生理活性物質の血中移行が可能となり、従来の注射による投与法に比べ、簡便で患者に優しい薬物治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】配列番号１または配列番号７のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：血中濃度。
【図２】配列番号１または配列番号７のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：血糖値。
【図３】配列番号１または配列番号７のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：バイオアベイラビリティ。
【図４】配列番号１のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：濃度依存性。
【図５】配列番号１のペプチドを用いた経鼻投与蛍光標識デキストラン吸収促進効果。
【図６】配列番号１のペプチドを用いた経鼻投与インターフェロンβ吸収促進効果。
【図７】配列番号１〜６のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：血糖値。
【図８】配列番号１〜６のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：血中濃度。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、親水性生理活性物質を鼻腔から血中に移行させる医薬組成物であって、薬効成分として親水性生理活性物質と鼻腔粘膜透過性を有する特定のペプチドを、それらが共有結合で連結されずにそれぞれ独立した状態で配合してなる経鼻投与用医薬組成物に関する。ここで、本発明における親水性生理活性物質とは、親水性の特徴を有する生理活性物質のことを表す。親水性とは水への溶解度が高いことを表し、ここでは水１ｍｌあたり１μｇ以上溶解する物質を親水性と定義する。また、生理活性物質とは、生体に作用し生体に変化を及ぼす物質全般を示し、特定の細胞の受容体に結合するタンパクや、生体内の物質に親和性を有する酵素が例示され、さらに生体内物質と直接の反応を起こさない物質であっても良く、例えば、血漿の代わりとして増血用途に用いられるデキストランなど、医療用途として生体に投与されうる物質も含まれる。
【００２６】
また、本発明におけるペプチドとは、アミノ酸がペプチド結合により連結された構造を持つものを示す。ペプチドのうち分子量の大きいものは一般的にタンパク質と呼称されるが、本明細書ではこれらのタンパク質も含めて分子量により制限されずペプチドと表す。また、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質や、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化などの化学的な修飾を行った誘導体についても、本発明におけるペプチドに含まれるものとする。
【００２７】
以下、本発明の経鼻投与用医薬組成物の詳細について説明する。
【００２８】
本発明において親水性生理活性物質とともに含まれる配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、一般にペネトラチンと呼ばれるペプチドである。ペネトラチンはショウジョウバエのアンテナペディアと呼ばれるペプチドのＤＮＡ結合部位から見いだされた細胞透過性を有するペプチドであるが、本発明者はペネトラチンと親水性生理活性物質を併せて経鼻投与した場合、ペネトラチンの優れた鼻腔粘膜透過性により親水性生理活性物質が生体内で高い比率で血中移行することを新規に見出し、本発明を完成させたものである。
【００２９】
本発明において用いられる配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、１つまたは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されている場合も、ペプチド全体として本発明で必要とする鼻腔粘膜透過性を有す範囲内での相違であれば許容される。例えば、ペプチドの内の塩基性アミノ酸が別の１つまたは数個の塩基性アミノ酸に置き換わる場合、親水性アミノ酸が別の１つまたは複数の親水性アミノ酸に置き換わる場合、疎水性アミノ酸が１つまたは複数の疎水性アミノ酸に置き換わる場合はペプチド全体の特性は変化しないため、問題なく許容される。特に配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１つまたは数個の塩基性アミノ酸が置換または付加される場合は好ましく許容される。なお、上記アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は少ない方が好ましく、好ましくは１〜５個のアミノ酸、より好ましくは１〜３個のアミノ酸、さらに好ましくは１個のアミノ酸である。ここで、本発明において疎水性アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸を表し、親水性アミノ酸とは、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。また、塩基性アミノ酸とは、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチドの好ましい例としては、配列番号３〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００３０】
また、本発明において親水性生理活性物質とともに含まれるペプチドは、有効な経鼻粘膜透過性を示す配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたは上記配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部が欠失、置換もしくは付加されたペプチドの逆配列で表されるペプチドであっても、ペプチド全体として本発明で必要とする鼻腔粘膜透過性を有す範囲内での相違であれば許容される。ここで、逆配列で表されるペプチドとは、構成するアミノ酸の並びが逆であることを示し、例を挙げるとＮ末端からＣ末端に向けてのアミノ酸配列の並びがアルギニン、グルタミン、イソロイシン、リシンである時、その逆ペプチドはＮ末端からＣ末端に向けてのアミノ酸配列の並びがリシン、イソロイシン、グルタミン、アルギニンであるペプチドを言う。好ましい例として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの逆配列で表されるペプチド（配列番号２）が挙げられる。
【００３１】
本発明において親水性生理活性物質とともに含まれるペプチドを構成するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である立体配置がＬ体であるアミノ酸の他に、天然のアミノ酸の構造を一部改変した誘導体など非天然のアミノ酸も使用されうる。例えば、立体配置がＤ体のアミノ酸は、蛋白分解酵素による分解を受けにくいことから有効に使用されうるため、該ペプチドのアミノ酸配列のうち、一部がＤ体であってもよいし、全体がＤ体であってもよく、該ペプチドと併用投与する親水性生理活性物質によって適宜選択される。なお、親水性生理活性物質が全体としてマイナスチャージを有する場合、全アミノ酸配列がＬ体であることが好ましく、例えば親水性生理活性物質がインスリンの場合、全アミノ酸配列がＬ体であることが好ましい。親水性生理活性物質がチャージを持たない場合、またはプラスチャージを有する場合、全アミノ酸配列がＤ体であることが好ましく、例えばプラスチャージを有するインターフェロンβの場合、該ペプチドの全アミノ酸配列がＤ体であることが好ましい。
【００３２】
本発明において親水性生理活性物質とともに含まれるペプチドは、通常のペプチド合成の方法を用いて調製することが可能であり、例えば、大腸菌などの微生物、動物細胞、昆虫細胞などに該ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入して発現させて作製することも可能である。また、天然に存在する該ペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質を分解処理して得ることもできる。たとえば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはショウジョウバエのアンテナペディアタンパクの一部分の配列と同一の配列であり、天然の当該タンパクより分解酵素処理を経て作製することも可能である。
【００３３】
本発明において親水性生理活性物質とともに含まれるペプチドは、１種類であっても複数種類含まれてもよいが、１種類であることが好ましい。また、その濃度としては特に限定はないが、実施例に示されるように０．２〜２ｍＭであることが好ましく、０．５〜２ｍＭの濃度においては親水性生理活性物質の顕著な鼻腔透過が確認されるためより好ましい。なお、本発明でいうペプチドの濃度は、鼻腔内に投与する時の濃度を表しており、本発明の医薬組成物が溶液状であればその溶液中での濃度を、固体状であれば１回の投与分の組成物を１回の鼻腔内投与量の目安である４０μｌの溶液で復元したときの濃度をいう。
【００３４】
本発明で使用される親水性生理活性物質の具体例としては、ペプチド、糖鎖、核酸があるが、好ましくはペプチドである。ペプチドの具体例としては、抗体、ペプチドホルモンまたはサイトカインが挙げられるが、好ましくはペプチドホルモンまたはサイトカインである。ペプチドホルモンとしてはインスリン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４が、サイトカインとしてインターフェロン類、インターロイキン類またはＧ−ＣＳＦが例示されるが、好ましくはインスリンまたはインターフェロンβである。なお、これら親水性生理活性物質は、天然の物質であっても、その配列の構造の一部を改変した誘導体であっても構わない。また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化などの化学的な修飾を行った誘導体であっても構わない。
【００３５】
本発明でいう親水性生理活性物質の経鼻吸収とは、鼻腔に投与した親水性生理活性物質が、鼻腔より血液中に移行することを示す。その結果は、その親水性生理活性物質の血中濃度の上昇または薬理活性の発現が確認されることで確認できる。親水性生理活性物質の血中濃度は、免疫学的測定法など当業者に通常用いられる方法で測定することができる。薬理活性は、例えば、酵素であればその酵素活性、細胞の受容体に作用する物質であれば、標的細胞の機能あるいはマーカー物質の産生量を変化させる能力などを指標に測定することができる。例えば、インスリンの薬理活性であれば、投与した動物の血中グルコース濃度を指標に測定することが可能である。
【００３６】
吸収促進が起きているかどうかは、鼻腔に薬効成分である親水性生理活性物質のみを投与した場合の投与薬物量に対する血中への薬物移行量の比率と、本発明の医薬組成物を投与した場合の投与薬物量に対する血中への薬物移行量の比率を比較し、後者が高いことで確認出来る。実際の医薬品として十分な機能を発揮するためには、ＡＵＣ（血中濃度−時間曲線下面積）の値として、同量の親水性生理活性物質を注射投与した時のＡＵＣを１００％とした時の比率を示すバイオアベイラビリティの値が１０％以上を示す医薬組成物が好ましく、２０％以上であることがより好ましい。
【００３７】
本発明の経鼻投与用医薬組成物は、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。
【００３８】
本発明の経鼻投与用医薬組成物は、溶液、固体、粉末状などの種々の形態で使用されうるが、安定性及び取扱いの容易さから、例えば、凍結乾燥等の方法で、固形状あるいは粉末状にした形態が好ましい。
【００３９】
本発明の経鼻投与用医薬組成物を、動物（ヒトを含む）に投与する方法には、特にその具体的形態に制限はない。例えば、乾燥状態のものあるいは溶液状のものをそのまま投与したり、あるいは賦形剤とともにカプセルに充填して投与したり、さらには乾燥状態のものを水に一旦溶解分散させてから投与したりすることができる。
【００４０】
本発明の経鼻投与用医薬組成物を生体に投与する際の投与量や投与回数は、親水性生理活性物質、投与形態、患者の年齢、体重、症状の重篤度によって適宜選択されうるが、含有する親水性生理活性物質の重量として通常成人１日あたり０．０００１〜５０ｍｇ、好ましくは０．００１〜２０ｍｇの範囲で投与されうる。
【実施例】
【００４１】
実施例１：インスリンの経鼻投与
＜方法＞
インスリン（ＷＡＫＯ社)粉末を１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ社）に一定量計りとり、０．１Ｎ、ＨＣｌに溶解した後、同量の０．１Ｎ、ＮａＯＨを加えインスリン溶液を作製した。
【００４２】
全アミノ酸配列がＬ体あるいはＤ体のペネトラチン（配列番号１、シグマジェノシス社委託合成）またはオリゴアルギニン（配列番号７、シグマジェノシス社委託合成）をＰＢＳに溶解し、前述のインスリン溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインスリン(１０ＩＵ／ｋｇ)、それぞれのペプチド０．５ｍＭの４０μｌ混合溶液を調製した。
【００４３】
２４時間絶食した体重約２００ｇのＳＤ系雄性ラットにペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射することにより麻酔した後、頸部を切開し気管を露出した。ポリエチレンチューブ（ＩＮＴＲＡＭＥＤＩＣ ＰＥ２０５，Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ）を気管に挿入し、次に食道を一部切開し同径のチューブを食道の切開部から後鼻孔へむけて慎重に組織に傷をつけぬよう挿入した。後鼻孔へ挿入するチューブの先端を予め脱脂綿と接着剤で密栓した。薬液の漏れを防ぐために口腔に開いている上顎部の鼻口蓋管を合成接着剤（第一三共株式会社製“アロンアルファＡ”)で閉じた。そして、調製したインスリン、ペプチド混合液またはインスリンのみを投与前および投与後５、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０分後に頸静脈より０．２５ｍｌを採血し、遠心分離により血漿を分離させ、血漿中インスリン濃度をＥＩＡキット（レビス社）により測定した。生物学的利用能(バイオアベイラビリティ)はインスリン皮下投与時との比較により算出した。
【００４４】
＜結果＞
投与後の血中インスリン濃度推移を図１に、血中グルコース濃度推移を図２に示す。インスリンのみを経鼻投与したラットでは血中のインスリン濃度上昇はほとんど確認出来ないのに対し、インスリンと共にペネトラチンまたはオリゴアルギニンを投与したラットでは投与直後よりインスリンの血中移行が認められ、最大血中濃度はＬ−ペネトラチンが最も高く、ついでＤ−ペネトラチン、Ｄ−オリゴアルギニン、Ｌ−オリゴアルギニンとなった（図１）。またインスリンの血中移行に伴う薬理活性である血糖値の低下も認められ、血中のインスリン濃度に対応する血糖値低下が確認された（図２）。
【００４５】
バイオアベイラビリティはインスリンのみを投与したラットが０．８％だったのに対し、インスリンとＬ体またはＤ体のオリゴアルギニンを同時に投与した場合、Ｌ体でバイオアベイラビリティ（ＢＡ）が１．１％、Ｄ体で２．０％となり、インスリンとペネトラチンを同時に投与した場合、Ｄ体でＢＡは３．４％、Ｌ体で７．１％となり（図３）、ペネトラチンはオリゴアルギニンと比較し、高いインスリン吸収促進効果を示した。
【００４６】
実施例２：インスリンの経鼻投与、ペプチド濃度依存性
＜方法＞
実施例１と同様の方法を用い、実施例１で最も効率の良い吸収促進効果が認められたＬ体のペネトラチン（配列番号１）について、投与溶液に含まれる濃度として０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭに変更し、同様の評価を行った。
【００４７】
＜結果＞
インスリン単独を投与した場合のバイオアベイラビリティが１．７％なのに対し、Ｌ体のペネトラチンを０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭで投与した場合のバイオアベイラビリティはそれぞれ１５．１％、１７．９％、２８．４％、５０．７％となり、ペネトラチンの濃度依存的にインスリンの吸収効率が向上した（図４）。
【００４８】
実施例３：蛍光標識デキストランの経鼻投与
＜方法＞
蛍光標識デキストランであるＦＤ−４（モルキュラープローブ社）をＰＢＳで希釈し４ｍｇ／ｍｌ溶液とした。この溶液を４０μｌ用い、実施例１と同じ手法を用いて評価を行った。血液中のＦＤ濃度は蛍光光度法にて定量した。バイオアベイラビリティは同量のＦＤ−４を静脈内投与した場合との比較により算出した。
【００４９】
＜結果＞
ＦＤ−４単独を投与したラットのバイオアベイラビリティは４．９％、Ｌ体のペネトラチン１７％、Ｄ体のペネトラチンを用いた場合は３６％となった。またＬ体またはＤ体のオリゴアルギニンを投与したラットのバイオアベイラビリティはそれぞれ、１２．４％、１２．４％となり、オリゴアルギニンに比較し、ペネトラチンが高い吸収促進効果を示した（図５）。
【００５０】
実施例４：インターフェロンβの経鼻投与
＜方法＞
氷冷下、ヒト天然型インターフェロンβ（東レ株式会社製“フエロン”）にＴｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳを１ｍｌ加え、６，０００，０００ＩＵ／ｍｌとし、この溶液を１００μｌ分取し、Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳを５６６μｌ加え９００，０００ＩＵ／ｍｌ溶液とした。Ｄ体およびＬ体のペネトラチン（配列番号１）をそれぞれ終濃度０．５ｍＭまたは２ｍＭになるように秤量しインターフェロンβ溶液４０μｌを添加して溶解し、インターフェロンβおよびペネトラチン混合溶液とし、実施例１と同じ手法を用いて評価を行った。インターフェロンβの濃度は株式会社鎌倉テクノサイエンス製“ヒトインターフェロンβＥＬＩＳＡキット”により測定し、バイオアベイラビリティは同量のインターフェロンβを静脈内投与した場合との血漿中濃度の比較により算出した。
【００５１】
＜結果＞
インターフェロンβと共にペネトラチンを添加することにより血中へのインターフェロンβ移行が認められた。バイオアベイラビリティは０．５ｍＭのＬ体で６．１％、０．５ｍＭのＤ体で１１．０％、２ｍＭのＤ体で２２．０％であった（図６）。
【００５２】
実施例５：インスリンの経鼻投与
＜方法＞
インスリン（ＷＡＫＯ社)粉末を１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ社）に一定量計りとり、０．１Ｎ、ＨＣｌに溶解した後、同量の０．１Ｎ、ＮａＯＨを加えインスリン溶液を作製した。
【００５３】
全アミノ酸配列がＬ体のペプチド（配列番号１〜６、シグマジェノシス社委託合成）をＰＢＳに溶解し、前述のインスリン溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインスリン(１ＩＵ／ｋｇ)、それぞれのペプチド０．５ｍＭの４０μｌ混合溶液を調製し、実施例１と同様の方法にて評価を行った。
【００５４】
＜結果＞
投与後の血中グルコース濃度推移を図７に血中インスリン濃度推移を図８に、評価結果より得られた各種パラメーターを表１に示す。インスリンのみを経鼻投与したラットでは血中のインスリン濃度上昇はほとんど確認出来ないのに対し、インスリンと共に配列番号１〜６のペプチドをそれぞれ投与することで、投与直後より血中へのインスリン移行が見られ、それに伴い、血中グルコース濃度の低下が確認された。血中インスリン濃度推移から算出したバイオアベイラビリティ（ＢＡ）はインスリンのみを投与したラットが２．３％だったのに対し、配列番号１〜６のペプチドでは４．４〜２０．１％となった。また、血中グルコース濃度推移より算出した薬学的利用性（ＰＡ）はインスリンのみを投与した場合、４．７％であったのが、配列番号１〜６のペプチドでは１５．７％〜３７．５％となった。
【００５５】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、これまで注射剤として投与されてきた親水性生理活性物質を経鼻投与することが可能となり、患者の苦痛、不便を大幅に改善する薬剤を提供することができる。これらの注射剤が患者に与える苦痛や通院の不便を改善することは医療現場における患者本位の医療を実現するだけではなく、これまでの製剤の概念を根底から変え、画期的製剤の創製につながる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性生理活性物質をその活性を保持した状態で鼻腔より血中に移行させるための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、これまで主流を占めていた低分子で疎水性の薬物に加えて、ペプチドや核酸などの親水性生理活性物質が臨床現場に登場し、医薬品として使用されて顕著な治療効果を示している。しかしながら今のところその投与方法はほとんどの場合、注射剤に限られている。これは親水性物質が、既存の薬物と異なり粘膜の上皮細胞層を通過することが出来ないことが理由である。上皮細胞層は、体外の異物が生体内に進入しないために細胞同士が密に結びついており、親水性を持つ物質はほとんど通過することはできず、一般的に用いられている薬物の投与方法である経口投与では体内に作用させることができない。
【０００３】
薬剤の注射による投与は、特に治療が頻回、長期にわたる場合には患者および医師にとって大きな負担であり、このような親水性生理活性物質を注射以外の方法で投与可能にするための様々な方法が検討されてきた。
【０００４】
一般的な薬物の投与方法として広く用いられている経口投与において、親水性生理活性物質を吸収させる技術は多数の試みが存在する。特に、経口投与時の主要な吸収部位である腸管上皮細胞層の透過性を向上させるために、界面活性物質や上皮細胞付着物質、細胞透過ペプチドなどを用いる試みがなされている。
【０００５】
細胞透過ペプチドは細胞膜を破壊せずに細胞外から細胞内へと移行する性質をもつペプチドの総称である。有名なものとしてはアルギニンがつらなったオリゴアルギニン、ＨＩＶ−１ウイルスのペプチドＴａｔ（特許文献１）、本発明の配列番号１のアミノ酸配列を持つペネトラチン（特許文献２、３）など、様々な種類が知られている。これらは単純な塩基性を特徴とするもの、疎水性ドメインを有するもの、ペプチドの一次構造あるいは二次構造の両親媒性を特徴とするもの、メカニズムが明確ではないものなど様々である。これらのペプチドは、自身の細胞内移行性に加えて、自身をビークルとして連結した遺伝子等を細胞内部に送達する用途に関する研究が盛んに行われている。
【０００６】
さらに、この特性を用い上皮細胞層透過を促進し、経口投与時の吸収促進を目指す検討も行われている（特許文献４、５）。しかし、これらの検討に用いられている細胞透過ペプチドの吸収促進効果は、洗浄した腸管による評価などに基づいており、実際の経口投与時の効果は明らかではない。また、胃における消化分解、食物摂取による消化管内環境の変化のため、安定した吸収を実現させることは難しく、親水性生理活性物質の経口投与は実用化には至っていない。
【０００７】
経口投与以外での吸収を実現させる方法として、鼻腔の粘膜層を利用する投与方法も考案されている。鼻腔粘膜と消化管粘膜には粘膜層を構成する細胞種類の相違や、個々の細胞の特性の違いがあり、また管腔内に存在する分解酵素の種類、量など種々の違いがあるため、経鼻吸収の促進には、消化管吸収促進とは異なる技術が求められる。
【０００８】
鼻腔粘膜は投与が容易であり、また鼻腔粘膜の下には血管、リンパ管が発達しており薬物の吸収には適した特性を有している。さらに、鼻腔より吸収された薬物は、吸収された後、直接体循環に移行するため、肝臓による初回通過効果を回避することが出来ると考えられ、消化管や肝臓で代謝されやすい薬物の投与部位として有効と考えられる。しかし、他の吸収部位と同様に親水性生理活性物質の鼻腔粘膜透過性は低く、また、吸収部位の面積も小さいため、鼻腔からの親水性生理活性物質吸収を実現させるためには吸収促進技術が必要である。
【０００９】
これまで複数の製薬メーカーにより界面活性剤を吸収促進剤として利用した経鼻製剤で臨床試験を行った例があるが、いずれも鼻粘膜への刺激性が強く断念する結果に終わっている。また、界面活性剤を用いない方法としては、研究段階においてペプチドを用いた吸収促進が試みられており、特許文献６には薬物に直接、ペプチドを連結させることで経鼻吸収性を促進させる試みが開示されている。しかしながら、この技術は薬物への化学修飾を必要とするため、必然的に薬物の薬理活性の低下や、体内動態の変化、生産コストの上昇、投与薬物の抗原性などの多くの解決すべき課題を有している。
【００１０】
また、ペネトラチンまたはその改変体による経鼻吸収促進の可能性に関して特許文献２または３で言及されているが、これは透過させる薬物とペネトラチン改変体の共有結合を必要とするため、親水性生理活性物質とペネトラチンまたはその改変体が共有結合していない本発明とは異なる技術である。さらに、細胞透過ペプチドを用いた鼻腔吸収促進の実現には、細胞外部から細胞内部への移行に加え、細胞からの離脱が効率よく起こることが必要であることが知られており、また、鼻腔粘膜吸収においては、鼻腔粘膜組織に存在する種々分解酵素によるペプチドの分解され易さなど、細胞透過性とは異なる様々な要因が吸収性に影響するため、細胞透過ペプチドが鼻腔粘膜透過性を有するかどうかについてはモデル動物等を使用した実験により確認される必要があることは当業者の技術常識であるが、特許文献２または３にはペネトラチンまたはその改変体の鼻腔粘膜透過性に関しての実験的証明は開示されていないため、当業者にとって特許文献２または３からペネトラチンまたはその改変体が鼻腔粘膜透過性を有することを類推することは容易ではない。
【００１１】
また、鼻腔吸収促進物質として薬物と共有結合されていないオリゴアルギニンを薬物と同時に投与する試み（特許文献７）もあるが、高濃度のオリゴアルギニンを必要とし、また蛍光標識デキストランという単一のモデル薬物のみでしかその効果が実証されておらず、ペプチド性の親水性生理活性物質の透過性については不明である。
【００１２】
このように、親水性生理活性物質を高い効率で経鼻吸収させる実用性の高い技術は未だ見出されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平１０−３３１８６号公報
【特許文献２】特表２００２−５３００５９号公報
【特許文献３】特表２００２−５１９３９２号公報
【特許文献４】特開２００６−２５７０７４号公報
【特許文献５】特開２００８−７４４８号公報
【特許文献６】ＷＯ２００４／０３７８５９号
【特許文献７】特開平１０−９５７３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、経鼻投与した親水性生理活性物質を血中に移行させる医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を克服するために、本発明者は通常の条件では経粘膜からの血中移行性の低い親水性生理活性物質に対して、その吸収効率を向上させる手段を検討した結果、親水性生理活性物質と（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチドまたは（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、鼻腔粘膜透過性を有するペプチドを含有する医薬組成物が有効であり、経鼻投与において高効率での親水性生理活性物質の血中移行を実現出来ることを見いだした。すなわち、本発明は、以下のような構成を有する。
【００１６】
（１）親水性生理活性物質と下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含有する経鼻投与用医薬組成物。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
【００１７】
（２）前記（ｂ）のペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個の塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチドである、（１）に記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００１８】
（３）前記（ｂ）のペプチドが、配列番号３〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１または２に記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００１９】
（４）前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００２０】
（５）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを０．２〜２．０ｍＭの濃度で含有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００２１】
（６）親水性生理活性物質がペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【００２２】
（７）親水性生理活性物質がインスリンまたはインターフェロンβである、（１）〜（６）のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、経鼻投与した親水性生理活性物質の血中移行が可能となり、従来の注射による投与法に比べ、簡便で患者に優しい薬物治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】配列番号１または配列番号７のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：血中濃度。
【図２】配列番号１または配列番号７のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：血糖値。
【図３】配列番号１または配列番号７のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：バイオアベイラビリティ。
【図４】配列番号１のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：濃度依存性。
【図５】配列番号１のペプチドを用いた経鼻投与蛍光標識デキストラン吸収促進効果。
【図６】配列番号１のペプチドを用いた経鼻投与インターフェロンβ吸収促進効果。
【図７】配列番号１〜６のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：血糖値。
【図８】配列番号１〜６のペプチドを用いた経鼻投与インスリン吸収促進効果：血中濃度。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、親水性生理活性物質を鼻腔から血中に移行させる医薬組成物であって、薬効成分として親水性生理活性物質と鼻腔粘膜透過性を有する特定のペプチドを、それらが共有結合で連結されずにそれぞれ独立した状態で配合してなる経鼻投与用医薬組成物に関する。ここで、本発明における親水性生理活性物質とは、親水性の特徴を有する生理活性物質のことを表す。親水性とは水への溶解度が高いことを表し、ここでは水１ｍｌあたり１μｇ以上溶解する物質を親水性と定義する。また、生理活性物質とは、生体に作用し生体に変化を及ぼす物質全般を示し、特定の細胞の受容体に結合するタンパクや、生体内の物質に親和性を有する酵素が例示され、さらに生体内物質と直接の反応を起こさない物質であっても良く、例えば、血漿の代わりとして増血用途に用いられるデキストランなど、医療用途として生体に投与されうる物質も含まれる。
【００２６】
また、本発明におけるペプチドとは、アミノ酸がペプチド結合により連結された構造を持つものを示す。ペプチドのうち分子量の大きいものは一般的にタンパク質と呼称されるが、本明細書ではこれらのタンパク質も含めて分子量により制限されずペプチドと表す。また、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質や、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化などの化学的な修飾を行った誘導体についても、本発明におけるペプチドに含まれるものとする。
【００２７】
以下、本発明の経鼻投与用医薬組成物の詳細について説明する。
【００２８】
本発明において親水性生理活性物質とともに含まれる配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、一般にペネトラチンと呼ばれるペプチドである。ペネトラチンはショウジョウバエのアンテナペディアと呼ばれるペプチドのＤＮＡ結合部位から見いだされた細胞透過性を有するペプチドであるが、本発明者はペネトラチンと親水性生理活性物質を併せて経鼻投与した場合、ペネトラチンの優れた鼻腔粘膜透過性により親水性生理活性物質が生体内で高い比率で血中移行することを新規に見出し、本発明を完成させたものである。
【００２９】
本発明において用いられる配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、１つまたは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されている場合も、ペプチド全体として本発明で必要とする鼻腔粘膜透過性を有す範囲内での相違であれば許容される。例えば、ペプチドの内の塩基性アミノ酸が別の１つまたは数個の塩基性アミノ酸に置き換わる場合、親水性アミノ酸が別の１つまたは複数の親水性アミノ酸に置き換わる場合、疎水性アミノ酸が１つまたは複数の疎水性アミノ酸に置き換わる場合はペプチド全体の特性は変化しないため、問題なく許容される。特に配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１つまたは数個の塩基性アミノ酸が置換または付加される場合は好ましく許容される。なお、上記アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は少ない方が好ましく、好ましくは１〜５個のアミノ酸、より好ましくは１〜３個のアミノ酸、さらに好ましくは１個のアミノ酸である。ここで、本発明において疎水性アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸を表し、親水性アミノ酸とは、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。また、塩基性アミノ酸とは、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチドの好ましい例としては、配列番号３〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００３０】
また、本発明において親水性生理活性物質とともに含まれるペプチドは、有効な経鼻粘膜透過性を示す配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたは上記配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部が欠失、置換もしくは付加されたペプチドの逆配列で表されるペプチドであっても、ペプチド全体として本発明で必要とする鼻腔粘膜透過性を有す範囲内での相違であれば許容される。ここで、逆配列で表されるペプチドとは、構成するアミノ酸の並びが逆であることを示し、例を挙げるとＮ末端からＣ末端に向けてのアミノ酸配列の並びがアルギニン、グルタミン、イソロイシン、リシンである時、その逆ペプチドはＮ末端からＣ末端に向けてのアミノ酸配列の並びがリシン、イソロイシン、グルタミン、アルギニンであるペプチドを言う。好ましい例として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの逆配列で表されるペプチド（配列番号２）が挙げられる。
【００３１】
本発明において親水性生理活性物質とともに含まれるペプチドを構成するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である立体配置がＬ体であるアミノ酸の他に、天然のアミノ酸の構造を一部改変した誘導体など非天然のアミノ酸も使用されうる。例えば、立体配置がＤ体のアミノ酸は、蛋白分解酵素による分解を受けにくいことから有効に使用されうるため、該ペプチドのアミノ酸配列のうち、一部がＤ体であってもよいし、全体がＤ体であってもよく、該ペプチドと併用投与する親水性生理活性物質によって適宜選択される。なお、親水性生理活性物質が全体としてマイナスチャージを有する場合、全アミノ酸配列がＬ体であることが好ましく、例えば親水性生理活性物質がインスリンの場合、全アミノ酸配列がＬ体であることが好ましい。親水性生理活性物質がチャージを持たない場合、またはプラスチャージを有する場合、全アミノ酸配列がＤ体であることが好ましく、例えばプラスチャージを有するインターフェロンβの場合、該ペプチドの全アミノ酸配列がＤ体であることが好ましい。
【００３２】
本発明において親水性生理活性物質とともに含まれるペプチドは、通常のペプチド合成の方法を用いて調製することが可能であり、例えば、大腸菌などの微生物、動物細胞、昆虫細胞などに該ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入して発現させて作製することも可能である。また、天然に存在する該ペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質を分解処理して得ることもできる。たとえば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはショウジョウバエのアンテナペディアタンパクの一部分の配列と同一の配列であり、天然の当該タンパクより分解酵素処理を経て作製することも可能である。
【００３３】
本発明において親水性生理活性物質とともに含まれるペプチドは、１種類であっても複数種類含まれてもよいが、１種類であることが好ましい。また、その濃度としては特に限定はないが、実施例に示されるように０．２〜２ｍＭであることが好ましく、０．５〜２ｍＭの濃度においては親水性生理活性物質の顕著な鼻腔透過が確認されるためより好ましい。なお、本発明でいうペプチドの濃度は、鼻腔内に投与する時の濃度を表しており、本発明の医薬組成物が溶液状であればその溶液中での濃度を、固体状であれば１回の投与分の組成物を１回の鼻腔内投与量の目安である４０μｌの溶液で復元したときの濃度をいう。
【００３４】
本発明で使用される親水性生理活性物質の具体例としては、ペプチド、糖鎖、核酸があるが、好ましくはペプチドである。ペプチドの具体例としては、抗体、ペプチドホルモンまたはサイトカインが挙げられるが、好ましくはペプチドホルモンまたはサイトカインである。ペプチドホルモンとしてはインスリン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４が、サイトカインとしてインターフェロン類、インターロイキン類またはＧ−ＣＳＦが例示されるが、好ましくはインスリンまたはインターフェロンβである。なお、これら親水性生理活性物質は、天然の物質であっても、その配列の構造の一部を改変した誘導体であっても構わない。また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化などの化学的な修飾を行った誘導体であっても構わない。
【００３５】
本発明でいう親水性生理活性物質の経鼻吸収とは、鼻腔に投与した親水性生理活性物質が、鼻腔より血液中に移行することを示す。その結果は、その親水性生理活性物質の血中濃度の上昇または薬理活性の発現が確認されることで確認できる。親水性生理活性物質の血中濃度は、免疫学的測定法など当業者に通常用いられる方法で測定することができる。薬理活性は、例えば、酵素であればその酵素活性、細胞の受容体に作用する物質であれば、標的細胞の機能あるいはマーカー物質の産生量を変化させる能力などを指標に測定することができる。例えば、インスリンの薬理活性であれば、投与した動物の血中グルコース濃度を指標に測定することが可能である。
【００３６】
吸収促進が起きているかどうかは、鼻腔に薬効成分である親水性生理活性物質のみを投与した場合の投与薬物量に対する血中への薬物移行量の比率と、本発明の医薬組成物を投与した場合の投与薬物量に対する血中への薬物移行量の比率を比較し、後者が高いことで確認出来る。実際の医薬品として十分な機能を発揮するためには、ＡＵＣ（血中濃度−時間曲線下面積）の値として、同量の親水性生理活性物質を注射投与した時のＡＵＣを１００％とした時の比率を示すバイオアベイラビリティの値が１０％以上を示す医薬組成物が好ましく、２０％以上であることがより好ましい。
【００３７】
本発明の経鼻投与用医薬組成物は、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。
【００３８】
本発明の経鼻投与用医薬組成物は、溶液、固体、粉末状などの種々の形態で使用されうるが、安定性及び取扱いの容易さから、例えば、凍結乾燥等の方法で、固形状あるいは粉末状にした形態が好ましい。
【００３９】
本発明の経鼻投与用医薬組成物を、動物（ヒトを含む）に投与する方法には、特にその具体的形態に制限はない。例えば、乾燥状態のものあるいは溶液状のものをそのまま投与したり、あるいは賦形剤とともにカプセルに充填して投与したり、さらには乾燥状態のものを水に一旦溶解分散させてから投与したりすることができる。
【００４０】
本発明の経鼻投与用医薬組成物を生体に投与する際の投与量や投与回数は、親水性生理活性物質、投与形態、患者の年齢、体重、症状の重篤度によって適宜選択されうるが、含有する親水性生理活性物質の重量として通常成人１日あたり０．０００１〜５０ｍｇ、好ましくは０．００１〜２０ｍｇの範囲で投与されうる。
【実施例】
【００４１】
実施例１：インスリンの経鼻投与
＜方法＞
インスリン（ＷＡＫＯ社)粉末を１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ社）に一定量計りとり、０．１Ｎ、ＨＣｌに溶解した後、同量の０．１Ｎ、ＮａＯＨを加えインスリン溶液を作製した。
【００４２】
全アミノ酸配列がＬ体あるいはＤ体のペネトラチン（配列番号１、シグマジェノシス社委託合成）またはオリゴアルギニン（配列番号７、シグマジェノシス社委託合成）をＰＢＳに溶解し、前述のインスリン溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインスリン(１０ＩＵ／ｋｇ)、それぞれのペプチド０．５ｍＭの４０μｌ混合溶液を調製した。
【００４３】
２４時間絶食した体重約２００ｇのＳＤ系雄性ラットにペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射することにより麻酔した後、頸部を切開し気管を露出した。ポリエチレンチューブ（ＩＮＴＲＡＭＥＤＩＣ ＰＥ２０５，Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ）を気管に挿入し、次に食道を一部切開し同径のチューブを食道の切開部から後鼻孔へむけて慎重に組織に傷をつけぬよう挿入した。後鼻孔へ挿入するチューブの先端を予め脱脂綿と接着剤で密栓した。薬液の漏れを防ぐために口腔に開いている上顎部の鼻口蓋管を合成接着剤（第一三共株式会社製“アロンアルファＡ”)で閉じた。そして、調製したインスリン、ペプチド混合液またはインスリンのみを投与前および投与後５、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０分後に頸静脈より０．２５ｍｌを採血し、遠心分離により血漿を分離させ、血漿中インスリン濃度をＥＩＡキット（レビス社）により測定した。生物学的利用能(バイオアベイラビリティ)はインスリン皮下投与時との比較により算出した。
【００４４】
＜結果＞
投与後の血中インスリン濃度推移を図１に、血中グルコース濃度推移を図２に示す。インスリンのみを経鼻投与したラットでは血中のインスリン濃度上昇はほとんど確認出来ないのに対し、インスリンと共にペネトラチンまたはオリゴアルギニンを投与したラットでは投与直後よりインスリンの血中移行が認められ、最大血中濃度はＬ−ペネトラチンが最も高く、ついでＤ−ペネトラチン、Ｄ−オリゴアルギニン、Ｌ−オリゴアルギニンとなった（図１）。またインスリンの血中移行に伴う薬理活性である血糖値の低下も認められ、血中のインスリン濃度に対応する血糖値低下が確認された（図２）。
【００４５】
バイオアベイラビリティはインスリンのみを投与したラットが０．８％だったのに対し、インスリンとＬ体またはＤ体のオリゴアルギニンを同時に投与した場合、Ｌ体でバイオアベイラビリティ（ＢＡ）が１．１％、Ｄ体で２．０％となり、インスリンとペネトラチンを同時に投与した場合、Ｄ体でＢＡは３．４％、Ｌ体で７．１％となり（図３）、ペネトラチンはオリゴアルギニンと比較し、高いインスリン吸収促進効果を示した。
【００４６】
実施例２：インスリンの経鼻投与、ペプチド濃度依存性
＜方法＞
実施例１と同様の方法を用い、実施例１で最も効率の良い吸収促進効果が認められたＬ体のペネトラチン（配列番号１）について、投与溶液に含まれる濃度として０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭに変更し、同様の評価を行った。
【００４７】
＜結果＞
インスリン単独を投与した場合のバイオアベイラビリティが１．７％なのに対し、Ｌ体のペネトラチンを０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭで投与した場合のバイオアベイラビリティはそれぞれ１５．１％、１７．９％、２８．４％、５０．７％となり、ペネトラチンの濃度依存的にインスリンの吸収効率が向上した（図４）。
【００４８】
実施例３：蛍光標識デキストランの経鼻投与
＜方法＞
蛍光標識デキストランであるＦＤ−４（モルキュラープローブ社）をＰＢＳで希釈し４ｍｇ／ｍｌ溶液とした。この溶液を４０μｌ用い、実施例１と同じ手法を用いて評価を行った。血液中のＦＤ濃度は蛍光光度法にて定量した。バイオアベイラビリティは同量のＦＤ−４を静脈内投与した場合との比較により算出した。
【００４９】
＜結果＞
ＦＤ−４単独を投与したラットのバイオアベイラビリティは４．９％、Ｌ体のペネトラチン１７％、Ｄ体のペネトラチンを用いた場合は３６％となった。またＬ体またはＤ体のオリゴアルギニンを投与したラットのバイオアベイラビリティはそれぞれ、１２．４％、１２．４％となり、オリゴアルギニンに比較し、ペネトラチンが高い吸収促進効果を示した（図５）。
【００５０】
実施例４：インターフェロンβの経鼻投与
＜方法＞
氷冷下、ヒト天然型インターフェロンβ（東レ株式会社製“フエロン”）にＴｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳを１ｍｌ加え、６，０００，０００ＩＵ／ｍｌとし、この溶液を１００μｌ分取し、Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳを５６６μｌ加え９００，０００ＩＵ／ｍｌ溶液とした。Ｄ体およびＬ体のペネトラチン（配列番号１）をそれぞれ終濃度０．５ｍＭまたは２ｍＭになるように秤量しインターフェロンβ溶液４０μｌを添加して溶解し、インターフェロンβおよびペネトラチン混合溶液とし、実施例１と同じ手法を用いて評価を行った。インターフェロンβの濃度は株式会社鎌倉テクノサイエンス製“ヒトインターフェロンβＥＬＩＳＡキット”により測定し、バイオアベイラビリティは同量のインターフェロンβを静脈内投与した場合との血漿中濃度の比較により算出した。
【００５１】
＜結果＞
インターフェロンβと共にペネトラチンを添加することにより血中へのインターフェロンβ移行が認められた。バイオアベイラビリティは０．５ｍＭのＬ体で６．１％、０．５ｍＭのＤ体で１１．０％、２ｍＭのＤ体で２２．０％であった（図６）。
【００５２】
実施例５：インスリンの経鼻投与
＜方法＞
インスリン（ＷＡＫＯ社)粉末を１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ社）に一定量計りとり、０．１Ｎ、ＨＣｌに溶解した後、同量の０．１Ｎ、ＮａＯＨを加えインスリン溶液を作製した。
【００５３】
全アミノ酸配列がＬ体のペプチド（配列番号１〜６、シグマジェノシス社委託合成）をＰＢＳに溶解し、前述のインスリン溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインスリン(１ＩＵ／ｋｇ)、それぞれのペプチド０．５ｍＭの４０μｌ混合溶液を調製し、実施例１と同様の方法にて評価を行った。
【００５４】
＜結果＞
投与後の血中グルコース濃度推移を図７に血中インスリン濃度推移を図８に、評価結果より得られた各種パラメーターを表１に示す。インスリンのみを経鼻投与したラットでは血中のインスリン濃度上昇はほとんど確認出来ないのに対し、インスリンと共に配列番号１〜６のペプチドをそれぞれ投与することで、投与直後より血中へのインスリン移行が見られ、それに伴い、血中グルコース濃度の低下が確認された。血中インスリン濃度推移から算出したバイオアベイラビリティ（ＢＡ）はインスリンのみを投与したラットが２．３％だったのに対し、配列番号１〜６のペプチドでは４．４〜２０．１％となった。また、血中グルコース濃度推移より算出した薬学的利用性（ＰＡ）はインスリンのみを投与した場合、４．７％であったのが、配列番号１〜６のペプチドでは１５．７％〜３７．５％となった。
【００５５】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、これまで注射剤として投与されてきた親水性生理活性物質を経鼻投与することが可能となり、患者の苦痛、不便を大幅に改善する薬剤を提供することができる。これらの注射剤が患者に与える苦痛や通院の不便を改善することは医療現場における患者本位の医療を実現するだけではなく、これまでの製剤の概念を根底から変え、画期的製剤の創製につながる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性生理活性物質と下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含有する経鼻投与用医薬組成物。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
【請求項２】
前記（ｂ）のペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個の塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチドである、請求項１に記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項３】
前記（ｂ）のペプチドが、配列番号３〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１または２に記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項４】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項５】
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを０．２〜２．０ｍＭの濃度で含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項６】
親水性生理活性物質がペプチドである、請求項１〜５のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項７】
親水性生理活性物質がインスリンまたはインターフェロンβである、請求項１〜６のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項１】
親水性生理活性物質と下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含有する経鼻投与用医薬組成物。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、鼻腔粘膜透過性を有するペプチド。
【請求項２】
前記（ｂ）のペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個の塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ鼻腔粘膜透過性を有するペプチドである、請求項１に記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項３】
前記（ｂ）のペプチドが、配列番号３〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１または２に記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項４】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項５】
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを０．２〜２．０ｍＭの濃度で含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項６】
親水性生理活性物質がペプチドである、請求項１〜５のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【請求項７】
親水性生理活性物質がインスリンまたはインターフェロンβである、請求項１〜６のいずれかに記載の経鼻投与用医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−８４５８１（Ｐ２０１１−８４５８１Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５６２３（Ｐ２０１１−１５６２３）
【出願日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【分割の表示】特願２００９−５１０２１２（Ｐ２００９−５１０２１２）の分割
【原出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「平成１９年度独立行政法人科学技術振興機構革新技術開発研究事業」および「平成２０年度独立行政法人科学技術振興機構産学共同シーズイノベーション化事業（顕在化ステージ）」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【分割の表示】特願２００９−５１０２１２（Ｐ２００９−５１０２１２）の分割
【原出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「平成１９年度独立行政法人科学技術振興機構革新技術開発研究事業」および「平成２０年度独立行政法人科学技術振興機構産学共同シーズイノベーション化事業（顕在化ステージ）」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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