結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出
【課題】抗結核治療法における主要な成分であるイソニアジド（ＩＮＨ）に対する抵抗性の分子機構を知り、ＩＮＨ−抵抗株を迅速に同定することのできる簡単な試験法及び核酸プローブと核酸ハイブリダイゼーションを実施するためのキットを提供する。
【解決手段】ＩＮＨ−感受性を仲介するＫａｔ Ｇ遺伝子を含有するクロモソーム領域のユニークな核酸配列との核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法によって検出する方法及びそのキット。
【解決手段】ＩＮＨ−感受性を仲介するＫａｔ Ｇ遺伝子を含有するクロモソーム領域のユニークな核酸配列との核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法によって検出する方法及びそのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は１９９２年４月３０日に出願した通し番号Ｎｏ．８７５，９４０の一部継続出願である。本発明は抗生物質イソニアジドに抵抗性の結核菌株の迅速検出に関するものである。より詳しくいえば、本発明は核酸ハイブリダイゼーションにより結核菌中のイソニアジド抵抗性を検出する方法に関する。本発明はまた核酸プローブおよび核酸ハイブリダイゼーションを実施するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
結核の病原因子としてロベルド・コッホにより結核菌が発見されて以来一世紀以上にわたる研究にもかかわらず、結核は依然としてヒトの罹病率と死亡率の主要な原因の一つになっている。結核による死亡は毎年３００万人に達しており（Ｓｎｉｄｅｒ，１９８９）、これらの大半は発展途上国であるが西側でもホームレス人口の増加とＡＩＤＳ流行の影響によって結核は再び重要な問題となっている（非特許文献１：Ｃｈａｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２）。
【０００３】
イソニコチン酸ヒドラジド、すなわちイソニアジド（ＩＮＨ）は“結核”群−ヒト型結核菌、ウシ型結核菌およびＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍの菌種に対して強い薬効をもつことから過去４０年間結核の治療に用いられてきた（非特許文献２：Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，１９５２；Ｙｏｕａｔｔ，１９６９）。ＩＮＨの標的は正確にはわからないし、また作用機作も知られていないが、本剤の投与等よっていくつかの代謝系路が乱されることがわかっている。ＩＮＨがＮＡＤおよびピリドキサルリン酸の抗代謝体として作用するらしいことを示すたくさんの証拠があり（非特許文献３：Ｂｅｋｉｅｒｋｕｎｓｔ ａｎｄ Ｂｒｉｃｋｅｒ，１９６７；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ ａｎｄ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，１９７０；Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９６８，１９６９，１９７０）、またそのほか結核菌細胞壁の酸抵抗特性の原因となっているミコール酸の合成を本剤がブロックすることを示すデータがある（非特許文献４：Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ １９７０；Ｑｕｅｍａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＩＮＨが使用されるようになって間もなく、ＩＮＨ−抵抗性の結核菌分離菌が出現し、特性をしらべた結果カタラーゼ−パーオキシダーゼ活性がなくなり、モルモットで菌毒性が弱まっていることがわかった（非特許文献５：Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９５４；Ｋｕｂｉｃａ ｅｔ ａｌ．，１９６８；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ ａｎｄ Ｒａｍａ−Ｋｒｉｓｈｍａｎ，１９７０）。
【非特許文献１】Ｃｈａｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２
【非特許文献２】Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，１９５２；Ｙｏｕａｔｔ，１９６９
【非特許文献３】Ｂｅｋｉｅｒｋｕｎｓｔ ａｎｄ Ｂｒｉｃｋｅｒ，１９６７；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ ａｎｄ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，１９７０；Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９６８，１９６９，１９７０
【非特許文献４】Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ １９７０；Ｑｕｅｍａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１
【非特許文献５】Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９５４；Ｋｕｂｉｃａ ｅｔ ａｌ．，１９６８；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ ａｎｄ Ｒａｍａ−Ｋｒｉｓｈｍａｎ，１９７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ごく最近になって、結核菌の多剤抵抗（ＭＤＲ）変種によるＵＳＡでの結核の流行（ＣＤＣ，１９９０；１９９１ａ，ｂ）ならびにこれら変異株がＨＩＶ−感染者とヘルスケア従事者の広範な院内感染の原因になっていることがわかったことから、ＩＮＨ−抵抗性の問題は新しい重要性をもつに至った（Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２）。この問題の重要性にかんがみ、ＩＮＨ抵抗性とカタラーゼ−ペルオキシダーゼ産生の関連をはっきりさせる必要がある。
【０００５】
より詳しくいえば、薬剤感受性に含まれる分子機構を知る必要がある。加えて、ＩＮＨ−抵抗株を迅速に同定することのできる簡単な試験法を開発する必要がある。さらに、このような試験法を実施するための試薬を作ることが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明はイソニアジドに抵抗性の結核菌細胞の存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するプロセスを提供することによって上述の諸要求を満たすことについて手助けする。そのプロセスは以下の段階から成る：
（Ａ） 細胞の核酸を沈着、固定してそれがプローブに近接できるようにする；
（Ｂ） ステップ（Ａ）から得られた固定化核酸をハイブリダイゼーションのできる条件下でプローブと接触させる；
（Ｃ） ステップ（Ｂ）からのフィルターを洗滌してハイブリッド形成しなかったプローブをすべて除去する；ついでそのあと
（Ｄ） ステップ（Ｃ）から得られた洗滌済みフィルター上のハイブリッド形成したすべてのプローブを検出する。
【０００７】
そのプローブはプラスミドｐＹＺ５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント中に存在する核酸配列を含んでおり、そのフラグメントの中にはＢａｍＨＩ開裂部位が含まれる。このフラグメントはイソニアジド−感受性結核菌の細胞内ＤＮＡと会合することがわかっており、このような抗生物質感受性の微生物を、以下に述べる条件下でこのフラグメントとハイブリッド形成するＤＮＡを含まないような、イソニアジド−抵抗性結核菌と区別することができる。
【０００８】
さらに本発明は、イソニアジド−抵抗性細胞からのＤＮＡには存在しないイソニアジド感受性を付与する結核菌のＫａｔ Ｇ遺伝子領域をコードするところの、イソニアジド−抵抗性結核菌のヌクレオチド配列−ＲＮＡやＤＮＡのような−も用意する。
本発明は、本発明のヌクレオチド配列に結合した、核種のような、標識から成るプローブも用意する。
【０００９】
さらに本発明は、本発明のヌクレオチド配列が、ＤＮＡやＲＮＡのような、相補的な塩基配列のヌクレオチド配列と水素結合したものから成るハイブリッド二重複合分子を用意する。
また、本発明は結核菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子、またはこのようなヌクレオチド配列の一部分をコードするヌクレオチド配列を一群のヌクレオチド配列から選択するためのプロセスも用意しており、これはどのヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成するかを決めるステップから成っている。そのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列か、またはＲＮＡ配列かである。そのプロセスはヌクレオチド配列上の標識を検出するステップを含んでいる。
【００１０】
さらに、本発明はイソニアジドに抵抗性の結核菌の検出のためのキットを用意している。そのキットは、プラスミドｐＹＺ５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントで、その中にＢａｍＨＩ開裂部位を含むところのヌクレオチド配列を包含するプローブを含む容器一式から成る。そのキットは核酸の対照調製物を含む容器一式も含んでいる。
【００１１】
本発明はまた酵素カタラーゼ、または類似の酵素がイソニアジドに作用して生じた生成物として得られた化合物をも包含する。Ｋａｔ Ｇ遺伝子または同様の活性を保持する誘導体はカタラーゼ蛋白質のソースとして使用することができる。新化合物はＩＳＢＮ Ｎ°０９９５−２４５４、パスツール研究所により編集されたＨ．Ｄａｖｉｄらの“マイコバクテリア臨床のための実験室の方法”に述べられているようなアンチバイオグラム法を用いて、ＩＮＨ−抵抗性結核菌株に対する反応性により選別される。
【００１２】
図の簡単な説明
本発明は以下の図を引用することによりさらに一層詳しく記述されるであろうし、それらはつぎの如くである：
図１（Ａ）はシャトルコスミドｐＢＨ４中でクローン化した結核菌ＤＮＡのフィジカルマップである。Ｃ１ａＩ（Ｃ）、ＮｏｔＩ（Ｎ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）に対する制限部位を示してある。ＤｒａＩとＡｓｎＩに対する制限部位は見出されておらず、コスミドは結核菌中に記載されている付加的既知遺伝子または挿入配列のいずれも有していない。Ｋａｔ Ｇ遺伝子の位置とスケールバーを示す。
【００１３】
図１（Ｂ）はｐＹＺ５６中に存在する挿入体の制限マップであり、Ｋａｇの位置と転写の方向を示している。
図２は結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼポリペプチドの部分配列および大腸菌とＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＨＰＩ酵素との比較である。同じ残基は＊で示してある。
図３は活性染色による組換え結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼの検出を示す。細胞抽出物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ペルオキシダーゼ（レーン１−５）とカタラーゼ活性に関して染色した。試料は結核菌からがレーン１；大腸菌ＴＧ１，レーン２，６；ＴＧ１／ｐＹＺ５６（Ｋａｔ Ｇ+），レーン３と７；ＴＧ１／ｐＢＡＫ１６（ｌａｃＺ′：：ＫａｔＧ），レーン４と８；ＴＧ１／ｐＹＺ５６（１．４Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラグメントを欠失したｐＹＺ５５と同じ）。
【００１４】
図４は４．５ＫｂのＫｐｎＩフラグメントをプローブとして用いての種々の結核菌株のサウザーンブロット分析の結果を示す。ＫｐｎＩで切断したゲノムＤＮＡはＨ３７ＲＶ株からのものがレーン１；株１２，レーン２；Ｂ１４５３，レーン３；株２４，レーン４；７９１１２，レーン５；１２６４６，レーン６；７９６６５，レーン７。株Ｂ１４５３と２４は高濃度のＩＮＨに抵抗性、株１２は低濃度のＩＮＨに抵抗性であるのに対してその他はＩＮＨ感受性である。対照として、同じブロットをｓｏｄＡ遺伝子に対するプローブとハイブリッドさせた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。Ｂ１４５３と関連したＩＳ６１１０−仲介多型現象に注目のこと。
【００１５】
図５はＩＮＨ−抵抗性Ｍ．スメグマの株を示し、ＢＨ１11（ｍｃ2−１５５10株の誘導体）は結核菌Ｈ３７ＲＶシャトルコスミド（ニューヨークのＷ．Ｒ．Ｊａｃｏｂ博士より提供された）のプールでトランスフォームし、それぞれのクローンをＩＮＨ−感受性に関して数をかぞえた。コスミドｐＢＨ４は終始一貫して薬剤感受性を付与し、トランスフォーマントはカタラーゼを過剰産生した（Ｈｅｙｍ中としてアッセイした）。ｐＢＨ４からのＤＮＡ挿入体の制限マップをｐＹＺ５５からの挿入体のマップと並べて示してある。このｐＹＺ５５は結核菌Ｈ３７ＲＶのＫａｔ Ｇを含むプラスミドで、大腸菌ＨＰＩの保存領域からのアミノ酸配列とマッチするように計画されたつぎのようなオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを基礎に分離されたものである：
【００１６】
（５′−ＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣ−３′）。以下の酵素に対する制限部位が示されている：Ｂ，ＢａｍＨ１；Ｃ，Ｃａｌ；Ｅ，ＥｃｏＲＶ；Ｈ，Ｈｉｎｄ１１１，Ｋ，Ｋｐｎ１；Ｍ，Ｓｍａｌ；Ｎ，Ｎｏｔｌ；Ｒ，ＥｃｏＲ１；Ｓ，Ｓａｃ１．ｐＹＺ５５からの４．５Ｋｂの挿入体を含むマイコバクテリアシャトルプラスミド，ＰＢＡＫ１４，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，によるＢＨ１のトランスフォーメーションは同じようにＩＮＨ−感受性を供与する。ＭＩＣ′ＳもまたｐＹＺ５５から導出されたサブフラグメントでトランスフォームされたＢＨ１に関して示され、１つ（＋）または他の（−）配位でｐＢＡＫ１４中に挿入される。Ｋａｔ Ｇ遺伝子およびＩＮＨ−感受性を供与する能力の両方とも２．９Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−Ｋｐｎ１フラグメント（ｐＢＡＫ−ＫＥ+）にマップされた。
【００１７】
図６は前に記載した活性ゲル分析18のために調製した種々のプラスミド構造によってトランスフォームした結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌からのそれを示す。Ｗａｙｎｅ ａｎｄ Ｄｉａｚ19により記載されたように、８％ポリアクリルアミドを含む非変性ゲルがカタラーゼ（パネルＡ）とペルオキシダーゼ（パネルＢ）活性に対して染色された。レーン１，結核菌Ｈ３７ＲＶ；２，大腸菌ＵＭ２（Ｋａｔ Ｅ，Ｋａｔ Ｇ，ｒｅｆ．１５）；３，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５５；４，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５６（図１中のｐＢＡＫ−ＫＥ+に対応する、ｐＵＣ１９中の２．９Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−Ｋｐｎ１フラグメント）；５，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５７（図１中のｐＢＡＫ−ＫＢ+に対応する、ＢａｍＨ１−Ｋｐｎ１欠失を有するｐＹＺ５５）。これらの条件下で結核菌カタラーゼとペルオキシダーゼ活性は２つのバンドとして移動した（レーン１）；同じパターンがｐＹＺ５５で発現した組換え酵素についてみられた（レーン３）。ｐＹＺ５６（レーン４）は、パネルＣに示したベクターからのＫａｔ Ｇとｌａｃ Ｚ′の間への融合によって分子量の増大した蛋白質を発現する。パネルＣも大腸菌ＨＰ１をもった部分配列の並びを示す（遺伝子の完全配列はどこかで発表されるであろう）。
【００１８】
図７はＫａｔ ＧとＫａｔ Ｅ（ＵＭ２，ｒｅｆ．１５）両方に突然変異を有する大腸菌株で、これはＰＵＣ１９ベクターだけ（ハッチしたバー）、結核菌Ｋａｔ Ｇを発現するｐＹＺ５５（白色バー）、および結核菌Ｋａｔ Ｇを多量に発現するｐＹＺ５６（黒バー）でトランスフォームされたものである。適当量の抗生物質を加えたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブイヨン中で終夜培養したものを種々の濃度のＩＮＨの存在下でプレートし、コロニー生成ユニットを数えた。典型的な実験の結果を３重試料での標準偏差を示す誤差バーとともに示す。結核菌Ｋａｔ Ｇの過剰発現は同様に大腸菌ＵＭ２５５中で高濃度のＩＮＨに対して感受性を付与したが（Ｋａｔ Ｇ，Ｋａｔ Ｅ，Ｍｕｌｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、大腸菌ＴＧ１のようなカタラーゼ陽性株に対しては作用しなかった。いくつかの実験において、高濃度のＩＮＨはＵＭ２とＵＭ２５５だけの増殖に対して検出できる阻害作用を示したが、すべての実験でｐＹＺ５６−トランスフォーマントの阻害は対応するベクター対照で観察された阻害よりも少なくとも１０−１００倍大きかった。
【００１９】
図８は、異なる結核菌株からＫｐｎ１で切断し、（Ａ）Ｋａｔ Ｇ（４．５Ｋｂ Ｋｐｎ１フラグメント）、および（Ｂ）ＳＯＤ遺伝子（１．１Ｋｂ ＥｃｏＲ１−Ｋｐｎ１フラグメント，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）でプローブしたゲノムＤＮＡを用いて調製したサウザーンブロットを示す。プローブの標識とブロットのプロセッシングは前に記載した16とおりに実施した。レーン１，Ｈ３７ＲＶ；２，株１２−ＭＩＣ １．６μｇ／ｍ１１ＮＨ；３，Ｂ１４５３−ＭＩＣ＞５０μｇ／ｍｌ ＩＮＨ20；４，株２４−ＭＩＣ＞５０μｇ／ｍｌ ＩＮＨ；５，７９１１２−ＩＮＨ−感受性21；６，１２６４６−ＩＮＨ−感受性21；７，７９６６５−ＩＮＨ−感受性21。ＩＮＨ感受性は異なるＩＮＨ濃度を含むＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ ｓ ｏｐｅｓの播種によって確認した。
【００２０】
好ましい態様の詳細な記述
米国で最近多剤抵抗性を示す多数の結核菌株が出現したことは最も驚くべき出来事であり、これはこの菌の並はずれて強い接触感受性による。この危険はいくつかの小さな結核流行域についてはっきりと示されていて、そこではＭＤＲ結核菌に感染した１人の患者がＨＩＶ陽性の刑務所看守と健常な看護スタッフ両方に感染させた（ＣＤＣ１９９０，１９９１；Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２）。ＨＩＶの流行が世界的な拡がりを見せている現状の重大さからみて、西側のＡＩＤＳ患者がアフリカの患者のようにＭＤＲ結核菌株（トリ結核菌／細胞内マイコバクテリウム複合体よりもむしろ）に感染したとすれば、この病気が世界的な規模で伝播するだろうと予測される。
イソニアジド（ＩＮＨ）はマイコバクテリアの結核菌群−ヒト結核菌、ウシ結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ−に対して特に強力な殺菌作用をもつ薬剤であり、結核の治療に特別な効力を発揮してきている。標準的な抗結核治療方式は一般にはＩＮＨとリファンピシンを与えるが、しばしばもっと弱い薬であるピラジナミド、エタンブトールまたはストレプトマイシンとの組み合わせが用いられる。治療に用いるほかにＩＮＨは予防の方法として患者と直接に接触する人達に対しても投与される。
【００２１】
ヒトの病気の原因物質であるヒト結核菌のＩＮＨ−抵抗変異体は２つのレベルの抵抗性を示す：すなわち低（１〜１０μｇ／ｍｌ）と高（１０〜１００μｇ／ｍｌ）である。ＩＮＨ−抵抗性はしばしばカタラーゼ活性および菌毒性の消失を伴う。最近、ＡＩＤＳの流行とホームレスの増大や社会条件の悪化によって、先進諸国とくに米国において結核が重大な公衆衛生上の問題として再び現われてきた。今日におけるこの病気の恐るべき一面は多剤薬剤に抵抗性の細菌の出現とヘルスケア従事者やＨＩＶ−感染患者への急速な院内感染である。このためＣＤＣは多剤抵抗株（少くともＩＮＨとリファンピシン）の処置と伝染予防に関する新しい勧告を提起した。ＩＮＨ−抵抗性の問題に新しい見通しを得るとともに迅速な診断テスト法を開発するために以下の研究が行われた。
当然のこととして、必須なことは主な抗結核薬であるＩＮＨとリファンピシンに対する抵抗性のメカニズムを明らかにすることであり、それによって開発すべき新しい化学療法上の戦略が立てられ、ＭＤＲ株を抑える新化合物の計画が可能になる。
【００２２】
本発明は以上のものとしてカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素、ＨＰＩ、が有効であることを証明しており、この酵素単独で毒性を仲介するものと考えている。このような結論を支持する証拠として以下のことが挙げられる。すなわち、大腸菌のカタラーゼ陰性変異体中の結核菌Ｋａｔ Ｇ遺伝子の発現によってこの細菌がＩＮＨ感受性になるということである。さらに、結核菌ＩＮＨ−感受性遺伝子、Ｋａｔ Ｇの分離は、ハイブリダイゼーションとＰＣＲを用いたアプローチによってＩＮＨ−抵抗性株の迅速な検出を容易にするという点で重要である。臨床株中にＫａｔ Ｇ欠失が高頻度でみられることは、ここに示すように、この手続きを簡単化する。
【００２３】
ＩＮＨ−感受性中に含まれる結核菌遺伝子の同定
ＩＮＨ−感受性中に含まれる結核菌遺伝子を分離するのに一つの異種的アプローチを用いた。ＢＨ１は容易にトランスフォームするスメグマ菌株ＭＣ2１５５の偶発変異体であり（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、５１２μｇ／ｍｌのＩＮＨに抵抗性でカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を欠いている（Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＩＮＨ−感受性とこれらの酵素の活性との間には厳密な相関関係があるので、結核菌からの適当な遺伝子を運ぶプラスミドによるＢＨ１のトランスフォーメーションは、それらの回復と同時に起こるＩＮＨ−抵抗性に導くべきである。
したがって、ＤＮＡを大腸菌中の結核菌シャトルコスミドのプールから調製し、ついでエレクトロ−トランスフォーメーションによってＢＨ１中に導入した。すると１０００以上のカナマイシン−抵抗性トランスフォーマントがＩＮＨ−抵抗性に関して数えられ、３２ｇ／ｍｌのＩＮＨを含む培地上で増殖できない４つのクローン、すなわち野生型ＭＣ2１５５からのＭＩＣが得られた。
【００２４】
ＢＨ１を再トランスフォーメーションしてのち、これらのうちのたった１つ、ｐＢＨ４だけが終始一貫してＩＮＨ−感受性表現型を付与した。制限酵素ＢａｍＨＩ，ＫｐｎＩ，ＮｏｔＩ，ＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断によってｐＢＨ４によって運ばれるクロモソームＤＮＡの大きさは約３０Ｋｂであることがわかった。上記の酵素のうちの終りの方の３つによって生じたマップを図１に示した。
【００２５】
ｐＢＨ４をハイブリダイゼーションプローブとして用いてライブラリー中の相同クローンを検出したところ、さらに８つのシャトルコスミドが分離された。ＢＨ１へのトランスフォーメーションによって、これらのうちの５つ（Ｔ３５，Ｔ６４６，Ｔ６７３，Ｔ７９，Ｔ５５６）がＩＮＨ−抵抗性を取り戻してｐＢＨ４と類似の制限プロフィルを示した（データは示さず）。とくに、４．５ＫｂのＫｐｎＩフラグメントはすべての場合に存在していた。
【００２６】
個々のＢａｍＨＩフラグメントをサブクローンすることを試みたが、ＢＨ１中の傷害を補足して完全にすることのできるトランスフォーマントは生じなかったことから、ＢａｍＨＩ部位は興味ある遺伝子の中に位置すると示唆された。それとは逆に、ｐＢＨ４の誘導体であるｐＢＨ５はＥｃｏＲＩフラグメントの欠失によって作り上げられ、このことはＩＮＨ−感受性の回復のためには７Ｋｂフラグメントは必要でないことを示している。
【００２７】
ＢＨ１のＩＮＨ−抵抗性変異と相補的であるシャトルコスミドを包含するトランスフォーマントを注意深くしらべて、いくつかの抗生物質に対するＭＩＣSを確立した。すべての場合に、ＩＮＨに関するＭＩＣは５１２から８μｇ／ｍｌへ減少し、これは感受性株ＭＣ2１５５（３２μｇ／ｍｌ）の値よりも低い。このような過剰感受性表現型は組換えクローンがＩＮＨ−毒性を強化する能力をもつ酵素を過剰産生したかもしれないことを示唆している。酵素学的研究から、これらのトランスフォーマントはすべてＩＮＨ−感受性である野生型ＭＣ2１５５株よりも約２倍多いペルオキシダーゼとカタラーゼを産生することがわかった（データは示さず）。
【００２８】
結核菌のＭＤＲ株の多くのものが、ＩＮＨだけでなくリファンピシン、ストレプトマイシン、エタンブトールおよびピラジンアミドに対して感受性を失っている。ＩＮＨとこれらの化合物に対する抵抗性の間に相関関係があるかもしれないという可能生をしらべるために、種々のＭ．スメグマチス株と、それらのｐＢＨ４トランスフォーマントに対するいくつかの薬剤のＭＩＣSを決定したが、なんらの差異は見出されなかった。
【００２９】
結核菌カタラーゼ遺伝子のクローニング
大腸菌（Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）およびバチルスｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）のカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素中の高度保存領域の一次配列をもとに４５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブをデザインした。結核菌ＤＮＡのゲノムブロットをこのオリゴヌクレオチドでプローブすることによって、ほとんどの場合に特異なバンドが検出された。ＫｐｎＩは強くハイブリッド形成する４．５Ｋｂのユニークなフラグメントを生成したので、この酵素をＰＵＣ１９中の大きさで選択するライブラリーを作るのに用いた。
【００３０】
そのオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることによって、適当なクローン、ｐＹＺ５６が得られた。挿入ＤＮＡの制限マップを図１に示したが、これはｐＢＨ４の部分に正確に対応することがわかる。クロス−ハイブリダイゼーションによっても独立に確認された。
【００３１】
いくつかのサブクローニングの実験によって大腸菌中の結核菌カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を発現する最小フラグメントは２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントであることがわかり、これは予期したように、ＢａｍＨＩに対する開裂部位を含んでいた。部分ＤＮＡ配列解析から、ｐＹＺ５６によって運ばれるＫａｔ Ｇ遺伝子は大腸菌およびＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＨＰＩ酵素に極めて相同なカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素をコードすることがわかった。
【００３２】
結核菌 ＡＰＬＮＳＷＰＤＮＡＳＬＤＫＡＲＲＬＬＷＰＳＫＫＫＹＧＫＫＬＳＷ
ＡＤＬＩＶ
大腸菌 ＊＊＊＊＊＊＊＊＊Ｖ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊Ｉ＊Ｑ＊＊＊Ｑ＊Ｉ＊＊
＊＊＊ＦＩ
Ｂ．ｓｔｅａｒｏ−
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊Ｎ＊＊＊＊＊＊Ｃ＊ＧＲ＊＊
ＲＮＴ＊Ｔ＊−＊ＬＧＰＩＣＳ
（図２；Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８）；（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）．同じ残基を＊で示した。ＨＰＩ活性は染色により大腸菌、Ｍ．スメグマチスいずれについても検出された（以下を見よ）。
【００３３】
ＩＮＨ−感受性中にカタラーゼ−ペルオキシダーゼが含まれる
結核菌Ｋａｔ Ｇ遺伝子をクローン化したので、カタラーゼ−陰性とイソニアジド抵抗性の相関関係の遺伝的基礎をしらべることが緊急の関心事であった。一連の構成をシャトルベクターｐＢＡＫ１４中に確立し、ＩＮＨ−抵抗Ｍ．スメグマチス変異体ＢＨ１をトランスフォームするのに用いた。完全なＫａｔ Ｇ遺伝子を運んでいるプラスミドのみがＨＰＩを産生してＩＮＨ−感受性を取り戻した。これらのうちの最小のｐＢＡＫ１６は２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントを運び、このことはＫａｔ Ｇの上流２Ｋｂ領域は含まれないこと、そしてカタラーゼ−ペルオキシダーゼだけでマイコバクテリアがＩＮＨに感受性になるのに十分であることを示している。
【００３４】
無細胞抽出物を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離し、ペルオキシダーゼとカタラーゼ活性に関して染色を行なった。これらの条件下で、結核菌酵素はペルオキシダーゼ活性の２つのバンドを示し（レーン１）、これはカタラーゼ活性と同時移動した（データは示さず；Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【００３５】
大腸菌中にＫａｔ Ｇ遺伝子を導入すると、同じ蛋白質の合成が行われるのに対して、ｐＹＺ５６は僅かに大きい蛋白質を産生した。これは、フレーム内のｌａｃ Ｚ：：Ｋａｔ Ｇ遺伝子融合の構成による。Ｍ．スメグマチスの細胞抽出物についても活性染色を実施した。ＢＨ１中の結核菌からのＫａｔ Ｇ遺伝子の存在はカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素の産生に導き、これは結核菌または大腸菌中に作られる酵素、およびＭ．スメグマチスの未変性ＨＰＩと電気泳動的に同じ移動度を示した。
【００３６】
結核菌中のＩＮＨ−抵抗性の基礎
ＩＮＨ−抵抗株のサブセット、とくに最高薬物濃度に抵抗性をもつものはモルモットに菌毒性が低く、またカタラーゼ活性を欠くことがずっと以前から知られていた。臨床的に分離したいくつかの結核菌からゲノムＤＮＡを調製し、４．５Ｋｂ ＫｐｎＩフラグメントをプローブとして用いることによってサウザーンブロッティングにより解析した。高度の抵抗性をもつ２つの株、Ｂ１４５３と２４の中で、カタラーゼ遺伝子がクロモソームから欠失していた。これに対して株１２のような低い抵抗性を示すものではそれがなお存在していたが発現はしていない。さらに付加して行なった研究からＫａｔ Ｇの直前の領域は転位し易いことがわかった（データは示さず）。
【００３７】
結核菌のＨＰＩは大腸菌をＩＮＨに対して感受性にさせる
結核菌のＨＰＩ酵素が大腸菌にＩＮＨ感受性を付与できるかどうかを明らかにするために、一連のカタラーゼ変異体をｐＹＺ５６でトランスフォームしてＭＩＣSを定量した。野生型株はＩＮＨ感受性でなかったが、内因性カタラーゼ活性を欠如する一方でｐＹＺ５６を包含する変異体は高濃度のＩＮＨ（５００μｇ／ｍｌ）の存在下では増殖阻害を示した。一方、トランスフォームしない株は非感受性であった。
【００３８】
本発明の目的のために、図５に示したプラスミド含有および制限エンドヌクレアーゼマップを、培養コレクション受入Ｎｏ．Ｉ−１２０９として１９９２年５月１８日に、フランス、パリー、パスツール研究所のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍの株中にｄｅｐｏｓｉｔした。このプラスミドは本発明の核酸配列、すなわちフラグメント中にＢａｍＨＩ開裂部位をもつプラスミドｐＹＺ５６の４．５Ｋｂ ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントを含んでいる。
【００３９】
一般的には、本発明は試料中のイソニアジド−抵抗性結核菌の存在を検出する方法を特徴としており、イソニアジド−抵抗性結核菌ＤＮＡと選択的にハイブリッド形成して検出可能な複合体を作れるようなＤＮＡまたはＲＮＡを少なくとも１つ用意することも含んでいる。検出はプローブが試料中に存在するイソニアジド−感受性結核菌ＤＮＡとハイブリッドを作ってハイブリッド複合体を形成し、試料中のイソニアジド−感受性結核菌の存在の表示としてハイブリッド複合体を検出できるような条件下で行なわれる（ここで用いた“選択的ハイブリッド形成”はイソニアジド−抵抗性結核菌とはハイブリッドを作らずにイソニアジド−感受性結核菌とだけハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡプローブを指している。）試料は結核菌細胞またはその細胞の一部または結核菌核酸、とくにＤＮＡを豊富に含む細胞成分から作ることができる。ハイブリダイゼーションは通常のハイブリダイゼーション試薬を用いて実施することができる。本発明にとって決定的であるような特定のハイブリダイゼーションの条件は何も見出されなかった。
【００４０】
より詳しくいえば、結核菌からのＤＮＡの配列はサウザーンブロッティングとハイブリダイゼーションによって解析できる。本発明で用いる方法についてはＭａｎｉａｔｉｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）に述べられている。ＤＮＡフラグメントはアガロースゲル上で分離できてその場所で変性される。ついでフラグメントはゲルから水不溶性固体、すなわちニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、または活性化セルロース紙のような多孔性の支持体に移され、そこで固定されるが、それにはたとえばＡｍｅｒｓｈａｍで発売しているＨｙｂｏｎｄTM膜が用いられる。プローブとの非特異的ハイブリダイゼーションを減らすためにプレハイブリダイゼーションしてのち、固体支持体を本発明の核酸プローブとハイブリッド形成させる。非結合と弱く結合したプローブを取除くために固体支持体を洗滌し、生成したハイブリッド二重複合分子をしらべる。代わりの便利なやり方はゲル中で変性したＤＮＡにオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させることである。
【００４１】
ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は標識の性質、フィルターに当然結合しうる標識プローブの量およびハイブリダイゼーションの厳密さに依存して大きく変化する。一般的には、固定化したＤＮＡへのプローブの結合の速度を促進させるために化学量論的量を大きく超える過量が用いられる。
【００４２】
種々の段階の厳密さをもつハイブリダイゼーションを用いることができる。条件が厳密であればあるほど、二重複合体形成のためのポリヌクレオチドとプローブ間のハイブリダイゼーションにとって要求される相補性はより大きくなる。ハイブリダイゼーションの厳しさは温度、プローブの濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間その他もろもろによって調節できる。都合よく、ハイブリダイゼーションの厳密さは反応溶液の極性を変えることによって変えられる。用いるべき温度は経験的に使用するか、またはこの目的のために開発された、よく知られた公式から決められる。
【００４３】
ＤＮＡフラグメントがアガロースゲルから固体支持体へ移されるサウザーンハイブリダイゼーションと異なり、本発明の方法は乾燥アガロースゲル中でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても実施することができる。この方法では、アガロースゲルを乾燥させ、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションをその位置で行なわせる。この方法は検出の速度と感度が望まれるときに推奨される。この方法は結核菌のゲノムまたはクローン化ＤＮＡを含むアガロースゲル上で実施することができる。
【００４４】
さらに、本発明の方法は結核菌ＤＮＡをポリアクリルアミドゲルからエレクトロブロッティングによってナイロンフィルターへ移すことによって実施することができる。時間が最も重要なときはエレクトロブロッティングが望ましいかもしれない、というのはエレクトロブロッティングはＤＮＡをアガロースゲルから移すために開発された毛細管ブロッティングよりも必まって早いからである。この方法はＵＶ−クロスリンキングと組み合わせて実施することができる。テストすべき試料を含むポリアクリルアミドゲルが、適当に調製されたナイロンフィルターと接触して置かれる。ついでこれらをエレクトロブロッティング装置の中にサンドイッチ状に入れ、ついで電流を用いてＤＮＡをゲルからフィルター上へ移す。緩衝液で洗滌後、フィルターをプレハイブリダイゼーションのために用意し、ついでハイブリッド形成またはＵＶ−クロスリンキングを行なわせる。
【００４５】
本発明の方法は、イソニアジドに抵抗性の結核菌を検出するための、本発明による核酸プローブを用いて実施することができる。プローブは通常の方法を用いて検出することができる。
【００４６】
本発明のヌクレオチドは結核菌の生物学的試料中のヌクレオチド配列の検出のためのプローブとして用いることができる。ポリヌクレオチドプローブは原子または無機遊離基、もっとも普通には放射性核種で標識することができるが、おそらく重金属でも標識できる。放射性標識の中には32Ｐ，3Ｈ，14Ｃまたは類似のものが含まれる。適当なシグナルを提供し十分な半減期をもつ放射性標識はどんなものでも用いることができる。その他の標識の中には、標識抗体、蛍光物質、化学ルミネッセンス体、酵素、抗体など標識リガンドや類似体に対する特異結合ペアメンバーとして働らきうるようなものが含まれる。標識の選択がどのようになされるかはハイブリダイゼーションの速度とＤＮＡまたはＲＮＡへの標識の結合に対する標識の効果によって決められる。標識が、ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡまたはＲＮＡの量を検出するのに十分な感度を提供することが必要である。
【００４７】
本発明の望ましい態様中では、プローブはたとえばニック−トランスレーションによって標識中に取みされ得るような、例えば32Ｐや125Ｉなどの放射性アイソトープで標識される。
他の望ましい態様においては、アビヂンがビオチンに結合しているとき、ハイブリッドＤＮＡ複合体の検出を可能にさせるような化学物質、たとえば蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）と結合体を作っているアビヂンと反応するところのビオチンでプローブを標識する。この蛍光団の存在によって、ハイブリッドＤＮＡ複合体を蛍光測定法によって検出することが可能となる；ビオチンに結合する化学物質が電子密度の高い化合物であれば電子顕微鏡によってハイブリッドＤＮＡ複合体の検出が可能である；抗体の場合は免疫学的に検出できる；あるいはカタラーゼ／基質対の一つは酵素学的に検出することができる。細菌をプローブと接触させる前に、結核菌を破壊してＤＮＡを溶出させ、ついでそれを変性させてニトロセルロース膜のような、適当な固体のＤＮＡ支持体上に固定させる。
【００４８】
プローブの標識を必要としないその他の検出法はいわゆるサンドイッチハイブリダイゼーション法である。このアッセイでは、１本鎖ベクター中に含まれる非標識プローブがイソニアジド−感受性結核菌ＤＮＡとハイブリッドを形成し、標識した、プローブを含まない１本鎖ベクターが、ハイブリッド複合体全体を標識しつつ、プローブを含むベクターとハイブリッド形成する。
【００４９】
本発明の配列はジデオキシヌクレオチド配列決定法から導かれた。ヌクレオチドの塩基配列は５′−−−−→３′の方向に書かれている。示した文字のそれぞれは以下のヌクレオチドについての通常の命名法によっている。
Ａ アデニン
Ｇ グアニン
Ｔ チミン
Ｃ サイトシン
【００５０】
本発明のヌクレオチドは、通常の化学合成法を用いてヌクレオシド間を３′−−−→５′リン酸結合生成によって作ることができる。たとえば、よく知られたホスホジエステル、ホスホトリエステル、およびホスファイトトリエステル法、ならびにこれらの方法の既知修飾法を用いることができる。デオキシリボヌクレオチドは、ホスホラミダイトアプローチを基礎としたような、自動合成マシンで調製することができる。オリゴ−およびポリリボヌクレオチドも通常の方法を用い、ＲＮＡリガーゼの助けをかりて得ることができる。
【００５１】
本発明のヌクレオチドは純粋状態にある。たとえば、これらのヌクレオチドはヒト血液由来の蛋白質、ヒト血清蛋白質、ウィルス蛋白質、これらの蛋白質をコードするヌクレオチド配列、ヒト組織、およびヒト組織成分を含んでいない。さらに、言えることはこれらのヌクレオチドは他の核酸、外来蛋白質や脂質、それに細菌やウィルスのような外来微生物を含まない。
【００５２】
もちろん本発明は、本発明のヌクレオチド配列の変異体または、本発明のプローブと同じ選択的ハイブリダイゼーションの性質を示す血清型変異体も含んでいる。
本発明のヌクレオチド配列はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られているＤＮＡ増幅プロセスで用いることができる。たとえばＳ．Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：１６９０−１６９４（１９８７）参照。ＰＣＲは迅速の故に好都合である。
【００５３】
増幅しようとするＤＮＡのプラスとマイナスストランドに相補的である部分から１０−３００塩基対だけ離れて位置する、既知配列のＤＮＡプライマー対は、オリゴヌクレオチド合成のためのよく知られた方法によって調製することができる。各プライマーの一方の端を伸ばすことができ、プライマーがＰＢＭＣ ＤＮＡにアニーリングするときに制限エンドヌクレアーゼ部位をつくるように修飾される。ＰＣＲ反応混合物が含み得るものは、ＰＢＭＣ ＤＮＡ、ＤＮＡプライマー対、４つのデオキシリボヌクレオシドトリリン酸、ＭｇＣｌ2、ＤＮＡポリメラーゼおよび通常の緩衝液である。ＤＮＡは何回にもわたるサイクルで増幅される。一般的には、サイクル回数を多くすることによって検出感度を増すことが可能であり、各サイクルは温度を上げて短時間ＰＢＭＣ ＤＮＡを変性させ、反応液を冷却し、ついでＤＮＡポリメラーゼで重合させることから成っている。
【００５４】
増幅した配列はオリゴマー制限（ＯＲ）と呼ばれている方法を用いて検出できる。Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１００８−１０１２（１９８５）およびＳＳＣＰ ＰＮＡＳ １９８５，Ｖｏｌ．８６，ｐ．２７６６−２７７０を参照。たとえば、増幅後、ＰＣＲ反応混合物の一部を分離してとり、32Ｐ標識アデノシントリリン酸末端−標識プローブのような、末端を標識したヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。ＯＲ中では、末端標識オリゴヌクレオチドプローブは溶液中で増幅配列領域にハイブリド形成し、そのプロセスで特異なエンドヌクレアーゼ部位を再構成する。こうして、標識プローブと増幅Ｋａｔ Ｇ配列のハイブリダイゼーションによって、選択的制限酵素切断に感受性の２本鎖ＤＮＡ形を生ずる。エンドヌクレアーゼで制限的に切断後、生成した試料をポリアクリルアミドゲル上で分析し、診断的に標識したフラグメントを有するゲルの１部のオートラジオグラムが得られる。オートラジオグラム中の診断的フラグメント（たとえば長さ１０−１５塩基）が見られたときはＰＢＭＣs中にＫａｔ Ｇ配列が存在することを示している。
【００５５】
もとのテンプレートとしてクロモソームＤＮＡの代りにＲＮＡを用いることによって検出感度を上げる可能性があるので、本発明ではここで述べたＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列を用いることを企てた。ＲＮＡは逆転写酵素によって相補的なＤＮＡに変換でき、そのあとＤＮＡ増幅させる。
【００５６】
実験法
細菌株とプラスミド
本発明で用いた細菌株とプラスミドの概略を表１に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
結核菌Ｈ３７ＲＶゲノムライブラリーがシャトルコスミドｐＹＵＢ１８（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）中に構成され、Ｄｒ．Ｗ．Ｒ．Ｊａｃｏｂｓの厚意により提供を受けた。使用したその他のシャトルベクターはｐＹＵＢ１２（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）とｐＢＡＫ１４（Ｚｈａｎｇｅｔ ａｌ．，１９９１）である。
【００５９】
微生物学的方法と酵素学
用いた抗生物質、増殖条件、酵素学およびＭＩＣ定量はＨｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）中で見ることができる。
【００６０】
核酸に関する方法
サブクローニング、サウザーンブロッティング、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチド生合成等に用いたのは標準プロトコールである（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｅｉｇｌｍｅｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
【００６１】
活性染色
大腸菌とマイコバクテリアの無細胞抽出物の調製は最近記載されている（Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。未変性蛋白試料はＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）が記載しているようなポリアクリルアミドゲル電気泳動法で調製した：但し以下の点はＬａｅｍｍｌｉと異なる。すなわち、すべての緩衝液からＳＤＳを取除き、試料を煮沸せず、そしてβ−メルカプトエタノールを試料緩衝液中に含めなかった。５０−１００μｇの蛋白質試料を７．５％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してのち、そのゲルをゆるく攪拌しながら３ｍＭ Ｈ2Ｏ2中に２０分間浸してカタラーゼ活性を検出した。等量の２％塩化第二鉄と２％第二鉄シアン化カリウムを加えると、光照射によってカタラーゼ活性を示す鮮明なバンドが現われる。ペルオキシダーゼ活性は、０．２−０．５ｍｇ／ｍｌジアミノベンヂジンと１．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2を含む溶液中にゲルを３０−１２０分間浸したのち褐色バンドとして検出される。
【００６２】
高度の毒性化合物をつくるための最も適当な方法は、結核菌ＨＰＩ酵素でペルオキシダーゼ作用的にＩＮＨを活性化することである（Ｙｏｕａｔｔ，１９６９；Ｇａｙａｔｈｒｉ−Ｄｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，１９７５）。ｋａｔ Ｇ遺伝子が分離されて特性が明らかになったので、同じようにして活性化され得るＩＮＨの新しい誘導体を作ることも可能なはずである。
【００６３】
引 用 文 献
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ｐＹＺ５６中に存在する挿入体の制限マップを示す。
【図２】結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼポリペプチドの部分配列およびＨＰＩ酵素との比較を示す。
【図３】組換え結核菌ペルオキシダーゼ／カタラーゼの発現を示す。
【図４】ＩＮＨ−抵抗株におけるカタラーゼ遺伝子の欠失を示す。
【図５】各種の制限酵素地図を示す。
【図６Ａ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌からの抽出物を示す。
【図６Ｂ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌からの抽出物を示す。
【図６Ｃ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌からの抽出物を示す。
【図７】コロニー数を示すグラフである。
【図８】サザーンブロット分析の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は１９９２年４月３０日に出願した通し番号Ｎｏ．８７５，９４０の一部継続出願である。本発明は抗生物質イソニアジドに抵抗性の結核菌株の迅速検出に関するものである。より詳しくいえば、本発明は核酸ハイブリダイゼーションにより結核菌中のイソニアジド抵抗性を検出する方法に関する。本発明はまた核酸プローブおよび核酸ハイブリダイゼーションを実施するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
結核の病原因子としてロベルド・コッホにより結核菌が発見されて以来一世紀以上にわたる研究にもかかわらず、結核は依然としてヒトの罹病率と死亡率の主要な原因の一つになっている。結核による死亡は毎年３００万人に達しており（Ｓｎｉｄｅｒ，１９８９）、これらの大半は発展途上国であるが西側でもホームレス人口の増加とＡＩＤＳ流行の影響によって結核は再び重要な問題となっている（非特許文献１：Ｃｈａｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２）。
【０００３】
イソニコチン酸ヒドラジド、すなわちイソニアジド（ＩＮＨ）は“結核”群−ヒト型結核菌、ウシ型結核菌およびＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍの菌種に対して強い薬効をもつことから過去４０年間結核の治療に用いられてきた（非特許文献２：Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，１９５２；Ｙｏｕａｔｔ，１９６９）。ＩＮＨの標的は正確にはわからないし、また作用機作も知られていないが、本剤の投与等よっていくつかの代謝系路が乱されることがわかっている。ＩＮＨがＮＡＤおよびピリドキサルリン酸の抗代謝体として作用するらしいことを示すたくさんの証拠があり（非特許文献３：Ｂｅｋｉｅｒｋｕｎｓｔ ａｎｄ Ｂｒｉｃｋｅｒ，１９６７；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ ａｎｄ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，１９７０；Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９６８，１９６９，１９７０）、またそのほか結核菌細胞壁の酸抵抗特性の原因となっているミコール酸の合成を本剤がブロックすることを示すデータがある（非特許文献４：Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ １９７０；Ｑｕｅｍａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＩＮＨが使用されるようになって間もなく、ＩＮＨ−抵抗性の結核菌分離菌が出現し、特性をしらべた結果カタラーゼ−パーオキシダーゼ活性がなくなり、モルモットで菌毒性が弱まっていることがわかった（非特許文献５：Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９５４；Ｋｕｂｉｃａ ｅｔ ａｌ．，１９６８；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ ａｎｄ Ｒａｍａ−Ｋｒｉｓｈｍａｎ，１９７０）。
【非特許文献１】Ｃｈａｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２
【非特許文献２】Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，１９５２；Ｙｏｕａｔｔ，１９６９
【非特許文献３】Ｂｅｋｉｅｒｋｕｎｓｔ ａｎｄ Ｂｒｉｃｋｅｒ，１９６７；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ ａｎｄ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，１９７０；Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９６８，１９６９，１９７０
【非特許文献４】Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ １９７０；Ｑｕｅｍａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１
【非特許文献５】Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９５４；Ｋｕｂｉｃａ ｅｔ ａｌ．，１９６８；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ ａｎｄ Ｒａｍａ−Ｋｒｉｓｈｍａｎ，１９７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ごく最近になって、結核菌の多剤抵抗（ＭＤＲ）変種によるＵＳＡでの結核の流行（ＣＤＣ，１９９０；１９９１ａ，ｂ）ならびにこれら変異株がＨＩＶ−感染者とヘルスケア従事者の広範な院内感染の原因になっていることがわかったことから、ＩＮＨ−抵抗性の問題は新しい重要性をもつに至った（Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２）。この問題の重要性にかんがみ、ＩＮＨ抵抗性とカタラーゼ−ペルオキシダーゼ産生の関連をはっきりさせる必要がある。
【０００５】
より詳しくいえば、薬剤感受性に含まれる分子機構を知る必要がある。加えて、ＩＮＨ−抵抗株を迅速に同定することのできる簡単な試験法を開発する必要がある。さらに、このような試験法を実施するための試薬を作ることが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明はイソニアジドに抵抗性の結核菌細胞の存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するプロセスを提供することによって上述の諸要求を満たすことについて手助けする。そのプロセスは以下の段階から成る：
（Ａ） 細胞の核酸を沈着、固定してそれがプローブに近接できるようにする；
（Ｂ） ステップ（Ａ）から得られた固定化核酸をハイブリダイゼーションのできる条件下でプローブと接触させる；
（Ｃ） ステップ（Ｂ）からのフィルターを洗滌してハイブリッド形成しなかったプローブをすべて除去する；ついでそのあと
（Ｄ） ステップ（Ｃ）から得られた洗滌済みフィルター上のハイブリッド形成したすべてのプローブを検出する。
【０００７】
そのプローブはプラスミドｐＹＺ５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント中に存在する核酸配列を含んでおり、そのフラグメントの中にはＢａｍＨＩ開裂部位が含まれる。このフラグメントはイソニアジド−感受性結核菌の細胞内ＤＮＡと会合することがわかっており、このような抗生物質感受性の微生物を、以下に述べる条件下でこのフラグメントとハイブリッド形成するＤＮＡを含まないような、イソニアジド−抵抗性結核菌と区別することができる。
【０００８】
さらに本発明は、イソニアジド−抵抗性細胞からのＤＮＡには存在しないイソニアジド感受性を付与する結核菌のＫａｔ Ｇ遺伝子領域をコードするところの、イソニアジド−抵抗性結核菌のヌクレオチド配列−ＲＮＡやＤＮＡのような−も用意する。
本発明は、本発明のヌクレオチド配列に結合した、核種のような、標識から成るプローブも用意する。
【０００９】
さらに本発明は、本発明のヌクレオチド配列が、ＤＮＡやＲＮＡのような、相補的な塩基配列のヌクレオチド配列と水素結合したものから成るハイブリッド二重複合分子を用意する。
また、本発明は結核菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子、またはこのようなヌクレオチド配列の一部分をコードするヌクレオチド配列を一群のヌクレオチド配列から選択するためのプロセスも用意しており、これはどのヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成するかを決めるステップから成っている。そのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列か、またはＲＮＡ配列かである。そのプロセスはヌクレオチド配列上の標識を検出するステップを含んでいる。
【００１０】
さらに、本発明はイソニアジドに抵抗性の結核菌の検出のためのキットを用意している。そのキットは、プラスミドｐＹＺ５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントで、その中にＢａｍＨＩ開裂部位を含むところのヌクレオチド配列を包含するプローブを含む容器一式から成る。そのキットは核酸の対照調製物を含む容器一式も含んでいる。
【００１１】
本発明はまた酵素カタラーゼ、または類似の酵素がイソニアジドに作用して生じた生成物として得られた化合物をも包含する。Ｋａｔ Ｇ遺伝子または同様の活性を保持する誘導体はカタラーゼ蛋白質のソースとして使用することができる。新化合物はＩＳＢＮ Ｎ°０９９５−２４５４、パスツール研究所により編集されたＨ．Ｄａｖｉｄらの“マイコバクテリア臨床のための実験室の方法”に述べられているようなアンチバイオグラム法を用いて、ＩＮＨ−抵抗性結核菌株に対する反応性により選別される。
【００１２】
図の簡単な説明
本発明は以下の図を引用することによりさらに一層詳しく記述されるであろうし、それらはつぎの如くである：
図１（Ａ）はシャトルコスミドｐＢＨ４中でクローン化した結核菌ＤＮＡのフィジカルマップである。Ｃ１ａＩ（Ｃ）、ＮｏｔＩ（Ｎ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）に対する制限部位を示してある。ＤｒａＩとＡｓｎＩに対する制限部位は見出されておらず、コスミドは結核菌中に記載されている付加的既知遺伝子または挿入配列のいずれも有していない。Ｋａｔ Ｇ遺伝子の位置とスケールバーを示す。
【００１３】
図１（Ｂ）はｐＹＺ５６中に存在する挿入体の制限マップであり、Ｋａｇの位置と転写の方向を示している。
図２は結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼポリペプチドの部分配列および大腸菌とＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＨＰＩ酵素との比較である。同じ残基は＊で示してある。
図３は活性染色による組換え結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼの検出を示す。細胞抽出物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ペルオキシダーゼ（レーン１−５）とカタラーゼ活性に関して染色した。試料は結核菌からがレーン１；大腸菌ＴＧ１，レーン２，６；ＴＧ１／ｐＹＺ５６（Ｋａｔ Ｇ+），レーン３と７；ＴＧ１／ｐＢＡＫ１６（ｌａｃＺ′：：ＫａｔＧ），レーン４と８；ＴＧ１／ｐＹＺ５６（１．４Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラグメントを欠失したｐＹＺ５５と同じ）。
【００１４】
図４は４．５ＫｂのＫｐｎＩフラグメントをプローブとして用いての種々の結核菌株のサウザーンブロット分析の結果を示す。ＫｐｎＩで切断したゲノムＤＮＡはＨ３７ＲＶ株からのものがレーン１；株１２，レーン２；Ｂ１４５３，レーン３；株２４，レーン４；７９１１２，レーン５；１２６４６，レーン６；７９６６５，レーン７。株Ｂ１４５３と２４は高濃度のＩＮＨに抵抗性、株１２は低濃度のＩＮＨに抵抗性であるのに対してその他はＩＮＨ感受性である。対照として、同じブロットをｓｏｄＡ遺伝子に対するプローブとハイブリッドさせた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。Ｂ１４５３と関連したＩＳ６１１０−仲介多型現象に注目のこと。
【００１５】
図５はＩＮＨ−抵抗性Ｍ．スメグマの株を示し、ＢＨ１11（ｍｃ2−１５５10株の誘導体）は結核菌Ｈ３７ＲＶシャトルコスミド（ニューヨークのＷ．Ｒ．Ｊａｃｏｂ博士より提供された）のプールでトランスフォームし、それぞれのクローンをＩＮＨ−感受性に関して数をかぞえた。コスミドｐＢＨ４は終始一貫して薬剤感受性を付与し、トランスフォーマントはカタラーゼを過剰産生した（Ｈｅｙｍ中としてアッセイした）。ｐＢＨ４からのＤＮＡ挿入体の制限マップをｐＹＺ５５からの挿入体のマップと並べて示してある。このｐＹＺ５５は結核菌Ｈ３７ＲＶのＫａｔ Ｇを含むプラスミドで、大腸菌ＨＰＩの保存領域からのアミノ酸配列とマッチするように計画されたつぎのようなオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを基礎に分離されたものである：
【００１６】
（５′−ＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣ−３′）。以下の酵素に対する制限部位が示されている：Ｂ，ＢａｍＨ１；Ｃ，Ｃａｌ；Ｅ，ＥｃｏＲＶ；Ｈ，Ｈｉｎｄ１１１，Ｋ，Ｋｐｎ１；Ｍ，Ｓｍａｌ；Ｎ，Ｎｏｔｌ；Ｒ，ＥｃｏＲ１；Ｓ，Ｓａｃ１．ｐＹＺ５５からの４．５Ｋｂの挿入体を含むマイコバクテリアシャトルプラスミド，ＰＢＡＫ１４，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，によるＢＨ１のトランスフォーメーションは同じようにＩＮＨ−感受性を供与する。ＭＩＣ′ＳもまたｐＹＺ５５から導出されたサブフラグメントでトランスフォームされたＢＨ１に関して示され、１つ（＋）または他の（−）配位でｐＢＡＫ１４中に挿入される。Ｋａｔ Ｇ遺伝子およびＩＮＨ−感受性を供与する能力の両方とも２．９Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−Ｋｐｎ１フラグメント（ｐＢＡＫ−ＫＥ+）にマップされた。
【００１７】
図６は前に記載した活性ゲル分析18のために調製した種々のプラスミド構造によってトランスフォームした結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌からのそれを示す。Ｗａｙｎｅ ａｎｄ Ｄｉａｚ19により記載されたように、８％ポリアクリルアミドを含む非変性ゲルがカタラーゼ（パネルＡ）とペルオキシダーゼ（パネルＢ）活性に対して染色された。レーン１，結核菌Ｈ３７ＲＶ；２，大腸菌ＵＭ２（Ｋａｔ Ｅ，Ｋａｔ Ｇ，ｒｅｆ．１５）；３，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５５；４，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５６（図１中のｐＢＡＫ−ＫＥ+に対応する、ｐＵＣ１９中の２．９Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−Ｋｐｎ１フラグメント）；５，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５７（図１中のｐＢＡＫ−ＫＢ+に対応する、ＢａｍＨ１−Ｋｐｎ１欠失を有するｐＹＺ５５）。これらの条件下で結核菌カタラーゼとペルオキシダーゼ活性は２つのバンドとして移動した（レーン１）；同じパターンがｐＹＺ５５で発現した組換え酵素についてみられた（レーン３）。ｐＹＺ５６（レーン４）は、パネルＣに示したベクターからのＫａｔ Ｇとｌａｃ Ｚ′の間への融合によって分子量の増大した蛋白質を発現する。パネルＣも大腸菌ＨＰ１をもった部分配列の並びを示す（遺伝子の完全配列はどこかで発表されるであろう）。
【００１８】
図７はＫａｔ ＧとＫａｔ Ｅ（ＵＭ２，ｒｅｆ．１５）両方に突然変異を有する大腸菌株で、これはＰＵＣ１９ベクターだけ（ハッチしたバー）、結核菌Ｋａｔ Ｇを発現するｐＹＺ５５（白色バー）、および結核菌Ｋａｔ Ｇを多量に発現するｐＹＺ５６（黒バー）でトランスフォームされたものである。適当量の抗生物質を加えたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブイヨン中で終夜培養したものを種々の濃度のＩＮＨの存在下でプレートし、コロニー生成ユニットを数えた。典型的な実験の結果を３重試料での標準偏差を示す誤差バーとともに示す。結核菌Ｋａｔ Ｇの過剰発現は同様に大腸菌ＵＭ２５５中で高濃度のＩＮＨに対して感受性を付与したが（Ｋａｔ Ｇ，Ｋａｔ Ｅ，Ｍｕｌｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、大腸菌ＴＧ１のようなカタラーゼ陽性株に対しては作用しなかった。いくつかの実験において、高濃度のＩＮＨはＵＭ２とＵＭ２５５だけの増殖に対して検出できる阻害作用を示したが、すべての実験でｐＹＺ５６−トランスフォーマントの阻害は対応するベクター対照で観察された阻害よりも少なくとも１０−１００倍大きかった。
【００１９】
図８は、異なる結核菌株からＫｐｎ１で切断し、（Ａ）Ｋａｔ Ｇ（４．５Ｋｂ Ｋｐｎ１フラグメント）、および（Ｂ）ＳＯＤ遺伝子（１．１Ｋｂ ＥｃｏＲ１−Ｋｐｎ１フラグメント，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）でプローブしたゲノムＤＮＡを用いて調製したサウザーンブロットを示す。プローブの標識とブロットのプロセッシングは前に記載した16とおりに実施した。レーン１，Ｈ３７ＲＶ；２，株１２−ＭＩＣ １．６μｇ／ｍ１１ＮＨ；３，Ｂ１４５３−ＭＩＣ＞５０μｇ／ｍｌ ＩＮＨ20；４，株２４−ＭＩＣ＞５０μｇ／ｍｌ ＩＮＨ；５，７９１１２−ＩＮＨ−感受性21；６，１２６４６−ＩＮＨ−感受性21；７，７９６６５−ＩＮＨ−感受性21。ＩＮＨ感受性は異なるＩＮＨ濃度を含むＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ ｓ ｏｐｅｓの播種によって確認した。
【００２０】
好ましい態様の詳細な記述
米国で最近多剤抵抗性を示す多数の結核菌株が出現したことは最も驚くべき出来事であり、これはこの菌の並はずれて強い接触感受性による。この危険はいくつかの小さな結核流行域についてはっきりと示されていて、そこではＭＤＲ結核菌に感染した１人の患者がＨＩＶ陽性の刑務所看守と健常な看護スタッフ両方に感染させた（ＣＤＣ１９９０，１９９１；Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２）。ＨＩＶの流行が世界的な拡がりを見せている現状の重大さからみて、西側のＡＩＤＳ患者がアフリカの患者のようにＭＤＲ結核菌株（トリ結核菌／細胞内マイコバクテリウム複合体よりもむしろ）に感染したとすれば、この病気が世界的な規模で伝播するだろうと予測される。
イソニアジド（ＩＮＨ）はマイコバクテリアの結核菌群−ヒト結核菌、ウシ結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ−に対して特に強力な殺菌作用をもつ薬剤であり、結核の治療に特別な効力を発揮してきている。標準的な抗結核治療方式は一般にはＩＮＨとリファンピシンを与えるが、しばしばもっと弱い薬であるピラジナミド、エタンブトールまたはストレプトマイシンとの組み合わせが用いられる。治療に用いるほかにＩＮＨは予防の方法として患者と直接に接触する人達に対しても投与される。
【００２１】
ヒトの病気の原因物質であるヒト結核菌のＩＮＨ−抵抗変異体は２つのレベルの抵抗性を示す：すなわち低（１〜１０μｇ／ｍｌ）と高（１０〜１００μｇ／ｍｌ）である。ＩＮＨ−抵抗性はしばしばカタラーゼ活性および菌毒性の消失を伴う。最近、ＡＩＤＳの流行とホームレスの増大や社会条件の悪化によって、先進諸国とくに米国において結核が重大な公衆衛生上の問題として再び現われてきた。今日におけるこの病気の恐るべき一面は多剤薬剤に抵抗性の細菌の出現とヘルスケア従事者やＨＩＶ−感染患者への急速な院内感染である。このためＣＤＣは多剤抵抗株（少くともＩＮＨとリファンピシン）の処置と伝染予防に関する新しい勧告を提起した。ＩＮＨ−抵抗性の問題に新しい見通しを得るとともに迅速な診断テスト法を開発するために以下の研究が行われた。
当然のこととして、必須なことは主な抗結核薬であるＩＮＨとリファンピシンに対する抵抗性のメカニズムを明らかにすることであり、それによって開発すべき新しい化学療法上の戦略が立てられ、ＭＤＲ株を抑える新化合物の計画が可能になる。
【００２２】
本発明は以上のものとしてカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素、ＨＰＩ、が有効であることを証明しており、この酵素単独で毒性を仲介するものと考えている。このような結論を支持する証拠として以下のことが挙げられる。すなわち、大腸菌のカタラーゼ陰性変異体中の結核菌Ｋａｔ Ｇ遺伝子の発現によってこの細菌がＩＮＨ感受性になるということである。さらに、結核菌ＩＮＨ−感受性遺伝子、Ｋａｔ Ｇの分離は、ハイブリダイゼーションとＰＣＲを用いたアプローチによってＩＮＨ−抵抗性株の迅速な検出を容易にするという点で重要である。臨床株中にＫａｔ Ｇ欠失が高頻度でみられることは、ここに示すように、この手続きを簡単化する。
【００２３】
ＩＮＨ−感受性中に含まれる結核菌遺伝子の同定
ＩＮＨ−感受性中に含まれる結核菌遺伝子を分離するのに一つの異種的アプローチを用いた。ＢＨ１は容易にトランスフォームするスメグマ菌株ＭＣ2１５５の偶発変異体であり（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、５１２μｇ／ｍｌのＩＮＨに抵抗性でカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を欠いている（Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＩＮＨ−感受性とこれらの酵素の活性との間には厳密な相関関係があるので、結核菌からの適当な遺伝子を運ぶプラスミドによるＢＨ１のトランスフォーメーションは、それらの回復と同時に起こるＩＮＨ−抵抗性に導くべきである。
したがって、ＤＮＡを大腸菌中の結核菌シャトルコスミドのプールから調製し、ついでエレクトロ−トランスフォーメーションによってＢＨ１中に導入した。すると１０００以上のカナマイシン−抵抗性トランスフォーマントがＩＮＨ−抵抗性に関して数えられ、３２ｇ／ｍｌのＩＮＨを含む培地上で増殖できない４つのクローン、すなわち野生型ＭＣ2１５５からのＭＩＣが得られた。
【００２４】
ＢＨ１を再トランスフォーメーションしてのち、これらのうちのたった１つ、ｐＢＨ４だけが終始一貫してＩＮＨ−感受性表現型を付与した。制限酵素ＢａｍＨＩ，ＫｐｎＩ，ＮｏｔＩ，ＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断によってｐＢＨ４によって運ばれるクロモソームＤＮＡの大きさは約３０Ｋｂであることがわかった。上記の酵素のうちの終りの方の３つによって生じたマップを図１に示した。
【００２５】
ｐＢＨ４をハイブリダイゼーションプローブとして用いてライブラリー中の相同クローンを検出したところ、さらに８つのシャトルコスミドが分離された。ＢＨ１へのトランスフォーメーションによって、これらのうちの５つ（Ｔ３５，Ｔ６４６，Ｔ６７３，Ｔ７９，Ｔ５５６）がＩＮＨ−抵抗性を取り戻してｐＢＨ４と類似の制限プロフィルを示した（データは示さず）。とくに、４．５ＫｂのＫｐｎＩフラグメントはすべての場合に存在していた。
【００２６】
個々のＢａｍＨＩフラグメントをサブクローンすることを試みたが、ＢＨ１中の傷害を補足して完全にすることのできるトランスフォーマントは生じなかったことから、ＢａｍＨＩ部位は興味ある遺伝子の中に位置すると示唆された。それとは逆に、ｐＢＨ４の誘導体であるｐＢＨ５はＥｃｏＲＩフラグメントの欠失によって作り上げられ、このことはＩＮＨ−感受性の回復のためには７Ｋｂフラグメントは必要でないことを示している。
【００２７】
ＢＨ１のＩＮＨ−抵抗性変異と相補的であるシャトルコスミドを包含するトランスフォーマントを注意深くしらべて、いくつかの抗生物質に対するＭＩＣSを確立した。すべての場合に、ＩＮＨに関するＭＩＣは５１２から８μｇ／ｍｌへ減少し、これは感受性株ＭＣ2１５５（３２μｇ／ｍｌ）の値よりも低い。このような過剰感受性表現型は組換えクローンがＩＮＨ−毒性を強化する能力をもつ酵素を過剰産生したかもしれないことを示唆している。酵素学的研究から、これらのトランスフォーマントはすべてＩＮＨ−感受性である野生型ＭＣ2１５５株よりも約２倍多いペルオキシダーゼとカタラーゼを産生することがわかった（データは示さず）。
【００２８】
結核菌のＭＤＲ株の多くのものが、ＩＮＨだけでなくリファンピシン、ストレプトマイシン、エタンブトールおよびピラジンアミドに対して感受性を失っている。ＩＮＨとこれらの化合物に対する抵抗性の間に相関関係があるかもしれないという可能生をしらべるために、種々のＭ．スメグマチス株と、それらのｐＢＨ４トランスフォーマントに対するいくつかの薬剤のＭＩＣSを決定したが、なんらの差異は見出されなかった。
【００２９】
結核菌カタラーゼ遺伝子のクローニング
大腸菌（Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）およびバチルスｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）のカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素中の高度保存領域の一次配列をもとに４５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブをデザインした。結核菌ＤＮＡのゲノムブロットをこのオリゴヌクレオチドでプローブすることによって、ほとんどの場合に特異なバンドが検出された。ＫｐｎＩは強くハイブリッド形成する４．５Ｋｂのユニークなフラグメントを生成したので、この酵素をＰＵＣ１９中の大きさで選択するライブラリーを作るのに用いた。
【００３０】
そのオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることによって、適当なクローン、ｐＹＺ５６が得られた。挿入ＤＮＡの制限マップを図１に示したが、これはｐＢＨ４の部分に正確に対応することがわかる。クロス−ハイブリダイゼーションによっても独立に確認された。
【００３１】
いくつかのサブクローニングの実験によって大腸菌中の結核菌カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を発現する最小フラグメントは２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントであることがわかり、これは予期したように、ＢａｍＨＩに対する開裂部位を含んでいた。部分ＤＮＡ配列解析から、ｐＹＺ５６によって運ばれるＫａｔ Ｇ遺伝子は大腸菌およびＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＨＰＩ酵素に極めて相同なカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素をコードすることがわかった。
【００３２】
結核菌 ＡＰＬＮＳＷＰＤＮＡＳＬＤＫＡＲＲＬＬＷＰＳＫＫＫＹＧＫＫＬＳＷ
ＡＤＬＩＶ
大腸菌 ＊＊＊＊＊＊＊＊＊Ｖ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊Ｉ＊Ｑ＊＊＊Ｑ＊Ｉ＊＊
＊＊＊ＦＩ
Ｂ．ｓｔｅａｒｏ−
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊Ｎ＊＊＊＊＊＊Ｃ＊ＧＲ＊＊
ＲＮＴ＊Ｔ＊−＊ＬＧＰＩＣＳ
（図２；Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８）；（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）．同じ残基を＊で示した。ＨＰＩ活性は染色により大腸菌、Ｍ．スメグマチスいずれについても検出された（以下を見よ）。
【００３３】
ＩＮＨ−感受性中にカタラーゼ−ペルオキシダーゼが含まれる
結核菌Ｋａｔ Ｇ遺伝子をクローン化したので、カタラーゼ−陰性とイソニアジド抵抗性の相関関係の遺伝的基礎をしらべることが緊急の関心事であった。一連の構成をシャトルベクターｐＢＡＫ１４中に確立し、ＩＮＨ−抵抗Ｍ．スメグマチス変異体ＢＨ１をトランスフォームするのに用いた。完全なＫａｔ Ｇ遺伝子を運んでいるプラスミドのみがＨＰＩを産生してＩＮＨ−感受性を取り戻した。これらのうちの最小のｐＢＡＫ１６は２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントを運び、このことはＫａｔ Ｇの上流２Ｋｂ領域は含まれないこと、そしてカタラーゼ−ペルオキシダーゼだけでマイコバクテリアがＩＮＨに感受性になるのに十分であることを示している。
【００３４】
無細胞抽出物を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離し、ペルオキシダーゼとカタラーゼ活性に関して染色を行なった。これらの条件下で、結核菌酵素はペルオキシダーゼ活性の２つのバンドを示し（レーン１）、これはカタラーゼ活性と同時移動した（データは示さず；Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【００３５】
大腸菌中にＫａｔ Ｇ遺伝子を導入すると、同じ蛋白質の合成が行われるのに対して、ｐＹＺ５６は僅かに大きい蛋白質を産生した。これは、フレーム内のｌａｃ Ｚ：：Ｋａｔ Ｇ遺伝子融合の構成による。Ｍ．スメグマチスの細胞抽出物についても活性染色を実施した。ＢＨ１中の結核菌からのＫａｔ Ｇ遺伝子の存在はカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素の産生に導き、これは結核菌または大腸菌中に作られる酵素、およびＭ．スメグマチスの未変性ＨＰＩと電気泳動的に同じ移動度を示した。
【００３６】
結核菌中のＩＮＨ−抵抗性の基礎
ＩＮＨ−抵抗株のサブセット、とくに最高薬物濃度に抵抗性をもつものはモルモットに菌毒性が低く、またカタラーゼ活性を欠くことがずっと以前から知られていた。臨床的に分離したいくつかの結核菌からゲノムＤＮＡを調製し、４．５Ｋｂ ＫｐｎＩフラグメントをプローブとして用いることによってサウザーンブロッティングにより解析した。高度の抵抗性をもつ２つの株、Ｂ１４５３と２４の中で、カタラーゼ遺伝子がクロモソームから欠失していた。これに対して株１２のような低い抵抗性を示すものではそれがなお存在していたが発現はしていない。さらに付加して行なった研究からＫａｔ Ｇの直前の領域は転位し易いことがわかった（データは示さず）。
【００３７】
結核菌のＨＰＩは大腸菌をＩＮＨに対して感受性にさせる
結核菌のＨＰＩ酵素が大腸菌にＩＮＨ感受性を付与できるかどうかを明らかにするために、一連のカタラーゼ変異体をｐＹＺ５６でトランスフォームしてＭＩＣSを定量した。野生型株はＩＮＨ感受性でなかったが、内因性カタラーゼ活性を欠如する一方でｐＹＺ５６を包含する変異体は高濃度のＩＮＨ（５００μｇ／ｍｌ）の存在下では増殖阻害を示した。一方、トランスフォームしない株は非感受性であった。
【００３８】
本発明の目的のために、図５に示したプラスミド含有および制限エンドヌクレアーゼマップを、培養コレクション受入Ｎｏ．Ｉ−１２０９として１９９２年５月１８日に、フランス、パリー、パスツール研究所のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍの株中にｄｅｐｏｓｉｔした。このプラスミドは本発明の核酸配列、すなわちフラグメント中にＢａｍＨＩ開裂部位をもつプラスミドｐＹＺ５６の４．５Ｋｂ ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントを含んでいる。
【００３９】
一般的には、本発明は試料中のイソニアジド−抵抗性結核菌の存在を検出する方法を特徴としており、イソニアジド−抵抗性結核菌ＤＮＡと選択的にハイブリッド形成して検出可能な複合体を作れるようなＤＮＡまたはＲＮＡを少なくとも１つ用意することも含んでいる。検出はプローブが試料中に存在するイソニアジド−感受性結核菌ＤＮＡとハイブリッドを作ってハイブリッド複合体を形成し、試料中のイソニアジド−感受性結核菌の存在の表示としてハイブリッド複合体を検出できるような条件下で行なわれる（ここで用いた“選択的ハイブリッド形成”はイソニアジド−抵抗性結核菌とはハイブリッドを作らずにイソニアジド−感受性結核菌とだけハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡプローブを指している。）試料は結核菌細胞またはその細胞の一部または結核菌核酸、とくにＤＮＡを豊富に含む細胞成分から作ることができる。ハイブリダイゼーションは通常のハイブリダイゼーション試薬を用いて実施することができる。本発明にとって決定的であるような特定のハイブリダイゼーションの条件は何も見出されなかった。
【００４０】
より詳しくいえば、結核菌からのＤＮＡの配列はサウザーンブロッティングとハイブリダイゼーションによって解析できる。本発明で用いる方法についてはＭａｎｉａｔｉｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）に述べられている。ＤＮＡフラグメントはアガロースゲル上で分離できてその場所で変性される。ついでフラグメントはゲルから水不溶性固体、すなわちニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、または活性化セルロース紙のような多孔性の支持体に移され、そこで固定されるが、それにはたとえばＡｍｅｒｓｈａｍで発売しているＨｙｂｏｎｄTM膜が用いられる。プローブとの非特異的ハイブリダイゼーションを減らすためにプレハイブリダイゼーションしてのち、固体支持体を本発明の核酸プローブとハイブリッド形成させる。非結合と弱く結合したプローブを取除くために固体支持体を洗滌し、生成したハイブリッド二重複合分子をしらべる。代わりの便利なやり方はゲル中で変性したＤＮＡにオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させることである。
【００４１】
ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は標識の性質、フィルターに当然結合しうる標識プローブの量およびハイブリダイゼーションの厳密さに依存して大きく変化する。一般的には、固定化したＤＮＡへのプローブの結合の速度を促進させるために化学量論的量を大きく超える過量が用いられる。
【００４２】
種々の段階の厳密さをもつハイブリダイゼーションを用いることができる。条件が厳密であればあるほど、二重複合体形成のためのポリヌクレオチドとプローブ間のハイブリダイゼーションにとって要求される相補性はより大きくなる。ハイブリダイゼーションの厳しさは温度、プローブの濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間その他もろもろによって調節できる。都合よく、ハイブリダイゼーションの厳密さは反応溶液の極性を変えることによって変えられる。用いるべき温度は経験的に使用するか、またはこの目的のために開発された、よく知られた公式から決められる。
【００４３】
ＤＮＡフラグメントがアガロースゲルから固体支持体へ移されるサウザーンハイブリダイゼーションと異なり、本発明の方法は乾燥アガロースゲル中でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても実施することができる。この方法では、アガロースゲルを乾燥させ、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションをその位置で行なわせる。この方法は検出の速度と感度が望まれるときに推奨される。この方法は結核菌のゲノムまたはクローン化ＤＮＡを含むアガロースゲル上で実施することができる。
【００４４】
さらに、本発明の方法は結核菌ＤＮＡをポリアクリルアミドゲルからエレクトロブロッティングによってナイロンフィルターへ移すことによって実施することができる。時間が最も重要なときはエレクトロブロッティングが望ましいかもしれない、というのはエレクトロブロッティングはＤＮＡをアガロースゲルから移すために開発された毛細管ブロッティングよりも必まって早いからである。この方法はＵＶ−クロスリンキングと組み合わせて実施することができる。テストすべき試料を含むポリアクリルアミドゲルが、適当に調製されたナイロンフィルターと接触して置かれる。ついでこれらをエレクトロブロッティング装置の中にサンドイッチ状に入れ、ついで電流を用いてＤＮＡをゲルからフィルター上へ移す。緩衝液で洗滌後、フィルターをプレハイブリダイゼーションのために用意し、ついでハイブリッド形成またはＵＶ−クロスリンキングを行なわせる。
【００４５】
本発明の方法は、イソニアジドに抵抗性の結核菌を検出するための、本発明による核酸プローブを用いて実施することができる。プローブは通常の方法を用いて検出することができる。
【００４６】
本発明のヌクレオチドは結核菌の生物学的試料中のヌクレオチド配列の検出のためのプローブとして用いることができる。ポリヌクレオチドプローブは原子または無機遊離基、もっとも普通には放射性核種で標識することができるが、おそらく重金属でも標識できる。放射性標識の中には32Ｐ，3Ｈ，14Ｃまたは類似のものが含まれる。適当なシグナルを提供し十分な半減期をもつ放射性標識はどんなものでも用いることができる。その他の標識の中には、標識抗体、蛍光物質、化学ルミネッセンス体、酵素、抗体など標識リガンドや類似体に対する特異結合ペアメンバーとして働らきうるようなものが含まれる。標識の選択がどのようになされるかはハイブリダイゼーションの速度とＤＮＡまたはＲＮＡへの標識の結合に対する標識の効果によって決められる。標識が、ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡまたはＲＮＡの量を検出するのに十分な感度を提供することが必要である。
【００４７】
本発明の望ましい態様中では、プローブはたとえばニック−トランスレーションによって標識中に取みされ得るような、例えば32Ｐや125Ｉなどの放射性アイソトープで標識される。
他の望ましい態様においては、アビヂンがビオチンに結合しているとき、ハイブリッドＤＮＡ複合体の検出を可能にさせるような化学物質、たとえば蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）と結合体を作っているアビヂンと反応するところのビオチンでプローブを標識する。この蛍光団の存在によって、ハイブリッドＤＮＡ複合体を蛍光測定法によって検出することが可能となる；ビオチンに結合する化学物質が電子密度の高い化合物であれば電子顕微鏡によってハイブリッドＤＮＡ複合体の検出が可能である；抗体の場合は免疫学的に検出できる；あるいはカタラーゼ／基質対の一つは酵素学的に検出することができる。細菌をプローブと接触させる前に、結核菌を破壊してＤＮＡを溶出させ、ついでそれを変性させてニトロセルロース膜のような、適当な固体のＤＮＡ支持体上に固定させる。
【００４８】
プローブの標識を必要としないその他の検出法はいわゆるサンドイッチハイブリダイゼーション法である。このアッセイでは、１本鎖ベクター中に含まれる非標識プローブがイソニアジド−感受性結核菌ＤＮＡとハイブリッドを形成し、標識した、プローブを含まない１本鎖ベクターが、ハイブリッド複合体全体を標識しつつ、プローブを含むベクターとハイブリッド形成する。
【００４９】
本発明の配列はジデオキシヌクレオチド配列決定法から導かれた。ヌクレオチドの塩基配列は５′−−−−→３′の方向に書かれている。示した文字のそれぞれは以下のヌクレオチドについての通常の命名法によっている。
Ａ アデニン
Ｇ グアニン
Ｔ チミン
Ｃ サイトシン
【００５０】
本発明のヌクレオチドは、通常の化学合成法を用いてヌクレオシド間を３′−−−→５′リン酸結合生成によって作ることができる。たとえば、よく知られたホスホジエステル、ホスホトリエステル、およびホスファイトトリエステル法、ならびにこれらの方法の既知修飾法を用いることができる。デオキシリボヌクレオチドは、ホスホラミダイトアプローチを基礎としたような、自動合成マシンで調製することができる。オリゴ−およびポリリボヌクレオチドも通常の方法を用い、ＲＮＡリガーゼの助けをかりて得ることができる。
【００５１】
本発明のヌクレオチドは純粋状態にある。たとえば、これらのヌクレオチドはヒト血液由来の蛋白質、ヒト血清蛋白質、ウィルス蛋白質、これらの蛋白質をコードするヌクレオチド配列、ヒト組織、およびヒト組織成分を含んでいない。さらに、言えることはこれらのヌクレオチドは他の核酸、外来蛋白質や脂質、それに細菌やウィルスのような外来微生物を含まない。
【００５２】
もちろん本発明は、本発明のヌクレオチド配列の変異体または、本発明のプローブと同じ選択的ハイブリダイゼーションの性質を示す血清型変異体も含んでいる。
本発明のヌクレオチド配列はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られているＤＮＡ増幅プロセスで用いることができる。たとえばＳ．Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：１６９０−１６９４（１９８７）参照。ＰＣＲは迅速の故に好都合である。
【００５３】
増幅しようとするＤＮＡのプラスとマイナスストランドに相補的である部分から１０−３００塩基対だけ離れて位置する、既知配列のＤＮＡプライマー対は、オリゴヌクレオチド合成のためのよく知られた方法によって調製することができる。各プライマーの一方の端を伸ばすことができ、プライマーがＰＢＭＣ ＤＮＡにアニーリングするときに制限エンドヌクレアーゼ部位をつくるように修飾される。ＰＣＲ反応混合物が含み得るものは、ＰＢＭＣ ＤＮＡ、ＤＮＡプライマー対、４つのデオキシリボヌクレオシドトリリン酸、ＭｇＣｌ2、ＤＮＡポリメラーゼおよび通常の緩衝液である。ＤＮＡは何回にもわたるサイクルで増幅される。一般的には、サイクル回数を多くすることによって検出感度を増すことが可能であり、各サイクルは温度を上げて短時間ＰＢＭＣ ＤＮＡを変性させ、反応液を冷却し、ついでＤＮＡポリメラーゼで重合させることから成っている。
【００５４】
増幅した配列はオリゴマー制限（ＯＲ）と呼ばれている方法を用いて検出できる。Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１００８−１０１２（１９８５）およびＳＳＣＰ ＰＮＡＳ １９８５，Ｖｏｌ．８６，ｐ．２７６６−２７７０を参照。たとえば、増幅後、ＰＣＲ反応混合物の一部を分離してとり、32Ｐ標識アデノシントリリン酸末端−標識プローブのような、末端を標識したヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。ＯＲ中では、末端標識オリゴヌクレオチドプローブは溶液中で増幅配列領域にハイブリド形成し、そのプロセスで特異なエンドヌクレアーゼ部位を再構成する。こうして、標識プローブと増幅Ｋａｔ Ｇ配列のハイブリダイゼーションによって、選択的制限酵素切断に感受性の２本鎖ＤＮＡ形を生ずる。エンドヌクレアーゼで制限的に切断後、生成した試料をポリアクリルアミドゲル上で分析し、診断的に標識したフラグメントを有するゲルの１部のオートラジオグラムが得られる。オートラジオグラム中の診断的フラグメント（たとえば長さ１０−１５塩基）が見られたときはＰＢＭＣs中にＫａｔ Ｇ配列が存在することを示している。
【００５５】
もとのテンプレートとしてクロモソームＤＮＡの代りにＲＮＡを用いることによって検出感度を上げる可能性があるので、本発明ではここで述べたＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列を用いることを企てた。ＲＮＡは逆転写酵素によって相補的なＤＮＡに変換でき、そのあとＤＮＡ増幅させる。
【００５６】
実験法
細菌株とプラスミド
本発明で用いた細菌株とプラスミドの概略を表１に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
結核菌Ｈ３７ＲＶゲノムライブラリーがシャトルコスミドｐＹＵＢ１８（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）中に構成され、Ｄｒ．Ｗ．Ｒ．Ｊａｃｏｂｓの厚意により提供を受けた。使用したその他のシャトルベクターはｐＹＵＢ１２（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）とｐＢＡＫ１４（Ｚｈａｎｇｅｔ ａｌ．，１９９１）である。
【００５９】
微生物学的方法と酵素学
用いた抗生物質、増殖条件、酵素学およびＭＩＣ定量はＨｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）中で見ることができる。
【００６０】
核酸に関する方法
サブクローニング、サウザーンブロッティング、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチド生合成等に用いたのは標準プロトコールである（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｅｉｇｌｍｅｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
【００６１】
活性染色
大腸菌とマイコバクテリアの無細胞抽出物の調製は最近記載されている（Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。未変性蛋白試料はＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）が記載しているようなポリアクリルアミドゲル電気泳動法で調製した：但し以下の点はＬａｅｍｍｌｉと異なる。すなわち、すべての緩衝液からＳＤＳを取除き、試料を煮沸せず、そしてβ−メルカプトエタノールを試料緩衝液中に含めなかった。５０−１００μｇの蛋白質試料を７．５％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してのち、そのゲルをゆるく攪拌しながら３ｍＭ Ｈ2Ｏ2中に２０分間浸してカタラーゼ活性を検出した。等量の２％塩化第二鉄と２％第二鉄シアン化カリウムを加えると、光照射によってカタラーゼ活性を示す鮮明なバンドが現われる。ペルオキシダーゼ活性は、０．２−０．５ｍｇ／ｍｌジアミノベンヂジンと１．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2を含む溶液中にゲルを３０−１２０分間浸したのち褐色バンドとして検出される。
【００６２】
高度の毒性化合物をつくるための最も適当な方法は、結核菌ＨＰＩ酵素でペルオキシダーゼ作用的にＩＮＨを活性化することである（Ｙｏｕａｔｔ，１９６９；Ｇａｙａｔｈｒｉ−Ｄｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，１９７５）。ｋａｔ Ｇ遺伝子が分離されて特性が明らかになったので、同じようにして活性化され得るＩＮＨの新しい誘導体を作ることも可能なはずである。
【００６３】
引 用 文 献
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ｐＹＺ５６中に存在する挿入体の制限マップを示す。
【図２】結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼポリペプチドの部分配列およびＨＰＩ酵素との比較を示す。
【図３】組換え結核菌ペルオキシダーゼ／カタラーゼの発現を示す。
【図４】ＩＮＨ−抵抗株におけるカタラーゼ遺伝子の欠失を示す。
【図５】各種の制限酵素地図を示す。
【図６Ａ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌からの抽出物を示す。
【図６Ｂ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌からの抽出物を示す。
【図６Ｃ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌からの抽出物を示す。
【図７】コロニー数を示すグラフである。
【図８】サザーンブロット分析の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図６Ｂ及び図６Ｃに示す１２１から３６０の塩基配列を含む、精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
放射性標識、酵素標識、蛍光標識およびリン光標識からなる群から選択される少なくとも１つの標識で標識されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む、ＩＮＨ感受性の結核菌を検出するための組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド或いは請求項３に記載の組成物を含む、ＩＮＨ感受性の結核菌を検出するためのキット。
【請求項５】
結核菌由来のヌクレオチドを、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含むプローブと、該プローブが試料中に存在する該ＩＮＨ感受性の結核菌のＤＮＡとハイブリダイズできる条件下で接触させて、ハイブリッド複合体を形成するステップと、
該ハイブリッド複合体を検出して、該試料中のＩＮＨ感受性結核菌の存在を明らかにするステップと
を含む、ＩＮＨ感受性の結核菌を検出する方法。
【請求項６】
結核菌の生物学的試料を、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含むプローブと、該プローブが結核菌のＫａｔＧ遺伝子とハイブリダイズできる条件下で接触させて、ハイブリッド複合体を形成するステップと、
該ハイブリッド複合体を検出して、該試料中のカタラーゼ−パーオキシダーゼ遺伝子の存在を明らかにするステップと
を含む、カタラーゼ−パーオキシダーゼ遺伝子又はその一部をコードする結核菌の生物学的試料中におけるヌクレオチド配列を検出する方法。
【請求項１】
図６Ｂ及び図６Ｃに示す１２１から３６０の塩基配列を含む、精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
放射性標識、酵素標識、蛍光標識およびリン光標識からなる群から選択される少なくとも１つの標識で標識されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む、ＩＮＨ感受性の結核菌を検出するための組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド或いは請求項３に記載の組成物を含む、ＩＮＨ感受性の結核菌を検出するためのキット。
【請求項５】
結核菌由来のヌクレオチドを、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含むプローブと、該プローブが試料中に存在する該ＩＮＨ感受性の結核菌のＤＮＡとハイブリダイズできる条件下で接触させて、ハイブリッド複合体を形成するステップと、
該ハイブリッド複合体を検出して、該試料中のＩＮＨ感受性結核菌の存在を明らかにするステップと
を含む、ＩＮＨ感受性の結核菌を検出する方法。
【請求項６】
結核菌の生物学的試料を、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含むプローブと、該プローブが結核菌のＫａｔＧ遺伝子とハイブリダイズできる条件下で接触させて、ハイブリッド複合体を形成するステップと、
該ハイブリッド複合体を検出して、該試料中のカタラーゼ−パーオキシダーゼ遺伝子の存在を明らかにするステップと
を含む、カタラーゼ−パーオキシダーゼ遺伝子又はその一部をコードする結核菌の生物学的試料中におけるヌクレオチド配列を検出する方法。
【図１】
【図２】
【図５】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図３】
【図４】
【図６Ａ】
【図８】
【図２】
【図５】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図３】
【図４】
【図６Ａ】
【図８】
【公開番号】特開２００６−１４９３９０（Ｐ２００６−１４９３９０Ａ）
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６９２８６（Ｐ２００５−３６９２８６）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【分割の表示】特願２００２−３７４０７７（Ｐ２００２−３７４０７７）の分割
【原出願日】平成４年１０月９日（１９９２．１０．９）
【出願人】（５９４１２０００９）メディカル リサーチ カウンスル (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【分割の表示】特願２００２−３７４０７７（Ｐ２００２−３７４０７７）の分割
【原出願日】平成４年１０月９日（１９９２．１０．９）
【出願人】（５９４１２０００９）メディカル リサーチ カウンスル (2)
【Ｆターム（参考）】
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