結腸直腸癌を評価する方法及びかかる方法に使用するための組成物
本明細書において開示されるのは、選択されたｍｉＲＮＡ配列における制御変化を観察することにより、結腸直腸癌のステージを診断する方法である。これらの配列には、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、これらのそれぞれの前駆体及びこれらの配列の組み合わせが含まれ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年５月１６日に出願された同時係属の米国仮特許出願第６１／０５３，７６０号の優先権及び利益を主張し、本出願の全内容は本明細書に参照により組み込まれている。
【０００２】
本発明は、１つの実施形態において、選択されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列の生成における制御変化を観察することによる、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出及び／又は監視をするための方法に関連する。特定の配列の上方制御又は下方制御を観察することにより、癌細胞の存在並びに癌のステージの両方を診断することができる。
【０００３】
（配列表、表、又はプログラム表の参照）
本出願は後述の「配列表」を参照するが、これは「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ３０３５１９１．ｔｘｔ」（９ｋｂ、２００８年１０月２９日作成）と題される電子文書として提供されており、全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は最も頻繁に生じる癌の１つであり、先進諸国における癌関連死の一般的な原因である。ＣＲＣの全体的な発生率は、全人口の５％であり、５年生存率は４０〜６０％である。予後診断は、腫瘍に関する形態学及び組織病理学を用いた、記述的な病期分類システムに主に依存する。しかしながら、形態学的に類似の腫瘍であっても、潜在する分子変化及び腫瘍形成能は異なる場合がある。ＣＲＣが正常な上皮細胞から悪性の癌へと進行するには、遺伝子学的及び後成的な変化の両方の蓄積を伴う複数段階のプロセスが関与しており、これにより一時的な腫瘍形成遺伝子の活性化、並びにこれらの変化を含む細胞に対し選択的な利点を付与する腫瘍抑制遺伝子の不活性化がもたらされる。
【０００５】
タンパク質コード遺伝子については、潜在する分子経路を更に明らかにし、ＣＲＣの様々なステージを更に詳細に分析するために、数多くのＣＲＣ発現プロファイリング研究が実施されてきた。最近新たに発見された、２２の短鎖ヌクレオチド（ｎｔ）非コーディングＲＮＡ種からなるクラス（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる）が同定され、これらが癌の発生と進行に関係していることが示された。これら低分子ＲＮＡの生合成は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写と、エンドヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによる一次転写のプロセスとが関与し、これにより不完全なヘアピン構造を有する６０〜７０ｎｔのｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはエキスポーチン５によって細胞質に輸送され、そこでＲＮＡアーゼＩＩＩ酵素ダイサー（Dicer）によるプロセシングを経て成熟ｍｉＲＮＡが生成され、これが多タンパク質複合体に組み込まれる。このｍｉＲＮＡを含む複合体は、常在性のｍｉＲＮＡ鎖と標的配列との間の相補性により、並びに相同性の度合に基づき、直接的な翻訳阻害又はｍＲＮＡ分解により、複数のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することが示された。これまでに、コンピュータ化モデルにより６７８のヒトｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース−リリース第１１）が同定されており、ヒトゲノムにおいて現在既知である遺伝子の約３％を含む、１０００を超えるｍｉＲＮＡ遺伝子があり得ることが示唆された。更に、バイオインフォマティクス解析によりｍｉＲＮＡはヒトタンパク質コード遺伝子の最高３０％を制御し得ると見積もられることから、これらの低分子量ＲＮＡが複雑なシグナル伝達経路間の相互作用を協調させる働きをする可能性が示唆されている。
【０００６】
正常組織及び腫瘍組織又は癌細胞株間で異なった発現をするとして、いくつかのｍｉＲＮＡが同定されてきた。（Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，６：８５７〜８６６，２００６；Ｂａｎｄｒｅｓ，Ｅ．，Ｃｕｂｅｄｏ，Ｅ．，Ａｇｉｒｒｅ，Ｘ．，Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ，Ｒ．，Ｚａｒａｔｅ，Ｒ．，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｎ．，Ａｂａｊｏ，Ａ．，Ｎａｖａｒｒｏ，Ａ．，Ｍｏｒｅｎｏ，Ｉ．，Ｍｏｎｚｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ−Ｆｏｎｃｉｌｌａｓ，Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｏｆ １３ ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ，５：２９，２００６；Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅ，Ｙ．，Ｌｅａｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐａｇｌｉａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｄｉａｚ，Ｌ．Ａ．，Ｊｒ．，Ｓｊｏｂｌｏｍ，Ｔ．，Ｂａｒａｄ，Ｏ．，Ｂｅｎｔｗｉｃｈ，Ｚ．，Ｓｚａｆｒａｎｓｋａ，Ａ．Ｅ．，Ｌａｂｏｕｒｉｅｒ，Ｅ．，Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｋ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｓ．，Ｊｕｈｌ，Ｈ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｖ．Ｅ．Ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｏｍｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３：３６８７〜３６９２，２００６；Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｍ．Ｚ．，ＳＭ，Ｏ．Ｃ．，ｖａｎ Ｈｏｌｓｔ Ｐｅｌｌｅｋａａｎ，Ｎ．Ｇ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ Ｊａｍｅｓ，Ｒ．Ｊ．Ｒｅｄｕｃｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１：８８２〜８９１，２００３；Ｌａｎｚａ，Ｇ．，Ｆｅｒｒａｃｉｎ，Ｍ．，Ｇａｆａ，Ｒ．，Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ａ．，Ｓｐｉｚｚｏ，Ｒ．，Ｐｉｃｈｉｏｒｒｉ，Ｆ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｇ．，Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｎｅｇｒｉｎｉ，Ｍ．ｍＲＮＡ／ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ，６：５４，２００７．）。
【０００７】
ＣＲＣでは、ｍｉＲＮＡの発現パターンを調査した研究は限られている。ｍｉＲＮＡの調節解除を示した最初の研究は、ＣＲＣの初期におけるこれらのｍｉＲＮＡの潜在的な役割を示唆する、プレ腺腫様ポリープ段階のような初期でのｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５の下方制御を報告した。続いて、ＣＲＣ腫瘍において異なった発現を示す１３グループのｍｉＲＮＡが、ＣＲＣ腫瘍のステージに相関がある、ｍｉＲ−３１の発現レベルに関して同定された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、１つの形態において、細胞検体中の結腸直腸癌の存在を検出するための方法を含む。別の形態において、本発明は細胞検体中の結腸直腸癌のステージを診断するための方法である。出願者らは、野生型細胞と比較して、結腸直腸癌において異なる制御が行われる特定のｍｉＲＮＡを発見した。このようなｍｉＲＮＡにおける制御変化の度合を診断することにより、組織検体に結腸直腸癌細胞が含まれているかどうかを診断することができる。出願者らは、初期（ステージＩ及びＩＩ）の結腸直腸癌と比較して、後期（ステージＩＩＩ及びＩＶ）において異なる制御が行われる、特定の他のｍｉＲＮＡを発見した。これらのｍｉＲＮＡを監視することにより、細胞形態学など信頼性の低い識別子に依存する必要なしに、初期の腫瘍検体と、後期の腫瘍検体とを区別することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】異なった発現を示す４１のｍｉＲＮＡを用いる、ＣＲＣと、正常な結腸直腸組織との２元配置された階層型クラスタ解析。完全連結法によるユークリッド距離計量法を用いて、全ての検体にわたって、Ｌｏｇ２変換されたシグナル強度の幾何平均を算出した。赤色と青色はそれぞれ、相対的に高いレベルで、又は相対的に低いレベルでｍｉＲＮＡが発現していることを示す。ｍｉＲ−１４３−１４５及びｍｉＲ−１７−９２のクラスタはそれぞれ、垂直の青色のバー及び垂直の赤色のバーで示す。検体は３つのメインクラスタにグループ分けされており、クラスタＩは主に正常な結腸直腸組織を表し、クラスタＩＩ及びＩＩＩはＣＲＣ検体を表す。複製検体は接尾語「２」により示される。
【図２】ｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイとＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プラットフォームを比較する、ｍｉＲＮＡ発現の相関性。１９のｍｒＲＮＡｓで線形回帰を実施し、両方のプラットフォームで測定した。４つの異なるＣＲＣ検体を試験した。相関係数の範囲は０．８５〜０．９２。
【図３】新鮮凍結ＣＲＣ検体のｍｉＲＮＡ発現対ホルマリン固定パラフィン包埋ＣＲＣ検体のｍｉＲＮＡ発現。（Ａ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ発現アッセイを、４つの対応する新鮮凍結検体及びＦＦＰＥ検体由来の、２６のｍｉＲＮＡで実施した。（Ｂ）ｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイアッセイを用いての、２つの対応する新鮮凍結検体及びＦＦＰＥ検体由来の、１８のｍｉＲＮＡの発現の比較。
【図４】疾病のステージに特異的なｍｉＲＮＡの発現レベル。（Ａ）正常な結腸直腸組織から、ＣＲＣの初期（Ｉ及びＩＩ）及び後期（ＩＩＩ及びＩＶ）へと進むにつれて発現の減少を示す、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１４３、及びｍｉＲ−１４５の、ドットプロット。（Ｂ）正常な結腸直腸組織から初期（Ｉ及びＩＩ）及び後期（ＩＩＩ及びＩＶ）ＣＲＣへと進むにつれて発現の上昇を示す、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０ａ、及びｍｉＲ−１０６ａのドットブロット。
【図５】８つのＣＲＣ細胞株及び正常結腸の全ＲＮＡにおける、２２のｍｉＲＮＡの発現。Ｕ６ ｓｎＲＮＡを内在性コントロールとして用いて、ノーザンブロットを実施した。
【図６】ＳＷ６２０細胞株において、ｍｉＲ−１４５の過剰発現は、細胞の形態及び増殖に影響を与える。（Ａ）ｍｉＲ−１４５遺伝子周辺のゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモータの制御下で、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）４．１中にクローン化した。後にトランスフェクションを行うＳＷ６２０細胞のプールした集団で、ノーザン解析により、成熟したｍｉＲ−１４５を検出した。Ｕ６ ｓｎＲＮＡをローディングコントロールとして用いた。（Ｂ）ｍｉＲ−１４５過剰発現細胞集団の主要な際立った特徴は、ＳＷ６２０の、丸い単細胞から、線維芽様細胞に典型的な進展した突起を備える細長い細胞への細胞形態の変化である。（Ｃ）ｍｉＲ−１４５を発現しているＳＷ６２０細胞集団は、血清の存在下で増殖させた場合には足場非依存性増殖において２倍の増加を示し、及び血清の存在下（黒の棒線）又は不在下（白の棒線）で増殖させた場合に、細胞増殖／代謝活性において５０％を超える増加を示した（ｐ＜０．００１）。（Ｄ）ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞及び対照細胞のウエスタン解析は、成熟したｍｉＲ−１４５を発現するＳＷ６２０細胞において、Ｅ−カドヘリンの定常状態のレベルが５０％低いことを示した。
【図７】アンチセンス介在性のｍｉＲ−１４５の変換が増殖を誘導したことを示す図。（Ａ）処理検体からの全ＲＮＡは、ｍｉＲ−１４５が、ｍｉＲ−１４５特異的な２’ＯｍｅアンチセンスＲＮＡを細胞内で欠乏している一方で、モック処理対照又はｍｉＲ−１４５センス鎖処理対象は欠乏していないことを示した。（Ｂ）予想されたように、ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５を発現するプールは、血清の存在下（黒の棒線）又は不在下（白の棒線）でのベクター対照と比較して、増殖の増加を示した。ｍｉＲ−１４５アンチセンスＲＮＡで処理した場合、ＳＷ６２０／ベクター及びＳＷ６２０ｍｉＲ−１４５プールの両方で増殖の減少が見られた。３つの別個の試験を実施した（ｐ＜０．０５；ｐ＜０．０１；ｐ＜０．００１）。
【図８】ＳＷ６２０細胞株において、ｍｉＲ−１４３の過剰発現は、細胞の形態及び増殖に影響を与えることを示す図。（Ａ）ｍｉＲ−１４３ゲノムＤＮＡを、Ｕ６プロモータ（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１中）の制御下でクローン化し、ＳＷ６２０細胞へと遺伝子導入した。７つの安定なＳＷ６２０クローンが、ｍｉＲ−１４３を発現していると同定された（Ａ４、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｃ１、Ｃ５及びＤ２）。Ｕ６ ｓｎＲＮＡを、ローディングコントロールとして用いた。（Ｂ）７つのＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４３クローンを、細胞形態についてベクター対照と比較して評価した。（Ｃ）ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４３クローン及び対照細胞のウエスタン解析は、定常状態のレベルのＥ−カドヘリンを示した。Ｅ−カドヘリンの比はβ−アクチンを正規化コントロールとして用いて算出した。（Ｄ）７つのＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４３クローンを、ベクター対照と比較して、血清の存在下（黒の棒線）又は不在下（白の棒線）で増殖させた場合の増殖／代謝活性についてアッセイした。（Ｅ）同一のクローンを、血清の存在下での急速軟寒天アッセイで、足場非依存性細胞増殖について評価した。２つの独立した試験を実施した（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．００１）。
【図９】ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５発現間の相関。ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５遺伝子について、正規化された発現強度（ｌｏｇ２）を比較する線形回帰分析を実施した。ｍｉＲＮＡ間の相関係数は０．９５。
【図１０】ｍｉＲ−１７−９２のための相互作用地図を示す図。
【図１１】ＳＷ６２０細胞株において、ｍｉＲ−１７−９２クラスタ及びｍｉＲ−２０ａ単独の過剰発現は、細胞の形態及び増殖に影響を与える。１３番染色体由来のｍｉＲ−１７−９２クラスタを含有しているゲノム領域及びｍｉＲ−２０ａ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含有しているゲノム領域を、ＰＣＲ増幅し、レトロウイルスベクター（retrofviral vector）ｐＱＣＸＩＮ中にＣＭＶプロモータの制御下でクローン化し、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株に送達した。（Ａ）ノーザンブロット解析を用いて、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１８ａ及びｍｉＲ−１９ａの過剰発現について、ＨＣＴ１１６／ｍｉＲ−１７−９２クラスタクローン（４−１及び４−１７）をスクリーニングした。ｍｉＲ−２０ａのみを過剰発現しているクローン（９−３、９−９、９−１２及び９−１３）もまた、これらのクラスタ構成要素の発現についてスクリーニングした。（Ｂ）ノーザンブロットから算出した、ｍｉＲ−１７−９２構成要素のｍｉＲＮＡ発現レベルのヒストグラム。発現レベルはＵ６ ｓｎＲＮＡで正規化した。（Ｃ）ｍｉＲ−２０ａを過剰発現しているいくつかのＨＣＴ１１６クローン（９−３、９−９、９−１２、９−１３）又はｍｉＲ−１７−９２クラスタ（４−１、４−７）を、血清の存在下（黒の棒線）又は不在下（白の棒線）で細胞の増殖／代謝活性について評価した。（Ｄ）同一のクローンを、足場非依存性細胞増殖について、急速軟寒天アッセイ（血清の存在下で）で評価した（ｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
マイクロＲＮＡ（ＭｉｒｃｒｏＲＮＡｓ）（ｍｉＲＮＡ）は、様々な機構を介してタンパク質の発現を制御する、短鎖非コードＲＮＡｓである。マイクロＲＮＡの異常発現は、様々な癌と関連があることが示されてきた。ＣＲＣにおいてｍｉＲＮＡ発現をプロファイルし、ＣＲＣ細胞に特異的なｍｒＲＮＡｓの機能を解析する方法が、本明細書に記載される。８つのＣＲＣ細胞株モデル、異なるステージの４５のヒトＣＲＣ検体及び４つの正常な結腸組織検体におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルを診断するために、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡバイオアレイを使用した。細胞株モデル及び臨床検体の両方で、正常結腸及びＣＲＣ間で異なった発現をする、１１の共通のｍｉＲＮＡを同定した。ＣＲＣにおいて非常に減少するｍｉＲ−１４５を含む、これらのｍｉＲＮＡの多くが、ＣＲＣ腫瘍進行の異なるステージに関連付けられることが現在までに示されている。インビトロのデータは、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５が、細胞のおかれた状況に基づいた細胞増殖の阻害又は増強のいずれかと逆に機能することを示した。ｍｉＲ−３１及びｍｉＲ−１７−９２クラスタを含むいくつかのｍｉＲＮＡがまた、ＣＲＣにおいて過剰発現していた。ＳＷ６２０ ＣＲＣ細胞におけるｍｉＲ−１７−９２の増強は、細胞増殖を抑制したが、足場非依存性増殖は増加させた。このｍｉＲＮＡクラスタの詳細な分析は、ｍｉＲ−２０Ａが活性化因子であることを示した。したがって、ｍｉＲＮＡは、ＣＲＣ治療、並びに診断及び予後診断検体用の標的となり得る。
【００１１】
４５の臨床ＣＲＣ検体、４つの対応する正常な結腸直腸組織及び８つの細胞株モデルにおけるｍｉＲＮＡの発現をプロファイルした。正常結腸と臨床検体及び細胞株の両方との間で発現レベルが共通して変化した、１１のｍｉＲＮＡが同定された。ＣＲＣの異なるステージについて、いくつかのｍｉＲＮＡの発現パターンを限定することで、この癌のための潜在的な予後診断又は診断マーカーを提供することができる。ＣＲＣモデル細胞株におけるｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の再発現は、反対の様式で、細胞の分化及び増殖の両方に影響を与える。加えて、ｍｉＲ−１７−９２クラスタの発現の増加は細胞増殖を抑制したが、足場非依存性増殖は増加させた。このクラスタの詳細な分析は、ｍｉＲ−２０ａが、これらの細胞のおかれた状況に依存して作用する活性化因子であることを示す。
【００１２】
バイオマーカーは示されたマーカー遺伝子の発現レベルの任意のしるしである。しるしは、直接的又は間接的なものであり、生理的パラメーターを付与された遺伝子の過剰発現又は過少発現を、内部対照群、正常な組織、又は別の癌と比較して測定することができる。バイオマーカーとしては、核酸（過剰発現及び過少発現、並びに直接的なもの及び間接的なもの、の両方）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸をバイオマーカーとして使用することには、限定するものではないが、ＤＮＡ増幅産物、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ヘテロ接合性欠失（ＬＯＨ）、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、マイクロサテライトＤＮＡ、ＤＮＡの低又は高メチル化、を測定することが挙げられる、当該技術分野において既知の任意の方法を含むことができる。タンパク質をバイオマーカーとして使用することには、限定するものではないが、量、活性、グリコシル化、リン酸化反応、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン化等の修飾、又は免疫組織化学（ＩＨＣ）を測定することが挙げられる、当該技術分野において既知の任意の方法を含むことができる。他のバイオマーカーとしては、イメージング、細胞計数及びアポトーシスマーカーが挙げられる。
【００１３】
本明細書で提供される示された遺伝子又はｍｉＲＮＡは、特定の腫瘍型又は組織型と関連付けられる。１つ以上の癌と関連付けられる数多くの遺伝子が当該技術分野において既知である。本発明は、好ましいマーカー遺伝子、及び更により好ましくはマーカー遺伝子の組み合わせを提供する。これらは本明細書中で詳しく記載される。
【００１４】
マーカー遺伝子は、配列番号によって指定される配列に対応する（遺伝子がこの配列又はこの相補体を含む場合）。遺伝子セグメント又は遺伝子断片は、基準配列、又はその相補体の一部を、これが遺伝子の配列であるものとして見分けるために十分に含む場合、このような遺伝子配列に対応する。遺伝子発現産物は、そのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｃＤＮＡがかかる配列を有する組成物（例えば、プローブ）とハイブリダイズする場合にはかかる配列に対応し、すなわち、遺伝子発現産物がペプチド又はタンパク質である場合には、これらはかかるｍＲＮＡによってコードされている。遺伝子発現産物のセグメント又は断片は、これらを遺伝子又は遺伝子発現産物の配列であるとして区別するのに十分な程度に、基準とされる遺伝子発現産物の一部又はその相補体の一部を含有している場合、かかる遺伝子又は遺伝子発現産物の配列と対応する。本明細書で記載され請求される本発明の方法、組成物、物品及びキットは１つ以上のマーカー遺伝子を含む。「マーカー」又は「マーカー遺伝子」は、過剰発現又は過少発現が腫瘍型又は組織型に関連付けられる任意の遺伝子に対応する、遺伝子及び遺伝子発現産物を指すために、本明細書を通して使用される。好ましいマーカー遺伝子が本明細書においてより詳細に記載される。本明細書において議論される全ての配列が本明細書中に記載され、配列表で提供される。本発明は更に本明細書で提供される方法に従うアッセイを行うためのキットを提供し、更にバイオマーカー検出試薬を含む。本発明は更に、本明細書に記載の方法を実施するためのマイクロアレイ又は遺伝子チップを提供する。本発明は更に、分離された核酸配列、それらの相補体、又は本明細書に記載されるような遺伝子の組み合わせの一部を含有する診断／予後診断ポートフォリオを提供し、ここでこの組み合わせは、異なる癌又は正常組織からの細胞に関連する転移性の細胞を有する生体検体中の遺伝子発現を、測定又は特徴づけることができる。
【００１５】
本発明に記載されるいずれかの方法が、検体中で恒常的に発現されている少なくとも１つの遺伝子の発現を測定することを更に含み得る。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載の方法に従ってＣＲＣの状態を診断し、ＣＲＣのための適切な治療を同定することによる、治療の方向性を提供するための方法を更に提供する。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載の方法に従ってＣＲＣの状態を診断し、ＣＲＣのための対応する予後診断を同定することによる、予後診断を提供するための方法を更に提供する。
【００１８】
本発明は、配列番号１〜３４から選択された少なくとも１つの分離された配列を含む組成物を更に提供する。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載のアッセイを行うためのキット、物品、マイクロアレイ又は遺伝子チップ、診断／予後診断ポートフォリオ、並びに本方法によって得られた結果を報告するための患者報告書（patient reports）を更に提供する。
【００２０】
組織検体中の特定の核酸配列の単なる存在又は不在が、診断又は予後診断的な価値を有するものとして見出されることは稀である。それに対して様々なタンパク質、ペプチド、ｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡの発現についての情報は、ますます重要視されている。タンパク質、ペプチド、ｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを発現する可能性を有する核酸配列（「遺伝子」と称される配列）の単なる存在は、ゲノム内で単独に存在するだけでは、タンパク質、ペプチド、又はｍＲＮＡが所与の細胞内で発現されるか否かを決定する要因にはならない。かかる産物を発現することのできる所与の遺伝子が発現するかどうか、及び仮に発現したとして、このような発現がどの程度生じるかは、様々な複雑な要因によって決定される。これらの要因の理解及び評価の難しさとは関係なく、遺伝子発現の解析は、腫瘍形成、転移、アポトーシス、及び他の臨床的に関連する現象などの、重要な事象の発生に関する有用な情報を提供し得る。遺伝子の活性又は不活性の程度の相対的な目安は、遺伝子発現プロファイルに見出すことができる。本発明の遺伝子発現プロファイルは、ＣＲＣについての患者の診断及び治療を提供するために使用される。
【００２１】
検体調製には、患者検体の収集を必要とする。本発明の方法で使用される患者検体は、例えば組織の穿刺吸引細胞診（ＦＮＡ）で小結節から採取された細胞などの、異常細胞を含有している疑いのあるようなものである。生検標本又は外科標本、及びレーザーキャプチャー法（ＬＣＭ）から得られる腫瘤組織（Bulk tissue）の調製もまた、使用に好適である。ＬＣＭ技術は、研究する細胞を選択する１つの方法であり、細胞型の不均一性によって生じるばらつきを最小化する。その結果として、正常又は良性及び悪性細胞間での、マーカー遺伝子の発現における中程度の又は少しの変化を容易に検出することができる。検体はまた、末梢血から抽出される循環上皮細胞を含む場合もある。これらは、多くの方法に従って得ることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第６１３６１８２号に記載される磁気分離技術である。一度対象とする細胞を含有している検体が得られると、適切なポートフォリオの遺伝子のためのバイオマーカーを用いることで、遺伝子発現プロファイルが得られる。
【００２２】
遺伝子発現プロファイルを確立するための好ましい方法は、遺伝子によって産生されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのいずれか）の量を診断することを含む。これは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、示差表示ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、及び他の関係する試験によって達成することができる。個別のＰＣＲ反応を使用するこれらの技術を実行することが可能であるが、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡから生成される相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又は相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅し、マイクロアレイ又は他の好適な方法によってこれを解析することが最善である。多くの異なるアレイ配列、及びこれらの生成のための方法が、当業者には既知であり、例えば、米国特許第５４４５９３４号、同第５５３２１２８号、同第５５５６７５２号、同第５２４２９７４号、同第５３８４２６１号、同第５４０５７８３号、同第５４１２０８７号、同第５４２４１８６号、同第５４２９８０７号、同第５４３６３２７号、同第５４７２６７２号、同第５５２７６８１号、同第５５２９７５６号、同第５５４５５３１号、同第５５５４５０１号、同第５５６１０７１号、同第５５７１６３９号、同第５５９３８３９号、同第５５９９６９５号、同第５６２４７１１号、同第５６５８７３４号、及び同第５７００６３７号に記載されている。
【００２３】
マイクロアレイ技術は、何千もの遺伝子の安定した状態のｍＲＮＡレベルの同時測定を可能にし、無制御の細胞増殖の発生、停止、又は調節等の効果を同定するための強力なツールを提供する。現在ではいくつかのマイクロアレイ技術が普及している（ｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイ、ｃＤＮＡアレイ及びオリゴヌクレオチドアレイ）。これらのチップの構成には違いが存在するものの、実質的に全ての下流のデータ解析及び出力は同じである。これらの解析の結果は、典型的には、マイクロアレイの既知の位置で核酸配列にハイブリダイズする、検体からのｃＤＮＡ配列を検出するために使用される標識されたプローブから受信される、シグナルの強度の測定値である。典型的には、シグナルの強度は、試料細胞内に発現したｃＤＮＡ、ひいてはｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの量に比例している。多くのこのような技術が利用可能であり有用である。遺伝子の発現を診断するための好ましい方法は、米国特許第６２７１００２号、同第６２１８１２２号、同第６２１８１１４号、及び同第６００４７５５号に見出すことができる。
【００２４】
発現レベルの解析は、かかるシグナル強度を比較することによって行われる。これは、試験検体の遺伝子の発現強度と対照検体のそれとの比率マトリックスを生成することによって最良に行われる。例えば、異常組織からの遺伝子発現強度が、同型の良性又は正常な組織から生成される発現強度と比較され得る。これらの発現強度の比率は、試験検体と対称検体との間の遺伝子発現における倍数変化を示す。
【００２５】
選択は、腫瘍形成に関連する因子間の各遺伝子の異なった発現に対する有意な証拠に関連したランク付けリストを生成する、統計的な検定に基づくことができる。このような試験の例としては、ＡＮＯＶＡ及びＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓが挙げられる。ランク付けは、カットオフ値までの、このような重さの合計を、あるクラスが別のクラスよりも優位であることを肯定する証拠として解釈するように設計されたモデルにおける重み付けとして使用され得る。本文献において記載される先の証拠もまた、重み付けを調整するために使用され得る。
【００２６】
遺伝子発現プロファイルは、様々な方法で表され得る。最も一般的には、未調整の蛍光強度、又は比率マトリックスをグラフィカルデンドログラム（dendogram）に配置し、列が試験検体を示し、行が遺伝子を示す。同様の発現プロファイルを有する遺伝子が、互いに近位にあるように配列される。各遺伝子の発現比率が色で可視化される。例えば、１未満の比率（下方制御）が、スペクトルの青色部分で表示される一方で、１を超える比率（上方制御）は、スペクトルの赤色部分で表示される。「ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ」（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」及び「Ｉｎｆｅｒ（商標）」（Ｐａｒｔｅｋ，Ｉｎｃ．）を含む、市販のコンピューターソフトウェアプログラムが、このようなデータを表示するために利用できる。
【００２７】
特有のＲＮＡ種の豊富さについての測定値が、生体検体からの原発腫瘍又は転移性腫瘍から収集される。臨床的な記録に沿うこれらの指数には、限定するものではないが、患者の年齢、性別、原発腫瘍の起源及び転移部位（該当する場合）が挙げられ、関係データベースを生成するために使用される。データベースは、ＣＲＣの存在、予後又は状態を診断するためのマーカーの変数として使用することができる、ｍｉＲＮＡ転写物及び臨床的な因子を選択するために使用される。
【００２８】
遺伝子発現を診断するためにタンパク質レベルを測定する場合、十分な特異性及び感度を生じるのであれば、当技術分野で公知の任意の方法が好適である。例えば、タンパク質レベルは、タンパク質に特異的な抗体又は抗体断片を結合させ、抗体結合タンパク質の量を測定することにより測定することができる。抗体を放射性、蛍光又は他の検出可能な試薬により標識して、検出を容易にすることができる。検出する方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び免疫ブロット法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の方法で使用された調節された遺伝子が、実施例で記載される。異なった発現をする遺伝子は、ＣＲＣに罹患していない者あるいは異なったＣＲＣの状態又は進行の患者と比較して、ＣＲＣ患者で上方又は下方制御のいずれかがなされている。上方制御及び下方制御は、一定の基準に対する遺伝子の発現の程度において、検出可能な差異（これを測定するために使用されるシステムのノイズの寄与以外）が見出されることを意味する、相対的な用語である。異常細胞中の対象とする遺伝子は次に、同じ測定方法を使用して、基準濃度に対して上方制御又は下方制御される。この関連において、疾病を有する、とは制御されない細胞の増殖を生じ、身体機能の適切な性能を中断若しくは阻害するか、又は阻害する可能性を有する身体の状態変化を指す。ある人の遺伝子型又は表現型のある態様が、疾病の存在と合致する場合、その人は疾病を有するものとして診断される。
【００３０】
診断又は予後診断を行う行為は、疾病／状態の問題の診断、例えば、再発の可能性、治療の種類、及び治療の監視などの診断を含み得る。治療監視では、経時的な遺伝子の発現を比較して、遺伝子発現プロファイルが、正常な組織とより一致するパターンに変化したか、又は変化しつつあるかを診断することによって所与の治療経過の効果に関連して、臨床的な判断が行われる。
【００３１】
遺伝子が分類され、その結果その分類の中の一連の遺伝子に関して得られる情報が、臨床的に関連する判断、例えば、診断、予後診断、又は治療選択などを行うための確固とした基盤を提供し得る。これらの一連の遺伝子は、本発明のポートフォリオを作成する。ほとんどの診療マーカーがそうであるように、多くの場合、正しい医療判断を行うために十分な、最小限の数のマーカーを使用することが、好ましい。これは、更なる解析を待つ間の治療の遅延、並びに時間及び資源の非生産的使用を回避する。
【００３２】
ポートフォリオの選択のプロセスはまた、ヒューリスティックルールの用途を含み得る。好ましくはこのようなルールは、生物学、及び臨床結果を生成するために使用される技術の理解に基づいて生成される。より好ましくは、これらは、最適化された方法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散方法は、癌患者において異なる様式で発現された多くの遺伝子の、マイクロアレイデータに適用され得る。この方法からの出力は、末梢血、加えて異常組織中に発現されたいくつかの遺伝子を含み得る遺伝子の最適化されたセットであり得る。試験方法で使用される検体が末梢血から得られ、癌の事例において異なる様式で発現された一定の遺伝子がまた、末梢血中で異なる様式で発現され得る場合、ポートフォリオが、末梢血中で異なる様式で発現されたものを除く、効果的境界から選択される、ヒューリスティックルールが適用され得る。当然、例えば、データ予備選択の間にルールを適用することにより、効果的な境界の形成の前にルールを適用することができる。
【００３３】
遺伝子発現ポートフォリオの設定の一方法は、資源ポートフォリオの設定において広範に使用される、平均分散アルゴリズムなどの、最適化アルゴリズムの使用による。この方法は、米国特許第２００３０１９４７３４号において詳細に記載される。本質的に、この方法は、それを使用するために受信されるリターン（例えば、生成されるシグナル）を最適化する一方で、リターンのばらつきを最小化する、一連の入力の設定を必要とする（財政適用における株式、本明細書における強度により測定される発現）。かかる操作を実行するために、多くの業務用ソフトウェアが利用できる。本明細書を通して「Ｗａｇｎｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」として参照される「Ｗａｇｎｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｍｅａｎ−Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」が好ましい。このソフトウェアは、効果的境界及び最適なポートフォリオを決定するために、「Ｗａｇｎｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｍｅａｎ−Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ」からの機能を使用し、そしてＭａｒｋｏｗｉｔｚセンスにおける最適ポートフォリオが好ましい。Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ（１９５２）。このタイプのソフトウェアの使用は、ソフトウェアがその意図された財政分析目的のために使用される場合、株式リターンの方法で入力として処理され、リスク測定値が使用されるように、マイクロアレイデータが変換され得ることを必要とする。
【００３４】
ポートフォリオの選択のプロセスはまた、ヒューリスティックルールの用途を含み得る。好ましくはこのようなルールは、生物学、及び臨床結果を生成するために使用される技術の理解に基づいて生成される。より好ましくは、これらは、最適化方法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散方法は、癌患者において異なる様式で発現された多くの遺伝子の、マイクロアレイデータに適用され得る。方法からの出力は、末梢血、加えて異常組織中に発現されたいくつかの遺伝子を含み得る遺伝子の最適化されたセットである。試験方法で使用される検体が末梢血から得られ、癌の事例において異なる様式で発現された一定の遺伝子がまた、末梢血中で異なる様式で発現され得る場合、ポートフォリオが、末梢血中で異なる様式で発現されたものを除く、効果的境界から選択される、ヒューリスティックルールが適用され得る。当然、例えば、データ予備選択の間にルールを適用することにより、効果的な境界の形成の前にルールを適用することができる。
【００３５】
必ずしも問題となっている生物学とは関係しない、他のヒューリスティックルールを適用することができる。例えば、記載されたポートフォリオの比率のみが特定の遺伝子又は遺伝子群によって表され得るようなルールを適用することができる。Ｗａｇｎｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅなどの市販のソフトウェアは、このような種類のヒューリスティックを容易に適合させる。これは、正確性及び精密性以外の要因（例えば、予測されるライセンス料）が、１つ以上の遺伝子を含めることの望ましさに影響する場合に有用であり得る。
【００３６】
本発明の遺伝子発現プロファイルはまた、癌診断、予後診断、又は治療監視において有用な、他の非遺伝子診断的な方法と共に使用することができる。例えば、一定の状況では、上記の遺伝子発現に基づく方法の診断能力と、従来的なマーカー、例えば、血清タンパク質マーカー（ｅ．ｇ．，Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ ２７．２９（「ＣＡ ２７．２９」））からのデータを組み合わせることが有益である。ＣＡ ２７．２９などの検体を含む、様々なマーカーが存在する。１つのこのような方法では、治療される患者から定期的に血液が採取され、上記の血清マーカーの１つについて酵素イムノアッセイに供される。マーカーの濃度が、腫瘍の再発、又は治療の失敗を示唆する場合、遺伝子発現解析を受ける検体源が採取される。疑わしい腫瘤が存在する場合、穿刺吸引細胞診（ＦＮＡ）がとられ、腫瘤から取られる細胞の遺伝子発現プロファイルが、上記のように解析される。あるいは、組織検体が、腫瘍が以前取り除かれた組織に隣接する領域からとられ得る。この手法は、他の試験手順が曖昧な結果を生じる場合に特に有用であり得る。
【００３７】
本発明に従って作製されたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するための、形式を合わせたアッセイを含む。これらは、アッセイを行うために必要な材料、例えば、試薬、並びにバイオマーカーを解析するための命令及び媒体の全て、又はいくつかを含み得る。
【００３８】
本発明の物品には、治療、診断、予後診断、及び他の方法で疾病を評価するために有用な遺伝子発現プロファイルの表示を含む。これらの特性表示は、コンピューター読み取り可能な媒体（磁気、光学など）などの機械によって自動的に読み取ることができる媒体に変換される。物品はまた、このような媒体における、遺伝子発現プロファイルを評価するための命令も含み得る。例えば、物品は、上記の遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現特性を比較するためのコンピューター命令を有するＣＤ−ＲＯＭを含んでもよい。物品はまた、その中にデジタル処理で記録される遺伝子発現プロファイルを有してもよく、それによってこれらは、患者検体からの遺伝子発現データと比較され得る。あるいは、特性は、異なる表現形式で記録されてもよい。図形的な記録が１つのそのような形式である。クラスタ化アルゴリズム、例えば、上記のＰａｒｔｅｋ社からの「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」及び「ＩＮＦＥＲ」ソフトウェアに組み込まれるものは、このようなデータの可視化を最も良好に補助することができる。
【００３９】
本発明に従って作製されたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するための、形式を合わせたアッセイを含む。これらは、アッセイを行うために必要な材料、例えば、試薬、並びにバイオマーカーを分析するための命令及び媒体の全て、又はいくつかを含み得る。
【００４０】
本発明の物品としては、治療、診断、予後診断、及び他の方法で疾病を評価するために有用な遺伝子発現プロファイルの表示を含む。これらの特性表示は、コンピューター読み取り可能な媒体（磁気、光学など）などの機械によって自動的に読み取ることができる媒体に変換される。物品はまた、このような媒体における、遺伝子発現プロファイルを評価するための命令も含み得る。例えば、物品は、上記の遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現特性を比較するためのコンピューター命令を有するＣＤ−ＲＯＭを含んでもよい。物品はまた、その中にデジタル処理で記録される遺伝子発現プロファイルを有してもよく、それによってこれらは、患者検体からの遺伝子発現データと比較され得る。あるいは、特性は、異なる表現形式で記録されてもよい。図形的な記録が１つのそのような形式である。クラスタ化アルゴリズム、例えば、上記のＰａｒｔｅｋ社からの「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」及び「ＩＮＦＥＲ」ソフトウェアに組み込まれるものは、このようなデータの可視化を最も良好に補助することができる。
【００４１】
本発明による製品の異なる種類の物品は、遺伝子発現特性を表すために使用される媒体、又は形式を合わせたアッセイである。これらは、例えば、マイクロアレイを含む場合があり、この中で配列相補体、又はプローブがマトリックスに取り付けられ、これに対象とする遺伝子の指標となる配列が結合し、それらの存在の読み取り可能な行列式を生成する。あるいは、本発明に従った物品は、対象とする遺伝子の発現レベルを示すハイブリダイゼーション、増幅、シグナル生成を実施するための試薬キットにすることができる。
【００４２】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、限定するためのものではない。本明細書で引用する全ての参考文献は、参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
方法
細胞株
ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞株は、ＡＴＣＣから入手された。ＫＭ２０Ｌ２及びＫＭ１２Ｃは、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ ＤＣＴ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから供給され、細胞株ＫＭ２０及びＫＭ１２ＳＭは、Ｄｒ Ｉｓａｉａｈ Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）から供給された。ＳＷ６２０及びＳＷ４８０細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。ＨＣＴ１１６細胞は、マッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養され、ＫＭ２０、ＫＭ２０Ｌ２、ＫＭ１２Ｃ、ＫＭ１２ＳＭ及びＨＴ２９細胞は、ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。全ての培地に、１０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ペニシリン０．１Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン０．１μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）が加えられたが、ただし例外としてＨＴ２９細胞は０．７２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で培養された。
【００４４】
臨床検体
合計で４９の急速冷凍ＣＲＣ検体が、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｃ．（ＧＣＩ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）又はＣｌｉｎｏｍｉｃｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）から入手され、これには正常結腸４検体、ステージＩが４検体、ステージＩＩが１９検体、ステージＩＩＩが２０検体、ステージＩＶが２検体含まれていた（表１）。更に、一致する８検体の、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）検体（ステージＩＩが３検体、ステージＩＩＩが４検体、ステージＩＶが１検体）が入手された。全ＣＲＣ検体の腫瘍含有率の中央値は７０％であり、初期（Ｉ及びＩＩ）と後期（ＩＩＩ及びＩＶ）の疾病との間に腫瘍含有率の有意差はなかった。
【表１】
ＭＡＣ＝修正アストラーカラー分類、ＮＡ＝ｍｉＲＮＡプロファイルが入手不能
【００４５】
２８７のヒトｍｉＲＮＡプローブを含むｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイ（Ａｍｂｉｏｎ、バージョン１）を、ＣＲＣ ｍｉＲＮＡシグネチャーを同定するために使用した。Ｓｈｉｎｇａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）。ｍｉＲＮＡは、急速冷凍検体についてはｍｉｒＶａｎａ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ）、及びＦＦＰＥ検体用ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）総核酸分離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して結腸直腸検体から得た全ＲＮＡ５μｇから分離した。全検体は、次にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｆｌａｓｈＰＡＧＥ（商標）、Ａｍｂｉｏｎ）によって分画され、直鎖アクリルアミドと共にエタノール沈殿により低分子量ＲＮＡ（＜４０ｎｔ）が回収された。ｍｉＲ−１６の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）が、ｍｉＲＮＡアレイ解析前のｍｉＲＮＡ濃縮を確認するために使用された。
【００４６】
全検体から得られた低分子量ＲＮＡには、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応を行い、アミン修飾されたウリジンを組み込んだ（Ａｍｂｉｏｎ）。テール付加された検体を、次に、アミン反応性Ｃｙ３又はＣｙ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して蛍光標識した。臨床ＣＲＣ又は細胞株の、プロファイリング実験のために、一色又は二色ハイブリダイゼーションをそれぞれ実施した。二色実験については、細胞株ｍｉＲＮＡが正常結腸ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）と直接比較された。蛍光標識されたＲＮＡは、ガラス繊維フィルタを使って精製し、溶出した（Ａｍｂｉｏｎ）。各検体は次に、４２℃で１４時間にわたってバイオアレイスライドにハイブリダイゼーションさせた（Ａｍｂｉｏｎ）。このアレイを次に洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２５０５Ｂ共焦点レーザーマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてスキャンし、発現解析ソフトウェア（Ｃｏｄｅｌｉｎｋ、バージョン４．２）を使用してデータを得た。
【００４７】
実施例２に概略されるように、特異的なｍｉＲＮＡのノーザンブロット解析を実施した。
【００４８】
統計分析
データはＲソフトウェアパッケージを使用して解析した。データはクオンタイル正規化を行ってから、遺伝子発現の差を診断した。複製検体及びプローブ値を平均し、スチューデントのｔ検定を実施して、検体群間で有意に異なる遺伝子を調べた。少なくとも１つの群について正規化されたシグナル強度の中央値が１００（中央値シグナルの７５パーセンタイル）を超え、平均変化が＞１．５倍かつｐ値＜０．０５である場合、その遺伝子を選択した。ｍｉＲＮＡ発現レベルを評価するために一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを確認するために、ＡＢＩ ｍｉＲＮＡ ＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬を使用してＱＰＣＲを実施した。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）。メーカー（Ａｍｂｉｏｎ）の取扱説明書に従って、１０ｎｇの全ＲＮＡを、高能力ＤＮＡアーカイブキット及び３μｌの５ｘ ＲＴプライマーを使ってｃＤＮＡに変換した。１５μＬの反応物を、サーマルサイクラー中で、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃に保持した。全ての逆転写酵素（ＲＴ）反応に、テンプレート制御は含まれなかった。ＱＰＣＲが、標準Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲキットプロトコルを使って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ配列検出システム上で行われた。１０μｌのＰＣＲ反応液には、０．６６μｌのＲＴ製品、１μｌのＴａｑｍａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイプライマー及びプローブミックス、５μｌのＴａｑｍａｎ（登録商標）２ｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（Ａｍｐｅｒａｓｅ ＵＮＧは用いない）並びに３．３４μｌの水を含んだ。反応液は、３８４ウェルプレート内にて９５℃で１０分、その後９５℃で１５秒、及び６０℃で２分の４０サイクルでインキュベートした。全てのＱＰＣＲ反応はｃＤＮＡコントロールを一切含まず、全ての反応は３つ組（triplicate）で行われた。
【００４９】
プラスミド作成
特有の制限部位とＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写終結領域（ＴＴＴＴＴＴ）とを導入するために、ｐｌａｓｍｉｄ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１（Ａｍｂｉｏｎ）をマルチクローニングサイト内で改変した。以下のオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ）、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで前消化したｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１にアニーリングさせて連結させ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１末端を作成した：ｐＳｉｌＵ６ｕｐｐｅｒ ５’ＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ（配列番号：１）及びｐＳｉｌＵ６ｌｏｗｅｒ ５’ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧ（配列番号：２）。ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４３又はｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５をコードしているＤＮＡを、プライマー１４３Ｆ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＴＣ（配列番号：３））及び１４３Ｒ（５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡ（配列番号：４））を用いてヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、次いで、ｍｉＲ−１４３発現プラスミドを作成するためにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１末端に連結させた。ｍｉＲ−１４５のため、ゲノムＤＮＡを、プライマー１４５Ｆ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＴＡＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣ（配列番号：５））及び１４５Ｒ（５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号：６））を用いてＰＣＲ増幅産物として回収し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、ＣＭＶプロモータの制御下でｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）４．１中に連結させた。ｍｉＲ−２０ａか又はｍｉＲ−１７−９２クラスタをコードしているレトロウイルス性の発現ベクターを作成するために、ゲノムＤＮＡ領域をヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＱＣＸＩＮ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中にクローン化した。ｍｉＲ−２０ａ用に用いたＰＣＲプライマーはｍｉＲ−２０Ｆ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣ（配列番号：７））及びｍｉＲ−２０ａＲ（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＡＡ（配列番号：８））であり、ｍｉＲ−１７−９２クラスタを増幅するために用いたプライマーはｍｉＲｃＦ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣＣＣＡＴＴＡＧＧＧＡＴＴＡＴＧＣ（配列番号：９））及びｍｉＲｃＲ（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＣＧＣＡＡＣＣ（配列番号：１０））である。安定発現株の生成 ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１（ｍｉＲ−１４３）及びｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）４．１（ｍｉＲ１４５）プラスミドを用いて安定なクローンを生成するために、１〜５×１０６個の細胞（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０）を６ウェルプレートの単一のウェルに播種した。８０〜９０％コンフルエンスに達したら、メーカーの取扱説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞に４μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。細胞を、５００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有している新鮮な培地に希釈し、蒔いた。選択から１４日後、別個のクローンを採集し、増大させ、トランスフェクトしたプラスミド（実施例２）によってコードされている特異的なｍｉＲＮＡの発現についてスクリーニングした。
【００５０】
レトロウイルス性の形質導入を用いてＨＣＴ１１６細胞の安定なクローンを作成するために、レトロウイルスパッケージング細胞株Ａｍｐｈｏｐａｃｋ（商標）ＨＥＫ ２９３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＧ１３を１０：１の比で混合し、次いでリン酸カルシウムを用いて１０μｇのｐＱＣＸＩＮベクターでトランスフェクトした。２４時間の形質導入後、ウイルスを含有している培地を回収し、ＨＣＴ１１６細胞を形質導入するのに用いた。細胞を希釈し、回収して、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を培地に添加して、２週間にわたってクローンを選択した。別個のクローンの特徴付けは、プラスミドトランスフェクションについて上記されている通りである。
【００５１】
アンチセンス実験
ビオチン化２’−Ｏ−メチルアンチセンスｍｉＲ−１４５ ＲＮＡ又は対照を、実施例２に記載のように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳＷ６２０に送達した。トランスフェクション効率は、全ての実験において少なくとも８０％であった。全ての実験を三組で実施した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）増殖アッセイＳＷ６２０細胞（３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）及びＨＣＴ１１６細胞（２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を、血清含有培地の入った９６ウェルプレートに播種した。細胞生存率解析を、０日（播種した当日）と５日で行った。全２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間にわたってインキュベートした。ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて蛍光を測定した。無血清解析を行うために、培地を１日後無血清培地に変えた。急速軟寒天アッセイ２Ｘイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）に、０．６％重炭酸ナトリウム、２０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、２Ｘ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、２％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（０．１Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１μｇ／ｍＬストレプトマイシン）（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。２Ｘ ＩＭＤＭを１．２％Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（５５℃）と１：１の比で混合し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０μＬ添加してアッセイのための基層を作成した。ＳＷ６２０細胞（３×１０３個）又はＨＣＴ１１６細胞（２×１０３個）を含有している細胞懸濁液１０μＬ、２Ｘ ＩＭＤＭ ２０μＬ及び０．８％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ（５５℃）３０μＬを混合し、各ウェル中の固化した基層に移した。２Ｘ ＩＭＤＭ２５μＬ及び１．２％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ（５５℃）２５μＬを混合して、半固体の支持細胞層を調製し、固化した細胞層上に積層した。細胞を、増殖させるために３７℃のＣＯ２インキュベーター中に７日間にわたって放置した。増殖性及び細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてスコア化した。生細胞イメージング
Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ及びＮｉｋｏｎ Ｅ９９５デジタルカメラを、細胞形態の画像を捕捉するために使用した。結果臨床ＣＲＣ検体におけるｍｉＲＮＡプロファイリング
我々はまず４９のヒト結腸直腸検体（４つの正常結腸、４つのステージＩのＣＲＣ、１９のステージＩＩのＣＲＣ、２０のステージＩＩＩのＣＲＣ及び２つのステージＩＶのＣＲＣ）を、正常組織及び腫瘍組織間、並びに初期及び後期疾病間で異なるｍｉＲＮＡ発現についてプロファイルした（表１）。ＣＲＣ及び正常結腸組織間で異なる発現をしたｍｉＲＮＡを、全部で３７同定した（表２）。
【表２】
ａ．正規化した中央値シグナル強度（ｌｏｇ２）
ｂ．癌：正常
ｃ．ｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ前駆体間の識別をすることができなかったため、一部のｍｉＲＮＡの染色体位置は多義的である。ＣＲＣにおいて頻発する染色体の増加及び減少はＳｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２００６）に要約されている通りである。
【００５２】
これらのｍｉＲＮＡのほとんどが、ＣＲＣにおいて頻繁に増加及び減少することが既知である染色体領域に関連付けられる。Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２００６）。階層的なクラスタリングは、ｍｉＲ−１４３−１４５及びｍｉＲ−１７−９２クラスタ（それぞれＣＲＣにおいて一貫して減少又は増加制御されている）が挙げられる、これらのｍｉＲＮＡの多くが協調して発現することを示した（図１）。興味深いことに、ｍｉＲ−１−１３３ａクラスタとｍｉＲ−１４３−１４５クラスタは、これら２つのクラスタが異なる染色体上に存在するものであるにも関わらず、転写的に密接な協調を示した。我々は次いで、４つの臨床ＣＲＣ検体中で異なった発現をした３７のｍｉＲＮＡのうち１９を、ＱＰＣＲ解析を用いて検証した（図２）。プラットフォーム間のｍｉＲＮＡ発現の相関は０．８５〜０．９２の範囲である。階層的クラスタリングはまた複製検体がお互いに近位であることを示したが、加えて高い割合で再現可能な結果であることを示している。ｍｉＲＮＡはまた、それぞれ０．９２及び０．８５の平均相関値でＡｍｂｉｏｎ ｍｉｒＶａｎａ（商標）アレイ又はＡＢＩ ＱＰＣＲプラットフォームのいずれかを用いることで、対応するＦＦＰＥ ＣＲＣ検体においても再現可能に検出され得る（図３）。ＦＦＰＥ検体中のｍｉＲＮＡが再現可能に検出されたことは、これらの検体が診断試験に幅広く利用可能であることから、重要な観察結果であった。特異的なｍｉＲＮＡ発現がＣＲＣステージに関連付けられる。我々は、正常及び初期（ステージＩ及びＩＩ）ＣＲＣ間で異なる発現をした２２のｍｉＲＮＡ（表３）と、初期及び後期（ステージＩＩＩ及びＩＶ）疾病間で有意に異なる発現を示した６つのｍｉＲＮＡ（表４）を同定した。後期にｍｉＲ−３１の発現が増加した一方で、ｍｉＲ−１３３ａは有意に減少した（図４Ａ及びＢ）。したがって、これらのｍｉＲＮＡはＣＲＣの進行と関連付けられ、ＣＲＣのステージ分類のための潜在的なバイオマーカーとして機能し得る。
【表３】
発現比（Fold change）＝癌：正常
【表４】
発現比＝ステージＩＩＩ／ＩＶ：ステージＩ／ＩＩ
ＣＲＣ細胞株中のｍｉＲＮＡのプロファイリング
【００５３】
異なった発現をするｍｉＲＮＡの機能解析用にＣＲＣ細胞株を同定するために、並びに臨床検体及び細胞株でのｍｉＲＮＡ発現間の関係性を検討するために、我々は正常な結腸上皮細胞及び４つのＣＲＣ細胞株モデル（ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＫＭ１２Ｃ、ＫＭ１２ＳＭ）間のｍｉＲＮＡ発現を、本解析からのｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイを用いて比較し、４つのＣＲＣ細胞株の少なくとも１つにおいて２倍上昇又は２倍減少のいずれかの状態にあるとして、４３のｍｉＲＮＡを同定した（表５）。
【表５】
【００５４】
マイクロアレイデータを検証するために、及びスクリーニングされるＣＲＣ株（line）の数を増大させるために、我々は８つのＣＲＣ細胞株中のこれらの２２のｍｉＲＮＡについてノーザンブロット解析を実施した（図５）。臨床検体中に同定されたこれらのｍｉＲＮＡのうち、１１つは、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１７−９２クラスタのｐメンバー、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ１４５を含む、細胞株モデルにおいて調節解除された４３と共通であった（表６）。したがって、我々は、これらのｍｉＲＮＡの発現上昇がＣＲＣ細胞表現型に影響するかどうかを判断するために、これらのｍｉＲＮＡのサブセットの機能研究を実施した。表６ ＣＲＣ臨床検体及びＣＲＣ細胞株において共通して調節解除されたｍｉＲＮＡ。
【表６】
＊Ｔｓａｆｒｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｐａｒｅｄｅｓ−Ｚａｇｌｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；及びＲｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）からの要約。ＣＲＣ細胞中のｍｉＲ−１４５の増大は、細胞の形態及び増殖を変化させる。
【００５５】
ＣＲＣにおける、ｍｉＲ−１４５の機能的な役割を調査するために、我々はＳＷ６２０細胞中に成熟ｍｉＲ−１４５を異所性発現させた。ＳＷ６２０細胞のトランスフェクションに続いて、安定なプールされた集団及びクローンを選択して、ｍｉＲ−１４５発現についてスクリーニングした。プールされた集団は非常に安定したレベルの成熟ｍｉＲ−１４５（ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５と命名）を発現した（図６Ａ）が、１２の単離されたクローンのいずれもが検出可能なレベルのこのｍｉＲＮＡを発現しなかった。別個のクローンを単離するためのいくつかの試行が、成熟ｍｉＲ−１４５を任意に発現させることに失敗した。
【００５６】
ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞集団の主に際立った特徴は、ＳＷ６２０の、丸い単細胞から、線維芽様細胞に典型的な進展した突起を備える細長い細胞への変化であった（図６Ｂ）。ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞はまた、細胞増殖／代謝活性において、それぞれ血清の存在下又は不在下で増殖させた場合に５０％〜９５％の増加を示した（図６Ｃ）。血清の存在下で増殖させた場合には、足場非依存性増殖の２倍の増加も観察された（図６Ｃ）。上皮細胞マーカーＥ−カドヘリンも同様に、対照と比較してＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞で５０％減少し（図６Ｄ）、これは間葉系細胞の細胞形態と一致し、ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞について増殖の増加が観察された。しかしながら、インビトロで観察された増殖増大と対比して、ＳＷ６２０細胞におけるｍｉＲ−１４５の過剰発現は、インビボマウスモデルにおいて腫瘍の増殖プロファイルを変化させなかった。
【００５７】
ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞における変化がｍｉＲ−１４５発現に起因することを確認するために、我々はｍｉＲ−１４５−特異的２’Ｏ−メチル（２’Ｏｍｅ）アンチセンスＲＮＡノックダウン実験を実施した。ｍｉＲ−１４５をＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞中で欠乏させ、センス対照以外にｍｉＲ−１４５−特異的２’ＯｍｅアンチセンスＲＮＡを受容させた（図７Ａ）。上記した実験（図６Ｃ）に見られるように、センス対照ＲＮＡの存在下でのｍｉＲ−１４５の過剰発現は、血清含有培地における、更に顕著には無血清培地における細胞増殖の増加をもたらした（図７Ｂ）。しかしながら、ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５中にアンチセンスｍｉＲ−１４５を共発現させた場合には、細胞の高増殖性が変換された（図７Ｂ）。これらの結果は、ｍｉＲ−１４５の特異的な異所性発現が、増殖性の増加に関連する、細胞分化における変化を誘導したことを示している。ＣＲＣ細胞中でのｍｉＲ−１４３の発現は、細胞の形態及び増殖を変化させる。
【００５８】
ｍｉＲ−１４５がｍｉＲ−１４３と同じゲノム部位から発現されることと、後者のｍｉＲＮＡもＣＲＣ中で同様に下方制御されたことから、我々はｍｉＲ−１４３を過剰発現するＳＷ６２０ ＣＲＣ細胞の表現形を調査した（図８）。ｍｉＲ−１４３を発現する７つの安定なクローンを単離し、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現増加に関連する、変化した形態をそれぞれ表示した（図８Ａ〜Ｃ）。細胞増殖率については何の違いも観察されなかったが、全てのクローンで足場非依存性増殖の減少が示された（図８Ｄ）。これらのデータは、ｍｉＲ−１４３を過剰発現する細胞の方が、ｍｉＲ−１４５を異所的に発現している細胞よりも、足場非依存性細胞増殖に対して反作用を有することを示唆する。我々は、ｍｉＲ−１４３介在性の増殖阻害の可能性を避けるためには協調発現が重要であるということを提案する。実際に、プロファイリングされた４９の臨床ＣＲＣ検体におけるｍｉＲ−１４３の発現とｍｉＲ−１４５の発現との間の相関は、０．９５であった（これはこれらのゲノム上の近接性と一致する（図１、図９）。我々にはｍｉＲ−１４３−１４５のゲノム位を過剰発現する安定した細胞を生成することはできず、したがって両方のｍｉＲＮＡが協調的に過剰発現した場合のＣＲＣの細胞表現型を調査することはできなかった。ｍｉＲ−１７−９２クラスタの過剰発現は、ｍｉＲ−１７−９２クラスタからのｍｉＲＮＡをプロファイリングするＣＲＣ増殖に作用し、染色体Ｘ及び７上に位置するそのパラログを、正常結腸組織と比較してＣＲＣにおいてより高い安定状態のレベルで発現した（図１、表２、５及び６）。ｍｉＲ−１７−９２、及びパラログクラスタメンバーの異なった発現は、正常な細胞から腫瘍原性結腸癌細胞への遷移におけるこれらのｍｉＲＮＡの潜在的な役割を検討するための基礎を提供した。図１０は、ｍｉＲ−１７−９２についての相互作用地図を示す。Ｂｌｅｎｋｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）．
【００５９】
１３番染色体に基づくｍｉＲ−１７−９２クラスタを含有するゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモータの制御下でレトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＮ中にクローン化し、ＨＣＴｌ１６結腸癌細胞株に送達した。スクリーニングされた他の細胞株と比較して、内因性のｍｉＲ−１７−９２クラスタメンバーのレベルが低かったことから、ＨＣＴｌ１６を選択した（図５）。２つのＨＣＴｌ１６／ｍｉＲ−１７−９２クローン、４−１及び４−７が単離され、成熟ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９ａ及びｍｉＲ−９２において随伴性の４〜５倍の増加を示した（図１１Ａ及びＢ）。
【００６０】
ｍｉＲ−１７−９２過剰発現クローン、４−１及び４−７は、無血清培地中で増殖させた場合、細胞増殖／代謝活性の５０％〜６０％の減少を示した（図１１Ｃ）。しかしながら、血清の存在下で増殖させた場合には、増殖においてより少ない有意な減少が見出された。ｍｉＲ−１７−９２クラスタを過剰発現するどちらのクローンにおいても、細胞形態の変化は見つからなかった。他の実験とは対照的に、上記の結果は、ｍｉＲ−１７−９２クラスタの発現の更なる増加は、血清の不在下で増殖させた場合の細胞の細胞増殖／代謝活性を減少させ得ることを示唆した。
【００６１】
ｍｉＲ−２０ａはｍｉＲ−１７−９２クラスタの活性化因子である。
【００６２】
クラスタの過剰発現に基づき増殖不利益か又は代謝活性の減少をもたらすｍｉＲ−１７−９２クラスタ構成要素の更なる特徴づけのために、我々はｍｉＲ−２０ａ単独の過剰発現の効果を検討した。我々が、ｍｉＲ−２０ａの増加を示す４ ＨＣＴ１１６／ｍｉＲ−２０ａクローンを生成したところ、そのうち３つはベクター対照と比較して１０〜１２倍の再現性のある増加を示した（９−３、９−９及び９−１２）。内因性ｍｉＲ−１７−９２クラスタの他の３つのｍｉＲＮＡメンバーでは発現の変化は見られなかった（図１１Ａ及びＢ）。細胞形態の変化を示すＨＣＴ１１６／ｍｉＲ−２０ａクローンは存在しなかった。しかしながら、ＨＣＴ１１６／ｍｉＲ−１７−９２クローンに関しては、全てのｍｉＲ−２０ａクローンが、無血清培地中での細胞増殖／代謝活性について有意な減少を示した（図１１Ｃ）。この表現型は、クローンが血清由来の増殖因子の存在下で増殖する場合にはあまり顕著なものではなかった（有意差に達したのは２つのクローンだけだった）。
【００６３】
２つのｍｉＲ−２０ａ発現クローンと、ｍｉＲ−１７−９２クラスタクローンの内の１つとが足場非依存性増殖において有意な増加を示したが、これは細胞増殖時のｍｉＲ−１７−９２の発現効果が、細胞状況に依存することを示す（図１１Ｄ）。これらの結果はまた、ＨＣＴ１１６増殖の調節が、おそらくｍｉＲ−２０ａによって指示されていたであろうことも示唆する。しかしながら、クラスタの他のメンバーにおける配列関連性の種は与えられたが、我々はＣＲＣ表現型においてこれらの他のｍｉＲＮＡに対しての役割を排除できていない。
【００６４】
考察
我々は、ＣＲＣ患者検体と細胞株の両方でｍｉＲＮＡ発現プロファイリングを実施し、正常結腸及び異なったステージのＣＲＣ間で異なった発現を示す、一連の特異的なｍｉＲＮＡを見出した。我々は更に、代表的な後期転移性疾病のＣＲＣ細胞株中のｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の再発現が、ある異なった状態の細胞を異なった様式で改変し、反対の方法で細胞増殖に影響を及ぼすことを示した。癌についてのこれまでのほとんどの報告とは対照的に、これらの進行したＣＲＣ細胞におけるｍｉＲ−１７−９２発現の増加は、細胞増殖を減少させるにもかかわらず、足場非依存性増殖の増加に関連する。クラスタの更なる詳細な分析が、ｍｉＲ−２０ａが、それらの変化をもたらす、ｍｉＲ−１７−９２の少なくとも１つの活性化因子であることを明らかにした。
【００６５】
正常結腸と比較して、臨床ＣＲＣ検体間で３７のｍｉＲＮＡの発現が変更され、これらのｍｉＲＮＡの内１１はＣＲＣ細胞株において同一の発現パターンを示した。これは、細胞株が、原発腫瘍において観察されるｍｉＲＮＡ発現パターンの一部を保持し、特異的なｍｉＲＮＡの機能解析のための好適なモデルとして機能し得ることを示した。ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５がＣＲＣにおいて下方制御されるという我々の観察結果は、先の報告で裏付けられている。Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｂａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｃｕｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００３）；及びＬａｎｚａ ｅｔ ａｌ．（２００７）。我々はまた、以前報告されたｍｉＲ−３０ａ−３ｐ（Ｂａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６））、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ及びｍｉＲ−１９５の下方制御を検証した。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）。
【００６６】
興味深いことに、筋特異的なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１３３ａは正常結腸粘膜で高発現されるが、ＣＲＣにおいては有意に下方制御された。我々は、正常検体において筋層粘膜からの混入を完全には排除できていないが、以下の理由から我々の観察結果は正しいと考えている。第一に、正常結腸において筋層粘膜の割合はわずかであり、これらの検体で高レベルのｍｉＲ−ｌ−１３３ａ発現が割合を占めることは起こりそうにない。第２に、疾病後期と比較して疾病初期での発現がより高く、並びに第３に、このクラスタはＣＲＣ特異的なｍｉＲＮＡクラスタｍｉＲ−１４３−１４５を協調的に発現した。加えて、我々の知識では、筋肉及び正常結腸粘膜上皮においてｍｉＲ−ｌ−１３３ａの発現間の直接的な比較は存在しないことから、ひいてはこれらのｍｉＲｓが完全には筋肉特異的ではない可能性がある。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）．
【００６７】
ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−２１、及びｍｉＲ−１７−９２クラスタのメンバー並びにそのパラログは、ＣＲＣにおいて上方制御されることが示された。ｍｉＲ−３１におけるこの増加は以前報告されているが、ＣＲＣにおけるいくつかの他のｍｉＲＮＡ発現についての研究は見出されていなかった。Ｂａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｃｕｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）；及びＶｏｌｉｎｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）。初期臨床検体（ステージＩ及びＩＩ）及び正常結腸間で全２２のｍｉＲＮＡが調節解除された一方で、６つのｍｉＲＮＡが初期検体及び後期検体間で異なる発現レベルを示した。これらのｍｉＲＮＡは、ＣＲＣ病期分類のための新規のバイオマーカーになり得る。最後に、我々はまた、ＦＦＰＥ ＣＲＣ検体中のｍｉＲＮＡの再現性のある検出を実証し、この保存状態が良くない材料中でｍｉＲＮＡが安定であることを示した。ＦＦＰＥ ＣＲＣ検体中のｍｉＲＮＡを再現可能に検出する能力は、Ｘｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）の近年の結果を裏付ける。
【００６８】
我々の研究では、ｍｉＲ−１４３の再発現はコロニー形成を減少させ、Ｅ−カドヘリン（上皮細胞分化のマーカー）を上方制御して、ｍｉＲ−１４３が、これらの条件下でＣＲＣ細胞に対して腫瘍抑制効果を示すことを示唆した。我々の観察結果と一致して、Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、ＤＬＤｌ又はＳＷ４８０ ＣＲＣ細胞株への合成ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４３の送達に基づく細胞生存率の用量依存的な減少を報告している。同様にして、Ｂｏｒｒａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）は、ＨＣＴｌ１６、ＬｏＶｏ、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０細胞におけるｍｉＲ−１４３の過剰発現が細胞生存率の低下をもたらし、及びアポトーシスを増加させることを示し、正常粘膜においてｍｉＲ−１４３がアポトーシスを促進する役割を果たすことを示唆した。この後者の研究にはｍｉＲ−１４３遺伝子のより大きな前駆体の発現が含まれ、この研究は本研究で用いた再発現ストラテジー最も似ている。対照的に、ｍｉＲ−１４５は細胞増殖、足場非依存性増殖を増加させ、Ｅカドヘリンレベルは減少させた。無血清培地で細胞を増殖させた場合にこれらの効果が増強されることは、細胞増殖因子がこれらのｍｉＲＮＡの活性に影響を与え得ることを示唆する。これらの結果は、ＣＲＣ細胞株において、ｍｉＲ−１４５の発現が細胞増殖を促進し、及び／又はアポトーシスのための通常のシグナルをブロックするよう作用することを示唆している。興味深いことに、ｍｉＲ−１４５の再発現に基づく我々の観察結果は、合成ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５を導入する前にＤＬＤｌ又はＳＷ４８０細胞において細胞生存率の喪失を報告した、このｍｉＲＮＡの機能的な役割を検討する単独の研究とは異なる。Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）．ｍｉＲ−１４５を導入する方法に加えて、我々の研究結果はまた我々が後期ＣＲＣ細胞を使用し、ｍｉＲ−１４５の高度に安定した発現レベルを達成することができなかった点においても異なる。
【００６９】
我々が、成熟ｍｉＲ−１４５を高レベルに発現する単一のクローンを生成できないということは、特異的な閾値を越えてｍｉＲ−１４５が発現された場合に、細胞増殖が維持され得ないことを示唆した。しかしながら、ｍｉＲ−１４５を発現する細胞をプールした集団は、ＣＲＣ細胞株において増殖の増加を一貫して示した。我々の研究室及び他の研究室からのデータは、ｍｉＲ−１４５を独立して過剰発現させた場合、ｍｉＲ−１４３がＣＲＣ細胞の増殖を減少させることを示した。どちらのｍｉＲＮＡも同じゲノム位置（５ｑ２３）を占有することから、我々は、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５が、それぞれ潜在的な腫瘍抑制因子及び癌遺伝子として反対の様式で協調的に作用するという仮説を立てた。独立して発現させた場合、次いでこれらのｍｉＲＮＡのそれぞれは、それらのそれぞれの発癌性の働き及び腫瘍抑制因子の働きを呈する。ｍｉＲ−１４３が単独クローンで高レベルに発現され得る一方で、ｍｉＲ−１４５の生理的な発現レベルを達成するにはｍｉＲ−１４３との同時発現が必要とされる場合がある。重要なことに、我々の結果はまた、単離時のｍｉＲ−１４３の送達が、ＣＲＣのための潜在的な治療戦略であり得ることも強調する。
【００７０】
本研究における１つの具体的な興味深い観察結果は、ｍｉＲ−１７−９２の多シストロン性の又はｍｉＲ−２０ａ単独の更なる過剰発現が、無血清培地における細胞増殖の減少をもたらしたことである。これらの結果は、ｍｉＲ−１７−９２及びｍｉＲ−２０ａが、急速に分裂しているＨＣＴ１１６細胞において過剰発現した場合、腫瘍抑制因子として作用し得ることを示唆する。対照的に、一部のｍｉＲ−１７−９２及びｍｉＲ−２０ａクローンでは足場非依存性増殖の増加が見られた。これらの逆向性の観察結果は、報告されている、癌におけるｍｉＲ−１７−９２の役割と一致する。
【００７１】
いくつかの研究は、ｍｉＲ−１７−９２が癌遺伝子に関係があるとしている。このクラスタはゲノム位置（１３ｑ）に関連付けられ、異なったクラスのリンパ腫及びＣＲＣで頻繁に増幅されている。Ｏｔａ ｅｔ ａｌ．（２００４）；及びＴｓａｆｒｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）。このクラスタによりコードされているｍｉＲＮＡはまた、リンパ腫、結腸癌、肺癌、膵臓癌及び前立腺癌においても高発現される。Ｖｏｌｉｎｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｈａｙａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）；及びＨｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、レトロウイルス性の変異誘発を用いて、マウスにおける潜在的な癌遺伝子としてｍｉＲ−１７−９２を同定したが、ｍｉＲ−１７−９２はリンパ腫の形成をもたらした。更に、ｍｉＲ−１７−９２クラスタの過剰発現は、マウスにおいてＢ細胞リンパ腫を促進し、インビトロにおいて肺癌細胞株の細胞増殖の増加を示した。Ｈａｙａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）；及びＨｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）。予後不良を導き得るいくつかの異なる癌型において、１３ｑ３１〜３２でヘテロ接合性が失われていることから、ｍｉＲ−１７−９２クラスタが腫瘍抑制因子として作用し得るという証拠もある。Ｅｉｒｉｋｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）；及びＴｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）。更に、Ｈｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、乳癌細胞株へのｍｉＲ−１７−５ｐの再導入は細胞増殖及び足場非依存性増殖を減少させることを示し、このクラスタのメンバーが、腫瘍抑制因子様の性質を示しうることを裏付けた。任意の特異的なｍｉＲＮＡに対して、異なる生物学的な効果が状況依存的に存在し、異なる細胞型において発現される標的遺伝子のレパートリーにより制御されているようである。我々の結果は、血清及び関連付けられる増殖因子の不在下で作用する腫瘍抑制因子が、ＣＲＣにおいて、ｍｉＲ−１７−９２に対して、特にｍｉＲ−２０ａに対して複雑な正の及び負のフィードバック制御機構を反映させ得ることを示す。
【００７２】
要約すると、我々は非常に大きな数の臨床ＣＲＣ検体をスクリーニングし、ｍｉＲＮＡ発現に対して正常結腸直腸組織を対応させた。３７のｍｉＲＮＡが、正常な、初期の又は後期のＣＲＣ間で異なった発現をすることが見出され、これらｍｉＲＮＡのうち１１のｍｉＲＮＡの調節解除がＣＲＣ細胞株モデルにおいて確認された。したがって、これらの候補ｍｉＲＮＡは、この疾病における潜在的な治療標的である。具体的には、ｍｉＲ−１４５ではなくｍｉＲ−１４３の添加が、ＣＲＣにおける治療的な適用として考慮され得る。
【００７３】
（実施例２）
ｍｉＲ−１４５のアンチセンス介在性の抑制
総量１００ｎＭのビオチン化２’−Ｏ−メチルアンチセンスｍｉＲ−１４５ ＲＮＡ（５ＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＵＧＧＧＡＡＡＡＣＵＧＧＡＣ３’（配列番号：１１））（ＩＤＴ）又は逆向き対照（reverse control）（５’ＣＡＧＧＵＣＡＡＡＡＧＧＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＡＳ’（配列番号：１２））（ＩＤＴ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２×１０６個のＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞にトランスフェクトした。メーカーの取扱説明書に従って、トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。２５０μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１００μｇの全ＲＮＡに３つの配列的な欠乏操作を行った。各欠乏操作には、０．１Ｍ ＮａＯＨ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ溶液で２回、次いで０．１Ｍ ＮａＣｌで１回ビーズを洗浄することが含まれた。ビーズを０．１Ｍ ＮａＣｌに再懸濁し、次いで２５０μｇのビーズをＲＮＡ検体に添加した。検体を４℃で２０分間にわたって撹拌した。ビーズは、磁気分離装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＲＮＡ溶液から分離し、溶液（欠乏処理したＲＮＡを含有している）をビーズから取り除いた。欠乏処理したＲＮＡをエタノール沈殿し、ｍｉＲ−１４５及びＵ６ ｓｎＲＮＡの発現についてノーザン解析によって解析した。ＦＡＭ−標識２’Ｏ−メチルアンチセンスｍｉＲ−１４５ ＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクション効率を、欠乏実験と並行して行った。１００ｎＭの全ＦＡＭ−標識２’Ｏ−メチルアンチセンスｍｉＲ−１４５ ＲＮＡ（ＩＤＴ）を、ｍｉＲ−１４５を発現している１．２×１０５個のＳＷ６２０細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。
【００７４】
ｍｉＲＮＡのためのノーザンブロット
全ＲＮＡの、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）抽出を、メーカーの取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って実行した。簡潔に述べれば、細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を添加し、細胞を室温で５分間にわたってインキュベートした。１ｍＬクロロホルムを添加した後、細胞を１５秒間、手で激しく振り混ぜた。検体を遠心分離し、水性層を、２．５ｍＬイソプロパノールが入った１５ｍＬファルコンチューブに移した。この検体を室温で２０分間インキュベートし、上記のように遠心分離にかけてＲＮＡをペレット状に沈殿させ、これを１ｍＬ７５％ＥｔＯＨで再懸濁した。遠心分離によりＲＮＡをペレット状に沈殿させ、風乾し、５０μＬＤＥＰＣ水（Ａｍｂｉｏｎ社）で再懸濁した。
【００７５】
ＳｅｑｕａＧｅｌ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて調整した１５％ＰＡＧＥ−尿素ゲルを使用してノーザン解析を実行し、ＭｉｍＰｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＩＩゲル電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて電気泳動を実施した。全４０μｇのＲＮＡを１０μｌ ＲＮＡローディング色素（９５％ホルムアミド、１８ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０２５％ ＳＤＳ、キシレンシアノール及びブロモフェノールブルーの２Ｘ溶液）に添加し、６５℃で１０分間にわたってインキュベートした。検体を１５％ＰＡＧＥ−尿素／ＴＢＥゲルにロードし、ブロモフェノールブルー色素がゲルの底面に到達するまで１Ｘ ＴＢＥ中で１００Ｖで電気泳動した。ＲＮＡを、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、０．５Ｘ ＴＢＥバッファ中で８０Ｖで１時間にわたってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。ＵＶ Ｓｔｒａｔａｈｎｋｅｒ（登録商標）１８００（１２００ジュール）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ＲＮＡをメンブレンに架橋させた。
【００７６】
メンブレンを、１０ｍＬ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で、３７℃でプレハイブリダイズした。Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを１分間煮沸し、次いでハイブリダイゼーション溶液に添加した。３７℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、メンブレンを２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで３回すすぎ、更に２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ溶液で、３７℃で１５分間にわたって洗浄した。メンブレンをＳｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｃｒｅｅｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に一晩曝露し、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ ｍａｃｈｉｎｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて画像化した。煮沸した０．１％ＳＤＳを直接メンブレン上に注ぎ、次いで３０分以上かけて溶液をゆっくりと冷ますことにより、結合したプローブをメンブレンから取り除いた。
【００７７】
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって、Ｃｕｓｔｏｍ Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブが合成された。凍結乾燥オリゴヌクレオチドプローブをＩＸ ＴＥ ｐＨ ８．０中に希釈して、１００μＭ原液とした。標識反応は、ＩＸ ｅｘｏ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、１μＬ Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＩＤＴ）及び０．５ｐｍｏｌ Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを含んだ。反応混合液を１分間煮沸し、次いで５分間室温へと冷まし、５０μＣｉ α−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）及び５ Ｕ ｅｘｏ Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を添加し、室温で９０分にわたってインキュベートした。４０μＬ １０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することで反応を停止した。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５ ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、メーカーの取扱説明書に従い、取り込まれなかったα−３２Ｐ−ｄＡＴＰを反応混合物から取り除いた。使用に先立ち、プローブを１分間煮沸した。
【表７】
【００７８】
Ｕ６ ｓｎＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（５’ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ３’（配列番号：３４））を、最終容量２０μＬの、２０ｐｍｏｌｅオリゴヌクレオチドプローブ、１Ｘ Ｔ４ポリヌクレオチドバッファ（ＮＥＢ）、５０μＣｉγ−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及び１０Ｕ Ｔ４ポロヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を用いて最終標識した。プローブを３７℃で３０分にわたってインキュベートした。４０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えることによって反応を止めた。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５ ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、メーカーの取扱説明書に従い、取り込まれなかったγ−３２Ｐ−ｄＡＴＰを反応混合液から除去した。使用前に、このプローブを５分間煮沸した。
【表８−１】
【表８−２】
【表８−３】
【表８−４】
【００７９】
〔実施の態様〕
（１） ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセスであって、
抽出されたＲＮＡからのマイクロＲＮＡの制御変化を、野生型結腸直腸組織検体における同一のマイクロＲＮＡと比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、制御変化を観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセス。
（２） 前記制御変化を観察する工程の前に、組織検体からＲＮＡを抽出する工程を更に含む、実施態様１に記載のプロセス。
（３） 前記制御変化を観察する工程が、配列番号５６における上方制御を観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（４） 前記制御変化を観察する工程が、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡの下方制御を観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（５） 前記マイクロＲＮＡが配列番号１０９を含み、前記制御変化を観察する工程が、配列番号１０９及び配列番号５６の両方の上方制御を観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（６） 前記マイクロＲＮＡが配列番号５７を含み、前記配列番号５７について２倍以上の上方制御がある場合には前記結腸直腸癌のステージがステージＩＩＩ以降であると判定される、実施態様１に記載のプロセス。
（７） ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセスであって、
結腸直腸細胞からＲＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記ＲＮＡからの少なくとも２つのマイクロＲＮＡの制御変化を、正常な結腸直腸組織検体における同一のマイクロＲＮＡと比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
（８） 前記少なくとも２つのマイクロＲＮＡが、配列番号１０９及び配列番号１１０の両方を含む、実施態様１３に記載のプロセス。
（９） ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセスであって、
配列番号５６及び配列番号５７の両方を含む少なくとも２つのマイクロＲＮＡの制御変化を観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年５月１６日に出願された同時係属の米国仮特許出願第６１／０５３，７６０号の優先権及び利益を主張し、本出願の全内容は本明細書に参照により組み込まれている。
【０００２】
本発明は、１つの実施形態において、選択されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列の生成における制御変化を観察することによる、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出及び／又は監視をするための方法に関連する。特定の配列の上方制御又は下方制御を観察することにより、癌細胞の存在並びに癌のステージの両方を診断することができる。
【０００３】
（配列表、表、又はプログラム表の参照）
本出願は後述の「配列表」を参照するが、これは「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ３０３５１９１．ｔｘｔ」（９ｋｂ、２００８年１０月２９日作成）と題される電子文書として提供されており、全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は最も頻繁に生じる癌の１つであり、先進諸国における癌関連死の一般的な原因である。ＣＲＣの全体的な発生率は、全人口の５％であり、５年生存率は４０〜６０％である。予後診断は、腫瘍に関する形態学及び組織病理学を用いた、記述的な病期分類システムに主に依存する。しかしながら、形態学的に類似の腫瘍であっても、潜在する分子変化及び腫瘍形成能は異なる場合がある。ＣＲＣが正常な上皮細胞から悪性の癌へと進行するには、遺伝子学的及び後成的な変化の両方の蓄積を伴う複数段階のプロセスが関与しており、これにより一時的な腫瘍形成遺伝子の活性化、並びにこれらの変化を含む細胞に対し選択的な利点を付与する腫瘍抑制遺伝子の不活性化がもたらされる。
【０００５】
タンパク質コード遺伝子については、潜在する分子経路を更に明らかにし、ＣＲＣの様々なステージを更に詳細に分析するために、数多くのＣＲＣ発現プロファイリング研究が実施されてきた。最近新たに発見された、２２の短鎖ヌクレオチド（ｎｔ）非コーディングＲＮＡ種からなるクラス（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる）が同定され、これらが癌の発生と進行に関係していることが示された。これら低分子ＲＮＡの生合成は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写と、エンドヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによる一次転写のプロセスとが関与し、これにより不完全なヘアピン構造を有する６０〜７０ｎｔのｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはエキスポーチン５によって細胞質に輸送され、そこでＲＮＡアーゼＩＩＩ酵素ダイサー（Dicer）によるプロセシングを経て成熟ｍｉＲＮＡが生成され、これが多タンパク質複合体に組み込まれる。このｍｉＲＮＡを含む複合体は、常在性のｍｉＲＮＡ鎖と標的配列との間の相補性により、並びに相同性の度合に基づき、直接的な翻訳阻害又はｍＲＮＡ分解により、複数のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することが示された。これまでに、コンピュータ化モデルにより６７８のヒトｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース−リリース第１１）が同定されており、ヒトゲノムにおいて現在既知である遺伝子の約３％を含む、１０００を超えるｍｉＲＮＡ遺伝子があり得ることが示唆された。更に、バイオインフォマティクス解析によりｍｉＲＮＡはヒトタンパク質コード遺伝子の最高３０％を制御し得ると見積もられることから、これらの低分子量ＲＮＡが複雑なシグナル伝達経路間の相互作用を協調させる働きをする可能性が示唆されている。
【０００６】
正常組織及び腫瘍組織又は癌細胞株間で異なった発現をするとして、いくつかのｍｉＲＮＡが同定されてきた。（Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，６：８５７〜８６６，２００６；Ｂａｎｄｒｅｓ，Ｅ．，Ｃｕｂｅｄｏ，Ｅ．，Ａｇｉｒｒｅ，Ｘ．，Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ，Ｒ．，Ｚａｒａｔｅ，Ｒ．，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｎ．，Ａｂａｊｏ，Ａ．，Ｎａｖａｒｒｏ，Ａ．，Ｍｏｒｅｎｏ，Ｉ．，Ｍｏｎｚｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ−Ｆｏｎｃｉｌｌａｓ，Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｏｆ １３ ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ，５：２９，２００６；Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅ，Ｙ．，Ｌｅａｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐａｇｌｉａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｄｉａｚ，Ｌ．Ａ．，Ｊｒ．，Ｓｊｏｂｌｏｍ，Ｔ．，Ｂａｒａｄ，Ｏ．，Ｂｅｎｔｗｉｃｈ，Ｚ．，Ｓｚａｆｒａｎｓｋａ，Ａ．Ｅ．，Ｌａｂｏｕｒｉｅｒ，Ｅ．，Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｋ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｓ．，Ｊｕｈｌ，Ｈ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｖ．Ｅ．Ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｏｍｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３：３６８７〜３６９２，２００６；Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｍ．Ｚ．，ＳＭ，Ｏ．Ｃ．，ｖａｎ Ｈｏｌｓｔ Ｐｅｌｌｅｋａａｎ，Ｎ．Ｇ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ Ｊａｍｅｓ，Ｒ．Ｊ．Ｒｅｄｕｃｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１：８８２〜８９１，２００３；Ｌａｎｚａ，Ｇ．，Ｆｅｒｒａｃｉｎ，Ｍ．，Ｇａｆａ，Ｒ．，Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ａ．，Ｓｐｉｚｚｏ，Ｒ．，Ｐｉｃｈｉｏｒｒｉ，Ｆ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｇ．，Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｎｅｇｒｉｎｉ，Ｍ．ｍＲＮＡ／ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ，６：５４，２００７．）。
【０００７】
ＣＲＣでは、ｍｉＲＮＡの発現パターンを調査した研究は限られている。ｍｉＲＮＡの調節解除を示した最初の研究は、ＣＲＣの初期におけるこれらのｍｉＲＮＡの潜在的な役割を示唆する、プレ腺腫様ポリープ段階のような初期でのｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５の下方制御を報告した。続いて、ＣＲＣ腫瘍において異なった発現を示す１３グループのｍｉＲＮＡが、ＣＲＣ腫瘍のステージに相関がある、ｍｉＲ−３１の発現レベルに関して同定された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、１つの形態において、細胞検体中の結腸直腸癌の存在を検出するための方法を含む。別の形態において、本発明は細胞検体中の結腸直腸癌のステージを診断するための方法である。出願者らは、野生型細胞と比較して、結腸直腸癌において異なる制御が行われる特定のｍｉＲＮＡを発見した。このようなｍｉＲＮＡにおける制御変化の度合を診断することにより、組織検体に結腸直腸癌細胞が含まれているかどうかを診断することができる。出願者らは、初期（ステージＩ及びＩＩ）の結腸直腸癌と比較して、後期（ステージＩＩＩ及びＩＶ）において異なる制御が行われる、特定の他のｍｉＲＮＡを発見した。これらのｍｉＲＮＡを監視することにより、細胞形態学など信頼性の低い識別子に依存する必要なしに、初期の腫瘍検体と、後期の腫瘍検体とを区別することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】異なった発現を示す４１のｍｉＲＮＡを用いる、ＣＲＣと、正常な結腸直腸組織との２元配置された階層型クラスタ解析。完全連結法によるユークリッド距離計量法を用いて、全ての検体にわたって、Ｌｏｇ２変換されたシグナル強度の幾何平均を算出した。赤色と青色はそれぞれ、相対的に高いレベルで、又は相対的に低いレベルでｍｉＲＮＡが発現していることを示す。ｍｉＲ−１４３−１４５及びｍｉＲ−１７−９２のクラスタはそれぞれ、垂直の青色のバー及び垂直の赤色のバーで示す。検体は３つのメインクラスタにグループ分けされており、クラスタＩは主に正常な結腸直腸組織を表し、クラスタＩＩ及びＩＩＩはＣＲＣ検体を表す。複製検体は接尾語「２」により示される。
【図２】ｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイとＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プラットフォームを比較する、ｍｉＲＮＡ発現の相関性。１９のｍｒＲＮＡｓで線形回帰を実施し、両方のプラットフォームで測定した。４つの異なるＣＲＣ検体を試験した。相関係数の範囲は０．８５〜０．９２。
【図３】新鮮凍結ＣＲＣ検体のｍｉＲＮＡ発現対ホルマリン固定パラフィン包埋ＣＲＣ検体のｍｉＲＮＡ発現。（Ａ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ発現アッセイを、４つの対応する新鮮凍結検体及びＦＦＰＥ検体由来の、２６のｍｉＲＮＡで実施した。（Ｂ）ｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイアッセイを用いての、２つの対応する新鮮凍結検体及びＦＦＰＥ検体由来の、１８のｍｉＲＮＡの発現の比較。
【図４】疾病のステージに特異的なｍｉＲＮＡの発現レベル。（Ａ）正常な結腸直腸組織から、ＣＲＣの初期（Ｉ及びＩＩ）及び後期（ＩＩＩ及びＩＶ）へと進むにつれて発現の減少を示す、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１４３、及びｍｉＲ−１４５の、ドットプロット。（Ｂ）正常な結腸直腸組織から初期（Ｉ及びＩＩ）及び後期（ＩＩＩ及びＩＶ）ＣＲＣへと進むにつれて発現の上昇を示す、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０ａ、及びｍｉＲ−１０６ａのドットブロット。
【図５】８つのＣＲＣ細胞株及び正常結腸の全ＲＮＡにおける、２２のｍｉＲＮＡの発現。Ｕ６ ｓｎＲＮＡを内在性コントロールとして用いて、ノーザンブロットを実施した。
【図６】ＳＷ６２０細胞株において、ｍｉＲ−１４５の過剰発現は、細胞の形態及び増殖に影響を与える。（Ａ）ｍｉＲ−１４５遺伝子周辺のゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモータの制御下で、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）４．１中にクローン化した。後にトランスフェクションを行うＳＷ６２０細胞のプールした集団で、ノーザン解析により、成熟したｍｉＲ−１４５を検出した。Ｕ６ ｓｎＲＮＡをローディングコントロールとして用いた。（Ｂ）ｍｉＲ−１４５過剰発現細胞集団の主要な際立った特徴は、ＳＷ６２０の、丸い単細胞から、線維芽様細胞に典型的な進展した突起を備える細長い細胞への細胞形態の変化である。（Ｃ）ｍｉＲ−１４５を発現しているＳＷ６２０細胞集団は、血清の存在下で増殖させた場合には足場非依存性増殖において２倍の増加を示し、及び血清の存在下（黒の棒線）又は不在下（白の棒線）で増殖させた場合に、細胞増殖／代謝活性において５０％を超える増加を示した（ｐ＜０．００１）。（Ｄ）ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞及び対照細胞のウエスタン解析は、成熟したｍｉＲ−１４５を発現するＳＷ６２０細胞において、Ｅ−カドヘリンの定常状態のレベルが５０％低いことを示した。
【図７】アンチセンス介在性のｍｉＲ−１４５の変換が増殖を誘導したことを示す図。（Ａ）処理検体からの全ＲＮＡは、ｍｉＲ−１４５が、ｍｉＲ−１４５特異的な２’ＯｍｅアンチセンスＲＮＡを細胞内で欠乏している一方で、モック処理対照又はｍｉＲ−１４５センス鎖処理対象は欠乏していないことを示した。（Ｂ）予想されたように、ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５を発現するプールは、血清の存在下（黒の棒線）又は不在下（白の棒線）でのベクター対照と比較して、増殖の増加を示した。ｍｉＲ−１４５アンチセンスＲＮＡで処理した場合、ＳＷ６２０／ベクター及びＳＷ６２０ｍｉＲ−１４５プールの両方で増殖の減少が見られた。３つの別個の試験を実施した（ｐ＜０．０５；ｐ＜０．０１；ｐ＜０．００１）。
【図８】ＳＷ６２０細胞株において、ｍｉＲ−１４３の過剰発現は、細胞の形態及び増殖に影響を与えることを示す図。（Ａ）ｍｉＲ−１４３ゲノムＤＮＡを、Ｕ６プロモータ（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１中）の制御下でクローン化し、ＳＷ６２０細胞へと遺伝子導入した。７つの安定なＳＷ６２０クローンが、ｍｉＲ−１４３を発現していると同定された（Ａ４、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｃ１、Ｃ５及びＤ２）。Ｕ６ ｓｎＲＮＡを、ローディングコントロールとして用いた。（Ｂ）７つのＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４３クローンを、細胞形態についてベクター対照と比較して評価した。（Ｃ）ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４３クローン及び対照細胞のウエスタン解析は、定常状態のレベルのＥ−カドヘリンを示した。Ｅ−カドヘリンの比はβ−アクチンを正規化コントロールとして用いて算出した。（Ｄ）７つのＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４３クローンを、ベクター対照と比較して、血清の存在下（黒の棒線）又は不在下（白の棒線）で増殖させた場合の増殖／代謝活性についてアッセイした。（Ｅ）同一のクローンを、血清の存在下での急速軟寒天アッセイで、足場非依存性細胞増殖について評価した。２つの独立した試験を実施した（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．００１）。
【図９】ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５発現間の相関。ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５遺伝子について、正規化された発現強度（ｌｏｇ２）を比較する線形回帰分析を実施した。ｍｉＲＮＡ間の相関係数は０．９５。
【図１０】ｍｉＲ−１７−９２のための相互作用地図を示す図。
【図１１】ＳＷ６２０細胞株において、ｍｉＲ−１７−９２クラスタ及びｍｉＲ−２０ａ単独の過剰発現は、細胞の形態及び増殖に影響を与える。１３番染色体由来のｍｉＲ−１７−９２クラスタを含有しているゲノム領域及びｍｉＲ−２０ａ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含有しているゲノム領域を、ＰＣＲ増幅し、レトロウイルスベクター（retrofviral vector）ｐＱＣＸＩＮ中にＣＭＶプロモータの制御下でクローン化し、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株に送達した。（Ａ）ノーザンブロット解析を用いて、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１８ａ及びｍｉＲ−１９ａの過剰発現について、ＨＣＴ１１６／ｍｉＲ−１７−９２クラスタクローン（４−１及び４−１７）をスクリーニングした。ｍｉＲ−２０ａのみを過剰発現しているクローン（９−３、９−９、９−１２及び９−１３）もまた、これらのクラスタ構成要素の発現についてスクリーニングした。（Ｂ）ノーザンブロットから算出した、ｍｉＲ−１７−９２構成要素のｍｉＲＮＡ発現レベルのヒストグラム。発現レベルはＵ６ ｓｎＲＮＡで正規化した。（Ｃ）ｍｉＲ−２０ａを過剰発現しているいくつかのＨＣＴ１１６クローン（９−３、９−９、９−１２、９−１３）又はｍｉＲ−１７−９２クラスタ（４−１、４−７）を、血清の存在下（黒の棒線）又は不在下（白の棒線）で細胞の増殖／代謝活性について評価した。（Ｄ）同一のクローンを、足場非依存性細胞増殖について、急速軟寒天アッセイ（血清の存在下で）で評価した（ｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
マイクロＲＮＡ（ＭｉｒｃｒｏＲＮＡｓ）（ｍｉＲＮＡ）は、様々な機構を介してタンパク質の発現を制御する、短鎖非コードＲＮＡｓである。マイクロＲＮＡの異常発現は、様々な癌と関連があることが示されてきた。ＣＲＣにおいてｍｉＲＮＡ発現をプロファイルし、ＣＲＣ細胞に特異的なｍｒＲＮＡｓの機能を解析する方法が、本明細書に記載される。８つのＣＲＣ細胞株モデル、異なるステージの４５のヒトＣＲＣ検体及び４つの正常な結腸組織検体におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルを診断するために、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡバイオアレイを使用した。細胞株モデル及び臨床検体の両方で、正常結腸及びＣＲＣ間で異なった発現をする、１１の共通のｍｉＲＮＡを同定した。ＣＲＣにおいて非常に減少するｍｉＲ−１４５を含む、これらのｍｉＲＮＡの多くが、ＣＲＣ腫瘍進行の異なるステージに関連付けられることが現在までに示されている。インビトロのデータは、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５が、細胞のおかれた状況に基づいた細胞増殖の阻害又は増強のいずれかと逆に機能することを示した。ｍｉＲ−３１及びｍｉＲ−１７−９２クラスタを含むいくつかのｍｉＲＮＡがまた、ＣＲＣにおいて過剰発現していた。ＳＷ６２０ ＣＲＣ細胞におけるｍｉＲ−１７−９２の増強は、細胞増殖を抑制したが、足場非依存性増殖は増加させた。このｍｉＲＮＡクラスタの詳細な分析は、ｍｉＲ−２０Ａが活性化因子であることを示した。したがって、ｍｉＲＮＡは、ＣＲＣ治療、並びに診断及び予後診断検体用の標的となり得る。
【００１１】
４５の臨床ＣＲＣ検体、４つの対応する正常な結腸直腸組織及び８つの細胞株モデルにおけるｍｉＲＮＡの発現をプロファイルした。正常結腸と臨床検体及び細胞株の両方との間で発現レベルが共通して変化した、１１のｍｉＲＮＡが同定された。ＣＲＣの異なるステージについて、いくつかのｍｉＲＮＡの発現パターンを限定することで、この癌のための潜在的な予後診断又は診断マーカーを提供することができる。ＣＲＣモデル細胞株におけるｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の再発現は、反対の様式で、細胞の分化及び増殖の両方に影響を与える。加えて、ｍｉＲ−１７−９２クラスタの発現の増加は細胞増殖を抑制したが、足場非依存性増殖は増加させた。このクラスタの詳細な分析は、ｍｉＲ−２０ａが、これらの細胞のおかれた状況に依存して作用する活性化因子であることを示す。
【００１２】
バイオマーカーは示されたマーカー遺伝子の発現レベルの任意のしるしである。しるしは、直接的又は間接的なものであり、生理的パラメーターを付与された遺伝子の過剰発現又は過少発現を、内部対照群、正常な組織、又は別の癌と比較して測定することができる。バイオマーカーとしては、核酸（過剰発現及び過少発現、並びに直接的なもの及び間接的なもの、の両方）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸をバイオマーカーとして使用することには、限定するものではないが、ＤＮＡ増幅産物、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ヘテロ接合性欠失（ＬＯＨ）、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、マイクロサテライトＤＮＡ、ＤＮＡの低又は高メチル化、を測定することが挙げられる、当該技術分野において既知の任意の方法を含むことができる。タンパク質をバイオマーカーとして使用することには、限定するものではないが、量、活性、グリコシル化、リン酸化反応、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン化等の修飾、又は免疫組織化学（ＩＨＣ）を測定することが挙げられる、当該技術分野において既知の任意の方法を含むことができる。他のバイオマーカーとしては、イメージング、細胞計数及びアポトーシスマーカーが挙げられる。
【００１３】
本明細書で提供される示された遺伝子又はｍｉＲＮＡは、特定の腫瘍型又は組織型と関連付けられる。１つ以上の癌と関連付けられる数多くの遺伝子が当該技術分野において既知である。本発明は、好ましいマーカー遺伝子、及び更により好ましくはマーカー遺伝子の組み合わせを提供する。これらは本明細書中で詳しく記載される。
【００１４】
マーカー遺伝子は、配列番号によって指定される配列に対応する（遺伝子がこの配列又はこの相補体を含む場合）。遺伝子セグメント又は遺伝子断片は、基準配列、又はその相補体の一部を、これが遺伝子の配列であるものとして見分けるために十分に含む場合、このような遺伝子配列に対応する。遺伝子発現産物は、そのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｃＤＮＡがかかる配列を有する組成物（例えば、プローブ）とハイブリダイズする場合にはかかる配列に対応し、すなわち、遺伝子発現産物がペプチド又はタンパク質である場合には、これらはかかるｍＲＮＡによってコードされている。遺伝子発現産物のセグメント又は断片は、これらを遺伝子又は遺伝子発現産物の配列であるとして区別するのに十分な程度に、基準とされる遺伝子発現産物の一部又はその相補体の一部を含有している場合、かかる遺伝子又は遺伝子発現産物の配列と対応する。本明細書で記載され請求される本発明の方法、組成物、物品及びキットは１つ以上のマーカー遺伝子を含む。「マーカー」又は「マーカー遺伝子」は、過剰発現又は過少発現が腫瘍型又は組織型に関連付けられる任意の遺伝子に対応する、遺伝子及び遺伝子発現産物を指すために、本明細書を通して使用される。好ましいマーカー遺伝子が本明細書においてより詳細に記載される。本明細書において議論される全ての配列が本明細書中に記載され、配列表で提供される。本発明は更に本明細書で提供される方法に従うアッセイを行うためのキットを提供し、更にバイオマーカー検出試薬を含む。本発明は更に、本明細書に記載の方法を実施するためのマイクロアレイ又は遺伝子チップを提供する。本発明は更に、分離された核酸配列、それらの相補体、又は本明細書に記載されるような遺伝子の組み合わせの一部を含有する診断／予後診断ポートフォリオを提供し、ここでこの組み合わせは、異なる癌又は正常組織からの細胞に関連する転移性の細胞を有する生体検体中の遺伝子発現を、測定又は特徴づけることができる。
【００１５】
本発明に記載されるいずれかの方法が、検体中で恒常的に発現されている少なくとも１つの遺伝子の発現を測定することを更に含み得る。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載の方法に従ってＣＲＣの状態を診断し、ＣＲＣのための適切な治療を同定することによる、治療の方向性を提供するための方法を更に提供する。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載の方法に従ってＣＲＣの状態を診断し、ＣＲＣのための対応する予後診断を同定することによる、予後診断を提供するための方法を更に提供する。
【００１８】
本発明は、配列番号１〜３４から選択された少なくとも１つの分離された配列を含む組成物を更に提供する。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載のアッセイを行うためのキット、物品、マイクロアレイ又は遺伝子チップ、診断／予後診断ポートフォリオ、並びに本方法によって得られた結果を報告するための患者報告書（patient reports）を更に提供する。
【００２０】
組織検体中の特定の核酸配列の単なる存在又は不在が、診断又は予後診断的な価値を有するものとして見出されることは稀である。それに対して様々なタンパク質、ペプチド、ｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡの発現についての情報は、ますます重要視されている。タンパク質、ペプチド、ｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを発現する可能性を有する核酸配列（「遺伝子」と称される配列）の単なる存在は、ゲノム内で単独に存在するだけでは、タンパク質、ペプチド、又はｍＲＮＡが所与の細胞内で発現されるか否かを決定する要因にはならない。かかる産物を発現することのできる所与の遺伝子が発現するかどうか、及び仮に発現したとして、このような発現がどの程度生じるかは、様々な複雑な要因によって決定される。これらの要因の理解及び評価の難しさとは関係なく、遺伝子発現の解析は、腫瘍形成、転移、アポトーシス、及び他の臨床的に関連する現象などの、重要な事象の発生に関する有用な情報を提供し得る。遺伝子の活性又は不活性の程度の相対的な目安は、遺伝子発現プロファイルに見出すことができる。本発明の遺伝子発現プロファイルは、ＣＲＣについての患者の診断及び治療を提供するために使用される。
【００２１】
検体調製には、患者検体の収集を必要とする。本発明の方法で使用される患者検体は、例えば組織の穿刺吸引細胞診（ＦＮＡ）で小結節から採取された細胞などの、異常細胞を含有している疑いのあるようなものである。生検標本又は外科標本、及びレーザーキャプチャー法（ＬＣＭ）から得られる腫瘤組織（Bulk tissue）の調製もまた、使用に好適である。ＬＣＭ技術は、研究する細胞を選択する１つの方法であり、細胞型の不均一性によって生じるばらつきを最小化する。その結果として、正常又は良性及び悪性細胞間での、マーカー遺伝子の発現における中程度の又は少しの変化を容易に検出することができる。検体はまた、末梢血から抽出される循環上皮細胞を含む場合もある。これらは、多くの方法に従って得ることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第６１３６１８２号に記載される磁気分離技術である。一度対象とする細胞を含有している検体が得られると、適切なポートフォリオの遺伝子のためのバイオマーカーを用いることで、遺伝子発現プロファイルが得られる。
【００２２】
遺伝子発現プロファイルを確立するための好ましい方法は、遺伝子によって産生されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのいずれか）の量を診断することを含む。これは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、示差表示ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、及び他の関係する試験によって達成することができる。個別のＰＣＲ反応を使用するこれらの技術を実行することが可能であるが、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡから生成される相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又は相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅し、マイクロアレイ又は他の好適な方法によってこれを解析することが最善である。多くの異なるアレイ配列、及びこれらの生成のための方法が、当業者には既知であり、例えば、米国特許第５４４５９３４号、同第５５３２１２８号、同第５５５６７５２号、同第５２４２９７４号、同第５３８４２６１号、同第５４０５７８３号、同第５４１２０８７号、同第５４２４１８６号、同第５４２９８０７号、同第５４３６３２７号、同第５４７２６７２号、同第５５２７６８１号、同第５５２９７５６号、同第５５４５５３１号、同第５５５４５０１号、同第５５６１０７１号、同第５５７１６３９号、同第５５９３８３９号、同第５５９９６９５号、同第５６２４７１１号、同第５６５８７３４号、及び同第５７００６３７号に記載されている。
【００２３】
マイクロアレイ技術は、何千もの遺伝子の安定した状態のｍＲＮＡレベルの同時測定を可能にし、無制御の細胞増殖の発生、停止、又は調節等の効果を同定するための強力なツールを提供する。現在ではいくつかのマイクロアレイ技術が普及している（ｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイ、ｃＤＮＡアレイ及びオリゴヌクレオチドアレイ）。これらのチップの構成には違いが存在するものの、実質的に全ての下流のデータ解析及び出力は同じである。これらの解析の結果は、典型的には、マイクロアレイの既知の位置で核酸配列にハイブリダイズする、検体からのｃＤＮＡ配列を検出するために使用される標識されたプローブから受信される、シグナルの強度の測定値である。典型的には、シグナルの強度は、試料細胞内に発現したｃＤＮＡ、ひいてはｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの量に比例している。多くのこのような技術が利用可能であり有用である。遺伝子の発現を診断するための好ましい方法は、米国特許第６２７１００２号、同第６２１８１２２号、同第６２１８１１４号、及び同第６００４７５５号に見出すことができる。
【００２４】
発現レベルの解析は、かかるシグナル強度を比較することによって行われる。これは、試験検体の遺伝子の発現強度と対照検体のそれとの比率マトリックスを生成することによって最良に行われる。例えば、異常組織からの遺伝子発現強度が、同型の良性又は正常な組織から生成される発現強度と比較され得る。これらの発現強度の比率は、試験検体と対称検体との間の遺伝子発現における倍数変化を示す。
【００２５】
選択は、腫瘍形成に関連する因子間の各遺伝子の異なった発現に対する有意な証拠に関連したランク付けリストを生成する、統計的な検定に基づくことができる。このような試験の例としては、ＡＮＯＶＡ及びＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓが挙げられる。ランク付けは、カットオフ値までの、このような重さの合計を、あるクラスが別のクラスよりも優位であることを肯定する証拠として解釈するように設計されたモデルにおける重み付けとして使用され得る。本文献において記載される先の証拠もまた、重み付けを調整するために使用され得る。
【００２６】
遺伝子発現プロファイルは、様々な方法で表され得る。最も一般的には、未調整の蛍光強度、又は比率マトリックスをグラフィカルデンドログラム（dendogram）に配置し、列が試験検体を示し、行が遺伝子を示す。同様の発現プロファイルを有する遺伝子が、互いに近位にあるように配列される。各遺伝子の発現比率が色で可視化される。例えば、１未満の比率（下方制御）が、スペクトルの青色部分で表示される一方で、１を超える比率（上方制御）は、スペクトルの赤色部分で表示される。「ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ」（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」及び「Ｉｎｆｅｒ（商標）」（Ｐａｒｔｅｋ，Ｉｎｃ．）を含む、市販のコンピューターソフトウェアプログラムが、このようなデータを表示するために利用できる。
【００２７】
特有のＲＮＡ種の豊富さについての測定値が、生体検体からの原発腫瘍又は転移性腫瘍から収集される。臨床的な記録に沿うこれらの指数には、限定するものではないが、患者の年齢、性別、原発腫瘍の起源及び転移部位（該当する場合）が挙げられ、関係データベースを生成するために使用される。データベースは、ＣＲＣの存在、予後又は状態を診断するためのマーカーの変数として使用することができる、ｍｉＲＮＡ転写物及び臨床的な因子を選択するために使用される。
【００２８】
遺伝子発現を診断するためにタンパク質レベルを測定する場合、十分な特異性及び感度を生じるのであれば、当技術分野で公知の任意の方法が好適である。例えば、タンパク質レベルは、タンパク質に特異的な抗体又は抗体断片を結合させ、抗体結合タンパク質の量を測定することにより測定することができる。抗体を放射性、蛍光又は他の検出可能な試薬により標識して、検出を容易にすることができる。検出する方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び免疫ブロット法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の方法で使用された調節された遺伝子が、実施例で記載される。異なった発現をする遺伝子は、ＣＲＣに罹患していない者あるいは異なったＣＲＣの状態又は進行の患者と比較して、ＣＲＣ患者で上方又は下方制御のいずれかがなされている。上方制御及び下方制御は、一定の基準に対する遺伝子の発現の程度において、検出可能な差異（これを測定するために使用されるシステムのノイズの寄与以外）が見出されることを意味する、相対的な用語である。異常細胞中の対象とする遺伝子は次に、同じ測定方法を使用して、基準濃度に対して上方制御又は下方制御される。この関連において、疾病を有する、とは制御されない細胞の増殖を生じ、身体機能の適切な性能を中断若しくは阻害するか、又は阻害する可能性を有する身体の状態変化を指す。ある人の遺伝子型又は表現型のある態様が、疾病の存在と合致する場合、その人は疾病を有するものとして診断される。
【００３０】
診断又は予後診断を行う行為は、疾病／状態の問題の診断、例えば、再発の可能性、治療の種類、及び治療の監視などの診断を含み得る。治療監視では、経時的な遺伝子の発現を比較して、遺伝子発現プロファイルが、正常な組織とより一致するパターンに変化したか、又は変化しつつあるかを診断することによって所与の治療経過の効果に関連して、臨床的な判断が行われる。
【００３１】
遺伝子が分類され、その結果その分類の中の一連の遺伝子に関して得られる情報が、臨床的に関連する判断、例えば、診断、予後診断、又は治療選択などを行うための確固とした基盤を提供し得る。これらの一連の遺伝子は、本発明のポートフォリオを作成する。ほとんどの診療マーカーがそうであるように、多くの場合、正しい医療判断を行うために十分な、最小限の数のマーカーを使用することが、好ましい。これは、更なる解析を待つ間の治療の遅延、並びに時間及び資源の非生産的使用を回避する。
【００３２】
ポートフォリオの選択のプロセスはまた、ヒューリスティックルールの用途を含み得る。好ましくはこのようなルールは、生物学、及び臨床結果を生成するために使用される技術の理解に基づいて生成される。より好ましくは、これらは、最適化された方法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散方法は、癌患者において異なる様式で発現された多くの遺伝子の、マイクロアレイデータに適用され得る。この方法からの出力は、末梢血、加えて異常組織中に発現されたいくつかの遺伝子を含み得る遺伝子の最適化されたセットであり得る。試験方法で使用される検体が末梢血から得られ、癌の事例において異なる様式で発現された一定の遺伝子がまた、末梢血中で異なる様式で発現され得る場合、ポートフォリオが、末梢血中で異なる様式で発現されたものを除く、効果的境界から選択される、ヒューリスティックルールが適用され得る。当然、例えば、データ予備選択の間にルールを適用することにより、効果的な境界の形成の前にルールを適用することができる。
【００３３】
遺伝子発現ポートフォリオの設定の一方法は、資源ポートフォリオの設定において広範に使用される、平均分散アルゴリズムなどの、最適化アルゴリズムの使用による。この方法は、米国特許第２００３０１９４７３４号において詳細に記載される。本質的に、この方法は、それを使用するために受信されるリターン（例えば、生成されるシグナル）を最適化する一方で、リターンのばらつきを最小化する、一連の入力の設定を必要とする（財政適用における株式、本明細書における強度により測定される発現）。かかる操作を実行するために、多くの業務用ソフトウェアが利用できる。本明細書を通して「Ｗａｇｎｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」として参照される「Ｗａｇｎｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｍｅａｎ−Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」が好ましい。このソフトウェアは、効果的境界及び最適なポートフォリオを決定するために、「Ｗａｇｎｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｍｅａｎ−Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ」からの機能を使用し、そしてＭａｒｋｏｗｉｔｚセンスにおける最適ポートフォリオが好ましい。Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ（１９５２）。このタイプのソフトウェアの使用は、ソフトウェアがその意図された財政分析目的のために使用される場合、株式リターンの方法で入力として処理され、リスク測定値が使用されるように、マイクロアレイデータが変換され得ることを必要とする。
【００３４】
ポートフォリオの選択のプロセスはまた、ヒューリスティックルールの用途を含み得る。好ましくはこのようなルールは、生物学、及び臨床結果を生成するために使用される技術の理解に基づいて生成される。より好ましくは、これらは、最適化方法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散方法は、癌患者において異なる様式で発現された多くの遺伝子の、マイクロアレイデータに適用され得る。方法からの出力は、末梢血、加えて異常組織中に発現されたいくつかの遺伝子を含み得る遺伝子の最適化されたセットである。試験方法で使用される検体が末梢血から得られ、癌の事例において異なる様式で発現された一定の遺伝子がまた、末梢血中で異なる様式で発現され得る場合、ポートフォリオが、末梢血中で異なる様式で発現されたものを除く、効果的境界から選択される、ヒューリスティックルールが適用され得る。当然、例えば、データ予備選択の間にルールを適用することにより、効果的な境界の形成の前にルールを適用することができる。
【００３５】
必ずしも問題となっている生物学とは関係しない、他のヒューリスティックルールを適用することができる。例えば、記載されたポートフォリオの比率のみが特定の遺伝子又は遺伝子群によって表され得るようなルールを適用することができる。Ｗａｇｎｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅなどの市販のソフトウェアは、このような種類のヒューリスティックを容易に適合させる。これは、正確性及び精密性以外の要因（例えば、予測されるライセンス料）が、１つ以上の遺伝子を含めることの望ましさに影響する場合に有用であり得る。
【００３６】
本発明の遺伝子発現プロファイルはまた、癌診断、予後診断、又は治療監視において有用な、他の非遺伝子診断的な方法と共に使用することができる。例えば、一定の状況では、上記の遺伝子発現に基づく方法の診断能力と、従来的なマーカー、例えば、血清タンパク質マーカー（ｅ．ｇ．，Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ ２７．２９（「ＣＡ ２７．２９」））からのデータを組み合わせることが有益である。ＣＡ ２７．２９などの検体を含む、様々なマーカーが存在する。１つのこのような方法では、治療される患者から定期的に血液が採取され、上記の血清マーカーの１つについて酵素イムノアッセイに供される。マーカーの濃度が、腫瘍の再発、又は治療の失敗を示唆する場合、遺伝子発現解析を受ける検体源が採取される。疑わしい腫瘤が存在する場合、穿刺吸引細胞診（ＦＮＡ）がとられ、腫瘤から取られる細胞の遺伝子発現プロファイルが、上記のように解析される。あるいは、組織検体が、腫瘍が以前取り除かれた組織に隣接する領域からとられ得る。この手法は、他の試験手順が曖昧な結果を生じる場合に特に有用であり得る。
【００３７】
本発明に従って作製されたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するための、形式を合わせたアッセイを含む。これらは、アッセイを行うために必要な材料、例えば、試薬、並びにバイオマーカーを解析するための命令及び媒体の全て、又はいくつかを含み得る。
【００３８】
本発明の物品には、治療、診断、予後診断、及び他の方法で疾病を評価するために有用な遺伝子発現プロファイルの表示を含む。これらの特性表示は、コンピューター読み取り可能な媒体（磁気、光学など）などの機械によって自動的に読み取ることができる媒体に変換される。物品はまた、このような媒体における、遺伝子発現プロファイルを評価するための命令も含み得る。例えば、物品は、上記の遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現特性を比較するためのコンピューター命令を有するＣＤ−ＲＯＭを含んでもよい。物品はまた、その中にデジタル処理で記録される遺伝子発現プロファイルを有してもよく、それによってこれらは、患者検体からの遺伝子発現データと比較され得る。あるいは、特性は、異なる表現形式で記録されてもよい。図形的な記録が１つのそのような形式である。クラスタ化アルゴリズム、例えば、上記のＰａｒｔｅｋ社からの「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」及び「ＩＮＦＥＲ」ソフトウェアに組み込まれるものは、このようなデータの可視化を最も良好に補助することができる。
【００３９】
本発明に従って作製されたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するための、形式を合わせたアッセイを含む。これらは、アッセイを行うために必要な材料、例えば、試薬、並びにバイオマーカーを分析するための命令及び媒体の全て、又はいくつかを含み得る。
【００４０】
本発明の物品としては、治療、診断、予後診断、及び他の方法で疾病を評価するために有用な遺伝子発現プロファイルの表示を含む。これらの特性表示は、コンピューター読み取り可能な媒体（磁気、光学など）などの機械によって自動的に読み取ることができる媒体に変換される。物品はまた、このような媒体における、遺伝子発現プロファイルを評価するための命令も含み得る。例えば、物品は、上記の遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現特性を比較するためのコンピューター命令を有するＣＤ−ＲＯＭを含んでもよい。物品はまた、その中にデジタル処理で記録される遺伝子発現プロファイルを有してもよく、それによってこれらは、患者検体からの遺伝子発現データと比較され得る。あるいは、特性は、異なる表現形式で記録されてもよい。図形的な記録が１つのそのような形式である。クラスタ化アルゴリズム、例えば、上記のＰａｒｔｅｋ社からの「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」及び「ＩＮＦＥＲ」ソフトウェアに組み込まれるものは、このようなデータの可視化を最も良好に補助することができる。
【００４１】
本発明による製品の異なる種類の物品は、遺伝子発現特性を表すために使用される媒体、又は形式を合わせたアッセイである。これらは、例えば、マイクロアレイを含む場合があり、この中で配列相補体、又はプローブがマトリックスに取り付けられ、これに対象とする遺伝子の指標となる配列が結合し、それらの存在の読み取り可能な行列式を生成する。あるいは、本発明に従った物品は、対象とする遺伝子の発現レベルを示すハイブリダイゼーション、増幅、シグナル生成を実施するための試薬キットにすることができる。
【００４２】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、限定するためのものではない。本明細書で引用する全ての参考文献は、参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
方法
細胞株
ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞株は、ＡＴＣＣから入手された。ＫＭ２０Ｌ２及びＫＭ１２Ｃは、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ ＤＣＴ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから供給され、細胞株ＫＭ２０及びＫＭ１２ＳＭは、Ｄｒ Ｉｓａｉａｈ Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）から供給された。ＳＷ６２０及びＳＷ４８０細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。ＨＣＴ１１６細胞は、マッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養され、ＫＭ２０、ＫＭ２０Ｌ２、ＫＭ１２Ｃ、ＫＭ１２ＳＭ及びＨＴ２９細胞は、ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。全ての培地に、１０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ペニシリン０．１Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン０．１μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）が加えられたが、ただし例外としてＨＴ２９細胞は０．７２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で培養された。
【００４４】
臨床検体
合計で４９の急速冷凍ＣＲＣ検体が、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｃ．（ＧＣＩ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）又はＣｌｉｎｏｍｉｃｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）から入手され、これには正常結腸４検体、ステージＩが４検体、ステージＩＩが１９検体、ステージＩＩＩが２０検体、ステージＩＶが２検体含まれていた（表１）。更に、一致する８検体の、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）検体（ステージＩＩが３検体、ステージＩＩＩが４検体、ステージＩＶが１検体）が入手された。全ＣＲＣ検体の腫瘍含有率の中央値は７０％であり、初期（Ｉ及びＩＩ）と後期（ＩＩＩ及びＩＶ）の疾病との間に腫瘍含有率の有意差はなかった。
【表１】
ＭＡＣ＝修正アストラーカラー分類、ＮＡ＝ｍｉＲＮＡプロファイルが入手不能
【００４５】
２８７のヒトｍｉＲＮＡプローブを含むｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイ（Ａｍｂｉｏｎ、バージョン１）を、ＣＲＣ ｍｉＲＮＡシグネチャーを同定するために使用した。Ｓｈｉｎｇａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）。ｍｉＲＮＡは、急速冷凍検体についてはｍｉｒＶａｎａ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ）、及びＦＦＰＥ検体用ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）総核酸分離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して結腸直腸検体から得た全ＲＮＡ５μｇから分離した。全検体は、次にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｆｌａｓｈＰＡＧＥ（商標）、Ａｍｂｉｏｎ）によって分画され、直鎖アクリルアミドと共にエタノール沈殿により低分子量ＲＮＡ（＜４０ｎｔ）が回収された。ｍｉＲ−１６の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）が、ｍｉＲＮＡアレイ解析前のｍｉＲＮＡ濃縮を確認するために使用された。
【００４６】
全検体から得られた低分子量ＲＮＡには、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応を行い、アミン修飾されたウリジンを組み込んだ（Ａｍｂｉｏｎ）。テール付加された検体を、次に、アミン反応性Ｃｙ３又はＣｙ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して蛍光標識した。臨床ＣＲＣ又は細胞株の、プロファイリング実験のために、一色又は二色ハイブリダイゼーションをそれぞれ実施した。二色実験については、細胞株ｍｉＲＮＡが正常結腸ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）と直接比較された。蛍光標識されたＲＮＡは、ガラス繊維フィルタを使って精製し、溶出した（Ａｍｂｉｏｎ）。各検体は次に、４２℃で１４時間にわたってバイオアレイスライドにハイブリダイゼーションさせた（Ａｍｂｉｏｎ）。このアレイを次に洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２５０５Ｂ共焦点レーザーマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてスキャンし、発現解析ソフトウェア（Ｃｏｄｅｌｉｎｋ、バージョン４．２）を使用してデータを得た。
【００４７】
実施例２に概略されるように、特異的なｍｉＲＮＡのノーザンブロット解析を実施した。
【００４８】
統計分析
データはＲソフトウェアパッケージを使用して解析した。データはクオンタイル正規化を行ってから、遺伝子発現の差を診断した。複製検体及びプローブ値を平均し、スチューデントのｔ検定を実施して、検体群間で有意に異なる遺伝子を調べた。少なくとも１つの群について正規化されたシグナル強度の中央値が１００（中央値シグナルの７５パーセンタイル）を超え、平均変化が＞１．５倍かつｐ値＜０．０５である場合、その遺伝子を選択した。ｍｉＲＮＡ発現レベルを評価するために一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを確認するために、ＡＢＩ ｍｉＲＮＡ ＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬を使用してＱＰＣＲを実施した。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）。メーカー（Ａｍｂｉｏｎ）の取扱説明書に従って、１０ｎｇの全ＲＮＡを、高能力ＤＮＡアーカイブキット及び３μｌの５ｘ ＲＴプライマーを使ってｃＤＮＡに変換した。１５μＬの反応物を、サーマルサイクラー中で、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃に保持した。全ての逆転写酵素（ＲＴ）反応に、テンプレート制御は含まれなかった。ＱＰＣＲが、標準Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲキットプロトコルを使って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ配列検出システム上で行われた。１０μｌのＰＣＲ反応液には、０．６６μｌのＲＴ製品、１μｌのＴａｑｍａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイプライマー及びプローブミックス、５μｌのＴａｑｍａｎ（登録商標）２ｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（Ａｍｐｅｒａｓｅ ＵＮＧは用いない）並びに３．３４μｌの水を含んだ。反応液は、３８４ウェルプレート内にて９５℃で１０分、その後９５℃で１５秒、及び６０℃で２分の４０サイクルでインキュベートした。全てのＱＰＣＲ反応はｃＤＮＡコントロールを一切含まず、全ての反応は３つ組（triplicate）で行われた。
【００４９】
プラスミド作成
特有の制限部位とＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写終結領域（ＴＴＴＴＴＴ）とを導入するために、ｐｌａｓｍｉｄ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１（Ａｍｂｉｏｎ）をマルチクローニングサイト内で改変した。以下のオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ）、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで前消化したｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１にアニーリングさせて連結させ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１末端を作成した：ｐＳｉｌＵ６ｕｐｐｅｒ ５’ＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ（配列番号：１）及びｐＳｉｌＵ６ｌｏｗｅｒ ５’ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧ（配列番号：２）。ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４３又はｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５をコードしているＤＮＡを、プライマー１４３Ｆ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＴＣ（配列番号：３））及び１４３Ｒ（５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡ（配列番号：４））を用いてヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、次いで、ｍｉＲ−１４３発現プラスミドを作成するためにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１末端に連結させた。ｍｉＲ−１４５のため、ゲノムＤＮＡを、プライマー１４５Ｆ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＴＡＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣ（配列番号：５））及び１４５Ｒ（５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号：６））を用いてＰＣＲ増幅産物として回収し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、ＣＭＶプロモータの制御下でｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）４．１中に連結させた。ｍｉＲ−２０ａか又はｍｉＲ−１７−９２クラスタをコードしているレトロウイルス性の発現ベクターを作成するために、ゲノムＤＮＡ領域をヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＱＣＸＩＮ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中にクローン化した。ｍｉＲ−２０ａ用に用いたＰＣＲプライマーはｍｉＲ−２０Ｆ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣ（配列番号：７））及びｍｉＲ−２０ａＲ（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＡＡ（配列番号：８））であり、ｍｉＲ−１７−９２クラスタを増幅するために用いたプライマーはｍｉＲｃＦ（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣＣＣＡＴＴＡＧＧＧＡＴＴＡＴＧＣ（配列番号：９））及びｍｉＲｃＲ（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＣＧＣＡＡＣＣ（配列番号：１０））である。安定発現株の生成 ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１（ｍｉＲ−１４３）及びｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）４．１（ｍｉＲ１４５）プラスミドを用いて安定なクローンを生成するために、１〜５×１０６個の細胞（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０）を６ウェルプレートの単一のウェルに播種した。８０〜９０％コンフルエンスに達したら、メーカーの取扱説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞に４μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。細胞を、５００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有している新鮮な培地に希釈し、蒔いた。選択から１４日後、別個のクローンを採集し、増大させ、トランスフェクトしたプラスミド（実施例２）によってコードされている特異的なｍｉＲＮＡの発現についてスクリーニングした。
【００５０】
レトロウイルス性の形質導入を用いてＨＣＴ１１６細胞の安定なクローンを作成するために、レトロウイルスパッケージング細胞株Ａｍｐｈｏｐａｃｋ（商標）ＨＥＫ ２９３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＧ１３を１０：１の比で混合し、次いでリン酸カルシウムを用いて１０μｇのｐＱＣＸＩＮベクターでトランスフェクトした。２４時間の形質導入後、ウイルスを含有している培地を回収し、ＨＣＴ１１６細胞を形質導入するのに用いた。細胞を希釈し、回収して、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を培地に添加して、２週間にわたってクローンを選択した。別個のクローンの特徴付けは、プラスミドトランスフェクションについて上記されている通りである。
【００５１】
アンチセンス実験
ビオチン化２’−Ｏ−メチルアンチセンスｍｉＲ−１４５ ＲＮＡ又は対照を、実施例２に記載のように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳＷ６２０に送達した。トランスフェクション効率は、全ての実験において少なくとも８０％であった。全ての実験を三組で実施した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）増殖アッセイＳＷ６２０細胞（３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）及びＨＣＴ１１６細胞（２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を、血清含有培地の入った９６ウェルプレートに播種した。細胞生存率解析を、０日（播種した当日）と５日で行った。全２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間にわたってインキュベートした。ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて蛍光を測定した。無血清解析を行うために、培地を１日後無血清培地に変えた。急速軟寒天アッセイ２Ｘイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）に、０．６％重炭酸ナトリウム、２０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、２Ｘ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、２％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（０．１Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１μｇ／ｍＬストレプトマイシン）（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。２Ｘ ＩＭＤＭを１．２％Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（５５℃）と１：１の比で混合し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０μＬ添加してアッセイのための基層を作成した。ＳＷ６２０細胞（３×１０３個）又はＨＣＴ１１６細胞（２×１０３個）を含有している細胞懸濁液１０μＬ、２Ｘ ＩＭＤＭ ２０μＬ及び０．８％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ（５５℃）３０μＬを混合し、各ウェル中の固化した基層に移した。２Ｘ ＩＭＤＭ２５μＬ及び１．２％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ（５５℃）２５μＬを混合して、半固体の支持細胞層を調製し、固化した細胞層上に積層した。細胞を、増殖させるために３７℃のＣＯ２インキュベーター中に７日間にわたって放置した。増殖性及び細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてスコア化した。生細胞イメージング
Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ及びＮｉｋｏｎ Ｅ９９５デジタルカメラを、細胞形態の画像を捕捉するために使用した。結果臨床ＣＲＣ検体におけるｍｉＲＮＡプロファイリング
我々はまず４９のヒト結腸直腸検体（４つの正常結腸、４つのステージＩのＣＲＣ、１９のステージＩＩのＣＲＣ、２０のステージＩＩＩのＣＲＣ及び２つのステージＩＶのＣＲＣ）を、正常組織及び腫瘍組織間、並びに初期及び後期疾病間で異なるｍｉＲＮＡ発現についてプロファイルした（表１）。ＣＲＣ及び正常結腸組織間で異なる発現をしたｍｉＲＮＡを、全部で３７同定した（表２）。
【表２】
ａ．正規化した中央値シグナル強度（ｌｏｇ２）
ｂ．癌：正常
ｃ．ｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ前駆体間の識別をすることができなかったため、一部のｍｉＲＮＡの染色体位置は多義的である。ＣＲＣにおいて頻発する染色体の増加及び減少はＳｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２００６）に要約されている通りである。
【００５２】
これらのｍｉＲＮＡのほとんどが、ＣＲＣにおいて頻繁に増加及び減少することが既知である染色体領域に関連付けられる。Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２００６）。階層的なクラスタリングは、ｍｉＲ−１４３−１４５及びｍｉＲ−１７−９２クラスタ（それぞれＣＲＣにおいて一貫して減少又は増加制御されている）が挙げられる、これらのｍｉＲＮＡの多くが協調して発現することを示した（図１）。興味深いことに、ｍｉＲ−１−１３３ａクラスタとｍｉＲ−１４３−１４５クラスタは、これら２つのクラスタが異なる染色体上に存在するものであるにも関わらず、転写的に密接な協調を示した。我々は次いで、４つの臨床ＣＲＣ検体中で異なった発現をした３７のｍｉＲＮＡのうち１９を、ＱＰＣＲ解析を用いて検証した（図２）。プラットフォーム間のｍｉＲＮＡ発現の相関は０．８５〜０．９２の範囲である。階層的クラスタリングはまた複製検体がお互いに近位であることを示したが、加えて高い割合で再現可能な結果であることを示している。ｍｉＲＮＡはまた、それぞれ０．９２及び０．８５の平均相関値でＡｍｂｉｏｎ ｍｉｒＶａｎａ（商標）アレイ又はＡＢＩ ＱＰＣＲプラットフォームのいずれかを用いることで、対応するＦＦＰＥ ＣＲＣ検体においても再現可能に検出され得る（図３）。ＦＦＰＥ検体中のｍｉＲＮＡが再現可能に検出されたことは、これらの検体が診断試験に幅広く利用可能であることから、重要な観察結果であった。特異的なｍｉＲＮＡ発現がＣＲＣステージに関連付けられる。我々は、正常及び初期（ステージＩ及びＩＩ）ＣＲＣ間で異なる発現をした２２のｍｉＲＮＡ（表３）と、初期及び後期（ステージＩＩＩ及びＩＶ）疾病間で有意に異なる発現を示した６つのｍｉＲＮＡ（表４）を同定した。後期にｍｉＲ−３１の発現が増加した一方で、ｍｉＲ−１３３ａは有意に減少した（図４Ａ及びＢ）。したがって、これらのｍｉＲＮＡはＣＲＣの進行と関連付けられ、ＣＲＣのステージ分類のための潜在的なバイオマーカーとして機能し得る。
【表３】
発現比（Fold change）＝癌：正常
【表４】
発現比＝ステージＩＩＩ／ＩＶ：ステージＩ／ＩＩ
ＣＲＣ細胞株中のｍｉＲＮＡのプロファイリング
【００５３】
異なった発現をするｍｉＲＮＡの機能解析用にＣＲＣ細胞株を同定するために、並びに臨床検体及び細胞株でのｍｉＲＮＡ発現間の関係性を検討するために、我々は正常な結腸上皮細胞及び４つのＣＲＣ細胞株モデル（ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＫＭ１２Ｃ、ＫＭ１２ＳＭ）間のｍｉＲＮＡ発現を、本解析からのｍｉｒＶａｎａ（商標）バイオアレイを用いて比較し、４つのＣＲＣ細胞株の少なくとも１つにおいて２倍上昇又は２倍減少のいずれかの状態にあるとして、４３のｍｉＲＮＡを同定した（表５）。
【表５】
【００５４】
マイクロアレイデータを検証するために、及びスクリーニングされるＣＲＣ株（line）の数を増大させるために、我々は８つのＣＲＣ細胞株中のこれらの２２のｍｉＲＮＡについてノーザンブロット解析を実施した（図５）。臨床検体中に同定されたこれらのｍｉＲＮＡのうち、１１つは、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１７−９２クラスタのｐメンバー、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ１４５を含む、細胞株モデルにおいて調節解除された４３と共通であった（表６）。したがって、我々は、これらのｍｉＲＮＡの発現上昇がＣＲＣ細胞表現型に影響するかどうかを判断するために、これらのｍｉＲＮＡのサブセットの機能研究を実施した。表６ ＣＲＣ臨床検体及びＣＲＣ細胞株において共通して調節解除されたｍｉＲＮＡ。
【表６】
＊Ｔｓａｆｒｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｐａｒｅｄｅｓ−Ｚａｇｌｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；及びＲｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）からの要約。ＣＲＣ細胞中のｍｉＲ−１４５の増大は、細胞の形態及び増殖を変化させる。
【００５５】
ＣＲＣにおける、ｍｉＲ−１４５の機能的な役割を調査するために、我々はＳＷ６２０細胞中に成熟ｍｉＲ−１４５を異所性発現させた。ＳＷ６２０細胞のトランスフェクションに続いて、安定なプールされた集団及びクローンを選択して、ｍｉＲ−１４５発現についてスクリーニングした。プールされた集団は非常に安定したレベルの成熟ｍｉＲ−１４５（ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５と命名）を発現した（図６Ａ）が、１２の単離されたクローンのいずれもが検出可能なレベルのこのｍｉＲＮＡを発現しなかった。別個のクローンを単離するためのいくつかの試行が、成熟ｍｉＲ−１４５を任意に発現させることに失敗した。
【００５６】
ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞集団の主に際立った特徴は、ＳＷ６２０の、丸い単細胞から、線維芽様細胞に典型的な進展した突起を備える細長い細胞への変化であった（図６Ｂ）。ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞はまた、細胞増殖／代謝活性において、それぞれ血清の存在下又は不在下で増殖させた場合に５０％〜９５％の増加を示した（図６Ｃ）。血清の存在下で増殖させた場合には、足場非依存性増殖の２倍の増加も観察された（図６Ｃ）。上皮細胞マーカーＥ−カドヘリンも同様に、対照と比較してＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞で５０％減少し（図６Ｄ）、これは間葉系細胞の細胞形態と一致し、ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞について増殖の増加が観察された。しかしながら、インビトロで観察された増殖増大と対比して、ＳＷ６２０細胞におけるｍｉＲ−１４５の過剰発現は、インビボマウスモデルにおいて腫瘍の増殖プロファイルを変化させなかった。
【００５７】
ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞における変化がｍｉＲ−１４５発現に起因することを確認するために、我々はｍｉＲ−１４５−特異的２’Ｏ−メチル（２’Ｏｍｅ）アンチセンスＲＮＡノックダウン実験を実施した。ｍｉＲ−１４５をＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞中で欠乏させ、センス対照以外にｍｉＲ−１４５−特異的２’ＯｍｅアンチセンスＲＮＡを受容させた（図７Ａ）。上記した実験（図６Ｃ）に見られるように、センス対照ＲＮＡの存在下でのｍｉＲ−１４５の過剰発現は、血清含有培地における、更に顕著には無血清培地における細胞増殖の増加をもたらした（図７Ｂ）。しかしながら、ＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５中にアンチセンスｍｉＲ−１４５を共発現させた場合には、細胞の高増殖性が変換された（図７Ｂ）。これらの結果は、ｍｉＲ−１４５の特異的な異所性発現が、増殖性の増加に関連する、細胞分化における変化を誘導したことを示している。ＣＲＣ細胞中でのｍｉＲ−１４３の発現は、細胞の形態及び増殖を変化させる。
【００５８】
ｍｉＲ−１４５がｍｉＲ−１４３と同じゲノム部位から発現されることと、後者のｍｉＲＮＡもＣＲＣ中で同様に下方制御されたことから、我々はｍｉＲ−１４３を過剰発現するＳＷ６２０ ＣＲＣ細胞の表現形を調査した（図８）。ｍｉＲ−１４３を発現する７つの安定なクローンを単離し、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現増加に関連する、変化した形態をそれぞれ表示した（図８Ａ〜Ｃ）。細胞増殖率については何の違いも観察されなかったが、全てのクローンで足場非依存性増殖の減少が示された（図８Ｄ）。これらのデータは、ｍｉＲ−１４３を過剰発現する細胞の方が、ｍｉＲ−１４５を異所的に発現している細胞よりも、足場非依存性細胞増殖に対して反作用を有することを示唆する。我々は、ｍｉＲ−１４３介在性の増殖阻害の可能性を避けるためには協調発現が重要であるということを提案する。実際に、プロファイリングされた４９の臨床ＣＲＣ検体におけるｍｉＲ−１４３の発現とｍｉＲ−１４５の発現との間の相関は、０．９５であった（これはこれらのゲノム上の近接性と一致する（図１、図９）。我々にはｍｉＲ−１４３−１４５のゲノム位を過剰発現する安定した細胞を生成することはできず、したがって両方のｍｉＲＮＡが協調的に過剰発現した場合のＣＲＣの細胞表現型を調査することはできなかった。ｍｉＲ−１７−９２クラスタの過剰発現は、ｍｉＲ−１７−９２クラスタからのｍｉＲＮＡをプロファイリングするＣＲＣ増殖に作用し、染色体Ｘ及び７上に位置するそのパラログを、正常結腸組織と比較してＣＲＣにおいてより高い安定状態のレベルで発現した（図１、表２、５及び６）。ｍｉＲ−１７−９２、及びパラログクラスタメンバーの異なった発現は、正常な細胞から腫瘍原性結腸癌細胞への遷移におけるこれらのｍｉＲＮＡの潜在的な役割を検討するための基礎を提供した。図１０は、ｍｉＲ−１７−９２についての相互作用地図を示す。Ｂｌｅｎｋｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）．
【００５９】
１３番染色体に基づくｍｉＲ−１７−９２クラスタを含有するゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモータの制御下でレトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＮ中にクローン化し、ＨＣＴｌ１６結腸癌細胞株に送達した。スクリーニングされた他の細胞株と比較して、内因性のｍｉＲ−１７−９２クラスタメンバーのレベルが低かったことから、ＨＣＴｌ１６を選択した（図５）。２つのＨＣＴｌ１６／ｍｉＲ−１７−９２クローン、４−１及び４−７が単離され、成熟ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９ａ及びｍｉＲ−９２において随伴性の４〜５倍の増加を示した（図１１Ａ及びＢ）。
【００６０】
ｍｉＲ−１７−９２過剰発現クローン、４−１及び４−７は、無血清培地中で増殖させた場合、細胞増殖／代謝活性の５０％〜６０％の減少を示した（図１１Ｃ）。しかしながら、血清の存在下で増殖させた場合には、増殖においてより少ない有意な減少が見出された。ｍｉＲ−１７−９２クラスタを過剰発現するどちらのクローンにおいても、細胞形態の変化は見つからなかった。他の実験とは対照的に、上記の結果は、ｍｉＲ−１７−９２クラスタの発現の更なる増加は、血清の不在下で増殖させた場合の細胞の細胞増殖／代謝活性を減少させ得ることを示唆した。
【００６１】
ｍｉＲ−２０ａはｍｉＲ−１７−９２クラスタの活性化因子である。
【００６２】
クラスタの過剰発現に基づき増殖不利益か又は代謝活性の減少をもたらすｍｉＲ−１７−９２クラスタ構成要素の更なる特徴づけのために、我々はｍｉＲ−２０ａ単独の過剰発現の効果を検討した。我々が、ｍｉＲ−２０ａの増加を示す４ ＨＣＴ１１６／ｍｉＲ−２０ａクローンを生成したところ、そのうち３つはベクター対照と比較して１０〜１２倍の再現性のある増加を示した（９−３、９−９及び９−１２）。内因性ｍｉＲ−１７−９２クラスタの他の３つのｍｉＲＮＡメンバーでは発現の変化は見られなかった（図１１Ａ及びＢ）。細胞形態の変化を示すＨＣＴ１１６／ｍｉＲ−２０ａクローンは存在しなかった。しかしながら、ＨＣＴ１１６／ｍｉＲ−１７−９２クローンに関しては、全てのｍｉＲ−２０ａクローンが、無血清培地中での細胞増殖／代謝活性について有意な減少を示した（図１１Ｃ）。この表現型は、クローンが血清由来の増殖因子の存在下で増殖する場合にはあまり顕著なものではなかった（有意差に達したのは２つのクローンだけだった）。
【００６３】
２つのｍｉＲ−２０ａ発現クローンと、ｍｉＲ−１７−９２クラスタクローンの内の１つとが足場非依存性増殖において有意な増加を示したが、これは細胞増殖時のｍｉＲ−１７−９２の発現効果が、細胞状況に依存することを示す（図１１Ｄ）。これらの結果はまた、ＨＣＴ１１６増殖の調節が、おそらくｍｉＲ−２０ａによって指示されていたであろうことも示唆する。しかしながら、クラスタの他のメンバーにおける配列関連性の種は与えられたが、我々はＣＲＣ表現型においてこれらの他のｍｉＲＮＡに対しての役割を排除できていない。
【００６４】
考察
我々は、ＣＲＣ患者検体と細胞株の両方でｍｉＲＮＡ発現プロファイリングを実施し、正常結腸及び異なったステージのＣＲＣ間で異なった発現を示す、一連の特異的なｍｉＲＮＡを見出した。我々は更に、代表的な後期転移性疾病のＣＲＣ細胞株中のｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の再発現が、ある異なった状態の細胞を異なった様式で改変し、反対の方法で細胞増殖に影響を及ぼすことを示した。癌についてのこれまでのほとんどの報告とは対照的に、これらの進行したＣＲＣ細胞におけるｍｉＲ−１７−９２発現の増加は、細胞増殖を減少させるにもかかわらず、足場非依存性増殖の増加に関連する。クラスタの更なる詳細な分析が、ｍｉＲ−２０ａが、それらの変化をもたらす、ｍｉＲ−１７−９２の少なくとも１つの活性化因子であることを明らかにした。
【００６５】
正常結腸と比較して、臨床ＣＲＣ検体間で３７のｍｉＲＮＡの発現が変更され、これらのｍｉＲＮＡの内１１はＣＲＣ細胞株において同一の発現パターンを示した。これは、細胞株が、原発腫瘍において観察されるｍｉＲＮＡ発現パターンの一部を保持し、特異的なｍｉＲＮＡの機能解析のための好適なモデルとして機能し得ることを示した。ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５がＣＲＣにおいて下方制御されるという我々の観察結果は、先の報告で裏付けられている。Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｂａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｃｕｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００３）；及びＬａｎｚａ ｅｔ ａｌ．（２００７）。我々はまた、以前報告されたｍｉＲ−３０ａ−３ｐ（Ｂａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６））、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ及びｍｉＲ−１９５の下方制御を検証した。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）。
【００６６】
興味深いことに、筋特異的なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１３３ａは正常結腸粘膜で高発現されるが、ＣＲＣにおいては有意に下方制御された。我々は、正常検体において筋層粘膜からの混入を完全には排除できていないが、以下の理由から我々の観察結果は正しいと考えている。第一に、正常結腸において筋層粘膜の割合はわずかであり、これらの検体で高レベルのｍｉＲ−ｌ−１３３ａ発現が割合を占めることは起こりそうにない。第２に、疾病後期と比較して疾病初期での発現がより高く、並びに第３に、このクラスタはＣＲＣ特異的なｍｉＲＮＡクラスタｍｉＲ−１４３−１４５を協調的に発現した。加えて、我々の知識では、筋肉及び正常結腸粘膜上皮においてｍｉＲ−ｌ−１３３ａの発現間の直接的な比較は存在しないことから、ひいてはこれらのｍｉＲｓが完全には筋肉特異的ではない可能性がある。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）．
【００６７】
ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−２１、及びｍｉＲ−１７−９２クラスタのメンバー並びにそのパラログは、ＣＲＣにおいて上方制御されることが示された。ｍｉＲ−３１におけるこの増加は以前報告されているが、ＣＲＣにおけるいくつかの他のｍｉＲＮＡ発現についての研究は見出されていなかった。Ｂａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｃｕｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）；及びＶｏｌｉｎｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）。初期臨床検体（ステージＩ及びＩＩ）及び正常結腸間で全２２のｍｉＲＮＡが調節解除された一方で、６つのｍｉＲＮＡが初期検体及び後期検体間で異なる発現レベルを示した。これらのｍｉＲＮＡは、ＣＲＣ病期分類のための新規のバイオマーカーになり得る。最後に、我々はまた、ＦＦＰＥ ＣＲＣ検体中のｍｉＲＮＡの再現性のある検出を実証し、この保存状態が良くない材料中でｍｉＲＮＡが安定であることを示した。ＦＦＰＥ ＣＲＣ検体中のｍｉＲＮＡを再現可能に検出する能力は、Ｘｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）の近年の結果を裏付ける。
【００６８】
我々の研究では、ｍｉＲ−１４３の再発現はコロニー形成を減少させ、Ｅ−カドヘリン（上皮細胞分化のマーカー）を上方制御して、ｍｉＲ−１４３が、これらの条件下でＣＲＣ細胞に対して腫瘍抑制効果を示すことを示唆した。我々の観察結果と一致して、Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、ＤＬＤｌ又はＳＷ４８０ ＣＲＣ細胞株への合成ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４３の送達に基づく細胞生存率の用量依存的な減少を報告している。同様にして、Ｂｏｒｒａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）は、ＨＣＴｌ１６、ＬｏＶｏ、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０細胞におけるｍｉＲ−１４３の過剰発現が細胞生存率の低下をもたらし、及びアポトーシスを増加させることを示し、正常粘膜においてｍｉＲ−１４３がアポトーシスを促進する役割を果たすことを示唆した。この後者の研究にはｍｉＲ−１４３遺伝子のより大きな前駆体の発現が含まれ、この研究は本研究で用いた再発現ストラテジー最も似ている。対照的に、ｍｉＲ−１４５は細胞増殖、足場非依存性増殖を増加させ、Ｅカドヘリンレベルは減少させた。無血清培地で細胞を増殖させた場合にこれらの効果が増強されることは、細胞増殖因子がこれらのｍｉＲＮＡの活性に影響を与え得ることを示唆する。これらの結果は、ＣＲＣ細胞株において、ｍｉＲ−１４５の発現が細胞増殖を促進し、及び／又はアポトーシスのための通常のシグナルをブロックするよう作用することを示唆している。興味深いことに、ｍｉＲ−１４５の再発現に基づく我々の観察結果は、合成ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５を導入する前にＤＬＤｌ又はＳＷ４８０細胞において細胞生存率の喪失を報告した、このｍｉＲＮＡの機能的な役割を検討する単独の研究とは異なる。Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）．ｍｉＲ−１４５を導入する方法に加えて、我々の研究結果はまた我々が後期ＣＲＣ細胞を使用し、ｍｉＲ−１４５の高度に安定した発現レベルを達成することができなかった点においても異なる。
【００６９】
我々が、成熟ｍｉＲ−１４５を高レベルに発現する単一のクローンを生成できないということは、特異的な閾値を越えてｍｉＲ−１４５が発現された場合に、細胞増殖が維持され得ないことを示唆した。しかしながら、ｍｉＲ−１４５を発現する細胞をプールした集団は、ＣＲＣ細胞株において増殖の増加を一貫して示した。我々の研究室及び他の研究室からのデータは、ｍｉＲ−１４５を独立して過剰発現させた場合、ｍｉＲ−１４３がＣＲＣ細胞の増殖を減少させることを示した。どちらのｍｉＲＮＡも同じゲノム位置（５ｑ２３）を占有することから、我々は、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５が、それぞれ潜在的な腫瘍抑制因子及び癌遺伝子として反対の様式で協調的に作用するという仮説を立てた。独立して発現させた場合、次いでこれらのｍｉＲＮＡのそれぞれは、それらのそれぞれの発癌性の働き及び腫瘍抑制因子の働きを呈する。ｍｉＲ−１４３が単独クローンで高レベルに発現され得る一方で、ｍｉＲ−１４５の生理的な発現レベルを達成するにはｍｉＲ−１４３との同時発現が必要とされる場合がある。重要なことに、我々の結果はまた、単離時のｍｉＲ−１４３の送達が、ＣＲＣのための潜在的な治療戦略であり得ることも強調する。
【００７０】
本研究における１つの具体的な興味深い観察結果は、ｍｉＲ−１７−９２の多シストロン性の又はｍｉＲ−２０ａ単独の更なる過剰発現が、無血清培地における細胞増殖の減少をもたらしたことである。これらの結果は、ｍｉＲ−１７−９２及びｍｉＲ−２０ａが、急速に分裂しているＨＣＴ１１６細胞において過剰発現した場合、腫瘍抑制因子として作用し得ることを示唆する。対照的に、一部のｍｉＲ−１７−９２及びｍｉＲ−２０ａクローンでは足場非依存性増殖の増加が見られた。これらの逆向性の観察結果は、報告されている、癌におけるｍｉＲ−１７−９２の役割と一致する。
【００７１】
いくつかの研究は、ｍｉＲ−１７−９２が癌遺伝子に関係があるとしている。このクラスタはゲノム位置（１３ｑ）に関連付けられ、異なったクラスのリンパ腫及びＣＲＣで頻繁に増幅されている。Ｏｔａ ｅｔ ａｌ．（２００４）；及びＴｓａｆｒｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）。このクラスタによりコードされているｍｉＲＮＡはまた、リンパ腫、結腸癌、肺癌、膵臓癌及び前立腺癌においても高発現される。Ｖｏｌｉｎｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）；Ｈａｙａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）；及びＨｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、レトロウイルス性の変異誘発を用いて、マウスにおける潜在的な癌遺伝子としてｍｉＲ−１７−９２を同定したが、ｍｉＲ−１７−９２はリンパ腫の形成をもたらした。更に、ｍｉＲ−１７−９２クラスタの過剰発現は、マウスにおいてＢ細胞リンパ腫を促進し、インビトロにおいて肺癌細胞株の細胞増殖の増加を示した。Ｈａｙａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）；及びＨｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）。予後不良を導き得るいくつかの異なる癌型において、１３ｑ３１〜３２でヘテロ接合性が失われていることから、ｍｉＲ−１７−９２クラスタが腫瘍抑制因子として作用し得るという証拠もある。Ｅｉｒｉｋｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）；及びＴｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）。更に、Ｈｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、乳癌細胞株へのｍｉＲ−１７−５ｐの再導入は細胞増殖及び足場非依存性増殖を減少させることを示し、このクラスタのメンバーが、腫瘍抑制因子様の性質を示しうることを裏付けた。任意の特異的なｍｉＲＮＡに対して、異なる生物学的な効果が状況依存的に存在し、異なる細胞型において発現される標的遺伝子のレパートリーにより制御されているようである。我々の結果は、血清及び関連付けられる増殖因子の不在下で作用する腫瘍抑制因子が、ＣＲＣにおいて、ｍｉＲ−１７−９２に対して、特にｍｉＲ−２０ａに対して複雑な正の及び負のフィードバック制御機構を反映させ得ることを示す。
【００７２】
要約すると、我々は非常に大きな数の臨床ＣＲＣ検体をスクリーニングし、ｍｉＲＮＡ発現に対して正常結腸直腸組織を対応させた。３７のｍｉＲＮＡが、正常な、初期の又は後期のＣＲＣ間で異なった発現をすることが見出され、これらｍｉＲＮＡのうち１１のｍｉＲＮＡの調節解除がＣＲＣ細胞株モデルにおいて確認された。したがって、これらの候補ｍｉＲＮＡは、この疾病における潜在的な治療標的である。具体的には、ｍｉＲ−１４５ではなくｍｉＲ−１４３の添加が、ＣＲＣにおける治療的な適用として考慮され得る。
【００７３】
（実施例２）
ｍｉＲ−１４５のアンチセンス介在性の抑制
総量１００ｎＭのビオチン化２’−Ｏ−メチルアンチセンスｍｉＲ−１４５ ＲＮＡ（５ＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＵＧＧＧＡＡＡＡＣＵＧＧＡＣ３’（配列番号：１１））（ＩＤＴ）又は逆向き対照（reverse control）（５’ＣＡＧＧＵＣＡＡＡＡＧＧＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＡＳ’（配列番号：１２））（ＩＤＴ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、２×１０６個のＳＷ６２０／ｍｉＲ−１４５細胞にトランスフェクトした。メーカーの取扱説明書に従って、トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。２５０μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１００μｇの全ＲＮＡに３つの配列的な欠乏操作を行った。各欠乏操作には、０．１Ｍ ＮａＯＨ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ溶液で２回、次いで０．１Ｍ ＮａＣｌで１回ビーズを洗浄することが含まれた。ビーズを０．１Ｍ ＮａＣｌに再懸濁し、次いで２５０μｇのビーズをＲＮＡ検体に添加した。検体を４℃で２０分間にわたって撹拌した。ビーズは、磁気分離装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＲＮＡ溶液から分離し、溶液（欠乏処理したＲＮＡを含有している）をビーズから取り除いた。欠乏処理したＲＮＡをエタノール沈殿し、ｍｉＲ−１４５及びＵ６ ｓｎＲＮＡの発現についてノーザン解析によって解析した。ＦＡＭ−標識２’Ｏ−メチルアンチセンスｍｉＲ−１４５ ＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクション効率を、欠乏実験と並行して行った。１００ｎＭの全ＦＡＭ−標識２’Ｏ−メチルアンチセンスｍｉＲ−１４５ ＲＮＡ（ＩＤＴ）を、ｍｉＲ−１４５を発現している１．２×１０５個のＳＷ６２０細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。
【００７４】
ｍｉＲＮＡのためのノーザンブロット
全ＲＮＡの、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）抽出を、メーカーの取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って実行した。簡潔に述べれば、細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を添加し、細胞を室温で５分間にわたってインキュベートした。１ｍＬクロロホルムを添加した後、細胞を１５秒間、手で激しく振り混ぜた。検体を遠心分離し、水性層を、２．５ｍＬイソプロパノールが入った１５ｍＬファルコンチューブに移した。この検体を室温で２０分間インキュベートし、上記のように遠心分離にかけてＲＮＡをペレット状に沈殿させ、これを１ｍＬ７５％ＥｔＯＨで再懸濁した。遠心分離によりＲＮＡをペレット状に沈殿させ、風乾し、５０μＬＤＥＰＣ水（Ａｍｂｉｏｎ社）で再懸濁した。
【００７５】
ＳｅｑｕａＧｅｌ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて調整した１５％ＰＡＧＥ−尿素ゲルを使用してノーザン解析を実行し、ＭｉｍＰｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＩＩゲル電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて電気泳動を実施した。全４０μｇのＲＮＡを１０μｌ ＲＮＡローディング色素（９５％ホルムアミド、１８ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０２５％ ＳＤＳ、キシレンシアノール及びブロモフェノールブルーの２Ｘ溶液）に添加し、６５℃で１０分間にわたってインキュベートした。検体を１５％ＰＡＧＥ−尿素／ＴＢＥゲルにロードし、ブロモフェノールブルー色素がゲルの底面に到達するまで１Ｘ ＴＢＥ中で１００Ｖで電気泳動した。ＲＮＡを、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、０．５Ｘ ＴＢＥバッファ中で８０Ｖで１時間にわたってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。ＵＶ Ｓｔｒａｔａｈｎｋｅｒ（登録商標）１８００（１２００ジュール）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ＲＮＡをメンブレンに架橋させた。
【００７６】
メンブレンを、１０ｍＬ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で、３７℃でプレハイブリダイズした。Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを１分間煮沸し、次いでハイブリダイゼーション溶液に添加した。３７℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、メンブレンを２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで３回すすぎ、更に２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ溶液で、３７℃で１５分間にわたって洗浄した。メンブレンをＳｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｃｒｅｅｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に一晩曝露し、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ ｍａｃｈｉｎｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて画像化した。煮沸した０．１％ＳＤＳを直接メンブレン上に注ぎ、次いで３０分以上かけて溶液をゆっくりと冷ますことにより、結合したプローブをメンブレンから取り除いた。
【００７７】
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって、Ｃｕｓｔｏｍ Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブが合成された。凍結乾燥オリゴヌクレオチドプローブをＩＸ ＴＥ ｐＨ ８．０中に希釈して、１００μＭ原液とした。標識反応は、ＩＸ ｅｘｏ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、１μＬ Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＩＤＴ）及び０．５ｐｍｏｌ Ｓｔａｒｆｉｒｅ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを含んだ。反応混合液を１分間煮沸し、次いで５分間室温へと冷まし、５０μＣｉ α−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）及び５ Ｕ ｅｘｏ Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を添加し、室温で９０分にわたってインキュベートした。４０μＬ １０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することで反応を停止した。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５ ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、メーカーの取扱説明書に従い、取り込まれなかったα−３２Ｐ−ｄＡＴＰを反応混合物から取り除いた。使用に先立ち、プローブを１分間煮沸した。
【表７】
【００７８】
Ｕ６ ｓｎＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（５’ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ３’（配列番号：３４））を、最終容量２０μＬの、２０ｐｍｏｌｅオリゴヌクレオチドプローブ、１Ｘ Ｔ４ポリヌクレオチドバッファ（ＮＥＢ）、５０μＣｉγ−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及び１０Ｕ Ｔ４ポロヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を用いて最終標識した。プローブを３７℃で３０分にわたってインキュベートした。４０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えることによって反応を止めた。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５ ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、メーカーの取扱説明書に従い、取り込まれなかったγ−３２Ｐ−ｄＡＴＰを反応混合液から除去した。使用前に、このプローブを５分間煮沸した。
【表８−１】
【表８−２】
【表８−３】
【表８−４】
【００７９】
〔実施の態様〕
（１） ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセスであって、
抽出されたＲＮＡからのマイクロＲＮＡの制御変化を、野生型結腸直腸組織検体における同一のマイクロＲＮＡと比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、制御変化を観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセス。
（２） 前記制御変化を観察する工程の前に、組織検体からＲＮＡを抽出する工程を更に含む、実施態様１に記載のプロセス。
（３） 前記制御変化を観察する工程が、配列番号５６における上方制御を観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（４） 前記制御変化を観察する工程が、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡの下方制御を観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（５） 前記マイクロＲＮＡが配列番号１０９を含み、前記制御変化を観察する工程が、配列番号１０９及び配列番号５６の両方の上方制御を観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（６） 前記マイクロＲＮＡが配列番号５７を含み、前記配列番号５７について２倍以上の上方制御がある場合には前記結腸直腸癌のステージがステージＩＩＩ以降であると判定される、実施態様１に記載のプロセス。
（７） ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセスであって、
結腸直腸細胞からＲＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記ＲＮＡからの少なくとも２つのマイクロＲＮＡの制御変化を、正常な結腸直腸組織検体における同一のマイクロＲＮＡと比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
（８） 前記少なくとも２つのマイクロＲＮＡが、配列番号１０９及び配列番号１１０の両方を含む、実施態様１３に記載のプロセス。
（９） ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセスであって、
配列番号５６及び配列番号５７の両方を含む少なくとも２つのマイクロＲＮＡの制御変化を観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセスであって、
抽出されたＲＮＡからのマイクロＲＮＡの制御変化を、野生型結腸直腸組織検体における同一のマイクロＲＮＡと比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、制御変化を観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセス。
【請求項２】
前記制御変化を観察する工程の前に、組織検体からＲＮＡを抽出する工程を更に含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記制御変化を観察する工程が、配列番号５６における上方制御を観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記制御変化を観察する工程が、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡの下方制御を観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記マイクロＲＮＡが配列番号１０９を含み、前記制御変化を観察する工程が、配列番号１０９及び配列番号５６の両方の上方制御を観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記マイクロＲＮＡが配列番号５７を含み、前記配列番号５７について２倍以上の上方制御がある場合には前記結腸直腸癌のステージがステージＩＩＩ以降であると判定される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセスであって、
結腸直腸細胞からＲＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記ＲＮＡからの少なくとも２つのマイクロＲＮＡの制御変化を、正常な結腸直腸組織検体における同一のマイクロＲＮＡと比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【請求項８】
前記少なくとも２つのマイクロＲＮＡが、配列番号１０９及び配列番号１１０の両方を含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項９】
ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセスであって、
配列番号５６及び配列番号５７の両方を含む少なくとも２つのマイクロＲＮＡの制御変化を観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【請求項１】
ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセスであって、
抽出されたＲＮＡからのマイクロＲＮＡの制御変化を、野生型結腸直腸組織検体における同一のマイクロＲＮＡと比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、制御変化を観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセス。
【請求項２】
前記制御変化を観察する工程の前に、組織検体からＲＮＡを抽出する工程を更に含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記制御変化を観察する工程が、配列番号５６における上方制御を観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記制御変化を観察する工程が、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡの下方制御を観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記マイクロＲＮＡが配列番号１０９を含み、前記制御変化を観察する工程が、配列番号１０９及び配列番号５６の両方の上方制御を観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記マイクロＲＮＡが配列番号５７を含み、前記配列番号５７について２倍以上の上方制御がある場合には前記結腸直腸癌のステージがステージＩＩＩ以降であると判定される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセスであって、
結腸直腸細胞からＲＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記ＲＮＡからの少なくとも２つのマイクロＲＮＡの制御変化を、正常な結腸直腸組織検体における同一のマイクロＲＮＡと比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号５６、配列番号５７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【請求項８】
前記少なくとも２つのマイクロＲＮＡが、配列番号１０９及び配列番号１１０の両方を含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項９】
ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセスであって、
配列番号５６及び配列番号５７の両方を含む少なくとも２つのマイクロＲＮＡの制御変化を観察する工程と、
観察された前記制御変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【公表番号】特表２０１１−５２０４５４（Ｐ２０１１−５２０４５４Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０９７８７（Ｐ２０１１−５０９７８７）
【出願日】平成２１年５月１８日（２００９．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４４２８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４０６７０
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１８日（２００９．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４４２８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４０６７０
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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