結腸直腸癌監視のためのプロセス
本明細書において開示されるのは、選択されたｍｉＲＮＡ配列におけるレギュレーション変化を観察することにより、結腸直腸癌のステージを判定する方法である。この配列には、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ及びこれら配列の組み合わせが含まれ得る。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２００７年１０月３０日に提出された米国特許仮出願番号第６０／９８３，７７１号に対する優先権及び利益を主張するものであり、この仮出願は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔配列表、表、又はプログラム表の参照〕
本出願は後述の「配列表」を参照するが、これは「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ３０３５１９１．ｔｘｔ」（９ｋｂ、２００８年１０月３０日作成）として提供されており、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
〔発明の分野〕
本発明は、１つの実施形態において、選択されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列の生成におけるレギュレーション変化を観察することによる結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出及び／又は監視をするための方法に関連する。特定の配列のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを観察することにより、癌細胞の存在並びに癌のステージの両方を判定することができる。
【０００４】
〔発明の背景〕
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は最も頻繁に起こる癌の１つであり、先進諸国における癌関連死亡の一般的な原因である。ＣＲＣの全体的な発生率は、全人口の５％であり、５年生存率は４０〜６０％である。予後診断は、腫瘍について形態学及び組織病理学を用いた、記述的なステージ系統に主に依存する。しかしながら、形態学的に類似の腫瘍であっても、潜在する分子変化及び腫瘍形成能は異なることがある。ＣＲＣが正常な上皮細胞から悪性の癌へと進行するには、遺伝子学的及び後成的な変化の両方の蓄積を伴う複数段階のプロセスが関与しており、これにより一時的な腫瘍形成遺伝子の活性化、並びにこういった変化を含む細胞に対し選択的な利点を付与する腫瘍抑制遺伝子の不活性化がもたらされる。
【０００５】
タンパク質コード遺伝子については、潜在する分子経路を更に明らかにし、ＣＲＣのさまざまなステージを更に詳細に分析するために、数多くのＣＲＣ発現プロファイリング研究が実施されてきた。最近新たに発見された、２２の短いヌクレオチド（ｎｔ）非コーディングＲＮＡ種からなるクラス（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる）が同定され、これらが癌の発生と進行に関係していた。これら低分子ＲＮＡの生物発生は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写と、エンドヌクレアーゼドローシャ（Drosha）による一次転写のプロセスとが関与し、これにより不完全なヘアピン構造を有する６０〜７０ｎｔのｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはエキスポーチン５によって細胞質に運ばれ、そこでＲＮＡアーゼＩＩＩ酵素ダイサー（Dicer）によるプロセスを経て完全なｍｉＲＮＡが生成され、これが多タンパク質複合体に組み込まれる。このｍｉＲＮＡを含む複合体は、レジデントｍｉＲＮＡ鎖と標的配列との間の相補性により、並びに相同性の度合に基づき、直接的な翻訳阻害又はｍＲＮＡ分解により、複数のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することが示された。これまでに、コンピュータ化モデルにより６７８種のヒトｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース−リリース第１１）が同定されており、ヒトゲノムにおいて現在既知である遺伝子の約３％を含む、１０００を超えるｍｉＲＮＡ遺伝子があり得ることが示唆された。更に、バイオインフォマティクス解析によりｍｉＲＮＡはヒトタンパク質コード遺伝子の最高３０％をレギュレーションし得ると見積もられることから、これらの小さなＲＮＡが複雑なシグナル伝達経路間の相互作用を調節する働きをする可能性が示唆されている。
【０００６】
正常組織と腫瘍組織又は癌細胞株との間で異なる発現をするものとして、いくつかのｍｉＲＮＡが同定された。（Ｃａｌｉｎ， Ｇ． Ａ． ａｎｄ Ｃｒｏｃｅ， Ｃ． Ｍ． ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ６： ８５７−８６６， ２００６； Ｂａｎｄｒｅｓ， Ｅ．， Ｃｕｂｅｄｏ， Ｅ．， Ａｇｉｒｒｅ， Ｘ．， Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ， Ｒ．， Ｚａｒａｔｅ， Ｒ．， Ｒａｍｉｒｅｚ， Ｎ．， Ａｂａｊｏ， Ａ．， Ｎａｖａｒｒｏ， Ａ．， Ｍｏｒｅｎｏ， Ｉ．， Ｍｏｎｚｏ， Ｍ．， ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ−Ｆｏｎｃｉｌｌａｓ， Ｊ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｏｆ １３ ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ， ５： ２９， ２００６； Ｃｕｍｍｉｎｓ， Ｊ． Ｍ．， Ｈｅ， Ｙ．， Ｌｅａｒｙ， Ｒ． Ｊ．， Ｐａｇｌｉａｒｉｎｉ， Ｒ．， Ｄｉａｚ， Ｌ． Ａ．， Ｊｒ．， Ｓｊｏｂｌｏｍ， Ｔ．， Ｂａｒａｄ， Ｏ．， Ｂｅｎｔｗｉｃｈ， Ｚ．， Ｓｚａｆｒａｎｓｋａ， Ａ． Ｅ．， Ｌａｂｏｕｒｉｅｒ， Ｅ．， Ｒａｙｍｏｎｄ， Ｃ． Ｋ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｂ． Ｓ．， Ｊｕｈｌ， Ｈ．， Ｋｉｎｚｌｅｒ， Ｋ． Ｗ．， Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ．， ａｎｄ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ， Ｖ． Ｅ． Ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｏｍｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １０３： ３６８７−３６９２， ２００６； Ｍｉｃｈａｅｌ， Ｍ． Ｚ．， ＳＭ， Ｏ． Ｃ．， ｖａｎ Ｈｏｌｓｔ Ｐｅｌｌｅｋａａｎ， Ｎ． Ｇ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｇ． Ｐ．， ａｎｄ Ｊａｍｅｓ， Ｒ． Ｊ． Ｒｅｄｕｃｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １： ８８２−８９１， ２００３； Ｌａｎｚａ， Ｇ．， Ｆｅｒｒａｃｉｎ， Ｍ．， Ｇａｆａ， Ｒ．， Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， Ａ．， Ｓｐｉｚｚｏ， Ｒ．， Ｐｉｃｈｉｏｒｒｉ， Ｆ．， Ｌｉｕ， Ｃ． Ｇ．， Ｃａｌｉｎ， Ｇ． Ａ．， Ｃｒｏｃｅ， Ｃ． Ｍ．， ａｎｄ Ｎｅｇｒｉｎｉ， Ｍ． ｍＲＮＡ／ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ， ６： ５４， ２００７．）
【０００７】
ＣＲＣにおいては、ｍｉＲＮＡの発現パターンを調べた研究は限られている。ｍｉＲＮＡの脱レギュレーションを示した最初の研究では、腺腫ポリープのステージで早くもｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５のダウンレギュレーションが報告されており、これらのｍｉＲＮＡがＣＲＣの早期ステージにおいて何らかの役割を有することが示唆されている。したがって、ＣＲＣ腫瘍において異なる発現を示す１３のｍｉＲＮＡ群が、ＣＲＣ腫瘍ステージに関連するｍｉＲ−３１の発現レベルとともに同定された。
【０００８】
〔発明の概要〕
本発明は、１つの形態において、細胞検体中の結腸直腸癌の存在を検出するための方法を含む。別の形態において、本発明は細胞検体中の結腸直腸癌のステージを診断するための方法である。出願者らは、野生型細胞に比較して、結腸直腸癌において異なるレギュレーションを行う特定のｍｉＲＮＡを発見した。このようなｍｉＲＮＡにおけるレギュレーション変化の度合を判定することにより、組織検体に結腸直腸癌細胞が含まれているかどうかを判定することができる。出願者らは、早期ステージ（ステージＩ及びＩＩ）の結腸直腸癌に比較して、後期ステージ（ステージＩＩＩ及びＩＶ）の結腸直腸癌において異なるレギュレーションを行う、特定の他のｍｉＲＮＡを発見した。これらのｍｉＲＮＡを監視することにより、細胞形態学など信頼性の低い識別子に依存する必要なしに、早期ステージの腫瘍検体と、後期ステージの腫瘍検体とを区別することができる。
【０００９】
〔詳細な説明〕
定義
用語「レギュレーション変化」は、野生型細胞における同じ細胞構成要素の存在量に比較した、ｍｉＲＮＡなどの細胞構成要素の存在量の変化を指す。用語「ダウンレギュレーション」は、関心対象の細胞構成要素の存在量が減少することを指し、用語「アップレギュレーション」は、その構成要素の存在量が増加することを指す。
【００１０】
ｍｉＲＮＡのレギュレーション差異による結腸直腸細胞の同定
結腸直腸癌細胞の複数の濃度を、野生型組織と比較した場合の、３７種類の異なる発現のｍｉＲＮＡが同定された（表１）。細胞株と臨床検体の両方を含む細胞検体が、市販の入手源から得られた。従来の技法に従って、細胞検体から総ＲＮＡが抽出された。例えば、急速冷凍検体用のｍｉｒＶａｎａ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）、及びＦＦＰＥ検体用ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）総核酸分離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用することができる。他の従来のＲＮＡ抽出方法も使用することができる。総ＲＮＡが抽出された後、低分子（４０ヌクレオチド未満）ＲＮＡがゲル電気泳動により分離できる。この検体を解析し、特定のｍｉＲＮＡ配列の同定及び存在量を決定した。同定及び存在量の決定には、例えばノーザンブロット解析を含むがこれに限定されない、任意の好適な技法を使用することができる。結腸直腸細胞において３７の異なる発現のｍｉＲＮＡが同定され、これらは野生型結腸直腸検体に比較して、顕著に改変された発現を有していた。
【表１】
ａ．正規化中央値信号強度（ｌｏｇ２）
ｂ．癌：正常
【数１】
【００１１】
階層的クラスタリングにより、上記の同定されたｍｉＲＮＡ配列の多くは、ｍｉＲ−１４３〜−１４５及びｍｉＲ１７−９２クラスタを含め、整合して発現されているが、これらは一貫してＣＲＣ検体においてダウンレギュレーションされたことが示されている。ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５の両方におけるダウンレギュレーションは明白であり、このダウンレギュレーションは幅広い細胞株及び臨床検体にわたって一貫することが観察された。したがって、これら２つのｍｉＲＮＡ配列におけるレギュレーション変化を観察することが、結腸直腸癌の存在を検出する指標となる。先行技術において、ｍｉＲ−１４５は腫瘍抑制効果を有しており（Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ １６： ８４５−８５０， ２００６； Ｓｃｈｅｐｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６８ （１５）， ２００８）、これらはＣＲＣ細胞でダウンレギュレーションされていることが示されている。しかしながら出願者らは、ｍｉＲ−１４５が非転移性細胞においてのみ腫瘍抑制効果を有しており、これは実際に転移環境において腫瘍形成性であることを見出した。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５を追加することなく腫瘍抑制ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３を送達することが、ＣＲＣの治療的戦略となる。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、表１のｍｉＲＮＡは、生体検体において観察され、野生型（非癌性）検体と比較される。存在量における予測外の変化（アップレギュレーション又はダウンレギュレーション）は、癌の指標であり得る。検体は組織検体から入手することができ、又は代わりに非組織検体から非侵襲的方法で入手することができる。例えば、血液、便、又は尿検体について、遊離ｍｉＲＮＡを検査することができる。この方法によって、ＣＲＣのスクリーニングがより便利になる。表２は、野生型組織に比べ、早期ステージのＣＲＣ検体において異なるレギュレーションが見出された、ｍｉＲＮＡ配列を示す。これらのｍｉＲＮＡは、早期発生段階のＣＲＣの検出のために実施するスクリーニングに適する。
【表２】
【００１３】
結腸直腸腫瘍のステージの判定
早期ステージ（Ｉ及びＩＩ）腫瘍に比較して、後期ステージ（ＩＩＩ及びＩＶ）の結腸直腸腫瘍に特徴的な、別のｍｉＲＮＡ配列が発見された。６つのｍｉＲＮＡ配列が、後期ステージと早期ステージの結腸直腸腫瘍において異なるレギュレーションを受けるものとしてそのように同定された。これらの配列を表３に列挙する。
【表３】
倍率変化＝ステージＩＩＩ／ＩＶ：ステージＩ／ＩＩ
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、総ＲＮＡは細胞検体から抽出される。例えば、組織検体は、手術中に患者から取り出されてもよい。従来の技法に従って、総ＲＮＡが組織から抽出される。低分子ＲＮＡが総ＲＮＡから分離された後、１つ以上のｍｉＲＮＡ配列の存在量が、野生型検体に比較して測定される。この存在量は、例えばＱＰＣＲなどを含むがこれに限定されない、従来の技法を用いて測定することができる。レギュレーション変化（すなわち野生型検体に比較したアップレギュレーション又はダウンレギュレーション）に基づき、癌のステージについての判定が行われる。例えば、このステージは、早期ステージ（Ｉ又はＩＩ）の癌であるか、後期ステージ（ＩＩＩ又はＩＶ）の癌であるかが判定され得る。表２を参照して、後期ステージＣＲＣの判定は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、又はこれらの配列の任意の組み合わせのｍｉＲＮＡのうち、１つ以上にレギュレーション変化が観察された場合に行われ得る。
【００１５】
実例として（これに制限されない）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１のレギュレーション変化を観察することができる。顕著なアップレギュレーションが観察された場合、その検査検体は、後期ステージの結腸直腸癌検体であると判定することができる。特定の実施形態において、そのような判定は、レギュレーション変化の大きさ（アップレギュレーション又はダウンレギュレーション）及び度合（倍率変化）が、指定された閾値を上回る場合にのみ、行われる。例えば、いくつかの実施形態において、陽性診断は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１におけるアップレギュレーションが少なくとも７倍である場合にのみ、行われる。別の実施形態において、陽性診断は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７におけるアップレギュレーションが少なくとも２倍である場合にのみ、行われる。別の実施形態において、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、及びこれらの組み合わせなど、選択された配列におけるダウンレギュレーションについて観察が行われる。これらの配列のダウンレギュレーションの予測される度合は、表２に示される。このような配列は、個別に、又は任意の組み合わせで観察され得る。
【００１６】
別の実施形態において、ＣＲＣのステージは、１つを超えるｍｉＲＮＡが特定のレギュレーション変化を示した場合に判定される。例えば、（１）ｈｓａ−ｍｉＲ−３１が少なくとも７倍のアップレギュレーションを示し、かつ（２）ｈｓａ−ｍｉＲ−７が少なくとも２倍のアップレギュレーションを示した場合に、後期ＣＲＣの判定を行うことができる。別の実施形態において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、又はこれらの両方におけるアップレギュレーションがあり、かつ、これらのアップレギュレーションがｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、又はこれらの組み合わせにおいてダウンレギュレーションを伴う場合に、後期ＣＲＣが存在すると判定される。７倍のアップレギュレーションといった閾値基準は、これらｍｉＲＮＡ配列それぞれについて確立することができる。例えば、ｈａｓ−ａｍｉＲ−１３３ａについての閾値基準を０．６ダウンレギュレーションとして確立することができる。上記の例は、単に実例にすぎない。任意の組み合わせのｍｉＲＮＡ配列について、レギュレーション変化を監視することができる。
【００１７】
ｍｉＲＮＡは、前述のように、組織検体から抽出することができる。あるいは、ｍｉＲＮＡは非組織検体から分離することができる。例えば、ｍｉＲＮＡは血液、便、尿、又は他の生体検体から分離することができる。この検体中に見出される特定のｍｉＲＮＡの存在量が、正常な検体と比較される。ｍｉＲＮＡ存在量のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションが、癌の指標となり得る。
【００１８】
添付の配列表におけるｍｉＲＮＡ配列は、一般に分離されるｍｉＲＮＡ配列を表わす。この記載される配列の末端における改変は当該技術分野において既知であり、残基が少なくとも９５％相同であれば、本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本発明は具体的な実施形態を参照して記述されるが、特定の状況に適合させるために、本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな改変を行うことができ、その構成要素について等価物に置換できることが、当業者には理解されるであろう。よって、本発明は、開示される特定の実施形態、又は本発明を実施するために想到される特定の様式に限定されることなく、本発明は、付記される請求項の範囲及び趣旨の範疇となるあらゆる実施形態を含むものとする。
【００２０】
方法
細胞株
ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞株は、ＡＴＣＣから入手された。ＫＭ２０Ｌ２及びＫＭ１２Ｃは、ＮＣＩ−フレデリック癌ＤＣＴ腫瘍レポジトリ（Frederick Cancer DCT Tumor Repository）から供給され、細胞株ＫＭ２０及びＫＭ１２ＳＭは、Ｄｒ Ｉｓａｉａｈ Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（テキサス大学ＭＤアンダーソン癌センター（MD Anderson Cancer Center））から供給された。ＳＷ６２０及びＳＷ４８０細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。ＨＣＴ１１６細胞は、マッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養され、ＫＭ２０、ＫＭ２０Ｌ２、ＫＭ１２Ｃ、ＫＭ１２ＳＭ及びＨＴ２９細胞は、ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。培地にはすべて、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ペニシリン０．１Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン０．１μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）が加えられ、ただし例外としてＨＴ２９細胞は０．７２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で培養された。
【００２１】
臨床検体
合計で４９の急速冷凍ヒト組織検体が、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ社（ＧＣＩ：マサチューセッツ州ケンブリッジ市）又はＣｌｉｎｏｍｉｃｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（マサチューセッツ州ピッツフィールド市）から入手され、これには正常結腸４検体、ステージＩが４検体、ステージＩＩが１９検体、ステージＩＩＩが２０検体、ステージＩＶが２検体含まれていた（付表１）。更に、一致する８検体の、ホルマリン固定パラフィン埋め込み（ＦＦＰＥ）検体（ステージＩＩが３検体、ステージＩＩＩが４検体、ステージＩＶが１検体）が入手された。全ＣＲＣ検体の中央値腫瘍含有率は７０％であり、早期ステージ（Ｉ及びＩＩ）と後期ステージ（ＩＩＩ及びＩＶ）の疾患との間に腫瘍含有率の有意差はなかった。
【００２２】
ｍｉＲＮＡプロファイリング
２８７本のヒトｍｉＲＮＡプローブを含むｍｉｒＶａｎａ Ｂｉｏａｒｒａｙ（Ａｍｂｉｏｎ社、バージョン１）を使用し、結腸直腸癌ｍｉＲＮＡシグネチャを同定した。ｍｉＲＮＡは、急速冷凍検体についてはｍｉｒＶａｎａ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）、及びＦＦＰＥ検体についてはＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）総核酸分離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用して、結腸直腸検体から得た総ＲＮＡ５μｇから分離された。全検体は、次にポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｆｌａｓｈ−Ｐａｇｅ、Ａｍｂｉｏｎ社）によって分別され、直鎖アクリルアミドとともにエタノール沈殿により低分子ＲＮＡ（＜４０ｎｔ）が回収された。ｍｉＲ−１６の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を使用して、ｍｉＲＮＡの濃縮を確認してから、ｍｉＲＮＡの配列解析が行われた。
【００２３】
全検体から得られた低分子ＲＮＡには、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応が行われ、アミン修飾されたウリジンが組み込まれた（Ａｍｂｉｏｎ社）。テール付加された検体を、次に、アミン反応性Ｃｙ３又はＣｙ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して蛍光標識した。臨床ＣＲＣ又は細胞株のプロファイリング実験にそれぞれ、一色又は二色ハイブリダイゼーションを実施した。二色実験については、細胞株ｍｉＲＮＡが正常結腸ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社）と直接比較された。蛍光標識されたＲＮＡは、ガラス繊維フィルターを用いて精製され、溶離された（Ａｍｂｉｏｎ社）。各検体は次にバイオアレイスライド上、４２℃で１４時間ハイブリダイゼーションを行った（Ａｍｂｉｏｎ社）。このアレイを次に洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ２５０５Ｂ共焦点（confocol）レーザーマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてスキャンし、発現解析ソフトウェア（Ｃｏｄｅｌｉｎｋ、バージョン４．２）を使用してデータが得られた。
【００２４】
個々のｍｉＲＮＡのノーザンブロット解析が次の手順で実施された。メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の仕様に従って、総ＲＮＡのＴＲＩｚｏｌ抽出が実施された。簡単に言えば、細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ試薬を加え、細胞を室温で５分間インキュベートした。１ｍＬクロロホルムを加えた後、細胞を１５秒間、手で激しく振り混ぜた。検体を遠心分離にかけ、水性層を、２．５ｍＬイソプロパノールが入った１５ｍＬファルコンチューブに移した。この検体を室温で２０分間インキュベートし、上記のように遠心分離にかけてＲＮＡをペレット状に沈殿させ、これを１ｍＬ ７５％ＥｔＯＨで再懸濁させた。遠心分離によりＲＮＡをペレット状に沈殿させ、空気中で乾燥させ、５０μＬ ＤＥＰＣ水（Ａｍｂｉｏｎ社）で再懸濁させた。
【００２５】
セクアゲル配列解析システム（SequaGel Sequencing System）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用して調製した１５％ ＰＡＧＥ−尿素ゲルを用いてノーザンブロット解析を実施し、ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ ＩＩゲル電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ社）を使用して電気泳動を実施した。合計４０μｇのＲＮＡを１０μＬ ＲＮＡローディングダイ（９５％ホルムアミド、１８ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０２５％ＳＤＳの２Ｘ溶液、キシレンシアノール、並びにブロモフェノールブルー）に加え、６５℃で１０分間インキュベートした。検体を１５％ＰＡＧＥ−尿素／ＴＢＥゲルに入れ、１Ｘ ＴＢＥ、１００Ｖで、ブロモフェノールブルー染料がゲルの底に達するまで電気泳動にかけた。このＲＮＡを、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ社）を使用し、０．５Ｘ ＴＢＥ緩衝液中、８０Ｖで１時間かけ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上に移した。ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００（１２００ジュール）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、ＲＮＡを膜に架橋させた。
【００２６】
膜を１０ｍＬ発現ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）中、３７℃で予備ハイブリダイゼーションさせた。Ｓｔａｒｆｉｒｅオリゴヌクレオチドプローブを１分間煮沸し、このハイブリダイゼーション溶液に加えた。３７℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた後、このハイブリダイゼーション溶液を除去し、膜を２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで３回すすぎ、更に２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で３７℃において１５分間洗浄した。この膜を貯蔵燐光スクリーン（Storage Phosphor Screen）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に一晩さらし、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して画像化した。沸騰した０．１％ＳＤＳを直接膜に注ぎ、３０分間かけてこの溶液をゆっくり冷ますことによって、付着したプローブから膜を剥がした。
【００２７】
カスタム仕様のＳｔａｒｆｉｒｅオリゴヌクレオチドプローブが、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ社）によって合成された。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドプローブを、１Ｘ ＴＥ ｐＨ８．０中に溶かし、１００μＭストック溶液とした。標識反応には、１Ｘ ｅｘｏ−ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液（ＮＥＢ社）、１μＬ Ｓｔａｒｆｉｒｅユニバーサルテンプレートオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ社）及び０．５ｐｍｏｌ Ｓｔａｒｆｉｒｅオリゴヌクレオチドプローブが含まれた。この反応混合物を１分間煮沸し、５分間かけて室温に冷ましてから、５０μＣｉα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）及び５Ｕ ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）を加え、室温で９０分間インキュベートした。４０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えることによって反応を止めた。結合していないα−３２Ｐ−ｄＡＴＰは、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用い、メーカーの説明に従って、反応混合物から除去された。使用前に、このプローブを１分間煮沸した。
【表４】
【００２８】
Ｕ６ ｓｎＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（５’ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＧＡ ＡＴＴ ＴＧＣ ＧＴ ３’、配列番号６１）は、２０ｐｍｏｌオリゴヌクレオチドプローブ、１Ｘ Ｔ４ポリヌクレオチド緩衝液（ＮＥＢ社）、５０μＣｉ γ−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）及び１０Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ社）を使用して末端標識され、最終体積２０μＬを得た。プローブを３７℃で３０分間インキュベートした。４０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えることによって反応を止めた。結合していないγ−３２Ｐ−ｄＡＴＰは、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用い、メーカーの説明に従って、反応混合物から除去された。使用前に、このプローブを５分間煮沸した。
【００２９】
統計分析
データはＲソフトウェアパッケージを使用して解析された。データはクオンタイル正規化を行ってから、遺伝子発現の差を判定した。複製検体及びプローブ値を平均し、スチューデントのｔ検定を実施して、検体群間で有意に異なる遺伝子を調べた。少なくとも１つの群について正規化された信号強度の中央値が１００（中央値信号の７５パーセンタイル）を超え、平均変化＞１．５倍かつｐ値＜０．０５である場合に、遺伝子が選択された。正常検体とさまざまな癌ステージとの間のｍｉＲＮＡ発現レベルを評価するには、片側ＡＮＯＶＡが使用された。プローブレベル及び遺伝子レベルのデータ解析の両方が、全ての群の比較のため実施された。
【００３０】
ＭｉＲＮＡ ＱＰＣＲ
ＡＢＩ ｍｉＲＮＡ Ｔａｑｍａｎ試薬を使用して、ＱＰＣＲを実施し、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを確認した（Ｃｈｅｎ， Ｃ．， Ｒｉｄｚｏｎ， Ｄ． Ａ．， Ｂｒｏｏｍｅｒ， Ａ． Ｊ．， Ｚｈｏｕ， Ｚ．， Ｌｅｅ， Ｄ． Ｈ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｊ． Ｔ．， Ｂａｒｂｉｓｉｎ， Ｍ．， Ｘｕ， Ｎ． Ｌ．， Ｍａｈｕｖａｋａｒ， Ｖ． Ｒ．， Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｍ． Ｒ．， Ｌａｏ， Ｋ． Ｑ．， Ｌｉｖａｋ， Ｋ． Ｊ．， ａｎｄ Ｇｕｅｇｌｅｒ， Ｋ． Ｊ． Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｂｙ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ ＲＴ−ＰＣＲ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ３３： ｅ１７９， ２００５）。メーカーの説明に従い（Ａｍｂｉｏｎ社）、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅキット及び３ｕＬの５×ＲＴプライマーを使用して、１０ｎｇの総ＲＮＡがｃＤＮＡに変換された。１５μＬの反応物を、サーマルサイクラー中で、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃に保持した。全ての逆転写酵素（ＲＴ）反応に、テンプレート制御は含まれなかった。標準Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲキットプロトコルを使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ配列検出システム（Sequence Detection System）上で、ＱＰＣＲが実施された。１０μＬのＰＣＲ反応物には、０．６６μＬのＲＴ生成物、１μＬのＴａｑｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイプライマー及びプローブ混合物、５μＬのＴａｑｍａｎ ２×ユニバーサルＰＣＲマスター混合物（Ａｍｐｅｒａｓｅ ＵＮＧなし）並びに３．３４μＬの水が含まれた。反応物を３８４ウェルのプレートに入れ、９５℃で１０分間インキュベートし、次いで９５℃で１５秒間、６０℃で２分間のサイクルを４０回行った。全てのＱＰＣＲ反応にはｃＤＮＡ制御は含まれず、全ての反応は三重複製で実施された。
【００３１】
〔実施の態様〕
（１） 抽出されたＲＮＡから得たマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を、野生型結腸直腸組織検体における同じマイクロＲＮＡに比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセス。
（２） レギュレーション変化を観察する前記工程の前に、組織検体からＲＮＡを抽出する工程を更に含む、実施態様１に記載のプロセス。
（３） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３８におけるアップレギュレーションを観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（４） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたマイクロＲＮＡにおけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（５） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３９におけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様４に記載のプロセス。
（６） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号２５におけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様４に記載のプロセス。
（７） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３３におけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様４に記載のプロセス。
（８） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３１におけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様４に記載のプロセス。
（９） 前記マイクロＲＮＡが配列番号２０を含み、レギュレーション変化を観察する前記工程が配列番号２０と配列番号３８の両方のアップレギュレーションを観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（１０） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号２０において少なくとも７倍のアップレギュレーションと、配列番号３８において少なくとも２倍のアップレギュレーションとを観察するものである、実施態様９に記載のプロセス。
【００３２】
（１１） 配列番号２０において７倍以上のアップレギュレーションがある、実施態様９に記載のプロセス。
（１２） 前記マイクロＲＮＡが配列番号３８を含み、該配列番号３８について２倍以上のアップレギュレーションがある場合に前記結腸直腸癌のステージがステージＩＩＩ以降であると判定される、実施態様１に記載のプロセス。
（１３） 結腸直腸細胞からＲＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記ＲＮＡから得た少なくとも２種のマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を、正常な結腸直腸組織検体における同じマイクロＲＮＡに比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
（１４） 前記少なくとも２種のマイクロＲＮＡが、配列番号２０及び配列番号３３の両方を含む、実施態様１３に記載のプロセス。
（１５） 正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号２０の濃度において、７倍以上のアップレギュレーションがあり、かつ、
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号３３の濃度において、０．６倍以上のダウンレギュレーションがある場合に、前記結腸直腸癌のステージが、ステージＩＩＩ以降であると判定される、実施態様１４に記載のプロセス。
（１６） 配列番号２０及び配列番号３８の両方を含む、少なくとも２種のマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を観察する工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
（１７） 正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号２０の濃度において、７倍以上のアップレギュレーションがあり、かつ、
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号３３の濃度において、０．６倍以上のダウンレギュレーションがある場合に、前記結腸直腸癌のステージが、ステージＩＩＩ以降であると判定される、実施態様１６に記載のプロセス。
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２００７年１０月３０日に提出された米国特許仮出願番号第６０／９８３，７７１号に対する優先権及び利益を主張するものであり、この仮出願は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔配列表、表、又はプログラム表の参照〕
本出願は後述の「配列表」を参照するが、これは「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ３０３５１９１．ｔｘｔ」（９ｋｂ、２００８年１０月３０日作成）として提供されており、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
〔発明の分野〕
本発明は、１つの実施形態において、選択されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列の生成におけるレギュレーション変化を観察することによる結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出及び／又は監視をするための方法に関連する。特定の配列のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを観察することにより、癌細胞の存在並びに癌のステージの両方を判定することができる。
【０００４】
〔発明の背景〕
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は最も頻繁に起こる癌の１つであり、先進諸国における癌関連死亡の一般的な原因である。ＣＲＣの全体的な発生率は、全人口の５％であり、５年生存率は４０〜６０％である。予後診断は、腫瘍について形態学及び組織病理学を用いた、記述的なステージ系統に主に依存する。しかしながら、形態学的に類似の腫瘍であっても、潜在する分子変化及び腫瘍形成能は異なることがある。ＣＲＣが正常な上皮細胞から悪性の癌へと進行するには、遺伝子学的及び後成的な変化の両方の蓄積を伴う複数段階のプロセスが関与しており、これにより一時的な腫瘍形成遺伝子の活性化、並びにこういった変化を含む細胞に対し選択的な利点を付与する腫瘍抑制遺伝子の不活性化がもたらされる。
【０００５】
タンパク質コード遺伝子については、潜在する分子経路を更に明らかにし、ＣＲＣのさまざまなステージを更に詳細に分析するために、数多くのＣＲＣ発現プロファイリング研究が実施されてきた。最近新たに発見された、２２の短いヌクレオチド（ｎｔ）非コーディングＲＮＡ種からなるクラス（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる）が同定され、これらが癌の発生と進行に関係していた。これら低分子ＲＮＡの生物発生は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写と、エンドヌクレアーゼドローシャ（Drosha）による一次転写のプロセスとが関与し、これにより不完全なヘアピン構造を有する６０〜７０ｎｔのｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはエキスポーチン５によって細胞質に運ばれ、そこでＲＮＡアーゼＩＩＩ酵素ダイサー（Dicer）によるプロセスを経て完全なｍｉＲＮＡが生成され、これが多タンパク質複合体に組み込まれる。このｍｉＲＮＡを含む複合体は、レジデントｍｉＲＮＡ鎖と標的配列との間の相補性により、並びに相同性の度合に基づき、直接的な翻訳阻害又はｍＲＮＡ分解により、複数のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することが示された。これまでに、コンピュータ化モデルにより６７８種のヒトｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース−リリース第１１）が同定されており、ヒトゲノムにおいて現在既知である遺伝子の約３％を含む、１０００を超えるｍｉＲＮＡ遺伝子があり得ることが示唆された。更に、バイオインフォマティクス解析によりｍｉＲＮＡはヒトタンパク質コード遺伝子の最高３０％をレギュレーションし得ると見積もられることから、これらの小さなＲＮＡが複雑なシグナル伝達経路間の相互作用を調節する働きをする可能性が示唆されている。
【０００６】
正常組織と腫瘍組織又は癌細胞株との間で異なる発現をするものとして、いくつかのｍｉＲＮＡが同定された。（Ｃａｌｉｎ， Ｇ． Ａ． ａｎｄ Ｃｒｏｃｅ， Ｃ． Ｍ． ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ６： ８５７−８６６， ２００６； Ｂａｎｄｒｅｓ， Ｅ．， Ｃｕｂｅｄｏ， Ｅ．， Ａｇｉｒｒｅ， Ｘ．， Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ， Ｒ．， Ｚａｒａｔｅ， Ｒ．， Ｒａｍｉｒｅｚ， Ｎ．， Ａｂａｊｏ， Ａ．， Ｎａｖａｒｒｏ， Ａ．， Ｍｏｒｅｎｏ， Ｉ．， Ｍｏｎｚｏ， Ｍ．， ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ−Ｆｏｎｃｉｌｌａｓ， Ｊ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｏｆ １３ ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ， ５： ２９， ２００６； Ｃｕｍｍｉｎｓ， Ｊ． Ｍ．， Ｈｅ， Ｙ．， Ｌｅａｒｙ， Ｒ． Ｊ．， Ｐａｇｌｉａｒｉｎｉ， Ｒ．， Ｄｉａｚ， Ｌ． Ａ．， Ｊｒ．， Ｓｊｏｂｌｏｍ， Ｔ．， Ｂａｒａｄ， Ｏ．， Ｂｅｎｔｗｉｃｈ， Ｚ．， Ｓｚａｆｒａｎｓｋａ， Ａ． Ｅ．， Ｌａｂｏｕｒｉｅｒ， Ｅ．， Ｒａｙｍｏｎｄ， Ｃ． Ｋ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｂ． Ｓ．， Ｊｕｈｌ， Ｈ．， Ｋｉｎｚｌｅｒ， Ｋ． Ｗ．， Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ．， ａｎｄ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ， Ｖ． Ｅ． Ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｏｍｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １０３： ３６８７−３６９２， ２００６； Ｍｉｃｈａｅｌ， Ｍ． Ｚ．， ＳＭ， Ｏ． Ｃ．， ｖａｎ Ｈｏｌｓｔ Ｐｅｌｌｅｋａａｎ， Ｎ． Ｇ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｇ． Ｐ．， ａｎｄ Ｊａｍｅｓ， Ｒ． Ｊ． Ｒｅｄｕｃｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １： ８８２−８９１， ２００３； Ｌａｎｚａ， Ｇ．， Ｆｅｒｒａｃｉｎ， Ｍ．， Ｇａｆａ， Ｒ．， Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， Ａ．， Ｓｐｉｚｚｏ， Ｒ．， Ｐｉｃｈｉｏｒｒｉ， Ｆ．， Ｌｉｕ， Ｃ． Ｇ．， Ｃａｌｉｎ， Ｇ． Ａ．， Ｃｒｏｃｅ， Ｃ． Ｍ．， ａｎｄ Ｎｅｇｒｉｎｉ， Ｍ． ｍＲＮＡ／ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ， ６： ５４， ２００７．）
【０００７】
ＣＲＣにおいては、ｍｉＲＮＡの発現パターンを調べた研究は限られている。ｍｉＲＮＡの脱レギュレーションを示した最初の研究では、腺腫ポリープのステージで早くもｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５のダウンレギュレーションが報告されており、これらのｍｉＲＮＡがＣＲＣの早期ステージにおいて何らかの役割を有することが示唆されている。したがって、ＣＲＣ腫瘍において異なる発現を示す１３のｍｉＲＮＡ群が、ＣＲＣ腫瘍ステージに関連するｍｉＲ−３１の発現レベルとともに同定された。
【０００８】
〔発明の概要〕
本発明は、１つの形態において、細胞検体中の結腸直腸癌の存在を検出するための方法を含む。別の形態において、本発明は細胞検体中の結腸直腸癌のステージを診断するための方法である。出願者らは、野生型細胞に比較して、結腸直腸癌において異なるレギュレーションを行う特定のｍｉＲＮＡを発見した。このようなｍｉＲＮＡにおけるレギュレーション変化の度合を判定することにより、組織検体に結腸直腸癌細胞が含まれているかどうかを判定することができる。出願者らは、早期ステージ（ステージＩ及びＩＩ）の結腸直腸癌に比較して、後期ステージ（ステージＩＩＩ及びＩＶ）の結腸直腸癌において異なるレギュレーションを行う、特定の他のｍｉＲＮＡを発見した。これらのｍｉＲＮＡを監視することにより、細胞形態学など信頼性の低い識別子に依存する必要なしに、早期ステージの腫瘍検体と、後期ステージの腫瘍検体とを区別することができる。
【０００９】
〔詳細な説明〕
定義
用語「レギュレーション変化」は、野生型細胞における同じ細胞構成要素の存在量に比較した、ｍｉＲＮＡなどの細胞構成要素の存在量の変化を指す。用語「ダウンレギュレーション」は、関心対象の細胞構成要素の存在量が減少することを指し、用語「アップレギュレーション」は、その構成要素の存在量が増加することを指す。
【００１０】
ｍｉＲＮＡのレギュレーション差異による結腸直腸細胞の同定
結腸直腸癌細胞の複数の濃度を、野生型組織と比較した場合の、３７種類の異なる発現のｍｉＲＮＡが同定された（表１）。細胞株と臨床検体の両方を含む細胞検体が、市販の入手源から得られた。従来の技法に従って、細胞検体から総ＲＮＡが抽出された。例えば、急速冷凍検体用のｍｉｒＶａｎａ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）、及びＦＦＰＥ検体用ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）総核酸分離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用することができる。他の従来のＲＮＡ抽出方法も使用することができる。総ＲＮＡが抽出された後、低分子（４０ヌクレオチド未満）ＲＮＡがゲル電気泳動により分離できる。この検体を解析し、特定のｍｉＲＮＡ配列の同定及び存在量を決定した。同定及び存在量の決定には、例えばノーザンブロット解析を含むがこれに限定されない、任意の好適な技法を使用することができる。結腸直腸細胞において３７の異なる発現のｍｉＲＮＡが同定され、これらは野生型結腸直腸検体に比較して、顕著に改変された発現を有していた。
【表１】
ａ．正規化中央値信号強度（ｌｏｇ２）
ｂ．癌：正常
【数１】
【００１１】
階層的クラスタリングにより、上記の同定されたｍｉＲＮＡ配列の多くは、ｍｉＲ−１４３〜−１４５及びｍｉＲ１７−９２クラスタを含め、整合して発現されているが、これらは一貫してＣＲＣ検体においてダウンレギュレーションされたことが示されている。ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５の両方におけるダウンレギュレーションは明白であり、このダウンレギュレーションは幅広い細胞株及び臨床検体にわたって一貫することが観察された。したがって、これら２つのｍｉＲＮＡ配列におけるレギュレーション変化を観察することが、結腸直腸癌の存在を検出する指標となる。先行技術において、ｍｉＲ−１４５は腫瘍抑制効果を有しており（Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ １６： ８４５−８５０， ２００６； Ｓｃｈｅｐｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６８ （１５）， ２００８）、これらはＣＲＣ細胞でダウンレギュレーションされていることが示されている。しかしながら出願者らは、ｍｉＲ−１４５が非転移性細胞においてのみ腫瘍抑制効果を有しており、これは実際に転移環境において腫瘍形成性であることを見出した。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５を追加することなく腫瘍抑制ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３を送達することが、ＣＲＣの治療的戦略となる。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、表１のｍｉＲＮＡは、生体検体において観察され、野生型（非癌性）検体と比較される。存在量における予測外の変化（アップレギュレーション又はダウンレギュレーション）は、癌の指標であり得る。検体は組織検体から入手することができ、又は代わりに非組織検体から非侵襲的方法で入手することができる。例えば、血液、便、又は尿検体について、遊離ｍｉＲＮＡを検査することができる。この方法によって、ＣＲＣのスクリーニングがより便利になる。表２は、野生型組織に比べ、早期ステージのＣＲＣ検体において異なるレギュレーションが見出された、ｍｉＲＮＡ配列を示す。これらのｍｉＲＮＡは、早期発生段階のＣＲＣの検出のために実施するスクリーニングに適する。
【表２】
【００１３】
結腸直腸腫瘍のステージの判定
早期ステージ（Ｉ及びＩＩ）腫瘍に比較して、後期ステージ（ＩＩＩ及びＩＶ）の結腸直腸腫瘍に特徴的な、別のｍｉＲＮＡ配列が発見された。６つのｍｉＲＮＡ配列が、後期ステージと早期ステージの結腸直腸腫瘍において異なるレギュレーションを受けるものとしてそのように同定された。これらの配列を表３に列挙する。
【表３】
倍率変化＝ステージＩＩＩ／ＩＶ：ステージＩ／ＩＩ
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、総ＲＮＡは細胞検体から抽出される。例えば、組織検体は、手術中に患者から取り出されてもよい。従来の技法に従って、総ＲＮＡが組織から抽出される。低分子ＲＮＡが総ＲＮＡから分離された後、１つ以上のｍｉＲＮＡ配列の存在量が、野生型検体に比較して測定される。この存在量は、例えばＱＰＣＲなどを含むがこれに限定されない、従来の技法を用いて測定することができる。レギュレーション変化（すなわち野生型検体に比較したアップレギュレーション又はダウンレギュレーション）に基づき、癌のステージについての判定が行われる。例えば、このステージは、早期ステージ（Ｉ又はＩＩ）の癌であるか、後期ステージ（ＩＩＩ又はＩＶ）の癌であるかが判定され得る。表２を参照して、後期ステージＣＲＣの判定は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、又はこれらの配列の任意の組み合わせのｍｉＲＮＡのうち、１つ以上にレギュレーション変化が観察された場合に行われ得る。
【００１５】
実例として（これに制限されない）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１のレギュレーション変化を観察することができる。顕著なアップレギュレーションが観察された場合、その検査検体は、後期ステージの結腸直腸癌検体であると判定することができる。特定の実施形態において、そのような判定は、レギュレーション変化の大きさ（アップレギュレーション又はダウンレギュレーション）及び度合（倍率変化）が、指定された閾値を上回る場合にのみ、行われる。例えば、いくつかの実施形態において、陽性診断は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１におけるアップレギュレーションが少なくとも７倍である場合にのみ、行われる。別の実施形態において、陽性診断は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７におけるアップレギュレーションが少なくとも２倍である場合にのみ、行われる。別の実施形態において、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、及びこれらの組み合わせなど、選択された配列におけるダウンレギュレーションについて観察が行われる。これらの配列のダウンレギュレーションの予測される度合は、表２に示される。このような配列は、個別に、又は任意の組み合わせで観察され得る。
【００１６】
別の実施形態において、ＣＲＣのステージは、１つを超えるｍｉＲＮＡが特定のレギュレーション変化を示した場合に判定される。例えば、（１）ｈｓａ−ｍｉＲ−３１が少なくとも７倍のアップレギュレーションを示し、かつ（２）ｈｓａ−ｍｉＲ−７が少なくとも２倍のアップレギュレーションを示した場合に、後期ＣＲＣの判定を行うことができる。別の実施形態において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、又はこれらの両方におけるアップレギュレーションがあり、かつ、これらのアップレギュレーションがｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、又はこれらの組み合わせにおいてダウンレギュレーションを伴う場合に、後期ＣＲＣが存在すると判定される。７倍のアップレギュレーションといった閾値基準は、これらｍｉＲＮＡ配列それぞれについて確立することができる。例えば、ｈａｓ−ａｍｉＲ−１３３ａについての閾値基準を０．６ダウンレギュレーションとして確立することができる。上記の例は、単に実例にすぎない。任意の組み合わせのｍｉＲＮＡ配列について、レギュレーション変化を監視することができる。
【００１７】
ｍｉＲＮＡは、前述のように、組織検体から抽出することができる。あるいは、ｍｉＲＮＡは非組織検体から分離することができる。例えば、ｍｉＲＮＡは血液、便、尿、又は他の生体検体から分離することができる。この検体中に見出される特定のｍｉＲＮＡの存在量が、正常な検体と比較される。ｍｉＲＮＡ存在量のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションが、癌の指標となり得る。
【００１８】
添付の配列表におけるｍｉＲＮＡ配列は、一般に分離されるｍｉＲＮＡ配列を表わす。この記載される配列の末端における改変は当該技術分野において既知であり、残基が少なくとも９５％相同であれば、本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本発明は具体的な実施形態を参照して記述されるが、特定の状況に適合させるために、本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな改変を行うことができ、その構成要素について等価物に置換できることが、当業者には理解されるであろう。よって、本発明は、開示される特定の実施形態、又は本発明を実施するために想到される特定の様式に限定されることなく、本発明は、付記される請求項の範囲及び趣旨の範疇となるあらゆる実施形態を含むものとする。
【００２０】
方法
細胞株
ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞株は、ＡＴＣＣから入手された。ＫＭ２０Ｌ２及びＫＭ１２Ｃは、ＮＣＩ−フレデリック癌ＤＣＴ腫瘍レポジトリ（Frederick Cancer DCT Tumor Repository）から供給され、細胞株ＫＭ２０及びＫＭ１２ＳＭは、Ｄｒ Ｉｓａｉａｈ Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（テキサス大学ＭＤアンダーソン癌センター（MD Anderson Cancer Center））から供給された。ＳＷ６２０及びＳＷ４８０細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。ＨＣＴ１１６細胞は、マッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養され、ＫＭ２０、ＫＭ２０Ｌ２、ＫＭ１２Ｃ、ＫＭ１２ＳＭ及びＨＴ２９細胞は、ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。培地にはすべて、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ペニシリン０．１Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン０．１μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）が加えられ、ただし例外としてＨＴ２９細胞は０．７２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で培養された。
【００２１】
臨床検体
合計で４９の急速冷凍ヒト組織検体が、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ社（ＧＣＩ：マサチューセッツ州ケンブリッジ市）又はＣｌｉｎｏｍｉｃｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（マサチューセッツ州ピッツフィールド市）から入手され、これには正常結腸４検体、ステージＩが４検体、ステージＩＩが１９検体、ステージＩＩＩが２０検体、ステージＩＶが２検体含まれていた（付表１）。更に、一致する８検体の、ホルマリン固定パラフィン埋め込み（ＦＦＰＥ）検体（ステージＩＩが３検体、ステージＩＩＩが４検体、ステージＩＶが１検体）が入手された。全ＣＲＣ検体の中央値腫瘍含有率は７０％であり、早期ステージ（Ｉ及びＩＩ）と後期ステージ（ＩＩＩ及びＩＶ）の疾患との間に腫瘍含有率の有意差はなかった。
【００２２】
ｍｉＲＮＡプロファイリング
２８７本のヒトｍｉＲＮＡプローブを含むｍｉｒＶａｎａ Ｂｉｏａｒｒａｙ（Ａｍｂｉｏｎ社、バージョン１）を使用し、結腸直腸癌ｍｉＲＮＡシグネチャを同定した。ｍｉＲＮＡは、急速冷凍検体についてはｍｉｒＶａｎａ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）、及びＦＦＰＥ検体についてはＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）総核酸分離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用して、結腸直腸検体から得た総ＲＮＡ５μｇから分離された。全検体は、次にポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｆｌａｓｈ−Ｐａｇｅ、Ａｍｂｉｏｎ社）によって分別され、直鎖アクリルアミドとともにエタノール沈殿により低分子ＲＮＡ（＜４０ｎｔ）が回収された。ｍｉＲ−１６の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を使用して、ｍｉＲＮＡの濃縮を確認してから、ｍｉＲＮＡの配列解析が行われた。
【００２３】
全検体から得られた低分子ＲＮＡには、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応が行われ、アミン修飾されたウリジンが組み込まれた（Ａｍｂｉｏｎ社）。テール付加された検体を、次に、アミン反応性Ｃｙ３又はＣｙ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して蛍光標識した。臨床ＣＲＣ又は細胞株のプロファイリング実験にそれぞれ、一色又は二色ハイブリダイゼーションを実施した。二色実験については、細胞株ｍｉＲＮＡが正常結腸ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社）と直接比較された。蛍光標識されたＲＮＡは、ガラス繊維フィルターを用いて精製され、溶離された（Ａｍｂｉｏｎ社）。各検体は次にバイオアレイスライド上、４２℃で１４時間ハイブリダイゼーションを行った（Ａｍｂｉｏｎ社）。このアレイを次に洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ２５０５Ｂ共焦点（confocol）レーザーマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてスキャンし、発現解析ソフトウェア（Ｃｏｄｅｌｉｎｋ、バージョン４．２）を使用してデータが得られた。
【００２４】
個々のｍｉＲＮＡのノーザンブロット解析が次の手順で実施された。メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の仕様に従って、総ＲＮＡのＴＲＩｚｏｌ抽出が実施された。簡単に言えば、細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ試薬を加え、細胞を室温で５分間インキュベートした。１ｍＬクロロホルムを加えた後、細胞を１５秒間、手で激しく振り混ぜた。検体を遠心分離にかけ、水性層を、２．５ｍＬイソプロパノールが入った１５ｍＬファルコンチューブに移した。この検体を室温で２０分間インキュベートし、上記のように遠心分離にかけてＲＮＡをペレット状に沈殿させ、これを１ｍＬ ７５％ＥｔＯＨで再懸濁させた。遠心分離によりＲＮＡをペレット状に沈殿させ、空気中で乾燥させ、５０μＬ ＤＥＰＣ水（Ａｍｂｉｏｎ社）で再懸濁させた。
【００２５】
セクアゲル配列解析システム（SequaGel Sequencing System）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用して調製した１５％ ＰＡＧＥ−尿素ゲルを用いてノーザンブロット解析を実施し、ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ ＩＩゲル電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ社）を使用して電気泳動を実施した。合計４０μｇのＲＮＡを１０μＬ ＲＮＡローディングダイ（９５％ホルムアミド、１８ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０２５％ＳＤＳの２Ｘ溶液、キシレンシアノール、並びにブロモフェノールブルー）に加え、６５℃で１０分間インキュベートした。検体を１５％ＰＡＧＥ−尿素／ＴＢＥゲルに入れ、１Ｘ ＴＢＥ、１００Ｖで、ブロモフェノールブルー染料がゲルの底に達するまで電気泳動にかけた。このＲＮＡを、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ社）を使用し、０．５Ｘ ＴＢＥ緩衝液中、８０Ｖで１時間かけ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上に移した。ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００（１２００ジュール）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、ＲＮＡを膜に架橋させた。
【００２６】
膜を１０ｍＬ発現ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）中、３７℃で予備ハイブリダイゼーションさせた。Ｓｔａｒｆｉｒｅオリゴヌクレオチドプローブを１分間煮沸し、このハイブリダイゼーション溶液に加えた。３７℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた後、このハイブリダイゼーション溶液を除去し、膜を２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで３回すすぎ、更に２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で３７℃において１５分間洗浄した。この膜を貯蔵燐光スクリーン（Storage Phosphor Screen）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に一晩さらし、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して画像化した。沸騰した０．１％ＳＤＳを直接膜に注ぎ、３０分間かけてこの溶液をゆっくり冷ますことによって、付着したプローブから膜を剥がした。
【００２７】
カスタム仕様のＳｔａｒｆｉｒｅオリゴヌクレオチドプローブが、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ社）によって合成された。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドプローブを、１Ｘ ＴＥ ｐＨ８．０中に溶かし、１００μＭストック溶液とした。標識反応には、１Ｘ ｅｘｏ−ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液（ＮＥＢ社）、１μＬ Ｓｔａｒｆｉｒｅユニバーサルテンプレートオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ社）及び０．５ｐｍｏｌ Ｓｔａｒｆｉｒｅオリゴヌクレオチドプローブが含まれた。この反応混合物を１分間煮沸し、５分間かけて室温に冷ましてから、５０μＣｉα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）及び５Ｕ ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）を加え、室温で９０分間インキュベートした。４０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えることによって反応を止めた。結合していないα−３２Ｐ−ｄＡＴＰは、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用い、メーカーの説明に従って、反応混合物から除去された。使用前に、このプローブを１分間煮沸した。
【表４】
【００２８】
Ｕ６ ｓｎＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（５’ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＧＡ ＡＴＴ ＴＧＣ ＧＴ ３’、配列番号６１）は、２０ｐｍｏｌオリゴヌクレオチドプローブ、１Ｘ Ｔ４ポリヌクレオチド緩衝液（ＮＥＢ社）、５０μＣｉ γ−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）及び１０Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ社）を使用して末端標識され、最終体積２０μＬを得た。プローブを３７℃で３０分間インキュベートした。４０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えることによって反応を止めた。結合していないγ−３２Ｐ−ｄＡＴＰは、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用い、メーカーの説明に従って、反応混合物から除去された。使用前に、このプローブを５分間煮沸した。
【００２９】
統計分析
データはＲソフトウェアパッケージを使用して解析された。データはクオンタイル正規化を行ってから、遺伝子発現の差を判定した。複製検体及びプローブ値を平均し、スチューデントのｔ検定を実施して、検体群間で有意に異なる遺伝子を調べた。少なくとも１つの群について正規化された信号強度の中央値が１００（中央値信号の７５パーセンタイル）を超え、平均変化＞１．５倍かつｐ値＜０．０５である場合に、遺伝子が選択された。正常検体とさまざまな癌ステージとの間のｍｉＲＮＡ発現レベルを評価するには、片側ＡＮＯＶＡが使用された。プローブレベル及び遺伝子レベルのデータ解析の両方が、全ての群の比較のため実施された。
【００３０】
ＭｉＲＮＡ ＱＰＣＲ
ＡＢＩ ｍｉＲＮＡ Ｔａｑｍａｎ試薬を使用して、ＱＰＣＲを実施し、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを確認した（Ｃｈｅｎ， Ｃ．， Ｒｉｄｚｏｎ， Ｄ． Ａ．， Ｂｒｏｏｍｅｒ， Ａ． Ｊ．， Ｚｈｏｕ， Ｚ．， Ｌｅｅ， Ｄ． Ｈ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｊ． Ｔ．， Ｂａｒｂｉｓｉｎ， Ｍ．， Ｘｕ， Ｎ． Ｌ．， Ｍａｈｕｖａｋａｒ， Ｖ． Ｒ．， Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｍ． Ｒ．， Ｌａｏ， Ｋ． Ｑ．， Ｌｉｖａｋ， Ｋ． Ｊ．， ａｎｄ Ｇｕｅｇｌｅｒ， Ｋ． Ｊ． Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｂｙ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ ＲＴ−ＰＣＲ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ３３： ｅ１７９， ２００５）。メーカーの説明に従い（Ａｍｂｉｏｎ社）、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅキット及び３ｕＬの５×ＲＴプライマーを使用して、１０ｎｇの総ＲＮＡがｃＤＮＡに変換された。１５μＬの反応物を、サーマルサイクラー中で、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃に保持した。全ての逆転写酵素（ＲＴ）反応に、テンプレート制御は含まれなかった。標準Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲキットプロトコルを使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ配列検出システム（Sequence Detection System）上で、ＱＰＣＲが実施された。１０μＬのＰＣＲ反応物には、０．６６μＬのＲＴ生成物、１μＬのＴａｑｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイプライマー及びプローブ混合物、５μＬのＴａｑｍａｎ ２×ユニバーサルＰＣＲマスター混合物（Ａｍｐｅｒａｓｅ ＵＮＧなし）並びに３．３４μＬの水が含まれた。反応物を３８４ウェルのプレートに入れ、９５℃で１０分間インキュベートし、次いで９５℃で１５秒間、６０℃で２分間のサイクルを４０回行った。全てのＱＰＣＲ反応にはｃＤＮＡ制御は含まれず、全ての反応は三重複製で実施された。
【００３１】
〔実施の態様〕
（１） 抽出されたＲＮＡから得たマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を、野生型結腸直腸組織検体における同じマイクロＲＮＡに比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセス。
（２） レギュレーション変化を観察する前記工程の前に、組織検体からＲＮＡを抽出する工程を更に含む、実施態様１に記載のプロセス。
（３） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３８におけるアップレギュレーションを観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（４） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたマイクロＲＮＡにおけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（５） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３９におけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様４に記載のプロセス。
（６） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号２５におけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様４に記載のプロセス。
（７） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３３におけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様４に記載のプロセス。
（８） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３１におけるダウンレギュレーションを観察するものである、実施態様４に記載のプロセス。
（９） 前記マイクロＲＮＡが配列番号２０を含み、レギュレーション変化を観察する前記工程が配列番号２０と配列番号３８の両方のアップレギュレーションを観察するものである、実施態様１に記載のプロセス。
（１０） レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号２０において少なくとも７倍のアップレギュレーションと、配列番号３８において少なくとも２倍のアップレギュレーションとを観察するものである、実施態様９に記載のプロセス。
【００３２】
（１１） 配列番号２０において７倍以上のアップレギュレーションがある、実施態様９に記載のプロセス。
（１２） 前記マイクロＲＮＡが配列番号３８を含み、該配列番号３８について２倍以上のアップレギュレーションがある場合に前記結腸直腸癌のステージがステージＩＩＩ以降であると判定される、実施態様１に記載のプロセス。
（１３） 結腸直腸細胞からＲＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記ＲＮＡから得た少なくとも２種のマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を、正常な結腸直腸組織検体における同じマイクロＲＮＡに比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
（１４） 前記少なくとも２種のマイクロＲＮＡが、配列番号２０及び配列番号３３の両方を含む、実施態様１３に記載のプロセス。
（１５） 正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号２０の濃度において、７倍以上のアップレギュレーションがあり、かつ、
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号３３の濃度において、０．６倍以上のダウンレギュレーションがある場合に、前記結腸直腸癌のステージが、ステージＩＩＩ以降であると判定される、実施態様１４に記載のプロセス。
（１６） 配列番号２０及び配列番号３８の両方を含む、少なくとも２種のマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を観察する工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
（１７） 正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号２０の濃度において、７倍以上のアップレギュレーションがあり、かつ、
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号３３の濃度において、０．６倍以上のダウンレギュレーションがある場合に、前記結腸直腸癌のステージが、ステージＩＩＩ以降であると判定される、実施態様１６に記載のプロセス。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出されたＲＮＡから得たマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を、野生型結腸直腸組織検体における同じマイクロＲＮＡに比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセス。
【請求項２】
レギュレーション変化を観察する前記工程の前に、組織検体からＲＮＡを抽出する工程を更に含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３８におけるアップレギュレーションを観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたマイクロＲＮＡにおけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３９におけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号２５におけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項７】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３３におけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項８】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３１におけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項９】
前記マイクロＲＮＡが配列番号２０を含み、レギュレーション変化を観察する前記工程が配列番号２０と配列番号３８の両方のアップレギュレーションを観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号２０において少なくとも７倍のアップレギュレーションと、配列番号３８において少なくとも２倍のアップレギュレーションとを観察するものである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
配列番号２０において７倍以上のアップレギュレーションがある、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記マイクロＲＮＡが配列番号３８を含み、該配列番号３８について２倍以上のアップレギュレーションがある場合に前記結腸直腸癌のステージがステージＩＩＩ以降であると判定される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
結腸直腸細胞からＲＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記ＲＮＡから得た少なくとも２種のマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を、正常な結腸直腸組織検体における同じマイクロＲＮＡに比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【請求項１４】
前記少なくとも２種のマイクロＲＮＡが、配列番号２０及び配列番号３３の両方を含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号２０の濃度において、７倍以上のアップレギュレーションがあり、かつ、
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号３３の濃度において、０．６倍以上のダウンレギュレーションがある場合に、前記結腸直腸癌のステージが、ステージＩＩＩ以降であると判定される、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
配列番号２０及び配列番号３８の両方を含む、少なくとも２種のマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を観察する工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【請求項１７】
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号２０の濃度において、７倍以上のアップレギュレーションがあり、かつ、
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号３３の濃度において、０．６倍以上のダウンレギュレーションがある場合に、前記結腸直腸癌のステージが、ステージＩＩＩ以降であると判定される、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１】
抽出されたＲＮＡから得たマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を、野生型結腸直腸組織検体における同じマイクロＲＮＡに比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを判定するためのプロセス。
【請求項２】
レギュレーション変化を観察する前記工程の前に、組織検体からＲＮＡを抽出する工程を更に含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３８におけるアップレギュレーションを観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたマイクロＲＮＡにおけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３９におけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号２５におけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項７】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３３におけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項８】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号３１におけるダウンレギュレーションを観察するものである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項９】
前記マイクロＲＮＡが配列番号２０を含み、レギュレーション変化を観察する前記工程が配列番号２０と配列番号３８の両方のアップレギュレーションを観察するものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
レギュレーション変化を観察する前記工程が、配列番号２０において少なくとも７倍のアップレギュレーションと、配列番号３８において少なくとも２倍のアップレギュレーションとを観察するものである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
配列番号２０において７倍以上のアップレギュレーションがある、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記マイクロＲＮＡが配列番号３８を含み、該配列番号３８について２倍以上のアップレギュレーションがある場合に前記結腸直腸癌のステージがステージＩＩＩ以降であると判定される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
結腸直腸細胞からＲＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記ＲＮＡから得た少なくとも２種のマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を、正常な結腸直腸組織検体における同じマイクロＲＮＡに比較して観察する工程であって、前記マイクロＲＮＡが配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【請求項１４】
前記少なくとも２種のマイクロＲＮＡが、配列番号２０及び配列番号３３の両方を含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号２０の濃度において、７倍以上のアップレギュレーションがあり、かつ、
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号３３の濃度において、０．６倍以上のダウンレギュレーションがある場合に、前記結腸直腸癌のステージが、ステージＩＩＩ以降であると判定される、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
配列番号２０及び配列番号３８の両方を含む、少なくとも２種のマイクロＲＮＡのレギュレーション変化を観察する工程と、
観察された前記レギュレーション変化に基づいて結腸直腸癌のステージを判定する工程と、を含む、ヒトにおける結腸直腸癌のステージを診断するためのプロセス。
【請求項１７】
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号２０の濃度において、７倍以上のアップレギュレーションがあり、かつ、
正常な結腸直腸組織検体に比較して、結腸直腸腫瘍における配列番号３３の濃度において、０．６倍以上のダウンレギュレーションがある場合に、前記結腸直腸癌のステージが、ステージＩＩＩ以降であると判定される、請求項１６に記載のプロセス。
【公表番号】特表２０１１−５０１９６６（Ｐ２０１１−５０１９６６Ａ）
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２２４８（Ｐ２０１０−５３２２４８）
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８２２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９０２６
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８２２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９０２６
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]