該発明は、結腸直腸細胞増殖障害を検出するため又は検出しかつそれらの間又は中での区別を行なうための方法、核酸及びキットを提供する。該発明は、前記の種類の障害の検出及びその間の弁別を改善し、かくして、患者の診断及び治療を改善できるようにするのに役立つメチル化パターンを有するゲノム配列を開示している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、
ｉ） 血漿、血清、全血、単離された血液細胞、対象から得た血液から単離された細胞から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階であって、隣接ヌクレオチドが少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含んでいる段階、
ｉｉ） ８０％以上の感度及び８０％以上の特異性で提供される、結腸細胞増殖障害を検出するか又は検出しかつそれらの間又は中での区別を行なう段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
標的領域がそれぞれ配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、３６、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０、ＤＵＸ４、ＳＭＡＤ７、ＧＴＭＢＰ、ＥＹＡ４、ＴＣＦ１−ＡＬＰＨＡ、ＴＰＥＦ、Ｐ７３、ＡＰＣ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＣＡＶ１、Ｈ−カドヘリン及びＬＴＢＰ４から成る群から選択された遺伝子又は配列の少なくとも１６個の隣接するヌクレオチドを含むか又はこれらに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するか又は検出しかつそれらの間又は中での区別を行なうための方法において、前記対象から単離された生体試料中の配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０及びＤＵＸ４から成る群から選択された遺伝子又は配列の発現レベルを決定する段階を含んで成る方法。
【請求項４】
前記発現レベルが、前記遺伝子又は配列から転写されたｍＲＮＡの存在、不在又はレベルを検出することによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現レベルが、前記遺伝子又は配列によりコードされるポリペプチドの存在、不在又はレベルを検出することによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、免疫検定、ＥＬＩＳＡ免疫検定、放射免疫検定及び抗体から成る群から選択された単数又は複数の手段によって検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現が前記遺伝子又は配列内のＣｐＧメチル化の存在又は不在を検出することによって決定され、高メチル化が結腸細胞増殖障害の存在を表わしている、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、対象から、対象から得た生体試料から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階を含んで成り、ここで該標的領域は、それぞれ配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０、ＤＵＸ４、ＳＭＡＤ７、ＧＴＭＢＰ、ＥＹＡ４及びＴＣＦ１−ＡＬＰＨＡから成る群から選択された少なくとも１つの遺伝子又は配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドの１配列を含むか又はストリンジェント条件下でそれに対してハイブリッド形成し、前記隣接ヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、かくして結腸細胞増殖障害の検出及び検出とそれらの間又は中での区別が少なくとも部分的に提供される、方法。
【請求項９】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、対象から、対象から得た生体試料から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階を含んで成り、ここで該標的領域は、それぞれ配列番号１〜３、１４、１６、２１、２２、２３、４４〜４６、４８、５０、５９〜６４、３６、ＣＯＸ７Ｂ、ＣＳＴ５、ＥＹＡ３、ＦＴＨ１、ＲＮＦ４、ＳＯＸ２１、ＲＮＦ４、ＡＬＸ４、ＯＮＣ２、ＮＧＦＲ、ＤＬＸ−５、ＨＶＩＡＡＴ、ＢＴＦ３相同体１、ＡＤＣＹ９、ＢＣＬ−５、ＢＣＯＲ、ＴＡＦＩＩ２８、ＨＯＭＥＯＢＯＸ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＩＸ６、ＧＳＫ−３ＢＥＴＡ、ＥＬＫ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｆ、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲ、ＲＮＦ３０、ＤＵＸ４、ＳＭＡＤ７、ＧＴＭＢＰ、ＥＹＡ４、ＴＣＦ１−ＡＬＰＨＡ、ＴＰＥＦ、Ｐ７３、ＡＰＣ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＣＡＶ１、Ｈ−カドヘリン及びＬＴＢＰ４から成る群から選択された少なくとも１つの遺伝子又は配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドの１配列を含むか又はストリンジェント条件下でそれに対してハイブリッド形成し、前記隣接ヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、かくして結腸細胞増殖障害の検出及び検出とそれらの間又は中での区別が少なくとも部分的に提供される、方法。
【請求項１０】
結腸直腸癌腫が、結腸腺腫、正常な結腸組織、非結腸組織及び非結腸組織増殖障害から成る群から選択された少なくとも１つの身体条件から区別される、請求項８及び９に記載の方法。
【請求項１１】
結腸腺腫が、結腸癌腫、正常な結腸組織、非結腸組織及び非結腸細胞増殖障害から成る群から選択された少なくとも１つの身体条件から区別される、請求項８及び９に記載の方法。
【請求項１２】
結腸直腸癌腫組織又は結腸腺腫のうちの少なくとも１つが、直径１ｃｍ未満の結腸ポリープ、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別され、標的領域が、配列番号１〜１２、１５〜２０、２２、２５〜３６、３８〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
結腸直腸癌腫が非結腸健常組織、末梢血リンパ球及び非結腸癌組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別され、該標的領域が、配列番号１〜２３、２６〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はこれらに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１４】
結腸直腸癌腫が、炎症性結腸組織、正常な結腸組織、非結腸健常組織、末梢血リンパ球、結腸腺腫及び非結腸癌組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別され、該標的領域が配列番号１〜３、５〜１３、１５〜２３、２６〜３６、３８〜４３、４５〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むかこれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１５】
結腸直腸癌腫が、結腸腺腫から区別され、標的領域が配列番号１１、２５、２７、３８、４０、４５、５３及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含む、又はそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１６】
結腸直腸癌腫組織又は大型腺腫のうちの少なくとも１つが、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１７】
結腸直腸癌腫組織が、炎症性結腸組織及び正常な結腸組織のうちの少なくとも１つから区別され、標的領域が配列番号１〜３、５〜２３、２５〜３６、３８〜４９、５１〜５８及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はそれに対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１８】
結腸直腸癌腫組織又は結腸腺腫のうちの少なくとも１つが、炎症性結腸組織、正常な結腸組織、非結腸健常組織、末梢血リンパ球及び非結腸癌組織から成る群から選択された少なくとも１つの組織から区別され、該標的領域が、配列番号１〜３６、３８〜４３、４５〜５８、及びその補体から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
結腸に由来する組織が、非結腸由来の組織から区別される、請求項８及び９に記載の方法。
【請求項２０】
対象の体内の細胞増殖障害及び健常組織を検出するため及び／又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、対象から得た生体試料から単離されたゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも１つの試薬又は一連の試薬と接触させる段階を含んで成り、ここで該標的領域は、それぞれ配列番号：＆［ＩＤＧＥＮＳＥＱクラス９］から成る群から選択された少なくとも２つの配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドの１配列を含むか又はストリンジェント条件下でそれに対してハイブリッド形成し、前記隣接ヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、該標的領域は、から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むか又はそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する、方法。
【請求項２１】
ａ．対象から得られた生体試料からゲノムＤＮＡを抽出するか又はその他の形で単離する段階；
ｂ．その５位置でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル又はハイブリダイゼーション特性に関してシトシンと検出可能な形で異なっているもう１つの塩基に転換するべく、ａ）のゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントを単数又は複数の試薬で処理する段階；
ｃ．処理済みゲノムＤＮＡ又はその処理済みフラグメントを、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも２つのプライマ及び１つの増幅酵素と接触させる段階であって、ここで処理済みゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントが少なくとも１つの増幅物を産生するべく増幅されるか、または増幅されていない、段階；及び
ｄ．前記増幅物の存在又は不在又はその特性に基づいて、配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された１配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態、又は配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された配列の複数のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化状態又はその平均メチル化状態を示す値を決定する段階であって、かくして結腸細胞増殖障害の検出又は検出とその間の区別のうちの少なくとも１つが少なくとも部分的に提供される段階、
を含んで成る請求項８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ｂ）のゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントの処理段階には、重亜硫酸塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩及びそれらの組合せから成る群から選択された試薬の使用が含まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｃ）の接触段階又は増幅段階には、増幅酵素としての耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用；５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼの使用；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用；検出可能な標識を担持する増幅物核酸分子の生成及びそれらの組合せから成る群から選択された少なくとも１つの方法が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
検出可能な増幅物標識が、蛍光標識；放射性核種又は放射性標識；質量分析計において検出可能である離脱可能な増幅物フラグメント質量標識；増幅物及び質量分析計において検出可能な単一正味正電荷又は単一正味負電荷を有する離脱可能な増幅フラグメント質量標識、及びそれらの組合せから成る群から選択選択されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象から得られた生体試料が、細胞系列、組織学スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、排泄物、結腸洗浄廃液、尿、血漿、血清、全血、単離された血液細胞、血液から単離された細胞及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
段階ｄ）に中にはさらに、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子の使用が含まれており、ここで前記核酸分子又はペプチド核酸分子は、それがハイブリッド形成される核酸の増幅を抑制する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸分子の配列が、
【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

から成る群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸分子又はペプチド核酸分子が、各々の場合において、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素による分解を排除するべくその５’末端で修飾されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸分子又はペプチド核酸分子は各々の場合において３’ヒドロキシル基が欠如している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
増幅酵素は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ｄ）における決定段階には、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子のハイブリダイゼーションが含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸が
【化６】

【化７】

【化８】

【化９】

【化１０】

から成る群から取られる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つのかかるハイブリッド形成する核酸分子又はペプチド核酸分子が固相に結合されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
複数のかかるハイブリッド形成する核酸分子又はペプチド核酸分子が、線形又は実質的に線形の、六角形又は実質的に六角形の、矩形又は実質的に矩形の、及びそれらの組合せのアレイ群から成る群から選択された核酸又はペプチド核酸アレイの形で固相に対し結合されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのヌクレオチド塩基だけ少なくとも１つのかかるハイブリッド形成された核酸分子を拡張させる段階をさらに含んで成る請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ｅ）における決定段階には増幅物の配列決定段階が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
ｃ）における接触及び増幅段階には、メチル化特異的プライマの使用が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
前記メチル化特異的プライマの配列が
【化１１】

【化１２】

【化１３】

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【化２１】

【化２２】

【化２３】

【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【化２８】

【化２９】

【化３０】

【化３１】

から成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｄ）には、単数又は複数のＣｐＧ；ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含むプライマオリゴマーヌクレオチドを使用する段階が含まれ；さらにｅ）には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子内でハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含みかつ固相に結合されている少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成し、少なくとも１つのヌクレオチド塩基だけ少なくとも１つのかかるハイブリッド形成された核酸分子を拡張させること；及び増幅物のｅ）における配列決定、から成る群から選択された少なくとも１つの方法の使用が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
ｄ）には、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子の使用が含まれ、ここで前記核酸分子又はペプチド核酸分子は、それがハイブリッド形成されている核酸の増幅を抑制し、さらに、ｅ）には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子内でハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含みかつ固相に結合されている少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成すること；配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８又はその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリッド形成し、少なくとも１つのヌクレオチド塩基だけ少なくとも１つのかかるハイブリッド形成された核酸分子を拡張させること；及び増幅物のｅ）における配列決定、から成る群から選択された少なくとも１つの方法の使用が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
ｃ）には、単数又は複数のＣｐＧ；ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチドを含むプライマオリゴマーヌクレオチドによる増幅が含まれ、さらにｄ）には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの検出可能な形で標識された核酸分子をハイブリッド形成する段階が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
ｃ）には、各々の場合において配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８及びその補体から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子の使用が含まれ、ここで前記核酸分子又はペプチド核酸分子はそれがハイブリッド形成されている核酸の増幅を抑制し、さらにｄ）には、配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８から成る群から選択された１配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する長さが少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも１つの検出可能な形で標識された核酸分子をハイブリッド形成する段階が含まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４３】
ｃ）のプライマオリゴマーヌクレオチドが
【化３２】

【化３３】

【化３４】

【化３５】

【化３６】

【化３７】

【化３８】

【化３９】

【化４０】

【化４１】

【化４２】

【化４３】

【化４４】

【化４５】

【化４６】

【化４７】

【化４８】

【化４９】

【化５０】

【化５１】

【化５２】

【化５３】

【化５４】

【化５５】

【化５６】

【化５７】

から成る群から選択されている、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
対象の体内の結腸細胞増殖障害を検出するため又は検出しかつそれらの間又は中で区別を行なうための方法において、
ａ．対象のゲノムＤＮＡを有する生体試料を対象から得る段階；
ｂ．ゲノムＤＮＡを抽出する、又はその他の形で単離する段階；
ｃ．配列番号１〜配列番号６４及びそれに対してストリンジェント条件下でハイブリッド形成する配列から成る群から選択された１配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含むｂ）のゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントを、単数又は複数のメチル化感応性制限酵素と接触させる段階であって、ゲノムＤＮＡがその各々の分割認識モチーフとの関係において、それによって分割されて分割フラグメントを形成するか又はそれによって分割されない段階；及び
ｄ．少なくとも１つのかかる分割フラグメントの存在又は不在又はその特性に基づいて、配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された１配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態、又は配列番号１〜配列番号６４から成る群から選択された配列の複数のＣｐＧジヌクレオチドの平均又はその平均メチル化状態を示す値を決定する段階であって、かくして結腸細胞増殖障害の検出又は検出とその間又はその中の弁別のうちの少なくとも１つが少なくとも部分的に提供される段階、
を含んで成る方法。
【請求項４５】
処理が、ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの未メチル化シトシン塩基を、ウラシル又は、ハイブリダイゼーションに関してシトシンと検出可能な形で異なっているもう１つの塩基に転換させるのに適したものである、ゲノム配列番号１〜配列番号６４から誘導された処理済み核酸。
【請求項４６】
配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８及びそれに相補的な配列から成る群から選択された処理済みゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１６の隣接ヌクレオチドを含む核酸において、該処理が、ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの未メチル化シトシン塩基を、ウラシル又はハイブリダイゼーションに関してシトシンと検出可能な形で異なっているもう１つの塩基に転換させるのに適したものである、核酸。
【請求項４７】
隣接塩基配列が少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧ又はＣｐＡジヌクレオチド配列を含む、請求項４５及び４６に記載の核酸。
【請求項４８】
処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩及びそれらの組合せから成る群から選択された試薬の使用を含んで成る、請求項４５及び４６に記載の核酸。
【請求項４９】
配列番号３０４〜配列番号５３５及び配列番号６５〜配列番号８８から成る群から選択された処理済みのゲノムＤＮＡ配列と相補的であるか又はそれに対して穏やかにストリンジェントな又はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチドの１配列を含むオリゴマー。
【請求項５０】
少なくとも１つのＣｐＧ、ＣｐＡ又はＴｐＧジヌクレオチド配列を含んで成る、請求項４９に記載のオリゴマー。
【請求項５１】
結腸細胞増殖障害の検出及び／又はその間の区別を目的とした、請求項１〜４４に記載の方法、請求項４５〜４８に記載の核酸又は請求項４９〜５０に記載のオリゴマーヌクレオチドの使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

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【図４０】

【図４１】

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【図８４】

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【図８６】

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【図８８】

【図８９】

【図９０】

【図９１】

【図９２】

【図９３】

【図９４】

【図９５】

【図９６】

【公表番号】特表２００７−５２８２０６（Ｐ２００７−５２８２０６Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７６３８（Ｐ２００６−５１７６３８）
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２０３３６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００１１４１
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（５０５４７６２５０）エピゲノミクス　アクチェンゲゼルシャフト (1)
【Ｆターム（参考）】