線維細胞への分化の検出方法、線維症を抑制する組成物および方法
【課題】腎臓標的部位での線維細胞形成を抑制するのに有用な線維細胞抑制組成物、及び該組成物の使用方法の提供。
【解決手段】腎臓標的部位での線維細胞形成を抑制するのに十分な量の、Ｆｃγ受容体に結合して単球から線維細胞への分化を阻害する、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）またはその部分を含む線維細胞抑制組成物、および該組成物の使用方法。これらの方法は、強皮症や喘息などの線維性疾患の治療および予防を含む様々な適用例においても有用である。
【解決手段】腎臓標的部位での線維細胞形成を抑制するのに十分な量の、Ｆｃγ受容体に結合して単球から線維細胞への分化を阻害する、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）またはその部分を含む線維細胞抑制組成物、および該組成物の使用方法。これらの方法は、強皮症や喘息などの線維性疾患の治療および予防を含む様々な適用例においても有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単球から線維細胞への分化を抑制するＳＡＰの能力に関する。したがって、本発明は、そのような分化を抑制するための組成物および方法を含む。これらの組成物および方法は、線維性疾患および喘息の治療など、線維細胞形成の低減が有益な様々な適用例で有用となり得る。本発明は、さらに、単球の線維細胞への分化能力の問題またはＳＡＰがこの分化を抑制する問題を検出する方法を含む。これらの問題は、疾患と相互に関係していてもよいし、薬物によって誘発されたものでもよい。
【背景技術】
【０００２】
線維細胞
炎症は、組織外傷または感染に対する協調応答である。開始事象は、白血球遊走因子の局所での放出、血小板の活性化、ならびに凝集および補体経路の開始を媒介とする。これらの事象が局所内皮を刺激して、好中球および単球の血管外遊出を促進する。炎症の第二相は、リンパ球を含む適応免疫系細胞の組織への流入を特徴とする。その後の消散相は、過剰白血球のアポトーシスおよび組織マクロファージによる抱き込みが起こるときには、線維芽細胞などの間質細胞による組織損傷の修復も特徴とする。
【０００３】
慢性の炎症では、炎症細胞の保存、線維芽細胞過形成、および最終的な組織破壊を伴い、炎症病変の消散が異常をきたす。これらの事象をもたらす機序は複雑であるが、細胞の動員、生存、および保持の増強、ならびに遊走障害を含む。
【０００４】
創傷病巣の修復を司り、または他の線維性応答で役割をもつ線維芽細胞の供給源については議論の最中にある。従来の仮説では、局所の静止線維芽細胞が、患部に移動し、細胞外マトリックスタンパク質を産生し、創傷の収縮または線維化を促進することが示唆されている。もう１つの仮説は、血液内に存在する循環線維芽細胞前駆細胞（線維細胞と呼ぶ）が、外傷部位または線維化部位に遊走し、そこで分化し、組織修復および他の線維性応答を媒介するというものである。
【０００５】
線維細胞は、ＣＤ１４＋末梢血単球前駆体集団から分化することが知られている。線維細胞は、造血細胞（ＣＤ４５、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３４）および間質細胞（コラーゲンＩ型およびＩＩＩ型、フィブロネクチン）の両方のマーカーを発現させる。成熟線維細胞は、組織外傷部位にすばやく侵入し、そこで炎症性のサイトカインを分泌する。線維細胞は、線維症を結果として生じ得る細胞外マトリックスタンパク質、他のサイトカイン、および血管原性前駆分子を分泌することもできる。
【０００６】
ＣＤ１４＋単球からの線維細胞への分化を抑制する機序は、本発明以前には広く知られていなかった。しかし、線維細胞への分化の制御は、多くの疾患および過程の制御において重要でありそうである。線維細胞は、様々な過程、ならびに強皮症、ケロイド性瘢痕化、リウマチ様関節炎、狼瘡、腎性線維性皮膚障害（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｎｇ ｄｅｒｍｏｐａｔｈｙ）、および特発性肺線維症を含む疾患と関係している。線維細胞は、マウスにおける日本住血吸虫感染後の線維性病変の成立で役割を果しており、自己免疫疾患に随伴する線維症にも関与する。線維細胞は、放射線による損傷と関係のある病原性線維症、ライム病、および肺線維症とも関連付けられている。ＣＤ３４＋線維細胞は、膵炎および間質性線維症における間質の再構築とも関連付けられており、一方この種の線維細胞の欠乏は、膵臓腫瘍および腺癌と関連している。線維症は、線維細胞が筋線維芽細胞へとさらに分化するときに、喘息患者、ならびにことによると慢性閉塞性肺疾患などの他の肺疾患でも付加的に起こる。
【０００７】
血清アミロイドＰ
線維細胞が役割を担う過程および疾患の範囲の広さを考えると、末梢血単球から線維細胞への分化を調節する機構は、非常に興味深いものである。本発明の態様は、単球からの末梢血線維細胞への分化が、血清および血漿中の因子によって抑制されるという発見に基づく。ヒト血漿を分別すると、この因子が血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）として同定された。ＳＡＰは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む、タンパク質のペントラキシンファミリーのメンバーであり、肝臓によって分泌され、安定な五量体として血中を循環する。ＳＡＰの正確な役割は未だ不明であるが、免疫応答の開始相および消散相の両方で役割を担うと思われる。ＳＡＰは、細菌表面上の糖残基に結合し、そのオプソニン作用をもたらし、抱き込まれる。またＳＡＰは、免疫応答の消散時に、アポトーシス細胞によって生成される遊離のＤＮＡおよびクロマチンに結合し、そうして二次炎症性応答を防ぐ。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）およびＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）が優先されるが、ＳＡＰが古典的Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）の３種すべてに結合できるために、ＳＡＰが結合した分子は、細胞外区域から除去される。受容体への結合後、ＳＡＰおよび結合相手の分子は、おそらくは細胞に抱き込まれる。
【０００８】
ＦｃγＲは、ＩｇＧが広範な造血細胞に結合するのに必要である。末梢血単球は、ＣＤ６４およびＣＤ３２を発現させ（単球の亜集団はＣＤ１６を発現させる）、組織マクロファージは、３種すべての古典的ＦｃγＲを発現させる。病原体に結合し、または免疫複合体の部分として結合したＩｇＧによって単球上のＦｃγＲがクラスターを形成すると、広範な生化学事象が開始される。受容体の集合に続く最初の事象は、一連のｓｒｃキナーゼタンパク質の活性化を含む。単球では、これらには、ｌｙｎ、ｈｃｋ、およびｆｇｒが含まれ、これらが、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩに関連するＦｃＲ−γ鎖のＩＴＡＭモチーフ上、またはＦｃγＲＩＩの細胞質ドメインのＩＴＡＭモチーフ上にあるチロシン残基をリン酸化する。リン酸化を受けたＩＴＡＭは、ｓｙｋを含む第２セットのｓｒｃキナーゼによって結合されることになる。ｓｙｋは、ＩｇＧに覆われた粒子に対する食作用にとって極めて重要であることがわかっている。しかし、非造血細胞中のｓｙｋの分布が広いこと、ならびにｓｙｋが、インテグリンおよびＧタンパク質共役型受容体の両方のシグナル伝達に関与するという証拠は、この分子が多くの機能を有することを示唆している。
【０００９】
ＳＡＰおよびＣＲＰはどちらも、食作用を増強し、様々な細胞上のＦｃγ受容体に結合する。ＣＲＰは、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）に高い親和性で結合し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に低い親和性で結合するが、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は結合しない。ＳＡＰは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩ、特にＦｃγＲＩに優先的に、３種すべての古典的Ｆｃγ受容体に結合する。ＣＲＰのＦｃγＲへの結合についての各所見は一致していないが、ＳＡＰおよびＣＲＰはどちらも、Ｆｃ受容体に結合し、ＦｃγＲの結合と一致する細胞内シグナル伝達事象を開始することがわかっている。
【００１０】
ヒト血清では、男性は通常、約３２μｇ／ｍｌ＋／−７μｇ／ｍｌのＳＡＰを有し、１２〜５０μｇ／ｍｌの範囲が正常である。女性は一般に、血清中に約２４μｇ／ｍｌ＋／−８μｇ／ｍｌのＳＡＰを有し、８〜５５μｇ／ｍｌの範囲が正常である。ヒトの大脳脊髄液中には、男性では通常約１２．８ｎｇ／ｍｌ、女性では約８．５ｎｇ／ｍｌのＳＡＰが存在する。男性と女性のデータを合わせると、ヒト血清中の正常ＳＡＰレベルは、２６μｇ／ｍｌ＋／−８μｇ／ｍｌであり、１２〜５５μｇ／ｍｌの範囲が正常である。（上記血清レベルは、平均＋／−標準偏差として示してある。）
【００１１】
ＩＬ−１２
本発明の他の態様は、新たに発見された、単球による線維細胞形成を抑制するＩＬ−１２の能力に関する。ＩＬ−１２は、以前から線維症および線維性疾患と関連付けられているが、ほとんどの研究は、ＩＬ−１２のＴｈ１免疫応答の促進における役割、またはインターフェロンγ産生の誘発による役割に焦点を当てている。線維細胞形成に対するＩＬ−１２の直接の作用は、これまで認められていないようである。
【００１２】
ラミニン−１
本発明のさらに別の態様は、新たに発見された、単球の線維細胞への分化を抑制するラミニン−１の能力に関する。ラミニンは、単球の循環から組織への移動に関与する細胞外マトリックスタンパク質である。
【００１３】
白血球が組織に侵入するためには、ラミニンが、血管壁の内皮細胞および周囲の基底膜を通り抜けなければならない。この過程は、白血球をその内皮細胞上に拘束し、回転させ、停止させるものである。内皮細胞に付着した後、白血球は内皮細胞間を通り、血管壁を抜けて組織へと渡る。細胞が血管壁を通過する血管外遊走の過程は、細胞の表現型および機能を変更する。
【００１４】
これらの事象は、インテグリンを含む一連の細胞表面接着受容体によって制御される。インテグリンは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、およびラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）を含む広範な種類のリガンドに結合する。マトリックスタンパク質は、血管壁の基底内に存在しており、これにラミニンが含まれる。ラミニンは、糖タンパク質の大きな一ファミリーであり、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有する。異なるα鎖、β鎖、およびγ鎖を使用すると、少なくとも１２種の異なるラミニンアイソフォームが発現される。種々の発育段階、および種々の体内部位で異なるラミニンが発現される。
【００１５】
強皮症
本明細書に記載の調査では、強皮症（全身性硬化症）患者の血清が、正常な患者の血清ほど、単球からの線維細胞への分化を抑制し得ないことが発見された。さらに、強皮症患者は、循環ＳＡＰのレベルがより低いことがわかった。
【００１６】
強皮症は、ある範囲の症状を伴う遺伝性でも感染性でもない疾患である。強皮症は、皮膚および内部の臓器で、線維芽細胞を含む瘢痕組織が形成されるものである。線維芽細胞の起源はわかっていない。強皮症の軽度または初期の症例では、皮膚の硬化、疲労、痛み、および寒さへの敏感さが見られる。より重度で後期の段階では、高血圧、皮膚潰瘍、関節動作困難、および肺の瘢痕化および腎不全による死が見られる。米国では約３００，０００人が強皮症に罹患している。この疾患は、狼瘡およびリウマチ様関節炎と類似点をもつ。臨床治験が行われていないので、強皮症のための療法または意味のある治療は存在せず、診断すら難しい。
【００１７】
腎性線維性皮膚障害
腎性線維性皮膚障害（ＮＦＤ）は、新たに認められた、強皮症様の皮膚の線維化状態である。この障害は、腎臓機能不全の患者で発症する。強膜の黄色斑および循環抗リン脂質抗体が、ＮＦＤのマーカーとして提案されている。ＮＦＤの紡錘細胞でＣＤ３４とプロコラーゲンに対する二重の免疫組織化学染色では、ＮＦＤの皮膚細胞が、真皮に動員された循環線維細胞であるかもしれないことが示唆された。したがって、線維細胞形成の抑制は、この疾患の症状を緩和し得る。
【００１８】
喘息
喘息は、世界中で１億人以上が罹患しており、その罹患率は増加しつつある。喘息は、慢性の気道炎症によって引き起こされるようである。喘息の最も破壊的な側面の１つは、慢性の炎症に応答した気道の再造形である。この再造形は、線維症のために網状板（気道を取り巻く上皮下の網状基底膜）が肥厚するものである。次いで、厚くなった気道壁のために、気道の通路が圧迫されるようになる。
【００１９】
喘息患者の肥厚した網状板は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、フィブロネクチン、およびテネイシンなどの細胞外マトリックスタンパク質を異常に高いレベルで含む。これらのタンパク質の供給源は、筋線維芽細胞と呼ばれる特殊化したタイプの線維芽細胞のようである。
【００２０】
喘息患者では、アレルゲンに曝してから４時間以内にＣＤ３４＋／コラーゲンＩ＋線維細胞が気管支粘膜の基底膜付近に蓄積する。アレルゲンに曝してから２４時間後には、標識された単球／線維細胞が、筋線維芽細胞のマーカーであるα−平滑筋アクチンを発現させたことが観察されている。これらの所見は、喘息患者では、アレルゲンへの曝露が、血液の線維細胞を気管支粘膜に侵入させ、筋線維芽細胞に分化させ、次いで気道壁の肥厚を引き起こし、気道を塞ぐことを示唆している。さらに、単球化学誘引タンパク質１もしくはＴＧＦβ−１をコードする遺伝子の調節領域に突然変異を有することと喘息の重症度とには相関がある。このことも、単球の動員および筋線維芽細胞の出現が喘息の合併症をもたらすことを示唆している。
【００２１】
網状板の肥厚は、喘息を慢性気管支炎または慢性閉塞性肺疾患と区別し、喘息が従来の薬物療法によって抑制されているときでも見られる。気道壁の肥厚程度の増大は、重症の喘息と関連付けられる。網状板の肥厚を低減するための薬物療法または治療法はない。しかし、気道壁中に見られる筋線維芽細胞数を減少させると、肥厚を軽減し、またはそれ以上の肥厚の予防を手助けし得ると思われる。
【００２２】
特発性肺線維症
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、病因の不明な独特なタイプの慢性線維性肺疾患である。発病させる機序の次第はわかっていないが、この疾患は、上皮の外傷および活性化、特有の上皮下の線維芽細胞病巣／筋線維芽細胞病巣の形成、および過剰の細胞外マトリックスの蓄積を特徴とする。これらの病理学的な過程は通常、肺の構造に進行性かつ不可逆性の変化をもたらし、その結果、比較的短い期間で、進行性の呼吸器不全、さらにはほとんど例外なく末期の結果を招く。研究では、主として線維性応答を開始するための炎症の機序に焦点が当てられてきたが、最近の証拠からは、肺胞上皮の崩壊が根底の病原事象であることが強く示唆される。創傷治癒において線維細胞が担う役割、および喘息の気道壁肥厚化におけるその既知の役割を考えると、線維細胞の過剰産生をＩＰＦと関連付けられそうに思われる。
【発明の開示】
【００２３】
本発明は、単球からの線維細胞への分化を抑制する組成物および方法を含む。選択された実施形態では、ＳＡＰ、ＩＬ−１２、ラミニン−１、ＩｇＧ凝集体、上記のもののいずれかの補因子、およびこれらの任意の組合せを供給することによって、目標とする位置での線維細胞への分化を抑制することができる（「ＳＡＰ」、「ＩＬ−１２」、および「ラミニン−１」の呼称は、本明細書では、所与の状況でそれがその用法から明らかに除外されない限り、これらタンパク質の機能性の断片も指す）。目標位置は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにあってもｉｎ ｖｉｖｏにあってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏでは、目標位置には、生物体全体またはその部分が含まれてもよいし、組成物は全身に投与してもよいし、臓器や組織などの特定の区域に限定してもよい。組成物には、直接に供給されるもの、または、例えば導入遺伝子を発現させて目標位置もしくは目標位置と同じ生物体中で生成されるものが含まれ得る。これらの組成物は、濃度を正常レベルよりも増大させ、またはその濃度を正常レベルにし、またはその正常な活性レベルを回復するのに十分な量で与えることができる。本来の産生を刺激し、または正常な分解を抑制することによって、これらの組成物のいくらかの濃度または活性を増大させることができる。
【００２４】
単球からの線維細胞への分化を低減すると、数多くの線維性疾患、または線維症によって引き起こされる他の障害の症状を緩和することができる。
【００２５】
本発明はまた、試料の、単球から線維細胞への分化を調節する能力を検出するためのアッセイを含む。一実施形態では、正常な単球を試料と共に供給する。試料は、正常なＳＡＰを含んでよい。試料は、線維症患者などの患者に由来するＳＡＰまたは生物学的な体液を含んでいてもよいし、あるいは潜在的な薬物を含んでいてもよい。別の実施形態では、試料は正常なＳＡＰを含み、単球は、患者由来であり、異常なものでよい。どちらのタイプのアッセイでも、単球の線維細胞への分化に及ぼされる影響を正常な対照と比較して、正常なものと比べた、単球の分化の増加または減少を検出することができる。
【００２６】
以下の図は、本明細書の部分であり、本発明のある側面をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図面の１種または複数を本明細書で提供する詳細な説明と合わせて参照することによってより深く理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
単球の分化の抑制
線維化をもたらす事象の調節には、線維細胞の増殖および分化が関与する。線維細胞は、通常は組織外傷部位に侵入して、血管新生および創傷治癒を促進する、末梢血単球由来の線維芽細胞様細胞の特質的な集団である。血清または血漿の不在下でＣＤ１４＋末梢血単球を培養すると、線維細胞へと急速に分化する。この過程は７２時間以内に起こり、血清または血漿の存在によって抑制される。線維細胞の急速な出現を抑制する血清中因子は、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）である。さらに、線維性疾患の強皮症患者の一団は、血清の線維細胞への分化を抑制する能力が弱く、相応じて低レベルのＳＡＰを示す。これらの結果は、循環または末梢組織中の低レベルのＳＡＰが、線維症などの病理学的過程をもたらし、またはその中で役割を担うことを示唆している。単球分化アッセイでは、ＩＬ−１２、ラミニン−１、および結合型ＩｇＧ分子が単球から線維細胞への分化を抑制することも明らかになった。
【００２８】
線維細胞形成の抑制因子の１種または複数を含有する組成物を使用して、特に、不適切な位置での線維症、および線維性障害および慢性の炎症状態における線維症を抑制することができる。組成物は、局所に適用しても、または全身に適用してもよい。特定の実施形態では、ＳＡＰを含有する組成物は、目標位置のＳＡＰ濃度を少なくとも約０．５μｇ／ｍｌに上昇させることが可能となり得る。ヒトでは、アミロイド症の調査患者に、予めＩ１２５標識ＳＡＰを投与している。治療では、成人に約６００μｇのＳＡＰを投与した。したがって、成人への約６００μｇのＳＡＰの投与は安全である。適切な条件下では、より多い投与量も安全となり得る。
【００２９】
本発明のある種の組成物の形で供給されるＳＡＰには、ＳＡＰタンパク質全体またはその部分、好ましくは線維細胞形成の抑制において機能する部分が含まれ得る。好例となる実施形態では、ＳＡＰの機能性部分は、線維細胞の生成に対して影響を及ぼさない、ＣＲＰと配列相同性の関係にない領域から選択する。例えば、ＳＡＰのアミノ酸６５〜８９（ＫＥＲＶＧＥＹＳＬＹＩＧＲＨＫＶＴＰＫＶＩＥＫＦＰ−配列番号１）は、ＣＲＰと相同でない。アミノ酸１７０〜１８１（ＩＬＳＡＹＡＹＱＧＴＰＬＰＡ−配列番号２）および１９２〜２０５（ＩＲＧＹＶＩＩＫＰＬＶ−配列番号３）も相同でない。さらに、２種のタンパク質間の単一アミノ酸によるいくつかの差異が知られており、機能の違いをもたらし得る。
【００３０】
ＩＬ−１２を含有する組成物は、目標とする位置のＩＬ−１２濃度を約０．１〜１０ｎｇ／ｍｌに上昇させることができる。ラミニン−１を含有する組成物は、目標位置のラミニン−１濃度を約１〜１０μｇ／ｍｌに上昇させることができる。凝集ＩｇＧを含有する組成物は、目標位置の凝集ＩｇＧ濃度を約１００μｇ／ｍｌに上昇させることができる。組成物は、組み合わせて、または補因子と共に供給してもよい。組成物は、目標位置に正常に存在すれば、正常レベルを回復するのに十分な量で投与してもよいし、あるいは目標位置のレベルを正常より高いレベルに上昇させる量で投与してもよい。
【００３１】
上記組成物は、外来供給源から目標位置に供給してもよいし、あるいは目標位置の細胞または目標位置と同じ生物体の細胞によってｉｎ ｖｉｖｏで生成されてもよい。これらの組成物は、生体液を含む提供された皮膚組織から単離することができる。これら組成物は、細菌、組織培養細胞、または当業界で知られている他の任意の種類の細胞もしくは組織、または完全体の動物中で組換えタンパク質として生成されてもよい。これら組成物は、合成によって、または当業界で知られている他の任意の方法によって生成してもよい。ｉｎ ｖｉｖｏで生成する場合、これらの組成物は、導入遺伝子の発現産物でもよいし、または既存のｉｎ ｖｉｖｏ供給源での産生を増強した結果として生じるものでもよい。これらの組成物のレベルは、目標位置で正常に存在する場合、正常な分解速度を下げることによって上昇させてもよい。さらに、例えば補因子を供給して、線維細胞への分化を抑制するこれらの組成物の能力を促進することも可能となり得る。
【００３２】
本発明の組成物は、生理的に適切などんな製剤にしてもよい。組成物は、注射、吸入、または他の任意の有効な手段によって生物体に局所的に投与することができる。
【００３３】
疾患ターゲット
単球から線維細胞への分化を抑制するための上述のものと同じ組成物および方法を使用して、強皮症、ケロイド性瘢痕化、リウマチ様関節炎、狼瘡、腎性線維性皮膚障害、日本住血吸虫感染後に形成されるような線維性病変、自己免疫疾患、病原性線維症、ライム病、膵炎および間質性線維症における間質の再構築、喘息、特発性肺線維症、慢性閉塞性灰疾患、および肺線維症が含まれるが、これに限らない状態の結果として生じる線維症を治療または予防することもできる。一部のこのような線維性疾患では、線維細胞が、線維症の末期の表れでないこともある。例えば、喘息では、線維細胞はさらに筋線維芽細胞に分化し、厚くなった気道壁に残り続ける。
【００３４】
本発明は、ＳＡＰによって正常に活性化された単球のＦｃシグナル伝達経路の任意の成分を活性化させて、線維細胞の生成を抑制し、または線維性疾患もしくは喘息を治療または予防する方法も含む。この経路は、Ｄａｅｒｏｎ、Ｍａｒｃによる「Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１５巻：２０３〜３４ページ（１９９７年）に詳述されている。好例となる実施形態では、副作用が最小限になるように活性化するように、他のシグナル伝達カスケードに共有されず、または単に数の限られた決定的でないシグナル伝達カスケードに過ぎない経路の一部を選択する。
【００３５】
単球分化アッセイ
本発明の別の態様は、単球からの線維細胞への分化を調節する試料の能力を検出するアッセイに関する。無血清培地では、正常な単球は、２〜３日で線維細胞になる。正常な血清、血液、または他の生物学的な体液は、特定の希釈度範囲内で正常な単球からの線維細胞の生成を抑制する。すなわち、このアッセイを使用して、試料が、無血清培地中で単球の線維細胞への分化を調節し得るかどうかを試験することができる。このアッセイを使用すると、試料の単球が無血清培地中で正常に線維細胞に分化するかどうか、さらに血清、ＳＡＰ、またはこの分化に影響を及ぼす他の因子に対して正常に応答したかどうかを判定することもできる。
【００３６】
特定の実施形態では、このアッセイを使用して、患者の生物学的な体液の、単球から線維細胞への分化を抑制する能力が低下しているか促進しているかを判定することができる。ＳＡＰによる抑制を試験する場合、本発明では、全血、血清、血漿、滑液、大脳脊髄液、および気管支体液を含めて、ＳＡＰが常時または一過性に存在するどんな生体液を使用してもよい。単球の分化を抑制する能力の減少は、線維症の指標とすることもでき、またはそのような障害になる性向であるともいえる。多くの患者では、生体液の線維細胞形成抑制能の減少は、ＳＡＰレベルが高いためであるかもしれないが、必ずしもこのとおりでない。ＳＡＰは、正常レベルで存在しても、ＳＡＰ自体の欠陥、または補因子もしくは他の分子の有無のために抑制活性の増強を示すこともある。ＥＬＩＳＡ、電気泳動法、分別など、抑制の問題のより正確な性質を決定する方法は、当分野の技術者に明らかとなろう。
【００３７】
上述の方法を使用して、線維細胞の分化に影響を及ぼすある種の潜在的な薬物が、患者にとって適切となり得るか否かを判定することもできる。
【００３８】
別の特定の実施形態では、このアッセイを使用して、患者の単球が、無血清培地で線維細胞に分化することができるか、ならびに生体液、ＳＡＰ、または別の組成物に正常に応答するかを判定することができる。より詳細には、線維症に罹患した患者が正常レベルのＳＡＰをもっていると思われる場合、血清またはＳＡＰありでも線維細胞に容易に分化することができるかを判定するために、患者の単球の試料を得ることが得策となり得る。
【００３９】
最後に、別の特定の実施形態では、このアッセイを使用して、単球の線維細胞への分化に対する薬物または他の組成物の作用を試験することができる。アッセイをこのように使用して、線維細胞の生成を調節するように設計された潜在的な薬物を同定してもよいし、あるいはアッセイを使用して、他の用途に向けた薬物の潜在的な有害事象をスクリーニングしてもよい。
【００４０】
本発明の特定の実施形態を明示するために、以下の実施例を含める。当業者ならば、以下の実施例中で開示する技術は、本発明を実施した際に発明者らが十分に機能することを発見した技術を代表するものであることを承知すべきである。しかし、当業者は、この開示を考えて、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、開示する特定の実施形態に多くの変更を加えても、同様または類似の結果が得られることを承知すべきである。
【実施例】
【００４１】
実施例１
線維細胞形成の抑制
末梢血Ｔ細胞の生存における細胞密度の考えられる役割を調べている際に、無血清培地で、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が線維芽細胞様細胞集団を生じさせたことが観察された。これらの細胞は、粘着性であり、紡錘体型の形態（図１Ａ）であった。無血清培地では約０．５〜１％のＰＢＭＣが線維芽細胞様細胞に分化し、この分化は、組織培養によって処理したプラスチック容器、ホウケイ酸塩スライドガラス、および標準のスライドガラスで起こった。
【００４２】
培養して３日以内のこれらの細胞の急速な出現は、ヒトの血清もしくは血漿によって抑制された。この過程をより詳細に調べるため、徐々に増していく各濃度のヒト血漿を含有する無血清培地中で、１ｍｌあたり５×１０５細胞のＰＢＭＣを６日間培養した。血漿が１０％〜０．５％の濃度で存在するとき、線維芽細胞様細胞には分化しなかった（図１Ｂ）。しかし、０．１％以下の血清では、線維芽細胞様細胞が急速に発育した。線維細胞の生成を抑制した血清の活性は、３０ｋＤａカットオフのスピンフィルターに捕らえられた（データ非表示）。血清を３０分間かけて５６℃に加熱した場合、効力は１０分の１になり、９５℃の加熱は、抑制活性を消滅させた（データ非表示）。
【００４３】
これらのデータは、抑制因子がタンパク質であることを示唆する。阻害因子はヒト血清中に存在していたので、凝固系とは関係がなさそうであることが示唆された。ウシ、ウマ、ヤギ、およびラットの血清も、これらの線維芽細胞様細胞の出現を抑制することができたので、阻害因子は、進化の過程で保存されたタンパク質であるようにも思われた（データ非表示）。
実施例２
【００４４】
線維芽細胞様細胞の特性決定
これら線維芽細胞様細胞が末梢血から分化したことは、これらが末梢血線維細胞であるかもしれないことを示唆した。線維細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで線維芽細胞様細胞に分化する末梢血単球由来の集団である。線維細胞は、創傷部位にすばやく侵入し、Ｔ細胞に抗原を提示することができる。この細胞の表現型は、ＣＤ４５やＭＨＣクラスＩＩなどの造血性マーカーと、コラーゲンＩやフィブロネクチンなどの間質性マーカーとからなる。しかし、これらの細胞を同定するために、ＰＢＭＣは、一般に、血清を含有する培地で１〜２週間培養した。
【００４５】
この系で認められた細胞が線維細胞であるかどうかを特性決定するために、ＰＢＭＣのＴ細胞を抗ＣＤ３で、Ｂ細胞を抗ＣＤ１９で、単球を抗ＣＤ１４で枯渇させ、あるいはすべての抗原提示細胞を抗ＨＬＡクラスＩＩで枯渇させ、次いで血清なしの条件で６日間培養した。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３または抗ＣＤ１９で枯渇処理しても、血清なしの培養物中で培養したとき、ＰＢＭＣから線維芽細胞様細胞は枯渇されなかった（データ非表示）。抗原提示細胞を抗ＨＬＡクラスＩＩで、または単球を抗ＣＤ１４抗体で枯渇させると、線維芽細胞様細胞の出現が妨げられたので、線維芽細胞様細胞が単球由来であり、樹状細胞集団でないことが示唆された。
【００４６】
線維芽細胞様細胞をさらに特性決定するために、ＰＢＭＣをスライドガラス上の無血清培地で５日間培養した。次いで、細胞を風乾し、アセトン固定し、種々の抗体で標識した（表１および図２）。線維細胞は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ、コラーゲンＩ、フィブロネクチン、ケモカイン受容体のＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、およびα−平滑筋アクチンを発現させる。上記培養条件下では、この実験の線維芽細胞様細胞も、これらすべてのマーカーを発現させた。線維細胞は、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ３８、およびｖＷＦについては陰性であり、この実験の線維芽細胞様細胞もそのとおりであった。これらのデータによれば、この実験で認められた線維芽細胞様細胞は、線維細胞であると思われる。さらに実験を行って、この表現型を広げた。上記条件下では、この線維細胞は、α１（ＣＤ４９ａ）、α２（ＣＤ４９ｂ）、α５（ＣＤ４９ｅ）、β１（ＣＤ２９）、およびβ３（ＣＤ６１）に加えて高レベルのβ２（ＣＤ１８）を含む数種のβ１インテグリンを発現させたが、α３、α４、α６、α４β７、αＥ、およびＣＬＡについては陰性であった（図２および表１）。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１のデータを得るために、８穴スライドガラスのウェルに入った無血清培地中で、１ｍｌあたり（１ウェル４００μｌ）２．５×１０５細胞のＰＢＭＣを６日間培養した。次いで、細胞を風乾し、アセトン固定し、免疫ペルオキシダーゼ染色した。細胞は、アイソタイプを一致させた対照抗体と比較して、示される抗原を陽性または陰性で記録した。
実施例３
【００４９】
線維細胞抑制因子の特性決定
急速な線維細胞への分化を妨げる血清因子の最初の特性決定では、その因子が、イオン交換カラム（Ｈｉｇｈ Ｑ）から４種のタンパク質のうちの１種として溶出されたヘパリン結合性分子であったことが示された。未変性ゲルから切断したバンドのトリプシン処理タンパク質断片の配列決定を行って、３種のタンパク質のうちの１種をＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）として同定した。Ｃ４ｂ結合タンパク質は、７本のα鎖（７０ｋＤａ）と、通常は１本のβ鎖（４０ｋＤａ）とからなる５７０ｋＤａのタンパク質であり、補体系のＣ４ｂ成分およびＣ２ａ成分の衰退の調節に関与する。Ｃ４ＢＰは、ビタミンＫ依存的な抗凝固タンパク質Ｓとも相互に作用する。Ｃ４ＢＰ／タンパク質Ｓ複合体は、ＢａＣｌ２沈殿法を使用して、血清または血漿から精製することができる。
【００５０】
Ｃ４ＢＰまたは関連するタンパク質が線維細胞への分化の抑制を司る因子であったかどうかを評価するため、クエン酸血漿をＢａＣｌ２処理した。抑制因子は、ＢａＣ１２沈殿中に存在した（図３および表２）。この画分をヘパリンカラムにかけ、画分を徐々に増していく各濃度のＮａＣｌで溶離し、無血清培地中で単球の線維細胞への分化を抑制するその能力を評価した。活性因子は、ヘパリンカラムから、２００ｍＭのＮａＣｌ濃度をピークに溶出された（図３および表２）。収量の若干の増加は、このステップが、この因子の活性を若干妨害する因子を除去したかもしれないことを示唆した。
【００５１】
２００ｍＭピークの画分をプールし、Ｈｉｇｈ Ｑイオン交換クロマトグラフィーによってさらに分別した。３００ｍＭのＮａＣｌで溶出される小さなピークが含んでいた活性は、線維細胞の分化を抑制した。この画分に存在するタンパク質を分析すると、主バンドが２７ｋＤａのタンパク質であったことが示された。イオン交換クロマトグラフィーにかけると、回収されるＳＡＰの量は減少したものの（図３Ａ、レーン８〜１０、および図３Ｄ、レーン８〜１０）、このステップにより、数種の混入タンパク質が確かに除去された。イオン交換ステップの後、唯一識別できる混入物は６５ｋＤａのアルブミンであった（図３Ａ、レーン１０）。
【００５２】
ＨｉｇｈＱ画分を濃縮し、非還元性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分別した後、ゲル切片中の物質を溶離した。約１４０ｋＤａのところに移動した単一のバンドが、分化を抑制することができた（図３Ｂ）。このバンドの分子量は、還元性ポリアクリルアミドゲルでは２７ｋＤａであったので、このタンパク質の未変性の構造が五量体であったことが示唆された（図３Ｃ）。このバンドをゲルから切除し、トリプシンで消化し、ＭＡＬＤＩ質量分光測定によって分析した。そこで、大きい方の３種のペプチドと、小さい方の２種のペプチド、すなわち、ＶＦＶＦＰＲ、ＶＧＥＹＳＬＹＩＧＲ、ＡＹＳＬＦＳＹＮＴＱＧＲ、ＱＧＹＦＶＥＡＱＰＫ、およびＩＶＬＧＱＥＱＤＳＹＧＧＫが同定された。これらの配列は、血清アミロイドＰのアミノ酸配列８〜１３、６８〜７７、４６〜５７、１２１〜１３０、および１３１〜１４３とぴったり一致した。
【００５３】
活性画分がＳＡＰを含んでいたことを確認するため、カラムクロマトグラフィーによって収集した画分をウェスタンブロッティングによって分析した（図３Ｄ）。線維細胞への分化を抑制したすべての画分で、ＳＡＰの存在が２７ｋＤａのところで検出された（図３Ｄ、レーン６、８、１０、および１１）。ＢａＣｌ２沈殿ステップの上清中にかなりの量のＳＡＰが存在したので、この手順の効率が悪いことが示唆され、ＢａＣｌ２ペレット中には、線維細胞抑制活性の約１０〜１５％しか回収されなかった（図３Ａ、レーン２）。ウェスタンブロッティングと共に使用するときに抗ＳＡＰ抗体が免疫グロブリンに結合するという既知の問題を解消するために、この抗体を、アガロースに結合させたヒトＩｇＧと共に予めインキュベートした。画分のＣＲＰ、Ｃ４ＢＰ、およびタンパク質Ｓの存在についても分析した。ウェスタンブロッティングでは、Ｃ４ＢＰおよびタンパク質Ｓが、血漿中、およびバリウム沈殿物中には存在するが、ヘパリンクロマトグラフィーによって収集した活性画分には存在しないことが示された（データ非表示）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
血漿は、ＢａＣｌ２沈殿法、ヘパリンクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーによって分別した。タンパク質濃度は、分光光度法によって２８０ｎｍで評価した。線維細胞の分化の抑制は、形態によって評価した。試料の線維細胞抑制活性は、無血清培地に加えたときに試料が線維細胞への分化を５０％抑制した希釈度の逆数であると定義した。
【００５６】
ＳＡＰは、以下の方法を使用するＥＬＩＳＡによって検出することもできる。
Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６穴プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニューヨーク州ロチェスター）を、４０℃のもと、モノクローナル抗ＳＡＰ抗体（ＳＡＰ−５、Ｓｉｇｍａ）の入った５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５で被覆した。次いで、プレートを、４％のＢＳＡを含有するトリス緩衝食塩水ｐＨ７．４（ＴＢＳ）（ＴＢＳ−４％ＢＳＡ）中でインキュベートして、非特異的結合を抑制した。血清および精製タンパク質をＴＢＳ−４％ＢＳＡで１０００倍に希釈して、ＳＡＰが凝固しないようにし、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで洗浄した。ＴＢＳ−４％ＢＳＡで５０００倍に希釈したポリクローナルウサギ抗ＳＡＰ抗体（ＢｉｏＧｅｎｅｓｉｓ）を検出用抗体として使用した。洗浄した後、ＴＢＳ−４％ＢＳＡで希釈した１００ｐｇ／ｍｌのビオチン標識ヤギ（Ｆａｂ）２抗ウサギ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を６０分間かけて加えた。ビオチン標識した抗体をＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）によって検出した。希釈していないペルオキシダーゼ基質３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を室温で５分間インキュベートした後、１Ｎ ＨＣｌによって反応を停止させ、４５０ｎｍで読み取った（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米バーモント州ウィヌースカ）。アッセイは、２００ｐｇ／ｍｌまで感度があった。
実施例４
【００５７】
血清アミロイドＰの特異性
血清アミロイドＰは、構成血漿タンパク質であり、ヒトの主要な急性相タンパク質であるＣＲＰと近い関係にある。他の血漿タンパク質も線維細胞への分化を抑制することができるかどうかを評価するため、精製した市販のＳＡＰ、ＣＲＰ、Ｃ４ｂ、またはタンパク質Ｓの存在下、ＰＢＭＣを無血清培地で培養した。市販のＳＡＰは、非置換アガロースのカルシウム依存的なアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。試験したタンパク質のうち、ＳＡＰだけが線維細胞への分化を抑制することができ、阻害活性は、１０μｇ／ｍｌで最高に達した（図４）。希釈曲線は、市販のＳＡＰの活性が約６．６×１０３単位／ｍｇであることを示唆した（図４）。血清および血漿は、３０〜５０μｇ／ｍｌのＳＡＰを含有する。線維細胞は、約０．１５〜０．２５μｇ／ｍｌのＳＡＰになるはずの０．５％の血漿希釈度で出現し始めたが、これは、精製ＳＡＰの閾値濃度に匹敵する。異なる２通りの手順を使用して精製したＳＡＰが、線維細胞への分化を抑制することを示すデータは、ＳＡＰが線維細胞への分化を抑制することを強く示唆している。
【００５８】
これらのデータは、ＳＡＰが線維細胞の発育を抑制し得ることを示唆しており、このことを示す方法でＳＡＰが精製されているが、血漿および血清からＳＡＰを枯渇させると抑制が無効になるかどうかを判定したものではない。アガロースビーズ（ＢｉｏＧｅｌ Ａ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、血漿からＳＡＰを枯渇させた。血漿を１００ｍＭのトリスｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２緩衝液で２０％に希釈し、４０℃で２時間、１ｍｌのアガロースビーズと混合した。次いで、遠心分離によってビーズを除去し、この過程を繰り返した。次いで、この枯渇処理した血漿の、線維細胞への分化を抑制する能力を評価した。１００ｍＭのトリスｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２緩衝液で２０％に希釈した対照血漿の希釈曲線は、未処理の血漿で認められるものと類似していた。対照的に、ビーズで処理した血漿は、中程度の血漿レベルでは線維細胞への分化をそれほど抑制することができなかった。これらのデータ、ならびに精製ＳＡＰが線維細胞への分化を抑制できることは、ＳＡＰが、線維細胞への分化を抑制する血清および血漿中の活性因子であることを強く示唆している（図５を参照のこと）。
【００５９】
血漿のＳＡＰの、抗ＳＡＰ抗体で被覆したタンパク質Ｇビーズを使用する枯渇処理も行った。ＳＡＰを除去すると、血漿の、線維細胞への分化を抑制する能力が、血漿、または対照抗体で被覆したビーズで処理した血漿と比べて有意に低下した（ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。対照抗体で被覆したビーズは、血漿からいくらかの線維細胞抑制活性を除去したが、これは、血漿と共に培養した細胞と有意に異なってはいなかった。このことはおそらく、ＳＡＰがタンパク質Ｇビーズ中のアガロースに結合していることを反映している。これらのデータ、ならびに精製ＳＡＰが線維細胞への分化を抑制できることは、ＳＡＰが、線維細胞への分化を抑制する血清および血漿中の活性因子であることを強く示唆している。
実施例５
【００６０】
抗体およびタンパク質
精製されたヒトＣＲＰ、血清アミロイドＰ、タンパク質Ｓ、およびＣ４ｂは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４０、Ｐａｎ ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ、マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ１、およびマウスＩｇＧ２ａに対するモノクローナル抗体は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。ケモカイン受容体抗体は、Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（米ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。ウサギ抗コラーゲンＩはＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（米カリフォルニア州テメキュラ）から、モノクローナルＣ４ｂ結合タンパク質はＧｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（米バーモント州バーリントン）から、ヒツジ抗ヒトＣ４ｂ結合タンパク質はＴｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ（英バーミンガム）から、モノクローナル抗ＣＲＰはＳｉｇｍａ（米ミズーリ州セントルイス）から得た。ポリクローナルウサギ抗タンパク質Ｓは、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（英国ドーセット州プール市）から得た。
実施例６
【００６１】
細胞の分離
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米ニュージャージー州ピスカタウェイ）による４００×ｇでの遠心分離に４０分間かけて、バフィーコート（Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ、米テキサス州ヒューストン）から末梢血単各細胞を単離した。ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、米ニューヨーク州レークサクセス）を使用するネガティブ選択を利用して、以前に記載したとおりに、指定された白血球サブセットの枯渇処理を行った。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを一次抗体と共に４０℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧで被覆したＤｙｎａｂｅａｄｓと共に３０分間インキュベートした後、磁気選択によって抗体で覆われた細胞を除去した。この過程を２回繰り返した。ネガティブ選択した細胞の純度は、モノクローナル抗体標識によって判定したところ、決まって９８％を超えていた。
実施例７
【００６２】
細胞培養および線維細胞分化アッセイ
細胞を、次のような無血清培地、すなわち、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌの鉄で飽和させたトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、および５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米カリフォルニア州カールスバッド）中でインキュベートした。正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、正常ヒト血漿（Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）、またはウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、カラム画分、患者の血清および滑液、または精製タンパク質を所定の濃度で加えた。患者試料は、ヒューストンのテキサス大学医学部にある、研究者に開放されている貯蔵所から入手した。この貯蔵所は、患者の情報を守秘し、ＮＩＨ指針をすべて満たしている。
【００６３】
５％のＣＯ２を含む加湿インキュベーター中で、体積がそれぞれ２ｍｌまたは２００μｌの２４穴または９６穴の組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米ニュージャージー州フランクリンレークス）に入った１ｍｌあたり２．５×１０５細胞のＰＢＭＣを、３７℃で指示どおりの時間培養した。小さなリンパ球または付着単球と異なる、引き伸ばされた紡錘型の形態を有する付着細胞として生存培養物中に存在する形態によって、異なる５箇所の直径９００μｍ視野にある線維細胞を数えた。あるいは、細胞を風乾し、メタノール固定し、ヘマトキシリンエオシン染色を施した（Ｈｅｍａ３ Ｓｔａｉｎ、ＶＷＲ、米テキサス州ヒューストン）。上記の判断基準、および楕円形の核の存在を利用して線維細胞を数えた。線維細胞のカウントは、ウェルあたり２．５×１０４細胞の細胞を平底９６穴プレートで６日間培養したものについて行った。さらに、免疫ペルオキシダーゼ染色によって線維細胞の同一性を確認した（以下を参照のこと）。試料の線維細胞抑制活性は、無血清培地に加えたときに試料が線維細胞への分化を５０％抑制した希釈度の逆数であると定義した。
実施例８
【００６４】
血清タンパク質および血漿タンパク質の精製と特性決定
冷凍ヒト血清もしくは血漿１００ｍｌを３７℃ですばやく解凍し、１倍「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、米インディアナ州インディアナポリス）、１ｍＭのベンズアミジンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、および１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（ＡＥＢＳＦ：フッ化４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル塩酸塩、Ｒｏｃｈｅ）を加えた。後続のステップはすべて、氷上または４℃で実施した。血漿を、以前に述べたとおりに、クエン酸バリウムに吸着させた。１０，０００×ｇで１５分間の遠心分離にかけて、沈殿を収集し、１００ｍＭのＢａＣｌ２プラス阻害剤２０ｍｌに再懸濁し、遠心分離にかけ直した。２回洗浄した後、ペレットを、５ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのベンズアミジンＨＣｌを含有する１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に再懸濁して２０ｍｌとし、同じ緩衝液４リットルを３回交換しながら２４時間かけて透析した。
【００６５】
Ｅｃｏｎｏ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米カリフォルニア州ハーキュレス）を使用するクロマトグラフィーを行って、流速１ｍｌ／分で１ｍｌの試料を収集した。透析処理したクエン酸バリウム沈殿を５ｍｌ容Ｈｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装入し、２８０ｎｍでの吸光度が基点に戻るまで、カラムを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４で十分に洗浄した。結合している材料を、１００、２００、３００、および５００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４各１５ｍｌで段階的に勾配をかけて溶離した。単球の線維細胞への分化を阻害した画分は、２００ｍＭのＮａＣｌで溶出された。これらをプールし（２ｍｌ）、５ｍｌ容Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｋ Ｈｉｇｈ Ｑカラムに装入した。１０ｍＭのリン酸緩衝液でカラムを洗浄した後、結合している材料を上記のように段階的な勾配をかけて溶離したが、活性画分は、３００ｍＭのＮａＣｌで溶出された。
【００６６】
Ａｑｕａｃｉｄｅ ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して、Ｈｉｇｈ Ｑクロマトグラフィーの活性画分を２００μｌに濃縮し、次いで以前に述べたとおりに４〜２０％の未還元性ポリアクリルアミドゲル（ＢＭＡ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、米メイン州ロックランド）上に載せた。電気泳動にかけた後、ゲルのレーンを切断して５ｍｍの切片とし、１ｍＭのベンズアミジンＨＣｌを含有する２００μｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４と混合し、エッペンドルフ試験管に入れて小さな乳棒で砕き、４℃で３日間転倒型ミキサーに入れておいた。ゲルから溶出されたタンパク質の活性を分析した。アミノ酸配列を得るため、ゲル切片から溶出されたタンパク質を、１００μＭのチオグリコール酸を含む上部チャンバー（Ｓｉｇｍａ）中の４〜２０％のゲル上に載せた。電気泳動にかけた後、ゲルを直ちにクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱染色し、ゲルからバンドを切除した。アミノ酸の配列決定は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、免疫学科、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦａｃｉｌｉｔｙのＲｉｃｈａｒｄ Ｃｏｏｋ博士が行った。
実施例９
【００６７】
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングについては、血漿および血清試料を１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４で５００倍に希釈した。ヘパリンカラムおよびＨｉｇｈ Ｑカラムからの画分は希釈しなかった。試料を、２０ｍＭのＤＴＴを含有するＬａｅｍｍｅｌｉ試料緩衝液と混合し、５分間かけて１００℃に加熱した。試料を４〜２０％のトリス／グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ）上に載せた。未変性ゲル用の試料は、ＤＴＴまたはＳＤＳなしで分析した。タンパク質を、２０％のメタノールを含有するトリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液中のＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米マサチューセッツ州ベッドフォード）膜に移した。フィルターを、４℃で１８時間かけて、５％のＢＳＡ、５％の無脂肪乳タンパク質、および０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＥＳ）ｐＨ７．４でブロックした。所定の最適希尺度（データ非表示）を使用して、一次抗体およびビオチン標識二次抗体を、５％のＢＳＡ、５％の無脂肪乳タンパク質、および０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ ｐＨ７．４で６０分間かけて希釈した。５％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ ｐＨ７．４で希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を使用してビオチン標識抗体を同定し、化学発光法（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結果を可視化した。
実施例１０
【００６８】
免疫組織化学
ガラス製８穴顕微鏡スライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米イリノイ州ネーパーヴィル）上で培養した細胞を風乾した後、１５分間アセトン固定した。内発性のペルオキシダーゼを０．０３％のＨ２Ｏ２で１５分間かけて失活させ、次いで、２％のＰＢＳ中ＢＳＡの中で６０分間インキュベートして非特異的結合をブロックした。スライドを、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中の一次抗体を加えて６０分間インキュベートした。アイソタイプを一致させた、関連性のない抗体を対照として使用した。次いで、スライドを１５分間かけてＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に６０分間インキュベートした。洗浄した後、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）によってビオチン標識抗体を検出した。染色の発色は、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン、Ｓｉｇｍａ）で３分間かけて行い、マイヤーのヘマラム（Ｓｉｇｍａ）で３０秒間の対比染色を行った。
実施例１１
【００６９】
線維細胞上の表面マーカーの発現
８穴スライドガラスのウェルに入った無血清培地中で、１ｍｌあたり（１ウェル４００μｌ）２．５×１０５細胞のＰＢＭＣを６日間培養した。次いで、細胞を風乾し、アセトン固定し、免疫ペルオキシダーゼ染色を施した。細胞は、アイソタイプを一致させた対照抗体と比較して、示される抗原を陽性または陰性で記録した。
実施例１２
【００７０】
分別にかけたヒト血漿からのタンパク質および線維細胞抑制活性の回収
血漿は、ＢａＣｌ２沈殿法、ヘパリンクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーによって分別した。タンパク質濃度は、吸光分光分析によって２８０ｎｍで評価した。線維細胞への分化の抑制は、形態によって評価した。試料の線維細胞抑制活性は、無血清培地に加えたときに試料が線維細胞への分化を５０％抑制した希釈度の逆数であると定義した。
実施例１３
【００７１】
ＩＬ−１２
実験では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで線維細胞への分化を促進し得ることがわかった。詳細には、末梢血単核細胞を、様々なサイトカインの存在下、無血清培地で培養した（図６Ａを参照のこと）。約５ｎｇ／ｍｌを上回るＩＬ−１２濃度が、培養中の線維細胞数を抑えた（図６Ｂを参照のこと）。このことは、ＩＬ−１２が、線維細胞前駆体から成熟線維細胞への分化を抑制し得ることを示唆している。
実施例１４
【００７２】
ラミニン１
内皮および基底膜を横断する過程は、単球に対する活性化シグナルおよび分化シグナルを誘発する。したがって、細胞外マトリックスタンパク質が線維細胞への分化に影響を及ぼしたかどうかを判定するために実験を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液ｐＨ９．５に入れた細胞外マトリックスタンパク質を、４℃で１８時間かけて９６穴組織培養プレートに結合させた。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−ＦおよびＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−ＬをＰＢＳに希釈させた。プレートをＰＢＳ中で洗浄し、２％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中、３７℃で６０分間インキュベートして、非特異的な結合を防いだ。プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで組織培養培地で洗浄した。次いで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、４日間培養した。線維細胞の分化は、コラーゲン、フィブロネクチン、およびビトロネクチンを含む広範な種類のＥＣＭタンパク質上で培養しても影響を受けなかった。しかし、ＰＢＭＣをラミニン１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米ミズーリ州セントルイス）またはＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｆ（三洋化成工業株式会社、京都府）と共に培養すると、線維細胞数が有意に減少した（図７Ａを参照のこと）（ｐ＜０．０００１）。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｆは、絹タンパク質構造物であり、フィブロネクチンの正準ＲＧＤ接着配列の繰返しである。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｌは、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｆと類似した構造であり、ラミニンのα１鎖由来のアミノ酸配列ＩＫＶＡＶを有する。
【００７３】
他のラミニンタンパク質が線維細胞への分化を抑制し得るかどうかを判定するため、追加の実験を実施した。第２の市販ラミニンであるラミニン１０／１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米カリフォルニア州テメキュラ）は、ラミニン１ほど線維細胞への分化を抑制することができなかった（図７Ｂを参照のこと）。
【００７４】
このデータは、ＩＫＶＡＶ領域の外側にあり、ラミニン１０および１１には不在である、ラミニン１に特異的な配列が、線維細胞への分化に対する抑制作用を司っている可能性を示唆している。
実施例１５
【００７５】
抗体試験
ＳＡＰおよびＣＲＰは、食作用を増強し、様々な細胞上のＦｃγ受容体に結合する。ＣＲＰは、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）に高い親和性で結合し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に低い親和性で結合するが、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は結合しなかった。ＳＡＰは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩに優先的に、これらすべての古典的Ｆｃγ受容体に結合する。単球は、ＦｃγＲＩを構成性に発現させる。この受容体は、単量体ＩｇＧを結合するので、ｉｎ ｖｉｖｏで飽和状態になる。単量体ヒトＩｇＧの存在が、ＳＡＰによる線維細胞への分化の抑制を妨げるかどうかを判定するために、ある濃度範囲の単量体ＩｇＧの存在下、ＰＢＭＣを無血清培地で６０分間培養した。次いで、図８Ａに示した濃度のＳＡＰを加え、細胞を４日間培養した。上の実施例で述べたように、ＩｇＧなしの２．５μｇ／ｍｌのＳＡＰが、線維細胞への分化を強力に抑制した（図８Ａを参照のこと）。それぞれ約０．００１〜１０％の血清に相当する、０．１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲の単量体ＩｇＧは、線維細胞形成のＳＡＰによる抑制にほとんど影響を及ぼさなかった。
【００７６】
Ｆｃ受容体の連結および架橋が単球からの線維細胞への分化にも影響を及ぼすかどうかを判定するため、３種の試験用試料、すなわち、可溶性免疫複合体（オボアルブミン−抗体）、オプソニン処理されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を含む粒状免疫複合体、および熱凝集ＩｇＧを使用した。ＰＢＭＣを、オボアルブミンまたは抗オボアルブミンｍＡｂと共に４日間培養すると、この２種のタンパク質が、単独では、試薬を加えなかった培養物と比べても単球からの分化にそれほど影響を及ぼさなかったことが示された（図９Ａを参照のこと）。しかし、オボアルブミン：抗オボアルブミン免疫複合体を加えると、分化による線維細胞数が有意に減少した（図９Ａを参照のこと）。ＰＢＭＣをオプソニン処理したＳＲＢＣと共に培養したとき、同様の作用が認められた。ウサギ抗ＳＲＢＣでオプソニン処理したＳＲＢＣは、２０：１および４０：１のＳＲＢＣ：単球比で、ＳＲＢＣのみと共に培養した細胞と比べて有意に線維細胞への分化を抑制した（図９Ｂを参照のこと）。最後に、熱凝集Ｆ（ａｂ）２でなく、熱凝集ＩｇＧと共に培養したＰＢＭＣも、線維細胞への分化の強力な抑制を示した（図９Ｃを参照のこと）。全体として、これらのデータは、Ｆｃ受容体の連結および架橋が、単球の線維細胞への分化を抑制するものであることを示唆している。
【００７７】
免疫複合体が線維細胞への分化を抑制するという所見は、１種または複数のＦｃγＲが線維細胞への分化に影響を及ぼすことを示唆している。線維細胞への分化におけるＦｃγＲの役割を調べるため、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に対する阻止抗体の存在下または不在下でＰＢＭＣを培養した後、ＳＡＰを加え、または対照としてＣＲＰを加えた。試料を３種のＦｃγＲそれぞれに対する阻止ｍＡｂと共にプレインキュベートしたとき、ＳＡＰは、後から線維細胞への分化をそれほど抑制することができなかった。しかし、外部から加えたＳＡＰなしでも、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）阻止ｍＡｂの、線維細胞への分化に対する作用は甚大であった。ＰＢＭＣをＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩでなく、ＦｃγＲＩに対する阻止ｍＡｂと共にインキュベートすると、アイソタイプを一致させた対照ｍＡｂと共に培養した細胞、またはｍＡｂなしで培養した細胞と比べて線維細胞への分化が促進された（Ｐ＜０．０１）（図１０を参照のこと）。これらのデータは、ＳＡＰまたはＩｇＧが、培養系中の一部の細胞によって４日間かけて産生されたかもしれないこと、あるいはＳＡＰまたはＩｇＧが血液由来の細胞によって保持されたことを示唆している。ウェスタンブロッティングでは、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した後にＳＡＰまたはＩｇＧの存在は示されなかった。このことは、ＦｃγＲＩ阻止ｍＡｂが線維細胞への分化に直接的に作用を及ぼすこと、あるいはＳＡＰまたはＩｇＧが細胞培養の早期の期間中にしか存在していなかったことを示唆している。
【００７８】
本発明の単に例示的な実施形態を上で詳述しているが、本発明の真意および意図する範囲から逸脱することなく、これら実施例の変更形態および変形形態が考えられることは承知されよう。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】線維芽細胞様細胞への急速な分化に対する血清および血漿の影響を示す図である。 図１Ａでは、無血清培地で、１ｍｌあたり２．５×１０５の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．１％のヒト血清の存在下または不在下で３または６日間培養し、次いで、線維芽細胞様細胞が出現したかどうか顕微鏡で調べた。帯は１００μｍである。 図１Ｂでは、無血清培地で、１ｍｌあたり２．５×１０５のＰＢＭＣを、ヒト血漿の希釈物中で６日間培養した。次いで、細胞を風乾し、固定し、染色し、形態によって線維細胞を数えた。結果は、２．５×１０５ＰＢＭＣあたりの線維細胞数の平均±ＳＤとして示す（ｎ＝５実験）。星印は、０血漿からの統計学的有意差を示す。
【図２】線維芽細胞様細胞上の表面分子の発現を示すグラフである。ＰＢＭＣを、スライドガラス上の無血清培地で６日間培養した。細胞を風乾し、免疫組織化学によって分析した。使用したモノクローナル抗体は、表示したとおりであり、ビオチン結合ヤギ抗マウスＩｇ、次いでＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼによって同定した。細胞にマイヤーヘマトキシリンで対比染色を施して、核を確認した。陽性の染色は、褐色の染色によって確認したが、核は、青色に対比染色される。ＣＤ８３への書き込みは、樹状細胞への陽性染色を示すために用いた。
【図３】血漿中に存在する、線維細胞への分化を抑制する分子の特性決定を示す図である。クエン酸血漿をＢａＣｌ２で処理し、沈殿した物質を遠心分離によって収集し、１０ｍＭのＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する１０ｍＭのリン酸ナトリウムを用いて透析した。次いで、この物質をヘパリンクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって分別した。 図３Ａでは、画分を４〜２０％の変性ゲル上でのＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブルーで染色した。Ｍは、分子量マーカーを示す。レーン１は血漿を含み、レーン２はＢａＣｌ２上清を含み、レーン３は洗液１を含み、レーン４は洗液２を含み、レーン５はＢａＣｌ２沈殿を含み、レーン６はＢａＣｌ２沈殿を含み、レーン７はヘパリン通過物を含み、レーン８はヘパリン画分を含み、レーン９はＨｉｇｈ Ｑ通過物を含み、レーン１０はＨｉｇｈ Ｑ画分を含み、レーン１１はゲル精製された画分を含んでいた。レーン１〜５は、リン酸ナトリウム緩衝液で５００倍に希釈し、レーン６〜１１は希釈しなかった。 Ｈｉｇｈ Ｑイオン交換カラムから溶出された活性画分およびゲル切片を、図３Ｂでは未変性ゲル上、図３Ｃでは変性ゲル上での４〜２０％ＰＡＧＥによって分析した。ＮＭは未変性ゲルマーカーを示し、ＲＭは変性ゲルマーカーを示し、図３Ｃではレーン１〜３が対照ゲル試料であり、レーン４が活性画分を含んでいた。図３Ｄでは、ウサギ抗ＳＡＰ抗体を使用して、画分をウェスタンブロッティングによって評価した。レーン１〜１１は、図３Ａと対応している。
【図４】線維細胞の生成がＳＡＰによって抑制され、ＣＲＰまたは他の血漿タンパク質によっては抑制されないことを示すグラフである。無血清培地で、１ｍｌあたり２．５×１０５のＰＢＭＣを、精製した市販のＳＡＰ（黒四角）、ＣＲＰ（白四角）、タンパク質Ｓ（白ひし形）、またはＣ４ｂ（白丸）の存在下で６日間培養し、次いで、線維芽細胞様細胞が出現したかどうかを調べた。次いで、細胞を風乾し、固定し、染色し、形態によって線維細胞を数えた。結果は、２．５×１０５のＰＢＭＣあたりの線維細胞の平均±ＳＤである（ｎ＝３通りの独立した実験）。
【図５】線維細胞分化アッセイにおける血漿からのＳＡＰの除去の影響を示すグラフである。 図５Ａは、ＢｉｏＧｅｌアガロースビーズを用いての血漿からのＳＡＰの除去が線維細胞への分化に及ぼす影響を示す。様々な希釈度の血漿（白四角）またはＢｉｏＧｅｌによって枯渇処理した血漿（黒四角）を供給したアッセイで見られた線維細胞の数を示す。星印は、２種の曲線間の統計学的有意差を示す。 図５Ｂは、血漿なし、または等希釈度の血漿、ＢｉｏＧｅｌ ＳＡＰ枯渇処理血漿、もしくは抗ＳＡＰ抗体枯渇処理血漿を用いて実施したアッセイで生成した線維細胞の数を示す。星印は、統計学的有意差を示す。
【図６】単球からの線維細胞への分化に対する様々なサイトカインの作用を示す図である。図６Ａは、様々なサイトカインの作用を示す。図６Ｂは、ＩＬ−１２の作用をより詳細に示す。
【図７】線維細胞形成に対する細胞外マトリックスタンパク質の作用を示す図である。５０ｍＭの炭酸緩衝液ｐＨ９．５に入れた細胞外マトリックスタンパク質を、９６穴組織培養プレートに４℃で１８時間かけて結合させた。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−ＦおよびＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−ＬをＰＢＳで希釈した。プレートをＰＢＳ中で洗浄し、２％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で、３７℃で６０分間インキュベートして、非特異的結合を防いだ。プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで組織培養培地で洗浄した。次いで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、４日間培養した。様々な細胞外マトリックスタンパク質での結果を図７Ａに示す。ラミニン−１、ラミニン−１０／１１、およびＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｌの作用を図７ｂにより詳細に示す。
【図８】単球に結合し、その分化を抑制するＳＡＰの能力に対する単量体ＩｇＧの作用を示す図である。ＰＢＭＣを、ある濃度範囲の単量体ＩｇＧの存在下、無血清培地で６０分間培養した。次いで、示した濃度のＳＡＰを加え、細胞を４日間培養した。
【図９】Ｆｃ受容体の連結および架橋が線維細胞への分化に及ぼす作用を示す図である。可溶性の免疫複合体（オボアルブミン−抗体）、オプソニン処理されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を含む粒状免疫複合体、および熱凝集ＩｇＧを使用した。図９Ａでは、ＰＢＭＣを、オボアルブミンもしくは抗オボアルブミンｍＡｂのみ、またはオボアルブミン：抗オボアルブミン免疫複合体と共に４日間培養した。図９Ｂは、２０：１および４０：１のＳＲＢＣ：単球比での、ＳＲＢＣ単独、およびウサギ抗ＳＲＢＣでオプソニン処理したＳＲＢＣの作用を示す。最後に、図９Ｃは、熱凝集ＩｇＧおよび熱凝集Ｆ（ａｂ）２がＰＢＭＣに及ぼす作用を示す。９Ａおよび９Ｂの星印は、統計学的有意差を示す。
【図１０】単球の分化に対する抗ＦｃγＲ抗体の作用を示す図である。星印は、対照との統計学的有意差を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単球から線維細胞への分化を抑制するＳＡＰの能力に関する。したがって、本発明は、そのような分化を抑制するための組成物および方法を含む。これらの組成物および方法は、線維性疾患および喘息の治療など、線維細胞形成の低減が有益な様々な適用例で有用となり得る。本発明は、さらに、単球の線維細胞への分化能力の問題またはＳＡＰがこの分化を抑制する問題を検出する方法を含む。これらの問題は、疾患と相互に関係していてもよいし、薬物によって誘発されたものでもよい。
【背景技術】
【０００２】
線維細胞
炎症は、組織外傷または感染に対する協調応答である。開始事象は、白血球遊走因子の局所での放出、血小板の活性化、ならびに凝集および補体経路の開始を媒介とする。これらの事象が局所内皮を刺激して、好中球および単球の血管外遊出を促進する。炎症の第二相は、リンパ球を含む適応免疫系細胞の組織への流入を特徴とする。その後の消散相は、過剰白血球のアポトーシスおよび組織マクロファージによる抱き込みが起こるときには、線維芽細胞などの間質細胞による組織損傷の修復も特徴とする。
【０００３】
慢性の炎症では、炎症細胞の保存、線維芽細胞過形成、および最終的な組織破壊を伴い、炎症病変の消散が異常をきたす。これらの事象をもたらす機序は複雑であるが、細胞の動員、生存、および保持の増強、ならびに遊走障害を含む。
【０００４】
創傷病巣の修復を司り、または他の線維性応答で役割をもつ線維芽細胞の供給源については議論の最中にある。従来の仮説では、局所の静止線維芽細胞が、患部に移動し、細胞外マトリックスタンパク質を産生し、創傷の収縮または線維化を促進することが示唆されている。もう１つの仮説は、血液内に存在する循環線維芽細胞前駆細胞（線維細胞と呼ぶ）が、外傷部位または線維化部位に遊走し、そこで分化し、組織修復および他の線維性応答を媒介するというものである。
【０００５】
線維細胞は、ＣＤ１４＋末梢血単球前駆体集団から分化することが知られている。線維細胞は、造血細胞（ＣＤ４５、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３４）および間質細胞（コラーゲンＩ型およびＩＩＩ型、フィブロネクチン）の両方のマーカーを発現させる。成熟線維細胞は、組織外傷部位にすばやく侵入し、そこで炎症性のサイトカインを分泌する。線維細胞は、線維症を結果として生じ得る細胞外マトリックスタンパク質、他のサイトカイン、および血管原性前駆分子を分泌することもできる。
【０００６】
ＣＤ１４＋単球からの線維細胞への分化を抑制する機序は、本発明以前には広く知られていなかった。しかし、線維細胞への分化の制御は、多くの疾患および過程の制御において重要でありそうである。線維細胞は、様々な過程、ならびに強皮症、ケロイド性瘢痕化、リウマチ様関節炎、狼瘡、腎性線維性皮膚障害（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｎｇ ｄｅｒｍｏｐａｔｈｙ）、および特発性肺線維症を含む疾患と関係している。線維細胞は、マウスにおける日本住血吸虫感染後の線維性病変の成立で役割を果しており、自己免疫疾患に随伴する線維症にも関与する。線維細胞は、放射線による損傷と関係のある病原性線維症、ライム病、および肺線維症とも関連付けられている。ＣＤ３４＋線維細胞は、膵炎および間質性線維症における間質の再構築とも関連付けられており、一方この種の線維細胞の欠乏は、膵臓腫瘍および腺癌と関連している。線維症は、線維細胞が筋線維芽細胞へとさらに分化するときに、喘息患者、ならびにことによると慢性閉塞性肺疾患などの他の肺疾患でも付加的に起こる。
【０００７】
血清アミロイドＰ
線維細胞が役割を担う過程および疾患の範囲の広さを考えると、末梢血単球から線維細胞への分化を調節する機構は、非常に興味深いものである。本発明の態様は、単球からの末梢血線維細胞への分化が、血清および血漿中の因子によって抑制されるという発見に基づく。ヒト血漿を分別すると、この因子が血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）として同定された。ＳＡＰは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む、タンパク質のペントラキシンファミリーのメンバーであり、肝臓によって分泌され、安定な五量体として血中を循環する。ＳＡＰの正確な役割は未だ不明であるが、免疫応答の開始相および消散相の両方で役割を担うと思われる。ＳＡＰは、細菌表面上の糖残基に結合し、そのオプソニン作用をもたらし、抱き込まれる。またＳＡＰは、免疫応答の消散時に、アポトーシス細胞によって生成される遊離のＤＮＡおよびクロマチンに結合し、そうして二次炎症性応答を防ぐ。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）およびＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）が優先されるが、ＳＡＰが古典的Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）の３種すべてに結合できるために、ＳＡＰが結合した分子は、細胞外区域から除去される。受容体への結合後、ＳＡＰおよび結合相手の分子は、おそらくは細胞に抱き込まれる。
【０００８】
ＦｃγＲは、ＩｇＧが広範な造血細胞に結合するのに必要である。末梢血単球は、ＣＤ６４およびＣＤ３２を発現させ（単球の亜集団はＣＤ１６を発現させる）、組織マクロファージは、３種すべての古典的ＦｃγＲを発現させる。病原体に結合し、または免疫複合体の部分として結合したＩｇＧによって単球上のＦｃγＲがクラスターを形成すると、広範な生化学事象が開始される。受容体の集合に続く最初の事象は、一連のｓｒｃキナーゼタンパク質の活性化を含む。単球では、これらには、ｌｙｎ、ｈｃｋ、およびｆｇｒが含まれ、これらが、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩに関連するＦｃＲ−γ鎖のＩＴＡＭモチーフ上、またはＦｃγＲＩＩの細胞質ドメインのＩＴＡＭモチーフ上にあるチロシン残基をリン酸化する。リン酸化を受けたＩＴＡＭは、ｓｙｋを含む第２セットのｓｒｃキナーゼによって結合されることになる。ｓｙｋは、ＩｇＧに覆われた粒子に対する食作用にとって極めて重要であることがわかっている。しかし、非造血細胞中のｓｙｋの分布が広いこと、ならびにｓｙｋが、インテグリンおよびＧタンパク質共役型受容体の両方のシグナル伝達に関与するという証拠は、この分子が多くの機能を有することを示唆している。
【０００９】
ＳＡＰおよびＣＲＰはどちらも、食作用を増強し、様々な細胞上のＦｃγ受容体に結合する。ＣＲＰは、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）に高い親和性で結合し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に低い親和性で結合するが、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は結合しない。ＳＡＰは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩ、特にＦｃγＲＩに優先的に、３種すべての古典的Ｆｃγ受容体に結合する。ＣＲＰのＦｃγＲへの結合についての各所見は一致していないが、ＳＡＰおよびＣＲＰはどちらも、Ｆｃ受容体に結合し、ＦｃγＲの結合と一致する細胞内シグナル伝達事象を開始することがわかっている。
【００１０】
ヒト血清では、男性は通常、約３２μｇ／ｍｌ＋／−７μｇ／ｍｌのＳＡＰを有し、１２〜５０μｇ／ｍｌの範囲が正常である。女性は一般に、血清中に約２４μｇ／ｍｌ＋／−８μｇ／ｍｌのＳＡＰを有し、８〜５５μｇ／ｍｌの範囲が正常である。ヒトの大脳脊髄液中には、男性では通常約１２．８ｎｇ／ｍｌ、女性では約８．５ｎｇ／ｍｌのＳＡＰが存在する。男性と女性のデータを合わせると、ヒト血清中の正常ＳＡＰレベルは、２６μｇ／ｍｌ＋／−８μｇ／ｍｌであり、１２〜５５μｇ／ｍｌの範囲が正常である。（上記血清レベルは、平均＋／−標準偏差として示してある。）
【００１１】
ＩＬ−１２
本発明の他の態様は、新たに発見された、単球による線維細胞形成を抑制するＩＬ−１２の能力に関する。ＩＬ−１２は、以前から線維症および線維性疾患と関連付けられているが、ほとんどの研究は、ＩＬ−１２のＴｈ１免疫応答の促進における役割、またはインターフェロンγ産生の誘発による役割に焦点を当てている。線維細胞形成に対するＩＬ−１２の直接の作用は、これまで認められていないようである。
【００１２】
ラミニン−１
本発明のさらに別の態様は、新たに発見された、単球の線維細胞への分化を抑制するラミニン−１の能力に関する。ラミニンは、単球の循環から組織への移動に関与する細胞外マトリックスタンパク質である。
【００１３】
白血球が組織に侵入するためには、ラミニンが、血管壁の内皮細胞および周囲の基底膜を通り抜けなければならない。この過程は、白血球をその内皮細胞上に拘束し、回転させ、停止させるものである。内皮細胞に付着した後、白血球は内皮細胞間を通り、血管壁を抜けて組織へと渡る。細胞が血管壁を通過する血管外遊走の過程は、細胞の表現型および機能を変更する。
【００１４】
これらの事象は、インテグリンを含む一連の細胞表面接着受容体によって制御される。インテグリンは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、およびラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）を含む広範な種類のリガンドに結合する。マトリックスタンパク質は、血管壁の基底内に存在しており、これにラミニンが含まれる。ラミニンは、糖タンパク質の大きな一ファミリーであり、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有する。異なるα鎖、β鎖、およびγ鎖を使用すると、少なくとも１２種の異なるラミニンアイソフォームが発現される。種々の発育段階、および種々の体内部位で異なるラミニンが発現される。
【００１５】
強皮症
本明細書に記載の調査では、強皮症（全身性硬化症）患者の血清が、正常な患者の血清ほど、単球からの線維細胞への分化を抑制し得ないことが発見された。さらに、強皮症患者は、循環ＳＡＰのレベルがより低いことがわかった。
【００１６】
強皮症は、ある範囲の症状を伴う遺伝性でも感染性でもない疾患である。強皮症は、皮膚および内部の臓器で、線維芽細胞を含む瘢痕組織が形成されるものである。線維芽細胞の起源はわかっていない。強皮症の軽度または初期の症例では、皮膚の硬化、疲労、痛み、および寒さへの敏感さが見られる。より重度で後期の段階では、高血圧、皮膚潰瘍、関節動作困難、および肺の瘢痕化および腎不全による死が見られる。米国では約３００，０００人が強皮症に罹患している。この疾患は、狼瘡およびリウマチ様関節炎と類似点をもつ。臨床治験が行われていないので、強皮症のための療法または意味のある治療は存在せず、診断すら難しい。
【００１７】
腎性線維性皮膚障害
腎性線維性皮膚障害（ＮＦＤ）は、新たに認められた、強皮症様の皮膚の線維化状態である。この障害は、腎臓機能不全の患者で発症する。強膜の黄色斑および循環抗リン脂質抗体が、ＮＦＤのマーカーとして提案されている。ＮＦＤの紡錘細胞でＣＤ３４とプロコラーゲンに対する二重の免疫組織化学染色では、ＮＦＤの皮膚細胞が、真皮に動員された循環線維細胞であるかもしれないことが示唆された。したがって、線維細胞形成の抑制は、この疾患の症状を緩和し得る。
【００１８】
喘息
喘息は、世界中で１億人以上が罹患しており、その罹患率は増加しつつある。喘息は、慢性の気道炎症によって引き起こされるようである。喘息の最も破壊的な側面の１つは、慢性の炎症に応答した気道の再造形である。この再造形は、線維症のために網状板（気道を取り巻く上皮下の網状基底膜）が肥厚するものである。次いで、厚くなった気道壁のために、気道の通路が圧迫されるようになる。
【００１９】
喘息患者の肥厚した網状板は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、フィブロネクチン、およびテネイシンなどの細胞外マトリックスタンパク質を異常に高いレベルで含む。これらのタンパク質の供給源は、筋線維芽細胞と呼ばれる特殊化したタイプの線維芽細胞のようである。
【００２０】
喘息患者では、アレルゲンに曝してから４時間以内にＣＤ３４＋／コラーゲンＩ＋線維細胞が気管支粘膜の基底膜付近に蓄積する。アレルゲンに曝してから２４時間後には、標識された単球／線維細胞が、筋線維芽細胞のマーカーであるα−平滑筋アクチンを発現させたことが観察されている。これらの所見は、喘息患者では、アレルゲンへの曝露が、血液の線維細胞を気管支粘膜に侵入させ、筋線維芽細胞に分化させ、次いで気道壁の肥厚を引き起こし、気道を塞ぐことを示唆している。さらに、単球化学誘引タンパク質１もしくはＴＧＦβ−１をコードする遺伝子の調節領域に突然変異を有することと喘息の重症度とには相関がある。このことも、単球の動員および筋線維芽細胞の出現が喘息の合併症をもたらすことを示唆している。
【００２１】
網状板の肥厚は、喘息を慢性気管支炎または慢性閉塞性肺疾患と区別し、喘息が従来の薬物療法によって抑制されているときでも見られる。気道壁の肥厚程度の増大は、重症の喘息と関連付けられる。網状板の肥厚を低減するための薬物療法または治療法はない。しかし、気道壁中に見られる筋線維芽細胞数を減少させると、肥厚を軽減し、またはそれ以上の肥厚の予防を手助けし得ると思われる。
【００２２】
特発性肺線維症
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、病因の不明な独特なタイプの慢性線維性肺疾患である。発病させる機序の次第はわかっていないが、この疾患は、上皮の外傷および活性化、特有の上皮下の線維芽細胞病巣／筋線維芽細胞病巣の形成、および過剰の細胞外マトリックスの蓄積を特徴とする。これらの病理学的な過程は通常、肺の構造に進行性かつ不可逆性の変化をもたらし、その結果、比較的短い期間で、進行性の呼吸器不全、さらにはほとんど例外なく末期の結果を招く。研究では、主として線維性応答を開始するための炎症の機序に焦点が当てられてきたが、最近の証拠からは、肺胞上皮の崩壊が根底の病原事象であることが強く示唆される。創傷治癒において線維細胞が担う役割、および喘息の気道壁肥厚化におけるその既知の役割を考えると、線維細胞の過剰産生をＩＰＦと関連付けられそうに思われる。
【発明の開示】
【００２３】
本発明は、単球からの線維細胞への分化を抑制する組成物および方法を含む。選択された実施形態では、ＳＡＰ、ＩＬ−１２、ラミニン−１、ＩｇＧ凝集体、上記のもののいずれかの補因子、およびこれらの任意の組合せを供給することによって、目標とする位置での線維細胞への分化を抑制することができる（「ＳＡＰ」、「ＩＬ−１２」、および「ラミニン−１」の呼称は、本明細書では、所与の状況でそれがその用法から明らかに除外されない限り、これらタンパク質の機能性の断片も指す）。目標位置は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにあってもｉｎ ｖｉｖｏにあってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏでは、目標位置には、生物体全体またはその部分が含まれてもよいし、組成物は全身に投与してもよいし、臓器や組織などの特定の区域に限定してもよい。組成物には、直接に供給されるもの、または、例えば導入遺伝子を発現させて目標位置もしくは目標位置と同じ生物体中で生成されるものが含まれ得る。これらの組成物は、濃度を正常レベルよりも増大させ、またはその濃度を正常レベルにし、またはその正常な活性レベルを回復するのに十分な量で与えることができる。本来の産生を刺激し、または正常な分解を抑制することによって、これらの組成物のいくらかの濃度または活性を増大させることができる。
【００２４】
単球からの線維細胞への分化を低減すると、数多くの線維性疾患、または線維症によって引き起こされる他の障害の症状を緩和することができる。
【００２５】
本発明はまた、試料の、単球から線維細胞への分化を調節する能力を検出するためのアッセイを含む。一実施形態では、正常な単球を試料と共に供給する。試料は、正常なＳＡＰを含んでよい。試料は、線維症患者などの患者に由来するＳＡＰまたは生物学的な体液を含んでいてもよいし、あるいは潜在的な薬物を含んでいてもよい。別の実施形態では、試料は正常なＳＡＰを含み、単球は、患者由来であり、異常なものでよい。どちらのタイプのアッセイでも、単球の線維細胞への分化に及ぼされる影響を正常な対照と比較して、正常なものと比べた、単球の分化の増加または減少を検出することができる。
【００２６】
以下の図は、本明細書の部分であり、本発明のある側面をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図面の１種または複数を本明細書で提供する詳細な説明と合わせて参照することによってより深く理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
単球の分化の抑制
線維化をもたらす事象の調節には、線維細胞の増殖および分化が関与する。線維細胞は、通常は組織外傷部位に侵入して、血管新生および創傷治癒を促進する、末梢血単球由来の線維芽細胞様細胞の特質的な集団である。血清または血漿の不在下でＣＤ１４＋末梢血単球を培養すると、線維細胞へと急速に分化する。この過程は７２時間以内に起こり、血清または血漿の存在によって抑制される。線維細胞の急速な出現を抑制する血清中因子は、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）である。さらに、線維性疾患の強皮症患者の一団は、血清の線維細胞への分化を抑制する能力が弱く、相応じて低レベルのＳＡＰを示す。これらの結果は、循環または末梢組織中の低レベルのＳＡＰが、線維症などの病理学的過程をもたらし、またはその中で役割を担うことを示唆している。単球分化アッセイでは、ＩＬ−１２、ラミニン−１、および結合型ＩｇＧ分子が単球から線維細胞への分化を抑制することも明らかになった。
【００２８】
線維細胞形成の抑制因子の１種または複数を含有する組成物を使用して、特に、不適切な位置での線維症、および線維性障害および慢性の炎症状態における線維症を抑制することができる。組成物は、局所に適用しても、または全身に適用してもよい。特定の実施形態では、ＳＡＰを含有する組成物は、目標位置のＳＡＰ濃度を少なくとも約０．５μｇ／ｍｌに上昇させることが可能となり得る。ヒトでは、アミロイド症の調査患者に、予めＩ１２５標識ＳＡＰを投与している。治療では、成人に約６００μｇのＳＡＰを投与した。したがって、成人への約６００μｇのＳＡＰの投与は安全である。適切な条件下では、より多い投与量も安全となり得る。
【００２９】
本発明のある種の組成物の形で供給されるＳＡＰには、ＳＡＰタンパク質全体またはその部分、好ましくは線維細胞形成の抑制において機能する部分が含まれ得る。好例となる実施形態では、ＳＡＰの機能性部分は、線維細胞の生成に対して影響を及ぼさない、ＣＲＰと配列相同性の関係にない領域から選択する。例えば、ＳＡＰのアミノ酸６５〜８９（ＫＥＲＶＧＥＹＳＬＹＩＧＲＨＫＶＴＰＫＶＩＥＫＦＰ−配列番号１）は、ＣＲＰと相同でない。アミノ酸１７０〜１８１（ＩＬＳＡＹＡＹＱＧＴＰＬＰＡ−配列番号２）および１９２〜２０５（ＩＲＧＹＶＩＩＫＰＬＶ−配列番号３）も相同でない。さらに、２種のタンパク質間の単一アミノ酸によるいくつかの差異が知られており、機能の違いをもたらし得る。
【００３０】
ＩＬ−１２を含有する組成物は、目標とする位置のＩＬ−１２濃度を約０．１〜１０ｎｇ／ｍｌに上昇させることができる。ラミニン−１を含有する組成物は、目標位置のラミニン−１濃度を約１〜１０μｇ／ｍｌに上昇させることができる。凝集ＩｇＧを含有する組成物は、目標位置の凝集ＩｇＧ濃度を約１００μｇ／ｍｌに上昇させることができる。組成物は、組み合わせて、または補因子と共に供給してもよい。組成物は、目標位置に正常に存在すれば、正常レベルを回復するのに十分な量で投与してもよいし、あるいは目標位置のレベルを正常より高いレベルに上昇させる量で投与してもよい。
【００３１】
上記組成物は、外来供給源から目標位置に供給してもよいし、あるいは目標位置の細胞または目標位置と同じ生物体の細胞によってｉｎ ｖｉｖｏで生成されてもよい。これらの組成物は、生体液を含む提供された皮膚組織から単離することができる。これら組成物は、細菌、組織培養細胞、または当業界で知られている他の任意の種類の細胞もしくは組織、または完全体の動物中で組換えタンパク質として生成されてもよい。これら組成物は、合成によって、または当業界で知られている他の任意の方法によって生成してもよい。ｉｎ ｖｉｖｏで生成する場合、これらの組成物は、導入遺伝子の発現産物でもよいし、または既存のｉｎ ｖｉｖｏ供給源での産生を増強した結果として生じるものでもよい。これらの組成物のレベルは、目標位置で正常に存在する場合、正常な分解速度を下げることによって上昇させてもよい。さらに、例えば補因子を供給して、線維細胞への分化を抑制するこれらの組成物の能力を促進することも可能となり得る。
【００３２】
本発明の組成物は、生理的に適切などんな製剤にしてもよい。組成物は、注射、吸入、または他の任意の有効な手段によって生物体に局所的に投与することができる。
【００３３】
疾患ターゲット
単球から線維細胞への分化を抑制するための上述のものと同じ組成物および方法を使用して、強皮症、ケロイド性瘢痕化、リウマチ様関節炎、狼瘡、腎性線維性皮膚障害、日本住血吸虫感染後に形成されるような線維性病変、自己免疫疾患、病原性線維症、ライム病、膵炎および間質性線維症における間質の再構築、喘息、特発性肺線維症、慢性閉塞性灰疾患、および肺線維症が含まれるが、これに限らない状態の結果として生じる線維症を治療または予防することもできる。一部のこのような線維性疾患では、線維細胞が、線維症の末期の表れでないこともある。例えば、喘息では、線維細胞はさらに筋線維芽細胞に分化し、厚くなった気道壁に残り続ける。
【００３４】
本発明は、ＳＡＰによって正常に活性化された単球のＦｃシグナル伝達経路の任意の成分を活性化させて、線維細胞の生成を抑制し、または線維性疾患もしくは喘息を治療または予防する方法も含む。この経路は、Ｄａｅｒｏｎ、Ｍａｒｃによる「Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１５巻：２０３〜３４ページ（１９９７年）に詳述されている。好例となる実施形態では、副作用が最小限になるように活性化するように、他のシグナル伝達カスケードに共有されず、または単に数の限られた決定的でないシグナル伝達カスケードに過ぎない経路の一部を選択する。
【００３５】
単球分化アッセイ
本発明の別の態様は、単球からの線維細胞への分化を調節する試料の能力を検出するアッセイに関する。無血清培地では、正常な単球は、２〜３日で線維細胞になる。正常な血清、血液、または他の生物学的な体液は、特定の希釈度範囲内で正常な単球からの線維細胞の生成を抑制する。すなわち、このアッセイを使用して、試料が、無血清培地中で単球の線維細胞への分化を調節し得るかどうかを試験することができる。このアッセイを使用すると、試料の単球が無血清培地中で正常に線維細胞に分化するかどうか、さらに血清、ＳＡＰ、またはこの分化に影響を及ぼす他の因子に対して正常に応答したかどうかを判定することもできる。
【００３６】
特定の実施形態では、このアッセイを使用して、患者の生物学的な体液の、単球から線維細胞への分化を抑制する能力が低下しているか促進しているかを判定することができる。ＳＡＰによる抑制を試験する場合、本発明では、全血、血清、血漿、滑液、大脳脊髄液、および気管支体液を含めて、ＳＡＰが常時または一過性に存在するどんな生体液を使用してもよい。単球の分化を抑制する能力の減少は、線維症の指標とすることもでき、またはそのような障害になる性向であるともいえる。多くの患者では、生体液の線維細胞形成抑制能の減少は、ＳＡＰレベルが高いためであるかもしれないが、必ずしもこのとおりでない。ＳＡＰは、正常レベルで存在しても、ＳＡＰ自体の欠陥、または補因子もしくは他の分子の有無のために抑制活性の増強を示すこともある。ＥＬＩＳＡ、電気泳動法、分別など、抑制の問題のより正確な性質を決定する方法は、当分野の技術者に明らかとなろう。
【００３７】
上述の方法を使用して、線維細胞の分化に影響を及ぼすある種の潜在的な薬物が、患者にとって適切となり得るか否かを判定することもできる。
【００３８】
別の特定の実施形態では、このアッセイを使用して、患者の単球が、無血清培地で線維細胞に分化することができるか、ならびに生体液、ＳＡＰ、または別の組成物に正常に応答するかを判定することができる。より詳細には、線維症に罹患した患者が正常レベルのＳＡＰをもっていると思われる場合、血清またはＳＡＰありでも線維細胞に容易に分化することができるかを判定するために、患者の単球の試料を得ることが得策となり得る。
【００３９】
最後に、別の特定の実施形態では、このアッセイを使用して、単球の線維細胞への分化に対する薬物または他の組成物の作用を試験することができる。アッセイをこのように使用して、線維細胞の生成を調節するように設計された潜在的な薬物を同定してもよいし、あるいはアッセイを使用して、他の用途に向けた薬物の潜在的な有害事象をスクリーニングしてもよい。
【００４０】
本発明の特定の実施形態を明示するために、以下の実施例を含める。当業者ならば、以下の実施例中で開示する技術は、本発明を実施した際に発明者らが十分に機能することを発見した技術を代表するものであることを承知すべきである。しかし、当業者は、この開示を考えて、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、開示する特定の実施形態に多くの変更を加えても、同様または類似の結果が得られることを承知すべきである。
【実施例】
【００４１】
実施例１
線維細胞形成の抑制
末梢血Ｔ細胞の生存における細胞密度の考えられる役割を調べている際に、無血清培地で、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が線維芽細胞様細胞集団を生じさせたことが観察された。これらの細胞は、粘着性であり、紡錘体型の形態（図１Ａ）であった。無血清培地では約０．５〜１％のＰＢＭＣが線維芽細胞様細胞に分化し、この分化は、組織培養によって処理したプラスチック容器、ホウケイ酸塩スライドガラス、および標準のスライドガラスで起こった。
【００４２】
培養して３日以内のこれらの細胞の急速な出現は、ヒトの血清もしくは血漿によって抑制された。この過程をより詳細に調べるため、徐々に増していく各濃度のヒト血漿を含有する無血清培地中で、１ｍｌあたり５×１０５細胞のＰＢＭＣを６日間培養した。血漿が１０％〜０．５％の濃度で存在するとき、線維芽細胞様細胞には分化しなかった（図１Ｂ）。しかし、０．１％以下の血清では、線維芽細胞様細胞が急速に発育した。線維細胞の生成を抑制した血清の活性は、３０ｋＤａカットオフのスピンフィルターに捕らえられた（データ非表示）。血清を３０分間かけて５６℃に加熱した場合、効力は１０分の１になり、９５℃の加熱は、抑制活性を消滅させた（データ非表示）。
【００４３】
これらのデータは、抑制因子がタンパク質であることを示唆する。阻害因子はヒト血清中に存在していたので、凝固系とは関係がなさそうであることが示唆された。ウシ、ウマ、ヤギ、およびラットの血清も、これらの線維芽細胞様細胞の出現を抑制することができたので、阻害因子は、進化の過程で保存されたタンパク質であるようにも思われた（データ非表示）。
実施例２
【００４４】
線維芽細胞様細胞の特性決定
これら線維芽細胞様細胞が末梢血から分化したことは、これらが末梢血線維細胞であるかもしれないことを示唆した。線維細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで線維芽細胞様細胞に分化する末梢血単球由来の集団である。線維細胞は、創傷部位にすばやく侵入し、Ｔ細胞に抗原を提示することができる。この細胞の表現型は、ＣＤ４５やＭＨＣクラスＩＩなどの造血性マーカーと、コラーゲンＩやフィブロネクチンなどの間質性マーカーとからなる。しかし、これらの細胞を同定するために、ＰＢＭＣは、一般に、血清を含有する培地で１〜２週間培養した。
【００４５】
この系で認められた細胞が線維細胞であるかどうかを特性決定するために、ＰＢＭＣのＴ細胞を抗ＣＤ３で、Ｂ細胞を抗ＣＤ１９で、単球を抗ＣＤ１４で枯渇させ、あるいはすべての抗原提示細胞を抗ＨＬＡクラスＩＩで枯渇させ、次いで血清なしの条件で６日間培養した。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３または抗ＣＤ１９で枯渇処理しても、血清なしの培養物中で培養したとき、ＰＢＭＣから線維芽細胞様細胞は枯渇されなかった（データ非表示）。抗原提示細胞を抗ＨＬＡクラスＩＩで、または単球を抗ＣＤ１４抗体で枯渇させると、線維芽細胞様細胞の出現が妨げられたので、線維芽細胞様細胞が単球由来であり、樹状細胞集団でないことが示唆された。
【００４６】
線維芽細胞様細胞をさらに特性決定するために、ＰＢＭＣをスライドガラス上の無血清培地で５日間培養した。次いで、細胞を風乾し、アセトン固定し、種々の抗体で標識した（表１および図２）。線維細胞は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ、コラーゲンＩ、フィブロネクチン、ケモカイン受容体のＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、およびα−平滑筋アクチンを発現させる。上記培養条件下では、この実験の線維芽細胞様細胞も、これらすべてのマーカーを発現させた。線維細胞は、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ３８、およびｖＷＦについては陰性であり、この実験の線維芽細胞様細胞もそのとおりであった。これらのデータによれば、この実験で認められた線維芽細胞様細胞は、線維細胞であると思われる。さらに実験を行って、この表現型を広げた。上記条件下では、この線維細胞は、α１（ＣＤ４９ａ）、α２（ＣＤ４９ｂ）、α５（ＣＤ４９ｅ）、β１（ＣＤ２９）、およびβ３（ＣＤ６１）に加えて高レベルのβ２（ＣＤ１８）を含む数種のβ１インテグリンを発現させたが、α３、α４、α６、α４β７、αＥ、およびＣＬＡについては陰性であった（図２および表１）。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１のデータを得るために、８穴スライドガラスのウェルに入った無血清培地中で、１ｍｌあたり（１ウェル４００μｌ）２．５×１０５細胞のＰＢＭＣを６日間培養した。次いで、細胞を風乾し、アセトン固定し、免疫ペルオキシダーゼ染色した。細胞は、アイソタイプを一致させた対照抗体と比較して、示される抗原を陽性または陰性で記録した。
実施例３
【００４９】
線維細胞抑制因子の特性決定
急速な線維細胞への分化を妨げる血清因子の最初の特性決定では、その因子が、イオン交換カラム（Ｈｉｇｈ Ｑ）から４種のタンパク質のうちの１種として溶出されたヘパリン結合性分子であったことが示された。未変性ゲルから切断したバンドのトリプシン処理タンパク質断片の配列決定を行って、３種のタンパク質のうちの１種をＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）として同定した。Ｃ４ｂ結合タンパク質は、７本のα鎖（７０ｋＤａ）と、通常は１本のβ鎖（４０ｋＤａ）とからなる５７０ｋＤａのタンパク質であり、補体系のＣ４ｂ成分およびＣ２ａ成分の衰退の調節に関与する。Ｃ４ＢＰは、ビタミンＫ依存的な抗凝固タンパク質Ｓとも相互に作用する。Ｃ４ＢＰ／タンパク質Ｓ複合体は、ＢａＣｌ２沈殿法を使用して、血清または血漿から精製することができる。
【００５０】
Ｃ４ＢＰまたは関連するタンパク質が線維細胞への分化の抑制を司る因子であったかどうかを評価するため、クエン酸血漿をＢａＣｌ２処理した。抑制因子は、ＢａＣ１２沈殿中に存在した（図３および表２）。この画分をヘパリンカラムにかけ、画分を徐々に増していく各濃度のＮａＣｌで溶離し、無血清培地中で単球の線維細胞への分化を抑制するその能力を評価した。活性因子は、ヘパリンカラムから、２００ｍＭのＮａＣｌ濃度をピークに溶出された（図３および表２）。収量の若干の増加は、このステップが、この因子の活性を若干妨害する因子を除去したかもしれないことを示唆した。
【００５１】
２００ｍＭピークの画分をプールし、Ｈｉｇｈ Ｑイオン交換クロマトグラフィーによってさらに分別した。３００ｍＭのＮａＣｌで溶出される小さなピークが含んでいた活性は、線維細胞の分化を抑制した。この画分に存在するタンパク質を分析すると、主バンドが２７ｋＤａのタンパク質であったことが示された。イオン交換クロマトグラフィーにかけると、回収されるＳＡＰの量は減少したものの（図３Ａ、レーン８〜１０、および図３Ｄ、レーン８〜１０）、このステップにより、数種の混入タンパク質が確かに除去された。イオン交換ステップの後、唯一識別できる混入物は６５ｋＤａのアルブミンであった（図３Ａ、レーン１０）。
【００５２】
ＨｉｇｈＱ画分を濃縮し、非還元性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分別した後、ゲル切片中の物質を溶離した。約１４０ｋＤａのところに移動した単一のバンドが、分化を抑制することができた（図３Ｂ）。このバンドの分子量は、還元性ポリアクリルアミドゲルでは２７ｋＤａであったので、このタンパク質の未変性の構造が五量体であったことが示唆された（図３Ｃ）。このバンドをゲルから切除し、トリプシンで消化し、ＭＡＬＤＩ質量分光測定によって分析した。そこで、大きい方の３種のペプチドと、小さい方の２種のペプチド、すなわち、ＶＦＶＦＰＲ、ＶＧＥＹＳＬＹＩＧＲ、ＡＹＳＬＦＳＹＮＴＱＧＲ、ＱＧＹＦＶＥＡＱＰＫ、およびＩＶＬＧＱＥＱＤＳＹＧＧＫが同定された。これらの配列は、血清アミロイドＰのアミノ酸配列８〜１３、６８〜７７、４６〜５７、１２１〜１３０、および１３１〜１４３とぴったり一致した。
【００５３】
活性画分がＳＡＰを含んでいたことを確認するため、カラムクロマトグラフィーによって収集した画分をウェスタンブロッティングによって分析した（図３Ｄ）。線維細胞への分化を抑制したすべての画分で、ＳＡＰの存在が２７ｋＤａのところで検出された（図３Ｄ、レーン６、８、１０、および１１）。ＢａＣｌ２沈殿ステップの上清中にかなりの量のＳＡＰが存在したので、この手順の効率が悪いことが示唆され、ＢａＣｌ２ペレット中には、線維細胞抑制活性の約１０〜１５％しか回収されなかった（図３Ａ、レーン２）。ウェスタンブロッティングと共に使用するときに抗ＳＡＰ抗体が免疫グロブリンに結合するという既知の問題を解消するために、この抗体を、アガロースに結合させたヒトＩｇＧと共に予めインキュベートした。画分のＣＲＰ、Ｃ４ＢＰ、およびタンパク質Ｓの存在についても分析した。ウェスタンブロッティングでは、Ｃ４ＢＰおよびタンパク質Ｓが、血漿中、およびバリウム沈殿物中には存在するが、ヘパリンクロマトグラフィーによって収集した活性画分には存在しないことが示された（データ非表示）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
血漿は、ＢａＣｌ２沈殿法、ヘパリンクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーによって分別した。タンパク質濃度は、分光光度法によって２８０ｎｍで評価した。線維細胞の分化の抑制は、形態によって評価した。試料の線維細胞抑制活性は、無血清培地に加えたときに試料が線維細胞への分化を５０％抑制した希釈度の逆数であると定義した。
【００５６】
ＳＡＰは、以下の方法を使用するＥＬＩＳＡによって検出することもできる。
Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６穴プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニューヨーク州ロチェスター）を、４０℃のもと、モノクローナル抗ＳＡＰ抗体（ＳＡＰ−５、Ｓｉｇｍａ）の入った５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５で被覆した。次いで、プレートを、４％のＢＳＡを含有するトリス緩衝食塩水ｐＨ７．４（ＴＢＳ）（ＴＢＳ−４％ＢＳＡ）中でインキュベートして、非特異的結合を抑制した。血清および精製タンパク質をＴＢＳ−４％ＢＳＡで１０００倍に希釈して、ＳＡＰが凝固しないようにし、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで洗浄した。ＴＢＳ−４％ＢＳＡで５０００倍に希釈したポリクローナルウサギ抗ＳＡＰ抗体（ＢｉｏＧｅｎｅｓｉｓ）を検出用抗体として使用した。洗浄した後、ＴＢＳ−４％ＢＳＡで希釈した１００ｐｇ／ｍｌのビオチン標識ヤギ（Ｆａｂ）２抗ウサギ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を６０分間かけて加えた。ビオチン標識した抗体をＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）によって検出した。希釈していないペルオキシダーゼ基質３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を室温で５分間インキュベートした後、１Ｎ ＨＣｌによって反応を停止させ、４５０ｎｍで読み取った（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米バーモント州ウィヌースカ）。アッセイは、２００ｐｇ／ｍｌまで感度があった。
実施例４
【００５７】
血清アミロイドＰの特異性
血清アミロイドＰは、構成血漿タンパク質であり、ヒトの主要な急性相タンパク質であるＣＲＰと近い関係にある。他の血漿タンパク質も線維細胞への分化を抑制することができるかどうかを評価するため、精製した市販のＳＡＰ、ＣＲＰ、Ｃ４ｂ、またはタンパク質Ｓの存在下、ＰＢＭＣを無血清培地で培養した。市販のＳＡＰは、非置換アガロースのカルシウム依存的なアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。試験したタンパク質のうち、ＳＡＰだけが線維細胞への分化を抑制することができ、阻害活性は、１０μｇ／ｍｌで最高に達した（図４）。希釈曲線は、市販のＳＡＰの活性が約６．６×１０３単位／ｍｇであることを示唆した（図４）。血清および血漿は、３０〜５０μｇ／ｍｌのＳＡＰを含有する。線維細胞は、約０．１５〜０．２５μｇ／ｍｌのＳＡＰになるはずの０．５％の血漿希釈度で出現し始めたが、これは、精製ＳＡＰの閾値濃度に匹敵する。異なる２通りの手順を使用して精製したＳＡＰが、線維細胞への分化を抑制することを示すデータは、ＳＡＰが線維細胞への分化を抑制することを強く示唆している。
【００５８】
これらのデータは、ＳＡＰが線維細胞の発育を抑制し得ることを示唆しており、このことを示す方法でＳＡＰが精製されているが、血漿および血清からＳＡＰを枯渇させると抑制が無効になるかどうかを判定したものではない。アガロースビーズ（ＢｉｏＧｅｌ Ａ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、血漿からＳＡＰを枯渇させた。血漿を１００ｍＭのトリスｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２緩衝液で２０％に希釈し、４０℃で２時間、１ｍｌのアガロースビーズと混合した。次いで、遠心分離によってビーズを除去し、この過程を繰り返した。次いで、この枯渇処理した血漿の、線維細胞への分化を抑制する能力を評価した。１００ｍＭのトリスｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２緩衝液で２０％に希釈した対照血漿の希釈曲線は、未処理の血漿で認められるものと類似していた。対照的に、ビーズで処理した血漿は、中程度の血漿レベルでは線維細胞への分化をそれほど抑制することができなかった。これらのデータ、ならびに精製ＳＡＰが線維細胞への分化を抑制できることは、ＳＡＰが、線維細胞への分化を抑制する血清および血漿中の活性因子であることを強く示唆している（図５を参照のこと）。
【００５９】
血漿のＳＡＰの、抗ＳＡＰ抗体で被覆したタンパク質Ｇビーズを使用する枯渇処理も行った。ＳＡＰを除去すると、血漿の、線維細胞への分化を抑制する能力が、血漿、または対照抗体で被覆したビーズで処理した血漿と比べて有意に低下した（ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。対照抗体で被覆したビーズは、血漿からいくらかの線維細胞抑制活性を除去したが、これは、血漿と共に培養した細胞と有意に異なってはいなかった。このことはおそらく、ＳＡＰがタンパク質Ｇビーズ中のアガロースに結合していることを反映している。これらのデータ、ならびに精製ＳＡＰが線維細胞への分化を抑制できることは、ＳＡＰが、線維細胞への分化を抑制する血清および血漿中の活性因子であることを強く示唆している。
実施例５
【００６０】
抗体およびタンパク質
精製されたヒトＣＲＰ、血清アミロイドＰ、タンパク質Ｓ、およびＣ４ｂは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４０、Ｐａｎ ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ、マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ１、およびマウスＩｇＧ２ａに対するモノクローナル抗体は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。ケモカイン受容体抗体は、Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（米ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。ウサギ抗コラーゲンＩはＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（米カリフォルニア州テメキュラ）から、モノクローナルＣ４ｂ結合タンパク質はＧｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（米バーモント州バーリントン）から、ヒツジ抗ヒトＣ４ｂ結合タンパク質はＴｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ（英バーミンガム）から、モノクローナル抗ＣＲＰはＳｉｇｍａ（米ミズーリ州セントルイス）から得た。ポリクローナルウサギ抗タンパク質Ｓは、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（英国ドーセット州プール市）から得た。
実施例６
【００６１】
細胞の分離
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米ニュージャージー州ピスカタウェイ）による４００×ｇでの遠心分離に４０分間かけて、バフィーコート（Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ、米テキサス州ヒューストン）から末梢血単各細胞を単離した。ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、米ニューヨーク州レークサクセス）を使用するネガティブ選択を利用して、以前に記載したとおりに、指定された白血球サブセットの枯渇処理を行った。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを一次抗体と共に４０℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧで被覆したＤｙｎａｂｅａｄｓと共に３０分間インキュベートした後、磁気選択によって抗体で覆われた細胞を除去した。この過程を２回繰り返した。ネガティブ選択した細胞の純度は、モノクローナル抗体標識によって判定したところ、決まって９８％を超えていた。
実施例７
【００６２】
細胞培養および線維細胞分化アッセイ
細胞を、次のような無血清培地、すなわち、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌの鉄で飽和させたトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、および５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米カリフォルニア州カールスバッド）中でインキュベートした。正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、正常ヒト血漿（Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）、またはウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、カラム画分、患者の血清および滑液、または精製タンパク質を所定の濃度で加えた。患者試料は、ヒューストンのテキサス大学医学部にある、研究者に開放されている貯蔵所から入手した。この貯蔵所は、患者の情報を守秘し、ＮＩＨ指針をすべて満たしている。
【００６３】
５％のＣＯ２を含む加湿インキュベーター中で、体積がそれぞれ２ｍｌまたは２００μｌの２４穴または９６穴の組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米ニュージャージー州フランクリンレークス）に入った１ｍｌあたり２．５×１０５細胞のＰＢＭＣを、３７℃で指示どおりの時間培養した。小さなリンパ球または付着単球と異なる、引き伸ばされた紡錘型の形態を有する付着細胞として生存培養物中に存在する形態によって、異なる５箇所の直径９００μｍ視野にある線維細胞を数えた。あるいは、細胞を風乾し、メタノール固定し、ヘマトキシリンエオシン染色を施した（Ｈｅｍａ３ Ｓｔａｉｎ、ＶＷＲ、米テキサス州ヒューストン）。上記の判断基準、および楕円形の核の存在を利用して線維細胞を数えた。線維細胞のカウントは、ウェルあたり２．５×１０４細胞の細胞を平底９６穴プレートで６日間培養したものについて行った。さらに、免疫ペルオキシダーゼ染色によって線維細胞の同一性を確認した（以下を参照のこと）。試料の線維細胞抑制活性は、無血清培地に加えたときに試料が線維細胞への分化を５０％抑制した希釈度の逆数であると定義した。
実施例８
【００６４】
血清タンパク質および血漿タンパク質の精製と特性決定
冷凍ヒト血清もしくは血漿１００ｍｌを３７℃ですばやく解凍し、１倍「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、米インディアナ州インディアナポリス）、１ｍＭのベンズアミジンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、および１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（ＡＥＢＳＦ：フッ化４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル塩酸塩、Ｒｏｃｈｅ）を加えた。後続のステップはすべて、氷上または４℃で実施した。血漿を、以前に述べたとおりに、クエン酸バリウムに吸着させた。１０，０００×ｇで１５分間の遠心分離にかけて、沈殿を収集し、１００ｍＭのＢａＣｌ２プラス阻害剤２０ｍｌに再懸濁し、遠心分離にかけ直した。２回洗浄した後、ペレットを、５ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのベンズアミジンＨＣｌを含有する１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に再懸濁して２０ｍｌとし、同じ緩衝液４リットルを３回交換しながら２４時間かけて透析した。
【００６５】
Ｅｃｏｎｏ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米カリフォルニア州ハーキュレス）を使用するクロマトグラフィーを行って、流速１ｍｌ／分で１ｍｌの試料を収集した。透析処理したクエン酸バリウム沈殿を５ｍｌ容Ｈｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装入し、２８０ｎｍでの吸光度が基点に戻るまで、カラムを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４で十分に洗浄した。結合している材料を、１００、２００、３００、および５００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４各１５ｍｌで段階的に勾配をかけて溶離した。単球の線維細胞への分化を阻害した画分は、２００ｍＭのＮａＣｌで溶出された。これらをプールし（２ｍｌ）、５ｍｌ容Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｋ Ｈｉｇｈ Ｑカラムに装入した。１０ｍＭのリン酸緩衝液でカラムを洗浄した後、結合している材料を上記のように段階的な勾配をかけて溶離したが、活性画分は、３００ｍＭのＮａＣｌで溶出された。
【００６６】
Ａｑｕａｃｉｄｅ ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して、Ｈｉｇｈ Ｑクロマトグラフィーの活性画分を２００μｌに濃縮し、次いで以前に述べたとおりに４〜２０％の未還元性ポリアクリルアミドゲル（ＢＭＡ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、米メイン州ロックランド）上に載せた。電気泳動にかけた後、ゲルのレーンを切断して５ｍｍの切片とし、１ｍＭのベンズアミジンＨＣｌを含有する２００μｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４と混合し、エッペンドルフ試験管に入れて小さな乳棒で砕き、４℃で３日間転倒型ミキサーに入れておいた。ゲルから溶出されたタンパク質の活性を分析した。アミノ酸配列を得るため、ゲル切片から溶出されたタンパク質を、１００μＭのチオグリコール酸を含む上部チャンバー（Ｓｉｇｍａ）中の４〜２０％のゲル上に載せた。電気泳動にかけた後、ゲルを直ちにクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱染色し、ゲルからバンドを切除した。アミノ酸の配列決定は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、免疫学科、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦａｃｉｌｉｔｙのＲｉｃｈａｒｄ Ｃｏｏｋ博士が行った。
実施例９
【００６７】
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングについては、血漿および血清試料を１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４で５００倍に希釈した。ヘパリンカラムおよびＨｉｇｈ Ｑカラムからの画分は希釈しなかった。試料を、２０ｍＭのＤＴＴを含有するＬａｅｍｍｅｌｉ試料緩衝液と混合し、５分間かけて１００℃に加熱した。試料を４〜２０％のトリス／グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ）上に載せた。未変性ゲル用の試料は、ＤＴＴまたはＳＤＳなしで分析した。タンパク質を、２０％のメタノールを含有するトリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液中のＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米マサチューセッツ州ベッドフォード）膜に移した。フィルターを、４℃で１８時間かけて、５％のＢＳＡ、５％の無脂肪乳タンパク質、および０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＥＳ）ｐＨ７．４でブロックした。所定の最適希尺度（データ非表示）を使用して、一次抗体およびビオチン標識二次抗体を、５％のＢＳＡ、５％の無脂肪乳タンパク質、および０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ ｐＨ７．４で６０分間かけて希釈した。５％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ ｐＨ７．４で希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を使用してビオチン標識抗体を同定し、化学発光法（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結果を可視化した。
実施例１０
【００６８】
免疫組織化学
ガラス製８穴顕微鏡スライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米イリノイ州ネーパーヴィル）上で培養した細胞を風乾した後、１５分間アセトン固定した。内発性のペルオキシダーゼを０．０３％のＨ２Ｏ２で１５分間かけて失活させ、次いで、２％のＰＢＳ中ＢＳＡの中で６０分間インキュベートして非特異的結合をブロックした。スライドを、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中の一次抗体を加えて６０分間インキュベートした。アイソタイプを一致させた、関連性のない抗体を対照として使用した。次いで、スライドを１５分間かけてＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に６０分間インキュベートした。洗浄した後、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）によってビオチン標識抗体を検出した。染色の発色は、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン、Ｓｉｇｍａ）で３分間かけて行い、マイヤーのヘマラム（Ｓｉｇｍａ）で３０秒間の対比染色を行った。
実施例１１
【００６９】
線維細胞上の表面マーカーの発現
８穴スライドガラスのウェルに入った無血清培地中で、１ｍｌあたり（１ウェル４００μｌ）２．５×１０５細胞のＰＢＭＣを６日間培養した。次いで、細胞を風乾し、アセトン固定し、免疫ペルオキシダーゼ染色を施した。細胞は、アイソタイプを一致させた対照抗体と比較して、示される抗原を陽性または陰性で記録した。
実施例１２
【００７０】
分別にかけたヒト血漿からのタンパク質および線維細胞抑制活性の回収
血漿は、ＢａＣｌ２沈殿法、ヘパリンクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーによって分別した。タンパク質濃度は、吸光分光分析によって２８０ｎｍで評価した。線維細胞への分化の抑制は、形態によって評価した。試料の線維細胞抑制活性は、無血清培地に加えたときに試料が線維細胞への分化を５０％抑制した希釈度の逆数であると定義した。
実施例１３
【００７１】
ＩＬ−１２
実験では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで線維細胞への分化を促進し得ることがわかった。詳細には、末梢血単核細胞を、様々なサイトカインの存在下、無血清培地で培養した（図６Ａを参照のこと）。約５ｎｇ／ｍｌを上回るＩＬ−１２濃度が、培養中の線維細胞数を抑えた（図６Ｂを参照のこと）。このことは、ＩＬ−１２が、線維細胞前駆体から成熟線維細胞への分化を抑制し得ることを示唆している。
実施例１４
【００７２】
ラミニン１
内皮および基底膜を横断する過程は、単球に対する活性化シグナルおよび分化シグナルを誘発する。したがって、細胞外マトリックスタンパク質が線維細胞への分化に影響を及ぼしたかどうかを判定するために実験を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液ｐＨ９．５に入れた細胞外マトリックスタンパク質を、４℃で１８時間かけて９６穴組織培養プレートに結合させた。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−ＦおよびＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−ＬをＰＢＳに希釈させた。プレートをＰＢＳ中で洗浄し、２％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中、３７℃で６０分間インキュベートして、非特異的な結合を防いだ。プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで組織培養培地で洗浄した。次いで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、４日間培養した。線維細胞の分化は、コラーゲン、フィブロネクチン、およびビトロネクチンを含む広範な種類のＥＣＭタンパク質上で培養しても影響を受けなかった。しかし、ＰＢＭＣをラミニン１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米ミズーリ州セントルイス）またはＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｆ（三洋化成工業株式会社、京都府）と共に培養すると、線維細胞数が有意に減少した（図７Ａを参照のこと）（ｐ＜０．０００１）。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｆは、絹タンパク質構造物であり、フィブロネクチンの正準ＲＧＤ接着配列の繰返しである。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｌは、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｆと類似した構造であり、ラミニンのα１鎖由来のアミノ酸配列ＩＫＶＡＶを有する。
【００７３】
他のラミニンタンパク質が線維細胞への分化を抑制し得るかどうかを判定するため、追加の実験を実施した。第２の市販ラミニンであるラミニン１０／１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米カリフォルニア州テメキュラ）は、ラミニン１ほど線維細胞への分化を抑制することができなかった（図７Ｂを参照のこと）。
【００７４】
このデータは、ＩＫＶＡＶ領域の外側にあり、ラミニン１０および１１には不在である、ラミニン１に特異的な配列が、線維細胞への分化に対する抑制作用を司っている可能性を示唆している。
実施例１５
【００７５】
抗体試験
ＳＡＰおよびＣＲＰは、食作用を増強し、様々な細胞上のＦｃγ受容体に結合する。ＣＲＰは、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）に高い親和性で結合し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に低い親和性で結合するが、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は結合しなかった。ＳＡＰは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩに優先的に、これらすべての古典的Ｆｃγ受容体に結合する。単球は、ＦｃγＲＩを構成性に発現させる。この受容体は、単量体ＩｇＧを結合するので、ｉｎ ｖｉｖｏで飽和状態になる。単量体ヒトＩｇＧの存在が、ＳＡＰによる線維細胞への分化の抑制を妨げるかどうかを判定するために、ある濃度範囲の単量体ＩｇＧの存在下、ＰＢＭＣを無血清培地で６０分間培養した。次いで、図８Ａに示した濃度のＳＡＰを加え、細胞を４日間培養した。上の実施例で述べたように、ＩｇＧなしの２．５μｇ／ｍｌのＳＡＰが、線維細胞への分化を強力に抑制した（図８Ａを参照のこと）。それぞれ約０．００１〜１０％の血清に相当する、０．１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲の単量体ＩｇＧは、線維細胞形成のＳＡＰによる抑制にほとんど影響を及ぼさなかった。
【００７６】
Ｆｃ受容体の連結および架橋が単球からの線維細胞への分化にも影響を及ぼすかどうかを判定するため、３種の試験用試料、すなわち、可溶性免疫複合体（オボアルブミン−抗体）、オプソニン処理されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を含む粒状免疫複合体、および熱凝集ＩｇＧを使用した。ＰＢＭＣを、オボアルブミンまたは抗オボアルブミンｍＡｂと共に４日間培養すると、この２種のタンパク質が、単独では、試薬を加えなかった培養物と比べても単球からの分化にそれほど影響を及ぼさなかったことが示された（図９Ａを参照のこと）。しかし、オボアルブミン：抗オボアルブミン免疫複合体を加えると、分化による線維細胞数が有意に減少した（図９Ａを参照のこと）。ＰＢＭＣをオプソニン処理したＳＲＢＣと共に培養したとき、同様の作用が認められた。ウサギ抗ＳＲＢＣでオプソニン処理したＳＲＢＣは、２０：１および４０：１のＳＲＢＣ：単球比で、ＳＲＢＣのみと共に培養した細胞と比べて有意に線維細胞への分化を抑制した（図９Ｂを参照のこと）。最後に、熱凝集Ｆ（ａｂ）２でなく、熱凝集ＩｇＧと共に培養したＰＢＭＣも、線維細胞への分化の強力な抑制を示した（図９Ｃを参照のこと）。全体として、これらのデータは、Ｆｃ受容体の連結および架橋が、単球の線維細胞への分化を抑制するものであることを示唆している。
【００７７】
免疫複合体が線維細胞への分化を抑制するという所見は、１種または複数のＦｃγＲが線維細胞への分化に影響を及ぼすことを示唆している。線維細胞への分化におけるＦｃγＲの役割を調べるため、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に対する阻止抗体の存在下または不在下でＰＢＭＣを培養した後、ＳＡＰを加え、または対照としてＣＲＰを加えた。試料を３種のＦｃγＲそれぞれに対する阻止ｍＡｂと共にプレインキュベートしたとき、ＳＡＰは、後から線維細胞への分化をそれほど抑制することができなかった。しかし、外部から加えたＳＡＰなしでも、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）阻止ｍＡｂの、線維細胞への分化に対する作用は甚大であった。ＰＢＭＣをＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩでなく、ＦｃγＲＩに対する阻止ｍＡｂと共にインキュベートすると、アイソタイプを一致させた対照ｍＡｂと共に培養した細胞、またはｍＡｂなしで培養した細胞と比べて線維細胞への分化が促進された（Ｐ＜０．０１）（図１０を参照のこと）。これらのデータは、ＳＡＰまたはＩｇＧが、培養系中の一部の細胞によって４日間かけて産生されたかもしれないこと、あるいはＳＡＰまたはＩｇＧが血液由来の細胞によって保持されたことを示唆している。ウェスタンブロッティングでは、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養した後にＳＡＰまたはＩｇＧの存在は示されなかった。このことは、ＦｃγＲＩ阻止ｍＡｂが線維細胞への分化に直接的に作用を及ぼすこと、あるいはＳＡＰまたはＩｇＧが細胞培養の早期の期間中にしか存在していなかったことを示唆している。
【００７８】
本発明の単に例示的な実施形態を上で詳述しているが、本発明の真意および意図する範囲から逸脱することなく、これら実施例の変更形態および変形形態が考えられることは承知されよう。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】線維芽細胞様細胞への急速な分化に対する血清および血漿の影響を示す図である。 図１Ａでは、無血清培地で、１ｍｌあたり２．５×１０５の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．１％のヒト血清の存在下または不在下で３または６日間培養し、次いで、線維芽細胞様細胞が出現したかどうか顕微鏡で調べた。帯は１００μｍである。 図１Ｂでは、無血清培地で、１ｍｌあたり２．５×１０５のＰＢＭＣを、ヒト血漿の希釈物中で６日間培養した。次いで、細胞を風乾し、固定し、染色し、形態によって線維細胞を数えた。結果は、２．５×１０５ＰＢＭＣあたりの線維細胞数の平均±ＳＤとして示す（ｎ＝５実験）。星印は、０血漿からの統計学的有意差を示す。
【図２】線維芽細胞様細胞上の表面分子の発現を示すグラフである。ＰＢＭＣを、スライドガラス上の無血清培地で６日間培養した。細胞を風乾し、免疫組織化学によって分析した。使用したモノクローナル抗体は、表示したとおりであり、ビオチン結合ヤギ抗マウスＩｇ、次いでＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼによって同定した。細胞にマイヤーヘマトキシリンで対比染色を施して、核を確認した。陽性の染色は、褐色の染色によって確認したが、核は、青色に対比染色される。ＣＤ８３への書き込みは、樹状細胞への陽性染色を示すために用いた。
【図３】血漿中に存在する、線維細胞への分化を抑制する分子の特性決定を示す図である。クエン酸血漿をＢａＣｌ２で処理し、沈殿した物質を遠心分離によって収集し、１０ｍＭのＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する１０ｍＭのリン酸ナトリウムを用いて透析した。次いで、この物質をヘパリンクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって分別した。 図３Ａでは、画分を４〜２０％の変性ゲル上でのＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブルーで染色した。Ｍは、分子量マーカーを示す。レーン１は血漿を含み、レーン２はＢａＣｌ２上清を含み、レーン３は洗液１を含み、レーン４は洗液２を含み、レーン５はＢａＣｌ２沈殿を含み、レーン６はＢａＣｌ２沈殿を含み、レーン７はヘパリン通過物を含み、レーン８はヘパリン画分を含み、レーン９はＨｉｇｈ Ｑ通過物を含み、レーン１０はＨｉｇｈ Ｑ画分を含み、レーン１１はゲル精製された画分を含んでいた。レーン１〜５は、リン酸ナトリウム緩衝液で５００倍に希釈し、レーン６〜１１は希釈しなかった。 Ｈｉｇｈ Ｑイオン交換カラムから溶出された活性画分およびゲル切片を、図３Ｂでは未変性ゲル上、図３Ｃでは変性ゲル上での４〜２０％ＰＡＧＥによって分析した。ＮＭは未変性ゲルマーカーを示し、ＲＭは変性ゲルマーカーを示し、図３Ｃではレーン１〜３が対照ゲル試料であり、レーン４が活性画分を含んでいた。図３Ｄでは、ウサギ抗ＳＡＰ抗体を使用して、画分をウェスタンブロッティングによって評価した。レーン１〜１１は、図３Ａと対応している。
【図４】線維細胞の生成がＳＡＰによって抑制され、ＣＲＰまたは他の血漿タンパク質によっては抑制されないことを示すグラフである。無血清培地で、１ｍｌあたり２．５×１０５のＰＢＭＣを、精製した市販のＳＡＰ（黒四角）、ＣＲＰ（白四角）、タンパク質Ｓ（白ひし形）、またはＣ４ｂ（白丸）の存在下で６日間培養し、次いで、線維芽細胞様細胞が出現したかどうかを調べた。次いで、細胞を風乾し、固定し、染色し、形態によって線維細胞を数えた。結果は、２．５×１０５のＰＢＭＣあたりの線維細胞の平均±ＳＤである（ｎ＝３通りの独立した実験）。
【図５】線維細胞分化アッセイにおける血漿からのＳＡＰの除去の影響を示すグラフである。 図５Ａは、ＢｉｏＧｅｌアガロースビーズを用いての血漿からのＳＡＰの除去が線維細胞への分化に及ぼす影響を示す。様々な希釈度の血漿（白四角）またはＢｉｏＧｅｌによって枯渇処理した血漿（黒四角）を供給したアッセイで見られた線維細胞の数を示す。星印は、２種の曲線間の統計学的有意差を示す。 図５Ｂは、血漿なし、または等希釈度の血漿、ＢｉｏＧｅｌ ＳＡＰ枯渇処理血漿、もしくは抗ＳＡＰ抗体枯渇処理血漿を用いて実施したアッセイで生成した線維細胞の数を示す。星印は、統計学的有意差を示す。
【図６】単球からの線維細胞への分化に対する様々なサイトカインの作用を示す図である。図６Ａは、様々なサイトカインの作用を示す。図６Ｂは、ＩＬ−１２の作用をより詳細に示す。
【図７】線維細胞形成に対する細胞外マトリックスタンパク質の作用を示す図である。５０ｍＭの炭酸緩衝液ｐＨ９．５に入れた細胞外マトリックスタンパク質を、９６穴組織培養プレートに４℃で１８時間かけて結合させた。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−ＦおよびＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−ＬをＰＢＳで希釈した。プレートをＰＢＳ中で洗浄し、２％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で、３７℃で６０分間インキュベートして、非特異的結合を防いだ。プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで組織培養培地で洗浄した。次いで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、４日間培養した。様々な細胞外マトリックスタンパク質での結果を図７Ａに示す。ラミニン−１、ラミニン−１０／１１、およびＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｌの作用を図７ｂにより詳細に示す。
【図８】単球に結合し、その分化を抑制するＳＡＰの能力に対する単量体ＩｇＧの作用を示す図である。ＰＢＭＣを、ある濃度範囲の単量体ＩｇＧの存在下、無血清培地で６０分間培養した。次いで、示した濃度のＳＡＰを加え、細胞を４日間培養した。
【図９】Ｆｃ受容体の連結および架橋が線維細胞への分化に及ぼす作用を示す図である。可溶性の免疫複合体（オボアルブミン−抗体）、オプソニン処理されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を含む粒状免疫複合体、および熱凝集ＩｇＧを使用した。図９Ａでは、ＰＢＭＣを、オボアルブミンもしくは抗オボアルブミンｍＡｂのみ、またはオボアルブミン：抗オボアルブミン免疫複合体と共に４日間培養した。図９Ｂは、２０：１および４０：１のＳＲＢＣ：単球比での、ＳＲＢＣ単独、およびウサギ抗ＳＲＢＣでオプソニン処理したＳＲＢＣの作用を示す。最後に、図９Ｃは、熱凝集ＩｇＧおよび熱凝集Ｆ（ａｂ）２がＰＢＭＣに及ぼす作用を示す。９Ａおよび９Ｂの星印は、統計学的有意差を示す。
【図１０】単球の分化に対する抗ＦｃγＲ抗体の作用を示す図である。星印は、対照との統計学的有意差を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓標的部位での線維細胞形成を抑制するのに十分な量の、Ｆｃγ受容体に結合して単球から線維細胞への分化を阻害する、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）またはその部分を含む線維細胞抑制組成物。
【請求項２】
腎臓線維症の治療または予防のための医薬調剤における、Ｆｃγ受容体に結合して単球から線維細胞への分化を阻害する、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）またはその部分を含む組成物の使用方法。
【請求項１】
腎臓標的部位での線維細胞形成を抑制するのに十分な量の、Ｆｃγ受容体に結合して単球から線維細胞への分化を阻害する、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）またはその部分を含む線維細胞抑制組成物。
【請求項２】
腎臓線維症の治療または予防のための医薬調剤における、Ｆｃγ受容体に結合して単球から線維細胞への分化を阻害する、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）またはその部分を含む組成物の使用方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１６８２４（Ｐ２０１１−１６８２４Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９６３３２（Ｐ２０１０−１９６３３２）
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【分割の表示】特願２００４−５６３９５８（Ｐ２００４−５６３９５８）の分割
【原出願日】平成１５年１２月２２日（２００３．１２．２２）
【出願人】（５０５２２６３８９）ウイリアム、マーシュ、ライス、ユーニヴァーサティ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【分割の表示】特願２００４−５６３９５８（Ｐ２００４−５６３９５８）の分割
【原出願日】平成１５年１２月２２日（２００３．１２．２２）
【出願人】（５０５２２６３８９）ウイリアム、マーシュ、ライス、ユーニヴァーサティ (3)
【Ｆターム（参考）】
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