耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤
【課題】 耐熱性芽胞形成細菌に対して高い増殖抑制作用を有し、しかも生分解性がよく、人体に対する安全性にも優れた耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤を提供する。
【解決手段】 コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液を有効成分とすることを特徴とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
【解決手段】 コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液を有効成分とすることを特徴とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、レトルト殺菌等で知られる高温・高圧条件下での加熱殺菌方法や化学薬品処理等以外に有効的な手段がない耐熱性芽胞形成細菌の増殖を抑制することができる耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、天然原料・素材を用いる加工食品の品質保持における最大の課題は、微生物の制御であり、微生物による腐敗や変質を極力抑えて安定的に流通させることが当該製造業者に求められている。一般に、自然界には、多数の微生物が存在し、人類と共存することが常であるが、時と場合によりそれらの存在は有害に作用することがある。耐熱性芽胞形成細菌は、薬剤や熱に対する強固な耐性を持つことが知られており、通常の加熱処理条件では死滅せず、製造場面では最終的な製品にまで残存し品質に悪影響を及ぼすものである。
【０００３】通常行われている加熱殺菌は、簡便且つ有効な手段として古くから用いられ、現在も常用されている。しかしながら、加熱殺菌方法は、加熱による食品素材そのものへの負荷・影響を考慮した場合の風味、香味や有用成分の安定性等に対する悪影響は著しく、また、殺菌効果とのバランスから加熱温度と時間に限界があるため、常在菌であるバチルス属に代表される耐熱性芽胞形成細菌には十分な効果が期待できない場合がある。
【０００４】従来、食品分野では、防腐・防黴を目的に食品添加物である保存料や、日持ち向上剤が使用され、加工食品や香粧品等の製品の保存流通期間中における品質保持に大きく貢献してきている（「別冊フードケミカル５ 保存料総覧」，食品化学新聞社，平成５年５月２５日発行）。
【０００５】このような事情から、従来以上に食品の保存技術の重要性がますます増してきており、中でも耐熱性芽胞形成細菌に対して顕著な効果を示す制御技術の開発が望まれているのが現状である。特に、食品分野では、人体に摂取されることを考慮し安全であることが必須要件であるが、このような観点からショ糖脂肪酸エステルやグリセリン脂肪酸エステルなどの食品添加物を主剤とした保存料、日持ち向上剤が多く用いられている（「食衛誌」第１８巻、第３号、第２１７頁，日高 徹著「食品用乳化剤 第２版」、２４４ページ、幸書房発行）。
【０００６】しかしながら、これらの食品添加物を主剤とした保存料、日持ち向上剤では、耐熱性芽胞形成細菌に対する殺菌効力等の面で未だ十分に満足しうるものではなかったものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の課題及び現状等に鑑み、これを解消しようとするものであり、安全性に優れ、且つ耐熱性芽胞形成細菌に対して高い増殖抑制効果を発現させることができる耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来の課題等を解決するため鋭意研究を重ねた結果、コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液に、耐熱性芽胞形成細菌に対する増殖抑制効果を見い出し、本発明を完成するに至ったのである。すなわち、本発明は、次の(1)及び(2)に存する。
(1) コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液を有効成分とすることを特徴とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
(2) 発酵液には、下記分析データで示される成分が含有される上記(1)記載の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
分析データ：分析用ODSカラム（YMC社製分析用ODSカラム、YMC-PACK ODS-AQ AQ-312,6.0×150mm）を用いて、カラム温度３０℃、流速１．０ｍｌ／分、メタノール／水／酢酸（２０／８０／０．３）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイ―において、市販のコーヒー飲料には存在せず、同条件で検出されるクロロゲン酸やカフェインのより必ず前に溶出される二成分を含むこと。
【０００９】なお、本発明で規定する「耐熱性芽胞形成細菌」とは、耐熱性を有する芽胞（胞子）を形成する細菌をいい、具体的には、Bacillus属細菌（例えば、subtilis，cereus，stearothermophilus，megateriumなど）、Clostridium属細菌（例えば、ボツリヌス菌、sporpgenes，pertringensなど）、Actinomyces属細菌（例えば、violaceusなど）等の細菌をいう。また、本発明で規定する耐熱性芽胞形成細菌に対する「増殖抑制（効果）」とは、液体培地中で微生物の増殖に供い観察される濁度の増減、並びに、通常法に従い所定の栄養を含んだ寒天培地と共にシャーレへ混釈後、培養期間を経た後に計測しうるコロニー数での増減の差をいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は、コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液を有効成分とすることを特徴とするものである。
【００１１】本発明に用いるコーヒー生豆としては、例えば、ロブスタ種のインドネシアロブスタ等、リベリカ種、アラビカ種のマンデリン、モカマタリ、ガテマラ、キリマンジャロ、ブルーマウンテン、エチオピアモカ、ハワイコナ、サントス等などが挙げられ、通常コーヒー飲料に用いられるものであれば、特に限定されるものではない。ただし、これらのコーヒー生豆は、飲用に原料として市販されているいずれのものであってもよいが、コーヒー飲料を製造する以前の生豆であり、本発明では焙煎された一切のコーヒー豆を除くものである。なお、上記コーヒー生豆は、１種を単独で又は二種以上の混合物として使用してもよい。
【００１２】本発明において、コーヒー生豆を発酵させる際には、栄養物質を非共存で発酵させることができるが、好ましくは、栄養物質の共存下にて発酵させることが望ましい。栄養物質としては、コーヒー生豆を効率的に発酵することができるものであれば、特に限定されず、例えば、０から５質量％（以下、単に「％」という）のブドウ糖、ソイペプトンが０から１％、リン酸ニカリウムが０から０．５％、トリプトンが０から２％、塩化ナトリウムが０から１％を含有する栄養培地が挙げられ、コーヒー生豆品種により異なるが、更に好ましくは、ブドウ糖５％、ソイペプトン０．５％、リン酸ニカリウム０．１％、塩化ナトリウム１．０％を含有するものが望ましい。
【００１３】本発明において、コーヒー生豆を発酵させる際のコーヒー生豆の仕込み量は、仕込み量全量に対して、５から２５％であり、好ましくは、１０から２０％である。仕込み量が５％未満では、発酵の進みが遅く、得られる耐熱性芽胞形成細菌抑制剤が少ないので耐熱性芽胞形成細菌への効果が弱く、また、２５％を越える仕込み量では、コーヒー生豆が水分を吸収するため発酵濾液（発酵液から不溶解物質等を分離・除去した溶液）が十分に得られず、好ましくない。本発明では、コーヒー生豆はそのままで、また、粉砕して用いてもよく、粉砕はいかなる粒度に粉砕して用いてもよい。また、コーヒー生豆は発酵させる前に品種により異なるが、の点から加熱処理してもよい。その場合、６０℃以上の温度、好ましくは、６０〜７０℃で１０から６０分間の加熱処理が好ましい。なお、通常の食用目的に用いられる焙煎されたコーヒー豆は、煮沸に準じた熱湯で処理するものであり、上記加熱処理とは相違するものである。
【００１４】本発明において、コーヒー生豆を発酵させる際には、ｐＨ４〜６．５の範囲、好ましくは、ｐＨ５〜６の範囲で発酵させることが望ましい。発酵は当初ｐＨ７から開始するが、ｐＨ４未満まで発酵させると、耐熱性芽胞形成細菌への増殖抑制効果が劣り、６．５以上の比較的発酵時間の少ないものでは効力が発現しないことがある。発酵の開始時にｐＨを調整するアルカリ性化合物としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩又は水酸化物、具体的には、炭酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。好ましくは、炭酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等の緩衝能を有するものが望ましい。また、上記発酵処理での反応温度は、特に制限はないが、通常、２０〜４０℃、好ましくは、２５〜３７℃であり、発酵時間は、通常、２４時間〜１２０時間である。また、本発明において行われる発酵には、接種し用いられる細菌菌株は不必要であり、コーヒー生豆に天然に付着残存する微生物により、その発酵工程は行われる。この発酵は、簡単な開放形タンクで十分であるが、発酵槽として用いられるいかなる装置を用いてもよく、例えば、柴田科学器械工業社より市販されるMDL-500型 バイオファーメンターを使用することができる。
【００１５】本発明の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は、コーヒー生豆の発酵を終えた発酵液（溶液）を有効成分とするものであるが、好ましくは、この発酵液から不溶解物質並びに微生物等を取り除いたコーヒー生豆発酵濾液とすることが好ましい。発酵濾液を得る方法としては、例えば、遠心分離、滅菌フィルター等のフィルター濾過、限外濾過等を使用する方法が挙げられ、不溶解物質並びに微生物等を取り除くことができるものであれば、いかなる方法を用いてもよい。本発明におけるコーヒー生豆の発酵から得られる発酵液とは、分析用ODSカラム（YMC社製分析用ODSカラム、YMC-PACK ODS-AQ AQ-312,6.0×150mm）を用いて、流速 1.0ml／分、メタノール／水／酢酸（２０／８０／０．３）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイ―において、市販のコーヒー飲料には存在せず、同条件で検出されるクロロゲン酸やカフェインより必ず前に溶出される二成分（耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤）を含むことをいう。
【００１６】図１（ａ）は、市販コーヒー飲料の高速液体クロマトグラフィーの結果を示す特性図であり、（ｂ）はコーヒー生豆発酵液の高速液体クロマトグラフィーの結果を示す特性図である。この図１（ａ）及び（ｂ）を比較検討すれば、（ｂ）のコーヒー生豆発酵液には市販のコーヒー飲料には存在せず、同条件で検出されるクロロゲン酸やカフェインより必ず前に溶出される二成分が検出されていることが明らかであり、これらの成分が後述するように耐熱性芽胞形成細菌抑制剤となるものである。
【００１７】本発明における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は、上述の如く、コーヒー生豆を栄養物質非共存あるいは共存下にて発酵させた発酵液を有効成分、好ましくは滅菌フィルター等を用いて不溶解物質並びに微生物等の夾雑物を除外した発酵濾液（水溶液）を有効成分としているものであり、野菜、果実、豆類、穀類、香辛料、魚介類、畜肉類、清涼飲料などの加工食品等に用いる保存料等として好適に使用できるものとなる。本発明における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤の加工食品や香粧品等に対する配合量は、清涼飲料などの加工食品の用途等により異なるものであるが、加工食品の全量に対して、１0ｐｐｍ（０．００１％）〜５％である。耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤の配合量が１0ｐｐｍ未満であると、目的の耐熱性芽胞形成細菌への増殖抑制効果を発揮することができず、また、５％を越えても、目的の耐熱性芽胞形成細菌への増殖抑制効果は変わらないが、不必要な呈色を示し、品質劣化を招く原因となることがある。
【００１８】また、本発明は、コーヒー生豆を栄養物質非共存あるいは共存下にて発酵させることにより、好ましくは、得た発酵液を更に滅菌フィルター等を用いて不溶解物質並びに微生物等の夾雑物を除外することにより容易に製造することができ、得た発酵液、好ましくは発酵濾液は、耐熱性芽胞形成細菌に対する増殖抑制効果を発現する耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤となるものである。
【００１９】このように構成される本発明の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤では、コーヒー生豆を発酵させることにより得られるものであり、得られた耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は著しい耐熱性芽胞形成細菌に対する増殖抑制効果を発現することとなる。また、本発明では、天然物由来であるコーヒー生豆を出発原料として製造することができるので、生分解性が良く、人体に対する安全性も高いことが期待され、食品、清涼飲料等へ添加して使用できるものとなる。更に、本発明では、加工食品の製造工程で制御困難な細菌芽胞の増殖を抑制できるので、製造工程で使用する場合は安定した製造品質を提供することができ、また、本発明の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤を添加した加工食品等の場合は、過度な加熱殺菌を施す必要がないので、加熱による品質の劣化を極力抑えることができ、香味豊かな加工食品などを提供でき、更に熱に対して不安定な有用成分を有する加工食品に対して配合しても細菌芽胞の増殖を抑制できるものとなる。
【００２０】
【実施例】次に、試験例（実施例及び比較例）により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例等に限定されるものではない。
【００２１】〔試験例１：コーヒー生豆の発酵液による耐熱性芽胞形成細菌に対する芽胞増殖抑制効果試験〕トリプトソイブイヨン培地（栄研化学社製）に、Bacillus subtilis ATCC9372株芽胞の細菌芽胞濃度を１．７５×１０3cfu／ml となるよう常法により接種調製し、下記に示す実施例１及び２のコーヒー生豆発酵液、並びに、比較例１及び２を０．０５％（１／２０００質量部）添加した培養用試験管を準備する。これらを光学系測定機能を備えた小型振とう培養装置（バイオフォトレコーダー ＴＮ−１５０６ ADVANTECH社製）を使用して、２５℃の環境に保ちながら振とう培養し、経時的な濁度の変化（測定波長６６０ｎｍ）を測定した。得られた微生物増殖曲線において、濁度の数値が低い程、耐熱性芽胞形成細菌に対する芽胞増殖抑制効果が高いことを表す。これらの結果を図２に示す。
【００２２】（実施例１）滅菌水に、コーヒー生豆（ブラジル種）１０％加えた水溶液を調製し、下記表１に示す栄養培地（以下、単に「栄養源」という）■を用いてリン酸一ナトリウム（関東化学社製）１％水溶液でｐＨを７．０に調製した後、２５℃で２４時間発酵させたものを実施例１とした。
（実施例２）滅菌水に、コーヒー生豆（マンデリン種）２０％加えた水溶液を調製し、下記表１に示す栄養源■を用いて炭酸ナトリウム（関東化学社製）１％水溶液でｐＨを６．５に調製した後、３２℃で３０時間発酵させたものを実施例２とした。
（比較例１）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例１とした。
（比較例２）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例２とした。
【００２３】
【表１】
【００２４】図２に示すように、本発明となる実施例１及び２は、比較例１（P-1670）及び比較例２（S-1670）に較べ、Bacillus subtilis ATCC9372株芽胞に対して、顕著な増殖抑制効果を示すことが判った。
【００２５】〔試験例２：コーヒー生豆の発酵液による耐熱性芽胞形成細菌に対する芽胞増殖抑制効果試験〕上記試験例１と同様の細菌芽胞培地溶液および培養方法を用いて、下記に示す実施例３及び４、比較例３及び４を０．５％（１／２００質量部）添加し、試験例１と同様に発酵濾液を用いた経時的な濁度の変化を測定した。これらの結果を図３に示す。
【００２６】（実施例３）滅菌水に、コーヒー生豆（ガテマラ種）５重量％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源■を用いて水酸化カリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを８．５に調製した後、２５℃で５０時間発酵させたものを実施例３とした。
（実施例４）滅菌水に、コーヒー生豆（サントス種）２０重量％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源■を用いてリン酸一ナトリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを８．０に調製した後、２５℃で２０時間発酵させたものを実施例３とした。
（比較例３）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例３とした。
（比較例４）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例４とした。
【００２７】図３に示すように、本発明となる実施例３及び４は、比較例３（P-1670）及び比較例４（S-1670）に較べ、Bacillus subtilis ATCC9372株芽胞に対して、顕著な増殖抑制効果を示すことが判った。
【００２８】〔試験例３：ミルクコーヒー飲料中での芽胞増殖抑制効果試験〕コーヒー豆（キリマンジャロ種／ハワイコナ種；60／40％）７５ｇを９５℃の熱湯１リットルに加え、静置後２０分間抽出した後、プレートクーラーで急冷して得たコーヒー溶液の９００ｇに牛乳１００ｇとグラニュー糖７０ｇを入れ、撹拌溶解してミルクコーヒーを調製した。このミルクコーヒーに１ｍｌあたり１０3個となるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を添加し、更に、下記に示す実施例５及び６、並びに、比較例５及び６を０．０５％（１／２０００質量部）添加し、滅菌した密閉容器に充填後、５５℃、３カ月保存した際の検出される芽胞菌由来の微生物数を常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表２に示す。
【００２９】（実施例５）滅菌水に、コーヒー生豆（ガテマラ種）１５％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源■を用いて水酸化カリウム（関東化学社製）１％水溶液を用いてｐＨを７．０に調製した後、２５℃で２４時間発酵させたものを実施例５とした。
（実施例６）滅菌水に、コーヒー生豆（ガテマラ種）２０％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源■を用いて炭酸カリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを７．５に調製した後、２５℃で２８時間発酵させたものを実施例６とした。
（比較例５）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例５とした。
（比較例６）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例６とした。
【００３０】
【表２】
【００３１】上記表２の結果から明らかなように、本発明となる実施例５及び６は、比較例５及び比較例６に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００３２】〔試験例４：加熱したコーヒー生豆の発酵液によるミルクコーヒー飲料中での芽胞増殖抑制効果試験〕コーヒー豆（キリマンジャロ種／ハワイコナ種；60／40％）７５ｇを９５℃の熱湯１リットルに加え、静置後２０分間抽出した後、プレートクーラーで急冷して得たコーヒー溶液の９００ｇに牛乳１００ｇとグラニュー糖７０ｇを入れ、撹拌溶解してミルクコーヒーを調製した。このミルクコーヒーに１ｍｌあたり１０3個となるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を添加し、更に、下記に示す実施例７及び８、並びに、比較例７及び８を０．０５％（１／２０００質量部）添加し、滅菌した密閉容器に充填後、５５℃、３カ月保存した際の検出される芽胞菌由来の微生物数を常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表３に示す。
【００３３】〔実施例７〕滅菌水に、予め水溶液中で６５℃、３０分の加熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）１５重量％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源■を用いてリン酸二ナトリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを６．５に調製した後、２５℃で４１時間発酵させたものを実施例７とした。
〔実施例８〕滅菌水に、予め水溶液中で７０℃、４０分の加熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）１０重量％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源■を用いて炭酸ナトリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを８．０に調製した後、２５℃で２５時間発酵させたものを実施例８とした。
〔比較例７〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例７とした。
〔比較例８〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例８とした。
【００３４】
【表３】
【００３５】上記表３の結果から明らかなように、本発明となる実施例７及び８は、比較例７及び比較例８に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００３６】〔試験例５：大豆煮豆中での芽胞増殖抑制効果試験〕市販の大豆１００ｇを５００ｍｌの水道水に入れ、６０分間加熱調理した。終了後余分な煮汁を棄て、常温に戻してから大豆煮豆を得た。無菌下でビニール袋を開封し、この大豆煮豆１０ｇと、１０3個／１０ｇとなるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を摂取し、更に、下記に示す実施例９及び１０、並びに、比較例９及び１０を０．０５％（１／２０００質量部）添加し、混合した後に充填後、５５℃、の恒温室に３カ月保存した。試験毎に検出される芽胞菌由来の微生物数は、常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表４に示す。
【００３７】〔実施例９〕滅菌水に、予め水溶液中で６５℃、３０分の加熱を施したコーヒー生豆（マンデリン種）１０％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源■を用いてリン酸二ナトリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを６．０に調製した後、３０℃で４４時間発酵させたものを実施例９とした。
〔実施例１０〕滅菌水に、予め水溶液中で５０℃、３５分の加熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）２０重量％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源■を用いて炭酸ナトリウム（関東化学社製）１％水溶液を用いてｐＨを７．０に調製した後、３２℃で２０時間発酵させたものを実施例１０とした。
〔比較例９〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例７とした。
〔比較例１０〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例８とした。
【００３８】
【表４】
【００３９】上記表４の結果から明らかなように、本発明となる実施例９及び１０は、比較例９及び比較例１０に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００４０】〔試験例６：生つぶあん中での芽胞増殖抑制効果試験〕市販の小豆１００ｇを５００ｍｌの水道水に入れ、３０分間加熱処理し、余分な煮汁を棄てた後、再度５００ｍｌの新しい水道水を入れ６０分間加熱調理した。終了後余分な煮汁を棄て、常温に戻してから小豆をつぶし、つぶあんを得た。無菌下でビニール袋を開封し、このつぶあん１０ｇと、１０3個／１０ｇとなるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を接取し、更に、下記に示す実施例１１及び１２、並びに、比較例１１及び１２を０．０５％（１／２０００質量部）添加し、混合した後に充填後、５５℃の恒温室に３カ月保存した。試験毎に検出される芽胞菌由来の微生物数は、常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表５に示す。
【００４１】〔実施例１１〕滅菌水に、予め水溶液中で６５℃、３０分の加熱を施したコーヒー生豆（サントス種）１５％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源■を用いてリン酸二ナトリウム（関東化学社製）１％水溶液を用いてｐＨを７．５に調製した後、２５℃で２６時間発酵させたものを実施例１１とした。
〔実施例１２〕滅菌水に、予め水溶液中で６０℃、３５分の加熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）１６％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源■を用いて炭酸ナトリウム（関東化学社製）１％水溶液を用いてｐＨを８．５に調製した後、２５℃で３４時間発酵させたものを実施例１２とした。
〔比較例１１〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例１１とした。
〔比較例１２〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例１２とした。
【００４２】
【表５】
【００４３】上記表５の結果から明らかなように、本発明となる実施例１１及び１２は、比較例１１及び比較例１２に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００４４】〔試験例７：コーヒー発酵抽出濾液を用いた生つぶあん中での芽胞増殖抑制効果試験〕市販の小豆１５０ｇを５００ｍｌの水道水に入れ、４５分間加熱処理し、余分な煮汁を棄てた後、再度５００ｍｌの新しい水道水を入れ６０分間加熱調理した。終了後余分な煮汁を棄て、常温に戻してから小豆をつぶし、つぶあんを得た。無菌下でビニール袋を開封し、このつぶあんを１０ｇと、１０３個／１０ｇとなるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を接種し、更に、下記に示す実施例１３及び１４，並びに比較例１３及び１４を０．０３％（１／３３３３質量部）添加し、混合した後に充填後、５５℃の恒温室に３カ月保存した。試験毎に検出される芽胞菌由来の微生物数は、常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表６に示す。
【００４５】〔実施例１３〕滅菌水に、予め水溶液中で６０℃、４５分の過熱を施したコーヒー生豆（マンデリン種）２０重量％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源 を用いてリン酸二ナトリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを７．０に調製した後、２５℃で２６時間発酵させ、滅菌フィルター（デユラポアメンブレンフィルター、日本ミリポア社）５μm次いで０．２２μmの同様のメンブレンフィルターで濾過したものを実施例１３とした。
〔実施例１４〕滅菌水に、予め水溶液中で６０℃、３５分の過熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）２０重量％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源 を用いて炭酸ナトリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを８．０に調製した後、２５℃で２５時間発酵させ滅菌フィルター（デユラポアメンブレンフィルター、日本ミリポア社）５μm次いで０．２２μmの同様のメンブレンフィルターで濾過したものを実施例１４とした。
〔比較例１３〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例１３とした。
〔比較例１４〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例１４とした。
【００４６】
【表６】
【００４７】上記表６の結果から明らかなように、本発明となる実施例１３及び１４は、比較例１３及び比較例１４に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００４８】上記試験例１〜７（図２〜３、表２〜６を含む）の結果を総合的に考察すると、コーヒー生豆を発酵させて得られる発酵液または発酵濾液を有効成分とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は、顕著な耐熱性芽胞形成細菌に対する増殖抑制効果を発現することが判明した。
【００４９】
【発明の効果】本発明によれば、耐熱性芽胞形成細菌に対して高い増殖抑制作用を有し、しかも生分解性がよく、人体に対する安全性にも優れた耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は市販コーヒー飲料とコーヒー生豆発酵液との高速液体クロマトグラフィーの結果を示す特性図である。
【図２】実施例１及び２と比較例１及び２における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制効果を示す特性図である。
【図３】実施例３及び４と比較例３及び４における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制効果を示す特性図である。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、レトルト殺菌等で知られる高温・高圧条件下での加熱殺菌方法や化学薬品処理等以外に有効的な手段がない耐熱性芽胞形成細菌の増殖を抑制することができる耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、天然原料・素材を用いる加工食品の品質保持における最大の課題は、微生物の制御であり、微生物による腐敗や変質を極力抑えて安定的に流通させることが当該製造業者に求められている。一般に、自然界には、多数の微生物が存在し、人類と共存することが常であるが、時と場合によりそれらの存在は有害に作用することがある。耐熱性芽胞形成細菌は、薬剤や熱に対する強固な耐性を持つことが知られており、通常の加熱処理条件では死滅せず、製造場面では最終的な製品にまで残存し品質に悪影響を及ぼすものである。
【０００３】通常行われている加熱殺菌は、簡便且つ有効な手段として古くから用いられ、現在も常用されている。しかしながら、加熱殺菌方法は、加熱による食品素材そのものへの負荷・影響を考慮した場合の風味、香味や有用成分の安定性等に対する悪影響は著しく、また、殺菌効果とのバランスから加熱温度と時間に限界があるため、常在菌であるバチルス属に代表される耐熱性芽胞形成細菌には十分な効果が期待できない場合がある。
【０００４】従来、食品分野では、防腐・防黴を目的に食品添加物である保存料や、日持ち向上剤が使用され、加工食品や香粧品等の製品の保存流通期間中における品質保持に大きく貢献してきている（「別冊フードケミカル５ 保存料総覧」，食品化学新聞社，平成５年５月２５日発行）。
【０００５】このような事情から、従来以上に食品の保存技術の重要性がますます増してきており、中でも耐熱性芽胞形成細菌に対して顕著な効果を示す制御技術の開発が望まれているのが現状である。特に、食品分野では、人体に摂取されることを考慮し安全であることが必須要件であるが、このような観点からショ糖脂肪酸エステルやグリセリン脂肪酸エステルなどの食品添加物を主剤とした保存料、日持ち向上剤が多く用いられている（「食衛誌」第１８巻、第３号、第２１７頁，日高 徹著「食品用乳化剤 第２版」、２４４ページ、幸書房発行）。
【０００６】しかしながら、これらの食品添加物を主剤とした保存料、日持ち向上剤では、耐熱性芽胞形成細菌に対する殺菌効力等の面で未だ十分に満足しうるものではなかったものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の課題及び現状等に鑑み、これを解消しようとするものであり、安全性に優れ、且つ耐熱性芽胞形成細菌に対して高い増殖抑制効果を発現させることができる耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来の課題等を解決するため鋭意研究を重ねた結果、コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液に、耐熱性芽胞形成細菌に対する増殖抑制効果を見い出し、本発明を完成するに至ったのである。すなわち、本発明は、次の(1)及び(2)に存する。
(1) コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液を有効成分とすることを特徴とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
(2) 発酵液には、下記分析データで示される成分が含有される上記(1)記載の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
分析データ：分析用ODSカラム（YMC社製分析用ODSカラム、YMC-PACK ODS-AQ AQ-312,6.0×150mm）を用いて、カラム温度３０℃、流速１．０ｍｌ／分、メタノール／水／酢酸（２０／８０／０．３）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイ―において、市販のコーヒー飲料には存在せず、同条件で検出されるクロロゲン酸やカフェインのより必ず前に溶出される二成分を含むこと。
【０００９】なお、本発明で規定する「耐熱性芽胞形成細菌」とは、耐熱性を有する芽胞（胞子）を形成する細菌をいい、具体的には、Bacillus属細菌（例えば、subtilis，cereus，stearothermophilus，megateriumなど）、Clostridium属細菌（例えば、ボツリヌス菌、sporpgenes，pertringensなど）、Actinomyces属細菌（例えば、violaceusなど）等の細菌をいう。また、本発明で規定する耐熱性芽胞形成細菌に対する「増殖抑制（効果）」とは、液体培地中で微生物の増殖に供い観察される濁度の増減、並びに、通常法に従い所定の栄養を含んだ寒天培地と共にシャーレへ混釈後、培養期間を経た後に計測しうるコロニー数での増減の差をいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は、コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液を有効成分とすることを特徴とするものである。
【００１１】本発明に用いるコーヒー生豆としては、例えば、ロブスタ種のインドネシアロブスタ等、リベリカ種、アラビカ種のマンデリン、モカマタリ、ガテマラ、キリマンジャロ、ブルーマウンテン、エチオピアモカ、ハワイコナ、サントス等などが挙げられ、通常コーヒー飲料に用いられるものであれば、特に限定されるものではない。ただし、これらのコーヒー生豆は、飲用に原料として市販されているいずれのものであってもよいが、コーヒー飲料を製造する以前の生豆であり、本発明では焙煎された一切のコーヒー豆を除くものである。なお、上記コーヒー生豆は、１種を単独で又は二種以上の混合物として使用してもよい。
【００１２】本発明において、コーヒー生豆を発酵させる際には、栄養物質を非共存で発酵させることができるが、好ましくは、栄養物質の共存下にて発酵させることが望ましい。栄養物質としては、コーヒー生豆を効率的に発酵することができるものであれば、特に限定されず、例えば、０から５質量％（以下、単に「％」という）のブドウ糖、ソイペプトンが０から１％、リン酸ニカリウムが０から０．５％、トリプトンが０から２％、塩化ナトリウムが０から１％を含有する栄養培地が挙げられ、コーヒー生豆品種により異なるが、更に好ましくは、ブドウ糖５％、ソイペプトン０．５％、リン酸ニカリウム０．１％、塩化ナトリウム１．０％を含有するものが望ましい。
【００１３】本発明において、コーヒー生豆を発酵させる際のコーヒー生豆の仕込み量は、仕込み量全量に対して、５から２５％であり、好ましくは、１０から２０％である。仕込み量が５％未満では、発酵の進みが遅く、得られる耐熱性芽胞形成細菌抑制剤が少ないので耐熱性芽胞形成細菌への効果が弱く、また、２５％を越える仕込み量では、コーヒー生豆が水分を吸収するため発酵濾液（発酵液から不溶解物質等を分離・除去した溶液）が十分に得られず、好ましくない。本発明では、コーヒー生豆はそのままで、また、粉砕して用いてもよく、粉砕はいかなる粒度に粉砕して用いてもよい。また、コーヒー生豆は発酵させる前に品種により異なるが、の点から加熱処理してもよい。その場合、６０℃以上の温度、好ましくは、６０〜７０℃で１０から６０分間の加熱処理が好ましい。なお、通常の食用目的に用いられる焙煎されたコーヒー豆は、煮沸に準じた熱湯で処理するものであり、上記加熱処理とは相違するものである。
【００１４】本発明において、コーヒー生豆を発酵させる際には、ｐＨ４〜６．５の範囲、好ましくは、ｐＨ５〜６の範囲で発酵させることが望ましい。発酵は当初ｐＨ７から開始するが、ｐＨ４未満まで発酵させると、耐熱性芽胞形成細菌への増殖抑制効果が劣り、６．５以上の比較的発酵時間の少ないものでは効力が発現しないことがある。発酵の開始時にｐＨを調整するアルカリ性化合物としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩又は水酸化物、具体的には、炭酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。好ましくは、炭酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等の緩衝能を有するものが望ましい。また、上記発酵処理での反応温度は、特に制限はないが、通常、２０〜４０℃、好ましくは、２５〜３７℃であり、発酵時間は、通常、２４時間〜１２０時間である。また、本発明において行われる発酵には、接種し用いられる細菌菌株は不必要であり、コーヒー生豆に天然に付着残存する微生物により、その発酵工程は行われる。この発酵は、簡単な開放形タンクで十分であるが、発酵槽として用いられるいかなる装置を用いてもよく、例えば、柴田科学器械工業社より市販されるMDL-500型 バイオファーメンターを使用することができる。
【００１５】本発明の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は、コーヒー生豆の発酵を終えた発酵液（溶液）を有効成分とするものであるが、好ましくは、この発酵液から不溶解物質並びに微生物等を取り除いたコーヒー生豆発酵濾液とすることが好ましい。発酵濾液を得る方法としては、例えば、遠心分離、滅菌フィルター等のフィルター濾過、限外濾過等を使用する方法が挙げられ、不溶解物質並びに微生物等を取り除くことができるものであれば、いかなる方法を用いてもよい。本発明におけるコーヒー生豆の発酵から得られる発酵液とは、分析用ODSカラム（YMC社製分析用ODSカラム、YMC-PACK ODS-AQ AQ-312,6.0×150mm）を用いて、流速 1.0ml／分、メタノール／水／酢酸（２０／８０／０．３）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイ―において、市販のコーヒー飲料には存在せず、同条件で検出されるクロロゲン酸やカフェインより必ず前に溶出される二成分（耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤）を含むことをいう。
【００１６】図１（ａ）は、市販コーヒー飲料の高速液体クロマトグラフィーの結果を示す特性図であり、（ｂ）はコーヒー生豆発酵液の高速液体クロマトグラフィーの結果を示す特性図である。この図１（ａ）及び（ｂ）を比較検討すれば、（ｂ）のコーヒー生豆発酵液には市販のコーヒー飲料には存在せず、同条件で検出されるクロロゲン酸やカフェインより必ず前に溶出される二成分が検出されていることが明らかであり、これらの成分が後述するように耐熱性芽胞形成細菌抑制剤となるものである。
【００１７】本発明における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は、上述の如く、コーヒー生豆を栄養物質非共存あるいは共存下にて発酵させた発酵液を有効成分、好ましくは滅菌フィルター等を用いて不溶解物質並びに微生物等の夾雑物を除外した発酵濾液（水溶液）を有効成分としているものであり、野菜、果実、豆類、穀類、香辛料、魚介類、畜肉類、清涼飲料などの加工食品等に用いる保存料等として好適に使用できるものとなる。本発明における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤の加工食品や香粧品等に対する配合量は、清涼飲料などの加工食品の用途等により異なるものであるが、加工食品の全量に対して、１0ｐｐｍ（０．００１％）〜５％である。耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤の配合量が１0ｐｐｍ未満であると、目的の耐熱性芽胞形成細菌への増殖抑制効果を発揮することができず、また、５％を越えても、目的の耐熱性芽胞形成細菌への増殖抑制効果は変わらないが、不必要な呈色を示し、品質劣化を招く原因となることがある。
【００１８】また、本発明は、コーヒー生豆を栄養物質非共存あるいは共存下にて発酵させることにより、好ましくは、得た発酵液を更に滅菌フィルター等を用いて不溶解物質並びに微生物等の夾雑物を除外することにより容易に製造することができ、得た発酵液、好ましくは発酵濾液は、耐熱性芽胞形成細菌に対する増殖抑制効果を発現する耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤となるものである。
【００１９】このように構成される本発明の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤では、コーヒー生豆を発酵させることにより得られるものであり、得られた耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は著しい耐熱性芽胞形成細菌に対する増殖抑制効果を発現することとなる。また、本発明では、天然物由来であるコーヒー生豆を出発原料として製造することができるので、生分解性が良く、人体に対する安全性も高いことが期待され、食品、清涼飲料等へ添加して使用できるものとなる。更に、本発明では、加工食品の製造工程で制御困難な細菌芽胞の増殖を抑制できるので、製造工程で使用する場合は安定した製造品質を提供することができ、また、本発明の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤を添加した加工食品等の場合は、過度な加熱殺菌を施す必要がないので、加熱による品質の劣化を極力抑えることができ、香味豊かな加工食品などを提供でき、更に熱に対して不安定な有用成分を有する加工食品に対して配合しても細菌芽胞の増殖を抑制できるものとなる。
【００２０】
【実施例】次に、試験例（実施例及び比較例）により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例等に限定されるものではない。
【００２１】〔試験例１：コーヒー生豆の発酵液による耐熱性芽胞形成細菌に対する芽胞増殖抑制効果試験〕トリプトソイブイヨン培地（栄研化学社製）に、Bacillus subtilis ATCC9372株芽胞の細菌芽胞濃度を１．７５×１０3cfu／ml となるよう常法により接種調製し、下記に示す実施例１及び２のコーヒー生豆発酵液、並びに、比較例１及び２を０．０５％（１／２０００質量部）添加した培養用試験管を準備する。これらを光学系測定機能を備えた小型振とう培養装置（バイオフォトレコーダー ＴＮ−１５０６ ADVANTECH社製）を使用して、２５℃の環境に保ちながら振とう培養し、経時的な濁度の変化（測定波長６６０ｎｍ）を測定した。得られた微生物増殖曲線において、濁度の数値が低い程、耐熱性芽胞形成細菌に対する芽胞増殖抑制効果が高いことを表す。これらの結果を図２に示す。
【００２２】（実施例１）滅菌水に、コーヒー生豆（ブラジル種）１０％加えた水溶液を調製し、下記表１に示す栄養培地（以下、単に「栄養源」という）
（実施例２）滅菌水に、コーヒー生豆（マンデリン種）２０％加えた水溶液を調製し、下記表１に示す栄養源
（比較例１）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例１とした。
（比較例２）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例２とした。
【００２３】
【表１】
【００２４】図２に示すように、本発明となる実施例１及び２は、比較例１（P-1670）及び比較例２（S-1670）に較べ、Bacillus subtilis ATCC9372株芽胞に対して、顕著な増殖抑制効果を示すことが判った。
【００２５】〔試験例２：コーヒー生豆の発酵液による耐熱性芽胞形成細菌に対する芽胞増殖抑制効果試験〕上記試験例１と同様の細菌芽胞培地溶液および培養方法を用いて、下記に示す実施例３及び４、比較例３及び４を０．５％（１／２００質量部）添加し、試験例１と同様に発酵濾液を用いた経時的な濁度の変化を測定した。これらの結果を図３に示す。
【００２６】（実施例３）滅菌水に、コーヒー生豆（ガテマラ種）５重量％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源
（実施例４）滅菌水に、コーヒー生豆（サントス種）２０重量％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源
（比較例３）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例３とした。
（比較例４）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例４とした。
【００２７】図３に示すように、本発明となる実施例３及び４は、比較例３（P-1670）及び比較例４（S-1670）に較べ、Bacillus subtilis ATCC9372株芽胞に対して、顕著な増殖抑制効果を示すことが判った。
【００２８】〔試験例３：ミルクコーヒー飲料中での芽胞増殖抑制効果試験〕コーヒー豆（キリマンジャロ種／ハワイコナ種；60／40％）７５ｇを９５℃の熱湯１リットルに加え、静置後２０分間抽出した後、プレートクーラーで急冷して得たコーヒー溶液の９００ｇに牛乳１００ｇとグラニュー糖７０ｇを入れ、撹拌溶解してミルクコーヒーを調製した。このミルクコーヒーに１ｍｌあたり１０3個となるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を添加し、更に、下記に示す実施例５及び６、並びに、比較例５及び６を０．０５％（１／２０００質量部）添加し、滅菌した密閉容器に充填後、５５℃、３カ月保存した際の検出される芽胞菌由来の微生物数を常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表２に示す。
【００２９】（実施例５）滅菌水に、コーヒー生豆（ガテマラ種）１５％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源
（実施例６）滅菌水に、コーヒー生豆（ガテマラ種）２０％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源
（比較例５）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例５とした。
（比較例６）ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例６とした。
【００３０】
【表２】
【００３１】上記表２の結果から明らかなように、本発明となる実施例５及び６は、比較例５及び比較例６に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００３２】〔試験例４：加熱したコーヒー生豆の発酵液によるミルクコーヒー飲料中での芽胞増殖抑制効果試験〕コーヒー豆（キリマンジャロ種／ハワイコナ種；60／40％）７５ｇを９５℃の熱湯１リットルに加え、静置後２０分間抽出した後、プレートクーラーで急冷して得たコーヒー溶液の９００ｇに牛乳１００ｇとグラニュー糖７０ｇを入れ、撹拌溶解してミルクコーヒーを調製した。このミルクコーヒーに１ｍｌあたり１０3個となるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を添加し、更に、下記に示す実施例７及び８、並びに、比較例７及び８を０．０５％（１／２０００質量部）添加し、滅菌した密閉容器に充填後、５５℃、３カ月保存した際の検出される芽胞菌由来の微生物数を常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表３に示す。
【００３３】〔実施例７〕滅菌水に、予め水溶液中で６５℃、３０分の加熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）１５重量％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源
〔実施例８〕滅菌水に、予め水溶液中で７０℃、４０分の加熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）１０重量％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源
〔比較例７〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例７とした。
〔比較例８〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例８とした。
【００３４】
【表３】
【００３５】上記表３の結果から明らかなように、本発明となる実施例７及び８は、比較例７及び比較例８に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００３６】〔試験例５：大豆煮豆中での芽胞増殖抑制効果試験〕市販の大豆１００ｇを５００ｍｌの水道水に入れ、６０分間加熱調理した。終了後余分な煮汁を棄て、常温に戻してから大豆煮豆を得た。無菌下でビニール袋を開封し、この大豆煮豆１０ｇと、１０3個／１０ｇとなるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を摂取し、更に、下記に示す実施例９及び１０、並びに、比較例９及び１０を０．０５％（１／２０００質量部）添加し、混合した後に充填後、５５℃、の恒温室に３カ月保存した。試験毎に検出される芽胞菌由来の微生物数は、常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表４に示す。
【００３７】〔実施例９〕滅菌水に、予め水溶液中で６５℃、３０分の加熱を施したコーヒー生豆（マンデリン種）１０％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源
〔実施例１０〕滅菌水に、予め水溶液中で５０℃、３５分の加熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）２０重量％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源
〔比較例９〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例７とした。
〔比較例１０〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例８とした。
【００３８】
【表４】
【００３９】上記表４の結果から明らかなように、本発明となる実施例９及び１０は、比較例９及び比較例１０に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００４０】〔試験例６：生つぶあん中での芽胞増殖抑制効果試験〕市販の小豆１００ｇを５００ｍｌの水道水に入れ、３０分間加熱処理し、余分な煮汁を棄てた後、再度５００ｍｌの新しい水道水を入れ６０分間加熱調理した。終了後余分な煮汁を棄て、常温に戻してから小豆をつぶし、つぶあんを得た。無菌下でビニール袋を開封し、このつぶあん１０ｇと、１０3個／１０ｇとなるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を接取し、更に、下記に示す実施例１１及び１２、並びに、比較例１１及び１２を０．０５％（１／２０００質量部）添加し、混合した後に充填後、５５℃の恒温室に３カ月保存した。試験毎に検出される芽胞菌由来の微生物数は、常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表５に示す。
【００４１】〔実施例１１〕滅菌水に、予め水溶液中で６５℃、３０分の加熱を施したコーヒー生豆（サントス種）１５％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源
〔実施例１２〕滅菌水に、予め水溶液中で６０℃、３５分の加熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）１６％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源
〔比較例１１〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例１１とした。
〔比較例１２〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例１２とした。
【００４２】
【表５】
【００４３】上記表５の結果から明らかなように、本発明となる実施例１１及び１２は、比較例１１及び比較例１２に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００４４】〔試験例７：コーヒー発酵抽出濾液を用いた生つぶあん中での芽胞増殖抑制効果試験〕市販の小豆１５０ｇを５００ｍｌの水道水に入れ、４５分間加熱処理し、余分な煮汁を棄てた後、再度５００ｍｌの新しい水道水を入れ６０分間加熱調理した。終了後余分な煮汁を棄て、常温に戻してから小豆をつぶし、つぶあんを得た。無菌下でビニール袋を開封し、このつぶあんを１０ｇと、１０３個／１０ｇとなるようBacillus stearothermophilus ATCC7953株芽胞液を接種し、更に、下記に示す実施例１３及び１４，並びに比較例１３及び１４を０．０３％（１／３３３３質量部）添加し、混合した後に充填後、５５℃の恒温室に３カ月保存した。試験毎に検出される芽胞菌由来の微生物数は、常法に従い標準寒天培地へ混釈後、３２℃、５日間培養した後に計測されたコロニー数により評価した。これらの結果を下記表６に示す。
【００４５】〔実施例１３〕滅菌水に、予め水溶液中で６０℃、４５分の過熱を施したコーヒー生豆（マンデリン種）２０重量％を加えた水溶液を調整し、下記表１に示す栄養源 を用いてリン酸二ナトリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを７．０に調製した後、２５℃で２６時間発酵させ、滅菌フィルター（デユラポアメンブレンフィルター、日本ミリポア社）５μm次いで０．２２μmの同様のメンブレンフィルターで濾過したものを実施例１３とした。
〔実施例１４〕滅菌水に、予め水溶液中で６０℃、３５分の過熱を施したコーヒー生豆（ガテマラ種）２０重量％を加えた水溶液を調整し、表１に示す栄養源 を用いて炭酸ナトリウム（関東化学社製）１重量％水溶液を用いてｐＨを８．０に調製した後、２５℃で２５時間発酵させ滅菌フィルター（デユラポアメンブレンフィルター、日本ミリポア社）５μm次いで０．２２μmの同様のメンブレンフィルターで濾過したものを実施例１４とした。
〔比較例１３〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製P-1670）を比較例１３とした。
〔比較例１４〕ショ糖脂肪酸エステル（三菱化学製S-1670）を比較例１４とした。
【００４６】
【表６】
【００４７】上記表６の結果から明らかなように、本発明となる実施例１３及び１４は、比較例１３及び比較例１４に較べ、検出される微生物数が顕著に低いことが判った。
【００４８】上記試験例１〜７（図２〜３、表２〜６を含む）の結果を総合的に考察すると、コーヒー生豆を発酵させて得られる発酵液または発酵濾液を有効成分とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤は、顕著な耐熱性芽胞形成細菌に対する増殖抑制効果を発現することが判明した。
【００４９】
【発明の効果】本発明によれば、耐熱性芽胞形成細菌に対して高い増殖抑制作用を有し、しかも生分解性がよく、人体に対する安全性にも優れた耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は市販コーヒー飲料とコーヒー生豆発酵液との高速液体クロマトグラフィーの結果を示す特性図である。
【図２】実施例１及び２と比較例１及び２における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制効果を示す特性図である。
【図３】実施例３及び４と比較例３及び４における耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制効果を示す特性図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液を有効成分とすることを特徴とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
【請求項２】 発酵液には、下記分析データで示される成分が含有される請求項１記載の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
分析データ：分析用ODSカラム（YMC社製分析用ODSカラム、YMC-PACK ODS-AQ AQ-312,6.0×150mm）を用いて、カラム温度３０℃、流速１．０ｍｌ／分、メタノール／水／酢酸（２０／８０／０．３）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイ―において、市販のコーヒー飲料には存在せず、同条件で検出されるクロロゲン酸やカフェインより必ず前に溶出される二成分を含むこと。
【請求項１】 コーヒー生豆を発酵させて得た発酵液を有効成分とすることを特徴とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
【請求項２】 発酵液には、下記分析データで示される成分が含有される請求項１記載の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
分析データ：分析用ODSカラム（YMC社製分析用ODSカラム、YMC-PACK ODS-AQ AQ-312,6.0×150mm）を用いて、カラム温度３０℃、流速１．０ｍｌ／分、メタノール／水／酢酸（２０／８０／０．３）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイ―において、市販のコーヒー飲料には存在せず、同条件で検出されるクロロゲン酸やカフェインより必ず前に溶出される二成分を含むこと。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００１−１７８４３１（Ｐ２００１−１７８４３１Ａ）
【公開日】平成１３年７月３日（２００１．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１１−３６７９８３
【出願日】平成１１年１２月２４日（１９９９．１２．２４）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１３年７月３日（２００１．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年１２月２４日（１９９９．１２．２４）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
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