肝機能障害治療において肝前駆細胞を用いる方法
肝機能障害治療において肝前駆細胞を用いる方法を提供する。より詳しくは、肝機能障害治療において、免疫抑制量の免疫抑制剤の非存在下で肝幹細胞を含む肝前駆細胞を用いる方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連発明の相互参照）
本出願は、２００５年１２月２２日に出願した米国仮出願第６０／７５２，５９７号の便益を主張し、そのすべての内容は参照により本開示に含まれるものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概略的には、肝機能障害治療における肝前駆細胞の使用に関する。より詳しくは、本発明は、肝機能障害治療において免疫抑制剤を併用せずに肝幹細胞を含む肝前駆細胞を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
全肝移植及び部分肝移植の効果は、ホストの免疫応答に実質的に依存する（例えば、対宿主性移植片病、ＧＶＨＤ）。実際、遺伝子的に異なる患者間では、ホストの身体がドナーの組織を数時間のうちに拒絶する可能性がある。この可能性に対処するため、移植を予定しているホストにドナーを遺伝子的に「適合」させるために、多大な時間と労力が掛けられている。
【０００４】
しかし、遺伝子的に同一な双子がいない場合は、最「適合」レシピエントの免疫系であっても、ドナーの組織に対する拒絶反応が開始される。したがって、移植期間が無い場合、ほぼ全ての臓器移植で短期間に多量の免疫抑制剤を使用することになる。肝臓移植では、例えば、カルシニューリン阻害剤、タクロリムス及びシクロスポリンが、同種異系移植片拒絶の予防に広く使用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、残念なことに免疫抑制剤は万能薬ではない。第１に、免疫抑制剤は、必ずしも作用するとは限らず、定期的に服用しなければならない。第２に、これらの薬物を常用することにより、患者の状態を更に悪化させかねないような細菌及びウイルス感染に対して、患者が脆弱性を有するようになってしまう。実際、カルシニューリン阻害剤は、腎毒性を招く可能性があり、時として移植後に遷延化した腎不全となることがある。その他の長期的な副作用には、耐糖能障害及び高脂血症が含まれる。しかし、免疫特権細胞を使用することで、免疫抑制剤が用いられる場合にもその必要性を低下させ、免疫抑制剤に伴う副作用を軽減させることができる。
【０００６】
したがって、免疫応答を悪化させずに同種異系細胞で肝機能障害を治療する方法が必要とされている。また、免疫抑制剤を殆ど又は全く使用しない肝細胞の移植方法も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様では、哺乳類の肝臓コンパートメントを再増殖させる方法を提供する。この方法では、（ａ）分離肝前駆細胞を用いること、及び（ｂ）前記分離肝前駆細胞を、哺乳類の肝臓コンパートメントに投与することを含んで構成され、前記投与は、低レベルの免疫抑制剤を伴って行われる。投与は、移植又は注射により行われてもよい。また、低レベルの免疫抑制剤とは、約０ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲である。より好ましくは、低レベルの免疫抑制剤とは、約０ｍｇ〜約５ｍｇである。
【０００８】
尚、当業者であれば、本開示の基礎となる思想は、本発明の複数の目的を実現するための他の構造、方法及びシステムの設計の基礎として容易に利用され得ることが理解できる。したがって、このような均等な構造は、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、特許請求の範囲に含まれるものと解されるべきものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、免疫抑制剤を必要とする場合であっても現行の標準用量までは必要としない、哺乳類への肝前駆細胞の移植方法を提供する。すなわち、本発明の好ましい実施形態では、肝前駆細胞を、免疫抑制剤の同時投与を殆ど又は全く伴わずに同種異系ホストに導入し、その拒絶を予防する。
【００１０】
現在、同種異系レシピエントへの部分肝移植又は全肝移植は、全てではないとしてもその多くが、移植組織の免疫拒絶（すなわちＧＶＨＤ）を予防するために免疫抑制剤の使用を必要としている。使用される免疫抑制剤の用量及び期間は、種々のファクター、例えば、組織の相対的な遺伝子的「適合」に応じて移植片間で大きく異なるものの、本発見及び本発明は、薬物使用を全体的に大幅に減少させうるものである。代表的な免疫抑制剤には、限定を意図するものではないが、プレドニゾン（例えば、ＯＲＡＳＯＮＥ（登録商標））、アザチオプリン（例えば、ＩＭＵＲＡＮ（登録商標））、シクロスポリン（例えば、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（登録商標）、ＮＥＯＲＡＬ（登録商標））及びミコフェノール酸（例えば、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標））が含まれる。
【００１１】
現在、代表的な免疫抑制剤の用量は、約５ｍｇ〜約２０ｍｇの範囲である（下表１参照）。本発明は、免疫抑制量未満（sub-immune suppressing amount）の免疫抑制剤を用いるか、又は、好ましくは免疫抑制剤を一切用いない、肝細胞の同種異系移植を提供する。換言すれば、個々のレシピエントにおいて、免疫抑制剤の免疫抑制量未満とは、そのレシピエントそれぞれの免疫応答を抑制する量未満の量として定義される。免疫抑制を達成する免疫抑制剤の最適用量を測定するものとしては幾つかのアッセイが実施可能であり、またこれらは当業者に公知である。これらの試験には、例えば、定量的ラジオレセプタアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、ＭＴＴアッセイ並びに市販の臨床キット及び分析器（例えば、Abbott Laboratories社の微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ法）を用いたＩＭｘ（登録商標）シロリムスアッセイ、及びRoche Diagnostics社のＣＥＤＩＡ ＣｓＡ ＰＬＵＳ）が含まれる。また、後述するようなインビトロアッセイによっても、インビボでの有効量曲線と適当な相関が得られる。本明細書において用いられるように、最適用量反応の約３０％未満、好ましくは約６０％未満、より好ましくは約９０％未満の用量反応を、免疫抑制未満（sub-immune）と定義する。代表的には、本発明の免疫抑制用量未満の用量は、好ましくは約０ｍｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０ｍｇ〜約５ｍｇ、更に好ましくは、約０ｍｇ〜約３ｍｇである。
【００１２】
【表１】
【００１３】
本発明は、病変又は機能不全の肝臓組織を他の健康なドナーの組織細胞で再増殖させ得る点で有用である。病変又は機能不全の肝臓を正常に機能している肝臓組織で再増殖することにより、機能不良組織から失われた活性を、少なくとも部分的に、置換することができる。このようにして肝臓の病気を治療することが可能となる。
【００１４】
以下、本発明を、限定を意図しない実施例により説明する。
【００１５】
（ヒト細胞の分離）
本発明における、インビトロ増殖に適した肝前駆細胞は、特定の方法により分離又は同定されるものに限定されるものではない。例として、肝前駆細胞の分離同定方法は、例えば、米国特許第６，０６９，００５号、米国特許出願第０９／４８７，３１８号、第１０／１３５，７００号及び第１０／３８７，５４７号に記載されている。尚、これらの開示内容は、その全体が参照により本開示に含まれるものである。
【００１６】
肝幹細胞及び肝芽細胞（hepatoblast）は、特徴的な抗原性特性を有しているため、上述のプロトコルで分離可能である。例えば、肝幹細胞及び肝芽細胞は、例えば、肝幹細胞及び肝芽細胞は、多数の抗原（例えば、サイトケラチン８、１８、１９、アルブミン、ＣＤ１３３／１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ））を共通で発現し、造血マーカー（例えば、グリコホリンＡ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５）及び間葉細胞マーカー（例えば、ＣＤ１４６）には陰性である。一方で、肝幹細胞及び肝芽細胞の区別は、サイズ（幹細胞は７〜９μｍ、肝芽細胞は１０〜１２μｍ）、又は抗原性特性（Ｎ−ＣＡＭは肝幹細胞に存在する一方、アルファ‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＩＣＡＭ１は肝芽細胞で発現する。）により可能である。
【００１７】
本実施例では、同所性肝移植に適さない提供肝臓を、米国の指定臓器調達機関から入手した。肝臓を研究目的で使用することに対して近親者からインフォームドコンセントを得た。細胞を分離するために、成体及び小児の肝臓において門脈及び肝動脈からＥＧＴＡを含むバッファーを１５分間、その後リベラーゼ（Roache社）１２５ｍｇ／Ｌを３０分間３４℃で灌流させた。得られた細胞を、孔径が１０００、５００、２５０及び１５０ミクロンのフィルタに順次通過させ、５００ｘｇで密度勾配を利用して遠心分離した。
【００１８】
（磁気細胞選択）
磁気細胞選択は、特異的な表面抗原を発現する細胞を、異種細胞からなる集団から分離する場合に便利な方法である。一実施形態では、市販されているシステム（「ＭＡＣＳ」マイクロビーズ、Miltenyi Biotec社）を用いて、肝前駆細胞のマーカーであるＥｐＣＡＭ陽性細胞を選択するタスクを実行した。標的抗原のモノクローナル抗体は、酸化鉄及び多糖類コーティングからなる超常磁性マイクロビーズに結合される。このマイクロビーズは、直径が約５０ナノメートル、体積は典型的な哺乳類細胞の１００万分の１である。このマイクロビーズは十分に小さいためコロイド懸濁液として存在し、このため細胞表面分子に急速にまた効率的に抗体性結合を形成することができる。製造者であれば、このマイクロビーズは、フローサイトメトリに干渉せず、生分解性であり、細胞機能に殆ど影響を及ぼさないことが理解できる。
【００１９】
選択に使用される抗体は、上述のような直接的方法又は次の間接的方法で用いてもよい。間接的方法では、ビーズをリガンド（例えば、フルオレセイン又はビオチン）のモノクローナル抗体に共有結合させ、リガンドで修飾された表面結合モノクローナル抗体を細胞の捕捉に使用する。直接的又は間接的免疫選択法のいずれであっても、標識ビーズと共にインキュベートした細胞を強磁場存在下でカラムに通過させ、抗原陽性細胞が保持され、陰性細胞が洗い流されるようにする。磁場を取り除いた後、陽性として標識された細胞を回収する。
【００２０】
（抗原マーカーのＦＡＣ分析）
細胞表面マーカー（例えば、ＥｐＣＡＭ）では、１×１０６個を５００ｘｇ５分間でペレット化し、２％ＦＢＳ及び０．０１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ１００μＬに再懸濁させた。その後、１μｇの標的抗体を添加し、氷上暗所で３０分間インキュベートした。その後細胞をＰＢＳで２回洗浄し、最終的に得られた細胞ペレットを１％パラホルムアルデヒド０．５ｍＬに再懸濁した。細胞を適切に制御するために、１μｇのマウスＩｇＧ１ ＦＩＴＣ及びマウスＩｇＧ１ ＰＥを添加した。
【００２１】
（免疫原性に関する混合リンパ球反応）
インビトロの相対免疫原性を評価するために、混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction、ＭＬＲ）アッセイを用いた。このアッセイは、同種異系刺激細胞集団でのＴ細胞（反応細胞）の増殖を測定する。概略的には、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール‐ハイパーク法による遠心分離で全血から精製した。この細胞、及びＰＢＭＣ集団から分離したＴ細胞を、ＭＬＲにおいて反応細胞として用いた。Ｂ細胞及び単球を抗体コート磁性ビーズでタグ付けし、これらを磁石で除去することによって、ネガティブセレクション法でＴ細胞を濃縮した。刺激細胞には、新鮮な分離肝細胞及び分離肝前駆細胞を用いた。
【００２２】
アッセイの間に刺激細胞が増殖しないように、刺激細胞集団のそれぞれにマイトマイシンＣ処理（マイトマイシンＣ１０μｇ／ｍＬで３時間）又は放射線照射を行った。ドナー以外の固体から得た反応細胞であるＴ細胞（ロイコパック（leukopack）を、Poietics社より購入）を、様々な数の各刺激細胞集団（０．２〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と共に、９６穴平底プレート中の５％ヒトＡＢ血清添加組織培養培地において培養した（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。またこれとは別に、コントロール培養を反応細胞又は刺激細胞の単独培養で行った。各処理について４通りの培養物で行った。培養物を、加湿５％ＣＯ２含有雰囲気下、３７℃でインキュベートした。その後、培養物を、１μＣｉ／ｗｅｌｌの３Ｈ‐チミジンで１６時間パルスし、ガラス繊維ろ紙で回収して、シンチレーションカウンターで計数した。
【００２３】
取り込まれた放射能の量（ｃｐｍ）は、Ｔ細胞の増殖に比例した。刺激細胞集団に対するＴ細胞反応から、単独で培養した反応細胞及び刺激細胞集団のバックグラウンドを適宜減算してデルタｃｐｍを算出した。
【００２４】
（免疫抑制に関する混合リンパ球反応（ＭＬＲ））
ＭＬＲアッセイを、同種異系刺激細胞集団を用いて、基本的には上述のように行った。この反応では、コントロールとして非抑制脾臓線維芽細胞（５×１０３、１０×１０３及び２０×１０３個）を測定（titrate）した。「実験」において、新鮮な分離前駆細胞との並列反応（parallel reaction）を測定（titrate）した。その後、Ｔ細胞に取り込まれた３Ｈ‐チミジンを測定した。コントロールと同等又はそれ以上の３Ｈ‐チミジンが取り込まれたことを示す実験値レベルからは、肝前駆細胞は免疫反応を抑制できないことが示された。
【００２５】
（結果）
ここでは、肝細胞の未分画混合物（Ｕｍｉｘ）及びＵｍｉｘ細胞を３日培養して得られた接着細胞集団（拡大肝実質細胞、Expanded Hepatocytes、Ｅｘｐ Ｈｅｐ）を研究した。図１に示されるように、未分画ＰＢＭＣは、照射Ｕｍｉｘ及び拡大肝実質細胞に対して、自己（Ａｕｔｏ）バックグラウンド反応よりも有意に（Ｐ＜０．０５）強い反応を、６０００／ｗｅｌｌ、３００００／ｗｅｌｌ及び１５００００／ｗｅｌｌ（拡大肝実質細胞のみ）の用量レベルにおいて示した。更に、拡大肝実質細胞に対する反応は、Ｕｍｉｘ細胞に対する反応よりも全ての用量において有意に高くなった（ｐ＜０．０５）。最高用量である１５００００肝細胞／ｗｅｌｌにおける反応は弱く、これはおそらく集密によるものと考えられる（３００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ用量においてＵｍｉｘ細胞及び拡大肝実質細胞は大きく、ウェルを完全に覆っていたため）。最低用量の刺激細胞（肝細胞の両集団）は、同種異系ＰＢＭＣよりも刺激性を有した。より高用量では、ＰＢＭＣはより刺激性を有した。
【００２６】
図２に示すように、精製Ｔ細胞は、Ｕｍｉｘ及び拡大肝実質細胞に対して同様の反応パターンを示した。拡大肝実質細胞は、全ての用量においてＴ細胞をバックグラウンドレベルよりも有意に刺激し、拡大肝実質細胞集団に対するＴ細胞の反応は、Ｕｍｉｘ細胞に対する反応よりも有意に高くなった。精製Ｔ細胞（抗原提示細胞（ＡＰＣ）欠損）は、拡大肝実質細胞に対して強く反応し、この細胞がＡＰＣとして機能し得ることを示唆した。Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ細胞（ＡＰＣ含有）を反応細胞としたときよりもＵｍｉｘ集団に対しての反応は弱く、この反応から、外部ＡＰＣ源が必要とされることが示唆された。
【００２７】
同様の実験を、まず、ＥｐＣＡＭの抗体で免疫選択され磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）で分離された成体の肝幹細胞／肝前駆細胞を用いて行った。ＦＡＣ分析によれば、分離細胞集団の純度は約８２％であった。図３は、これらの細胞のＭＬＲ実験結果を示している。末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ、図３（Ａ）、３×１０５個）及び精製Ｔ細胞（図３（Ｂ）、２×１０５個）からなる反応細胞を、自己ＰＭＢＣ（ｘＡｕｔｏ）、同種異系ＰＭＢＣ（ｘＡｌｌｏ）、又は成体肝前駆細胞（ｘＨｅｐ）からなる刺激細胞と混合した。これらの刺激細胞を異なる量で試験した（図中の各棒は、左＝１２．５×１０３個、中＝２５×１０３個、右＝５０×１０３個を示す。）。
【００２８】
同種異系ＰＭＢＣは、取り込んだ３Ｈ‐チミジンの増加によって検出された様に、増殖性Ｔ細胞集団の免疫応答を誘導した。一方、成体肝前駆細胞に対するＴ細胞の増殖の程度と、自己ＰＢＭＣコントロールに対する反応とでは、有意な違いは見られなかった。これらのデータは、成体肝幹細胞／肝前駆細胞は免疫原性ではないという結論を支持するものである。
【００２９】
別の試料（preparation）による成体肝幹細胞／肝前駆細胞を用いて、これらの細胞の免疫原性を評価する実験を行った。更に、これら細胞の免疫抑制能を評価するための実験も行った。図４〜７は、ＥｐＣＡＭ＋細胞がＰＭＢＣ及びＴ細胞の２つの異なるドナーのいずれかによるＴ細胞の増殖反応を刺激しないことを示している。
【００３０】
図８には、免疫抑制実験の結果を示す。このデータからは、成体の肝幹細胞／肝前駆細胞は、ＭＬＲ反応を抑制しないことが示されている。この実験により、ＥｐＣＡＭ細胞は免疫抑制能を持たないとの結論が得られた。
【００３１】
以上をまとめると、Ｕｍｉｘ及び拡大肝実質細胞は共に免疫原性であり、これらは自己ＰＭＢＣに対するバックグラウンド反応よりも有意に強くＴ細胞増殖を刺激する。更に、拡大肝実質細胞は、Ｕｍｉｘ細胞よりも有意に免疫原性であり、精製Ｔ細胞を直接的に刺激しており、ここから、拡大肝実質細胞（又はその亜集団）が抗原提示細胞として機能し得ることが示唆される。一方、Ｕｍｉｘ細胞は、反応細胞であるＰＭＢＣと比較して精製Ｔ細胞への刺激が弱く、ここから、Ｕｍｉｘ細胞はＡＰＣとして機能せず、反応を刺激するためにＰＢＭＣ集団からＡＰＣの助けを必要とすることが示唆される。
【００３２】
これらのデータは、両細胞集団（Ｕｍｉｘ及び拡大肝実質細胞）は、無処理免疫系を有する同種異系レシピエントに移植されたときに、Ｔ細胞の反応を誘導する傾向にあることを示唆している。拡大肝実質細胞集団は、インビボではＵｍｉｘ細胞よりも強い免疫応答を誘導すると予測される。
【００３３】
成体肝幹細胞／肝前駆細胞は、自己ＰＭＢＣ対するバックグラウンド反応よりも有意に強いＴ細胞増殖への刺激は認められなかったことから、免疫原性では無いと考えられる。同様に、成体肝幹細胞／肝前駆細胞は、自己ＰＭＢＣに対するバックグラウンド反応よりも有意に強くＴ細胞の増殖を抑制しなかったことから、免疫抑制性ではない。最後に、結果からは、成体肝幹細胞／肝前駆細胞（ＥｐＣＡＭ陽性細胞）は、ＭＨＣ分子を全く又は殆ど発現せず（おそらくクラスＩＩはなし）、共起刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現は殆ど見られないことが示唆されている。したがって、成体肝幹細胞／肝前駆細胞（ＥｐＣＡＭ陽性細胞）は、同種異系細胞移植の候補としてふさわしいと考えられる。
【００３４】
実際、ＥｐＣＡＭ、Ａｌｂ及びＣＫ１９の発現により定義される成体由来ヒト肝幹細胞／肝前駆細胞は、免疫特権肝細胞治療薬として有用である。成体由来ヒト肝幹細胞／肝前駆細胞を用いるインビボ異種移植生存アッセイでは、従来サイト（即ち非免疫特権サイト）に移植してもよく、例えば、確立された技術を用いて腎臓皮膜下に移植してもよい。望ましくは、同数の成体由来成熟肝実質細胞をコントロールの動物に移植する。
【００３５】
レシピエントマウスの側腹部に皮膚切開を行い、筋肉壁（muscle wall）を切開し、そして腎臓を露出させた。腎臓と腎皮質との間の被膜下にポケットを形成し、このポケットに移植に用いる細胞を配置した。この腎臓を腹腔内に再配置し、クリップで皮膚を閉じた。インビボでの移植片生存評価は、手術用顕微鏡を用いて移植後の所定の時間において目視検査により行った。移植片の外見（例えば、壊死）及び血管の内殖を経時変化（例えば、１時間、１、７、１４、２１、２８日）で評価した。
【００３６】
加えて、腎臓被膜下に配置した移植片の凍結切片の同様の経時変化について、ＣＤ４５の組織化学的研究を行っても良い。ＣＤ４５抗原は、チロシンホスファターゼであり、白血球共通抗原（ＬＣＡ）としても知られている。ＣＤ４５は、赤血球系細胞、血小板及びこれらの前駆細胞を除く全ての造血起源ヒト細胞に存在する。ＣＤ４５分子は、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化に必要とされ、細胞の活性化状態に応じて少なくとも５つのアイソフォームで発現する。一般的に、移植サイトにＣＤ４５＋細胞の蓄積がないことは、ホストによる免疫応答がないことを示し、移植された細胞が非免疫原性であるという概念を支持するものである。成体ヒト肝幹細胞／肝前駆細胞の移植では、このような結果が予測される。反対に、成体由来成熟肝実質細胞を移植したコントロール（対照）マウスでは、移植細胞の壊死、血管内殖不良、及びＣＤ４５＋細胞の蓄積として、強い免疫応答が示された。
【００３７】
このように、実質的に非免疫原性である肝幹細胞を肝機能障害治療に使用することにより、代表的な免疫抑制剤の必要性を大幅に又は完全に低減することができる。したがって、肝幹細胞は、病変又は機能不全肝臓組織を哺乳類患者において再増殖させ、これにより失われた肝機能を一部で回復させることができる。
【００３８】
実験室において、この能力は、例えば、メスＢａｌｂ／ｃマウス（８〜１２週齢）を用い、催奇形物質（例えば、ＣＣｌ４）を体重１ｋｇあたり１ｍＬ、肝障害を誘導するために１週間に２回、計８回にわたり注射して測定する。このマウスで、アラニントランスアミナーゼの血液化学検査を、処理期間を肝障害が示されるまでに設定して行った。未処理コントロールマウスと比較する酵素レベル評価は、試験に供する前の動物で行う。レシピエントマウスへの成体ヒト肝幹細胞の移植は、脾臓内注射により行う。
【００３９】
種々の投与量の細胞を、好ましくは、最大用量を１０６ｃｅｌｌｓ／マウスとして、各条件下で１０体の動物のコホートに移植する。肝機能の改善を判定基準（アラニントランスアミナーゼ、アルブミン、総タンパク質量、コレステロール及びトリグリセリド）から明らかとするために、動物の経時変化をモニタリングする。尚、研究の間に障害の兆候を示した動物は安楽死させ、死亡をエンドポイントとしなかった。
【００４０】
したがって、各移植条件下の５つのグループの動物を、移植４及び１６週間後に安楽死させる。その後、臓器を回収する。回収する臓器は、肝臓、腎臓、脳、心臓、肺、及び脾臓である。また、ルーチンの血液化学検査及びＣＢＣ用に血清標本を得た。同様に、臓器で免疫組織化学検査、Ｈ＆Ｅ染色、及びＲＮＡ分析を行った。標本は、抗体で染色し、移植細胞のマーカーを検出する（抗β-ガラクトシダーゼ抗体）。
【００４１】
或いは、Ｙ染色体を検出するＦＩＳＨ分析を行って、移植オス細胞の同定を行う。連続切片で肝臓タンパク質（肝臓中）の発現をモニターし、ＤＡＰＩ染色を行って細胞の倍数性を測定した（細胞融合の可能性を評価するため）。脾臓、腎臓、脳、肺、心臓の連続切片は、肝臓外での移植細胞を実証するためのものである。
【００４２】
他のアプローチとして、成体ヒト肝幹細胞をＡｐｏＥ欠損マウスに移植してもよい。簡単に説明すると、Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ変異のホモ結合であるマウスは、年齢又は性別に影響されないで総血漿コレステロールレベルの顕著な増加を示す。３月齢において、近位大動脈内の脂肪線条が見られる。病変部は年齢と共に増加し、そして前動脈硬化性病変の更に進行した段階において典型的で脂質が少なく細長い細胞を伴った病変に進行する。この変異を有する混合Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９の遺伝的背景のマウスにおいて、トリグリセリドレベルの中程度の増加が報告されている。老年期のＡｐｏＥ欠損マウス（＞１７月齢）では、脳において主として結晶性コレステロール裂、脂質球、及び泡沫細胞からなる黄色腫性病変が進行することが示されている。より小さな黄色腫が、脈絡叢及び腹側脳弓において認められた。最近の研究では、ＡｐｏＥ欠損マウスでは、ストレス応答の変化、空間学習及び記憶への障害、長期増強現象の変化、及びシナプスの損傷が見られることが示されている。
【００４３】
このマウスを、脾臓内注射により成体ヒト肝幹細胞を４〜６週齢ホモ接合Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃマウスに移植するためのホストとして用いてもよい。このレシピエントグループは、次の各グループにおいて動物を５体含むこととしてもよい。グループ１は、コントロールとして生理食塩水を注射し、細胞は注射せず、グループ２は、１×１０６個のヒト肝細胞、グループ３は、２×１０６個のヒト肝細胞、グループ４は、５×１０５個のヒト肝細胞、そして、グループ５は、１×１０６個のヒト成熟肝実質細胞とする。移植実験では、歴史的対照から約１５％の死亡率が予測される。
【００４４】
移植後の経時変化によるエンドポイント分析では、ＡｐｏＥが含まれる（ウエスタンブロット分析により、２、４、８、１２週の時点で分析）。欠損マウスにおいて成体ヒト肝幹細胞移植後にＡｐｏＥが検出されたことから、これらの細胞は、レシピエントの免疫抑制を伴わない肝機能の再構築に使用可能であるとの概念が支持される。
【００４５】
本発明は、その具体的な実施形態と関連させて記載したが、これを更に変更可能であることは理解され得るものであり、また、この出願は、本発明の如何なる変形、使用又は改変をも含むことを意図していると理解されるものである。一般的に、本発明の原理は、本発明の属する技術分野において知られる又は慣行されるような本開示からの逸脱、及びこれまでに開示され又は特許請求の範囲において示される本質的特徴に適用し得る逸脱をも包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】同定肝細胞集団に対する未分画ＰＢＭＣの反応を示す図である。
【図２】同定肝細胞集団に対する精製Ｔ細胞の反応を示す図である。
【図３】同定細胞集団で行った混合リンパ球反応アッセイの結果を示す図であり、（Ａ）はＰＢＭＣ反応、（Ｂ）は精製Ｔ細胞反応を示す。
【図４】ＥｐＣＡＭ陽性肝細胞に対する精製Ｔ細胞の反応を示す図である。
【図５】ＥｐＣＡＭ陽性肝細胞に対する他の精製Ｔ細胞反応を示す図である。
【図６】ＥｐＣＡＭ陽性肝細胞に対する更に他の精製Ｔ細胞反応を示す図である。
【図７】ＥｐＣＡＭ陽性肝細胞に対する更に他の精製Ｔ細胞反応を示す図である。
【図８】ＥｐＣＡＭ陽性細胞による混合リンパ球反応の抑制を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
（関連発明の相互参照）
本出願は、２００５年１２月２２日に出願した米国仮出願第６０／７５２，５９７号の便益を主張し、そのすべての内容は参照により本開示に含まれるものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概略的には、肝機能障害治療における肝前駆細胞の使用に関する。より詳しくは、本発明は、肝機能障害治療において免疫抑制剤を併用せずに肝幹細胞を含む肝前駆細胞を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
全肝移植及び部分肝移植の効果は、ホストの免疫応答に実質的に依存する（例えば、対宿主性移植片病、ＧＶＨＤ）。実際、遺伝子的に異なる患者間では、ホストの身体がドナーの組織を数時間のうちに拒絶する可能性がある。この可能性に対処するため、移植を予定しているホストにドナーを遺伝子的に「適合」させるために、多大な時間と労力が掛けられている。
【０００４】
しかし、遺伝子的に同一な双子がいない場合は、最「適合」レシピエントの免疫系であっても、ドナーの組織に対する拒絶反応が開始される。したがって、移植期間が無い場合、ほぼ全ての臓器移植で短期間に多量の免疫抑制剤を使用することになる。肝臓移植では、例えば、カルシニューリン阻害剤、タクロリムス及びシクロスポリンが、同種異系移植片拒絶の予防に広く使用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、残念なことに免疫抑制剤は万能薬ではない。第１に、免疫抑制剤は、必ずしも作用するとは限らず、定期的に服用しなければならない。第２に、これらの薬物を常用することにより、患者の状態を更に悪化させかねないような細菌及びウイルス感染に対して、患者が脆弱性を有するようになってしまう。実際、カルシニューリン阻害剤は、腎毒性を招く可能性があり、時として移植後に遷延化した腎不全となることがある。その他の長期的な副作用には、耐糖能障害及び高脂血症が含まれる。しかし、免疫特権細胞を使用することで、免疫抑制剤が用いられる場合にもその必要性を低下させ、免疫抑制剤に伴う副作用を軽減させることができる。
【０００６】
したがって、免疫応答を悪化させずに同種異系細胞で肝機能障害を治療する方法が必要とされている。また、免疫抑制剤を殆ど又は全く使用しない肝細胞の移植方法も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様では、哺乳類の肝臓コンパートメントを再増殖させる方法を提供する。この方法では、（ａ）分離肝前駆細胞を用いること、及び（ｂ）前記分離肝前駆細胞を、哺乳類の肝臓コンパートメントに投与することを含んで構成され、前記投与は、低レベルの免疫抑制剤を伴って行われる。投与は、移植又は注射により行われてもよい。また、低レベルの免疫抑制剤とは、約０ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲である。より好ましくは、低レベルの免疫抑制剤とは、約０ｍｇ〜約５ｍｇである。
【０００８】
尚、当業者であれば、本開示の基礎となる思想は、本発明の複数の目的を実現するための他の構造、方法及びシステムの設計の基礎として容易に利用され得ることが理解できる。したがって、このような均等な構造は、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、特許請求の範囲に含まれるものと解されるべきものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、免疫抑制剤を必要とする場合であっても現行の標準用量までは必要としない、哺乳類への肝前駆細胞の移植方法を提供する。すなわち、本発明の好ましい実施形態では、肝前駆細胞を、免疫抑制剤の同時投与を殆ど又は全く伴わずに同種異系ホストに導入し、その拒絶を予防する。
【００１０】
現在、同種異系レシピエントへの部分肝移植又は全肝移植は、全てではないとしてもその多くが、移植組織の免疫拒絶（すなわちＧＶＨＤ）を予防するために免疫抑制剤の使用を必要としている。使用される免疫抑制剤の用量及び期間は、種々のファクター、例えば、組織の相対的な遺伝子的「適合」に応じて移植片間で大きく異なるものの、本発見及び本発明は、薬物使用を全体的に大幅に減少させうるものである。代表的な免疫抑制剤には、限定を意図するものではないが、プレドニゾン（例えば、ＯＲＡＳＯＮＥ（登録商標））、アザチオプリン（例えば、ＩＭＵＲＡＮ（登録商標））、シクロスポリン（例えば、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（登録商標）、ＮＥＯＲＡＬ（登録商標））及びミコフェノール酸（例えば、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標））が含まれる。
【００１１】
現在、代表的な免疫抑制剤の用量は、約５ｍｇ〜約２０ｍｇの範囲である（下表１参照）。本発明は、免疫抑制量未満（sub-immune suppressing amount）の免疫抑制剤を用いるか、又は、好ましくは免疫抑制剤を一切用いない、肝細胞の同種異系移植を提供する。換言すれば、個々のレシピエントにおいて、免疫抑制剤の免疫抑制量未満とは、そのレシピエントそれぞれの免疫応答を抑制する量未満の量として定義される。免疫抑制を達成する免疫抑制剤の最適用量を測定するものとしては幾つかのアッセイが実施可能であり、またこれらは当業者に公知である。これらの試験には、例えば、定量的ラジオレセプタアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、ＭＴＴアッセイ並びに市販の臨床キット及び分析器（例えば、Abbott Laboratories社の微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ法）を用いたＩＭｘ（登録商標）シロリムスアッセイ、及びRoche Diagnostics社のＣＥＤＩＡ ＣｓＡ ＰＬＵＳ）が含まれる。また、後述するようなインビトロアッセイによっても、インビボでの有効量曲線と適当な相関が得られる。本明細書において用いられるように、最適用量反応の約３０％未満、好ましくは約６０％未満、より好ましくは約９０％未満の用量反応を、免疫抑制未満（sub-immune）と定義する。代表的には、本発明の免疫抑制用量未満の用量は、好ましくは約０ｍｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０ｍｇ〜約５ｍｇ、更に好ましくは、約０ｍｇ〜約３ｍｇである。
【００１２】
【表１】
【００１３】
本発明は、病変又は機能不全の肝臓組織を他の健康なドナーの組織細胞で再増殖させ得る点で有用である。病変又は機能不全の肝臓を正常に機能している肝臓組織で再増殖することにより、機能不良組織から失われた活性を、少なくとも部分的に、置換することができる。このようにして肝臓の病気を治療することが可能となる。
【００１４】
以下、本発明を、限定を意図しない実施例により説明する。
【００１５】
（ヒト細胞の分離）
本発明における、インビトロ増殖に適した肝前駆細胞は、特定の方法により分離又は同定されるものに限定されるものではない。例として、肝前駆細胞の分離同定方法は、例えば、米国特許第６，０６９，００５号、米国特許出願第０９／４８７，３１８号、第１０／１３５，７００号及び第１０／３８７，５４７号に記載されている。尚、これらの開示内容は、その全体が参照により本開示に含まれるものである。
【００１６】
肝幹細胞及び肝芽細胞（hepatoblast）は、特徴的な抗原性特性を有しているため、上述のプロトコルで分離可能である。例えば、肝幹細胞及び肝芽細胞は、例えば、肝幹細胞及び肝芽細胞は、多数の抗原（例えば、サイトケラチン８、１８、１９、アルブミン、ＣＤ１３３／１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ））を共通で発現し、造血マーカー（例えば、グリコホリンＡ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５）及び間葉細胞マーカー（例えば、ＣＤ１４６）には陰性である。一方で、肝幹細胞及び肝芽細胞の区別は、サイズ（幹細胞は７〜９μｍ、肝芽細胞は１０〜１２μｍ）、又は抗原性特性（Ｎ−ＣＡＭは肝幹細胞に存在する一方、アルファ‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＩＣＡＭ１は肝芽細胞で発現する。）により可能である。
【００１７】
本実施例では、同所性肝移植に適さない提供肝臓を、米国の指定臓器調達機関から入手した。肝臓を研究目的で使用することに対して近親者からインフォームドコンセントを得た。細胞を分離するために、成体及び小児の肝臓において門脈及び肝動脈からＥＧＴＡを含むバッファーを１５分間、その後リベラーゼ（Roache社）１２５ｍｇ／Ｌを３０分間３４℃で灌流させた。得られた細胞を、孔径が１０００、５００、２５０及び１５０ミクロンのフィルタに順次通過させ、５００ｘｇで密度勾配を利用して遠心分離した。
【００１８】
（磁気細胞選択）
磁気細胞選択は、特異的な表面抗原を発現する細胞を、異種細胞からなる集団から分離する場合に便利な方法である。一実施形態では、市販されているシステム（「ＭＡＣＳ」マイクロビーズ、Miltenyi Biotec社）を用いて、肝前駆細胞のマーカーであるＥｐＣＡＭ陽性細胞を選択するタスクを実行した。標的抗原のモノクローナル抗体は、酸化鉄及び多糖類コーティングからなる超常磁性マイクロビーズに結合される。このマイクロビーズは、直径が約５０ナノメートル、体積は典型的な哺乳類細胞の１００万分の１である。このマイクロビーズは十分に小さいためコロイド懸濁液として存在し、このため細胞表面分子に急速にまた効率的に抗体性結合を形成することができる。製造者であれば、このマイクロビーズは、フローサイトメトリに干渉せず、生分解性であり、細胞機能に殆ど影響を及ぼさないことが理解できる。
【００１９】
選択に使用される抗体は、上述のような直接的方法又は次の間接的方法で用いてもよい。間接的方法では、ビーズをリガンド（例えば、フルオレセイン又はビオチン）のモノクローナル抗体に共有結合させ、リガンドで修飾された表面結合モノクローナル抗体を細胞の捕捉に使用する。直接的又は間接的免疫選択法のいずれであっても、標識ビーズと共にインキュベートした細胞を強磁場存在下でカラムに通過させ、抗原陽性細胞が保持され、陰性細胞が洗い流されるようにする。磁場を取り除いた後、陽性として標識された細胞を回収する。
【００２０】
（抗原マーカーのＦＡＣ分析）
細胞表面マーカー（例えば、ＥｐＣＡＭ）では、１×１０６個を５００ｘｇ５分間でペレット化し、２％ＦＢＳ及び０．０１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ１００μＬに再懸濁させた。その後、１μｇの標的抗体を添加し、氷上暗所で３０分間インキュベートした。その後細胞をＰＢＳで２回洗浄し、最終的に得られた細胞ペレットを１％パラホルムアルデヒド０．５ｍＬに再懸濁した。細胞を適切に制御するために、１μｇのマウスＩｇＧ１ ＦＩＴＣ及びマウスＩｇＧ１ ＰＥを添加した。
【００２１】
（免疫原性に関する混合リンパ球反応）
インビトロの相対免疫原性を評価するために、混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction、ＭＬＲ）アッセイを用いた。このアッセイは、同種異系刺激細胞集団でのＴ細胞（反応細胞）の増殖を測定する。概略的には、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール‐ハイパーク法による遠心分離で全血から精製した。この細胞、及びＰＢＭＣ集団から分離したＴ細胞を、ＭＬＲにおいて反応細胞として用いた。Ｂ細胞及び単球を抗体コート磁性ビーズでタグ付けし、これらを磁石で除去することによって、ネガティブセレクション法でＴ細胞を濃縮した。刺激細胞には、新鮮な分離肝細胞及び分離肝前駆細胞を用いた。
【００２２】
アッセイの間に刺激細胞が増殖しないように、刺激細胞集団のそれぞれにマイトマイシンＣ処理（マイトマイシンＣ１０μｇ／ｍＬで３時間）又は放射線照射を行った。ドナー以外の固体から得た反応細胞であるＴ細胞（ロイコパック（leukopack）を、Poietics社より購入）を、様々な数の各刺激細胞集団（０．２〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と共に、９６穴平底プレート中の５％ヒトＡＢ血清添加組織培養培地において培養した（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。またこれとは別に、コントロール培養を反応細胞又は刺激細胞の単独培養で行った。各処理について４通りの培養物で行った。培養物を、加湿５％ＣＯ２含有雰囲気下、３７℃でインキュベートした。その後、培養物を、１μＣｉ／ｗｅｌｌの３Ｈ‐チミジンで１６時間パルスし、ガラス繊維ろ紙で回収して、シンチレーションカウンターで計数した。
【００２３】
取り込まれた放射能の量（ｃｐｍ）は、Ｔ細胞の増殖に比例した。刺激細胞集団に対するＴ細胞反応から、単独で培養した反応細胞及び刺激細胞集団のバックグラウンドを適宜減算してデルタｃｐｍを算出した。
【００２４】
（免疫抑制に関する混合リンパ球反応（ＭＬＲ））
ＭＬＲアッセイを、同種異系刺激細胞集団を用いて、基本的には上述のように行った。この反応では、コントロールとして非抑制脾臓線維芽細胞（５×１０３、１０×１０３及び２０×１０３個）を測定（titrate）した。「実験」において、新鮮な分離前駆細胞との並列反応（parallel reaction）を測定（titrate）した。その後、Ｔ細胞に取り込まれた３Ｈ‐チミジンを測定した。コントロールと同等又はそれ以上の３Ｈ‐チミジンが取り込まれたことを示す実験値レベルからは、肝前駆細胞は免疫反応を抑制できないことが示された。
【００２５】
（結果）
ここでは、肝細胞の未分画混合物（Ｕｍｉｘ）及びＵｍｉｘ細胞を３日培養して得られた接着細胞集団（拡大肝実質細胞、Expanded Hepatocytes、Ｅｘｐ Ｈｅｐ）を研究した。図１に示されるように、未分画ＰＢＭＣは、照射Ｕｍｉｘ及び拡大肝実質細胞に対して、自己（Ａｕｔｏ）バックグラウンド反応よりも有意に（Ｐ＜０．０５）強い反応を、６０００／ｗｅｌｌ、３００００／ｗｅｌｌ及び１５００００／ｗｅｌｌ（拡大肝実質細胞のみ）の用量レベルにおいて示した。更に、拡大肝実質細胞に対する反応は、Ｕｍｉｘ細胞に対する反応よりも全ての用量において有意に高くなった（ｐ＜０．０５）。最高用量である１５００００肝細胞／ｗｅｌｌにおける反応は弱く、これはおそらく集密によるものと考えられる（３００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ用量においてＵｍｉｘ細胞及び拡大肝実質細胞は大きく、ウェルを完全に覆っていたため）。最低用量の刺激細胞（肝細胞の両集団）は、同種異系ＰＢＭＣよりも刺激性を有した。より高用量では、ＰＢＭＣはより刺激性を有した。
【００２６】
図２に示すように、精製Ｔ細胞は、Ｕｍｉｘ及び拡大肝実質細胞に対して同様の反応パターンを示した。拡大肝実質細胞は、全ての用量においてＴ細胞をバックグラウンドレベルよりも有意に刺激し、拡大肝実質細胞集団に対するＴ細胞の反応は、Ｕｍｉｘ細胞に対する反応よりも有意に高くなった。精製Ｔ細胞（抗原提示細胞（ＡＰＣ）欠損）は、拡大肝実質細胞に対して強く反応し、この細胞がＡＰＣとして機能し得ることを示唆した。Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ細胞（ＡＰＣ含有）を反応細胞としたときよりもＵｍｉｘ集団に対しての反応は弱く、この反応から、外部ＡＰＣ源が必要とされることが示唆された。
【００２７】
同様の実験を、まず、ＥｐＣＡＭの抗体で免疫選択され磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）で分離された成体の肝幹細胞／肝前駆細胞を用いて行った。ＦＡＣ分析によれば、分離細胞集団の純度は約８２％であった。図３は、これらの細胞のＭＬＲ実験結果を示している。末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ、図３（Ａ）、３×１０５個）及び精製Ｔ細胞（図３（Ｂ）、２×１０５個）からなる反応細胞を、自己ＰＭＢＣ（ｘＡｕｔｏ）、同種異系ＰＭＢＣ（ｘＡｌｌｏ）、又は成体肝前駆細胞（ｘＨｅｐ）からなる刺激細胞と混合した。これらの刺激細胞を異なる量で試験した（図中の各棒は、左＝１２．５×１０３個、中＝２５×１０３個、右＝５０×１０３個を示す。）。
【００２８】
同種異系ＰＭＢＣは、取り込んだ３Ｈ‐チミジンの増加によって検出された様に、増殖性Ｔ細胞集団の免疫応答を誘導した。一方、成体肝前駆細胞に対するＴ細胞の増殖の程度と、自己ＰＢＭＣコントロールに対する反応とでは、有意な違いは見られなかった。これらのデータは、成体肝幹細胞／肝前駆細胞は免疫原性ではないという結論を支持するものである。
【００２９】
別の試料（preparation）による成体肝幹細胞／肝前駆細胞を用いて、これらの細胞の免疫原性を評価する実験を行った。更に、これら細胞の免疫抑制能を評価するための実験も行った。図４〜７は、ＥｐＣＡＭ＋細胞がＰＭＢＣ及びＴ細胞の２つの異なるドナーのいずれかによるＴ細胞の増殖反応を刺激しないことを示している。
【００３０】
図８には、免疫抑制実験の結果を示す。このデータからは、成体の肝幹細胞／肝前駆細胞は、ＭＬＲ反応を抑制しないことが示されている。この実験により、ＥｐＣＡＭ細胞は免疫抑制能を持たないとの結論が得られた。
【００３１】
以上をまとめると、Ｕｍｉｘ及び拡大肝実質細胞は共に免疫原性であり、これらは自己ＰＭＢＣに対するバックグラウンド反応よりも有意に強くＴ細胞増殖を刺激する。更に、拡大肝実質細胞は、Ｕｍｉｘ細胞よりも有意に免疫原性であり、精製Ｔ細胞を直接的に刺激しており、ここから、拡大肝実質細胞（又はその亜集団）が抗原提示細胞として機能し得ることが示唆される。一方、Ｕｍｉｘ細胞は、反応細胞であるＰＭＢＣと比較して精製Ｔ細胞への刺激が弱く、ここから、Ｕｍｉｘ細胞はＡＰＣとして機能せず、反応を刺激するためにＰＢＭＣ集団からＡＰＣの助けを必要とすることが示唆される。
【００３２】
これらのデータは、両細胞集団（Ｕｍｉｘ及び拡大肝実質細胞）は、無処理免疫系を有する同種異系レシピエントに移植されたときに、Ｔ細胞の反応を誘導する傾向にあることを示唆している。拡大肝実質細胞集団は、インビボではＵｍｉｘ細胞よりも強い免疫応答を誘導すると予測される。
【００３３】
成体肝幹細胞／肝前駆細胞は、自己ＰＭＢＣ対するバックグラウンド反応よりも有意に強いＴ細胞増殖への刺激は認められなかったことから、免疫原性では無いと考えられる。同様に、成体肝幹細胞／肝前駆細胞は、自己ＰＭＢＣに対するバックグラウンド反応よりも有意に強くＴ細胞の増殖を抑制しなかったことから、免疫抑制性ではない。最後に、結果からは、成体肝幹細胞／肝前駆細胞（ＥｐＣＡＭ陽性細胞）は、ＭＨＣ分子を全く又は殆ど発現せず（おそらくクラスＩＩはなし）、共起刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現は殆ど見られないことが示唆されている。したがって、成体肝幹細胞／肝前駆細胞（ＥｐＣＡＭ陽性細胞）は、同種異系細胞移植の候補としてふさわしいと考えられる。
【００３４】
実際、ＥｐＣＡＭ、Ａｌｂ及びＣＫ１９の発現により定義される成体由来ヒト肝幹細胞／肝前駆細胞は、免疫特権肝細胞治療薬として有用である。成体由来ヒト肝幹細胞／肝前駆細胞を用いるインビボ異種移植生存アッセイでは、従来サイト（即ち非免疫特権サイト）に移植してもよく、例えば、確立された技術を用いて腎臓皮膜下に移植してもよい。望ましくは、同数の成体由来成熟肝実質細胞をコントロールの動物に移植する。
【００３５】
レシピエントマウスの側腹部に皮膚切開を行い、筋肉壁（muscle wall）を切開し、そして腎臓を露出させた。腎臓と腎皮質との間の被膜下にポケットを形成し、このポケットに移植に用いる細胞を配置した。この腎臓を腹腔内に再配置し、クリップで皮膚を閉じた。インビボでの移植片生存評価は、手術用顕微鏡を用いて移植後の所定の時間において目視検査により行った。移植片の外見（例えば、壊死）及び血管の内殖を経時変化（例えば、１時間、１、７、１４、２１、２８日）で評価した。
【００３６】
加えて、腎臓被膜下に配置した移植片の凍結切片の同様の経時変化について、ＣＤ４５の組織化学的研究を行っても良い。ＣＤ４５抗原は、チロシンホスファターゼであり、白血球共通抗原（ＬＣＡ）としても知られている。ＣＤ４５は、赤血球系細胞、血小板及びこれらの前駆細胞を除く全ての造血起源ヒト細胞に存在する。ＣＤ４５分子は、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化に必要とされ、細胞の活性化状態に応じて少なくとも５つのアイソフォームで発現する。一般的に、移植サイトにＣＤ４５＋細胞の蓄積がないことは、ホストによる免疫応答がないことを示し、移植された細胞が非免疫原性であるという概念を支持するものである。成体ヒト肝幹細胞／肝前駆細胞の移植では、このような結果が予測される。反対に、成体由来成熟肝実質細胞を移植したコントロール（対照）マウスでは、移植細胞の壊死、血管内殖不良、及びＣＤ４５＋細胞の蓄積として、強い免疫応答が示された。
【００３７】
このように、実質的に非免疫原性である肝幹細胞を肝機能障害治療に使用することにより、代表的な免疫抑制剤の必要性を大幅に又は完全に低減することができる。したがって、肝幹細胞は、病変又は機能不全肝臓組織を哺乳類患者において再増殖させ、これにより失われた肝機能を一部で回復させることができる。
【００３８】
実験室において、この能力は、例えば、メスＢａｌｂ／ｃマウス（８〜１２週齢）を用い、催奇形物質（例えば、ＣＣｌ４）を体重１ｋｇあたり１ｍＬ、肝障害を誘導するために１週間に２回、計８回にわたり注射して測定する。このマウスで、アラニントランスアミナーゼの血液化学検査を、処理期間を肝障害が示されるまでに設定して行った。未処理コントロールマウスと比較する酵素レベル評価は、試験に供する前の動物で行う。レシピエントマウスへの成体ヒト肝幹細胞の移植は、脾臓内注射により行う。
【００３９】
種々の投与量の細胞を、好ましくは、最大用量を１０６ｃｅｌｌｓ／マウスとして、各条件下で１０体の動物のコホートに移植する。肝機能の改善を判定基準（アラニントランスアミナーゼ、アルブミン、総タンパク質量、コレステロール及びトリグリセリド）から明らかとするために、動物の経時変化をモニタリングする。尚、研究の間に障害の兆候を示した動物は安楽死させ、死亡をエンドポイントとしなかった。
【００４０】
したがって、各移植条件下の５つのグループの動物を、移植４及び１６週間後に安楽死させる。その後、臓器を回収する。回収する臓器は、肝臓、腎臓、脳、心臓、肺、及び脾臓である。また、ルーチンの血液化学検査及びＣＢＣ用に血清標本を得た。同様に、臓器で免疫組織化学検査、Ｈ＆Ｅ染色、及びＲＮＡ分析を行った。標本は、抗体で染色し、移植細胞のマーカーを検出する（抗β-ガラクトシダーゼ抗体）。
【００４１】
或いは、Ｙ染色体を検出するＦＩＳＨ分析を行って、移植オス細胞の同定を行う。連続切片で肝臓タンパク質（肝臓中）の発現をモニターし、ＤＡＰＩ染色を行って細胞の倍数性を測定した（細胞融合の可能性を評価するため）。脾臓、腎臓、脳、肺、心臓の連続切片は、肝臓外での移植細胞を実証するためのものである。
【００４２】
他のアプローチとして、成体ヒト肝幹細胞をＡｐｏＥ欠損マウスに移植してもよい。簡単に説明すると、Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ変異のホモ結合であるマウスは、年齢又は性別に影響されないで総血漿コレステロールレベルの顕著な増加を示す。３月齢において、近位大動脈内の脂肪線条が見られる。病変部は年齢と共に増加し、そして前動脈硬化性病変の更に進行した段階において典型的で脂質が少なく細長い細胞を伴った病変に進行する。この変異を有する混合Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９の遺伝的背景のマウスにおいて、トリグリセリドレベルの中程度の増加が報告されている。老年期のＡｐｏＥ欠損マウス（＞１７月齢）では、脳において主として結晶性コレステロール裂、脂質球、及び泡沫細胞からなる黄色腫性病変が進行することが示されている。より小さな黄色腫が、脈絡叢及び腹側脳弓において認められた。最近の研究では、ＡｐｏＥ欠損マウスでは、ストレス応答の変化、空間学習及び記憶への障害、長期増強現象の変化、及びシナプスの損傷が見られることが示されている。
【００４３】
このマウスを、脾臓内注射により成体ヒト肝幹細胞を４〜６週齢ホモ接合Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃマウスに移植するためのホストとして用いてもよい。このレシピエントグループは、次の各グループにおいて動物を５体含むこととしてもよい。グループ１は、コントロールとして生理食塩水を注射し、細胞は注射せず、グループ２は、１×１０６個のヒト肝細胞、グループ３は、２×１０６個のヒト肝細胞、グループ４は、５×１０５個のヒト肝細胞、そして、グループ５は、１×１０６個のヒト成熟肝実質細胞とする。移植実験では、歴史的対照から約１５％の死亡率が予測される。
【００４４】
移植後の経時変化によるエンドポイント分析では、ＡｐｏＥが含まれる（ウエスタンブロット分析により、２、４、８、１２週の時点で分析）。欠損マウスにおいて成体ヒト肝幹細胞移植後にＡｐｏＥが検出されたことから、これらの細胞は、レシピエントの免疫抑制を伴わない肝機能の再構築に使用可能であるとの概念が支持される。
【００４５】
本発明は、その具体的な実施形態と関連させて記載したが、これを更に変更可能であることは理解され得るものであり、また、この出願は、本発明の如何なる変形、使用又は改変をも含むことを意図していると理解されるものである。一般的に、本発明の原理は、本発明の属する技術分野において知られる又は慣行されるような本開示からの逸脱、及びこれまでに開示され又は特許請求の範囲において示される本質的特徴に適用し得る逸脱をも包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】同定肝細胞集団に対する未分画ＰＢＭＣの反応を示す図である。
【図２】同定肝細胞集団に対する精製Ｔ細胞の反応を示す図である。
【図３】同定細胞集団で行った混合リンパ球反応アッセイの結果を示す図であり、（Ａ）はＰＢＭＣ反応、（Ｂ）は精製Ｔ細胞反応を示す。
【図４】ＥｐＣＡＭ陽性肝細胞に対する精製Ｔ細胞の反応を示す図である。
【図５】ＥｐＣＡＭ陽性肝細胞に対する他の精製Ｔ細胞反応を示す図である。
【図６】ＥｐＣＡＭ陽性肝細胞に対する更に他の精製Ｔ細胞反応を示す図である。
【図７】ＥｐＣＡＭ陽性肝細胞に対する更に他の精製Ｔ細胞反応を示す図である。
【図８】ＥｐＣＡＭ陽性細胞による混合リンパ球反応の抑制を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の肝臓コンパートメントを再増殖させる方法であって、
（ａ）分離非免疫原性肝前駆細胞を用いること、及び
（ｂ）前記分離肝前駆細胞を、免疫抑制量の免疫抑制剤の非存在下で前記哺乳類の肝臓コンパートメントに導入すること
を含んで構成される方法。
【請求項２】
前記分離肝前駆細胞は、移植又は注射により導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫抑制量未満の免疫抑制剤が、前記哺乳類に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫抑制量未満は、前記哺乳類の体重１ｋｇあたりの免疫抑制剤が約１０ｍｇ未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫抑制量未満は、前記哺乳類の体重の１ｋｇあたりの免疫抑制剤が約５ｍｇ未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫抑制量未満は、前記哺乳類の体重の１ｋｇあたりの免疫抑制剤が約３ｍｇ未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫抑制量未満は、前記哺乳類の体重の１ｋｇあたりの免疫抑制剤が約０．１ｍｇ未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫抑制剤は、プレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリン、及びミコフェノール酸からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類は、ヒト以外の哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒトは、同種異系レシピエントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記同種異系レシピエントは、免疫低下しておらず、免疫特権も持たない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離非免疫原性肝前駆細胞は、更に非免疫抑制性であると特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離非免疫原性肝前駆細胞は、ＥｐＣＡＭ発現陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
哺乳類の肝臓コンパートメントを再増殖させる方法であって、
（ａ）分離非免疫原性肝前駆細胞を用いること、及び
（ｂ）前記分離肝前駆細胞を、免疫抑制量の免疫抑制剤の非存在下で前記哺乳類の肝臓コンパートメントに導入すること
を含んで構成される方法。
【請求項２】
前記分離肝前駆細胞は、移植又は注射により導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫抑制量未満の免疫抑制剤が、前記哺乳類に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫抑制量未満は、前記哺乳類の体重１ｋｇあたりの免疫抑制剤が約１０ｍｇ未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫抑制量未満は、前記哺乳類の体重の１ｋｇあたりの免疫抑制剤が約５ｍｇ未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫抑制量未満は、前記哺乳類の体重の１ｋｇあたりの免疫抑制剤が約３ｍｇ未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫抑制量未満は、前記哺乳類の体重の１ｋｇあたりの免疫抑制剤が約０．１ｍｇ未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫抑制剤は、プレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリン、及びミコフェノール酸からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類は、ヒト以外の哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒトは、同種異系レシピエントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記同種異系レシピエントは、免疫低下しておらず、免疫特権も持たない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離非免疫原性肝前駆細胞は、更に非免疫抑制性であると特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離非免疫原性肝前駆細胞は、ＥｐＣＡＭ発現陽性である、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５２１４５９（Ｐ２００９−５２１４５９Ａ）
【公表日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４７５０５（Ｐ２００８−５４７５０５）
【出願日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４８６５０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７５８１２
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０５０２４０１７）ヴェスタ セラピューティクス，インコーポレーテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４８６５０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７５８１２
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０５０２４０１７）ヴェスタ セラピューティクス，インコーポレーテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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