肺感染症および敗血症を防止および処置するための表面活性タンパク質−Ｄ
表面活性タンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）は、肺の上皮細胞において発現する、コラーゲン性のレクチンドメイン含有タンパク質のコレクチンファミリーのメンバーである。ＳＰ−Ｄタンパク質またはそのフラグメントの投与は、敗血症または肺感染を防止または処置するために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府援助のＲ＆Ｄに関する言及）
本明細書中に開示される本発明のいくつかの態様がＮＩＨ（国立衛生研究所）補助金番号ＨＬ６３３２９のもとでの合衆国政府の援助によりなされた。合衆国政府は本発明のこれらの態様において一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、生物学的に活性なタンパク質およびその医薬的使用の分野に関連する。より具体的には、本発明は、ＳＰ−Ｄタンパク質、および、敗血症を防止または処置するための個体へのその投与に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
肺の表面活性物質は肺における正常な肺力学およびガス交換のために不可欠である。肺の表面活性物質はＩＩ型上皮細胞によって産生され、肺における表面張力を低下させる表面活性物質の能力を与えるリン脂質成分から構成される。加えて、コラーゲン性のレクチンドメイン含有ポリペプチドであるコレクチンと呼ばれる表面活性物質と会合するタンパク質がいくつか存在する。これらの表面活性タンパク質の１つ、すなわち、表面活性タンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）と呼ばれる表面活性タンパク質が、表面活性物質の構造および機能ならびに宿主防御に関与していると考えられる。
【０００４】
敗血症は、血流における甚だしい細菌感染から生じる高レベルの細菌エンドトキシンによって典型的には引き起こされる重篤な、多くの場合には命を脅かす疾患である。敗血症は、多くの体組織（例えば、腎臓、肝臓、膀胱および皮膚など）から生じ得る一方で、肺における初期感染に由来することが多い。
【０００５】
どのような年齢の個体であっても、敗血症に罹る可能性がある。幼児は、その免疫系が未成熟であるために、敗血症に特に罹りやすい。例えば、低出産体重児（１５００ｇ未満）はしばしば、重篤な全身性の感染症（Ｋａｕｆｍａｎ他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１７：６３８〜６８０；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、および、敗血症に関連したショックを経験し、これらは、子宮内での絨毛性羊膜炎および出生後の肺感染症にさらされることによってよく起こる（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ他（２０００）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４２：１５００〜１５０７；Ｗｅｎｓｔｒｏｍ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１７８：５４６〜５５０；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。その未成熟のために、早産新生児の肺は非常に透過性であり、タンパク質、生物、毒素および媒介因子が肺から全身循環に漏れることを許している（Ｐｒｉｎｇｌｅ他（１９８６）、Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、２９：５０２〜５１３；Ｊｏｂｅ他（１９８５）、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、５８：１２４６〜１２５１；Ｂｌａｎｄ他（１９８９）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、８４：５６８〜５７６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。新生児敗血症症候群は、肺炎および絨毛性羊膜炎に関連する場合、満期児および早産児の両方における新生児の発病および死亡の一般的な原因である（Ｋａｕｆｍａｎ他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１７：６３８〜６８０；Ｄｅｍｐｓｅｙ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔａｌ、２２：１５５〜１５９；Ｊｉａｎｇ他（２００４）、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ、３７：３０１〜３０６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。以前の研究では、全身的炎症が、早産新生児の子ヒツジにおいて、気管内リポ多糖（ＬＰＳ）が全身循環に漏れることによって引き起こされた（Ｋｒａｍｅｒ他（２００２）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０００６】
肺感染および全身的感染に対する新生児の罹りやすさは、その肺構造および免疫系の両方が未成熟であることに関連している。早産児の肺は、表面活性タンパク質（ＳＰ）ＡおよびＤを含めて、肺の表面活性タンパク質および生得的な宿主防御タンパク質が不十分である（Ｍａｓｏｎ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７５：Ｌ１〜Ｌ１３；Ｍｉｙａｍｕｒａ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１２１０：３０３〜３０７；Ａｗａｓｔｈｉ他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：９４２〜９４９１０〜１２；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。新生児における呼吸困難のために使用される表面活性物質代償調製物はＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃを含有するが、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄまたは他の生得的な宿主防御タンパク質を含有しない。肺のコレクチンが、ウイルス病原体、細菌病原体および真菌病原体から肺を守ることにおいて重要な役割を果たしている。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄはともに抗菌活性および抗炎症活性を有する（Ｍａｓｏｎ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７５：Ｌ１〜Ｌ１３；Ｃｒｏｕｃｈ他（２００１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、６３：５２１〜５５４；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄの低下したレベルが、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）のモデルにおける肺の炎症（Ａｗａｓｔｈｉ，Ｓ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：９４２〜９４９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に、また、嚢胞性線維症の小児における肺の炎症（Ｎｏａｈ他（２００３）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６８：６８５〜６９１；Ｐｏｓｔｌｅ他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：９０〜９８；ｖｏｎ Ｂｒｅｄｏｗ他（２００３）、Ｌｕｎｇ、１８１：７９〜８８；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）に関連しており、そのような肺の炎症は疾患の病理発生に影響を及ぼす可能性があり、敗血症を引き起こす可能性がある。
【０００７】
敗血症に対する個体の罹りやすさを低下させる方法、および、敗血症を処置する方法、具体的には、典型的には肺に天然に存在する免疫関連タンパク質の投与の使用によるそのような方法は、敗血症についての危険性があるすべての年齢の患者を処置するために有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、一般には、患者における肺感染および敗血症を防止および処置するための方法、および、ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントあるいはその組換え形態を含有する組成物に関連する。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態において、個体における敗血症を防止または処置する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。個体は、例えば、哺乳動物であり得、ヒトであり得る。個体は、例えば、成人、小児、幼児、新生または早産新生児であり得る。投与は、例えば、気管内投与、エアロゾル化または全身投与によって行うことができる。敗血症は、例えば、細菌感染症または肺感染症に由来し得る。ポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。組換えポリペプチドは、例えば、組換えヒト表面活性タンパク質Ｄであり得る。ポリペプチドは、例えば、体重１ｋｇあたり約０．５０ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇのポリペプチドから、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇのポリペプチドの範囲で投与することができる。ポリペプチドは、例えば、体重１ｋｇあたり約２ｍｇのポリペプチドで投与することができる。ＳＰ−Ｄ配合物は、例えば、気管内投与、エアロゾル化または全身投与によって投与することができ、気管内投与、エアロゾル化または全身投与のために好適な形態であり得る。組換えポリペプチドは約５個のアミノ酸〜約３７５個のアミノ酸のアミノ酸配列を有することができる。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態において、個体における敗血症を防止または処置する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸を個体に投与することによる方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態において、個体におけるリポ多糖（ＬＰＳ）の血漿への漏出を低下させる方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態において、個体における大腸菌細胞の血漿への漏出を低下させる方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態において、個体における血漿中のエンドトキシンレベルを低下させる方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、肺からのエンドトキシンの放出を阻害する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを投与することによる方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態において、気管内エンドトキシンの全身的影響から個体を保護する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、全身的炎症を防止する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。全身的炎症は、例えば、肺からのエンドトキシンの放出によって引き起こされ得る。
【００１７】
本発明のなおさらなる実施形態において、肺感染症の個体を処置するための方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントを投与することによる方法が提供される。肺感染症は、例えば、細菌によって引き起こされ得る。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントを投与することによって、敗血症の危険性が低下するように、肺感染症の個体を処置するための方法が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはその活性なフラグメントを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物におけるＳＰ−Ｄポリペプチドは、例えば、組換えＳＰ−Ｄポリペプチドであり得る。組換えＳＰ−Ｄポリペプチドは、例えば、組換えヒトＳＰ−Ｄポリペプチドであり得る。ＳＰ−Ｄポリペプチドは、例えば、配列番号２または配列番号３に示される配列を含むことができる。さらに、ＳＰ−Ｄポリペプチドを含む医薬組成物は、例えば、医薬的に許容され得る分散化剤をさらに含むことができる。医薬組成物は、例えば、気管内投与、エアロゾル化または全身投与のために配合することができる。医薬組成物はまた、ＳＰ−Ｄポリペプチドが、例えば、体重１ｋｇあたり約０．５０ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇのポリペプチドから、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇのポリペプチドの範囲で投与されるように配合することができる。医薬組成物は、ＳＰ−Ｄポリペプチドが、例えば、体重１ｋｇあたり約２ｍｇのポリペプチドで投与されるように配合することができる。
【００２０】
本発明の他の実施形態において、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはその活性なフラグメントをコードする核酸を含有する医薬組成物が提供される。核酸は、例えば、配列番号１に示される配列を含むことができる。核酸はまた、例えば、アデノウイルスベクター内にコードされ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
肺は、吸入された粒子および微生物によって絶えず攻撃されており、それにもかかわらず、肺は著しく健康なままである。これは、大部分が、肺のコレクチン、表面活性タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）および表面活性タンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）によるものである（Ｋｉｎｇｍａ，Ｐ．Ｓ．およびＪ．Ａ．Ｗｈｉｔｓｅｔｔ（２００６）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６：２７７〜８３；Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．およびＪ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ（２００１）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、６３：５２１〜５４；Ｈａｗｇｏｏｄ，Ｓ．およびＦ．Ｒ．Ｐｏｕｌａｉｎ（２００１）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、６３：４９５〜５１９；Ｗｈｉｔｓｅｔｔ，Ｊ．Ａ．（２００５）、Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｎａｔｅ、８８：１７５〜８０；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄの炭水化物認識ドメインと、生物表面の炭水化物成分との間における相互作用によって感染性生物を認識し、感染性生物と結合し、このことはさらには、肺胞のマクロファージによる感染性病原体のクリアランスを容易にする（Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｕ．他（１９９６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、３１８：５０５〜５１１；Ｌｉｍ，Ｂ．Ｌ．他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０２：１６７４〜８０；Ｋｕａｎ，Ｓ．Ｆ．他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄ遺伝子の標的化された欠失を有するマウス（Ｓｆｐｔｄ−／−）は、徐々に悪化する肺気腫および炎症を発症し、このことは、感染性粒子と結合することに加えて、ＳＰ−Ｄが、肺の宿主防御細胞を調節することにおいて重要な役割を有し得ることを示している（Ｋｏｒｆｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｒ．他（１９９８）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：２８４３８〜２９４４３；Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．他（２０００）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７：５９７２〜７；Ｃｌａｒｋ，Ｈ．他（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：２８９２〜２８９９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。肺の免疫系におけるその役割の結果として、ＳＰ−Ｄは、肺における微生物の成長およびその結果として生じた肺の損傷を制限するために設計された治療剤として開発中である。呼吸樹に加えて、ＳＰ−Ｄはまた、より低い濃度で血漿および多くの他の肺以外の組織（血管内皮細胞を含む）でも検出される（Ｓｔａｈｌｍａｎ，Ｍ．Ｔ．他（２００２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、５０：６５１〜６０；Ｈｏｎｄａ，Ｙ．他（１９９５）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１５２：１８６０〜６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｈ２２８６〜Ｈ２２９４；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄの肺外レベルは、肺内ＳＰ−Ｄと類似する様式で感染時および他の炎症状態の期間中において増大する（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７；Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ．他（２００５）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、３１：２５〜３３；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。しかしながら、肺外ＳＰ−Ｄの供給源および機能は大部分が不明である。本明細書中に記載されるように、予備的研究において、ＳＰ−Ｄは、肺のシステムを越えて宿主防御にも関与し、肺以外のシステムでは感染性病原体を排除することができ、また、宿主防御細胞を調節することができることが示される。
【００２２】
ＳＰ−Ｄは、生得的な免疫分子のコレクチンファミリーの多量体糖タンパク質であり、気道上皮細胞によって分泌される。ＳＰ−Ｄは、細菌、ウイルス、真菌およびダニ抽出物を含めて、広範囲の様々な微生物病原体に結合し、これらを凝集させ（Ｋｕａｎ他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；Ｌｉｍ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０２：１６７４〜１６８０；ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４５４：２６１〜２６９；Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｌ７５３〜Ｌ７６２；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）、また、細菌成分（例えば、ＬＰＳ、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸など）に直接的に結合する（Ｃｒｏｕｃｈ他（２００１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、６３：５２１〜５５４；ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｋ．他（２００４）、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７１：１２２９〜１２４９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。多量体形態のＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄが種々の微生物の表面でリガンドに結合して、それにより、微生物の凝集を誘導し、肺の病原体の免疫細胞媒介による認識およびクリアランスを刺激する微生物間のタンパク質架橋を形成することを可能にする（Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ，Ｋ．他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｌ７５３６２；Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ，Ｋ．Ｌ．他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９５８〜Ｌ９６９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。これらの微生物または微生物成分と相互作用することにより、ＳＰ−Ｄは、肺胞のマクロファージの活性化を阻害することによって、肺の感染またはＬＰＳにより誘導される炎症を制限する（Ｋｕａｎ他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；Ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ，Ｂ．Ａ．他（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ、２５：Ｓ６５６；ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ，Ｂ．Ａ．他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４５４：２６１〜９；Ｓｃｈａｕｂ，Ｂ．他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３４：１８１９〜２６；Ｌｉｕ，Ｃ．Ｆ．他（２００５）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３５：５１５〜５２１；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００２３】
ほとんどの微生物リガンドがマンノースまたはグルコースを含有しており、ＳＰ−Ｄは、イノシトール、マルトース、マンノースおよびグルコースに優先的に結合することが知られている。ＳＰ−Ａとは異なり、ＳＰ−Ｄは脂質Ａドメインに結合せず（Ｖａｎ Ｉｗａａｒｄｅｎ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、３０３（Ｐｔ２）：４０７〜４１１；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、しかし、ＬＰＳの連続したコアオリゴ多糖に結合する（Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１７７〜２０１；Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４０８：２７８〜２８９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。そのうえ、ＳＰ−Ｄの最大の分子寸法はＳＰ−Ａよりも５倍大きく、ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ａよりも大きい結合表面を有する（Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１７７〜２０１；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００２４】
ＳＰ−ＤはそのＣ末端のレクチン様ドメインを介して大腸菌属の表面に結合する。さらに、ＳＰ−Ｄが病原体に結合することにより、肺の食細胞による病原体の殺傷が促進される（Ｍａｓｏｎ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７５：Ｌ１〜Ｌ１３；Ｃｒｏｕｃｈ他（２００１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、６３：５２１〜５５４；Ｋｕａｎ他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；Ｌｉｍ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０２：１６７４〜１６８０；ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４５４：２６１〜２６９；Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１７７〜２０１；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄを欠失するマウス（Ｓｆｔｐｄ−／−マウス）は肺の感染および炎症に非常に罹りやすい（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００２５】
ＳＰ−Ｄは肺胞のマクロファージを調節する
感染性生物と結合することはＳＰ−Ｄ生理学の重要な特徴であるが、ＳＰ−Ｄ欠損のマウスモデルにより、肺の宿主防御におけるこのタンパク質のより複雑な役割が明らかにされた。Ｓｆｔｐｄ遺伝子の欠失を有するマウスは正常に生存したが、高まった表面活性脂質プールサイズを有し、肺の炎症および気腔の拡張を自然発症した（Ｋｏｒｆｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｒ．他（１９９８）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：２８４３８〜２９４４３；Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．他（２０００）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７：５９７２〜７；Ｃｌａｒｋ，Ｈ．他（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：２８９２〜２８９９）。ベースライン状態での肺胞のマクロファージ活性が、反応性酸素化学種およびメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を放出したアポトーシス性マクロファージおよび肥大した泡沫状マクロファージの増大した数によって明らかであるように、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは上昇する。ウイルス病原体（インフルエンザＡおよび呼吸器合胞体ウイルスを含む）の取り込みおよびクリアランスがＳｆｔｐｄ−／−マウスでは不十分であった（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３）。対照的に、Ｂ群連鎖球菌属およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）のクリアランスは変化しなかった（ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（２０００）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：３９３４〜３９４０；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。しかしながら、酸素ラジカルの放出および前炎症性媒介因子（ＴＮＦα、ＩＬ−１およびＩＬ−６）の産生が、ウイルス病原体または細菌病原体のいずれかにさらされたとき、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおいて増大した。このことは、ＳＰ−Ｄがまた、病原体のクリアランスとは無関係である感染性攻撃の間に肺胞のマクロファージを調節することにおいて重要な役割を果たすことを示している（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（２０００）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：３９３４〜３９４０）。
【００２６】
肺において、ＳＰ−Ｄは肺胞のＩＩ型上皮細胞および他の非線毛性細気管支上皮細胞によって産生され、肺胞のマクロファージおよびＩＩ型細胞によって除かれる（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９２）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６３：Ｌ６０〜Ｌ６６；Ｖｏｏｒｈｏｕｔ，Ｗ．Ｆ．他（１９９２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、４０：１５８９〜９７；Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５：１３〜１８；Ｄｏｎｇ，Ｑ．およびＪ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ（１９９８）、Ｊ．Ｒ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９７〜１０５；Ｈｅｒｂｅｉｎ，Ｊ．Ｆ．他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７８：Ｌ８３０〜Ｌ８３９；Ｋｕａｎ，Ｓ．Ｆ．他（１９９４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０：４３０〜４３６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。肺外ＳＰ−Ｄの供給源、および、血漿中のＳＰ−Ｄレベルを制御する機構はこれまで不明である。血漿に存在するＳＰ−Ｄは、肺以外で産生される可能性があり、また、ＳＰ−Ｄの全身的レベルの制御が、全身的な発現経路の活性化によるか、または、全身的なＳＰ−Ｄクリアランスを変化させることによるかのいずれかで行われる可能性がある。
【００２７】
ＳＰ−Ｄはいくつかの免疫細胞シグナル伝達経路に関わっている。ＳＰ−Ｄは、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）と、ＣＤ１４におけるＮ結合型オリゴ糖との間での相互作用を介してＬＰＳ受容体のＣＤ１４と結合する（Ｓａｎｏ，Ｈ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：２２４４２〜２２４５１；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄはまた、ＣＤ１４と、ＬＰＳの滑面形態および粗面形態の両方との間での相互作用を阻害する（Ｓａｎｏ，Ｈ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：２２４４２〜５１）。加えて、ＣＤ１４受容体のレベルが、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスから得られた肺胞マクロファージの表面では低下し、これに対して、可溶性ＣＤ１４のレベルが増大する（Ｓｅｎｆｔ，Ａ．Ｐ．他（２００５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４：４９５３〜４９５９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。可溶性ＣＤ１４のレベルが、ＭＭＰ−９遺伝子またはＭＭＰ−１２遺伝子の標的化された欠失を有するＳｆｔｐｄ−／−マウスでは野生型のレベルに戻った。このことは、ＳＰ−Ｄが、ＣＤ１４受容体のレベルを、受容体のＭＭＰ−９媒介またはＭＭＰ−１２媒介によるタンパク質分解的切断を阻害することによって制御することを示唆している（Ｓｅｎｆｔ，Ａ．Ｐ．他（２００５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４：４９５３〜４９５９）。
【００２８】
ＳＰ−Ｄは、ＬＰＳ、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸に対する炎症性応答を開始することに関与するｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−２およびＴＬＲ−４の細胞外ドメインと結合する（Ｏｈｙａ，Ｍ．他（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：８６５７〜８６６４；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−ＡはペプチドグリカンによるＴＬＲ−２の活性化を阻害する（Ｓａｔｏ，Ｍ．他（２００３）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１１：４１７〜２５；Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｓ．他（２００２）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７：６８３０〜７；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）が、ＴＬＲ−２またはＴＬＲ−４のシグナル伝達に対するＳＰ−Ｄの影響は現在不明である。
【００２９】
Ｇａｒｄａｉらは、ＳＰ−Ｄが、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）およびカルレチクリン／ＣＤ９１の相反する作用を介して肺における抗炎症性プロセスおよび前炎症性プロセスを同時に媒介するかもしれないモデルを提案した（Ｇａｒｄａｉ，Ｓ．Ｊ．他（２００３）、Ｃｅｌｌ、１１５：１３〜２３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。Ｇａｒｄａｉらのモデルでは、結合していない状態において、ＳＰ−ＤのＣＲＤが、マクロファージの活性化を、ＮＦκＢのＰ３８媒介による活性化を阻害するＳＩＲＰαに結合することによって阻害することが示される。対照的に、ＳＰ−ＤのＣＲＤが微生物のリガンドによって占有されるならば、ＳＩＲＰαに結合することが阻害され、コレクチンがマクロファージ活性化受容体のカルレチクリン／ＣＤ９１に結合する。カルレチクリン／ＣＤ９１はその後、前炎症性媒介因子を誘導し、かつ、肺胞のマクロファージを活性化するＮＦκＢのＰ３８媒介による活性化を刺激する。従って、ＣＲＤにおける感染性粒子の存在または不在、ならびに、結合した受容体のタイプに依存して、ＳＰ−Ｄは炎症の強化または抑制のいずれかをもたらすことができる。
【００３０】
ＳＰ−Ｄは、酸化剤感受性経路を介してＮＦκＢの活性に影響を及ぼす（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６６：７５１４〜９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスから得られた肺胞のマクロファージは、増大した量の過酸化水素を産生する。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおける反応性酸素化学種の増大には、組織脂質ペルオキシドおよび反応性カルボニルをはじめとする酸化ストレスのマーカーにおける増大が伴い、これはさらには、ＮＦκＢを活性化し、ＭＭＰの産生を増大させた。
【００３１】
ＳＰ−Ｄはまた、細菌抗原のＭＨＣクラスＩＩ提示およびその後のＴ細胞の活性化に影響を及ぼす（Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。興味深いことに、ＳＰ−Ｄは骨髄由来の樹状細胞による抗原提示を高め、これに対して、肺の樹状細胞による抗原提示が阻害された。これらの結果は、全身的な宿主防御細胞に対するＳＰ−Ｄの影響、および、全身的ＳＰ−Ｄにより調節されるシグナル伝達経路が、肺において認められるものとは異なり得ることを示している。
【００３２】
ＳＰ−Ｄの発現
ＳＰ−Ｄは、ヒト第１０染色体上のＳＰ−Ａ遺伝子の非常に近くに位置する１つだけの遺伝子（Ｓｆｔｐｄ）によってコードされる（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９３）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６８：２９７６〜８３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄが肺において最初に認められ、主に呼吸器のＩＩ型上皮細胞および他の非線毛性細気管支上皮細胞によって発現される（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９２）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６３：Ｌ６０〜Ｌ６６；Ｖｏｏｒｈｏｕｔ，Ｗ．Ｆ．他（１９９２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、４０：１５８９〜９７；Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５：１３〜１８；Ｄｏｎｇ，Ｑ．およびＪ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ（１９９８）、Ｊ．Ｒ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９７〜１０５；Ｈｅｒｂｅｉｎ，Ｊ．Ｆ．他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７８：Ｌ８３０〜Ｌ８３９；Ｋｕａｎ，Ｓ．Ｆ．他（１９９４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０：４３０〜４３６）が、ＳＰ−ＤのｍＲＮＡおよびタンパク質が多くの肺以外の組織において検出される。ＳＰ−Ｄの免疫染色が、血管内皮、ならびに、耳下腺、汗腺、涙腺、皮膚、胆嚢、胆管、膵臓、胃、食道、小腸、腎臓、副腎皮質、下垂体前葉、子宮頸管腺、精嚢および尿路の上皮細胞において検出される（Ｓｔａｈｌｍａｎ，Ｍ．Ｔ．他（２００２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、５０：６５１〜６６０；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｈ．およびＲ．Ｍａｓｏｎ（１９９５）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１２：１３〜１８；Ｍｏｔｗａｎｉ，Ｍ．他（１９９５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５５：５６７１〜５６７７；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−ＤのｍＲＮＡの肺外レベルが炎症に応答して増大し、しかし、その肺外レベルは、肺で検出されるｍＲＮＡレベルよりも数倍低く、このことは、異なる機構が肺外対肺内のＳｆｔｐｄ発現を制御することを示している（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７）。
【００３３】
ＳＰ−ＤのｍＲＮＡが妊娠中期のマウスまたはラットの肺において最初に検出され、出生前および新生児期の間において増大する（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５：１３〜１８）。ＳＰ−ＤのｍＲＮＡが、細菌エンドトキシン、吸入微生物および高酸素症によって引き起こされる肺傷害の後で増大する（Ｃａｏ，Ｙ．他（２００４）、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１３：４３９〜４４４；Ｍｃｉｎｔｏｓｈ，Ｊ．Ｃ．他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１５：５０９〜５１９；Ｊａｉｎ−Ｖｏｒａ，Ｓ．他（１９９８）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６６：４２２９〜４２３６；Ａｄｅｒｉｂｉｇｂｅ，Ａ．Ｏ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：２１９〜２２７；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。マウスのＳｆｔｐｄプロモータは、ＡＰ−１ファミリー、フォークヘッド転写因子（ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＡ２）、甲状腺転写因子（ＴＴＦ）−１、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）についてのコンセンサスな転写因子結合配列、ならびに、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）についての多数の部位を含有する（Ｌａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：９５３〜９６３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＡＰ−１ファミリーに含まれるタンパク質のＪｕｎＢおよびＪｕｎＤはＳｆｔｐｄプロモータ活性を高め、これに対して、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−ＦｏｓはＳｆｔｐｄの転写を阻害した（Ｈｅ，Ｙ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：３１０５１〜３１０６０；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＡ２のコンセンサスな結合部位の欠失は転写を阻害した（Ｈｅ，Ｙ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：３１０５１〜３１０６０）。Ｃ／ＥＢＰはＳｆｔｐｄの転写を活性化する（Ｈｅ，Ｙ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：３１０５１〜３１０６０；Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．他（１９９７）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７２：３６９４〜３６９８；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。Ｃ／ＥＢＰはまた、全身的な急性期応答にも関与し、このことは、全身的なＳＰ−Ｄ発現が、全身的感染に対する生理学的応答の一部であり得ることを示している。ＮＦＡＴもまた、カルシニューリン依存的経路およびＴＴＦ−１との直接的な相互作用を介してＳｆｔｐｄプロモータ活性を促進させる（Ｄａｖｅ，Ｖ．他（２００４）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７９：３４５７８〜３４５８８；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３４】
肺以外の組織におけるＳＰ−Ｄの役割
肺以外の組織におけるＳＰ−Ｄの相対的に低い濃度のために、ＳＰ−Ｄの生理学的役割および治療的可能性の研究は大部分が呼吸樹に限られている。ＳＰ−Ｄが低いレベルでヒト血漿に存在しており、多数の研究では、感染時および／または肺毒物にさらされているときの血漿中のＳＰ−Ｄにおける増大が明らかにされている（Ｈｏｎｄａ，Ｙ．他（１９９５）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１５２：１８６０〜６；Ｋｕｒｏｋｉ，Ｙ．他（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４０８：３３４〜３４５；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｋ．Ｅ．他（２００２）、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ、１９：４３９〜４６；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｋ．Ｅ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：１８４３〜１８５０；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。この増大は、肺からのＳＰ−Ｄの漏出を表すと解釈されており、いくつかのグループが現在、血漿中のＳＰ−Ｄレベルを肺傷害の臨床的バイオマーカーとして使用するための方法を開発中である。しかしながら、これらの研究において肺の傷害および炎症を誘導するために使用された薬剤の多くはまた、全身的な傷害および炎症を誘導する。従って、血漿ＳＰ−Ｄのプールサイズに対する肺供給源対全身的供給源の相対的な寄与は不明である。
【００３５】
羊水および女性の生殖管に存在するＳＰ−Ｄは子宮内感染を防ぐことができる（Ｏｂｅｒｌｅｙ，Ｒ．Ｅ．他（２００４）、Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ、１０：８６１〜８７０；Ｌｅｔｈ−Ｌａｒｓｅｎ，Ｒ．他（２００４）、Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ、１０：１４９〜１５４；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄは涙に存在し、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）による角膜上皮細胞への侵入を阻害する（Ｎｉ，Ｍ．他（２００５）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、７３：２１４７〜２１５６；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。これらの知見は肺外ＳＰ−Ｄについての生理学的目的を示しているが、血漿中のＳＰ−Ｄが全身的な宿主防御細胞を調節することができること、または、全身的な病原体と結合し、そのクリアランスを促進させることができることは今後、明らかにされなければならない。
【００３６】
ＳＰ−Ｄの臨床的適用
肺において、ＳＰ−Ｄは、肺実質の精巧な一体性を維持しながら、侵入途中の病原体のクリアランスを同時に容易にする、肺の感染に対する肺胞のマクロファージによる制御された応答を促進する前炎症的性質および抗炎症的性質の両方を有する。ＳＰ−Ｄの抗炎症的性質により、このタンパク質が、喘息、気管支肺異形成症、嚢胞性線維症、成人呼吸窮迫症候群または慢性的感染に関連する持続した炎症からの損傷を制限し得ることが示される。この指摘の裏付けとして、ＳＰ−Ｄまたは短縮形態のＳＰ−Ｄの投与は、アレルギー性気道過敏性に苦しむマウスにおけるアレルギー性応答を低下させる（Ｌｉｕ，Ｃ．Ｆ．他（２００５）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３５：５１５〜５２１；Ｈａｃｚｋｕ，Ａ．他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３４：１８１５〜１８１８；Ｋａｓｐｅｒ，Ｍ．他（２００２）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３２：１２５１〜１２５８；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３７】
ＳＰ−Ｄ欠損が早産に関連し、人工的な表面活性物質の代償治療が呼吸窮迫症候群の早産児において広く使用される（他の肺疾患における表面活性物質治療の臨床研究が進行中である）が、ＳＰ−Ｄは人工的な表面活性物質の構成成分ではない。マウスモデルでは、ＳＰ−Ｄの欠損が肺の感染に対する増大した感受性をもたらすことが明瞭に明らかにされる（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（２０００）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：３９３４〜３９４０）。ＳＰ−ＤをＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて回復させることにより、肺の微生物クリアランスおよび炎症における欠陥が取り消される（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．他（２００２）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７：３８７０９〜３８７１３；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：２７９〜２８６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。加えて、気管内投与された組換えＳＰ−Ｄは生存を著しく改善し、また、気管内ＬＰＳにさらされた早産新生児ヒツジでのＬＰＳの全身的放出、および、ベンチレータ誘導による肺傷害を低下させる（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｍ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。まとめると、これらの研究から、免疫欠陥または表面活性物質欠損を有する患者における肺感染時の抗菌剤としてのＳＰ−Ｄの潜在的価値が明らかにされる。肺のＳＰ−Ｄレベルが感染に対する生理学的応答の一部として増大することを考慮すると、このプロセスを感染の初期段階の間に外因性ＳＰ−Ｄにより補うことはまた、無傷の免疫系を有する患者に利益をもたらし得る。
【００３８】
肺において、ＳＰ−Ｄは、侵入途中の病原体のクリアランスを促進すること、および、ＬＰＳ誘導による炎症の損傷化影響を制限することに関与する。しかしながら、肺システムの外部での感染が最も臨床的に顕著な発病および死亡の一部を誘導する。先天性肺炎または周産期に罹った肺炎を有する幼児は、効果的な抗生物質処置が出生後直ちに施されたときでさえ、脾臓敗血症および死亡の危険性が高い（Ｋａｕｆｍａｎ他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１７：６３８〜６８０；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ他（２０００）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４２：１５００〜１５０７；Ｗｅｎｓｔｒｏｍ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１７８：５４６〜５５０；Ｄｅｍｐｓｅｙ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ、２２：１５５〜１５９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。早期発症敗血症における先天性肺炎の高い発生率は、感染が、多くの場合、子宮内または出生時の病原体の吸引によって生じることを示している。絨毛羊膜炎は未熟分娩の危険性を増大させ、また、新生児の敗血症および敗血症関連ショックに強く関連する（Ｄｅｍｐｓｅｙ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ、２２：１５５〜１５９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。早産新生児の肺は非常に透過性であり（Ｊｏｂｅ他（１９８５）、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、５８：１２４６〜１２５１；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、肺からの前炎症性媒介因子および生物の全身的拡大を許している（Ｋｒａｍｅｒ他（２００２）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。早産児だけにおいて、出生時の体重が１５００グラム未満である乳児の約の２０％が、病院から退院する前に、全身的感染と診断される（Ｓｔｏｌｌ，Ｂ．Ｊ．他（２００２）、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１１０：２８５〜２９１；Ｂｒｏｄｉｅ，Ｓ．Ｂ．他（２０００）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ、１９：５６〜６５；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。これらの乳児の大部分が、敗血症、感染に対する宿主由来の炎症性応答の臨床的な徴候および症状を発症する（Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ，（１９９６）、Ｊａｍａ、２７６：５６５〜５６６；Ａｎｇｕｓ，Ｄ．Ｃ．他（２００１）、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、２９：１３０３〜１３１０；Ｇｌａｕｓｅｒ，Ｍ．Ｐ．他（１９９１）、Ｌａｎｃｅｔ、３３８：７３２〜７３６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。究極的には、感染と診断された早産児のおよそ２０％のうち、１８％が敗血症のために死亡する（Ｓｔｏｌｌ，Ｂ．Ｊ．他（２００２）、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１１０：２８５〜２９１；Ｂｒｏｄｉｅ，Ｓ．Ｂ．他（２０００）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ、１９：５６〜６５）。
【００３９】
Ｂ群連鎖球菌およびグラム陰性細菌（大腸菌を含む）は、先天性肺炎を一般に引き起こす生物である（Ｓｔｏｌｌ他（２００５）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ、２４：６３５〜６３９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。細菌そのものではなく、むしろ、微生物の毒素およびＬＰＳの全身的拡大により、ショックをもたらす細胞性応答および体液性応答が開始され得る（Ｇｒａｎｄｅｌ他（２００３）、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：２６７〜２９９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。敗血症ショックは、多臓器機能障害、多臓器不全および死を多くの場合にはもたらす複雑な病態生理学的状態である（Ｍｕｒｐｈｙ他（１９９８）、Ｎｅｗ Ｈｏｒｉｚ、６：１８１〜１９３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。血液ｐＨ、血中塩基過剰（ＢＥ）における低下、および、ｐＣＯ２における増大（これらは本研究でのコントロール群において明らかにされた）は、早産児における敗血症ショックの臨床的経過に典型的である。血管収縮、肺高血圧症、臓器循環の悪化、および、代謝性アシドーシスがしばしば、敗血症の存在に関係する。下記で例示される実施例において、本発明者らは、ＳＰ−Ｄが全身的な生得的免疫系の重要な構成要素であり得ることを示し、また、全身的感染を処置することにおけるＳＰ−Ｄの治療的可能性を評価するために、全身的宿主防御におけるＳＰ−Ｄの生理学的機能を明らかにしている。
【００４０】
ＳＰ−Ｄによる処置
外因的に調製されたＳＰ−Ｄは、阻止されないならば、最終的には全身的な敗血症を引き起こし得る様々な疾患（例えば、肺感染症など）を処置するために有用であり得る。ＳＰ−Ｄの投与が個体において敗血症の危険性を低下させ得るかどうかを明らかにするために、早産新生児の子ヒツジに大腸菌由来のリポ多糖エンドトキシンを滴注し、その後、早産新生児の子ヒツジを、本明細書中に記載されるようにＳＰ−Ｄにより処置した。その後、生存率、生理学的な肺機能、肺の炎症および全身的な炎症、ならびに、血漿中のエンドトキシンレベルを評価した。本明細書中に示されるように、気管内の組換えヒト表面活性タンパク質−Ｄ（ｒｈＳＰ−Ｄ）は、早産新生児において換気時に肺から放出されたエンドトキシンによって引き起こされるショックを防止した。加えて、ＳＰ−Ｄ遺伝子を有しないか、または、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的なＳＰ−Ｄ導入遺伝子を発現するか、または、ＳＰ−Ｄの変異型導入遺伝子を発現する遺伝子組換えマウス系統を、このタンパク質の構造／機能研究を可能にするために開発した。本明細書中に示されるように、ＳＰ−Ｄの投与は、全身的ＬＰＳにより誘導される炎症を阻害し、また、盲腸結紮および穿刺における炎症を軽減させる。加えて、ＳＰ−Ｄの投与は、致死量のＬＰＳを投与した後における生存および組織傷害を改善し、血漿ＬＰＳのクリアランス速度を増大させ、また、ＬＰＳの全身的漏出および肺漏出を防止する。従って、ＳＰ−Ｄ処置は、敗血症を処置または防止するために有用であり得る。
【００４１】
子ヒツジにおける実験的研究の結果
組換えヒト表面活性タンパク質−Ｄ（ｒｈＳＰ−Ｄ）を、実施例１に記載されるような全長のヒトＳＰ−ＤをコードするｃＤＮＡによるＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクションによって合成した。ＳＰ−Ｄを、実施例１に記載されるようなイオン交換クロマトグラフィおよびアフィニティ精製を使用して培養培地から単離した。
【００４２】
生物学的に活性な組換えヒトＳＰ−Ｄおよび組換えラットＳＰ−Ｄがインビトロで以前に作製されている（Ｅｒｐｅｎｂｅｃｋ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８８：Ｌ６９２〜６９８；Ｃｌａｒｋ他（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：２８９２〜２８９９；Ｃｌａｒｋ他（２００２）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０５：６１９〜６３１；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。全長の組換えＳＰ−Ｄを本研究では利用した。２ｍｇ／ｋｇのｒｈＳＰ−Ｄの用量を早産の子ヒツジに与えた。１３０ｄのＧＡの子ヒツジ（出産予定日、１５０日）は表面活性物質欠損であり（Ｄｏｃｉｍｏ他（１９９１）、Ａｎａｔ Ｒｅｃ、２２９：４９５〜４９８；Ｉｋｅｇａｍｉ他（１９８１）、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１４１：２２７〜２２９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）、生存するための表面活性物質処置および機械的換気を必要とする。表面活性物質プールサイズが時間とともに変化し、新生児動物において最大であり（Ｉｋｅｇａｍｉ他（１９９３）、Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ、１７：２３３〜２４０；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、時間の進行とともに低下して成体レベルになる（Ｉｋｅｇａｍｉ他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７９：Ｌ４６８〜Ｌ４７６；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。処置のための表面活性物質の臨床的用量は正常な新生児における表面活性物質プールサイズに類似する（Ｉｋｅｇａｍｉ他（１９８０）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ、１４：１０８２〜１０８５；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。満期新生児の肺におけるＳＰ−Ｄの正確な量は不明である。出産間近（１７５ｄのＧＡ）のヒヒ（出産予定日−１８５ｄのＧＡ）におけるＳＰ−Ｄは気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において０．０２ｍｇ／肺であり、肺組織において０．２ｍｇ／肺であった（Ａｗａｓｔｈｉ他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：９４２〜９４９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。出産間近のヒヒは体重が１ｋｇ未満であるので、本研究で使用されたｒｈＳＰ−Ｄの用量（２ｍｇ／ｋｇ）は、満期新生児の子ヒツジについてのＳＰ−Ｄプールサイズよりも少なくとも１０倍高いことが推定された。
【００４３】
処置用の動物を調製するために、予定日前の子ヒツジを、実施例２に記載されるように１３０ｄの在胎齢で帝王切開によって分娩させた。気管内チューブを気管内に結び、過剰な胎児肺液を除いた。肺におけるリポ多糖（ＬＰＳ）の均一な分布を容易にするために、実施例３に記載されるように、０．１ｍｇ／ｋｇの大腸菌由来ＬＰＳを１ｍｌ（２５ｍｇ）のＳｕｒｖａｎｔａと混合し、最初の呼吸の前に子ヒツジに投与し、その後、１０ｍｌの空気を投与した。
【００４４】
その後、子ヒツジを、実施例４に記載されるように、Ｓｕｒｖａｎｔａ単独（コントロール群）、または、ＳｕｒｖａｎｔａおよびｒｈＳＰ−Ｄ（処置群）のいずれかにより処置した。動物を、実施例４に記載されるように、注意深くモニターしながら５時間換気した。処置後５時間で、それぞれの動物を、実施例４に記載されるように、静脈内投与による２５ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで深く麻酔し、１００％酸素でしばらく換気した。
【００４５】
子ヒツジの組織を分析する方法が実施例５〜実施例１２に記載される。実施例５は、子ヒツジの組織を処理およびサンプル分析のために調製する方法を詳しく記載する。実施例６は、使用されたデータ分析方法を詳しく記載する。実施例７は、肺組織を処理するために使用された方法を記載する。
【００４６】
ｒｈＳＰ−Ｄの投与は、新生児の子ヒツジを気管内エンドトキシンの全身的影響から保護することが見出された。５匹の子ヒツジをそれぞれの群において調べた。体重（コントロール：３．２±０．３ｋｇ、ｒｈＳＰ−Ｄ：３．０±０．２ｋｇ）、臍血ｐＨ（コントロール：７．３３±０．０２、ｒｈＳＰ−Ｄ：７．３１±０．０４）および性別（両方の群において３匹のメスおよび２匹のオス）を処置群およびコントロール群の間で等しく分布させた。コントロール群において、５匹中４匹の子ヒツジが、５時間の研究期間が終了する前に死亡した。対照的に、ｒｈＳＰ−Ｄにより処置されたすべての子ヒツジが生存した（図１）。動物が死亡したとき、死亡直前に得られたデータを群間の比較のために使用した。コントロール群におけるほとんどの死亡が４時間〜５時間の間で生じた。
【００４７】
気管内投与後、エンドトキシンが、リムルス細胞分解産物アッセイによって評価されたとき、両方の動物群で、３０分が経過したとき、血漿において検出された（図２Ａ）。血漿中のエンドトキシンレベルがコントロールの子ヒツジでは増大し続けたが、ｒｈＳＰ−Ｄにより処置された子ヒツジでは、実験の継続期間中、増大しなかった。死亡前の収縮期血圧は、３時間が経過したとき、これらの群の間において類似しており、その後、コントロールでは低下し、しかし、ｒｈＳＰ−Ｄ処置の動物では低下しなかった（図２Ｂ）。
【００４８】
ＬＰＳの顕著な全身的影響が、低下した血液ｐＨ、血中塩基過剰（ＢＥ）（図３）、および、増大したｐＣＯ２（図４Ａ）によって示されるように、コントロール群において、４時間が経過した後で認められた。対照的に、血液ｐＨ、ＢＥおよびｐＣＯ２が、ｒｈＳＰ−Ｄ処置の動物では５時間の実験の期間中を通して安定したままであった。ヘマトクリット、カリウム、カルシウムおよびグルコースのレベルは両方の群について類似していた。ＰＯ２は、この在胎齢では比較的不安定であり、動脈管開存症に関連する可能性があるが、これらの群の間には違いがなかった（データは示されず）。
【００４９】
肺胞細胞をＢＡＬＦ液から単離する方法が実施例８に記載される。遠心分離後の肺ホモジネート（ＢＡＬＦ）におけるｒｈＳＰ−Ｄのレベルおよび血清中のｒｈＳＰ−Ｄのレベルを測定する方法が実施例９に記載される。使用された組織学方法が実施例１０に記載される。エンドトキシンおよびサイトカインのレベルを実施例１１に記載されるように測定した。ＲＮＡ分析を実施例１２に記載されるように行った。
【００５０】
前炎症性サイトカインのｍＲＮＡ（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８）のレベルが、ｒｈＳＰ−Ｄ処置の動物と比較されたとき、コントロール動物の脾臓および肝臓において増大した。このことは、ＬＰＳがｒｈＳＰ−Ｄの不在下では肺から全身循環に漏出することを示している（図５Ａおよび図５Ｂ）。ＩＬ−１０およびＴＮＦαのｍＲＮＡの脾臓および肝臓でのレベルは両方の動物群において低かった（データは示されず）。血漿中のＩＬ−８が気管内ＬＰＳの後においてコントロール群では著しく増大し、ｒｈＳＰ−Ｄ処置のヒツジでは著しくより低くなっていた（図５Ｄ）。血漿中のＩＬ−１βは両方のヒツジ群においてアッセイの検出可能レベルよりも低かった（０．８ｐｇ／ｍｌ未満）（データは示されず）。
【００５１】
下記の表１は、ＢＡＬＦにおけるＷＢＣ、炎症性細胞および総タンパク質を示す。ＢＡＬＦにおける好中球の数は両方の群について類似していたが、ＬＰＳを受けなかったコントロール動物について以前に示されたよりも１０倍大きかった（Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ．Ｗ．他（２００２）、Ａｍ ＪＲｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９：これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＢＡＬＦにおける過酸化水素および総タンパク質は２つの群の間において異なっていなかった。アポトーシス細胞の割合および壊死細胞の割合もまた、両方の群において類似していた（表１）。ｒｈＳＰ−Ｄの抗炎症性効果と一致して、前炎症性サイトカインのＩＬ−１βのｍＲＮＡが、ｒｈＳＰ−Ｄにより処置された動物の肺では著しく低下した（図５Ｃ）。ｒｈＳＰ−Ｄは、肺ホモジネートの上清におけるＩＬ−１βのレベルを、コントロールにおける２１．６±３．６ｎｇ／ｍｌから、ｒｈＳＰ−Ｄによる処置の後での１２．６±１．４ｎｇ／ｍｌに低下させた（ｐ＜０．０５）。同様に、ｒｈＳＰ−ＤはＩＬ−６を７．７±０．８ｎｇ／ｍｌから２．３±１．２ｎｇ／ｍｌに低下させた（ｐ＜０．０５）。ＩＬ−８は、コントロール群またはｒｈＳＰ−Ｄ処置群のいずれにおいてもＥＬＩＳＡによって検出することができなかった。肺の炎症がｒｈＳＰ−Ｄ処置群およびコントロール群の両方において認められた（図５Ａ、Ｂ）。図６は、ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色による肺の形態学（６Ａおよび６Ｂ）、ならびに、ＩＬ−８の免疫組織化学（６Ｃおよび６Ｄ）およびＩＬ−１βの免疫組織化学（６Ｅおよび６Ｆ）を示すいくつかの組織学的画像を例示する。ＩＬ−８（図６Ｃおよび６Ｄ）およびＩＬ−１β（図６Ｅおよび６Ｆ）についての増大した免疫染色が両方の動物群において観測され、しかし、両方のサイトカインについての染色の増大した程度および強度がコントロール群において観測された。このことは、気管内ｒｈＳＰ−Ｄ処置が炎症性細胞におけるサイトカインのＩＬ−８およびＩＬ−１βのレベルを低下させたことを示している。
【表１】
【００５２】
ｒｈＳＰ−Ｄの投与はエンドトキシン暴露後の肺力学を変化させなかった。目標の一回換気量を維持するために使用された換気圧は両方の群において類似していた（図４Ｂ）。同様に、動的肺コンプライアンスおよび圧力−体積曲線は、図７に示されるように、ｒｈＳＰ−Ｄ処置によって変化しなかった。
【００５３】
ＢＡＬＦ、肺ホモジネートおよび血漿におけるｒｈＳＰ−Ｄのレベルを、ＥＬＩＳＡによって両方の群において気管内投与後５時間で測定し（下記の表２）、また、ＢＡＬＦにおける免疫ブロットによって測定した（図８）。ｒｈＳＰ−Ｄの存在が、コントロール群からではなく、ｒｈＳＰ−Ｄ群から得られたＢＡＬＦ、肺ホモジネートおよび血漿において明らかにされた。血漿におけるｒｈＳＰ−Ｄの存在により、肺からのその漏出が明らかにされる。
【表２】
【００５４】
本明細書中に示されるように、気管内ｒｈＳＰ−Ｄの投与は、早産新生児の子ヒツジを肺内大腸菌ＬＰＳの全身的影響から保護することができた。肺の炎症がｒｈＳＰ−Ｄによって阻止された一方で、ＬＰＳの全身的影響が、血漿中のＬＰＳレベルおよび全身的炎症の証拠によって示されるように、ｒｈＳＰ−Ｄによって改善された。以前の研究では、気管内ＬＰＳによって引き起こされた全身的炎症が、１３０ｄのＧＡで認められたが、１４１ｄのＧＡでは認められなかったので、胎齢依存的であったことが明らかにされた（Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ．Ｗ．他（２００２）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９）。
【００５５】
マウス研究：肺および全身性の炎症および感染に対するＳＰ−Ｄの影響
ＳＰ−Ｄが、全身的なＬＰＳ誘導の炎症を制限するかを明らかにするために、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスのモデルを利用した。非致死量の大腸菌０１１１：Ｂ４のＬＰＳを、化学量論量の精製された組換えヒトＳＰ−Ｄとともに、または、組換えヒトＳＰ−Ｄを伴うことなく、尾静脈注入によって投与した（それぞれの処置群についてｎ＝５）。ＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）を、コントロールの緩衝液、または、増大する濃度の組換えヒトＳＰ−Ｄとともに投与し、サイトカイン応答を注入後２時間で血漿において測定した。ＳＰ−ＤはＩＬ−６およびＴＮＦαのレベルを濃度依存的な様式で著しく低下させ、１５０μｇ／ｋｇのＳＰ−ＤはＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルにおける４０％および５０％の最大減少をそれぞれもたらした（それぞれについてｐ＜０．０１）（図９）。
【００５６】
ＬＰＳが注入前にＳＰ−Ｄとプレインキュベーションされたので、この実験は、ＬＰＳ誘導による全身的炎症に対するＳＰ−Ｄの影響を評価するための最適な条件を表した。血液中に循環するＬＰＳを突き止め、阻害するための全身的ＳＰ−Ｄの可能性を評価するために、ＳＰ−ＤをＬＰＳ注入前３０分およびＬＰＳ注入後３０分で尾静脈注入によって投与し、サイトカイン応答を２時間後に血漿において測定した（それぞれの処置群についてｎ＝５）（図１０）。ＳＰ−ＤがＬＰＳ注入前３０分で投与されたとき（ｐ＜０．０１）、または、ＬＰＳ注入と一緒に投与されたとき（ｐ＜０．０１）、全身的なＩＬ−６レベルが著しく低下した。ＩＬ−６のレベルはまた、ＳＰ−ＤがＬＰＳ後３０分で投与されたときにはより低くなっており、しかし、結果は統計学的有意には達しなかった（ｐ＝０．０９）。まとめると、上記の結果は、循環しているＳＰ−Ｄにより、全身的なＬＰＳ誘導による炎症が阻害され得ること、および、感染時における増大する全身的ＳＰ−Ｄレベルの生理学的目的が、全身的ＬＰＳを捕捉し、ＬＰＳにより誘導される炎症の損傷化作用を制限することであることを示している。
【００５７】
インビトロ研究では、ＳＰ−Ｄが、直接的なＬＰＳ結合、ＣＤ１４阻害およびＴＬＲ４結合をはじめとする、ＬＰＳのシグナル伝達経路におけるいくつかの段階に影響を及ぼし得ることが示される（Ｓａｎｏ，Ｈ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：２２４４２〜２２４５１；Ｓｅｎｆｔ，Ａ．Ｐ．他（２００５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４：４９５３〜４９５９；Ｏｈｙａ，Ｍ．他（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：８６５７〜８６６４；Ｇａｒｄａｉ，Ｓ．Ｊ．他（２００３）、Ｃｅｌｌ、１１５：１３〜２３）。ＳＰ−ＤはＬＰＳのコアオリゴ多糖に対する大きい親和性を有しており、しかし、相対的親和性は、用いられた細菌ＬＰＳの株に依存して変化する。対照的に、ＣＤ１４およびＴＬＲ４のＳＰ−Ｄ結合が、ＳＰ−Ｄと、ＬＰＳとの相互作用とは無関係に生じる。従って、ＳＰ−Ｄが、ＬＰＳ結合に依存または非依存である経路を介して、ＬＰＳ誘導による全身的炎症を阻害するかを明らかにするために、低ＳＰ−Ｄ親和性および高ＳＰ−Ｄ親和性のＬＰＳ血清型により誘導される炎症に対するＳＰ−Ｄの影響を比較した。ＥＬＩＳＡに基づくＳＰ−Ｄ ＬＰＳ結合アッセイを使用して、数株の大腸菌株から得られたＬＰＳについてのＳＰ−Ｄの結合親和性を測定した。大きい結合親和性を有する１つの株（大腸菌０１１１：Ｂ４）、および、低い結合親和性を有する１つの株（大腸菌０１２７：Ｂ８）が特定された（図１１Ａ）。低結合性ＬＰＳまたは高結合性ＬＰＳのいずれかを尾静脈注入した後２時間での全身的ＩＬ−６レベルに対するＳＰ−Ｄの影響を求めた（それぞれの群においてｎ＝５）。高結合性ＬＰＳをＳＰ−Ｄとプレインキュベーションしたとき、血漿中のＩＬ−６レベルが著しく低下し、しかし、ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄに対する低い親和性を有するＬＰＳ株により誘導される炎症を阻害しなかった（図１１Ｂ）。従って、ＬＰＳにより誘導される炎症の阻害はＳＰ−ＤのＬＰＳ結合親和性と直接に相関しており、全身的ＳＰ−Ｄが、ＬＰＳにより誘導される炎症を、主として直接的なＬＰＳ相互作用によって阻害し得ることを示している。加えて、ＳＰ−ＤのＬＰＳ結合と、ＬＰＳ誘導の炎症のＳＰ−Ｄ媒介による阻害との間での相関により、これらの研究で認められたＬＰＳの阻害が、ＳＰ−Ｄ調製物に含まれる混入物の抗炎症的性質のためでないことが示される。
【００５８】
Ｓｆｔｐｄ−／−マウスは、ベースラインのときおよび感染性攻撃の間における増大した肺の炎症によって特徴づけられる（Ｋｏｒｆｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｒ．他（１９９８）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：２８４３８〜２９４４３；Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．他（２０００）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７：５９７２〜７；Ｃｌａｒｋ，Ｈ．他（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：２８９２〜２８９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３）。ＳＰ−Ｄが全身的なＬＰＳ誘導の炎症およびＳｆｔｐｄ−／−マウスの顕著な前炎症性表現型を阻害するという結果を考慮すると、血漿中のサイトカインレベルが全身的ＬＰＳ暴露の後でＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて上昇すると考えられることが仮定された。従って、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスおよび野生型マウス（同腹子コントロール）の両方を静脈内ＬＰＳにより処置し、血漿中のＩＬ−６レベルを注入後２時間で測定した。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスに特徴的である高まった肺の炎症性サイトカインとは際立って対照的に、ＬＰＳにより処置されたＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける血漿中のＩＬ−６レベルは、野生型マウスよりもおよそ８０％低かった（図１２）。ＳＰ−Ｄは、ベンチレータ誘導の肺傷害を受けたヒツジにおいて肺ＬＰＳの全身的放出を制限する（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｍ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ）ので、この驚くべき結果についての最も単純な説明は、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスが、肺ＬＰＳの全身循環への持続した漏出にさらされ、その後、ＬＰＳ寛容性を発達させるということである。しかしながら、この結果からはまた、ＳＰ−Ｄが全身的免疫系における重要かつ複雑な役割を果たすことが示され得る。
【００５９】
ＬＰＳと結合し、ＬＰＳを肺から除くことに加えて、ＳＰ−Ｄは、ウイルス感染、細菌感染および真菌感染に対する生得的な免疫応答の重要な構成要素である（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３）。インビトロ研究では、ＳＰ−Ｄが細菌およびウイルスと結合し、これらを凝集させること、また、この凝集が肺胞のマクロファージによる感染性生物の食作用および殺傷を容易にすることが明らかにされる（Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ，Ｋ．他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｌ７５３６２；Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ，Ｋ．Ｌ．他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９５８〜Ｌ９６９）。全身的ＳＰ−Ｄは全身的細菌と結合し、そのクリアランスを容易にすることができ、このことは最終的には、それほど大きくない炎症性組織損傷および改善された生存を引き起こすと考えられる。このことを調べるために、全身性多菌性敗血症／腹膜炎を誘導する、盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）の臨床的に関連したマウスモデルを利用した。処置様式（すなわち、ＳＰ−Ｄ対コントロール）について知らされていない職員による盲腸の結紮および２１ゲージでの穿刺の後、マウスを、腹腔内注入によって与えられるコントロールの緩衝液または２ｍｇ／ｋｇのＳＰ−Ｄにより処置し（ｎ＝１０、それぞれの群において６週齢〜８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス）、血液を手技後６時間で集め、血漿中のＩＬ−６レベルを測定した。ＳＰ−Ｄにより処置されたマウスは、コントロールマウスよりもおよそ４０％低い平均血漿ＩＬ−６レベルを有した（図１３）。この実験における変動性のために、これらの結果は統計学的に有意ではなく（ｐ＝０．０６）、しかし、その傾向から、ＳＰ−Ｄは生細菌攻撃の間における炎症を軽減し得ることが示される。
【００６０】
盲腸穿刺により誘導される敗血症の重篤さのために、マウスの一部が採取時点（６時間または２４時間のいずれか）の前に死亡した。ＣＬＰに供されたマウスの生存に対するＳＰ−Ｄの影響についての予備的研究として、コントロールマウス対ＳＰ−Ｄ処置マウスについてのＣＬＰ後の死亡率を求めた。この実験の目的のために、死亡を採取時点前の死として定義した（図１４）。死亡率は、コントロールマウスの方がＳＰ−Ｄ処置マウスの場合よりも約３倍高かった。これらのデータが、様々な盲腸穿刺サイズ、採取時点、ならびに、ＳＰ−Ｄ用量および投与経路を使用した実験に由来するので、これらの結果の生理学的および統計学的な重要性は限られている。しかしながら、これらの結果から、全身的ＳＰ−Ｄは、生細菌攻撃の間において、マウスの炎症を軽減することができ、また、マウスの生存を改善することができることが示される。
【００６１】
マウス研究：ＳＰ−Ｄの発現およびクリアランス
ベースラインにおいて血液中に低いレベルで存在するが、多数の研究では、ヒトの血漿中のＳＰ−Ｄレベルが様々な前炎症性状態（例えば、肺または全身性の感染など）において数倍増大することが明らかにされている（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７；Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ．他（２００５）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、３１：２５〜３３）。血漿中のＳＰ−Ｄレベルがマウスにおいて敗血症時に増大するかを明らかにするために、また、血漿中のＳＰ−Ｄの起源を明らかにするためのモデルシステムを確立するために、マウスＣＬＰモデルを利用した。敗血症を、盲腸の結紮および３０ゲージのニードルによる穿刺によって誘導し、血漿中のＳＰ−Ｄレベルを手技後４８時間でＥＬＩＳＡによって測定した（ｎ＝５、６週齢〜８週齢）（図１５）。血漿中のＳＰ−Ｄレベルが、ＣＬＰ後、数倍増大して、およそ４０ｎｇ／ｍｌの平均値になった。このことは、マウスおよびヒトにおけるＳＰ−Ｄの全身的レベルが類似した様式で応答することを示している。加えて、これらの結果から、ＣＬＰモデルが、全身的ＳＰ−Ｄの産生を評価するための機能的なインビボシステムを提供し得ることが明らかにされる。
【００６２】
ＳＰ−Ｄはまた、血管内皮、胃、小腸、腎臓および多数の腺組織において免疫染色によって検出される（Ｓｔａｈｌｍａｎ，Ｍ．Ｔ．他（２００２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、５０：６５１〜６６０；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｈ２２８６〜Ｈ２２９４）。ＳＰ−Ｄがいくつかの組織タイプで存在し、保護的役割をこれらの存在場所のそれぞれにおいて果たし得るが、血漿において循環するＳＰ−Ｄは、全身的な宿主防御に寄与する集団である。血管内皮がＳＰ−Ｄの循環プールに近いこと、および、宿主防御における血管内皮の役割を考えると、血管内皮が血漿ＳＰ−Ｄのプールサイズに寄与し得る。Ｓｆｔｐｄ遺伝子発現に関する以前の研究は呼吸器上皮に限られている。従って、Ｓｆｔｐｄプロモータが血管内皮細胞において活性化されるかを明らかにするために、マウス胎児肺間葉細胞株（ＭＦＬＭ−９１Ｕ）を利用した。この細胞は、不死化されたマウス胎児肺間葉（日数、Ｅ１９）に由来し、血管内皮系譜の特徴（すなわち、再構成された基底膜において培養されたとき、血管内皮増殖因子受容体２の発現、および、管腔を伴う毛細管様構造の形成）を示す（Ａｋｅｓｏｎ，Ａ．Ｌ．他（２０００）、Ｄｅｖ Ｄｙｎ、２１７：１１〜２３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＭＦＬＭ細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子につながれたＳｆｔｐｄプロモータを含有するプラスミドにより一過性でトランスフェクションし、Ｓｆｔｐｄプロモータ活性を測定した（図１６）。ルシフェラーゼ活性が、ルシフェラーゼ遺伝子だけによりトランスフェクションされた細胞と比較されたとき、ルシフェラーゼレポーター遺伝子につながれたＳｆｔｐｄプロモータによりトランスフェクションされたＭＦＬＭ−９１Ｕ細胞ではおよそ５０倍増大した。このことは、Ｓｆｔｐｄプロモータが血管内皮細胞において活性化されることを示している。加えて、これらの結果は、このシステムが、血漿中のＳＰ−Ｄレベルを全身的な敗血症のときに増大させる調節因子だけでなく、ＳＰ−Ｄの血漿中レベルをベースラインにおいて肺のレベルよりも数倍低く保つ調節因子を明らかにするために使用されることを裏付ける。
【００６３】
肺において、ＳＰ−Ｄは肺胞のＩＩ型細胞によって産生され、ＩＩ型細胞または肺胞のマクロファージによって分解または再循環され、これにより、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは７時間の半減期がもたらされ、野生型マウスでは１３時間の半減期がもたらされる（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９２）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６３：Ｌ６０〜Ｌ６６；Ｖｏｏｒｈｏｕｔ，Ｗ．Ｆ．他（１９９２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、４０：１５８９〜９７；Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５：１３〜１８；Ｄｏｎｇ，Ｑ．およびＪ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ（１９９８）、Ｊ．Ｒ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９７〜１０５；Ｈｅｒｂｅｉｎ，Ｊ．Ｆ．他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７８：Ｌ８３０〜Ｌ８３９；Ｋｕａｎ，Ｓ．Ｆ．他（１９９４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０：４３０〜４３６；Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｍ．他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７９：Ｌ４６８〜Ｌ４７６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。血漿におけるＳＰ−Ｄの半減期を求めるために、ＳＰ−Ｄを尾静脈注入によって投与し、血漿中のＳＰ−ＤレベルをＥＬＩＳＡによって経時的に測定した（図１７）。ＳＰ−Ｄが初回通過代謝によって血漿から除かれず、しかし、むしろ、野生型マウスではおよそ６時間の半減期で血漿中に保持された。興味深いことに、血漿ＳＰ−Ｄの半減期がＳｆｔｐｄ−／−マウスではおよそ２時間に低下したが、ネック部およびＣＲＤのみの三量体からなるＳＰ−Ｄの短縮型フラグメントの半減期は６２時間の血漿半減期を有する（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｈ２２８６〜Ｈ２２９４）。このことは、血漿ＳＰ−Ｄの取り込みについての特異的な細胞機構が存在することを示しており、また、この機構がＳＰ−ＤのＮ末端ドメインおよび／またはコラーゲンドメインに依存することを示している。
【００６４】
血漿ＳＰ−Ｄの取り込みの主要な場所を明らかにするために、ＳＰ−ＤをＳｆｔｐｄ−／−マウスに尾静脈注入によって投与し、組織ホモジネートにおけるＳＰ−Ｄレベルを注入後８時間でＳＰ−ＤのＥＬＩＳＡによって求めた（図１８）。脾臓におけるＳＰ−Ｄのレベルが組織１グラムあたり約３２０ｎｇのＳＰ−Ｄに達した。これは、それ以外の組織で観測されたＳＰ−Ｄレベル（および脾臓におけるバックグラウンドシグナル）よりも顕著に高かった。従って、肺のＳＰ−Ｄは肺胞のマクロファージおよびＩＩ型細胞によって分解または再循環されるが、結果は、全身的ＳＰ−Ｄが脾臓によって循環から除かれることを示している。
【００６５】
マウス研究：宿主防御細胞を調節することにおけるＳＰ−Ｄの構造的ドメインの役割
相対的に大きいＳＰ−Ｄのコラーゲンドメイン（他のコレクチンと比較したとき）のために、ＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインは、肺胞マクロファージのＳＰ−Ｄ媒介による調節には不可欠であり得る。このことを調べるために、正常なＣＲＤ、ネックドメインおよびＮ末端ドメインを伴うが、コラーゲンドメインを有しないＳＰ−Ｄ変異型タンパク質（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭ）を作製した。インビトロアッセイでは、精製されたｒＳｆｐｔｄＣＤＭが多量体を形成し、野生型タンパク質と同等またはそれよりも良好な様式で、炭水化物、細菌およびウイルスと結合したことが明らかにされた。ｒＳｆｔｐｄＣＤＭが肺胞のマクロファージ活性を効果的に調節するかを明らかにするために、変異型の導入遺伝子（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋）を野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて発現させた。変異型タンパク質は野生型マウスにおいて肺の形態学またはマクロファージ活性を乱さなかった一方で、変異型タンパク質は、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスに特徴的であるベースラインでの異常なマクロファージ活性を救うことができなかった。増大したレベルのメタロプロテイナーゼを発現する肥大した泡沫状マクロファージが、Ｓｆｔｐｄ−／−マウス、および、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭタンパク質を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−）において容易に認められた（図１９）。
【００６６】
ｒＳｆｔｐｄＣＤＭが肺胞のマクロファージ活性を感染性攻撃時において調節するかを明らかにするために、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）への気管内暴露に対する、野生型マウス、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスおよびｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−マウスの応答を評価した。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスとは対照的に、検出可能なＩＡＶが野生型またはｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−の肺ホモジネートからは回収されなかった。加えて、ＩＡＶ攻撃されたＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて観測された増大したＩＬ−６レベル、ＴＮＦαレベルおよびＩＦＮ−γレベルが、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは野生型のレベルに回復した（図２０）。まとめると、これらの結果から、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭはベースラインでの肺胞のマクロファージ活性を効果的に調節しないが、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭは正常な肺胞のマクロファージ応答をウイルス攻撃時に容易にし得ることが示される。そのうえ、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭの変異型タンパク質は、ＬＰＳにより誘導される炎症においてＳＰ−Ｄの全身的な抗炎症的性質を誘発するＳＰ−Ｄの構造的ドメインが、肺における感染性攻撃の間に要求される構造的ドメインと一致するかを明らかにするためのモデルシステムを提供する。
【００６７】
大腸菌ＬＰＳに対するＳＰ−Ｄの結合がインビボおよびインビトロの両方で明らかにされている（Ｋｕａｎ他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；Ｌｉｍ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０２：１６７４〜１６８０；ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４５４：２６１〜２６９；Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１７７〜２０１；Ｐｉｋａａｒ他（１９９５）、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、１７２：４８１〜４８９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。早産新生児は、ＳＰ−Ｄを含めて、表面活性物質が不十分である（Ｍｉｙａｍｕｒａ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１２１０：３０３〜３０７；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。呼吸窮迫症候群の新生児を処置するための市販されている表面活性物質はＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃを含有するが、ＳＰ−ＡまたはＳＰ−Ｄを含有しない。早産新生児の肺で見られる増大した炎症性応答は、低いレベルのＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄおよび相対的に少ない数のマクロファージを含めて、宿主防御における欠損から生じ得る（Ａｗａｓｔｈｉ他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：９４２〜９４９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。絨毛羊膜炎および肺の出生後感染に関連する胎児の炎症には、慢性的な肺傷害および気管支肺異形成症の発症が伴う（Ｌｉ他（２００２）、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ、４：７２３〜７３２；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００６８】
ＳＰ−Ｄが、気管内投与されたＬＰＳの後における全身的影響を改善し、死を防止したという知見は、ＳＰ−ＤがＬＰＳに結合し、肺区画から全身区画へのＬＰＳ移行を解毒または阻害するという考えを裏付けている。早産のヒト新生児における知見と類似して、敗血症ショックもまた、成人において比較的頻発する死因の１つである（Ｍａｎｏｃｈａ他（２００２）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ、１１：１７９５〜１８１２；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。早産児の肺でのように、増大した透過性が成人の肺の傷害および換気の後で生じる（Ｓａｒｔｏｒｉ他（２００２）、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ、２０：１２９９〜１３１３；Ｌｅｃｕｏｎａ他（１９９９）、Ｃｈｅｓｔ、１１６：２９Ｓ〜３０Ｓ；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。従って、ＳＰ−Ｄは、感染を有する肺から生じる全身的な炎症性応答を防止するための可能性のある治療的方策を表す。
【００６９】
本明細書中に示されるように、ｒｈＳＰ−Ｄは、早産新生児の子ヒツジにおいて病原体誘導による全身的エンドトキシンショックを防止するために安全に気管内投与することができる。そのような治療は、新生児を肺感染およびその続発症から防ぐことにおいて有用であり得る。
【００７０】
加えて、本明細書中に記載される研究では、下記のことが明らかにされる：１）ＳＰ−ＤがＬＰＳを全身循環から捕捉し、ＬＰＳにより誘導される全身的炎症を阻害すること；２）ＳＰ−Ｄが、ＬＰＳにより誘導される炎症を直接的なＳＰ−Ｄ／ＬＰＳ相互作用によって阻害すること；３）全身的なＬＰＳ誘導の炎症がＳｆｔｐｄ−／−マウスでは軽減されること；４）ＳＰ−Ｄが生菌の全身的細菌攻撃の間にマウスにおける炎症を軽減し、生存を改善すること；５）血漿中のＳＰ−Ｄレベルがマウスにおいて敗血症時に増大すること；６）血管内皮細胞がＳｆｔｐｄ遺伝子を発現すること；７）全身的ＳＰ−Ｄが脾臓によって除かれること；および８）ＳＰ−Ｄの特異な構造的ドメインにより、肺胞のマクロファージが調節されること。さらには、本明細書中に示されるように、静脈内ＬＰＳ注入、ＣＬＰおよび血管内皮Ｓｆｔｐｄ発現の実験的モデルが確立され、研究室において機能的である。
【００７１】
従って、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、あるいは、それをコードする核酸を、肺感染症および／または敗血症を防止または処置するために個体に投与することができる。いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄ処置は、例えば、ＳＰ−Ｄ処置により、生存、または、致死量のＬＰＳを哺乳動物に投与または導入することに由来する組織傷害が改善されるように、ＬＰＳにより誘導される炎症を阻害することができる。他の実施形態において、ＳＰ−Ｄ処置は、例えば、ＬＰＳにより誘導される炎症を、血漿からのＬＰＳのクリアランスを高めることによって阻害することができる。さらに他の実施形態において、ＳＰ−Ｄ処置は、例えば、肺に投与されたとき、肺傷害がない場合における呼吸樹から全身循環へのＬＰＳの漏出を防止することができる。ＳＰ−Ｄ処置の実施形態はまた、例えば、多菌性敗血症または細菌攻撃を防止または処置するために全身的様式で、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、あるいは、それをコードする核酸を投与することによって敗血症を処置するために使用することができる。さらに他の実施形態において、ＳＰ−Ｄ処置は、例えば、急性呼吸窮迫症候群を処置するために、肺に、または、全身的様式で投与することができる。
【００７２】
ＳＰ−Ｄ処置は、単独で、または、他の処置（例えば、抗生物質投与など）との併用で使用することができる。さらに、いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントをコードする核酸を個体に投与することができる。ＳＰ−Ｄをコードする核酸は、例えば、アデノウイルスベクターに含有させることができる。そのようなアデノウイルスベクターは、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３５１２１（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される方法に従って構築することができる。
【００７３】
ＳＰ−Ｄタンパク質は、例えば、組換えＳＰ−Ｄであり得る。いくつかの実施形態において、組換えＳＰ−Ｄは組換えヒトＳＰ−Ｄ（ｒｈＳＰ−Ｄ）である。例えば、いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄポリペプチドはアクセション番号ＮＰ＿００３０１０の成熟ポリペプチド配列（配列番号２）である。さらなる実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質は、例えば、アクセション番号ＮＰ＿００３０１０のＳＰ−Ｄ前駆体配列（配列番号３）であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質は、例えば、ＳＰ−Ｄタンパク質またはそのフラグメントを大量に調製するために、任意の好適な生物にトランスフェクションすることができる、ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントをコードする核酸から調製することができる。タンパク質は、その後、この技術分野で知られている方法を使用して単離および精製することができる。用語「精製された」は絶対的な純度を要求せず、むしろ、相対的な定義として意図される。単離されたタンパク質は通常、例えば、クーマシー染色によって電気泳動的に均一に精製されている。出発材料または天然物質を、少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは４桁または５桁精製することが、特に意図される。
【００７４】
用語「ポリペプチド」は、例えば、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーを示すことができる。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を指定または排除しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基および脂質基などの共有結合を含むポリペプチドが、ポリペプチドの用語によって特に包含される。この定義にはまた、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（これらには、例えば、天然に存在しないアミノ酸、非関連の生物学的システムにおいて天然に存在するだけであるアミノ酸、哺乳動物システムに由来する修飾されたアミノ酸などが含まれる）を含有するポリペプチド、置換れた連結を有するポリペプチド、ならびに、この技術分野で知られている他の修飾体（天然に存在するもの、および、天然に存在しないものの両方）が含まれる。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態において、用語「精製された」は、核酸、脂質、炭水化物および他のタンパク質（これらに限定されない）をはじめとする他の化合物から分離されている本発明のＳＰ−Ｄポリペプチドを表す。ポリペプチドは、サンプルの少なくとも５０％（好ましくは６０％〜７５％）が単一のポリペプチド配列を示すときに実質的に純粋である。実質的に純粋なポリペプチドは、典型的には、タンパク質サンプルの約５０％（好ましくは６０％〜９０％、重量／重量）を構成し、より通常的には約９５％を構成し、好ましくは、約９９％を越える純度である。ポリペプチドの純度または均一性は、この技術分野で広く知られているいくつかの方法によって示される（例えば、サンプルのアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続く、ゲルを染色したときに１つだけのポリペプチドバンドを視覚化することなど）。特定の目的のために、より大きい分解能が、この技術分野で広く知られているＨＰＬＣまたは他の手段を使用することによって提供され得る。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄ配列は核酸前駆体配列のアクセション番号ＮＭ＿００３０１９（配列番号１）に由来し得る。
【００７７】
用語「実質的に相同的な」は、ＳＰ−Ｄをコードするヌクレオチド配列に関して本明細書中で使用されるときには、基準ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を示し、この場合、その対応する配列は、基準ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ構造を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、実質的に類似するヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをコードする。
【００７８】
本発明に関連して、「実質的に相同的な」は、基準タンパク質の配列の領域に対して少なくとも５０％の同一性、あるいは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする基準配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、あるいは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を示すことができる。同様に、「実質的に相同的な」はまた、好ましくは、基準タンパク質をコードするヌクレオチド配列の領域に対して少なくとも５０％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、一層より好ましくは９５％の同一性、さらに一層より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を示す。用語「実質的に相同的な」は、具体的には、配列が、特定の細胞における発現を最適化するために修飾されているヌクレオチド配列を含むことが意図される。
【００７９】
ＳＰ−Ｄヌクレオチド配列に対して「実質的に相同的な」ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、好ましくは、基準ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする。基準ヌクレオチド配列は、例えば、核酸前駆体配列のアクセション番号ＮＭ＿００３０１９（配列番号１）またはそのフラグメントが可能である。用語「ハイブリダイゼーションする」は、核酸配列を溶液中または固体支持体（例えば、セルロースまたはニトロセルロースなど）表面のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と相互作用させる方法を示す。核酸配列がＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と大きい親和性で結合するならば、その核酸配列は、そのようなＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子に「ハイブリダイゼーションする」と言われる。
【００８０】
ＳＰ−Ｄタンパク質またはそのフラグメント、あるいは、それらをコードする核酸を含む医薬組成物を、この技術分野で知られている方法に従って調製することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸あるいはそれらのフラグメントまたはアナログまたは誘導体を、哺乳動物の体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから、前記哺乳動物の体重１ｋｇあたり約１００ｍｇまでの間の量で、エアロゾル形態で対象に導入することができる。いくつかの実施形態において、投薬量は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇから、約２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇまでであり得る。さらなる実施形態において、投薬量は、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇから、約５．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。具体的な実施形態において、投薬量は１日あたりの投薬量である。当業者は、この投薬量に対応するエアロゾルの体積または重量を対象物のエアロゾル配合物におけるＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸の濃度に基づいて容易に決定することができる。あるいは、当業者によって容易に理解されるように、適切な投薬量のＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を投与される体積に有するエアロゾル配合物を調製することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を直接に肺に投与することは、より少ないＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸の使用を可能にし、従って、コストおよび望まれない副作用の両方を制限する。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸あるいはそれらのフラグメントまたはアナログまたは誘導体を含む医薬調製物を、哺乳動物の体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから、前記哺乳動物の体重１ｋｇあたり約１００ｍｇまでの間の量で、全身的様式で対象に導入することができる。いくつかの実施形態において、投薬量は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇから、約２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇまでであり得る。さらなる実施形態において、投薬量は、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇから、約５．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。具体的な実施形態において、投薬量は１日あたりの投薬量である。当業者は、この投薬量に対応する医薬調製物の体積または重量を対象物の前記医薬調製物におけるＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸の濃度に基づいて容易に決定することができる。あるいは、当業者によって容易に理解されるように、適切な投薬量のＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を投与される体積に有する医薬配合物を調製することができる。
【００８２】
本発明のＳＰ−Ｄは、分散化剤または分散剤と組み合わせて、乾燥粉末としてのエアロゾル配合物で、あるいは、希釈剤を伴う溶液または懸濁物で投与することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を含む配合物を、医薬組成物および治療用配合物を気道に送達するために設計される広範囲の様々なデバイスにおける使用のために調製することができる。いくつかの実施形態において、好ましい投与経路はエアロゾル形態または吸入形態においてである。本発明のＳＰ−Ｄはまた、例えば、希釈剤を伴う溶液または懸濁物で全身投与することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を含む配合物を、医薬組成物および治療用配合物を全身送達するために設計される広範囲の様々なデバイスにおける使用のために調製することができる。いくつかの実施形態において、好ましい投与経路は、全身送達によるものである。配合物は、疾患適応に依存して、単回服用または多回服用で投与することができる。使用される予防用配合物または治療用配合物の正確な量は、疾患の段階および重篤度、対象の身体状態および多数の他の要因に依存することが当業者によって理解される。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄ配合物はまた、敗血症または肺感染症を処置するための他の薬剤（例えば、経口投与または静脈内投与される抗生物質など）を含有することができる。
【実施例】
【００８４】
下記の実施例は、特許請求される発明を限定するためではなく、特許請求される発明を例示するために提供される。
【００８５】
実施例１
組換えＳＰ−Ｄの調製および精製
ｒｈＳＰ−Ｄを、全長のヒトＳＰ−ＤをコードするｃＤＮＡによるＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクションによって合成した。トランスフェクションされた細胞を、メトトレキサートの濃度を増大させることにより選択した。トランスフェクションされたプールを限界希釈によってクローン化し、高発現クローンを、特にこの目的のために設計されたＥＬＩＳＡを使用して特定した。ＳＰ−Ｄクローンを、血清を含有する培地でローラーボトルにおいて成長させ、その後、バイオ生産のためのＪＲＨ ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地に切り換えた。血清非含有培地の選択は、高い産生レベルのｒｈＳＰ−Ｄを達成することにおいて重要であることが見出された。大規模な緩衝液交換方法に伴う大きい剪断速度を避けるために、タンパク質を、アニオンイオン交換クロマトグラフィを使用して馴化培地から捕捉して、サンプルを濃縮し、グルコースを除いた。具体的には、培地を希釈し、ｐＨを７．４に調節し、その後、ＱセラミックｈｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）に負荷した。徹底的に洗浄して不純物を除いた後、ｒｈＳＰ−Ｄを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を使用して溶出した。溶出物を希釈し、カルシウムを５ｍＭの最終濃度に加えた。その後、ｒｈＳＰ−Ｄを、以前に記載された方法を使用してマルトースアガロースでアフィニティ精製した（Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｌ７５３〜Ｌ７６２；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。最終調製物におけるエンドトキシンレベルを最小限に抑えるために、アニオン交換樹脂およびすべてのクロマトグラフィ設備を０．２ＮのＮａＯＨにさらすことによって消毒し、マルトースアガロースを酸−エタノール混合物により処理した。精製されたｒｈＳＰ−Ｄは、サイズ排除クロマトグラフィにおいて１ｘ１０６ダルトンを越える多量体として移動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、このタンパク質は、非還元条件下では三量体として移動し、還元されたときには約４８ｋＤａの単量体形態に完全に転換された。組換えｈＳＰ−Ｄはインビトロにおいてカルシウム依存的様式で大腸菌と結合し、凝集させた（データは示されず）。これらの実験で使用されたｒｈＳＰ−Ｄは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）において０．５ｍｇ／ｍｌの濃度であった。ｒｈＳＰ−Ｄ調製物におけるエンドトキシンレベルは０．１ＥＵ／ｍｌ〜０．５ＥＵ／ｍｌの範囲であった（リムルス細胞分解産物アッセイ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）。予備的研究では、正常な成体マウスおよび早産子ヒツジへの処置用量のｒｈＳＰ−Ｄの滴注は肺の炎症を誘導しなかった（データは示されず）。従って、ｒｈＳＰ−Ｄにおけるエンドトキシンレベルは、炎症を誘導するレベルよりも低かったか、または、存在するエンドトキシンがｒｈＳＰ−Ｄに結合し、応答を誘発することができなかったかのいずれかであった。
【００８６】
実施例２
内因性ＳＰ−Ｄの精製
内因性ＳＰ−Ｄを、以前に記載されたように気管支肺胞洗浄液から精製する（Ｋｉｎｇｍａ，Ｐ．Ｓ．他（２００６）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２４４９６〜２４５０５；Ｓｔｒｏｎｇ，Ｐ．他（１９９８）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２２０：１３９〜１４９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。洗浄液から、遠心分離によって脂質が除かれる。脂質を含まない上清を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／５ｍＭ ＣａＣｌ２において２０ｍｌのマルトシル−セファロースカラムに加える。カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＣａＣｌ２および１Ｍ ＮａＣｌの溶液により洗浄し、その後、ＳＰ−Ｄを塩化マンガンにより選択的に溶出する。プールされた分画物を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および３０ｍＭ ＣａＣｌ２の溶液で１０倍希釈し、１ｍｌのベッド体積のマルトシル−セファロースカラムに加える。カラムから、ＬＰＳを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ｎ−オクチル−ｄ−グルコピラノシド、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２および１００ｕｇ／ｍｌ ポリミキシンの溶液により除き、カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２および２００ｍＭ ＮａＣｌの溶液により洗浄する。ＳＰ−Ｄを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液により溶出する。記載された条件のもとで、ＬＰＳ濃度は典型的には０．１エンドトキシンユニット／μｇタンパク質以下である。
【００８７】
実施例３
処置用の早産子ヒツジの調製
すべての動物を、以前に記載されたように、Ｄｏｒｓｅｔｎの雄ヒツジと交配されたＳｕｆｆｏｌｋの雌ヒツジ（出産予定日、１５０ｄのＧＡ）から１３０日の在胎齢で帝王切開によって分娩させた（Ｋｒａｍｅｒ他（２００２）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９；Ｋｒａｍｅｒ他（２００１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６３：１５８〜１６５；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。胎児の頭部および頸部が露出した後、気管内チューブを気管内に結び付けた。シリンジによって容易に吸引され得る胎児の肺液を取り戻し、子ヒツジを分娩させ、体重を測定した。
【００８８】
実施例４
換気された早産子ヒツジへのＬＰＳ暴露
最初の呼吸の前に、子ヒツジに、１ｍｌ（２５ｍｇ）のＳｕｒｖａｎｔａ（Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）と混合された０．１ｍｇ／ｋｇの大腸菌ＬＰＳ（大腸菌０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を与え、その後、１０ｍｌの空気をシリンジによって気道内に与えた。ＬＰＳを、肺におけるＬＰＳの均一な分布を容易にするために、少量の表面活性物質と混合し、最初の呼吸の前に肺に与えた。その後、最初の呼吸の間および最初の呼吸の後、ＬＰＳが末梢の気道に分布させられる。１０ｍｌの空気を、胎児の肺液のクリアランスを高めるために、また、ＬＰＳが末梢の気道に分布する前にＬＰＳがｒｈＳＰ−Ｄと混合することを防止するために、ＬＰＳ滴注後、気管を介して与えた。２５ｍｇのＳｕｒｖａｎｔａを使用して、エンドトキシンを滴注した。
【００８９】
実施例５
ＬＰＳにさらされた早産子ヒツジの肺へのｒｈＳＰ−Ｄの投与
上記で記載されたようなＬＰＳ暴露の子ヒツジを、その後、ｒｈＳＰ−Ｄと組み合わせて（処置群）、または、ｒｈＳＰ−Ｄと組み合わせることなく（コントロール群）、そのいずれかで所定量のＳｕｒｖａｎｔａにより処置した。Ｓｕｒｖａｎｔａの処置用量を、合計で１００ｍｇ／ｋｇを与えるように調節した。Ｓｕｒｖａｎｔａのこの後者の用量を、２ｍｇ／ｋｇのｒｈＳＰ−Ｄを含有する１２ｍｌの緩衝液（処置群）または１２ｍｌの緩衝液のみ（コントロール群）のいずれかとともに気管チューブにより滴注した。すべての動物を、類似する換気法を使用して時間循環および圧力制限の幼児ベンチレータ（Ｓｅｃｈｒｉｓｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ａｎａｈｅｉｍ、ＣＡ）により５時間にわたって換気した。５Ｆのカテーテルを、臍動脈を介して大動脈内に進め、胎盤から集めたろ過された胎児血液の１０ｍｌ／ｋｇの輸血を、早産に伴う低いヘマトクリットを正すために分娩後１０分以内に投与した。血圧、心拍数、一回換気量（ＶＴ）（ＣＰ−１００：Ｂｉｃｏｒｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｎａｈｅｉｍ、ＣＡ）および体温を継続してモニターした。血液ガス、ｐＨ、塩基過剰（ＢＥ）、ヘマトクリット、カリウム、カルシウムおよびグルコースのレベルを、少なくとも２０分毎に、または、胸の動きおよび一回換気量における変化によって示されるように、換気状態が変化したとき、血液ガス、電解質および代謝物システム（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ＵＳＡ、Ｗｅｓｔ Ｌａｋｅ、ＯＨ）によって分析した。４０回／分の呼吸速度、吸入時間：０．６ｓ、終末呼気陽圧（ＢＥＥＰ）＝４ｃｍＨ２Ｏは変化しなかった。最大吸気圧（ＰＩＰ）を、ＶＴを８ｍｌ／ｋｇ〜９ｍｌ／ｋｇで維持するために変化させた。圧力は、気胸を避けるために３５ｃｍＨ２ＯのＰＩＰに制限された。吸入酸素の割合（Ｆｉｏ２）を、１００ｍｍＨｇ〜１５０ｍｍＨｇの目標ｐＯ２を保つために調節した。１０パーセントのデキストロース（１００ｍｌ／ｋｇ／ｄ）を動脈カテーテルにより継続して注入した。動的コンプライアンスを、体重に対して正規化され、換気圧（ＰＩＰ−ＰＥＥＰ）によって除された、呼吸気流計により測定されたＶＴから計算した。直腸温度を、加熱用パッド、放射熱およびプラスチック製の身体被覆ラップを用いてヒツジについての正常な体温（３８．５℃）で維持した。補助的なケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）およびアセプロムザイン（０．１ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）を使用して、自発呼吸を抑制した。
【００９０】
実施例６
肺処理のための調製
５時間後、子ヒツジを静脈内投与による２５ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールにより深く麻酔し、１００％酸素によりしばらく換気した。気管内チューブを３分間固定して、酸素吸収により、肺を空気のない状態にすることを可能にした。５時間の研究期間を生存しなかった子ヒツジについては、死を、収縮期血圧が１０ｍｍＨｇ未満であること、または、鼓動がないことのいずれかによって決定した。
【００９１】
実施例７
データ分析
結果が平均±ＳＥＭとして与えられる。ｒｈＳＰ−Ｄ処置群および緩衝液コントロール群を、両側ｔ検定を使用して比較した。ログランク検定を群間の生存率比較のために使用した。有意性をｐ＜０．０５で認めた。
【００９２】
実施例８
肺の処理
胸腔を開き、肺を空気で４０ｃｍＨ２Ｏの圧力に１分間膨張させ、最大肺体積を記録した。肺を収縮させ、肺のガス体積を、２０ｃｍＨ２Ｏ、１５ｃｍＨ２Ｏ、１０ｃｍＨ２Ｏ、５ｃｍＨ２Ｏおよび０ｃｍＨ２Ｏで測定した。右下部葉の肺組織をＲＮＡ抽出のために液体窒素で凍結した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、視覚的に広がるまで左肺を４℃において０．９％ＮａＣｌで満たすことによって左肺に対して行い、この洗浄を５回繰り返した。ＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）をプールし、アリコートを総タンパク質の測定（Ｌｏｗｒｙ他（１９５１）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９５１、１９３：２６５〜２７５；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）のために保存した。
【００９３】
実施例９
肺胞細胞の調製
ＢＡＬＦを５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ペレット内の細胞を、トリパンブルーを使用して計数した。分別細胞計数を、染色されたサイトスピン調製物に対して行った（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ、ＩＮ）。気道に呼び寄せられた細胞の活性化を、酸性条件下における過酸化水素による第一鉄イオン（Ｆｅ２＋）から第二鉄イオン（Ｆｅ３＋）への酸化に基づくアッセイ（Ｂｉｏｘｙｔｅｃｈ Ｈ２Ｏ２−５６０アッセイ；ＯＸＩＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して過酸化水素を測定することによって評価した。
【００９４】
アポトーシス細胞を、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムによる染色（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって検出し、以前に記載されたようにフローサイトメトリによって分析した（Ｋｒａｍｅｒ他（２００１）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８０：Ｌ６８９〜Ｌ６９４；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００９５】
実施例１０
ＢＡＬＦ、肺組織および血清におけるｒｈＳＰ−Ｄの測定
ＢＡＬＦ、遠心分離後の肺ホモジネートの上清、および、５時間が経過して集められた血清におけるｒｈＳＰ−ＤのレベルをＥＬＩＳＡによって分析した。免疫ブロッティングのために、１０μｌのＢＡＬＦをＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルに負荷し、ニトロセルロースに転写し、ブロットを、ヒツジのＳＰ−Ｄと交差反応せず、これにより、サンプルにおける内因性ＳＰ−Ｄのレベルの推定を可能にするウサギ抗ｒｈＳＰ−Ｄ血清によりプローブした。
【００９６】
実施例１１
肺の組織学方法
右上部葉を３０ｃｍＨ２Ｏの圧力で１０％ホルマリンにより膨張固定した。パラフィン包埋組織を切片化し（９μｍ）、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。肺組織に対するＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１βの免疫組織化学的検出を、ヒツジＩＬ−６についてはウサギポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、ヒツジＩＬ−８についてはマウスポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、および、ヒツジＩＬ−１βについてはウサギポリクローナル抗体を使用して、以前の記載（Ｉｋｅｇａｍｉ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８６：Ｌ５７３〜Ｌ５７９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）のように行った。
【００９７】
実施例１２
血漿におけるエンドトキシンレベルおよびサイトカインレベルの測定
ＬＰＳを、カブトガニ変形細胞溶解成分アッセイ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）により、０分（臍血）、３０分、１時間、２時間および５時間で血漿において定量した。ＥＬＩＳＡを、血漿中のＩＬ−８およびＩＬ−１βを、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから得られる抗体を使用して求めるために使用した。
【００９８】
実施例１３
肺、脾臓および肝臓におけるＲＮＡ分析
総ＲＮＡを、グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によって右下部肺葉、脾臓および肝臓から単離した。脾臓組織および肝臓組織を使用して、気管内投与されたＬＰＳが全身的な炎症性応答を誘導したかを評価した。ＲＮａｓｅ保護アッセイを、以前に記載されたように、ヒツジのＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＴＮＦαのＲＮＡ転写物を使用して行った（Ｎａｉｋ他（２００１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、２００１；１６４：４９４〜４９８；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ヒツジのリボソームタンパク質Ｌ３２を基準ＲＮＡとした。保護されたバンドの密度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用してホスホルイメージャーで定量した。
【００９９】
実施例１４
ｒｈＳＰ−Ｄの投与による新生児における敗血症の防止
敗血症について危険性のあるヒト新生児を特定する。新生児に、ｒｈＳＰ−Ｄを、体重１ｋｇあたり１ｍｇのＳＰ−Ｄでエアロゾル配合物を使用して投与する。投与を１日に４回行う。患者を継続してモニターする。この方法の使用によって、敗血症に対する新生児の感受性が低下する。
【０１００】
実施例１５
ｒｈＳＰ−Ｄの投与による幼児における敗血症の処置
敗血症と診断される幼児を特定する。幼児に、ｒｈＳＰ−Ｄを、エアロゾル配合物を使用して体重１ｋｇあたり４ｍｇのｒｈＳＰ−Ｄで投与する。投与を１時間毎に行う。血漿中のエンドトキシンレベルをモニターする。この方法の使用によって、敗血症が治まり、死の危険性が低下する。
【０１０１】
実施例１６
ｒｈＳＰ−Ｄの３０ＡＡフラグメントの投与による幼児における敗血症の処置
敗血症と診断される幼児を特定する。幼児に、ＳＰ−Ｄの領域に対応する３０アミノ酸のペプチドを、エアロゾル配合物を使用して体重１ｋｇあたり０．５ｍｇのペプチドで投与する。投与を１時間毎に行う。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、敗血症が治まり、死の危険性が低下する。
【０１０２】
実施例１７
ｒｈＳＰ−Ｄの投与による個体における死の危険性または敗血症を防止するための肺感染症の処置
重篤な肺感染症の個体を特定する。個体は、肺感染症が続くならば、敗血症を発症する危険性がある。患者に、ｒｈＳＰ−Ｄを、１日に２回投与されるとき、１０ｍｇ／ｋｇで投与する。患者の血漿におけるエンドトキシンレベルを５日間にわたって１日に２回測定する。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、肺感染症が治まり、敗血症を発症する危険性が低下する。
【０１０３】
実施例１８
抗生物質との併用でのｒｈＳＰ−Ｄの投与による個体における死の危険性または敗血症を防止するための肺感染症の処置
重篤な肺感染症の個体を特定する。個体は、肺感染症が続くならば、敗血症を発症する危険性がある。患者に、ｒｈＳＰ−Ｄを、１日に６回投与されるとき、１ｍｇ／ｋｇで投与する。患者にはまた、経口による抗生物質処置が与えられる。患者の血漿におけるエンドトキシンレベルを５日間にわたって１日に２回測定する。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、肺感染症が治まり、敗血症を発症する危険性が低下する。
【０１０４】
実施例１９
ＬＰＳおよびＳＰ−Ｄによる感染研究のためのプロトコル
マウスを加温し、吸入２％イソフルランにより麻酔した。麻酔を足指つまみ試験によって確認する。尾をアルコールにより調製し、尾に、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ、ＬＰＳ、または、室温で１０分間プレインキュベーションされるＳＰ−Ｄと一緒でのＬＰＳを注入する。ＳＰ−Ｄ（１ｍｇ／ｍｌ）をＳＰ−Ｄ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）において保存し、１ｍＭ ＣａＣｌ２を伴うＰＢＳにおいて希釈する。ＬＰＳを等体積のＳＰ−Ｄ緩衝液において保存し、１ｍＭ ＣａＣｌ２を伴うＰＢＳにおいて希釈する。１ｍＭ ＣａＣｌ２および等体積のＳＰ−Ｄ緩衝液を伴うＰＢＳをコントロール緩衝液として使用する。
【０１０５】
実施例２０
ＳＰ−Ｄ分析のための血漿および臓器の調製
ＬＰＳ、ＳＰ−Ｄまたはコントロール緩衝液を投与した後、マウスに致死量のチオペントンナトリウム（８０μｇ／ｇ）を与え、血液を心臓穿刺または眼窩後技術によって集める。血液を氷上に置き、直ちに遠心分離して、血漿を単離する。心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓を集め、組織学のためにパラホルムアルデヒドに入れるか、または、ＲＮＡ単離のためにホモジネートする。
【０１０６】
実施例２１
全身的ＳＰ−Ｄ処置はＬＰＳ感染哺乳動物における生存を改善する
マウスに、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、致死量のＬＰＳ（８ｍｇ／ｋｇ）をＳＰ−Ｄ（２ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール緩衝液とともに与える。生存を７２時間にわたって４時間毎にモニターする。瀕死状態（逆立った毛、動くことが完全にできないこと、および、下痢）の動物は非生存体と見なし、致死量のチオペンタンナトリウムにより安楽死させる。研究では、７５％の死亡率がＬＰＳ処置マウスにおいて７２時間までに予測される。この方法の使用によって、処置群の間における７２時間での生存における統計学的有意差が認められ、より高い生存率がＳＰ−Ｄ処置群において認められ、このことは、全身的ＳＰ−Ｄ処置がＬＰＳ感染哺乳動物の生存を改善することを示している。
【０１０７】
実施例２２
全身的ＳＰ−Ｄ処置はＬＰＳ感染哺乳動物における組織傷害を改善する
マウスを、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、ＳＰ−Ｄ（２ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール緩衝液とともにＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ）で処置する。肝臓を２４時間で集め、組織傷害のマーカー（これには、肝臓でのＴＮＦα、ＮＦκＢ、ｉＮＯＳおよびミエロペルオキシダーゼの発現、肝細胞の壊死、ならびに、好中球浸潤が含まれるが、これらに限定されない）を評価する。遺伝子発現研究のために、肝臓をホモジネートし、ＲＮＡを単離し、濃度および純度について調べる。ｃＤＮＡを逆転写酵素重合によって合成し、ＰＣＲによって増幅する。遺伝子発現を、リアルタイムＰＣＲによって、または、アガロースゲルでの分離の後でのＰＣＲ産物の濃度測定によって定量する。すべての結果がＬ３２コントロールまたはＧＡＰＤＨコントロールと比較して報告される。この方法の使用によって、ＬＰＳにより誘導される組織傷害のマーカーにおける統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、全身的ＳＰ−Ｄ処置がＬＰＳ感染哺乳動物における組織傷害を改善することを示している。
【０１０８】
実施例２３
ＳＰ−Ｄ処置は血漿ＬＰＳのクリアランス速度を増大させる
マウスを、実施例１９に記載されるように、コントロール緩衝液またはＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。血液を、注入後の０．５時間、１時間、２時間、４時間および６時間で集める。ＬＰＳレベルを、実施例１２に記載されるようにリムルスアッセイによってモニターし、ＬＰＳの半減期を計算する。この方法の使用によって、クリアランス速度における統計学的に有意な増大、および、ＬＰＳの半減期における統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が血漿ＬＰＳのクリアランス速度を増大させることを示している。
【０１０９】
実施例２４
ＳＰ−Ｄ処置は組織特異的場所でのＬＰＳ誘導の炎症を阻害する
マウスを、実施例１９に記載されるように、コントロール緩衝液またはＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓（これらに限定されない）を含む）を注入後２時間で集め、ｍＲＮＡを組織ホモジネートから単離する。ＩＬ−６の遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲによって測定する。この方法の使用によって、ＬＰＳ刺激されたＩＬ−６発現における統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置マウスの特定の組織において認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が組織特異的場所でのＬＰＳ誘導の炎症を阻害することを示している。
【０１１０】
実施例２５
ＳＰ−Ｄ処置は特定の細胞タイプにおけるＬＰＳ誘導の炎症を阻害する
脾臓白血球の単一細胞懸濁物を１００μｍの濾過器での分離によってマウス脾臓から単離し、組織培養培地に入れる。場合により、リンパ球集団およびマクロファージ集団への脾臓白血球のさらなる選抜が組織培養プレートへの接着によって達成される。ＬＰＳ非含有条件で４８時間培養した後、白血球を、２４時間、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により、または、ＳＰ−Ｄ（５μｇ／ｍｌ）とともにＬＰＳにより刺激する。培地を集め、ＩＬ−６およびＴＮＦαのレベルを培養上清においてＥＬＩＳＡによって測定する。この方法の使用によって、Ｌ−６およびＴＮＦαのレベルにおける統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置の脾臓白血球において認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が特定の細胞タイプにおけるＬＰＳ誘導の炎症を阻害することを示している。
【０１１１】
実施例２６
ＳＰ−Ｄ処置は肺傷害の不在下でＬＰＳの全身的漏出を防止する
野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスを吸入イソフルランにより麻酔し、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を気管内注入によって投与する。血液を、注入後の１時間、２時間、４時間および６時間で集め、血漿中のＬＰＳレベルをリムルスアッセイによって測定する。この方法の使用によって、血漿中のＬＰＳレベルにおける統計学的有意差が２つの群の間で認められ、より高いＬＰＳレベルがＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が肺傷害の不在下でＬＰＳの全身的漏出を防止し得ることを示している。
【０１１２】
実施例２７
盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）のためのプロトコル
マウスを吸入２％イソフルランで麻酔するか、または、チオペントンナトリウムの非致死的な腹腔内注入によって麻酔する。無菌的調製の後、マウスの盲腸を２ｃｍの腹部切開により露出させ、回盲弁からおよそ０．５ｃｍ遠位側で結紮する。結紮された盲腸を２５ゲージまたは３０ゲージのニードルで穿刺する。盲腸を腹腔に戻し、腹腔を閉じる。１ｍｌの規定生理的食塩水溶液を、サードスペース（ｔｈｉｒｄ−ｓｐａｃｅ）液喪失を補償するために皮下に注入する。擬似処置マウスを、盲腸を隔離し、結紮または穿刺を伴うことなく腹腔に戻すことを除いて、上記のように処置する。ＣＬＰ後直ちに、マウスを、実施例１９に記載されるように注入のために調製する。
【０１１３】
実施例２８
ＳＰ−Ｄ処置は全身的感染における生存を改善する
ＣＬＰを実施例２７に記載されるようにマウスに対して行う。続いて、マウスに、ＳＰ−Ｄ（２ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール緩衝液を、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により投与する。生存を７２時間にわたって４時間毎にモニターする。瀕死状態（逆立った毛、動くことが完全にできないこと、および、下痢）の動物を非生存体と見なし、致死量のチオペンタンナトリウムにより安楽死させる。この方法の使用によって、処置群の間における７２時間での生存における統計学的有意差が認められ、より高い生存率がＳＰ−Ｄ処置群において認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が全身感染の対象における生存を改善することを示している。
【０１１４】
実施例２９
ＳＰ−Ｄ処置は全身的感染時における組織傷害を軽減させる
ＣＬＰを、実施例２７および実施例２８に記載されるように、ＳＰ−Ｄを伴って、また、ＳＰ−Ｄを伴うことなくマウスに対して行う。肝臓を２４時間で採取し、組織傷害のマーカーを実施例２２に記載されるように評価する。この方法の使用によって、ＬＰＳにより誘導される組織傷害のマーカーにおける統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が全身的感染の対象における組織傷害を軽減させることを示している。
【０１１５】
実施例３０
ＳＰ−Ｄ処置は全身的感染における免疫応答を高める
ＣＬＰを、実施例２７および実施例２８に記載されるように、ＳＰ−Ｄを伴って、また、ＳＰ−Ｄを伴うことなくＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導する。腹膜腔を洗浄し、血液をＣＬＰ後６時間で集める。血漿および腹膜洗浄液のＬＰＳレベルをリムルスアッセイによって求める。細菌数を、血液または腹膜洗浄液の連続対数希釈、および、トリプシン消化ダイズ寒天ディッシュに置床することによって求める。コロニーを一晩のインキュベーションの後で計数する。この方法の使用によって、血漿および腹膜のＬＰＳレベルまたは細菌レベルにおける統計学的有意差が２つの群の間で認められ、より低いＬＰＳレベルまたは細菌レベルがＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が全身的感染の対象における免疫応答を高めることを示している。
【０１１６】
実施例３１
ＳＰ−Ｄ処置はＬＰＳまたは細菌の全身的拡大を低下させる
ＣＬＰを、実施例２７および実施例２８に記載されるように、ＳＰ−Ｄを伴って、または、ＳＰ−Ｄを伴うことなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導する。腹膜腔を洗浄し、血液をＣＬＰ後６時間で集める。血漿および腹膜洗浄液のＬＰＳレベルをリムルスアッセイによって求める。細菌数を、血液または腹膜洗浄液の連続対数希釈、および、トリプシン消化ダイズ寒天ディッシュに置床することによって求める。コロニーを一晩のインキュベーションの後で計数する。この方法の使用によって、血漿のみでのＬＰＳレベルまたは細菌レベルにおける統計学的有意差が２つの群の間で認められ、より低いＬＰＳレベルまたは細菌レベルがＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置がＬＰＳまたは細菌の全身的拡大を低下させることを示している。
【０１１７】
実施例３２
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）についてのマーカーが敗血症罹患Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおいて増大する
野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスを、実施例２７に記載されるようにＣＬＰに供する。ＡＲＤＳのマーカー（これには、例えば、肺胞タンパク質レベル、Ｓａｔ ＰＣレベル、または、好中球浸潤物が含まれるが、これらに限定されない）を下記のように測定する。２４時間で、肺を規定生理的食塩水により洗浄し、洗浄液における肺胞タンパク質レベルをＬｏｗｒｙアッセイによって求める。肺胞洗浄によって回収された表面活性脂質の量を、飽和ホスファチジルコリン（Ｓａｔ ＰＣ）レベルを測定することによって求める。簡単に記載すると、Ｓａｔ ＰＣレベルを、肺胞洗浄液をクロロホルム・メタノールにより抽出し、その後、四塩化炭素におけるＯｓＯ４による脂質抽出物の処置、および、シリカカラムクロマトグラフィを行うことによって測定する。細胞浸潤物を測定するために、肺胞洗浄液を遠心分離して、細胞をペレット化し、赤血球を低浸透圧ショックによって溶解する。細胞を再懸濁し、総細胞数を、血球計算器を使用して求める。分別細胞計数を、洗浄液の細胞遠心分離を行い、Ｗｒｉｇｈｔ染料により染色することによって求める。この方法の使用によって、肺胞タンパク質レベル、Ｓａｔ ＰＣレベルまたは好中球数における統計学的有意差が２つの群の間で認められ、より高いレベルがＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められる。
【０１１８】
実施例３３
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の処置における全身的ＳＰ−Ｄの相対的重要性を研究するためのＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける肺ＳＰ−Ｄの生成
ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（すなわち、ＳＰ−Ｃ−ｒｔＴＡ／（ｔｅｔＯ）７−ＳＰ−Ｄ／Ｓｆｔｐｄ−／−またはＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ／（ｔｅｔＯ）７−ＳＰ−Ｄ／Ｓｆｔｐｄ−／−）を作製する（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．他（２００２）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７：３８７０９〜３８７１３）。ＳＰ−ＣプロモータおよびＣＣＳＰプロモータはもっぱら肺において活性化され、（ｔｅｔＯ）７−ＳＰ−Ｄ構築物はＳＰ−Ｄの発現がドキシサイクリン誘導の制御下にある。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められた肺の異常が、これらの肺特異的導入遺伝子の発現によって完全になくなる。従って、これらの遺伝子組換えマウスはＳＰ−Ｄの全身的発現の除去を可能にし、これにより、全身的免疫性におけるＳＰ−Ｄの肺供給源対全身的供給源の相対的な重要性を比較する手段を提供する。
【０１１９】
実施例３４
全身的ＳＰ−Ｄは急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の症状の改善に関与する
ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（実施例３３）は、正常なレベルの肺ＳＰ−Ｄならびに正常な肺形態学および肺胞マクロファージ機能を有しており、しかし、全身的ＳＰ−Ｄのすべての供給源を有していない。ＣＬＰマウスにおけるＡＲＤＳに対する肺ＳＰ−Ｄ対全身的ＳＰ−Ｄの相対的な重要性を分離するために、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（実施例３３）におけるＡＲＤＳのマーカーを測定し、野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスにおけるＡＲＤＳマーカーレベルと比較する。すべてのマウスをドキシサイクリンにより処置して、ドキシサイクリンの抗菌作用を補償する。実施例２７に記載されるように、ＣＬＰを、野生型マウス、Ｓｆｔｐｄ−／−マウス、および、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて誘導する。ＡＲＤＳのマーカー（これには、肺胞タンパク質レベル、Ｓａｔ ＰＣレベル、または、好中球浸潤物が含まれるが、これらに限定されない）を、実施例３２に記載されるように測定し、これら３つの実験マウス群から得られた組織において比較する。この方法の使用によって、肺胞タンパク質レベル、Ｓａｔ ＰＣレベル、または、好中球数における統計学的に有意な増大が、野生型マウスにおいて見出されるそのようなレベルと比較して、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められ、このことは、全身的ＳＰ−ＤがＡＲＤＳの症状の改善に関与することを示している。
【０１２０】
実施例３５
ＳＰ−Ｄの全身的供給源は全身的感染時における血漿ＳＰ−Ｄのプールサイズに寄与する
研究では、血漿中のＳＰ−ＤレベルがＣＬＰ後に著しく増大することが示された。研究ではまた、肺のＳＰ−Ｄレベルが、ＣＬＰ後、野生型において、また、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて等しいことが示されている（ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける肺のＳＰ−Ｄレベルが一般に、ベースラインではより高い）。従って、ＳＰ−Ｄの肺供給源が、両方の実験群においてＣＬＰ後の増大した血漿中のＳＰ−Ｄレベルの唯一の供給源であるならば、この寄与は、完全に肺での漏出に依存することが予想される。
【０１２１】
敗血症を、野生型マウス、および、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（実施例３３）において、これらのマウスを、実施例２７に記載されるような技術を使用して、３０ゲージのニードルによるＣＬＰに供することによって誘導する。血液を４８時間で集め、血漿中のＳＰ−ＤレベルをＳＰ−ＤのＥＬＩＳＡによって求める。この方法の使用によって、血漿中のＳＰ−Ｄレベルにおける統計学的に有意な低下が、野生型マウスにおいて見出されるそのようなレベルと比較して、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄの全身的供給源が敗血症時における血漿ＳＰ−Ｄのプールサイズに寄与することを示している。
【０１２２】
実施例３６
ＳＰ−Ｄの血漿半減期が全身的感染時において増大する
敗血症のＳｆｔｐｄ−／−マウスを、実施例２７に記載されるような技術を使用して、３０ゲージのニードルによるＣＬＰによって作製する。コントロールのＳｆｔｐｄ−／−マウスを、擬似処置ＣＬＰ（すなわち、実施例２７に記載されるような結紮または穿刺を伴うことなく盲腸を露出させることによるＣＬＰ）によって作製する。４８時間後、マウスにＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）を尾静脈注入により投与する。血液を、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間で集め、血漿中のＳＰ−ＤレベルをＳＰ−ＤのＥＬＩＳＡによって測定する。その後、血漿ＳＰ−Ｄの半減期を計算する。この方法の使用によって、血漿中のＳＰ−Ｄレベルにおける統計学的に有意な増大が、コントロールマウスと比較して、ＣＬＰ処置マウスにおいて認められ、このことは、マウスにおいて血漿中のＳＰ−Ｄレベルを上昇させるために使用された生理学的機構が血漿ＳＰ−Ｄの分解における低下を介してであることを示している。
【０１２３】
実施例３７
Ｓｆｐｔｄプロモータ活性を制御する転写機構の特定
Ｓｆｐｔｄプロモータの欠失構築物を使用して、ＭＦＬＭ−９１Ｕ血管内皮細胞株における発現のために重要であるプロモータの領域を特定する。Ｓｆｐｔｄ遺伝子の近位側の８２塩基対、１６７塩基対、２４６塩基対、３５７塩基対、６００塩基対および６８０塩基対に連結されたルシフェラーゼレポーター遺伝子（図２１）を、標準的なトランスフェクションプロトコルを使用してＭＦＬＭ細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションされたＤＮＡの量を正規化するための適切なコントロール、および、トランスフェクション効率のための適切なコントロールが含められる。ルシフェラーゼ活性を、ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ構築物を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化する。血管内皮細胞における遺伝子発現を調節する転写因子（これには、Ｅ−ｂｏｘ、Ｎｆ１様およびＰｅａ３が含まれるが、これらに限定されない）を欠失分析において特定することができ、これらはＳｆｐｔｄプロモータにおけるコンセンサスな結合部位に対応する（Ｋｏｕ，Ｒ．他（２００５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４４：１５０６４〜１５０７３；Ａｒｄｅｋａｎｉ，Ａ．Ｍ．他（１９９８）、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、８０：４８８〜４９４；Ｃｉｅｓｌｉｋ，Ｋ．他（１９９８）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：１４８８５〜１４８９０；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。当業者はまた、Ｓｆｐｔｄ遺伝子の配列分析に基づいて、全身的なＳｆｐｔｄ発現を調節する他の転写因子を特定することができる。
【０１２４】
欠失分析によって特定されたＳｆｐｔｄプロモータの領域は、標準的なＤＮＡｓｅＩ保護アッセイによってさらに狭められる。ＭＦＬＭ細胞およびマウス肺上皮細胞（ＭＬＥ−１５）から得られた核抽出物を用いたＤＮＡｓｅＩフットプリント分析が、血管内皮細胞に対して特異的であるＳｆｐｔｄプロモータの保護された領域または高感受性領域を明らかにするために行われる。特にＭＦＬＭ細胞から得られた核抽出物によって保護されるか、または、特にＭＦＬＭ細胞から得られた核抽出物によって高感受性にされるＳｆｐｔｄプロモータのセグメントが、血管内皮細胞において特異的な転写因子ＤＮＡ結合の部位を特定するために使用される。
【０１２５】
欠失分析およびＤＮＡｓｅＩ保護アッセイによって特定された候補の転写因子はさらに、同時トランスフェクション実験によって調べられる。候補の転写因子がｐＣＭＶ発現ベクターに挿入され、上記で記載されるように、Ｓｆｐｔｄルシフェラーゼレポーター構築物とともにＭＦＬＭ細胞に同時トランスフェクションされ、ルシフェラーゼ活性が測定される。この方法の使用によって、ルシフェラーゼ活性における統計学的有意差が、コントロールのｐＣＭＶベクターとともに同時トランスフェクションされたＭＦＬＭ細胞におけるベースラインでのルシフェラーゼ活性と比較して認められ、このことは、候補のタンパク質が血管内皮細胞においてＳｆｐｔｄプロモータ活性を調節することを示している。
【０１２６】
これらの知見は、候補の転写因子のコンセンサスな結合部位が変異しているＳｆｐｔｄレポータープラスミドとの同時トランスフェクション実験を繰り返すことによって確認される。これらの実験の結果より、天然のＳｆｐｔｄのコンセンサスな結合部位を用いた同時トランスフェクション実験で以前に認められたルシフェラーゼ活性における統計学的有意差が、コンセンサスな結合部位が変異しているときにはもはや認められないことが明らかにされる。
【０１２７】
最後に、上記実験でＭＦＬＭ細胞において明らかにされた転写機構の細胞特異性が、他の細胞タイプ（すなわち、ＨｅＬａ細胞およびＨ４４１細胞）と比較することによって評価される。この方法の使用によって、ＭＦＬＭ細胞において明らかにされた転写機構の細胞特異性が、ルシフェラーゼ活性の調節がＭＦＬＭ細胞においてのみ認められることを示すことによって確認される。
【０１２８】
実施例３８
ＬＰＳは血管内皮細胞においてＳｆｐｔｄプロモータ活性を増大させる
ＭＦＬＭ細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で処置し、Ｓｆｐｔｄプロモータ活性を実施例３７に記載されるように測定する。この方法の使用によって、ルシフェラーゼ活性における統計学的に有意な増大が、ＬＰＳ非処置の細胞におけるベースラインでのルシフェラーゼ活性と比較して、ＬＰＳ処置細胞において認められ、このことは、ＬＰＳが血管内皮細胞においてＳｆｐｔｄプロモータ活性を増大させることを示している。
【０１２９】
実施例３９
全身的ＳＰ−Ｄが脾臓内の特定の細胞タイプによって除かれる
Ｓｆｐｔｄ−／−マウスに、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ（２００μｇ／ｋｇ）、または、ＬＰＳ（５０μｇ／ｋｇ）とともにＳＰ−Ｄ（２００μｇ／ｋｇ）を、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により投与する。脾臓を注入後８時間で採取し、パラホルムアルデヒドにおいて固定処理し、パラフィンに包埋し、切片化する。切片を脱パラフィン化し、再水和し、ＳＰ−Ｄ抗体とインキュベーションする。抗体複合体を、標準的な検出技術（例えば、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）、蛍光標識化）を使用して検出する。この方法の使用によって、脾臓における特定の細胞による細胞輸送が特定される。
【０１３０】
脾臓による全身的ＳＰ−Ｄの取り込みがＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインを必要とするかを明らかにするために、これらの実験を、ＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインを欠失する変異型タンパク質（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭ）を用いて繰り返す。この方法の使用によって、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭが、全長のタンパク質とは異なる組織経路または細胞経路により輸送され、このことは、ＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインが脾臓におけるＳＰ−Ｄのルーティングおよびプロセシングのために重要であることを示している。
【０１３１】
実施例４０
ＬＰＳが血管内皮細胞においてＳｆｔｐｄプロモータ活性を増大させる機構の決定
実施例３７に記載されるような分析をＬＰＳ処置のＭＦＬＭ細胞において行う。欠失構築物をＬＰＳ処置のＭＦＬＭ細胞において調べる。Ｓｆｔｐｄ発現をＬＰＳに応答して増大させるために重要である領域を、ＤＮＡｓｅＩ保護アッセイによって分析する。ＬＰＳで処理されたＭＦＬＭ細胞から得られた核抽出物に対して、コントロール緩衝液で処置されたＭＦＬＭ細胞から得られた核抽出物を用いて認められる保護された領域および高感受性領域の間の比較を、血管内皮細胞におけるＬＰＳ誘導によるＳｆｔｐｄ発現のために重要な領域をさらに単離するために行う。候補の転写因子を同時トランスフェクションおよび候補の転写因子の結合部位の変異によって調べる。この方法の使用によって、ルシフェラーゼ活性における統計学的有意差が、非処置のＭＦＬＭ細胞におけるベースラインでのルシフェラーゼ活性と比較して、ＬＰＳ処置されたＭＦＬＭ細胞において認められ、これにより、血管内皮細胞においてＬＰＳ誘導のＳｆｐｔｄプロモータ活性を調節する候補タンパク質の特定が示される。
【０１３２】
実施例４１
全身的感染を阻害することに関与するＳＰ−Ｄの構造的特徴および機構は、肺におけるウイルス攻撃に対する応答において使用されるものと類似する
ＳＰ−Ｄコラーゲン欠失変異体のｒＳｆｔｐｄＣＤＭは細菌と結合し、インフルエンザＡウイルスによる肺攻撃に対する正常な応答を容易にし、しかし、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは、ベースラインでの肺胞のマクロファージ活性（すなわち、明白な感染性攻撃の不在下でのマクロファージ活性）を調節すること、または、表面活性脂質の異常を直すことができない（Ｋｉｎｇｍａ，Ｐ．Ｓ．他（２００６）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８１：２４４９６〜２４５０５）。このタンパク質を、感染の不在下でのＳＰ−Ｄの調節を感染性攻撃時におけるＳＰ−Ｄの機能から分離することが必要である実験において使用する。
【０１３３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）、または、精製されたｒＳｆｔｐｄＣＤＭ（７５μｇ／ｋｇ、これは１５０μｇ／ｋｇのＳＰ−Ｄと等価なモル量を表す）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。血液を注入後２時間で集め、血漿中のＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルをＥＬＩＳＡによって測定する。この方法の使用によって、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭが全身的なＬＰＳ誘導の炎症を阻害することが明らかにされ、このことは、全身的なＬＰＳ誘導の炎症を阻害するために使用されるＳＰ−Ｄの構造的特徴および機構が、肺におけるウイルス攻撃の間に利用されるものと類似すること示している。
【０１３４】
実施例４２
ＳＰ−Ｄのオリゴマー化はＬＰＳ誘導の全身的炎症のＳＰ−Ｄ媒介による阻害のために要求されない
ＳＰ−Ｄは、Ｎ末端ドメイン内の１５位および２０位のシステイン残基におけるジスルフィド連結によって安定化される十量体として主に組み立てられる。これらの残基を欠失する変異型ＳＰ−Ｄ（ｒＳＰ−ＤＳｅｒ１５／２０）は、高次の多量体を形成することができない安定な三量体を形成する（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．他（２００１）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７６：１９２１４〜１９２１９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ｒＳＰ−ＤＳｅｒ１５／２０は炭水化物と結合するが、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおける異常なマクロファージ活性を直すことができず、このことから、肺のＳＰ−Ｄ機能におけるＳＰ−Ｄのオリゴマー化の重要性が明らかにされる。
【０１３５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）、または、精製されたｒＳＰ−ＤＳｅｒ１５／２０（１５０μｇ／ｋｇ）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。血液を注入後２時間で集め、血漿中のＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルをＥＬＩＳＡによって測定する。この方法の使用によって、ｒＳＰ−ＤＳｅｒ１５／２０が全身的なＬＰＳ誘導の炎症を阻害することが明らかにされ、このことは、全身的なＬＰＳ誘導の炎症のＳＰ−Ｄによる阻害がＳＰ−Ｄの多量体構造に依存しないこと、および、全身的ＳＰ−Ｄの作用機構が、肺においてＳＰ−Ｄによって利用される機構からかけ離れていることを示している。
【０１３６】
実施例４３
ＳＰ−ＤはＳＰ−Ｄ特異的な様式で全身的炎症を阻害する
ＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａはともに、肺の宿主防御において重要な役割を果たしており、しかし、ＳＰ−Ａを欠失するマウス（Ｓｆｔｐｄ−／−）は、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスに特徴的である肥大した泡沫状マクロファージを発達させず、このことは、ＳＰ−Ｄが、肺胞マクロファージの活性を、ＳＰ−Ｄに対して特異的である機構を介して調節することを示している（ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（２０００）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：３９３４〜３９４０；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：２７９〜２８６；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（１９９９）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１０３：１０１５〜１０２１；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：７００〜７０８；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１３７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）、または、ＳＰ−Ａ（１５０μｇ／ｋｇ）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。血液を注入後２時間で集め、血漿中のＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルをＥＬＩＳＡによって測定する。この方法の使用によって、ＳＰ−ＡがＬＰＳ誘導の全身的炎症を阻害しないことが明らかにされ、このことは、全身的なＬＰＳ誘導の炎症の阻害がＳＰ−Ｄに対して特異的であり、コレクチンファミリーのタンパク質の共通する性質でないことを示している。
【０１３８】
実施例４４
ＳＰ−Ｄの全身投与による新生児における敗血症の防止
敗血症について危険性のあるヒト新生児を特定する。新生児に、ＳＰ−Ｄを、体重１ｋｇあたり１ｍｇのＳＰ−Ｄで医薬配合物を使用して全身投与する。投与を１日に４回行う。患者を継続してモニターする。この方法の使用によって、敗血症に対する新生児の感受性が低下する。
【０１３９】
実施例４５
ＳＰ−Ｄの全身投与による幼児における敗血症の処置
敗血症と診断される幼児を特定する。幼児に、ＳＰ−Ｄを、医薬配合物を使用して体重１ｋｇあたり４ｍｇのＳＰ−Ｄで全身投与する。投与を１時間毎に行う。血漿中のエンドトキシンレベルをモニターする。この方法の使用によって、敗血症が治まり、死の危険性が低下する。
【０１４０】
実施例４６
ＳＰ−Ｄの３０ＡＡフラグメントの全身投与による幼児における敗血症の処置
敗血症と診断される幼児を特定する。幼児に、ＳＰ−Ｄの領域に対応する３０アミノ酸のペプチドを、医薬配合物を使用して体重１ｋｇあたり０．５ｍｇのペプチドで全身投与する。投与を１時間毎に行う。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、敗血症が治まり、死の危険性が低下する。
【０１４１】
実施例４７
ＳＰ−Ｄの全身投与による個体における死の危険性または敗血症を防止するための肺感染症の処置
重篤な肺感染症の個体を特定する。個体は、肺感染症が続くならば、敗血症を発症する危険性がある。患者に、ＳＰ−Ｄを、１日に２回投与されるとき、医薬配合物を使用して１０ｍｇ／ｋｇで全身投与する。患者の血漿におけるエンドトキシンレベルを５日間にわたって１日に２回測定する。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、肺感染症が治まり、敗血症を発症する危険性が低下する。
【０１４２】
実施例４８
抗生物質との併用でのＳＰ−Ｄの全身投与による個体における死の危険性または敗血症を防止するための肺感染症の処置
重篤な肺感染症の個体を特定する。個体は、肺感染症が続くならば、敗血症を発症する危険性がある。患者に、ＳＰ−Ｄを、１日に６回投与されるとき、医薬配合物を使用して１ｍｇ／ｋｇで全身投与する。患者にはまた、経口による抗生物質処置が与えられる。患者の血漿におけるエンドトキシンレベルを５日間にわたって１日に２回測定する。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、肺感染症が治まり、敗血症を発症する危険性が低下する。
【０１４３】
様々な置換および修飾が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書中に開示された発明に対して行われ得ることが当業者には明らかである。様々な修飾が、開示された発明の範囲内において可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態および最適な特徴によって具体的に開示されているが、本明細書中に開示された概念の修飾および変形が当業者によって用いられ得ること、また、そのような修飾および変形が、開示によって定義されるような本発明の範囲内に含まれると見なされることが理解される。
【０１４４】
別途示されない限り、本明細書において使用される、成分の量、特性（例えば、実験条件など）などを表すすべての数字は、すべての場合において用語「約」によって修飾されているとして理解しなければならない。従って、別に示されない限り、本明細書において示される数値パラメーターは、本発明によって求められようとする所望の性質に依存して変化し得る近似値である。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群およびコントロール群を比較するカプラン−マイヤープロットである。コントロール群では、子ヒツジの２０％のみが、５時間の研究期間が終了する前に生存していた。対照的に、ｒｈＳＰ−Ｄにより処置されたすべての子ヒツジが生存した。ログランク検定によってｐ＜０．０５。
【図２Ａ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における血漿中のエンドトキシンレベルの線グラフによる比較である。気管内エンドトキシンがコントロール群では循環において検出され、時間とともに増大し、一方、ｒｈＳＰ−Ｄは、５時間の研究の期間中、血漿中のエンドトキシン濃度を低下させた。
【図２Ｂ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における収縮期血圧測定を比較する線グラフである。ｒｈＳＰ−Ｄによる処置はエンドトキシンショックを防止した。収縮期血圧がｒｈＳＰ−Ｄ処置群では早産新生児の正常なレベルで維持された。対照的に、血圧が、３時間が経過した後、コントロール群では徐々に低下した。＊ｐ＜０．０５（対コントロール）。
【図３Ａ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における血液ｐＨを比較する線グラフである。血液ｐＨがｒｈＳＰ−Ｄ処置により維持された。ＬＰＳ処置には、低下した血液ｐＨが伴った一方で、ｒｈＳＰ−Ｄによる処置では、ｐＨが維持され、出生前のエンドトキシン誘導によるショックが防止された。
【図３Ｂ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群におけるＢＥ（血中塩基過剰）を比較する線グラフである。ＢＥが気管内ＬＰＳによって変化した。気管内ＬＰＳは代謝性アシドーシスを誘導し、ｒｈＳＰ−Ｄ処置は低いＢＥおよびエンドトキシンショックを防止した。
【図４Ａ】図４はｐＣＯ２および換気圧の逐次測定を明らかにする。図４Ａは、ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群におけるｐＣＯ２を比較する線グラフである。気管内ＬＰＳは、３時間が経過した後、ｐＣＯ２における増大を引き起こした。ｒｈＳＰ−Ｄにより処置されたとき、ｐＣＯ２が維持された。
【図４Ｂ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における換気圧（ＰＩＰ−ＰＥＥＰ）を比較する線グラフである。目標の一回換気量を維持するために使用された換気圧の量は両方の群について類似していた。＊ｐ＜０．０５（対コントロール）。
【図５Ａ】図５はｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における前炎症性サイトカインの発現の比較である。図５Ａは、脾臓および肝臓における前炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８）のｍＲＮＡが、気管内ＬＰＳ滴注後、コントロールの子ヒツジでは増大したことを明らかにする棒グラフである。脾臓および肝臓における前炎症性サイトカインのｍＲＮＡがｒｈＳＰ−Ｄの投与によって低下した。
【図５Ｂ】脾臓および肝臓における前炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８）のｍＲＮＡが、気管内ＬＰＳ滴注後、コントロールの子ヒツジでは増大したことを明らかにする棒グラフである。脾臓および肝臓における前炎症性サイトカインのｍＲＮＡがｒｈＳＰ−Ｄの投与によって低下した。
【図５Ｃ】気管内ＬＰＳが肺におけるＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡを増大させたことを明らかにする棒グラフである。ｒｈＳＰ−Ｄにより処置されたとき、ＩＬ−１βの発現が低下した。
【図５Ｄ】血漿におけるＩＬ−８の濃度を示す線グラフである。血漿中のＩＬ−８レベルがコントロール群では増大した。血漿中のＩＬ−８レベルがｒｈＳＰ−Ｄ処置によって低いレベルで維持された。＊ｐ＜０．０５（対コントロール）。
【図６】ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色による肺の形態学（６Ａおよび６Ｂ）、ならびに、ＩＬ−８の免疫組織化学（６Ｃおよび６Ｄ）およびＩＬ−１βの免疫組織化学（６Ｅおよび６Ｆ）を示すいくつかの組織学的画像を含む。コントロール群およびｒｈＳＰ−Ｄ群の両方において、増大した顆粒球、ならびに、ＩＬ−８およびＩＬ−１βについての陽性に染色された炎症性細胞が認められる。ＩＬ−８およびＩＬ−１βについて免疫染色された炎症性細胞が気管内ｒｈＳＰ−Ｄ処置によって低下した。
【図７Ａ】図７は肺機能がｒｈＳＰ−Ｄ処置によって影響されなかったことを明らかにする線グラフである。図７Ａは、換気時におけるＶＴ、ＰＩＰ−ＰＥＥＰおよび体重から計算された動的肺コンプライアンスを示す。
【図７Ｂ】静的肺体積圧力曲線測定値の下降部がコントロール群およびｒｈＳＰ−Ｄ群の間で類似していたことを明らかにする。
【図８】高レベルのｒｈＳＰ−Ｄが気管内ＳＰ−Ｄ滴注後５時間で気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において検出されたことを明らかにする免疫ブロットである（動物＃６、＃７および＃８）。ｒｈＳＰ−Ｄが、コントロールの子ヒツジから得られたＢＡＬＦでは見出されなかった（動物＃１および＃２）。
【図９】ＬＰＳとともに投与されたとき、ＳＰ−Ｄが濃度依存的様式で血漿中のＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルを著しく低下させたことを明らかにする。図９ＡはＩＬ−６のデータを示し、図９ＢはＴＮＦαのデータを示す。
【図１０】ＳＰ−Ｄが、ＳＰ−Ｄ処置の不在下での血漿中のＩＬ−６レベルと比較した場合、ＬＰＳ用量の前（ｔ＝−３０）、ＬＰＳ用量と同時（ｔ＝０）またはＬＰＳ用量の後（ｔ＝＋３０）で投与されたとき、血漿中のＩＬ−６レベルを低下させたことを示す。
【図１１Ａ】図１１はＬＰＳにより誘導される炎症の阻害がＳＰ−Ｄ ＬＰＳ結合親和性と直接に相関したことを示す。図１１Ａは、ＳＰ−Ｄについての２つの異なった大腸菌株のＬＰＳ結合親和性を例示する。菌株０１１：Ｂ４は大きいＳＰ−Ｄ ＬＰＳ結合親和性を有し、これに対して、菌株０１２７：Ｂ８は低いＳＰ−Ｄ ＬＰＳ結合親和性を有する。
【図１１Ｂ】高結合性ＬＰＳ株（菌株０１１：Ｂ４）をＳＰ−Ｄとプレインキュベーションすることにより、血漿中のＩＬ−６レベルが著しく低下したことを明らかにし、しかしながら、ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄに対する親和性が低いＬＰＳ株（菌株０１２７：Ｂ８）により誘導される炎症を阻害しなかった。
【図１２】全身的ＬＰＳ暴露の後での野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける血漿中のサイトカインレベルの比較である。ＬＰＳにより処置されたＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける血漿ＩＬ−６レベルは野生型マウスの場合よりも約８０％低く、これは予想以外の結果であった。
【図１３】ＳＰ−Ｄ処置および非処置の全身的敗血症マウスにおける血漿中のサイトカインレベルの比較である。盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）の後、ＳＰ−Ｄにより処置されたマウスは、コントロールマウスよりも低い平均血漿ＩＬ−６レベルを示した。
【図１４】ＳＰ−Ｄ処置および非処置の全身的敗血症マウスにおける生存の比較である。ＣＬＰ後、死亡率は、コントロールマウスの方が、ＳＰ−Ｄにより処置されたマウスの場合よりも著しく高かった。
【図１５】敗血症マウスおよびコントロールマウスにおける血漿中のＳＰ−Ｄレベルの比較である。血漿中のＳＰ−Ｄレベルが、コントロールマウスと比較して、敗血症誘導マウスにおいて著しく低下した。このことは、マウスのＣＬＰモデルは、全身的ＳＰ−Ｄ産生を評価するための機能的なインビボシステムを提供し得ることを示す。
【図１６】Ｓｆｔｐｄプロモータが血管内皮細胞において活性化されることを明らかにする。ＭＦＬＭ−９１Ｕ細胞（不死化されたマウス胎児肺間葉細胞株）を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子につながれたＳｆｔｐｄプロモータを含有するプラスミド、または、ルシフェラーゼレポーター遺伝子だけを含有するコントロールプラスミドにより一過性にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性が、コントロールプラスミドによりトランスフェクションされた細胞と比較して、ルシフェラーゼ遺伝子につながれたＳｆｔｐｄプロモータを含有するプラスミドによりトランスフェクションされたＭＦＬＭ−９１Ｕ細胞において著しく増大した。
【図１７】野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける経時的な血漿中のＳＰ−Ｄレベルを示す線グラフである。ＳＰ−Ｄが、野生型マウスでは約６時間の半減期で血漿に残存し、しかし、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは、ＳＰ−Ｄの半減期が約２時間に低下した。興味深いことに、ネックドメインおよび炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）のみの三量体からなる短縮型ＳＰ−Ｄフラグメントの半減期は６２時間である（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｈ２２８６〜Ｈ２２９４）。まとめると、結果から、血漿中のＳＰ−Ｄを取り込むための特異的な細胞機構が存在すること、および、この機構はＳＰ−ＤのＮ末端ドメインおよび／またはコラーゲンドメインに依存していることが示される。
【図１８】ＳＰ−Ｄを尾静脈注入により投与した後のＳｆｔｐｄ−／−マウスでの組織ホモジネートにおけるＳＰ−Ｄレベルを例示する。脾臓におけるＳＰ−Ｄのレベルが、他の組織で観測されたＳＰ−Ｄレベルよりも、また、脾臓におけるバックグラウンドレベルに対して著しく高くなった。このことは、全身的ＳＰ−Ｄが脾臓による循環から除かれることを示す。
【図１９】野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウス（変異型導入遺伝子ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋が発現する）における肺の形態学およびマクロファージ活性を例示する。変異型導入遺伝子ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋は、正常なＣＲＤ、ネックドメインおよびＮ末端ドメインを有するが、コラーゲンドメインを有しない変異型ＳＰ−Ｄタンパク質（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭ）を発現する。この変異型ＳＰ−Ｄタンパク質は野生型マウスにおいて肺の形態学またはマクロファージ活性を乱さなかった。しかしながら、この変異型ＳＰ−Ｄタンパク質はＳｆｔｐｄ−／−マウスのベースライン状態での異常なマクロファージ活性を回復させなかった。増大したレベルのメタロプロテイナーゼを発現する肥大した泡沫状マクロファージが、Ｓｆｔｐｄ−／−マウス、および、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭタンパク質を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて容易に認められた。図１９Ａは野生型マウスからの肺組織を例示する。図１９Ｂは野生型バックグラウンドにおけるｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋導入遺伝子の発現を例示する。図１９ＣはＳｆｔｐｄ−／−マウスからの肺組織を例示する。図１９ＤはＳｆｔｐｄ−／−バックグラウンドにおけるｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋導入遺伝子の発現を示す。図における矢じりは、肥大した泡沫状マクロファージを示す。
【図２０】インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）に対する気管内暴露に対する、野生型マウス、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスおよびｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−マウスの応答を例示する。増大したレベルのＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγが、ＩＡＶ攻撃されたＳｆｔｐｄ−／−マウスの肺ホモジネートにおいて認められた。しかしながら、これらのレベルはｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−マウスの肺ホモジネートでは野生型レベルに戻った。図２０Ａは、ＩＡＶ攻撃されたマウスの３つの群における血漿中のＩＬ−６についてのデータを示す。図２０Ｂおよび図２０Ｃは同様に、ＩＡＶ攻撃されたマウスの３つの群における血漿中のＴＮＦαレベルおよびＩＦＮγレベルについての結果をそれぞれ例示する。
【図２１】血管内皮細胞における発現のために重要であるＳｆｔｐｄプロモータの領域を特定するための実験で使用される利用可能なＳｆｔｐｄプロモータ構築物の概略図である。
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府援助のＲ＆Ｄに関する言及）
本明細書中に開示される本発明のいくつかの態様がＮＩＨ（国立衛生研究所）補助金番号ＨＬ６３３２９のもとでの合衆国政府の援助によりなされた。合衆国政府は本発明のこれらの態様において一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、生物学的に活性なタンパク質およびその医薬的使用の分野に関連する。より具体的には、本発明は、ＳＰ−Ｄタンパク質、および、敗血症を防止または処置するための個体へのその投与に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
肺の表面活性物質は肺における正常な肺力学およびガス交換のために不可欠である。肺の表面活性物質はＩＩ型上皮細胞によって産生され、肺における表面張力を低下させる表面活性物質の能力を与えるリン脂質成分から構成される。加えて、コラーゲン性のレクチンドメイン含有ポリペプチドであるコレクチンと呼ばれる表面活性物質と会合するタンパク質がいくつか存在する。これらの表面活性タンパク質の１つ、すなわち、表面活性タンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）と呼ばれる表面活性タンパク質が、表面活性物質の構造および機能ならびに宿主防御に関与していると考えられる。
【０００４】
敗血症は、血流における甚だしい細菌感染から生じる高レベルの細菌エンドトキシンによって典型的には引き起こされる重篤な、多くの場合には命を脅かす疾患である。敗血症は、多くの体組織（例えば、腎臓、肝臓、膀胱および皮膚など）から生じ得る一方で、肺における初期感染に由来することが多い。
【０００５】
どのような年齢の個体であっても、敗血症に罹る可能性がある。幼児は、その免疫系が未成熟であるために、敗血症に特に罹りやすい。例えば、低出産体重児（１５００ｇ未満）はしばしば、重篤な全身性の感染症（Ｋａｕｆｍａｎ他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１７：６３８〜６８０；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、および、敗血症に関連したショックを経験し、これらは、子宮内での絨毛性羊膜炎および出生後の肺感染症にさらされることによってよく起こる（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ他（２０００）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４２：１５００〜１５０７；Ｗｅｎｓｔｒｏｍ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１７８：５４６〜５５０；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。その未成熟のために、早産新生児の肺は非常に透過性であり、タンパク質、生物、毒素および媒介因子が肺から全身循環に漏れることを許している（Ｐｒｉｎｇｌｅ他（１９８６）、Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、２９：５０２〜５１３；Ｊｏｂｅ他（１９８５）、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、５８：１２４６〜１２５１；Ｂｌａｎｄ他（１９８９）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、８４：５６８〜５７６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。新生児敗血症症候群は、肺炎および絨毛性羊膜炎に関連する場合、満期児および早産児の両方における新生児の発病および死亡の一般的な原因である（Ｋａｕｆｍａｎ他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１７：６３８〜６８０；Ｄｅｍｐｓｅｙ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔａｌ、２２：１５５〜１５９；Ｊｉａｎｇ他（２００４）、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ、３７：３０１〜３０６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。以前の研究では、全身的炎症が、早産新生児の子ヒツジにおいて、気管内リポ多糖（ＬＰＳ）が全身循環に漏れることによって引き起こされた（Ｋｒａｍｅｒ他（２００２）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０００６】
肺感染および全身的感染に対する新生児の罹りやすさは、その肺構造および免疫系の両方が未成熟であることに関連している。早産児の肺は、表面活性タンパク質（ＳＰ）ＡおよびＤを含めて、肺の表面活性タンパク質および生得的な宿主防御タンパク質が不十分である（Ｍａｓｏｎ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７５：Ｌ１〜Ｌ１３；Ｍｉｙａｍｕｒａ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１２１０：３０３〜３０７；Ａｗａｓｔｈｉ他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：９４２〜９４９１０〜１２；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。新生児における呼吸困難のために使用される表面活性物質代償調製物はＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃを含有するが、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄまたは他の生得的な宿主防御タンパク質を含有しない。肺のコレクチンが、ウイルス病原体、細菌病原体および真菌病原体から肺を守ることにおいて重要な役割を果たしている。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄはともに抗菌活性および抗炎症活性を有する（Ｍａｓｏｎ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７５：Ｌ１〜Ｌ１３；Ｃｒｏｕｃｈ他（２００１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、６３：５２１〜５５４；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄの低下したレベルが、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）のモデルにおける肺の炎症（Ａｗａｓｔｈｉ，Ｓ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：９４２〜９４９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に、また、嚢胞性線維症の小児における肺の炎症（Ｎｏａｈ他（２００３）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６８：６８５〜６９１；Ｐｏｓｔｌｅ他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：９０〜９８；ｖｏｎ Ｂｒｅｄｏｗ他（２００３）、Ｌｕｎｇ、１８１：７９〜８８；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）に関連しており、そのような肺の炎症は疾患の病理発生に影響を及ぼす可能性があり、敗血症を引き起こす可能性がある。
【０００７】
敗血症に対する個体の罹りやすさを低下させる方法、および、敗血症を処置する方法、具体的には、典型的には肺に天然に存在する免疫関連タンパク質の投与の使用によるそのような方法は、敗血症についての危険性があるすべての年齢の患者を処置するために有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、一般には、患者における肺感染および敗血症を防止および処置するための方法、および、ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントあるいはその組換え形態を含有する組成物に関連する。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態において、個体における敗血症を防止または処置する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。個体は、例えば、哺乳動物であり得、ヒトであり得る。個体は、例えば、成人、小児、幼児、新生または早産新生児であり得る。投与は、例えば、気管内投与、エアロゾル化または全身投与によって行うことができる。敗血症は、例えば、細菌感染症または肺感染症に由来し得る。ポリペプチドは組換えポリペプチドであり得る。組換えポリペプチドは、例えば、組換えヒト表面活性タンパク質Ｄであり得る。ポリペプチドは、例えば、体重１ｋｇあたり約０．５０ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇのポリペプチドから、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇのポリペプチドの範囲で投与することができる。ポリペプチドは、例えば、体重１ｋｇあたり約２ｍｇのポリペプチドで投与することができる。ＳＰ−Ｄ配合物は、例えば、気管内投与、エアロゾル化または全身投与によって投与することができ、気管内投与、エアロゾル化または全身投与のために好適な形態であり得る。組換えポリペプチドは約５個のアミノ酸〜約３７５個のアミノ酸のアミノ酸配列を有することができる。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態において、個体における敗血症を防止または処置する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸を個体に投与することによる方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態において、個体におけるリポ多糖（ＬＰＳ）の血漿への漏出を低下させる方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態において、個体における大腸菌細胞の血漿への漏出を低下させる方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態において、個体における血漿中のエンドトキシンレベルを低下させる方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、肺からのエンドトキシンの放出を阻害する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを投与することによる方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態において、気管内エンドトキシンの全身的影響から個体を保護する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、全身的炎症を防止する方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを個体に投与することによる方法が提供される。全身的炎症は、例えば、肺からのエンドトキシンの放出によって引き起こされ得る。
【００１７】
本発明のなおさらなる実施形態において、肺感染症の個体を処置するための方法であって、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントを投与することによる方法が提供される。肺感染症は、例えば、細菌によって引き起こされ得る。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントを投与することによって、敗血症の危険性が低下するように、肺感染症の個体を処置するための方法が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはその活性なフラグメントを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物におけるＳＰ−Ｄポリペプチドは、例えば、組換えＳＰ−Ｄポリペプチドであり得る。組換えＳＰ−Ｄポリペプチドは、例えば、組換えヒトＳＰ−Ｄポリペプチドであり得る。ＳＰ−Ｄポリペプチドは、例えば、配列番号２または配列番号３に示される配列を含むことができる。さらに、ＳＰ−Ｄポリペプチドを含む医薬組成物は、例えば、医薬的に許容され得る分散化剤をさらに含むことができる。医薬組成物は、例えば、気管内投与、エアロゾル化または全身投与のために配合することができる。医薬組成物はまた、ＳＰ−Ｄポリペプチドが、例えば、体重１ｋｇあたり約０．５０ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇのポリペプチドから、体重１ｋｇあたり約１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇのポリペプチドの範囲で投与されるように配合することができる。医薬組成物は、ＳＰ−Ｄポリペプチドが、例えば、体重１ｋｇあたり約２ｍｇのポリペプチドで投与されるように配合することができる。
【００２０】
本発明の他の実施形態において、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはその活性なフラグメントをコードする核酸を含有する医薬組成物が提供される。核酸は、例えば、配列番号１に示される配列を含むことができる。核酸はまた、例えば、アデノウイルスベクター内にコードされ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
肺は、吸入された粒子および微生物によって絶えず攻撃されており、それにもかかわらず、肺は著しく健康なままである。これは、大部分が、肺のコレクチン、表面活性タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）および表面活性タンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）によるものである（Ｋｉｎｇｍａ，Ｐ．Ｓ．およびＪ．Ａ．Ｗｈｉｔｓｅｔｔ（２００６）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６：２７７〜８３；Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．およびＪ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ（２００１）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、６３：５２１〜５４；Ｈａｗｇｏｏｄ，Ｓ．およびＦ．Ｒ．Ｐｏｕｌａｉｎ（２００１）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、６３：４９５〜５１９；Ｗｈｉｔｓｅｔｔ，Ｊ．Ａ．（２００５）、Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｎａｔｅ、８８：１７５〜８０；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄの炭水化物認識ドメインと、生物表面の炭水化物成分との間における相互作用によって感染性生物を認識し、感染性生物と結合し、このことはさらには、肺胞のマクロファージによる感染性病原体のクリアランスを容易にする（Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｕ．他（１９９６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、３１８：５０５〜５１１；Ｌｉｍ，Ｂ．Ｌ．他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０２：１６７４〜８０；Ｋｕａｎ，Ｓ．Ｆ．他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄ遺伝子の標的化された欠失を有するマウス（Ｓｆｐｔｄ−／−）は、徐々に悪化する肺気腫および炎症を発症し、このことは、感染性粒子と結合することに加えて、ＳＰ−Ｄが、肺の宿主防御細胞を調節することにおいて重要な役割を有し得ることを示している（Ｋｏｒｆｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｒ．他（１９９８）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：２８４３８〜２９４４３；Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．他（２０００）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７：５９７２〜７；Ｃｌａｒｋ，Ｈ．他（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：２８９２〜２８９９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。肺の免疫系におけるその役割の結果として、ＳＰ−Ｄは、肺における微生物の成長およびその結果として生じた肺の損傷を制限するために設計された治療剤として開発中である。呼吸樹に加えて、ＳＰ−Ｄはまた、より低い濃度で血漿および多くの他の肺以外の組織（血管内皮細胞を含む）でも検出される（Ｓｔａｈｌｍａｎ，Ｍ．Ｔ．他（２００２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、５０：６５１〜６０；Ｈｏｎｄａ，Ｙ．他（１９９５）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１５２：１８６０〜６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｈ２２８６〜Ｈ２２９４；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄの肺外レベルは、肺内ＳＰ−Ｄと類似する様式で感染時および他の炎症状態の期間中において増大する（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７；Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ．他（２００５）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、３１：２５〜３３；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。しかしながら、肺外ＳＰ−Ｄの供給源および機能は大部分が不明である。本明細書中に記載されるように、予備的研究において、ＳＰ−Ｄは、肺のシステムを越えて宿主防御にも関与し、肺以外のシステムでは感染性病原体を排除することができ、また、宿主防御細胞を調節することができることが示される。
【００２２】
ＳＰ−Ｄは、生得的な免疫分子のコレクチンファミリーの多量体糖タンパク質であり、気道上皮細胞によって分泌される。ＳＰ−Ｄは、細菌、ウイルス、真菌およびダニ抽出物を含めて、広範囲の様々な微生物病原体に結合し、これらを凝集させ（Ｋｕａｎ他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；Ｌｉｍ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０２：１６７４〜１６８０；ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４５４：２６１〜２６９；Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｌ７５３〜Ｌ７６２；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）、また、細菌成分（例えば、ＬＰＳ、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸など）に直接的に結合する（Ｃｒｏｕｃｈ他（２００１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、６３：５２１〜５５４；ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｋ．他（２００４）、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７１：１２２９〜１２４９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。多量体形態のＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄが種々の微生物の表面でリガンドに結合して、それにより、微生物の凝集を誘導し、肺の病原体の免疫細胞媒介による認識およびクリアランスを刺激する微生物間のタンパク質架橋を形成することを可能にする（Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ，Ｋ．他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｌ７５３６２；Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ，Ｋ．Ｌ．他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９５８〜Ｌ９６９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。これらの微生物または微生物成分と相互作用することにより、ＳＰ−Ｄは、肺胞のマクロファージの活性化を阻害することによって、肺の感染またはＬＰＳにより誘導される炎症を制限する（Ｋｕａｎ他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；Ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ，Ｂ．Ａ．他（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ、２５：Ｓ６５６；ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ，Ｂ．Ａ．他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４５４：２６１〜９；Ｓｃｈａｕｂ，Ｂ．他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３４：１８１９〜２６；Ｌｉｕ，Ｃ．Ｆ．他（２００５）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３５：５１５〜５２１；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００２３】
ほとんどの微生物リガンドがマンノースまたはグルコースを含有しており、ＳＰ−Ｄは、イノシトール、マルトース、マンノースおよびグルコースに優先的に結合することが知られている。ＳＰ−Ａとは異なり、ＳＰ−Ｄは脂質Ａドメインに結合せず（Ｖａｎ Ｉｗａａｒｄｅｎ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、３０３（Ｐｔ２）：４０７〜４１１；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、しかし、ＬＰＳの連続したコアオリゴ多糖に結合する（Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１７７〜２０１；Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４０８：２７８〜２８９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。そのうえ、ＳＰ−Ｄの最大の分子寸法はＳＰ−Ａよりも５倍大きく、ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ａよりも大きい結合表面を有する（Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１７７〜２０１；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００２４】
ＳＰ−ＤはそのＣ末端のレクチン様ドメインを介して大腸菌属の表面に結合する。さらに、ＳＰ−Ｄが病原体に結合することにより、肺の食細胞による病原体の殺傷が促進される（Ｍａｓｏｎ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７５：Ｌ１〜Ｌ１３；Ｃｒｏｕｃｈ他（２００１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、６３：５２１〜５５４；Ｋｕａｎ他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；Ｌｉｍ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０２：１６７４〜１６８０；ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４５４：２６１〜２６９；Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１７７〜２０１；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄを欠失するマウス（Ｓｆｔｐｄ−／−マウス）は肺の感染および炎症に非常に罹りやすい（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００２５】
ＳＰ−Ｄは肺胞のマクロファージを調節する
感染性生物と結合することはＳＰ−Ｄ生理学の重要な特徴であるが、ＳＰ−Ｄ欠損のマウスモデルにより、肺の宿主防御におけるこのタンパク質のより複雑な役割が明らかにされた。Ｓｆｔｐｄ遺伝子の欠失を有するマウスは正常に生存したが、高まった表面活性脂質プールサイズを有し、肺の炎症および気腔の拡張を自然発症した（Ｋｏｒｆｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｒ．他（１９９８）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：２８４３８〜２９４４３；Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．他（２０００）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７：５９７２〜７；Ｃｌａｒｋ，Ｈ．他（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：２８９２〜２８９９）。ベースライン状態での肺胞のマクロファージ活性が、反応性酸素化学種およびメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を放出したアポトーシス性マクロファージおよび肥大した泡沫状マクロファージの増大した数によって明らかであるように、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは上昇する。ウイルス病原体（インフルエンザＡおよび呼吸器合胞体ウイルスを含む）の取り込みおよびクリアランスがＳｆｔｐｄ−／−マウスでは不十分であった（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３）。対照的に、Ｂ群連鎖球菌属およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）のクリアランスは変化しなかった（ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（２０００）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：３９３４〜３９４０；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。しかしながら、酸素ラジカルの放出および前炎症性媒介因子（ＴＮＦα、ＩＬ−１およびＩＬ−６）の産生が、ウイルス病原体または細菌病原体のいずれかにさらされたとき、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおいて増大した。このことは、ＳＰ−Ｄがまた、病原体のクリアランスとは無関係である感染性攻撃の間に肺胞のマクロファージを調節することにおいて重要な役割を果たすことを示している（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（２０００）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：３９３４〜３９４０）。
【００２６】
肺において、ＳＰ−Ｄは肺胞のＩＩ型上皮細胞および他の非線毛性細気管支上皮細胞によって産生され、肺胞のマクロファージおよびＩＩ型細胞によって除かれる（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９２）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６３：Ｌ６０〜Ｌ６６；Ｖｏｏｒｈｏｕｔ，Ｗ．Ｆ．他（１９９２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、４０：１５８９〜９７；Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５：１３〜１８；Ｄｏｎｇ，Ｑ．およびＪ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ（１９９８）、Ｊ．Ｒ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９７〜１０５；Ｈｅｒｂｅｉｎ，Ｊ．Ｆ．他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７８：Ｌ８３０〜Ｌ８３９；Ｋｕａｎ，Ｓ．Ｆ．他（１９９４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０：４３０〜４３６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。肺外ＳＰ−Ｄの供給源、および、血漿中のＳＰ−Ｄレベルを制御する機構はこれまで不明である。血漿に存在するＳＰ−Ｄは、肺以外で産生される可能性があり、また、ＳＰ−Ｄの全身的レベルの制御が、全身的な発現経路の活性化によるか、または、全身的なＳＰ−Ｄクリアランスを変化させることによるかのいずれかで行われる可能性がある。
【００２７】
ＳＰ−Ｄはいくつかの免疫細胞シグナル伝達経路に関わっている。ＳＰ−Ｄは、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）と、ＣＤ１４におけるＮ結合型オリゴ糖との間での相互作用を介してＬＰＳ受容体のＣＤ１４と結合する（Ｓａｎｏ，Ｈ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：２２４４２〜２２４５１；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄはまた、ＣＤ１４と、ＬＰＳの滑面形態および粗面形態の両方との間での相互作用を阻害する（Ｓａｎｏ，Ｈ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：２２４４２〜５１）。加えて、ＣＤ１４受容体のレベルが、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスから得られた肺胞マクロファージの表面では低下し、これに対して、可溶性ＣＤ１４のレベルが増大する（Ｓｅｎｆｔ，Ａ．Ｐ．他（２００５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４：４９５３〜４９５９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。可溶性ＣＤ１４のレベルが、ＭＭＰ−９遺伝子またはＭＭＰ−１２遺伝子の標的化された欠失を有するＳｆｔｐｄ−／−マウスでは野生型のレベルに戻った。このことは、ＳＰ−Ｄが、ＣＤ１４受容体のレベルを、受容体のＭＭＰ−９媒介またはＭＭＰ−１２媒介によるタンパク質分解的切断を阻害することによって制御することを示唆している（Ｓｅｎｆｔ，Ａ．Ｐ．他（２００５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４：４９５３〜４９５９）。
【００２８】
ＳＰ−Ｄは、ＬＰＳ、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸に対する炎症性応答を開始することに関与するｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−２およびＴＬＲ−４の細胞外ドメインと結合する（Ｏｈｙａ，Ｍ．他（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：８６５７〜８６６４；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−ＡはペプチドグリカンによるＴＬＲ−２の活性化を阻害する（Ｓａｔｏ，Ｍ．他（２００３）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１１：４１７〜２５；Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｓ．他（２００２）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７：６８３０〜７；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）が、ＴＬＲ−２またはＴＬＲ−４のシグナル伝達に対するＳＰ−Ｄの影響は現在不明である。
【００２９】
Ｇａｒｄａｉらは、ＳＰ−Ｄが、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）およびカルレチクリン／ＣＤ９１の相反する作用を介して肺における抗炎症性プロセスおよび前炎症性プロセスを同時に媒介するかもしれないモデルを提案した（Ｇａｒｄａｉ，Ｓ．Ｊ．他（２００３）、Ｃｅｌｌ、１１５：１３〜２３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。Ｇａｒｄａｉらのモデルでは、結合していない状態において、ＳＰ−ＤのＣＲＤが、マクロファージの活性化を、ＮＦκＢのＰ３８媒介による活性化を阻害するＳＩＲＰαに結合することによって阻害することが示される。対照的に、ＳＰ−ＤのＣＲＤが微生物のリガンドによって占有されるならば、ＳＩＲＰαに結合することが阻害され、コレクチンがマクロファージ活性化受容体のカルレチクリン／ＣＤ９１に結合する。カルレチクリン／ＣＤ９１はその後、前炎症性媒介因子を誘導し、かつ、肺胞のマクロファージを活性化するＮＦκＢのＰ３８媒介による活性化を刺激する。従って、ＣＲＤにおける感染性粒子の存在または不在、ならびに、結合した受容体のタイプに依存して、ＳＰ−Ｄは炎症の強化または抑制のいずれかをもたらすことができる。
【００３０】
ＳＰ−Ｄは、酸化剤感受性経路を介してＮＦκＢの活性に影響を及ぼす（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６６：７５１４〜９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスから得られた肺胞のマクロファージは、増大した量の過酸化水素を産生する。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおける反応性酸素化学種の増大には、組織脂質ペルオキシドおよび反応性カルボニルをはじめとする酸化ストレスのマーカーにおける増大が伴い、これはさらには、ＮＦκＢを活性化し、ＭＭＰの産生を増大させた。
【００３１】
ＳＰ−Ｄはまた、細菌抗原のＭＨＣクラスＩＩ提示およびその後のＴ細胞の活性化に影響を及ぼす（Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。興味深いことに、ＳＰ−Ｄは骨髄由来の樹状細胞による抗原提示を高め、これに対して、肺の樹状細胞による抗原提示が阻害された。これらの結果は、全身的な宿主防御細胞に対するＳＰ−Ｄの影響、および、全身的ＳＰ−Ｄにより調節されるシグナル伝達経路が、肺において認められるものとは異なり得ることを示している。
【００３２】
ＳＰ−Ｄの発現
ＳＰ−Ｄは、ヒト第１０染色体上のＳＰ−Ａ遺伝子の非常に近くに位置する１つだけの遺伝子（Ｓｆｔｐｄ）によってコードされる（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９３）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６８：２９７６〜８３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄが肺において最初に認められ、主に呼吸器のＩＩ型上皮細胞および他の非線毛性細気管支上皮細胞によって発現される（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９２）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６３：Ｌ６０〜Ｌ６６；Ｖｏｏｒｈｏｕｔ，Ｗ．Ｆ．他（１９９２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、４０：１５８９〜９７；Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５：１３〜１８；Ｄｏｎｇ，Ｑ．およびＪ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ（１９９８）、Ｊ．Ｒ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９７〜１０５；Ｈｅｒｂｅｉｎ，Ｊ．Ｆ．他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７８：Ｌ８３０〜Ｌ８３９；Ｋｕａｎ，Ｓ．Ｆ．他（１９９４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０：４３０〜４３６）が、ＳＰ−ＤのｍＲＮＡおよびタンパク質が多くの肺以外の組織において検出される。ＳＰ−Ｄの免疫染色が、血管内皮、ならびに、耳下腺、汗腺、涙腺、皮膚、胆嚢、胆管、膵臓、胃、食道、小腸、腎臓、副腎皮質、下垂体前葉、子宮頸管腺、精嚢および尿路の上皮細胞において検出される（Ｓｔａｈｌｍａｎ，Ｍ．Ｔ．他（２００２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、５０：６５１〜６６０；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｈ．およびＲ．Ｍａｓｏｎ（１９９５）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１２：１３〜１８；Ｍｏｔｗａｎｉ，Ｍ．他（１９９５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５５：５６７１〜５６７７；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−ＤのｍＲＮＡの肺外レベルが炎症に応答して増大し、しかし、その肺外レベルは、肺で検出されるｍＲＮＡレベルよりも数倍低く、このことは、異なる機構が肺外対肺内のＳｆｔｐｄ発現を制御することを示している（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７）。
【００３３】
ＳＰ−ＤのｍＲＮＡが妊娠中期のマウスまたはラットの肺において最初に検出され、出生前および新生児期の間において増大する（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５：１３〜１８）。ＳＰ−ＤのｍＲＮＡが、細菌エンドトキシン、吸入微生物および高酸素症によって引き起こされる肺傷害の後で増大する（Ｃａｏ，Ｙ．他（２００４）、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１３：４３９〜４４４；Ｍｃｉｎｔｏｓｈ，Ｊ．Ｃ．他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１５：５０９〜５１９；Ｊａｉｎ−Ｖｏｒａ，Ｓ．他（１９９８）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６６：４２２９〜４２３６；Ａｄｅｒｉｂｉｇｂｅ，Ａ．Ｏ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：２１９〜２２７；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。マウスのＳｆｔｐｄプロモータは、ＡＰ−１ファミリー、フォークヘッド転写因子（ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＡ２）、甲状腺転写因子（ＴＴＦ）−１、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）についてのコンセンサスな転写因子結合配列、ならびに、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）についての多数の部位を含有する（Ｌａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：９５３〜９６３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＡＰ−１ファミリーに含まれるタンパク質のＪｕｎＢおよびＪｕｎＤはＳｆｔｐｄプロモータ活性を高め、これに対して、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−ＦｏｓはＳｆｔｐｄの転写を阻害した（Ｈｅ，Ｙ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：３１０５１〜３１０６０；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＡ２のコンセンサスな結合部位の欠失は転写を阻害した（Ｈｅ，Ｙ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：３１０５１〜３１０６０）。Ｃ／ＥＢＰはＳｆｔｐｄの転写を活性化する（Ｈｅ，Ｙ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５：３１０５１〜３１０６０；Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．他（１９９７）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７２：３６９４〜３６９８；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。Ｃ／ＥＢＰはまた、全身的な急性期応答にも関与し、このことは、全身的なＳＰ−Ｄ発現が、全身的感染に対する生理学的応答の一部であり得ることを示している。ＮＦＡＴもまた、カルシニューリン依存的経路およびＴＴＦ−１との直接的な相互作用を介してＳｆｔｐｄプロモータ活性を促進させる（Ｄａｖｅ，Ｖ．他（２００４）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７９：３４５７８〜３４５８８；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３４】
肺以外の組織におけるＳＰ−Ｄの役割
肺以外の組織におけるＳＰ−Ｄの相対的に低い濃度のために、ＳＰ−Ｄの生理学的役割および治療的可能性の研究は大部分が呼吸樹に限られている。ＳＰ−Ｄが低いレベルでヒト血漿に存在しており、多数の研究では、感染時および／または肺毒物にさらされているときの血漿中のＳＰ−Ｄにおける増大が明らかにされている（Ｈｏｎｄａ，Ｙ．他（１９９５）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１５２：１８６０〜６；Ｋｕｒｏｋｉ，Ｙ．他（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４０８：３３４〜３４５；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｋ．Ｅ．他（２００２）、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ、１９：４３９〜４６；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｋ．Ｅ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：１８４３〜１８５０；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。この増大は、肺からのＳＰ−Ｄの漏出を表すと解釈されており、いくつかのグループが現在、血漿中のＳＰ−Ｄレベルを肺傷害の臨床的バイオマーカーとして使用するための方法を開発中である。しかしながら、これらの研究において肺の傷害および炎症を誘導するために使用された薬剤の多くはまた、全身的な傷害および炎症を誘導する。従って、血漿ＳＰ−Ｄのプールサイズに対する肺供給源対全身的供給源の相対的な寄与は不明である。
【００３５】
羊水および女性の生殖管に存在するＳＰ−Ｄは子宮内感染を防ぐことができる（Ｏｂｅｒｌｅｙ，Ｒ．Ｅ．他（２００４）、Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ、１０：８６１〜８７０；Ｌｅｔｈ−Ｌａｒｓｅｎ，Ｒ．他（２００４）、Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ、１０：１４９〜１５４；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ＳＰ−Ｄは涙に存在し、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）による角膜上皮細胞への侵入を阻害する（Ｎｉ，Ｍ．他（２００５）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、７３：２１４７〜２１５６；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。これらの知見は肺外ＳＰ−Ｄについての生理学的目的を示しているが、血漿中のＳＰ−Ｄが全身的な宿主防御細胞を調節することができること、または、全身的な病原体と結合し、そのクリアランスを促進させることができることは今後、明らかにされなければならない。
【００３６】
ＳＰ−Ｄの臨床的適用
肺において、ＳＰ−Ｄは、肺実質の精巧な一体性を維持しながら、侵入途中の病原体のクリアランスを同時に容易にする、肺の感染に対する肺胞のマクロファージによる制御された応答を促進する前炎症的性質および抗炎症的性質の両方を有する。ＳＰ−Ｄの抗炎症的性質により、このタンパク質が、喘息、気管支肺異形成症、嚢胞性線維症、成人呼吸窮迫症候群または慢性的感染に関連する持続した炎症からの損傷を制限し得ることが示される。この指摘の裏付けとして、ＳＰ−Ｄまたは短縮形態のＳＰ−Ｄの投与は、アレルギー性気道過敏性に苦しむマウスにおけるアレルギー性応答を低下させる（Ｌｉｕ，Ｃ．Ｆ．他（２００５）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３５：５１５〜５２１；Ｈａｃｚｋｕ，Ａ．他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３４：１８１５〜１８１８；Ｋａｓｐｅｒ，Ｍ．他（２００２）、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、３２：１２５１〜１２５８；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３７】
ＳＰ−Ｄ欠損が早産に関連し、人工的な表面活性物質の代償治療が呼吸窮迫症候群の早産児において広く使用される（他の肺疾患における表面活性物質治療の臨床研究が進行中である）が、ＳＰ−Ｄは人工的な表面活性物質の構成成分ではない。マウスモデルでは、ＳＰ−Ｄの欠損が肺の感染に対する増大した感受性をもたらすことが明瞭に明らかにされる（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（２０００）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：３９３４〜３９４０）。ＳＰ−ＤをＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて回復させることにより、肺の微生物クリアランスおよび炎症における欠陥が取り消される（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．他（２００２）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７：３８７０９〜３８７１３；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：２７９〜２８６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。加えて、気管内投与された組換えＳＰ−Ｄは生存を著しく改善し、また、気管内ＬＰＳにさらされた早産新生児ヒツジでのＬＰＳの全身的放出、および、ベンチレータ誘導による肺傷害を低下させる（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｍ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。まとめると、これらの研究から、免疫欠陥または表面活性物質欠損を有する患者における肺感染時の抗菌剤としてのＳＰ−Ｄの潜在的価値が明らかにされる。肺のＳＰ−Ｄレベルが感染に対する生理学的応答の一部として増大することを考慮すると、このプロセスを感染の初期段階の間に外因性ＳＰ−Ｄにより補うことはまた、無傷の免疫系を有する患者に利益をもたらし得る。
【００３８】
肺において、ＳＰ−Ｄは、侵入途中の病原体のクリアランスを促進すること、および、ＬＰＳ誘導による炎症の損傷化影響を制限することに関与する。しかしながら、肺システムの外部での感染が最も臨床的に顕著な発病および死亡の一部を誘導する。先天性肺炎または周産期に罹った肺炎を有する幼児は、効果的な抗生物質処置が出生後直ちに施されたときでさえ、脾臓敗血症および死亡の危険性が高い（Ｋａｕｆｍａｎ他（２００４）、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１７：６３８〜６８０；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ他（２０００）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４２：１５００〜１５０７；Ｗｅｎｓｔｒｏｍ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１７８：５４６〜５５０；Ｄｅｍｐｓｅｙ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ、２２：１５５〜１５９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。早期発症敗血症における先天性肺炎の高い発生率は、感染が、多くの場合、子宮内または出生時の病原体の吸引によって生じることを示している。絨毛羊膜炎は未熟分娩の危険性を増大させ、また、新生児の敗血症および敗血症関連ショックに強く関連する（Ｄｅｍｐｓｅｙ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ、２２：１５５〜１５９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。早産新生児の肺は非常に透過性であり（Ｊｏｂｅ他（１９８５）、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、５８：１２４６〜１２５１；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、肺からの前炎症性媒介因子および生物の全身的拡大を許している（Ｋｒａｍｅｒ他（２００２）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。早産児だけにおいて、出生時の体重が１５００グラム未満である乳児の約の２０％が、病院から退院する前に、全身的感染と診断される（Ｓｔｏｌｌ，Ｂ．Ｊ．他（２００２）、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１１０：２８５〜２９１；Ｂｒｏｄｉｅ，Ｓ．Ｂ．他（２０００）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ、１９：５６〜６５；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。これらの乳児の大部分が、敗血症、感染に対する宿主由来の炎症性応答の臨床的な徴候および症状を発症する（Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ，（１９９６）、Ｊａｍａ、２７６：５６５〜５６６；Ａｎｇｕｓ，Ｄ．Ｃ．他（２００１）、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、２９：１３０３〜１３１０；Ｇｌａｕｓｅｒ，Ｍ．Ｐ．他（１９９１）、Ｌａｎｃｅｔ、３３８：７３２〜７３６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。究極的には、感染と診断された早産児のおよそ２０％のうち、１８％が敗血症のために死亡する（Ｓｔｏｌｌ，Ｂ．Ｊ．他（２００２）、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１１０：２８５〜２９１；Ｂｒｏｄｉｅ，Ｓ．Ｂ．他（２０００）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ、１９：５６〜６５）。
【００３９】
Ｂ群連鎖球菌およびグラム陰性細菌（大腸菌を含む）は、先天性肺炎を一般に引き起こす生物である（Ｓｔｏｌｌ他（２００５）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ、２４：６３５〜６３９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。細菌そのものではなく、むしろ、微生物の毒素およびＬＰＳの全身的拡大により、ショックをもたらす細胞性応答および体液性応答が開始され得る（Ｇｒａｎｄｅｌ他（２００３）、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：２６７〜２９９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。敗血症ショックは、多臓器機能障害、多臓器不全および死を多くの場合にはもたらす複雑な病態生理学的状態である（Ｍｕｒｐｈｙ他（１９９８）、Ｎｅｗ Ｈｏｒｉｚ、６：１８１〜１９３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。血液ｐＨ、血中塩基過剰（ＢＥ）における低下、および、ｐＣＯ２における増大（これらは本研究でのコントロール群において明らかにされた）は、早産児における敗血症ショックの臨床的経過に典型的である。血管収縮、肺高血圧症、臓器循環の悪化、および、代謝性アシドーシスがしばしば、敗血症の存在に関係する。下記で例示される実施例において、本発明者らは、ＳＰ−Ｄが全身的な生得的免疫系の重要な構成要素であり得ることを示し、また、全身的感染を処置することにおけるＳＰ−Ｄの治療的可能性を評価するために、全身的宿主防御におけるＳＰ−Ｄの生理学的機能を明らかにしている。
【００４０】
ＳＰ−Ｄによる処置
外因的に調製されたＳＰ−Ｄは、阻止されないならば、最終的には全身的な敗血症を引き起こし得る様々な疾患（例えば、肺感染症など）を処置するために有用であり得る。ＳＰ−Ｄの投与が個体において敗血症の危険性を低下させ得るかどうかを明らかにするために、早産新生児の子ヒツジに大腸菌由来のリポ多糖エンドトキシンを滴注し、その後、早産新生児の子ヒツジを、本明細書中に記載されるようにＳＰ−Ｄにより処置した。その後、生存率、生理学的な肺機能、肺の炎症および全身的な炎症、ならびに、血漿中のエンドトキシンレベルを評価した。本明細書中に示されるように、気管内の組換えヒト表面活性タンパク質−Ｄ（ｒｈＳＰ−Ｄ）は、早産新生児において換気時に肺から放出されたエンドトキシンによって引き起こされるショックを防止した。加えて、ＳＰ−Ｄ遺伝子を有しないか、または、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的なＳＰ−Ｄ導入遺伝子を発現するか、または、ＳＰ−Ｄの変異型導入遺伝子を発現する遺伝子組換えマウス系統を、このタンパク質の構造／機能研究を可能にするために開発した。本明細書中に示されるように、ＳＰ−Ｄの投与は、全身的ＬＰＳにより誘導される炎症を阻害し、また、盲腸結紮および穿刺における炎症を軽減させる。加えて、ＳＰ−Ｄの投与は、致死量のＬＰＳを投与した後における生存および組織傷害を改善し、血漿ＬＰＳのクリアランス速度を増大させ、また、ＬＰＳの全身的漏出および肺漏出を防止する。従って、ＳＰ−Ｄ処置は、敗血症を処置または防止するために有用であり得る。
【００４１】
子ヒツジにおける実験的研究の結果
組換えヒト表面活性タンパク質−Ｄ（ｒｈＳＰ−Ｄ）を、実施例１に記載されるような全長のヒトＳＰ−ＤをコードするｃＤＮＡによるＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクションによって合成した。ＳＰ−Ｄを、実施例１に記載されるようなイオン交換クロマトグラフィおよびアフィニティ精製を使用して培養培地から単離した。
【００４２】
生物学的に活性な組換えヒトＳＰ−Ｄおよび組換えラットＳＰ−Ｄがインビトロで以前に作製されている（Ｅｒｐｅｎｂｅｃｋ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８８：Ｌ６９２〜６９８；Ｃｌａｒｋ他（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：２８９２〜２８９９；Ｃｌａｒｋ他（２００２）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０５：６１９〜６３１；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。全長の組換えＳＰ−Ｄを本研究では利用した。２ｍｇ／ｋｇのｒｈＳＰ−Ｄの用量を早産の子ヒツジに与えた。１３０ｄのＧＡの子ヒツジ（出産予定日、１５０日）は表面活性物質欠損であり（Ｄｏｃｉｍｏ他（１９９１）、Ａｎａｔ Ｒｅｃ、２２９：４９５〜４９８；Ｉｋｅｇａｍｉ他（１９８１）、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１４１：２２７〜２２９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）、生存するための表面活性物質処置および機械的換気を必要とする。表面活性物質プールサイズが時間とともに変化し、新生児動物において最大であり（Ｉｋｅｇａｍｉ他（１９９３）、Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ、１７：２３３〜２４０；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、時間の進行とともに低下して成体レベルになる（Ｉｋｅｇａｍｉ他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７９：Ｌ４６８〜Ｌ４７６；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。処置のための表面活性物質の臨床的用量は正常な新生児における表面活性物質プールサイズに類似する（Ｉｋｅｇａｍｉ他（１９８０）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ、１４：１０８２〜１０８５；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。満期新生児の肺におけるＳＰ−Ｄの正確な量は不明である。出産間近（１７５ｄのＧＡ）のヒヒ（出産予定日−１８５ｄのＧＡ）におけるＳＰ−Ｄは気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において０．０２ｍｇ／肺であり、肺組織において０．２ｍｇ／肺であった（Ａｗａｓｔｈｉ他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：９４２〜９４９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。出産間近のヒヒは体重が１ｋｇ未満であるので、本研究で使用されたｒｈＳＰ−Ｄの用量（２ｍｇ／ｋｇ）は、満期新生児の子ヒツジについてのＳＰ−Ｄプールサイズよりも少なくとも１０倍高いことが推定された。
【００４３】
処置用の動物を調製するために、予定日前の子ヒツジを、実施例２に記載されるように１３０ｄの在胎齢で帝王切開によって分娩させた。気管内チューブを気管内に結び、過剰な胎児肺液を除いた。肺におけるリポ多糖（ＬＰＳ）の均一な分布を容易にするために、実施例３に記載されるように、０．１ｍｇ／ｋｇの大腸菌由来ＬＰＳを１ｍｌ（２５ｍｇ）のＳｕｒｖａｎｔａと混合し、最初の呼吸の前に子ヒツジに投与し、その後、１０ｍｌの空気を投与した。
【００４４】
その後、子ヒツジを、実施例４に記載されるように、Ｓｕｒｖａｎｔａ単独（コントロール群）、または、ＳｕｒｖａｎｔａおよびｒｈＳＰ−Ｄ（処置群）のいずれかにより処置した。動物を、実施例４に記載されるように、注意深くモニターしながら５時間換気した。処置後５時間で、それぞれの動物を、実施例４に記載されるように、静脈内投与による２５ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで深く麻酔し、１００％酸素でしばらく換気した。
【００４５】
子ヒツジの組織を分析する方法が実施例５〜実施例１２に記載される。実施例５は、子ヒツジの組織を処理およびサンプル分析のために調製する方法を詳しく記載する。実施例６は、使用されたデータ分析方法を詳しく記載する。実施例７は、肺組織を処理するために使用された方法を記載する。
【００４６】
ｒｈＳＰ−Ｄの投与は、新生児の子ヒツジを気管内エンドトキシンの全身的影響から保護することが見出された。５匹の子ヒツジをそれぞれの群において調べた。体重（コントロール：３．２±０．３ｋｇ、ｒｈＳＰ−Ｄ：３．０±０．２ｋｇ）、臍血ｐＨ（コントロール：７．３３±０．０２、ｒｈＳＰ−Ｄ：７．３１±０．０４）および性別（両方の群において３匹のメスおよび２匹のオス）を処置群およびコントロール群の間で等しく分布させた。コントロール群において、５匹中４匹の子ヒツジが、５時間の研究期間が終了する前に死亡した。対照的に、ｒｈＳＰ−Ｄにより処置されたすべての子ヒツジが生存した（図１）。動物が死亡したとき、死亡直前に得られたデータを群間の比較のために使用した。コントロール群におけるほとんどの死亡が４時間〜５時間の間で生じた。
【００４７】
気管内投与後、エンドトキシンが、リムルス細胞分解産物アッセイによって評価されたとき、両方の動物群で、３０分が経過したとき、血漿において検出された（図２Ａ）。血漿中のエンドトキシンレベルがコントロールの子ヒツジでは増大し続けたが、ｒｈＳＰ−Ｄにより処置された子ヒツジでは、実験の継続期間中、増大しなかった。死亡前の収縮期血圧は、３時間が経過したとき、これらの群の間において類似しており、その後、コントロールでは低下し、しかし、ｒｈＳＰ−Ｄ処置の動物では低下しなかった（図２Ｂ）。
【００４８】
ＬＰＳの顕著な全身的影響が、低下した血液ｐＨ、血中塩基過剰（ＢＥ）（図３）、および、増大したｐＣＯ２（図４Ａ）によって示されるように、コントロール群において、４時間が経過した後で認められた。対照的に、血液ｐＨ、ＢＥおよびｐＣＯ２が、ｒｈＳＰ−Ｄ処置の動物では５時間の実験の期間中を通して安定したままであった。ヘマトクリット、カリウム、カルシウムおよびグルコースのレベルは両方の群について類似していた。ＰＯ２は、この在胎齢では比較的不安定であり、動脈管開存症に関連する可能性があるが、これらの群の間には違いがなかった（データは示されず）。
【００４９】
肺胞細胞をＢＡＬＦ液から単離する方法が実施例８に記載される。遠心分離後の肺ホモジネート（ＢＡＬＦ）におけるｒｈＳＰ−Ｄのレベルおよび血清中のｒｈＳＰ−Ｄのレベルを測定する方法が実施例９に記載される。使用された組織学方法が実施例１０に記載される。エンドトキシンおよびサイトカインのレベルを実施例１１に記載されるように測定した。ＲＮＡ分析を実施例１２に記載されるように行った。
【００５０】
前炎症性サイトカインのｍＲＮＡ（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８）のレベルが、ｒｈＳＰ−Ｄ処置の動物と比較されたとき、コントロール動物の脾臓および肝臓において増大した。このことは、ＬＰＳがｒｈＳＰ−Ｄの不在下では肺から全身循環に漏出することを示している（図５Ａおよび図５Ｂ）。ＩＬ−１０およびＴＮＦαのｍＲＮＡの脾臓および肝臓でのレベルは両方の動物群において低かった（データは示されず）。血漿中のＩＬ−８が気管内ＬＰＳの後においてコントロール群では著しく増大し、ｒｈＳＰ−Ｄ処置のヒツジでは著しくより低くなっていた（図５Ｄ）。血漿中のＩＬ−１βは両方のヒツジ群においてアッセイの検出可能レベルよりも低かった（０．８ｐｇ／ｍｌ未満）（データは示されず）。
【００５１】
下記の表１は、ＢＡＬＦにおけるＷＢＣ、炎症性細胞および総タンパク質を示す。ＢＡＬＦにおける好中球の数は両方の群について類似していたが、ＬＰＳを受けなかったコントロール動物について以前に示されたよりも１０倍大きかった（Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ．Ｗ．他（２００２）、Ａｍ ＪＲｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９：これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＢＡＬＦにおける過酸化水素および総タンパク質は２つの群の間において異なっていなかった。アポトーシス細胞の割合および壊死細胞の割合もまた、両方の群において類似していた（表１）。ｒｈＳＰ−Ｄの抗炎症性効果と一致して、前炎症性サイトカインのＩＬ−１βのｍＲＮＡが、ｒｈＳＰ−Ｄにより処置された動物の肺では著しく低下した（図５Ｃ）。ｒｈＳＰ−Ｄは、肺ホモジネートの上清におけるＩＬ−１βのレベルを、コントロールにおける２１．６±３．６ｎｇ／ｍｌから、ｒｈＳＰ−Ｄによる処置の後での１２．６±１．４ｎｇ／ｍｌに低下させた（ｐ＜０．０５）。同様に、ｒｈＳＰ−ＤはＩＬ−６を７．７±０．８ｎｇ／ｍｌから２．３±１．２ｎｇ／ｍｌに低下させた（ｐ＜０．０５）。ＩＬ−８は、コントロール群またはｒｈＳＰ−Ｄ処置群のいずれにおいてもＥＬＩＳＡによって検出することができなかった。肺の炎症がｒｈＳＰ−Ｄ処置群およびコントロール群の両方において認められた（図５Ａ、Ｂ）。図６は、ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色による肺の形態学（６Ａおよび６Ｂ）、ならびに、ＩＬ−８の免疫組織化学（６Ｃおよび６Ｄ）およびＩＬ−１βの免疫組織化学（６Ｅおよび６Ｆ）を示すいくつかの組織学的画像を例示する。ＩＬ−８（図６Ｃおよび６Ｄ）およびＩＬ−１β（図６Ｅおよび６Ｆ）についての増大した免疫染色が両方の動物群において観測され、しかし、両方のサイトカインについての染色の増大した程度および強度がコントロール群において観測された。このことは、気管内ｒｈＳＰ−Ｄ処置が炎症性細胞におけるサイトカインのＩＬ−８およびＩＬ−１βのレベルを低下させたことを示している。
【表１】
【００５２】
ｒｈＳＰ−Ｄの投与はエンドトキシン暴露後の肺力学を変化させなかった。目標の一回換気量を維持するために使用された換気圧は両方の群において類似していた（図４Ｂ）。同様に、動的肺コンプライアンスおよび圧力−体積曲線は、図７に示されるように、ｒｈＳＰ−Ｄ処置によって変化しなかった。
【００５３】
ＢＡＬＦ、肺ホモジネートおよび血漿におけるｒｈＳＰ−Ｄのレベルを、ＥＬＩＳＡによって両方の群において気管内投与後５時間で測定し（下記の表２）、また、ＢＡＬＦにおける免疫ブロットによって測定した（図８）。ｒｈＳＰ−Ｄの存在が、コントロール群からではなく、ｒｈＳＰ−Ｄ群から得られたＢＡＬＦ、肺ホモジネートおよび血漿において明らかにされた。血漿におけるｒｈＳＰ−Ｄの存在により、肺からのその漏出が明らかにされる。
【表２】
【００５４】
本明細書中に示されるように、気管内ｒｈＳＰ−Ｄの投与は、早産新生児の子ヒツジを肺内大腸菌ＬＰＳの全身的影響から保護することができた。肺の炎症がｒｈＳＰ−Ｄによって阻止された一方で、ＬＰＳの全身的影響が、血漿中のＬＰＳレベルおよび全身的炎症の証拠によって示されるように、ｒｈＳＰ−Ｄによって改善された。以前の研究では、気管内ＬＰＳによって引き起こされた全身的炎症が、１３０ｄのＧＡで認められたが、１４１ｄのＧＡでは認められなかったので、胎齢依存的であったことが明らかにされた（Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ．Ｗ．他（２００２）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９）。
【００５５】
マウス研究：肺および全身性の炎症および感染に対するＳＰ−Ｄの影響
ＳＰ−Ｄが、全身的なＬＰＳ誘導の炎症を制限するかを明らかにするために、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスのモデルを利用した。非致死量の大腸菌０１１１：Ｂ４のＬＰＳを、化学量論量の精製された組換えヒトＳＰ−Ｄとともに、または、組換えヒトＳＰ−Ｄを伴うことなく、尾静脈注入によって投与した（それぞれの処置群についてｎ＝５）。ＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）を、コントロールの緩衝液、または、増大する濃度の組換えヒトＳＰ−Ｄとともに投与し、サイトカイン応答を注入後２時間で血漿において測定した。ＳＰ−ＤはＩＬ−６およびＴＮＦαのレベルを濃度依存的な様式で著しく低下させ、１５０μｇ／ｋｇのＳＰ−ＤはＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルにおける４０％および５０％の最大減少をそれぞれもたらした（それぞれについてｐ＜０．０１）（図９）。
【００５６】
ＬＰＳが注入前にＳＰ−Ｄとプレインキュベーションされたので、この実験は、ＬＰＳ誘導による全身的炎症に対するＳＰ−Ｄの影響を評価するための最適な条件を表した。血液中に循環するＬＰＳを突き止め、阻害するための全身的ＳＰ−Ｄの可能性を評価するために、ＳＰ−ＤをＬＰＳ注入前３０分およびＬＰＳ注入後３０分で尾静脈注入によって投与し、サイトカイン応答を２時間後に血漿において測定した（それぞれの処置群についてｎ＝５）（図１０）。ＳＰ−ＤがＬＰＳ注入前３０分で投与されたとき（ｐ＜０．０１）、または、ＬＰＳ注入と一緒に投与されたとき（ｐ＜０．０１）、全身的なＩＬ−６レベルが著しく低下した。ＩＬ−６のレベルはまた、ＳＰ−ＤがＬＰＳ後３０分で投与されたときにはより低くなっており、しかし、結果は統計学的有意には達しなかった（ｐ＝０．０９）。まとめると、上記の結果は、循環しているＳＰ−Ｄにより、全身的なＬＰＳ誘導による炎症が阻害され得ること、および、感染時における増大する全身的ＳＰ−Ｄレベルの生理学的目的が、全身的ＬＰＳを捕捉し、ＬＰＳにより誘導される炎症の損傷化作用を制限することであることを示している。
【００５７】
インビトロ研究では、ＳＰ−Ｄが、直接的なＬＰＳ結合、ＣＤ１４阻害およびＴＬＲ４結合をはじめとする、ＬＰＳのシグナル伝達経路におけるいくつかの段階に影響を及ぼし得ることが示される（Ｓａｎｏ，Ｈ．他（２０００）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：２２４４２〜２２４５１；Ｓｅｎｆｔ，Ａ．Ｐ．他（２００５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４：４９５３〜４９５９；Ｏｈｙａ，Ｍ．他（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：８６５７〜８６６４；Ｇａｒｄａｉ，Ｓ．Ｊ．他（２００３）、Ｃｅｌｌ、１１５：１３〜２３）。ＳＰ−ＤはＬＰＳのコアオリゴ多糖に対する大きい親和性を有しており、しかし、相対的親和性は、用いられた細菌ＬＰＳの株に依存して変化する。対照的に、ＣＤ１４およびＴＬＲ４のＳＰ−Ｄ結合が、ＳＰ−Ｄと、ＬＰＳとの相互作用とは無関係に生じる。従って、ＳＰ−Ｄが、ＬＰＳ結合に依存または非依存である経路を介して、ＬＰＳ誘導による全身的炎症を阻害するかを明らかにするために、低ＳＰ−Ｄ親和性および高ＳＰ−Ｄ親和性のＬＰＳ血清型により誘導される炎症に対するＳＰ−Ｄの影響を比較した。ＥＬＩＳＡに基づくＳＰ−Ｄ ＬＰＳ結合アッセイを使用して、数株の大腸菌株から得られたＬＰＳについてのＳＰ−Ｄの結合親和性を測定した。大きい結合親和性を有する１つの株（大腸菌０１１１：Ｂ４）、および、低い結合親和性を有する１つの株（大腸菌０１２７：Ｂ８）が特定された（図１１Ａ）。低結合性ＬＰＳまたは高結合性ＬＰＳのいずれかを尾静脈注入した後２時間での全身的ＩＬ−６レベルに対するＳＰ−Ｄの影響を求めた（それぞれの群においてｎ＝５）。高結合性ＬＰＳをＳＰ−Ｄとプレインキュベーションしたとき、血漿中のＩＬ−６レベルが著しく低下し、しかし、ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄに対する低い親和性を有するＬＰＳ株により誘導される炎症を阻害しなかった（図１１Ｂ）。従って、ＬＰＳにより誘導される炎症の阻害はＳＰ−ＤのＬＰＳ結合親和性と直接に相関しており、全身的ＳＰ−Ｄが、ＬＰＳにより誘導される炎症を、主として直接的なＬＰＳ相互作用によって阻害し得ることを示している。加えて、ＳＰ−ＤのＬＰＳ結合と、ＬＰＳ誘導の炎症のＳＰ−Ｄ媒介による阻害との間での相関により、これらの研究で認められたＬＰＳの阻害が、ＳＰ−Ｄ調製物に含まれる混入物の抗炎症的性質のためでないことが示される。
【００５８】
Ｓｆｔｐｄ−／−マウスは、ベースラインのときおよび感染性攻撃の間における増大した肺の炎症によって特徴づけられる（Ｋｏｒｆｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｒ．他（１９９８）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：２８４３８〜２９４４３；Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．他（２０００）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７：５９７２〜７；Ｃｌａｒｋ，Ｈ．他（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：２８９２〜２８９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３）。ＳＰ−Ｄが全身的なＬＰＳ誘導の炎症およびＳｆｔｐｄ−／−マウスの顕著な前炎症性表現型を阻害するという結果を考慮すると、血漿中のサイトカインレベルが全身的ＬＰＳ暴露の後でＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて上昇すると考えられることが仮定された。従って、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスおよび野生型マウス（同腹子コントロール）の両方を静脈内ＬＰＳにより処置し、血漿中のＩＬ−６レベルを注入後２時間で測定した。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスに特徴的である高まった肺の炎症性サイトカインとは際立って対照的に、ＬＰＳにより処置されたＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける血漿中のＩＬ−６レベルは、野生型マウスよりもおよそ８０％低かった（図１２）。ＳＰ−Ｄは、ベンチレータ誘導の肺傷害を受けたヒツジにおいて肺ＬＰＳの全身的放出を制限する（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｍ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ）ので、この驚くべき結果についての最も単純な説明は、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスが、肺ＬＰＳの全身循環への持続した漏出にさらされ、その後、ＬＰＳ寛容性を発達させるということである。しかしながら、この結果からはまた、ＳＰ−Ｄが全身的免疫系における重要かつ複雑な役割を果たすことが示され得る。
【００５９】
ＬＰＳと結合し、ＬＰＳを肺から除くことに加えて、ＳＰ−Ｄは、ウイルス感染、細菌感染および真菌感染に対する生得的な免疫応答の重要な構成要素である（ＬｅＶｉｎｅ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１：１９３〜１９９；ＬｅＶｉｎｅ他（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：５８６８〜５８７３）。インビトロ研究では、ＳＰ−Ｄが細菌およびウイルスと結合し、これらを凝集させること、また、この凝集が肺胞のマクロファージによる感染性生物の食作用および殺傷を容易にすることが明らかにされる（Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ，Ｋ．他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｌ７５３６２；Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ，Ｋ．Ｌ．他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９５８〜Ｌ９６９）。全身的ＳＰ−Ｄは全身的細菌と結合し、そのクリアランスを容易にすることができ、このことは最終的には、それほど大きくない炎症性組織損傷および改善された生存を引き起こすと考えられる。このことを調べるために、全身性多菌性敗血症／腹膜炎を誘導する、盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）の臨床的に関連したマウスモデルを利用した。処置様式（すなわち、ＳＰ−Ｄ対コントロール）について知らされていない職員による盲腸の結紮および２１ゲージでの穿刺の後、マウスを、腹腔内注入によって与えられるコントロールの緩衝液または２ｍｇ／ｋｇのＳＰ−Ｄにより処置し（ｎ＝１０、それぞれの群において６週齢〜８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス）、血液を手技後６時間で集め、血漿中のＩＬ−６レベルを測定した。ＳＰ−Ｄにより処置されたマウスは、コントロールマウスよりもおよそ４０％低い平均血漿ＩＬ−６レベルを有した（図１３）。この実験における変動性のために、これらの結果は統計学的に有意ではなく（ｐ＝０．０６）、しかし、その傾向から、ＳＰ−Ｄは生細菌攻撃の間における炎症を軽減し得ることが示される。
【００６０】
盲腸穿刺により誘導される敗血症の重篤さのために、マウスの一部が採取時点（６時間または２４時間のいずれか）の前に死亡した。ＣＬＰに供されたマウスの生存に対するＳＰ−Ｄの影響についての予備的研究として、コントロールマウス対ＳＰ−Ｄ処置マウスについてのＣＬＰ後の死亡率を求めた。この実験の目的のために、死亡を採取時点前の死として定義した（図１４）。死亡率は、コントロールマウスの方がＳＰ−Ｄ処置マウスの場合よりも約３倍高かった。これらのデータが、様々な盲腸穿刺サイズ、採取時点、ならびに、ＳＰ−Ｄ用量および投与経路を使用した実験に由来するので、これらの結果の生理学的および統計学的な重要性は限られている。しかしながら、これらの結果から、全身的ＳＰ−Ｄは、生細菌攻撃の間において、マウスの炎症を軽減することができ、また、マウスの生存を改善することができることが示される。
【００６１】
マウス研究：ＳＰ−Ｄの発現およびクリアランス
ベースラインにおいて血液中に低いレベルで存在するが、多数の研究では、ヒトの血漿中のＳＰ−Ｄレベルが様々な前炎症性状態（例えば、肺または全身性の感染など）において数倍増大することが明らかにされている（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｌ１０１０〜Ｌ１０１７；Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ．他（２００５）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、３１：２５〜３３）。血漿中のＳＰ−Ｄレベルがマウスにおいて敗血症時に増大するかを明らかにするために、また、血漿中のＳＰ−Ｄの起源を明らかにするためのモデルシステムを確立するために、マウスＣＬＰモデルを利用した。敗血症を、盲腸の結紮および３０ゲージのニードルによる穿刺によって誘導し、血漿中のＳＰ−Ｄレベルを手技後４８時間でＥＬＩＳＡによって測定した（ｎ＝５、６週齢〜８週齢）（図１５）。血漿中のＳＰ−Ｄレベルが、ＣＬＰ後、数倍増大して、およそ４０ｎｇ／ｍｌの平均値になった。このことは、マウスおよびヒトにおけるＳＰ−Ｄの全身的レベルが類似した様式で応答することを示している。加えて、これらの結果から、ＣＬＰモデルが、全身的ＳＰ−Ｄの産生を評価するための機能的なインビボシステムを提供し得ることが明らかにされる。
【００６２】
ＳＰ−Ｄはまた、血管内皮、胃、小腸、腎臓および多数の腺組織において免疫染色によって検出される（Ｓｔａｈｌｍａｎ，Ｍ．Ｔ．他（２００２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、５０：６５１〜６６０；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｈ２２８６〜Ｈ２２９４）。ＳＰ−Ｄがいくつかの組織タイプで存在し、保護的役割をこれらの存在場所のそれぞれにおいて果たし得るが、血漿において循環するＳＰ−Ｄは、全身的な宿主防御に寄与する集団である。血管内皮がＳＰ−Ｄの循環プールに近いこと、および、宿主防御における血管内皮の役割を考えると、血管内皮が血漿ＳＰ−Ｄのプールサイズに寄与し得る。Ｓｆｔｐｄ遺伝子発現に関する以前の研究は呼吸器上皮に限られている。従って、Ｓｆｔｐｄプロモータが血管内皮細胞において活性化されるかを明らかにするために、マウス胎児肺間葉細胞株（ＭＦＬＭ−９１Ｕ）を利用した。この細胞は、不死化されたマウス胎児肺間葉（日数、Ｅ１９）に由来し、血管内皮系譜の特徴（すなわち、再構成された基底膜において培養されたとき、血管内皮増殖因子受容体２の発現、および、管腔を伴う毛細管様構造の形成）を示す（Ａｋｅｓｏｎ，Ａ．Ｌ．他（２０００）、Ｄｅｖ Ｄｙｎ、２１７：１１〜２３；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ＭＦＬＭ細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子につながれたＳｆｔｐｄプロモータを含有するプラスミドにより一過性でトランスフェクションし、Ｓｆｔｐｄプロモータ活性を測定した（図１６）。ルシフェラーゼ活性が、ルシフェラーゼ遺伝子だけによりトランスフェクションされた細胞と比較されたとき、ルシフェラーゼレポーター遺伝子につながれたＳｆｔｐｄプロモータによりトランスフェクションされたＭＦＬＭ−９１Ｕ細胞ではおよそ５０倍増大した。このことは、Ｓｆｔｐｄプロモータが血管内皮細胞において活性化されることを示している。加えて、これらの結果は、このシステムが、血漿中のＳＰ−Ｄレベルを全身的な敗血症のときに増大させる調節因子だけでなく、ＳＰ−Ｄの血漿中レベルをベースラインにおいて肺のレベルよりも数倍低く保つ調節因子を明らかにするために使用されることを裏付ける。
【００６３】
肺において、ＳＰ−Ｄは肺胞のＩＩ型細胞によって産生され、ＩＩ型細胞または肺胞のマクロファージによって分解または再循環され、これにより、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは７時間の半減期がもたらされ、野生型マウスでは１３時間の半減期がもたらされる（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９２）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６３：Ｌ６０〜Ｌ６６；Ｖｏｏｒｈｏｕｔ，Ｗ．Ｆ．他（１９９２）、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、４０：１５８９〜９７；Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．他（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５：１３〜１８；Ｄｏｎｇ，Ｑ．およびＪ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ（１９９８）、Ｊ．Ｒ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７４：Ｌ９７〜１０５；Ｈｅｒｂｅｉｎ，Ｊ．Ｆ．他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７８：Ｌ８３０〜Ｌ８３９；Ｋｕａｎ，Ｓ．Ｆ．他（１９９４）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０：４３０〜４３６；Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｍ．他（２０００）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７９：Ｌ４６８〜Ｌ４７６；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。血漿におけるＳＰ−Ｄの半減期を求めるために、ＳＰ−Ｄを尾静脈注入によって投与し、血漿中のＳＰ−ＤレベルをＥＬＩＳＡによって経時的に測定した（図１７）。ＳＰ−Ｄが初回通過代謝によって血漿から除かれず、しかし、むしろ、野生型マウスではおよそ６時間の半減期で血漿中に保持された。興味深いことに、血漿ＳＰ−Ｄの半減期がＳｆｔｐｄ−／−マウスではおよそ２時間に低下したが、ネック部およびＣＲＤのみの三量体からなるＳＰ−Ｄの短縮型フラグメントの半減期は６２時間の血漿半減期を有する（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｈ２２８６〜Ｈ２２９４）。このことは、血漿ＳＰ−Ｄの取り込みについての特異的な細胞機構が存在することを示しており、また、この機構がＳＰ−ＤのＮ末端ドメインおよび／またはコラーゲンドメインに依存することを示している。
【００６４】
血漿ＳＰ−Ｄの取り込みの主要な場所を明らかにするために、ＳＰ−ＤをＳｆｔｐｄ−／−マウスに尾静脈注入によって投与し、組織ホモジネートにおけるＳＰ−Ｄレベルを注入後８時間でＳＰ−ＤのＥＬＩＳＡによって求めた（図１８）。脾臓におけるＳＰ−Ｄのレベルが組織１グラムあたり約３２０ｎｇのＳＰ−Ｄに達した。これは、それ以外の組織で観測されたＳＰ−Ｄレベル（および脾臓におけるバックグラウンドシグナル）よりも顕著に高かった。従って、肺のＳＰ−Ｄは肺胞のマクロファージおよびＩＩ型細胞によって分解または再循環されるが、結果は、全身的ＳＰ−Ｄが脾臓によって循環から除かれることを示している。
【００６５】
マウス研究：宿主防御細胞を調節することにおけるＳＰ−Ｄの構造的ドメインの役割
相対的に大きいＳＰ−Ｄのコラーゲンドメイン（他のコレクチンと比較したとき）のために、ＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインは、肺胞マクロファージのＳＰ−Ｄ媒介による調節には不可欠であり得る。このことを調べるために、正常なＣＲＤ、ネックドメインおよびＮ末端ドメインを伴うが、コラーゲンドメインを有しないＳＰ−Ｄ変異型タンパク質（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭ）を作製した。インビトロアッセイでは、精製されたｒＳｆｐｔｄＣＤＭが多量体を形成し、野生型タンパク質と同等またはそれよりも良好な様式で、炭水化物、細菌およびウイルスと結合したことが明らかにされた。ｒＳｆｔｐｄＣＤＭが肺胞のマクロファージ活性を効果的に調節するかを明らかにするために、変異型の導入遺伝子（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋）を野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて発現させた。変異型タンパク質は野生型マウスにおいて肺の形態学またはマクロファージ活性を乱さなかった一方で、変異型タンパク質は、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスに特徴的であるベースラインでの異常なマクロファージ活性を救うことができなかった。増大したレベルのメタロプロテイナーゼを発現する肥大した泡沫状マクロファージが、Ｓｆｔｐｄ−／−マウス、および、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭタンパク質を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−）において容易に認められた（図１９）。
【００６６】
ｒＳｆｔｐｄＣＤＭが肺胞のマクロファージ活性を感染性攻撃時において調節するかを明らかにするために、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）への気管内暴露に対する、野生型マウス、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスおよびｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−マウスの応答を評価した。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスとは対照的に、検出可能なＩＡＶが野生型またはｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−の肺ホモジネートからは回収されなかった。加えて、ＩＡＶ攻撃されたＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて観測された増大したＩＬ−６レベル、ＴＮＦαレベルおよびＩＦＮ−γレベルが、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは野生型のレベルに回復した（図２０）。まとめると、これらの結果から、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭはベースラインでの肺胞のマクロファージ活性を効果的に調節しないが、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭは正常な肺胞のマクロファージ応答をウイルス攻撃時に容易にし得ることが示される。そのうえ、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭの変異型タンパク質は、ＬＰＳにより誘導される炎症においてＳＰ−Ｄの全身的な抗炎症的性質を誘発するＳＰ−Ｄの構造的ドメインが、肺における感染性攻撃の間に要求される構造的ドメインと一致するかを明らかにするためのモデルシステムを提供する。
【００６７】
大腸菌ＬＰＳに対するＳＰ−Ｄの結合がインビボおよびインビトロの両方で明らかにされている（Ｋｕａｎ他（１９９２）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９７〜１０６；Ｌｉｍ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０２：１６７４〜１６８０；ｖａｎ Ｒｏｚｅｎｄａａｌ他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４５４：２６１〜２６９；Ｃｒｏｕｃｈ他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：１７７〜２０１；Ｐｉｋａａｒ他（１９９５）、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、１７２：４８１〜４８９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。早産新生児は、ＳＰ−Ｄを含めて、表面活性物質が不十分である（Ｍｉｙａｍｕｒａ他（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１２１０：３０３〜３０７；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。呼吸窮迫症候群の新生児を処置するための市販されている表面活性物質はＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃを含有するが、ＳＰ−ＡまたはＳＰ−Ｄを含有しない。早産新生児の肺で見られる増大した炎症性応答は、低いレベルのＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄおよび相対的に少ない数のマクロファージを含めて、宿主防御における欠損から生じ得る（Ａｗａｓｔｈｉ他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６０：９４２〜９４９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。絨毛羊膜炎および肺の出生後感染に関連する胎児の炎症には、慢性的な肺傷害および気管支肺異形成症の発症が伴う（Ｌｉ他（２００２）、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ、４：７２３〜７３２；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００６８】
ＳＰ−Ｄが、気管内投与されたＬＰＳの後における全身的影響を改善し、死を防止したという知見は、ＳＰ−ＤがＬＰＳに結合し、肺区画から全身区画へのＬＰＳ移行を解毒または阻害するという考えを裏付けている。早産のヒト新生児における知見と類似して、敗血症ショックもまた、成人において比較的頻発する死因の１つである（Ｍａｎｏｃｈａ他（２００２）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ、１１：１７９５〜１８１２；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。早産児の肺でのように、増大した透過性が成人の肺の傷害および換気の後で生じる（Ｓａｒｔｏｒｉ他（２００２）、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ、２０：１２９９〜１３１３；Ｌｅｃｕｏｎａ他（１９９９）、Ｃｈｅｓｔ、１１６：２９Ｓ〜３０Ｓ；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。従って、ＳＰ−Ｄは、感染を有する肺から生じる全身的な炎症性応答を防止するための可能性のある治療的方策を表す。
【００６９】
本明細書中に示されるように、ｒｈＳＰ−Ｄは、早産新生児の子ヒツジにおいて病原体誘導による全身的エンドトキシンショックを防止するために安全に気管内投与することができる。そのような治療は、新生児を肺感染およびその続発症から防ぐことにおいて有用であり得る。
【００７０】
加えて、本明細書中に記載される研究では、下記のことが明らかにされる：１）ＳＰ−ＤがＬＰＳを全身循環から捕捉し、ＬＰＳにより誘導される全身的炎症を阻害すること；２）ＳＰ−Ｄが、ＬＰＳにより誘導される炎症を直接的なＳＰ−Ｄ／ＬＰＳ相互作用によって阻害すること；３）全身的なＬＰＳ誘導の炎症がＳｆｔｐｄ−／−マウスでは軽減されること；４）ＳＰ−Ｄが生菌の全身的細菌攻撃の間にマウスにおける炎症を軽減し、生存を改善すること；５）血漿中のＳＰ−Ｄレベルがマウスにおいて敗血症時に増大すること；６）血管内皮細胞がＳｆｔｐｄ遺伝子を発現すること；７）全身的ＳＰ−Ｄが脾臓によって除かれること；および８）ＳＰ−Ｄの特異な構造的ドメインにより、肺胞のマクロファージが調節されること。さらには、本明細書中に示されるように、静脈内ＬＰＳ注入、ＣＬＰおよび血管内皮Ｓｆｔｐｄ発現の実験的モデルが確立され、研究室において機能的である。
【００７１】
従って、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、あるいは、それをコードする核酸を、肺感染症および／または敗血症を防止または処置するために個体に投与することができる。いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄ処置は、例えば、ＳＰ−Ｄ処置により、生存、または、致死量のＬＰＳを哺乳動物に投与または導入することに由来する組織傷害が改善されるように、ＬＰＳにより誘導される炎症を阻害することができる。他の実施形態において、ＳＰ−Ｄ処置は、例えば、ＬＰＳにより誘導される炎症を、血漿からのＬＰＳのクリアランスを高めることによって阻害することができる。さらに他の実施形態において、ＳＰ−Ｄ処置は、例えば、肺に投与されたとき、肺傷害がない場合における呼吸樹から全身循環へのＬＰＳの漏出を防止することができる。ＳＰ−Ｄ処置の実施形態はまた、例えば、多菌性敗血症または細菌攻撃を防止または処置するために全身的様式で、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、あるいは、それをコードする核酸を投与することによって敗血症を処置するために使用することができる。さらに他の実施形態において、ＳＰ−Ｄ処置は、例えば、急性呼吸窮迫症候群を処置するために、肺に、または、全身的様式で投与することができる。
【００７２】
ＳＰ−Ｄ処置は、単独で、または、他の処置（例えば、抗生物質投与など）との併用で使用することができる。さらに、いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントをコードする核酸を個体に投与することができる。ＳＰ−Ｄをコードする核酸は、例えば、アデノウイルスベクターに含有させることができる。そのようなアデノウイルスベクターは、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３５１２１（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される方法に従って構築することができる。
【００７３】
ＳＰ−Ｄタンパク質は、例えば、組換えＳＰ−Ｄであり得る。いくつかの実施形態において、組換えＳＰ−Ｄは組換えヒトＳＰ−Ｄ（ｒｈＳＰ−Ｄ）である。例えば、いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄポリペプチドはアクセション番号ＮＰ＿００３０１０の成熟ポリペプチド配列（配列番号２）である。さらなる実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質は、例えば、アクセション番号ＮＰ＿００３０１０のＳＰ−Ｄ前駆体配列（配列番号３）であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質は、例えば、ＳＰ−Ｄタンパク質またはそのフラグメントを大量に調製するために、任意の好適な生物にトランスフェクションすることができる、ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントをコードする核酸から調製することができる。タンパク質は、その後、この技術分野で知られている方法を使用して単離および精製することができる。用語「精製された」は絶対的な純度を要求せず、むしろ、相対的な定義として意図される。単離されたタンパク質は通常、例えば、クーマシー染色によって電気泳動的に均一に精製されている。出発材料または天然物質を、少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは４桁または５桁精製することが、特に意図される。
【００７４】
用語「ポリペプチド」は、例えば、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーを示すことができる。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を指定または排除しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基および脂質基などの共有結合を含むポリペプチドが、ポリペプチドの用語によって特に包含される。この定義にはまた、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（これらには、例えば、天然に存在しないアミノ酸、非関連の生物学的システムにおいて天然に存在するだけであるアミノ酸、哺乳動物システムに由来する修飾されたアミノ酸などが含まれる）を含有するポリペプチド、置換れた連結を有するポリペプチド、ならびに、この技術分野で知られている他の修飾体（天然に存在するもの、および、天然に存在しないものの両方）が含まれる。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態において、用語「精製された」は、核酸、脂質、炭水化物および他のタンパク質（これらに限定されない）をはじめとする他の化合物から分離されている本発明のＳＰ−Ｄポリペプチドを表す。ポリペプチドは、サンプルの少なくとも５０％（好ましくは６０％〜７５％）が単一のポリペプチド配列を示すときに実質的に純粋である。実質的に純粋なポリペプチドは、典型的には、タンパク質サンプルの約５０％（好ましくは６０％〜９０％、重量／重量）を構成し、より通常的には約９５％を構成し、好ましくは、約９９％を越える純度である。ポリペプチドの純度または均一性は、この技術分野で広く知られているいくつかの方法によって示される（例えば、サンプルのアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続く、ゲルを染色したときに１つだけのポリペプチドバンドを視覚化することなど）。特定の目的のために、より大きい分解能が、この技術分野で広く知られているＨＰＬＣまたは他の手段を使用することによって提供され得る。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄ配列は核酸前駆体配列のアクセション番号ＮＭ＿００３０１９（配列番号１）に由来し得る。
【００７７】
用語「実質的に相同的な」は、ＳＰ−Ｄをコードするヌクレオチド配列に関して本明細書中で使用されるときには、基準ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を示し、この場合、その対応する配列は、基準ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ構造を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、実質的に類似するヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをコードする。
【００７８】
本発明に関連して、「実質的に相同的な」は、基準タンパク質の配列の領域に対して少なくとも５０％の同一性、あるいは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする基準配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、あるいは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を示すことができる。同様に、「実質的に相同的な」はまた、好ましくは、基準タンパク質をコードするヌクレオチド配列の領域に対して少なくとも５０％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、一層より好ましくは９５％の同一性、さらに一層より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を示す。用語「実質的に相同的な」は、具体的には、配列が、特定の細胞における発現を最適化するために修飾されているヌクレオチド配列を含むことが意図される。
【００７９】
ＳＰ−Ｄヌクレオチド配列に対して「実質的に相同的な」ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、好ましくは、基準ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする。基準ヌクレオチド配列は、例えば、核酸前駆体配列のアクセション番号ＮＭ＿００３０１９（配列番号１）またはそのフラグメントが可能である。用語「ハイブリダイゼーションする」は、核酸配列を溶液中または固体支持体（例えば、セルロースまたはニトロセルロースなど）表面のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と相互作用させる方法を示す。核酸配列がＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と大きい親和性で結合するならば、その核酸配列は、そのようなＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子に「ハイブリダイゼーションする」と言われる。
【００８０】
ＳＰ−Ｄタンパク質またはそのフラグメント、あるいは、それらをコードする核酸を含む医薬組成物を、この技術分野で知られている方法に従って調製することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸あるいはそれらのフラグメントまたはアナログまたは誘導体を、哺乳動物の体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから、前記哺乳動物の体重１ｋｇあたり約１００ｍｇまでの間の量で、エアロゾル形態で対象に導入することができる。いくつかの実施形態において、投薬量は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇから、約２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇまでであり得る。さらなる実施形態において、投薬量は、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇから、約５．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。具体的な実施形態において、投薬量は１日あたりの投薬量である。当業者は、この投薬量に対応するエアロゾルの体積または重量を対象物のエアロゾル配合物におけるＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸の濃度に基づいて容易に決定することができる。あるいは、当業者によって容易に理解されるように、適切な投薬量のＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を投与される体積に有するエアロゾル配合物を調製することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を直接に肺に投与することは、より少ないＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸の使用を可能にし、従って、コストおよび望まれない副作用の両方を制限する。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸あるいはそれらのフラグメントまたはアナログまたは誘導体を含む医薬調製物を、哺乳動物の体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから、前記哺乳動物の体重１ｋｇあたり約１００ｍｇまでの間の量で、全身的様式で対象に導入することができる。いくつかの実施形態において、投薬量は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇから、約２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇまでであり得る。さらなる実施形態において、投薬量は、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇから、約５．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。具体的な実施形態において、投薬量は１日あたりの投薬量である。当業者は、この投薬量に対応する医薬調製物の体積または重量を対象物の前記医薬調製物におけるＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸の濃度に基づいて容易に決定することができる。あるいは、当業者によって容易に理解されるように、適切な投薬量のＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を投与される体積に有する医薬配合物を調製することができる。
【００８２】
本発明のＳＰ−Ｄは、分散化剤または分散剤と組み合わせて、乾燥粉末としてのエアロゾル配合物で、あるいは、希釈剤を伴う溶液または懸濁物で投与することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を含む配合物を、医薬組成物および治療用配合物を気道に送達するために設計される広範囲の様々なデバイスにおける使用のために調製することができる。いくつかの実施形態において、好ましい投与経路はエアロゾル形態または吸入形態においてである。本発明のＳＰ−Ｄはまた、例えば、希釈剤を伴う溶液または懸濁物で全身投与することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄ核酸を含む配合物を、医薬組成物および治療用配合物を全身送達するために設計される広範囲の様々なデバイスにおける使用のために調製することができる。いくつかの実施形態において、好ましい投与経路は、全身送達によるものである。配合物は、疾患適応に依存して、単回服用または多回服用で投与することができる。使用される予防用配合物または治療用配合物の正確な量は、疾患の段階および重篤度、対象の身体状態および多数の他の要因に依存することが当業者によって理解される。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｄ配合物はまた、敗血症または肺感染症を処置するための他の薬剤（例えば、経口投与または静脈内投与される抗生物質など）を含有することができる。
【実施例】
【００８４】
下記の実施例は、特許請求される発明を限定するためではなく、特許請求される発明を例示するために提供される。
【００８５】
実施例１
組換えＳＰ−Ｄの調製および精製
ｒｈＳＰ−Ｄを、全長のヒトＳＰ−ＤをコードするｃＤＮＡによるＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクションによって合成した。トランスフェクションされた細胞を、メトトレキサートの濃度を増大させることにより選択した。トランスフェクションされたプールを限界希釈によってクローン化し、高発現クローンを、特にこの目的のために設計されたＥＬＩＳＡを使用して特定した。ＳＰ−Ｄクローンを、血清を含有する培地でローラーボトルにおいて成長させ、その後、バイオ生産のためのＪＲＨ ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地に切り換えた。血清非含有培地の選択は、高い産生レベルのｒｈＳＰ−Ｄを達成することにおいて重要であることが見出された。大規模な緩衝液交換方法に伴う大きい剪断速度を避けるために、タンパク質を、アニオンイオン交換クロマトグラフィを使用して馴化培地から捕捉して、サンプルを濃縮し、グルコースを除いた。具体的には、培地を希釈し、ｐＨを７．４に調節し、その後、ＱセラミックｈｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）に負荷した。徹底的に洗浄して不純物を除いた後、ｒｈＳＰ−Ｄを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を使用して溶出した。溶出物を希釈し、カルシウムを５ｍＭの最終濃度に加えた。その後、ｒｈＳＰ−Ｄを、以前に記載された方法を使用してマルトースアガロースでアフィニティ精製した（Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ他（１９９６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｌ７５３〜Ｌ７６２；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。最終調製物におけるエンドトキシンレベルを最小限に抑えるために、アニオン交換樹脂およびすべてのクロマトグラフィ設備を０．２ＮのＮａＯＨにさらすことによって消毒し、マルトースアガロースを酸−エタノール混合物により処理した。精製されたｒｈＳＰ−Ｄは、サイズ排除クロマトグラフィにおいて１ｘ１０６ダルトンを越える多量体として移動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、このタンパク質は、非還元条件下では三量体として移動し、還元されたときには約４８ｋＤａの単量体形態に完全に転換された。組換えｈＳＰ−Ｄはインビトロにおいてカルシウム依存的様式で大腸菌と結合し、凝集させた（データは示されず）。これらの実験で使用されたｒｈＳＰ−Ｄは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）において０．５ｍｇ／ｍｌの濃度であった。ｒｈＳＰ−Ｄ調製物におけるエンドトキシンレベルは０．１ＥＵ／ｍｌ〜０．５ＥＵ／ｍｌの範囲であった（リムルス細胞分解産物アッセイ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）。予備的研究では、正常な成体マウスおよび早産子ヒツジへの処置用量のｒｈＳＰ−Ｄの滴注は肺の炎症を誘導しなかった（データは示されず）。従って、ｒｈＳＰ−Ｄにおけるエンドトキシンレベルは、炎症を誘導するレベルよりも低かったか、または、存在するエンドトキシンがｒｈＳＰ−Ｄに結合し、応答を誘発することができなかったかのいずれかであった。
【００８６】
実施例２
内因性ＳＰ−Ｄの精製
内因性ＳＰ−Ｄを、以前に記載されたように気管支肺胞洗浄液から精製する（Ｋｉｎｇｍａ，Ｐ．Ｓ．他（２００６）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２４４９６〜２４５０５；Ｓｔｒｏｎｇ，Ｐ．他（１９９８）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２２０：１３９〜１４９；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。洗浄液から、遠心分離によって脂質が除かれる。脂質を含まない上清を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／５ｍＭ ＣａＣｌ２において２０ｍｌのマルトシル−セファロースカラムに加える。カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＣａＣｌ２および１Ｍ ＮａＣｌの溶液により洗浄し、その後、ＳＰ−Ｄを塩化マンガンにより選択的に溶出する。プールされた分画物を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および３０ｍＭ ＣａＣｌ２の溶液で１０倍希釈し、１ｍｌのベッド体積のマルトシル−セファロースカラムに加える。カラムから、ＬＰＳを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ｎ−オクチル−ｄ−グルコピラノシド、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２および１００ｕｇ／ｍｌ ポリミキシンの溶液により除き、カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２および２００ｍＭ ＮａＣｌの溶液により洗浄する。ＳＰ−Ｄを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液により溶出する。記載された条件のもとで、ＬＰＳ濃度は典型的には０．１エンドトキシンユニット／μｇタンパク質以下である。
【００８７】
実施例３
処置用の早産子ヒツジの調製
すべての動物を、以前に記載されたように、Ｄｏｒｓｅｔｎの雄ヒツジと交配されたＳｕｆｆｏｌｋの雌ヒツジ（出産予定日、１５０ｄのＧＡ）から１３０日の在胎齢で帝王切開によって分娩させた（Ｋｒａｍｅｒ他（２００２）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５：４６３〜４６９；Ｋｒａｍｅｒ他（２００１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６３：１５８〜１６５；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。胎児の頭部および頸部が露出した後、気管内チューブを気管内に結び付けた。シリンジによって容易に吸引され得る胎児の肺液を取り戻し、子ヒツジを分娩させ、体重を測定した。
【００８８】
実施例４
換気された早産子ヒツジへのＬＰＳ暴露
最初の呼吸の前に、子ヒツジに、１ｍｌ（２５ｍｇ）のＳｕｒｖａｎｔａ（Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）と混合された０．１ｍｇ／ｋｇの大腸菌ＬＰＳ（大腸菌０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を与え、その後、１０ｍｌの空気をシリンジによって気道内に与えた。ＬＰＳを、肺におけるＬＰＳの均一な分布を容易にするために、少量の表面活性物質と混合し、最初の呼吸の前に肺に与えた。その後、最初の呼吸の間および最初の呼吸の後、ＬＰＳが末梢の気道に分布させられる。１０ｍｌの空気を、胎児の肺液のクリアランスを高めるために、また、ＬＰＳが末梢の気道に分布する前にＬＰＳがｒｈＳＰ−Ｄと混合することを防止するために、ＬＰＳ滴注後、気管を介して与えた。２５ｍｇのＳｕｒｖａｎｔａを使用して、エンドトキシンを滴注した。
【００８９】
実施例５
ＬＰＳにさらされた早産子ヒツジの肺へのｒｈＳＰ−Ｄの投与
上記で記載されたようなＬＰＳ暴露の子ヒツジを、その後、ｒｈＳＰ−Ｄと組み合わせて（処置群）、または、ｒｈＳＰ−Ｄと組み合わせることなく（コントロール群）、そのいずれかで所定量のＳｕｒｖａｎｔａにより処置した。Ｓｕｒｖａｎｔａの処置用量を、合計で１００ｍｇ／ｋｇを与えるように調節した。Ｓｕｒｖａｎｔａのこの後者の用量を、２ｍｇ／ｋｇのｒｈＳＰ−Ｄを含有する１２ｍｌの緩衝液（処置群）または１２ｍｌの緩衝液のみ（コントロール群）のいずれかとともに気管チューブにより滴注した。すべての動物を、類似する換気法を使用して時間循環および圧力制限の幼児ベンチレータ（Ｓｅｃｈｒｉｓｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ａｎａｈｅｉｍ、ＣＡ）により５時間にわたって換気した。５Ｆのカテーテルを、臍動脈を介して大動脈内に進め、胎盤から集めたろ過された胎児血液の１０ｍｌ／ｋｇの輸血を、早産に伴う低いヘマトクリットを正すために分娩後１０分以内に投与した。血圧、心拍数、一回換気量（ＶＴ）（ＣＰ−１００：Ｂｉｃｏｒｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｎａｈｅｉｍ、ＣＡ）および体温を継続してモニターした。血液ガス、ｐＨ、塩基過剰（ＢＥ）、ヘマトクリット、カリウム、カルシウムおよびグルコースのレベルを、少なくとも２０分毎に、または、胸の動きおよび一回換気量における変化によって示されるように、換気状態が変化したとき、血液ガス、電解質および代謝物システム（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ＵＳＡ、Ｗｅｓｔ Ｌａｋｅ、ＯＨ）によって分析した。４０回／分の呼吸速度、吸入時間：０．６ｓ、終末呼気陽圧（ＢＥＥＰ）＝４ｃｍＨ２Ｏは変化しなかった。最大吸気圧（ＰＩＰ）を、ＶＴを８ｍｌ／ｋｇ〜９ｍｌ／ｋｇで維持するために変化させた。圧力は、気胸を避けるために３５ｃｍＨ２ＯのＰＩＰに制限された。吸入酸素の割合（Ｆｉｏ２）を、１００ｍｍＨｇ〜１５０ｍｍＨｇの目標ｐＯ２を保つために調節した。１０パーセントのデキストロース（１００ｍｌ／ｋｇ／ｄ）を動脈カテーテルにより継続して注入した。動的コンプライアンスを、体重に対して正規化され、換気圧（ＰＩＰ−ＰＥＥＰ）によって除された、呼吸気流計により測定されたＶＴから計算した。直腸温度を、加熱用パッド、放射熱およびプラスチック製の身体被覆ラップを用いてヒツジについての正常な体温（３８．５℃）で維持した。補助的なケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）およびアセプロムザイン（０．１ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）を使用して、自発呼吸を抑制した。
【００９０】
実施例６
肺処理のための調製
５時間後、子ヒツジを静脈内投与による２５ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールにより深く麻酔し、１００％酸素によりしばらく換気した。気管内チューブを３分間固定して、酸素吸収により、肺を空気のない状態にすることを可能にした。５時間の研究期間を生存しなかった子ヒツジについては、死を、収縮期血圧が１０ｍｍＨｇ未満であること、または、鼓動がないことのいずれかによって決定した。
【００９１】
実施例７
データ分析
結果が平均±ＳＥＭとして与えられる。ｒｈＳＰ−Ｄ処置群および緩衝液コントロール群を、両側ｔ検定を使用して比較した。ログランク検定を群間の生存率比較のために使用した。有意性をｐ＜０．０５で認めた。
【００９２】
実施例８
肺の処理
胸腔を開き、肺を空気で４０ｃｍＨ２Ｏの圧力に１分間膨張させ、最大肺体積を記録した。肺を収縮させ、肺のガス体積を、２０ｃｍＨ２Ｏ、１５ｃｍＨ２Ｏ、１０ｃｍＨ２Ｏ、５ｃｍＨ２Ｏおよび０ｃｍＨ２Ｏで測定した。右下部葉の肺組織をＲＮＡ抽出のために液体窒素で凍結した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、視覚的に広がるまで左肺を４℃において０．９％ＮａＣｌで満たすことによって左肺に対して行い、この洗浄を５回繰り返した。ＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）をプールし、アリコートを総タンパク質の測定（Ｌｏｗｒｙ他（１９５１）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９５１、１９３：２６５〜２７５；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）のために保存した。
【００９３】
実施例９
肺胞細胞の調製
ＢＡＬＦを５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ペレット内の細胞を、トリパンブルーを使用して計数した。分別細胞計数を、染色されたサイトスピン調製物に対して行った（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ、ＩＮ）。気道に呼び寄せられた細胞の活性化を、酸性条件下における過酸化水素による第一鉄イオン（Ｆｅ２＋）から第二鉄イオン（Ｆｅ３＋）への酸化に基づくアッセイ（Ｂｉｏｘｙｔｅｃｈ Ｈ２Ｏ２−５６０アッセイ；ＯＸＩＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して過酸化水素を測定することによって評価した。
【００９４】
アポトーシス細胞を、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムによる染色（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって検出し、以前に記載されたようにフローサイトメトリによって分析した（Ｋｒａｍｅｒ他（２００１）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８０：Ｌ６８９〜Ｌ６９４；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００９５】
実施例１０
ＢＡＬＦ、肺組織および血清におけるｒｈＳＰ−Ｄの測定
ＢＡＬＦ、遠心分離後の肺ホモジネートの上清、および、５時間が経過して集められた血清におけるｒｈＳＰ−ＤのレベルをＥＬＩＳＡによって分析した。免疫ブロッティングのために、１０μｌのＢＡＬＦをＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルに負荷し、ニトロセルロースに転写し、ブロットを、ヒツジのＳＰ−Ｄと交差反応せず、これにより、サンプルにおける内因性ＳＰ−Ｄのレベルの推定を可能にするウサギ抗ｒｈＳＰ−Ｄ血清によりプローブした。
【００９６】
実施例１１
肺の組織学方法
右上部葉を３０ｃｍＨ２Ｏの圧力で１０％ホルマリンにより膨張固定した。パラフィン包埋組織を切片化し（９μｍ）、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。肺組織に対するＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１βの免疫組織化学的検出を、ヒツジＩＬ−６についてはウサギポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、ヒツジＩＬ−８についてはマウスポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、および、ヒツジＩＬ−１βについてはウサギポリクローナル抗体を使用して、以前の記載（Ｉｋｅｇａｍｉ他（２００４）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８６：Ｌ５７３〜Ｌ５７９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）のように行った。
【００９７】
実施例１２
血漿におけるエンドトキシンレベルおよびサイトカインレベルの測定
ＬＰＳを、カブトガニ変形細胞溶解成分アッセイ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）により、０分（臍血）、３０分、１時間、２時間および５時間で血漿において定量した。ＥＬＩＳＡを、血漿中のＩＬ−８およびＩＬ−１βを、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから得られる抗体を使用して求めるために使用した。
【００９８】
実施例１３
肺、脾臓および肝臓におけるＲＮＡ分析
総ＲＮＡを、グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によって右下部肺葉、脾臓および肝臓から単離した。脾臓組織および肝臓組織を使用して、気管内投与されたＬＰＳが全身的な炎症性応答を誘導したかを評価した。ＲＮａｓｅ保護アッセイを、以前に記載されたように、ヒツジのＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＴＮＦαのＲＮＡ転写物を使用して行った（Ｎａｉｋ他（２００１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、２００１；１６４：４９４〜４９８；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ヒツジのリボソームタンパク質Ｌ３２を基準ＲＮＡとした。保護されたバンドの密度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用してホスホルイメージャーで定量した。
【００９９】
実施例１４
ｒｈＳＰ−Ｄの投与による新生児における敗血症の防止
敗血症について危険性のあるヒト新生児を特定する。新生児に、ｒｈＳＰ−Ｄを、体重１ｋｇあたり１ｍｇのＳＰ−Ｄでエアロゾル配合物を使用して投与する。投与を１日に４回行う。患者を継続してモニターする。この方法の使用によって、敗血症に対する新生児の感受性が低下する。
【０１００】
実施例１５
ｒｈＳＰ−Ｄの投与による幼児における敗血症の処置
敗血症と診断される幼児を特定する。幼児に、ｒｈＳＰ−Ｄを、エアロゾル配合物を使用して体重１ｋｇあたり４ｍｇのｒｈＳＰ−Ｄで投与する。投与を１時間毎に行う。血漿中のエンドトキシンレベルをモニターする。この方法の使用によって、敗血症が治まり、死の危険性が低下する。
【０１０１】
実施例１６
ｒｈＳＰ−Ｄの３０ＡＡフラグメントの投与による幼児における敗血症の処置
敗血症と診断される幼児を特定する。幼児に、ＳＰ−Ｄの領域に対応する３０アミノ酸のペプチドを、エアロゾル配合物を使用して体重１ｋｇあたり０．５ｍｇのペプチドで投与する。投与を１時間毎に行う。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、敗血症が治まり、死の危険性が低下する。
【０１０２】
実施例１７
ｒｈＳＰ−Ｄの投与による個体における死の危険性または敗血症を防止するための肺感染症の処置
重篤な肺感染症の個体を特定する。個体は、肺感染症が続くならば、敗血症を発症する危険性がある。患者に、ｒｈＳＰ−Ｄを、１日に２回投与されるとき、１０ｍｇ／ｋｇで投与する。患者の血漿におけるエンドトキシンレベルを５日間にわたって１日に２回測定する。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、肺感染症が治まり、敗血症を発症する危険性が低下する。
【０１０３】
実施例１８
抗生物質との併用でのｒｈＳＰ−Ｄの投与による個体における死の危険性または敗血症を防止するための肺感染症の処置
重篤な肺感染症の個体を特定する。個体は、肺感染症が続くならば、敗血症を発症する危険性がある。患者に、ｒｈＳＰ−Ｄを、１日に６回投与されるとき、１ｍｇ／ｋｇで投与する。患者にはまた、経口による抗生物質処置が与えられる。患者の血漿におけるエンドトキシンレベルを５日間にわたって１日に２回測定する。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、肺感染症が治まり、敗血症を発症する危険性が低下する。
【０１０４】
実施例１９
ＬＰＳおよびＳＰ−Ｄによる感染研究のためのプロトコル
マウスを加温し、吸入２％イソフルランにより麻酔した。麻酔を足指つまみ試験によって確認する。尾をアルコールにより調製し、尾に、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ、ＬＰＳ、または、室温で１０分間プレインキュベーションされるＳＰ−Ｄと一緒でのＬＰＳを注入する。ＳＰ−Ｄ（１ｍｇ／ｍｌ）をＳＰ−Ｄ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）において保存し、１ｍＭ ＣａＣｌ２を伴うＰＢＳにおいて希釈する。ＬＰＳを等体積のＳＰ−Ｄ緩衝液において保存し、１ｍＭ ＣａＣｌ２を伴うＰＢＳにおいて希釈する。１ｍＭ ＣａＣｌ２および等体積のＳＰ−Ｄ緩衝液を伴うＰＢＳをコントロール緩衝液として使用する。
【０１０５】
実施例２０
ＳＰ−Ｄ分析のための血漿および臓器の調製
ＬＰＳ、ＳＰ−Ｄまたはコントロール緩衝液を投与した後、マウスに致死量のチオペントンナトリウム（８０μｇ／ｇ）を与え、血液を心臓穿刺または眼窩後技術によって集める。血液を氷上に置き、直ちに遠心分離して、血漿を単離する。心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓を集め、組織学のためにパラホルムアルデヒドに入れるか、または、ＲＮＡ単離のためにホモジネートする。
【０１０６】
実施例２１
全身的ＳＰ−Ｄ処置はＬＰＳ感染哺乳動物における生存を改善する
マウスに、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、致死量のＬＰＳ（８ｍｇ／ｋｇ）をＳＰ−Ｄ（２ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール緩衝液とともに与える。生存を７２時間にわたって４時間毎にモニターする。瀕死状態（逆立った毛、動くことが完全にできないこと、および、下痢）の動物は非生存体と見なし、致死量のチオペンタンナトリウムにより安楽死させる。研究では、７５％の死亡率がＬＰＳ処置マウスにおいて７２時間までに予測される。この方法の使用によって、処置群の間における７２時間での生存における統計学的有意差が認められ、より高い生存率がＳＰ−Ｄ処置群において認められ、このことは、全身的ＳＰ−Ｄ処置がＬＰＳ感染哺乳動物の生存を改善することを示している。
【０１０７】
実施例２２
全身的ＳＰ−Ｄ処置はＬＰＳ感染哺乳動物における組織傷害を改善する
マウスを、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、ＳＰ−Ｄ（２ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール緩衝液とともにＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ）で処置する。肝臓を２４時間で集め、組織傷害のマーカー（これには、肝臓でのＴＮＦα、ＮＦκＢ、ｉＮＯＳおよびミエロペルオキシダーゼの発現、肝細胞の壊死、ならびに、好中球浸潤が含まれるが、これらに限定されない）を評価する。遺伝子発現研究のために、肝臓をホモジネートし、ＲＮＡを単離し、濃度および純度について調べる。ｃＤＮＡを逆転写酵素重合によって合成し、ＰＣＲによって増幅する。遺伝子発現を、リアルタイムＰＣＲによって、または、アガロースゲルでの分離の後でのＰＣＲ産物の濃度測定によって定量する。すべての結果がＬ３２コントロールまたはＧＡＰＤＨコントロールと比較して報告される。この方法の使用によって、ＬＰＳにより誘導される組織傷害のマーカーにおける統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、全身的ＳＰ−Ｄ処置がＬＰＳ感染哺乳動物における組織傷害を改善することを示している。
【０１０８】
実施例２３
ＳＰ−Ｄ処置は血漿ＬＰＳのクリアランス速度を増大させる
マウスを、実施例１９に記載されるように、コントロール緩衝液またはＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。血液を、注入後の０．５時間、１時間、２時間、４時間および６時間で集める。ＬＰＳレベルを、実施例１２に記載されるようにリムルスアッセイによってモニターし、ＬＰＳの半減期を計算する。この方法の使用によって、クリアランス速度における統計学的に有意な増大、および、ＬＰＳの半減期における統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が血漿ＬＰＳのクリアランス速度を増大させることを示している。
【０１０９】
実施例２４
ＳＰ−Ｄ処置は組織特異的場所でのＬＰＳ誘導の炎症を阻害する
マウスを、実施例１９に記載されるように、コントロール緩衝液またはＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓（これらに限定されない）を含む）を注入後２時間で集め、ｍＲＮＡを組織ホモジネートから単離する。ＩＬ−６の遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲによって測定する。この方法の使用によって、ＬＰＳ刺激されたＩＬ−６発現における統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置マウスの特定の組織において認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が組織特異的場所でのＬＰＳ誘導の炎症を阻害することを示している。
【０１１０】
実施例２５
ＳＰ−Ｄ処置は特定の細胞タイプにおけるＬＰＳ誘導の炎症を阻害する
脾臓白血球の単一細胞懸濁物を１００μｍの濾過器での分離によってマウス脾臓から単離し、組織培養培地に入れる。場合により、リンパ球集団およびマクロファージ集団への脾臓白血球のさらなる選抜が組織培養プレートへの接着によって達成される。ＬＰＳ非含有条件で４８時間培養した後、白血球を、２４時間、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により、または、ＳＰ−Ｄ（５μｇ／ｍｌ）とともにＬＰＳにより刺激する。培地を集め、ＩＬ−６およびＴＮＦαのレベルを培養上清においてＥＬＩＳＡによって測定する。この方法の使用によって、Ｌ−６およびＴＮＦαのレベルにおける統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置の脾臓白血球において認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が特定の細胞タイプにおけるＬＰＳ誘導の炎症を阻害することを示している。
【０１１１】
実施例２６
ＳＰ−Ｄ処置は肺傷害の不在下でＬＰＳの全身的漏出を防止する
野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスを吸入イソフルランにより麻酔し、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を気管内注入によって投与する。血液を、注入後の１時間、２時間、４時間および６時間で集め、血漿中のＬＰＳレベルをリムルスアッセイによって測定する。この方法の使用によって、血漿中のＬＰＳレベルにおける統計学的有意差が２つの群の間で認められ、より高いＬＰＳレベルがＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が肺傷害の不在下でＬＰＳの全身的漏出を防止し得ることを示している。
【０１１２】
実施例２７
盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）のためのプロトコル
マウスを吸入２％イソフルランで麻酔するか、または、チオペントンナトリウムの非致死的な腹腔内注入によって麻酔する。無菌的調製の後、マウスの盲腸を２ｃｍの腹部切開により露出させ、回盲弁からおよそ０．５ｃｍ遠位側で結紮する。結紮された盲腸を２５ゲージまたは３０ゲージのニードルで穿刺する。盲腸を腹腔に戻し、腹腔を閉じる。１ｍｌの規定生理的食塩水溶液を、サードスペース（ｔｈｉｒｄ−ｓｐａｃｅ）液喪失を補償するために皮下に注入する。擬似処置マウスを、盲腸を隔離し、結紮または穿刺を伴うことなく腹腔に戻すことを除いて、上記のように処置する。ＣＬＰ後直ちに、マウスを、実施例１９に記載されるように注入のために調製する。
【０１１３】
実施例２８
ＳＰ−Ｄ処置は全身的感染における生存を改善する
ＣＬＰを実施例２７に記載されるようにマウスに対して行う。続いて、マウスに、ＳＰ−Ｄ（２ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール緩衝液を、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により投与する。生存を７２時間にわたって４時間毎にモニターする。瀕死状態（逆立った毛、動くことが完全にできないこと、および、下痢）の動物を非生存体と見なし、致死量のチオペンタンナトリウムにより安楽死させる。この方法の使用によって、処置群の間における７２時間での生存における統計学的有意差が認められ、より高い生存率がＳＰ−Ｄ処置群において認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が全身感染の対象における生存を改善することを示している。
【０１１４】
実施例２９
ＳＰ−Ｄ処置は全身的感染時における組織傷害を軽減させる
ＣＬＰを、実施例２７および実施例２８に記載されるように、ＳＰ−Ｄを伴って、また、ＳＰ−Ｄを伴うことなくマウスに対して行う。肝臓を２４時間で採取し、組織傷害のマーカーを実施例２２に記載されるように評価する。この方法の使用によって、ＬＰＳにより誘導される組織傷害のマーカーにおける統計学的に有意な低下がＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が全身的感染の対象における組織傷害を軽減させることを示している。
【０１１５】
実施例３０
ＳＰ−Ｄ処置は全身的感染における免疫応答を高める
ＣＬＰを、実施例２７および実施例２８に記載されるように、ＳＰ−Ｄを伴って、また、ＳＰ−Ｄを伴うことなくＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導する。腹膜腔を洗浄し、血液をＣＬＰ後６時間で集める。血漿および腹膜洗浄液のＬＰＳレベルをリムルスアッセイによって求める。細菌数を、血液または腹膜洗浄液の連続対数希釈、および、トリプシン消化ダイズ寒天ディッシュに置床することによって求める。コロニーを一晩のインキュベーションの後で計数する。この方法の使用によって、血漿および腹膜のＬＰＳレベルまたは細菌レベルにおける統計学的有意差が２つの群の間で認められ、より低いＬＰＳレベルまたは細菌レベルがＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置が全身的感染の対象における免疫応答を高めることを示している。
【０１１６】
実施例３１
ＳＰ−Ｄ処置はＬＰＳまたは細菌の全身的拡大を低下させる
ＣＬＰを、実施例２７および実施例２８に記載されるように、ＳＰ−Ｄを伴って、または、ＳＰ−Ｄを伴うことなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導する。腹膜腔を洗浄し、血液をＣＬＰ後６時間で集める。血漿および腹膜洗浄液のＬＰＳレベルをリムルスアッセイによって求める。細菌数を、血液または腹膜洗浄液の連続対数希釈、および、トリプシン消化ダイズ寒天ディッシュに置床することによって求める。コロニーを一晩のインキュベーションの後で計数する。この方法の使用によって、血漿のみでのＬＰＳレベルまたは細菌レベルにおける統計学的有意差が２つの群の間で認められ、より低いＬＰＳレベルまたは細菌レベルがＳＰ−Ｄ処置マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄ処置がＬＰＳまたは細菌の全身的拡大を低下させることを示している。
【０１１７】
実施例３２
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）についてのマーカーが敗血症罹患Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおいて増大する
野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスを、実施例２７に記載されるようにＣＬＰに供する。ＡＲＤＳのマーカー（これには、例えば、肺胞タンパク質レベル、Ｓａｔ ＰＣレベル、または、好中球浸潤物が含まれるが、これらに限定されない）を下記のように測定する。２４時間で、肺を規定生理的食塩水により洗浄し、洗浄液における肺胞タンパク質レベルをＬｏｗｒｙアッセイによって求める。肺胞洗浄によって回収された表面活性脂質の量を、飽和ホスファチジルコリン（Ｓａｔ ＰＣ）レベルを測定することによって求める。簡単に記載すると、Ｓａｔ ＰＣレベルを、肺胞洗浄液をクロロホルム・メタノールにより抽出し、その後、四塩化炭素におけるＯｓＯ４による脂質抽出物の処置、および、シリカカラムクロマトグラフィを行うことによって測定する。細胞浸潤物を測定するために、肺胞洗浄液を遠心分離して、細胞をペレット化し、赤血球を低浸透圧ショックによって溶解する。細胞を再懸濁し、総細胞数を、血球計算器を使用して求める。分別細胞計数を、洗浄液の細胞遠心分離を行い、Ｗｒｉｇｈｔ染料により染色することによって求める。この方法の使用によって、肺胞タンパク質レベル、Ｓａｔ ＰＣレベルまたは好中球数における統計学的有意差が２つの群の間で認められ、より高いレベルがＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められる。
【０１１８】
実施例３３
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の処置における全身的ＳＰ−Ｄの相対的重要性を研究するためのＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける肺ＳＰ−Ｄの生成
ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（すなわち、ＳＰ−Ｃ−ｒｔＴＡ／（ｔｅｔＯ）７−ＳＰ−Ｄ／Ｓｆｔｐｄ−／−またはＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ／（ｔｅｔＯ）７−ＳＰ−Ｄ／Ｓｆｔｐｄ−／−）を作製する（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．他（２００２）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７：３８７０９〜３８７１３）。ＳＰ−ＣプロモータおよびＣＣＳＰプロモータはもっぱら肺において活性化され、（ｔｅｔＯ）７−ＳＰ−Ｄ構築物はＳＰ−Ｄの発現がドキシサイクリン誘導の制御下にある。Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められた肺の異常が、これらの肺特異的導入遺伝子の発現によって完全になくなる。従って、これらの遺伝子組換えマウスはＳＰ−Ｄの全身的発現の除去を可能にし、これにより、全身的免疫性におけるＳＰ−Ｄの肺供給源対全身的供給源の相対的な重要性を比較する手段を提供する。
【０１１９】
実施例３４
全身的ＳＰ−Ｄは急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の症状の改善に関与する
ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（実施例３３）は、正常なレベルの肺ＳＰ−Ｄならびに正常な肺形態学および肺胞マクロファージ機能を有しており、しかし、全身的ＳＰ−Ｄのすべての供給源を有していない。ＣＬＰマウスにおけるＡＲＤＳに対する肺ＳＰ−Ｄ対全身的ＳＰ−Ｄの相対的な重要性を分離するために、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（実施例３３）におけるＡＲＤＳのマーカーを測定し、野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスにおけるＡＲＤＳマーカーレベルと比較する。すべてのマウスをドキシサイクリンにより処置して、ドキシサイクリンの抗菌作用を補償する。実施例２７に記載されるように、ＣＬＰを、野生型マウス、Ｓｆｔｐｄ−／−マウス、および、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて誘導する。ＡＲＤＳのマーカー（これには、肺胞タンパク質レベル、Ｓａｔ ＰＣレベル、または、好中球浸潤物が含まれるが、これらに限定されない）を、実施例３２に記載されるように測定し、これら３つの実験マウス群から得られた組織において比較する。この方法の使用によって、肺胞タンパク質レベル、Ｓａｔ ＰＣレベル、または、好中球数における統計学的に有意な増大が、野生型マウスにおいて見出されるそのようなレベルと比較して、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められ、このことは、全身的ＳＰ−ＤがＡＲＤＳの症状の改善に関与することを示している。
【０１２０】
実施例３５
ＳＰ−Ｄの全身的供給源は全身的感染時における血漿ＳＰ−Ｄのプールサイズに寄与する
研究では、血漿中のＳＰ−ＤレベルがＣＬＰ後に著しく増大することが示された。研究ではまた、肺のＳＰ−Ｄレベルが、ＣＬＰ後、野生型において、また、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて等しいことが示されている（ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける肺のＳＰ−Ｄレベルが一般に、ベースラインではより高い）。従って、ＳＰ−Ｄの肺供給源が、両方の実験群においてＣＬＰ後の増大した血漿中のＳＰ−Ｄレベルの唯一の供給源であるならば、この寄与は、完全に肺での漏出に依存することが予想される。
【０１２１】
敗血症を、野生型マウス、および、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウス（実施例３３）において、これらのマウスを、実施例２７に記載されるような技術を使用して、３０ゲージのニードルによるＣＬＰに供することによって誘導する。血液を４８時間で集め、血漿中のＳＰ−ＤレベルをＳＰ−ＤのＥＬＩＳＡによって求める。この方法の使用によって、血漿中のＳＰ−Ｄレベルにおける統計学的に有意な低下が、野生型マウスにおいて見出されるそのようなレベルと比較して、ドキシサイクリン誘導可能な肺特異的Ｓｆｔｐｄ導入遺伝子を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて認められ、このことは、ＳＰ−Ｄの全身的供給源が敗血症時における血漿ＳＰ−Ｄのプールサイズに寄与することを示している。
【０１２２】
実施例３６
ＳＰ−Ｄの血漿半減期が全身的感染時において増大する
敗血症のＳｆｔｐｄ−／−マウスを、実施例２７に記載されるような技術を使用して、３０ゲージのニードルによるＣＬＰによって作製する。コントロールのＳｆｔｐｄ−／−マウスを、擬似処置ＣＬＰ（すなわち、実施例２７に記載されるような結紮または穿刺を伴うことなく盲腸を露出させることによるＣＬＰ）によって作製する。４８時間後、マウスにＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）を尾静脈注入により投与する。血液を、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間で集め、血漿中のＳＰ−ＤレベルをＳＰ−ＤのＥＬＩＳＡによって測定する。その後、血漿ＳＰ−Ｄの半減期を計算する。この方法の使用によって、血漿中のＳＰ−Ｄレベルにおける統計学的に有意な増大が、コントロールマウスと比較して、ＣＬＰ処置マウスにおいて認められ、このことは、マウスにおいて血漿中のＳＰ−Ｄレベルを上昇させるために使用された生理学的機構が血漿ＳＰ−Ｄの分解における低下を介してであることを示している。
【０１２３】
実施例３７
Ｓｆｐｔｄプロモータ活性を制御する転写機構の特定
Ｓｆｐｔｄプロモータの欠失構築物を使用して、ＭＦＬＭ−９１Ｕ血管内皮細胞株における発現のために重要であるプロモータの領域を特定する。Ｓｆｐｔｄ遺伝子の近位側の８２塩基対、１６７塩基対、２４６塩基対、３５７塩基対、６００塩基対および６８０塩基対に連結されたルシフェラーゼレポーター遺伝子（図２１）を、標準的なトランスフェクションプロトコルを使用してＭＦＬＭ細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションされたＤＮＡの量を正規化するための適切なコントロール、および、トランスフェクション効率のための適切なコントロールが含められる。ルシフェラーゼ活性を、ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ構築物を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化する。血管内皮細胞における遺伝子発現を調節する転写因子（これには、Ｅ−ｂｏｘ、Ｎｆ１様およびＰｅａ３が含まれるが、これらに限定されない）を欠失分析において特定することができ、これらはＳｆｐｔｄプロモータにおけるコンセンサスな結合部位に対応する（Ｋｏｕ，Ｒ．他（２００５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４４：１５０６４〜１５０７３；Ａｒｄｅｋａｎｉ，Ａ．Ｍ．他（１９９８）、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、８０：４８８〜４９４；Ｃｉｅｓｌｉｋ，Ｋ．他（１９９８）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：１４８８５〜１４８９０；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。当業者はまた、Ｓｆｐｔｄ遺伝子の配列分析に基づいて、全身的なＳｆｐｔｄ発現を調節する他の転写因子を特定することができる。
【０１２４】
欠失分析によって特定されたＳｆｐｔｄプロモータの領域は、標準的なＤＮＡｓｅＩ保護アッセイによってさらに狭められる。ＭＦＬＭ細胞およびマウス肺上皮細胞（ＭＬＥ−１５）から得られた核抽出物を用いたＤＮＡｓｅＩフットプリント分析が、血管内皮細胞に対して特異的であるＳｆｐｔｄプロモータの保護された領域または高感受性領域を明らかにするために行われる。特にＭＦＬＭ細胞から得られた核抽出物によって保護されるか、または、特にＭＦＬＭ細胞から得られた核抽出物によって高感受性にされるＳｆｐｔｄプロモータのセグメントが、血管内皮細胞において特異的な転写因子ＤＮＡ結合の部位を特定するために使用される。
【０１２５】
欠失分析およびＤＮＡｓｅＩ保護アッセイによって特定された候補の転写因子はさらに、同時トランスフェクション実験によって調べられる。候補の転写因子がｐＣＭＶ発現ベクターに挿入され、上記で記載されるように、Ｓｆｐｔｄルシフェラーゼレポーター構築物とともにＭＦＬＭ細胞に同時トランスフェクションされ、ルシフェラーゼ活性が測定される。この方法の使用によって、ルシフェラーゼ活性における統計学的有意差が、コントロールのｐＣＭＶベクターとともに同時トランスフェクションされたＭＦＬＭ細胞におけるベースラインでのルシフェラーゼ活性と比較して認められ、このことは、候補のタンパク質が血管内皮細胞においてＳｆｐｔｄプロモータ活性を調節することを示している。
【０１２６】
これらの知見は、候補の転写因子のコンセンサスな結合部位が変異しているＳｆｐｔｄレポータープラスミドとの同時トランスフェクション実験を繰り返すことによって確認される。これらの実験の結果より、天然のＳｆｐｔｄのコンセンサスな結合部位を用いた同時トランスフェクション実験で以前に認められたルシフェラーゼ活性における統計学的有意差が、コンセンサスな結合部位が変異しているときにはもはや認められないことが明らかにされる。
【０１２７】
最後に、上記実験でＭＦＬＭ細胞において明らかにされた転写機構の細胞特異性が、他の細胞タイプ（すなわち、ＨｅＬａ細胞およびＨ４４１細胞）と比較することによって評価される。この方法の使用によって、ＭＦＬＭ細胞において明らかにされた転写機構の細胞特異性が、ルシフェラーゼ活性の調節がＭＦＬＭ細胞においてのみ認められることを示すことによって確認される。
【０１２８】
実施例３８
ＬＰＳは血管内皮細胞においてＳｆｐｔｄプロモータ活性を増大させる
ＭＦＬＭ細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で処置し、Ｓｆｐｔｄプロモータ活性を実施例３７に記載されるように測定する。この方法の使用によって、ルシフェラーゼ活性における統計学的に有意な増大が、ＬＰＳ非処置の細胞におけるベースラインでのルシフェラーゼ活性と比較して、ＬＰＳ処置細胞において認められ、このことは、ＬＰＳが血管内皮細胞においてＳｆｐｔｄプロモータ活性を増大させることを示している。
【０１２９】
実施例３９
全身的ＳＰ−Ｄが脾臓内の特定の細胞タイプによって除かれる
Ｓｆｐｔｄ−／−マウスに、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ（２００μｇ／ｋｇ）、または、ＬＰＳ（５０μｇ／ｋｇ）とともにＳＰ−Ｄ（２００μｇ／ｋｇ）を、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により投与する。脾臓を注入後８時間で採取し、パラホルムアルデヒドにおいて固定処理し、パラフィンに包埋し、切片化する。切片を脱パラフィン化し、再水和し、ＳＰ−Ｄ抗体とインキュベーションする。抗体複合体を、標準的な検出技術（例えば、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）、蛍光標識化）を使用して検出する。この方法の使用によって、脾臓における特定の細胞による細胞輸送が特定される。
【０１３０】
脾臓による全身的ＳＰ−Ｄの取り込みがＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインを必要とするかを明らかにするために、これらの実験を、ＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインを欠失する変異型タンパク質（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭ）を用いて繰り返す。この方法の使用によって、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭが、全長のタンパク質とは異なる組織経路または細胞経路により輸送され、このことは、ＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインが脾臓におけるＳＰ−Ｄのルーティングおよびプロセシングのために重要であることを示している。
【０１３１】
実施例４０
ＬＰＳが血管内皮細胞においてＳｆｔｐｄプロモータ活性を増大させる機構の決定
実施例３７に記載されるような分析をＬＰＳ処置のＭＦＬＭ細胞において行う。欠失構築物をＬＰＳ処置のＭＦＬＭ細胞において調べる。Ｓｆｔｐｄ発現をＬＰＳに応答して増大させるために重要である領域を、ＤＮＡｓｅＩ保護アッセイによって分析する。ＬＰＳで処理されたＭＦＬＭ細胞から得られた核抽出物に対して、コントロール緩衝液で処置されたＭＦＬＭ細胞から得られた核抽出物を用いて認められる保護された領域および高感受性領域の間の比較を、血管内皮細胞におけるＬＰＳ誘導によるＳｆｔｐｄ発現のために重要な領域をさらに単離するために行う。候補の転写因子を同時トランスフェクションおよび候補の転写因子の結合部位の変異によって調べる。この方法の使用によって、ルシフェラーゼ活性における統計学的有意差が、非処置のＭＦＬＭ細胞におけるベースラインでのルシフェラーゼ活性と比較して、ＬＰＳ処置されたＭＦＬＭ細胞において認められ、これにより、血管内皮細胞においてＬＰＳ誘導のＳｆｐｔｄプロモータ活性を調節する候補タンパク質の特定が示される。
【０１３２】
実施例４１
全身的感染を阻害することに関与するＳＰ−Ｄの構造的特徴および機構は、肺におけるウイルス攻撃に対する応答において使用されるものと類似する
ＳＰ−Ｄコラーゲン欠失変異体のｒＳｆｔｐｄＣＤＭは細菌と結合し、インフルエンザＡウイルスによる肺攻撃に対する正常な応答を容易にし、しかし、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは、ベースラインでの肺胞のマクロファージ活性（すなわち、明白な感染性攻撃の不在下でのマクロファージ活性）を調節すること、または、表面活性脂質の異常を直すことができない（Ｋｉｎｇｍａ，Ｐ．Ｓ．他（２００６）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８１：２４４９６〜２４５０５）。このタンパク質を、感染の不在下でのＳＰ−Ｄの調節を感染性攻撃時におけるＳＰ−Ｄの機能から分離することが必要である実験において使用する。
【０１３３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）、または、精製されたｒＳｆｔｐｄＣＤＭ（７５μｇ／ｋｇ、これは１５０μｇ／ｋｇのＳＰ−Ｄと等価なモル量を表す）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。血液を注入後２時間で集め、血漿中のＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルをＥＬＩＳＡによって測定する。この方法の使用によって、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭが全身的なＬＰＳ誘導の炎症を阻害することが明らかにされ、このことは、全身的なＬＰＳ誘導の炎症を阻害するために使用されるＳＰ−Ｄの構造的特徴および機構が、肺におけるウイルス攻撃の間に利用されるものと類似すること示している。
【０１３４】
実施例４２
ＳＰ−Ｄのオリゴマー化はＬＰＳ誘導の全身的炎症のＳＰ−Ｄ媒介による阻害のために要求されない
ＳＰ−Ｄは、Ｎ末端ドメイン内の１５位および２０位のシステイン残基におけるジスルフィド連結によって安定化される十量体として主に組み立てられる。これらの残基を欠失する変異型ＳＰ−Ｄ（ｒＳＰ−ＤＳｅｒ１５／２０）は、高次の多量体を形成することができない安定な三量体を形成する（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．他（２００１）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７６：１９２１４〜１９２１９；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。ｒＳＰ−ＤＳｅｒ１５／２０は炭水化物と結合するが、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスにおける異常なマクロファージ活性を直すことができず、このことから、肺のＳＰ−Ｄ機能におけるＳＰ−Ｄのオリゴマー化の重要性が明らかにされる。
【０１３５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）、または、精製されたｒＳＰ−ＤＳｅｒ１５／２０（１５０μｇ／ｋｇ）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。血液を注入後２時間で集め、血漿中のＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルをＥＬＩＳＡによって測定する。この方法の使用によって、ｒＳＰ−ＤＳｅｒ１５／２０が全身的なＬＰＳ誘導の炎症を阻害することが明らかにされ、このことは、全身的なＬＰＳ誘導の炎症のＳＰ−Ｄによる阻害がＳＰ−Ｄの多量体構造に依存しないこと、および、全身的ＳＰ−Ｄの作用機構が、肺においてＳＰ−Ｄによって利用される機構からかけ離れていることを示している。
【０１３６】
実施例４３
ＳＰ−ＤはＳＰ−Ｄ特異的な様式で全身的炎症を阻害する
ＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａはともに、肺の宿主防御において重要な役割を果たしており、しかし、ＳＰ−Ａを欠失するマウス（Ｓｆｔｐｄ−／−）は、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスに特徴的である肥大した泡沫状マクロファージを発達させず、このことは、ＳＰ−Ｄが、肺胞マクロファージの活性を、ＳＰ−Ｄに対して特異的である機構を介して調節することを示している（ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（２０００）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：３９３４〜３９４０；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（１９９９）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０：２７９〜２８６；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（１９９９）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１０３：１０１５〜１０２１；ＬｅＶｉｎｅ，Ａ．Ｍ．他（１９９８）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９：７００〜７０８；これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１３７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１９に記載されるように尾静脈注入により、コントロール緩衝液、ＳＰ−Ｄ（１５０μｇ／ｋｇ）、または、ＳＰ−Ａ（１５０μｇ／ｋｇ）とともにＬＰＳ（５μｇ／ｋｇ）で処置する。血液を注入後２時間で集め、血漿中のＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルをＥＬＩＳＡによって測定する。この方法の使用によって、ＳＰ−ＡがＬＰＳ誘導の全身的炎症を阻害しないことが明らかにされ、このことは、全身的なＬＰＳ誘導の炎症の阻害がＳＰ−Ｄに対して特異的であり、コレクチンファミリーのタンパク質の共通する性質でないことを示している。
【０１３８】
実施例４４
ＳＰ−Ｄの全身投与による新生児における敗血症の防止
敗血症について危険性のあるヒト新生児を特定する。新生児に、ＳＰ−Ｄを、体重１ｋｇあたり１ｍｇのＳＰ−Ｄで医薬配合物を使用して全身投与する。投与を１日に４回行う。患者を継続してモニターする。この方法の使用によって、敗血症に対する新生児の感受性が低下する。
【０１３９】
実施例４５
ＳＰ−Ｄの全身投与による幼児における敗血症の処置
敗血症と診断される幼児を特定する。幼児に、ＳＰ−Ｄを、医薬配合物を使用して体重１ｋｇあたり４ｍｇのＳＰ−Ｄで全身投与する。投与を１時間毎に行う。血漿中のエンドトキシンレベルをモニターする。この方法の使用によって、敗血症が治まり、死の危険性が低下する。
【０１４０】
実施例４６
ＳＰ−Ｄの３０ＡＡフラグメントの全身投与による幼児における敗血症の処置
敗血症と診断される幼児を特定する。幼児に、ＳＰ−Ｄの領域に対応する３０アミノ酸のペプチドを、医薬配合物を使用して体重１ｋｇあたり０．５ｍｇのペプチドで全身投与する。投与を１時間毎に行う。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、敗血症が治まり、死の危険性が低下する。
【０１４１】
実施例４７
ＳＰ−Ｄの全身投与による個体における死の危険性または敗血症を防止するための肺感染症の処置
重篤な肺感染症の個体を特定する。個体は、肺感染症が続くならば、敗血症を発症する危険性がある。患者に、ＳＰ−Ｄを、１日に２回投与されるとき、医薬配合物を使用して１０ｍｇ／ｋｇで全身投与する。患者の血漿におけるエンドトキシンレベルを５日間にわたって１日に２回測定する。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、肺感染症が治まり、敗血症を発症する危険性が低下する。
【０１４２】
実施例４８
抗生物質との併用でのＳＰ−Ｄの全身投与による個体における死の危険性または敗血症を防止するための肺感染症の処置
重篤な肺感染症の個体を特定する。個体は、肺感染症が続くならば、敗血症を発症する危険性がある。患者に、ＳＰ−Ｄを、１日に６回投与されるとき、医薬配合物を使用して１ｍｇ／ｋｇで全身投与する。患者にはまた、経口による抗生物質処置が与えられる。患者の血漿におけるエンドトキシンレベルを５日間にわたって１日に２回測定する。患者の健康状態を継続してモニターする。この方法の使用によって、肺感染症が治まり、敗血症を発症する危険性が低下する。
【０１４３】
様々な置換および修飾が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書中に開示された発明に対して行われ得ることが当業者には明らかである。様々な修飾が、開示された発明の範囲内において可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態および最適な特徴によって具体的に開示されているが、本明細書中に開示された概念の修飾および変形が当業者によって用いられ得ること、また、そのような修飾および変形が、開示によって定義されるような本発明の範囲内に含まれると見なされることが理解される。
【０１４４】
別途示されない限り、本明細書において使用される、成分の量、特性（例えば、実験条件など）などを表すすべての数字は、すべての場合において用語「約」によって修飾されているとして理解しなければならない。従って、別に示されない限り、本明細書において示される数値パラメーターは、本発明によって求められようとする所望の性質に依存して変化し得る近似値である。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群およびコントロール群を比較するカプラン−マイヤープロットである。コントロール群では、子ヒツジの２０％のみが、５時間の研究期間が終了する前に生存していた。対照的に、ｒｈＳＰ−Ｄにより処置されたすべての子ヒツジが生存した。ログランク検定によってｐ＜０．０５。
【図２Ａ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における血漿中のエンドトキシンレベルの線グラフによる比較である。気管内エンドトキシンがコントロール群では循環において検出され、時間とともに増大し、一方、ｒｈＳＰ−Ｄは、５時間の研究の期間中、血漿中のエンドトキシン濃度を低下させた。
【図２Ｂ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における収縮期血圧測定を比較する線グラフである。ｒｈＳＰ−Ｄによる処置はエンドトキシンショックを防止した。収縮期血圧がｒｈＳＰ−Ｄ処置群では早産新生児の正常なレベルで維持された。対照的に、血圧が、３時間が経過した後、コントロール群では徐々に低下した。＊ｐ＜０．０５（対コントロール）。
【図３Ａ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における血液ｐＨを比較する線グラフである。血液ｐＨがｒｈＳＰ−Ｄ処置により維持された。ＬＰＳ処置には、低下した血液ｐＨが伴った一方で、ｒｈＳＰ−Ｄによる処置では、ｐＨが維持され、出生前のエンドトキシン誘導によるショックが防止された。
【図３Ｂ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群におけるＢＥ（血中塩基過剰）を比較する線グラフである。ＢＥが気管内ＬＰＳによって変化した。気管内ＬＰＳは代謝性アシドーシスを誘導し、ｒｈＳＰ−Ｄ処置は低いＢＥおよびエンドトキシンショックを防止した。
【図４Ａ】図４はｐＣＯ２および換気圧の逐次測定を明らかにする。図４Ａは、ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群におけるｐＣＯ２を比較する線グラフである。気管内ＬＰＳは、３時間が経過した後、ｐＣＯ２における増大を引き起こした。ｒｈＳＰ−Ｄにより処置されたとき、ｐＣＯ２が維持された。
【図４Ｂ】ｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における換気圧（ＰＩＰ−ＰＥＥＰ）を比較する線グラフである。目標の一回換気量を維持するために使用された換気圧の量は両方の群について類似していた。＊ｐ＜０．０５（対コントロール）。
【図５Ａ】図５はｒｈＳＰ−Ｄ処置群対非処置コントロール群における前炎症性サイトカインの発現の比較である。図５Ａは、脾臓および肝臓における前炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８）のｍＲＮＡが、気管内ＬＰＳ滴注後、コントロールの子ヒツジでは増大したことを明らかにする棒グラフである。脾臓および肝臓における前炎症性サイトカインのｍＲＮＡがｒｈＳＰ−Ｄの投与によって低下した。
【図５Ｂ】脾臓および肝臓における前炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８）のｍＲＮＡが、気管内ＬＰＳ滴注後、コントロールの子ヒツジでは増大したことを明らかにする棒グラフである。脾臓および肝臓における前炎症性サイトカインのｍＲＮＡがｒｈＳＰ−Ｄの投与によって低下した。
【図５Ｃ】気管内ＬＰＳが肺におけるＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡを増大させたことを明らかにする棒グラフである。ｒｈＳＰ−Ｄにより処置されたとき、ＩＬ−１βの発現が低下した。
【図５Ｄ】血漿におけるＩＬ−８の濃度を示す線グラフである。血漿中のＩＬ−８レベルがコントロール群では増大した。血漿中のＩＬ−８レベルがｒｈＳＰ−Ｄ処置によって低いレベルで維持された。＊ｐ＜０．０５（対コントロール）。
【図６】ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色による肺の形態学（６Ａおよび６Ｂ）、ならびに、ＩＬ−８の免疫組織化学（６Ｃおよび６Ｄ）およびＩＬ−１βの免疫組織化学（６Ｅおよび６Ｆ）を示すいくつかの組織学的画像を含む。コントロール群およびｒｈＳＰ−Ｄ群の両方において、増大した顆粒球、ならびに、ＩＬ−８およびＩＬ−１βについての陽性に染色された炎症性細胞が認められる。ＩＬ−８およびＩＬ−１βについて免疫染色された炎症性細胞が気管内ｒｈＳＰ−Ｄ処置によって低下した。
【図７Ａ】図７は肺機能がｒｈＳＰ−Ｄ処置によって影響されなかったことを明らかにする線グラフである。図７Ａは、換気時におけるＶＴ、ＰＩＰ−ＰＥＥＰおよび体重から計算された動的肺コンプライアンスを示す。
【図７Ｂ】静的肺体積圧力曲線測定値の下降部がコントロール群およびｒｈＳＰ−Ｄ群の間で類似していたことを明らかにする。
【図８】高レベルのｒｈＳＰ−Ｄが気管内ＳＰ−Ｄ滴注後５時間で気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において検出されたことを明らかにする免疫ブロットである（動物＃６、＃７および＃８）。ｒｈＳＰ−Ｄが、コントロールの子ヒツジから得られたＢＡＬＦでは見出されなかった（動物＃１および＃２）。
【図９】ＬＰＳとともに投与されたとき、ＳＰ−Ｄが濃度依存的様式で血漿中のＩＬ−６レベルおよびＴＮＦαレベルを著しく低下させたことを明らかにする。図９ＡはＩＬ−６のデータを示し、図９ＢはＴＮＦαのデータを示す。
【図１０】ＳＰ−Ｄが、ＳＰ−Ｄ処置の不在下での血漿中のＩＬ−６レベルと比較した場合、ＬＰＳ用量の前（ｔ＝−３０）、ＬＰＳ用量と同時（ｔ＝０）またはＬＰＳ用量の後（ｔ＝＋３０）で投与されたとき、血漿中のＩＬ−６レベルを低下させたことを示す。
【図１１Ａ】図１１はＬＰＳにより誘導される炎症の阻害がＳＰ−Ｄ ＬＰＳ結合親和性と直接に相関したことを示す。図１１Ａは、ＳＰ−Ｄについての２つの異なった大腸菌株のＬＰＳ結合親和性を例示する。菌株０１１：Ｂ４は大きいＳＰ−Ｄ ＬＰＳ結合親和性を有し、これに対して、菌株０１２７：Ｂ８は低いＳＰ−Ｄ ＬＰＳ結合親和性を有する。
【図１１Ｂ】高結合性ＬＰＳ株（菌株０１１：Ｂ４）をＳＰ−Ｄとプレインキュベーションすることにより、血漿中のＩＬ−６レベルが著しく低下したことを明らかにし、しかしながら、ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄに対する親和性が低いＬＰＳ株（菌株０１２７：Ｂ８）により誘導される炎症を阻害しなかった。
【図１２】全身的ＬＰＳ暴露の後での野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける血漿中のサイトカインレベルの比較である。ＬＰＳにより処置されたＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける血漿ＩＬ−６レベルは野生型マウスの場合よりも約８０％低く、これは予想以外の結果であった。
【図１３】ＳＰ−Ｄ処置および非処置の全身的敗血症マウスにおける血漿中のサイトカインレベルの比較である。盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）の後、ＳＰ−Ｄにより処置されたマウスは、コントロールマウスよりも低い平均血漿ＩＬ−６レベルを示した。
【図１４】ＳＰ−Ｄ処置および非処置の全身的敗血症マウスにおける生存の比較である。ＣＬＰ後、死亡率は、コントロールマウスの方が、ＳＰ−Ｄにより処置されたマウスの場合よりも著しく高かった。
【図１５】敗血症マウスおよびコントロールマウスにおける血漿中のＳＰ−Ｄレベルの比較である。血漿中のＳＰ−Ｄレベルが、コントロールマウスと比較して、敗血症誘導マウスにおいて著しく低下した。このことは、マウスのＣＬＰモデルは、全身的ＳＰ−Ｄ産生を評価するための機能的なインビボシステムを提供し得ることを示す。
【図１６】Ｓｆｔｐｄプロモータが血管内皮細胞において活性化されることを明らかにする。ＭＦＬＭ−９１Ｕ細胞（不死化されたマウス胎児肺間葉細胞株）を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子につながれたＳｆｔｐｄプロモータを含有するプラスミド、または、ルシフェラーゼレポーター遺伝子だけを含有するコントロールプラスミドにより一過性にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性が、コントロールプラスミドによりトランスフェクションされた細胞と比較して、ルシフェラーゼ遺伝子につながれたＳｆｔｐｄプロモータを含有するプラスミドによりトランスフェクションされたＭＦＬＭ−９１Ｕ細胞において著しく増大した。
【図１７】野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウスにおける経時的な血漿中のＳＰ−Ｄレベルを示す線グラフである。ＳＰ−Ｄが、野生型マウスでは約６時間の半減期で血漿に残存し、しかし、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスでは、ＳＰ−Ｄの半減期が約２時間に低下した。興味深いことに、ネックドメインおよび炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）のみの三量体からなる短縮型ＳＰ−Ｄフラグメントの半減期は６２時間である（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、Ｇ．Ｌ．他（２００６）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９０：Ｈ２２８６〜Ｈ２２９４）。まとめると、結果から、血漿中のＳＰ−Ｄを取り込むための特異的な細胞機構が存在すること、および、この機構はＳＰ−ＤのＮ末端ドメインおよび／またはコラーゲンドメインに依存していることが示される。
【図１８】ＳＰ−Ｄを尾静脈注入により投与した後のＳｆｔｐｄ−／−マウスでの組織ホモジネートにおけるＳＰ−Ｄレベルを例示する。脾臓におけるＳＰ−Ｄのレベルが、他の組織で観測されたＳＰ−Ｄレベルよりも、また、脾臓におけるバックグラウンドレベルに対して著しく高くなった。このことは、全身的ＳＰ−Ｄが脾臓による循環から除かれることを示す。
【図１９】野生型マウスおよびＳｆｔｐｄ−／−マウス（変異型導入遺伝子ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋が発現する）における肺の形態学およびマクロファージ活性を例示する。変異型導入遺伝子ｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋は、正常なＣＲＤ、ネックドメインおよびＮ末端ドメインを有するが、コラーゲンドメインを有しない変異型ＳＰ−Ｄタンパク質（ｒＳｆｔｐｄＣＤＭ）を発現する。この変異型ＳＰ−Ｄタンパク質は野生型マウスにおいて肺の形態学またはマクロファージ活性を乱さなかった。しかしながら、この変異型ＳＰ−Ｄタンパク質はＳｆｔｐｄ−／−マウスのベースライン状態での異常なマクロファージ活性を回復させなかった。増大したレベルのメタロプロテイナーゼを発現する肥大した泡沫状マクロファージが、Ｓｆｔｐｄ−／−マウス、および、ｒＳｆｔｐｄＣＤＭタンパク質を発現するＳｆｔｐｄ−／−マウスにおいて容易に認められた。図１９Ａは野生型マウスからの肺組織を例示する。図１９Ｂは野生型バックグラウンドにおけるｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋導入遺伝子の発現を例示する。図１９ＣはＳｆｔｐｄ−／−マウスからの肺組織を例示する。図１９ＤはＳｆｔｐｄ−／−バックグラウンドにおけるｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋導入遺伝子の発現を示す。図における矢じりは、肥大した泡沫状マクロファージを示す。
【図２０】インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）に対する気管内暴露に対する、野生型マウス、Ｓｆｔｐｄ−／−マウスおよびｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−マウスの応答を例示する。増大したレベルのＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγが、ＩＡＶ攻撃されたＳｆｔｐｄ−／−マウスの肺ホモジネートにおいて認められた。しかしながら、これらのレベルはｒＳｆｔｐｄＣＤＭＴｇ＋／Ｓｆｔｐｄ−／−マウスの肺ホモジネートでは野生型レベルに戻った。図２０Ａは、ＩＡＶ攻撃されたマウスの３つの群における血漿中のＩＬ−６についてのデータを示す。図２０Ｂおよび図２０Ｃは同様に、ＩＡＶ攻撃されたマウスの３つの群における血漿中のＴＮＦαレベルおよびＩＦＮγレベルについての結果をそれぞれ例示する。
【図２１】血管内皮細胞における発現のために重要であるＳｆｔｐｄプロモータの領域を特定するための実験で使用される利用可能なＳｆｔｐｄプロモータ構築物の概略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における敗血症の防止および処置を、敗血症の症状を防止または軽減するために効果的な量で行うための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項２】
患者が哺乳動物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
患者がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
患者が成人である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
患者が小児である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
患者が幼児である、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
患者が新生児である、請求項３に記載の使用。
【請求項８】
患者が早産新生児である、請求項３に記載の使用。
【請求項９】
ポリペプチドが気管内手段によって投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
ポリペプチドがエアロゾル化によって投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
ポリペプチドが全身投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
敗血症が細菌感染症に由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
敗血症が肺感染症に由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
ポリペプチドが体重１ｋｇあたり０．５０ｍｇ〜１００ｍｇの量で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
ポリペプチドが体重１ｋｇあたり０．５０ｍｇ〜５０ｍｇの量で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
ポリペプチドが体重１ｋｇあたり０．５０ｍｇ〜２０ｍｇの量で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
患者における敗血症の防止および処置を、敗血症の症状を防止または軽減するために効果的な量で行うための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有する組換えポリペプチドの使用。
【請求項１８】
患者が哺乳動物である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
患者がヒトである、請求項１４に記載の使用。
【請求項２０】
患者が成人である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
患者が小児である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
患者が幼児である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
患者が新生児である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２４】
患者が早産新生児である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２５】
組換えポリペプチドが気管内手段によって投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２６】
ポリペプチドがエアロゾル化によって投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２７】
組換えポリペプチドが全身投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２８】
敗血症が細菌感染症に由来する、請求項１４に記載の使用。
【請求項２９】
敗血症が肺感染症に由来する、請求項１４に記載の使用。
【請求項３０】
ポリペプチドが少なくとも５アミノ酸の長さである、請求項１４に記載の使用。
【請求項３１】
患者における敗血症の防止および処置を、敗血症の症状を防止または軽減するために効果的な量で行うための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項３２】
患者が哺乳動物である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
患者がヒトである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
患者が、成人、小児、幼児、新生児および早産新生児の１つから選択される、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
核酸が気管内手段によって投与される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３６】
核酸がエアロゾル化によって投与される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３７】
核酸が全身投与される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３８】
敗血症が細菌感染症に由来する、請求項３１に記載の使用。
【請求項３９】
敗血症が肺感染症に由来する、請求項３１に記載の使用。
【請求項４０】
患者の血漿内へのリポ多糖（ＬＰＳ）の漏出を、血漿内へのＬＰＳの漏出を低下させるために効果的な量で低下させるための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４１】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
患者の血漿内への大腸菌細胞の漏出を、血漿内への大腸菌細胞の漏出を低下させるために効果的な量で低下させるための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４３】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
患者の血漿中のエンドドキシンレベルを、血漿中のエンドトキシンレベルを低下させるために効果的な量で低下させるための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４５】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４２に記載の使用。
【請求項４６】
患者の肺からのエンドドキシンの放出を、肺からのエンドトキシンの放出を阻害するために効果的な量で阻害するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４７】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
患者を気管内エンドドキシンの全身的影響から保護するために効果的な量で患者を気管内エンドドキシンの全身的影響から保護するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４９】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
患者における全身的炎症を防止するために効果的な量で患者における全身的炎症を防止するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
全身的炎症が肺からのエンドトキシンの放出によって引き起こされる、請求項４８に記載の使用。
【請求項５２】
患者における肺感染症を処置するために効果的な量で患者における肺感染症を処置するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５３】
肺感染症が細菌によって引き起こされる、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
患者における肺感染症を処置するために効果的な量で、患者における肺感染症を、敗血症の危険性が低下するように処置するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項５５】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５７】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
医薬的に許容され得る分散化剤をさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
配列番号２を含むＳＰ−Ｄポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６０】
配列番号３を含むＳＰ−Ｄポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６１】
ＳＰ−Ｄポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物。
【請求項１】
患者における敗血症の防止および処置を、敗血症の症状を防止または軽減するために効果的な量で行うための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項２】
患者が哺乳動物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
患者がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
患者が成人である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
患者が小児である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
患者が幼児である、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
患者が新生児である、請求項３に記載の使用。
【請求項８】
患者が早産新生児である、請求項３に記載の使用。
【請求項９】
ポリペプチドが気管内手段によって投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
ポリペプチドがエアロゾル化によって投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
ポリペプチドが全身投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
敗血症が細菌感染症に由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
敗血症が肺感染症に由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
ポリペプチドが体重１ｋｇあたり０．５０ｍｇ〜１００ｍｇの量で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
ポリペプチドが体重１ｋｇあたり０．５０ｍｇ〜５０ｍｇの量で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
ポリペプチドが体重１ｋｇあたり０．５０ｍｇ〜２０ｍｇの量で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
患者における敗血症の防止および処置を、敗血症の症状を防止または軽減するために効果的な量で行うための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有する組換えポリペプチドの使用。
【請求項１８】
患者が哺乳動物である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
患者がヒトである、請求項１４に記載の使用。
【請求項２０】
患者が成人である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
患者が小児である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
患者が幼児である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
患者が新生児である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２４】
患者が早産新生児である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２５】
組換えポリペプチドが気管内手段によって投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２６】
ポリペプチドがエアロゾル化によって投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２７】
組換えポリペプチドが全身投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２８】
敗血症が細菌感染症に由来する、請求項１４に記載の使用。
【請求項２９】
敗血症が肺感染症に由来する、請求項１４に記載の使用。
【請求項３０】
ポリペプチドが少なくとも５アミノ酸の長さである、請求項１４に記載の使用。
【請求項３１】
患者における敗血症の防止および処置を、敗血症の症状を防止または軽減するために効果的な量で行うための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項３２】
患者が哺乳動物である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
患者がヒトである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
患者が、成人、小児、幼児、新生児および早産新生児の１つから選択される、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
核酸が気管内手段によって投与される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３６】
核酸がエアロゾル化によって投与される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３７】
核酸が全身投与される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３８】
敗血症が細菌感染症に由来する、請求項３１に記載の使用。
【請求項３９】
敗血症が肺感染症に由来する、請求項３１に記載の使用。
【請求項４０】
患者の血漿内へのリポ多糖（ＬＰＳ）の漏出を、血漿内へのＬＰＳの漏出を低下させるために効果的な量で低下させるための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４１】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
患者の血漿内への大腸菌細胞の漏出を、血漿内への大腸菌細胞の漏出を低下させるために効果的な量で低下させるための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４３】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
患者の血漿中のエンドドキシンレベルを、血漿中のエンドトキシンレベルを低下させるために効果的な量で低下させるための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４５】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４２に記載の使用。
【請求項４６】
患者の肺からのエンドドキシンの放出を、肺からのエンドトキシンの放出を阻害するために効果的な量で阻害するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４７】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
患者を気管内エンドドキシンの全身的影響から保護するために効果的な量で患者を気管内エンドドキシンの全身的影響から保護するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項４９】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
患者における全身的炎症を防止するために効果的な量で患者における全身的炎症を防止するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
全身的炎症が肺からのエンドトキシンの放出によって引き起こされる、請求項４８に記載の使用。
【請求項５２】
患者における肺感染症を処置するために効果的な量で患者における肺感染症を処置するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５３】
肺感染症が細菌によって引き起こされる、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
患者における肺感染症を処置するために効果的な量で、患者における肺感染症を、敗血症の危険性が低下するように処置するための医薬品を製造するための、ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドの使用。
【請求項５５】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
ＳＰ−Ｄポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５７】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
医薬的に許容され得る分散化剤をさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
配列番号２を含むＳＰ−Ｄポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６０】
配列番号３を含むＳＰ−Ｄポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６１】
ＳＰ−Ｄポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２００９−５１４９５８（Ｐ２００９−５１４９５８Ａ）
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４００９５（Ｐ２００８−５４００９５）
【出願日】平成１８年１１月３日（２００６．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３０５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５６１９５
【国際公開日】平成１９年５月１８日（２００７．５．１８）
【出願人】（５００４６９２３５）チルドレンズ ホスピタル メディカル センター (40)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月３日（２００６．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３０５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５６１９５
【国際公開日】平成１９年５月１８日（２００７．５．１８）
【出願人】（５００４６９２３５）チルドレンズ ホスピタル メディカル センター (40)
【Ｆターム（参考）】
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