胃腸疾患および胃腸障害の処置のための長期持続性グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）
【課題】本発明は、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）誘導体を提供することを、本発明の課題とする。
【解決手段】本発明は、胃腸障害または胃腸疾患（例えば、炎症性腸疾患、および食道から肛門までの胃腸管の任意のセグメントの他の胃腸機能）の処置または予防のための、延長したインビボ半減期を有するＧＬＰ−２ペプチド融合体を提供する。本発明はまた、胃腸組織増殖促進因子誘導体であって、以下：胃腸組織増殖促進活性を有するＧＬＰ−２ペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント；および該ペプチドに結合される反応性要素、を含み、該誘導体は、インビボで、血液成分上の官能基と共有結合し得る、胃腸組織増殖促進因子を提供する。
【解決手段】本発明は、胃腸障害または胃腸疾患（例えば、炎症性腸疾患、および食道から肛門までの胃腸管の任意のセグメントの他の胃腸機能）の処置または予防のための、延長したインビボ半減期を有するＧＬＰ−２ペプチド融合体を提供する。本発明はまた、胃腸組織増殖促進因子誘導体であって、以下：胃腸組織増殖促進活性を有するＧＬＰ−２ペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント；および該ペプチドに結合される反応性要素、を含み、該誘導体は、インビボで、血液成分上の官能基と共有結合し得る、胃腸組織増殖促進因子を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）誘導体に関する。特に、本発明は、食道から肛門までの、胃腸管の任意の分節由来の、胃腸障害および胃腸疾患（例えば、炎症性の腸疾患および他の胃腸機能）の処置または予防のために、延長されたインビボ半減期を有するＧＬＰ−２ペプチド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＧＬＰ−２は、多面的なプログルカゴン遺伝子から組織特異的様式で発現される３３アミノ酸ペプチドであり、したがってペプチドホルモンのグルカゴンスーパーファミリーの一部である。プログルカゴンの代替可能な翻訳後のプロセシングは、膵臓、腸および脳で生じる。プログルカゴンにおける酵素的な切断は、栄養代謝に関与する多数の多機能性ペプチドホルモンを産生する。プログルカゴン由来の主要な生物活性ホルモンは、膵臓のα細胞、および腸のＬ細胞におけるＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２ならびに脳にある。それは、初めにＤｒｕｃｋｅｒらにより強力な腸向性性質を有することが発見された（非特許文献１を参照のこと）。天然の腸由来ペプチドのような、ＧＬＰ−２は、小腸および大腸の粘膜上皮に対して有意な回復活性を有することが実証されている。それはまた、腸が栄養分を消化および吸収する能力を増加することが実証されており、これは腸不全の処置における強力な治療的役割を示唆する。実際に、いくつかの研究により、ＧＬＰ−２の投与が、結腸炎、腸炎、総非経口および広範囲の切除のげっ歯類モデルにおける腸の損傷を減少または予防することが現在確認されている。極めて最近では、ＧＬＰ−２の第２相臨床試験はまた、短期の腸の症状を有する患者が、明らかに所望でない副作用が無く、ＧＬＰ−２投与の３０日後に腸内の栄養を吸収する増強された能力を示すことが実証されていることが報告されている。
【０００３】
ＧＬＰ−２の排除に対する主要な代謝性経路は、酵素的分解を介する。ＧＬＰ−２は、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によりその２つのＮ末端アミノ酸の除去を介して急速に分解されることが示されており、これはＧＬＰ−２がペプチドの完全な不活性化を導くことに起因して、主要な制限を表す。結果として、ＧＬＰ−２の半減期は、従って、きわめて短く、そして現在のＧＬＰ−２処置は、注入または頻繁な注射を必要とする。腎クリアランスはまた、ＧＬＰ−２のクリアランスに関与されることが示されている。ＧＬＰ−２の主要な作用は、細胞増殖の刺激を含み、そしてＧＬＰ−２レセプターの活性化を細胞増殖と、直接的または間接的に共役する機構は、試験されていない。
【０００４】
ネイティブＧＬＰ−２のペプチドアナログが、ＧＬＰ−２レセプターアゴニストとして小腸において増強した栄養活性を有することが示されている（例えば、米国特許第５，９９０，０７７号を参照のこと）。
【０００５】
非常に有用であるが、上記で記載するように、ＧＬＰ−２ペプチドおよびアナログの決定的な不利益は、それらの非常に短いインビボ半減期であり、これは代表的にわずか２分である。
【０００６】
炎症腸疾患（ＩＢＤ）は、小腸および大腸における炎症および潰瘍化を引き起こす慢性障害の群である。それは、命までもを脅かし得、そして現在公知の治療は存在しない。ＩＢＤは、一般に、緩解および発赤の慢性周期を生じる、結腸に制限される潰瘍性大腸炎（ＵＣ）および胃腸管全体を含み得るクローン病（ＣＤ）をいう。多数の薬学的産物は、ＩＢＤの処置（例えば、炎症を抑制すること、再発を予防すること、症状（例えば、疼痛または下痢）を制御すること、または、広範な疾患または外科術に起因してあまり吸収されない必須栄養物を交換または補充すること）は公知である。現在の治療選択肢は、広範な種々の薬学的産物様アミノ酸サリチル酸薬剤、コルチコステロイド薬剤、免疫モジュレーター薬剤および抗ＴＮＦα薬剤を含み、そして失った体液および栄養を交換することに加えて、炎症を減少および症状を軽減するように設計されている。しかしながら、これらの産物のほとんどは、一般的に体に対するそれらの所望でない副作用に起因して、ＩＢＤにおける制限された使用を有する。
【０００７】
アメリカ合衆国およびヨーロッパにおいて、約１００万人の患者が、毎年ＩＢＤについて処置され、その大半は、一般に、クローン病または潰瘍性大腸炎のいずれかに罹患している。実際に、腸の大部分の除去に関する根治手術を受けることは、ＩＢＤに罹患する患者にとって珍しくない。ＩＢＤの直接の年間保険医療費は、約７億ＵＳドルであり、そして、直接的および間接的の両方の全経済的影響は、世界的に、１年間で約２０億ドルと約３０億ドルの間の費用を見積もる。現存の処置は、しばしば軽減を提供するが、いくつかの欠点を有する。
【０００８】
米国特許第５，７８９，３７９号は、長期持続性化合物（ＡＬＸ−６００ＴＭ）として開発されたものの中のＧＬＰ−２を教示し、そして、現在は、臨床試験中である。しかし、たとえＧＬＰ−２のＤＰＰ−ＩＶ分解がいくらか予防されそうであっても、その半減期は、腎クリアランスによって制限されたままであり、そして、上記のように、２分を超えない。
【０００９】
キメラ抗体（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）は、クローン病の短期間の処置のために、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に特異的に結合するように開発された。この抗体は、コルチコステロイド、他の免疫抑制剤および／または抗生物質を用いた従来の治療に対して不十分な応答を有する患者における重篤なクローン病に対する中程度の症状の減少を示す。にもかかわらず、これら処置を用いると、深刻な副作用が観察される。例えば、それは、過敏性反応、敗血症を含む重篤な感染、ならびに胎児感染に関連している。その投与は、さらに、ＴＮＦ−ブロッキングを介して、患者に感染させやすくし得る。
【００１０】
近年のＩＢＤ有病率の増加に伴い、ゆえに、ＧＬＰ−２と実質的に同一の活性、低毒性および治療的利点を維持し得るが、より長いインビボ半減期を有し、従って、種々の疾患（例えば、炎症性腸疾患、２つの主要な炎症性腸疾患を示すクローン病および潰瘍性大腸炎）の処置において、それらの連続投与をする必要性を回避する、ＧＬＰ−２ペプチド誘導体またはアナログを開発することが非常に所望される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９６，９３（１１５），７９１１−７９１６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明に従って、ここで、対応する非改変のＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子と比較した場合、延長されたインビボ半減期を有する、ＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子誘導体を提供する。さらに具体的には、このＧＬＰ−２誘導体は、そこに結合され、そして、インビボまたはエキソビボのいずれかで、安定な共有結合を形成するために血液成分上の利用可能な官能基と反応し得る反応性要素を含む。ＧＬＰ−２誘導体と血液成分との間に形成される共有結合は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのような酵素によりＧＬＰ−２の所望でない切断を防止し、それによりインビボ半減期および活性を延長する。この反応性要素は、ＧＬＰ−２ペプチドのＮ末端、ＧＬＰ−２ペプチドのＣ末端、またはペプチド鎖に沿
う任意の他の利用可能な部位に結合され得る。
【００１３】
好ましい血液成分は、免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭを含む）、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、チロキシン結合タンパク質、α−２−マクログロブリン、ハプトグロビンなどのようなタンパク質を含み、血清アルブミンおよびＩｇＧがより好ましく、そして、血清アルブミンが最も好ましい。
【００１４】
好ましい反応性要素は、インビボまたはインビトロ（またはエキソビボ）のいずれかで、血液成分上に存在するアミノ基、ヒドロキシ基、またチオール基と反応することによって、血液成分と共有結合を形成し得る。最も好ましい実施形態において、タンパク質上の官能基はチオール基であり、そして、反応性要素は、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプター（例えば、アクロレイン誘導体、ハロアセテート、ハロアセトアミド、α，β−不飽和ケトン、α，β−不飽和エステル、α，β−不飽和アミド、α，β−不飽和チオエステルなど）、マレイミドまたはマレイミド含有基（例えば、γ−マレイミドブチリルアミド（ＧＭＢＡ）、またはマレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ））であり、最も好ましくはＭＰＡである。
【００１５】
本発明の別の局面において、薬学的に受容可能なキャリアと組合せた本発明のＧＬＰ−２胃腸増殖促進因子誘導体を含む薬学的組成物が提供される。このような組成物は、腸障害または腸疾患（例えば、炎症性腸疾患および他の胃腸機能）の処置または予防に有用である。この組成物はまた、胃腸組織増殖促進因子ペプチド誘導体の内因的な生成を、細胞に誘導させるための遺伝子治療に使用され得、これは、次いで、所望の生物学的効果を生成するために、被験体中に移植され得る。最後に、この組成物はまた、大腸組織増殖の増大のための薬学的組成物または獣医学的組成物を製造するために、使用され得る。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、腸障害または腸疾患（例えば、炎症性腸疾患および胃腸機能）の予防または処置のための方法を提供する。この方法は、被験体（好ましくは哺乳動物、動物またはヒト）に、有効量の本発明のＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子誘導体またはその結合体を、単独でまたは薬学的に受容可能なキャリアと組合せて投与する工程を包含する。
【００１７】
本発明のさらなる局面において、血液成分に共有結合された本発明のＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子誘導体を含む結合体を、提供する。
【００１８】
本発明のさらなる局面において、被験体におけるＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子のインビボ半減期を延長する方法を提供し、本方法は、本ＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子誘導体を血液成分に共有結合させる方法を包含する。この共有結合は、インビボまたはインビトロで起こり得る。
【００１９】
好ましい胃腸組織増殖促進因子化合物は、ＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２アナログ、ＧＬＰ−２フラグメントが胃腸組織増殖促進因子活性を有するのであれば、このようなアナログまたはフラグメントのようなペプチドである。これらのペプチド、アナログおよびフラグメントの詳細な配列は、以下に示される。
【００２０】
本発明の化合物誘導体のさらなる使用は、本発明の化合物誘導体と組合せて使用される場合（特に、この化合物がＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２アナログまたはＧＬＰ−２フラグメントである場合）、ホルモンの腸刺激（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）活性を決定し得る。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）腸刺激量のＧＬＰ−２誘導体とホルモンを、試験被験体に同時投与する工程；（２）試験被験体における小腸組織および大腸組織の引き続く増殖を評価する工程；（３）試験被験体中の小腸組織および／または大腸組織の増殖が、非改変のＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２アナログまたはＧＬＰ−２誘導体で処置したコントロール被験体と比較して増大されているかどうかを決定する工程。
【００２１】
連結する基が存在する場合、好ましくは、以下のように定義されるが、これらに限定されない：直鎖Ｃ１〜１０アルキルもしくは分枝Ｃ１〜１０アルキル部分的にペルフルオロ化された、直鎖Ｃ１〜１０アルキルもしくは分枝Ｃ１〜１０アルキル；１つ以上の炭素原子がＯ、ＮもしくはＳで置換されて、エーテルもしくはチオエーテルを形成する、Ｃ１〜１０アルキルもしくはフルオロアルキル；置換基が同一であるかもしくは異なり、そして、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ（ここで、ＲはＨ、Ｃ１〜１０アルキルもしくはＣ１〜１０アシルである）である、ｏ−置換、ｍ−置換またはｐ−置換されたフェニル；または、−置換された複素環（例えば、フラン、チオフェン、ピラン、オキサゾールもしくはチアゾール）
従って、本発明においては、以下が提供される：
（項目１） 胃腸組織増殖促進因子誘導体であって、以下：
胃腸組織増殖促進活性を有するＧＬＰ−２ペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント；および
該ペプチドに結合される反応性要素、
を含み、該誘導体は、インビボで、血液成分上の官能基と共有結合し得る、胃腸組織増殖促進因子。
（項目２） 項目１に記載の誘導体であって、ここで、前記ＧＬＰ−２が、以下の配列：
【化１】
であり、ここで、
Ｘ１は、ＨｉｓまたはＴｙｒであり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｎｏｒ−Ｖａｌ、α−アミノ酪酸、またはＤＰＰ−ＩＶ酵素に耐性の該アナログ上に付与されるＡｌａ−交換アミノ酸であり；
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏもしくはＨＰｒｏであるか；またはＸ２−Ｘ３がＸ２y
（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２）Ｘ３；Ｘ２y（ＣＨ２ＮＨ２）Ｘ３もしくはＸ２y（ＣＨＣＨ）Ｘ３であり、ここで、Ｘ２およびＸ３は、上記のとおりであり；
Ｘ４は、ＧｌｙまたはＡｌａであり；
Ｘ５は、ＳｅｒまたはＡｌａであり；
Ｐ１は、Ｇｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ、Ｇｌｙ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＶａｌまたはＴｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒであり；
Ｘ１０は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ置換アミノ酸であり；
Ｘ１４は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘ１６は、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ１７は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘ１９は、ＡｌａまたはＴｈｒであり；
Ｘ２０は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｌａであり；
Ｘ２１は、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
Ｘ２７は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ２８は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり；
Ｐ２は、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｉｌｅ−ＡｌａまたはＶａｌ−Ｇｌｎであり；
Ｐ３は、共有結合であるか、あるいはＩｌｅ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−ＡｓｐまたはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎであり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロッキング基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロッキング基であり；
Ｙ１は、１つまたは２つのＡｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓであり；
Ｙ２は、１つまたは２つのＡｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓであり；そして
ｍおよびｎは、独立して、０または１である、誘導体。
（項目３） 項目２に記載の誘導体であって、Ｘ１はＨｉｓであり；Ｘ２は、ＡｌａまたはＧｌｙで
あり、Ｘ３はＡｓｐであり；Ｘ４はＧｌｙであり；Ｘ５はＳｅｒであり；Ｐ１はＧｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅであり；Ｘ１０はＭｅｔであり；Ｘ１６は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；Ｘ１９はＡｌａであり；Ｘ２０はＡｒｇであり；Ｘ２７はＩｌｅであり；Ｘ２８はＧｌｎであり；Ｐ２はＩｌｅ−Ａｓｎであり；Ｐ３はＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐであり、そしてＲ２はＣＯＮＨ２である、誘導体。
（項目４） 項目１に記載の誘導体であって、前記反応性要素が、マレイミドまたはマレイミド含有
基である、誘導体。
（項目５） 項目３に記載の誘導体であって、前記ＧＬＰ−２が、以下：
【化２】
からなる群より選択される、誘導体。
（項目６） 項目１に記載の誘導体であって、以下：
【化３】
からなる群より選択される、誘導体。
（項目７） 項目１に記載の誘導体であって、前記血液成分が、血液タンパク質を含む、誘導体。
（項目８） 項目１に記載の誘導体を、薬学的に受容可能なキャリアとともに含む、薬学的組成物。
（項目９） 項目８に記載の組成物であって、胃腸障害または胃腸疾患の予防の処置のための、組成
物。
（項目１０） 被験体における胃腸障害または胃腸疾患の予防の処置のための方法であって、該方法は、
該被験体に、有効量の項目１に記載の誘導体を単独で、または有効量の項目１に記載
の誘導体を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目１１） 被験体における胃腸組織増殖の促進のための方法であって、該方法は、該被験体に、有効
量の項目１に記載の誘導体を単独で、または有効量の項目１に記載の誘導体を薬学的
に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目１２） 血液成分に共有結合された、項目１に記載の誘導体を含む、結合体。
（項目１３） 項目１２に記載の結合体であって、前記反応性要素が、マレイミドまたはマレイミド含
有基であり、前記血液成分が、血液タンパク質である、誘導体。
（項目１４） 項目１３に記載の結合体であって、前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、結
合体。
（項目１５） 項目１２に記載の結合体であって、前記誘導体が、項目６に規定される誘導体である
、結合体。
（項目１６） 胃腸組織増殖促進活性を有するＧＬＰ−２ペプチドのインビボ半減期を延長する方法であ
って、該方法は、該ペプチドを血液成分に共有結合させる工程を包含する、方法。
（項目１７） 項目１６に記載の方法であって、前記ペプチドが、ＧＬＰ−２、または胃腸組織増殖促
進活性を有する、ＧＬＰ−２のアナログもしくはフラグメントを含む、方法。
（項目１８） 項目１６に記載の方法であって、前記ＧＬＰ−２ペプチドが、項目５に規定される誘
導体である、方法。
（項目１９） 被験体における胃腸障害または胃腸疾患の予防の処置のための方法であって、該方法は、
該被験体に、有効量の項目１２に記載の結合体を単独で、または有効量の項目１２に
記載の結合体を薬学的キャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、生理食塩水、または５μｇの実施例１〜８の化合物で、毎日２回、１０日間処置したマウスの小腸湿重量における変化を示す（ｎ＝１０／集団）。結果は、平均Δ重量対コントロール±ＳＥＭとして表す。
【図２】図２は、生理食塩水、または５、２５、５０μｇの実施例５、７および８の化合物で、１日２回、１０日間処置したマウスの小腸および大腸の湿重量における変化を示す。（ｎ＝１０／集団）。結果は、平均重量±ＳＥＭとして表す。
【図３】図３は、５００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回静脈内用量または単回皮下用量後の、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、実施例５および実施例８の化合物についての平均血漿濃度を示す（ｎ＝４／集団）。
【図４】図４は、ポリクローナル抗体抗ＧＬＰ−２抗体を使用して、ラット血漿タンパク質に結合体化した実施例８の化合物の検出、および抗ラットアルブミンを用いて得たパターンとの比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
インビボでの生体結合体化（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、体内における、ＧＬＰ−２誘導体に標的血液成分の生物物理学的パラメーターを与えることを介して、生物学的活性の延長された持続期間を提供しながら、元の改変されていないＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子ペプチドの生物学的活性の実質的な保持、または、ある場合には増加を可能にする様式で、分子（例えば、本発明の胃腸組織増殖促進因子化合物誘導体）を標的血液成分（好ましくはタンパク質）に共有結合させるプロセスである。
【００２４】
本発明の目的のために、用語「アナログ」または「フラグメント」は、ネイティブな配列（例えば、ＧＬＰ−２配列）に由来する異なるアミノ酸配列を有するが、類似する活性または匹敵する活性を有するペプチドを含むアミノ酸配列を含むことを意味する。このようなアナログは、好ましくは少なくとも６０％、そしてより好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の、同数のアミノ酸残基を有するＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２のフラグメントのいずれかと同じアミノ酸配列を有する。
【００２５】
より好ましい実施形態において、本発明の胃腸組織増殖促進因子ペプチド誘導体は、直接的または結合基を介してのいずれかで反応性要素に結合することによって改変されているＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子ペプチドを含み、反応性要素は、血液成分（好ましくは血液タンパク質）と共有結合を形成し得る。反応性要素は、水性の環境において安定でなければならず、そしてそれらの好ましい実施形態は、カルボキシ基、ホスホリル基、イミデート基、またはエステルまたは混合した無水物のいずれかとしてのアシル基を含む。共有結合は、一般的に反応性要素と血液成分のアミノ基、ヒドロキシ基、チオール基との間で形成される。アミノ基は、好ましくはカルボキシ基、ホスホリル基またはアシル基のような反応性要素と共有結合を形成し；ヒドロキシ基は、好ましくは活性化エステルのような反応性要素と共有結合を形成し；そしてチオール基は、好ましくは、エステルまたは混合した無水物のような反応性要素と共有結合を形成する。好ましい血液成分としては、血清アルブミン、免疫グロブリンまたはそれらの組み合わせのような移動性の血液成分が挙げられ、そして好ましい反応性要素としては、マレイミド基のような無水物が挙げられる。最も好ましい実施形態において、血液成分は、血清アルブミンである。
【００２６】
血液成分は、好ましくは移動性であり、これは、この血液成分が任意の長期間（一般的に５分、より通常には１分を超えない）ある位置に固定していないことを意味する。これらの血液成分は、膜結合性ではなく、そして少なくとも０．１μｇ／ｍｌの最小濃度で長期間血液中に存在する。好ましい移動性血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、フェリチンならびにＩｇＭおよびＩｇＧのような免疫グロブリンが挙げられる。移動性血液成分の半減期は、少なくとも約１２時間である。
【００２７】
本発明の胃腸組織増殖促進因子誘導体は、ＧＬＰ−２ペプチドであるので、保護基は、ＧＬＰ−２誘導体の合成プロセスの間必要であり得る。これらの保護基は、ペプチド合成の分野では従来的であり、そして他の官能基との反応からペプチド誘導体を保護し得る化学的部分として一般的に記載され得る。様々な保護基は、市販され、そしてその例は、本明細書中に参考として援用される米国特許第５，４９３，００７号に見出され得る。適切な保護基の代表的な例としては、アセチル、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）などが挙げられる。表１は、アミノ酸の３文字および１文字の両方の略語を提供する。
【００２８】
【表１】
本発明のＧＬＰ−２誘導体は、血液成分との結合体化後、ペプチダーゼ安定化ペプチドを形成する。１つ以上のさらなるアミノ酸が、反応性実体のペプチドへの結合を促進するために反応性実体の添加前にペプチドに付加または置換され得ることもまた意図される。このような付加または置換は、Ｎ末端、Ｃ末端またはこれらの間においてなされ得る。このように得られたペプチド誘導体は、被験体（動物またはヒト）に投与され得、その結果、血液成分との結合体化がインビボで生じるか、またはこの誘導体は、被験体（動物またはヒト）の血液成分にインビトロで最初に結合体化し得、そして以下に規定されるような得られた結合体もしくはペプチターゼ安定化ペプチドが、被験体に投与される。
【００２９】
ＧＬＰ−２配列に存在するか、ＧＬＰ−２配列で置換されたかまたはＧＬＰ−２配列に付加された任意のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸あるいはそれらの組み合わせであり得る。Ｌ−アミノ酸が一般的に好ましい。ネイティブなＧＬＰ−２配列の２位でのグリシン置換は、ＤＰＰ−ＩＶ酵素に対するより優れた耐性を類似体に与えるので、好ましい実施形態を代表する。グリシンはまた、同一の目的のためにＤ−アラニンまたはプロリンに差し替えられ得る。さらに、ネイティブなＧＬＰ−２配列の３位でのＮ−α−メチルアスパラギン酸置換ならびにメチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレンまたはスルホンアミドのような他のペプチド模倣物は、アミド結合の等配電子置換と同一の結果を達成し得る。
【００３０】
本発明はまた、ＧＬＰ−２フラグメントを含み、このフラグメントは、天然に存在するＧＬＰ−２ペプチドの配列に対して実質的に相同な配列を含むが、ＧＬＰ−２のネイティブなペプチド上に天然に見出されるアミノ末端および／またはカルボキシ末端で、１つ以上のさらなるアミノ酸を欠如し得る。従って、本発明は、天然に存在するＧＬＰ−２配列に通常存在する１つ以上のアミノ酸を欠如し得るＧＬＰ−２のポリペプチドフラグメントであって、このようなポリペプチドは、好ましくはＧＬＰ−２の胃腸組織増殖促進活性と少なくとも実質的に等しい胃腸組織増殖促進活性を有する、ＧＬＰ−２のポリペプチドフラグメントに関する。
【００３１】
本発明はまた、重要でないアミノ酸置換を有する（従って天然の配列とは異なるアミノ酸配列を有する）上記のアナログまたはフラグメントの明白なまたは平凡な改変体であって、ＧＬＰ−２の胃腸組織増殖促進活性に実質的に類似する胃腸組織増殖促進活性を有する、改変体を包含する。明白なまたは平凡な置換の例としては、別の残基に対する１つの塩基性残基の置換（すなわちＬｙｓに対してＡｒｇ）、別の残基に対する１つの疎水性残基の置換（すなわちＩｌｅに対してＬｅｕ）、別の残基に対する１つの芳香族残基の置換（すなわちＴｙｒに対してＰｈｅ）などが挙げられる。さらに、他の平凡な改変体は、元の配列の実質的な構造的アナログを生じる保存的置換が得られる、アナログを含む。このような保存的置換の例としては、限定されないが、アスパラギン酸に対してグルタミン酸および逆もまた同様；アスパラギンに対してグルタミンおよび逆もまた同様；またはスレオニンに対してセリンおよび逆もまた同様；アルギニンに対してリジンおよび逆もまた同様；あるいはお互いに対してイソロイシン、バリンまたはロイシンのいずれか、が挙げられる。
【００３２】
ペプチダーゼ安定化ＧＬＰ−２誘導体は、インビボで、ペプチダーゼ存在下で、対応する非安定化ＧＬＰ−２アナログよりもより安定である。ペプチダーゼ安定性は、血清または血液中のネイティブなＧＬＰ−２アナログの半減期と、血清または血液中の反応性実体を含む対応する誘導体の半減期との比較によって決定される。半減期は、誘導体ペプチドまたは非改変ペプチドの投与後、血清または血液をサンプリングし、そしてそれぞれの化合物の活性を決定することによって決定される。
【００３３】
より詳細には、本発明は、ＧＬＰ−２ならびにそのアナログおよびフラグメントの顕著な治療的特性を実質的に維持または改善しながら、血液成分との選択的な結合体化を介する、そのバイオアベイラビリティ、延長されたインビボ半減期および分布を改善するための、ＧＬＰ−２ならびにそのアナログおよびフラグメントの改変に関する。
【００３４】
ヒトＧＬＰ−２は、以下の配列を有することが知られている：
【００３５】
【化４】
本発明は、特に以下のための、延長されたインビボ半減期を有するＧＬＰ−２誘導体の治療的使用および関連の使用に関する：
−小腸組織および／または大腸組織の成長の促進；
−ＧＬＰ−２誘導体の血中レベルの増大；
−胃腸機能の回復または維持；
−損傷したまたは潰瘍形成した／炎症した腸粘膜の治癒および再成長の促進；
−腸疾患の危険性の軽減；
−栄養状態の増強；
−栄養または胃腸の障害または疾患の処置または予防；
−体重減少の軽減；
−インターロイキン−１の発現の軽減；
−結腸の長さ、結腸の粘膜面積および完全性、ならびに陰窩の深さの増大；
−セリアック病、感染後絨毛萎縮および短胃症候群（ｓｈｏｒｔ ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような疾患に罹患した被験体における絨毛成長の促進；
−健康な被験体における小腸および大腸の増殖促進、例えば、ウシにおいて栄養吸収の増加を可能にして、早期の離乳または牛乳および肉の産生を増加させるため；など。
【００３６】
本発明のＧＬＰ−２誘導体によって誘発される成長における効果は、模倣物で処置されたコントロールとの比較による小腸の重量の増加として明らかにされる。特に、本ＧＬＰ−２誘導体は、本明細書中に例示されたマウスモデルにおいて評価されるとき、このアナログがビヒクルのみを受容するコントロール動物と比較して、少なくとも１０％の小腸重量の増加を媒介する場合に、「腸栄養性（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）」活性を有すると考えられる。特に治療上の使用のために適切なこれらの誘導体は、小腸重量の少なくとも２０％の増加を媒介する、誘導体であるが、より好ましくは、５０％以上の小腸重量における増加を媒介する誘導体である。腸栄養性活性は、空腸（遠位空腸および特に近位空腸を含む）との関連において、最も有意に注目され、そしてまた、回腸についても注目される。
【００３７】
腸栄養性活性の提示に加えて、本発明のＧＬＰ−２誘導体は、ＧＬＰ−２ペプチド「骨格」内の１つ以上の部位において、アミノ酸置換を組み込み、この「骨格」は、本質的に哺乳動物ＧＬＰ−２種であるか、または哺乳動物ＧＬＰ−２種の改変体であり、ここでそのＣ末端および／もしくはＮ末端は、インビボでの所望でない生化学的攻撃および分解からペプチド末端を保護するために、１つ以上の塩基性残基の付加によって改変されているか、またはペプチド化学の分野において通常使用される型のブロック基を取り込むように改変されている。従って、本発明のペプチド誘導体は、以下に挙げられる（限定されないが）任意の哺乳動物ＧＬＰ−２種に関して、アミノ酸置換を取り込む：ヒトＧＬＰ−２、ウシＧＬＰ−２、ラットＧＬＰ−２、イヌＧＬＰ−２、雄ウシ（ｏｘ）ＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、モルモットＧＬＰ−２およびハムスターＧＬＰ−２であって、これらの配列は、多くの著者によって報告されており、Ｂｕｈｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３（１８）：８６２１が挙げられる。より好ましい実施形態において、リジン残基は、ＧＬＰ−２ペプチド配列のＣ末端に付加される。
【００３８】
本発明の１つの局面において、本発明に基づく誘導体化のために適切なＧＬＰ−２の腸栄養性アナログは、以下の配列を有し：
【００３９】
【化５】
ここで、
Ｘ１は、ＨｉｓまたはＴｙｒであり；
Ｘ２は、ＤＰＰ−ＩＶ酵素に対する抵抗性を前記のアナログに与えるＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｎｏｒ−Ｖａｌ、α−アミノ酪酸、またはＡｌａ置換アミノ酸である；
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ ＨＰｒｏであるか；またはＸ２−Ｘ３は、Ｘ２ψ（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２）Ｘ３；Ｘ２ψ（ＣＨ２ＮＨ２）Ｘ３またはＸ２ψ（ＣＨＣＨ）Ｘ３であって、ここで、Ｘ２およびＸ３は、上記に規定されるとおりであり；
Ｘ４は、ＧｌｙまたはＡｌａであり；
Ｘ５は、ＳｅｒまたはＡｌａであり；
Ｐ１は、Ｇｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ、Ｇｌｙ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＶａｌまたはＴｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒであり；
Ｘ１０は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ置換アミノ酸であり；
Ｘ１４は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘ１６は、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ１７は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘ１９は、ＡｌａまたはＴｈｒであり；
Ｘ２０は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｌａであり；
Ｘ２１は、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
Ｘ２７は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ２８は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり；
Ｐ２は、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｉｌｅ−ＡｌａまたはＶａｌ−Ｇｌｎであり；
Ｐ３は、共有結合であるか、またはＩｌｅ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−ＡｓｐもしくはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎであり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基であり；
Ｙ１は、１つまたは２つのＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓであり；
Ｙ２は、１つまたは２つのＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓであり；そして
ｍおよびｎは、独立して０または１である。
【００４０】
好ましい実施形態において、Ｘ１は、Ｈｉｓであり；Ｘ２は、ＡｌａまたはＧｌｙであり；Ｘ３は、Ａｓｐであり；Ｘ４は、Ｇｌｙであり；Ｘ５は、Ｓｅｒであり；Ｐ１は、Ｇｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅであり；Ｘ１０は、Ｍｅｔであり；Ｘ１６は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；Ｘ１９は、Ａｌａであり；Ｘ２０は、Ａｒｇであり；Ｘ２７は、Ｉｌｅであり；Ｘ２８は、Ｇｌｎであり；Ｐ２は、Ｉｌｅ−Ａｓｎであり；Ｐ３は、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐであり、Ｒ２は、ＣＯＮＨ２でありそしてｍは、０である。さらに好ましい実施形態において、ｎは１であり、そしてＹ２はＬｙｓである。
【００４１】
好ましい実施形態において、タンパク質上の官能基は、チオール基であり、そして反応性実体は、マレイミドまたはマレイミド含有基（例えば、γ−マレイミド−ブチリルアミド（ＧＭＢＡ）、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）−ＭＰＡ、エチレンジアミン（ＥＤＡ）−ＭＰＡまたは［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）−ＭＰＡおよびこれらの組み合わせ）である。組み合わせの例としては、限定されないが、（ＡＥＥＡ−ＥＤＡ）−ＭＰＡ；（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ）−ＭＰＡ、（ＡＥＡ−ＡＥＥＡ）−ＭＰＡなどが挙げられる。
【００４２】
マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５と７．４との間に維持される場合、ペプチドのスルフヒドリル基に対して最も選択的である。ｐＨ７．０で、スルフヒドリルとのマレイミド基の反応速度は、アミンとの反応速度よりも１０００倍速い。マレイミド基とスルフヒドリルとの間の、生理学的条件下で切断され得ない安定なチオエーテル結合が形成される。
【００４３】
本発明の胃腸組織増殖促進因子誘導体は、血液成分の特異的標識化を提供する。このような特異的標識化（特に、マレイミドを用いる）は、いくつかの利点を提供する。遊離チオール基は、インビボでアミノ基より少なく、そして結果として、マレイミド誘導体は、より少数のタンパク質に共有結合する。例えば、血清アルブミンにおいて、１分子あたり１つのみの遊離チオール基が存在する。従って、ＧＬＰ−２−マレイミド−アルブミン結合体は、約１：１のモル比の、アルブミンに対するペプチドを含む傾向がある。アルブミンに加えて、ＩｇＧ分子（クラスＩＩ）はまた、遊離チオールを有する。ＩｇＧ分子および血清アルブミンは、血液中で大多数の可溶性タンパク質を構成するので（すなわち９９％）、それらはまた、マレイミド置換ＧＬＰ−２に共有結合するために利用可能な大多数の遊離のチオール基を構成する。
【００４４】
さらに、遊離チオール含有血液タンパク質の間でさえ、マレイミドでの特異的標識化は、アルブミン自体の独特の特性に起因して、ペプチドマレイミド−アルブミン結合体の優先的な形成を導く。アルブミンの単一の遊離チオール基（種の間で高度に保存される）は、アミノ酸残基Ｃｙｓ３４に位置する。アルブミンのＣｙｓ３４は、他の遊離チオール含有タンパク質上の遊離チオールと比較して増加した反応性を有することが最近証明されている。これは、アルブミンのＣｙｓ３４についての５．５の異常な低いｐＫ値に部分的に起因する。これは、一般的なシステイン残基についての代表的なｐＫ値（これは代表的には、約８である）よりもかなり低い。この低いｐＫに起因して、通常の生理学的条件下で、アルブミンのＣｙｓ３４は、主に陰イオン化形態であり、その反応性を劇的に上昇させる。Ｃｙｓ３４の低いｐＫ値に加えて、Ｃｙｓ３４の反応性を増強する別の因子は、アルブミンのＶ領域の１つのループの表面に近接する疎水性ポケットに存在する位置である。この位置は、Ｃｙｓ３４を、全ての種類のリガンドに非常にアクセス可能にし、そしてフリーラジカルトラップおよび遊離のチオールスカベンジャーとしてのＣｙｓ３４の生物学的な役割において重要な因子である。結果として、反応速度の加速は、他の遊離チオール含有タンパク質を有するペプチド−マレイミドの反応速度と比較して１０００倍ほど高くあり得る。
【００４５】
ペプチド−マレイミド−アルブミン結合体の別の利点は、Ｃｙｓ３４において特異的に、アルブミンに対してペプチドを１：１でロードすることに伴う再現性である。従来の活性化技術（例えば、グルタルアルデヒド、ＤＣＣ、ＥＤＣおよび他の化学的アクチベータ（例えば、遊離アミンの化学的アクチベータ）を用いる技術）は、この選択性を欠いている。例えば、アルブミンは、５２個のリジン残基を含み、このうち２５〜３０個は、アルブミンの表面上に位置し、そして結合体にとってアクセス可能である。これらのリジン残基を活性化すること、あるいは、これらのリジン残基を介して結合するようにペプチドを修飾することは、結合体の不均一な集団を生じる。等モル比（すなわち、１：１）のペプチド：アルブミンが使用される場合でさえ、最終的な結果は、ランダムな結合体生成物の生成であり、いくつかは、アルブミンの各分子に連結した不正確な数のペプチドを含み、そして各々の結合体は、２５〜３０個の利用可能なリジン部位のいずれか１つにおいてランダムに結合したペプチドを有する。結果として、正確な組成の特徴付けは、再現性の非存在はもちろんのこと、実際には不可能である。さらに、アルブミンのリジン残基を介した結合体化は、アルブミン１分子当たり、より多くの治療剤を送達する利点を少なくとも有すると考えられたが、研究により、アルブミンに対する治療剤の１：１の比が好ましいことが示されている。Ｓｔｅｈｌｅら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ、１９９７、８、６７７−６８５（これは、本明細書中でその全体が援用される）による論文において、グルタルアルデヒドを介して結合体化したアルブミンに対する抗癌メトトレキセートの１：１の比が、最も見込みのある結果を生じたことが報告された。これらの結合体は、腫瘍細胞によって取り込まれたが、一方、５：１〜２０：１のメトトレキセート分子を保有する結合体は、変更されたＨＰＬＣプロフィールを有し、そしてインビボで肝臓によって迅速に取りこまれた。従って、より高い比では、治療剤のためのキャリアとしてのアルブミンの有効性を減少すると考えられる。
【００４６】
本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体、および特にマレイミド反応性実体を含むＧＬＰ−２ペプチドの制御された投与によって、アルブミンおよびＩｇＧの、特異的なインビボでの標識および結合が制御され得る。代表的な投与において、投与されたペプチド誘導体の８０〜９０％がアルブミンに結合し、そして５％未満がＩｇＧに結合することが示された。存在する遊離チオール（例えば、グルタチオン）の微量結合もまた生じる。このような特異的結合は、投与される治療剤の推定半減期の正確な計算を可能にするので、インビボでの使用のために好ましい。
【００４７】
マレイミド置換されたＧＬＰ−２ペプチドは、一般に、水溶液の存在下および遊離アミンの存在下で、非常に安定である。マレイミド置換されたＧＬＰ−２ペプチドは、遊離チオールと反応するので、保護基が、マレイミド置換されたＧＬＰ−２ペプチドがそれら自身と反応することを防止する必要はない。
【００４８】
上記のように、血液成分に対するＧＬＰ−２誘導体の所望の結合体は、動物またはヒトであり得る被験体にこれらの誘導体を直接投与することによって、インビボで調製され得る。この投与は、ボーラスの形態で行われ得るか、または規制流れ（ｍｅｔｅｒｅｄ ｆｌｏｗ）などを使用する注入により、ゆっくりと時間をかけて導入され得る。
【００４９】
あるいは、この結合体はまた、血液または市販の精製血液成分を、本発明のＧＬＰ−２誘導体と合わせ、血液成分上の官能基に対するＧＬＰ−２誘導体の共有結合を可能にし、次いで結合体化した血液または結合体化した精製血液成分を宿主に戻すか、または投与することによって、エキソビボで調製され得る。さらに、上記はまた、個々の血液成分または限定数の成分（例えば、赤血球、免疫グロブリン、血清アルブミンなど）を最初に精製し、そしてこれらの成分を本発明の化合物誘導体とエキソビボであわせることによっても、達成され得る。次いで、標識された血液または血液成分は、インビボで治療的に有効な結合体を提供するために、被験体に戻され得る。血液はまた、エキソビボでの扱いの間の凝集を予防するために、処理され得る。
【００５０】
（ペプチド合成）
ＧＬＰ−２ペプチドは、いずれかの当業者に周知の固相ペプチド化学の標準的な方法によって、合成され得る。例えば、ペプチドは、Ｓｔｅｗａｒｄら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第二版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．（１９８４）に記載される手順に従って、Ｒａｉｎｉｎ ＰＴＩ ＳｙｍｐｈｏｎｙＴＭ合成機を使用して、固相化学技術によって合成され得る。同様に、ペプチドフラグメントが合成され得、引き続いて一緒に合わせられるかまたは連結されて、より大きなペプチド（セグメント凝縮）を形成し得る。これらの合成ペプチドフラグメントはまた、特定の位置でアミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失を有して作製され得る。
【００５１】
固相ペプチド合成について、多くの技術の要約が、Ｓｔｅｗａｒｔら、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、１９６３およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１９７３、２、４６に見出され得る。古典的な溶液合成については、例えば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第１巻、Ａｃａｃｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。一般に、このような方法は、ポリマー上の成長するペプチド鎖に、１以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸の連続的付加を含む。通常、第一のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される。次いで、保護されたアミノ酸および／または誘導体化アミノ酸は、不活性な固体支持体に結合されるか、または、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中に次のアミノ酸を、アミド結合の形成に適切な条件下で付加することによって、溶液中で使用されるかのいずれかである。次いで、保護基を、この新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、（適切に保護された）次のアミノ酸を付加するなどする。
【００５２】
全ての所望のアミノ酸が、適切な配列に連結された後、任意の残りの保護基（および任意の固体支持体）を引き続いて除去するか、または同時に最終ポリペプチドを得る。この一般的手順の簡単な改変によって（例えば、（キラル中心をラセミ化しない条件下で）保護トリペプチドを適切に保護されたジペプチドに結合させて、脱保護後にペンタペプチドを形成すること（セグメント凝縮）によって）、成長する鎖に同時に１つより多くのアミノ酸を付加することが可能である。
【００５３】
本発明のＧＬＰ−２誘導体を調製する特に好ましい方法としては、固相ペプチド合成が挙げられ、ここでこのアミノ酸α−Ｎ末端は酸感応基または塩基感応基によって保護される。このような保護基は、ペプチド連結形成の条件に安定であるが、成長ペプチド鎖またはこれらに含まれる任意のキラル中心のラセミ化を破壊することなくに容易に除去可能な性質を有するべきである。Ｎ−保護基およびカルボキシ保護基の例は、Ｇｒｅｅｎｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｐｐ．１５２〜１８６（１９８１））に開示され、これは参考として本明細書中で援用される。Ｎ−保護基の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：低級アルカノイル基（例えば、ホルミル、アセチル（「Ａｃ」）、プロピオニル、ピバロイル（ｐｉｖａｌｏｙｌ）、ｔ−ブチルアセチルなど）；他のアシル基（例えば、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタルリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、ｏ−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル、などを含む）；スルホニル基（たとえば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、ｏ−ニトロフェニルスルホニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）など）；カルバメート形成基（例えば、ｔ−アミルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−エトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル（ｉｓｏｂｏｒｎｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル（ａｄａｍａｎｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど）；アリールアルキル基（例えば、ベンジル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）など）およびシリル基（例えば、トリメチルシリルなど）。好ましいα−Ｎ−保護基は、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル；３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル；ｔ−アミルオキシカルボニル；２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニルなどであり、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）がより好ましい。その一方、好ましい側鎖Ｎ−保護基としては、リジンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基に対しては２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼン−スルホニル、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、およびアダマンチルオキシカルボニル；チロシンに対してはベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロピル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロペニルおよびアセチル（Ａｃ）；セリンに対してはｔ−ブチル、ベンジルおよびテトラヒドロピラニル；ヒスチジンに対しては、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、ｐ−トルエンスルホニル、および２，４−ジニトロフェニル；トリプロファンに対してはホルミル；アスパラギン酸およびグルタミン酸に対してはベンジルおよびｔ−ブチル；そしてシステインに対してはトリフェニルメチル（トリチル）が挙げられる。
【００５４】
カルボキシ保護基は、慣習的に、カルボン酸保護エステルまたはアミド基と呼ばれる。このようなカルボキシ保護基は、当業者に周知であり、米国特許第３，８４０，５５６号および同第３，７１９，６６７号（これらの開示は、参考として本明細書中で本明細書中によって援用される）に記載されるようにペニシリンおよびセファロスポリンの分野におけるカルボキシル基の保護において広範に使用されている。代表的なカルボキシ保護基としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃ１〜Ｃ８低級アルキル；アリールアルキル（例えば、フェネチルまたはベンジルおよび（アルコキシベンジル基またはニトロベンジル基のような）これらの置換された誘導体；アリールアルケニル（例えば、フェニルエテニル）；アリールおよび（５−インダニルのような）この置換された誘導体；ジアルキルアミノアルキル（例えば、ジメチルアミノエチル）；アルカノイルオキシアルキル基（例えば、アセトキシメチル、ブチリルオキシメチル、バレリルオキシメチル（ｖａｌｅｒｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）、イソブチリルオキシメチル、イソバレリルオキシメチル、１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、１−（ピバロイルオキシ）−１−エチル、１−メチルー１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、ピバロイルオキシメチル、プロピオニルオキシメチル）；シクロアルカノイルオキシアルキル基（例えば、シクロプロピルカルボニルオキシメチル、シクロブチルカルボニルオキシメチル、シクロペンチルカルボニルオキシメチル、シクロヘキシルカルボニルオキシメチル）；アロイルオキシアルキル（例えば、ベンゾイルオキシメチル、ベンゾイルオキシエチル）；アリールアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、ベンジルカルボニルオキシメチル、２−ベンジルカルボニルオキシエチル）；アルコキシカルボニルアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル（例えば、メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル、１−メトキシカルボニル−１−エチル）；アルコキシカルボニルオキシアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、メトキシカルボニルオキシメチル、ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシメチル、１−エトキシカルボニルオキシ−１−エチル、１−シクロヘキシルオキシカルボニルオキシー１−エチル）；アリールオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（フェノキシカルボニルオキシ）エチル、２−（５−インダニルオキシカルボニルオキシ）−エチル）；アルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（１−メトキシ−２−メチルプロパン−２−オイルオキシ（ｏｙｌｏｘｙ））−エチル）；アリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）エチル）；アリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（３−フェニルプロペン−２−イルオキシカルボニルオキシ）エチル）；アルコキシカルボニルアミノアルキル（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチル）；アルキルアミノカルボニルアミノアルキル（例えば、メチルアミノカルボニルアミノメチル）；アルカノイルアミノアルキル（例えば、アセチルアミノメチル）；複素環式カルボニルオキシアルキル（例えば、４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル）；ジアルキルアミノカルボニルアルキル（例えば、ジメチルアミノカルボニルメチル、ジエチルアミノカルボニルメチル）；（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル（例えば、（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル）；および（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル（例えば、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル。代表的なアミドカルボキシ保護基としては、アミノカルボニル基および低級アルキルアミノカルボニル基が挙げられるがこれらに限定されない。上記のカルボキシ保護基の中で、低級アルキル、シクロアルキルエステルもしくはアリールアルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステルなど）またはアルカノイルオキシアルキル、シクロアルカノイルオキシアルキル、アロイルオキシアルキルまたはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルが好ましい。好ましいアミドカルボキシ保護基は、低級アルキルアミノカルボニル基である。
【００５５】
固相ペプチド合成法において、α−Ｃ−末端アミノ酸は、適切な固体支持体または樹脂に結合される。上記の合成に有用な適切な固体支持体は、試薬および段階的な濃縮−脱保護反応の反応条件に不活性であり、そして使用される媒体に不溶である、材料である。α−Ｃ末端カルボキシペプチドの合成に好ましい固体支持体は、４−ヒドロキシメチルフェノキシアセチル−４’−メチルベンジヒドリルアミン樹脂（ＨＭＰ樹脂）である。このα−Ｃ末端アミドペプチドのための好ましい固体支持体は、Ｆｍｏｃ−保護Ｒａｍａｇｅ Ｒｅｓｉｎである。
【００５６】
固体支持体が、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂である場合、上記のようにα−Ｃ−末端アミノ酸によるカップリングの前に、このＦｍｏｃ基は２級アミン（好ましくはピペリジン）によって切断される。脱保護された４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂にカップリングする好ましい方法は、ＤＭＦ中のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１当量）、および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。連続的な保護アミノ酸のカップリングは、当該分野で周知の従来の様式で自動ポリペプチド合成機で実行され得る。
【００５７】
成長ペプチドのα−Ｎ−末端側からのＦｍｏｃ保護基の除去は、例えば、２級アミン（好ましくはピペリジン）での処理によって従来どおりに達成される。次いで、それぞれの保護アミノ酸は、約３倍の過剰モル濃度において導入され、そしてそのカップリングは好ましくはＤＭＦ中で実行される。このカップリング剤は、通常、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１当量）、および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。
【００５８】
固相合成の最後、このペプチドは、連続的な操作かまたは単一の操作のいずれかで樹脂から除去され、そして脱保護される。このポリペプチドの除去および脱保護は、樹脂結合ポリペプチドを、チオアニソール、トリイソプロピルシラン、フェノール、およびトリフルオロ酢酸を含む切断試薬で処理することによる一回の操作において従来どおりに達成され得る。ポリペプチドのα−Ｃ−末端がアルキルアミドである場合、この樹脂は、アルキルアミンを用いるアミノ分解によって切断される。あるいは、このペプチドは、エステル交換（例えば、メタノールを用いて）によって除去され得、続いてアミノ分解または直接アミド基転移によって除去され得る。この保護ペプチドは、この時点で精製され得るかまたは直接、次の工程に移される。この側鎖保護基の除去は、上記の切断混合物を使用して達成される。十分に脱保護されたペプチドは、以下のいずれかまたはすべての型を使用する一連のクロマトグラフィー工程によって精製され得る：弱酸樹脂（酢酸型）によるイオン交換；非誘導化ポリスチレン−ジビニルベンゼン（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤＴＭ）による疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロースによるイオン交換クロマトグラフィー；分配クロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ＴＭ、ＬＨ−２０ＴＭまたは向流分配）；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、オクチルシリカまたはオクタデシルシリルシリカが、カラム充填相に結合されている逆相ＨＰＬＣ。当業者の誰もが、どのクロマトグラフィー工程または順序が、ＧＬＰ−２ペプチドの満足な精製を得るのに必要とされるかを容易に決定し得る。
【００５９】
これらのペプチドの分子量は、Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙ質量分析器を使用して測定される。
【００６０】
本発明のＧＬＰ−２誘導体の生成のための合成プロセスは、ＧＬＰ−２誘導体に含まれる種々の要素の性質（すなわち、このＧＬＰ−２の配列、連結基および反応性実体）に依存して大きく変化する。この合成手順は、単純性、高収率および反復性を保証するよう選択され、そして高度に精製された生成物を得る。通常、この化学的に反応性の実体は、その合成の最終段階でカップリングされる（例えば、カルボキシル基と、活性エステルを形成するためのエステル化）。本発明のＧＬＰ−２誘導体の生成のための特定の方法は、以下に記載される。
【００６１】
この化学的に反応性の実体は、ポリペプチドが対応するネイティブのＧＬＰ−２ペプチドの実質的な比率、活性および／または有益な影響を（全てではないにしても）保持しながら血液成分に共有結合され得る側に配置されなければならない。
【００６２】
より好ましい実施形態において、各ＧＬＰ−２誘導体は、以下の基準に従って合成される：末端カルボキシル基が、ペプチド上で利用可能であり、薬理学的活性の保持に重大な意味を持たず、かつ他の感応性官能基がペプチド上に存在しない場合、カルボン酸が、連結基−反応性実体の修飾のための結合部分として選択される。この末端カルボキシル基が、薬理学的活性に関与するか、またはどのカルボン酸も利用可能でない場合、薬理学的活性の保持に重要な意味を持たない任意の他の感応性官能基が、連結基−反応性実体の修飾のための結合部分として選択される。いくつかの感応性官能基が、ペプチド上で利用可能である場合、保護基の組合せは、連結基／反応性実体の付加および全ての保護された感応性感応基の脱保護後に薬理学的活性の保持がなお得られるような方法において使用される。感応性感応基がペプチド上で利用可能でない場合、合成の努力によって、生物学的活性の保持およびレセプター特異性または標的特異性の保持が得られるような方法での元のペプチドの修飾が可能となる。この場合、この修飾は、好ましくはペプチドの反対の末端で生じる。
【００６３】
本発明に従って、ＧＬＰ−２誘導体は、上部胃腸管組織の増大から利益をうける患者に投与され得る。さらに、上部胃腸管組織の増大した機能から利益をうける患者（組織増殖の増大の結果であるかどうかにかかわらず）は、本発明を用いて処置するための候補である。一般的に、増加した上部胃腸管の質量および／または増加した上部胃腸管の粘膜機能のいずれかから利益をうける患者は、本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いた処理の候補である。本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いて処理され得る特定の状態は、胃または食道の炎症性疾患、ならびに上部胃腸管の部分的または完全に近い切除を受けている患者の様々な形態を含む。本発明のＧＬＰ−２誘導体またはその混合物によって処置され得る、胃および食道を含む上部胃腸管の状態の非網羅的な列挙としては、以下のような胃の障害が挙げられる：急性胃炎、急性出血性胃炎、急性ストレス性胃炎、ウイルス性胃炎、寄生虫性胃炎、真菌性胃炎、胃疾患（急性）、出血性胃疾患、急性ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ胃炎、Ａ型、Ｂ型またはＣ型胃炎、過分泌性胃炎、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに続発する非特異的胃炎、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ−関連胃炎、化学物質胃炎、反応性胃炎、逆流性胃炎、胆汁性胃炎、化生性萎縮性胃炎および環境化生性萎縮性胃炎、特発性全胃炎（ｐａｎｇａｓｔｒｉｔｉｓ）、びまん性肉体性胃炎（ｄｉｆｆｕｓｅ ｃｏｒｐｏｒａｌ ｇａｓｔｒｉｔｉｓ）、自己免疫性慢性胃炎および自己免疫関連胃炎、ヘリコバクターピロリ以外の細菌性胃炎（Ｇａｓｔｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓ、フレグモーネ、マイコバクテリア、梅毒性）、幽門洞切除後（ｐｏｓｔａｎｔｒｅｃｔｏｍｙ）萎縮性胃炎、好酸球性胃炎、および任意の他の感染性胃炎；クローン病、サルコイドーシス、孤立性肉芽腫性胃炎、リンパ球性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｌｉｃ）胃炎、メネトリエ病（Ｍｅｎｅｔｒｉｅｒｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）など、および以下のような真菌またはウイルスまたは細菌からの感染性食道炎のような食道の障害：Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｅｃｉｅｓ（ｅｓｐ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ａｓｐａｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｅｓのような真菌、または単純ヘルペスウイルス（１型）、サイトメガロウイルス、Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒウイルスのようなウイルス、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ Ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ．のような細菌。食道の他の障害としては、限定しないが以下が挙げられる：非感染性食道炎、酸逆流、胆汁逆流、化学的損傷（医薬、毒、酸、アルカリなどによる）、サーコイドーシス、クローン病、ベーチェット病、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ関連感染症（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｉｌｌ、Ｇｌａｒｄｉａ Ｌａｍｂｌｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペス）。
本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いて処置され得る他の疾患または状態としては、以下が挙げられる：小腸管粘膜における異常性（これは潰瘍および炎症性障害を含む）；吸収不良症候群を含む先天性または後天性消化障害および吸収障害；ならびに小腸粘膜機能の欠損による疾患および状態（特に延長した腸管外栄養補給を受けている患者、または外科手術の結果、小腸の切除を受けたかまたは短腸症候群（ｓｈｏｒｔ−ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および窩（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ）症候群を罹患する患者）。一般的に、増加した小腸の質量、そしてその結果起こる増加した小腸粘膜機能のいずれかから利益をうける患者は、ＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いての処置に対する候補である。本発明のＧＬＰ−２誘導体を用いて処置され得る特定の状態は、以下を含む様々なスプルーが挙げられる：小麦からグリアジンへの毒性反応の結果生じ、そして小腸の絨毛（ｖｉｌｌａｅ）の損失が顕著である、セリアックスプルー；感染の結果生じ、絨毛の部分的な平坦化が顕著である、熱帯性スプルー；分類不能型免疫不全または低ガンマグロブリン血を有する患者において共通して観察され、そして絨毛の長さの有意な減少が顕著である、低ガンマグロブリン血スプルー。本発明の誘導体を用いて処置され得るか、またはこれらが予防的に有用であり得る他の状態としては、以下が挙げられる：放射線腸炎、感染性または感染後の腸炎、限局性腸炎（クローン病）、毒または化学療法薬に起因する小腸損傷および短腸症候群を有する患者。
【００６４】
別の局面において、本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いた処置のための患者の候補は、膵島の増殖（そして特に膵島の増殖または再生）から利益を得る患者である。このような患者としては、膵島の不在もしくは減少、または低下した膵島機能が顕著である疾患または状態を罹患した患者が挙げられる。特別な患者の候補は、１型または２型糖尿病を罹患する患者、ならび膵臓の浸潤、炎症または破壊に起因する糖尿病の２次的形態を有する患者である。
【００６５】
本発明のＧＬＰ−２誘導体は、その治療効果を最適化するよう単独でかまたは組み合わせで使用され得る。これらは、生理学的に受容可能な媒体（例えば、脱イオン水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、水性エタノールまたは他のアルコール、血漿、タンパク溶液、マンニトール、水性グルコース、アルコール、植物油など）中で投与され得る。含まれ得る他の添加物としては、緩衝液（ここでこの培体は一般的には約５〜１０の範囲のｐＨに緩衝され、この緩衝液は一般的には約５０〜２５０ｍＭの濃度範囲である）、塩（ここで塩の濃度は一般的には約５〜５００ｍＭの範囲である）、生理学的に受容可能な安定剤などが挙げられる。この組成物は、便利な貯蔵および輸送のために凍結乾燥され得る。
【００６６】
本発明のペプチド誘導体は、経口的に、非経口的（例えば、脈管内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）など）に投与され得る。投与は、注入によって適切な状況においてなされ得る。いくつかの例では、官能基の反応が比較的遅い場合、投与は、経口、経鼻、直腸、経皮またはエアロゾルであり得、ここでこの結合体の性質は、脈管系への輸送を可能にする。所望の場合、１度以上の注射が使用され得るが、通常は１度の注射が行われる。このペプチド誘導体は、任意の首尾良い手段によって投与され得、その手段としては、注射器、外套針、カテーテルなどが挙げられる。投与の特定の様式は、投与量によって、１度のボーラス投与であるか連続的な投与であるかなどによって変化する。好ましくは、投与は、脈管内投与であり、ここで注入の部位は、本発明にとって重要ではなく、好ましくは速い血流が存在する部位（例えば、静脈内、末梢静脈または中心静脈）である。他の経路は、投与が遅延放出技術または保護マトリクスと結び付けられた用途を見出し得る。この意図は、ペプチドが血液中に効果的に拡散され、その結果、血液成分と反応し得ることである。この結合体の濃度は、広範に変化し、一般的には約１ｐｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。代表的に、脈管内総投与量は、通常約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、より一般的には約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００６７】
長寿命の血液成分（例えば、免疫グロブリン、血清アルブミン、赤血球および血小板）への結合によって多くの利点を生じる。本発明のＧＬＰ−２誘導体の活性は、数日間、延長され、そして潜在的には数週間にまで延長される。１回のみの投与が、この期間の間で必要とされる。より大きい特異性が、活性成分が大分子に最初に結合することによって達成され、細胞内に取り込まれて、他の生理学的プロセスと干渉する可能性はほとんどない。
【００６８】
哺乳動物宿主の血液は、ＧＬＰ−２の活性および／またはＧＬＰ−２誘導体の存在についてモニタリングされ得る。異なる時間で宿主の血液サンプルを取り出すことによって、ＧＬＰ−２ペプチドが治療的に活性であるのに十分な量で長寿命血液成分に結合するか否かが測定され得、その後、血液中のＧＬＰ−２のレベルが測定され得る。所望の場合、ＧＬＰ−２ペプチドが共有結合される血液成分もまた測定され得る。特異的なマレイミド置換されたペプチドは、血清アルブミンおよびＩｇＧの半減期を計算するのが容易である。モニタリングはまた、ペプチド活性のアッセイ、ＨＰＬＣ−ＭＳまたはペプチドに対する抗体を使用することによって行われ得る。
【００６９】
本発明の別の局面は、ＧＬＰ−２ペプチドに特異的な抗体を使用して生物学的サンプル（例えば、血液）においてＧＬＰ−２ペプチドまたはその結合体の濃度を測定する方法、およびこのようなＧＬＰ−２ペプチドまたは結合体と潜在的に関連する毒性に対する処置としてのこのような抗体の使用に関する。これは、患者におけるＧＬＰ−２ペプチドのインビボでの安定性および寿命が延長されることにより、処置の間の新たな問題（毒性に対する可能性の増加を含む）が引き起こされ得るという理由で有利である。抗ＧＬＰ−２抗体（モノクローナルまたはポリクローナルのいずれか）の使用は、ＧＬＰ−２に対して特異性を有しており、任意のこのような問題の媒介を補助し得る。この抗体は、産生され得るかまたは、特定のＧＬＰ−２誘導体、または薬剤の免疫原性フラグメント、または薬剤の抗原決定基に対応する合成された免疫原で免疫化された宿主から誘導され得る。好ましい抗体は、ＧＬＰ−２ペプチド誘導体のネイティブ形態、誘導体形態および結合体形態に対して高い特異性および親和性を有する。このような抗体はまた、酵素、蛍光色素、または放射標識で標識化され得る。
【００７０】
ＧＬＰ−２誘導体に対する抗体特異性は、誘導体化ＧＬＰ−２特異的抗体の導入のために精製されたＧＬＰ−２ペプチドを使用することによって生成され得る。抗体の誘導によって、動物への注射による免疫応答の刺激だけでなく、合成抗体または他の特異的結合分子の生成における類似の工程（例えば、遺伝子組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニング）が意図される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が、当該分野において周知の手順によって作製され得る。
【００７１】
この抗体はまた、血流におけるＧＬＰ−２ペプチドの存在をモニタリングするのに使用され得る。血液サンプルおよび／または血清サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析され得る。このような技術は、血液成分に対するＧＬＰ−２誘導体の結合の測定のための血液または血清の分析を可能にする。
【００７２】
抗治療薬剤抗体がまた、ＧＬＰ−２誘導体の投与によって誘導された毒性の処置に使用され得、エキソビボまたはインビボで使用され得る。エキソビボ法としては、固体支持体に固定された抗治療薬剤抗体を使用する毒性についての免疫透析処置が挙げられる。インビボ法としては、抗体−薬剤複合体のクリアランスを誘導するのに有効量の抗治療薬剤抗体の投与が挙げられる。
【００７３】
この抗体は、ＧＬＰ−２誘導体およびこれらの結合体を、滅菌条件下で血液を抗体に接触させることによって、エキソビボで患者の血液から除去するのに使用され得る。例えば、抗体は固定され得るかまたはそうでなければカラムマトリクスに固定され得、そして患者の血液が患者から取り出され、このマトリクスを通され得る。このＧＬＰ−２誘導体は、抗体および低濃度のＧＬＰ−２を含む血液に結合し、次いで、患者の循環系に戻され得る。除去されるＧＬＰ−２誘導体の量は、圧力および流速を調節することによって制御され得る。患者の血液の血清成分からのＧＬＰ−２誘導体の優先的な除去は、例えば、抗治療抗体を含むマトリクスを介して血清成分を通過する前に、半透膜の使用によってかまたは当該分野において公知の方法による細胞成分からの血清成分の最初の分離によってもたらされ得る。あるいは、ＧＬＰ−２結合体化血液細胞（例えば、赤血球）の優先的な除去は、患者の血液の血清成分を除去するために、患者の血液中の赤血球を回収することおよび濃縮することならびにこれらの細胞と固定化された抗ＧＬＰ−２抗体と接触させることによってもたらされ得る。
【００７４】
この抗ＧＬＰ−２抗体は、処置のためにＧＬＰ−２誘導体またはその結合体を受ける患者にインビボで非経口的に投与され得る。この抗体は、ＧＬＰ−２誘導体および結合体と結合する。一旦結合すると、このＧＬＰ−２活性は完全にブロッキングされない場合、妨害され、それによって患者の血流におけるＧＬＰ−２誘導体の生物学的に有効な濃度を減少させ、そして有害な副作用を最小限に抑える。さらに、結合された抗体ＧＬＰ−２複合体は、患者の血流からのＧＬＰ−２誘導体および結合体のクリアランスを容易にする。
【００７５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために提供され、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されない。他に示されない限り、Ｌ−配置の光学活性保護化アミノ酸を使用した。
【００７６】
（合成）
ＧＬＰ−２ペプチドおよびその誘導体の合成を、ＧＬＰ−２誘導体の生成の間に手動で介入し、ＳｙｍｐｈｏｎｙＴＭペプチド合成器における自動固相手順を使用して実施した。この合成を、Ｆｍｏｃ保護ＲａｍａｇｅＴＭアミドリンカー樹脂上でＦｍｏｃ保護化アミノ酸を使用して実施した。カップリングを、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液におけるアクチベーターとして、そしてジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を塩基として使用することによって達成した。このＦｍｏｃ保護基を、２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用して除去した。必要な場合、Ｂｏｃ−保護化アミノ酸を、ペプチドを樹脂から切断した後に遊離Ｎα−末端を生成するためにＮ−末端で使用した。合成の間に使用した全てのアミノ酸は、他に記載されない限り、Ｌ−立体化学を有した。ガラス反応容器は、ＳｉｇｍａｃｏｔｅｄＴＭであり、合成の際に使用した。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
【００７８】
【化６】
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、連続的に樹脂に添加した：
【００７９】
【化７】
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンの溶液を用いて、２０分間で成し遂げた。
【００８０】
工程２：ペプチドを、８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ チオアニゾールおよび５％フェノールを用いて樹脂から分割し、続いて、ドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏによって沈殿した。この粗製ペプチドを、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中のアセトニトリルの混合物（０．１％ ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して精製プロセスにおいて使用される対応する粗製物質を生成した。
【００８１】
（実施例２）
【００８２】
【化８】
工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、連続的に樹脂に添加した：
【００８３】
【化９】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【００８４】
（実施例３）
【００８５】
【化１０】
工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであることを除いて、上記の実施例１の工程１と同様の様式で実行した。
【００８６】
工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護化を、手動で実行し、そして樹脂を、５ｍＬのＣ６Ｈ６：ＣＨＣｌ３（１：１）：２．５％ ＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％ ＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）中に溶解した３当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４の溶液を用いて２時間処理することによって達成した。次いで、樹脂を、ＣＨＣｌ３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中２０％ ＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）を用いて洗浄する。
【００８７】
工程３：次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸の添加のために再自動化した。全カップリングの間、樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。
【００８８】
工程４：ペプチドを、８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ チオアニゾールおよび５％ フェノールを用いて樹脂から分離し、続いてドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏによって沈殿した。この粗製ペプチドを、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中のアセトニトリルの混合物（０．１％ ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して精製プロセスにおいて使用される、対応する粗製物質を生成した。
【００８９】
（実施例４）
【００９０】
【化１１】
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載される手順に従って、連続的に樹脂に添加した：
【００９１】
【化１２】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【００９２】
（実施例５）
【００９３】
【化１３】
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載される手順に従って、連続的に樹脂に添加した：
【００９４】
【化１４】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【００９５】
（実施例６）
【００９６】
【化１５】
工程１：この工程を、２位のアラニン残基がグリシンと置換されていることを除いて、実施例２の工程１と同様の様式で実行した。
【００９７】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【００９８】
（実施例７）
【００９９】
【化１６】
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載される手順に従って、連続的に樹脂に添加した：
【０１００】
【化１７】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【０１０１】
（実施例８）
【０１０２】
【化１８】
工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、上記の実施例５の工程１と同様の様式で実行した。
【０１０３】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【０１０４】
（実施例９）
【０１０５】
【化１９】
工程１：この工程を、実施例７の工程１と同様の様式で実行した。
【０１０６】
工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護化を、手動で実行し、そして樹脂を、５ｍＬのＣ６Ｈ６：ＣＨＣｌ３（１：１）：２．５％ ＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％ ＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）に溶解した３当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４の溶液を用いて２時間処理することによって達成した。次いで、この樹脂を、ＣＨＣｌ３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中２０％ ＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）を用いて洗浄する。
【０１０７】
工程３：次いで、この合成を、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ−アミノエトキシエトキシ酢酸）の添加について再自動化した。各カップリングの間に、樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。適切な脱保護化後、ＭＰＡ（３−マレイミドプロピオン酸）を、スペーサーにアンカーし、そして再度樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。
【０１０８】
工程４：このペプチドを、８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ チオアニゾールおよび５％フェノールを用いて樹脂から分離し、続いて、ドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏによって沈殿した。この粗製ペプチドを、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中のアセトニトリルの混合物（０．１％ ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して、精製プロセスにおいて使用される対応する粗製物質を生成した。
【０１０９】
（実施例１０）
【０１１０】
【化２０】
工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、上記の実施例５の工程１と同様の様式で実行した。
【０１１１】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【０１１２】
（実施例１１）
【０１１３】
【化２１】
工程１：この工程を、合成の終わりに、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨが、ＭＰＡ−ＯＨの前に樹脂に添加されることを除いて、実施例６の工程１と同様の様式で実行した。
【０１１４】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【０１１５】
（実施例１２）
【０１１６】
【化２２】
工程１：この工程を、合成の終わりに、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨが、ＭＰＡ−ＯＨの前に樹脂に添加されることを除いて、実施例１の工程１と同様の様式で実行した。
【０１１７】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【０１１８】
（実施例１３）
【０１１９】
【化２３】
工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、上記の実施例１の工程１と同様の様式で実行した。
【０１２０】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【０１２１】
（実施例１４）
【０１２２】
【化２４】
工程１：この工程を、実施例４の工程１と同じ様式で行った。
【０１２３】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同じ様式で行った。
【０１２４】
（実施例１５）
【０１２５】
【化２５】
工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂に連続的に添加した：
【０１２６】
【化２６】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で行った。
【０１２７】
（実施例１６）
【０１２８】
【化２７】
工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂に連続的に添加した：
【０１２９】
【化２８】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で行った。
【０１３０】
（実施例１７）
【０１３１】
【化２９】
工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂に連続的に添加した：
【０１３２】
【化３０】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で行った。
【０１３３】
（実施例１８）
【０１３４】
【化３１】
工程１：この工程を、実施例１５の工程１と同じ様式で行った。
【０１３５】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同じ様式で行った。
【０１３６】
（実施例１９）
【０１３７】
【化３２】
工程１：この工程を、実施例１６の工程１と同じ様式で行った。
【０１３８】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同じ様式で行った。
【０１３９】
（実施例２０）
【０１４０】
【化３３】
工程１：この工程を、実施例１７の工程１と同じ様式で行った。
【０１４１】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同じ様式で行った。
【０１４２】
（精製手順）
各化合物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｄｙｎａｍａｘ）調製二元ＨＰＬＣシステムを用いて、調製逆相ＨＰＬＣによって精製した。この精製を、水／ＴＦＡ混合物（Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ））およびアセトニトリル／ＴＦＡ（ＣＨ３ＣＮ中０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ｂ））で平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０μフェニル−ヘキシル、５０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（粒子１０μ）を用いて行った。溶出を、２８〜３８％Ｂ勾配で１８０分間にわたって実行することによって５０ｍＬ／分で達成した。ペプチドを含む画分を、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍでＵＶ吸光度（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）によって検出した。
【０１４３】
この画分を、２５ｍＬのアリコートで収集した。所望の産物を含む画分を、ＬＣ／ＭＳ上に直接注入した後に質量検出によって同定した。選択した画分を、分析ＨＰＬＣ（２０分間にわたり、２０〜６０％ Ｂ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ フェニル−ヘキシル、１０ｍｍ×２５０ｍｍカラム、０．５ｍＬ／分）によって連続的に分析して、プールについて９０％以上の純度で画分を同定した。このプールを、液体窒素を用いて凍結乾燥し、そして少なくとも２日間連続的に凍結乾燥して白色の粉末を得た。
【０１４４】
（インビボでの結果）
実施例１〜８の化合物の腸栄養活性を、正常マウスモデルにおいて評価した。５週齢の雄性ＣＤ−１マウス（２０〜２５ｇ）を、０．９％ＮａＣｌ水溶液中に溶解した、５μｇ／用量の各化合物で、１日に２回、１０日連続で処理した。これらの化合物を、腰領域の背側野に皮下注射を介して投与した。コントロール動物は、０．２５ｍｌ／用量の０．９％ ＮａＣｌを受けた。
【０１４５】
１１日目、マウスを４時間絶食させ、そしてＣＯ２で麻酔した。小腸を除去し、清浄化しそして秤量した。小腸重量の有意な増加を、実施例１、３、５，７および８の化合物で処置した動物において、観察した。結果を、図１に示す。実施例１および３のネイティブなＧＬＰ−２ペプチドと比較した場合、見られ得るように、より明白な腸栄養効果を、２位のグリシン残基で安定化した実施例５，７および８の化合物を用いて得た。
【０１４６】
（選択したＧｌｙ２−ＧＬＰ−２アナログを用いる用量応答）
６週齢の雌性ＣＤ−１マウス（２０〜２５ｇ）を、５、２５または５０μｇ／用量の、実施例５，７および８の化合物を、１日に２回、１０日連続で処理した。これらの化合物を、０．０８３Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中に溶解し、そして腰領域の背側野に皮下注射を介して投与した。コントロール動物は、０．２５ｍｌ／用量のリン酸ナトリウム緩衝液を受けた。
【０１４７】
１１日目、給餌したマウスを、ＨａｌｏｔｈａｎｅＴＭで麻酔し、そして小腸、大腸および胃を、側腹切開後の各マウスから回収した。次いで、これらの組織を清浄化しそして秤量した。
【０１４８】
コントロールマウスと比較した、処置した群の全てにおいて、小腸の重量における統計学的に有意な増加（５３％〜８８％）を実証した（図２を参照のこと）。しかし、実施例５および７の化合物では、用量応答は観察されなかったが、実施例８の化合物について、かなりの用量応答に注目した。
【０１４９】
処置した全ての群について、大腸の重量を、２７〜４８％増加させた。また、実施例５および７の化合物について、用量応答は観察されなかったが、実施例８の化合物について、かなりの用量応答に注目した（図２を参照のこと）。
【０１５０】
これらの結果は、実施例７および８のＧＬＰ−２誘導体が、対応する、実施例５の遊離ペプチドに類似した腸栄養活性を示すことを、実証する。
【０１５１】
（ラットにおける薬物動態学プロファイル）
実施例５および８の化合物の薬物動態学のプロファイルを、正常ラットにおいて、単回の静脈内注射または皮下注射に続いて研究した。血漿濃度を、市販の抗体（抗ヒトＧＬＰ−２）を用いるラジオイムノアッセイによって決定した。
【０１５２】
（動物実験）
試験物を、０．０８３Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中に溶解し、用量レベル５００ｎｍｏｌ／ｋｇで単回の静脈内注射または皮下注射によって８〜１１週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。連続血液サンプル（１５０〜２００μｌ）を、ＥＤＴＡおよびＤＰＰ−ＩＶインヒビターを含有するチューブに、以下の時間点で収集した：投薬前、試験試薬投与後５分および３０分、ならびに試験試薬投与後１、２、４、８、２４、４８、７２および９６時間。全血を遠心分離し、血漿サンプルを回収し、そして−８０℃で分析まで保存した。
【０１５３】
（血漿分析）
実施例５および８の化合物の血漿濃度を、ウサギポリクローナル抗体（抗ヒトＧＬＰ−２（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＲＧＧ７１６７））およびトレーサーとしてのヨード化ヒトＧＬＰ−２を使用するラジオイムノアッセイによって決定した。
【０１５４】
（薬物動態学分析）
記述の薬物動態学パラメーターを、血漿濃度−時間データの分析に基づく、標準のモデル非依存性法（ＧｉｂａｌｄｉおよびＰｅｒｒｉｅｒ，１９８２）によって決定した。薬物動態学分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ９７について書かれたマクロを使用して行った。以下のパラメーターを計算した：
−Ｃｍａｘは、最大血漿濃度である；
−Ｔｍａｘは、Ｃｍａｘが観察される場合の時間である；
−Ｔ１／２は、終末半減期である；
−ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）は、０時〜無限時までの血漿濃度−時間曲線より下の面積である；
−Ｆは、完全なバイオアベイラビリティである；
−ＣＬは、全身性クリアランスである；
−ＭＲＴは、滞留時間の平均である；および
−Ｖｓｓは、分布の安定状態容積である。
【０１５５】
血漿濃度プロファイルを、図３に示し、そして、対応する薬物動態学パラメーターを、以下の表２に示す。これらの結果は、本発明に従って誘導体化されたＧＬＰ−２が、対応する遊離Ｇｌｙ２−ＧＬＰ−２ペプチドの排出および分布を効率的に減少させ、これにより全身循環におけるより高い血漿濃度およびより長い半減期を生成することを示す。
【０１５６】
（表２）
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、単回５００ｎｍｏｌ／ｋｇ用量に続く実施例５および８の化合物の平均薬物動態学パラメーターの比較
【０１５７】
【表２】
ａ媒体として示す
ｂ基準平均として示す。
【０１５８】
（イムノブロッティング）
ラット薬物動態学研究より得られた血漿サンプルを、イムノブロッティングにより分析した。血漿タンパク質を、非還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）に従って使用して分離した。血漿サンプルを、最初に滅菌水で１：１０に希釈し、そして２０μｌを、１０μｌの３×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（３０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％ ＳＤＳ（ｐＨ６．８））および２μｌのブロモフェノールブルー溶液（０．１％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）と、混合した。混合物を、沸騰する湯浴中に３分間置き、そしてゲル上にロードした。タンパク質を、１０ウェルコームを用いるミニゲル系（１．５×４．８ｍｍ）を使用して、３％スタッキングゲル中で最初に濃縮し、次いで、８％分離ゲルを通って移動した。スタッキングゲル中でタンパク質を濃縮するための１５ｍＡ／ゲルの定電流下、および分離ゲル中での約１．５ｈにわたる２０ｍＡ／ゲルの定電流下での電気泳動を、行った。
【０１５９】
引き続き、セミドライ転写装置を１００ｍＡ／ゲルで１時間使用して、タンパク質を、ニトロセルロース膜上に転写した。転写効率を、１％の赤色ＰｏｎｃｅａｕＴＭ溶液で膜を可逆的に染色することによりチェックした。
【０１６０】
（免疫化学的検出）
膜を、５％低脂肪乳を含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中に４℃で一晩浸した。ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭで５分間を３回の洗浄後、ブロットを、１％のラット血漿を含有するＴＢＳ−０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭで１：２，５００に希釈したウサギポリクローナル抗体（抗ＧＬＰ−２（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂ．，ＲＧＧ７１６７））を用いて、室温で９０分間インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭで１０分間の洗浄を３回行い、次いで、ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ中１：１００，０００希釈したペルオキシダーゼ標識化ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ，７１１−０３６−１５２）を用いて、室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、ペルオキシダーゼの化学発光物質（ｃｈｅｍｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）（ＥＣＬＴＭキット Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用する曝露を行った。フィルムを、５〜１０分間感光させた。
【０１６１】
膜を、ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ中１：４００，０００希釈したペルオキシダーゼ標識化ウサギ抗ラットアルブミン（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＹＮ−ＲＲａＡＬＢＰ）と、代替的にインキュベートした。ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭでの３回の洗浄後、上記のように、曝露を行った。
【０１６２】
（結果）
予備的なスクリーニングは、市販の抗体（抗ＧＬＰ−２）が、タンパク質に結合体化された実施例７の化合物を検出するに十分感受性ではなかったことを、ウエスタンブロッティングによって実証した。従って、実施例８の化合物を注入されたラットの血漿サンプルのみがこの方法によって分析された。
【０１６３】
図４に示される結果は、実施例８の化合物が、ｉｖ投与後のラットアルブミンに効率的に結合体化することを示す。弱いシグナルをまた、ｓｃ投与後のアルブミンにおいて観察した（示さず）。抗ラットアルブミン抗体との比較は、抗ＧＬＰ−２抗体によって検出されるバンドのほとんど（１つを除く）が、種々のアルブミン種（モノマー、ダイマーおよびポリマー）に起因することを示す。
【０１６４】
本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されるが、さらなる改変が可能であることが理解され、そして本願は、一般に、本発明の原理に従う本発明の任意のバリエーション、使用または適応をカバーすることが意図され、そして、本発明が属する分野内で公知または慣習的に実行されているもの、および本明細書中で前述した本質的特徴に適用され得るもの、および添付の特許請求の範囲に従うようもののような、本明細書の記載から逸脱する本発明の任意のバリエーション、使用または適応を含むことが意図される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）誘導体に関する。特に、本発明は、食道から肛門までの、胃腸管の任意の分節由来の、胃腸障害および胃腸疾患（例えば、炎症性の腸疾患および他の胃腸機能）の処置または予防のために、延長されたインビボ半減期を有するＧＬＰ−２ペプチド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＧＬＰ−２は、多面的なプログルカゴン遺伝子から組織特異的様式で発現される３３アミノ酸ペプチドであり、したがってペプチドホルモンのグルカゴンスーパーファミリーの一部である。プログルカゴンの代替可能な翻訳後のプロセシングは、膵臓、腸および脳で生じる。プログルカゴンにおける酵素的な切断は、栄養代謝に関与する多数の多機能性ペプチドホルモンを産生する。プログルカゴン由来の主要な生物活性ホルモンは、膵臓のα細胞、および腸のＬ細胞におけるＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２ならびに脳にある。それは、初めにＤｒｕｃｋｅｒらにより強力な腸向性性質を有することが発見された（非特許文献１を参照のこと）。天然の腸由来ペプチドのような、ＧＬＰ−２は、小腸および大腸の粘膜上皮に対して有意な回復活性を有することが実証されている。それはまた、腸が栄養分を消化および吸収する能力を増加することが実証されており、これは腸不全の処置における強力な治療的役割を示唆する。実際に、いくつかの研究により、ＧＬＰ−２の投与が、結腸炎、腸炎、総非経口および広範囲の切除のげっ歯類モデルにおける腸の損傷を減少または予防することが現在確認されている。極めて最近では、ＧＬＰ−２の第２相臨床試験はまた、短期の腸の症状を有する患者が、明らかに所望でない副作用が無く、ＧＬＰ−２投与の３０日後に腸内の栄養を吸収する増強された能力を示すことが実証されていることが報告されている。
【０００３】
ＧＬＰ−２の排除に対する主要な代謝性経路は、酵素的分解を介する。ＧＬＰ−２は、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によりその２つのＮ末端アミノ酸の除去を介して急速に分解されることが示されており、これはＧＬＰ−２がペプチドの完全な不活性化を導くことに起因して、主要な制限を表す。結果として、ＧＬＰ−２の半減期は、従って、きわめて短く、そして現在のＧＬＰ−２処置は、注入または頻繁な注射を必要とする。腎クリアランスはまた、ＧＬＰ−２のクリアランスに関与されることが示されている。ＧＬＰ−２の主要な作用は、細胞増殖の刺激を含み、そしてＧＬＰ−２レセプターの活性化を細胞増殖と、直接的または間接的に共役する機構は、試験されていない。
【０００４】
ネイティブＧＬＰ−２のペプチドアナログが、ＧＬＰ−２レセプターアゴニストとして小腸において増強した栄養活性を有することが示されている（例えば、米国特許第５，９９０，０７７号を参照のこと）。
【０００５】
非常に有用であるが、上記で記載するように、ＧＬＰ−２ペプチドおよびアナログの決定的な不利益は、それらの非常に短いインビボ半減期であり、これは代表的にわずか２分である。
【０００６】
炎症腸疾患（ＩＢＤ）は、小腸および大腸における炎症および潰瘍化を引き起こす慢性障害の群である。それは、命までもを脅かし得、そして現在公知の治療は存在しない。ＩＢＤは、一般に、緩解および発赤の慢性周期を生じる、結腸に制限される潰瘍性大腸炎（ＵＣ）および胃腸管全体を含み得るクローン病（ＣＤ）をいう。多数の薬学的産物は、ＩＢＤの処置（例えば、炎症を抑制すること、再発を予防すること、症状（例えば、疼痛または下痢）を制御すること、または、広範な疾患または外科術に起因してあまり吸収されない必須栄養物を交換または補充すること）は公知である。現在の治療選択肢は、広範な種々の薬学的産物様アミノ酸サリチル酸薬剤、コルチコステロイド薬剤、免疫モジュレーター薬剤および抗ＴＮＦα薬剤を含み、そして失った体液および栄養を交換することに加えて、炎症を減少および症状を軽減するように設計されている。しかしながら、これらの産物のほとんどは、一般的に体に対するそれらの所望でない副作用に起因して、ＩＢＤにおける制限された使用を有する。
【０００７】
アメリカ合衆国およびヨーロッパにおいて、約１００万人の患者が、毎年ＩＢＤについて処置され、その大半は、一般に、クローン病または潰瘍性大腸炎のいずれかに罹患している。実際に、腸の大部分の除去に関する根治手術を受けることは、ＩＢＤに罹患する患者にとって珍しくない。ＩＢＤの直接の年間保険医療費は、約７億ＵＳドルであり、そして、直接的および間接的の両方の全経済的影響は、世界的に、１年間で約２０億ドルと約３０億ドルの間の費用を見積もる。現存の処置は、しばしば軽減を提供するが、いくつかの欠点を有する。
【０００８】
米国特許第５，７８９，３７９号は、長期持続性化合物（ＡＬＸ−６００ＴＭ）として開発されたものの中のＧＬＰ−２を教示し、そして、現在は、臨床試験中である。しかし、たとえＧＬＰ−２のＤＰＰ−ＩＶ分解がいくらか予防されそうであっても、その半減期は、腎クリアランスによって制限されたままであり、そして、上記のように、２分を超えない。
【０００９】
キメラ抗体（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）は、クローン病の短期間の処置のために、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に特異的に結合するように開発された。この抗体は、コルチコステロイド、他の免疫抑制剤および／または抗生物質を用いた従来の治療に対して不十分な応答を有する患者における重篤なクローン病に対する中程度の症状の減少を示す。にもかかわらず、これら処置を用いると、深刻な副作用が観察される。例えば、それは、過敏性反応、敗血症を含む重篤な感染、ならびに胎児感染に関連している。その投与は、さらに、ＴＮＦ−ブロッキングを介して、患者に感染させやすくし得る。
【００１０】
近年のＩＢＤ有病率の増加に伴い、ゆえに、ＧＬＰ−２と実質的に同一の活性、低毒性および治療的利点を維持し得るが、より長いインビボ半減期を有し、従って、種々の疾患（例えば、炎症性腸疾患、２つの主要な炎症性腸疾患を示すクローン病および潰瘍性大腸炎）の処置において、それらの連続投与をする必要性を回避する、ＧＬＰ−２ペプチド誘導体またはアナログを開発することが非常に所望される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９６，９３（１１５），７９１１−７９１６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明に従って、ここで、対応する非改変のＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子と比較した場合、延長されたインビボ半減期を有する、ＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子誘導体を提供する。さらに具体的には、このＧＬＰ−２誘導体は、そこに結合され、そして、インビボまたはエキソビボのいずれかで、安定な共有結合を形成するために血液成分上の利用可能な官能基と反応し得る反応性要素を含む。ＧＬＰ−２誘導体と血液成分との間に形成される共有結合は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのような酵素によりＧＬＰ−２の所望でない切断を防止し、それによりインビボ半減期および活性を延長する。この反応性要素は、ＧＬＰ−２ペプチドのＮ末端、ＧＬＰ−２ペプチドのＣ末端、またはペプチド鎖に沿
う任意の他の利用可能な部位に結合され得る。
【００１３】
好ましい血液成分は、免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭを含む）、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、チロキシン結合タンパク質、α−２−マクログロブリン、ハプトグロビンなどのようなタンパク質を含み、血清アルブミンおよびＩｇＧがより好ましく、そして、血清アルブミンが最も好ましい。
【００１４】
好ましい反応性要素は、インビボまたはインビトロ（またはエキソビボ）のいずれかで、血液成分上に存在するアミノ基、ヒドロキシ基、またチオール基と反応することによって、血液成分と共有結合を形成し得る。最も好ましい実施形態において、タンパク質上の官能基はチオール基であり、そして、反応性要素は、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプター（例えば、アクロレイン誘導体、ハロアセテート、ハロアセトアミド、α，β−不飽和ケトン、α，β−不飽和エステル、α，β−不飽和アミド、α，β−不飽和チオエステルなど）、マレイミドまたはマレイミド含有基（例えば、γ−マレイミドブチリルアミド（ＧＭＢＡ）、またはマレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ））であり、最も好ましくはＭＰＡである。
【００１５】
本発明の別の局面において、薬学的に受容可能なキャリアと組合せた本発明のＧＬＰ−２胃腸増殖促進因子誘導体を含む薬学的組成物が提供される。このような組成物は、腸障害または腸疾患（例えば、炎症性腸疾患および他の胃腸機能）の処置または予防に有用である。この組成物はまた、胃腸組織増殖促進因子ペプチド誘導体の内因的な生成を、細胞に誘導させるための遺伝子治療に使用され得、これは、次いで、所望の生物学的効果を生成するために、被験体中に移植され得る。最後に、この組成物はまた、大腸組織増殖の増大のための薬学的組成物または獣医学的組成物を製造するために、使用され得る。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、腸障害または腸疾患（例えば、炎症性腸疾患および胃腸機能）の予防または処置のための方法を提供する。この方法は、被験体（好ましくは哺乳動物、動物またはヒト）に、有効量の本発明のＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子誘導体またはその結合体を、単独でまたは薬学的に受容可能なキャリアと組合せて投与する工程を包含する。
【００１７】
本発明のさらなる局面において、血液成分に共有結合された本発明のＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子誘導体を含む結合体を、提供する。
【００１８】
本発明のさらなる局面において、被験体におけるＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子のインビボ半減期を延長する方法を提供し、本方法は、本ＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子誘導体を血液成分に共有結合させる方法を包含する。この共有結合は、インビボまたはインビトロで起こり得る。
【００１９】
好ましい胃腸組織増殖促進因子化合物は、ＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２アナログ、ＧＬＰ−２フラグメントが胃腸組織増殖促進因子活性を有するのであれば、このようなアナログまたはフラグメントのようなペプチドである。これらのペプチド、アナログおよびフラグメントの詳細な配列は、以下に示される。
【００２０】
本発明の化合物誘導体のさらなる使用は、本発明の化合物誘導体と組合せて使用される場合（特に、この化合物がＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２アナログまたはＧＬＰ−２フラグメントである場合）、ホルモンの腸刺激（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）活性を決定し得る。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）腸刺激量のＧＬＰ−２誘導体とホルモンを、試験被験体に同時投与する工程；（２）試験被験体における小腸組織および大腸組織の引き続く増殖を評価する工程；（３）試験被験体中の小腸組織および／または大腸組織の増殖が、非改変のＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２アナログまたはＧＬＰ−２誘導体で処置したコントロール被験体と比較して増大されているかどうかを決定する工程。
【００２１】
連結する基が存在する場合、好ましくは、以下のように定義されるが、これらに限定されない：直鎖Ｃ１〜１０アルキルもしくは分枝Ｃ１〜１０アルキル部分的にペルフルオロ化された、直鎖Ｃ１〜１０アルキルもしくは分枝Ｃ１〜１０アルキル；１つ以上の炭素原子がＯ、ＮもしくはＳで置換されて、エーテルもしくはチオエーテルを形成する、Ｃ１〜１０アルキルもしくはフルオロアルキル；置換基が同一であるかもしくは異なり、そして、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ（ここで、ＲはＨ、Ｃ１〜１０アルキルもしくはＣ１〜１０アシルである）である、ｏ−置換、ｍ−置換またはｐ−置換されたフェニル；または、−置換された複素環（例えば、フラン、チオフェン、ピラン、オキサゾールもしくはチアゾール）
従って、本発明においては、以下が提供される：
（項目１） 胃腸組織増殖促進因子誘導体であって、以下：
胃腸組織増殖促進活性を有するＧＬＰ−２ペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント；および
該ペプチドに結合される反応性要素、
を含み、該誘導体は、インビボで、血液成分上の官能基と共有結合し得る、胃腸組織増殖促進因子。
（項目２） 項目１に記載の誘導体であって、ここで、前記ＧＬＰ−２が、以下の配列：
【化１】
であり、ここで、
Ｘ１は、ＨｉｓまたはＴｙｒであり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｎｏｒ−Ｖａｌ、α−アミノ酪酸、またはＤＰＰ−ＩＶ酵素に耐性の該アナログ上に付与されるＡｌａ−交換アミノ酸であり；
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏもしくはＨＰｒｏであるか；またはＸ２−Ｘ３がＸ２y
（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２）Ｘ３；Ｘ２y（ＣＨ２ＮＨ２）Ｘ３もしくはＸ２y（ＣＨＣＨ）Ｘ３であり、ここで、Ｘ２およびＸ３は、上記のとおりであり；
Ｘ４は、ＧｌｙまたはＡｌａであり；
Ｘ５は、ＳｅｒまたはＡｌａであり；
Ｐ１は、Ｇｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ、Ｇｌｙ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＶａｌまたはＴｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒであり；
Ｘ１０は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ置換アミノ酸であり；
Ｘ１４は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘ１６は、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ１７は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘ１９は、ＡｌａまたはＴｈｒであり；
Ｘ２０は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｌａであり；
Ｘ２１は、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
Ｘ２７は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ２８は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり；
Ｐ２は、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｉｌｅ−ＡｌａまたはＶａｌ−Ｇｌｎであり；
Ｐ３は、共有結合であるか、あるいはＩｌｅ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−ＡｓｐまたはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎであり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロッキング基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロッキング基であり；
Ｙ１は、１つまたは２つのＡｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓであり；
Ｙ２は、１つまたは２つのＡｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓであり；そして
ｍおよびｎは、独立して、０または１である、誘導体。
（項目３） 項目２に記載の誘導体であって、Ｘ１はＨｉｓであり；Ｘ２は、ＡｌａまたはＧｌｙで
あり、Ｘ３はＡｓｐであり；Ｘ４はＧｌｙであり；Ｘ５はＳｅｒであり；Ｐ１はＧｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅであり；Ｘ１０はＭｅｔであり；Ｘ１６は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；Ｘ１９はＡｌａであり；Ｘ２０はＡｒｇであり；Ｘ２７はＩｌｅであり；Ｘ２８はＧｌｎであり；Ｐ２はＩｌｅ−Ａｓｎであり；Ｐ３はＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐであり、そしてＲ２はＣＯＮＨ２である、誘導体。
（項目４） 項目１に記載の誘導体であって、前記反応性要素が、マレイミドまたはマレイミド含有
基である、誘導体。
（項目５） 項目３に記載の誘導体であって、前記ＧＬＰ−２が、以下：
【化２】
からなる群より選択される、誘導体。
（項目６） 項目１に記載の誘導体であって、以下：
【化３】
からなる群より選択される、誘導体。
（項目７） 項目１に記載の誘導体であって、前記血液成分が、血液タンパク質を含む、誘導体。
（項目８） 項目１に記載の誘導体を、薬学的に受容可能なキャリアとともに含む、薬学的組成物。
（項目９） 項目８に記載の組成物であって、胃腸障害または胃腸疾患の予防の処置のための、組成
物。
（項目１０） 被験体における胃腸障害または胃腸疾患の予防の処置のための方法であって、該方法は、
該被験体に、有効量の項目１に記載の誘導体を単独で、または有効量の項目１に記載
の誘導体を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目１１） 被験体における胃腸組織増殖の促進のための方法であって、該方法は、該被験体に、有効
量の項目１に記載の誘導体を単独で、または有効量の項目１に記載の誘導体を薬学的
に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目１２） 血液成分に共有結合された、項目１に記載の誘導体を含む、結合体。
（項目１３） 項目１２に記載の結合体であって、前記反応性要素が、マレイミドまたはマレイミド含
有基であり、前記血液成分が、血液タンパク質である、誘導体。
（項目１４） 項目１３に記載の結合体であって、前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、結
合体。
（項目１５） 項目１２に記載の結合体であって、前記誘導体が、項目６に規定される誘導体である
、結合体。
（項目１６） 胃腸組織増殖促進活性を有するＧＬＰ−２ペプチドのインビボ半減期を延長する方法であ
って、該方法は、該ペプチドを血液成分に共有結合させる工程を包含する、方法。
（項目１７） 項目１６に記載の方法であって、前記ペプチドが、ＧＬＰ−２、または胃腸組織増殖促
進活性を有する、ＧＬＰ−２のアナログもしくはフラグメントを含む、方法。
（項目１８） 項目１６に記載の方法であって、前記ＧＬＰ−２ペプチドが、項目５に規定される誘
導体である、方法。
（項目１９） 被験体における胃腸障害または胃腸疾患の予防の処置のための方法であって、該方法は、
該被験体に、有効量の項目１２に記載の結合体を単独で、または有効量の項目１２に
記載の結合体を薬学的キャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、生理食塩水、または５μｇの実施例１〜８の化合物で、毎日２回、１０日間処置したマウスの小腸湿重量における変化を示す（ｎ＝１０／集団）。結果は、平均Δ重量対コントロール±ＳＥＭとして表す。
【図２】図２は、生理食塩水、または５、２５、５０μｇの実施例５、７および８の化合物で、１日２回、１０日間処置したマウスの小腸および大腸の湿重量における変化を示す。（ｎ＝１０／集団）。結果は、平均重量±ＳＥＭとして表す。
【図３】図３は、５００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回静脈内用量または単回皮下用量後の、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、実施例５および実施例８の化合物についての平均血漿濃度を示す（ｎ＝４／集団）。
【図４】図４は、ポリクローナル抗体抗ＧＬＰ−２抗体を使用して、ラット血漿タンパク質に結合体化した実施例８の化合物の検出、および抗ラットアルブミンを用いて得たパターンとの比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
インビボでの生体結合体化（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、体内における、ＧＬＰ−２誘導体に標的血液成分の生物物理学的パラメーターを与えることを介して、生物学的活性の延長された持続期間を提供しながら、元の改変されていないＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子ペプチドの生物学的活性の実質的な保持、または、ある場合には増加を可能にする様式で、分子（例えば、本発明の胃腸組織増殖促進因子化合物誘導体）を標的血液成分（好ましくはタンパク質）に共有結合させるプロセスである。
【００２４】
本発明の目的のために、用語「アナログ」または「フラグメント」は、ネイティブな配列（例えば、ＧＬＰ−２配列）に由来する異なるアミノ酸配列を有するが、類似する活性または匹敵する活性を有するペプチドを含むアミノ酸配列を含むことを意味する。このようなアナログは、好ましくは少なくとも６０％、そしてより好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の、同数のアミノ酸残基を有するＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２のフラグメントのいずれかと同じアミノ酸配列を有する。
【００２５】
より好ましい実施形態において、本発明の胃腸組織増殖促進因子ペプチド誘導体は、直接的または結合基を介してのいずれかで反応性要素に結合することによって改変されているＧＬＰ−２胃腸組織増殖促進因子ペプチドを含み、反応性要素は、血液成分（好ましくは血液タンパク質）と共有結合を形成し得る。反応性要素は、水性の環境において安定でなければならず、そしてそれらの好ましい実施形態は、カルボキシ基、ホスホリル基、イミデート基、またはエステルまたは混合した無水物のいずれかとしてのアシル基を含む。共有結合は、一般的に反応性要素と血液成分のアミノ基、ヒドロキシ基、チオール基との間で形成される。アミノ基は、好ましくはカルボキシ基、ホスホリル基またはアシル基のような反応性要素と共有結合を形成し；ヒドロキシ基は、好ましくは活性化エステルのような反応性要素と共有結合を形成し；そしてチオール基は、好ましくは、エステルまたは混合した無水物のような反応性要素と共有結合を形成する。好ましい血液成分としては、血清アルブミン、免疫グロブリンまたはそれらの組み合わせのような移動性の血液成分が挙げられ、そして好ましい反応性要素としては、マレイミド基のような無水物が挙げられる。最も好ましい実施形態において、血液成分は、血清アルブミンである。
【００２６】
血液成分は、好ましくは移動性であり、これは、この血液成分が任意の長期間（一般的に５分、より通常には１分を超えない）ある位置に固定していないことを意味する。これらの血液成分は、膜結合性ではなく、そして少なくとも０．１μｇ／ｍｌの最小濃度で長期間血液中に存在する。好ましい移動性血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、フェリチンならびにＩｇＭおよびＩｇＧのような免疫グロブリンが挙げられる。移動性血液成分の半減期は、少なくとも約１２時間である。
【００２７】
本発明の胃腸組織増殖促進因子誘導体は、ＧＬＰ−２ペプチドであるので、保護基は、ＧＬＰ−２誘導体の合成プロセスの間必要であり得る。これらの保護基は、ペプチド合成の分野では従来的であり、そして他の官能基との反応からペプチド誘導体を保護し得る化学的部分として一般的に記載され得る。様々な保護基は、市販され、そしてその例は、本明細書中に参考として援用される米国特許第５，４９３，００７号に見出され得る。適切な保護基の代表的な例としては、アセチル、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）などが挙げられる。表１は、アミノ酸の３文字および１文字の両方の略語を提供する。
【００２８】
【表１】
本発明のＧＬＰ−２誘導体は、血液成分との結合体化後、ペプチダーゼ安定化ペプチドを形成する。１つ以上のさらなるアミノ酸が、反応性実体のペプチドへの結合を促進するために反応性実体の添加前にペプチドに付加または置換され得ることもまた意図される。このような付加または置換は、Ｎ末端、Ｃ末端またはこれらの間においてなされ得る。このように得られたペプチド誘導体は、被験体（動物またはヒト）に投与され得、その結果、血液成分との結合体化がインビボで生じるか、またはこの誘導体は、被験体（動物またはヒト）の血液成分にインビトロで最初に結合体化し得、そして以下に規定されるような得られた結合体もしくはペプチターゼ安定化ペプチドが、被験体に投与される。
【００２９】
ＧＬＰ−２配列に存在するか、ＧＬＰ−２配列で置換されたかまたはＧＬＰ−２配列に付加された任意のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸あるいはそれらの組み合わせであり得る。Ｌ−アミノ酸が一般的に好ましい。ネイティブなＧＬＰ−２配列の２位でのグリシン置換は、ＤＰＰ−ＩＶ酵素に対するより優れた耐性を類似体に与えるので、好ましい実施形態を代表する。グリシンはまた、同一の目的のためにＤ−アラニンまたはプロリンに差し替えられ得る。さらに、ネイティブなＧＬＰ−２配列の３位でのＮ−α−メチルアスパラギン酸置換ならびにメチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレンまたはスルホンアミドのような他のペプチド模倣物は、アミド結合の等配電子置換と同一の結果を達成し得る。
【００３０】
本発明はまた、ＧＬＰ−２フラグメントを含み、このフラグメントは、天然に存在するＧＬＰ−２ペプチドの配列に対して実質的に相同な配列を含むが、ＧＬＰ−２のネイティブなペプチド上に天然に見出されるアミノ末端および／またはカルボキシ末端で、１つ以上のさらなるアミノ酸を欠如し得る。従って、本発明は、天然に存在するＧＬＰ−２配列に通常存在する１つ以上のアミノ酸を欠如し得るＧＬＰ−２のポリペプチドフラグメントであって、このようなポリペプチドは、好ましくはＧＬＰ−２の胃腸組織増殖促進活性と少なくとも実質的に等しい胃腸組織増殖促進活性を有する、ＧＬＰ−２のポリペプチドフラグメントに関する。
【００３１】
本発明はまた、重要でないアミノ酸置換を有する（従って天然の配列とは異なるアミノ酸配列を有する）上記のアナログまたはフラグメントの明白なまたは平凡な改変体であって、ＧＬＰ−２の胃腸組織増殖促進活性に実質的に類似する胃腸組織増殖促進活性を有する、改変体を包含する。明白なまたは平凡な置換の例としては、別の残基に対する１つの塩基性残基の置換（すなわちＬｙｓに対してＡｒｇ）、別の残基に対する１つの疎水性残基の置換（すなわちＩｌｅに対してＬｅｕ）、別の残基に対する１つの芳香族残基の置換（すなわちＴｙｒに対してＰｈｅ）などが挙げられる。さらに、他の平凡な改変体は、元の配列の実質的な構造的アナログを生じる保存的置換が得られる、アナログを含む。このような保存的置換の例としては、限定されないが、アスパラギン酸に対してグルタミン酸および逆もまた同様；アスパラギンに対してグルタミンおよび逆もまた同様；またはスレオニンに対してセリンおよび逆もまた同様；アルギニンに対してリジンおよび逆もまた同様；あるいはお互いに対してイソロイシン、バリンまたはロイシンのいずれか、が挙げられる。
【００３２】
ペプチダーゼ安定化ＧＬＰ−２誘導体は、インビボで、ペプチダーゼ存在下で、対応する非安定化ＧＬＰ−２アナログよりもより安定である。ペプチダーゼ安定性は、血清または血液中のネイティブなＧＬＰ−２アナログの半減期と、血清または血液中の反応性実体を含む対応する誘導体の半減期との比較によって決定される。半減期は、誘導体ペプチドまたは非改変ペプチドの投与後、血清または血液をサンプリングし、そしてそれぞれの化合物の活性を決定することによって決定される。
【００３３】
より詳細には、本発明は、ＧＬＰ−２ならびにそのアナログおよびフラグメントの顕著な治療的特性を実質的に維持または改善しながら、血液成分との選択的な結合体化を介する、そのバイオアベイラビリティ、延長されたインビボ半減期および分布を改善するための、ＧＬＰ−２ならびにそのアナログおよびフラグメントの改変に関する。
【００３４】
ヒトＧＬＰ−２は、以下の配列を有することが知られている：
【００３５】
【化４】
本発明は、特に以下のための、延長されたインビボ半減期を有するＧＬＰ−２誘導体の治療的使用および関連の使用に関する：
−小腸組織および／または大腸組織の成長の促進；
−ＧＬＰ−２誘導体の血中レベルの増大；
−胃腸機能の回復または維持；
−損傷したまたは潰瘍形成した／炎症した腸粘膜の治癒および再成長の促進；
−腸疾患の危険性の軽減；
−栄養状態の増強；
−栄養または胃腸の障害または疾患の処置または予防；
−体重減少の軽減；
−インターロイキン−１の発現の軽減；
−結腸の長さ、結腸の粘膜面積および完全性、ならびに陰窩の深さの増大；
−セリアック病、感染後絨毛萎縮および短胃症候群（ｓｈｏｒｔ ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような疾患に罹患した被験体における絨毛成長の促進；
−健康な被験体における小腸および大腸の増殖促進、例えば、ウシにおいて栄養吸収の増加を可能にして、早期の離乳または牛乳および肉の産生を増加させるため；など。
【００３６】
本発明のＧＬＰ−２誘導体によって誘発される成長における効果は、模倣物で処置されたコントロールとの比較による小腸の重量の増加として明らかにされる。特に、本ＧＬＰ−２誘導体は、本明細書中に例示されたマウスモデルにおいて評価されるとき、このアナログがビヒクルのみを受容するコントロール動物と比較して、少なくとも１０％の小腸重量の増加を媒介する場合に、「腸栄養性（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）」活性を有すると考えられる。特に治療上の使用のために適切なこれらの誘導体は、小腸重量の少なくとも２０％の増加を媒介する、誘導体であるが、より好ましくは、５０％以上の小腸重量における増加を媒介する誘導体である。腸栄養性活性は、空腸（遠位空腸および特に近位空腸を含む）との関連において、最も有意に注目され、そしてまた、回腸についても注目される。
【００３７】
腸栄養性活性の提示に加えて、本発明のＧＬＰ−２誘導体は、ＧＬＰ−２ペプチド「骨格」内の１つ以上の部位において、アミノ酸置換を組み込み、この「骨格」は、本質的に哺乳動物ＧＬＰ−２種であるか、または哺乳動物ＧＬＰ−２種の改変体であり、ここでそのＣ末端および／もしくはＮ末端は、インビボでの所望でない生化学的攻撃および分解からペプチド末端を保護するために、１つ以上の塩基性残基の付加によって改変されているか、またはペプチド化学の分野において通常使用される型のブロック基を取り込むように改変されている。従って、本発明のペプチド誘導体は、以下に挙げられる（限定されないが）任意の哺乳動物ＧＬＰ−２種に関して、アミノ酸置換を取り込む：ヒトＧＬＰ−２、ウシＧＬＰ−２、ラットＧＬＰ−２、イヌＧＬＰ−２、雄ウシ（ｏｘ）ＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、モルモットＧＬＰ−２およびハムスターＧＬＰ−２であって、これらの配列は、多くの著者によって報告されており、Ｂｕｈｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３（１８）：８６２１が挙げられる。より好ましい実施形態において、リジン残基は、ＧＬＰ−２ペプチド配列のＣ末端に付加される。
【００３８】
本発明の１つの局面において、本発明に基づく誘導体化のために適切なＧＬＰ−２の腸栄養性アナログは、以下の配列を有し：
【００３９】
【化５】
ここで、
Ｘ１は、ＨｉｓまたはＴｙｒであり；
Ｘ２は、ＤＰＰ−ＩＶ酵素に対する抵抗性を前記のアナログに与えるＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｎｏｒ−Ｖａｌ、α−アミノ酪酸、またはＡｌａ置換アミノ酸である；
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ ＨＰｒｏであるか；またはＸ２−Ｘ３は、Ｘ２ψ（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２）Ｘ３；Ｘ２ψ（ＣＨ２ＮＨ２）Ｘ３またはＸ２ψ（ＣＨＣＨ）Ｘ３であって、ここで、Ｘ２およびＸ３は、上記に規定されるとおりであり；
Ｘ４は、ＧｌｙまたはＡｌａであり；
Ｘ５は、ＳｅｒまたはＡｌａであり；
Ｐ１は、Ｇｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ、Ｇｌｙ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＶａｌまたはＴｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒであり；
Ｘ１０は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ置換アミノ酸であり；
Ｘ１４は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘ１６は、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ１７は、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；
Ｘ１９は、ＡｌａまたはＴｈｒであり；
Ｘ２０は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｌａであり；
Ｘ２１は、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
Ｘ２７は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；
Ｘ２８は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり；
Ｐ２は、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｉｌｅ−ＡｌａまたはＶａｌ−Ｇｌｎであり；
Ｐ３は、共有結合であるか、またはＩｌｅ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−ＡｓｐもしくはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎであり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基であり；
Ｙ１は、１つまたは２つのＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓであり；
Ｙ２は、１つまたは２つのＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓであり；そして
ｍおよびｎは、独立して０または１である。
【００４０】
好ましい実施形態において、Ｘ１は、Ｈｉｓであり；Ｘ２は、ＡｌａまたはＧｌｙであり；Ｘ３は、Ａｓｐであり；Ｘ４は、Ｇｌｙであり；Ｘ５は、Ｓｅｒであり；Ｐ１は、Ｇｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅであり；Ｘ１０は、Ｍｅｔであり；Ｘ１６は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；Ｘ１９は、Ａｌａであり；Ｘ２０は、Ａｒｇであり；Ｘ２７は、Ｉｌｅであり；Ｘ２８は、Ｇｌｎであり；Ｐ２は、Ｉｌｅ−Ａｓｎであり；Ｐ３は、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐであり、Ｒ２は、ＣＯＮＨ２でありそしてｍは、０である。さらに好ましい実施形態において、ｎは１であり、そしてＹ２はＬｙｓである。
【００４１】
好ましい実施形態において、タンパク質上の官能基は、チオール基であり、そして反応性実体は、マレイミドまたはマレイミド含有基（例えば、γ−マレイミド−ブチリルアミド（ＧＭＢＡ）、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）−ＭＰＡ、エチレンジアミン（ＥＤＡ）−ＭＰＡまたは［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）−ＭＰＡおよびこれらの組み合わせ）である。組み合わせの例としては、限定されないが、（ＡＥＥＡ−ＥＤＡ）−ＭＰＡ；（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ）−ＭＰＡ、（ＡＥＡ−ＡＥＥＡ）−ＭＰＡなどが挙げられる。
【００４２】
マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５と７．４との間に維持される場合、ペプチドのスルフヒドリル基に対して最も選択的である。ｐＨ７．０で、スルフヒドリルとのマレイミド基の反応速度は、アミンとの反応速度よりも１０００倍速い。マレイミド基とスルフヒドリルとの間の、生理学的条件下で切断され得ない安定なチオエーテル結合が形成される。
【００４３】
本発明の胃腸組織増殖促進因子誘導体は、血液成分の特異的標識化を提供する。このような特異的標識化（特に、マレイミドを用いる）は、いくつかの利点を提供する。遊離チオール基は、インビボでアミノ基より少なく、そして結果として、マレイミド誘導体は、より少数のタンパク質に共有結合する。例えば、血清アルブミンにおいて、１分子あたり１つのみの遊離チオール基が存在する。従って、ＧＬＰ−２−マレイミド−アルブミン結合体は、約１：１のモル比の、アルブミンに対するペプチドを含む傾向がある。アルブミンに加えて、ＩｇＧ分子（クラスＩＩ）はまた、遊離チオールを有する。ＩｇＧ分子および血清アルブミンは、血液中で大多数の可溶性タンパク質を構成するので（すなわち９９％）、それらはまた、マレイミド置換ＧＬＰ−２に共有結合するために利用可能な大多数の遊離のチオール基を構成する。
【００４４】
さらに、遊離チオール含有血液タンパク質の間でさえ、マレイミドでの特異的標識化は、アルブミン自体の独特の特性に起因して、ペプチドマレイミド−アルブミン結合体の優先的な形成を導く。アルブミンの単一の遊離チオール基（種の間で高度に保存される）は、アミノ酸残基Ｃｙｓ３４に位置する。アルブミンのＣｙｓ３４は、他の遊離チオール含有タンパク質上の遊離チオールと比較して増加した反応性を有することが最近証明されている。これは、アルブミンのＣｙｓ３４についての５．５の異常な低いｐＫ値に部分的に起因する。これは、一般的なシステイン残基についての代表的なｐＫ値（これは代表的には、約８である）よりもかなり低い。この低いｐＫに起因して、通常の生理学的条件下で、アルブミンのＣｙｓ３４は、主に陰イオン化形態であり、その反応性を劇的に上昇させる。Ｃｙｓ３４の低いｐＫ値に加えて、Ｃｙｓ３４の反応性を増強する別の因子は、アルブミンのＶ領域の１つのループの表面に近接する疎水性ポケットに存在する位置である。この位置は、Ｃｙｓ３４を、全ての種類のリガンドに非常にアクセス可能にし、そしてフリーラジカルトラップおよび遊離のチオールスカベンジャーとしてのＣｙｓ３４の生物学的な役割において重要な因子である。結果として、反応速度の加速は、他の遊離チオール含有タンパク質を有するペプチド−マレイミドの反応速度と比較して１０００倍ほど高くあり得る。
【００４５】
ペプチド−マレイミド−アルブミン結合体の別の利点は、Ｃｙｓ３４において特異的に、アルブミンに対してペプチドを１：１でロードすることに伴う再現性である。従来の活性化技術（例えば、グルタルアルデヒド、ＤＣＣ、ＥＤＣおよび他の化学的アクチベータ（例えば、遊離アミンの化学的アクチベータ）を用いる技術）は、この選択性を欠いている。例えば、アルブミンは、５２個のリジン残基を含み、このうち２５〜３０個は、アルブミンの表面上に位置し、そして結合体にとってアクセス可能である。これらのリジン残基を活性化すること、あるいは、これらのリジン残基を介して結合するようにペプチドを修飾することは、結合体の不均一な集団を生じる。等モル比（すなわち、１：１）のペプチド：アルブミンが使用される場合でさえ、最終的な結果は、ランダムな結合体生成物の生成であり、いくつかは、アルブミンの各分子に連結した不正確な数のペプチドを含み、そして各々の結合体は、２５〜３０個の利用可能なリジン部位のいずれか１つにおいてランダムに結合したペプチドを有する。結果として、正確な組成の特徴付けは、再現性の非存在はもちろんのこと、実際には不可能である。さらに、アルブミンのリジン残基を介した結合体化は、アルブミン１分子当たり、より多くの治療剤を送達する利点を少なくとも有すると考えられたが、研究により、アルブミンに対する治療剤の１：１の比が好ましいことが示されている。Ｓｔｅｈｌｅら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ、１９９７、８、６７７−６８５（これは、本明細書中でその全体が援用される）による論文において、グルタルアルデヒドを介して結合体化したアルブミンに対する抗癌メトトレキセートの１：１の比が、最も見込みのある結果を生じたことが報告された。これらの結合体は、腫瘍細胞によって取り込まれたが、一方、５：１〜２０：１のメトトレキセート分子を保有する結合体は、変更されたＨＰＬＣプロフィールを有し、そしてインビボで肝臓によって迅速に取りこまれた。従って、より高い比では、治療剤のためのキャリアとしてのアルブミンの有効性を減少すると考えられる。
【００４６】
本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体、および特にマレイミド反応性実体を含むＧＬＰ−２ペプチドの制御された投与によって、アルブミンおよびＩｇＧの、特異的なインビボでの標識および結合が制御され得る。代表的な投与において、投与されたペプチド誘導体の８０〜９０％がアルブミンに結合し、そして５％未満がＩｇＧに結合することが示された。存在する遊離チオール（例えば、グルタチオン）の微量結合もまた生じる。このような特異的結合は、投与される治療剤の推定半減期の正確な計算を可能にするので、インビボでの使用のために好ましい。
【００４７】
マレイミド置換されたＧＬＰ−２ペプチドは、一般に、水溶液の存在下および遊離アミンの存在下で、非常に安定である。マレイミド置換されたＧＬＰ−２ペプチドは、遊離チオールと反応するので、保護基が、マレイミド置換されたＧＬＰ−２ペプチドがそれら自身と反応することを防止する必要はない。
【００４８】
上記のように、血液成分に対するＧＬＰ−２誘導体の所望の結合体は、動物またはヒトであり得る被験体にこれらの誘導体を直接投与することによって、インビボで調製され得る。この投与は、ボーラスの形態で行われ得るか、または規制流れ（ｍｅｔｅｒｅｄ ｆｌｏｗ）などを使用する注入により、ゆっくりと時間をかけて導入され得る。
【００４９】
あるいは、この結合体はまた、血液または市販の精製血液成分を、本発明のＧＬＰ−２誘導体と合わせ、血液成分上の官能基に対するＧＬＰ−２誘導体の共有結合を可能にし、次いで結合体化した血液または結合体化した精製血液成分を宿主に戻すか、または投与することによって、エキソビボで調製され得る。さらに、上記はまた、個々の血液成分または限定数の成分（例えば、赤血球、免疫グロブリン、血清アルブミンなど）を最初に精製し、そしてこれらの成分を本発明の化合物誘導体とエキソビボであわせることによっても、達成され得る。次いで、標識された血液または血液成分は、インビボで治療的に有効な結合体を提供するために、被験体に戻され得る。血液はまた、エキソビボでの扱いの間の凝集を予防するために、処理され得る。
【００５０】
（ペプチド合成）
ＧＬＰ−２ペプチドは、いずれかの当業者に周知の固相ペプチド化学の標準的な方法によって、合成され得る。例えば、ペプチドは、Ｓｔｅｗａｒｄら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第二版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．（１９８４）に記載される手順に従って、Ｒａｉｎｉｎ ＰＴＩ ＳｙｍｐｈｏｎｙＴＭ合成機を使用して、固相化学技術によって合成され得る。同様に、ペプチドフラグメントが合成され得、引き続いて一緒に合わせられるかまたは連結されて、より大きなペプチド（セグメント凝縮）を形成し得る。これらの合成ペプチドフラグメントはまた、特定の位置でアミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失を有して作製され得る。
【００５１】
固相ペプチド合成について、多くの技術の要約が、Ｓｔｅｗａｒｔら、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、１９６３およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１９７３、２、４６に見出され得る。古典的な溶液合成については、例えば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第１巻、Ａｃａｃｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。一般に、このような方法は、ポリマー上の成長するペプチド鎖に、１以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸の連続的付加を含む。通常、第一のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される。次いで、保護されたアミノ酸および／または誘導体化アミノ酸は、不活性な固体支持体に結合されるか、または、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中に次のアミノ酸を、アミド結合の形成に適切な条件下で付加することによって、溶液中で使用されるかのいずれかである。次いで、保護基を、この新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、（適切に保護された）次のアミノ酸を付加するなどする。
【００５２】
全ての所望のアミノ酸が、適切な配列に連結された後、任意の残りの保護基（および任意の固体支持体）を引き続いて除去するか、または同時に最終ポリペプチドを得る。この一般的手順の簡単な改変によって（例えば、（キラル中心をラセミ化しない条件下で）保護トリペプチドを適切に保護されたジペプチドに結合させて、脱保護後にペンタペプチドを形成すること（セグメント凝縮）によって）、成長する鎖に同時に１つより多くのアミノ酸を付加することが可能である。
【００５３】
本発明のＧＬＰ−２誘導体を調製する特に好ましい方法としては、固相ペプチド合成が挙げられ、ここでこのアミノ酸α−Ｎ末端は酸感応基または塩基感応基によって保護される。このような保護基は、ペプチド連結形成の条件に安定であるが、成長ペプチド鎖またはこれらに含まれる任意のキラル中心のラセミ化を破壊することなくに容易に除去可能な性質を有するべきである。Ｎ−保護基およびカルボキシ保護基の例は、Ｇｒｅｅｎｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｐｐ．１５２〜１８６（１９８１））に開示され、これは参考として本明細書中で援用される。Ｎ−保護基の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：低級アルカノイル基（例えば、ホルミル、アセチル（「Ａｃ」）、プロピオニル、ピバロイル（ｐｉｖａｌｏｙｌ）、ｔ−ブチルアセチルなど）；他のアシル基（例えば、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタルリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、ｏ−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル、などを含む）；スルホニル基（たとえば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、ｏ−ニトロフェニルスルホニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）など）；カルバメート形成基（例えば、ｔ−アミルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−エトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル（ｉｓｏｂｏｒｎｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル（ａｄａｍａｎｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど）；アリールアルキル基（例えば、ベンジル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）など）およびシリル基（例えば、トリメチルシリルなど）。好ましいα−Ｎ−保護基は、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル；３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル；ｔ−アミルオキシカルボニル；２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニルなどであり、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）がより好ましい。その一方、好ましい側鎖Ｎ−保護基としては、リジンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基に対しては２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼン−スルホニル、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、およびアダマンチルオキシカルボニル；チロシンに対してはベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロピル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロペニルおよびアセチル（Ａｃ）；セリンに対してはｔ−ブチル、ベンジルおよびテトラヒドロピラニル；ヒスチジンに対しては、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、ｐ−トルエンスルホニル、および２，４−ジニトロフェニル；トリプロファンに対してはホルミル；アスパラギン酸およびグルタミン酸に対してはベンジルおよびｔ−ブチル；そしてシステインに対してはトリフェニルメチル（トリチル）が挙げられる。
【００５４】
カルボキシ保護基は、慣習的に、カルボン酸保護エステルまたはアミド基と呼ばれる。このようなカルボキシ保護基は、当業者に周知であり、米国特許第３，８４０，５５６号および同第３，７１９，６６７号（これらの開示は、参考として本明細書中で本明細書中によって援用される）に記載されるようにペニシリンおよびセファロスポリンの分野におけるカルボキシル基の保護において広範に使用されている。代表的なカルボキシ保護基としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃ１〜Ｃ８低級アルキル；アリールアルキル（例えば、フェネチルまたはベンジルおよび（アルコキシベンジル基またはニトロベンジル基のような）これらの置換された誘導体；アリールアルケニル（例えば、フェニルエテニル）；アリールおよび（５−インダニルのような）この置換された誘導体；ジアルキルアミノアルキル（例えば、ジメチルアミノエチル）；アルカノイルオキシアルキル基（例えば、アセトキシメチル、ブチリルオキシメチル、バレリルオキシメチル（ｖａｌｅｒｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）、イソブチリルオキシメチル、イソバレリルオキシメチル、１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、１−（ピバロイルオキシ）−１−エチル、１−メチルー１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、ピバロイルオキシメチル、プロピオニルオキシメチル）；シクロアルカノイルオキシアルキル基（例えば、シクロプロピルカルボニルオキシメチル、シクロブチルカルボニルオキシメチル、シクロペンチルカルボニルオキシメチル、シクロヘキシルカルボニルオキシメチル）；アロイルオキシアルキル（例えば、ベンゾイルオキシメチル、ベンゾイルオキシエチル）；アリールアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、ベンジルカルボニルオキシメチル、２−ベンジルカルボニルオキシエチル）；アルコキシカルボニルアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル（例えば、メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル、１−メトキシカルボニル−１−エチル）；アルコキシカルボニルオキシアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、メトキシカルボニルオキシメチル、ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシメチル、１−エトキシカルボニルオキシ−１−エチル、１−シクロヘキシルオキシカルボニルオキシー１−エチル）；アリールオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（フェノキシカルボニルオキシ）エチル、２−（５−インダニルオキシカルボニルオキシ）−エチル）；アルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（１−メトキシ−２−メチルプロパン−２−オイルオキシ（ｏｙｌｏｘｙ））−エチル）；アリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）エチル）；アリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（３−フェニルプロペン−２−イルオキシカルボニルオキシ）エチル）；アルコキシカルボニルアミノアルキル（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチル）；アルキルアミノカルボニルアミノアルキル（例えば、メチルアミノカルボニルアミノメチル）；アルカノイルアミノアルキル（例えば、アセチルアミノメチル）；複素環式カルボニルオキシアルキル（例えば、４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル）；ジアルキルアミノカルボニルアルキル（例えば、ジメチルアミノカルボニルメチル、ジエチルアミノカルボニルメチル）；（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル（例えば、（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル）；および（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル（例えば、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル。代表的なアミドカルボキシ保護基としては、アミノカルボニル基および低級アルキルアミノカルボニル基が挙げられるがこれらに限定されない。上記のカルボキシ保護基の中で、低級アルキル、シクロアルキルエステルもしくはアリールアルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステルなど）またはアルカノイルオキシアルキル、シクロアルカノイルオキシアルキル、アロイルオキシアルキルまたはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルが好ましい。好ましいアミドカルボキシ保護基は、低級アルキルアミノカルボニル基である。
【００５５】
固相ペプチド合成法において、α−Ｃ−末端アミノ酸は、適切な固体支持体または樹脂に結合される。上記の合成に有用な適切な固体支持体は、試薬および段階的な濃縮−脱保護反応の反応条件に不活性であり、そして使用される媒体に不溶である、材料である。α−Ｃ末端カルボキシペプチドの合成に好ましい固体支持体は、４−ヒドロキシメチルフェノキシアセチル−４’−メチルベンジヒドリルアミン樹脂（ＨＭＰ樹脂）である。このα−Ｃ末端アミドペプチドのための好ましい固体支持体は、Ｆｍｏｃ−保護Ｒａｍａｇｅ Ｒｅｓｉｎである。
【００５６】
固体支持体が、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂である場合、上記のようにα−Ｃ−末端アミノ酸によるカップリングの前に、このＦｍｏｃ基は２級アミン（好ましくはピペリジン）によって切断される。脱保護された４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂にカップリングする好ましい方法は、ＤＭＦ中のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１当量）、および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。連続的な保護アミノ酸のカップリングは、当該分野で周知の従来の様式で自動ポリペプチド合成機で実行され得る。
【００５７】
成長ペプチドのα−Ｎ−末端側からのＦｍｏｃ保護基の除去は、例えば、２級アミン（好ましくはピペリジン）での処理によって従来どおりに達成される。次いで、それぞれの保護アミノ酸は、約３倍の過剰モル濃度において導入され、そしてそのカップリングは好ましくはＤＭＦ中で実行される。このカップリング剤は、通常、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１当量）、および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。
【００５８】
固相合成の最後、このペプチドは、連続的な操作かまたは単一の操作のいずれかで樹脂から除去され、そして脱保護される。このポリペプチドの除去および脱保護は、樹脂結合ポリペプチドを、チオアニソール、トリイソプロピルシラン、フェノール、およびトリフルオロ酢酸を含む切断試薬で処理することによる一回の操作において従来どおりに達成され得る。ポリペプチドのα−Ｃ−末端がアルキルアミドである場合、この樹脂は、アルキルアミンを用いるアミノ分解によって切断される。あるいは、このペプチドは、エステル交換（例えば、メタノールを用いて）によって除去され得、続いてアミノ分解または直接アミド基転移によって除去され得る。この保護ペプチドは、この時点で精製され得るかまたは直接、次の工程に移される。この側鎖保護基の除去は、上記の切断混合物を使用して達成される。十分に脱保護されたペプチドは、以下のいずれかまたはすべての型を使用する一連のクロマトグラフィー工程によって精製され得る：弱酸樹脂（酢酸型）によるイオン交換；非誘導化ポリスチレン−ジビニルベンゼン（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤＴＭ）による疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロースによるイオン交換クロマトグラフィー；分配クロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ＴＭ、ＬＨ−２０ＴＭまたは向流分配）；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、オクチルシリカまたはオクタデシルシリルシリカが、カラム充填相に結合されている逆相ＨＰＬＣ。当業者の誰もが、どのクロマトグラフィー工程または順序が、ＧＬＰ−２ペプチドの満足な精製を得るのに必要とされるかを容易に決定し得る。
【００５９】
これらのペプチドの分子量は、Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙ質量分析器を使用して測定される。
【００６０】
本発明のＧＬＰ−２誘導体の生成のための合成プロセスは、ＧＬＰ−２誘導体に含まれる種々の要素の性質（すなわち、このＧＬＰ−２の配列、連結基および反応性実体）に依存して大きく変化する。この合成手順は、単純性、高収率および反復性を保証するよう選択され、そして高度に精製された生成物を得る。通常、この化学的に反応性の実体は、その合成の最終段階でカップリングされる（例えば、カルボキシル基と、活性エステルを形成するためのエステル化）。本発明のＧＬＰ−２誘導体の生成のための特定の方法は、以下に記載される。
【００６１】
この化学的に反応性の実体は、ポリペプチドが対応するネイティブのＧＬＰ−２ペプチドの実質的な比率、活性および／または有益な影響を（全てではないにしても）保持しながら血液成分に共有結合され得る側に配置されなければならない。
【００６２】
より好ましい実施形態において、各ＧＬＰ−２誘導体は、以下の基準に従って合成される：末端カルボキシル基が、ペプチド上で利用可能であり、薬理学的活性の保持に重大な意味を持たず、かつ他の感応性官能基がペプチド上に存在しない場合、カルボン酸が、連結基−反応性実体の修飾のための結合部分として選択される。この末端カルボキシル基が、薬理学的活性に関与するか、またはどのカルボン酸も利用可能でない場合、薬理学的活性の保持に重要な意味を持たない任意の他の感応性官能基が、連結基−反応性実体の修飾のための結合部分として選択される。いくつかの感応性官能基が、ペプチド上で利用可能である場合、保護基の組合せは、連結基／反応性実体の付加および全ての保護された感応性感応基の脱保護後に薬理学的活性の保持がなお得られるような方法において使用される。感応性感応基がペプチド上で利用可能でない場合、合成の努力によって、生物学的活性の保持およびレセプター特異性または標的特異性の保持が得られるような方法での元のペプチドの修飾が可能となる。この場合、この修飾は、好ましくはペプチドの反対の末端で生じる。
【００６３】
本発明に従って、ＧＬＰ−２誘導体は、上部胃腸管組織の増大から利益をうける患者に投与され得る。さらに、上部胃腸管組織の増大した機能から利益をうける患者（組織増殖の増大の結果であるかどうかにかかわらず）は、本発明を用いて処置するための候補である。一般的に、増加した上部胃腸管の質量および／または増加した上部胃腸管の粘膜機能のいずれかから利益をうける患者は、本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いた処理の候補である。本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いて処理され得る特定の状態は、胃または食道の炎症性疾患、ならびに上部胃腸管の部分的または完全に近い切除を受けている患者の様々な形態を含む。本発明のＧＬＰ−２誘導体またはその混合物によって処置され得る、胃および食道を含む上部胃腸管の状態の非網羅的な列挙としては、以下のような胃の障害が挙げられる：急性胃炎、急性出血性胃炎、急性ストレス性胃炎、ウイルス性胃炎、寄生虫性胃炎、真菌性胃炎、胃疾患（急性）、出血性胃疾患、急性ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ胃炎、Ａ型、Ｂ型またはＣ型胃炎、過分泌性胃炎、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに続発する非特異的胃炎、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ−関連胃炎、化学物質胃炎、反応性胃炎、逆流性胃炎、胆汁性胃炎、化生性萎縮性胃炎および環境化生性萎縮性胃炎、特発性全胃炎（ｐａｎｇａｓｔｒｉｔｉｓ）、びまん性肉体性胃炎（ｄｉｆｆｕｓｅ ｃｏｒｐｏｒａｌ ｇａｓｔｒｉｔｉｓ）、自己免疫性慢性胃炎および自己免疫関連胃炎、ヘリコバクターピロリ以外の細菌性胃炎（Ｇａｓｔｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓ、フレグモーネ、マイコバクテリア、梅毒性）、幽門洞切除後（ｐｏｓｔａｎｔｒｅｃｔｏｍｙ）萎縮性胃炎、好酸球性胃炎、および任意の他の感染性胃炎；クローン病、サルコイドーシス、孤立性肉芽腫性胃炎、リンパ球性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｌｉｃ）胃炎、メネトリエ病（Ｍｅｎｅｔｒｉｅｒｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）など、および以下のような真菌またはウイルスまたは細菌からの感染性食道炎のような食道の障害：Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｅｃｉｅｓ（ｅｓｐ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ａｓｐａｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｅｓのような真菌、または単純ヘルペスウイルス（１型）、サイトメガロウイルス、Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒウイルスのようなウイルス、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ Ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ．のような細菌。食道の他の障害としては、限定しないが以下が挙げられる：非感染性食道炎、酸逆流、胆汁逆流、化学的損傷（医薬、毒、酸、アルカリなどによる）、サーコイドーシス、クローン病、ベーチェット病、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ関連感染症（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｉｌｌ、Ｇｌａｒｄｉａ Ｌａｍｂｌｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペス）。
本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いて処置され得る他の疾患または状態としては、以下が挙げられる：小腸管粘膜における異常性（これは潰瘍および炎症性障害を含む）；吸収不良症候群を含む先天性または後天性消化障害および吸収障害；ならびに小腸粘膜機能の欠損による疾患および状態（特に延長した腸管外栄養補給を受けている患者、または外科手術の結果、小腸の切除を受けたかまたは短腸症候群（ｓｈｏｒｔ−ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および窩（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ）症候群を罹患する患者）。一般的に、増加した小腸の質量、そしてその結果起こる増加した小腸粘膜機能のいずれかから利益をうける患者は、ＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いての処置に対する候補である。本発明のＧＬＰ−２誘導体を用いて処置され得る特定の状態は、以下を含む様々なスプルーが挙げられる：小麦からグリアジンへの毒性反応の結果生じ、そして小腸の絨毛（ｖｉｌｌａｅ）の損失が顕著である、セリアックスプルー；感染の結果生じ、絨毛の部分的な平坦化が顕著である、熱帯性スプルー；分類不能型免疫不全または低ガンマグロブリン血を有する患者において共通して観察され、そして絨毛の長さの有意な減少が顕著である、低ガンマグロブリン血スプルー。本発明の誘導体を用いて処置され得るか、またはこれらが予防的に有用であり得る他の状態としては、以下が挙げられる：放射線腸炎、感染性または感染後の腸炎、限局性腸炎（クローン病）、毒または化学療法薬に起因する小腸損傷および短腸症候群を有する患者。
【００６４】
別の局面において、本発明のＧＬＰ−２ペプチド誘導体を用いた処置のための患者の候補は、膵島の増殖（そして特に膵島の増殖または再生）から利益を得る患者である。このような患者としては、膵島の不在もしくは減少、または低下した膵島機能が顕著である疾患または状態を罹患した患者が挙げられる。特別な患者の候補は、１型または２型糖尿病を罹患する患者、ならび膵臓の浸潤、炎症または破壊に起因する糖尿病の２次的形態を有する患者である。
【００６５】
本発明のＧＬＰ−２誘導体は、その治療効果を最適化するよう単独でかまたは組み合わせで使用され得る。これらは、生理学的に受容可能な媒体（例えば、脱イオン水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、水性エタノールまたは他のアルコール、血漿、タンパク溶液、マンニトール、水性グルコース、アルコール、植物油など）中で投与され得る。含まれ得る他の添加物としては、緩衝液（ここでこの培体は一般的には約５〜１０の範囲のｐＨに緩衝され、この緩衝液は一般的には約５０〜２５０ｍＭの濃度範囲である）、塩（ここで塩の濃度は一般的には約５〜５００ｍＭの範囲である）、生理学的に受容可能な安定剤などが挙げられる。この組成物は、便利な貯蔵および輸送のために凍結乾燥され得る。
【００６６】
本発明のペプチド誘導体は、経口的に、非経口的（例えば、脈管内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）など）に投与され得る。投与は、注入によって適切な状況においてなされ得る。いくつかの例では、官能基の反応が比較的遅い場合、投与は、経口、経鼻、直腸、経皮またはエアロゾルであり得、ここでこの結合体の性質は、脈管系への輸送を可能にする。所望の場合、１度以上の注射が使用され得るが、通常は１度の注射が行われる。このペプチド誘導体は、任意の首尾良い手段によって投与され得、その手段としては、注射器、外套針、カテーテルなどが挙げられる。投与の特定の様式は、投与量によって、１度のボーラス投与であるか連続的な投与であるかなどによって変化する。好ましくは、投与は、脈管内投与であり、ここで注入の部位は、本発明にとって重要ではなく、好ましくは速い血流が存在する部位（例えば、静脈内、末梢静脈または中心静脈）である。他の経路は、投与が遅延放出技術または保護マトリクスと結び付けられた用途を見出し得る。この意図は、ペプチドが血液中に効果的に拡散され、その結果、血液成分と反応し得ることである。この結合体の濃度は、広範に変化し、一般的には約１ｐｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。代表的に、脈管内総投与量は、通常約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、より一般的には約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００６７】
長寿命の血液成分（例えば、免疫グロブリン、血清アルブミン、赤血球および血小板）への結合によって多くの利点を生じる。本発明のＧＬＰ−２誘導体の活性は、数日間、延長され、そして潜在的には数週間にまで延長される。１回のみの投与が、この期間の間で必要とされる。より大きい特異性が、活性成分が大分子に最初に結合することによって達成され、細胞内に取り込まれて、他の生理学的プロセスと干渉する可能性はほとんどない。
【００６８】
哺乳動物宿主の血液は、ＧＬＰ−２の活性および／またはＧＬＰ−２誘導体の存在についてモニタリングされ得る。異なる時間で宿主の血液サンプルを取り出すことによって、ＧＬＰ−２ペプチドが治療的に活性であるのに十分な量で長寿命血液成分に結合するか否かが測定され得、その後、血液中のＧＬＰ−２のレベルが測定され得る。所望の場合、ＧＬＰ−２ペプチドが共有結合される血液成分もまた測定され得る。特異的なマレイミド置換されたペプチドは、血清アルブミンおよびＩｇＧの半減期を計算するのが容易である。モニタリングはまた、ペプチド活性のアッセイ、ＨＰＬＣ−ＭＳまたはペプチドに対する抗体を使用することによって行われ得る。
【００６９】
本発明の別の局面は、ＧＬＰ−２ペプチドに特異的な抗体を使用して生物学的サンプル（例えば、血液）においてＧＬＰ−２ペプチドまたはその結合体の濃度を測定する方法、およびこのようなＧＬＰ−２ペプチドまたは結合体と潜在的に関連する毒性に対する処置としてのこのような抗体の使用に関する。これは、患者におけるＧＬＰ−２ペプチドのインビボでの安定性および寿命が延長されることにより、処置の間の新たな問題（毒性に対する可能性の増加を含む）が引き起こされ得るという理由で有利である。抗ＧＬＰ−２抗体（モノクローナルまたはポリクローナルのいずれか）の使用は、ＧＬＰ−２に対して特異性を有しており、任意のこのような問題の媒介を補助し得る。この抗体は、産生され得るかまたは、特定のＧＬＰ−２誘導体、または薬剤の免疫原性フラグメント、または薬剤の抗原決定基に対応する合成された免疫原で免疫化された宿主から誘導され得る。好ましい抗体は、ＧＬＰ−２ペプチド誘導体のネイティブ形態、誘導体形態および結合体形態に対して高い特異性および親和性を有する。このような抗体はまた、酵素、蛍光色素、または放射標識で標識化され得る。
【００７０】
ＧＬＰ−２誘導体に対する抗体特異性は、誘導体化ＧＬＰ−２特異的抗体の導入のために精製されたＧＬＰ−２ペプチドを使用することによって生成され得る。抗体の誘導によって、動物への注射による免疫応答の刺激だけでなく、合成抗体または他の特異的結合分子の生成における類似の工程（例えば、遺伝子組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニング）が意図される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が、当該分野において周知の手順によって作製され得る。
【００７１】
この抗体はまた、血流におけるＧＬＰ−２ペプチドの存在をモニタリングするのに使用され得る。血液サンプルおよび／または血清サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析され得る。このような技術は、血液成分に対するＧＬＰ−２誘導体の結合の測定のための血液または血清の分析を可能にする。
【００７２】
抗治療薬剤抗体がまた、ＧＬＰ−２誘導体の投与によって誘導された毒性の処置に使用され得、エキソビボまたはインビボで使用され得る。エキソビボ法としては、固体支持体に固定された抗治療薬剤抗体を使用する毒性についての免疫透析処置が挙げられる。インビボ法としては、抗体−薬剤複合体のクリアランスを誘導するのに有効量の抗治療薬剤抗体の投与が挙げられる。
【００７３】
この抗体は、ＧＬＰ−２誘導体およびこれらの結合体を、滅菌条件下で血液を抗体に接触させることによって、エキソビボで患者の血液から除去するのに使用され得る。例えば、抗体は固定され得るかまたはそうでなければカラムマトリクスに固定され得、そして患者の血液が患者から取り出され、このマトリクスを通され得る。このＧＬＰ−２誘導体は、抗体および低濃度のＧＬＰ−２を含む血液に結合し、次いで、患者の循環系に戻され得る。除去されるＧＬＰ−２誘導体の量は、圧力および流速を調節することによって制御され得る。患者の血液の血清成分からのＧＬＰ−２誘導体の優先的な除去は、例えば、抗治療抗体を含むマトリクスを介して血清成分を通過する前に、半透膜の使用によってかまたは当該分野において公知の方法による細胞成分からの血清成分の最初の分離によってもたらされ得る。あるいは、ＧＬＰ−２結合体化血液細胞（例えば、赤血球）の優先的な除去は、患者の血液の血清成分を除去するために、患者の血液中の赤血球を回収することおよび濃縮することならびにこれらの細胞と固定化された抗ＧＬＰ−２抗体と接触させることによってもたらされ得る。
【００７４】
この抗ＧＬＰ−２抗体は、処置のためにＧＬＰ−２誘導体またはその結合体を受ける患者にインビボで非経口的に投与され得る。この抗体は、ＧＬＰ−２誘導体および結合体と結合する。一旦結合すると、このＧＬＰ−２活性は完全にブロッキングされない場合、妨害され、それによって患者の血流におけるＧＬＰ−２誘導体の生物学的に有効な濃度を減少させ、そして有害な副作用を最小限に抑える。さらに、結合された抗体ＧＬＰ−２複合体は、患者の血流からのＧＬＰ−２誘導体および結合体のクリアランスを容易にする。
【００７５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために提供され、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されない。他に示されない限り、Ｌ−配置の光学活性保護化アミノ酸を使用した。
【００７６】
（合成）
ＧＬＰ−２ペプチドおよびその誘導体の合成を、ＧＬＰ−２誘導体の生成の間に手動で介入し、ＳｙｍｐｈｏｎｙＴＭペプチド合成器における自動固相手順を使用して実施した。この合成を、Ｆｍｏｃ保護ＲａｍａｇｅＴＭアミドリンカー樹脂上でＦｍｏｃ保護化アミノ酸を使用して実施した。カップリングを、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液におけるアクチベーターとして、そしてジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を塩基として使用することによって達成した。このＦｍｏｃ保護基を、２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用して除去した。必要な場合、Ｂｏｃ−保護化アミノ酸を、ペプチドを樹脂から切断した後に遊離Ｎα−末端を生成するためにＮ−末端で使用した。合成の間に使用した全てのアミノ酸は、他に記載されない限り、Ｌ−立体化学を有した。ガラス反応容器は、ＳｉｇｍａｃｏｔｅｄＴＭであり、合成の際に使用した。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
【００７８】
【化６】
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、連続的に樹脂に添加した：
【００７９】
【化７】
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンの溶液を用いて、２０分間で成し遂げた。
【００８０】
工程２：ペプチドを、８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ チオアニゾールおよび５％フェノールを用いて樹脂から分割し、続いて、ドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏによって沈殿した。この粗製ペプチドを、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中のアセトニトリルの混合物（０．１％ ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して精製プロセスにおいて使用される対応する粗製物質を生成した。
【００８１】
（実施例２）
【００８２】
【化８】
工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、連続的に樹脂に添加した：
【００８３】
【化９】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【００８４】
（実施例３）
【００８５】
【化１０】
工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであることを除いて、上記の実施例１の工程１と同様の様式で実行した。
【００８６】
工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護化を、手動で実行し、そして樹脂を、５ｍＬのＣ６Ｈ６：ＣＨＣｌ３（１：１）：２．５％ ＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％ ＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）中に溶解した３当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４の溶液を用いて２時間処理することによって達成した。次いで、樹脂を、ＣＨＣｌ３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中２０％ ＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）を用いて洗浄する。
【００８７】
工程３：次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸の添加のために再自動化した。全カップリングの間、樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。
【００８８】
工程４：ペプチドを、８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ チオアニゾールおよび５％ フェノールを用いて樹脂から分離し、続いてドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏによって沈殿した。この粗製ペプチドを、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中のアセトニトリルの混合物（０．１％ ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して精製プロセスにおいて使用される、対応する粗製物質を生成した。
【００８９】
（実施例４）
【００９０】
【化１１】
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載される手順に従って、連続的に樹脂に添加した：
【００９１】
【化１２】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【００９２】
（実施例５）
【００９３】
【化１３】
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載される手順に従って、連続的に樹脂に添加した：
【００９４】
【化１４】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【００９５】
（実施例６）
【００９６】
【化１５】
工程１：この工程を、２位のアラニン残基がグリシンと置換されていることを除いて、実施例２の工程１と同様の様式で実行した。
【００９７】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【００９８】
（実施例７）
【００９９】
【化１６】
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載される手順に従って、連続的に樹脂に添加した：
【０１００】
【化１７】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【０１０１】
（実施例８）
【０１０２】
【化１８】
工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、上記の実施例５の工程１と同様の様式で実行した。
【０１０３】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【０１０４】
（実施例９）
【０１０５】
【化１９】
工程１：この工程を、実施例７の工程１と同様の様式で実行した。
【０１０６】
工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護化を、手動で実行し、そして樹脂を、５ｍＬのＣ６Ｈ６：ＣＨＣｌ３（１：１）：２．５％ ＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％ ＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）に溶解した３当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４の溶液を用いて２時間処理することによって達成した。次いで、この樹脂を、ＣＨＣｌ３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中２０％ ＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）を用いて洗浄する。
【０１０７】
工程３：次いで、この合成を、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ−アミノエトキシエトキシ酢酸）の添加について再自動化した。各カップリングの間に、樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。適切な脱保護化後、ＭＰＡ（３−マレイミドプロピオン酸）を、スペーサーにアンカーし、そして再度樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。
【０１０８】
工程４：このペプチドを、８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ チオアニゾールおよび５％フェノールを用いて樹脂から分離し、続いて、ドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏによって沈殿した。この粗製ペプチドを、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中のアセトニトリルの混合物（０．１％ ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して、精製プロセスにおいて使用される対応する粗製物質を生成した。
【０１０９】
（実施例１０）
【０１１０】
【化２０】
工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、上記の実施例５の工程１と同様の様式で実行した。
【０１１１】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【０１１２】
（実施例１１）
【０１１３】
【化２１】
工程１：この工程を、合成の終わりに、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨが、ＭＰＡ−ＯＨの前に樹脂に添加されることを除いて、実施例６の工程１と同様の様式で実行した。
【０１１４】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【０１１５】
（実施例１２）
【０１１６】
【化２２】
工程１：この工程を、合成の終わりに、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨが、ＭＰＡ−ＯＨの前に樹脂に添加されることを除いて、実施例１の工程１と同様の様式で実行した。
【０１１７】
工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。
【０１１８】
（実施例１３）
【０１１９】
【化２３】
工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、上記の実施例１の工程１と同様の様式で実行した。
【０１２０】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同様の様式で実行した。
【０１２１】
（実施例１４）
【０１２２】
【化２４】
工程１：この工程を、実施例４の工程１と同じ様式で行った。
【０１２３】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同じ様式で行った。
【０１２４】
（実施例１５）
【０１２５】
【化２５】
工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂に連続的に添加した：
【０１２６】
【化２６】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で行った。
【０１２７】
（実施例１６）
【０１２８】
【化２７】
工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂に連続的に添加した：
【０１２９】
【化２８】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で行った。
【０１３０】
（実施例１７）
【０１３１】
【化２９】
工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂に連続的に添加した：
【０１３２】
【化３０】
工程２〜４：これらの工程を、実施例３の工程２〜４と同様の様式で行った。
【０１３３】
（実施例１８）
【０１３４】
【化３１】
工程１：この工程を、実施例１５の工程１と同じ様式で行った。
【０１３５】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同じ様式で行った。
【０１３６】
（実施例１９）
【０１３７】
【化３２】
工程１：この工程を、実施例１６の工程１と同じ様式で行った。
【０１３８】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同じ様式で行った。
【０１３９】
（実施例２０）
【０１４０】
【化３３】
工程１：この工程を、実施例１７の工程１と同じ様式で行った。
【０１４１】
工程２〜４：これらの工程を、実施例９の工程２〜４と同じ様式で行った。
【０１４２】
（精製手順）
各化合物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｄｙｎａｍａｘ）調製二元ＨＰＬＣシステムを用いて、調製逆相ＨＰＬＣによって精製した。この精製を、水／ＴＦＡ混合物（Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ））およびアセトニトリル／ＴＦＡ（ＣＨ３ＣＮ中０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ｂ））で平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０μフェニル−ヘキシル、５０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（粒子１０μ）を用いて行った。溶出を、２８〜３８％Ｂ勾配で１８０分間にわたって実行することによって５０ｍＬ／分で達成した。ペプチドを含む画分を、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍでＵＶ吸光度（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）によって検出した。
【０１４３】
この画分を、２５ｍＬのアリコートで収集した。所望の産物を含む画分を、ＬＣ／ＭＳ上に直接注入した後に質量検出によって同定した。選択した画分を、分析ＨＰＬＣ（２０分間にわたり、２０〜６０％ Ｂ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ フェニル−ヘキシル、１０ｍｍ×２５０ｍｍカラム、０．５ｍＬ／分）によって連続的に分析して、プールについて９０％以上の純度で画分を同定した。このプールを、液体窒素を用いて凍結乾燥し、そして少なくとも２日間連続的に凍結乾燥して白色の粉末を得た。
【０１４４】
（インビボでの結果）
実施例１〜８の化合物の腸栄養活性を、正常マウスモデルにおいて評価した。５週齢の雄性ＣＤ−１マウス（２０〜２５ｇ）を、０．９％ＮａＣｌ水溶液中に溶解した、５μｇ／用量の各化合物で、１日に２回、１０日連続で処理した。これらの化合物を、腰領域の背側野に皮下注射を介して投与した。コントロール動物は、０．２５ｍｌ／用量の０．９％ ＮａＣｌを受けた。
【０１４５】
１１日目、マウスを４時間絶食させ、そしてＣＯ２で麻酔した。小腸を除去し、清浄化しそして秤量した。小腸重量の有意な増加を、実施例１、３、５，７および８の化合物で処置した動物において、観察した。結果を、図１に示す。実施例１および３のネイティブなＧＬＰ−２ペプチドと比較した場合、見られ得るように、より明白な腸栄養効果を、２位のグリシン残基で安定化した実施例５，７および８の化合物を用いて得た。
【０１４６】
（選択したＧｌｙ２−ＧＬＰ−２アナログを用いる用量応答）
６週齢の雌性ＣＤ−１マウス（２０〜２５ｇ）を、５、２５または５０μｇ／用量の、実施例５，７および８の化合物を、１日に２回、１０日連続で処理した。これらの化合物を、０．０８３Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中に溶解し、そして腰領域の背側野に皮下注射を介して投与した。コントロール動物は、０．２５ｍｌ／用量のリン酸ナトリウム緩衝液を受けた。
【０１４７】
１１日目、給餌したマウスを、ＨａｌｏｔｈａｎｅＴＭで麻酔し、そして小腸、大腸および胃を、側腹切開後の各マウスから回収した。次いで、これらの組織を清浄化しそして秤量した。
【０１４８】
コントロールマウスと比較した、処置した群の全てにおいて、小腸の重量における統計学的に有意な増加（５３％〜８８％）を実証した（図２を参照のこと）。しかし、実施例５および７の化合物では、用量応答は観察されなかったが、実施例８の化合物について、かなりの用量応答に注目した。
【０１４９】
処置した全ての群について、大腸の重量を、２７〜４８％増加させた。また、実施例５および７の化合物について、用量応答は観察されなかったが、実施例８の化合物について、かなりの用量応答に注目した（図２を参照のこと）。
【０１５０】
これらの結果は、実施例７および８のＧＬＰ−２誘導体が、対応する、実施例５の遊離ペプチドに類似した腸栄養活性を示すことを、実証する。
【０１５１】
（ラットにおける薬物動態学プロファイル）
実施例５および８の化合物の薬物動態学のプロファイルを、正常ラットにおいて、単回の静脈内注射または皮下注射に続いて研究した。血漿濃度を、市販の抗体（抗ヒトＧＬＰ−２）を用いるラジオイムノアッセイによって決定した。
【０１５２】
（動物実験）
試験物を、０．０８３Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中に溶解し、用量レベル５００ｎｍｏｌ／ｋｇで単回の静脈内注射または皮下注射によって８〜１１週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。連続血液サンプル（１５０〜２００μｌ）を、ＥＤＴＡおよびＤＰＰ−ＩＶインヒビターを含有するチューブに、以下の時間点で収集した：投薬前、試験試薬投与後５分および３０分、ならびに試験試薬投与後１、２、４、８、２４、４８、７２および９６時間。全血を遠心分離し、血漿サンプルを回収し、そして−８０℃で分析まで保存した。
【０１５３】
（血漿分析）
実施例５および８の化合物の血漿濃度を、ウサギポリクローナル抗体（抗ヒトＧＬＰ−２（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＲＧＧ７１６７））およびトレーサーとしてのヨード化ヒトＧＬＰ−２を使用するラジオイムノアッセイによって決定した。
【０１５４】
（薬物動態学分析）
記述の薬物動態学パラメーターを、血漿濃度−時間データの分析に基づく、標準のモデル非依存性法（ＧｉｂａｌｄｉおよびＰｅｒｒｉｅｒ，１９８２）によって決定した。薬物動態学分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ９７について書かれたマクロを使用して行った。以下のパラメーターを計算した：
−Ｃｍａｘは、最大血漿濃度である；
−Ｔｍａｘは、Ｃｍａｘが観察される場合の時間である；
−Ｔ１／２は、終末半減期である；
−ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）は、０時〜無限時までの血漿濃度−時間曲線より下の面積である；
−Ｆは、完全なバイオアベイラビリティである；
−ＣＬは、全身性クリアランスである；
−ＭＲＴは、滞留時間の平均である；および
−Ｖｓｓは、分布の安定状態容積である。
【０１５５】
血漿濃度プロファイルを、図３に示し、そして、対応する薬物動態学パラメーターを、以下の表２に示す。これらの結果は、本発明に従って誘導体化されたＧＬＰ−２が、対応する遊離Ｇｌｙ２−ＧＬＰ−２ペプチドの排出および分布を効率的に減少させ、これにより全身循環におけるより高い血漿濃度およびより長い半減期を生成することを示す。
【０１５６】
（表２）
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、単回５００ｎｍｏｌ／ｋｇ用量に続く実施例５および８の化合物の平均薬物動態学パラメーターの比較
【０１５７】
【表２】
ａ媒体として示す
ｂ基準平均として示す。
【０１５８】
（イムノブロッティング）
ラット薬物動態学研究より得られた血漿サンプルを、イムノブロッティングにより分析した。血漿タンパク質を、非還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）に従って使用して分離した。血漿サンプルを、最初に滅菌水で１：１０に希釈し、そして２０μｌを、１０μｌの３×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（３０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％ ＳＤＳ（ｐＨ６．８））および２μｌのブロモフェノールブルー溶液（０．１％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）と、混合した。混合物を、沸騰する湯浴中に３分間置き、そしてゲル上にロードした。タンパク質を、１０ウェルコームを用いるミニゲル系（１．５×４．８ｍｍ）を使用して、３％スタッキングゲル中で最初に濃縮し、次いで、８％分離ゲルを通って移動した。スタッキングゲル中でタンパク質を濃縮するための１５ｍＡ／ゲルの定電流下、および分離ゲル中での約１．５ｈにわたる２０ｍＡ／ゲルの定電流下での電気泳動を、行った。
【０１５９】
引き続き、セミドライ転写装置を１００ｍＡ／ゲルで１時間使用して、タンパク質を、ニトロセルロース膜上に転写した。転写効率を、１％の赤色ＰｏｎｃｅａｕＴＭ溶液で膜を可逆的に染色することによりチェックした。
【０１６０】
（免疫化学的検出）
膜を、５％低脂肪乳を含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中に４℃で一晩浸した。ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭで５分間を３回の洗浄後、ブロットを、１％のラット血漿を含有するＴＢＳ−０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭで１：２，５００に希釈したウサギポリクローナル抗体（抗ＧＬＰ−２（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂ．，ＲＧＧ７１６７））を用いて、室温で９０分間インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭで１０分間の洗浄を３回行い、次いで、ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ中１：１００，０００希釈したペルオキシダーゼ標識化ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ，７１１−０３６−１５２）を用いて、室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、ペルオキシダーゼの化学発光物質（ｃｈｅｍｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）（ＥＣＬＴＭキット Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用する曝露を行った。フィルムを、５〜１０分間感光させた。
【０１６１】
膜を、ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ中１：４００，０００希釈したペルオキシダーゼ標識化ウサギ抗ラットアルブミン（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＹＮ−ＲＲａＡＬＢＰ）と、代替的にインキュベートした。ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭでの３回の洗浄後、上記のように、曝露を行った。
【０１６２】
（結果）
予備的なスクリーニングは、市販の抗体（抗ＧＬＰ−２）が、タンパク質に結合体化された実施例７の化合物を検出するに十分感受性ではなかったことを、ウエスタンブロッティングによって実証した。従って、実施例８の化合物を注入されたラットの血漿サンプルのみがこの方法によって分析された。
【０１６３】
図４に示される結果は、実施例８の化合物が、ｉｖ投与後のラットアルブミンに効率的に結合体化することを示す。弱いシグナルをまた、ｓｃ投与後のアルブミンにおいて観察した（示さず）。抗ラットアルブミン抗体との比較は、抗ＧＬＰ−２抗体によって検出されるバンドのほとんど（１つを除く）が、種々のアルブミン種（モノマー、ダイマーおよびポリマー）に起因することを示す。
【０１６４】
本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されるが、さらなる改変が可能であることが理解され、そして本願は、一般に、本発明の原理に従う本発明の任意のバリエーション、使用または適応をカバーすることが意図され、そして、本発明が属する分野内で公知または慣習的に実行されているもの、および本明細書中で前述した本質的特徴に適用され得るもの、および添付の特許請求の範囲に従うようもののような、本明細書の記載から逸脱する本発明の任意のバリエーション、使用または適応を含むことが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１５０２７６（Ｐ２０１０−１５０２７６Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４６７５０（Ｐ２０１０−４６７５０）
【出願日】平成２２年３月３日（２０１０．３．３）
【分割の表示】特願２００８−８８２３７（Ｐ２００８−８８２３７）の分割
【原出願日】平成１４年２月１５日（２００２．２．１５）
【出願人】（５０７３４０６３６）コンジュケム バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３日（２０１０．３．３）
【分割の表示】特願２００８−８８２３７（Ｐ２００８−８８２３７）の分割
【原出願日】平成１４年２月１５日（２００２．２．１５）
【出願人】（５０７３４０６３６）コンジュケム バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
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