胆汁酸結合能を有する新規菌株
【課題】 従来知られている乳酸菌よりも、胆汁酸結合能の高い乳酸菌の提供。
【解決手段】 高い胆汁酸結合能を持ち、特定配列の１６ＳｒＲＮＡを有するロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、ラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株、及びこれらの類似菌株。上記菌株を含有するパン、ヨーグルト、漬物、ピザ等の食品、および、上記菌株を有効成分として含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。
【解決手段】 高い胆汁酸結合能を持ち、特定配列の１６ＳｒＲＮＡを有するロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、ラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株、及びこれらの類似菌株。上記菌株を含有するパン、ヨーグルト、漬物、ピザ等の食品、および、上記菌株を有効成分として含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆汁酸結合能を有する新規菌株、並びにそれを利用した食品及び動脈硬化予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、ステロイドホルモンや胆汁酸の合成原料となる一方、その血中濃度が高い場合には、動脈硬化、心筋梗塞、脳出血などの疾患の原因となる。このため、血中のコレステロール値が一定値以上の場合には、その値を薬剤によって下げることが一般に行われている。コレスチラミンは、このようなコレステロール低下薬の一つであり、腸管内で胆汁酸と結合し、その排泄を促進することによって、胆汁酸の原料であるコレステロールを減少させる働きを持つ。コレスチラミンは、コレステロール値の低下には有効な薬剤であるが、便秘や肝機能障害などの副作用があるため、日常的な使用には適さない。
【０００３】
ところで、ラクトバチルス属に属する幾つかの菌株は、コレスチラミンと同様に胆汁酸結合能を持つことが知られている（特許文献１）。ラクトバチルス属の細菌は、ヨーグルトや漬物などの食品中に含まれている細菌であることから、人体に対する安全性は高い。従って、このラクトバチルス属の菌株を利用することにより、副作用のない安全なコレステロール低下薬を作り出せる可能性がある。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２３５５０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、特許文献１中の菌株は、コレスチラミンと同様に胆汁酸結合能を持つ。しかし、その結合能は、コレスチラミンの結合能の４〜５割程度にすぎないため、実際にコレステロール値を下げることができるかどうかは必ずしも明らかではない。
【０００６】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、より胆汁酸結合能の高い菌株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母を含むパン種から単離された菌株が非常に高い胆汁酸結合能を持ち、また、この菌株を高コレステロール飼料と共にラットに与えると、総コレステロール値の上昇が抑制されるだけでなく、善玉コレステロールと呼ばれるＨＤＬＣの値の低下が抑制されることを見出し、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１６）を提供するものである。
【０００９】
（１）ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株。
【００１０】
（２）ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【００１１】
（３）配列番号１記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする（２）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【００１２】
（４）リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、Ｄ−ツラノース、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、及びグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項２記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【００１３】
（５）ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【００１４】
（６）配列番号２記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする（５）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【００１５】
（７）グリセロール、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、及びＤ−ツラノースに対する資化性を持ち、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、アルブチン、サリシン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする（５）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【００１６】
（８）ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【００１７】
（９）配列番号３記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする（８）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【００１８】
（１０）リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、及びＤ−ツラノースに対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする（８）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【００１９】
（１１） ラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【００２０】
（１２）配列番号４記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする（１１）記載のラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【００２１】
（１３）リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｌ−アラビトール、及び２−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アルブチン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、グルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする（１１）記載のラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【００２２】
（１４）（１）乃至（１３）のいずれか記載の菌株を含有することを特徴とする食品。
【００２３】
（１５）食品が、パン、ヨーグルト、又は漬物であることを特徴とする（１４）記載の食品。
【００２４】
（１６）（１）乃至（１３）のいずれか記載の菌株を有効成分として含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の菌株は、高コレステロール食によって生じる総コレステロール値の上昇とＨＤＬＣ値の低下を抑制する作用を持つので、動脈硬化の予防などの用途に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明には、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の４菌株が含まれる。これらの菌株は、それぞれ受託番号NITE P-42、NITE P-43、NITE P-44、NITE P-45として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている（受託日：平成１６年１２月７日）。これらの菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４に示すとおりである。また、これらの菌株の糖に対する資化性（酸の生成）は、実施例７中の表８に示すとおりである。
【００２８】
本発明には、前記４菌株の類似菌株も含まれる。ここで、「類似菌株」とは、前記４菌株と同様に高い胆汁酸結合能を有する菌株をいい、前記４菌株の変異株のほか、ビール酵母パン種中から新たに単離される前記４菌株と同様の性質を持つ菌株なども含まれる。ここでいう「高い胆汁酸結合能」とは、コレスチラミン比で、通常６０％以上、好適には６４％以上であることを意味するが、これらの数値に限定されるわけではない。
【００２９】
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、細菌の分類における指標の一つである。従って、前記４菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを持つ菌株は、「類似菌株」に含まれる。即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有する菌株は、それぞれロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株である。なお、ここでいう「同等の塩基配列」とは、配列番号１〜４に記載した塩基配列と完全に同一である塩基配列のほか、完全に同一ではないが、１６ＳｒＤＮＡによる細菌分類学上同一であるとみなせる塩基配列も含まれる。通常、配列番号１〜４に記載した塩基配列と９９％以上相同である塩基配列は、配列番号１〜４に記載した塩基配列と同一であるとみなすことができる。 糖に対する資化性も、細菌の分類における指標の一つである。従って、糖に対する資化性が、前記４菌株と同一の菌株は、「類似菌株」に含まれる。即ち、（１）リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、Ｄ−ツラノース、２−ケトグルコン酸、５−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸に対する資化性を持たない菌株、（２）グリセロール、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｄ−ツラノースに対する資化性を持ち、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、アルブチン、サリシン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たない菌株、（３）リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、Ｄ−ツラノースに対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たない菌株、及び（４）リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｌ−アラビトール、２−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アルブチン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、グルコン酸、５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たない菌株は、それぞれロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株である。
【００３０】
本発明の菌株は、後述するように食品や動脈硬化予防剤に利用することができる。
【００３１】
本発明の食品は、上述した本発明の菌株を含有するものである。食品の種類は特に限定されず、パン、ヨーグルト、漬物、ピザなどを例示できる。
【００３２】
本発明の食品は、その製造工程のいずれかの時期に本発明の菌株を添加することにより製造できる。添加する菌株は、生菌でも、乾燥菌体でもいずれでもよい（但し、本発明の菌株によって乳酸醗酵を行う場合は生菌を添加する。）。添加する菌株の量は食品の種類などによって異なるが、例えば、本発明の菌株を含むパンを製造する場合、原料中に４〜５重量％の生菌を添加すればよい。
【００３３】
本発明の動脈硬化予防剤は本発明の菌株を含有するものである。本発明の動脈硬化予防剤は、経口薬に適用される一般的な製剤化方法に従って製造することができる。製剤化された動脈硬化予防剤中の本発明の菌株の含有率（濃度）は特に限定されないが、１日当たりの投与量は乾燥菌体として５〜３０ｇとするのが好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３５】
〔実施例１〕 ビール酵母パン種からの乳酸菌の分離
ビール酵母パン種（製造元：有限会社ホシノ天然酵母パン種）と滅菌水（２５℃）を２：１で混合し、よく混ぜた後、静置培養した。その培養液（生種という）を、適当な濃度に希釈後、ＡＰＴ−トマトジュース寒天培地（表１）にスプレッドし、嫌気培養（２５℃、７２時間）し、出てきたコロニーを釣菌した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
〔実施例２〕 乳酸菌株の胆汁酸結合能の測定（１）
実施例１で分離した乳酸菌株について、胆汁酸の主成分であるタウロコール酸に対する結合能を調べた。
【００３８】
０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水にタウロコール酸を加え、１．２５ｍＭのタウロコール酸溶液を調製した。この溶液１ｍｌに、Ｂ０１１１株、Ｂ１０２１株、Ｂ０３２１株、Ｂ０３１２株、Ｂ０３１１株、Ｂ１１１１株、及びＢ１３１１株の７株の乾燥菌体１５ｍｇを加え、３７℃で２．５時間インキュベートした。インキュベート後、遠心分離によって、乳酸菌を取り除き、上清中に残ったタウロコール酸の濃度（以下、これを「残存タウロコール酸濃度」という）を測定した。タウロコール酸濃度の測定は、市販のキット（「総胆汁酸−テストワコー」、製造販売：和光純薬工業株式会社）で発色させ、吸光度（５６０ｎｍ）を測定することによって行った。残存タウロコール酸濃度の測定は二回行い、その平均値を求めた。
【００３９】
また、乳酸菌を加えず、上記と同様に残存タウロコール酸の濃度を測定し、次式に従って各乳酸菌株の胆汁酸結合能を求めた。なお、乳酸菌を加えない場合の残存タウロコール酸の濃度は９６９．８μｍｏｌ／Ｌであった。
【００４０】
胆汁酸結合能（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／Ａ｝×１００
Ａ：乳酸菌を添加しない場合の残存タウロコール酸の濃度
Ｂ：乳酸菌を添加した場合の残存タウロコール酸の濃度
更に、胆汁酸吸着物質として知られているコレスチラミン１５ｍｇを、乳酸菌の代わりに用い、上記と同様に残存タウロコール酸の濃度を測定し、コレスチラミンの胆汁酸結合能を求め、この値を１００とした場合の各乳酸菌株の胆汁酸結合能の相対値（コレスチラミン比）も求めた。なお、コレスチラミンの胆汁酸結合能は９３．１％であった。以上の結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
表２に示すように、いずれの菌株も高い胆汁酸結合能を示した。
【００４３】
〔実施例３〕 乳酸菌株の胆汁酸結合能の測定（２）
乳酸菌株として、Ｂ０６１１株、Ｂ０７１１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株、及びＢ１２１１株の５株を用い、他は実施例２と同様にして、各菌株の胆汁酸結合能等を求めた。なお、このときの乳酸菌を添加しない場合の残存タウロコール酸の濃度は１０９８μｍｏｌ／Ｌであり、また、コレスチラミンの胆汁酸結合能は１０２．４％であった。結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
実施例２の場合と同様、いずれの菌株も高い胆汁酸結合能及びコレスチラミン比を示した。
【００４６】
〔実施例４〕 乳酸菌株の胆汁酸結合能の測定（３）
実施例２及び３で高い胆汁酸結合能を示した５株について、再度胆汁酸結合能を測定した。なお、このときの乳酸菌を添加しない場合の残存タウロコール酸の濃度は１１３９μｍｏｌ／Ｌであり、また、コレスチラミンの胆汁酸結合能は９４．５％であった。結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
【００４８】
表４に示すように、いずれの菌株も高い胆汁酸結合能を示した。
【００４９】
〔実施例５〕 乳酸菌株の胆汁酸結合能の測定（４）
実施例２及び４で高い胆汁酸結合能を示したＢ１０２１株、納豆菌ＩＯＫ−１株（市販のオーケー水戸納豆（製造者：株式会社オーサト）から分離）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＪＣＭ１１４９株（理化学研究所微生物系統保存施設より入手）、大腸菌Ｋ１２（λ）株の４株を用い、実施例２と同様にして、各菌株の胆汁酸結合能を調べた。ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９株は、特開２００３−２３５５０１号公報において使用されている菌株である。なお、このときの乳酸菌を添加しない場合の残存タウロコール酸の濃度は１０３７μｍｏｌ／Ｌであり、また、コレスチラミンの胆汁酸結合能は８８．６３％であった。結果を表５に示す。
【００５０】
【表５】
【００５１】
表５に示すように、Ｂ１０２１株は、他の菌株と比較して、胆汁酸結合能が著しく高かった。ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９株は、特開２００３−２３５５０１号公報中で高い胆汁酸結合能を示していたが、Ｂ１０２１株は、それよりも３倍以上も高い胆汁酸結合能を示した。
【００５２】
〔実施例６〕 ＭＲＳ培地での生育
乳酸菌同定キットであるＡＰＩ５０ＣＨ（輸入販売：日本ビオメリュー株式会社）を用いた各乳酸菌株の同定を行う前に、ＭＲＳ培地（表７）において各乳酸菌株が生育できるかどうかを調べた。ＡＰＩ５０ＣＨによる乳酸菌の同定は、ＡＰＩ５０ＣＨＬ培地を用いて行うが、ＡＰＩ５０ＣＨＬ培地はＭＲＳ培地にブロモクレゾールパープルを加えたものである。従って、ＡＰＩ５０ＣＨによる同定は、菌株がＭＲＳ培地で生育可能であることが前提となる。
【００５３】
表６に、各乳酸菌株のＭＲＳ培地における生育性を示す。また、各菌株の収量も併せて表５に示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
表６に示すように、幾つかの菌株はＭＲＳ培地で生育できなかった。生育できない原因はＭＲＳ培地中に含まれる酢酸ナトリウムにあると予想されたので、以下の実験ではＢ０３２１、Ｂ０９１１についてはＡＰＩ５０ＣＨＬ培地の代わりに、この培地から酢酸ナトリウムを除いた培地（以下、この培地を「ＭＡＰＩ培地」という）を使用することとした。
【００５６】
【表７】
【００５７】
〔実施例７〕 乳酸菌株の糖の資化性試験
実施例１、２及び３で高い胆汁酸結合能を示したＢ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株及びＢ１０２１株の４株について、ＡＰＩ５０ＣＨを用いて糖の資化性を調べた（但し、前述したようにB0321株、B0911株についてはＡＰＩ５０ＣＨＬ培地ではなく、ＭＡＰＩ培地を使用した。）。
【００５８】
なお、上記４株のいずれも、グラム染色：陽性、内生胞子形成：なし、カタラーゼの有無：なし、酸の生成：あり、形状：球菌あるいは桿菌、といった乳酸菌の特有の性質を示した。
【００５９】
各菌株の糖の資化性試験の結果を表８に示す。
【００６０】
【表８】
【００６１】
以上の糖の資化性（酸生成）試験からＢ１０２１株はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）と同定された（同定確率：９９％）。Ｂ０８１１株はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（同定確率：８５％）又はラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）（同定確率：１５％）である可能性が示唆された。また、Ｂ０３２１株とＢ０９１１株は、ＡＰＩのデータベース上に対応する菌種がなかった。
【００６２】
Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株の糖資化性（酸生成）データとロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）の文献データ（John A. E. Farrow et al., International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 39, p.279-283 (1989) )との比較を表９に示す。
【００６３】
この結果は、Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株の糖資化性（酸生成）データが、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスに類似する点もあるが、多くの糖においてその反応が異なることを示している。
【００６４】
【表９】
（APIによる４８時間反応のデータを示す。＋、−はそれぞれ陽性、陰性。Leu. pseudomesenteroidesの欄の数字は同種に属する７株の菌株中で陽性を示した菌株の率（％）を表しており、＋および−は、それが１００％と０％であることを表す。また、括弧内の数字は７２時間後の資化率を表す。）
【００６５】
〔実施例８〕 乳酸菌株の１６ＳｒＤＮＡのホモロジー検索
Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株及びＢ１０２１株の４株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００６６】
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の決定は、以下のように行った。
【００６７】
Ａ.菌体からのゲノム抽出
（１）ＡＰＴ寒天培地で嫌気培養（30℃、48時間）して得たコロニーをＡＰＴ液体培地50ml中で静置培養（30℃、48時間）した。
【００６８】
（２）その培養液を遠心（9000×g、5分間）し、得られたペレットを緩衝液1ml（pH7.5、10ｍM Tris-HCl、150mM NaCl）に懸濁した後、Tris飽和フェノール150μl（pH7.5）を加えた。
【００６９】
（３）その後、-80℃のディープフリーザーに入れての凍結、30℃のウォーターバスでの融解の作業を3回行った後に、0.3gのジルコニウムビーズを加えてbead-beating（1800rpm、5分間）を行った。
【００７０】
（４）CI solution 150μl（体積比でクロロホルム：イソアミルアルコール＝24：1）を加えて、軽く撹拌し遠心（4℃、15000rpm、5分間）し、水層を採取した。
【００７１】
（５）採取した水層に3M酢酸ナトリウム水溶液100μl（pH5.2）を加えた後、Tris飽和フェノール150μl、CI solution 150μlを加えて軽く撹拌し遠心（4℃、15000rpm、5分間）し水層を採取した。
【００７２】
（６）採取した水層にその2.5倍量のエタノールを加え、冷却（-80℃、10分）した後、遠心（4℃、15000rpm、5分）し、水層を静かに捨て、沈殿物をTE溶液500μlで溶解させた。
【００７３】
（７）DNase-free RNase（Takara） 5units加え、インキュベート（37℃、15分間）した。
【００７４】
（８）（５）と（６）の操作を再度行い（液量はすべて半分）、得られた沈殿物を真空条件下に３０分おいて乾燥させ、30μlの滅菌水に溶解させた。
【００７５】
Ｂ．１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の特異的増幅とゲルからの抽出
（１）ＰＣＲに用いた反応混合液とプログラムは以下の通りである。
【００７６】
ａ．反応混合液
ゲノム水溶液（Ａで得られた水溶液をさらに50倍希釈したもの）・・・1μl
プライマー・・・各1.5pmol
PerfectShot ExTaq kit（Takara）・・・25μl
滅菌水・・・反応混合液量が50μlになるようメスアップ
ｂ．ＰＣＲのプログラム
94℃で5分反応させた後、「94℃で30秒、72℃で1分」という反応を1サイクルとして25サイクル行い、その後72℃で7分反応させた。
【００７７】
なお、プライマーとしては、以下に示す16S 27f BamHと16S 1525r Hindを使用した。
【００７８】
16S 27f BamH：5’-TTAGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号５）
16S 1525r Hind：5’-CGGAAGCTTAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’（配列番号６）
【００７９】
（２）0.9%アガロースゲルのウェルにＰＣＲ反応溶液を注入し、電気泳動した。
【００８０】
（３）エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下で目的のＰＣＲ産物が増幅されていることを確認後、その部分を切り取り一辺2mm程度になるまで細かく切り刻んだ後、飽和フェノール300μlに入れよく撹拌した。
【００８１】
（４）凍結（-80℃、20分）、融解（30℃、5分）後よく撹拌し、遠心（15000×g、5分間）した。水層を採取し300μlのCI solutionを加えてよく撹拌し、再度遠心（15000×g、5分間）した。そして、また水層を採取した。
【００８２】
（５）採取した水層にTris飽和フェノール150μl、CI solution 150μlを加えて撹拌し、遠心（15000×g、5分間）後、水層採取の操作を２回繰り返した。
【００８３】
（６）採取した水層にその10分の1量の3M 酢酸ナトリウム水溶液を加えた後、その2.5倍量のエタノールを加えて冷却（-80℃、10分）し、遠心（15000×g、5分間）した。その後、水層部分を捨て沈殿物を採取した。
【００８４】
（７）得られた沈殿物を真空条件下に30分おいて乾燥させ、30μlの滅菌水に溶解させた。
【００８５】
（８）その溶解液の一部を使い260nmの吸光度を測定し、『ＤＮＡ濃度（μg
/ml）＝ＯＤ260×50』（改訂遺伝子工学実験ノート上、第２版第２刷、田村隆明編、羊土社、２００２）をもとにＤＮＡ濃度を算出した。
【００８６】
Ｃ．シークエンス反応と塩基配列決定
（１）シークエンス反応
ａ．反応混合液
鋳型ＤＮＡ溶液・・・20ng
プライマー（Sigma）・・・3.2 pmol
BigDye Terminator v3.1（Applied Biosystem）・・・4μl
Buffer（Applied Biosystem）・・・2μl
滅菌水・・・反応混合液総量が20μl
ｂ．シークエンス反応のプログラム
96℃で1分反応させた後、「96℃で30秒、60℃で４分」という反応を１サイクルとして25サイクル行った。
【００８７】
（２）BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 日本語版プロトコール（Applied Biosystem）のEthanol/EDTA/Sodium Acetate法に従って、反応産物を精製した。
【００８８】
（３）精製物をホルムアミド15μlに溶解し、ABI 310を用いて塩基配列を決定した。
【００８９】
なお、プライマーとしては、以下に示す16S 27f BamH、LAB0589f、LAB0677rf
EUB0933f、LAB0951r、及び16S 1525r Hindを使用した。
【００９０】
16S 27f BamH：5’-TTAGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号７）
LAB0589f：5’-TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’（配列番号８）
LAB0677rf：5’-CACCGCTACACATGGAG-3’（配列番号９）
EUB0933f：5’-GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG-3’（配列番号１０）
LAB0951r：5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’（配列番号１１）
16S 1525r Hind:5’-CGGAAGCTTAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’（配列番号１２）
Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株及びＢ１０２１株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４に示す。
【００９１】
これらの配列について、ｂｌａｓｔｎを用いてＧｅｎＢａｎｋ等のＤＮＡデータベースに対してホモロジー検索を行った。その結果、Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、及びＢ０９１１株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列はいずれもロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）のそれと９９．５％の相同性を示した。また、Ｂ１０２１株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列はラクトバチルス・プランタルムのそれと９９．４％の相同性を示した。
【００９２】
以上の結果から、Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、及びＢ０９１１株の３株は、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスに近い菌株である可能性もあるが、表９のように糖の資化性（酸生成）試験では不一致の点も多いので、これらの菌株は、ロイコノストックｓｐ．と同定した。
【００９３】
Ｂ１０２１株は、１６ＳｒＤＮＡのホモロジー検索及び糖の資化性試験のいずれにおいても、ラクトバチルス・プランタルムという結果がでたので、この菌株はラクトバチルス・プランタルムと同定した。
【００９４】
〔実施例９〕 Ｂ１０２１株を用いたラット実験
７週齢のＳＤ雄ラット（日本クレア株式会社）を購入し、１週間予備飼育をした後実験に供した。飼育は、５：００−１９：００点灯、２２±２℃、湿度５０−７０％の条件で行った。ラットを１群６匹で、それを３群に分け、それぞれ表１０に示す３種類の高コレステロール飼料（Ａ．パン粉添加飼料、Ｂ．乳酸菌入りパン粉添加飼料、Ｃ．乾燥菌体添加飼料）を２１日間、自由摂食させた（以下、Ａ．パン粉添加飼料を摂食させた群を「Ａ群」、乳酸菌入りパン粉添加飼料を摂食させた群を「Ｂ群」、Ｃ．乾燥菌体添加飼料を摂食させた群を「Ｃ群」という）。
【００９５】
摂食量は毎日個別に測定し、体重も経時的に測定した。採血は軽いエーテル麻酔下で尾静脈より行い、０、７、１４、２１日目及び、２１日目の採血の後一昼夜絶食させた後２２日目に再び採血を行った。また２２日目の採血の後ただちに剖検し、主要臓器の重量を測定した。
【００９６】
血液はただちに遠心後、富士ドライケム（富士写真フィルム株式会社）を用いて血液の生化学値（血糖値、中性脂肪値、総コレステロール値、ＨＤＬＣ値、ＧＯＴ値、ＧＰＴ値）を測定した。
【００９７】
【表１０】
【００９８】
なお、飼料Ａ、Ｃの中で使われるパンは表１１に示す配合率の製パン原料から製造した。飼料Ｂの中で使われるパンは、表１１に示す配合率の製パン原料に、Ｂ１０２１株を加えた原料から製造した。Ｂ１０２１株の添加量は、水を除いた原料の重量を１００％とした場合の５重量％（生乳酸菌体）とした。また、パン製造は松下電気産業株式会社ナショナル自動ホームベーカリー（松下電気産業株式会社製造）を使用し、原料の総重量４８０ｇずつ製造した。
【００９９】
【表１１】
【０１００】
飼料Ｂ及びＣで使用するＢ１０２１株は、ＡＰＴ培地（表１２）で３０℃、４８時間培養した菌体を用いた。飼料Ｃで使用する乾燥菌体は、前記培養によって得られる菌体を１００℃で一夜乾燥させた後、粉砕したものを使用した。
【０１０１】
パン粉は出来上がったパンを１０５℃で一夜乾燥させた後、ミキサーで粉末にしたものを使用した。
【０１０２】
飼料配合調製はニッチク薬品工業株式会社に依頼し行った。また、パン製造の酵母は生イースト（オリエンタル酵母工業株式会社）を使用した。
【０１０３】
採取した血液の生化学値等の結果を以下に示す。
【０１０４】
（１）血糖値の経時的変化
０日から２１日までの血糖値の経時的変化を図１に示す。図に示すように、各群とも０〜２１日間血糖値は一定の値で推移した。
【０１０５】
（２）中性脂肪値の経時的変化
０日から２１日までの中性脂肪値の経時的変化を図２に示す。図に示すように、各群とも経時的に増加する傾向を示したが、その増加率は、Ｃ群で、他の２群に比べて有意差は認められないものの、やや抑制される傾向を示した。
【０１０６】
（３）総コレステロール値の経時的変化
０日から２１日までの総コレステロール値の経時的変化を図３に示す。図に示すように、７日目には６０％ほど増加し、１４、２１日目ではさらに増加傾向を示した。このことから３群とも高コレステロール食の影響を受けているものと考えられた。しかしながら、飼料の違いによる差は認められなかった。
【０１０７】
（４）ＨＤＬＣ値の経時的変化
０日から２１日までの総コレステロール値の経時的変化を図４に示す。図に示すように、善玉コレステロールであるＨＤＬＣ値は、３群とも経時的に減少する傾向を見せた。しかしながら、２１日目では、Ｂ群ではＡ群に比べ有意に高い値を示し、また、Ｃ群も、Ａ群に比べて高い値を示す傾向があった。
【０１０８】
また、ＨＤＬＣ値及び総コレステロール値から動脈硬化指数を算出し、動脈硬化指数の経時的変化も調べた（図には示さない。）。その結果、３群とも経時的に増加する傾向があったが、その増加はＢ群では有意に抑制され、Ｃ群でも増加抑制傾向がみられた。
【０１０９】
（５）ＧＯＴ値及びＧＰＴ値の経時的変化
０日から２１日までのＧＯＴ値及びＧＰＴ値の経時的変化をそれぞれ図５及び図６に示す。ＧＯＴ値及びＧＰＴ値は肝機能の指標になる酵素活性であるが、図に示すように、それらは実験期間中は特に大きな変化を認められず、各群間にも差がなかった。
【０１１０】
（６）絶食時に採取した血液の生化学値
血液生化学性状については、絶食時の値で比較することが常法である。そこで、実験２２日目の絶食時における各群の血液の生化学値を比較した。各群の血糖値、中性脂肪値、総コレステロール値、ＨＤＬＣ値、ＧＯＴ値、ＧＰＴ値、及び動脈硬化指数を図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、及び図１３に示す。
【０１１１】
中性脂肪値、総コレステロール値では、Ｂ群及びＣ群は、有意差は認められないものの、Ａ群と比較して低い値を示した（図８及び９）。また、ＨＤＬＣ（善玉コレステロール）値では、Ｂ群及びＣ群は、Ａ群に比べ有意に高い値を示した（図１０）。GOT値とGPT値については、A群、B群、C群の間に有意差は認められなかった（図１１および１２）。
【０１１２】
（７）剖検所見
剖検時の体重、肝臓、腎臓の重量については、有意差は認められないものの、Ａ群に比べてＢ群及びＣ群はわずかに低い値を示した。肝臓は、正常時において表面は滑らかで明るい赤褐色を示すが、３群の肝臓は、異常に白く、また白い斑点が肝全体を覆い明らかに異常所見を示すものであった。また組織標本を作製し、光学顕微鏡による観察の結果、肝脂肪内に脂肪顆粒が多数認められ、精査を要するものの、脂肪肝の疑いが認められた。体脂肪（精巣上体脂肪＋腎脂肪）についても３群で大きな変化を認めなかった。
【０１１３】
【表１２】
【０１１４】
〔実施例１０〕 Ｂ１０２１株を用いたヨーグルトの作製
Ｂ１０２１株をＡＰＴ培地（表１２）に植菌し、３０℃で２４時間培養した後、その培養液５ｍｌを５００ｍｌの牛乳（メグミルク、日本ミルクコミュニティ株式会社製造）と混合した。その後、３０℃で保温し、ｐＨを経時的に測定した。この結果を表１３に示す。
【０１１５】
【表１３】
【０１１６】
表１３に示すように、菌接種から４日目にｐＨが４．５以下になった。参考のために市販のヨーグルト（明治ブルガリアヨーグルト微糖）のｐＨを調べてみたところ、そのｐＨは４．５であった。このことから、菌接種から４日目には、市販のヨーグルトと同様の品質のヨーグルトが生成していたものと考えられる。
【０１１７】
上記のように牛乳のみで培養した場合、ヨーグルトができるまでにかなりの時間を要した。そこで、種々の添加物を牛乳に加え、菌接種から２４時間後のｐＨを測定し、ヨーグルト生成までの時間が短縮できるかどうかを検討した。添加物としては、市販のトマトジュース（日本デルモンテ株式会社製造）、Bacto Tryptone、Bacto Yeast Extractを用いた。菌接種から２４時間後のｐＨを表１４に示す。
【０１１８】
【表１４】
【０１１９】
表１４に示すように、トマトジュース、Bacto Tryptone、Bacto Yeast Extractのいずれを添加した場合も、２４時間後のｐＨは４前後まで低下していた。この結果から、トマトジュース等の添加物を加えることにより、２４時間程度で十分な品質のヨーグルトを作製できると考えられる。
【０１２０】
〔実施例１１〕 Ｂ１０２１株の食塩生育限界、ｐＨ耐性試験
Ｂ１０２１株について食塩生育限界試験と、ｐＨ耐性試験を行った。実験では種培養として、ＡＰＴ培地１０ｍｌ（１６．５ｍｌ試験管使用）に一白金耳Ｂ１０２１株を接種後、シリコ栓（信越ポリマー株式会社）をし、３０℃で２４時間培養した。そして、ＮａＣｌ濃度、ｐＨをそれぞれ変えた１０ｍｌのＡＰＴ培地に前培養物を１００μｌ接種した。その後、３０℃で培養した。
【０１２１】
ｐＨ耐性試験の結果を表１５に、食塩生育限界試験の結果を表１６に示す。
【０１２２】
【表１５】
【０１２３】
【表１６】
【０１２４】
表１５に示すように、Ｂ１０２１株はｐＨ３．５程度まで生育可能であった。また、表１６に示すように、Ｂ１０２１株は食塩濃度９．５％程度まで生育可能であった。一般的な漬物のｐＨは３．５〜４．５、食塩濃度は５〜９％程度であることから、Ｂ１０２１株は漬物の作製に使用できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】Ａ〜Ｃ群の血糖値の経時的変化を示す図。
【図２】Ａ〜Ｃ群の中性脂肪値の経時的変化を示す図。
【図３】Ａ〜Ｃ群の総コレステロール値の経時的変化を示す図。
【図４】Ａ〜Ｃ群のＨＤＬＣ値の経時的変化を示す図。
【図５】Ａ〜Ｃ群のＧＯＴ値の経時的変化を示す図。
【図６】Ａ〜Ｃ群のＧＰＴ値の経時的変化を示す図。
【図７】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群の血糖値を示す図。
【図８】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群の中性脂肪値を示す図。
【図９】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群の総コレステロール値を示す図。
【図１０】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群のＨＤＬＣ値を示す図。
【図１１】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群のＧＯＴ値を示す図。
【図１２】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群のＧＰＴ値を示す図。
【図１３】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群の動脈硬化指数を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆汁酸結合能を有する新規菌株、並びにそれを利用した食品及び動脈硬化予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、ステロイドホルモンや胆汁酸の合成原料となる一方、その血中濃度が高い場合には、動脈硬化、心筋梗塞、脳出血などの疾患の原因となる。このため、血中のコレステロール値が一定値以上の場合には、その値を薬剤によって下げることが一般に行われている。コレスチラミンは、このようなコレステロール低下薬の一つであり、腸管内で胆汁酸と結合し、その排泄を促進することによって、胆汁酸の原料であるコレステロールを減少させる働きを持つ。コレスチラミンは、コレステロール値の低下には有効な薬剤であるが、便秘や肝機能障害などの副作用があるため、日常的な使用には適さない。
【０００３】
ところで、ラクトバチルス属に属する幾つかの菌株は、コレスチラミンと同様に胆汁酸結合能を持つことが知られている（特許文献１）。ラクトバチルス属の細菌は、ヨーグルトや漬物などの食品中に含まれている細菌であることから、人体に対する安全性は高い。従って、このラクトバチルス属の菌株を利用することにより、副作用のない安全なコレステロール低下薬を作り出せる可能性がある。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２３５５０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、特許文献１中の菌株は、コレスチラミンと同様に胆汁酸結合能を持つ。しかし、その結合能は、コレスチラミンの結合能の４〜５割程度にすぎないため、実際にコレステロール値を下げることができるかどうかは必ずしも明らかではない。
【０００６】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、より胆汁酸結合能の高い菌株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母を含むパン種から単離された菌株が非常に高い胆汁酸結合能を持ち、また、この菌株を高コレステロール飼料と共にラットに与えると、総コレステロール値の上昇が抑制されるだけでなく、善玉コレステロールと呼ばれるＨＤＬＣの値の低下が抑制されることを見出し、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１６）を提供するものである。
【０００９】
（１）ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株。
【００１０】
（２）ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【００１１】
（３）配列番号１記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする（２）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【００１２】
（４）リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、Ｄ−ツラノース、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、及びグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項２記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【００１３】
（５）ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【００１４】
（６）配列番号２記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする（５）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【００１５】
（７）グリセロール、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、及びＤ−ツラノースに対する資化性を持ち、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、アルブチン、サリシン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする（５）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【００１６】
（８）ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【００１７】
（９）配列番号３記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする（８）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【００１８】
（１０）リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、及びＤ−ツラノースに対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする（８）記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【００１９】
（１１） ラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【００２０】
（１２）配列番号４記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする（１１）記載のラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【００２１】
（１３）リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｌ−アラビトール、及び２−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アルブチン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、グルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする（１１）記載のラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【００２２】
（１４）（１）乃至（１３）のいずれか記載の菌株を含有することを特徴とする食品。
【００２３】
（１５）食品が、パン、ヨーグルト、又は漬物であることを特徴とする（１４）記載の食品。
【００２４】
（１６）（１）乃至（１３）のいずれか記載の菌株を有効成分として含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の菌株は、高コレステロール食によって生じる総コレステロール値の上昇とＨＤＬＣ値の低下を抑制する作用を持つので、動脈硬化の予防などの用途に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明には、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の４菌株が含まれる。これらの菌株は、それぞれ受託番号NITE P-42、NITE P-43、NITE P-44、NITE P-45として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている（受託日：平成１６年１２月７日）。これらの菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４に示すとおりである。また、これらの菌株の糖に対する資化性（酸の生成）は、実施例７中の表８に示すとおりである。
【００２８】
本発明には、前記４菌株の類似菌株も含まれる。ここで、「類似菌株」とは、前記４菌株と同様に高い胆汁酸結合能を有する菌株をいい、前記４菌株の変異株のほか、ビール酵母パン種中から新たに単離される前記４菌株と同様の性質を持つ菌株なども含まれる。ここでいう「高い胆汁酸結合能」とは、コレスチラミン比で、通常６０％以上、好適には６４％以上であることを意味するが、これらの数値に限定されるわけではない。
【００２９】
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、細菌の分類における指標の一つである。従って、前記４菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを持つ菌株は、「類似菌株」に含まれる。即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有する菌株は、それぞれロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株である。なお、ここでいう「同等の塩基配列」とは、配列番号１〜４に記載した塩基配列と完全に同一である塩基配列のほか、完全に同一ではないが、１６ＳｒＤＮＡによる細菌分類学上同一であるとみなせる塩基配列も含まれる。通常、配列番号１〜４に記載した塩基配列と９９％以上相同である塩基配列は、配列番号１〜４に記載した塩基配列と同一であるとみなすことができる。 糖に対する資化性も、細菌の分類における指標の一つである。従って、糖に対する資化性が、前記４菌株と同一の菌株は、「類似菌株」に含まれる。即ち、（１）リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、Ｄ−ツラノース、２−ケトグルコン酸、５−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸に対する資化性を持たない菌株、（２）グリセロール、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｄ−ツラノースに対する資化性を持ち、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、アルブチン、サリシン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たない菌株、（３）リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、Ｄ−ツラノースに対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たない菌株、及び（４）リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｌ−アラビトール、２−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アルブチン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、グルコン酸、５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たない菌株は、それぞれロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株である。
【００３０】
本発明の菌株は、後述するように食品や動脈硬化予防剤に利用することができる。
【００３１】
本発明の食品は、上述した本発明の菌株を含有するものである。食品の種類は特に限定されず、パン、ヨーグルト、漬物、ピザなどを例示できる。
【００３２】
本発明の食品は、その製造工程のいずれかの時期に本発明の菌株を添加することにより製造できる。添加する菌株は、生菌でも、乾燥菌体でもいずれでもよい（但し、本発明の菌株によって乳酸醗酵を行う場合は生菌を添加する。）。添加する菌株の量は食品の種類などによって異なるが、例えば、本発明の菌株を含むパンを製造する場合、原料中に４〜５重量％の生菌を添加すればよい。
【００３３】
本発明の動脈硬化予防剤は本発明の菌株を含有するものである。本発明の動脈硬化予防剤は、経口薬に適用される一般的な製剤化方法に従って製造することができる。製剤化された動脈硬化予防剤中の本発明の菌株の含有率（濃度）は特に限定されないが、１日当たりの投与量は乾燥菌体として５〜３０ｇとするのが好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３５】
〔実施例１〕 ビール酵母パン種からの乳酸菌の分離
ビール酵母パン種（製造元：有限会社ホシノ天然酵母パン種）と滅菌水（２５℃）を２：１で混合し、よく混ぜた後、静置培養した。その培養液（生種という）を、適当な濃度に希釈後、ＡＰＴ−トマトジュース寒天培地（表１）にスプレッドし、嫌気培養（２５℃、７２時間）し、出てきたコロニーを釣菌した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
〔実施例２〕 乳酸菌株の胆汁酸結合能の測定（１）
実施例１で分離した乳酸菌株について、胆汁酸の主成分であるタウロコール酸に対する結合能を調べた。
【００３８】
０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水にタウロコール酸を加え、１．２５ｍＭのタウロコール酸溶液を調製した。この溶液１ｍｌに、Ｂ０１１１株、Ｂ１０２１株、Ｂ０３２１株、Ｂ０３１２株、Ｂ０３１１株、Ｂ１１１１株、及びＢ１３１１株の７株の乾燥菌体１５ｍｇを加え、３７℃で２．５時間インキュベートした。インキュベート後、遠心分離によって、乳酸菌を取り除き、上清中に残ったタウロコール酸の濃度（以下、これを「残存タウロコール酸濃度」という）を測定した。タウロコール酸濃度の測定は、市販のキット（「総胆汁酸−テストワコー」、製造販売：和光純薬工業株式会社）で発色させ、吸光度（５６０ｎｍ）を測定することによって行った。残存タウロコール酸濃度の測定は二回行い、その平均値を求めた。
【００３９】
また、乳酸菌を加えず、上記と同様に残存タウロコール酸の濃度を測定し、次式に従って各乳酸菌株の胆汁酸結合能を求めた。なお、乳酸菌を加えない場合の残存タウロコール酸の濃度は９６９．８μｍｏｌ／Ｌであった。
【００４０】
胆汁酸結合能（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／Ａ｝×１００
Ａ：乳酸菌を添加しない場合の残存タウロコール酸の濃度
Ｂ：乳酸菌を添加した場合の残存タウロコール酸の濃度
更に、胆汁酸吸着物質として知られているコレスチラミン１５ｍｇを、乳酸菌の代わりに用い、上記と同様に残存タウロコール酸の濃度を測定し、コレスチラミンの胆汁酸結合能を求め、この値を１００とした場合の各乳酸菌株の胆汁酸結合能の相対値（コレスチラミン比）も求めた。なお、コレスチラミンの胆汁酸結合能は９３．１％であった。以上の結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
表２に示すように、いずれの菌株も高い胆汁酸結合能を示した。
【００４３】
〔実施例３〕 乳酸菌株の胆汁酸結合能の測定（２）
乳酸菌株として、Ｂ０６１１株、Ｂ０７１１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株、及びＢ１２１１株の５株を用い、他は実施例２と同様にして、各菌株の胆汁酸結合能等を求めた。なお、このときの乳酸菌を添加しない場合の残存タウロコール酸の濃度は１０９８μｍｏｌ／Ｌであり、また、コレスチラミンの胆汁酸結合能は１０２．４％であった。結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
実施例２の場合と同様、いずれの菌株も高い胆汁酸結合能及びコレスチラミン比を示した。
【００４６】
〔実施例４〕 乳酸菌株の胆汁酸結合能の測定（３）
実施例２及び３で高い胆汁酸結合能を示した５株について、再度胆汁酸結合能を測定した。なお、このときの乳酸菌を添加しない場合の残存タウロコール酸の濃度は１１３９μｍｏｌ／Ｌであり、また、コレスチラミンの胆汁酸結合能は９４．５％であった。結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
【００４８】
表４に示すように、いずれの菌株も高い胆汁酸結合能を示した。
【００４９】
〔実施例５〕 乳酸菌株の胆汁酸結合能の測定（４）
実施例２及び４で高い胆汁酸結合能を示したＢ１０２１株、納豆菌ＩＯＫ−１株（市販のオーケー水戸納豆（製造者：株式会社オーサト）から分離）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＪＣＭ１１４９株（理化学研究所微生物系統保存施設より入手）、大腸菌Ｋ１２（λ）株の４株を用い、実施例２と同様にして、各菌株の胆汁酸結合能を調べた。ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９株は、特開２００３−２３５５０１号公報において使用されている菌株である。なお、このときの乳酸菌を添加しない場合の残存タウロコール酸の濃度は１０３７μｍｏｌ／Ｌであり、また、コレスチラミンの胆汁酸結合能は８８．６３％であった。結果を表５に示す。
【００５０】
【表５】
【００５１】
表５に示すように、Ｂ１０２１株は、他の菌株と比較して、胆汁酸結合能が著しく高かった。ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９株は、特開２００３−２３５５０１号公報中で高い胆汁酸結合能を示していたが、Ｂ１０２１株は、それよりも３倍以上も高い胆汁酸結合能を示した。
【００５２】
〔実施例６〕 ＭＲＳ培地での生育
乳酸菌同定キットであるＡＰＩ５０ＣＨ（輸入販売：日本ビオメリュー株式会社）を用いた各乳酸菌株の同定を行う前に、ＭＲＳ培地（表７）において各乳酸菌株が生育できるかどうかを調べた。ＡＰＩ５０ＣＨによる乳酸菌の同定は、ＡＰＩ５０ＣＨＬ培地を用いて行うが、ＡＰＩ５０ＣＨＬ培地はＭＲＳ培地にブロモクレゾールパープルを加えたものである。従って、ＡＰＩ５０ＣＨによる同定は、菌株がＭＲＳ培地で生育可能であることが前提となる。
【００５３】
表６に、各乳酸菌株のＭＲＳ培地における生育性を示す。また、各菌株の収量も併せて表５に示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
表６に示すように、幾つかの菌株はＭＲＳ培地で生育できなかった。生育できない原因はＭＲＳ培地中に含まれる酢酸ナトリウムにあると予想されたので、以下の実験ではＢ０３２１、Ｂ０９１１についてはＡＰＩ５０ＣＨＬ培地の代わりに、この培地から酢酸ナトリウムを除いた培地（以下、この培地を「ＭＡＰＩ培地」という）を使用することとした。
【００５６】
【表７】
【００５７】
〔実施例７〕 乳酸菌株の糖の資化性試験
実施例１、２及び３で高い胆汁酸結合能を示したＢ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株及びＢ１０２１株の４株について、ＡＰＩ５０ＣＨを用いて糖の資化性を調べた（但し、前述したようにB0321株、B0911株についてはＡＰＩ５０ＣＨＬ培地ではなく、ＭＡＰＩ培地を使用した。）。
【００５８】
なお、上記４株のいずれも、グラム染色：陽性、内生胞子形成：なし、カタラーゼの有無：なし、酸の生成：あり、形状：球菌あるいは桿菌、といった乳酸菌の特有の性質を示した。
【００５９】
各菌株の糖の資化性試験の結果を表８に示す。
【００６０】
【表８】
【００６１】
以上の糖の資化性（酸生成）試験からＢ１０２１株はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）と同定された（同定確率：９９％）。Ｂ０８１１株はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（同定確率：８５％）又はラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）（同定確率：１５％）である可能性が示唆された。また、Ｂ０３２１株とＢ０９１１株は、ＡＰＩのデータベース上に対応する菌種がなかった。
【００６２】
Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株の糖資化性（酸生成）データとロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）の文献データ（John A. E. Farrow et al., International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 39, p.279-283 (1989) )との比較を表９に示す。
【００６３】
この結果は、Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株の糖資化性（酸生成）データが、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスに類似する点もあるが、多くの糖においてその反応が異なることを示している。
【００６４】
【表９】
（APIによる４８時間反応のデータを示す。＋、−はそれぞれ陽性、陰性。Leu. pseudomesenteroidesの欄の数字は同種に属する７株の菌株中で陽性を示した菌株の率（％）を表しており、＋および−は、それが１００％と０％であることを表す。また、括弧内の数字は７２時間後の資化率を表す。）
【００６５】
〔実施例８〕 乳酸菌株の１６ＳｒＤＮＡのホモロジー検索
Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株及びＢ１０２１株の４株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００６６】
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の決定は、以下のように行った。
【００６７】
Ａ.菌体からのゲノム抽出
（１）ＡＰＴ寒天培地で嫌気培養（30℃、48時間）して得たコロニーをＡＰＴ液体培地50ml中で静置培養（30℃、48時間）した。
【００６８】
（２）その培養液を遠心（9000×g、5分間）し、得られたペレットを緩衝液1ml（pH7.5、10ｍM Tris-HCl、150mM NaCl）に懸濁した後、Tris飽和フェノール150μl（pH7.5）を加えた。
【００６９】
（３）その後、-80℃のディープフリーザーに入れての凍結、30℃のウォーターバスでの融解の作業を3回行った後に、0.3gのジルコニウムビーズを加えてbead-beating（1800rpm、5分間）を行った。
【００７０】
（４）CI solution 150μl（体積比でクロロホルム：イソアミルアルコール＝24：1）を加えて、軽く撹拌し遠心（4℃、15000rpm、5分間）し、水層を採取した。
【００７１】
（５）採取した水層に3M酢酸ナトリウム水溶液100μl（pH5.2）を加えた後、Tris飽和フェノール150μl、CI solution 150μlを加えて軽く撹拌し遠心（4℃、15000rpm、5分間）し水層を採取した。
【００７２】
（６）採取した水層にその2.5倍量のエタノールを加え、冷却（-80℃、10分）した後、遠心（4℃、15000rpm、5分）し、水層を静かに捨て、沈殿物をTE溶液500μlで溶解させた。
【００７３】
（７）DNase-free RNase（Takara） 5units加え、インキュベート（37℃、15分間）した。
【００７４】
（８）（５）と（６）の操作を再度行い（液量はすべて半分）、得られた沈殿物を真空条件下に３０分おいて乾燥させ、30μlの滅菌水に溶解させた。
【００７５】
Ｂ．１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の特異的増幅とゲルからの抽出
（１）ＰＣＲに用いた反応混合液とプログラムは以下の通りである。
【００７６】
ａ．反応混合液
ゲノム水溶液（Ａで得られた水溶液をさらに50倍希釈したもの）・・・1μl
プライマー・・・各1.5pmol
PerfectShot ExTaq kit（Takara）・・・25μl
滅菌水・・・反応混合液量が50μlになるようメスアップ
ｂ．ＰＣＲのプログラム
94℃で5分反応させた後、「94℃で30秒、72℃で1分」という反応を1サイクルとして25サイクル行い、その後72℃で7分反応させた。
【００７７】
なお、プライマーとしては、以下に示す16S 27f BamHと16S 1525r Hindを使用した。
【００７８】
16S 27f BamH：5’-TTAGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号５）
16S 1525r Hind：5’-CGGAAGCTTAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’（配列番号６）
【００７９】
（２）0.9%アガロースゲルのウェルにＰＣＲ反応溶液を注入し、電気泳動した。
【００８０】
（３）エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下で目的のＰＣＲ産物が増幅されていることを確認後、その部分を切り取り一辺2mm程度になるまで細かく切り刻んだ後、飽和フェノール300μlに入れよく撹拌した。
【００８１】
（４）凍結（-80℃、20分）、融解（30℃、5分）後よく撹拌し、遠心（15000×g、5分間）した。水層を採取し300μlのCI solutionを加えてよく撹拌し、再度遠心（15000×g、5分間）した。そして、また水層を採取した。
【００８２】
（５）採取した水層にTris飽和フェノール150μl、CI solution 150μlを加えて撹拌し、遠心（15000×g、5分間）後、水層採取の操作を２回繰り返した。
【００８３】
（６）採取した水層にその10分の1量の3M 酢酸ナトリウム水溶液を加えた後、その2.5倍量のエタノールを加えて冷却（-80℃、10分）し、遠心（15000×g、5分間）した。その後、水層部分を捨て沈殿物を採取した。
【００８４】
（７）得られた沈殿物を真空条件下に30分おいて乾燥させ、30μlの滅菌水に溶解させた。
【００８５】
（８）その溶解液の一部を使い260nmの吸光度を測定し、『ＤＮＡ濃度（μg
/ml）＝ＯＤ260×50』（改訂遺伝子工学実験ノート上、第２版第２刷、田村隆明編、羊土社、２００２）をもとにＤＮＡ濃度を算出した。
【００８６】
Ｃ．シークエンス反応と塩基配列決定
（１）シークエンス反応
ａ．反応混合液
鋳型ＤＮＡ溶液・・・20ng
プライマー（Sigma）・・・3.2 pmol
BigDye Terminator v3.1（Applied Biosystem）・・・4μl
Buffer（Applied Biosystem）・・・2μl
滅菌水・・・反応混合液総量が20μl
ｂ．シークエンス反応のプログラム
96℃で1分反応させた後、「96℃で30秒、60℃で４分」という反応を１サイクルとして25サイクル行った。
【００８７】
（２）BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 日本語版プロトコール（Applied Biosystem）のEthanol/EDTA/Sodium Acetate法に従って、反応産物を精製した。
【００８８】
（３）精製物をホルムアミド15μlに溶解し、ABI 310を用いて塩基配列を決定した。
【００８９】
なお、プライマーとしては、以下に示す16S 27f BamH、LAB0589f、LAB0677rf
EUB0933f、LAB0951r、及び16S 1525r Hindを使用した。
【００９０】
16S 27f BamH：5’-TTAGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号７）
LAB0589f：5’-TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’（配列番号８）
LAB0677rf：5’-CACCGCTACACATGGAG-3’（配列番号９）
EUB0933f：5’-GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG-3’（配列番号１０）
LAB0951r：5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’（配列番号１１）
16S 1525r Hind:5’-CGGAAGCTTAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’（配列番号１２）
Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、Ｂ０９１１株及びＢ１０２１株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４に示す。
【００９１】
これらの配列について、ｂｌａｓｔｎを用いてＧｅｎＢａｎｋ等のＤＮＡデータベースに対してホモロジー検索を行った。その結果、Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、及びＢ０９１１株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列はいずれもロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）のそれと９９．５％の相同性を示した。また、Ｂ１０２１株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列はラクトバチルス・プランタルムのそれと９９．４％の相同性を示した。
【００９２】
以上の結果から、Ｂ０３２１株、Ｂ０８１１株、及びＢ０９１１株の３株は、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスに近い菌株である可能性もあるが、表９のように糖の資化性（酸生成）試験では不一致の点も多いので、これらの菌株は、ロイコノストックｓｐ．と同定した。
【００９３】
Ｂ１０２１株は、１６ＳｒＤＮＡのホモロジー検索及び糖の資化性試験のいずれにおいても、ラクトバチルス・プランタルムという結果がでたので、この菌株はラクトバチルス・プランタルムと同定した。
【００９４】
〔実施例９〕 Ｂ１０２１株を用いたラット実験
７週齢のＳＤ雄ラット（日本クレア株式会社）を購入し、１週間予備飼育をした後実験に供した。飼育は、５：００−１９：００点灯、２２±２℃、湿度５０−７０％の条件で行った。ラットを１群６匹で、それを３群に分け、それぞれ表１０に示す３種類の高コレステロール飼料（Ａ．パン粉添加飼料、Ｂ．乳酸菌入りパン粉添加飼料、Ｃ．乾燥菌体添加飼料）を２１日間、自由摂食させた（以下、Ａ．パン粉添加飼料を摂食させた群を「Ａ群」、乳酸菌入りパン粉添加飼料を摂食させた群を「Ｂ群」、Ｃ．乾燥菌体添加飼料を摂食させた群を「Ｃ群」という）。
【００９５】
摂食量は毎日個別に測定し、体重も経時的に測定した。採血は軽いエーテル麻酔下で尾静脈より行い、０、７、１４、２１日目及び、２１日目の採血の後一昼夜絶食させた後２２日目に再び採血を行った。また２２日目の採血の後ただちに剖検し、主要臓器の重量を測定した。
【００９６】
血液はただちに遠心後、富士ドライケム（富士写真フィルム株式会社）を用いて血液の生化学値（血糖値、中性脂肪値、総コレステロール値、ＨＤＬＣ値、ＧＯＴ値、ＧＰＴ値）を測定した。
【００９７】
【表１０】
【００９８】
なお、飼料Ａ、Ｃの中で使われるパンは表１１に示す配合率の製パン原料から製造した。飼料Ｂの中で使われるパンは、表１１に示す配合率の製パン原料に、Ｂ１０２１株を加えた原料から製造した。Ｂ１０２１株の添加量は、水を除いた原料の重量を１００％とした場合の５重量％（生乳酸菌体）とした。また、パン製造は松下電気産業株式会社ナショナル自動ホームベーカリー（松下電気産業株式会社製造）を使用し、原料の総重量４８０ｇずつ製造した。
【００９９】
【表１１】
【０１００】
飼料Ｂ及びＣで使用するＢ１０２１株は、ＡＰＴ培地（表１２）で３０℃、４８時間培養した菌体を用いた。飼料Ｃで使用する乾燥菌体は、前記培養によって得られる菌体を１００℃で一夜乾燥させた後、粉砕したものを使用した。
【０１０１】
パン粉は出来上がったパンを１０５℃で一夜乾燥させた後、ミキサーで粉末にしたものを使用した。
【０１０２】
飼料配合調製はニッチク薬品工業株式会社に依頼し行った。また、パン製造の酵母は生イースト（オリエンタル酵母工業株式会社）を使用した。
【０１０３】
採取した血液の生化学値等の結果を以下に示す。
【０１０４】
（１）血糖値の経時的変化
０日から２１日までの血糖値の経時的変化を図１に示す。図に示すように、各群とも０〜２１日間血糖値は一定の値で推移した。
【０１０５】
（２）中性脂肪値の経時的変化
０日から２１日までの中性脂肪値の経時的変化を図２に示す。図に示すように、各群とも経時的に増加する傾向を示したが、その増加率は、Ｃ群で、他の２群に比べて有意差は認められないものの、やや抑制される傾向を示した。
【０１０６】
（３）総コレステロール値の経時的変化
０日から２１日までの総コレステロール値の経時的変化を図３に示す。図に示すように、７日目には６０％ほど増加し、１４、２１日目ではさらに増加傾向を示した。このことから３群とも高コレステロール食の影響を受けているものと考えられた。しかしながら、飼料の違いによる差は認められなかった。
【０１０７】
（４）ＨＤＬＣ値の経時的変化
０日から２１日までの総コレステロール値の経時的変化を図４に示す。図に示すように、善玉コレステロールであるＨＤＬＣ値は、３群とも経時的に減少する傾向を見せた。しかしながら、２１日目では、Ｂ群ではＡ群に比べ有意に高い値を示し、また、Ｃ群も、Ａ群に比べて高い値を示す傾向があった。
【０１０８】
また、ＨＤＬＣ値及び総コレステロール値から動脈硬化指数を算出し、動脈硬化指数の経時的変化も調べた（図には示さない。）。その結果、３群とも経時的に増加する傾向があったが、その増加はＢ群では有意に抑制され、Ｃ群でも増加抑制傾向がみられた。
【０１０９】
（５）ＧＯＴ値及びＧＰＴ値の経時的変化
０日から２１日までのＧＯＴ値及びＧＰＴ値の経時的変化をそれぞれ図５及び図６に示す。ＧＯＴ値及びＧＰＴ値は肝機能の指標になる酵素活性であるが、図に示すように、それらは実験期間中は特に大きな変化を認められず、各群間にも差がなかった。
【０１１０】
（６）絶食時に採取した血液の生化学値
血液生化学性状については、絶食時の値で比較することが常法である。そこで、実験２２日目の絶食時における各群の血液の生化学値を比較した。各群の血糖値、中性脂肪値、総コレステロール値、ＨＤＬＣ値、ＧＯＴ値、ＧＰＴ値、及び動脈硬化指数を図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、及び図１３に示す。
【０１１１】
中性脂肪値、総コレステロール値では、Ｂ群及びＣ群は、有意差は認められないものの、Ａ群と比較して低い値を示した（図８及び９）。また、ＨＤＬＣ（善玉コレステロール）値では、Ｂ群及びＣ群は、Ａ群に比べ有意に高い値を示した（図１０）。GOT値とGPT値については、A群、B群、C群の間に有意差は認められなかった（図１１および１２）。
【０１１２】
（７）剖検所見
剖検時の体重、肝臓、腎臓の重量については、有意差は認められないものの、Ａ群に比べてＢ群及びＣ群はわずかに低い値を示した。肝臓は、正常時において表面は滑らかで明るい赤褐色を示すが、３群の肝臓は、異常に白く、また白い斑点が肝全体を覆い明らかに異常所見を示すものであった。また組織標本を作製し、光学顕微鏡による観察の結果、肝脂肪内に脂肪顆粒が多数認められ、精査を要するものの、脂肪肝の疑いが認められた。体脂肪（精巣上体脂肪＋腎脂肪）についても３群で大きな変化を認めなかった。
【０１１３】
【表１２】
【０１１４】
〔実施例１０〕 Ｂ１０２１株を用いたヨーグルトの作製
Ｂ１０２１株をＡＰＴ培地（表１２）に植菌し、３０℃で２４時間培養した後、その培養液５ｍｌを５００ｍｌの牛乳（メグミルク、日本ミルクコミュニティ株式会社製造）と混合した。その後、３０℃で保温し、ｐＨを経時的に測定した。この結果を表１３に示す。
【０１１５】
【表１３】
【０１１６】
表１３に示すように、菌接種から４日目にｐＨが４．５以下になった。参考のために市販のヨーグルト（明治ブルガリアヨーグルト微糖）のｐＨを調べてみたところ、そのｐＨは４．５であった。このことから、菌接種から４日目には、市販のヨーグルトと同様の品質のヨーグルトが生成していたものと考えられる。
【０１１７】
上記のように牛乳のみで培養した場合、ヨーグルトができるまでにかなりの時間を要した。そこで、種々の添加物を牛乳に加え、菌接種から２４時間後のｐＨを測定し、ヨーグルト生成までの時間が短縮できるかどうかを検討した。添加物としては、市販のトマトジュース（日本デルモンテ株式会社製造）、Bacto Tryptone、Bacto Yeast Extractを用いた。菌接種から２４時間後のｐＨを表１４に示す。
【０１１８】
【表１４】
【０１１９】
表１４に示すように、トマトジュース、Bacto Tryptone、Bacto Yeast Extractのいずれを添加した場合も、２４時間後のｐＨは４前後まで低下していた。この結果から、トマトジュース等の添加物を加えることにより、２４時間程度で十分な品質のヨーグルトを作製できると考えられる。
【０１２０】
〔実施例１１〕 Ｂ１０２１株の食塩生育限界、ｐＨ耐性試験
Ｂ１０２１株について食塩生育限界試験と、ｐＨ耐性試験を行った。実験では種培養として、ＡＰＴ培地１０ｍｌ（１６．５ｍｌ試験管使用）に一白金耳Ｂ１０２１株を接種後、シリコ栓（信越ポリマー株式会社）をし、３０℃で２４時間培養した。そして、ＮａＣｌ濃度、ｐＨをそれぞれ変えた１０ｍｌのＡＰＴ培地に前培養物を１００μｌ接種した。その後、３０℃で培養した。
【０１２１】
ｐＨ耐性試験の結果を表１５に、食塩生育限界試験の結果を表１６に示す。
【０１２２】
【表１５】
【０１２３】
【表１６】
【０１２４】
表１５に示すように、Ｂ１０２１株はｐＨ３．５程度まで生育可能であった。また、表１６に示すように、Ｂ１０２１株は食塩濃度９．５％程度まで生育可能であった。一般的な漬物のｐＨは３．５〜４．５、食塩濃度は５〜９％程度であることから、Ｂ１０２１株は漬物の作製に使用できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】Ａ〜Ｃ群の血糖値の経時的変化を示す図。
【図２】Ａ〜Ｃ群の中性脂肪値の経時的変化を示す図。
【図３】Ａ〜Ｃ群の総コレステロール値の経時的変化を示す図。
【図４】Ａ〜Ｃ群のＨＤＬＣ値の経時的変化を示す図。
【図５】Ａ〜Ｃ群のＧＯＴ値の経時的変化を示す図。
【図６】Ａ〜Ｃ群のＧＰＴ値の経時的変化を示す図。
【図７】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群の血糖値を示す図。
【図８】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群の中性脂肪値を示す図。
【図９】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群の総コレステロール値を示す図。
【図１０】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群のＨＤＬＣ値を示す図。
【図１１】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群のＧＯＴ値を示す図。
【図１２】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群のＧＰＴ値を示す図。
【図１３】高コレステロール飼料給餌後、絶食時のＡ〜Ｃ群の動脈硬化指数を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株。
【請求項２】
ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【請求項３】
配列番号１記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする請求項２記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【請求項４】
リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、Ｄ−ツラノース、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、及びグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項２記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【請求項５】
ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【請求項６】
配列番号２記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする請求項５記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【請求項７】
グリセロール、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、及びＤ−ツラノースに対する資化性を持ち、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、アルブチン、サリシン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項５記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【請求項８】
ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【請求項９】
配列番号３記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする請求項８記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【請求項１０】
リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、及びＤ−ツラノースに対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項８記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【請求項１１】
ラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【請求項１２】
配列番号４記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする請求項１１記載のラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【請求項１３】
リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｌ−アラビトール、及び２−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アルブチン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、グルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項１１記載のラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか一項記載の菌株を含有することを特徴とする食品。
【請求項１５】
食品が、パン、ヨーグルト、漬物、又はピザであることを特徴とする請求項１４記載の食品。
【請求項１６】
請求項１乃至１３のいずれか一項記載の菌株を有効成分として含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。
【請求項１】
ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株、ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株、及びラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株。
【請求項２】
ロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【請求項３】
配列番号１記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする請求項２記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【請求項４】
リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、Ｄ−ツラノース、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、及びグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項２記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０３２１株の類似菌株。
【請求項５】
ロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【請求項６】
配列番号２記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする請求項５記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【請求項７】
グリセロール、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、及びＤ−ツラノースに対する資化性を持ち、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、アルブチン、サリシン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項５記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０８１１株の類似菌株。
【請求項８】
ロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【請求項９】
配列番号３記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする請求項８記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【請求項１０】
リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、及びＤ−ツラノースに対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、２−ケトグルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項８記載のロイコノストックｓｐ．Ｂ０９１１株の類似菌株。
【請求項１１】
ラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【請求項１２】
配列番号４記載の塩基配列と同等の塩基配列で表される１６ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする請求項１１記載のラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【請求項１３】
リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｌ−アラビトール、及び２−ケトグルコン酸に対する資化性を持ち、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロシド、ソルボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アルブチン、イヌリン、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、グルコン酸、及び５−ケトグルコン酸に対する資化性を持たないことを特徴とする請求項１１記載のラクトバチルス・プランタルムＢ１０２１株の類似菌株。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか一項記載の菌株を含有することを特徴とする食品。
【請求項１５】
食品が、パン、ヨーグルト、漬物、又はピザであることを特徴とする請求項１４記載の食品。
【請求項１６】
請求項１乃至１３のいずれか一項記載の菌株を有効成分として含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００６−２９６３０７（Ｐ２００６−２９６３０７Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２３４０７（Ｐ２００５−１２３４０７）
【出願日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（８０１００００２７）学校法人明治大学 (161)
【出願人】（５０３２８０８１３）有限会社ホシノ天然酵母パン種 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（８０１００００２７）学校法人明治大学 (161)
【出願人】（５０３２８０８１３）有限会社ホシノ天然酵母パン種 (1)
【Ｆターム（参考）】
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