胆汁酸耐性細菌を含有する動物用飼料添加剤
【課題】飼料に添加することにより、消化活動を補助し、好ましい作用を及ぼす細菌を分離し、動物の成長を促進するための動物用飼料添加剤を提供する。
【解決手段】胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性であるバチルス属細菌を動物用飼料添加剤に用いる。
【解決手段】胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性であるバチルス属細菌を動物用飼料添加剤に用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性である細菌及びこれを含有する動物用飼料添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトを始めとする動物の疾病を予防、治療する方法として合成薬剤を用いず、微生物の働きを利用するプロバイオティクス療法が盛んに行われるようになっている。プロバイオティクスは、生きたまま宿主の腸に到達し、腸内フローラのバランスを改善することにより、整腸作用や免疫調節作用など、宿主に有益な作用をもたらす。
プロバイオティクスの代表的な例としては、乳酸菌やビフィズス菌が挙げられ、これらの細菌はヨーグルトやその他乳製品に広く利用されている。
【０００３】
細菌をプロバイオティクスとして利用するためには、胃液、胆汁酸などに耐性を有し、生きたまま腸に到達する能力を有すること、宿主の腸内フローラを構成していること、小腸下部や大腸で増殖する能力を有すること、宿主に対して有用な作用を及ぼすこと、食品や飼料の形態中で一定以上の菌数を維持できること、安全であることなどが要求される。
【０００４】
このような状況下で、畜産業、ペット産業などの領域において、動物の消化活動を補助し、腸内細菌を増強したり、腸内の有毒細菌の増殖を抑制したりすることにより、ヒトや動物の成長を促進したり、ウイルスなどによる炎症性腸疾患を予防・改善するために、プロバイオティクス細菌の利用が拡大している。
例えば、胆汁酸耐性であるバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）を動物の体重増加の促進、各種酵素産生による消化補助、及び病原体増殖制御を目的として動物用飼料強化剤として用いることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、ここで報告されているバチルス属細菌は、胞子の状態では耐酸性であるものの、栄養細胞の状態では耐酸性ではなく、栄養細胞をプロバイオティクスとして用いる場合は、胃の酸性環境による死滅から細胞を保護するために酸耐性担体でコーティング又はカプセル化しなければならないという問題があった。また、乳酸を産生し、耐熱性かつ耐酸性であるバチルス・コアギュランスを動物などに経口投与すること（特許文献２）、胆汁酸耐性であるバチルス属細菌（特許文献３、４、非特許文献１）、胆汁酸耐性かつ耐酸性であるラクトバチルス属細菌（特許文献５、特許文献６）などが知られているが、耐酸性、胆汁酸耐性かつ耐熱性であるバチルス属細菌及びこのような細菌を動物に経口投与して用いることは知られていなかった。
このような技術背景において、動物の消化機能を補助し、成長を促進するための新たな細菌種であって、安全性、取り扱いの容易性を満足する細菌種が探し求められていた。
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５０７６７０号公報
【特許文献２】特表２００３−５１３４６９号公報
【特許文献３】特開平５−２６８９４４号公報
【特許文献４】国際公開第９６／０２４６５９号パンフレット
【特許文献５】特表２００４−５２３２４１号公報
【特許文献６】特開２００５−０００１６０号公報
【非特許文献１】「インターナショナル ジャーナル オブ フード マイクロバイオロジー（international Journal of Food Microbiology）」２０００年，第６１巻，ｐ．１９３−１９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
飲食品や動物用飼料に添加するプロバイオティクスとしては、上述したように胆汁酸耐性、かつ耐酸性であることが要求される。また、細菌が体外に排出された後も、排泄物中で細菌が増殖できれば、排泄物の発酵が促進され、脱水、減量化、消臭に役立つと考えられる。このためには、排泄物中の細菌が発酵熱によって死滅せず、高温条件下においても一定時間増殖し続ける能力を有することが好ましい。そこで、本発明は、胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性である細菌を提供することを課題とする。さらに、細菌が腸内で消化吸収や炎症性障害などに有用な物質を産生する能力を有していれば、消化器官の障害などを予防・改善し、動物の成長促進に有効である。そこで、本発明は、上記性質に加え、このような物質を産生する細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、胆汁酸耐性、耐酸性及び耐熱性を有し、さらに有機酸を産生する能力を有するバチルス属細菌を発見し、これを分離した。そして、この細菌を動物用飼料添加剤に含有させ、動物に与えることにより、動物に有益な作用をもたらすことを知見し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）胆汁酸耐性、耐酸性、耐熱性であるバチルス属細菌を含有する動物用飼料添加剤。（２）バチルス属細菌が、さらに有機酸を産生する能力を有することを特徴とする、（１）に記載の動物用飼料添加剤。
（３）バチルス属細菌が、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＣＯＲ−２４ ＦＥＲＭ
ＡＰ−２０６４３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６菌株又はこれらの変異株である（１）又は（２）に記載の動物用飼料添加剤。
（４）バチルス属細菌が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis） ＮＢＲＣ １２１９８菌株又はこの変異株である（１）又は（２）に記載の動物用飼料添加剤。
（５）バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＣＯＲ−２４ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６菌株又はこれらの変異株。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の動物飼料添加剤を飼料に混合し、動物に与えることにより、動物の腸内で細菌が増殖し、腸内フローラのバランスを改善し、動物の体重増加を促進する。また、細菌が体外に排出された後、発酵熱によって排泄物が高温になってもさらに細菌は増殖するため、排泄物の脱水、消臭、減量化が起こる。さらに、バチルス属細菌が乳酸、酪酸、コハク酸などの有機酸を産生する場合には、腸内で発生する有害なアンモニアを中和し、腸管の吸収阻害などの症状を改善する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の動物用飼料添加剤は、胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性であるバチルス属細菌を含有することを特徴とする。
【００１０】
「胆汁酸耐性である」とは、高濃度の胆汁酸を含有する培地において増殖できることをいう。胆汁酸とは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類の胆汁中に広く見出される４環
構造のステロイドをいい、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸及びウルソデオキシコール酸が含まれる。通常、動物の体内では、胆汁酸は、胆汁中でグリシンやタウリンとアミド結合した抱合型として存在し、ナトリウム塩となっている。本明細書において単に「胆汁酸」という場合は、上記胆汁酸及びこれらの塩並びにこれらの抱合体を含む。
高濃度の胆汁酸を含有する培地とは、例えば、胆汁酸のうち最も殺菌性の高いデオキシコール酸を含む培地において、デオキシコール酸濃度が、３００ｍｇ／ｌ以上、好ましくは５００ｍｇ／ｌ以上、さらに好ましくは１０００ｍｇ／ｌ以上であることが挙げられる。また、通常動物の体内に存在する胆汁を含む培地において、胆汁濃度が、３０００ｍｇ／ｌ以上、好ましくは５０００ｍｇ／ｌ以上、さらに好ましくは１００００ｍｇ／ｌ以上であることが挙げられる。また、増殖できるとは、上記のような高濃度の胆汁酸を含有する培地で、胆汁酸濃度以外の条件をバチルス属細菌の培養に好適な条件にして培養を行ったときに、コロニーが形成されることをいう。
【００１１】
「耐酸性である」とは、酸性条件下で細菌の栄養細胞が生存できることをいう。酸性条件とは、ｐＨ４．５以下、好ましくはｐＨ３．０以下をいう。酸性条件下で栄養細胞が生存できるとは、例えば、上記酸性条件下で培養したときに、培養開始時の生菌数より培養後の生菌数が多いことをいう。通常、ヒトや動物の胃内部は食物を摂取した状態ではｐＨは３．５〜６の範囲であるため、このような性質を有するバチルス属細菌は、胃内部においても死滅することなく、腸まで到達する。
【００１２】
「耐熱性である」とは、高温条件下で細菌の栄養細胞が生存できることをいう。高温条件とは、３７℃以上、好ましくは５０℃以上をいう。また、生存できるとは、例えば、上記高温条件の水溶液中に細胞を４時間以上置いた場合に、処理後の細胞数が処理前の細胞数より多いことをいう。耐熱性のバチルス属細菌を用いることにより、細菌が排泄物と共に動物体外へ排出された後に、発酵熱により排泄物が高温になっても、細菌が死滅することなく、有機廃棄物を分解し、減量化が促進される。
【００１３】
本発明の動物用飼料添加剤に用いる胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性であるバチルス属細菌は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、分離源を含む水溶液を７０℃で３０分間処理し、次いで、水溶液を上記酸性条件にして３７℃以上で３０分間処理した後、生存する菌株を選抜する。次に、バチルス属細菌の培養に好適な培地に、デオキシコール酸を上記高濃度になるように添加して、培養を行い、形成したコロニーを分離する。
このようなバチルス属細菌は、動物に摂取させた場合に、細菌が胃内部で死滅することなく腸まで到達し、腸内で増殖することができ、さらに排泄物中においても死滅しない。細菌が消化管内で死滅せず増殖していることは、例えば、動物の排泄物中の菌体の濃度を測定することによって確認することができる。
【００１４】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌は、さらに嫌気的条件下で増殖できることが好ましい。嫌気的条件とは、例えば、動物の腸内に含まれる気体中の酸素濃度以下の条件を意味する。実験室的には、例えば、２０℃で測定した酸化還元電位が通常−１０ｍＶ以下、好ましくは−５０ｍＶ以下である条件をいう。酸化還元電位は、通常用いられる市販の酸化還元電位計で測定することができる。動物の消化管は、微好気的条件又は嫌気的条件であるため、このような細菌を用いることにより、胃腸内の環境下でも十分に細菌が増殖する。
【００１５】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌は、さらに有機酸を産生する能力を有することが好ましい。有機酸の種類は特に制限されるものではないが、乳酸、酪酸、グルコン酸、酢酸、クエン酸、２−オキソグルタル酸、コハク酸などが挙げられ、これらの
一種又は二種以上を産生することが好ましい。この中でも、乳酸、酪酸、コハク酸を産生することがさらに好ましい。ここで、有機酸を産生するとは、菌体を培養したときに、培養物中に有機酸が検出できる程度に有機酸を産生することをいう。有機酸の生成は、高速液体クロマトグラフィーで定性定量分析することができる。腸内で生成するアンモニアは、腸管からの栄養素の吸収を阻害するが、乳酸、酪酸、コハク酸などの有機酸は、有害なアンモニアを中和し、腸管からの栄養素の吸収阻害などの症状を改善する。
【００１６】
また、胆汁酸耐性、耐酸性及び耐熱性に加えて有機酸を産生する能力を有するバチルス属細菌を選抜するためには、上記性質の菌株を選抜する方法に、有機酸を形成するコロニーを選抜するための工程を加えればよい。例えば、胆汁酸を含有する培地に、さらに有機酸の存在を検出するためのマーカー物質を添加して、細菌の培養を行うことにより、有機酸を分泌するコロニーを可視化することができる。例えば、普通寒天培地に溶解度以上の炭酸カルシウムを加えて細菌を培養すると、有機酸を分泌するコロニーの周りの炭酸カルシウムが溶解しクリアゾーンが形成されるため、これを指標に有機酸を産生する能力を有する菌株を得ることができる。また、ｐＨインディケーターを固体、液体培地に添加して、培地の色変化を検出することによっても上記菌株を得ることができる。
【００１７】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌の菌種は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第９版（１９９４）において「バチルス属（Bacillus）」に分類される細菌であって、上記の性質を有しているものであれば特に制限されない。例えば、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・スミシー(Bacillus smithii)、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）などが挙げられる。この中では、例えば、バチルス・リケニフォルミス ＮＢＲＣ １２１９８菌株などを好ましく用いることができる。バチルス・リケニフォルミス ＮＢＲＣ １２１９８菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に登録されている株であって、胆汁酸耐性、耐酸性かつ耐熱性であり、乳酸などの有機酸を産生する能力を有する。
【００１８】
また、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）を用いてもよい。例えば、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＣＯＲ−２４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２菌株を好ましく用いることができる。ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７は平成１７年８月２４日より、ＢＵＴ−６Ａ１２は平成１７年９月２６日より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６で寄託されている。
【００１９】
ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７は、それぞれフスマ、下水の沈殿物、豚糞から見出した菌株であって、胆汁酸耐性、耐酸性かつ耐熱性であり、乳酸などの有機酸を産生する能力を有する。
【００２０】
また、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３、ＳＰＩ−３７のそれぞれについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ−５００塩基配列を解析した結果、以下のようなことが明らかとなった。
ＭｉｃｒｏＳｅｑを用いた解析の結果、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の１６Ｓ ｒＲＮＡ 部分塩基配列は、Bacillus amyloliquefaciens 及びBacillus atrophaeusの１６Ｓ ｒＲＮＡに対し、相同率９９％以上の高い相同性を示した。分子系統樹でもＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の１６Ｓ ｒＲＮＡはB. amyloliquefaci
ensの１６Ｓ ｒＲＮＡとクラスターを形成した。
また、ＢＬＡＳＴを用いたGenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の１６Ｓ ｒＲＮＡは、相同率１００％でBacillus sp. Bchl株の１６Ｓ ｒＲＮＡと一致した。また、検索の結果、相同性の高い上位２０株のほとんどは、バチルス属由来の１６Ｓ ｒＲＮＡが占めていたが、この上位２０株内にはBacillus基準株由来の１６Ｓ ｒＲＮＡは検索されなかった。
【００２１】
上記のことから、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７は、B. amyloliquefaciens やB. atrophaeusに近縁と考えられるが、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７とこれらの種の１６Ｓ ｒＲＮＡは完全には一致しておらず、これらの種と系統的に異なる菌株である可能性は否定できない。また、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の１６Ｓ ｒＲＮＡは、B. subtilis subsp. subtilisやB. mojavensisの１６Ｓ ｒＲＮＡに対しても高い相同率を示しており、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を用いた解析結果のみからはＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の種レベルでの帰属を判断することは難しいと考えられ、現時点ではＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７及びＢＵＴ−６Ａ１２をBacillus sp.とすることが妥当であると考えられる。
【００２２】
ＢＵＴ−６Ａ１２は、鶏糞から見出した菌株であって、胆汁酸耐性、耐酸性かつ耐熱性であり、乳酸などの有機酸を産生する能力を有する。
また、ＢＵＴ−６Ａ１２の１６Ｓ ｒＲＮＡ−５００塩基配列を解析した結果、以下のようなことが明らかとなった。
ＢＬＡＳＴを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、ＢＵＴ−６Ａ１２の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列は相同率９９．２％でBacillus fusiformis ＤＳＭ２８９８株の１６Ｓ ｒＲＮＡに対し最も高い相同性を示した。
GenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果においても、ＢＵＴ−６Ａ１２の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列は、Bacillus由来の１６Ｓ ｒＲＮＡに対し高い相同性を示し、基準株ではB. fusiformis ＤＭＳ ２８９８株の１６Ｓ ｒＲＮＡに対し最も高い相同性を示した。
また、ＢＵＴ−６Ａ１２の１６Ｓ ｒＲＮＡと細菌基準株データベースに対する相同性検索上位３０株の１６Ｓ ｒＲＮＡを用いた簡易分子系統樹解析の結果、ＢＵＴ−６Ａ１２はB. fusiformisの１６Ｓ ｒＲＮＡとクラスターを形成し、近縁であることが示された。
【００２３】
上記のことから、ＢＵＴ−６Ａ１２は、Bacillusに含まれ、既知のBacillusの中ではB.
fusiformisに最も近縁であるもののこれらの種と系統的に異なる菌株である可能性は否定できない。よって、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を用いた解析結果のみからはＢＵＴ−６Ａ１２の種レベルでの帰属を判断することは難しいと考えられ、現時点ではB. fusiformisに近縁なBacillus sp.とすることが妥当であると考えられる。
【００２４】
また、本発明の動物用飼料添加剤に用いることができるＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３、ＳＰＩ−３７、ＢＵＴ−６Ａ１２又はＮＢＲＣ １２１９８の変異株は、各菌株が自然変異することにより得られた菌株や、各菌株を化学的変異剤や紫外線等で変異処理することにより得られた菌株から、各菌株と同様の菌学的性質を有し、上記性質を有する菌株を選抜することにより得ることができる。
【００２５】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌を培養する方法は特に制限されず、細菌の性質に応じた適当な条件下で定法により行うことができる。例えば、培養温度は２０〜５０℃で行うことができるが、通常は、２８〜４０℃で培養することが好ましい。また、培養方法は、往復動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができる。
培養に用いる培地成分も特に制限されず、動物性又は植物性の何れを用いてもよく、例えば、大豆粉、フスマ、コメヌカ、麦、乳製品等を含む資材を用いることができる。さらに、炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜などの糖類、クエン酸などの有機酸類、グリセリンなどのアルコール類、また窒素源としてアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や硝酸塩等を添加することができる。
【００２６】
本発明の動物用飼料添加剤におけるバチルス属細菌の菌体の濃度は、飼料に添加・混合するのに適した濃度であればよく、配合する食品、飼料の種類、与える対象の種類や体重、投与目的などに応じて最適な濃度を決定することができる。通常は、動物用飼料添加剤全量に対して、１×１０3〜１×１０11ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位）、好ましくは１×１０4〜１×１０10ＣＦＵ／ｇ、さらに好ましくは１×１０5〜１×１０9ＣＦＵ／ｇとすることができる。
【００２７】
また、本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌は、胞子及び栄養細胞の何れの状態でもよい。細菌に胞子を形成させる場合は、培養の周期において、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度、培養湿度、培養する際の酸素濃度などの培養条件を、その胞子形成条件に適合させるように調整することができる。
【００２８】
本発明の動物用飼料添加剤は、菌体の培養後、得られた培養物をそのまま動物用飼料添加剤とすることもできるし、得られた培養物から、菌体を含む一部を分離して、適宜任意成分と混合して動物用飼料添加剤とすることもできる。例えば、固体培地を用いて菌体の培養を行う場合には、菌体を培地と共に乾燥、粉砕して飼料添加剤としてもよい。液体培地を用いて菌体の培養を行う場合には、培地を遠心分離することにより菌体を分離するなどした後、菌体のみをスプレー乾燥や凍結乾燥により乾燥して添加してもよい。用いる細菌が有機酸産生能を有するものである場合には、菌体の培養によって得られた培養物中に有機酸が含まれるため、培養物をそのまま動物用飼料添加剤に含有させるか、あるいは全量を乾燥して添加することが好ましい。
【００２９】
また、本発明の動物用飼料添加剤は、製品としての品質安定性、保存性を高めるために乾燥することが好ましい。乾燥は、動物用飼料添加剤の水分含有量が２０重量％以下となるように行うことが好ましい。
乾燥方法は、特に制限されず、自然乾燥、通風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられるが、この中でも噴霧乾燥及び通風乾燥が好ましく用いられる。乾燥する際には、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム及び糖類などの保護剤を用いることができる。糖類を用いる場合は、グルコースやトレハロースを用いることができる。さらに、乾燥後は、得られた乾燥物に、脱酸素剤、脱水剤を加えて、ガスバリアー性のアルミ袋に入れて密封し、室温から低温で貯蔵することが好ましい。これにより、細菌を長期間生きたまま保存することが可能となる。
また、バチルス属細菌の菌体や培養物に製剤化のための担体や増量剤などの任意の物質をさらに加えて、動物用飼料添加剤に加工することも可能である。
【００３０】
本発明の動物用飼料添加剤は、通常用いられる飼料に添加、混合して、動物に摂取させることができる。飼料の種類や成分は、バチルス属細菌が死滅しない限りにおいて特に制限されず、通常、家畜の飼料やペットフード、動物用サプリメントなど、動物用の飼料として用いられているものを用いることができる。
【００３１】
また、本発明の動物用飼料添加剤を他の飼料成分に添加し、混合することにより動物の成長促進のための飼料を製造することができる。この場合、動物用飼料添加剤の含有量は、与える動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適
宜調節することができ、特に制限されないが、例えば、通常は飼料に対して、菌体濃度が１×１０4〜１×１０9ＣＦＵ／ｇとなるように添加することが好ましい。
【００３２】
飼料への動物用飼料添加剤の混合は、動物用飼料添加剤をそのまま混合することができるが、粉末状、固形状の動物用飼料添加剤を添加、混合する場合は、飼料への混合を容易にするために液状又はゲル状の形態にして使用することもできる。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、飼料中における菌体濃度の均一性を保つために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グアーガム、タマリンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。また、雑菌の繁殖を防ぐために有機酸を配合し、液体生菌剤を酸性にすることもできる。
【００３３】
本発明の飼料を摂取させる動物の種類は、特に制限されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などが挙げられる。動物に摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができる。
【実施例】
【００３４】
＜菌体の分離＞
フスマ、下水の沈殿物、豚糞及び鶏糞を分離源とし、それぞれ１０ｇずつガラス容器に取り、水９０ｍｌを加えて攪拌し、ｐＨを４．５に調整した後、湯浴中で７５℃で２０分間加温した。この液を２５０ｍｌ容のメディアボトルに移し、４０℃の恒温槽に入れ、内部を窒素でパージした後、ブチルゴム栓付きスクリューキャップで密栓し、毎分６０回転で７日間攪拌振とうした。その後、メディアボトルを冷却しながら３０分間静置し、上澄み液を分離した。この上澄み５０ｍｌに４規定塩酸を滴下してｐＨを２とし、３７℃で４時間振とうした。
【００３５】
次に、以下に示すデオキシコール酸添加培地を調製し、加温溶解後にシャーレに２０ｍｌずつ分注した。胆汁酸成分のうち、微生物に対して最も殺菌効果の高いデオキシコール酸のナトリウム塩を培地に添加することとした。
（デオキシコール酸添加培地） （ｇ／ｌ）
デオキシコール酸ナトリウム ０．５
ペプトン １０．０
クエン酸鉄アンモニウム ２．０
塩化ナトリウム ５．０
リン酸−水素カリウム ２．０
乳糖 １０．０
ニュートラルレッド ０．０３３
炭酸カルシウム ５．０
寒天 ２０．０
【００３６】
このデオキシコール酸添加培地に、上記加熱処理及び酸処理後の上澄み液を２００μｌ滴下し、塗布棒を使って広げた。このシャーレを嫌気ジャーに入れ、脱酸素剤を入れて３７℃で５日間培養し、クリアゾーンとなった部分のコロニーを多数分離した。この分離した菌株の中でも特に増殖の旺盛な菌株を４つ選択した。フスマの分離源から分離した菌株をＣＯＲ−２４、下水の沈殿物の分離源から分離した菌株をＰＯＴ−２３、豚糞の分離源から分離した菌株をＳＰＩ−３７、鶏糞の分離源から分離した菌株をＢＵＴ−６Ａ１２とし、それぞれ受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６として寄託した。これらの菌株の性質は前述したとおりである。
【００３７】
＜成長試験＞
上記で得られたＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３、ＳＰＩ−３７、ＢＵＴ−６Ａ１２の菌体、及びバチルス・リケニフォルミス ＮＢＲＣ １２１９８をそれぞれ下記液体培地を用いて、３５℃で４８時間液体培養した。得られた培養物１０ｌを遠心分離し、菌体を集めた。それぞれの菌体を凍結乾燥し、鳥雛の飼料全質量（ＳＤブロイラー前後期用、日本配合飼料株式会社製、抗菌性物質無添加飼料）に対して１００ｐｐｍとなるように混合したものを実施例１〜５とした。鳥雛１２羽を一群として、各群に実施例１〜５の飼料を３０日間与え、成長試験を行った。一方、胆汁酸耐性でないバチルス・ラセミラクティカス（Bacillus racemilacticus） ＤＳＭ４４５を同様に培養し、菌体を分離して凍結乾燥したものを飼料に混合したものを比較例とし、菌体を添加しない飼料を対照例とし、同様に成長試験を行った。
【００３８】
（液体培地）
（ｇ／ｌ）
グルコース ６０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．２
ＮａＣｌ ４．８
酵母エキス ５．０
脱脂大豆粉 ２４．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．０
コーンスターチ ５．０
（ｍｇ／ｌ）
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．５
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ７．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．０
【００３９】
３０日後の各群の鳥雛の体重を測定し、それぞれの群の平均体重を算出した。また、飼育期間中の糞中における添加菌の濃度を測定し、それぞれ平均濃度を算出した。
結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例１〜５の動物用飼料添加剤を与えた鳥雛は、比較例の動物用飼料添加剤を与えた鳥雛に比して、何れも体重が増加が大きかった。また、実施例の鳥雛の糞からは、７．２×１０7ＣＦＵ／ｇ（グラム生鶏糞）以上の添加菌が検出された。これより、本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌を含有する動物用飼料添加剤は、胃や腸の消化管内で死滅することなく、腸内で増殖し、動物の体重増加を促進することが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性である細菌及びこれを含有する動物用飼料添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトを始めとする動物の疾病を予防、治療する方法として合成薬剤を用いず、微生物の働きを利用するプロバイオティクス療法が盛んに行われるようになっている。プロバイオティクスは、生きたまま宿主の腸に到達し、腸内フローラのバランスを改善することにより、整腸作用や免疫調節作用など、宿主に有益な作用をもたらす。
プロバイオティクスの代表的な例としては、乳酸菌やビフィズス菌が挙げられ、これらの細菌はヨーグルトやその他乳製品に広く利用されている。
【０００３】
細菌をプロバイオティクスとして利用するためには、胃液、胆汁酸などに耐性を有し、生きたまま腸に到達する能力を有すること、宿主の腸内フローラを構成していること、小腸下部や大腸で増殖する能力を有すること、宿主に対して有用な作用を及ぼすこと、食品や飼料の形態中で一定以上の菌数を維持できること、安全であることなどが要求される。
【０００４】
このような状況下で、畜産業、ペット産業などの領域において、動物の消化活動を補助し、腸内細菌を増強したり、腸内の有毒細菌の増殖を抑制したりすることにより、ヒトや動物の成長を促進したり、ウイルスなどによる炎症性腸疾患を予防・改善するために、プロバイオティクス細菌の利用が拡大している。
例えば、胆汁酸耐性であるバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）を動物の体重増加の促進、各種酵素産生による消化補助、及び病原体増殖制御を目的として動物用飼料強化剤として用いることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、ここで報告されているバチルス属細菌は、胞子の状態では耐酸性であるものの、栄養細胞の状態では耐酸性ではなく、栄養細胞をプロバイオティクスとして用いる場合は、胃の酸性環境による死滅から細胞を保護するために酸耐性担体でコーティング又はカプセル化しなければならないという問題があった。また、乳酸を産生し、耐熱性かつ耐酸性であるバチルス・コアギュランスを動物などに経口投与すること（特許文献２）、胆汁酸耐性であるバチルス属細菌（特許文献３、４、非特許文献１）、胆汁酸耐性かつ耐酸性であるラクトバチルス属細菌（特許文献５、特許文献６）などが知られているが、耐酸性、胆汁酸耐性かつ耐熱性であるバチルス属細菌及びこのような細菌を動物に経口投与して用いることは知られていなかった。
このような技術背景において、動物の消化機能を補助し、成長を促進するための新たな細菌種であって、安全性、取り扱いの容易性を満足する細菌種が探し求められていた。
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５０７６７０号公報
【特許文献２】特表２００３−５１３４６９号公報
【特許文献３】特開平５−２６８９４４号公報
【特許文献４】国際公開第９６／０２４６５９号パンフレット
【特許文献５】特表２００４−５２３２４１号公報
【特許文献６】特開２００５−０００１６０号公報
【非特許文献１】「インターナショナル ジャーナル オブ フード マイクロバイオロジー（international Journal of Food Microbiology）」２０００年，第６１巻，ｐ．１９３−１９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
飲食品や動物用飼料に添加するプロバイオティクスとしては、上述したように胆汁酸耐性、かつ耐酸性であることが要求される。また、細菌が体外に排出された後も、排泄物中で細菌が増殖できれば、排泄物の発酵が促進され、脱水、減量化、消臭に役立つと考えられる。このためには、排泄物中の細菌が発酵熱によって死滅せず、高温条件下においても一定時間増殖し続ける能力を有することが好ましい。そこで、本発明は、胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性である細菌を提供することを課題とする。さらに、細菌が腸内で消化吸収や炎症性障害などに有用な物質を産生する能力を有していれば、消化器官の障害などを予防・改善し、動物の成長促進に有効である。そこで、本発明は、上記性質に加え、このような物質を産生する細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、胆汁酸耐性、耐酸性及び耐熱性を有し、さらに有機酸を産生する能力を有するバチルス属細菌を発見し、これを分離した。そして、この細菌を動物用飼料添加剤に含有させ、動物に与えることにより、動物に有益な作用をもたらすことを知見し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）胆汁酸耐性、耐酸性、耐熱性であるバチルス属細菌を含有する動物用飼料添加剤。（２）バチルス属細菌が、さらに有機酸を産生する能力を有することを特徴とする、（１）に記載の動物用飼料添加剤。
（３）バチルス属細菌が、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＣＯＲ−２４ ＦＥＲＭ
ＡＰ−２０６４３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６菌株又はこれらの変異株である（１）又は（２）に記載の動物用飼料添加剤。
（４）バチルス属細菌が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis） ＮＢＲＣ １２１９８菌株又はこの変異株である（１）又は（２）に記載の動物用飼料添加剤。
（５）バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＣＯＲ−２４ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６菌株又はこれらの変異株。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の動物飼料添加剤を飼料に混合し、動物に与えることにより、動物の腸内で細菌が増殖し、腸内フローラのバランスを改善し、動物の体重増加を促進する。また、細菌が体外に排出された後、発酵熱によって排泄物が高温になってもさらに細菌は増殖するため、排泄物の脱水、消臭、減量化が起こる。さらに、バチルス属細菌が乳酸、酪酸、コハク酸などの有機酸を産生する場合には、腸内で発生する有害なアンモニアを中和し、腸管の吸収阻害などの症状を改善する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の動物用飼料添加剤は、胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性であるバチルス属細菌を含有することを特徴とする。
【００１０】
「胆汁酸耐性である」とは、高濃度の胆汁酸を含有する培地において増殖できることをいう。胆汁酸とは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類の胆汁中に広く見出される４環
構造のステロイドをいい、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸及びウルソデオキシコール酸が含まれる。通常、動物の体内では、胆汁酸は、胆汁中でグリシンやタウリンとアミド結合した抱合型として存在し、ナトリウム塩となっている。本明細書において単に「胆汁酸」という場合は、上記胆汁酸及びこれらの塩並びにこれらの抱合体を含む。
高濃度の胆汁酸を含有する培地とは、例えば、胆汁酸のうち最も殺菌性の高いデオキシコール酸を含む培地において、デオキシコール酸濃度が、３００ｍｇ／ｌ以上、好ましくは５００ｍｇ／ｌ以上、さらに好ましくは１０００ｍｇ／ｌ以上であることが挙げられる。また、通常動物の体内に存在する胆汁を含む培地において、胆汁濃度が、３０００ｍｇ／ｌ以上、好ましくは５０００ｍｇ／ｌ以上、さらに好ましくは１００００ｍｇ／ｌ以上であることが挙げられる。また、増殖できるとは、上記のような高濃度の胆汁酸を含有する培地で、胆汁酸濃度以外の条件をバチルス属細菌の培養に好適な条件にして培養を行ったときに、コロニーが形成されることをいう。
【００１１】
「耐酸性である」とは、酸性条件下で細菌の栄養細胞が生存できることをいう。酸性条件とは、ｐＨ４．５以下、好ましくはｐＨ３．０以下をいう。酸性条件下で栄養細胞が生存できるとは、例えば、上記酸性条件下で培養したときに、培養開始時の生菌数より培養後の生菌数が多いことをいう。通常、ヒトや動物の胃内部は食物を摂取した状態ではｐＨは３．５〜６の範囲であるため、このような性質を有するバチルス属細菌は、胃内部においても死滅することなく、腸まで到達する。
【００１２】
「耐熱性である」とは、高温条件下で細菌の栄養細胞が生存できることをいう。高温条件とは、３７℃以上、好ましくは５０℃以上をいう。また、生存できるとは、例えば、上記高温条件の水溶液中に細胞を４時間以上置いた場合に、処理後の細胞数が処理前の細胞数より多いことをいう。耐熱性のバチルス属細菌を用いることにより、細菌が排泄物と共に動物体外へ排出された後に、発酵熱により排泄物が高温になっても、細菌が死滅することなく、有機廃棄物を分解し、減量化が促進される。
【００１３】
本発明の動物用飼料添加剤に用いる胆汁酸耐性、耐酸性、かつ耐熱性であるバチルス属細菌は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、分離源を含む水溶液を７０℃で３０分間処理し、次いで、水溶液を上記酸性条件にして３７℃以上で３０分間処理した後、生存する菌株を選抜する。次に、バチルス属細菌の培養に好適な培地に、デオキシコール酸を上記高濃度になるように添加して、培養を行い、形成したコロニーを分離する。
このようなバチルス属細菌は、動物に摂取させた場合に、細菌が胃内部で死滅することなく腸まで到達し、腸内で増殖することができ、さらに排泄物中においても死滅しない。細菌が消化管内で死滅せず増殖していることは、例えば、動物の排泄物中の菌体の濃度を測定することによって確認することができる。
【００１４】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌は、さらに嫌気的条件下で増殖できることが好ましい。嫌気的条件とは、例えば、動物の腸内に含まれる気体中の酸素濃度以下の条件を意味する。実験室的には、例えば、２０℃で測定した酸化還元電位が通常−１０ｍＶ以下、好ましくは−５０ｍＶ以下である条件をいう。酸化還元電位は、通常用いられる市販の酸化還元電位計で測定することができる。動物の消化管は、微好気的条件又は嫌気的条件であるため、このような細菌を用いることにより、胃腸内の環境下でも十分に細菌が増殖する。
【００１５】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌は、さらに有機酸を産生する能力を有することが好ましい。有機酸の種類は特に制限されるものではないが、乳酸、酪酸、グルコン酸、酢酸、クエン酸、２−オキソグルタル酸、コハク酸などが挙げられ、これらの
一種又は二種以上を産生することが好ましい。この中でも、乳酸、酪酸、コハク酸を産生することがさらに好ましい。ここで、有機酸を産生するとは、菌体を培養したときに、培養物中に有機酸が検出できる程度に有機酸を産生することをいう。有機酸の生成は、高速液体クロマトグラフィーで定性定量分析することができる。腸内で生成するアンモニアは、腸管からの栄養素の吸収を阻害するが、乳酸、酪酸、コハク酸などの有機酸は、有害なアンモニアを中和し、腸管からの栄養素の吸収阻害などの症状を改善する。
【００１６】
また、胆汁酸耐性、耐酸性及び耐熱性に加えて有機酸を産生する能力を有するバチルス属細菌を選抜するためには、上記性質の菌株を選抜する方法に、有機酸を形成するコロニーを選抜するための工程を加えればよい。例えば、胆汁酸を含有する培地に、さらに有機酸の存在を検出するためのマーカー物質を添加して、細菌の培養を行うことにより、有機酸を分泌するコロニーを可視化することができる。例えば、普通寒天培地に溶解度以上の炭酸カルシウムを加えて細菌を培養すると、有機酸を分泌するコロニーの周りの炭酸カルシウムが溶解しクリアゾーンが形成されるため、これを指標に有機酸を産生する能力を有する菌株を得ることができる。また、ｐＨインディケーターを固体、液体培地に添加して、培地の色変化を検出することによっても上記菌株を得ることができる。
【００１７】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌の菌種は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第９版（１９９４）において「バチルス属（Bacillus）」に分類される細菌であって、上記の性質を有しているものであれば特に制限されない。例えば、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・スミシー(Bacillus smithii)、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）などが挙げられる。この中では、例えば、バチルス・リケニフォルミス ＮＢＲＣ １２１９８菌株などを好ましく用いることができる。バチルス・リケニフォルミス ＮＢＲＣ １２１９８菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に登録されている株であって、胆汁酸耐性、耐酸性かつ耐熱性であり、乳酸などの有機酸を産生する能力を有する。
【００１８】
また、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）を用いてもよい。例えば、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＣＯＲ−２４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２菌株を好ましく用いることができる。ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７は平成１７年８月２４日より、ＢＵＴ−６Ａ１２は平成１７年９月２６日より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６で寄託されている。
【００１９】
ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７は、それぞれフスマ、下水の沈殿物、豚糞から見出した菌株であって、胆汁酸耐性、耐酸性かつ耐熱性であり、乳酸などの有機酸を産生する能力を有する。
【００２０】
また、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３、ＳＰＩ−３７のそれぞれについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ−５００塩基配列を解析した結果、以下のようなことが明らかとなった。
ＭｉｃｒｏＳｅｑを用いた解析の結果、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の１６Ｓ ｒＲＮＡ 部分塩基配列は、Bacillus amyloliquefaciens 及びBacillus atrophaeusの１６Ｓ ｒＲＮＡに対し、相同率９９％以上の高い相同性を示した。分子系統樹でもＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の１６Ｓ ｒＲＮＡはB. amyloliquefaci
ensの１６Ｓ ｒＲＮＡとクラスターを形成した。
また、ＢＬＡＳＴを用いたGenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の１６Ｓ ｒＲＮＡは、相同率１００％でBacillus sp. Bchl株の１６Ｓ ｒＲＮＡと一致した。また、検索の結果、相同性の高い上位２０株のほとんどは、バチルス属由来の１６Ｓ ｒＲＮＡが占めていたが、この上位２０株内にはBacillus基準株由来の１６Ｓ ｒＲＮＡは検索されなかった。
【００２１】
上記のことから、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７は、B. amyloliquefaciens やB. atrophaeusに近縁と考えられるが、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７とこれらの種の１６Ｓ ｒＲＮＡは完全には一致しておらず、これらの種と系統的に異なる菌株である可能性は否定できない。また、ＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の１６Ｓ ｒＲＮＡは、B. subtilis subsp. subtilisやB. mojavensisの１６Ｓ ｒＲＮＡに対しても高い相同率を示しており、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を用いた解析結果のみからはＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７の種レベルでの帰属を判断することは難しいと考えられ、現時点ではＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３及びＳＰＩ−３７及びＢＵＴ−６Ａ１２をBacillus sp.とすることが妥当であると考えられる。
【００２２】
ＢＵＴ−６Ａ１２は、鶏糞から見出した菌株であって、胆汁酸耐性、耐酸性かつ耐熱性であり、乳酸などの有機酸を産生する能力を有する。
また、ＢＵＴ−６Ａ１２の１６Ｓ ｒＲＮＡ−５００塩基配列を解析した結果、以下のようなことが明らかとなった。
ＢＬＡＳＴを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、ＢＵＴ−６Ａ１２の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列は相同率９９．２％でBacillus fusiformis ＤＳＭ２８９８株の１６Ｓ ｒＲＮＡに対し最も高い相同性を示した。
GenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果においても、ＢＵＴ−６Ａ１２の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列は、Bacillus由来の１６Ｓ ｒＲＮＡに対し高い相同性を示し、基準株ではB. fusiformis ＤＭＳ ２８９８株の１６Ｓ ｒＲＮＡに対し最も高い相同性を示した。
また、ＢＵＴ−６Ａ１２の１６Ｓ ｒＲＮＡと細菌基準株データベースに対する相同性検索上位３０株の１６Ｓ ｒＲＮＡを用いた簡易分子系統樹解析の結果、ＢＵＴ−６Ａ１２はB. fusiformisの１６Ｓ ｒＲＮＡとクラスターを形成し、近縁であることが示された。
【００２３】
上記のことから、ＢＵＴ−６Ａ１２は、Bacillusに含まれ、既知のBacillusの中ではB.
fusiformisに最も近縁であるもののこれらの種と系統的に異なる菌株である可能性は否定できない。よって、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を用いた解析結果のみからはＢＵＴ−６Ａ１２の種レベルでの帰属を判断することは難しいと考えられ、現時点ではB. fusiformisに近縁なBacillus sp.とすることが妥当であると考えられる。
【００２４】
また、本発明の動物用飼料添加剤に用いることができるＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３、ＳＰＩ−３７、ＢＵＴ−６Ａ１２又はＮＢＲＣ １２１９８の変異株は、各菌株が自然変異することにより得られた菌株や、各菌株を化学的変異剤や紫外線等で変異処理することにより得られた菌株から、各菌株と同様の菌学的性質を有し、上記性質を有する菌株を選抜することにより得ることができる。
【００２５】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌を培養する方法は特に制限されず、細菌の性質に応じた適当な条件下で定法により行うことができる。例えば、培養温度は２０〜５０℃で行うことができるが、通常は、２８〜４０℃で培養することが好ましい。また、培養方法は、往復動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができる。
培養に用いる培地成分も特に制限されず、動物性又は植物性の何れを用いてもよく、例えば、大豆粉、フスマ、コメヌカ、麦、乳製品等を含む資材を用いることができる。さらに、炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜などの糖類、クエン酸などの有機酸類、グリセリンなどのアルコール類、また窒素源としてアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や硝酸塩等を添加することができる。
【００２６】
本発明の動物用飼料添加剤におけるバチルス属細菌の菌体の濃度は、飼料に添加・混合するのに適した濃度であればよく、配合する食品、飼料の種類、与える対象の種類や体重、投与目的などに応じて最適な濃度を決定することができる。通常は、動物用飼料添加剤全量に対して、１×１０3〜１×１０11ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位）、好ましくは１×１０4〜１×１０10ＣＦＵ／ｇ、さらに好ましくは１×１０5〜１×１０9ＣＦＵ／ｇとすることができる。
【００２７】
また、本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌は、胞子及び栄養細胞の何れの状態でもよい。細菌に胞子を形成させる場合は、培養の周期において、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度、培養湿度、培養する際の酸素濃度などの培養条件を、その胞子形成条件に適合させるように調整することができる。
【００２８】
本発明の動物用飼料添加剤は、菌体の培養後、得られた培養物をそのまま動物用飼料添加剤とすることもできるし、得られた培養物から、菌体を含む一部を分離して、適宜任意成分と混合して動物用飼料添加剤とすることもできる。例えば、固体培地を用いて菌体の培養を行う場合には、菌体を培地と共に乾燥、粉砕して飼料添加剤としてもよい。液体培地を用いて菌体の培養を行う場合には、培地を遠心分離することにより菌体を分離するなどした後、菌体のみをスプレー乾燥や凍結乾燥により乾燥して添加してもよい。用いる細菌が有機酸産生能を有するものである場合には、菌体の培養によって得られた培養物中に有機酸が含まれるため、培養物をそのまま動物用飼料添加剤に含有させるか、あるいは全量を乾燥して添加することが好ましい。
【００２９】
また、本発明の動物用飼料添加剤は、製品としての品質安定性、保存性を高めるために乾燥することが好ましい。乾燥は、動物用飼料添加剤の水分含有量が２０重量％以下となるように行うことが好ましい。
乾燥方法は、特に制限されず、自然乾燥、通風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられるが、この中でも噴霧乾燥及び通風乾燥が好ましく用いられる。乾燥する際には、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム及び糖類などの保護剤を用いることができる。糖類を用いる場合は、グルコースやトレハロースを用いることができる。さらに、乾燥後は、得られた乾燥物に、脱酸素剤、脱水剤を加えて、ガスバリアー性のアルミ袋に入れて密封し、室温から低温で貯蔵することが好ましい。これにより、細菌を長期間生きたまま保存することが可能となる。
また、バチルス属細菌の菌体や培養物に製剤化のための担体や増量剤などの任意の物質をさらに加えて、動物用飼料添加剤に加工することも可能である。
【００３０】
本発明の動物用飼料添加剤は、通常用いられる飼料に添加、混合して、動物に摂取させることができる。飼料の種類や成分は、バチルス属細菌が死滅しない限りにおいて特に制限されず、通常、家畜の飼料やペットフード、動物用サプリメントなど、動物用の飼料として用いられているものを用いることができる。
【００３１】
また、本発明の動物用飼料添加剤を他の飼料成分に添加し、混合することにより動物の成長促進のための飼料を製造することができる。この場合、動物用飼料添加剤の含有量は、与える動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適
宜調節することができ、特に制限されないが、例えば、通常は飼料に対して、菌体濃度が１×１０4〜１×１０9ＣＦＵ／ｇとなるように添加することが好ましい。
【００３２】
飼料への動物用飼料添加剤の混合は、動物用飼料添加剤をそのまま混合することができるが、粉末状、固形状の動物用飼料添加剤を添加、混合する場合は、飼料への混合を容易にするために液状又はゲル状の形態にして使用することもできる。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、飼料中における菌体濃度の均一性を保つために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グアーガム、タマリンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。また、雑菌の繁殖を防ぐために有機酸を配合し、液体生菌剤を酸性にすることもできる。
【００３３】
本発明の飼料を摂取させる動物の種類は、特に制限されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などが挙げられる。動物に摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができる。
【実施例】
【００３４】
＜菌体の分離＞
フスマ、下水の沈殿物、豚糞及び鶏糞を分離源とし、それぞれ１０ｇずつガラス容器に取り、水９０ｍｌを加えて攪拌し、ｐＨを４．５に調整した後、湯浴中で７５℃で２０分間加温した。この液を２５０ｍｌ容のメディアボトルに移し、４０℃の恒温槽に入れ、内部を窒素でパージした後、ブチルゴム栓付きスクリューキャップで密栓し、毎分６０回転で７日間攪拌振とうした。その後、メディアボトルを冷却しながら３０分間静置し、上澄み液を分離した。この上澄み５０ｍｌに４規定塩酸を滴下してｐＨを２とし、３７℃で４時間振とうした。
【００３５】
次に、以下に示すデオキシコール酸添加培地を調製し、加温溶解後にシャーレに２０ｍｌずつ分注した。胆汁酸成分のうち、微生物に対して最も殺菌効果の高いデオキシコール酸のナトリウム塩を培地に添加することとした。
（デオキシコール酸添加培地） （ｇ／ｌ）
デオキシコール酸ナトリウム ０．５
ペプトン １０．０
クエン酸鉄アンモニウム ２．０
塩化ナトリウム ５．０
リン酸−水素カリウム ２．０
乳糖 １０．０
ニュートラルレッド ０．０３３
炭酸カルシウム ５．０
寒天 ２０．０
【００３６】
このデオキシコール酸添加培地に、上記加熱処理及び酸処理後の上澄み液を２００μｌ滴下し、塗布棒を使って広げた。このシャーレを嫌気ジャーに入れ、脱酸素剤を入れて３７℃で５日間培養し、クリアゾーンとなった部分のコロニーを多数分離した。この分離した菌株の中でも特に増殖の旺盛な菌株を４つ選択した。フスマの分離源から分離した菌株をＣＯＲ−２４、下水の沈殿物の分離源から分離した菌株をＰＯＴ−２３、豚糞の分離源から分離した菌株をＳＰＩ−３７、鶏糞の分離源から分離した菌株をＢＵＴ−６Ａ１２とし、それぞれ受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６として寄託した。これらの菌株の性質は前述したとおりである。
【００３７】
＜成長試験＞
上記で得られたＣＯＲ−２４、ＰＯＴ−２３、ＳＰＩ−３７、ＢＵＴ−６Ａ１２の菌体、及びバチルス・リケニフォルミス ＮＢＲＣ １２１９８をそれぞれ下記液体培地を用いて、３５℃で４８時間液体培養した。得られた培養物１０ｌを遠心分離し、菌体を集めた。それぞれの菌体を凍結乾燥し、鳥雛の飼料全質量（ＳＤブロイラー前後期用、日本配合飼料株式会社製、抗菌性物質無添加飼料）に対して１００ｐｐｍとなるように混合したものを実施例１〜５とした。鳥雛１２羽を一群として、各群に実施例１〜５の飼料を３０日間与え、成長試験を行った。一方、胆汁酸耐性でないバチルス・ラセミラクティカス（Bacillus racemilacticus） ＤＳＭ４４５を同様に培養し、菌体を分離して凍結乾燥したものを飼料に混合したものを比較例とし、菌体を添加しない飼料を対照例とし、同様に成長試験を行った。
【００３８】
（液体培地）
（ｇ／ｌ）
グルコース ６０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．２
ＮａＣｌ ４．８
酵母エキス ５．０
脱脂大豆粉 ２４．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．０
コーンスターチ ５．０
（ｍｇ／ｌ）
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．５
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ７．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．０
【００３９】
３０日後の各群の鳥雛の体重を測定し、それぞれの群の平均体重を算出した。また、飼育期間中の糞中における添加菌の濃度を測定し、それぞれ平均濃度を算出した。
結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
実施例１〜５の動物用飼料添加剤を与えた鳥雛は、比較例の動物用飼料添加剤を与えた鳥雛に比して、何れも体重が増加が大きかった。また、実施例の鳥雛の糞からは、７．２×１０7ＣＦＵ／ｇ（グラム生鶏糞）以上の添加菌が検出された。これより、本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス属細菌を含有する動物用飼料添加剤は、胃や腸の消化管内で死滅することなく、腸内で増殖し、動物の体重増加を促進することが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆汁酸耐性、耐酸性、耐熱性であるバチルス属細菌を含有する動物用飼料添加剤。
【請求項２】
バチルス属細菌が、さらに有機酸を産生する能力を有することを特徴とする、請求項１に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項３】
バチルス属細菌が、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＣＯＲ−２４ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６菌株又はこれらの変異株である請求項１又は２に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項４】
バチルス属細菌が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＮＢＲＣ
１２１９８菌株又はこの変異株である請求項１又は２に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項５】
バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＣＯＲ−２４ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６菌株又はこれらの変異株。
【請求項１】
胆汁酸耐性、耐酸性、耐熱性であるバチルス属細菌を含有する動物用飼料添加剤。
【請求項２】
バチルス属細菌が、さらに有機酸を産生する能力を有することを特徴とする、請求項１に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項３】
バチルス属細菌が、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＣＯＲ−２４ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６菌株又はこれらの変異株である請求項１又は２に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項４】
バチルス属細菌が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＮＢＲＣ
１２１９８菌株又はこの変異株である請求項１又は２に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項５】
バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＣＯＲ−２４ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４３菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＰＯＴ−２３ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４４菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＳＰＩ−３７ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６４５菌株、バチルス・エスピー（Bacillus sp.） ＢＵＴ−６Ａ１２ ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６６菌株又はこれらの変異株。
【公開番号】特開２００７−１１７００４（Ｐ２００７−１１７００４Ａ）
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３１４５０５（Ｐ２００５−３１４５０５）
【出願日】平成１７年１０月２８日（２００５．１０．２８）
【出願人】（０００１８３６４６）出光興産株式会社 (2,069)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２８日（２００５．１０．２８）
【出願人】（０００１８３６４６）出光興産株式会社 (2,069)
【Ｆターム（参考）】
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