胞子形成能が欠損した細菌、及びそれを用いたタンパク質製造方法
【課題】胞子形成能が欠損したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ、及び当該細菌を用いて遺伝子工学的にタンパク質を製造する方法を提供する。
【解決手段】Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株を変異原物質で処理することで、胞子形成能が欠損し、プロテアーゼ活性が低下した該細菌の変異株。また、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、前記変異株へ形質転換することで得られる、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓを用いた前記タンパク質の製造方法。本法は高タンパク質生産能を有しつつ環境への影響が少ない、組換えタンパク質の製造法である。
【解決手段】Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株を変異原物質で処理することで、胞子形成能が欠損し、プロテアーゼ活性が低下した該細菌の変異株。また、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、前記変異株へ形質転換することで得られる、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓを用いた前記タンパク質の製造方法。本法は高タンパク質生産能を有しつつ環境への影響が少ない、組換えタンパク質の製造法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胞子形成能が欠損したバチルス属細菌、及びそれを用いた組み換えタンパク質、特にＦｃレセプターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９４のロイシン（Ｌｅｕ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。
【０００７】
以前、本出願人は、変異原物質で処理することでプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）活性が低下したバチルス属細菌変異株を取得し、当該変異株を遺伝子工学的にＦｃγＲＩを製造するための宿主として用いることで、バチルス属細菌野生株の有するプロテアーゼに由来した発現タンパク質の分解が低減し、結果としてＦｃγＲＩを効率的に生産することを実現している（特願２００９−００８６８０号）。しかしながら、前記発明により得られた遺伝子組み替え体変異株は自然環境下で生存する能力を有しているため、前記組み替え体が培養または処分の過程で製造施設等から漏れた場合、前記組み替え体による環境への影響が懸念された。
【０００８】
自然環境下で生存する能力を有しないバチルス属細菌変異株としては、胞子形成能を欠損させた変異株があり、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ３株（タカラバイオ社製）が知られている。また、特許文献２には胞子形成能を欠損させた変異株が培養や発酵工程で利用されていることを開示している。しかしながら、遺伝子工学的手法によるタンパク質製造に有用なＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）の胞子形成能を欠損させた変異株についての報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特表２００６−５２７５８９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９、４５７（１９９１）
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８、３１８（２００５）
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３３８、１８１１（２００５）
【非特許文献４】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、３７８（１９８９）
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３０、ｅ４３（２００２）
【非特許文献６】Ｇａｎｇ Ｗｕ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．、４７、４４１−４４５（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、遺伝子工学的手法によるタンパク質製造に有用なＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの胞子形成能を欠損させた変異株、及び当該変異株を用いて遺伝子工学的にタンパク質を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）を変異原物質で処理することで得られる、胞子形成能が欠損したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株。
【００１３】
（２）さらにＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）と比較しプロテアーゼ活性が低下した、（１）に記載の変異株。
【００１４】
（３）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、（１）または（２）に記載の変異株に形質転換することにより得られる、前記タンパク質を発現可能なＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株組み替え体。
【００１５】
（４）タンパク質がヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩである、（３）に記載の組み替え体。
【００１６】
（５）（４）に記載の組み替え体を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１７】
以下本発明をさらに詳細に説明する。
【００１８】
一般的に変異株の取得方法としては、自然突然変異により派生した優良菌株を選別していく方法の他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することにより変異を加速させた後生産性が向上した菌株を選別していく方法、前記方法で得られた性質の異なる菌株同士を細胞融合させる方法が例示できる。このうち、本発明の変異株は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）を変異原物質で処理することにより得ることができ、かつ胞子形成能が欠損していることを特徴としている。
【００１９】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株の取得に用いる変異原物質としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチルといった化合物を例示できる。前記変異原物質を用いた変異株の選択方法としては、あらかじめ培養して得たＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの菌体を前記変異原物質の水溶液に懸濁し、一定時間放置した後、遠心分離などの方法で菌体を回収することで変異原物質を除去した後、平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する方法を例示できる。前記選択方法における、コロニーを選択する方法についても特に制限はなく、胞子形成用の固体培地上でのコロニーの見た目や形状（色つや、コロニー周辺部の形状）を指標に選択する方法や、任意の多数のコロニーを選択・分離後、液体培養を行ない胞子形成能を測定する方法が例示できる。胞子形成能を測定する方法としては、胞子形成能が残存していると形成した胞子により熱等の刺激に耐性を示す性質を利用すればよく、具体的には、胞子形成能がないと死滅する程度に熱等の刺激を与えた後、培養して再度生育するかを調べることで測定することができる。
【００２０】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株の保存方法については特に限定はなく、任意の培地に継代培養することで菌の活性を維持した状態で保存する方法、凍結法や凍結乾燥法により保存する方法が例示できる。継代培養による保存方法の場合は菌が活発に増殖している状態で新たな培地に継代するのが好ましい。凍結による保存の場合は、培地にグリセロール、マンニトール、ジメチルスルフォキシドといった通常の微生物の保存に用いられる凍結補助剤を添加した後に凍結すればよい。前記凍結補助剤の添加量は菌の生存に影響のない範囲であればよく、例えばグリセロールの場合では培養液容量全体の１／１０から１／３が好ましい。凍結の温度は可能な限り低温であることが好ましく、より好ましくは−２０℃以下、特に好ましくは−８０℃以下である。凍結乾燥による保存の場合は、凍結補助剤を用いてあらかじめ可能な限り低温で凍結後、減圧乾燥すればよい。凍結乾燥の場合の凍結補助剤としては上記の他にスキムミルク等も用いられる。凍結乾燥後の菌体は室温以下の温度で、好ましくは４℃以下で、さらに好ましくは−２０℃以下で保存される。
【００２１】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株は、バチルス属細菌の培養に好適な公知の培地で増殖させることができる。炭素源には糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸等が、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、アスパラギン酸・グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩、塩化ナトリウム等が、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を加えてもよい。また所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでも良い。なお、固体培地を用いる場合には上記の組成の培地に寒天やジェランガムといった固形化剤を添加し加熱溶解させた後に、培養に用いる試験管やシャーレに分注し、目的温度まで冷却して固形化後、用いればよい。バチルス属細菌増殖における培養温度は２０から４０℃、好ましくは２５から３５℃であり、より好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは５から１０、好ましくは７前後である。
【００２２】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株は、胞子形成能が欠損していることを特徴としている。したがって、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを本発明の変異株へ形質転換することにより得られる、組み換えＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いて前記タンパク質を製造する方法は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの有する高タンパク質分泌能を有しつつ、前記組み換え変異株による環境への影響が少ない製造方法を提供することができる。また、前記組み換え変異株のプロテアーゼ活性がＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株と比較し低下している場合は、野生株よりもプロテアーゼに由来する発現タンパク質の分解が低減するため、前記タンパク質の生産量がより増大する点で好ましい。以降、本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いたタンパク質製造の一例として、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造について詳細に説明する。
【００２３】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いて遺伝子工学的にヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを製造する際に使用する、ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドとしては、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子の全領域又は一部領域からなるポリヌクレオチドをそのまま用いてもよいが、前記ポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドがより好ましい。前記コドン変換したポリヌクレオチドの一態様として、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子のうち、少なくとも配列番号１の６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在するバチルス属細菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）を、コードするアミノ酸を同一のまま、バチルス属細菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドがあげられる（特願２００８−０４６４３８号）。なお、レアコドンとは、その宿主におけるコドンの使用頻度が少ないものをいう。宿主におけるコドンの使用頻度は、ゲノム遺伝子の塩基配列等の解析結果等から推測することが可能であり、例えば、バチルス属細菌の一種であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓにおけるレアコドンとしては、アミノ酸セリン（Ｓｅｒ）コドンのＵＣＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）コドンのＣＵＡ、アルギニン（Ａｒｇ）コドンのＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、イソロイシン（Ｉｌｅ）コドンのＡＵＡがあげられる。また、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）からも得ることができる。レアコドンから利用頻度の高いコドンへの変換は対応する塩基配列を変換することにより可能であり、塩基配列の変換はＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法など公知の変異導入法を利用することができるが、好ましい変換方法は、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献５）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）である。上記方法では、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。なお、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのヒト型からバチルス属細菌型へのコドン変換は、ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子配列（配列番号１）のすべてのレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換しても良いし、一部のレアコドン、例えば配列番号１に示すポリヌクレオチド配列のうち６４番目から８６７番目にあるレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換してもよい。
【００２４】
さらにヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドの５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンをコードするオリゴヌクレオチドを付加しても良く、また上記記載のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。ここに述べる、シグナルペプチドとは、細胞質内で発現したタンパク質が細胞膜を通過し、細胞膜外において分泌するためのポリペプチドであり、通常、当該タンパク質のＮ末端側に存在しており、細胞膜通過後、特定のプロテアーゼ酵素によって切断される。シグナルペプチドの例としては、配列番号１のアミノ酸番号１から１５、あるいは１から２０のペプチドをあげることができる。
【００２５】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、ヒト型ＦｃγＲＩを簡便に精製することを目的として、上記記載のポリヌクレオチドに、タグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加させてもよい。タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ミックタグ（Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ）等を例示することができる。付加させる位置は、上述のポリペプチドの生物活性を損なわない限りにおいて、Ｎ末端側、Ｃ末端側どちらでも構わない。上記記載のオリゴヌクレオチドへのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、当業者に周知の方法にて遺伝子工学的に作製することが可能である。
【００２６】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、コドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドが挿入された遺伝子組換えプラスミドベクターは、上記記載のヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドを公知の発現プラスミドベクターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入することにより、ヒト型ＦｃγＲＩが発現可能な遺伝子組換えプラスミドベクターを得ることができる。公知の発現プラスミドベクターとしては、例えば、バチルス属細菌の形質転換に利用されるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＷＶＯ１等をあげることができる。ここで述べる適当な位置とはプラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しないような位置等を意味する。そして、上記記載の遺伝子組換えプラスミドベクターを本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株に形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させることがきる。
【００２７】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓへの外来遺伝子の導入および発現のための手順、および方法は、実施例に記載した方法のほかにも、遺伝子工学の分野により慣用されているものを含み、具体的にはエレクトロポレーション法、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法等をあげることができる。
【００２８】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、ヒト型ＦｃγＲＩの製造で使用する培地の組成としては、本発明の変異株が増殖し、かつヒト型ＦｃγＲＩを生産し得るものであればよく、前述した炭素源、無機塩、ビタミン類から適宜選択して用いればよい。好ましい実施態様では、発現プラスミドベクターを含有するＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの増殖を選択的に可能にするために、発現プラスミドベクターの構成を基とした選抜剤を培地に含んでもよい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のためにネオマイシンを培地に添加する。発現プラスミドベクターに本発明の変異株の細胞壁タンパク質由来のプロモータを用いる場合には、菌の生育が定常期に入ってから活発に働くため、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、対数増殖期から定常期に移行した後、引き続き培養することによりタンパク質を培養液中へ分泌発現させることができる。培養温度は１５から４０℃が好ましく、ｐＨは６から８が好ましい。また、培養時間はＦｃγＲＩが十分に生産される時間であればよく、通常は数時間から２００時間の間に設定されるが、最適な培養時間は培地成分、培養温度、および通気量といった条件により変化するため、発現したタンパク質の発現量や活性等を測定して決定するのが好ましい。
【００２９】
培養液から、ヒト型ＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒト型ＦｃγＲＩを抽出すればよい。細胞質内で発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集め、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、ヒト型ＦｃγＲＩを抽出することができる。抽出タンパク質の中からヒト型ＦｃγＲＩを分離・精製するためには液体クロマトグラフィーを利用することができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等をあげることができる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより高純度なヒト型ＦｃγＲＩを調製することができる。
【００３０】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒト型ＦｃγＲＩの分析方法は、培養液から安定に効率的に定量できれば特に限定はないが、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）による定量が簡便性の点で好ましい。
【００３１】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒト型ＦｃγＲＩは、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、アフィニティーリガンド（分離剤）等の様々な用途に用いられる。使用の際の形態や純度はその用途により異なり、培養液のまま使用することも可能であり、高度に精製して用いることもでき、またその中間の純度の様々な精製度合いで使用される。前記精製されたヒト型ＦｃγＲＩは医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、アフィニティーリガンド（分離剤）等として利用される。精製ヒト型ＦｃγＲＩに要求される純度はその用途により異なり、それぞれの目的に要求される純度に調製されて利用される。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の変異株は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株を変異原物質で処理することで得られる。本発明の変異株は胞子形成能が欠損しているため、自然環境下で生存する能力を有さない。そのため、本発明の変異株を遺伝子工学的にタンパク質を製造する際の宿主として用いた場合、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの特徴である高タンパク質分泌能を有しつつ、前記変異株による環境への影響が少ない製造方法を提供することができる。
【００３３】
また、前記変異株のプロテアーゼ活性がＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株と比較し低下している場合は、野生株よりもプロテアーゼに由来する発現タンパク質の分解が低減するため、環境への影響が少なく、かつタンパク質を効率的に生産することができる。
【００３４】
特に、本発明の変異株はヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの遺伝子工学的生産の宿主として好ましく、得られたＦｃγＲＩは医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または分離剤のリガンドとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００３７】
実施例１ 本発明の変異株の所得（その１）
以下に示す方法で、胞子形成能が欠損したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を取得した。
【００３８】
（１）ＬＢ培地（トリプトン １０ｇ／Ｌ、食塩 １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ）４ｍＬ入りの１４ｍＬ容チューブにＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養を行なった。この培養液のうち１．０ｍＬを１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【００３９】
（２）（１）の菌体を１０μｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略記する）の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液１．０ｍＬに懸濁し、１０から６０分間室温で静置して変異導入処理を行なった。
【００４０】
（３）遠心分離して菌体を回収し０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。
【００４１】
（４）回収した菌体を２ｍＬの胞子形成培地（ニュートリエントブロス ８ｇ／Ｌ、塩化カリウム １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 １２０ｍｇ／Ｌ、硝酸カルシウム・四水和物 ２３６ｍｇ／Ｌ、塩化マンガン・四水和物 １９８ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄・七水和物 ０．２７８ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）に懸濁して、３７℃で一晩振とう培養を行なった。
【００４２】
（５）（４）の培養液を適宜希釈し、シングルコロニーを作成するよう適当量を胞子形成固体培地（胞子形成培地１Ｌに対し寒天を１４ｇ添加して溶解後、固化させた培地）に塗布し、３７℃で３日間静置培養した。
【００４３】
（６）生じたコロニーから透明なコロニー、または、末端もしくは全体がウェット状でクリーム色をしたコロニーを選択し、染色後、顕微鏡で観察することで、胞子形成能が欠損した変異株を取得した。
【００４４】
（７）（６）で取得した変異株が胞子を作らないことを、以下に示すマラカイトグリーンとサフラニンを用いた染色法（Ｗｉｒｔｚ法）により確認した。
（７−１）（６）で選択した変異株のコロニーをスライドガラス上に滴下した約５０μＬの水に懸濁し乾燥後、炎で軽くあぶることで、固定化した。
（７−２）固定化したコロニーに２００μＬの５％マラカイトグリーン水溶液を滴下し、３分間加温染色した。
（７−３）冷却後、固定化したコロニーを洗い流さないように水洗することで余分なマラカイトグリーン水溶液を洗い流し、２００μＬの０．５％サフラニン液を滴下後、３０秒間染色した。
（７−４）水洗・乾燥後、顕微鏡にて菌体及び胞子の染色具合を観察し、緑色に染まった胞子が存在しないことを確認した。
【００４５】
（８）（６）で取得した変異株が胞子形成能を欠損していることを以下の熱処理法にて確認した。
（８−１）（６）で選択した変異株を胞子形成固体培地で培養後、生じたコロニーを５００μＬの生理食塩水に懸濁して、８０℃・２０分間熱処理した。胞子形成能が残存していれば胞子を形成するため前記熱処理でも生存し、胞子形成能が欠損していれば前記熱処理で死滅する。
（８−２）ネガティブコントロール株として、胞子形成能を示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株を、ポジティブコントロール株として、胞子形成能欠損株として市販されているＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ３株（タカラバイオ社製）を（８−１）と同様な方法で処理した。
（８−３）ＬＢ固体培地上に塗布後、３７℃で静置培養することで胞子形成能を欠損しているかを確認した。
【００４６】
（６）で取得したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株（Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（胞子形成能あり）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ３株（胞子形成能なし）、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）（胞子形成能あり）の熱処理後の育成状況をまとめた結果を表１に示す。Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株は８０℃・２０分間の熱処理により生育しなかったことから、Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株が胞子形成能を欠損していることを確認した。
【００４７】
【表１】
実施例２ Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株の保存
（１）実施例１で得られたＬ−Ｄ７−ＨＫ１株をＬＢ培地で培養した。得られた培養液１ｍＬに、滅菌した７０％グリセロ−ル水溶液０．４ｍＬを加えてよく混合後、あらかじめ滅菌したサンプル瓶（容量２ｍＬ）に分注することでグリセロールストックを調製した。前記グリセロールストックは−８０℃にて凍結保存した。
（２）ＬＢ培地プレート上にＬ−Ｄ７−ＨＫ１株を植菌して３７℃で静置培養後、生じたコロニーを２０％スキムミルク水溶液で懸濁した。次いで、アンプル管に約０．１ｍＬずつ分注して、液体窒素中で凍結した後に凍結乾燥機で乾燥し、減圧を保ったまま封管することで凍結乾燥菌体を調製した。
【００４８】
実施例３ 本発明の変異株を用いたＦｃγＲＩ生産
実施例１で得られた変異株（Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株）、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）の有するプロテアーゼ活性、及び前記２つの株を宿主として用いたときのヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ発現量を比較した。
【００４９】
（１）プラスミドベクターを用いた一般的な遺伝子工学的手法により、ＦｃγＲＩ遺伝子（当該遺伝子のＣ末端側には精製・標識用のＣ−ｍｙｃタグが付加されている）を、野生株、または実施例１で取得した変異株（Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株）へ形質転換後、ＢＴＹｍ２培地（ポリペプトン ３０ｇ／Ｌ、酵母エキス ７．５ｇ／Ｌ、グルコース １５ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・七水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・四水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．００１ｇ／Ｌ）２００ｍＬに植菌し、３０℃にて２日間培養した。
【００５０】
（２）遠心上清を回収した後、上清中のプロテアーゼ活性を、下記に示すカゼイン法により測定した。
（２−１）１％（ｗ／ｖ）カゼインを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．２ｍＬを３０℃で５分間加温した後、酵素濃度を適宜調整した酵素溶液（培養上清）０．２ｍＬを添加し、３０℃で１０分から半日程度反応を行なった。
（２−２）反応停止液（０．１Ｍトリクロロ酢酸、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３Ｍ酢酸）０．４ｍＬを添加して反応を停止し、３０℃にて３０分間放置した後、酸変性タンパク質を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。
（２−３）遠心分離した上清０．２ｍＬを分注し、アルカリ溶液（０．４Ｍ炭酸ナトリウム）１．０ｍＬとフェリン試薬（フェノール試薬を脱イオン水で５倍希釈したもの）０．２ｍＬを添加し、３０℃にて２０分間加温した。
（２−４）分光光度計を用いて６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、酸可溶性タンパク質分解物の生成量を求めた。菌の濁度あたりの吸光度を計算し、プロテアーゼ活性の比較を行なった。なお、上記の酵素反応系に反応停止液を加えた後、酵素溶液を加えた系をブランクとする。
【００５１】
（３）遠心上清を回収した後、上清中のＦｃγＲＩ分解活性を下記に示す方法で測定した。
（３−１）培養液の遠心上清０．６７５ｍＬと適度に希釈した精製ＦｃγＲＩ溶液０．０７５ｍＬを混和後、４℃および３０℃にて静置し、一定時間経過ごとに０．１５ｍＬずつサンプリングを行なった。
（３−２）経時変化に対してＦｃγＲＩの残存率を下記に示すＥＬＩＳＡ法で測定し、培養上清中のＦｃγＲＩ分解活性を測定した。
（３−２−１）９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ／ｍＬに希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固定した。
（３−２−２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（３−２−３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、形質転換体の培養上清を１００μＬ添加し、固定化した抗体ガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ａｎｔｉ−ｃ−ｍｙｃ−ＨＲＰ抗体（Ｍｅｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＢｍｇＨ社製）を添加した。
（３−２−４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５２】
（４）遠心上清を回収した後、上清中のＦｃγＲＩ生産量を、（３−２）に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、形質転換体でのＦｃγＲＩ生産性を測定した。
【００５３】
結果を表２に示す。かっこ内の数字は、それぞれ野生株の結果を１００％とした際のＬ−Ｄ７−ＨＫ１株の相対値（％）を示す。Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株が有するプロテアーゼ活性は７．６１（濁度あたりのプロテアーゼ活性、以降同じ）、野生株が有する活性（２４．８）より約７０％低下していた。また、ＦｃγＲＩ分解活性で比較すると、３０℃・２４時間後のＦｃγＲＩ残存率が野生株では３６％に対し、Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株では７６％とプロテアーゼ活性抑制効果がみられた。以上より、実施例１で得られたＬ−Ｄ７−ＨＫ１株は胞子形成能を欠損し、かつ野生株よりプロテアーゼ活性が低下した株であることが判明した。
【００５４】
ＦｃγＲＩ発現量で比較すると、野生株を宿主として用いたときはが７７μｇ／Ｌであったのに対して、Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株を宿主として用いたときのＦｃγＲＩ発現量は８０μｇ／Ｌと野生株より向上していた。前述したように、Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株は野生株よりプロテアーゼ活性が低下した株であるため、プロテアーゼに由来する発現タンパク質の分解が低減している。そのため、ＦｃγＲＩ発現量が向上したと考えられる。
【００５５】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胞子形成能が欠損したバチルス属細菌、及びそれを用いた組み換えタンパク質、特にＦｃレセプターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９４のロイシン（Ｌｅｕ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。
【０００７】
以前、本出願人は、変異原物質で処理することでプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）活性が低下したバチルス属細菌変異株を取得し、当該変異株を遺伝子工学的にＦｃγＲＩを製造するための宿主として用いることで、バチルス属細菌野生株の有するプロテアーゼに由来した発現タンパク質の分解が低減し、結果としてＦｃγＲＩを効率的に生産することを実現している（特願２００９−００８６８０号）。しかしながら、前記発明により得られた遺伝子組み替え体変異株は自然環境下で生存する能力を有しているため、前記組み替え体が培養または処分の過程で製造施設等から漏れた場合、前記組み替え体による環境への影響が懸念された。
【０００８】
自然環境下で生存する能力を有しないバチルス属細菌変異株としては、胞子形成能を欠損させた変異株があり、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ３株（タカラバイオ社製）が知られている。また、特許文献２には胞子形成能を欠損させた変異株が培養や発酵工程で利用されていることを開示している。しかしながら、遺伝子工学的手法によるタンパク質製造に有用なＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）の胞子形成能を欠損させた変異株についての報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特表２００６−５２７５８９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９、４５７（１９９１）
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８、３１８（２００５）
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３３８、１８１１（２００５）
【非特許文献４】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、３７８（１９８９）
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３０、ｅ４３（２００２）
【非特許文献６】Ｇａｎｇ Ｗｕ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．、４７、４４１−４４５（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、遺伝子工学的手法によるタンパク質製造に有用なＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの胞子形成能を欠損させた変異株、及び当該変異株を用いて遺伝子工学的にタンパク質を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）を変異原物質で処理することで得られる、胞子形成能が欠損したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株。
【００１３】
（２）さらにＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）と比較しプロテアーゼ活性が低下した、（１）に記載の変異株。
【００１４】
（３）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、（１）または（２）に記載の変異株に形質転換することにより得られる、前記タンパク質を発現可能なＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株組み替え体。
【００１５】
（４）タンパク質がヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩである、（３）に記載の組み替え体。
【００１６】
（５）（４）に記載の組み替え体を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１７】
以下本発明をさらに詳細に説明する。
【００１８】
一般的に変異株の取得方法としては、自然突然変異により派生した優良菌株を選別していく方法の他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することにより変異を加速させた後生産性が向上した菌株を選別していく方法、前記方法で得られた性質の異なる菌株同士を細胞融合させる方法が例示できる。このうち、本発明の変異株は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）を変異原物質で処理することにより得ることができ、かつ胞子形成能が欠損していることを特徴としている。
【００１９】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株の取得に用いる変異原物質としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチルといった化合物を例示できる。前記変異原物質を用いた変異株の選択方法としては、あらかじめ培養して得たＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの菌体を前記変異原物質の水溶液に懸濁し、一定時間放置した後、遠心分離などの方法で菌体を回収することで変異原物質を除去した後、平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する方法を例示できる。前記選択方法における、コロニーを選択する方法についても特に制限はなく、胞子形成用の固体培地上でのコロニーの見た目や形状（色つや、コロニー周辺部の形状）を指標に選択する方法や、任意の多数のコロニーを選択・分離後、液体培養を行ない胞子形成能を測定する方法が例示できる。胞子形成能を測定する方法としては、胞子形成能が残存していると形成した胞子により熱等の刺激に耐性を示す性質を利用すればよく、具体的には、胞子形成能がないと死滅する程度に熱等の刺激を与えた後、培養して再度生育するかを調べることで測定することができる。
【００２０】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株の保存方法については特に限定はなく、任意の培地に継代培養することで菌の活性を維持した状態で保存する方法、凍結法や凍結乾燥法により保存する方法が例示できる。継代培養による保存方法の場合は菌が活発に増殖している状態で新たな培地に継代するのが好ましい。凍結による保存の場合は、培地にグリセロール、マンニトール、ジメチルスルフォキシドといった通常の微生物の保存に用いられる凍結補助剤を添加した後に凍結すればよい。前記凍結補助剤の添加量は菌の生存に影響のない範囲であればよく、例えばグリセロールの場合では培養液容量全体の１／１０から１／３が好ましい。凍結の温度は可能な限り低温であることが好ましく、より好ましくは−２０℃以下、特に好ましくは−８０℃以下である。凍結乾燥による保存の場合は、凍結補助剤を用いてあらかじめ可能な限り低温で凍結後、減圧乾燥すればよい。凍結乾燥の場合の凍結補助剤としては上記の他にスキムミルク等も用いられる。凍結乾燥後の菌体は室温以下の温度で、好ましくは４℃以下で、さらに好ましくは−２０℃以下で保存される。
【００２１】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株は、バチルス属細菌の培養に好適な公知の培地で増殖させることができる。炭素源には糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸等が、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、アスパラギン酸・グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩、塩化ナトリウム等が、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を加えてもよい。また所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでも良い。なお、固体培地を用いる場合には上記の組成の培地に寒天やジェランガムといった固形化剤を添加し加熱溶解させた後に、培養に用いる試験管やシャーレに分注し、目的温度まで冷却して固形化後、用いればよい。バチルス属細菌増殖における培養温度は２０から４０℃、好ましくは２５から３５℃であり、より好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは５から１０、好ましくは７前後である。
【００２２】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株は、胞子形成能が欠損していることを特徴としている。したがって、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを本発明の変異株へ形質転換することにより得られる、組み換えＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いて前記タンパク質を製造する方法は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの有する高タンパク質分泌能を有しつつ、前記組み換え変異株による環境への影響が少ない製造方法を提供することができる。また、前記組み換え変異株のプロテアーゼ活性がＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株と比較し低下している場合は、野生株よりもプロテアーゼに由来する発現タンパク質の分解が低減するため、前記タンパク質の生産量がより増大する点で好ましい。以降、本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いたタンパク質製造の一例として、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造について詳細に説明する。
【００２３】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いて遺伝子工学的にヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを製造する際に使用する、ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドとしては、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子の全領域又は一部領域からなるポリヌクレオチドをそのまま用いてもよいが、前記ポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドがより好ましい。前記コドン変換したポリヌクレオチドの一態様として、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子のうち、少なくとも配列番号１の６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在するバチルス属細菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）を、コードするアミノ酸を同一のまま、バチルス属細菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドがあげられる（特願２００８−０４６４３８号）。なお、レアコドンとは、その宿主におけるコドンの使用頻度が少ないものをいう。宿主におけるコドンの使用頻度は、ゲノム遺伝子の塩基配列等の解析結果等から推測することが可能であり、例えば、バチルス属細菌の一種であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓにおけるレアコドンとしては、アミノ酸セリン（Ｓｅｒ）コドンのＵＣＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）コドンのＣＵＡ、アルギニン（Ａｒｇ）コドンのＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、イソロイシン（Ｉｌｅ）コドンのＡＵＡがあげられる。また、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）からも得ることができる。レアコドンから利用頻度の高いコドンへの変換は対応する塩基配列を変換することにより可能であり、塩基配列の変換はＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法など公知の変異導入法を利用することができるが、好ましい変換方法は、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献５）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）である。上記方法では、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。なお、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのヒト型からバチルス属細菌型へのコドン変換は、ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子配列（配列番号１）のすべてのレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換しても良いし、一部のレアコドン、例えば配列番号１に示すポリヌクレオチド配列のうち６４番目から８６７番目にあるレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換してもよい。
【００２４】
さらにヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドの５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンをコードするオリゴヌクレオチドを付加しても良く、また上記記載のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。ここに述べる、シグナルペプチドとは、細胞質内で発現したタンパク質が細胞膜を通過し、細胞膜外において分泌するためのポリペプチドであり、通常、当該タンパク質のＮ末端側に存在しており、細胞膜通過後、特定のプロテアーゼ酵素によって切断される。シグナルペプチドの例としては、配列番号１のアミノ酸番号１から１５、あるいは１から２０のペプチドをあげることができる。
【００２５】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、ヒト型ＦｃγＲＩを簡便に精製することを目的として、上記記載のポリヌクレオチドに、タグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加させてもよい。タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ミックタグ（Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ）等を例示することができる。付加させる位置は、上述のポリペプチドの生物活性を損なわない限りにおいて、Ｎ末端側、Ｃ末端側どちらでも構わない。上記記載のオリゴヌクレオチドへのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、当業者に周知の方法にて遺伝子工学的に作製することが可能である。
【００２６】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、コドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドが挿入された遺伝子組換えプラスミドベクターは、上記記載のヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドを公知の発現プラスミドベクターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入することにより、ヒト型ＦｃγＲＩが発現可能な遺伝子組換えプラスミドベクターを得ることができる。公知の発現プラスミドベクターとしては、例えば、バチルス属細菌の形質転換に利用されるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＷＶＯ１等をあげることができる。ここで述べる適当な位置とはプラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しないような位置等を意味する。そして、上記記載の遺伝子組換えプラスミドベクターを本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株に形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させることがきる。
【００２７】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓへの外来遺伝子の導入および発現のための手順、および方法は、実施例に記載した方法のほかにも、遺伝子工学の分野により慣用されているものを含み、具体的にはエレクトロポレーション法、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法等をあげることができる。
【００２８】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、ヒト型ＦｃγＲＩの製造で使用する培地の組成としては、本発明の変異株が増殖し、かつヒト型ＦｃγＲＩを生産し得るものであればよく、前述した炭素源、無機塩、ビタミン類から適宜選択して用いればよい。好ましい実施態様では、発現プラスミドベクターを含有するＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの増殖を選択的に可能にするために、発現プラスミドベクターの構成を基とした選抜剤を培地に含んでもよい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のためにネオマイシンを培地に添加する。発現プラスミドベクターに本発明の変異株の細胞壁タンパク質由来のプロモータを用いる場合には、菌の生育が定常期に入ってから活発に働くため、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、対数増殖期から定常期に移行した後、引き続き培養することによりタンパク質を培養液中へ分泌発現させることができる。培養温度は１５から４０℃が好ましく、ｐＨは６から８が好ましい。また、培養時間はＦｃγＲＩが十分に生産される時間であればよく、通常は数時間から２００時間の間に設定されるが、最適な培養時間は培地成分、培養温度、および通気量といった条件により変化するため、発現したタンパク質の発現量や活性等を測定して決定するのが好ましい。
【００２９】
培養液から、ヒト型ＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒト型ＦｃγＲＩを抽出すればよい。細胞質内で発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集め、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、ヒト型ＦｃγＲＩを抽出することができる。抽出タンパク質の中からヒト型ＦｃγＲＩを分離・精製するためには液体クロマトグラフィーを利用することができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等をあげることができる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより高純度なヒト型ＦｃγＲＩを調製することができる。
【００３０】
本発明のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒト型ＦｃγＲＩの分析方法は、培養液から安定に効率的に定量できれば特に限定はないが、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）による定量が簡便性の点で好ましい。
【００３１】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒト型ＦｃγＲＩは、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、アフィニティーリガンド（分離剤）等の様々な用途に用いられる。使用の際の形態や純度はその用途により異なり、培養液のまま使用することも可能であり、高度に精製して用いることもでき、またその中間の純度の様々な精製度合いで使用される。前記精製されたヒト型ＦｃγＲＩは医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、アフィニティーリガンド（分離剤）等として利用される。精製ヒト型ＦｃγＲＩに要求される純度はその用途により異なり、それぞれの目的に要求される純度に調製されて利用される。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の変異株は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株を変異原物質で処理することで得られる。本発明の変異株は胞子形成能が欠損しているため、自然環境下で生存する能力を有さない。そのため、本発明の変異株を遺伝子工学的にタンパク質を製造する際の宿主として用いた場合、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓの特徴である高タンパク質分泌能を有しつつ、前記変異株による環境への影響が少ない製造方法を提供することができる。
【００３３】
また、前記変異株のプロテアーゼ活性がＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株と比較し低下している場合は、野生株よりもプロテアーゼに由来する発現タンパク質の分解が低減するため、環境への影響が少なく、かつタンパク質を効率的に生産することができる。
【００３４】
特に、本発明の変異株はヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの遺伝子工学的生産の宿主として好ましく、得られたＦｃγＲＩは医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または分離剤のリガンドとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００３７】
実施例１ 本発明の変異株の所得（その１）
以下に示す方法で、胞子形成能が欠損したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を取得した。
【００３８】
（１）ＬＢ培地（トリプトン １０ｇ／Ｌ、食塩 １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ）４ｍＬ入りの１４ｍＬ容チューブにＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養を行なった。この培養液のうち１．０ｍＬを１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【００３９】
（２）（１）の菌体を１０μｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略記する）の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液１．０ｍＬに懸濁し、１０から６０分間室温で静置して変異導入処理を行なった。
【００４０】
（３）遠心分離して菌体を回収し０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。
【００４１】
（４）回収した菌体を２ｍＬの胞子形成培地（ニュートリエントブロス ８ｇ／Ｌ、塩化カリウム １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 １２０ｍｇ／Ｌ、硝酸カルシウム・四水和物 ２３６ｍｇ／Ｌ、塩化マンガン・四水和物 １９８ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄・七水和物 ０．２７８ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）に懸濁して、３７℃で一晩振とう培養を行なった。
【００４２】
（５）（４）の培養液を適宜希釈し、シングルコロニーを作成するよう適当量を胞子形成固体培地（胞子形成培地１Ｌに対し寒天を１４ｇ添加して溶解後、固化させた培地）に塗布し、３７℃で３日間静置培養した。
【００４３】
（６）生じたコロニーから透明なコロニー、または、末端もしくは全体がウェット状でクリーム色をしたコロニーを選択し、染色後、顕微鏡で観察することで、胞子形成能が欠損した変異株を取得した。
【００４４】
（７）（６）で取得した変異株が胞子を作らないことを、以下に示すマラカイトグリーンとサフラニンを用いた染色法（Ｗｉｒｔｚ法）により確認した。
（７−１）（６）で選択した変異株のコロニーをスライドガラス上に滴下した約５０μＬの水に懸濁し乾燥後、炎で軽くあぶることで、固定化した。
（７−２）固定化したコロニーに２００μＬの５％マラカイトグリーン水溶液を滴下し、３分間加温染色した。
（７−３）冷却後、固定化したコロニーを洗い流さないように水洗することで余分なマラカイトグリーン水溶液を洗い流し、２００μＬの０．５％サフラニン液を滴下後、３０秒間染色した。
（７−４）水洗・乾燥後、顕微鏡にて菌体及び胞子の染色具合を観察し、緑色に染まった胞子が存在しないことを確認した。
【００４５】
（８）（６）で取得した変異株が胞子形成能を欠損していることを以下の熱処理法にて確認した。
（８−１）（６）で選択した変異株を胞子形成固体培地で培養後、生じたコロニーを５００μＬの生理食塩水に懸濁して、８０℃・２０分間熱処理した。胞子形成能が残存していれば胞子を形成するため前記熱処理でも生存し、胞子形成能が欠損していれば前記熱処理で死滅する。
（８−２）ネガティブコントロール株として、胞子形成能を示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株を、ポジティブコントロール株として、胞子形成能欠損株として市販されているＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ３株（タカラバイオ社製）を（８−１）と同様な方法で処理した。
（８−３）ＬＢ固体培地上に塗布後、３７℃で静置培養することで胞子形成能を欠損しているかを確認した。
【００４６】
（６）で取得したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株（Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（胞子形成能あり）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｉｎｅｎｓｉｓ ＳＰ３株（胞子形成能なし）、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）（胞子形成能あり）の熱処理後の育成状況をまとめた結果を表１に示す。Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株は８０℃・２０分間の熱処理により生育しなかったことから、Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株が胞子形成能を欠損していることを確認した。
【００４７】
【表１】
実施例２ Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株の保存
（１）実施例１で得られたＬ−Ｄ７−ＨＫ１株をＬＢ培地で培養した。得られた培養液１ｍＬに、滅菌した７０％グリセロ−ル水溶液０．４ｍＬを加えてよく混合後、あらかじめ滅菌したサンプル瓶（容量２ｍＬ）に分注することでグリセロールストックを調製した。前記グリセロールストックは−８０℃にて凍結保存した。
（２）ＬＢ培地プレート上にＬ−Ｄ７−ＨＫ１株を植菌して３７℃で静置培養後、生じたコロニーを２０％スキムミルク水溶液で懸濁した。次いで、アンプル管に約０．１ｍＬずつ分注して、液体窒素中で凍結した後に凍結乾燥機で乾燥し、減圧を保ったまま封管することで凍結乾燥菌体を調製した。
【００４８】
実施例３ 本発明の変異株を用いたＦｃγＲＩ生産
実施例１で得られた変異株（Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株）、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）の有するプロテアーゼ活性、及び前記２つの株を宿主として用いたときのヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ発現量を比較した。
【００４９】
（１）プラスミドベクターを用いた一般的な遺伝子工学的手法により、ＦｃγＲＩ遺伝子（当該遺伝子のＣ末端側には精製・標識用のＣ−ｍｙｃタグが付加されている）を、野生株、または実施例１で取得した変異株（Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株）へ形質転換後、ＢＴＹｍ２培地（ポリペプトン ３０ｇ／Ｌ、酵母エキス ７．５ｇ／Ｌ、グルコース １５ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・七水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・四水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．００１ｇ／Ｌ）２００ｍＬに植菌し、３０℃にて２日間培養した。
【００５０】
（２）遠心上清を回収した後、上清中のプロテアーゼ活性を、下記に示すカゼイン法により測定した。
（２−１）１％（ｗ／ｖ）カゼインを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．２ｍＬを３０℃で５分間加温した後、酵素濃度を適宜調整した酵素溶液（培養上清）０．２ｍＬを添加し、３０℃で１０分から半日程度反応を行なった。
（２−２）反応停止液（０．１Ｍトリクロロ酢酸、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３Ｍ酢酸）０．４ｍＬを添加して反応を停止し、３０℃にて３０分間放置した後、酸変性タンパク質を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。
（２−３）遠心分離した上清０．２ｍＬを分注し、アルカリ溶液（０．４Ｍ炭酸ナトリウム）１．０ｍＬとフェリン試薬（フェノール試薬を脱イオン水で５倍希釈したもの）０．２ｍＬを添加し、３０℃にて２０分間加温した。
（２−４）分光光度計を用いて６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、酸可溶性タンパク質分解物の生成量を求めた。菌の濁度あたりの吸光度を計算し、プロテアーゼ活性の比較を行なった。なお、上記の酵素反応系に反応停止液を加えた後、酵素溶液を加えた系をブランクとする。
【００５１】
（３）遠心上清を回収した後、上清中のＦｃγＲＩ分解活性を下記に示す方法で測定した。
（３−１）培養液の遠心上清０．６７５ｍＬと適度に希釈した精製ＦｃγＲＩ溶液０．０７５ｍＬを混和後、４℃および３０℃にて静置し、一定時間経過ごとに０．１５ｍＬずつサンプリングを行なった。
（３−２）経時変化に対してＦｃγＲＩの残存率を下記に示すＥＬＩＳＡ法で測定し、培養上清中のＦｃγＲＩ分解活性を測定した。
（３−２−１）９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ／ｍＬに希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固定した。
（３−２−２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（３−２−３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、形質転換体の培養上清を１００μＬ添加し、固定化した抗体ガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ａｎｔｉ−ｃ−ｍｙｃ−ＨＲＰ抗体（Ｍｅｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＢｍｇＨ社製）を添加した。
（３−２−４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５２】
（４）遠心上清を回収した後、上清中のＦｃγＲＩ生産量を、（３−２）に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、形質転換体でのＦｃγＲＩ生産性を測定した。
【００５３】
結果を表２に示す。かっこ内の数字は、それぞれ野生株の結果を１００％とした際のＬ−Ｄ７−ＨＫ１株の相対値（％）を示す。Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株が有するプロテアーゼ活性は７．６１（濁度あたりのプロテアーゼ活性、以降同じ）、野生株が有する活性（２４．８）より約７０％低下していた。また、ＦｃγＲＩ分解活性で比較すると、３０℃・２４時間後のＦｃγＲＩ残存率が野生株では３６％に対し、Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株では７６％とプロテアーゼ活性抑制効果がみられた。以上より、実施例１で得られたＬ−Ｄ７−ＨＫ１株は胞子形成能を欠損し、かつ野生株よりプロテアーゼ活性が低下した株であることが判明した。
【００５４】
ＦｃγＲＩ発現量で比較すると、野生株を宿主として用いたときはが７７μｇ／Ｌであったのに対して、Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株を宿主として用いたときのＦｃγＲＩ発現量は８０μｇ／Ｌと野生株より向上していた。前述したように、Ｌ−Ｄ７−ＨＫ１株は野生株よりプロテアーゼ活性が低下した株であるため、プロテアーゼに由来する発現タンパク質の分解が低減している。そのため、ＦｃγＲＩ発現量が向上したと考えられる。
【００５５】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）を変異原物質で処理することで得られる、胞子形成能が欠損したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株。
【請求項２】
さらにＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）と比較しプロテアーゼ活性が低下した、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、請求項１または２に記載の変異株に形質転換することにより得られる、前記タンパク質を発現可能なＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株組み替え体。
【請求項４】
タンパク質がヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩである、請求項３に記載の組み替え体。
【請求項５】
請求項４に記載の組み替え体を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【請求項１】
Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）を変異原物質で処理することで得られる、胞子形成能が欠損したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株。
【請求項２】
さらにＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）と比較しプロテアーゼ活性が低下した、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、請求項１または２に記載の変異株に形質転換することにより得られる、前記タンパク質を発現可能なＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株組み替え体。
【請求項４】
タンパク質がヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩである、請求項３に記載の組み替え体。
【請求項５】
請求項４に記載の組み替え体を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２２０５３９（Ｐ２０１０−２２０５３９Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７１１８０（Ｐ２００９−７１１８０）
【出願日】平成２１年３月２４日（２００９．３．２４）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２４日（２００９．３．２４）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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