腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法，使用方法，機能性食品および医薬
【課題】食物中からの分画成分により、肥満、糖尿病あるいは腸疾患の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬を提供する。
【解決手段】食物から得られる脂肪酸を変性し、変性脂肪酸を少なくとも１回のＨＰＬＣを含むクロマトグラフィーによって分画することにより、変性脂肪酸から腸管ホルモン分泌調整成分を取り出す。複数回のＨＰＬＣによる分画を行なってもよい。脂肪酸としては、特に、αリノレン酸、ＤＨＡ等不飽和長鎖脂肪酸あるいは天然の油脂、たとえば紫蘇油や魚油から画分された脂肪酸が適している。カラムクロマトグラフィーにより分画することにより、ＳＩＨＲおよびＩＩＨＲと名付けた物質が得られる。ＳＩＨＲは、カロリー当たりの腸管ホルモン分泌調整（促進または抑制）機能が高いので、長期間摂取しても、肥満等を招くことなく、糖尿病の予防，改善に役立つ。ＩＩＨＲは腸疾患等の予防、改善に役立つ。
【解決手段】食物から得られる脂肪酸を変性し、変性脂肪酸を少なくとも１回のＨＰＬＣを含むクロマトグラフィーによって分画することにより、変性脂肪酸から腸管ホルモン分泌調整成分を取り出す。複数回のＨＰＬＣによる分画を行なってもよい。脂肪酸としては、特に、αリノレン酸、ＤＨＡ等不飽和長鎖脂肪酸あるいは天然の油脂、たとえば紫蘇油や魚油から画分された脂肪酸が適している。カラムクロマトグラフィーにより分画することにより、ＳＩＨＲおよびＩＩＨＲと名付けた物質が得られる。ＳＩＨＲは、カロリー当たりの腸管ホルモン分泌調整（促進または抑制）機能が高いので、長期間摂取しても、肥満等を招くことなく、糖尿病の予防，改善に役立つ。ＩＩＨＲは腸疾患等の予防、改善に役立つ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法，使用方法，ならびに腸管ホルモン分泌調整成分を含む機能性食品および医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物を摂取すると腸管から種々のホルモンが分泌され、種々の生理機能を発揮することが知られている。これら腸管ホルモンのうち、膵蔵のβ細胞からインスリンを放出促進する能力を持つホルモンは、インクレチンと称されている。インクレチンとしてはグルカゴン様ペプチド（以下、ＧＬＰ-1(glucagon-like peptide 1)と呼ぶ）およびGIP（gastric inhibitory peptide）が知られている。インクレチンはインスリン分泌を介して、血糖の組織取り込みを調節する重要なホルモンである。インクレチン分泌の障害は糖尿病発症の原因となる。
【０００３】
一方、末梢でサブスタンスＰ（Subastance P）やニューロキニン（Neurokinin）がニューロキニン受容体（Neurokinin receptor）に反応することによる疾患として、例えば腸管の神経性炎症（非特許文献１参照），内臓の痛み／痛覚過敏症（非特許文献２参照），下痢（非特許文献３参照），腸管や膵臓の炎症惹起（非特許文献４参照），ストレス性皮膚炎症（非特許文献５参照），神経性炎症（非特許文献６参照），急性腸炎（非特許文献７，８参照），腸管憩室疾患（非特許文献９参照）などが知られている。
【０００４】
腸管ホルモンであるサブスタンスＰ、ニューロキニンやＣＣＫは過剰に継続的に放出された場合はＩＢＳ（過敏性腸疾患）やＩＢＤ（炎症性腸疾患）の発症や増悪を推進するが、健常人では、腸管免疫を惹起し、消化管に侵入する病原菌等から生体を守る働きや、消化液の分泌や腸管運動の調節を行い消化活動を推進する働きを行っている、生体にとって有用な物質である。サブスタンスＰ、ニューロキニンやＣＣＫ等の腸管ホルモン分泌が十分行われない患者に対しては、腸管ホルモン分泌を促進する療法が必要である。
【０００５】
また、腸管より腸管ホルモン放出を促進する食物中成分として、糖類、アミノ酸、ペプチド、脂質や脂肪酸類が知られている。いずれも栄養素として人体に利用される。また、腸管ホルモン分泌をコントロールしてインスリン放出を促進し、糖尿病を治療しようとする医薬品が開発されている。体内で分解されにくいＧＬＰ-1誘導体を投与するアプローチと、体内でのＧＬＰ-1分解を抑える分解酵素阻害剤（DPP4インヒビター）が次世代糖尿病薬として注目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Am J Physiol Gatrointesti Liver Physiol 279, G1298-G1306, 2000
【非特許文献２】Neuroscience,98(2), 345-352, 2000
【非特許文献３】Br. J. Pharmacol. 121(3), 375-80）1997
【非特許文献４】Am J Physiol 272, G785-93, 1997
【非特許文献５】Clin Exp Dermatol, 29, 644-648, 2004
【非特許文献６】Neurocience 125(2), 449-459, 2004
【非特許文献７】Neuroscience, 145(2), 699-707 2007
【非特許文献８】IBD (Eur J Pharmacol, 548(1-3), 150-137, 2006
【非特許文献９】Dig Liver Dis 36(5), 348-354,2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記次世代糖尿病薬などの臨床結果から、ＧＬＰ-1の血中濃度を上昇させることが、糖尿病治療に有効であることが明確になってきている。一方、ＧＬＰ-1は満腹中枢を刺激して、食欲を抑制することが知られている。ＧＬＰ-1誘導体の臨床結果により、肥満抑制効果が明確に示された。したがって、食物を摂取すれば、腸管からＧＬＰ-1が放出され、ＧＬＰ-1の血中濃度が上昇するので、自然に食物を摂取することは、糖尿病を予防することにもつながるといえる。
【０００８】
しかしながら、食物は栄養ともなるので、食物を摂取過剰することで、肥満、ひいては糖尿病を招く。カロリーの取り過ぎで肥満状態に陥ると、生活習慣病として糖尿病が誘発されることは周知の通りである。
したがって、ＧＬＰ-1の血中濃度を上昇させるために、食物を過剰に摂取することは、糖尿病の予防または治療方法として適切でない。
【０００９】
一方、食物摂取はＧＬＰ−１以外にも様々な腸管ホルモン放出を促進する。サブスタンスＰ，ニューロキニン，ＣＣＫ等は、腸管免疫の促進による腸管からの微生物の体内への侵入を防ぎ、また消化活動を助ける。これら腸管ホルモン分泌能力の低下した人は、腸管からの微生物侵入を防御する機能が低下して、腸のみならず全身の感染症誘発の危険にさらされる。また、消化活動の低下に端を発するさまざまな疾患の危険にさらされる。
食物摂取による腸管ホルモン分泌能力が低下した人には、腸管ホルモン分泌促進物質投与が有効であるが、当然のことながら、通常の食物に対して、カロリーあるいは分子（モル数）あたりの腸管ホルモン分泌能力の高い物質を投与する必要がある。
【００１０】
反面、腸管ホルモンの過剰分泌が継続することは、腸疾患、例えばＩＢＳ, ＩＢＤ発症あるいは増悪につながる。ＩＢＳ，ＩＢＤ等の腸疾患発症を予防治療するためには、腸管ホルモン分泌を抑制する物質を投与する必要がある。
【００１１】
本発明の目的は、食物中からカロリー当たりあるいは分子（モル数）の腸管ホルンの調整機能の高い成分を取り出す手段を講ずることにより、肥満、糖尿病あるいは腸疾患の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者達は、食物中に存在する、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの、ＧＬＰ-1放出活性などの腸管ホルモン調整機能の高い成分（分泌調整成分）を取り出すことができれば、これを摂取することにより、肥満、糖尿病あるいは腸疾患の予防あるいは治療が可能ではないかと考えた。
かかる発想の下に、鋭意努力の結果、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進活性あるいは腸管ホルモン分泌抑制活性が高い成分など、腸管ホルモン調整機能の高い成分を食品より取り出すことに成功した。
本発明は、本発明者達が出願した特願２００８−０６６９０９号の発明を前提とし、これをさらに発展させたものである。したがって、特願２００８−０６６９０９号中の各発明を前提としている。
【００１３】
すなわち、本発明の腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法は、脂肪酸を変性し、変性脂肪酸を少なくとも１回の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含むクロマトグラフィーにより分画して、変性脂肪酸から腸管ホルモン分泌調整成分を取り出す方法である。
【００１４】
脂肪酸としては、より好ましくは、αリノレン酸（αLA）、Docosahexanoic Acid（ＤＨＡ)等の不飽和長鎖脂肪酸，紫蘇油および魚油等の天然油脂，あるいは、天然油脂から調整した脂肪酸画分が適している。
そして、これらを変性する方法としては、周知の方法を採用することができる。たとえば、高温（３０℃から１５０℃）で加熱あるいは空気中や酸素中で攪拌し、酸化させる、あるいは紫外線照射等により変性する。あるいはこれらを組み合わせて変性させるなどの方法がある。
【００１５】
天然油脂からの脂肪酸の調製方法は、周知の方法を採用して実施することができる。典型的な方法としては、以下の処理がある。
アルカリで元の油脂をけん化し、けん化物を水と石油エーテルの混合物を用いて分画し、水−エタノール画分を酸処理すると、水−エタノール画分として遊離の脂肪酸とグリセリンの混合物が得られ、石油エーテル画分として不けん化物が得られる。次に、水−エタノール画分を石油エーテルで再度洗浄すると、石油エーテル側に脂肪酸が分画され、残りにグリセリンが分画される。
【００１６】
分画の方法としては、溶媒抽出法や各種クロマトグラフィーを用いることができるが、一部で必ず少なくとも１回のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ−）を用いる。本発明者達は、後述する各実施例に記載されるように、分離能の高いＨＰＬＣを用いることにより、より高精度で物質を特定しあるいは物質を特定できることを見出した。
たとえば、変性脂肪酸を逆相クロマトグラフを用いたＨＰＬＣにより、メタノールと水との容量比が８０〜５０：２０〜５０であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により溶出し、分画する。
その際、特願２００８−０６６９０９号に記載したように、シリカゲルプレート上で、展開溶媒としてヘキサン、エーテルおよび酢酸を、容量比６０：４０：１の割合で用い、Ｒｆ値が、０．１０〜０．１２、０．１３〜０．１５、０．２２〜０．２４、０．２３〜０．２５、０．２４〜０．２６、および０．２５〜０．２７の領域にスポットを示す画分を分画する。
【００１７】
また、分画の方法として、シリカゲルカラムを用いたクロマトグラフィー（たとえばシリカゲルカートリッジSep-Pak等），各種カラム（例えば逆相カラム、シリカゲルカラム等）を装着したＨＰＬＣ，あるいは他のクロマトグラフイー）によることができる。たとえば、変性脂質をシリカゲルカートリッジ（Sep-Pak Plus long, Waters, WT020520）にチャージし、溶媒ヘキサン：エーテルの比率を段階的に変えて溶出する。ＨＰＬＣの前処理としてシリカゲルカートリッジを用いる場合は、例えばヘキサン：エーテル＝１００：１〜５０混合液でカートリッジを洗浄後、ヘキサン：エーテル＝０〜５０：１００混合液で溶出する。この操作により未変性のαリノレン酸を除去でき、次の精製ステップであるＨＰＬＣでの分離性能向上あるいは、カラム劣化の防止に役立つ。
また、シリカゲルカートリッジを用いたクロマトグラフィーにより、腸管ホルモン分泌調整成分を大まかに分別することができる、たとえば溶出液として、ヘキサン：エーテルの比を、
(1)１００：５
(2)９０：１０
(3)８０：２０
(4)７０：３０
(5)６０：４０
(6)５０：５０
(7)４０：６０
(8)３０：７０
(9)２０：８０
(10)１０：９０
(11)０：１００
に変化させた混合液に、段階的に溶出する。目的の腸管ホルモン分泌調整物質に合わせて、洗浄に用いる溶出液と溶出に用いる溶出液を選択する。たとえば、上記溶出液(2)で洗い、溶出液(6)で目的物質を溶出する。機能性食品あるいは医薬品の成分として腸管ホルモン分泌調整物質を用いる時に、部分精製物で目的を達成できる場合があり、シリカゲルカラムでの部分精製は有効である。
シリカゲルカートリッジを用いる方法の詳細は、特願２００８−０６６９０９号に記載したとおりである。
【００１８】
そして、分画する際に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（シリカゲルプレートと、ヘキサン，エーテル，酢酸を容量比６０：４０：１で混合した展開溶媒とを用いる）においてＲｆ値が、０．１０〜０．１２、０．１３〜０．１５、０．２２〜０．２４、０．２３〜０．２５、０．２４〜０．２６、および０．２５〜０．２７の領域にスポットを示す画分を分画することにより、カロリー、又は分子（モル数）当たりのＧＬＰ-1（Glucagon-like peptide-1）分泌促進活性が高い物質が取り出される。本明細書においては、この分泌促進成分をＳＩＨＲ（Stimulators of intestinal hormone release )と呼ぶことにする。ＳＩＨＲは、その物質自体がＧＬＰ-1放出促進活性を有するものである。
【００１９】
また、分画する際に、ＨＰＬＣ（送液装置（SHIMADZU, LC-6AD）、カラムオーブン（SHIMADZU, CTO-10A）、検出器（SHIMADZU, SPD-M20A））において、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、ＨＰＬＣにおいて、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件でそれぞれ分画し、メタノールと水との容量比が６４〜６６：３６〜３４であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、溶出時間が１１〜１２．５分，１８．７５〜２０．２５分，２６．５〜２８分、６０〜６２分，および６２〜６４分の画分を分画することにより、アゴニストとして機能するＳＩＨＲが得られる。
【００２０】
また、ＨＰＬＣ（送液装置（SHIMADZU, LC-6AD）、カラムオーブン（SHIMADZU, CTO-10A）、検出器（SHIMADZU, SPD-M20A））において、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、メタノールと水との容量比が４９〜５１：５１〜４９であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、溶出時間が４８．２５〜５０．２５分、５０．２５〜５２．５分の画分を分画することによっても、アゴニストとして機能するＳＩＨＲを得ることができる。
【００２１】
また、分画する際に、ＨＰＬＣ（送液装置（SHIMADZU, LC-6AD）、カラムオーブン（SHIMADZU, CTO-10A）、検出器（SHIMADZU, SPD-M20A））において、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、メタノールと水との容量比が６９〜７１：３１〜２９であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、溶出時間が０〜５分，３５〜４０分，４５〜５０分，および６５〜７０分の画分を分画することにより、腸管ホルモン例えばＧＬＰ−１，ＣＣＫ、サブスタンスＰやニューロキニン類（例えばニューロキニンAの分泌抑制成分が得られる。
腸管ホルモンの過剰分泌あるいは継続的分泌は疾患の原因となり、ＣＣＫ, サブスタンスＰ（Substance P）およびニューロキニンＡ（Neurokinin A）の過剰分泌が人体に有害であることが知られている。本明細書においては、腸管ホルモンの分泌を抑制する食品成分を、ＩＩＨＲ（Inhibitor of Intestinal hormone-release）と呼ぶことにする。サブスタンスＰ、ニューロキニンまたはＣＣＫはＩＢＳ（過敏性腸疾患症候群）、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）等の腸疾患において、疾患の発症、増悪に関係することが知られており、ＩＩＨＲはIBS, IBD等腸疾患予防治療医薬あるいは機能性食品として有用である。
【００２２】
上記３種類のＨＰＬＣのうちのいずれかを一回目のＨＰＬＣとして行なって、得られた画分について、さらに、二回目のＨＰＬＣとして上記３種類のＨＰＬＣのうちのいずれかを行うことにより、より夾雑物が除かれたＳＩＨＲおよびＩＩＨＲを得ることができる。
上記二回目のＨＰＬＣの後、さらに、三回目，四回目，・・・と、多数回のＨＰＬＣを行なってもよい。
【００２３】
ＧＬＰ−１分泌促進物質を含む機能性食品、あるいはＧＬＰ−１分泌促進物質を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
ＧＬＰ-1の濃度増加にともなう対象疾患または症状として、例えば、(1)膵臓β細胞からインスリン分泌を促進することによる糖尿病治療薬 （２）膵臓β細胞の分化増殖促進による、高血糖、インスリン抵抗性、肥満などから糖尿病に移行することを予防する糖尿病予防薬。またはβ細胞移植時の移植細胞の生着率向上；(３)胃酸分泌抑制による胃酸過多治療；(４)腸管運動抑制による下痢治療（５）神経の可塑性や生存を維持し、神経障害による疾患の治療；及び(６)食欲抑制による肥満予防治療、などが対象となる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、ＧＬＰ-1の濃度亢進にともなう治療，症状改善のすべてが対象となる。
【００２４】
ＣＣＫ分泌抑制物質を含む機能性食品、あるいはＣＣＫ分泌抑制成分を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
ＣＣＫの濃度増加にともなう対象疾患または症状として、たとえば（１）ＣＣＫは膵炎を促進するために、ＣＣＫ濃度を低下させることにより、膵炎治療が可能になる。（２）ＣＣＫは胃酸の分泌を促進するので、ＣＣＫ濃度の抑制により、胃酸過多の治療が可能になる。（３）ＣＣＫは中枢で不安、ストレスによる行動障害を起こすために、ＣＣＫ濃度の抑制により、行動障害の治療や精神安定剤としての利用が可能になる。（４）ＣＣＫはモルヒネ等の鎮痛剤に拮抗するので、ＣＣＫ濃度を低下させることにより、鎮痛剤の効果増強が可能である。（５）ＣＣＫ濃度の抑止により、感染性下痢など下痢の治療が可能になる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、ＣＣＫの濃度亢進にともなう疾患の治療または症状改善のすべてが対象となり得る。
【００２５】
サブタンスＰまたはニューロキニン分泌抑制物質を含む機能性食品、あるいはサブタンスＰまたはニューロキニン分泌抑制物質を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
末梢で、サブスタンスＰやニューロキニンの濃度増加にともなう対象疾患として、例えば腸管の神経性炎症（非特許文献１参照），内臓の痛み／痛覚過敏症（非特許文献２参照），下痢（非特許文献３参照），腸管や膵臓の炎症惹起（非特許文献４参照），ストレス性皮膚炎症（非特許文献５参照），神経性炎症（非特許文献６参照），急性腸炎（非特許文献７，８参照），腸管憩室疾患（非特許文献９参照）などが知られている。ＩＩＨＲ（サブスタンスＰ／ニューロキニン分泌抑制物質）により、これらの疾患または症状の治療または症状改善が可能となる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、サブスタンスＰやニューロキニンの濃度亢進にともなう疾患の治療または症状改善のすべてが対象となり得る。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法，機能性食品または医薬によると、食物中からカロリー当たりの腸管ホルモン調整機能促進成分を分画して取り出すことにより、肥満、糖尿病の予防あるいは治療に供しうる機能食品や薬品を提供することができる。
食品成分の脂肪から腸管ホルモン分泌を促進あるいは抑制する成分の製造法を確立し、
分離された成分を含む機能性食品や医薬品の提供を試みた。目的の成分の純度を向上させることにより、夾雑物が持つ可能性のある副作用の危険を回避できる。あるいは活性本体の構造、性質を明らかにすることにより、目的の成分の安定的供給を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例３における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラフを示す図である。
【図２】実施例６における一回目ＨＰＬで分取された画分と各画分のＧＬＰ−１放出特性を示す図である。
【図３】実施例７における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラフを示す図である。
【図４】実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のＧＬＰ−１分泌阻害活性を示す図である。
【図５】実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のＣＣＫ分泌阻害活性を示す図である。
【図６】実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のサブスタンスＰ分泌阻害活性を示す図である。
【図７】実施例８における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと短時間側で分取された画分を示す図である。
【図８】実施例８における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと長時間側で分取された画分を示す図である。
【図９】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(1)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１０】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(1)に対する二回目ＨＰＬＣで分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１１】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(5)に対する二回目ＨＰＬＣで分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１２】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(9)に対する二回目ＨＰＬＣで分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１３】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(５)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１４】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(9)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１５】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(13)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１６】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(13)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１７】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(14)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１８】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(14)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１９】各実施例で説明したＳＩＨＲおよびＩＩＨＲの調製法のフローを示すフロー図である。
【図２０】二回目ＨＰＬＣの結果得られた各画分についてのＴＬＣ測定結果を示す図である。
【図２１】腸管ホルモン分泌調整物質のＴＬＣ・Rf値、およびＨＰＬＣにおける溶出時間を表にして示す図である。
【図２２】画分ＳＩＨＲ1-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図２３】画分ＳＩＨＲ1-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図２４】ＳＩＨＲ１−１のＮＭＲ分析結果を示す図である。
【図２５】ＳＩＨＲ１−２のＮＭＲ分析結果を示す図である。
【図２６】（ａ），（ｂ）は，順に、ＳＩＨＲ１−１，ＳＩＨＲ１−２の分子構造を示す図である。
【図２７】画分ＳＩＨＲ2-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図２８】画分ＳＩＨＲ2-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図２９】画分ＳＩＨＲ3-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図３０】画分ＳＩＨＲ3-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図３１】推定されるモノヒドロキシα−リノレン酸の構造、およびフラグメント構造を示す図である。
【図３２】二回目ＨＰＬＣにより調製した各画分ＳＩＨＲの比活性を表にして示す図である。
【図３３】シリカゲルカートリッジを用いた溶媒のヘキサン：エーテルの比を表にして示す図である。
【図３４】シリカゲルカートリッジによる変性αＬＡ分画物についてのＴＬＣ測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本実施の形態は、本発明者達の発明を記載した特願２００８−０６６９０９号における実施の形態を前提とし、その各実施例に追加して、以下の各実施例を行なった。したがって、特願２００８−０６６９０９号中の各実施例中の記載は、そのまま本出願にも適用される。
−実施例１−
脂肪酸として、αリノレン酸（αＬＡ（Sigma, L2376））475μｌをチューブ（容量２ｍｌ）に入れ、６０℃の恒温槽内で６日回転（7ｒｐｍ）させ、空気と混合させて、変性αリノレン酸を得た。変性αリノレン酸は次の精製操作まで、−３０℃で保存した。
【００２９】
−実施例２−
実施例１で調製した変性αリノレン酸の２００μｌをヘキサン：エーテル＝９５：５混合液３ｍｌに溶解し、シリカゲルカートリッジ（Sep-Pak Plus long, Waters, WT020520）にチャージした。同溶媒４０ｍｌでカートリッジを洗浄した後に、エーテルで溶出した溶出液を、窒素気流下で乾固した。残留物をジメチルスルホキシド（DMSO（Sigma, D5879））２００μｌ中に溶解し、次の精製操作のサンプルとした。
同様の操作を繰り返し、サンプルをストックした。サンプルは、次の操作まで、−３０℃で保存した。
本シリカゲルカートリッジを用いた精製操作は、未変性のαリノレン酸を除くことが主たる目的で、次の精製過程に用いるＨＰＬＣのカラムでの成分分離効果の向上およびカラム寿命の延長効果がある。
【００３０】
−実施例３−
実施例２で得たサンプルに対して、送液装置（SHIMADZU, LC-6AD）、カラムオーブン（SHIMADZU, CTO-10A）、検出器（SHIMADZU, SPD-M20A）を用いて、ＨＰＬＣ分画を行なった。即ち、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）、カラムオーブン温度４０℃、流速１ｍｌ／分、移動相はメタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化し、このカラムに実施例２で得たサンプルの７５μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で溶出した。
図１は、実施例３における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラフを示す図である。
【００３１】
−実施例４−
溶出時間１０〜３０分、および５５〜７５分の間を２分間隔で分取した。同様の操作を２回行い、３回分の溶出液からFolch法で脂溶性成分を回収した。Folch法とは脂溶性成分を抽出する方法で、以下の操作による。
溶媒の組成から各溶媒の量を計算し、遠沈管に最終組成がクロロホルム：メタノール：H2O＝２：１：０.９となるように調整する。試験管ミキサーで攪拌した後、2400rpm、４℃、10分間遠心し、２層に分離した下層（クロロホルム層）を回収する。回収した溶媒と等量のクロロホルムを遠沈管に加え、同様に攪拌、遠心をし、再び下層を回収する。回収した溶液を窒素ガス気流下で乾固し、クロロホルム：メタノール＝２：１の混合液（４ｍｌ）に溶解する。サンプルは、次の操作まで、−３０℃で保存した。
【００３２】
−実施例５−
実施例４のサンプルから２ｍｌをサンプリングし、窒素気流化で乾固し、5μｌのＤＭＳＯに溶解して、活性測定用サンプルとした。サンプルは、次の操作まで、−３０℃で保存した。
【００３３】
−実施例６−
実施例５のサンプルのＳＴＣ-1（腸管のホルモン分泌細胞の株化細胞：Am. J. Pathol. 136:1349-1363(1990)参照）からのGLP-1分泌促進活性を測定した。ＳＴＣ-1細胞を4×10５細胞／mlの濃度で１ｍｌずつ12ウェルプレートにまき、48時間培養後、各フラクション（２μｌ）をDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM（SIGMA, D6429））（５００μｌ）に溶解したものを添加して、１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ−１量をELISAで測定した。ELISAとしては、Rat GLP-1 ELISA Kit wako（和光純薬工業, 29-59201）を用いた。
図２は、実施例６における一回目ＨＰＬＣで分取された画分と各画分のＧＬＰ−１放出特性を示す図である。
【００３４】
−実施例７−
STC-1からのGLP-1分泌抑制活性を測定するために、実施例２で得たサンプルに対してＨＰＬＣ分画を行なった。実施例３と装置条件は同じで、移動相はメタノール：H2O＝７０：３０混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化し、このカラムに、実施例２で得たサンプルの７５μｌをチャージし、メタノール：H2O＝７０：３０混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画は０〜８０分の間を５分間隔で分画した。
図３は、実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のクロマトグラフを示す図である。
【００３５】
これらの溶出液からFolch法で脂溶性成分を回収し、溶液を窒素ガス気流下で乾固し、DMSO 25μｌに溶解した。
そして、実施例６と同様に、ＳＴＣ-1細胞を12ウェルプレートにまき、48時間培養後、αＬＡを50μＭ添加と同時に各フラクションを添加して、１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ-1, ＣＣＫ, およびサブスタンスＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。CCK、およびサブスタンスPのELISAには、Cholecytokinin Octapeptide (CCK) (26-30) (Human, Rat, Mouse) (Non-Sulfated) EIA Kit（PHOENIX PHARMACEUTICALS, INC., EK-069-04）、ParameterTM Substance P Assay（R&D Systems, KGE007）を用いた。
図４は、実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のＧＬＰ−１分泌阻害活性を示す図である。
図５は、実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のＣＣＫ分泌阻害活性を示す図である。
図６は、実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のサブスタンスＰ分泌阻害活性を示す図である。
【００３６】
−実施例８−
実施例２で調整したサンプル 75μｌを実施例３と同じＨＰＬＣ条件で、ＨＰＬＣを行い、以下に記す時間の画分を分取した。
画分１（11〜12.5分）
画分５（18.75〜20.25分）
画分９（26.5〜28分）
画分１３（60〜62分）
画分１４（62〜64分）
同様のＨＰＬＣ分画を4回行い、計5回分の脂溶性成分を別々にFolch法で回収した。 図７は、実施例８における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと短時間側で分取された画分を示す図である。
図８は、実施例８における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと長時間側で分取された画分を示す図である。
これらのサンプルを、それぞれ、一回目ＨＰＬＣ画分１、５、９、１３、１４とする。回収した溶液は窒素ガス気流下で乾固し、DMSO（50μｌ）に溶解した。サンプルは、次の操作まで、−３０℃で保存した。
【００３７】
−実施例９−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分１（画分(1)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。ここでは、一回目ＨＰＬＣとは条件を変更して、逆相カラム（実施例３と同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝５０：５０混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(1)を20μｌだけチャージし、メタノール：H2O＝５０：５０混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画に際しては、主要なピークおよびその前後を含む領域を分取した。
その結果、図９に示すように、ＳＩＨＲ1-1前画分（46.25〜48.25分）、ＳＩＨＲ1-1画分（48.25〜50.25分）、ＳＩＨＲ1-2画分（50.25〜52.5分）、ＳＩＨＲ1-2後画分（52.5〜54.5分）が分取された。
図９からわかるように、一回目ＨＰＬＣにおいて一成分に見えた画分(1)は、ＳＩＨＲ1-1画分（48.25〜50.25分）、ＳＩＨＲ1-2画分（50.25〜52.5分）という２成分に分かれた。
分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１の混合液２mlに溶解して、次の操作まで、−３０℃で保存した。
【００３８】
−実施例１０−
実施例９で分取された画分の1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その2μｌをGLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。
GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１０は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(1)に対する二回目ＨＰＬＣで分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００３９】
−実施例１１−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分５（画分(5)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。一回目ＨＰＬＣと同じ条件で、逆相カラム（実施例３と同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(5)の２０μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画時間を、（16.75〜18.75分）、（18.75〜20.25分）、（20.25〜22.5分）として、画分(5)の20μｌについてＨＰＬＣ分画を行った。本操作を二回目のＨＰＬＣ分画とする。分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（2ml）に溶解して、次の操作まで、−３０℃で保存した。
図１３に示すように、ＳＩＨＲ2-1前画分（16.75〜18.75分），ＳＩＨＲ2-1画分（18.75〜20.25分）、ＳＩＨＲ2-1後画分（20.25〜22.5分）の３つの画分が分取された。
【００４０】
−実施例１２−
実施例１１で分取された画分の1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その2μｌをGLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１１は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(5)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００４１】
−実施例１３−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分９（画分(9)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。一回目ＨＰＬＣと同じ条件で、逆相カラム（実施例３同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝６５：３５（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(9)の20μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画時間を、（24.5〜26.5分）、（26.5〜28分）、（28〜30分）として、画分(9)の20μｌをＨＰＬＣ分画を行った。本操作を二回目ＨＰＬＣ分画とする。分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（ ２ml）に溶解して、次の操作まで−３０℃で保存した。
図１４に示すように、ＳＩＨＲ2-2前画分（24.5〜26.5分）、ＳＩＨＲ2-2画分（26.5〜28分）、ＳＩＨＲ2-2後画分（28〜30分）の３つの画分が分取された。
【００４２】
−実施例１４−
また、実施例１３の分取画分の1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その2μｌをGLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１２は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(9)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００４３】
−実施例１５−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分１３（画分(13)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。一回目ＨＰＬＣと同じ条件で、逆相カラム（実施例３同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(13)の20μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画時間は、（58〜60分）、（60〜62分）、（62〜64分）である。本操作を二回目ＨＰＬＣ分画とする。分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（２ml）に溶解して、次の操作まで、−３０℃で保存した。
図１５に示すように、ＳＩＨＲ3-1前画分（58〜60分）、ＳＩＨＲ3-1画分（60〜62分）、ＳＩＨＲ3-1後画分（62〜64分）の３つの画分が分取された。
【００４４】
−実施例１６−
実施例１５のサンプルの1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その２μｌについて、GLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１６は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(13)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００４５】
−実施例１７−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分１４（画分(14)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。一回目ＨＰＬＣと同じ条件で、逆相カラム（実施例３同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(14)の20μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画時間は、（60〜62分）、（62〜64分）、（64〜65.75分）である。画分(14)の20μｌについて、ＨＰＬＣ分画を行った。本操作を二回目ＨＰＬＣ分画とする。分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合胃液（２ml）に溶解して、次の操作まで、−３０℃で保存した。
図１８に示すように、ＳＩＨＲ3-2前画分（60〜62分）、ＳＩＨＲ3-2画分（62〜64分）、ＳＩＨＲ3-2後画分（64〜65.75分）の３つの画分が分取された。
【００４６】
−実施例１８−
実施例１７のサンプルの1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その2μｌについて、GLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１７は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(14)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００４７】
−実施例１９−
図１９は、上記各実施例で説明したＳＩＨＲおよびＩＩＨＲの調製法のフローを示すフロー図である。
図１９に示すように、ＳＩＨＲ画分１については、一回目ＨＰＬＣと異なる条件で、二回目ＨＰＬＣを行い、ＳＩＨＲ画分２〜５については、一回目ＨＰＬＣと同じ条件で二回目ＨＰＬＣを行っている。ただし、ＳＩＨＲ画分２〜５についても、一回目ＨＰＬＣと異なる条件で、二回目ＨＰＬＣを行なうことができる。ＩＩＨＲ画分１〜４についてもＳＩＨＲと同様に、一回目と同じ条件で２回目ＨＰＬＣを行うことも、一回目ＨＰＬＣと異なる条件で二回目ＨＰＬＣを行うこともできる。
【００４８】
−実施例２０−
実施例９、１１、１３、１５および１７で得た調整サンプル（2ml）のうち、GLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性の測定に使用した分を除く残存部分0.8ml（４０％分）を窒素気流下で乾固し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（32μｌ）に溶解し、そのうち16μｌ（２０％分）を、ＴＬＣ（担体：シリカゲル、Whatman 社、Thin Layer Chromatography Plate, Partisil (R)K6F Silica Gel 60 Å with Fluorescent Indicator Size: 10x20cm Layer Thickness 250 μm, catalogue No. 4861-720）にかけ、溶媒：（ヘキサン：エーテル：酢酸＝６０：４０：１混合液）にて展開させ（室温において）、硫酸銅による炭化発色により有機炭素の存在を測定した。
図２０は、二回目ＨＰＬＣの結果得られた各画分についてのＴＬＣ測定結果を示す図である。
図２１は、腸管ホルモン分泌調整物質のＴＬＣ・Rf値、およびＨＰＬＣにおける溶出時間を表にして示す図である。
図２０や図２１のデータから各ＳＩＨＲおよびＩＩＨＲを同定することができる。なお、ＩＩＨＲについては、特願２００８−０６６９０９号に記載されている通りである。
【００４９】
−実施例２１−
実施例１０、１２、１４，１６、１８で調整したサンプルの各１μｌずつについて、質量分析（MS）を行った。ＨＰＬＣ部には逆相カラム（TOSOH, TSKgel super ODS (2.0mmID×50mm)）を用い、質量分析装置としてはLCMS-IT-TOF（SHIMADZU）を用い、条件（ネガティブモード、CDL温度200℃、ヒートブロック温度200℃、ネブライザーガス1.5L／min、CIDエネルギー100％、コリジョンガス100％）で、分析を行なった。
図２２は、画分ＳＩＨＲ1-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。図２３は、画分ＳＩＨＲ1-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
画分ＳＩＨＲ1-1および画分ＳＩＨＲ1-2については、主要なピークにおいてマススペクトル223（M−H）を確認した。これより、画分ＳＩＨＲ1-1および画分ＳＩＨＲ1-2の主要成分の分子量は224であることがわかる。
【００５０】
次に、実施例２（変性αＬＡのＳｅｐ−ｐａｋ分画）、実施例８（一回目ＨＰＬＣ分画）、実施例９（ＳＩＨＲ１の二回目ＨＰＬＣ分画）を繰り返し行い、ＳＩＨＲ１−１、１−２を各４００ｎｍｏｌ調製した。サンプルは次の操作まで、−３０℃で保存した。
次に、上記手順により調製したＳＩＨＲ１−１、１−２のＮＭＲ分析を行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトルの測定はＪＥＯＬ ＥＣＡ５００（５００ ＭＨｚ）（日本電子）で行った。ケミカルシフト（δ）はトリメチルシランに対する相対的なｐｐｍ値で示す。カップリングコンスタント（Ｊ値）はＨｚで示す。多重度はｓｉｎｇｌｅｔ：ｓ、ｄｏｕｂｌｅｔ：ｄ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ：ｍの略号で示す。
図２４は、ＳＩＨＲ１−１のＮＭＲ分析結果を示し、１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１．３０−１．３９（ｍ、６Ｈ）、１．４１−１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．６９（ｍ、２Ｈ）、２．３０−２．４０（ｍ、４Ｈ）、５．９７−６．０４（ｍ、１Ｈ）、６．１５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０、１４．９ Ｈｚ）、６．２４−６．３１（ｍ、１Ｈ）、７．４５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１１．５、１４．９ Ｈｚ）、９．６２ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０ Ｈｚ）となる。同図のデータを採取した条件は、Original Points Count:16.384,Actual Points Count:16.384,Acquisition Times 1.7459(sec),Spectrum Width:18.763(ppm)である。
図２６（ａ）は、上記結果から導かれるＳＩＨＲ１−１の分子構造を示す図である。
図２５は、ＳＩＨＲ１−２のＮＭＲ分析結果を示し、１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２９−１．３８（ｍ、６Ｈ）、１．４１−１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．５７−１．６９（ｍ、２Ｈ）、２．１８−２．２５（ｍ、２Ｈ）、２．２９−２．２４（ｍ、２Ｈ）、６．０９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０、１５．４ Ｈｚ）、６．２１−６．３８（ｍ、２Ｈ）、７．０８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７、１５．４ Ｈｚ）、９．５４ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０ Ｈｚ）となる。同図のデータを採取した条件は、Original Points Count:16.384,Actual Points Count:16.384,Acquisition Times 1.7459(sec),Spectrum Width:18.763(ppm)である。
図２６（ｂ）は、上記結果から導かれるＳＩＨＲ１−２の分子構造を示す図である。
【００５１】
図２７は、画分ＳＩＨＲ2-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。図２８は、画分ＳＩＨＲ2-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
画分SIGR2-1および画分ＳＩＨＲ2-2の主要なピークにおいて、マススペクトル309（M−H）を確認した。これより、画分ＳＩＨＲ2-1および画分ＳＩＨＲ2-2の主要成分の分子量は310であることがわかった。構造は、αリノレン酸が二箇所ヒドロキシ化された分子の可能性がある。
図２９は、画分ＳＩＨＲ3-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。図３０は、画分ＳＩＨＲ3-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
図２９，図３０に示すように、画分ＳＩＨＲ3-1および画分ＳＩＨＲ3-2の主要なピークにおいて、マススペクトル293（M−H）を確認した。これにより、画分ＳＩＨＲ3-1および画分ＳＩＨＲ3-2の主要成分の分子量は294であり、構造はαリノレン酸のいずれかの二重結合が酸化されモノヒドロキシ構造となった物質であると推定された。
さらにMS／MS測定を行ったところ、画分ＳＩＨＲ3-1ではフラグメントイオンとして、分子量171（M-H）、および分子量235（M-H）が確認された（図２９参照）。画分ＳＩＨＲ3-2ではフラグメントイオンとして、分子量195（M-H）、および分子量211（M-H）が確認された（図３０参照）。
【００５２】
図３１は、上記結果から推定されるモノヒドロキシα−リノレン酸の構造、およびフラグメント構造を示す図である。リノレン酸の自動酸化の位置については9位、12位、13位、16位が酸化を受ける4パターン（シス、トランスも含めると8パターン）の可能性があり（非特許文献：Prog Lipid Res., 23(4), 197-221, 1984）、それぞれフラグメント化の可能性も図３１に示すように起こる。ＳＩＨＲ3-1でフラグメントイオンとして、分子量171（M-H）、および分子量235（M-H）が確認できたことは、主要な成分として9位、もしくは16位がモノヒドロキシ化されたαリノレン酸であることが推定された。ＳＩＨＲ3-2ではフラグメントイオンとして、分子量195（M-H）、および分子量211（M-H）が確認できたことは、主要な成分として12位、もしくは13位がモノヒドロキシ化されたαリノレン酸であることが推定された。
【００５３】
−実施例２２−
本実施例では、実施例９，１１，１３，１５，１７で調製した、ＳＩＨＲ画分の比活性を測定した。
比活性の算出は、以下の２通りの方法で行った。
１）実施例２０で行ったTLCの結果をLAS-4000mini（FUJIFILM）で撮影した後、各サンプルのスポットをMulti Gauge Ver3.0（FUJIFILM）で数値化した。同時に、展開したαリノレン酸の数値を対照にした。発色は硫酸銅による炭化発色で、炭化水素が存在する物質はすべて発色するため発色強度が含有炭素数に比例する。TLCの数値と実施例１０、１２、１４、１６、１８の腸管ホルモン分泌促進活性の結果から、各ＳＩＨＲ画分の比活性を求めた。
２）遊離脂肪酸のカルボキシル基への反応により遊離脂肪酸のモル数を定量するNEFA C-テストワコー（和光純薬工業, 279-75401）を用いた。実施例９、１１、１３、１５および１７で調整し、腸管ホルモン分泌促進活性及び、実施例２０でTLCに使用した残りの各サンプル16μｌ（２０％分）を窒素気流下で乾固し、5% Triton X-100（SIGMA, T-8787）を含むH2O （5μｌ）に溶解し、その４μｌをNEFA C-テストワコーで定量した。この定量値と実施例１０、１２、１４、１６、１８の腸管ホルモン分泌促進活性の結果から比活性を求めた。
図３２は、二回目ＨＰＬＣにより調製した各画分ＳＩＨＲの比活性を表にして示す図である。
【００５４】
−実施例２３−
本精製法において、シリカゲルカートリッジ(Sep-Pak Plus long, Waters, WT020520) はＨＰＬＣの前処理として実施した。主たる目的は、未変性のαリノレン酸を除去して、ＨＰＬＣにおけるサンプルの分離能力の向上、およびカラム劣化防止である。しかしながら、目的により、ＳＩＨＲやＩＩＨＲの粗精製物を利用する場合がある。粗精製物を調製する目的でこのシリカゲルカートリッジを用いることができる。
実施例１で調製した変性αリノレン酸の２００μｌを、ヘキサン：エーテル＝１０：０．５混合液（３ml）に溶解して、Sep-Pak plus long (Waters)にチャージした。ヘキサン：エーテルの比を変化させ段階的に溶出した。
図３３は、シリカゲルカートリッジを用いた溶媒のヘキサン：エーテルの比を表にして示す図である。
【００５５】
また、各溶出画分を窒素気流下で乾固し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（２００μｌ）に溶解して、その４μｌについてTLCを実施した。TLCの条件は、実施例１９と同様である。
図３４は、シリカゲルカートリッジによる変性αＬＡ分画物についてのＴＬＣ測定の結果を示す図である。
画分ＳＩＨＲ1-1および画分ＳＩＨＲ1-2粗精製物を得るには、溶出液１〜５のうちいずれかの溶出液で処理後、溶出液６、又は溶出液７で溶出する。
画分ＳＩＨＲ2-1および画分ＳＩＨＲ2-2粗精製物を得るには、溶出液１〜１０のうちいずれかの溶出液で処理後、溶出液１１、又は溶出液１２で溶出する。
画分ＳＩＨＲ3-1および画分ＳＩＨＲ3-2粗精製物を得るには、溶出液１〜６のうちいずれかの溶出液で処理後、溶出液７、又は溶出液８で溶出する。以上の操作を行うことにより、各粗精製物を調製することができる。
【００５６】
−機能性食品，医薬としての機能−
ＳＩＨＲ１−１, ＳＩＨＲ１−２, ＳＩＨＲ２−２、ＳＩＨＲ２−２，ＳＩＨＲ３−１３およびＳＩＨＲ３−２は、糖尿病や肥満予防治療に効果があるＧＬＰ-1の腸管からの放出を促進する。通常の食事においては脂肪酸がこの働きをするが、これらの物質は、脂肪酸よりもカロリー当たりあるいは分子あたりのＧＬＰ-1放出活性が２〜５０倍高い。よって、脂肪酸投与に比べて、カロリーが低く、高いＧＬＰ-1放出活性を発揮する、有効な糖尿病や肥満予防治療薬あるいは機能性食品を提供できる。
【００５７】
また、サブスタンスＰおよびＣＣＫの放出は炎症を惹起したり、痛みを発生したりする。ＩＢＳ、ＩＢＤなどの腸炎の発症あるいは増悪の原因となると考えられる。ＩＩＨＲ１, ＩＩＨＲ２, ＩＩＨＲ３, ＩＩＨＲ４は、サブスタンスＰおよびＣＣＫの放出を抑制するので、これらの成分を利用して、ＩＢＳ、ＩＢＤなどの腸炎の発症あるいは増悪をおさえる予防治療薬あるいは機能性食品を提供できる。ＩＢＳ，ＩＢＤの発症、増悪の環境では脂肪酸に対する反応が過敏になっていることから、これを抑制することは、ＩＢＳ，ＩＢＤに対する重要な医薬あるいは機能性食品を提供できる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の腸管ホルモン分泌調節剤は、医薬だけでなく、機能性食品として利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法，使用方法，ならびに腸管ホルモン分泌調整成分を含む機能性食品および医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物を摂取すると腸管から種々のホルモンが分泌され、種々の生理機能を発揮することが知られている。これら腸管ホルモンのうち、膵蔵のβ細胞からインスリンを放出促進する能力を持つホルモンは、インクレチンと称されている。インクレチンとしてはグルカゴン様ペプチド（以下、ＧＬＰ-1(glucagon-like peptide 1)と呼ぶ）およびGIP（gastric inhibitory peptide）が知られている。インクレチンはインスリン分泌を介して、血糖の組織取り込みを調節する重要なホルモンである。インクレチン分泌の障害は糖尿病発症の原因となる。
【０００３】
一方、末梢でサブスタンスＰ（Subastance P）やニューロキニン（Neurokinin）がニューロキニン受容体（Neurokinin receptor）に反応することによる疾患として、例えば腸管の神経性炎症（非特許文献１参照），内臓の痛み／痛覚過敏症（非特許文献２参照），下痢（非特許文献３参照），腸管や膵臓の炎症惹起（非特許文献４参照），ストレス性皮膚炎症（非特許文献５参照），神経性炎症（非特許文献６参照），急性腸炎（非特許文献７，８参照），腸管憩室疾患（非特許文献９参照）などが知られている。
【０００４】
腸管ホルモンであるサブスタンスＰ、ニューロキニンやＣＣＫは過剰に継続的に放出された場合はＩＢＳ（過敏性腸疾患）やＩＢＤ（炎症性腸疾患）の発症や増悪を推進するが、健常人では、腸管免疫を惹起し、消化管に侵入する病原菌等から生体を守る働きや、消化液の分泌や腸管運動の調節を行い消化活動を推進する働きを行っている、生体にとって有用な物質である。サブスタンスＰ、ニューロキニンやＣＣＫ等の腸管ホルモン分泌が十分行われない患者に対しては、腸管ホルモン分泌を促進する療法が必要である。
【０００５】
また、腸管より腸管ホルモン放出を促進する食物中成分として、糖類、アミノ酸、ペプチド、脂質や脂肪酸類が知られている。いずれも栄養素として人体に利用される。また、腸管ホルモン分泌をコントロールしてインスリン放出を促進し、糖尿病を治療しようとする医薬品が開発されている。体内で分解されにくいＧＬＰ-1誘導体を投与するアプローチと、体内でのＧＬＰ-1分解を抑える分解酵素阻害剤（DPP4インヒビター）が次世代糖尿病薬として注目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Am J Physiol Gatrointesti Liver Physiol 279, G1298-G1306, 2000
【非特許文献２】Neuroscience,98(2), 345-352, 2000
【非特許文献３】Br. J. Pharmacol. 121(3), 375-80）1997
【非特許文献４】Am J Physiol 272, G785-93, 1997
【非特許文献５】Clin Exp Dermatol, 29, 644-648, 2004
【非特許文献６】Neurocience 125(2), 449-459, 2004
【非特許文献７】Neuroscience, 145(2), 699-707 2007
【非特許文献８】IBD (Eur J Pharmacol, 548(1-3), 150-137, 2006
【非特許文献９】Dig Liver Dis 36(5), 348-354,2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記次世代糖尿病薬などの臨床結果から、ＧＬＰ-1の血中濃度を上昇させることが、糖尿病治療に有効であることが明確になってきている。一方、ＧＬＰ-1は満腹中枢を刺激して、食欲を抑制することが知られている。ＧＬＰ-1誘導体の臨床結果により、肥満抑制効果が明確に示された。したがって、食物を摂取すれば、腸管からＧＬＰ-1が放出され、ＧＬＰ-1の血中濃度が上昇するので、自然に食物を摂取することは、糖尿病を予防することにもつながるといえる。
【０００８】
しかしながら、食物は栄養ともなるので、食物を摂取過剰することで、肥満、ひいては糖尿病を招く。カロリーの取り過ぎで肥満状態に陥ると、生活習慣病として糖尿病が誘発されることは周知の通りである。
したがって、ＧＬＰ-1の血中濃度を上昇させるために、食物を過剰に摂取することは、糖尿病の予防または治療方法として適切でない。
【０００９】
一方、食物摂取はＧＬＰ−１以外にも様々な腸管ホルモン放出を促進する。サブスタンスＰ，ニューロキニン，ＣＣＫ等は、腸管免疫の促進による腸管からの微生物の体内への侵入を防ぎ、また消化活動を助ける。これら腸管ホルモン分泌能力の低下した人は、腸管からの微生物侵入を防御する機能が低下して、腸のみならず全身の感染症誘発の危険にさらされる。また、消化活動の低下に端を発するさまざまな疾患の危険にさらされる。
食物摂取による腸管ホルモン分泌能力が低下した人には、腸管ホルモン分泌促進物質投与が有効であるが、当然のことながら、通常の食物に対して、カロリーあるいは分子（モル数）あたりの腸管ホルモン分泌能力の高い物質を投与する必要がある。
【００１０】
反面、腸管ホルモンの過剰分泌が継続することは、腸疾患、例えばＩＢＳ, ＩＢＤ発症あるいは増悪につながる。ＩＢＳ，ＩＢＤ等の腸疾患発症を予防治療するためには、腸管ホルモン分泌を抑制する物質を投与する必要がある。
【００１１】
本発明の目的は、食物中からカロリー当たりあるいは分子（モル数）の腸管ホルンの調整機能の高い成分を取り出す手段を講ずることにより、肥満、糖尿病あるいは腸疾患の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者達は、食物中に存在する、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの、ＧＬＰ-1放出活性などの腸管ホルモン調整機能の高い成分（分泌調整成分）を取り出すことができれば、これを摂取することにより、肥満、糖尿病あるいは腸疾患の予防あるいは治療が可能ではないかと考えた。
かかる発想の下に、鋭意努力の結果、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進活性あるいは腸管ホルモン分泌抑制活性が高い成分など、腸管ホルモン調整機能の高い成分を食品より取り出すことに成功した。
本発明は、本発明者達が出願した特願２００８−０６６９０９号の発明を前提とし、これをさらに発展させたものである。したがって、特願２００８−０６６９０９号中の各発明を前提としている。
【００１３】
すなわち、本発明の腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法は、脂肪酸を変性し、変性脂肪酸を少なくとも１回の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含むクロマトグラフィーにより分画して、変性脂肪酸から腸管ホルモン分泌調整成分を取り出す方法である。
【００１４】
脂肪酸としては、より好ましくは、αリノレン酸（αLA）、Docosahexanoic Acid（ＤＨＡ)等の不飽和長鎖脂肪酸，紫蘇油および魚油等の天然油脂，あるいは、天然油脂から調整した脂肪酸画分が適している。
そして、これらを変性する方法としては、周知の方法を採用することができる。たとえば、高温（３０℃から１５０℃）で加熱あるいは空気中や酸素中で攪拌し、酸化させる、あるいは紫外線照射等により変性する。あるいはこれらを組み合わせて変性させるなどの方法がある。
【００１５】
天然油脂からの脂肪酸の調製方法は、周知の方法を採用して実施することができる。典型的な方法としては、以下の処理がある。
アルカリで元の油脂をけん化し、けん化物を水と石油エーテルの混合物を用いて分画し、水−エタノール画分を酸処理すると、水−エタノール画分として遊離の脂肪酸とグリセリンの混合物が得られ、石油エーテル画分として不けん化物が得られる。次に、水−エタノール画分を石油エーテルで再度洗浄すると、石油エーテル側に脂肪酸が分画され、残りにグリセリンが分画される。
【００１６】
分画の方法としては、溶媒抽出法や各種クロマトグラフィーを用いることができるが、一部で必ず少なくとも１回のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ−）を用いる。本発明者達は、後述する各実施例に記載されるように、分離能の高いＨＰＬＣを用いることにより、より高精度で物質を特定しあるいは物質を特定できることを見出した。
たとえば、変性脂肪酸を逆相クロマトグラフを用いたＨＰＬＣにより、メタノールと水との容量比が８０〜５０：２０〜５０であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により溶出し、分画する。
その際、特願２００８−０６６９０９号に記載したように、シリカゲルプレート上で、展開溶媒としてヘキサン、エーテルおよび酢酸を、容量比６０：４０：１の割合で用い、Ｒｆ値が、０．１０〜０．１２、０．１３〜０．１５、０．２２〜０．２４、０．２３〜０．２５、０．２４〜０．２６、および０．２５〜０．２７の領域にスポットを示す画分を分画する。
【００１７】
また、分画の方法として、シリカゲルカラムを用いたクロマトグラフィー（たとえばシリカゲルカートリッジSep-Pak等），各種カラム（例えば逆相カラム、シリカゲルカラム等）を装着したＨＰＬＣ，あるいは他のクロマトグラフイー）によることができる。たとえば、変性脂質をシリカゲルカートリッジ（Sep-Pak Plus long, Waters, WT020520）にチャージし、溶媒ヘキサン：エーテルの比率を段階的に変えて溶出する。ＨＰＬＣの前処理としてシリカゲルカートリッジを用いる場合は、例えばヘキサン：エーテル＝１００：１〜５０混合液でカートリッジを洗浄後、ヘキサン：エーテル＝０〜５０：１００混合液で溶出する。この操作により未変性のαリノレン酸を除去でき、次の精製ステップであるＨＰＬＣでの分離性能向上あるいは、カラム劣化の防止に役立つ。
また、シリカゲルカートリッジを用いたクロマトグラフィーにより、腸管ホルモン分泌調整成分を大まかに分別することができる、たとえば溶出液として、ヘキサン：エーテルの比を、
(1)１００：５
(2)９０：１０
(3)８０：２０
(4)７０：３０
(5)６０：４０
(6)５０：５０
(7)４０：６０
(8)３０：７０
(9)２０：８０
(10)１０：９０
(11)０：１００
に変化させた混合液に、段階的に溶出する。目的の腸管ホルモン分泌調整物質に合わせて、洗浄に用いる溶出液と溶出に用いる溶出液を選択する。たとえば、上記溶出液(2)で洗い、溶出液(6)で目的物質を溶出する。機能性食品あるいは医薬品の成分として腸管ホルモン分泌調整物質を用いる時に、部分精製物で目的を達成できる場合があり、シリカゲルカラムでの部分精製は有効である。
シリカゲルカートリッジを用いる方法の詳細は、特願２００８−０６６９０９号に記載したとおりである。
【００１８】
そして、分画する際に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（シリカゲルプレートと、ヘキサン，エーテル，酢酸を容量比６０：４０：１で混合した展開溶媒とを用いる）においてＲｆ値が、０．１０〜０．１２、０．１３〜０．１５、０．２２〜０．２４、０．２３〜０．２５、０．２４〜０．２６、および０．２５〜０．２７の領域にスポットを示す画分を分画することにより、カロリー、又は分子（モル数）当たりのＧＬＰ-1（Glucagon-like peptide-1）分泌促進活性が高い物質が取り出される。本明細書においては、この分泌促進成分をＳＩＨＲ（Stimulators of intestinal hormone release )と呼ぶことにする。ＳＩＨＲは、その物質自体がＧＬＰ-1放出促進活性を有するものである。
【００１９】
また、分画する際に、ＨＰＬＣ（送液装置（SHIMADZU, LC-6AD）、カラムオーブン（SHIMADZU, CTO-10A）、検出器（SHIMADZU, SPD-M20A））において、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、ＨＰＬＣにおいて、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件でそれぞれ分画し、メタノールと水との容量比が６４〜６６：３６〜３４であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、溶出時間が１１〜１２．５分，１８．７５〜２０．２５分，２６．５〜２８分、６０〜６２分，および６２〜６４分の画分を分画することにより、アゴニストとして機能するＳＩＨＲが得られる。
【００２０】
また、ＨＰＬＣ（送液装置（SHIMADZU, LC-6AD）、カラムオーブン（SHIMADZU, CTO-10A）、検出器（SHIMADZU, SPD-M20A））において、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、メタノールと水との容量比が４９〜５１：５１〜４９であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、溶出時間が４８．２５〜５０．２５分、５０．２５〜５２．５分の画分を分画することによっても、アゴニストとして機能するＳＩＨＲを得ることができる。
【００２１】
また、分画する際に、ＨＰＬＣ（送液装置（SHIMADZU, LC-6AD）、カラムオーブン（SHIMADZU, CTO-10A）、検出器（SHIMADZU, SPD-M20A））において、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、メタノールと水との容量比が６９〜７１：３１〜２９であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、溶出時間が０〜５分，３５〜４０分，４５〜５０分，および６５〜７０分の画分を分画することにより、腸管ホルモン例えばＧＬＰ−１，ＣＣＫ、サブスタンスＰやニューロキニン類（例えばニューロキニンAの分泌抑制成分が得られる。
腸管ホルモンの過剰分泌あるいは継続的分泌は疾患の原因となり、ＣＣＫ, サブスタンスＰ（Substance P）およびニューロキニンＡ（Neurokinin A）の過剰分泌が人体に有害であることが知られている。本明細書においては、腸管ホルモンの分泌を抑制する食品成分を、ＩＩＨＲ（Inhibitor of Intestinal hormone-release）と呼ぶことにする。サブスタンスＰ、ニューロキニンまたはＣＣＫはＩＢＳ（過敏性腸疾患症候群）、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）等の腸疾患において、疾患の発症、増悪に関係することが知られており、ＩＩＨＲはIBS, IBD等腸疾患予防治療医薬あるいは機能性食品として有用である。
【００２２】
上記３種類のＨＰＬＣのうちのいずれかを一回目のＨＰＬＣとして行なって、得られた画分について、さらに、二回目のＨＰＬＣとして上記３種類のＨＰＬＣのうちのいずれかを行うことにより、より夾雑物が除かれたＳＩＨＲおよびＩＩＨＲを得ることができる。
上記二回目のＨＰＬＣの後、さらに、三回目，四回目，・・・と、多数回のＨＰＬＣを行なってもよい。
【００２３】
ＧＬＰ−１分泌促進物質を含む機能性食品、あるいはＧＬＰ−１分泌促進物質を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
ＧＬＰ-1の濃度増加にともなう対象疾患または症状として、例えば、(1)膵臓β細胞からインスリン分泌を促進することによる糖尿病治療薬 （２）膵臓β細胞の分化増殖促進による、高血糖、インスリン抵抗性、肥満などから糖尿病に移行することを予防する糖尿病予防薬。またはβ細胞移植時の移植細胞の生着率向上；(３)胃酸分泌抑制による胃酸過多治療；(４)腸管運動抑制による下痢治療（５）神経の可塑性や生存を維持し、神経障害による疾患の治療；及び(６)食欲抑制による肥満予防治療、などが対象となる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、ＧＬＰ-1の濃度亢進にともなう治療，症状改善のすべてが対象となる。
【００２４】
ＣＣＫ分泌抑制物質を含む機能性食品、あるいはＣＣＫ分泌抑制成分を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
ＣＣＫの濃度増加にともなう対象疾患または症状として、たとえば（１）ＣＣＫは膵炎を促進するために、ＣＣＫ濃度を低下させることにより、膵炎治療が可能になる。（２）ＣＣＫは胃酸の分泌を促進するので、ＣＣＫ濃度の抑制により、胃酸過多の治療が可能になる。（３）ＣＣＫは中枢で不安、ストレスによる行動障害を起こすために、ＣＣＫ濃度の抑制により、行動障害の治療や精神安定剤としての利用が可能になる。（４）ＣＣＫはモルヒネ等の鎮痛剤に拮抗するので、ＣＣＫ濃度を低下させることにより、鎮痛剤の効果増強が可能である。（５）ＣＣＫ濃度の抑止により、感染性下痢など下痢の治療が可能になる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、ＣＣＫの濃度亢進にともなう疾患の治療または症状改善のすべてが対象となり得る。
【００２５】
サブタンスＰまたはニューロキニン分泌抑制物質を含む機能性食品、あるいはサブタンスＰまたはニューロキニン分泌抑制物質を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
末梢で、サブスタンスＰやニューロキニンの濃度増加にともなう対象疾患として、例えば腸管の神経性炎症（非特許文献１参照），内臓の痛み／痛覚過敏症（非特許文献２参照），下痢（非特許文献３参照），腸管や膵臓の炎症惹起（非特許文献４参照），ストレス性皮膚炎症（非特許文献５参照），神経性炎症（非特許文献６参照），急性腸炎（非特許文献７，８参照），腸管憩室疾患（非特許文献９参照）などが知られている。ＩＩＨＲ（サブスタンスＰ／ニューロキニン分泌抑制物質）により、これらの疾患または症状の治療または症状改善が可能となる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、サブスタンスＰやニューロキニンの濃度亢進にともなう疾患の治療または症状改善のすべてが対象となり得る。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法，機能性食品または医薬によると、食物中からカロリー当たりの腸管ホルモン調整機能促進成分を分画して取り出すことにより、肥満、糖尿病の予防あるいは治療に供しうる機能食品や薬品を提供することができる。
食品成分の脂肪から腸管ホルモン分泌を促進あるいは抑制する成分の製造法を確立し、
分離された成分を含む機能性食品や医薬品の提供を試みた。目的の成分の純度を向上させることにより、夾雑物が持つ可能性のある副作用の危険を回避できる。あるいは活性本体の構造、性質を明らかにすることにより、目的の成分の安定的供給を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例３における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラフを示す図である。
【図２】実施例６における一回目ＨＰＬで分取された画分と各画分のＧＬＰ−１放出特性を示す図である。
【図３】実施例７における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラフを示す図である。
【図４】実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のＧＬＰ−１分泌阻害活性を示す図である。
【図５】実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のＣＣＫ分泌阻害活性を示す図である。
【図６】実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のサブスタンスＰ分泌阻害活性を示す図である。
【図７】実施例８における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと短時間側で分取された画分を示す図である。
【図８】実施例８における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと長時間側で分取された画分を示す図である。
【図９】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(1)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１０】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(1)に対する二回目ＨＰＬＣで分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１１】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(5)に対する二回目ＨＰＬＣで分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１２】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(9)に対する二回目ＨＰＬＣで分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１３】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(５)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１４】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(9)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１５】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(13)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１６】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(13)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１７】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(14)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【図１８】一回目ＨＰＬＣで分取された画分(14)に対する二回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと分取された画分を示す図である。
【図１９】各実施例で説明したＳＩＨＲおよびＩＩＨＲの調製法のフローを示すフロー図である。
【図２０】二回目ＨＰＬＣの結果得られた各画分についてのＴＬＣ測定結果を示す図である。
【図２１】腸管ホルモン分泌調整物質のＴＬＣ・Rf値、およびＨＰＬＣにおける溶出時間を表にして示す図である。
【図２２】画分ＳＩＨＲ1-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図２３】画分ＳＩＨＲ1-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図２４】ＳＩＨＲ１−１のＮＭＲ分析結果を示す図である。
【図２５】ＳＩＨＲ１−２のＮＭＲ分析結果を示す図である。
【図２６】（ａ），（ｂ）は，順に、ＳＩＨＲ１−１，ＳＩＨＲ１−２の分子構造を示す図である。
【図２７】画分ＳＩＨＲ2-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図２８】画分ＳＩＨＲ2-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図２９】画分ＳＩＨＲ3-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図３０】画分ＳＩＨＲ3-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
【図３１】推定されるモノヒドロキシα−リノレン酸の構造、およびフラグメント構造を示す図である。
【図３２】二回目ＨＰＬＣにより調製した各画分ＳＩＨＲの比活性を表にして示す図である。
【図３３】シリカゲルカートリッジを用いた溶媒のヘキサン：エーテルの比を表にして示す図である。
【図３４】シリカゲルカートリッジによる変性αＬＡ分画物についてのＴＬＣ測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本実施の形態は、本発明者達の発明を記載した特願２００８−０６６９０９号における実施の形態を前提とし、その各実施例に追加して、以下の各実施例を行なった。したがって、特願２００８−０６６９０９号中の各実施例中の記載は、そのまま本出願にも適用される。
−実施例１−
脂肪酸として、αリノレン酸（αＬＡ（Sigma, L2376））475μｌをチューブ（容量２ｍｌ）に入れ、６０℃の恒温槽内で６日回転（7ｒｐｍ）させ、空気と混合させて、変性αリノレン酸を得た。変性αリノレン酸は次の精製操作まで、−３０℃で保存した。
【００２９】
−実施例２−
実施例１で調製した変性αリノレン酸の２００μｌをヘキサン：エーテル＝９５：５混合液３ｍｌに溶解し、シリカゲルカートリッジ（Sep-Pak Plus long, Waters, WT020520）にチャージした。同溶媒４０ｍｌでカートリッジを洗浄した後に、エーテルで溶出した溶出液を、窒素気流下で乾固した。残留物をジメチルスルホキシド（DMSO（Sigma, D5879））２００μｌ中に溶解し、次の精製操作のサンプルとした。
同様の操作を繰り返し、サンプルをストックした。サンプルは、次の操作まで、−３０℃で保存した。
本シリカゲルカートリッジを用いた精製操作は、未変性のαリノレン酸を除くことが主たる目的で、次の精製過程に用いるＨＰＬＣのカラムでの成分分離効果の向上およびカラム寿命の延長効果がある。
【００３０】
−実施例３−
実施例２で得たサンプルに対して、送液装置（SHIMADZU, LC-6AD）、カラムオーブン（SHIMADZU, CTO-10A）、検出器（SHIMADZU, SPD-M20A）を用いて、ＨＰＬＣ分画を行なった。即ち、逆相カラム（TOSOH, TSKgel ODS-80Ts, 4.6mmID×250mm）、カラムオーブン温度４０℃、流速１ｍｌ／分、移動相はメタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化し、このカラムに実施例２で得たサンプルの７５μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で溶出した。
図１は、実施例３における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラフを示す図である。
【００３１】
−実施例４−
溶出時間１０〜３０分、および５５〜７５分の間を２分間隔で分取した。同様の操作を２回行い、３回分の溶出液からFolch法で脂溶性成分を回収した。Folch法とは脂溶性成分を抽出する方法で、以下の操作による。
溶媒の組成から各溶媒の量を計算し、遠沈管に最終組成がクロロホルム：メタノール：H2O＝２：１：０.９となるように調整する。試験管ミキサーで攪拌した後、2400rpm、４℃、10分間遠心し、２層に分離した下層（クロロホルム層）を回収する。回収した溶媒と等量のクロロホルムを遠沈管に加え、同様に攪拌、遠心をし、再び下層を回収する。回収した溶液を窒素ガス気流下で乾固し、クロロホルム：メタノール＝２：１の混合液（４ｍｌ）に溶解する。サンプルは、次の操作まで、−３０℃で保存した。
【００３２】
−実施例５−
実施例４のサンプルから２ｍｌをサンプリングし、窒素気流化で乾固し、5μｌのＤＭＳＯに溶解して、活性測定用サンプルとした。サンプルは、次の操作まで、−３０℃で保存した。
【００３３】
−実施例６−
実施例５のサンプルのＳＴＣ-1（腸管のホルモン分泌細胞の株化細胞：Am. J. Pathol. 136:1349-1363(1990)参照）からのGLP-1分泌促進活性を測定した。ＳＴＣ-1細胞を4×10５細胞／mlの濃度で１ｍｌずつ12ウェルプレートにまき、48時間培養後、各フラクション（２μｌ）をDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM（SIGMA, D6429））（５００μｌ）に溶解したものを添加して、１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ−１量をELISAで測定した。ELISAとしては、Rat GLP-1 ELISA Kit wako（和光純薬工業, 29-59201）を用いた。
図２は、実施例６における一回目ＨＰＬＣで分取された画分と各画分のＧＬＰ−１放出特性を示す図である。
【００３４】
−実施例７−
STC-1からのGLP-1分泌抑制活性を測定するために、実施例２で得たサンプルに対してＨＰＬＣ分画を行なった。実施例３と装置条件は同じで、移動相はメタノール：H2O＝７０：３０混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化し、このカラムに、実施例２で得たサンプルの７５μｌをチャージし、メタノール：H2O＝７０：３０混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画は０〜８０分の間を５分間隔で分画した。
図３は、実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のクロマトグラフを示す図である。
【００３５】
これらの溶出液からFolch法で脂溶性成分を回収し、溶液を窒素ガス気流下で乾固し、DMSO 25μｌに溶解した。
そして、実施例６と同様に、ＳＴＣ-1細胞を12ウェルプレートにまき、48時間培養後、αＬＡを50μＭ添加と同時に各フラクションを添加して、１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ-1, ＣＣＫ, およびサブスタンスＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。CCK、およびサブスタンスPのELISAには、Cholecytokinin Octapeptide (CCK) (26-30) (Human, Rat, Mouse) (Non-Sulfated) EIA Kit（PHOENIX PHARMACEUTICALS, INC., EK-069-04）、ParameterTM Substance P Assay（R&D Systems, KGE007）を用いた。
図４は、実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のＧＬＰ−１分泌阻害活性を示す図である。
図５は、実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のＣＣＫ分泌阻害活性を示す図である。
図６は、実施例７における一回目ＨＰＬＣで分取された画分のサブスタンスＰ分泌阻害活性を示す図である。
【００３６】
−実施例８−
実施例２で調整したサンプル 75μｌを実施例３と同じＨＰＬＣ条件で、ＨＰＬＣを行い、以下に記す時間の画分を分取した。
画分１（11〜12.5分）
画分５（18.75〜20.25分）
画分９（26.5〜28分）
画分１３（60〜62分）
画分１４（62〜64分）
同様のＨＰＬＣ分画を4回行い、計5回分の脂溶性成分を別々にFolch法で回収した。 図７は、実施例８における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと短時間側で分取された画分を示す図である。
図８は、実施例８における一回目ＨＰＬＣのクロマトグラムと長時間側で分取された画分を示す図である。
これらのサンプルを、それぞれ、一回目ＨＰＬＣ画分１、５、９、１３、１４とする。回収した溶液は窒素ガス気流下で乾固し、DMSO（50μｌ）に溶解した。サンプルは、次の操作まで、−３０℃で保存した。
【００３７】
−実施例９−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分１（画分(1)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。ここでは、一回目ＨＰＬＣとは条件を変更して、逆相カラム（実施例３と同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝５０：５０混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(1)を20μｌだけチャージし、メタノール：H2O＝５０：５０混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画に際しては、主要なピークおよびその前後を含む領域を分取した。
その結果、図９に示すように、ＳＩＨＲ1-1前画分（46.25〜48.25分）、ＳＩＨＲ1-1画分（48.25〜50.25分）、ＳＩＨＲ1-2画分（50.25〜52.5分）、ＳＩＨＲ1-2後画分（52.5〜54.5分）が分取された。
図９からわかるように、一回目ＨＰＬＣにおいて一成分に見えた画分(1)は、ＳＩＨＲ1-1画分（48.25〜50.25分）、ＳＩＨＲ1-2画分（50.25〜52.5分）という２成分に分かれた。
分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１の混合液２mlに溶解して、次の操作まで、−３０℃で保存した。
【００３８】
−実施例１０−
実施例９で分取された画分の1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その2μｌをGLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。
GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１０は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(1)に対する二回目ＨＰＬＣで分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００３９】
−実施例１１−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分５（画分(5)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。一回目ＨＰＬＣと同じ条件で、逆相カラム（実施例３と同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(5)の２０μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画時間を、（16.75〜18.75分）、（18.75〜20.25分）、（20.25〜22.5分）として、画分(5)の20μｌについてＨＰＬＣ分画を行った。本操作を二回目のＨＰＬＣ分画とする。分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（2ml）に溶解して、次の操作まで、−３０℃で保存した。
図１３に示すように、ＳＩＨＲ2-1前画分（16.75〜18.75分），ＳＩＨＲ2-1画分（18.75〜20.25分）、ＳＩＨＲ2-1後画分（20.25〜22.5分）の３つの画分が分取された。
【００４０】
−実施例１２−
実施例１１で分取された画分の1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その2μｌをGLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１１は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(5)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００４１】
−実施例１３−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分９（画分(9)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。一回目ＨＰＬＣと同じ条件で、逆相カラム（実施例３同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝６５：３５（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(9)の20μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画時間を、（24.5〜26.5分）、（26.5〜28分）、（28〜30分）として、画分(9)の20μｌをＨＰＬＣ分画を行った。本操作を二回目ＨＰＬＣ分画とする。分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（ ２ml）に溶解して、次の操作まで−３０℃で保存した。
図１４に示すように、ＳＩＨＲ2-2前画分（24.5〜26.5分）、ＳＩＨＲ2-2画分（26.5〜28分）、ＳＩＨＲ2-2後画分（28〜30分）の３つの画分が分取された。
【００４２】
−実施例１４−
また、実施例１３の分取画分の1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その2μｌをGLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１２は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(9)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００４３】
−実施例１５−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分１３（画分(13)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。一回目ＨＰＬＣと同じ条件で、逆相カラム（実施例３同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(13)の20μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画時間は、（58〜60分）、（60〜62分）、（62〜64分）である。本操作を二回目ＨＰＬＣ分画とする。分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（２ml）に溶解して、次の操作まで、−３０℃で保存した。
図１５に示すように、ＳＩＨＲ3-1前画分（58〜60分）、ＳＩＨＲ3-1画分（60〜62分）、ＳＩＨＲ3-1後画分（62〜64分）の３つの画分が分取された。
【００４４】
−実施例１６−
実施例１５のサンプルの1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その２μｌについて、GLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１６は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(13)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００４５】
−実施例１７−
実施例８で調製した一回目ＨＰＬＣ溶出画分１４（画分(14)と称する）に対して、さらにＨＰＬＣ分画を行なった。一回目ＨＰＬＣと同じ条件で、逆相カラム（実施例３同様のカラム）を用い、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）で緩衝化した。画分(14)の20μｌをチャージし、メタノール：H2O＝６５：３５混合液（酢酸0.05％含む）（流速1ml／分）で溶出した。分画時間は、（60〜62分）、（62〜64分）、（64〜65.75分）である。画分(14)の20μｌについて、ＨＰＬＣ分画を行った。本操作を二回目ＨＰＬＣ分画とする。分取画分は、Folch法で脂質成分を回収し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合胃液（２ml）に溶解して、次の操作まで、−３０℃で保存した。
図１８に示すように、ＳＩＨＲ3-2前画分（60〜62分）、ＳＩＨＲ3-2画分（62〜64分）、ＳＩＨＲ3-2後画分（64〜65.75分）の３つの画分が分取された。
【００４６】
−実施例１８−
実施例１７のサンプルの1.2ml（６０％分）を窒素気流下で乾固し、4μｌのＤＭＳＯに溶解し、その2μｌについて、GLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性を測定した。GLP-1分泌促進活性の測定は、実施例６と同様に行った。
図１７は、一回目ＨＰＬＣで分取された画分(14)に対する二回目ＨＰＬＣ分画で分取された画分の腸管ホルモン放出特性を表にして示す図である。
【００４７】
−実施例１９−
図１９は、上記各実施例で説明したＳＩＨＲおよびＩＩＨＲの調製法のフローを示すフロー図である。
図１９に示すように、ＳＩＨＲ画分１については、一回目ＨＰＬＣと異なる条件で、二回目ＨＰＬＣを行い、ＳＩＨＲ画分２〜５については、一回目ＨＰＬＣと同じ条件で二回目ＨＰＬＣを行っている。ただし、ＳＩＨＲ画分２〜５についても、一回目ＨＰＬＣと異なる条件で、二回目ＨＰＬＣを行なうことができる。ＩＩＨＲ画分１〜４についてもＳＩＨＲと同様に、一回目と同じ条件で２回目ＨＰＬＣを行うことも、一回目ＨＰＬＣと異なる条件で二回目ＨＰＬＣを行うこともできる。
【００４８】
−実施例２０−
実施例９、１１、１３、１５および１７で得た調整サンプル（2ml）のうち、GLP-1、CCK、およびサブスタンスP分泌促進活性の測定に使用した分を除く残存部分0.8ml（４０％分）を窒素気流下で乾固し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（32μｌ）に溶解し、そのうち16μｌ（２０％分）を、ＴＬＣ（担体：シリカゲル、Whatman 社、Thin Layer Chromatography Plate, Partisil (R)K6F Silica Gel 60 Å with Fluorescent Indicator Size: 10x20cm Layer Thickness 250 μm, catalogue No. 4861-720）にかけ、溶媒：（ヘキサン：エーテル：酢酸＝６０：４０：１混合液）にて展開させ（室温において）、硫酸銅による炭化発色により有機炭素の存在を測定した。
図２０は、二回目ＨＰＬＣの結果得られた各画分についてのＴＬＣ測定結果を示す図である。
図２１は、腸管ホルモン分泌調整物質のＴＬＣ・Rf値、およびＨＰＬＣにおける溶出時間を表にして示す図である。
図２０や図２１のデータから各ＳＩＨＲおよびＩＩＨＲを同定することができる。なお、ＩＩＨＲについては、特願２００８−０６６９０９号に記載されている通りである。
【００４９】
−実施例２１−
実施例１０、１２、１４，１６、１８で調整したサンプルの各１μｌずつについて、質量分析（MS）を行った。ＨＰＬＣ部には逆相カラム（TOSOH, TSKgel super ODS (2.0mmID×50mm)）を用い、質量分析装置としてはLCMS-IT-TOF（SHIMADZU）を用い、条件（ネガティブモード、CDL温度200℃、ヒートブロック温度200℃、ネブライザーガス1.5L／min、CIDエネルギー100％、コリジョンガス100％）で、分析を行なった。
図２２は、画分ＳＩＨＲ1-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。図２３は、画分ＳＩＨＲ1-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
画分ＳＩＨＲ1-1および画分ＳＩＨＲ1-2については、主要なピークにおいてマススペクトル223（M−H）を確認した。これより、画分ＳＩＨＲ1-1および画分ＳＩＨＲ1-2の主要成分の分子量は224であることがわかる。
【００５０】
次に、実施例２（変性αＬＡのＳｅｐ−ｐａｋ分画）、実施例８（一回目ＨＰＬＣ分画）、実施例９（ＳＩＨＲ１の二回目ＨＰＬＣ分画）を繰り返し行い、ＳＩＨＲ１−１、１−２を各４００ｎｍｏｌ調製した。サンプルは次の操作まで、−３０℃で保存した。
次に、上記手順により調製したＳＩＨＲ１−１、１−２のＮＭＲ分析を行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトルの測定はＪＥＯＬ ＥＣＡ５００（５００ ＭＨｚ）（日本電子）で行った。ケミカルシフト（δ）はトリメチルシランに対する相対的なｐｐｍ値で示す。カップリングコンスタント（Ｊ値）はＨｚで示す。多重度はｓｉｎｇｌｅｔ：ｓ、ｄｏｕｂｌｅｔ：ｄ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ：ｍの略号で示す。
図２４は、ＳＩＨＲ１−１のＮＭＲ分析結果を示し、１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１．３０−１．３９（ｍ、６Ｈ）、１．４１−１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．６９（ｍ、２Ｈ）、２．３０−２．４０（ｍ、４Ｈ）、５．９７−６．０４（ｍ、１Ｈ）、６．１５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０、１４．９ Ｈｚ）、６．２４−６．３１（ｍ、１Ｈ）、７．４５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１１．５、１４．９ Ｈｚ）、９．６２ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０ Ｈｚ）となる。同図のデータを採取した条件は、Original Points Count:16.384,Actual Points Count:16.384,Acquisition Times 1.7459(sec),Spectrum Width:18.763(ppm)である。
図２６（ａ）は、上記結果から導かれるＳＩＨＲ１−１の分子構造を示す図である。
図２５は、ＳＩＨＲ１−２のＮＭＲ分析結果を示し、１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２９−１．３８（ｍ、６Ｈ）、１．４１−１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．５７−１．６９（ｍ、２Ｈ）、２．１８−２．２５（ｍ、２Ｈ）、２．２９−２．２４（ｍ、２Ｈ）、６．０９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０、１５．４ Ｈｚ）、６．２１−６．３８（ｍ、２Ｈ）、７．０８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７、１５．４ Ｈｚ）、９．５４ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０ Ｈｚ）となる。同図のデータを採取した条件は、Original Points Count:16.384,Actual Points Count:16.384,Acquisition Times 1.7459(sec),Spectrum Width:18.763(ppm)である。
図２６（ｂ）は、上記結果から導かれるＳＩＨＲ１−２の分子構造を示す図である。
【００５１】
図２７は、画分ＳＩＨＲ2-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。図２８は、画分ＳＩＨＲ2-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
画分SIGR2-1および画分ＳＩＨＲ2-2の主要なピークにおいて、マススペクトル309（M−H）を確認した。これより、画分ＳＩＨＲ2-1および画分ＳＩＨＲ2-2の主要成分の分子量は310であることがわかった。構造は、αリノレン酸が二箇所ヒドロキシ化された分子の可能性がある。
図２９は、画分ＳＩＨＲ3-1のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。図３０は、画分ＳＩＨＲ3-2のＭＳ分析によるマススペクトルを示す図である。
図２９，図３０に示すように、画分ＳＩＨＲ3-1および画分ＳＩＨＲ3-2の主要なピークにおいて、マススペクトル293（M−H）を確認した。これにより、画分ＳＩＨＲ3-1および画分ＳＩＨＲ3-2の主要成分の分子量は294であり、構造はαリノレン酸のいずれかの二重結合が酸化されモノヒドロキシ構造となった物質であると推定された。
さらにMS／MS測定を行ったところ、画分ＳＩＨＲ3-1ではフラグメントイオンとして、分子量171（M-H）、および分子量235（M-H）が確認された（図２９参照）。画分ＳＩＨＲ3-2ではフラグメントイオンとして、分子量195（M-H）、および分子量211（M-H）が確認された（図３０参照）。
【００５２】
図３１は、上記結果から推定されるモノヒドロキシα−リノレン酸の構造、およびフラグメント構造を示す図である。リノレン酸の自動酸化の位置については9位、12位、13位、16位が酸化を受ける4パターン（シス、トランスも含めると8パターン）の可能性があり（非特許文献：Prog Lipid Res., 23(4), 197-221, 1984）、それぞれフラグメント化の可能性も図３１に示すように起こる。ＳＩＨＲ3-1でフラグメントイオンとして、分子量171（M-H）、および分子量235（M-H）が確認できたことは、主要な成分として9位、もしくは16位がモノヒドロキシ化されたαリノレン酸であることが推定された。ＳＩＨＲ3-2ではフラグメントイオンとして、分子量195（M-H）、および分子量211（M-H）が確認できたことは、主要な成分として12位、もしくは13位がモノヒドロキシ化されたαリノレン酸であることが推定された。
【００５３】
−実施例２２−
本実施例では、実施例９，１１，１３，１５，１７で調製した、ＳＩＨＲ画分の比活性を測定した。
比活性の算出は、以下の２通りの方法で行った。
１）実施例２０で行ったTLCの結果をLAS-4000mini（FUJIFILM）で撮影した後、各サンプルのスポットをMulti Gauge Ver3.0（FUJIFILM）で数値化した。同時に、展開したαリノレン酸の数値を対照にした。発色は硫酸銅による炭化発色で、炭化水素が存在する物質はすべて発色するため発色強度が含有炭素数に比例する。TLCの数値と実施例１０、１２、１４、１６、１８の腸管ホルモン分泌促進活性の結果から、各ＳＩＨＲ画分の比活性を求めた。
２）遊離脂肪酸のカルボキシル基への反応により遊離脂肪酸のモル数を定量するNEFA C-テストワコー（和光純薬工業, 279-75401）を用いた。実施例９、１１、１３、１５および１７で調整し、腸管ホルモン分泌促進活性及び、実施例２０でTLCに使用した残りの各サンプル16μｌ（２０％分）を窒素気流下で乾固し、5% Triton X-100（SIGMA, T-8787）を含むH2O （5μｌ）に溶解し、その４μｌをNEFA C-テストワコーで定量した。この定量値と実施例１０、１２、１４、１６、１８の腸管ホルモン分泌促進活性の結果から比活性を求めた。
図３２は、二回目ＨＰＬＣにより調製した各画分ＳＩＨＲの比活性を表にして示す図である。
【００５４】
−実施例２３−
本精製法において、シリカゲルカートリッジ(Sep-Pak Plus long, Waters, WT020520) はＨＰＬＣの前処理として実施した。主たる目的は、未変性のαリノレン酸を除去して、ＨＰＬＣにおけるサンプルの分離能力の向上、およびカラム劣化防止である。しかしながら、目的により、ＳＩＨＲやＩＩＨＲの粗精製物を利用する場合がある。粗精製物を調製する目的でこのシリカゲルカートリッジを用いることができる。
実施例１で調製した変性αリノレン酸の２００μｌを、ヘキサン：エーテル＝１０：０．５混合液（３ml）に溶解して、Sep-Pak plus long (Waters)にチャージした。ヘキサン：エーテルの比を変化させ段階的に溶出した。
図３３は、シリカゲルカートリッジを用いた溶媒のヘキサン：エーテルの比を表にして示す図である。
【００５５】
また、各溶出画分を窒素気流下で乾固し、クロロホルム：メタノール＝２：１混合液（２００μｌ）に溶解して、その４μｌについてTLCを実施した。TLCの条件は、実施例１９と同様である。
図３４は、シリカゲルカートリッジによる変性αＬＡ分画物についてのＴＬＣ測定の結果を示す図である。
画分ＳＩＨＲ1-1および画分ＳＩＨＲ1-2粗精製物を得るには、溶出液１〜５のうちいずれかの溶出液で処理後、溶出液６、又は溶出液７で溶出する。
画分ＳＩＨＲ2-1および画分ＳＩＨＲ2-2粗精製物を得るには、溶出液１〜１０のうちいずれかの溶出液で処理後、溶出液１１、又は溶出液１２で溶出する。
画分ＳＩＨＲ3-1および画分ＳＩＨＲ3-2粗精製物を得るには、溶出液１〜６のうちいずれかの溶出液で処理後、溶出液７、又は溶出液８で溶出する。以上の操作を行うことにより、各粗精製物を調製することができる。
【００５６】
−機能性食品，医薬としての機能−
ＳＩＨＲ１−１, ＳＩＨＲ１−２, ＳＩＨＲ２−２、ＳＩＨＲ２−２，ＳＩＨＲ３−１３およびＳＩＨＲ３−２は、糖尿病や肥満予防治療に効果があるＧＬＰ-1の腸管からの放出を促進する。通常の食事においては脂肪酸がこの働きをするが、これらの物質は、脂肪酸よりもカロリー当たりあるいは分子あたりのＧＬＰ-1放出活性が２〜５０倍高い。よって、脂肪酸投与に比べて、カロリーが低く、高いＧＬＰ-1放出活性を発揮する、有効な糖尿病や肥満予防治療薬あるいは機能性食品を提供できる。
【００５７】
また、サブスタンスＰおよびＣＣＫの放出は炎症を惹起したり、痛みを発生したりする。ＩＢＳ、ＩＢＤなどの腸炎の発症あるいは増悪の原因となると考えられる。ＩＩＨＲ１, ＩＩＨＲ２, ＩＩＨＲ３, ＩＩＨＲ４は、サブスタンスＰおよびＣＣＫの放出を抑制するので、これらの成分を利用して、ＩＢＳ、ＩＢＤなどの腸炎の発症あるいは増悪をおさえる予防治療薬あるいは機能性食品を提供できる。ＩＢＳ，ＩＢＤの発症、増悪の環境では脂肪酸に対する反応が過敏になっていることから、これを抑制することは、ＩＢＳ，ＩＢＤに対する重要な医薬あるいは機能性食品を提供できる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の腸管ホルモン分泌調節剤は、医薬だけでなく、機能性食品として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸を変性する工程（ａ）と、
上記工程（ａ）で変性された変性脂肪酸を、少なくとも１回の高速液体クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーにより分画して、変性脂肪酸から腸管ホルモン分泌調整成分を取り出す工程（ｂ）と、
を含む腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、
上記変性脂肪酸をシリカゲルカラムを用いたクロマトグラフで分画し、
続いて、高速液体クロマトグラフィー装置の送液装置，カラムオーブン，および検出器を用いて、分画を行なった後、
メタノールと水との容量比が８０〜５０：２０〜５０であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により溶出し、
シリカゲルプレート上で、展開溶媒としてヘキサン、エーテルおよび酢酸を、容量比６０：４０：１の割合で用い、Ｒｆ値が、０．１０〜０．１２、０．１３〜０．１５、０．２２〜０．２４、０．２３〜０．２５、０．２４〜０．２６、および０．２５〜０．２７の領域にスポットを示す画分を分画する、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、
上記変性脂肪酸を、高速液体クロマトグラフィーにより、逆相カラム、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、
メタノールと水との容量比が６９〜７１：３１〜２９であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ml／分で溶出し、
溶出時間が０〜５分，３５〜４０分，４５〜５０分、および６５〜７０分の画分を分画する、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１または２記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、
上記変性脂肪酸を、高速液体クロマトグラフィーにより、逆相カラム、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、
メタノールと水との容量比が６４〜６６：３６〜３４であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、
溶出時間が１１〜１２．５分，１８．７５〜２０．２５分，２６．５〜２８分、６０〜６２分，および６２〜６４分の画分を分画する、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１または２記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、
上記変性脂肪酸を、高速液体クロマトグラフィーにより、逆相カラム、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件でそれぞれ分画し、
メタノールと水との容量比が４９〜５１：５１〜４９であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、
溶出時間が４８．２５〜５０．２５分、５０．２５〜５２．５分の画分を分画する、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項６】
請求項３〜５のうちいずれか１つの請求項において、
一回目の高速液体クロマトグラフィーとして請求項３〜５のうちいずれか１つに記載の工程（ｂ）を行い、得られた画分について、さらに、二回目の高速液体クロマトグラフィーとして請求項３〜５のうちいずれか１つに記載の工程（ｂ）を行なう、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のうちいずれか１つに記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ａ）では、上記脂肪酸として、不飽和長鎖脂肪酸，天然油脂，および，上記天然油脂から調整した脂肪酸画分から選ばれる１つの物質を用いる、腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項８】
請求項７記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記不飽和長鎖脂肪酸は、αリノレン酸またはＤＨＡであり、
上記天然油脂は、紫蘇油または魚油である、腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のうちいずれか１つに記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法によって取り出された腸管ホルモン分泌調整成分を含む機能性食品。
【請求項１０】
請求項１〜８のうちいずれか１つに記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法によって取り出された腸管ホルモン分泌調整成分を有効成分として含有する医薬。
【請求項１１】
請求項９記載の機能性食品，または請求項１０記載の医薬を投与することにより、腸管からのＧＬＰ-1の放出を促進する、腸管ホルモン分泌調整剤の使用方法。
【請求項１２】
請求項９記載の機能性食品，または請求項１０記載の医薬を投与することにより、腸管からのサブスタンスＰの放出を抑制する、腸管ホルモン分泌調整剤の使用方法。
【請求項１３】
請求項９記載の機能性食品，または請求項１０記載の医薬を投与することにより、腸管からのＣＣＫの放出を抑制する、腸管ホルモン分泌調整剤の使用方法。
【請求項１】
脂肪酸を変性する工程（ａ）と、
上記工程（ａ）で変性された変性脂肪酸を、少なくとも１回の高速液体クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーにより分画して、変性脂肪酸から腸管ホルモン分泌調整成分を取り出す工程（ｂ）と、
を含む腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、
上記変性脂肪酸をシリカゲルカラムを用いたクロマトグラフで分画し、
続いて、高速液体クロマトグラフィー装置の送液装置，カラムオーブン，および検出器を用いて、分画を行なった後、
メタノールと水との容量比が８０〜５０：２０〜５０であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により溶出し、
シリカゲルプレート上で、展開溶媒としてヘキサン、エーテルおよび酢酸を、容量比６０：４０：１の割合で用い、Ｒｆ値が、０．１０〜０．１２、０．１３〜０．１５、０．２２〜０．２４、０．２３〜０．２５、０．２４〜０．２６、および０．２５〜０．２７の領域にスポットを示す画分を分画する、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、
上記変性脂肪酸を、高速液体クロマトグラフィーにより、逆相カラム、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、
メタノールと水との容量比が６９〜７１：３１〜２９であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ml／分で溶出し、
溶出時間が０〜５分，３５〜４０分，４５〜５０分、および６５〜７０分の画分を分画する、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１または２記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、
上記変性脂肪酸を、高速液体クロマトグラフィーにより、逆相カラム、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件で分画し、
メタノールと水との容量比が６４〜６６：３６〜３４であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、
溶出時間が１１〜１２．５分，１８．７５〜２０．２５分，２６．５〜２８分、６０〜６２分，および６２〜６４分の画分を分画する、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１または２記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、
上記変性脂肪酸を、高速液体クロマトグラフィーにより、逆相カラム、カラムオーブン温度４０℃±５℃の条件でそれぞれ分画し、
メタノールと水との容量比が４９〜５１：５１〜４９であり容量比０．０５％±０．０１％の酢酸を含む溶出液により流速０．９〜１．１ｍｌ／分で溶出し、
溶出時間が４８．２５〜５０．２５分、５０．２５〜５２．５分の画分を分画する、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項６】
請求項３〜５のうちいずれか１つの請求項において、
一回目の高速液体クロマトグラフィーとして請求項３〜５のうちいずれか１つに記載の工程（ｂ）を行い、得られた画分について、さらに、二回目の高速液体クロマトグラフィーとして請求項３〜５のうちいずれか１つに記載の工程（ｂ）を行なう、
腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のうちいずれか１つに記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ａ）では、上記脂肪酸として、不飽和長鎖脂肪酸，天然油脂，および，上記天然油脂から調整した脂肪酸画分から選ばれる１つの物質を用いる、腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項８】
請求項７記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記不飽和長鎖脂肪酸は、αリノレン酸またはＤＨＡであり、
上記天然油脂は、紫蘇油または魚油である、腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のうちいずれか１つに記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法によって取り出された腸管ホルモン分泌調整成分を含む機能性食品。
【請求項１０】
請求項１〜８のうちいずれか１つに記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法によって取り出された腸管ホルモン分泌調整成分を有効成分として含有する医薬。
【請求項１１】
請求項９記載の機能性食品，または請求項１０記載の医薬を投与することにより、腸管からのＧＬＰ-1の放出を促進する、腸管ホルモン分泌調整剤の使用方法。
【請求項１２】
請求項９記載の機能性食品，または請求項１０記載の医薬を投与することにより、腸管からのサブスタンスＰの放出を抑制する、腸管ホルモン分泌調整剤の使用方法。
【請求項１３】
請求項９記載の機能性食品，または請求項１０記載の医薬を投与することにより、腸管からのＣＣＫの放出を抑制する、腸管ホルモン分泌調整剤の使用方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【公開番号】特開２０１１−８４５４６（Ｐ２０１１−８４５４６Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５６８２７（Ｐ２０１０−５６８２７）
【出願日】平成２２年３月１３日（２０１０．３．１３）
【出願人】（５０６１８００４０）ファルマフロンティア株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１３日（２０１０．３．１３）
【出願人】（５０６１８００４０）ファルマフロンティア株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
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