腸管保護剤
【課題】腸管の防御機構が破綻した場合に、腸管バリアー機能の低下や腸管における炎症反応の惹起を抑制し、これを介して腸粘膜傷害を抑制することを可能とする、腸管保護剤を提供する。
【解決手段】ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤。また、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の培養上清又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤。
【解決手段】ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤。また、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の培養上清又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸管保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の正常な腸管では、種々の防御機構が働いて腸粘膜を外的刺激から保護している。何らかの原因によってそのような防御機構が破綻すると、腸管（腸粘膜）が傷害され、場合により、それが、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）を始めとする種々の腸疾患の発症に関与することになる。
【０００３】
腸管保護剤に関しては、例えば、ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブミン及びこれらの分解物から選択される１種以上の物質を有効成分とする腸管保護剤が知られている（特許文献１参照）。また、ラクトバチラス属細菌（特にラクトバチラス・カゼイ、ラクトバチラス・ガッセリ）又はその菌体由来多糖画分を有効成分とする炎症性腸疾患予防治療剤が知られている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２４１１７７号公報
【特許文献２】特開２００３−７３２８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
腸管（腸粘膜）を保護して腸粘膜傷害を抑制する腸管保護剤は、腸粘膜傷害を伴う種々の腸疾患の予防又は改善に有効と考えられる。腸管保護剤はいくつか知られているものの、未だ、消費者の多様な需要を満たすのに十分な選択肢が存在するとはいえないのが実情である。
【０００６】
そこで、本発明は、新規の腸管保護剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤を提供する。また、本発明は、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の培養上清又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤を提供する。
【０００８】
本発明の腸管保護剤は、腸管における防御機構が破綻した場合に、例えば、腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下や腸管（腸粘膜）における炎症反応の惹起（炎症性物質の産生）を抑制し、これを介して腸粘膜傷害を抑制することを可能とする。また、腸粘膜傷害を抑制することによって、腸粘膜傷害を伴う種々の腸疾患（例えば、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎））を予防又は改善（治療、軽減）することを可能とする。
【０００９】
本発明の腸管保護剤は、上述のような効果を奏することから、例えば、腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下を抑制するために使用することができる。また、腸管（腸粘膜）における炎症反応の惹起（炎症性物質の産生）を抑制するために使用することができる。また、腸粘膜傷害を伴う種々の腸疾患（例えば、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎））の予防又は改善剤として使用することができる。
【００１０】
ラクトバチラス・ブレビスは、古くから発酵食品に利用されている乳酸菌の一種であり、生体への安全性が確立されている。従って、本発明の腸管保護剤は、生体への安全性が高く、長期間継続的に摂取可能であり、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。
【００１１】
ラクトバチラス・ブレビスには、ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、グレブセンシス（ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ）、オタキエンシス（ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ）及びコアギュランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）という４つの亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）が存在する。本発明の腸管保護剤における菌株としては、亜種ブレビスに属する菌株が好適であり、亜種ブレビスに属する菌株の中では、例えば、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＢＣ８８０３菌株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６３２）が特に好適である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体への安全性が高く、飲食品の成分としても使用可能な新規の腸管保護剤が提供される。また、そのような腸管保護剤を含有する医薬品、飲食品、飲食品添加物、飼料等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で抽出されたタンパク質のウェスタンブロットである。
【図２】実施例２においてモノクロラミンで刺激された腸管のマンニトールフラックスを示すグラフである。
【図３】実施例３で抽出されたタンパク質のウェスタンブロットである。
【図４】実施例４で抽出されたタンパク質のウェスタンブロットである。
【図５】参考例１で得られた培養上清及び沈殿画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ写真である。
【図６】実施例５においてデキストラン硫酸ナトリウムを投与されたマウスの炎症スコアの分布を示す箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１５】
本発明の腸管保護剤は、一態様において、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する。また、他の一態様において、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の培養上清又はその処理物を有効成分として含有する。
【００１６】
ラクトバチラス・ブレビスは、１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列、消費した糖からの酸生成割合、等の相違に基づいて、４つの亜種［ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、グレブセンシス（ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ）、オタキエンシス（ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ）及びコアギュランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）］に区別される。
【００１７】
ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株としては、亜種ブレビスに属する菌株が好適であり、亜種ブレビスに属する菌株の中では、例えば、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＢＣ８８０３菌株が好適である。ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株は、２００６年６月２８日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託された、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０６３２の菌株である。なお、ＳＢＣ８８０３菌株は、アルコール存在下でも増殖可能であり、アルコール飲料の成分として使用するのに好適である。
【００１８】
本発明の腸管保護剤における菌株は、ラクトバチラス・ブレビスに属するものであればよく、例えば、自然界から分離可能なもの、又はＡＴＣＣ等の細胞バンクから入手可能なものであってもよい。
【００１９】
上記菌株の菌体としては、１種の菌株の菌体のみが含有されても、また、２種以上の菌株の菌体が併せて含有されてもよい。また、菌体は、生菌体及び死菌体のいずれでもよい。菌体は、生菌体を培養することにより大量に生産することができる。培地は、液体培地及び固体培地のいずれでもよいが、窒素源及び炭素源を含有するものが好ましい。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等を、また、炭素源としては、グルコース、キシロース、フルクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、デンプン、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等を用いることができる。また、無機質として、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン等を添加することができ、更にビタミン等を添加することができる。好適な培地としては、ＭＲＳ培地、ＬＢＳ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、ＷＹＰ培地、ＧＹＰ培地等が挙げられる。培養温度は通常約２５〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３８℃（特に約３７℃）である。培養時間は通常約６〜約６２時間である。培地のｐＨは通常約３〜約６、好ましくは約４〜約６である。培養はインキュベーター中で行ってもよく、また、培養の際は通気振とうしてもよい。
【００２０】
菌体の処理物としては、例えば、菌体を１００℃以上で数分以上加熱して得られる処理物（例えば、菌体に、１１０〜１２５℃の温度で１０分以上、オートクレーブ処理を施して得られる処理物）、菌体に対して凍結乾燥、噴霧乾燥等を行って得られる処理物、或いは菌体を超音波、フレンチプレス等で物理的に破壊して得られる処理物が挙げられる。このような菌体処理物は、未処理菌体（特に生菌体）と比較して、取り扱いが容易な点で腸管保護剤の有効成分として好適である。
【００２１】
培養上清とは、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の生菌体を液体培地で培養して得られる培養物の上清のことである。液体培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものが好ましい。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等を、また、炭素源としては、グルコース、キシロース、フルクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、デンプン、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等を用いることができる。また、無機質として、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン等を添加することができ、更にビタミン等を添加することができる。好適な液体培地としては、ＭＲＳ培地、ＬＢ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、ＷＹＰ培地、ＧＹＰ培地等が挙げられる。培養温度は通常約２７〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３８℃（特に約３７℃）である。培養時間は通常約６〜約６２時間、好ましくは約１２〜約４８時間である。培地のｐＨは通常約３〜約６、好ましくは約４〜約６である。培養はインキュベーター中で行ってもよく、また、培養の際は通気振とうしてもよい。培養上清は、例えば培養物をフィルターで濾過することによって、培養物から分離することができる。
【００２２】
上述から明らかように、培養上清を得るための好適な培養方法としては、例えば、インキュベーター中、ｐＨ約４〜約６のＭＲＳ培地、ＬＢ培地等を用いて、約３０〜約３８℃（特に約３７℃）で約１２〜約４８時間（特に、約１２時間、約２４時間、約３６時間又は約４８時間）培養する方法が挙げられる。
【００２３】
培養上清の処理物としては、例えば、遠心分離により培養上清を固液分離して得られる処理物、凍結乾燥により培養上清から水分を除去して得られる処理物、エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物、限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物、或いはフィルター等を用いて培養上清を固液分離して得られる処理物が挙げられる。また、例えば、培養上清を遠心分離（例えば、３０００ｒｐｍ、１０分）した後、上清をシリンジフィルター（例えば、０．４５μｍ）で濾過し、濾液を硫安（例えば、６５％飽和硫安）で分画し、沈殿物を蒸留水で透析して得られる沈殿画分が挙げられる。
【００２４】
本発明の腸管保護剤は、固体（例えば、凍結乾燥させて得られる粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤等のいずれの剤形を取ってもよい。また、本発明の腸管保護剤は、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の菌体又はその処理物からなるもの、或いはラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の培養上清又はその処理物からなるものであってもよい。
【００２５】
上述の各種製剤は、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の菌体若しくはその処理物又は培養上清若しくはその処理物と、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）と、を混和することによって調製することができる。
【００２６】
例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２７】
本発明の腸管保護剤は、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。
【００２８】
例えば、本発明の腸管保護剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。これらの飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有してもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類、が挙げられる。本発明の腸管保護剤はまた、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。本発明の腸管保護剤を含有する飲食品は、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株で牛乳、脱脂乳、豆乳等を発酵させて得られる発酵物であってもよい。
【００２９】
本発明の腸管保護剤は、ヒトに投与しても、非ヒト哺乳動物に投与してもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【００３１】
〔実施例１〕
（試験サンプルの調製）
ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の菌体をオートクレーブ処理（１０５℃、３０分）で殺菌した後、凍結乾燥し、凍結乾燥菌体をＲＰＭＩ培地に懸濁して菌体懸濁液［０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）］を得た。また、菌体を含有しないＲＰＭＩ培地をコントロールとして用意した。
【００３２】
（腸管への刺激）
雄性、６〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー）から小腸を取り出し、腸管内をＰＢＳで洗浄した後、腸管を３等分した。得られた３つの腸管の各々について、一端を外科用糸で縛り、菌体懸濁液［０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）］又はＲＰＭＩ培地（コントロ−ル）を注入した後、他端を外科用糸で縛った。３つの腸管をＲＰＭＩ培地に浸して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２時間インキュベートし、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて腸管上皮からタンパク質を抽出した。
【００３３】
（ウェスタンブロッティング）
抽出したタンパク質について、次のようにウェスタンブロッティングを行った。まず、抽出したタンパク質３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、セミドライブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５％スキムミルク中で１時間振とうして、ブロッキングを行った。そして、ＰＶＤＦ膜を１次抗体［抗Ｈｓｐ２５抗体、抗Ｈｓｐ７０抗体又は抗Ｈｓｃ７０抗体］と反応させた。更に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにてＰＶＤＦ膜を十分に洗浄した後、２次抗体［ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体又はＨＲＰ結合抗マウス抗体］と反応させた。最後に、ＰＶＤＦ膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＤにて十分に洗浄した後、化学発光法により抗原タンパク質を検出した。
【００３４】
なお、Ｈｓｃ７０は、腸管上皮細胞に恒常的に発現するタンパク質の一つである。他方、Ｈｓｐ２５、Ｈｓｐ７０は、炎症性物質（インターロイキン−１β、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α等）の産生及びこれに伴う炎症反応の惹起を抑制して、細胞への傷害を抑制する熱ショックタンパク質である。
【００３５】
（結果）
結果を図１及び表１に示す。図１は、抽出したタンパク質のウェスタンブロットである。表１は、図１のウェスタンブロット上のバンドの強度を示す表である。図１及び表１において、濃度［％（ｗ／ｖ）］は菌体懸濁液中の菌体濃度を示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
図１及び表１から明らかなように、Ｈｓｃ７０の発現量には、菌体懸濁液とコントロールとの間で大きな差異が見られなかったのに対して、Ｈｓｐ２５及びＨｓｐ７０の発現量は、菌体懸濁液が注入された腸管において顕著に多かった。
【００３８】
〔実施例２〕
（試験サンプルの調製）
実施例１と同様にして試験サンプルを調製した。また、菌体を含有しないＲＰＭＩ培地をコントロールとして用意した。
【００３９】
（腸管への刺激）
雄性、６〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー）から小腸を取り出し、腸管内をＰＢＳで洗浄した後、腸管を３等分した。得られた３つの腸管の各々について、一端を外科用糸で縛り、菌体懸濁液［０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）］又はＲＰＭＩ培地（コントロ−ル）を注入した後、他端を外科用糸で縛った。３つの腸管をＲＰＭＩ培地に浸して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２時間インキュベートした。
【００４０】
（マンニトールフラックスの測定）
次いで、各腸管から内容物を排出し、腸管を更に２等分した後、一方の腸管には、モノクロラミン（ＮＨ２Ｃｌ）を添加したトリチウム標識マンニトール水溶液（１μＣｉ ［３Ｈ］ｍａｎｎｉｔｏｌ／ｍＬ）を、他方の腸管には、モノクロラミンを添加していないトリチウム標識マンニトール水溶液（１μＣｉ ［３Ｈ］ｍａｎｎｉｔｏｌ／ｍＬ）を注入し、腸管をＲＰＭＩ培地に浸して静置した。５分、２０分、３５分後に培地をサンプリングし、シンチレーションカウンターにてトリチウム量を測定した。「２０分後のトリチウム量−５分後のトリチウム量」、「３５分後のトリチウム量−５分後のトリチウム量」を算出し、それぞれ１５分、３０分のマンニトールフラックスとした。
【００４１】
なお、モノクロラミンは、消化管粘膜を酸化的に傷害することが知られている物質である。また、腸管のマンニトールフラックスは、腸粘膜傷害（腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下）の指標として用いることができる。
【００４２】
（結果）
結果を図２に示す。図２は、モノクロラミンで刺激した腸管のマンニトールフラックス（１５分、３０分）を示すグラフである。図２において、濃度［％（ｗ／ｖ）］は菌体懸濁液中の菌体濃度を示す。
【００４３】
図２から明らかなように、モノクロラミンで刺激した腸管のマンニトールフラックスは、菌体懸濁液が注入された腸管において顕著に小さかった。なお、モノクロラミンで刺激されていない腸管のマンニトールフラックスは、いずれの腸管においても無視し得る程度に小さかった。
【００４４】
〔実施例３〕
（培養上清の調製）
ＭＲＳ培地中、１０％（ｗ／ｖ）のラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の菌体を、インキュベーター中、３７℃で１２時間、３６時間及び６０時間培養して培養上清を得た。また、培養上清を含有しないＭＲＳ培地をコントロールとして用意した。
【００４５】
（腸管上皮細胞への刺激）
得られた培養上清中、Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト大腸癌由来腸管上皮細胞）を３７℃で２４時間インキュベートし、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてＣａｃｏ−２細胞からタンパク質を抽出した。
【００４６】
（ウェスタンブロッティング）
１次抗体として抗Ｈｓｐ２７抗体又は抗Ｈｓｃ７０抗体を使用したこと以外は実施例１と同様にして、抽出したタンパク質についてウェスタンブロッティングを行った。
【００４７】
なお、Ｈｓｃ７０は、腸管上皮細胞に恒常的に発現するタンパク質の一つである。他方、Ｈｓｐ２７は、炎症性物質（インターロイキン−１β、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α等）の産生及びこれに伴う炎症反応の惹起を抑制して、細胞への傷害を抑制する熱ショックタンパク質である。
【００４８】
（結果）
結果を図３及び表２に示す。図３は、抽出したタンパク質のウェスタンブロットである。表２は、図３のウェスタンブロット上のバンドの強度を示す表である。図３及び表２において、時間は菌体の培養時間を示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
図３及び表２から明らかなように、Ｈｓｃ７０の発現量には、培養上清とコントロールとの間で大きな差異が見られなかったのに対して、Ｈｓｐ２７の発現量は、培養上清中でインキュベートされたＣａｃｏ−２細胞において顕著に多かった。
【００５１】
〔実施例４〕
（培養上清の調製）
培養時間を２４時間としたこと以外は実施例３と同様にして、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清を得た。また、培養上清を含有しないＭＲＳ培地をコントロールとして用意した。
【００５２】
（硫安分画）
得られた培養上清を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）し、上清をシリンジフィルター（０．４５μｍ）で濾過した。濾液を６５％飽和硫安で分画し、沈殿物を蒸留水で透析して沈殿画分を得た。
【００５３】
（腸管上皮細胞への刺激）
得られた沈殿画分中、Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト大腸癌由来腸管上皮細胞）を３７℃で２４時間インキュベートし、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてＣａｃｏ−２細胞からタンパク質を抽出した。
【００５４】
（ウェスタンブロッティング）
抽出したタンパク質について、実施例３と同様にしてウェスタンブロッティングを行った。
【００５５】
（結果）
結果を図４に示す。図４は、抽出したタンパク質のウェスタンブロットである。図４において、「×１００」、「×１０」、「×１」はそれぞれ、沈殿画分の希釈倍率が１００倍、１０倍、１倍であることを表す。
【００５６】
図４から明らかなように、Ｈｓｃ７０の発現量には、沈殿画分とコントロールとの間で大きな差異が見られなかったのに対して、Ｈｓｐ２７の発現量は、沈殿画分中でインキュベートされたＣａｃｏ−２細胞において顕著に多かった。
【００５７】
実施例１〜４により、本発明の腸管保護剤は、腸管の防御機構が破綻した場合に、腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下や腸管（腸粘膜）における炎症反応の惹起（炎症性物質の産生）を抑制し、これを介して腸粘膜傷害を抑制することが可能であることが確認された。
【００５８】
〔参考例１〕
実施例４と同様にして、培養上清の調製及び硫安分画を行った。得られた培養上清及び沈殿画分についてＳＤＳ−Ｐａｇｅを行い、銀染色によりタンパク質を検出した。
【００５９】
結果を図５に示す。図５は、培養上清及び沈殿画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ写真である。図５において、「×１」、「×５」、「×２５」、「×１２５」、「×６２５」はそれぞれ、培養上清又は沈殿画分の希釈倍率が１倍、５倍、２５倍、１２５倍、６２５倍であることを表す。
【００６０】
参考例１により、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清が、２５ｋＤａ及び５０ｋＤａのタンパク質を含有することが示された。
【００６１】
〔実施例５〕
（試験サンプルの調製）
ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の菌体をオートクレーブ処理（１０５℃、３０分）で殺菌した後、凍結乾燥し、凍結乾燥菌体を蒸留水に懸濁して０．１％（ｗ／ｖ）菌体懸濁液を得た。
【００６２】
（潰瘍性大腸炎誘発試験）
試験サンプルの投与：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄性、体重１８〜２５ｇ）（日本チャールス・リバー）８匹を菌体投与群（３匹）と菌体非投与群（５匹）とに分けた後、１０日間、毎日、菌体投与群のマウスには菌体懸濁液１ｍＬを、菌体非投与群のマウスには蒸留水１ｍＬを経口投与した。この期間中、いずれの群のマウスにも通常食を自由摂取させた。１０日目に各マウスの体重を測定したところ、体重（平均±標準偏差）は下記の通りであった。
【００６３】
体重（ｇ）：
菌体投与群：２１．７±２．２
菌体非投与群：２２．２±１．１
【００６４】
ＤＳＳの投与：
次に、１４日間、各群のマウスに２％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）水溶液を自由飲水させた。この期間中、菌体投与群のマウスには、菌体懸濁液１ｍＬを１日置きに経口投与した。また、上記期間中、いずれの群のマウスにも通常食を自由摂取させた。なお、ＤＳＳは、組織学的、免疫学的に潰瘍性大腸炎類似の腸管炎症を誘発することが知られている。
【００６５】
１４日目に、各マウスの体重を測定し、更に、屠殺（頚椎脱臼）後、腸管を摘出して腸管長（肛門から盲腸までの長さ）を測定した。体重（平均±標準偏差）及び腸管長（平均±標準偏差）は下記の通りであった。
【００６６】
体重（ｇ）：
菌体投与群：１７．３±４．８
菌体非投与群：１８．８±１．９
腸管長（ｃｍ）：
菌体投与群：６．２±１．９
菌体非投与群：６．２±０．５
【００６７】
炎症の組織学的評価：
腸管から更に遠位大腸（直腸近傍）の組織を採取し、ホルマリン固定、パラフィン包埋を行った。そして、４μｍ厚に薄切し、組織切片（２切片／匹）にヘマトキシリン・エオジン染色を行って、組織標本（２標本／匹）を得た。各標本を光学顕微鏡で観察し、炎症の程度を下記基準（Ｂｅｒｇ ＤＪら，Ｊ ｃｌｉｎ ｉｎｖｅｓｔ，１９９８参照）で組織学的に評価した。
【００６８】
評価基準：
スコア０： 炎症細胞浸潤は認められない。
スコア１： １〜数個の単核球が粘膜上皮内に浸潤している。杯細胞からのムチン産生の低下は認められない。
スコア２： 粘膜上皮内に軽度の炎症細胞浸潤が認められる。炎症細胞浸潤は単核球優位だが、好中球浸潤も見られる。
スコア３： ムチン産生の低下が認められる。しばしば粘膜下層への炎症細胞浸潤が見られる。
スコア４： 炎症細胞浸潤が筋層に及び、ムチン産生はほぼ消失している。陰窩膿瘍又は潰瘍が認められる。
【００６９】
（結果）
評価結果（炎症スコア）は下記及び図６の通りであった。図６は、各群のマウスの炎症スコアの分布を示す箱ひげ図である。図６において、上ひげ及び下ひげの先端は、それぞれ炎症スコアの最大値及び最小値の位置を示す。また、箱の上端及び下端は、それぞれ２５％点及び７５％点の位置を示し、箱の中心点は中央値の位置を示す。なお、菌体投与群及び菌体非投与群のいずれにおいても、下ひげは箱の下端と重なっている。
【００７０】
評価結果：
菌体投与群：１、１、２、２、２、３
菌体非投与群：２、２、２、３、３、３、３、３、４、４
【００７１】
上記結果から明らかなように、菌体投与群では炎症が顕著に抑制された。菌体投与群の炎症スコアは、菌体非投与群に比べて有意に低かった（Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｐ＜０．０５）。また、体重及び腸管長については、群間で有意差が認められなかった（Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【００７２】
実施例５により、本発明の腸管保護剤は、腸管の防御機構が破綻した場合に、腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下や腸管（腸粘膜）における炎症反応の惹起（炎症性物質の産生）を抑制し、これを介して腸粘膜傷害を抑制することが可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の腸管保護剤は、種々の腸疾患の予防及び改善に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸管保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の正常な腸管では、種々の防御機構が働いて腸粘膜を外的刺激から保護している。何らかの原因によってそのような防御機構が破綻すると、腸管（腸粘膜）が傷害され、場合により、それが、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）を始めとする種々の腸疾患の発症に関与することになる。
【０００３】
腸管保護剤に関しては、例えば、ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブミン及びこれらの分解物から選択される１種以上の物質を有効成分とする腸管保護剤が知られている（特許文献１参照）。また、ラクトバチラス属細菌（特にラクトバチラス・カゼイ、ラクトバチラス・ガッセリ）又はその菌体由来多糖画分を有効成分とする炎症性腸疾患予防治療剤が知られている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２４１１７７号公報
【特許文献２】特開２００３−７３２８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
腸管（腸粘膜）を保護して腸粘膜傷害を抑制する腸管保護剤は、腸粘膜傷害を伴う種々の腸疾患の予防又は改善に有効と考えられる。腸管保護剤はいくつか知られているものの、未だ、消費者の多様な需要を満たすのに十分な選択肢が存在するとはいえないのが実情である。
【０００６】
そこで、本発明は、新規の腸管保護剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤を提供する。また、本発明は、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の培養上清又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤を提供する。
【０００８】
本発明の腸管保護剤は、腸管における防御機構が破綻した場合に、例えば、腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下や腸管（腸粘膜）における炎症反応の惹起（炎症性物質の産生）を抑制し、これを介して腸粘膜傷害を抑制することを可能とする。また、腸粘膜傷害を抑制することによって、腸粘膜傷害を伴う種々の腸疾患（例えば、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎））を予防又は改善（治療、軽減）することを可能とする。
【０００９】
本発明の腸管保護剤は、上述のような効果を奏することから、例えば、腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下を抑制するために使用することができる。また、腸管（腸粘膜）における炎症反応の惹起（炎症性物質の産生）を抑制するために使用することができる。また、腸粘膜傷害を伴う種々の腸疾患（例えば、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎））の予防又は改善剤として使用することができる。
【００１０】
ラクトバチラス・ブレビスは、古くから発酵食品に利用されている乳酸菌の一種であり、生体への安全性が確立されている。従って、本発明の腸管保護剤は、生体への安全性が高く、長期間継続的に摂取可能であり、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。
【００１１】
ラクトバチラス・ブレビスには、ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、グレブセンシス（ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ）、オタキエンシス（ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ）及びコアギュランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）という４つの亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）が存在する。本発明の腸管保護剤における菌株としては、亜種ブレビスに属する菌株が好適であり、亜種ブレビスに属する菌株の中では、例えば、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＢＣ８８０３菌株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６３２）が特に好適である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体への安全性が高く、飲食品の成分としても使用可能な新規の腸管保護剤が提供される。また、そのような腸管保護剤を含有する医薬品、飲食品、飲食品添加物、飼料等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で抽出されたタンパク質のウェスタンブロットである。
【図２】実施例２においてモノクロラミンで刺激された腸管のマンニトールフラックスを示すグラフである。
【図３】実施例３で抽出されたタンパク質のウェスタンブロットである。
【図４】実施例４で抽出されたタンパク質のウェスタンブロットである。
【図５】参考例１で得られた培養上清及び沈殿画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ写真である。
【図６】実施例５においてデキストラン硫酸ナトリウムを投与されたマウスの炎症スコアの分布を示す箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１５】
本発明の腸管保護剤は、一態様において、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する。また、他の一態様において、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の培養上清又はその処理物を有効成分として含有する。
【００１６】
ラクトバチラス・ブレビスは、１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列、消費した糖からの酸生成割合、等の相違に基づいて、４つの亜種［ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、グレブセンシス（ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ）、オタキエンシス（ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ）及びコアギュランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）］に区別される。
【００１７】
ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株としては、亜種ブレビスに属する菌株が好適であり、亜種ブレビスに属する菌株の中では、例えば、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＢＣ８８０３菌株が好適である。ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株は、２００６年６月２８日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託された、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０６３２の菌株である。なお、ＳＢＣ８８０３菌株は、アルコール存在下でも増殖可能であり、アルコール飲料の成分として使用するのに好適である。
【００１８】
本発明の腸管保護剤における菌株は、ラクトバチラス・ブレビスに属するものであればよく、例えば、自然界から分離可能なもの、又はＡＴＣＣ等の細胞バンクから入手可能なものであってもよい。
【００１９】
上記菌株の菌体としては、１種の菌株の菌体のみが含有されても、また、２種以上の菌株の菌体が併せて含有されてもよい。また、菌体は、生菌体及び死菌体のいずれでもよい。菌体は、生菌体を培養することにより大量に生産することができる。培地は、液体培地及び固体培地のいずれでもよいが、窒素源及び炭素源を含有するものが好ましい。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等を、また、炭素源としては、グルコース、キシロース、フルクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、デンプン、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等を用いることができる。また、無機質として、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン等を添加することができ、更にビタミン等を添加することができる。好適な培地としては、ＭＲＳ培地、ＬＢＳ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、ＷＹＰ培地、ＧＹＰ培地等が挙げられる。培養温度は通常約２５〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３８℃（特に約３７℃）である。培養時間は通常約６〜約６２時間である。培地のｐＨは通常約３〜約６、好ましくは約４〜約６である。培養はインキュベーター中で行ってもよく、また、培養の際は通気振とうしてもよい。
【００２０】
菌体の処理物としては、例えば、菌体を１００℃以上で数分以上加熱して得られる処理物（例えば、菌体に、１１０〜１２５℃の温度で１０分以上、オートクレーブ処理を施して得られる処理物）、菌体に対して凍結乾燥、噴霧乾燥等を行って得られる処理物、或いは菌体を超音波、フレンチプレス等で物理的に破壊して得られる処理物が挙げられる。このような菌体処理物は、未処理菌体（特に生菌体）と比較して、取り扱いが容易な点で腸管保護剤の有効成分として好適である。
【００２１】
培養上清とは、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の生菌体を液体培地で培養して得られる培養物の上清のことである。液体培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものが好ましい。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等を、また、炭素源としては、グルコース、キシロース、フルクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、デンプン、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等を用いることができる。また、無機質として、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン等を添加することができ、更にビタミン等を添加することができる。好適な液体培地としては、ＭＲＳ培地、ＬＢ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、ＷＹＰ培地、ＧＹＰ培地等が挙げられる。培養温度は通常約２７〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３８℃（特に約３７℃）である。培養時間は通常約６〜約６２時間、好ましくは約１２〜約４８時間である。培地のｐＨは通常約３〜約６、好ましくは約４〜約６である。培養はインキュベーター中で行ってもよく、また、培養の際は通気振とうしてもよい。培養上清は、例えば培養物をフィルターで濾過することによって、培養物から分離することができる。
【００２２】
上述から明らかように、培養上清を得るための好適な培養方法としては、例えば、インキュベーター中、ｐＨ約４〜約６のＭＲＳ培地、ＬＢ培地等を用いて、約３０〜約３８℃（特に約３７℃）で約１２〜約４８時間（特に、約１２時間、約２４時間、約３６時間又は約４８時間）培養する方法が挙げられる。
【００２３】
培養上清の処理物としては、例えば、遠心分離により培養上清を固液分離して得られる処理物、凍結乾燥により培養上清から水分を除去して得られる処理物、エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物、限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物、或いはフィルター等を用いて培養上清を固液分離して得られる処理物が挙げられる。また、例えば、培養上清を遠心分離（例えば、３０００ｒｐｍ、１０分）した後、上清をシリンジフィルター（例えば、０．４５μｍ）で濾過し、濾液を硫安（例えば、６５％飽和硫安）で分画し、沈殿物を蒸留水で透析して得られる沈殿画分が挙げられる。
【００２４】
本発明の腸管保護剤は、固体（例えば、凍結乾燥させて得られる粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤等のいずれの剤形を取ってもよい。また、本発明の腸管保護剤は、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の菌体又はその処理物からなるもの、或いはラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の培養上清又はその処理物からなるものであってもよい。
【００２５】
上述の各種製剤は、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の菌体若しくはその処理物又は培養上清若しくはその処理物と、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）と、を混和することによって調製することができる。
【００２６】
例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２７】
本発明の腸管保護剤は、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。
【００２８】
例えば、本発明の腸管保護剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。これらの飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有してもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類、が挙げられる。本発明の腸管保護剤はまた、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。本発明の腸管保護剤を含有する飲食品は、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株で牛乳、脱脂乳、豆乳等を発酵させて得られる発酵物であってもよい。
【００２９】
本発明の腸管保護剤は、ヒトに投与しても、非ヒト哺乳動物に投与してもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【００３１】
〔実施例１〕
（試験サンプルの調製）
ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の菌体をオートクレーブ処理（１０５℃、３０分）で殺菌した後、凍結乾燥し、凍結乾燥菌体をＲＰＭＩ培地に懸濁して菌体懸濁液［０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）］を得た。また、菌体を含有しないＲＰＭＩ培地をコントロールとして用意した。
【００３２】
（腸管への刺激）
雄性、６〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー）から小腸を取り出し、腸管内をＰＢＳで洗浄した後、腸管を３等分した。得られた３つの腸管の各々について、一端を外科用糸で縛り、菌体懸濁液［０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）］又はＲＰＭＩ培地（コントロ−ル）を注入した後、他端を外科用糸で縛った。３つの腸管をＲＰＭＩ培地に浸して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２時間インキュベートし、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて腸管上皮からタンパク質を抽出した。
【００３３】
（ウェスタンブロッティング）
抽出したタンパク質について、次のようにウェスタンブロッティングを行った。まず、抽出したタンパク質３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、セミドライブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５％スキムミルク中で１時間振とうして、ブロッキングを行った。そして、ＰＶＤＦ膜を１次抗体［抗Ｈｓｐ２５抗体、抗Ｈｓｐ７０抗体又は抗Ｈｓｃ７０抗体］と反応させた。更に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにてＰＶＤＦ膜を十分に洗浄した後、２次抗体［ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体又はＨＲＰ結合抗マウス抗体］と反応させた。最後に、ＰＶＤＦ膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＤにて十分に洗浄した後、化学発光法により抗原タンパク質を検出した。
【００３４】
なお、Ｈｓｃ７０は、腸管上皮細胞に恒常的に発現するタンパク質の一つである。他方、Ｈｓｐ２５、Ｈｓｐ７０は、炎症性物質（インターロイキン−１β、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α等）の産生及びこれに伴う炎症反応の惹起を抑制して、細胞への傷害を抑制する熱ショックタンパク質である。
【００３５】
（結果）
結果を図１及び表１に示す。図１は、抽出したタンパク質のウェスタンブロットである。表１は、図１のウェスタンブロット上のバンドの強度を示す表である。図１及び表１において、濃度［％（ｗ／ｖ）］は菌体懸濁液中の菌体濃度を示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
図１及び表１から明らかなように、Ｈｓｃ７０の発現量には、菌体懸濁液とコントロールとの間で大きな差異が見られなかったのに対して、Ｈｓｐ２５及びＨｓｐ７０の発現量は、菌体懸濁液が注入された腸管において顕著に多かった。
【００３８】
〔実施例２〕
（試験サンプルの調製）
実施例１と同様にして試験サンプルを調製した。また、菌体を含有しないＲＰＭＩ培地をコントロールとして用意した。
【００３９】
（腸管への刺激）
雄性、６〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー）から小腸を取り出し、腸管内をＰＢＳで洗浄した後、腸管を３等分した。得られた３つの腸管の各々について、一端を外科用糸で縛り、菌体懸濁液［０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）］又はＲＰＭＩ培地（コントロ−ル）を注入した後、他端を外科用糸で縛った。３つの腸管をＲＰＭＩ培地に浸して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２時間インキュベートした。
【００４０】
（マンニトールフラックスの測定）
次いで、各腸管から内容物を排出し、腸管を更に２等分した後、一方の腸管には、モノクロラミン（ＮＨ２Ｃｌ）を添加したトリチウム標識マンニトール水溶液（１μＣｉ ［３Ｈ］ｍａｎｎｉｔｏｌ／ｍＬ）を、他方の腸管には、モノクロラミンを添加していないトリチウム標識マンニトール水溶液（１μＣｉ ［３Ｈ］ｍａｎｎｉｔｏｌ／ｍＬ）を注入し、腸管をＲＰＭＩ培地に浸して静置した。５分、２０分、３５分後に培地をサンプリングし、シンチレーションカウンターにてトリチウム量を測定した。「２０分後のトリチウム量−５分後のトリチウム量」、「３５分後のトリチウム量−５分後のトリチウム量」を算出し、それぞれ１５分、３０分のマンニトールフラックスとした。
【００４１】
なお、モノクロラミンは、消化管粘膜を酸化的に傷害することが知られている物質である。また、腸管のマンニトールフラックスは、腸粘膜傷害（腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下）の指標として用いることができる。
【００４２】
（結果）
結果を図２に示す。図２は、モノクロラミンで刺激した腸管のマンニトールフラックス（１５分、３０分）を示すグラフである。図２において、濃度［％（ｗ／ｖ）］は菌体懸濁液中の菌体濃度を示す。
【００４３】
図２から明らかなように、モノクロラミンで刺激した腸管のマンニトールフラックスは、菌体懸濁液が注入された腸管において顕著に小さかった。なお、モノクロラミンで刺激されていない腸管のマンニトールフラックスは、いずれの腸管においても無視し得る程度に小さかった。
【００４４】
〔実施例３〕
（培養上清の調製）
ＭＲＳ培地中、１０％（ｗ／ｖ）のラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の菌体を、インキュベーター中、３７℃で１２時間、３６時間及び６０時間培養して培養上清を得た。また、培養上清を含有しないＭＲＳ培地をコントロールとして用意した。
【００４５】
（腸管上皮細胞への刺激）
得られた培養上清中、Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト大腸癌由来腸管上皮細胞）を３７℃で２４時間インキュベートし、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてＣａｃｏ−２細胞からタンパク質を抽出した。
【００４６】
（ウェスタンブロッティング）
１次抗体として抗Ｈｓｐ２７抗体又は抗Ｈｓｃ７０抗体を使用したこと以外は実施例１と同様にして、抽出したタンパク質についてウェスタンブロッティングを行った。
【００４７】
なお、Ｈｓｃ７０は、腸管上皮細胞に恒常的に発現するタンパク質の一つである。他方、Ｈｓｐ２７は、炎症性物質（インターロイキン−１β、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α等）の産生及びこれに伴う炎症反応の惹起を抑制して、細胞への傷害を抑制する熱ショックタンパク質である。
【００４８】
（結果）
結果を図３及び表２に示す。図３は、抽出したタンパク質のウェスタンブロットである。表２は、図３のウェスタンブロット上のバンドの強度を示す表である。図３及び表２において、時間は菌体の培養時間を示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
図３及び表２から明らかなように、Ｈｓｃ７０の発現量には、培養上清とコントロールとの間で大きな差異が見られなかったのに対して、Ｈｓｐ２７の発現量は、培養上清中でインキュベートされたＣａｃｏ−２細胞において顕著に多かった。
【００５１】
〔実施例４〕
（培養上清の調製）
培養時間を２４時間としたこと以外は実施例３と同様にして、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清を得た。また、培養上清を含有しないＭＲＳ培地をコントロールとして用意した。
【００５２】
（硫安分画）
得られた培養上清を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）し、上清をシリンジフィルター（０．４５μｍ）で濾過した。濾液を６５％飽和硫安で分画し、沈殿物を蒸留水で透析して沈殿画分を得た。
【００５３】
（腸管上皮細胞への刺激）
得られた沈殿画分中、Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト大腸癌由来腸管上皮細胞）を３７℃で２４時間インキュベートし、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてＣａｃｏ−２細胞からタンパク質を抽出した。
【００５４】
（ウェスタンブロッティング）
抽出したタンパク質について、実施例３と同様にしてウェスタンブロッティングを行った。
【００５５】
（結果）
結果を図４に示す。図４は、抽出したタンパク質のウェスタンブロットである。図４において、「×１００」、「×１０」、「×１」はそれぞれ、沈殿画分の希釈倍率が１００倍、１０倍、１倍であることを表す。
【００５６】
図４から明らかなように、Ｈｓｃ７０の発現量には、沈殿画分とコントロールとの間で大きな差異が見られなかったのに対して、Ｈｓｐ２７の発現量は、沈殿画分中でインキュベートされたＣａｃｏ−２細胞において顕著に多かった。
【００５７】
実施例１〜４により、本発明の腸管保護剤は、腸管の防御機構が破綻した場合に、腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下や腸管（腸粘膜）における炎症反応の惹起（炎症性物質の産生）を抑制し、これを介して腸粘膜傷害を抑制することが可能であることが確認された。
【００５８】
〔参考例１〕
実施例４と同様にして、培養上清の調製及び硫安分画を行った。得られた培養上清及び沈殿画分についてＳＤＳ−Ｐａｇｅを行い、銀染色によりタンパク質を検出した。
【００５９】
結果を図５に示す。図５は、培養上清及び沈殿画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ写真である。図５において、「×１」、「×５」、「×２５」、「×１２５」、「×６２５」はそれぞれ、培養上清又は沈殿画分の希釈倍率が１倍、５倍、２５倍、１２５倍、６２５倍であることを表す。
【００６０】
参考例１により、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清が、２５ｋＤａ及び５０ｋＤａのタンパク質を含有することが示された。
【００６１】
〔実施例５〕
（試験サンプルの調製）
ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の菌体をオートクレーブ処理（１０５℃、３０分）で殺菌した後、凍結乾燥し、凍結乾燥菌体を蒸留水に懸濁して０．１％（ｗ／ｖ）菌体懸濁液を得た。
【００６２】
（潰瘍性大腸炎誘発試験）
試験サンプルの投与：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄性、体重１８〜２５ｇ）（日本チャールス・リバー）８匹を菌体投与群（３匹）と菌体非投与群（５匹）とに分けた後、１０日間、毎日、菌体投与群のマウスには菌体懸濁液１ｍＬを、菌体非投与群のマウスには蒸留水１ｍＬを経口投与した。この期間中、いずれの群のマウスにも通常食を自由摂取させた。１０日目に各マウスの体重を測定したところ、体重（平均±標準偏差）は下記の通りであった。
【００６３】
体重（ｇ）：
菌体投与群：２１．７±２．２
菌体非投与群：２２．２±１．１
【００６４】
ＤＳＳの投与：
次に、１４日間、各群のマウスに２％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）水溶液を自由飲水させた。この期間中、菌体投与群のマウスには、菌体懸濁液１ｍＬを１日置きに経口投与した。また、上記期間中、いずれの群のマウスにも通常食を自由摂取させた。なお、ＤＳＳは、組織学的、免疫学的に潰瘍性大腸炎類似の腸管炎症を誘発することが知られている。
【００６５】
１４日目に、各マウスの体重を測定し、更に、屠殺（頚椎脱臼）後、腸管を摘出して腸管長（肛門から盲腸までの長さ）を測定した。体重（平均±標準偏差）及び腸管長（平均±標準偏差）は下記の通りであった。
【００６６】
体重（ｇ）：
菌体投与群：１７．３±４．８
菌体非投与群：１８．８±１．９
腸管長（ｃｍ）：
菌体投与群：６．２±１．９
菌体非投与群：６．２±０．５
【００６７】
炎症の組織学的評価：
腸管から更に遠位大腸（直腸近傍）の組織を採取し、ホルマリン固定、パラフィン包埋を行った。そして、４μｍ厚に薄切し、組織切片（２切片／匹）にヘマトキシリン・エオジン染色を行って、組織標本（２標本／匹）を得た。各標本を光学顕微鏡で観察し、炎症の程度を下記基準（Ｂｅｒｇ ＤＪら，Ｊ ｃｌｉｎ ｉｎｖｅｓｔ，１９９８参照）で組織学的に評価した。
【００６８】
評価基準：
スコア０： 炎症細胞浸潤は認められない。
スコア１： １〜数個の単核球が粘膜上皮内に浸潤している。杯細胞からのムチン産生の低下は認められない。
スコア２： 粘膜上皮内に軽度の炎症細胞浸潤が認められる。炎症細胞浸潤は単核球優位だが、好中球浸潤も見られる。
スコア３： ムチン産生の低下が認められる。しばしば粘膜下層への炎症細胞浸潤が見られる。
スコア４： 炎症細胞浸潤が筋層に及び、ムチン産生はほぼ消失している。陰窩膿瘍又は潰瘍が認められる。
【００６９】
（結果）
評価結果（炎症スコア）は下記及び図６の通りであった。図６は、各群のマウスの炎症スコアの分布を示す箱ひげ図である。図６において、上ひげ及び下ひげの先端は、それぞれ炎症スコアの最大値及び最小値の位置を示す。また、箱の上端及び下端は、それぞれ２５％点及び７５％点の位置を示し、箱の中心点は中央値の位置を示す。なお、菌体投与群及び菌体非投与群のいずれにおいても、下ひげは箱の下端と重なっている。
【００７０】
評価結果：
菌体投与群：１、１、２、２、２、３
菌体非投与群：２、２、２、３、３、３、３、３、４、４
【００７１】
上記結果から明らかなように、菌体投与群では炎症が顕著に抑制された。菌体投与群の炎症スコアは、菌体非投与群に比べて有意に低かった（Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｐ＜０．０５）。また、体重及び腸管長については、群間で有意差が認められなかった（Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【００７２】
実施例５により、本発明の腸管保護剤は、腸管の防御機構が破綻した場合に、腸管（腸粘膜）バリアー機能の低下や腸管（腸粘膜）における炎症反応の惹起（炎症性物質の産生）を抑制し、これを介して腸粘膜傷害を抑制することが可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の腸管保護剤は、種々の腸疾患の予防及び改善に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤。
【請求項２】
ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の培養上清又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤。
【請求項３】
前記菌株が、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株である、請求項１又は２に記載の腸管保護剤。
【請求項４】
前記菌株が、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＢＣ８８０３（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６３２）菌株である、請求項３に記載の腸管保護剤。
【請求項５】
哺乳動物における腸管バリアー機能の低下を抑制するために使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腸管保護剤。
【請求項６】
哺乳動物の腸管における炎症反応の惹起を抑制するために使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の腸管保護剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の腸管保護剤を含有する医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の腸管保護剤を含有する飲食品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の腸管保護剤を含有する飲食品添加物。
【請求項１】
ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤。
【請求項２】
ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株の培養上清又はその処理物を有効成分として含有する腸管保護剤。
【請求項３】
前記菌株が、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株である、請求項１又は２に記載の腸管保護剤。
【請求項４】
前記菌株が、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＢＣ８８０３（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６３２）菌株である、請求項３に記載の腸管保護剤。
【請求項５】
哺乳動物における腸管バリアー機能の低下を抑制するために使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腸管保護剤。
【請求項６】
哺乳動物の腸管における炎症反応の惹起を抑制するために使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の腸管保護剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の腸管保護剤を含有する医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の腸管保護剤を含有する飲食品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の腸管保護剤を含有する飲食品添加物。
【図２】
【図６】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−８３８８１（Ｐ２０１０−８３８８１Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０４９００（Ｐ２００９−２０４９００）
【出願日】平成２１年９月４日（２００９．９．４）
【出願人】（５０５２１０１１５）国立大学法人旭川医科大学 (17)
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月４日（２００９．９．４）
【出願人】（５０５２１０１１５）国立大学法人旭川医科大学 (17)
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
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