膵液成分保存用試料の調製方法
【課題】採取された膵液を、膵液由来の生体成分の分解が抑制された状態で保存可能な試料を調製する方法、当該試料を調製するための容器、及び当該試料を用いて膵液成分を測定する方法の提供。
【解決手段】膵液又は十二指腸液を保存するための膵液成分保存用試料の調製方法であって、膵液又は十二指腸液とｐＨ調整液とを混合することにより、ｐＨが２〜５である膵液成分保存用試料を調製する膵液成分保存用試料の調製方法、膵液又は十二指腸液のための採取用容器であって、採取された膵液又は十二指腸液のｐＨを２〜５に調整するためのｐＨ調整液が予め含まれている膵液又は十二指腸液のための採取用容器、前記記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料、並びに、前記記載の膵液成分保存用試料のｐＨを６〜８に調整することを特徴とする、膵液成分測定用試料の調製方法。
【解決手段】膵液又は十二指腸液を保存するための膵液成分保存用試料の調製方法であって、膵液又は十二指腸液とｐＨ調整液とを混合することにより、ｐＨが２〜５である膵液成分保存用試料を調製する膵液成分保存用試料の調製方法、膵液又は十二指腸液のための採取用容器であって、採取された膵液又は十二指腸液のｐＨを２〜５に調整するためのｐＨ調整液が予め含まれている膵液又は十二指腸液のための採取用容器、前記記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料、並びに、前記記載の膵液成分保存用試料のｐＨを６〜８に調整することを特徴とする、膵液成分測定用試料の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵液又は膵液が含まれる十二指腸液を保存するための試料を調製するための方法、当該試料を調製するための容器、及び当該試料を用いて膵液成分を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液は臓器の状態を知るための重要な生体試料である。膵液も膵臓の状態を知るための重要な生体試料であり、細胞診ならびに各種生体分子の測定などの検査や研究に用いられている。その採取方法は、一般的に、内視鏡を十二指腸まで挿入し、十二指腸乳頭部を確認した後、当該内視鏡の開口部から膵臓の膵管へカテーテルを挿入することにより、膵管に貯まった膵液を採取する方法である。また、膵管を通じて乳頭部から排出された膵液を十二指腸で採取する方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。なお、十二指腸で採取した液中には、膵液だけではなく、同じく乳頭部より排出された胆汁や元々十二指腸に存在している液も含まれている。
【０００３】
膵液は消化液であるため、様々な消化酵素を含む。これらの消化酵素は、膵臓内においては不活性の状態で存在しているが、十二指腸に排出された後に活性化することが知られている。膵液中の消化酵素は、十二指腸上皮細胞から分泌される小腸エンテロキナーゼによって分解のカスケード反応が進む。小腸エンテロキナーゼによって膵液中に含まれるトリプシノーゲンが活性化されてトリプシンになり、さらにこのトリプシンが引き金となり、キモトリプシノーゲン、プロエステラーゼなど種々の消化酵素（プロテアーゼ）が活性化されることが知られている。なお、トリプシノーゲンは膵液総タンパク量のほぼ１２％前後を占めると言われている（例えば、非特許文献２参照。）。これら種々のプロテアーゼの活性化により、膵液中に含まれるタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子は、十二指腸に排出後に分解、変性されてしまう。このため、十二指腸へ排出された膵液を細胞診や生体分子の測定をはじめとした検査や研究に役立てる場合、膵液中の目的とする細胞やタンパク質などがプロテアーゼの影響を受け、正確に測定できないことが懸念される。このため、十二指腸に排出された膵液中におけるプロテアーゼの活性をいかに阻害するかが重要となる。
【０００４】
また、弱アルカリ性（ｐＨ８．５程度）である膵液は、十二指腸に排出されて胃酸と混ざることによって中性になる。このため、ｐＨ７〜７．５に至適ｐＨを持つヌクレアーゼは、十二指腸に排出されることにより、より活性が進むことが予想される。このため、特に膵液中の核酸を解析対象として診断等を行う場合、膵液中に含まれているヌクレアーゼをいかに阻害するかが重要となる。
【０００５】
十二指腸から採取された膵液中の各種分解酵素の活性を低減させるための従来法の１つとして、採取した膵液を冷やした状態で保存し、酵素活性の至適温度を外すことによって活性を抑える方法がある。しかしながら、当該方法では、採取された膵液を常に低温に保つ必要があり、取り扱いが煩雑であるという問題がある。また、タンパク質の種類によっては、低温であっても分解が進むことがあるため、単に低温で保存するだけでは、膵液由来の成分の分解・変性等を抑制するためには不十分である。
【０００６】
その他、非特許文献１では、十二指腸に排出された膵液にプロテアーゼ阻害剤を加えることにより、酵素活性を抑えている。しかしながら、膵液中に含まれる酵素、特にプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、カルボキシペプチターゼなど多種多様であり、１又は数種の阻害剤を添加しただけでは全ての酵素の活性を完全に抑制することは非常に困難である。さらに、多くの阻害剤は低温での保存が必要であり、コストも高いため、ルーチンな検査に適しているとは言えない、という問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ノウ（Noh）、他４名、クリニカル・ガステロエンテロロジー・アンド・へパトロジー（CLINICAL GASTROENTEROLOGY AND HEPATOLOGY）、２００６年、第４巻、第７８２〜７８９ページ。
【非特許文献２】洲脇 謹一郎、日本消化器病学会雑誌、１９８１年、第７８巻、第６号、第１２７５〜１２８１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、採取された膵液、特に十二指腸に排出された後に採取された膵液を、膵液由来の生体成分の分解が抑制された状態で保存可能な試料を調製する方法、当該試料を調製するための容器、及び当該試料を用いて膵液成分を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、採取された膵液をｐＨ２〜５で保存することにより、当該膵液中に含まれている酵素の活性を効果的に抑制し、生体成分を安定して保存し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１） 膵液又は十二指腸液を保存するための膵液成分保存用試料の調製方法であって、
膵液又は十二指腸液とｐＨ調整液とを混合することにより、ｐＨが２〜５である膵液成分保存用試料を調製することを特徴とする膵液成分保存用試料の調製方法、
（２） 前記膵液成分保存用試料のｐＨが３．５〜５であることを特徴とする前記（１）に記載の膵液成分保存用試料の調製方法、
（３） 前記膵液成分保存用試料のｐＨが４〜４．５であることを特徴とする前記（１）に記載の膵液成分保存用試料の調製方法、
（４） 前記ｐＨ調整液が緩衝作用を有していることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の膵液成分保存用試料の調製方法、
（５） 前記膵液成分保存用試料の容量は、前記膵液又は十二指腸液の容量の３倍以上であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の膵液成分保存用試料の調製方法、
（６） 膵液又は十二指腸液のための採取用容器であって、
採取された膵液又は十二指腸液のｐＨを２〜５に調整するためのｐＨ調整液が予め含まれていることを特徴とする膵液又は十二指腸液のための採取用容器、
（７） 前記ｐＨ調整液の容量が、採取予定の膵液又は十二指腸液の容量の２倍以上であることを特徴とする前記（６）に記載の採取用容器、
（８） 前記ｐＨ調整液が、緩衝作用を有することを特徴とする前記（６）又は（７）に記載の採取用容器、
（９） 前記ｐＨ調整液が、ｐＨ指示薬を含むことを特徴とする前記（６）〜（８）のいずれか一つに記載の採取用容器、
（１０） 前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料、
（１１） 前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料のｐＨを６〜８に調整することを特徴とする、膵液成分測定用試料の調製方法、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法により、採取された膵液を、当該液中に含まれている各種酵素の活性を効果的に抑制し、生体成分の分解・変性等をより安定して保存することが可能な膵液成分保存用試料を調製することができる。当該調製方法により得られた膵液成分保存用試料は、生体成分の分解・変性等が顕著に抑制されているため、当該膵液成分保存用試料を用いて測定することにより、より精度よく膵液中の生体成分を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】参考例１において、各十二指腸液試料から測定された蛍光量を示した図である。
【図２】参考例２において、各パンクレアチン溶液から測定された蛍光量を示した図である。
【図３】実施例１において、十二指腸液の各希釈液から測定された蛍光量を示した図である。
【図４】実施例２において、各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を示した図である。
【図５】実施例３において、各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
膵液は十二指腸に排出されると、十二指腸上皮細胞から分泌される小腸エンテロキナーゼによって膵液中に含まれるトリプシノーゲンが活性化されトリプシンになり、表１に示すような種々の消化酵素が活性化される。小腸エンテロキナーゼは、ｐＨ８に至適ｐＨを持つ。また、表１に示すような各種プロテアーゼの至適ｐＨは５〜９程度と比較的幅広い。
【００１４】
【表１】
【００１５】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法は、膵液又は十二指腸液を保存するための膵液成分保存用試料の調製方法であって、膵液又は十二指腸液とｐＨ調整液とを混合することにより、ｐＨが２〜５である膵液成分保存用試料を調製することを特徴とする。ｐＨが２〜５の状態では、膵液由来の消化酵素の大部分の至適ｐＨから外れるため、これらの消化酵素の活性を簡便かつ有意に抑制することができる。よって、膵液又は十二指腸液のｐＨを２〜５に調整することによって、膵液等中の膵液由来の生体成分の消化酵素による分解等を抑制し、生体成分を解析可能な状態で保存することができる。
【００１６】
本発明及び本願明細書において、十二指腸液とは、十二指腸で採取される体液であり、膵液に加えて、胆汁や元々十二指腸に存在している液も含まれている。
【００１７】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法に供される膵液由来の成分を含む体液は、膵臓から直接カテーテルから採取された膵液であってもよく、十二指腸液であってもよい。膵液や十二指腸液は、常法により採取することができる。本発明に供される体液は、膵液と十二指腸液のいずれであってもよいが、十二指腸液のほうがより本発明の効果を奏することができる。
【００１８】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法において調製される膵液成分保存用試料のｐＨは、２〜５の範囲内であればよいが、２．４〜５．１であることが好ましく、３．０〜５であることがより好ましく、３．５〜５であることがさらに好ましく、４〜４．５であることがよりさらに好ましい。
【００１９】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法に供される膵液等は、採取された後常法により保存されたものであってもよいが、採取直後のものであることが好ましい。採取後速やかにｐＨを２〜５に調整することによって、生体成分の分解等をより効果的に抑制することができる。
【００２０】
具体的には、膵液等とｐＨ調整液とを混合する。本発明において用いられるｐＨ調整液は、膵液等のｐＨを２〜５に調整可能なものであれば特に限定されるものではなく、一般的に中性又はアルカリ性の溶液を酸性に調整する際に用いられる酸の中から、膵液等の量、粘度、得られた膵液成分保存用試料の使用方法等を考慮して、適宜調整することができる。
【００２１】
ｐＨ調整液の有効成分として用いられる酸としては、鉱酸であってもよく、有機酸であってもよい。具体的には、塩酸、硝酸、硫酸、酢酸、過酸化水素、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、アジピン酸、コハク酸、リン酸などの酸、又はその塩を、１種又は２種以上を混合して用いる。中でも、食品添加物として用いられ、より安全性が高いと考えられるクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、アジピン酸、コハク酸、リン酸等を用いることが好ましい。
【００２２】
本発明において用いられるｐＨ調整液は、膵液等と混合した際に得られた混合液（膵液成分保存用試料）のｐＨをほぼ一定に保つために、緩衝作用のある緩衝液であることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液（クエン酸とクエン酸ナトリウム）や酢酸緩衝液（酢酸と酢酸ナトリウム）、グリシン−塩酸緩衝液（グリシンと塩酸）等が挙げられる。例えば、０．１Ｍクエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏ、２１．０１ｇ／Ｌ）３３ｍｌにクエン酸３ナトリウム（Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、２９．４１ｇ／Ｌ）２２ｍｌを加え、１００ｍｌに希釈することにより、クエン酸とクエン酸ナトリウムを用いてｐＨ４の緩衝液を調製することができる。
【００２３】
より安定して確実にｐＨを所望の範囲内に調整するために、本発明においては、得られた膵液成分保存用試料では、膵液等が充分に希釈されていることが好ましい。また、膵液等は粘性が高い場合があるため、ほとんどの場合、均一化の意味も含め、アッセイ時には希釈する必要がある。そこで、本発明においては、膵液等に対して等量以上のｐＨ調整剤を混合することが好ましい。膵液等に対して十分な容量のｐＨ調整剤を添加することにより、適度な希釈とｐＨ調整とを同時に達成することができる。本発明においては、調製された膵液成分保存用試料の容量は、前記膵液又は十二指腸液の容量の３倍以上であることが好ましく、４倍以上であることがより好ましく、５倍以上であることがさらに好ましく、６倍以上であることがよりさらに好ましい。特に、膵液等の体液は粘性やｐＨの個体差が大きいため、より確実にｐＨを調整するためには、さらに希釈倍率を上げて調製することが望ましい。
【００２４】
本発明においては、膵液等に少量のｐＨ調整剤を添加した後、緩衝液等を添加して希釈してもよく、予め緩衝液等で希釈したｐＨ調整剤を膵液等に添加してもよい。少量の膵液等に対して濃い酸を少量添加した場合には、凝固する場合がある。このため、本発明においては、予め緩衝液等で膵液等の２倍以上の容量に希釈したｐＨ調整剤と膵液等を混合することが好ましい。
【００２５】
本発明において、得られた膵液成分保存用試料のｐＨの確認や、用いられるｐＨ調整剤や希釈に用いられる緩衝液のｐＨの確認は、溶液の一部を採取し、得られた溶液のｐＨをｐＨ試験紙やｐＨ計測器を用いて測定することができる。また、ｐＨ調整剤や希釈用の緩衝液に予めｐＨ指示薬を添加しておき、溶液の色の変化を目視で確認することによって、膵液成分保存用試料等の溶液のｐＨを確認してもよい。ｐＨ指示薬としては、当該技術分野で公知の指示薬の中から適宜選択して用いることができる。具体的なｐＨ指示薬を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法においては、一旦採取容器に回収された膵液等にｐＨ調整液を混合することによって調製してもよいが、生体から採取された膵液を直接、ｐＨ調整液が予め含まれている採取容器（以下、本発明の採取容器、ということがある。）に回収することが好ましい。また、本発明の採取容器に含有されているｐＨ調整液は、採取予定の膵液又は十二指腸液のｐＨを調整するために十分な量であればよいが、採取予定の膵液等の容量の２倍以上の容量であることが好ましく、３倍以上の容量であることがより好ましく、４倍以上の容量であることがさらに好ましく、５倍以上の容量であることがよりさらに好ましい。また、採取された膵液等のｐＨを所望の範囲内により安定して調整することができるため、本発明の採取容器に含有されているｐＨ調整液は、緩衝作用を有していてもよい。さらに、ｐＨの評価を簡便に行うことができるため、本発明の採取容器に含有されているｐＨ調整液は、適当なｐＨ指示薬を有していることも好ましい。
【００２８】
本発明の採取容器は、例えば、膵液又は十二指腸液の採取する際に用いられるカテーテルの末端に接続され、当該カテーテルを通って生体外へ採取された体液を回収可能な容器に、前記のｐＨ調整液を予め収容させておくことにより作製することができる。その他、通常膵液又は十二指腸液の採取に用いられる採取用具中の、採取された体液が一次的に貯留される部位に、予め前記のｐＨ調整液を収容させたものも、本発明の採取容器とすることができる。
【００２９】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料は、多種多様な消化酵素を含有しているにもかかわらず、これらの消化酵素による影響が有意に抑制されており、タンパク質や核酸等の生体成分を安定して保存することができる。つまり、本発明の膵液成分保存用試料は、膵液等に含まれている生体成分を、診断、検査、研究を実施するまでの間、非常に効果的に保存することができるため、膵液等に含まれている生体成分の解析に好適に用いることができる。特に、本発明の膵液成分保存用試料は、ｐＨを所望の範囲内に維持されている限り安定して消化酵素の活性を抑制することができるため、冷蔵・冷凍保存等を必ずしも必要とせず、取り扱いが容易である。なお、本発明の膵液成分保存用試料の保存温度は、常温以下であればよく、冷蔵保存や冷凍保存をしてもよい。
【００３０】
本発明の膵液成分保存用試料は、その他の生体試料と同様に、各種検査のための測定試料として用いることができる。本発明の膵液成分保存用試料中の測定対象物質は、膵液又は十二指腸液に含まれていることが期待される生体成分であれば特に限定されるものではなく、タンパク質であってもよく、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸であってもよく、細胞であってもよい。例えば、本発明の膵液成分保存用試料は、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、二次元電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法などを用いた種々のタンパク質解析や、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、プローブを用いたハイブリダイゼーションなどを用いた種々の核酸解析、細胞数カウントや細胞診のような細胞解析等に用いることができる。
【００３１】
本発明の膵液成分保存用試料は、ｐＨが２〜５であるため、測定方法によっては、ｐＨを中性付近、例えばｐＨを６〜８に調整した後に、測定に供することが好ましい。例えば、測定対象物質がタンパク質であり、測定方法がＥＬＩＳＡ等の抗原抗体反応を利用した方法である場合には、反応溶液に添加する前に本発明の膵液成分保存用試料のｐＨを中性付近にすることにより、抗原抗体反応や、抗原抗体複合体を検出するための酵素反応に対する影響を抑制することができる。特に、測定対象物質が核酸である場合には、通常、本発明の膵液成分保存用試料から核酸抽出工程を経て得られた核酸に対して測定が行われるが、本発明の膵液成分保存用試料のｐＨを６〜７に調整した後に核酸抽出が行われることによって、核酸抽出工程において汎用されているプロテアーゼＫ（至適ｐＨは７．５〜１０付近。）の働きに対する影響を極力減らすことができる。
【００３２】
本発明の膵液成分保存用試料を膵液由来のＳ１００Ｐ（カルシウム結合タンパク質）の測定に用いる場合には、本発明の膵液成分保存用試料のｐＨは３．５〜５に調整されていることが好ましく、４〜４．５に調整されていることがより好ましい。当該範囲内にあることにより、膵液成分保存用試料中のＳ１００Ｐをより効果的に安定して保存することができる。
【実施例】
【００３３】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
［参考例１］
７人から採取された十二指腸液（十二指腸排出後膵液）検体のプロテアーゼ活性、及びプロテアーゼ活性に対する阻害剤の影響を調べた。
まず、７人から常法により採取された十二指腸液を３等分し、１つはそのままの状態で、１つは市販の阻害剤（商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ社製）を最終濃度が推奨濃度（１×）になるように添加し、残る１つは当該阻害剤を最終濃度が推奨濃度の５倍濃度（５×）になるように添加して十二指腸液試料を調製し、それぞれのプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活は、ＥｎｚＣｈｅｃｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて測定した。具体的には、調製した各十二指腸液試料に、当該キットに添付されている蛍光標識されたカゼインを添加し、３７℃で２時間インキュベーションした後、Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５３５ｎｍの蛍光波長で蛍光量を測定した。蛍光量はカゼインを分解した量を表すため、当該蛍光量をプロテアーゼ活性の値として概算した。
【００３５】
各十二指腸液試料から測定された蛍光量を図１に示す。図１中、「（−）」が阻害剤を添加しなかった十二指腸液試料の結果を、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １×」は前記阻害剤を推奨濃度（１×）になるように添加した十二指腸液試料の結果を、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ５×」は前記阻害剤を推奨濃度の５倍濃度（５×）になるように添加した十二指腸液試料の結果を、それぞれ示す。この結果、十二指腸液中のプロテアーゼ活性には個人差が大きいことが示された。また、阻害剤によってプロテアーゼ活性は阻害されるものの、活性を完全に抑えることは難しいことが明らかになった。
【００３６】
［参考例２］
膵酵素が活性化した状態で存在するブタの膵臓から製した消化酵素剤である“パンクレアチン”を擬似人工膵液として用い、膵酵素の活性に対するｐＨの影響を調べた。
まず、１ｍｇ／ｍｌ（終濃度）のパンクレアチン溶液に対し、塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨを２．５〜１１．９に調整した。ｐＨの確認は、塩酸等を添加した後に、パンクレアチン溶液の一部を分取し、ｐＨ測定器を用いて測定することにより行った。次に、各パンクレアチン溶液のプロテアーゼ活性を参考例１と同様にして測定した。
【００３７】
各パンクレアチン溶液から測定された蛍光量を図２に示す。この結果、ｐＨ７．９〜１０．５のパンクレアチン溶液の蛍光量（プロテアーゼ活性）は、ｐＨ調整を行わなかったパンクレアチン溶液と同等又はそれ以上であった。これに対して、ｐＨ２．５〜４．５のパンクレアチン溶液の蛍光量は、ｐＨ調整を行わなかったパンクレアチン溶液よりも顕著に小さくなっていた。また、ｐＨ６．３及び１１．９のパンクレアチン溶液の蛍光量は、ｐＨ調整を行わなかったパンクレアチン溶液よりも小さいものの、大部分のパンクレアチン・プロテアーゼ活性はまだ残存していた。これらの結果から、アルカリ側のｐＨでは、ほとんど膵酵素のプロテアーゼ活性は阻害されないが、ｐＨ２〜５付近ではパンクレアチンのプロテアーゼ活性が有意に阻害されることが明らかになった。
【００３８】
［実施例１］
４人から採取された十二指腸液検体のプロテアーゼ活性、及びプロテアーゼ活性に対するｐＨの影響を調べた。
ＥｎｚＣｈｅｃｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）に付属の緩衝液（ｐＨ７．５）をそれぞれｐＨ２．４〜１１．２に調整し、様々なｐＨの緩衝液を調製した。これらの緩衝液を用いて、十二指腸液をそれぞれ２５００倍希釈し、各ｐＨに調整された十二指腸液希釈液を調整した。各十二指腸液希釈液のプロテアーゼ活性を参考例１と同様にして測定した。対照として、付属の緩衝液（ｐＨ７．５）で２５００倍に希釈した希釈液（ｐＨ調整なし）、付属の緩衝液（ｐＨ７．５）で２５００倍に希釈し、かつ参考例１で用いた市販の阻害剤を最終濃度が推奨濃度（１×）になるように添加した希釈液をそれぞれ調製し、これらのプロテアーゼ活性を参考例１と同様にして測定した。
【００３９】
各希釈液から測定された蛍光量を図３に示す。図３に示すように、４種類の十二指腸液全てにおいて、酸性ｐＨ、特にｐＨ２．４〜５．１に調整された希釈液ではプロテアーゼ活性が、阻害剤を添加した希釈液よりも明らかに抑制されていた。これらの結果から、酸性ｐＨに調整することが、従来の阻害剤よりもプロテアーゼの活性に対する阻害効果が高いことが確認された。つまり、酸性ｐＨ環境下では、十二指腸液に含まれる多種多様のプロテアーゼの活性を全体的に抑制可能であることが示唆された。
【００４０】
［実施例２］
十二指腸液検体にＳ１００Ｐの標品を加え、当該検体中のＳ１００Ｐを測定し、当該測定に対するｐＨの影響を調べた。
まず、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＣｉｒｃｕＬｅｘ社製、カタログ番号：＃ＣＹ−８０６０）に付属の緩衝液（ｐＨ７．３）のｐＨを２．０〜１１．４に調整し、様々なｐＨの緩衝液を調製した。これらの緩衝液を用いて、各ｐＨのＳ１００Ｐ標品溶液を調製した。次いで、４μｌの十二指腸液検体と、３２μｌの前記緩衝液と、４μｌのＳ１００Ｐ標品溶液（当該緩衝液と同じｐＨに調製されたもの）を混合し、試料溶液を調製した。対照として、緩衝液として、付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液と、緩衝液として、参考例１で用いた市販の阻害剤を最終濃度が推奨濃度の５倍濃度（５×）になるように前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）で調製した阻害剤溶液を用いて調製された試料溶液とを、それぞれ調製した。
これらの試料溶液を２５℃、１６時間インキュベートして反応させた後、一旦凍結保存した。その後、各試料溶液を解凍後、前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）で１０倍希釈することによってｐＨを中性付近に戻した後、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて各試料溶液中のＳ１００Ｐの検出を行った。また、対照として、緩衝液に代えて前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液について、２５℃、１６時間の反応を行わずに直接Ｓ１００Ｐの検出を行った。
【００４１】
各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を図４に示す。図４中、「ＦＴ（１）」は緩衝液に代えて前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製され、かつ２５℃、１６時間の反応を行わなかった試料溶液の結果であり、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は緩衝液に代えて前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液の結果であり、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ５×」は阻害剤を添加した試料溶液の結果である。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は「ＦＴ（１）」よりも明らかにＳ１００Ｐの含有量が少なく、２５℃、１６時間の反応により、Ｓ１００Ｐが分解していることが確認された。また、阻害剤を添加した試料溶液では、前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液よりも若干Ｓ１００Ｐの含有量は多いものの、やはり大部分のＳ１００Ｐが分解されてしまっていた。これに対して、ｐＨ３．０〜４．９の緩衝液で調製された試料溶液では、阻害剤を添加した試料溶液よりもＳ１００Ｐの含有量が高く、阻害剤よりも効果的にＳ１００Ｐの分解を抑制できたことがわかった。特にｐＨ３．５〜４．９の緩衝液で調製された試料溶液では、非常に高い濃度のＳ１００Ｐを検出できた。これらの結果から、本発明の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料では、Ｓ１００Ｐをはじめとする膵液由来の生体成分を安定して保存可能であることが明らかとなった。
【００４２】
［実施例３］
ヒトから採取された十二指腸液検体中のＳ１００Ｐの含有量を測定し、及び当該測定に対するｐＨの影響を調べた。
まず、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＣｉｒｃｕＬｅｘ社製、カタログ番号：＃ＣＹ−８０６０）に付属の緩衝液（ｐＨ７．３）のｐＨを２．０、４．０、又は１１．５に調整した緩衝液を調製した。なお、ｐＨは、それぞれのｐＨに該当するｐＨ指示薬を用いて目視で確認しながら調整した後、さらにｐＨ測定器を用いて精査した。
２５μｌの十二指腸液検体と７５μｌの緩衝液とを混合し、試料溶液を調製した。また、対照として、緩衝液として、参考例１で用いた市販の阻害剤を最終濃度が推奨濃度の５倍濃度（５×）になるように前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）で調製した阻害剤溶液を用いて調製された試料溶液を調製した。
各試料溶液を、３７℃、４時間インキュベートして反応させた。反応後の各試料溶液のｐＨを測定したところ、ｐＨ２．０の緩衝液を用いた試料溶液のｐＨは２．５であり、ｐＨ４．０の緩衝液を用いた試料溶液のｐＨは４．７であり、ｐＨ７．３の緩衝液を用いた試料溶液のｐＨは７．５であり、ｐＨ１１．５の緩衝液を用いた試料溶液のｐＨは１１．２であり、ｐＨはあまり変動していなかった。
その後、各試料溶液を一旦凍結保存した。さらに解凍した後、前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）で１０倍希釈することによってｐＨを中性付近に戻した後、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて各試料溶液中のＳ１００Ｐの検出を行った。また、対照として、緩衝液として、付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液に対して、インキュベートせずに直ちにＳ１００Ｐの検出を行った。
【００４３】
各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を図５に示す。この結果、十二指腸液中に含まれていたＳ１００Ｐは、３７℃、４時間のインキュベーションにより分解されることが確認された。また、阻害剤を添加した試料溶液とｐＨ１１．２の試料溶液ではＳ１００Ｐが検出されなかった。また、ｐＨ７．５の試料溶液では、阻害剤を添加した試料溶液よりは多くのＳ１００Ｐが検出されたものの、インキュベーション前の試料溶液（対照）の１０％程度にすぎなかった。これに対して、ｐＨ２．５の試料溶液では、インキュベーション前の試料溶液（対照）の２０％程度のＳ１００Ｐが検出され、ｐＨ４．７の試料溶液では、インキュベーション前の試料溶液（対照）の８０％近くものＳ１００Ｐが検出できた。これらの結果から、膵酵素によるタンパク質分解はｐＨ２〜５付近で有意に阻害されること、及び膵液や十二指腸液をｐＨ３．５〜５で保存することにより、目的のタンパク質の変性や分解を特に効果的に抑制できることが明らかとなった
【００４４】
［実施例４］
ヒトから採取された膵液又は十二指腸液のｐＨ調整時における希釈倍率が、調整後の溶液のｐＨ安定性に与える影響を調べた。
２名から採取された膵液と、別の２名から採取された十二指腸液に、それぞれ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加して希釈し、得られた希釈液のｐＨをｐＨ試験紙（測定ｐＨ範囲：ｐＨ４〜１０）にて測定した。
測定結果を表３に示す。表３中、「×１」は酢酸緩衝液を添加していないことを意味し、「−」は測定していないことを意味する。
【００４５】
【表３】
【００４６】
膵液はｐＨ８．５〜９．０と弱アルカリであり、十二指腸液はｐＨ７．０〜８．０と膵液よりもややｐＨは低かった。これらに対して表３に示す希釈倍率となるように酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を混合したところ、安定的にｐＨ４．５に調整するには５倍以上、好ましくは６倍以上の希釈倍率が望ましいことが示された。つまり、これらの結果から、膵液等は、ある程度希釈されたほうが、より安定してｐＨを酸性に調整できること、中でも５倍以上であって、検出対象の分子の検出限界以下にならない程度の希釈倍率が好ましいことが示唆された。
【００４７】
また、５倍希釈した各希釈液中のＳ１００Ｐの含有量を実施例２と同様にして測定した。このとき、各希釈液を２等分し、一方は当該希釈液のｐＨを中性付近に戻した後にＳ１００Ｐを測定し、残る一方は当該希釈液のｐＨを中性付近に戻さず、そのまま測定した。この結果、中性付近に戻した後に測定した場合にはＳ１００Ｐが検出されたが、中性付近に戻さずそのまま測定した場合には、Ｓ１００Ｐを検出することはできなかった。このことから、Ｓ１００Ｐを検出するためには、測定前に試料溶液のｐＨを中性付近に戻すことにより、安定的にＳ１００Ｐを検出できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法は、採取された膵液から、生体成分をより安定して保存することが可能な膵液成分保存用試料を調製し得るため、生体試料を解析する分野、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵液又は膵液が含まれる十二指腸液を保存するための試料を調製するための方法、当該試料を調製するための容器、及び当該試料を用いて膵液成分を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液は臓器の状態を知るための重要な生体試料である。膵液も膵臓の状態を知るための重要な生体試料であり、細胞診ならびに各種生体分子の測定などの検査や研究に用いられている。その採取方法は、一般的に、内視鏡を十二指腸まで挿入し、十二指腸乳頭部を確認した後、当該内視鏡の開口部から膵臓の膵管へカテーテルを挿入することにより、膵管に貯まった膵液を採取する方法である。また、膵管を通じて乳頭部から排出された膵液を十二指腸で採取する方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。なお、十二指腸で採取した液中には、膵液だけではなく、同じく乳頭部より排出された胆汁や元々十二指腸に存在している液も含まれている。
【０００３】
膵液は消化液であるため、様々な消化酵素を含む。これらの消化酵素は、膵臓内においては不活性の状態で存在しているが、十二指腸に排出された後に活性化することが知られている。膵液中の消化酵素は、十二指腸上皮細胞から分泌される小腸エンテロキナーゼによって分解のカスケード反応が進む。小腸エンテロキナーゼによって膵液中に含まれるトリプシノーゲンが活性化されてトリプシンになり、さらにこのトリプシンが引き金となり、キモトリプシノーゲン、プロエステラーゼなど種々の消化酵素（プロテアーゼ）が活性化されることが知られている。なお、トリプシノーゲンは膵液総タンパク量のほぼ１２％前後を占めると言われている（例えば、非特許文献２参照。）。これら種々のプロテアーゼの活性化により、膵液中に含まれるタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子は、十二指腸に排出後に分解、変性されてしまう。このため、十二指腸へ排出された膵液を細胞診や生体分子の測定をはじめとした検査や研究に役立てる場合、膵液中の目的とする細胞やタンパク質などがプロテアーゼの影響を受け、正確に測定できないことが懸念される。このため、十二指腸に排出された膵液中におけるプロテアーゼの活性をいかに阻害するかが重要となる。
【０００４】
また、弱アルカリ性（ｐＨ８．５程度）である膵液は、十二指腸に排出されて胃酸と混ざることによって中性になる。このため、ｐＨ７〜７．５に至適ｐＨを持つヌクレアーゼは、十二指腸に排出されることにより、より活性が進むことが予想される。このため、特に膵液中の核酸を解析対象として診断等を行う場合、膵液中に含まれているヌクレアーゼをいかに阻害するかが重要となる。
【０００５】
十二指腸から採取された膵液中の各種分解酵素の活性を低減させるための従来法の１つとして、採取した膵液を冷やした状態で保存し、酵素活性の至適温度を外すことによって活性を抑える方法がある。しかしながら、当該方法では、採取された膵液を常に低温に保つ必要があり、取り扱いが煩雑であるという問題がある。また、タンパク質の種類によっては、低温であっても分解が進むことがあるため、単に低温で保存するだけでは、膵液由来の成分の分解・変性等を抑制するためには不十分である。
【０００６】
その他、非特許文献１では、十二指腸に排出された膵液にプロテアーゼ阻害剤を加えることにより、酵素活性を抑えている。しかしながら、膵液中に含まれる酵素、特にプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、カルボキシペプチターゼなど多種多様であり、１又は数種の阻害剤を添加しただけでは全ての酵素の活性を完全に抑制することは非常に困難である。さらに、多くの阻害剤は低温での保存が必要であり、コストも高いため、ルーチンな検査に適しているとは言えない、という問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ノウ（Noh）、他４名、クリニカル・ガステロエンテロロジー・アンド・へパトロジー（CLINICAL GASTROENTEROLOGY AND HEPATOLOGY）、２００６年、第４巻、第７８２〜７８９ページ。
【非特許文献２】洲脇 謹一郎、日本消化器病学会雑誌、１９８１年、第７８巻、第６号、第１２７５〜１２８１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、採取された膵液、特に十二指腸に排出された後に採取された膵液を、膵液由来の生体成分の分解が抑制された状態で保存可能な試料を調製する方法、当該試料を調製するための容器、及び当該試料を用いて膵液成分を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、採取された膵液をｐＨ２〜５で保存することにより、当該膵液中に含まれている酵素の活性を効果的に抑制し、生体成分を安定して保存し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１） 膵液又は十二指腸液を保存するための膵液成分保存用試料の調製方法であって、
膵液又は十二指腸液とｐＨ調整液とを混合することにより、ｐＨが２〜５である膵液成分保存用試料を調製することを特徴とする膵液成分保存用試料の調製方法、
（２） 前記膵液成分保存用試料のｐＨが３．５〜５であることを特徴とする前記（１）に記載の膵液成分保存用試料の調製方法、
（３） 前記膵液成分保存用試料のｐＨが４〜４．５であることを特徴とする前記（１）に記載の膵液成分保存用試料の調製方法、
（４） 前記ｐＨ調整液が緩衝作用を有していることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の膵液成分保存用試料の調製方法、
（５） 前記膵液成分保存用試料の容量は、前記膵液又は十二指腸液の容量の３倍以上であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の膵液成分保存用試料の調製方法、
（６） 膵液又は十二指腸液のための採取用容器であって、
採取された膵液又は十二指腸液のｐＨを２〜５に調整するためのｐＨ調整液が予め含まれていることを特徴とする膵液又は十二指腸液のための採取用容器、
（７） 前記ｐＨ調整液の容量が、採取予定の膵液又は十二指腸液の容量の２倍以上であることを特徴とする前記（６）に記載の採取用容器、
（８） 前記ｐＨ調整液が、緩衝作用を有することを特徴とする前記（６）又は（７）に記載の採取用容器、
（９） 前記ｐＨ調整液が、ｐＨ指示薬を含むことを特徴とする前記（６）〜（８）のいずれか一つに記載の採取用容器、
（１０） 前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料、
（１１） 前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料のｐＨを６〜８に調整することを特徴とする、膵液成分測定用試料の調製方法、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法により、採取された膵液を、当該液中に含まれている各種酵素の活性を効果的に抑制し、生体成分の分解・変性等をより安定して保存することが可能な膵液成分保存用試料を調製することができる。当該調製方法により得られた膵液成分保存用試料は、生体成分の分解・変性等が顕著に抑制されているため、当該膵液成分保存用試料を用いて測定することにより、より精度よく膵液中の生体成分を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】参考例１において、各十二指腸液試料から測定された蛍光量を示した図である。
【図２】参考例２において、各パンクレアチン溶液から測定された蛍光量を示した図である。
【図３】実施例１において、十二指腸液の各希釈液から測定された蛍光量を示した図である。
【図４】実施例２において、各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を示した図である。
【図５】実施例３において、各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
膵液は十二指腸に排出されると、十二指腸上皮細胞から分泌される小腸エンテロキナーゼによって膵液中に含まれるトリプシノーゲンが活性化されトリプシンになり、表１に示すような種々の消化酵素が活性化される。小腸エンテロキナーゼは、ｐＨ８に至適ｐＨを持つ。また、表１に示すような各種プロテアーゼの至適ｐＨは５〜９程度と比較的幅広い。
【００１４】
【表１】
【００１５】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法は、膵液又は十二指腸液を保存するための膵液成分保存用試料の調製方法であって、膵液又は十二指腸液とｐＨ調整液とを混合することにより、ｐＨが２〜５である膵液成分保存用試料を調製することを特徴とする。ｐＨが２〜５の状態では、膵液由来の消化酵素の大部分の至適ｐＨから外れるため、これらの消化酵素の活性を簡便かつ有意に抑制することができる。よって、膵液又は十二指腸液のｐＨを２〜５に調整することによって、膵液等中の膵液由来の生体成分の消化酵素による分解等を抑制し、生体成分を解析可能な状態で保存することができる。
【００１６】
本発明及び本願明細書において、十二指腸液とは、十二指腸で採取される体液であり、膵液に加えて、胆汁や元々十二指腸に存在している液も含まれている。
【００１７】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法に供される膵液由来の成分を含む体液は、膵臓から直接カテーテルから採取された膵液であってもよく、十二指腸液であってもよい。膵液や十二指腸液は、常法により採取することができる。本発明に供される体液は、膵液と十二指腸液のいずれであってもよいが、十二指腸液のほうがより本発明の効果を奏することができる。
【００１８】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法において調製される膵液成分保存用試料のｐＨは、２〜５の範囲内であればよいが、２．４〜５．１であることが好ましく、３．０〜５であることがより好ましく、３．５〜５であることがさらに好ましく、４〜４．５であることがよりさらに好ましい。
【００１９】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法に供される膵液等は、採取された後常法により保存されたものであってもよいが、採取直後のものであることが好ましい。採取後速やかにｐＨを２〜５に調整することによって、生体成分の分解等をより効果的に抑制することができる。
【００２０】
具体的には、膵液等とｐＨ調整液とを混合する。本発明において用いられるｐＨ調整液は、膵液等のｐＨを２〜５に調整可能なものであれば特に限定されるものではなく、一般的に中性又はアルカリ性の溶液を酸性に調整する際に用いられる酸の中から、膵液等の量、粘度、得られた膵液成分保存用試料の使用方法等を考慮して、適宜調整することができる。
【００２１】
ｐＨ調整液の有効成分として用いられる酸としては、鉱酸であってもよく、有機酸であってもよい。具体的には、塩酸、硝酸、硫酸、酢酸、過酸化水素、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、アジピン酸、コハク酸、リン酸などの酸、又はその塩を、１種又は２種以上を混合して用いる。中でも、食品添加物として用いられ、より安全性が高いと考えられるクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、アジピン酸、コハク酸、リン酸等を用いることが好ましい。
【００２２】
本発明において用いられるｐＨ調整液は、膵液等と混合した際に得られた混合液（膵液成分保存用試料）のｐＨをほぼ一定に保つために、緩衝作用のある緩衝液であることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液（クエン酸とクエン酸ナトリウム）や酢酸緩衝液（酢酸と酢酸ナトリウム）、グリシン−塩酸緩衝液（グリシンと塩酸）等が挙げられる。例えば、０．１Ｍクエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏ、２１．０１ｇ／Ｌ）３３ｍｌにクエン酸３ナトリウム（Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、２９．４１ｇ／Ｌ）２２ｍｌを加え、１００ｍｌに希釈することにより、クエン酸とクエン酸ナトリウムを用いてｐＨ４の緩衝液を調製することができる。
【００２３】
より安定して確実にｐＨを所望の範囲内に調整するために、本発明においては、得られた膵液成分保存用試料では、膵液等が充分に希釈されていることが好ましい。また、膵液等は粘性が高い場合があるため、ほとんどの場合、均一化の意味も含め、アッセイ時には希釈する必要がある。そこで、本発明においては、膵液等に対して等量以上のｐＨ調整剤を混合することが好ましい。膵液等に対して十分な容量のｐＨ調整剤を添加することにより、適度な希釈とｐＨ調整とを同時に達成することができる。本発明においては、調製された膵液成分保存用試料の容量は、前記膵液又は十二指腸液の容量の３倍以上であることが好ましく、４倍以上であることがより好ましく、５倍以上であることがさらに好ましく、６倍以上であることがよりさらに好ましい。特に、膵液等の体液は粘性やｐＨの個体差が大きいため、より確実にｐＨを調整するためには、さらに希釈倍率を上げて調製することが望ましい。
【００２４】
本発明においては、膵液等に少量のｐＨ調整剤を添加した後、緩衝液等を添加して希釈してもよく、予め緩衝液等で希釈したｐＨ調整剤を膵液等に添加してもよい。少量の膵液等に対して濃い酸を少量添加した場合には、凝固する場合がある。このため、本発明においては、予め緩衝液等で膵液等の２倍以上の容量に希釈したｐＨ調整剤と膵液等を混合することが好ましい。
【００２５】
本発明において、得られた膵液成分保存用試料のｐＨの確認や、用いられるｐＨ調整剤や希釈に用いられる緩衝液のｐＨの確認は、溶液の一部を採取し、得られた溶液のｐＨをｐＨ試験紙やｐＨ計測器を用いて測定することができる。また、ｐＨ調整剤や希釈用の緩衝液に予めｐＨ指示薬を添加しておき、溶液の色の変化を目視で確認することによって、膵液成分保存用試料等の溶液のｐＨを確認してもよい。ｐＨ指示薬としては、当該技術分野で公知の指示薬の中から適宜選択して用いることができる。具体的なｐＨ指示薬を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法においては、一旦採取容器に回収された膵液等にｐＨ調整液を混合することによって調製してもよいが、生体から採取された膵液を直接、ｐＨ調整液が予め含まれている採取容器（以下、本発明の採取容器、ということがある。）に回収することが好ましい。また、本発明の採取容器に含有されているｐＨ調整液は、採取予定の膵液又は十二指腸液のｐＨを調整するために十分な量であればよいが、採取予定の膵液等の容量の２倍以上の容量であることが好ましく、３倍以上の容量であることがより好ましく、４倍以上の容量であることがさらに好ましく、５倍以上の容量であることがよりさらに好ましい。また、採取された膵液等のｐＨを所望の範囲内により安定して調整することができるため、本発明の採取容器に含有されているｐＨ調整液は、緩衝作用を有していてもよい。さらに、ｐＨの評価を簡便に行うことができるため、本発明の採取容器に含有されているｐＨ調整液は、適当なｐＨ指示薬を有していることも好ましい。
【００２８】
本発明の採取容器は、例えば、膵液又は十二指腸液の採取する際に用いられるカテーテルの末端に接続され、当該カテーテルを通って生体外へ採取された体液を回収可能な容器に、前記のｐＨ調整液を予め収容させておくことにより作製することができる。その他、通常膵液又は十二指腸液の採取に用いられる採取用具中の、採取された体液が一次的に貯留される部位に、予め前記のｐＨ調整液を収容させたものも、本発明の採取容器とすることができる。
【００２９】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料は、多種多様な消化酵素を含有しているにもかかわらず、これらの消化酵素による影響が有意に抑制されており、タンパク質や核酸等の生体成分を安定して保存することができる。つまり、本発明の膵液成分保存用試料は、膵液等に含まれている生体成分を、診断、検査、研究を実施するまでの間、非常に効果的に保存することができるため、膵液等に含まれている生体成分の解析に好適に用いることができる。特に、本発明の膵液成分保存用試料は、ｐＨを所望の範囲内に維持されている限り安定して消化酵素の活性を抑制することができるため、冷蔵・冷凍保存等を必ずしも必要とせず、取り扱いが容易である。なお、本発明の膵液成分保存用試料の保存温度は、常温以下であればよく、冷蔵保存や冷凍保存をしてもよい。
【００３０】
本発明の膵液成分保存用試料は、その他の生体試料と同様に、各種検査のための測定試料として用いることができる。本発明の膵液成分保存用試料中の測定対象物質は、膵液又は十二指腸液に含まれていることが期待される生体成分であれば特に限定されるものではなく、タンパク質であってもよく、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸であってもよく、細胞であってもよい。例えば、本発明の膵液成分保存用試料は、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、二次元電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法などを用いた種々のタンパク質解析や、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、プローブを用いたハイブリダイゼーションなどを用いた種々の核酸解析、細胞数カウントや細胞診のような細胞解析等に用いることができる。
【００３１】
本発明の膵液成分保存用試料は、ｐＨが２〜５であるため、測定方法によっては、ｐＨを中性付近、例えばｐＨを６〜８に調整した後に、測定に供することが好ましい。例えば、測定対象物質がタンパク質であり、測定方法がＥＬＩＳＡ等の抗原抗体反応を利用した方法である場合には、反応溶液に添加する前に本発明の膵液成分保存用試料のｐＨを中性付近にすることにより、抗原抗体反応や、抗原抗体複合体を検出するための酵素反応に対する影響を抑制することができる。特に、測定対象物質が核酸である場合には、通常、本発明の膵液成分保存用試料から核酸抽出工程を経て得られた核酸に対して測定が行われるが、本発明の膵液成分保存用試料のｐＨを６〜７に調整した後に核酸抽出が行われることによって、核酸抽出工程において汎用されているプロテアーゼＫ（至適ｐＨは７．５〜１０付近。）の働きに対する影響を極力減らすことができる。
【００３２】
本発明の膵液成分保存用試料を膵液由来のＳ１００Ｐ（カルシウム結合タンパク質）の測定に用いる場合には、本発明の膵液成分保存用試料のｐＨは３．５〜５に調整されていることが好ましく、４〜４．５に調整されていることがより好ましい。当該範囲内にあることにより、膵液成分保存用試料中のＳ１００Ｐをより効果的に安定して保存することができる。
【実施例】
【００３３】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
［参考例１］
７人から採取された十二指腸液（十二指腸排出後膵液）検体のプロテアーゼ活性、及びプロテアーゼ活性に対する阻害剤の影響を調べた。
まず、７人から常法により採取された十二指腸液を３等分し、１つはそのままの状態で、１つは市販の阻害剤（商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ社製）を最終濃度が推奨濃度（１×）になるように添加し、残る１つは当該阻害剤を最終濃度が推奨濃度の５倍濃度（５×）になるように添加して十二指腸液試料を調製し、それぞれのプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活は、ＥｎｚＣｈｅｃｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて測定した。具体的には、調製した各十二指腸液試料に、当該キットに添付されている蛍光標識されたカゼインを添加し、３７℃で２時間インキュベーションした後、Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５３５ｎｍの蛍光波長で蛍光量を測定した。蛍光量はカゼインを分解した量を表すため、当該蛍光量をプロテアーゼ活性の値として概算した。
【００３５】
各十二指腸液試料から測定された蛍光量を図１に示す。図１中、「（−）」が阻害剤を添加しなかった十二指腸液試料の結果を、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １×」は前記阻害剤を推奨濃度（１×）になるように添加した十二指腸液試料の結果を、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ５×」は前記阻害剤を推奨濃度の５倍濃度（５×）になるように添加した十二指腸液試料の結果を、それぞれ示す。この結果、十二指腸液中のプロテアーゼ活性には個人差が大きいことが示された。また、阻害剤によってプロテアーゼ活性は阻害されるものの、活性を完全に抑えることは難しいことが明らかになった。
【００３６】
［参考例２］
膵酵素が活性化した状態で存在するブタの膵臓から製した消化酵素剤である“パンクレアチン”を擬似人工膵液として用い、膵酵素の活性に対するｐＨの影響を調べた。
まず、１ｍｇ／ｍｌ（終濃度）のパンクレアチン溶液に対し、塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨを２．５〜１１．９に調整した。ｐＨの確認は、塩酸等を添加した後に、パンクレアチン溶液の一部を分取し、ｐＨ測定器を用いて測定することにより行った。次に、各パンクレアチン溶液のプロテアーゼ活性を参考例１と同様にして測定した。
【００３７】
各パンクレアチン溶液から測定された蛍光量を図２に示す。この結果、ｐＨ７．９〜１０．５のパンクレアチン溶液の蛍光量（プロテアーゼ活性）は、ｐＨ調整を行わなかったパンクレアチン溶液と同等又はそれ以上であった。これに対して、ｐＨ２．５〜４．５のパンクレアチン溶液の蛍光量は、ｐＨ調整を行わなかったパンクレアチン溶液よりも顕著に小さくなっていた。また、ｐＨ６．３及び１１．９のパンクレアチン溶液の蛍光量は、ｐＨ調整を行わなかったパンクレアチン溶液よりも小さいものの、大部分のパンクレアチン・プロテアーゼ活性はまだ残存していた。これらの結果から、アルカリ側のｐＨでは、ほとんど膵酵素のプロテアーゼ活性は阻害されないが、ｐＨ２〜５付近ではパンクレアチンのプロテアーゼ活性が有意に阻害されることが明らかになった。
【００３８】
［実施例１］
４人から採取された十二指腸液検体のプロテアーゼ活性、及びプロテアーゼ活性に対するｐＨの影響を調べた。
ＥｎｚＣｈｅｃｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）に付属の緩衝液（ｐＨ７．５）をそれぞれｐＨ２．４〜１１．２に調整し、様々なｐＨの緩衝液を調製した。これらの緩衝液を用いて、十二指腸液をそれぞれ２５００倍希釈し、各ｐＨに調整された十二指腸液希釈液を調整した。各十二指腸液希釈液のプロテアーゼ活性を参考例１と同様にして測定した。対照として、付属の緩衝液（ｐＨ７．５）で２５００倍に希釈した希釈液（ｐＨ調整なし）、付属の緩衝液（ｐＨ７．５）で２５００倍に希釈し、かつ参考例１で用いた市販の阻害剤を最終濃度が推奨濃度（１×）になるように添加した希釈液をそれぞれ調製し、これらのプロテアーゼ活性を参考例１と同様にして測定した。
【００３９】
各希釈液から測定された蛍光量を図３に示す。図３に示すように、４種類の十二指腸液全てにおいて、酸性ｐＨ、特にｐＨ２．４〜５．１に調整された希釈液ではプロテアーゼ活性が、阻害剤を添加した希釈液よりも明らかに抑制されていた。これらの結果から、酸性ｐＨに調整することが、従来の阻害剤よりもプロテアーゼの活性に対する阻害効果が高いことが確認された。つまり、酸性ｐＨ環境下では、十二指腸液に含まれる多種多様のプロテアーゼの活性を全体的に抑制可能であることが示唆された。
【００４０】
［実施例２］
十二指腸液検体にＳ１００Ｐの標品を加え、当該検体中のＳ１００Ｐを測定し、当該測定に対するｐＨの影響を調べた。
まず、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＣｉｒｃｕＬｅｘ社製、カタログ番号：＃ＣＹ−８０６０）に付属の緩衝液（ｐＨ７．３）のｐＨを２．０〜１１．４に調整し、様々なｐＨの緩衝液を調製した。これらの緩衝液を用いて、各ｐＨのＳ１００Ｐ標品溶液を調製した。次いで、４μｌの十二指腸液検体と、３２μｌの前記緩衝液と、４μｌのＳ１００Ｐ標品溶液（当該緩衝液と同じｐＨに調製されたもの）を混合し、試料溶液を調製した。対照として、緩衝液として、付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液と、緩衝液として、参考例１で用いた市販の阻害剤を最終濃度が推奨濃度の５倍濃度（５×）になるように前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）で調製した阻害剤溶液を用いて調製された試料溶液とを、それぞれ調製した。
これらの試料溶液を２５℃、１６時間インキュベートして反応させた後、一旦凍結保存した。その後、各試料溶液を解凍後、前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）で１０倍希釈することによってｐＨを中性付近に戻した後、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて各試料溶液中のＳ１００Ｐの検出を行った。また、対照として、緩衝液に代えて前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液について、２５℃、１６時間の反応を行わずに直接Ｓ１００Ｐの検出を行った。
【００４１】
各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を図４に示す。図４中、「ＦＴ（１）」は緩衝液に代えて前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製され、かつ２５℃、１６時間の反応を行わなかった試料溶液の結果であり、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は緩衝液に代えて前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液の結果であり、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ５×」は阻害剤を添加した試料溶液の結果である。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は「ＦＴ（１）」よりも明らかにＳ１００Ｐの含有量が少なく、２５℃、１６時間の反応により、Ｓ１００Ｐが分解していることが確認された。また、阻害剤を添加した試料溶液では、前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液よりも若干Ｓ１００Ｐの含有量は多いものの、やはり大部分のＳ１００Ｐが分解されてしまっていた。これに対して、ｐＨ３．０〜４．９の緩衝液で調製された試料溶液では、阻害剤を添加した試料溶液よりもＳ１００Ｐの含有量が高く、阻害剤よりも効果的にＳ１００Ｐの分解を抑制できたことがわかった。特にｐＨ３．５〜４．９の緩衝液で調製された試料溶液では、非常に高い濃度のＳ１００Ｐを検出できた。これらの結果から、本発明の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料では、Ｓ１００Ｐをはじめとする膵液由来の生体成分を安定して保存可能であることが明らかとなった。
【００４２】
［実施例３］
ヒトから採取された十二指腸液検体中のＳ１００Ｐの含有量を測定し、及び当該測定に対するｐＨの影響を調べた。
まず、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＣｉｒｃｕＬｅｘ社製、カタログ番号：＃ＣＹ−８０６０）に付属の緩衝液（ｐＨ７．３）のｐＨを２．０、４．０、又は１１．５に調整した緩衝液を調製した。なお、ｐＨは、それぞれのｐＨに該当するｐＨ指示薬を用いて目視で確認しながら調整した後、さらにｐＨ測定器を用いて精査した。
２５μｌの十二指腸液検体と７５μｌの緩衝液とを混合し、試料溶液を調製した。また、対照として、緩衝液として、参考例１で用いた市販の阻害剤を最終濃度が推奨濃度の５倍濃度（５×）になるように前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）で調製した阻害剤溶液を用いて調製された試料溶液を調製した。
各試料溶液を、３７℃、４時間インキュベートして反応させた。反応後の各試料溶液のｐＨを測定したところ、ｐＨ２．０の緩衝液を用いた試料溶液のｐＨは２．５であり、ｐＨ４．０の緩衝液を用いた試料溶液のｐＨは４．７であり、ｐＨ７．３の緩衝液を用いた試料溶液のｐＨは７．５であり、ｐＨ１１．５の緩衝液を用いた試料溶液のｐＨは１１．２であり、ｐＨはあまり変動していなかった。
その後、各試料溶液を一旦凍結保存した。さらに解凍した後、前記付属の緩衝液（ｐＨ７．３）で１０倍希釈することによってｐＨを中性付近に戻した後、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて各試料溶液中のＳ１００Ｐの検出を行った。また、対照として、緩衝液として、付属の緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて調製された試料溶液に対して、インキュベートせずに直ちにＳ１００Ｐの検出を行った。
【００４３】
各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を図５に示す。この結果、十二指腸液中に含まれていたＳ１００Ｐは、３７℃、４時間のインキュベーションにより分解されることが確認された。また、阻害剤を添加した試料溶液とｐＨ１１．２の試料溶液ではＳ１００Ｐが検出されなかった。また、ｐＨ７．５の試料溶液では、阻害剤を添加した試料溶液よりは多くのＳ１００Ｐが検出されたものの、インキュベーション前の試料溶液（対照）の１０％程度にすぎなかった。これに対して、ｐＨ２．５の試料溶液では、インキュベーション前の試料溶液（対照）の２０％程度のＳ１００Ｐが検出され、ｐＨ４．７の試料溶液では、インキュベーション前の試料溶液（対照）の８０％近くものＳ１００Ｐが検出できた。これらの結果から、膵酵素によるタンパク質分解はｐＨ２〜５付近で有意に阻害されること、及び膵液や十二指腸液をｐＨ３．５〜５で保存することにより、目的のタンパク質の変性や分解を特に効果的に抑制できることが明らかとなった
【００４４】
［実施例４］
ヒトから採取された膵液又は十二指腸液のｐＨ調整時における希釈倍率が、調整後の溶液のｐＨ安定性に与える影響を調べた。
２名から採取された膵液と、別の２名から採取された十二指腸液に、それぞれ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加して希釈し、得られた希釈液のｐＨをｐＨ試験紙（測定ｐＨ範囲：ｐＨ４〜１０）にて測定した。
測定結果を表３に示す。表３中、「×１」は酢酸緩衝液を添加していないことを意味し、「−」は測定していないことを意味する。
【００４５】
【表３】
【００４６】
膵液はｐＨ８．５〜９．０と弱アルカリであり、十二指腸液はｐＨ７．０〜８．０と膵液よりもややｐＨは低かった。これらに対して表３に示す希釈倍率となるように酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を混合したところ、安定的にｐＨ４．５に調整するには５倍以上、好ましくは６倍以上の希釈倍率が望ましいことが示された。つまり、これらの結果から、膵液等は、ある程度希釈されたほうが、より安定してｐＨを酸性に調整できること、中でも５倍以上であって、検出対象の分子の検出限界以下にならない程度の希釈倍率が好ましいことが示唆された。
【００４７】
また、５倍希釈した各希釈液中のＳ１００Ｐの含有量を実施例２と同様にして測定した。このとき、各希釈液を２等分し、一方は当該希釈液のｐＨを中性付近に戻した後にＳ１００Ｐを測定し、残る一方は当該希釈液のｐＨを中性付近に戻さず、そのまま測定した。この結果、中性付近に戻した後に測定した場合にはＳ１００Ｐが検出されたが、中性付近に戻さずそのまま測定した場合には、Ｓ１００Ｐを検出することはできなかった。このことから、Ｓ１００Ｐを検出するためには、測定前に試料溶液のｐＨを中性付近に戻すことにより、安定的にＳ１００Ｐを検出できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の膵液成分保存用試料の調製方法は、採取された膵液から、生体成分をより安定して保存することが可能な膵液成分保存用試料を調製し得るため、生体試料を解析する分野、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵液又は十二指腸液を保存するための膵液成分保存用試料の調製方法であって、
膵液又は十二指腸液とｐＨ調整液とを混合することにより、ｐＨが２〜５である膵液成分保存用試料を調製することを特徴とする膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項２】
前記膵液成分保存用試料のｐＨが３．５〜５であることを特徴とする請求項１に記載の膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項３】
前記膵液成分保存用試料のｐＨが４〜４．５であることを特徴とする請求項１に記載の膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項４】
前記ｐＨ調整液が緩衝作用を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項５】
前記膵液成分保存用試料の容量は、前記膵液又は十二指腸液の容量の３倍以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項６】
膵液又は十二指腸液のための採取用容器であって、
採取された膵液又は十二指腸液のｐＨを２〜５に調整するためのｐＨ調整液が予め含まれていることを特徴とする膵液又は十二指腸液のための採取用容器。
【請求項７】
前記ｐＨ調整液の容量が、採取予定の膵液又は十二指腸液の容量の２倍以上であることを特徴とする請求項６に記載の採取用容器。
【請求項８】
前記ｐＨ調整液が、緩衝作用を有することを特徴とする請求項６又は７に記載の採取用容器。
【請求項９】
前記ｐＨ調整液が、ｐＨ指示薬を含むことを特徴とする請求項６〜８のいずれか一項に記載の採取用容器。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料のｐＨを６〜８に調整することを特徴とする、膵液成分測定用試料の調製方法。
【請求項１】
膵液又は十二指腸液を保存するための膵液成分保存用試料の調製方法であって、
膵液又は十二指腸液とｐＨ調整液とを混合することにより、ｐＨが２〜５である膵液成分保存用試料を調製することを特徴とする膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項２】
前記膵液成分保存用試料のｐＨが３．５〜５であることを特徴とする請求項１に記載の膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項３】
前記膵液成分保存用試料のｐＨが４〜４．５であることを特徴とする請求項１に記載の膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項４】
前記ｐＨ調整液が緩衝作用を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項５】
前記膵液成分保存用試料の容量は、前記膵液又は十二指腸液の容量の３倍以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の膵液成分保存用試料の調製方法。
【請求項６】
膵液又は十二指腸液のための採取用容器であって、
採取された膵液又は十二指腸液のｐＨを２〜５に調整するためのｐＨ調整液が予め含まれていることを特徴とする膵液又は十二指腸液のための採取用容器。
【請求項７】
前記ｐＨ調整液の容量が、採取予定の膵液又は十二指腸液の容量の２倍以上であることを特徴とする請求項６に記載の採取用容器。
【請求項８】
前記ｐＨ調整液が、緩衝作用を有することを特徴とする請求項６又は７に記載の採取用容器。
【請求項９】
前記ｐＨ調整液が、ｐＨ指示薬を含むことを特徴とする請求項６〜８のいずれか一項に記載の採取用容器。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の膵液成分保存用試料の調製方法により調製された膵液成分保存用試料のｐＨを６〜８に調整することを特徴とする、膵液成分測定用試料の調製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２３００７３（Ｐ２０１２−２３００７３Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９９８８８（Ｐ２０１１−９９８８８）
【出願日】平成２３年４月２７日（２０１１．４．２７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２７日（２０１１．４．２７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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