膵臓癌を処置するための方法
本開示は、プロガストリンに特異的に結合する抗体を用いた癌を使用した被験者において膵臓癌を処置する方法に向けられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本願は、仮出願第６１／２９３，６１２号（２０１０年１月８日出願）の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）下の利益を主張し、その内容がその全体において参照により組み入れられる。
【０００２】
２．配列リスト、表、又はコンピュータプログラムの参照
配列リストを本明細書と同時に提出する。
【０００３】
３．発明の属する技術分野
本開示は、とりわけ、プロガストリンについて特異的な抗体を含む組成物を被験者に投与することにより原発性及び／又は転移性膵臓癌を伴う被験者を処置する方法に向けられる。
【０００４】
４．背景
数十年の基礎及び臨床研究にもかかわらず、癌は人類の最も大きな災難の１つのままである。世界保健機関（ＷＨＯ）により回収された統計によると、癌は世界中の主な死亡原因の１つであり、２００４年に７４０万人（又はその年の全ての死亡の約１３%）が死んだ。何が癌を起こすか、及び、癌が分子レベルでどのように作用するのかに関して多くのことが学ばれてきたが、癌の死亡率における最も大きな低下は、公衆衛生介入（例えば禁煙キャンペーンなど）ならびに画像テクノロジー及び分子診断における進歩により可能になった早期診断に起因しうるままである。癌細胞を実際に殺す難しい仕事については、しかし、臨床医は、依然として、一世代前の癌専門医が精通してきたであろう治療様式（例えば手術、放射線、及び化学療法など）に頼っている。全てのこれらの処置の効力が長年にわたり改善されてきたが、治癒率における改善及び寿命における増加は漸進的である。分子腫瘍学における革命に起因する新たな標的治療さえ、大半の部分について、そこそこに転帰を改善してきただけである。
【０００５】
膵臓癌（膵臓の悪性新生物）は、処置するのが特に困難な形態の癌である。なぜなら、それは、典型的には、もはや処置できなくなるまで、未検出で進行するからである（Jemal et al., 2008, CA Cancer J. Clin.58(2):71-96）。予後は不良である。膵臓癌と診断された者の５%未満が、依然として、診断後５年間生存しており（Jemal et al., 2010, CA Cancer J. Clin.60(5):277-300）、完全寛解はまれである（Ghaneh et al., 2007, Gut 56(8):1134-1152）。診断からの生存期間中央値はわずか３〜６ヶ月間である（Stathis & Moore, 2010, Nat.Rev.Clin.Oncol.7(3):163-172）。２０１０年に、米国単独における約４３，０００人の個人が膵臓癌と診断され、約３６，８００人がこの疾患で死亡していると推定されている（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｔｙｐｅｓ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃを参照のこと）。膵臓癌は毎年診断される新たな癌症例のわずか２．５%を占めるが、それは、年間の癌死亡の６%に関与し（Jemal et al., 2007, Cancer J. Clin.57(1):43-46）、全ての癌の最も高い致死率の１つを表している。実際に、米国では、膵臓癌は、男性及び女性の間で４番目に高い癌による死因である。
【０００６】
癌を管理する別の困難な局面は、原発性（最初の）腫瘍からの細胞が壊れて遊離し、身体内の別の部位へ、典型的にはリンパ又は血液を通じて、「転移」と呼ばれるプロセスを介して移動し、別の転移性（又は二次性）腫瘍を形成する患者を処置することである。二次性又は転移性腫瘍は、典型的には、最初の腫瘍と同じ型であり（その新たな部位とは無関係に）、疾患は転移癌として言及され、新たな居住組織の癌ではない。例えば、肝臓に広がった膵臓癌は、転移性膵臓癌であり、肝臓癌ではない。原発性膵臓癌はしばしば後のステージまで診断されないため、転移の発生率は高い。実際に、患者の約８０%が診断時に既に転移を有する（Sohn et al., 2000, J. Gastrointest. Surg. 4(6):567-579）。
【０００７】
転移は処置の選択肢を限定する。なぜなら、原発腫瘍の切除又は除去はもはや十分な処置の選択肢ではないからである。ゲムシタビンベースの化学療法は、現在、転移性疾患を伴う任意の患者のためのケアの標準を表す。ゲムシタビンを用いて処置された転移性疾患を伴う患者の生存は、わずか約６ヶ月間である（研究によっては、４．０〜７．１ヶ月間の範囲）。組み合わせ処置、例えば、化学療法（オキサリプラチン、５ＦＵ、又はイリノテカン）を伴うゲムシタビン、又は標的治療（エルロチニブ、ベバシズマブ、又はセツキシマブ）を伴うゲムシタビンを用いた現在の治験では、わずか１〜２ヶ月間の生存延長が報告されている（Sathis & Moore, 2000, Nat. Rev. Clin. Oncol. 7(3):163-172）。
【０００８】
原発性膵臓癌及び転移性膵臓癌のための処置の選択肢における適度な進歩が近年ではなされてきたが（同上を参照のこと）、代替の及び／又はより効果的な治療が依然として差し迫って必要である。
【０００９】
５．要約
ガストリンは、胃酸の分泌を刺激する消化管ペプチドホルモンである。成体の哺乳動物において、それは主に胃前庭部においてＧ細胞により、ならびに上部小腸及び膵臓においてある程度産生される。図１を参照すると、ガストリン遺伝子は、１０１アミノ酸ポリペプチド（「プレプロガストリン」と呼ばれる）に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン（「ＰＧ」）（８０アミノ酸残基ポリペプチド）を生じるシグナル配列（下線）を含む。ガストリンは、主に３つの形態Ｇ３４、Ｇ１７、及びＧ１４（例証せず）で見出され、プロガストリンプロセシングに起因する。
【００１０】
アミド化ガストリンの存在が膵臓腫瘍において観察されてきた（Goetze et al., 2000, Cancer 88(11):2487-2494）。研究者らは、膵臓腫瘍を処置するための抗ガストリンアプローチを使用することを試みてきた（例、Chau et al., 2006, Br. J. Cancer 94:1107-1115；Brett et al., 2002, J. Clin. Oncol. 20:4225-4231を参照のこと）。また、膵臓癌に苦しむ患者がそれらの膵臓腫瘍において検出可能なレベルのプロガストリンを有することが観察されている（Caplin et al., 2000, Br. J. Surg.87(8):1035-1040）。現在、抗プロガストリンアプローチを使用して、原発性及び転移性の両方の膵臓癌を診断、モニター、及び処置することができることが発見されている。本明細書において初めて実証する通り、原発性及び転移性の両方の膵臓癌を伴う患者が、プロガストリンの上昇した血漿及び／又は血清レベルを有し、原発性及び転移性膵臓腫瘍に由来する細胞株の増殖が、プロガストリンに特異的に結合する抗体を用いて処置された場合に阻害される（低付着条件下で癌球を形成するそれらの能力と同様に）。これらの発見は、膵臓癌の再発を診断、処置、防止し、その進行及び／又は処置の経過をモニターするための強力な新たなツールを提供する。
【００１１】
したがって、一局面において、本開示は、膵臓癌（それは原発性膵臓癌又は転移性膵臓癌でありうる）を処置する方法を提供し、原発性又は転移性膵臓癌と診断された被験者に、治療的利益を提供するために効果的な、プロガストリンに特異的に結合する抗体（「抗ＰＧ抗体」）の量を投与することを含む。抗ＰＧ抗体を単独で、単剤療法として、又は他の処置様式（例えば腫瘍切除、放射線治療、化学療法など）と併せて、又はその補助として投与してもよい。
【００１２】
腫瘍切除と併せて、又はその補助として使用した場合、抗ＰＧ抗体を、腫瘍の除去の前及び／又は後に投与してもよく、腫瘍除去に続く特定の期間にわたり、特定の閾値レベルを下回る血漿及び／又は血清プロガストリンレベルが達成されるまで、あるいは特定の期間にわたる血漿及び／又は血清プロガストリンにおける減少が達成されるまで継続してもよい。
【００１３】
化学療法と併せて、又はその補助として使用した場合、抗ＰＧ抗体を、化学療法の前に、化学療法と同時に、又は化学療法の後に投与してもよい。再び、抗ＰＧ抗体を、特定の期間にわたり、特定の閾値レベルを下回る血漿及び／又は血清プロガストリンレベルが達成されるまで、あるいは特定の期間にわたる血漿及び／又は血清プロガストリンにおける減少が達成されるまで投与してもよい。
【００１４】
以下により詳細に考察される通り、原発性及び／又は転移性膵臓癌と診断された患者は、ＰＧの上昇した血漿及び／又は血清レベルを有する。例えば、図４を参照すると、健常個人におけるプロガストリンの血清及び／又は血清レベルは、典型的には、無視できる。膵臓癌に苦しむ個人は、約５０pMの測定可能レベルを有する。この発見は、膵臓癌の診断及び管理においていくつかの有用で重要な新たなツールをもたらす。
【００１５】
第１に、膵臓癌は診断することが困難でありうるため、測定したＰＧ血漿及び／又は血清レベルを他の診断テストと併せて使用し、膵臓癌の診断を確認する、又は初期診断において助けることができる。例えば、膵臓癌の徴候（存在する場合）は、多くの他の病気の徴候と同様であることが一般に公知である。一般的な症状は、背中に放射する上腹部における疼痛、食欲の喪失及び／又は嘔気と嘔吐、有意な体重減少、及び無痛性黄疸を含む。あまり一般的ではない症状は、遠位静脈血栓症及び肺塞栓症、糖尿病、ならびに膵炎を含む。早期検出はより多くの処置の選択肢及びより良い予後を提供するため、血漿及び／血清ＰＧレベルを、これら及び／又は膵臓癌の他の症状を呈する患者において測定し、診断を助けうるが、ここで、上昇レベル、例えば、約５０pMの又はそれを上回る血漿及び／又は血清レベルは、患者が膵臓癌を有することを示しうる。
【００１６】
診断を助けるために血漿及び／又は血清ＰＧレベルを測定することは、膵臓癌についてのリスク因子（限定しないが、喫煙、食事及び環境因子を含む）、Ｈピロリ感染、メタボリックシンドローム（例、肥満、耐糖能障害、長期糖尿病）、及び家族歴（膵臓癌を伴う患者の約５〜１０%を占める）を示す被験者において特に有用でありうる（Maisonneuve & Lowenfels, 2010, Dig.Dis.28(4-5):645-656）。そのような又は他のリスク因子を示す被験者における血漿及び／又は血清ＰＧレベルを、定期的にモニターすることができ、観察された経時的な増加、あるいは約５０pMの閾値の又はそれを上回る観察されたレベルを伴い、個人が膵臓癌を発生しうることを示す。リスクのある個人のそのようなモニタリングは、疾患の早期検出において役立ち、より良い処置の選択肢を提供しうる。
【００１７】
第２に、測定した血漿及び／又は血清ＰＧレベルを使用し、任意の膵臓癌治療（本明細書に記載する抗ＰＧ治療を含む）の有効性、及び／又は潜在的な再発もしくは転移をモニターすることができる。操作の任意の特定の理論により拘束されることを意図しないが、腫瘍が治療の経過にわたり収縮するにつれて、血漿及び／又は血清ＰＧレベルが減少し、正常に戻りうることが予測される。
【００１８】
このように、別の局面において、開示は、被験者において膵臓癌（原発性膵臓癌又は転移性膵臓癌を問わず）の処置の効力及び／又は再発を診断及び／又はモニターするために有用な方法を提供する。この方法は、一般的に、関連する被験者においてＰＧの血漿及び／又は血清レベルを別々の時間点で、又は期間にわたり測定すること、及び、レベルが閾値レベルを上回っている又は下回っているか、あるいは経時的に増加又は減少するかを決定することを含む。閾値レベルを上回るレベル、膵臓癌を発生するリスクのある被験者において又は膵臓癌に関連する１つ又は複数の症状を示す被験者において経時的に増加するレベルは、被験者が膵臓癌を有することを示している。閾値レベルを下回る、又は経時的に減少するレベルは、特定の治療が効果的であることを示している。膵臓癌を有する患者の短い生存時間の観点から、測定値を、合理的に、しばしば、例えば、２週間毎に１回、又はさらにより短い間隔で取るべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ヒトプレプロガストリン（配列番号１００）（そこでシグナルペプチド配列に下線が付いている）、成熟ヒトプロガストリン（配列番号２０）、及びプロガストリンプロセシングの特定産物（Ｇ３４（配列番号１０２）、Ｇ３４−Ｇｌｙ（配列番号１０３）、Ｇ１７（配列番号１０４）、Ｇ１７−Ｇｌｙ（配列番号１０５）、及びＣＴＦＰ（配列番号１０６）を含む）のアミノ酸配列を提供する。
【図２Ａ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ａは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ３のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号１２）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１６）を提供する；
【図２Ｂ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｂは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ３のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号１３）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１７）を提供する；
【図２Ｃ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｃは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ４のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号１４）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１８）を提供する；
【図２Ｄ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｄは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ４のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号１５）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１９）を提供する；
【図２Ｅ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｅは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ８のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号５９）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６７）を提供する；
【図２Ｆ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｆは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ８のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６３）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７１）を提供する；
【図２Ｇ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｇは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１３のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６０）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６８）を提供する；
【図２Ｈ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｈは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１３のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６４）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７２）を提供する；
【図２Ｉ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｉは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１６のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６１）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６９）を提供する；
【図２Ｊ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｊは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１６のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６５）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７３）を提供する；
【図２Ｋ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｋは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１９のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６２）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７０）を提供する；そして
【図２Ｌ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｌは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１９のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６６）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７４）を提供する。
【図３Ａ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ａは、ヒト化ＭＡｂ３のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２１）；
【図３Ｂ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｂは、ヒト化ＭＡｂ３のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２２）；
【図３Ｃ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｃは、ヒト化ＭＡｂ４のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２３）；
【図３Ｄ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｄは、ヒト化ＭＡｂ４のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２４）；
【図３Ｅ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｅは、ヒト化ＭＡｂ８（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７５）；
【図３Ｆ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｆは、ヒト化ＭＡｂ８（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７６）；
【図３Ｇ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｇは、ヒト化ＭＡｂ８（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７７）；
【図３Ｈ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｈは、ヒト化ＭＡｂ８（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７８）；
【図３Ｉ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｉは、ヒト化ＭＡｂ８（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７９）；
【図３Ｊ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｊは、ヒト化ＭＡｂ８（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７６）；
【図３Ｋ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｋは、ヒト化ＭＡｂ１３（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８０）；
【図３Ｌ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｌは、ヒト化ＭＡｂ１３（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８１）；
【図３Ｍ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｍは、ヒト化ＭＡｂ１３（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８２）；
【図３Ｎ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｎは、ヒト化ＭＡｂ１３（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８３）；
【図３Ｏ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｏは、ヒト化ＭＡｂ１６（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８４）；
【図３Ｐ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｐは、ヒト化ＭＡｂ１６（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８５）；
【図３Ｑ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｑは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８６）；
【図３Ｒ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｒは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８７）；
【図３Ｓ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｓは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８８）；
【図３Ｔ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｔは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８９）；
【図３Ｕ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｕは、ヒト化ＭＡｂ１９（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９０）；
【図３Ｖ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｖは、ヒト化ＭＡｂ１９（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９１）；
【図３Ｗ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｗは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９２）；
【図３Ｘ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｘは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９３）；
【図３Ｙ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｙは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９４）；そして
【図３Ｚ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｚは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９５）。
【図４】図４は、健常コントロールと比較した、原発性（Ｍ−）又は転移性（Ｍ＋）膵臓癌を伴う患者からの血漿又は血清中のプロガストリン濃度を例証するグラフを提供する。
【図５】図５は、種々の型の原発性及び転移性膵臓癌細胞株におけるプロガストリンの発現レベルを例証するグラフを提供する。
【図６】図６は、種々の型の原発性及び転移性膵臓癌細胞株によるプロガストリン分泌を例証するグラフを提供する。
【図７】図７は、ネガティブコントロールモノクローナル抗体と比較した、Ｃａｐａｎ １細胞（転移性膵臓腫瘍細胞）に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ３の抗増殖特性を比較するグラフを提供する。
【図８】図８は、ネガティブコントロールモノクローナル抗体と比較した、ＢｘＰＣ ３細胞（原発性膵臓腫瘍細胞）に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ８の抗増殖特性を比較するグラフを提供する。
【図９】図９は、ネガティブコントロールモノクローナル抗体と比較した、ＭＩＡ ＰａＣａ２細胞（原発性膵臓腫瘍細胞）に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ８の抗増殖特性を比較するグラフを提供する。
【図１０】図１０は、未処理コントロール細胞と比較した、低付着条件下で癌球を形成するＣａｐａｎ １細胞（転移性膵臓腫瘍細胞）の長期能力に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ３の阻害特性を実証するグラフを提供する。
【図１１】図１１は、未処理コントロール細胞と比較した、低付着条件下で癌球を形成するＳＵ．８６．８６細胞（転移性膵臓腫瘍細胞）の長期能力に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ８、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１６、及びＭＡｂ１９の阻害特性を実証するグラフを提供する。
【００２０】
７．詳細な説明
７．１ 膵臓癌
膵臓（長さ約６インチの細い腺）は２つの主な機能を有する：食物を消化するのを助ける分泌液を産生し、血糖レベルを制御するのを助けるホルモン（例えばインシュリン及びグルカゴンなど）を産生する。消化分泌液は外分泌膵臓細胞により、ホルモンは内分泌膵臓細胞により産生される。膵臓癌の約９５%又はそれ以上が、外分泌細胞において生じる（Yao et al., 2007, Oncology 14(12):3492-3450）。外分泌膵臓癌の内、約９５%が腺癌であり、残り５%には腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、コロイド癌、未分化癌、及び破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌を含むがある（ｈｔｔｐ：／／ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｐａｎｃｒｅａｓ／ＢａｓｉｃＴｙｐｅｓ１．ｐｈｐを参照のこと）。
【００２１】
初期膵臓癌は、しばしば、症状を起こさず（Jemal et al., 2008, CA Cancer J. Clin.58(2):71-96）、後期膵臓癌により起こされる症状は通常変動し、非特異的である（Stathis & Moore, 2010, Nat. Rev. Clin. Oncol.7(3):163-172）。結果として、膵臓癌は、しばしば、それが進行するまで診断されない（Jemal et al., 2008, CA Cancer J. Clin. 58(2):71-96）。一般的な症状は、限定しないが、上腹部における疼痛及び背痛、食欲の喪失及び／又は嘔気と嘔吐、有意な体重減少、無痛性黄疸、遠位静脈血栓症、肺塞栓症、ならびに糖尿病及び／又は膵炎を含む。
【００２２】
種々のリスク因子は膵臓癌に関連し、限定しないが、喫煙；長期にわたる糖尿病；慢性膵炎；ならびに特定の遺伝性疾患、例えば遺伝性膵炎、多発性内分泌腫瘍１型症候群、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ；リンチ症候群）、フォン・ヒッペル・リンダウ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、及び家族性非定型多発性モルメラノーマ症候群（ＦＡＭＭＭ）を含む。
【００２３】
膵臓癌を診断するために使用される診断手順は、画像研究、例えばコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、内視鏡超音波（ＥＵＳ）、腹腔鏡検査、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、及び経皮経肝胆管造影（ＰＴＣ）などを含む。しかし、確定診断は、放射線学的に疑わしい組織の内視鏡下針生検又は外科的切除により行われる。これらの種々の診断技術を、また、癌を病期分類するために使用し、それは処置の選択肢に影響を及ぼす。以下のステージを一般に使用し、膵臓癌を評価する：
ステージ０（上皮内癌）：このステージにおいて、異常細胞が膵臓の内膜において見出される。これらの異常細胞は癌性になり、周囲組織に広がりうる。
ステージＩ：このステージにおいて、癌が形成し、膵臓だけで見出される。ステージＩは、さらに、腫瘍のサイズに依存して、２つのサブステージに分割される：ステージＩＡ（腫瘍が２cm又はそれより小さい）及びステージＩＢ（腫瘍が２ｃｍより大きい）。
ステージＩＩ：このステージにおいて、癌は近くの組織及び臓器に広がっており、リンパ節に広がっているであろう。このステージは、さらに、癌がどこに広がっているかに基づいてサブステージに分割される。ステージＩＡ（近くの組織及び臓器に広がっているが、しかし、リンパには広がっていない）；及びステージＩＩＢ（リンパならびに恐らくは他の近くの組織及び臓器に広がっている）。
ステージＩＩＩ：このステージにおいて、癌は膵臓近くの主要血管に広がっており、また、近くのリンパ節に広がっている。
ステージＩＶ：このステージにおいて、癌は任意のサイズでありうるが、遠隔組織及び臓器（例えば肝臓、肺、及び腹腔など）に広がっている（即ち、癌は転移している）。
【００２４】
３つの主な処置の選択肢があり（手術、放射線治療、及び化学療法）、それはステージにより変動する。ステージＩ及びステージＩＩの原発性膵臓癌のための処置は、ゲムシタビン又は５ＦＵレジメンに基づく補助化学療法を伴う手術（放射線治療を伴う又は伴わない）を含みうる。
【００２５】
しばしば、原発性膵臓癌が処置に続いて再発する（再発性膵臓癌と呼ばれる）。ゲムシタビンベースの化学療法は、また、一般的に、再発性の局所進行膵臓癌を伴う患者のために使用され、時折、放射線又は化学放射線が続く。
【００２６】
７．２ 転移
バックグラウンドのセクションにおいて記述する通り、転移は、癌が広がるプロセスを指す。簡単には、腫瘍細胞は、原発腫瘍を離れ、血液循環又はリンパ系を介して新たな組織部位へ移動し、二次腫瘍を形成する。新たな組織部位の腫瘍は転移性腫瘍として言及され、典型的には、原発腫瘍の供給源を同定する。例えば、他の組織に広がっている膵臓癌は、二次性の転移性腫瘍の組織部位にかかわらず、「転移性膵臓癌」として言及される。
【００２７】
癌細胞は原発腫瘍の近くのリンパ節に頻繁に広がり、それはリンパ節転移又は局所疾患と呼ばれる。
【００２８】
転移は多数の別々のステップからなる：浸潤及び遊走、脈管内への侵入、循環、血管外遊出及びコロニー形成、増殖及び血管新生。浸潤及び遊走の間に、個々の細胞は原発腫瘍から剥離し、隣接する健常組織に浸潤する。これを達成するために、腫瘍細胞は運動性にならなければならず、上皮から間葉への移行と呼ばれる表現型の形質転換を受けると仮定される。Kalluri et al., 2009, J. Clin.Invest.119(6): 1420-28.また、そのような細胞は、しばしば、細胞外マトリックスを分解する酵素を産生し、それにより、原発腫瘍外への及び周囲の健常組織中への遊走を促進する。腫瘍細胞が血管又はリンパ管に遭遇すると、それは、血管を覆う内皮細胞の間にそれ自体を挿入し、血流又はリンパ系中に侵入する。異常腫瘍細胞は、次に、循環器系又はリンパ系を介して新たな臓器に又はリンパ節に移動する。腫瘍細胞は、次に、臓器（例えば肝臓、肺、又は他の組織もしくは臓器など）の毛細血管又はリンパ管に留まり、次に、組織空間中へ内皮に侵入することにより血管外遊出しうる。最後に、コロニー形成、増殖、及び血管新生の間に、腫瘍細胞はその新たな宿主組織中に居を定めて、成長を始める。新たな転移性腫瘍が十分なサイズに達すると、それは、成長因子（例えばＶＥＧＦなど）を分泌し、腫瘍中への新たな血管の成長を刺激し、急速に成長する腫瘍に酸素及び栄養を供給しうる。
【００２９】
腫瘍は、転移を介してほぼ全ての身体の部位に広がることができる。局所再発、肝臓転移、及び腹膜伝播は、膵臓腫瘍の切除後での最も一般的な再発部位である。典型的な局所領域浸潤が、膵後方神経組織、十二指腸、門脈（ＰＶ）、及び上腸間膜静脈（ＳＭＶ）、又は所属リンパ節において見出される。膵臓癌における遠隔転移の最も通常の部位は、肝臓及び腹膜腔である。他のあまり一般的ではない部位は、肺、骨、及び脳である。まれな部位、例えば筋肉、皮膚、心臓、胸膜、胃、臍、腎臓、虫垂、精索、及び前立腺なども報告されている（Howard, 1996, Curr. Prob.l Cancer 20(5):281-328；Borad et al., 2009, Yale J. Biol.Med.82(1):1-6）。
【００３０】
７．３ 原発性及び転移性膵臓癌のための処置
膵臓癌と診断された患者は、典型的には、不良な予後を有する。部分的には、なぜなら、膵臓癌は、通常、早期に症状を起こさず、診断時に局所的に進行した又は転移性の疾患に至るからである。処置の選択肢（上に考察する）は、診断時の疾患のステージに依存する。
【００３１】
７．４ 抗ｈＰＧ抗体ならびに原発性及び転移性膵臓癌に対するそれらの効果
本明細書に開示する通り、膵臓癌を伴う被験者は、それらの膵臓腫瘍においてプロガストリンの検出可能なレベルを有することが報告されている（Caplin et al., 2000, Br. J. Surg.87(8):1035-1040）。本明細書に報告し、実施例のセクションにおいて考察するデータは、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、Ｃａｐａｎ １、及びＳＵ．８６．８６が、プロガストリンをコードする遺伝子（ＧＡＳＴ）についてのｍＲＮＡを発現すること（実施例７）、また、膵臓癌細胞株がプロガストリンを分泌することを実証する（実施例８）。原発性及び転移性の両方の膵臓癌を伴う患者が、プロガストリンの上昇した血漿及び／又は血清レベルを有すること（実施例６）、原発性及び転移性膵臓腫瘍に由来する細胞の成長が、ヒトプロガストリン（「ｈＰＧ」）に特異的に結合する抗体を用いた処理により阻害されること（実施例９、１０、及び１１）、及び、低付着培養条件下で腫瘍球として成長する膵臓癌細胞の能力が、抗ｈＰＧ抗体を用いた前処理に続いて有意に低下すること（実施例１２）が現在発見されている。これらの驚くべき励みになる発見に基づき、そのような抗ｈＰＧ抗体を使用し、膵臓癌の診断を助け、膵臓癌の処置計画の効力をモニターし、発生の任意のステージの膵臓癌（原発性及び転移性の両方の膵臓癌を含む）を処置し、膵臓癌の再発を防止しうることが期待される。
【００３２】
Hollande et al.により最近実証された通り、プロガストリンは、ＩＣＡＴ（ベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４シグナル伝達のネガティブ調節因子）を抑制することにより結腸直腸癌細胞のベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４経路を刺激する（ＷＯ ２００７／１３５５４２を参照のこと）。ベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４シグナル伝達は細胞増殖を起こす。このシグナル伝達の非存在において、それらは分化し、正常な細胞周期（プログラムされた細胞死、又はアポトーシスを含む）を受ける。Hollande et al.は、また、そのような細胞を抗ｈＰＧ抗体に曝露させることで、ベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４誘導性増殖が遮断されること、ＣＲＣ細胞の成長又は増殖が阻害されることを実証している（例、ＷＯ ２００７／１３５５４２を参照のこと）。プロガストリンを用いた処理又はそれへの曝露に応答して増殖する細胞は、内因性に産生される又は外因性であるに関わらず、それにおいて増殖が、抗ＰＧ抗体を用いた処理又はそれへの曝露時に阻害され、本明細書において「プロガストリン感受性」として言及される。
【００３３】
上に記述する通り、原発性及び転移性の両方の腫瘍細胞がプロガストリン感受性であり、抗ＰＧ抗体を用いた処理又はそれへの曝露に応答することが発見されている。操作の任意の理論により拘束されることを意図しないが、抗ＰＧ抗体は、ＰＧに結合し、その推定受容体とのその相互作用を遮断し、順に、増加したＩＣＡＴ発現に起因するベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４誘導性増殖を抑止することによりそれらの抗増殖特性を発揮すると考えられる。他の機構（それにより抗ＰＧ抗体が原発性及び／又は転移性癌細胞の生存及び／又は成長に干渉しうる）も可能であり、本明細書に開示する本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００３４】
７．５ 治療的方法
したがって、一局面において、本開示は、膵臓癌に苦しんでいる又はそれと診断された被験者を処置する方法を提供する。この方法は、被験者に、治療的利益を提供するために効果的な１つ又は複数の抗ＰＧ抗体の量を投与することを含む。抗ＰＧ抗体を一般的に、及び方法において有用な特異的抗ＰＧ抗体を、後のセクションにおいて詳細に記載する。
【００３５】
処置される被験者は、任意の動物、例えば、哺乳動物、例えば農場動物（例、ウシ、ブタ、ウマなど）もしくは家畜化したペット（例、イヌ、ネコなど）、又はヒトでありうる。投与される抗ＰＧ抗体は、処置されている動物の種について特異的であるべきである。ヒト被験者の処置のために、抗ＰＧ抗体は、ヒトプロガストリン（本明細書において「抗ｈＰＧ抗体」として言及され、以下により詳細に記載する）に特異的に結合すべきである。
【００３６】
処置される膵臓癌は、発生の任意のステージ、ステージ０からステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はさらにはステージＩＶでありうる。実際に、本明細書に記載する抗ＰＧ治療の有意な利点は、それが、転移性膵臓腫瘍ならびに原発性膵臓腫瘍に対して効果的であると期待されることであり、それにより、発生の後のステージにおいてでさえ膵臓癌を有する患者に利益を提供する。また、膵臓癌の再発を防止することが期待される。
【００３７】
抗ＰＧ治療を単独で、単剤療法として、又は膵臓癌の特定のステージを処置するために一般的に使用される他の治療と組み合わせてもしくはその補助として使用することができる。そのような一般的な処置が上に記述されており、例えば、ゲムシタビン、５ＦＵ、又は他の化学療法剤を用いた化学療法、及び標的治療（例えばベバシズマブを用いた処置など）を含む。特定の実施態様において、抗ＰＧ治療を、腫瘍細胞を標的とする他の抗体（例えばベバシズマブなど）を用いた処置と組み合わせて、又はその補助として適用する。他の処置と組み合わせて使用する場合、抗ＰＧ抗体及び他の治療を同時に、連続的に、又は別々に投与することができる。
【００３８】
本明細書において使用する通り、抗ｈＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤が、それらが患者に同じ日、例えば同じ患者の来診の間に投与される場合、連続的に投与されると言われる。連続投与は、１、２、３、４、５、６、７、８時間又はそれ以上離して生じうる。対照的に、抗ＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤が、それらが異なる日に患者に投与される場合、別々に投与されると言われる。例えば、抗ＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、又は１ヶ月間の間隔で投与することができる。抗ＰＧ抗体の投与は、第２の治療用薬剤の投与に先行する又は続くことができる。
【００３９】
あるいは、抗ＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤を、期間にわたり同時に投与することができ、抗ＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤の投与を交代させる第２の期間が続く。
【００４０】
同様に、抗ＰＧ抗体を、可能な場合、腫瘍の外科的除去と組み合わせて、又はその補助として投与することができる。抗ＰＧ抗体を、腫瘍の除去の前、その間、又はその後に投与してもよい。
【００４１】
７．６ 医薬的組成物
抗ＰＧ抗体は、典型的には、医薬的製剤又は組成物の形態で投与されうる。そのような製剤又は組成物は、場合により、追加の活性及び／又は治療用薬剤を含みうる（当技術分野において公知の通り）。製剤は、典型的には、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤を含みうる。使用される特定の担体、賦形剤、及び／又は希釈剤は、所望の投与様式に依存しうる。この組成物は、患者にそれを投与する所望の方法に依存して、任意の適した形態でありうる。
【００４２】
抗ＰＧ抗体は、種々の経路により、典型的には、非経口的に、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、又は筋肉内注射を介して被験者に投与することができる。投与は、１つ又は複数のボーラス注射として、あるいは１つ又は複数の注入としてもたらすことができる。他の投与経路が、また、当業者の知識に従って可能である。任意の所与の場合における最も適した投与経路は、特定の抗体、被験者、及び処置される膵臓癌のステージに依存しうる。
【００４３】
医薬的組成物は、用量当たりに抗ＰＧ抗体の所定量を含む単位用量形態で便利に提示することができる。そのような単位は、限定しないが、５mg〜５g、例えば１０mg〜１g、又は２０〜５０mgを含みうる。
【００４４】
医薬的組成物は、所望の純度を有する抗体を、当技術分野において典型的に用いられる任意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤（それらの全てが本明細書において「担体」として言及される）、即ち、緩衝化薬剤、安定化薬剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、及び他の種々の添加剤を混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての保存のために調製することができる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed.1980)を参照のこと。そのような添加剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であるべきである。
【００４５】
緩衝化薬剤は、生理的条件に近似する範囲内のｐＨを維持するために役立つ。それらは約２mM〜約５０mMの範囲の濃度で存在することができる。本開示を用いた使用のための適した緩衝化薬剤は、有機酸及び無機酸の両方ならびにその塩、例えばクエン酸緩衝剤（例、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝剤（例、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝剤（例、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、及び酢酸緩衝剤（例、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などを含む。加えて、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及びトリメチルアミン塩（例えばＴｒｉｓなど）を使用することができる。
【００４６】
保存剤を加えて、微生物の成長を遅らせることができ、０．２%−１%（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えることができる。本開示を用いた使用のための適した保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例、塩化物、臭化物、及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン（例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３ペンタノールなど）を含む。
【００４７】
等張剤（時折「安定剤」として公知である）を加えて、本開示の液体組成物の等張性を確実にしてもよく、多価糖アルコール、例えば、三価又はそれより高い糖アルコール（例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなど）を含む。安定剤は、機能において、増量剤から添加剤（治療用薬剤を安定化する、又は、変性もしくは容器壁への付着を防止することを助ける）に及びうる広範なカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖又は糖アルコール（例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど）、シクリトール（例えばイノシトールなど）を含む；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；含硫の還元剤（例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、αモノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなど）；低分子量ポリペプチド（例、１０残基又はそれより少ないペプチド）；タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドンなど）単糖類（例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）、及び三糖類（例えばラフィノースなど）；及び多糖類（例えばデキストランなど）でありうる。安定剤は、活性タンパク質重量部当たり０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在することができる。
【００４８】
非イオン性界面活性物質又は界面活性剤（「湿潤剤」としても公知である）を加えて、治療用薬剤を可溶化し、ならびに、撹拌誘導性の凝集に対して治療的タンパク質を保護するのを助けることができ、それは、また、タンパク質の変性を起こすことなく、製剤が剪断面に曝露されることを許す。適した非イオン性界面活性物質は、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（TWEEN（登録商標）20、TWEEN（登録商標）80など）を含む。非イオン性界面活性物質は、約０．０５mg/ml〜約１．０mg/ml、例えば、約０．０７mg/ml〜約０．２mg/mlの範囲で存在しうる。界面活性物質は、しかし、抗体に結合する傾向を有し、それらの立体構造を損ないうる。従って、使用する場合、安定化濃度は低く、実験的に識別しなければならない。
【００４９】
追加の種々の賦形剤は、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒を含むことができる。
【００５０】
７．７ 効果的な投与量
抗ＰＧ抗体を、被験者に、治療的利益を提供するために十分な又は効果的な量で投与する。原発性及び／又は転移性膵臓癌を処置する状況において、治療的利益を、以下の１つ又は複数が達成される場合に推論することができる：腫瘍の成長を停止又は減速すること、患者の腫瘍の数及び／又はサイズを低下させること、手術不可能な腫瘍を、それらを外科的に除去することができるサイズ及び位置に収縮させること、寿命を延長させること、及び／又は患者の生活の質を改善させること。
【００５１】
完治が望ましいが、治療的利益があれば要求されない。実際に、膵臓癌の診断からの生存中央値はわずか３〜６ヶ月間であるため（Stathis & Moore, 2010, Nat Rev Clin Oncol.7(3):163-72）、この中央値を超える追加の３ヶ月間の個人の生存における延長は、大幅な治療的利益を提供する。例えば、Philip et al., 2009, J. Clin.Oncol.24(33):5660-5669を参照のこと。
【００５２】
一部の状況において、治療的利益は、当業者の知識に従い、１つ又は複数のサロゲートエンドポイントと相関しうる。例として、限定しないが、血漿及び／又は血清ＰＧ濃度を被験者において経時的に測定することができ、ＰＧレベルにおける低下、又は閾値レベルを下回るレベル、例えば、約５０pM、４０pM、３０pM、２０pM、１０pM、又は５pM未満は治療的利益を示している。
【００５３】
腫瘍サイズ、数、及び代謝を、種々のスキャン技術（例えば、限定しないが、ＣＴ、ＭＲＩ、機能的ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、及びＰＥＴなど）、ならびに当業者に公知の他の方法を使用して測定することができる。
【００５４】
全ての遊離ＰＧを結合することが、治療的効力を達成するために要求される訳ではないが、それが望まれうる。遊離ＰＧは、抗ＰＧ抗体により結合されるために利用可能であるＰＧを意味する。むしろ、腫瘍内又は周囲の遊離ＰＧの濃度を全身的に、特に体液又は他においてより限定された範囲まで低下させることも効果的でありうる。遊離ＰＧ濃度が抗ＰＧ抗体組成物の投与により低下されうる例示的な組織及び体液は、限定しないが、患者から除去された腫瘍サンプル、腹水、胸水からの液体、脳脊髄液、リンパ、血液、血漿、血清、及びその他を含む。これらの組織又は体液の１つ又は複数におけるＰＧの濃度は、ＥＬＩＳＡ技術又は当業者が精通する他の技術を使用して定量化することができる。
【００５５】
当業者の知識によれば、抗ＰＧ抗体の用量を、患者において滴定し、投与後の所定の時間での目的の組織又は体液中での遊離ＰＧ濃度を低下させるようにすることができる（少なくとも約１０%、２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０、又は１００%、あるいは約５%−１０%、約１０%−１５%、約１５%−２０%、約２０%−２５%、約２５%−３０%、約３０%−３５%、約３５%−４０%、約４０%−４５%、約４５%−５０%、約５０%−５５%、約５５%−６０%、約６０%−６５%、約６５%−７０%、約７０%−７５%、約７５%−８０%、約８０%−８５%、約８５%−９０%、又は約９０%−９５%又は先行する値のいずれかの間の範囲での遊離ＰＧ濃度におけるパーセンテージ低下）。
【００５６】
投与される抗ＰＧ抗体の量は、種々の因子（処置されている膵臓癌のステージ、投与の形態、経路、及び部位、治療レジメン（例、第２の治療用薬剤が使用されるか否か）、処置されている特定の被験者の年齢及び状態、処置されている患者の抗ＰＧ抗体への感受性）に依存しうる。適切な投与量は、当業者により容易に決定されることができる。最終的には、臨床医が、使用される適切な投与量を決定する。この投与量は、しばしば、適宜、反復することができる。副作用が発生した場合、投与量の量及び／又は頻度を、通常の臨床診療に従って、変える又は低下させることができる。適当な投与量及び処置レジメンは、当業者に公知の従来の技術を使用して、治療の進行をモニターすることにより確立することができる。
【００５７】
効果的な投与量を、最初にインビトロアッセイから推定することができる。例えば、動物における使用のための初回用量を製剤化し、特定の抗ＰＧ抗体の結合親和性定数である又はそれを上回る抗ＰＧ抗体の循環血液又は血清濃度を達成してもよい。特定の抗体のバイオアベイラビリティを考慮に入れた、そのような循環血液又は血清中濃度を達成するための投与量の算出は、十分に当業者の能力内にある。ガイダンスについては、読者はパート１を参照のこと：General Principles in "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," 11th Ed., Hardman, J.G., et al., Eds., McGraw-Hill Professional、及びその中で引用される参考文献。
【００５８】
初回投与量は、また、インビボのデータ（例えば動物モデルなど）から推定することができる。膵臓癌を処置するための薬剤の効力をテストするために有用な動物モデルが、当技術分野において周知である。当業者は、そのような情報を定期的に適用して、ヒトへの投与のために適した投与量を決定することができる。
【００５９】
特定の実施態様において、静脈内用量を、処置の数日から数週間前に数回個人の血清又は血漿ＰＧ濃度を測定し、飽和しうる抗ＰＧ抗体の量（即ち、ＰＧの全てに結合するために十分でありうる量）を算出することにより個々の被験者について決定してもよい。当業者により理解される通り、ＰＧの所与の血清又は血漿中濃度について飽和を達成するために必要な任意の特定の抗体の量は、特定の抗体の親和定数に部分的に依存する。目的の特定の抗ＰＧ抗体についての飽和量を算出するための方法は周知である。
【００６０】
飽和を保証するために、算出された飽和量より大きい量を投与してもよく、例えば、算出された飽和量よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又はさらには１０倍大きい量を投与してもよい。静脈内以外の投与様式のために、量を、当技術分野において周知の通りに、薬物動態及びバイオアベイラビリティに基づいて調整することができる。
【００６１】
抗ＰＧ抗体の効果的な用量は、約０．００１mg/kg〜約２５０mg/kg／単回（例、ボーラス）投与、複数投与又は連続（例、注入）投与の範囲である、あるいは、処置されている膵臓癌のステージ、投与経路、ならびに被験者の年齢、体重、及び状態に依存する本明細書における任意の効果的な範囲又は値であることが期待される。特定の実施態様において、各用量は約０．１mg/kg〜約０．５mg/kg；約０．２５mg/kg〜約０．７５mg/kg；約０．５mg/kg〜約１mg/kg；約２mg/kg；約１．５mg/kg〜約２．５mg/kg；約２mg/kg〜約３mg/kg；約２．５mg/kg〜約３．５mg/kg；約３mg/kg〜約４mg/kg；約３．５mg/kg〜約４．５mg/kg；約４mg/kg〜約５mg/kg；約５mg/kg〜約７mg/kg；約６mg/kg〜約８mg/kg；約７mg/kg〜約９mg/kg；約８mg/kg〜約１０mg/kg；約１０mg/kg〜約１５mg/kg；約１２．５mg/kg〜約１７．５mg/kg；約１５mg/kg〜約２０mg/kg；約１７．５mg/kg〜約２２．５mg/kg；約２０mg/kg〜約２５mg/kg；約２２．５mg/kg〜約２７．５mg/kg；約２５mg/kg〜約３０mg/kg；約３０mg/kg〜約４０mg/kg；約３５mg/kg〜約４５mg/kg；約４０mg/kg〜約５０mg/kg；約４５mg/kg〜約５５mg/kg；約５０mg/kg〜約６０mg/kg；約５５mg/kg〜約６５mg/kg；約６０mg/kg〜約７０mg/kg；約６５mg/kg〜約７５mg/kg；約７０mg/kg〜約８０mg/kg；約７５mg/kg〜約８５mg/kg；約８０mg/kg〜約９０mg/kg；約８５mg/kg〜約９５mg/kg；約９０mg/kg〜約１００mg/kg；約９５mg/kg〜約１０５mg/kg；約１００mg/kg〜約１５０mg/kg；約１２５mg/kg〜約１７５mg/kg；約１５０mg/kg〜約２００mg/kg；約１７５mg/kg〜約２２５mg/kg；約２００mg/kg〜約２５０mg/kgの範囲であればよい。他の投与量の範囲も可能である。
【００６２】
投与の量、頻度、及び持続時間は、種々の因子（例えば患者の年齢、体重、及び疾患の状態など）に依存する。このように、非限定的な例において、投与のための治療計画は、１日又はそれ以上、２日又はそれ以上、３日又はそれ以上、４日又はそれ以上、５日又はそれ以上、６日又はそれ以上、１週間又はそれ以上、２週間から無制限にわたり、２週間〜６ヶ月間、３ヶ月間〜５年間、６ヶ月間〜１又は２年間、８ヶ月間〜１８ヶ月間などにわたり継続することができる。場合により、治療レジメンは、反復投与（例、１日１回、１日２回、２日、３日、５日、１週間、２週間、又は１ヶ月毎）を提供する。反復投与は同じ用量で又は異なる用量でありうる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又はそれ以上反復することができる。抗ＰＧ抗体の治療的に効果的な量は、単回用量として又は治療レジメンの経過にわたり（例、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長い経過にわたり）投与することができる。
【００６３】
７．８ 治療的効力を決定するための診断及び患者モニタリングの方法
上に記述する通り、原発性及び／又は転移性膵臓癌と診断された患者は、ＰＧの上昇した血漿及び／又は血清レベルを有する。図４を参照すると、健常個人におけるＰＧのベースラインレベルは無視でき、典型的には、検出の限度である。原発性及び／又は転移性膵臓癌を伴う被験者におけるＰＧ血漿及び／又は血清レベルが測定可能であり、約５０pMである。この観察に基づき、ＰＧの血漿及び／又は血清レベルを使用し、原発性又は転移性膵臓癌の診断を助け、又はその処置の有効性をモニターすることができる。
【００６４】
したがって、本開示は、また、原発性又は転移性膵臓癌を診断する、又はその処置の経過の効力をモニターする方法を提供する。診断を助けるために、診断を受けている個人からの血漿又は血清サンプルのＰＧレベルを測定し、閾値と比較し、閾値よりも高いレベルは膵臓癌を示している（特に、他の診断テストが、個人が膵臓癌に苦しみうることを示す場合）。一部の実施態様において、少なくとも約５０pMの血漿又は血清ＰＧ濃度は、膵臓癌を示している（特に、他のポジティブなテスト結果と組み合わせた場合）。
【００６５】
治療の効力をモニターする目的のために、血液、血漿、又は血清ＰＧレベルを特定の時間点で測定することができる。濃度における経時的な減少、及び／又は特定の時間点での閾値を下回る測定レベルは、効力を示している。閾値は、上で考察されるものでありうる、あるいは、治療の開始前に又は１ラウンドの治療の間の早期の特定の点で処置されている被験者から得られた被験者に特異的な値でありうる。
【００６６】
操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、患者における腫瘍の数及び／又はサイズが、治療のラウンドの結果として低下するにつれて、腫瘍により産生されたＰＧの総量も減退すると考えられる。対照的に、１ラウンドの治療が完了した後でのＰＧレベルにおける実質的な変化又は上昇がないことは、治療が効果的ではなかったことを示しうる。この情報はケア提供者により使用され、新たなラウンドの治療を開始すべきか否かを決めることができる。
【００６７】
ＰＧレベルは、当業者が精通する分析技術（例えば、限定しないが、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡなど）を使用して測定することができる。ヒト被験者のＰＧレベルを測定するために有用な抗ｈＰＧ抗体を、後のセクションに記載する。
【００６８】
特定の実施態様において、ＰＧレベルは、プロガストリンのＮ末端を標的化する１つの抗ＰＧ抗体及びプロガストリンのＣ末端を標的化する第２の抗ＰＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定されうる。そのようなサンドイッチアッセイのために有用な例示的なＮ及びＣ末端抗ＰＧ抗体を、後のセクションに記載する。そのようなアッセイにおいて、表面（例えば９６ウェルプレート中のウェルなど）を調製し、それに、既知量の第１の「捕捉」Ｎ末端又はＣ末端抗ＰＧ抗体を結合させる。テストサンプルを次に表面に適用し、インキュベーション期間が続く。表面を次に洗浄し、第２「検出」抗ＰＧ抗体を含む溶液を適用し、そこで検出抗体がＰＧの異なるエピトープに結合する（例えば、捕捉抗体がＣ末端抗ＰＧ抗体である場合、Ｎ末端抗ＰＧ抗体が検出抗体として使用され、及び逆もまた同様である）。ＰＧレベルを次に直接的（例えば、検出抗体が検出可能な標識に結合している場合）又は間接的（検出抗ＰＧ抗体に結合する標識二次抗体を通じて）のいずれかで測定する。このアッセイのために、抗体を過剰に使用すべきであり、全てのＰＧが結合され、定量化されるようにする。血漿及び／又は血清ＰＧレベルを測定するための特定のサンドイッチアッセイを、実施例１に提供する。
【００６９】
治療の完了後の異なる間隔での複数の測定値を取り、次に、グラフ化し、傾向が存在するか否かを決定しうる。非限定的な例において、ＰＧレベルを、１ラウンドの治療が終わった後、最初の６ヶ月にわたり毎週又は毎月決定することができる。他の間隔も可能である。
【００７０】
抗ＰＧ抗体を使用した１ラウンドの治療を含む実施態様において、１つ又は複数の測定値を、また、治療の経過の間に取ってもよく、ＰＧレベルに対する抗体の効果を推定することができる。他のそのような実施態様において、残留抗ＰＧ抗体がサンプリングの間に患者において存在する場合、データは、抗体によるＰＧの隔離に起因するＰＧレベルにおける低下を示すことがあり、この効果が軽減するにつれて上昇が続き、処置が効果的である場合にはその後の減退が続く。さらに他の実施態様において、治療後の測定値を、抗ＰＧ抗体が患者から取り除かれたことを推定した後に取ることができ、そのような抗体によるＰＧの結合がＰＧ濃度の測定の精度に影響を及ぼさないようにする。
【００７１】
異なるベースラインを使用してもよく、それに対して、患者において検出されたＰＧレベルを比較する。一部の実施態様において、ベースラインを、同じ患者からの以前の測定値（所定の間隔で取られうる）により確立する。非限定的な例において、ＰＧレベルを、処置の終了後、最初の６ヶ月にわたり毎週又は毎月、次に、処置の終了の２周年目まで３ヶ月毎、次に、その後、６ヶ月又は１年毎に決定することができる。他の間隔も可能である。
【００７２】
他の実施態様において、ベースラインは、モニタリングを受けている患者のものと同様の特徴を伴う患者の集団における平均ＰＧレベルから確立することができる。そのような特徴は、しかし、必ずしも限定しないが、性、年齢、原発癌の型、特定の型の処置へ曝露、これらの任意の組み合わせ、及びその他を含みうる。さらなる他の実施態様において、１を上回るベースラインを特定の患者のモニタリングにおいて使用することができる。例えば、患者に特異的なベースライン、ならびに集団に由来するベースラインの両方を使用することができる。
【００７３】
一部の実施態様において、以前に処置された癌患者における平均ＰＧ濃度が、患者が比較されている関連集団についての正常範囲にあり、定常なままである場合、患者は転移を有さないとしてスコア化されうるが、このように、新たな処置を要求しない。対照的に、ＰＧ濃度が、以前に処置された癌患者において期間にわたり上昇するらしく、そして特定の実施態様において、集団データに由来する閾値を超える場合、患者は恐らくは転移を有するとしてスコア化され、このように、転移癌に対する新たな処置のための候補となりうる。
【００７４】
なぜなら、摂食は、通常、ガストリン合成及び分泌を増加させるため、それは血液ＰＧレベルにおける一過性の増加を起こしうるが、それは治療的効力について、及び転移の存在についてモニターされている患者においてＰＧの正確な測定に干渉しうる。この効果を回避するために、特に血液サンプル中のＰＧ濃度を決定すべき場合、サンプルを、絶食後に患者から取ることができる。
【００７５】
７．９ 抗ＰＧ抗体
本明細書に開示する方法において有用な抗体は、ガストリン遺伝子の他の産物を上回りヒトプロガストリンに特異的に結合するものである。図１を参照すると、ガストリン遺伝子は、１０１アミノ酸ポリペプチド（プレプロガストリンと呼ばれる）に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン（８０アミノ酸ポリペプチド）を生じるシグナル配列（下線）を含む。プロガストリンは、順に、切断されて、３４アミノ酸産物（配列において、プロガストリンの残基３８−７１に対応する）を生成し、それは、次に、グリシン残基を用いてそのカルボキシ末端で伸長されて、グリシン伸長Ｇ３４（「Ｇ３４−Ｇｌｙ」）を生成する。この切断の副産物は、６アミノ酸ペプチド（Ｃ末端隣接ペプチド、又はＣＴＦＰと呼ばれる）であり、それは、配列において、プロガストリンの残基７５−８０に対応する。Ｇ３４−Ｇｌｙは、次に、さらに切断されて、配列において、プロガストリンの残基５５−７１に対応し、Ｇ１７−Ｇｌｙとして言及される１７残基ポリペプチドを生成する。Ｇ３４−Ｇｌｙ及びＧ１７−ＧｌｙのＣ末端グリシンの除去、それに続くＣ末端アミド化は、それぞれＧ３４及びＧ１７をもたらし、それらの両方がＣ末端アミド化されている。
【００７６】
本明細書において使用する通り、抗体は、それが全長プロガストリンに結合するが、しかし、ＣＴＦＰ、アミド化ガストリン、又はグリシン伸長ガストリンには全く結合しない場合、ｈＰＧ「について高度に特異的」又はｈＰＧに「高度に特異的に結合する」、及び、それがＣＴＦＰ及びガストリン遺伝子の他の産物よりも少なくとも約５倍大きなｈＰＧの結合を示す場合（標準的な結合アッセイにおいて測定した通り）、ｈＰＧ「について特異的」又はｈＰＧに「特異的に結合する」。特定の抗ｈＰＧ抗体の特異性を評価するために使用することができる特定のＥＬＩＳＡアッセイが、実施例２に提供される。
【００７７】
そのような高度に特異的及び／又は特異的な抗ｈＰＧ抗体（本明細書において「抗ｈＰＧ抗体」として言及される）は、ポリクローナル（「抗ｈＰＧ ＰＡｂ」）又はモノクローナル（「抗ｈＰＧ ＭＡｂ」）であるが、治療的使用、一部の例において、診断又は他のインビトロでの使用のために、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７８】
抗ｈＰＧ抗体により結合されるエピトープは決定的ではない。有用な抗ｈＰＧ抗体は、ｈＰＧのＮ末端領域、ｈＰＧのＣ末端領域、又はｈＰＧの異なる領域に結合しうる。近年、少なくともモノクローナル抗ｈＰＧ抗体について、抗ｈＰＧ抗体を産生するために使用される抗原の選択が重要でありうることが発見されている（国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００６３２９号（２０１０年１０月１５日出願）及び米国出願第１２／９０６，０４１号（２０１０年１０月１５日出願）、その開示及び具体的に開示される抗ｈＰＧ抗体が参照により本明細書において組み入れられる；以下、‘３２９及び‘０４１出願としてそれぞれ言及される）。‘３２９及び‘０４１出願において開示される通り、ｈＰＧに由来する全ての抗原が、生理学的条件下でｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体の産生を刺激するわけではない。実際に、ポリクローナル抗ｈＰＧ抗体を成功裏に産生するために使用されてきた特定の抗原（例えば全長組換えｈＰＧ（例、ＷＯ０８／０７６４５４ Singhを参照のこと）及びｈＰＧのＣ末端の最後の１０アミノ酸に対応するペプチド（ＷＯ０７／１３５５４２ Hollande et al.を参照のこと）など）は、モノクローナル抗体の生成に失敗した。‘３２９及び‘０４１出願において記述される通り、ｈＰＧ配列内の抗原性Ｎ末端及びＣ末端配列が同定されており、ｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するために使用することができる。興味深いことに、抗原性配列は、それに固有であるｈＰＧ配列の領域に限定する必要はない。ガストリン遺伝子の他の産物と共通の配列の領域を有するペプチド抗原（例えば、Ｇ１７、Ｇ３４、及びＣＴＦＰ）は、ｈＰＧに結合するだけでなく、しかし、それに特異的に結合するモノクローナル抗体をもたらす。
【００７９】
ｈＰＧのＮ末端領域に対応する配列を有するペプチド抗原を使用して入手可能であり及び／又はｈＰＧのＮ末端領域に結合する抗ｈＰＧ抗体を、本明細書において「Ｎ末端抗ＰＧ抗体」として言及する。ｈＰＧについて特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を得るために適した免疫原を構築するために使用することができるｈＰＧの特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基１〜１４：ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２５）に対応する。Ｎ末端抗ｈＰＧ抗体を得るために有用な例示的な免疫原、ならびに、これらの例示的な免疫原を用いて得られたＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＣＤＲならびにＶＨ及びＶＬ配列を以下の表１Ａ及び実施例のセクションに提供する：
【表１】
【００８０】
ｈＰＧのＣ末端領域に対応する配列を有するペプチド抗原を使用して入手可能であり及び／又はｈＰＧのＣ末端領域に結合する抗ｈＰＧ抗体を、本明細書において「Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体」として言及する。ポリクローナル及びモノクローナルＣ末端抗ｈＰＧ抗体の両方を得るために有用な免疫原を構築するために使用することができる特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基５５〜８０：ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号２７）に対応する。Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体を得るために有用なこの抗原を含む例示的な免疫原、ならびに、これらの例示的な免疫原を用いて得られたＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＣＤＲならびにＶＨ及びＶＬ配列を以下の表１Ｂ及び実施例のセクションに提供する。
【表２】
【００８１】
表１Ａ及び１Ｂに提供する例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ１−ＭＡｂ２３により結合される特定のエピトープは、ＳＰＯＴ技術及びアラニンスキャンを使用してマッピングされた（Laune et al., 2002, J. Immunol. Methods 267: 53-70及びLaune, 1997, J. Biol. Chem. 272: 30937-30944にそれぞれ記載される通り）（‘３２９出願の実施例６も参照のこと）。
【００８２】
ＳＰＯＴ技術において、推定エピトープに及ぶ１５のアミノ酸ペプチド配列を生成し、ニトロセルロース膜上にスポットし、それを、次に、テスト抗体でプローブし、抗体により認識される最小エピトープ配列を決定する。アラニンスキャンを使用して、抗体結合のために決定的であるエピトープ内の残基を決定する。推定エピトープ内の各残基が、１つずつ、アラニンに変異しており、アラニン含有ペプチドを、次に、テスト抗体を用いてプローブする。
【００８３】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ１−４及び１５−２０について、エピトープは少なくとも以下の配列を含む：ＤＡＰＬＧ（配列番号２８）、ＰＤＡＰＬＧ（配列番号２９）、ＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３０）、ＷＫＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３１）、又はＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号３２）（以下の表２Ａに示す通り）。
【表３】
【００８４】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５−７、９−１２、１４、及び２１−２３について、エピトープは少なくとも以下の配列を含む：ＦＧＲＲ（配列番号３３）、ＭＤＦＧＲ（配列番号３４）、ＡＥＤＥＮ（配列番号３５）、及びＧＷＭＤＦＧＲＲ（配列番号３６）（以下の表２Ｂに示す通り）。
【表４】
【００８５】
エピトープマッピング実験では、抗ｈＰＧ ＭＡｂ２及びＭＡｂ４が同じエピトープに結合することが明らかになる；抗ｈＰＧ ＭＡｂ１及びＭＡｂ３はほぼ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、及びＭＡｂ２０はほぼ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ１５及びＭＡｂ１６はほぼ同じエピトープに結合する；抗ｈＰＧ ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ９、及びＭＡｂ１２は同じエピトープに結合し、抗ｈＰＧ ＭＡｂ１０とほぼ同じエピトープに結合する；ならびに抗ｈＰＧ ＭＡｂ１１及びＭＡｂ１４はほぼ同じエピトープに結合する。
【００８６】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＮ末端抗ＰＧ抗体の特定の実施態様は、ｈＰＧの残基１０〜１４（配列番号２８）、ｈＰＧの残基９〜１４（配列番号２９）、ｈＰＧの残基４〜１０（配列番号３０）、ｈＰＧの残基２〜１０（配列番号３１）、又はｈＰＧの残基２〜１４（配列番号３２）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００８７】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＣ末端抗ＰＧ抗体の特定の実施態様は、ｈＰＧの残基７１〜７４（配列番号３３）、ｈＰＧの残基６９〜７３（配列番号３４）、ｈＰＧの残基７６〜８０（配列番号３５）、又はｈＰＧの残基６７〜７４（配列番号３６）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００８８】
本明細書に開示する方法及びキットにおいて有用なＮ末端及びＣ末端抗ｈＰＧ抗体は、表１Ａ＆１Ｂに提供するものに加えて、例示的なＭＡｂ１−２３を用いた、あるいはＮ又はＣ末端エピトープに結合する他の参照抗体を用いた競合結合アッセイにおいて同定することができる（後のセクションにおいてより詳細に記載する通り）。
【００８９】
‘３２９及び‘０４１出願においても報告される通り、全ての抗ｈＰＧ抗体（ｈＰＧについて高い程度の特異性及び親和性を示すものでさえ）が、ｈＰＧの生物学的活性を中和するわけではないであろう。例えば、抗ｈＰＧ ＭＡｂ１４は約６pMのＫＤでｈＰＧに結合するが、それはインビトロアッセイにおいて結腸直腸癌細胞の成長を阻害しなかったのに対し、他の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は有意な阻害活性を示した（例、‘３２９出願の実施例７を参照のこと）。ｈＰＧに特異的に結合する非中和及び中和抗体の両方が本明細書に記載する種々の診断及びモニタリング方法のために有用であるが、治療方法のために有用な抗ｈＰＧ抗体は中和活性を示すはずである。
【００９０】
本明細書において使用する通り、「中和性抗ｈＰＧ抗体」は、非特異的抗体を用いて処理したコントロールサンプルと比較して、抗ｈＰＧ抗体を用いて処理したテストサンプル中の生きたＢｘＰＣ ３細胞の数における統計的に有意な低下をもたらす抗ｈＰＧ抗体である。任意の特定の抗ｈＰＧ抗体がｈＰＧを中和する能力を評価するための特定のアッセイが、実施例３に記載される。このアッセイにおいて生細胞の数における少なくとも約５０%低下を示すそれらの抗ｈＰＧ抗体は、膵臓癌を処置する際に特に有用であると考えられるが、このアッセイにおける生細胞の数におけるより低いレベルの中和活性、例えば、４０%、３０%、２０%、１５%、又はさらには１０%の統計的に有意な低下を示す抗ｈＰＧ抗体が治療的利益を提供することが期待される。
【００９１】
したがって、一部の実施態様、例えば、治療的な実施態様において、有用な抗ｈＰＧ抗体は中和性である。‘３２９及び‘０４１出願において開示される通り、抗ｈＰＧモノクローナル抗体の能力は、エピトープ依存的ではない。なぜなら、Ｎ末端及びＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体の両方が、膵臓癌細胞を用いたアッセイにおいて中和活性を示したからである。このように、一部の特定の実施態様において、中和性抗ｈＰＧ抗体はＮ末端中和性抗ｈＰＧ抗体である。他の実施態様において、中和性抗ｈＰＧ抗体はＣ末端中和性抗ｈＰＧ抗体である。
【００９２】
任意の特定の抗ｈＰＧ抗体の親和性は決定的ではない。しかし、一部の使用のために、少なくとも約１μMの親和性を示す抗体が好まれうる。治療的使用のために、少なくとも約９０nM、８０nM、７０nM、６０nM、５０nM、４０nM、３０nM、２０nM、１５nM、１０nM、７nM、６nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、０．１nM、０．０１nM又はさらに大きい親和性が望まれうる。表１Ａ＆１Ｂにおいて同定された抗ｈＰＧモノクローナル抗体の測定された親和性は、１０−６〜１０−１２Mの範囲である（以下の表３に記述する通り）：
【表５】
【００９３】
特定の所望の適用のために特に適する親和性を有する抗ＰＧモノクローナル抗体を、これらの間より容易に選択する、あるいは、本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体の種々の免疫原、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）配列を使用して生成又は設計することができる。任意の特定の抗ＰＧモノクローナル抗体の親和性は、当技術分野において周知の又は本明細書に記載する技術（例えばＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は蛍光偏光アッセイなど）を使用して決定することができる。特定のアッセイを実施例４に提供する。
【００９４】
表１Ａ＆１Ｂに記述する通り、いくつかのＮ末端及びＣ末端モノクローナル抗ｈＰＧ抗体が同定されている。これらの抗体の全てがｈＰＧについて特異的であり、ＭＡｂ１４の例外を伴い、全てが結腸直腸癌細胞を用いたテストにおいて中和活性を示した。膵臓癌細胞を用いてテストした抗体の全て（ＭＡｂ ８、１３、１６、及び１９）が、中和活性を示した。抗体を得るための有用なハイブリドーマのいくつかが、２０１０年１０月６日に、ブダペスト条約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganisms（ＣＮＣＭ）に寄託された。抗ｈＰＧ ＭＡｂ１−２３を産生するハイブリドーマの指定名称及び寄託されたそれらのハイブリドーマの寄託登録番号を表１Ａ＆１Ｂに提供する。また、抗体のいくつかについて、それらの可変重鎖（ＶＨ）、可変軽鎖（ＶＬ）、ＶＬ相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列が決定されている。これらのアミノ酸配列、及び開示を通じてそれらを参照するために使用される省略命名法も表１Ａ＆１Ｂに提供する。簡単には、マウス重鎖及び軽鎖可変ドメインは、本明細書においてｍＶＨ及びｍＶＬとして言及され、対応するモノクローナル抗体の番号が続く（例えば、抗ｈＰＧ ＭＡｂ３の可変軽鎖及び可変重鎖についてそれぞれｍＶＨ．３及びｍＶＬ．３）。同様に、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメインは、本明細書においてｈＶＨ及びｈＶＬとして言及され、対応するモノクローナル抗体の番号が続く。３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変軽鎖ＣＤＲは、それぞれＶＨ ＣＤＲ１、２、又は３及びＶＬ ＣＤＲ１、２、又は３として言及され、特定の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の番号が続く。例えば、ＭＡｂ３のＶＨ ＣＤＲ１はＶＨ ＣＤＲ１．３と表示され、及び、ＭＡｂ３のＶＬ ＣＤＲ １はＶＬ ＣＤＲ１．３と表示される。ＭＡｂ３のＶＨ ＣＤＲ２はＶＨ ＣＤＲ２．３と表示され、及び、ＭＡｂ３のＶＬ ＣＤＲ２はＶＬ ＣＤＲ２．３と表示される。
【００９５】
ほぼ同じエピトープに結合する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の対応するＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ鎖を交換して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な新たな抗ｈＰＧモノクローナル抗体をもたらしうることが期待される。例えば、上に記述する通り、例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５及びＭＡｂ６は同じエピトープに結合する。そのＶＬ鎖において、これらの２つの抗体のＶＬ ＣＤＲの種々の組み合わせ、及び／又は、そのＶＨ鎖において、これらの２つの抗体のＶＨ ＣＤＲの種々の組み合わせを含む抗ｈＰＧモノクローナル抗体を設計することができる。可能な種々の組み合わせを例証するための特定の非限定的な例として、そのような抗体は、そのＶＬ鎖において、ＭＡｂ５のＣＤＲ１及び２（それぞれＶＬ ＣＤＲ １．５及びＶＬ ＣＤＲ ２．５）ならびにＭＡｂ６のＣＤＲ３（ＶＬ ＣＤＲ ３．６）、及び、そのＶＨ鎖において、ＭＡｂ６のＣＤＲ１（ＶＨ ＣＤＲ １．６）ならびにＭＡｂ５のＣＤＲ２及び３（それぞれＶＨ ＣＤＲ ２．５及びＶＨ ＣＤＲ ３．５）を含みうる。寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体のＣＤＲのアミノ酸配列（超可変領域としても公知）は、従来の手段を使用して得ることができる。
【００９６】
当技術分野において公知の通り、抗体の超可変領域を描写するアミノ酸位置／境界は、状況及び当技術分野において公知の種々の定義に依存して変動しうる。可変ドメイン内の一部の位置を、ハイブリッド超可変位置として見なしてもよく、それにおいて、これらの位置は、１セットの基準下で超可変領域内と見なすことができ、異なるセットの基準下で超可変領域外と見なす。これらの位置の１つ又は複数は、また、伸長した超可変領域において見出すことができる。本明細書に記載する抗ＰＧ抗体は、これらのハイブリッド超可変位置において改変を含みうる。天然重及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置（３つのＣＤＲにより連結され、それは、βシート構造を連結し、一部の場合において、その一部を形成するループを形成する）を採用することにより、各々、４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域により近接して、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順番で、他の鎖からのＣＤＲと一緒に保持され、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md.1987を参照のこと）。本明細書において使用する通り、免疫グロブリンのアミノ酸残基のナンバリングを、他に示さない場合、Kabat et al.の免疫グロブリンのアミノ酸残基ナンバリングに従って行う。
【００９７】
表１Ａを参照して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＮ末端抗ｈＰＧ抗体の特定の実施態様は、限定しないが、以下を含む：
（ａ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ ＣＤＲに対応するＶＬ ＣＤＲ、及び、配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＨ ＣＤＲに対応するＶＨ ＣＤＲを有する抗体；
（ｂ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ及びＶＨ ＣＤＲに対応するＶＬ ＣＤＲ及びＶＨ ＣＤＲを有する抗体；
（ｃ）抗体、それにおいて：
（ｉ）ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（「ＶＬ ＣＤＲ １．３」；配列番号４）、ＱＳＬＶＨＳＳＧＶＴＹ（「ＶＬ ＣＤＲ １．４」；配列番号１０）、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ ＣＤＲ １．１６」；配列番号５０）、及びＳＱＨＲＴＹＴ（「ＶＬ ＣＤＲ １．１９」；配列番号５１）より選択される；
（ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ２はＫＶＳ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．３」又は「ＶＬ ＣＤＲ ２．４」；配列番号５）、ＬＶＳ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．１６」；配列番号５３）、及びＶＫＫＤＧＳＨ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．１９」；配列番号５４）より選択される；
（ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３はＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．３」；配列番号６）、ＳＱＳＴＨＶＰＰＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．４」；配列番号１１）、ＷＱＧＴＨＳＰＹＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．１６」；配列番号５７）、及びＧＶＧＤＡＩＫＧＱＳＶＦＶ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．１９」；配列番号５８）より選択される；
（ｉｖ）ＶＨ ＣＤＲ１はＧＹＩＦＴＳＹＷ（「ＶＨ ＣＤＲ １．３」；配列番号１）、ＧＹＴＦＳＳＳＷ（「ＶＨ ＣＤＲ １．４」；配列番号７）、ＧＹＴＦＴＳＹＹ（「ＶＨ ＣＤＲ １．１６」；配列番号３９）、及びＧＹＳＩＴＳＤＹＡ（「ＶＨ ＣＤＲ １．１９」；配列番号４０）より選択される；
（ｖ）ＶＨ ＣＤＲ２はＦＹＰＧＮＳＤＳ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．３」；配列番号２）、ＦＬＰＧＳＧＳＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．４」；配列番号８）、ＩＮＰＳＮＧＧＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．１６」；配列番号４３）、及びＩＳＦＳＧＹＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．１９」；配列番号４４）より選択される；及び
（ｖｉ）ＶＨ ＣＤＲ３はＴＲＲＤＳＰＱＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．３」；配列番号３）、ＡＴＤＧＮＹＤＷＦＡＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．４」配列番号９）、ＴＲＧＧＹＹＰＦＤＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．１６」；配列番号４７）、及びＡＲＥＶＮＹＧＤＳＹＨＦＤＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．１９」；配列番号４８）より選択される；
（ｄ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬに対応するＶＬ、及び、配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＨに対応するＶＨを有する抗体；及び
（ｅ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ及びＶＨに対応するＶＬ及びＶＨを有する抗体。
【００９８】
表１Ｂを参照すると、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＣ末端抗ｈＰＧ抗体の特定の実施態様は、限定しないが、以下を含む：
（ｆ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ ＣＤＲに対応するＶＬ ＣＤＲ、及び、配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＨ ＣＤＲに対応するＶＨ ＣＤＲを有する抗体；
（ｇ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ及びＶＨ ＣＤＲに対応するＶＬ ＣＤＲ及びＶＨ ＣＤＲを有する抗体；
（ｈ）抗体、それにおいて：
（ｉ）ＶＬ ＣＤＲ１はＫＳＬＲＨＴＫＧＩＴＦ（「ＶＬ ＣＤＲ １．８」；配列番号４９）及び ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ ＣＤＲ １．１３」；配列番号５０）より選択される；
（ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ２はＱＭＳ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．８」；配列番号５２）及び ＬＶＳ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．１３」；配列番号５３）より選択される；
（ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３はＡＱＮＬＥＬＰＬＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．８」；配列番号５５）及び ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．１３」；配列番号５６）より選択される；
（ｉｖ）ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＴＴＹＡ（「ＶＨ ＣＤＲ １．８」；配列番号３７）及び ＧＦＩＦＳＳＹＧ（「ＶＨ ＣＤＲ １．１３」；配列番号３８）より選択される；
（ｖ）ＶＨ ＣＤＲ２はＩＳＳＧＧＴＹＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．８」；配列番号４１）及び ＩＮＴＦＧＤＲＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．１３」；配列番号４２）より選択される；及び
（ｖｉ）ＶＨ ＣＤＲ３はＡＴＱＧＮＹＳＬＤＦ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．８」；配列番号４５）及び ＡＲＧＴＧＴＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．１３」；配列番号４６）より選択される；
（ｉ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬに対応するＶＬ、及び、配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＨに対応するＶＨを有する抗体；及び
（ｊ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ及びＶＨに対応するＶＬ及びＶＨを有する抗体。
【００９９】
当業者により理解される通り、診断方法において有用な抗ｈＰＧ抗体は、任意の起源（例えば、哺乳動物（例、ヒト、霊長類、げっ歯類、ヤギ、又はウサギ）、非哺乳動物、又は自然におけるキメラ（１を上回る種に由来する）を含む）でありうる。動物（ヒトを含む）における治療的使用のために適した抗体は、好ましくは、処置されることが意図される同じ種に由来する、あるいは、改変又は設計され、非免疫原性である、又は処置されている動物において低下した免疫原性を有する。ヒトにおける治療的使用のために有用な抗ｈＰＧ抗体の特定のクラスは、ヒト化抗体のクラスであり、以下により詳細に考察する。本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な抗ｈＰＧ抗体は、また、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ（例、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、又はＩｇＭを含む）でありうる、又はそれに由来しうる。治療的使用のために設計された抗ｈＰＧ抗体は、好ましくは、ＩｇＧアイソタイプである。
【０１００】
一部の実施態様において、本明細書に記載する治療的方法のために有用な抗ｈＰＧ抗体はヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、それにおいて、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであり、「ＣＤＲ移植」として言及することができる。ヒト化抗体は、また、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものを含むことができる。抗体をヒト化するための方法（ヒト化抗体を設計するための方法を含む）は、当技術分野において周知である。例えば、Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77；Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111；Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-7；米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号、Queen et al.；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Padlan, 1991, Mol. Immunol. 28: 489-498;Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7: 805-814；Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973；及び米国特許第５，５６５，３３２号（その開示は、その全体において参照により本明細書により組み入れられる）。
【０１０１】
非ヒト抗ｈＰＧ抗体のＣＤＲに対応するＣＤＲ配列を有する抗体のヒト化バージョン（例として、限定しないが、表１Ａに提供する種々のＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び表１Ｂに提供する種々のＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体を含む）を、これらの周知の方法を使用して得ることができる。選択された抗ｈＰＧ抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨ鎖の予測配列を、表１Ａ及び１Ｂに提供する。ヒト化抗体の特定の例は、以下を含む抗体を含む：
（ｋ）本明細書に開示される任意の３つのＶＬ ＣＤＲ及び任意の３つのＶＨ ＣＤＲ；
（ｌ）配列番号２１に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｍ）配列番号２３に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｎ）配列番号７５、７７、及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７６及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｏ）配列番号８０及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８１及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｐ）配列番号８４、８６、及び８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８５、８７、及び８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；及び
（ｑ）配列番号９０、９２、及び９４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号９１、９３、及び９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【０１０２】
当業者により認識される通り、特定の結合特性（例えば、目的の特定のエピトープに結合する能力など）を有する抗ｈＰＧ抗体は、本明細書に記載する種々の抗原及び免疫原を使用し、目的の参照抗体とｈＰＧ結合について競合するそれらの能力を評価して容易に得ることができる。本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体のいずれかを、そのような競合アッセイにおける参照抗体として利用することができる。目的のビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体を用いてｈＰＧ結合について競合する抗体の能力を評価するために有用な特定のアッセイを、実施例５に提供する。
【０１０３】
参照抗ｈＰＧ抗体と任意のテスト抗体（種又はアイソタイプと無関係）の間での抗体競合試験を行う際、最初に、参照を、直接的（例えばラジオアイソトープ又はフルオロフォアなど）又は間接的（例えばビオチン（蛍光標識ストレプトアビジンとの結合を介して検出可能）又は酵素（酵素反応を介して検出可能）など）のいずれかで検出可能な標識を用いて標識し、その後の同定を可能にしうる。この場合において、標識参照抗ｈＰＧ抗体（固定又は増加濃度で）を、既知量のｈＰＧを用いてインキュベートし、ｈＰＧ：標識抗ｈＰＧ抗体複合体を形成する。非標識テスト抗体を、次に、複合体に加える。複合標識の強度を測定する。テスト抗体が、重複するエピトープに結合することにより、ｈＰＧについて標識参照抗ｈＰＧ抗体と競合する場合、複合標識の強度は、テスト抗体の非存在において行うコントロール実験と比べて減少する。
【０１０４】
結合競合アッセイを行うための多数の方法が公知であり、適応し、上に及び実施例５に記載されるアッセイと同等の結果をもたらすことができる。
【０１０５】
抗体は、それが、競合結合アッセイ、及び、具体的には、実施例５の競合結合アッセイにおいて参照抗ｈＰＧ抗体のｈＰＧへの結合を、少なくとも５０%だけ（より高いレベルの低下、例えば６０%、７０%、８０%、９０%、又はさらには１００%が望まれうる）、テスト抗体濃度の範囲０．０１−１００μg/mL（例、０．０１μg/mL、０．０８μg/mL、０．４μg/mL、２μg/mL、１０μg/mL、５０μg/mL、又は１００μg/mL、あるいは記述する範囲内の他の濃度）で低下させる場合、参照抗ｈＰＧ抗体とｈＰＧ結合について競合すると考えられ、このように、参照抗ｈＰＧ抗体とほぼ同じ又は重複するｈＰＧのエピトープに結合すると考えられる。
【０１０６】
当業者は、一部の状況、例えば、診断及びモニタリングの状況において、抗ＰＧ抗体を標識することが望まれうることを理解するであろう。そのような標識は検出及び定量化のために有用である。適した標識が当技術分野において周知であり、それらが直接的に観察可能又は検出可能である点で「直接的」（例えば、フルオロフォア又はラジオアイソトープ）、あるいは、それらが観察可能又は検出可能なシグナルを産生する何か他のものと相互作用する点で間接的（例えば、基質上で作用し、検出可能なシグナルを産生する酵素、又は、結合分子、例えば、標識したストレプトアビジン分子に結合するビオチンなど）でありうる。多数の標識システム、ならびにそれらを用いて抗体を標識するための手段が、当技術分野において公知であり、本明細書において使用のために熟慮される。
【０１０７】
本明細書に記載する方法において有用な種々の抗ｈＰＧ抗体は、全長抗体を用いて例示されてきたが、当業者は、結合フラグメント、あるいは全長抗体又は結合フラグメントから設計される又はそれに由来するサロゲート抗体も使用してもよいことを理解するであろう。適したフラグメント、サロゲートなどは、限定しないが、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｖＩｇＧ、ｓｃＦｖフラグメント及びサロボディを含む。他に特定しない場合、用語「抗体」は、本明細書において使用する通り、全ての形態の抗体及び「抗体様」サロゲート分子（一本鎖抗体、サロボディ、及び結合フラグメントを含む）を含むことを意図する。自然発生する抗体に典型的な構造を有する抗体は、本明細書において「天然抗体」として言及される。
【０１０８】
７．１０ 抗ＰＧ抗体を産生する方法
本明細書に記載する方法において有用な抗ＰＧ抗体を、標準的な周知の方法を使用して得てもよい。本明細書に記載する方法において有用な抗ＰＧ抗体を発現するために、部分又は全長の軽及び重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、遺伝子が、転写及び翻訳制御配列に操作的に結合されるようにする。この状況において、用語「操作的に結合される」は、抗体遺伝子がベクター中に連結され、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図される機能を果たすようにすることを意味することを意図する。発現ベクター及び発現制御配列を選び、使用する発現宿主細胞と適合させる。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子を別々のベクター中に挿入することができる。又は、より典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入する。
【０１０９】
抗体遺伝子を発現ベクター中に標準的な方法（例、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補的制限部位の連結、又は、制限部位が存在しない場合、平滑末端連結）により挿入する。抗ＰＧ抗体の軽又は重鎖配列の挿入前に、発現ベクターは既に抗体定常領域配列を保有することができる。例えば、抗ＰＧ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を全長抗体遺伝子に変換する１つのアプローチは、それらを、重鎖定常及び軽鎖定常領域をそれぞれ既にコードする発現ベクター中に挿入することであり、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作的に結合され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作的に結合されるようにする。加えて又は代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子をベクター中にクローン化することができ、シグナルペプチドをインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に結合するようにする。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）でありうる。
【０１１０】
抗体鎖遺伝子に加えて、開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)に記載されている。発現ベクターの設計（調節配列の選択を含む）は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存しうることが当業者により理解されうる。哺乳動物宿主細胞発現のための適した調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現に向けるウイルスエレメント、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなどを含む。ウイルス調節エレメント及びその配列のさらなる記載については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号（Stinskiによる）、米国特許第４，５１０，２４５号（Bell et al.による）、及び米国特許第４，９６８，６１５号（Schaffner et al.による）を参照のこと。
【０１１１】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子などを保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進させる（例、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、及び第５，１７９，０１７号（全てAxel et al.による）を参照のこと）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、薬物（例えばＧ４１８、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなど）への耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。適した選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うＤＨＦＲ宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。軽及び重鎖の発現のために、重及び軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技術により宿主細胞中にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核又は真核宿主細胞中への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。
【０１１２】
原核又は真核生物のいずれかの宿主細胞において本明細書に記載する抗体を発現させることが可能である。特定の実施態様において、抗体の発現が、適切に折り畳まれた、免疫学的に活性な抗体の最適な分泌のために、真核細胞（例、哺乳動物宿主細胞）中で実施される。開示の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Urlaub & Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されるＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含み、例えば、Kaufman & Sharp, 1982, Mol. Biol. 159: 601-621に記載される通りにＤＨＦＲ選択可能なマーカーと使用される）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、及びＳＰ２／０細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞が成長する培養培地中への抗体の分泌を許すために十分な期間にわたり宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。宿主細胞は、また、インタクトな抗体の部分（例えばＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖ分子など）を産生するために使用することができる。上の手順のバリエーションは本開示の範囲内であることが理解される。例えば、本明細書中に記載する抗ＰＧ抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（両方ではない）をコードするＤＮＡを用いて宿主細胞をトランスフェクトすることが望まれうる。
【０１１３】
組換えＤＮＡテクノロジーを使用し、ＰＧへの結合のために必要ではない軽及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全てを除去することもできる。そのような切断ＤＮＡ分子から発現される分子は、また、本明細書に記載する方法において有用である。
【０１１４】
抗ＰＧ抗体の組換え発現のために、宿主細胞を、２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１ベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２ベクターを用いてコトランスフェクトすることができる。典型的には、２つのベクターは、各々、別々の選択可能なマーカーを含む。あるいは、重及び軽鎖の両方のポリペプチドをコードする単一のベクターを使用することができる。
【０１１５】
抗ＰＧ抗体を化学合成により産生することもできる（例、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.に記載される方法による）。種々の抗体を、また、無細胞プラットフォームを使用して生成することができる（例、Chu et al., 2001, Biochemia No. 2 (Roche Molecular Biologicals)を参照のこと）。
【０１１６】
一旦、抗ＰＧ抗体が組換え発現又は合成手段により産生されれば、それは、免疫グロブリン分子の精製のための当該分野において公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ又はプロテインＧ選択後のＰＧについての親和性により、及びサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差により、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により精製することができる。さらに、抗ＰＧ抗体又はその結合フラグメントを、本明細書に記載する又は当技術分野において他で公知の異種ポリペプチド配列に融合し、精製を促進することができる。
【０１１７】
８．実施例
８．１ 実施例１：血漿又は血清ＰＧレベルの定量化
ＰＧの血漿及び／又は血清レベルは、以下のアッセイを使用して便利に決定することができる。９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．５〜１０μg/mLのＣ末端抗ｈＰＧ抗体、例えば、ウサギＣ末端抗ｈＰＧポリクローナル抗体、又はＣ末端抗ｈＰＧ抗体（本明細書に記載する）を用いてコーティングし、次に、一晩インキュベートする。プレートを、次に、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中で３回洗浄し、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中の２%（ｗ／ｖ）脱脂乾燥ミルクを用いてブロックする。別々に、テストサンプル、コントロールサンプル（ブランク又はＰＧ陰性血漿又は血清サンプル）、及び約５ｐＭ（０．５×１０−１１M）〜約０．１nM（１×１０−１０M）のｈＰＧ参照基準（ＰＧ陰性血漿又は血清中で希釈した凍結乾燥ｈＰＧ）を適切な希釈剤（例、ＰＢＳ−TWEEN ０．０５%）中で調製する。サンプルを、コーティングしたプレート上で２〜４時間にわたり３７℃で、又は、あるいは、１２〜１６時間２１℃でインキュベートする。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）を用いて３回洗浄し、０．００１〜０．１μg/mLのＮ末端抗ｈＰＧ抗体、例えば、ポリクローナルＮ末端抗ｈＰＧ抗体又はＮ末端モノクローナル抗ｈＰＧ抗体（本明細書に記載する）を用いてインキュベートし、２１℃で３０分間にわたり西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091を参照のこと）に共役させる。プレートを次にＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中で３回洗浄し、ＨＲＰ基質を２１℃で１５分間にわたり加える。反応を、１００μLの０．５M硫酸を加えることにより停止させ、光学密度測定値を４０５nMで取る。テストサンプルｈＰＧレベルを、ｈＰＧ参照基準に由来する測定値から構築された標準曲線との比較により決定する。
【０１１８】
８．２ 実施例２：抗ｈＰＧ抗体の特異性を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイ
抗ｈＰＧ抗体の特異性を、以下の通りにＥＬＩＳＡアッセイを使用して便利に決定することができる。９６ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の適切な濃度のテストポリペプチド（例、２５及び５０ngの組換えヒトＰＧ、ならびに５０及び２５０ngのＣＴＦＰ又は他のガストリン由来の遺伝子産物）を用いて４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルを、洗浄溶液（ＰＢＳ及び０．１%TWEEN−20）を用いて３回洗浄し、次に１ウェル当たり１００μLのブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．１%TWEEN−２０、０．１%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物）を用いて２２℃で２時間にわたりインキュベートした。ブロッキング後、ウェルを３回洗浄し、アッセイする抗体（テスト抗体）を加える。１００μLのＰＢＳ中のテスト抗体（０．３〜１ng/mL）及び０．１%TWEEN−20を各ウェルに加える。プレートを次に２２℃で２時間にわたりインキュベートし、その後、テスト抗体溶液を捨て、洗浄工程（３×１００μLの洗浄溶液、上に記述する通り）後、二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼに共役させたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を含むブロッキング溶液を用いて置換する。二次抗体を用いた１時間のインキュベーション後、１００μLの基質溶液（例、Ｆａｓｔ ＯＰＤ、又はＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigma-Aldrich Co.から入手可能、製造者の指示に従って調製した）を各ウェルに加え、暗所で、２２℃で２０分間にわたりインキュベートした。反応は、５０μLの４N硫酸を加えることにより停止させ、触媒された基質の量を、４９２nmでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定する。基質変換は、抗原に結合した一次（テスト）抗体の量に比例する。実験を２通りに実行し、ＯＤ測定値を抗原濃度の関数としてプロットする。テスト抗体は、測定されたＯＤがｈＰＧについて０．２〜１．５の間であり、ＣＴＦＰ又は他のガストリン遺伝子由来ペプチドのいずれかを用いて、バックグラウンドを上回る統計的に有意なシグナルがない場合、ＰＧについて特異的であるとスコア化される（ここで、バックグラウンドはＰＢＳだけを含むコントロールウェルからの平均シグナルである）。
【０１１９】
８．３ 実施例３：抗ｈＰＧ抗体の中和性抗体を評価するためのアッセイ
特異的な抗ｈＰＧ抗体が中和性であるか否かを評価するための特定のテストを、以下の通りに実行することができる。ＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞を６ウェルプレートの６ウェル中に約１５０，０００個細胞／ウェルで播種する。細胞を、次に、テスト抗ｈＰＧ抗体又はコントロール抗体を用いて、約５μg/mLの抗体濃度で４８時間にわたり１２時間間隔で処理する。テスト抗体は、テスト抗体を用いて処理した細胞の数が、コントロールの非特異的抗体を用いて処理した細胞の数と比較して、生存細胞の数における少なくとも１０%の統計的に有意な低下を示す場合（両側マンホイットニー検定（差は、ｐ＜０．０５の場合に有意と考えられる）を使用する）、アッセイにおいて中和性であるとして定義される。全細胞数は、処理期間の開始時での細胞数について補正され、Ｔ０として言及される。
【０１２０】
８．４ 実施例４：抗ｈＰＧ抗体の親和性を評価するためのアッセイ
抗ｈＰＧ抗体の親和性定数は、Proteon Technique(BioRad)を使用して、Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383: 52-60（その全体において参照により本明細書により組み入れられる）に従って測定することができる。簡単には、マウス抗ＰＧ抗体について、抗マウスＩｇＧ抗体（５０μg/mL）を最初にセンサーチップ上にコーティングし、抗体の注射後にチップにより検出されたシグナルが１０，０００〜１１，５００応答単位（ＲＵ）の間に入ることを確認する。目的のマウス抗ｈＰＧ抗体（テスト抗体）を次に注射する（３０μg/mLの典型的な濃度で）。テスト抗体が十分に結合する場合、少なくとも５００ＲＵの追加シグナルが観察される。テスト抗体とｈＰＧの間での結合の時間経過を、次に、ｈＰＧの変動濃度、例えば、２００nM、１００nM、５０nM、２５nM、及び１２．５nMを注射し、結合のレベルを検出することにより得る。典型的には、いくつかのチャンネルが、単一の実験において並行して複数の抗体をテストするために利用可能であり、ｈＰＧの異なる濃度で並行して単一のテスト抗体の結合をアッセイすることを可能にする。１つのチャネルを、非特異的結合についてのコントロールとして、ｈＰＧに特異的ではないマウスモノクローナル抗体を用いて注射すべきである。別のチャネルを、バックグラウンドシグナルについてのベースラインとして、希釈緩衝液単独を用いて注射すべきである。一般的に、結合は、非特異的マウス抗体を用いて注射したチャネルにおいて検出可能ではない。この設定において高レベルの結合を示す抗体は、ｈＰＧによる捕捉モノクローナル抗体の飽和をもたらしうるが、より低いｈＰＧ濃度（５０nM、２５nM、１２．５nM、６．２５nM、及び３．１２５nM）に対してテストすることができ、より精度のよい測定を可能とする。
【０１２１】
親和性定数（ＫＤ）を、解離定数（ｋｄ）と結合定数（ｋａ）の間の比率として算出する。実験値は、結合測定値に基づく実験曲線及び理論上のプロファイルの間での統計的に関連する類似性を分析することにより検証することができる。
【０１２２】
非マウス抗ｈＰＧ抗体の親和性定数は、抗ｈＰＧテスト抗体の起源の種について特異的なＩｇＧを使用して同様のフォーマットにおいて評価することができる。
【０１２３】
８．５ 実施例５：参照抗ｈＰＧ抗体を用いた競合的結合を評価するためのアッセイ
目的の抗体（テスト抗体）が、ｈＰＧ結合について、ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体と競合するか否かを評価するための特定のアッセイを、以下の通りに実施することができる。９６ウェルプレートを、捕捉抗ｈＰＧ抗体（ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体により認識されるエピトープとは異なるｈＰＧのＮ又はＣ末端領域を認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体）を用いて、１〜１０μg/mLの範囲内で選ばれる濃度で、４℃で一晩コーティングする（０．１〜１μg/ウェル）。２２℃で２時間にわたるブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の０．１% TWEEN−２０、０．１%ＢＳＡ）を用いたブロッキング後、組換えｈＰＧを、１０pM〜１nM（１０〜１０００pg/ウェル）の間の範囲の濃度で加え、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。その後、ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体（又はビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体を含む混合物）を、増加濃度の非標識テスト抗体濃度と共に加え、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。非結合抗体を除去するための洗浄後、結合した標識参照抗ｈＰＧ抗体の検出を、混合物を、５０ng/mLのストレプトアビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰと２２℃で１時間にわたりインキュベーション、西洋ワサビペルオキシダーゼ用の蛍光基質との２２℃で１時間にわたるインキュベーション、及び、次に、ルミノメーターにおける相対的な光単位（ＲＬＵ）の定量化により実施する。アッセイは二重に実施する。
【０１２４】
参照抗ｈＰＧ抗体と競合する抗体は、ｈＰＧへの参照抗体の結合を阻害する。実質的に同一のエピトープに、又は重複するエピトープと参照抗体として結合する抗体は、結合した参照抗ｈＰＧ抗体の量を有意に（例えば、少なくとも５０%）低下させる（観察されたＲＬＵにおける低下により証明される通り）。
【０１２５】
高いコントロール値が、標識した参照抗体を、テスト抗体を伴わず、組換えｈＰＧとインキュベートすることにより行われるコントロール実験から得られる。低いコントロール値は、過剰濃度の非標識参照抗体（非標識参照抗体は、このように、ｈＰＧへの結合について標識抗体と競合する）の存在において、標識された参照抗体を、組換えｈＰＧを用いてインキュベートすることにより行われるコントロール実験から得られる。参照抗ｈＰＧ抗体と競合するテスト抗体の能力は、次に、標識した参照抗体を、増加濃度の非標識テスト抗体の存在下で組換えｈＰＧとインキュベートすることにより決定される。
【０１２６】
テストアッセイにおいて、テスト抗体の存在下で観察されるＲＬＵにおける有意な低下は、テスト抗体が、参照抗ｈＰＧ抗体と実質的に同じエピトープを認識することを示す。
【０１２７】
結合の阻害は阻害定数又はＫｉとして表現することができ、以下の式に従って算出される：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／［１＋（［参照抗ｈＰＧ Ａｂ濃度］／ＫＤ参照抗ｈＰＧ Ａｂ）］
式中、「ＩＣ５０」は、参照抗体の結合における５０%低下をもたらすテスト抗体の濃度であり、ＫＤ参照抗ｈＰＧ Ａｂは参照抗ｈＰＧ抗体の解離定数（ｈＰＧについてのその親和性の測定値）である。参照抗ｈＰＧ抗体（例えば、本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体の１つ）と競合する有用なテスト抗体は、典型的には、本明細書に記載するアッセイ条件下で１０pM〜１００nMの範囲のＫｉｓを有する。
【０１２８】
８．６ 実施例６：原発性及び転移性膵臓癌と診断された患者における血漿又は血清ガストリン濃度
この実施例では、原発性又は転移性のいずれかの膵臓癌と診断された患者がプロガストリンの上昇した血漿又は血清レベルを有することを実証する。
【０１２９】
８．６．１ 方法
血漿又は血清プロガストリン濃度を、健常個人（コントロールとして）において、及び膵臓癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、又は乳癌と診断された患者において測定した。健常コントロールサンプル（ｎ＝１０４）を血液バンクから得た。分析に含まれた患者の内、２５／３２の膵臓癌患者が転移性疾患を有したが、その内の１０人がそれらの原発性腫瘍を除去されていた。
【０１３０】
血漿又は血清プロガストリンレベルの定量化は、以下に予測的に記載するものと同様のプロガストリン特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して実施した。
【０１３１】
Nunc MaxiSORP 96ウェルプレートのウェルを、以下の通りに第１プロガストリン特異的抗体を用いてコーティングする。プロガストリンのカルボキシ末端領域について特異的な抗プロガストリンポリクローナル抗体を、ＭｉｌｌｉＱ水中の５０mM，ｐＨ ９．６炭酸／重炭酸ナトリウム緩衝液の溶液中に、濃度３μg/mLまで希釈する。合計１００μLの抗体溶液を、次に、９６ウェルプレートの各ウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートする。結合後、抗体溶液をウェルから除去し、それらを次に、１００μL洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ／０．１% TWEEN−20）を用いて３回洗浄する。合計１００μLのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ／０．１% TWEEN−20／０．１% ＢＳＡ）を次に各ウェルに加えて、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。ブロッキング緩衝液を次に除去し、ウェルを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄する。患者から単離された血漿又は血清サンプルを、ウェルに、容積１００μL中の希釈系列（典型的には１：１、１：２、１：５、及び１：１０希釈）において加えて、次に、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。血漿又は血清サンプルは、二重に分析する。
【０１３２】
アッセイは、また、２つの標準曲線を含む。第１の標準曲線を、組換えプロガストリンの希釈物を使用して、最終量１ng、０．５ng、０．２５ng、０．１ng、０．０５ng、０．０１ng、及び０ng/ウェルに調製する。第２の標準曲線は、陰性コントロールとしての役割を果たし、テストサンプルと同じ希釈で（即ち、１：１、１：２、１：５及び１：１０）、ブロッキング緩衝液中に希釈したプロガストリン陰性ヒト血清から調製する。あるいは、血漿サンプルをアッセイしている場合、第２の標準曲線は、陰性コントロールとしての役割を果たし、テストサンプルと同じ希釈で（即ち、１：１、１：２、１：５及び１：１０）、ブロッキング緩衝液中に希釈したプロガストリン陰性ヒト血漿から調製する。
【０１３３】
血漿又は血清サンプルを用いたインキュベーションが完了した後、ウェル内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液（１００μL/ウェル）を用いて３回洗浄し、その後、第１抗体に結合したプロガストリンを、プロガストリンについて特異的な第２抗体を使用して、以下の通りに検出する。
【０１３４】
プロガストリンのアミノ末端領域について特異的なビオチン共役抗プロガストリンポリクローナル又はモノクローナル抗体を、ブロッキング緩衝液中で、濃度０．１〜１０μg/mLまで、抗体に依存して希釈する。合計１００μLの抗体溶液を次に各ウェルに加えて、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。
【０１３５】
第２抗体結合が完了した後、プレートを、洗浄緩衝液（１００μL／ウェル）を用いて３回洗浄し、その後、１００μLのストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液（ブロッキング緩衝液中２５ng/mL）を各ウェルに加えて、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液を用いたインキュベーションが完了した後、プレートを、洗浄緩衝液（１００μL/ウェル）を用いて３回洗浄する。その後、Pierce SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Chemiluminescent Substrateキットを使用して調製した１００μLの化学発光基質を１ウェル当たりに加え、暗所に室温で５分間にわたりインキュベートし、ルミノメーターで読み込む。
【０１３６】
ルミノメーターの読み取りに基づき、線形回帰分析を使用して、標準曲線データに対応する線の等式を導く。この等式を使用して、種々の患者サンプル中でのプロガストリンの濃度を次に算出する。
【０１３７】
８．６．２ 結果
図４におけるボックスプロットは、健常コントロールと比較した、アッセイされた癌患者の２５パーセンタイル、中央値、及び７５パーセンタイル血漿又は血清プロガストリン濃度を示す。ウィスカーは、血漿又は血清プロガストリン濃度の５及び９５パーセンタイルを示す。このデータは、原発性及び転移性膵臓癌を伴う患者を含む患者集団が、健常個人と比較して、それらの血漿又は血清中のプロガストリンの上昇レベルを有していたことを実証する。
【０１３８】
８．７ 実施例７：原発性及び転移性膵臓癌細胞株におけるガストリン遺伝子の発現
この実施例では、ＧＡＳＴ遺伝子が原発性及び転移性膵臓癌細胞株において発現されることを示す。
【０１３９】
８．７．１ 方法
テストした細胞は、原発性膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ ３及びＭＩＡ ＰａＣａ ２、ならびに転移性膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ １及びＳＵ．８６．８６からであった。成長の期間後、細胞を再懸濁し、溶解し、全ｍＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってQIAGEN RNeasy Miniキットを使用して抽出した。ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー（Roche Applied Science）の存在においてSuperscript II RT（Invitrogen）を使用して逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、Quantifast SYBR Green PCRキット（Qiagen）及びEppendorf Mastercycler ep realplex（Eppendorf）を使用して実施した。ＧＡＳＴ及びＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用のプライマーをSigma Life Scienceから得た。各ＰＣＲ増幅を、以下の条件を使用して３通りのウェルにおいて実施した：９５℃で５分、合計４５の２温度サイクル（９５℃で１０秒及び６０℃で３０秒）が続く。
【０１４０】
８．７．２ 結果
異なる細胞株中で発現されるガストリンｍＲＮＡの相対レベルを図５６に報告する。レベルを、ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸癌細胞株（ポジティブコントロールとしての役割を果たした）において発現されるＧＡＳＴ ｍＲＮＡの量と比べて標準化し、データをＬＳ１７４Ｔ ＣＲＣ細胞株における発現レベルと比べて表現した。テストした全ての膵臓癌細胞株が、プロガストリンをコードする遺伝子（ＧＡＳＴ）についてのｍＲＮＡを発現する。
【０１４１】
８．８ 実施例８：膵臓癌細胞株によるプロガストリンの分泌
この実施例では、膵臓癌細胞株がプロガストリンを分泌することを実証する。
【０１４２】
８．８．１ 方法
プロガストリンの分泌は、以下のプロトコールを使用して、２Ｄ培養中で成長させた膵臓細胞から得られた条件培地において、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して定量化した。細胞を、それらが６０%コンフルエントに達するまで７５cm2フラスコ中で成長させた。培地を次に除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞を次に２０mlのＭ１１培地（フェノールレッドを伴わない）中で４８時間にわたり成長させた。培地を次に回収し、１，０００gで５分間にわたり遠心し、細胞デブリを除去し、−８０℃で凍結した。細胞を次にトリプシン処理し、カウントした。
【０１４３】
分泌されたプロガストリンを測定するために、凍結した培地をゆっくりと氷上で解凍し、次に、タンパク質コンセントレータ（Icon, Pierce）を使用して、２，５００gで４５分間にわたる遠心により容積５００μLまで４０倍濃縮した。プロガストリン濃度を、次に、サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して測定した。
【０１４４】
８．８．２ 結果
膵臓癌細胞株により条件付けした培地中のプロガストリンの濃度を図６に報告する。データを、プロガストリン濃度（pM）／１００万個細胞／４８時間の成長として表現した。
【０１４５】
８．９ 実施例９：培養中のＣａｐａｎ １転移性膵臓癌細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の効果
この実施例では、抗ｈＰＧ抗体が転移性膵臓腫瘍細胞の増殖を阻害することを実証する。
【０１４６】
８．９．１ 方法
Ｃａｐａｎ １細胞を６ウェルプレート中に播種し（５０，０００個細胞／ウェル）、２０%ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で８時間にわたり成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ（播種後２４時間目に開始する（時間Ｔ０））、細胞を、４８時間にわたり１２時間毎に、０．５% ＰａｎｅｘｉｎＨの存在において、１μg/mLのコントロールモノクローナル抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ１、Calbiochem Ref #411451）を用いて、又は１μg/mLの抗ｈＰＧ ＭＡｂ３を用いて処理した（示す通り）。技術者は、処理溶液の内容物に関して盲検化された。
【０１４７】
８．９．２ 結果
結果（図７に示す）を、実験の終了時での平均細胞数／ウェル−実験の開始時に播種した細胞数として算出した。この実験の結果は、抗ｈＰＧ ＭＡｂ３が、コントロール抗体と比較して、インビトロでＣａｐａｎ １転移性膵臓癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。
【０１４８】
８．１０ 実施例１０：ＢｘＰＣ−３細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた２Ｄ処理の阻害効果
この実施例では、培養中のＢｘＰＣ−３原発性膵臓癌細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の阻害効果を実証する。
【０１４９】
８．１０．１ 方法
各実験について、１５０ ０００個のＢｘＰＣ−３細胞を６ウェルプレート中に播種し、８時間にわたり１０%ウシ胎児血清を含む培地中で成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ（播種後２４時間目に開始する（時間Ｔ０））、細胞を、４８時間にわたり１２時間毎に、０．５% ＰａｎｅｘｉｎＨの存在において、１μg/mLのコントロールモノクローナル抗体（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８、ＡＴＣＣ、Ｒｅｆ ＴＩＢ−９）を用いて、又は１μg/mLの抗ｈＰＧ ＭＡｂ８を用いて処理した（示す通り）。
【０１５０】
コントロールＭＡｂ処理細胞及び抗ｈＰＧ ＭＡｂ処理細胞の両方における生細胞の数を、４８時間目にカウントした。処理の開始時（Ｔ０）での細胞数を、４８時間目に測定したテスト及びコントロール細胞数から引いた。
【０１５１】
８．１０．２ 結果
結果を図８に示す。コントロール及びテストの両方のサンプルについての実際の細胞数、ならびにコントロールと比べたテストサンプルの細胞数を、以下の表４に提供する：
【表６】
【０１５２】
８．１１ 実施例１１：ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた２Ｄ処理の阻害効果
この実施例では、培養中のＭＩＡ ＰａＣａ−２原発性膵臓癌細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の阻害効果を実証する。
【０１５３】
８．１１．１ 方法
各実験について、１００ ０００個のＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞を６ウェルプレート中に播種し、１０%ウシ胎児血清＋２．５%ウマ血清を含む培地中で８時間にわたり成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ（播種後２４時間目に開始する（時間Ｔ０））、細胞を、７２時間にわたり１２時間毎に、０．５% ＰａｎｅｘｉｎＨの存在において、１０μg/mLのコントロールモノクローナル抗体（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８、ＡＴＣＣ、Ｒｅｆ ＴＩＢ−９）を用いて、又は１０μg/mLの抗ｈＰＧ ＭＡｂ８を用いて処理した（示す通り）。コントロールＭＡｂ処理細胞及び抗ｈＰＧ ＭＡｂ処理細胞の両方における生細胞の数を、７２時間目にカウントした。処理の開始時（Ｔ０）での細胞数を、７２時間目に測定したテスト及びコントロール細胞数から引いた。
【０１５４】
８．１１．２ 結果
実験の結果を図９に提供する。コントロール及びテストの両方のサンプルについての実際の細胞数、ならびにコントロールと比べたテストサンプルの細胞数を、以下の表５に提供する：
【表７】
【０１５５】
８．１２ 実施例１２：懸濁液中の癌球としての膵臓癌細胞のその後の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた２Ｄ前処理の阻害効果
この実施例では、抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた転移性膵臓癌細胞の前処理が、低接着培養条件下で癌球として成長するこれらの細胞のその後の能力に対して有する阻害効果を実証する。
【０１５６】
８．１２．１ 実験１：方法
１００，０００個のＣａｐａｎ １細胞／ウェルを、最初に６ウェルプレート中へ２０%ＦＣＳを伴うＤＭＥＭ中に播種し、一晩血清飢餓させ、抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ３又はモノクローナルコントロール抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ１；Calbiochem ref #411451）の存在において、０．５%Ｐａｎｅｘｉｎ Ｈを伴うＤＭＥＭ中で４８時間にわたり成長させた。処理の終了時、各処理群について、５００個細胞／ウェルを超低付着２４ウェルプレートの８つのウェル中へ５００μlの無血清Ｍ１１培地（ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含む）中に蒔き、さらに１１日間にわたり処理なしで成長させた。この期間の終了時に、写真を撮り、ウェル当たりの球の数をカウントし、球の表面積を測定した。
【０１５７】
８．１２．２ 実験１：結果
写真を１１日間の「休薬」期間の終了時に撮り、その間に、全ての本来の処理条件からのＣａｐａｎ １細胞を同じＭ１１培地中で成長させた。その後、全てのウェルの同一性について盲検化された操作者が、球をカウントした。
【０１５８】
図１０に示す通り、低接着プレート中でスフェロイドとして成長するＣａｐａｎ １膵臓癌細胞の能力は、プロガストリンに対するモノクローナル抗体を用いた先の４８時間処理により有意に低下した。
【０１５９】
８．１２．３ 実験２：方法
１５０，０００個細胞／ウェル（転移性膵臓癌細胞株ＳＵ．８６．８６）を、最初に６ウェルプレート（従来の付着性カルチャウェア）中へ８時間にわたり１０%ＦＣＳを伴うＲＰＭＩ中に播種し、一晩血清飢餓させ、抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ８、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１６、又はＭＡｂ１９の非存在又は存在において、０．５%Ｐａｎｅｘｉｎ Ｈを伴うＲＰＭＩ中で４８時間にわたり成長させた。処理の終了時、各処理群について、５０個細胞／ウェルを超低付着９６ウェルプレートの８つのウェル中へ１００μｌの無血清Ｍ１１培地（ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含む）中に蒔き、さらに６日間にわたり処理なしで成長させた。この期間の終了時に、写真を撮り、ウェル当たりの球の数をカウントし、球の表面積を測定した。
【０１６０】
８．１２．４ 実験２：結果
写真を６日間の「休薬」期間の終了時に撮り、その間に、全ての本来の処置条件からのＳＵ．８６．８６細胞を同じＭ１１培地中で成長させた。その後、全てのウェルの同一性について盲検化された操作者が、球をカウントした。
【０１６１】
図１１に示す通り、低接着プレート中でスフェロイドとして成長するＳＵ．８６．８６膵臓癌細胞の能力は、プロガストリンに対するモノクローナル抗体を用いた先の４８時間処理により有意に低下した。
【０１６２】
本願において引用する全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書が、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、又は他の文書が全ての目的のために参照により組み入れられることが個々に示される場合と同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体において参照により本明細書により組み入れられる。
【０１６３】
種々の特定の実施態様が例証及び記載されているが、種々の変化を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく作ることができることが理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本願は、仮出願第６１／２９３，６１２号（２０１０年１月８日出願）の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）下の利益を主張し、その内容がその全体において参照により組み入れられる。
【０００２】
２．配列リスト、表、又はコンピュータプログラムの参照
配列リストを本明細書と同時に提出する。
【０００３】
３．発明の属する技術分野
本開示は、とりわけ、プロガストリンについて特異的な抗体を含む組成物を被験者に投与することにより原発性及び／又は転移性膵臓癌を伴う被験者を処置する方法に向けられる。
【０００４】
４．背景
数十年の基礎及び臨床研究にもかかわらず、癌は人類の最も大きな災難の１つのままである。世界保健機関（ＷＨＯ）により回収された統計によると、癌は世界中の主な死亡原因の１つであり、２００４年に７４０万人（又はその年の全ての死亡の約１３%）が死んだ。何が癌を起こすか、及び、癌が分子レベルでどのように作用するのかに関して多くのことが学ばれてきたが、癌の死亡率における最も大きな低下は、公衆衛生介入（例えば禁煙キャンペーンなど）ならびに画像テクノロジー及び分子診断における進歩により可能になった早期診断に起因しうるままである。癌細胞を実際に殺す難しい仕事については、しかし、臨床医は、依然として、一世代前の癌専門医が精通してきたであろう治療様式（例えば手術、放射線、及び化学療法など）に頼っている。全てのこれらの処置の効力が長年にわたり改善されてきたが、治癒率における改善及び寿命における増加は漸進的である。分子腫瘍学における革命に起因する新たな標的治療さえ、大半の部分について、そこそこに転帰を改善してきただけである。
【０００５】
膵臓癌（膵臓の悪性新生物）は、処置するのが特に困難な形態の癌である。なぜなら、それは、典型的には、もはや処置できなくなるまで、未検出で進行するからである（Jemal et al., 2008, CA Cancer J. Clin.58(2):71-96）。予後は不良である。膵臓癌と診断された者の５%未満が、依然として、診断後５年間生存しており（Jemal et al., 2010, CA Cancer J. Clin.60(5):277-300）、完全寛解はまれである（Ghaneh et al., 2007, Gut 56(8):1134-1152）。診断からの生存期間中央値はわずか３〜６ヶ月間である（Stathis & Moore, 2010, Nat.Rev.Clin.Oncol.7(3):163-172）。２０１０年に、米国単独における約４３，０００人の個人が膵臓癌と診断され、約３６，８００人がこの疾患で死亡していると推定されている（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｔｙｐｅｓ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃを参照のこと）。膵臓癌は毎年診断される新たな癌症例のわずか２．５%を占めるが、それは、年間の癌死亡の６%に関与し（Jemal et al., 2007, Cancer J. Clin.57(1):43-46）、全ての癌の最も高い致死率の１つを表している。実際に、米国では、膵臓癌は、男性及び女性の間で４番目に高い癌による死因である。
【０００６】
癌を管理する別の困難な局面は、原発性（最初の）腫瘍からの細胞が壊れて遊離し、身体内の別の部位へ、典型的にはリンパ又は血液を通じて、「転移」と呼ばれるプロセスを介して移動し、別の転移性（又は二次性）腫瘍を形成する患者を処置することである。二次性又は転移性腫瘍は、典型的には、最初の腫瘍と同じ型であり（その新たな部位とは無関係に）、疾患は転移癌として言及され、新たな居住組織の癌ではない。例えば、肝臓に広がった膵臓癌は、転移性膵臓癌であり、肝臓癌ではない。原発性膵臓癌はしばしば後のステージまで診断されないため、転移の発生率は高い。実際に、患者の約８０%が診断時に既に転移を有する（Sohn et al., 2000, J. Gastrointest. Surg. 4(6):567-579）。
【０００７】
転移は処置の選択肢を限定する。なぜなら、原発腫瘍の切除又は除去はもはや十分な処置の選択肢ではないからである。ゲムシタビンベースの化学療法は、現在、転移性疾患を伴う任意の患者のためのケアの標準を表す。ゲムシタビンを用いて処置された転移性疾患を伴う患者の生存は、わずか約６ヶ月間である（研究によっては、４．０〜７．１ヶ月間の範囲）。組み合わせ処置、例えば、化学療法（オキサリプラチン、５ＦＵ、又はイリノテカン）を伴うゲムシタビン、又は標的治療（エルロチニブ、ベバシズマブ、又はセツキシマブ）を伴うゲムシタビンを用いた現在の治験では、わずか１〜２ヶ月間の生存延長が報告されている（Sathis & Moore, 2000, Nat. Rev. Clin. Oncol. 7(3):163-172）。
【０００８】
原発性膵臓癌及び転移性膵臓癌のための処置の選択肢における適度な進歩が近年ではなされてきたが（同上を参照のこと）、代替の及び／又はより効果的な治療が依然として差し迫って必要である。
【０００９】
５．要約
ガストリンは、胃酸の分泌を刺激する消化管ペプチドホルモンである。成体の哺乳動物において、それは主に胃前庭部においてＧ細胞により、ならびに上部小腸及び膵臓においてある程度産生される。図１を参照すると、ガストリン遺伝子は、１０１アミノ酸ポリペプチド（「プレプロガストリン」と呼ばれる）に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン（「ＰＧ」）（８０アミノ酸残基ポリペプチド）を生じるシグナル配列（下線）を含む。ガストリンは、主に３つの形態Ｇ３４、Ｇ１７、及びＧ１４（例証せず）で見出され、プロガストリンプロセシングに起因する。
【００１０】
アミド化ガストリンの存在が膵臓腫瘍において観察されてきた（Goetze et al., 2000, Cancer 88(11):2487-2494）。研究者らは、膵臓腫瘍を処置するための抗ガストリンアプローチを使用することを試みてきた（例、Chau et al., 2006, Br. J. Cancer 94:1107-1115；Brett et al., 2002, J. Clin. Oncol. 20:4225-4231を参照のこと）。また、膵臓癌に苦しむ患者がそれらの膵臓腫瘍において検出可能なレベルのプロガストリンを有することが観察されている（Caplin et al., 2000, Br. J. Surg.87(8):1035-1040）。現在、抗プロガストリンアプローチを使用して、原発性及び転移性の両方の膵臓癌を診断、モニター、及び処置することができることが発見されている。本明細書において初めて実証する通り、原発性及び転移性の両方の膵臓癌を伴う患者が、プロガストリンの上昇した血漿及び／又は血清レベルを有し、原発性及び転移性膵臓腫瘍に由来する細胞株の増殖が、プロガストリンに特異的に結合する抗体を用いて処置された場合に阻害される（低付着条件下で癌球を形成するそれらの能力と同様に）。これらの発見は、膵臓癌の再発を診断、処置、防止し、その進行及び／又は処置の経過をモニターするための強力な新たなツールを提供する。
【００１１】
したがって、一局面において、本開示は、膵臓癌（それは原発性膵臓癌又は転移性膵臓癌でありうる）を処置する方法を提供し、原発性又は転移性膵臓癌と診断された被験者に、治療的利益を提供するために効果的な、プロガストリンに特異的に結合する抗体（「抗ＰＧ抗体」）の量を投与することを含む。抗ＰＧ抗体を単独で、単剤療法として、又は他の処置様式（例えば腫瘍切除、放射線治療、化学療法など）と併せて、又はその補助として投与してもよい。
【００１２】
腫瘍切除と併せて、又はその補助として使用した場合、抗ＰＧ抗体を、腫瘍の除去の前及び／又は後に投与してもよく、腫瘍除去に続く特定の期間にわたり、特定の閾値レベルを下回る血漿及び／又は血清プロガストリンレベルが達成されるまで、あるいは特定の期間にわたる血漿及び／又は血清プロガストリンにおける減少が達成されるまで継続してもよい。
【００１３】
化学療法と併せて、又はその補助として使用した場合、抗ＰＧ抗体を、化学療法の前に、化学療法と同時に、又は化学療法の後に投与してもよい。再び、抗ＰＧ抗体を、特定の期間にわたり、特定の閾値レベルを下回る血漿及び／又は血清プロガストリンレベルが達成されるまで、あるいは特定の期間にわたる血漿及び／又は血清プロガストリンにおける減少が達成されるまで投与してもよい。
【００１４】
以下により詳細に考察される通り、原発性及び／又は転移性膵臓癌と診断された患者は、ＰＧの上昇した血漿及び／又は血清レベルを有する。例えば、図４を参照すると、健常個人におけるプロガストリンの血清及び／又は血清レベルは、典型的には、無視できる。膵臓癌に苦しむ個人は、約５０pMの測定可能レベルを有する。この発見は、膵臓癌の診断及び管理においていくつかの有用で重要な新たなツールをもたらす。
【００１５】
第１に、膵臓癌は診断することが困難でありうるため、測定したＰＧ血漿及び／又は血清レベルを他の診断テストと併せて使用し、膵臓癌の診断を確認する、又は初期診断において助けることができる。例えば、膵臓癌の徴候（存在する場合）は、多くの他の病気の徴候と同様であることが一般に公知である。一般的な症状は、背中に放射する上腹部における疼痛、食欲の喪失及び／又は嘔気と嘔吐、有意な体重減少、及び無痛性黄疸を含む。あまり一般的ではない症状は、遠位静脈血栓症及び肺塞栓症、糖尿病、ならびに膵炎を含む。早期検出はより多くの処置の選択肢及びより良い予後を提供するため、血漿及び／血清ＰＧレベルを、これら及び／又は膵臓癌の他の症状を呈する患者において測定し、診断を助けうるが、ここで、上昇レベル、例えば、約５０pMの又はそれを上回る血漿及び／又は血清レベルは、患者が膵臓癌を有することを示しうる。
【００１６】
診断を助けるために血漿及び／又は血清ＰＧレベルを測定することは、膵臓癌についてのリスク因子（限定しないが、喫煙、食事及び環境因子を含む）、Ｈピロリ感染、メタボリックシンドローム（例、肥満、耐糖能障害、長期糖尿病）、及び家族歴（膵臓癌を伴う患者の約５〜１０%を占める）を示す被験者において特に有用でありうる（Maisonneuve & Lowenfels, 2010, Dig.Dis.28(4-5):645-656）。そのような又は他のリスク因子を示す被験者における血漿及び／又は血清ＰＧレベルを、定期的にモニターすることができ、観察された経時的な増加、あるいは約５０pMの閾値の又はそれを上回る観察されたレベルを伴い、個人が膵臓癌を発生しうることを示す。リスクのある個人のそのようなモニタリングは、疾患の早期検出において役立ち、より良い処置の選択肢を提供しうる。
【００１７】
第２に、測定した血漿及び／又は血清ＰＧレベルを使用し、任意の膵臓癌治療（本明細書に記載する抗ＰＧ治療を含む）の有効性、及び／又は潜在的な再発もしくは転移をモニターすることができる。操作の任意の特定の理論により拘束されることを意図しないが、腫瘍が治療の経過にわたり収縮するにつれて、血漿及び／又は血清ＰＧレベルが減少し、正常に戻りうることが予測される。
【００１８】
このように、別の局面において、開示は、被験者において膵臓癌（原発性膵臓癌又は転移性膵臓癌を問わず）の処置の効力及び／又は再発を診断及び／又はモニターするために有用な方法を提供する。この方法は、一般的に、関連する被験者においてＰＧの血漿及び／又は血清レベルを別々の時間点で、又は期間にわたり測定すること、及び、レベルが閾値レベルを上回っている又は下回っているか、あるいは経時的に増加又は減少するかを決定することを含む。閾値レベルを上回るレベル、膵臓癌を発生するリスクのある被験者において又は膵臓癌に関連する１つ又は複数の症状を示す被験者において経時的に増加するレベルは、被験者が膵臓癌を有することを示している。閾値レベルを下回る、又は経時的に減少するレベルは、特定の治療が効果的であることを示している。膵臓癌を有する患者の短い生存時間の観点から、測定値を、合理的に、しばしば、例えば、２週間毎に１回、又はさらにより短い間隔で取るべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ヒトプレプロガストリン（配列番号１００）（そこでシグナルペプチド配列に下線が付いている）、成熟ヒトプロガストリン（配列番号２０）、及びプロガストリンプロセシングの特定産物（Ｇ３４（配列番号１０２）、Ｇ３４−Ｇｌｙ（配列番号１０３）、Ｇ１７（配列番号１０４）、Ｇ１７−Ｇｌｙ（配列番号１０５）、及びＣＴＦＰ（配列番号１０６）を含む）のアミノ酸配列を提供する。
【図２Ａ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ａは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ３のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号１２）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１６）を提供する；
【図２Ｂ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｂは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ３のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号１３）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１７）を提供する；
【図２Ｃ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｃは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ４のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号１４）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１８）を提供する；
【図２Ｄ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｄは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ４のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号１５）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１９）を提供する；
【図２Ｅ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｅは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ８のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号５９）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６７）を提供する；
【図２Ｆ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｆは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ８のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６３）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７１）を提供する；
【図２Ｇ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｇは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１３のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６０）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６８）を提供する；
【図２Ｈ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｈは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１３のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６４）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７２）を提供する；
【図２Ｉ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｉは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１６のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６１）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６９）を提供する；
【図２Ｊ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｊは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１６のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６５）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７３）を提供する；
【図２Ｋ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｋは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１９のＶＨ鎖のポリペプチド配列（配列番号６２）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７０）を提供する；そして
【図２Ｌ】図２は、特定の例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図２Ｌは、マウス抗ｈＰＧ ＭＡｂ１９のＶＬ鎖のポリペプチド配列（配列番号６６）及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７４）を提供する。
【図３Ａ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ａは、ヒト化ＭＡｂ３のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２１）；
【図３Ｂ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｂは、ヒト化ＭＡｂ３のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２２）；
【図３Ｃ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｃは、ヒト化ＭＡｂ４のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２３）；
【図３Ｄ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｄは、ヒト化ＭＡｂ４のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号２４）；
【図３Ｅ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｅは、ヒト化ＭＡｂ８（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７５）；
【図３Ｆ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｆは、ヒト化ＭＡｂ８（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７６）；
【図３Ｇ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｇは、ヒト化ＭＡｂ８（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７７）；
【図３Ｈ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｈは、ヒト化ＭＡｂ８（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７８）；
【図３Ｉ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｉは、ヒト化ＭＡｂ８（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７９）；
【図３Ｊ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｊは、ヒト化ＭＡｂ８（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号７６）；
【図３Ｋ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｋは、ヒト化ＭＡｂ１３（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８０）；
【図３Ｌ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｌは、ヒト化ＭＡｂ１３（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８１）；
【図３Ｍ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｍは、ヒト化ＭＡｂ１３（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８２）；
【図３Ｎ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｎは、ヒト化ＭＡｂ１３（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８３）；
【図３Ｏ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｏは、ヒト化ＭＡｂ１６（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８４）；
【図３Ｐ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｐは、ヒト化ＭＡｂ１６（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８５）；
【図３Ｑ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｑは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８６）；
【図３Ｒ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｒは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８７）；
【図３Ｓ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｓは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８８）；
【図３Ｔ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｔは、ヒト化ＭＡｂ１６（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号８９）；
【図３Ｕ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｕは、ヒト化ＭＡｂ１９（ａ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９０）；
【図３Ｖ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｖは、ヒト化ＭＡｂ１９（ａ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９１）；
【図３Ｗ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｗは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｂ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９２）；
【図３Ｘ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｘは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｂ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９３）；
【図３Ｙ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｙは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｃ）のＶＨ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９４）；そして
【図３Ｚ】図３は、本明細書に記載する、選択された抗ｈＰＧモノクローナル抗体のヒト化可変重鎖及び軽鎖についての予測ポリペプチド配列を提供する。各々の場合において、３つのＣＤＲを太字の下線付きテキストで示す。具体的には：図３Ｚは、ヒト化ＭＡｂ１９（ｃ）のＶＬ鎖の予測アミノ酸配列を提供する（配列番号９５）。
【図４】図４は、健常コントロールと比較した、原発性（Ｍ−）又は転移性（Ｍ＋）膵臓癌を伴う患者からの血漿又は血清中のプロガストリン濃度を例証するグラフを提供する。
【図５】図５は、種々の型の原発性及び転移性膵臓癌細胞株におけるプロガストリンの発現レベルを例証するグラフを提供する。
【図６】図６は、種々の型の原発性及び転移性膵臓癌細胞株によるプロガストリン分泌を例証するグラフを提供する。
【図７】図７は、ネガティブコントロールモノクローナル抗体と比較した、Ｃａｐａｎ １細胞（転移性膵臓腫瘍細胞）に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ３の抗増殖特性を比較するグラフを提供する。
【図８】図８は、ネガティブコントロールモノクローナル抗体と比較した、ＢｘＰＣ ３細胞（原発性膵臓腫瘍細胞）に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ８の抗増殖特性を比較するグラフを提供する。
【図９】図９は、ネガティブコントロールモノクローナル抗体と比較した、ＭＩＡ ＰａＣａ２細胞（原発性膵臓腫瘍細胞）に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ８の抗増殖特性を比較するグラフを提供する。
【図１０】図１０は、未処理コントロール細胞と比較した、低付着条件下で癌球を形成するＣａｐａｎ １細胞（転移性膵臓腫瘍細胞）の長期能力に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ３の阻害特性を実証するグラフを提供する。
【図１１】図１１は、未処理コントロール細胞と比較した、低付着条件下で癌球を形成するＳＵ．８６．８６細胞（転移性膵臓腫瘍細胞）の長期能力に対する例示的な抗ｈＰＧ ＭＡｂ８、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１６、及びＭＡｂ１９の阻害特性を実証するグラフを提供する。
【００２０】
７．詳細な説明
７．１ 膵臓癌
膵臓（長さ約６インチの細い腺）は２つの主な機能を有する：食物を消化するのを助ける分泌液を産生し、血糖レベルを制御するのを助けるホルモン（例えばインシュリン及びグルカゴンなど）を産生する。消化分泌液は外分泌膵臓細胞により、ホルモンは内分泌膵臓細胞により産生される。膵臓癌の約９５%又はそれ以上が、外分泌細胞において生じる（Yao et al., 2007, Oncology 14(12):3492-3450）。外分泌膵臓癌の内、約９５%が腺癌であり、残り５%には腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、コロイド癌、未分化癌、及び破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌を含むがある（ｈｔｔｐ：／／ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｐａｎｃｒｅａｓ／ＢａｓｉｃＴｙｐｅｓ１．ｐｈｐを参照のこと）。
【００２１】
初期膵臓癌は、しばしば、症状を起こさず（Jemal et al., 2008, CA Cancer J. Clin.58(2):71-96）、後期膵臓癌により起こされる症状は通常変動し、非特異的である（Stathis & Moore, 2010, Nat. Rev. Clin. Oncol.7(3):163-172）。結果として、膵臓癌は、しばしば、それが進行するまで診断されない（Jemal et al., 2008, CA Cancer J. Clin. 58(2):71-96）。一般的な症状は、限定しないが、上腹部における疼痛及び背痛、食欲の喪失及び／又は嘔気と嘔吐、有意な体重減少、無痛性黄疸、遠位静脈血栓症、肺塞栓症、ならびに糖尿病及び／又は膵炎を含む。
【００２２】
種々のリスク因子は膵臓癌に関連し、限定しないが、喫煙；長期にわたる糖尿病；慢性膵炎；ならびに特定の遺伝性疾患、例えば遺伝性膵炎、多発性内分泌腫瘍１型症候群、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ；リンチ症候群）、フォン・ヒッペル・リンダウ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、及び家族性非定型多発性モルメラノーマ症候群（ＦＡＭＭＭ）を含む。
【００２３】
膵臓癌を診断するために使用される診断手順は、画像研究、例えばコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、内視鏡超音波（ＥＵＳ）、腹腔鏡検査、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、及び経皮経肝胆管造影（ＰＴＣ）などを含む。しかし、確定診断は、放射線学的に疑わしい組織の内視鏡下針生検又は外科的切除により行われる。これらの種々の診断技術を、また、癌を病期分類するために使用し、それは処置の選択肢に影響を及ぼす。以下のステージを一般に使用し、膵臓癌を評価する：
ステージ０（上皮内癌）：このステージにおいて、異常細胞が膵臓の内膜において見出される。これらの異常細胞は癌性になり、周囲組織に広がりうる。
ステージＩ：このステージにおいて、癌が形成し、膵臓だけで見出される。ステージＩは、さらに、腫瘍のサイズに依存して、２つのサブステージに分割される：ステージＩＡ（腫瘍が２cm又はそれより小さい）及びステージＩＢ（腫瘍が２ｃｍより大きい）。
ステージＩＩ：このステージにおいて、癌は近くの組織及び臓器に広がっており、リンパ節に広がっているであろう。このステージは、さらに、癌がどこに広がっているかに基づいてサブステージに分割される。ステージＩＡ（近くの組織及び臓器に広がっているが、しかし、リンパには広がっていない）；及びステージＩＩＢ（リンパならびに恐らくは他の近くの組織及び臓器に広がっている）。
ステージＩＩＩ：このステージにおいて、癌は膵臓近くの主要血管に広がっており、また、近くのリンパ節に広がっている。
ステージＩＶ：このステージにおいて、癌は任意のサイズでありうるが、遠隔組織及び臓器（例えば肝臓、肺、及び腹腔など）に広がっている（即ち、癌は転移している）。
【００２４】
３つの主な処置の選択肢があり（手術、放射線治療、及び化学療法）、それはステージにより変動する。ステージＩ及びステージＩＩの原発性膵臓癌のための処置は、ゲムシタビン又は５ＦＵレジメンに基づく補助化学療法を伴う手術（放射線治療を伴う又は伴わない）を含みうる。
【００２５】
しばしば、原発性膵臓癌が処置に続いて再発する（再発性膵臓癌と呼ばれる）。ゲムシタビンベースの化学療法は、また、一般的に、再発性の局所進行膵臓癌を伴う患者のために使用され、時折、放射線又は化学放射線が続く。
【００２６】
７．２ 転移
バックグラウンドのセクションにおいて記述する通り、転移は、癌が広がるプロセスを指す。簡単には、腫瘍細胞は、原発腫瘍を離れ、血液循環又はリンパ系を介して新たな組織部位へ移動し、二次腫瘍を形成する。新たな組織部位の腫瘍は転移性腫瘍として言及され、典型的には、原発腫瘍の供給源を同定する。例えば、他の組織に広がっている膵臓癌は、二次性の転移性腫瘍の組織部位にかかわらず、「転移性膵臓癌」として言及される。
【００２７】
癌細胞は原発腫瘍の近くのリンパ節に頻繁に広がり、それはリンパ節転移又は局所疾患と呼ばれる。
【００２８】
転移は多数の別々のステップからなる：浸潤及び遊走、脈管内への侵入、循環、血管外遊出及びコロニー形成、増殖及び血管新生。浸潤及び遊走の間に、個々の細胞は原発腫瘍から剥離し、隣接する健常組織に浸潤する。これを達成するために、腫瘍細胞は運動性にならなければならず、上皮から間葉への移行と呼ばれる表現型の形質転換を受けると仮定される。Kalluri et al., 2009, J. Clin.Invest.119(6): 1420-28.また、そのような細胞は、しばしば、細胞外マトリックスを分解する酵素を産生し、それにより、原発腫瘍外への及び周囲の健常組織中への遊走を促進する。腫瘍細胞が血管又はリンパ管に遭遇すると、それは、血管を覆う内皮細胞の間にそれ自体を挿入し、血流又はリンパ系中に侵入する。異常腫瘍細胞は、次に、循環器系又はリンパ系を介して新たな臓器に又はリンパ節に移動する。腫瘍細胞は、次に、臓器（例えば肝臓、肺、又は他の組織もしくは臓器など）の毛細血管又はリンパ管に留まり、次に、組織空間中へ内皮に侵入することにより血管外遊出しうる。最後に、コロニー形成、増殖、及び血管新生の間に、腫瘍細胞はその新たな宿主組織中に居を定めて、成長を始める。新たな転移性腫瘍が十分なサイズに達すると、それは、成長因子（例えばＶＥＧＦなど）を分泌し、腫瘍中への新たな血管の成長を刺激し、急速に成長する腫瘍に酸素及び栄養を供給しうる。
【００２９】
腫瘍は、転移を介してほぼ全ての身体の部位に広がることができる。局所再発、肝臓転移、及び腹膜伝播は、膵臓腫瘍の切除後での最も一般的な再発部位である。典型的な局所領域浸潤が、膵後方神経組織、十二指腸、門脈（ＰＶ）、及び上腸間膜静脈（ＳＭＶ）、又は所属リンパ節において見出される。膵臓癌における遠隔転移の最も通常の部位は、肝臓及び腹膜腔である。他のあまり一般的ではない部位は、肺、骨、及び脳である。まれな部位、例えば筋肉、皮膚、心臓、胸膜、胃、臍、腎臓、虫垂、精索、及び前立腺なども報告されている（Howard, 1996, Curr. Prob.l Cancer 20(5):281-328；Borad et al., 2009, Yale J. Biol.Med.82(1):1-6）。
【００３０】
７．３ 原発性及び転移性膵臓癌のための処置
膵臓癌と診断された患者は、典型的には、不良な予後を有する。部分的には、なぜなら、膵臓癌は、通常、早期に症状を起こさず、診断時に局所的に進行した又は転移性の疾患に至るからである。処置の選択肢（上に考察する）は、診断時の疾患のステージに依存する。
【００３１】
７．４ 抗ｈＰＧ抗体ならびに原発性及び転移性膵臓癌に対するそれらの効果
本明細書に開示する通り、膵臓癌を伴う被験者は、それらの膵臓腫瘍においてプロガストリンの検出可能なレベルを有することが報告されている（Caplin et al., 2000, Br. J. Surg.87(8):1035-1040）。本明細書に報告し、実施例のセクションにおいて考察するデータは、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、Ｃａｐａｎ １、及びＳＵ．８６．８６が、プロガストリンをコードする遺伝子（ＧＡＳＴ）についてのｍＲＮＡを発現すること（実施例７）、また、膵臓癌細胞株がプロガストリンを分泌することを実証する（実施例８）。原発性及び転移性の両方の膵臓癌を伴う患者が、プロガストリンの上昇した血漿及び／又は血清レベルを有すること（実施例６）、原発性及び転移性膵臓腫瘍に由来する細胞の成長が、ヒトプロガストリン（「ｈＰＧ」）に特異的に結合する抗体を用いた処理により阻害されること（実施例９、１０、及び１１）、及び、低付着培養条件下で腫瘍球として成長する膵臓癌細胞の能力が、抗ｈＰＧ抗体を用いた前処理に続いて有意に低下すること（実施例１２）が現在発見されている。これらの驚くべき励みになる発見に基づき、そのような抗ｈＰＧ抗体を使用し、膵臓癌の診断を助け、膵臓癌の処置計画の効力をモニターし、発生の任意のステージの膵臓癌（原発性及び転移性の両方の膵臓癌を含む）を処置し、膵臓癌の再発を防止しうることが期待される。
【００３２】
Hollande et al.により最近実証された通り、プロガストリンは、ＩＣＡＴ（ベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４シグナル伝達のネガティブ調節因子）を抑制することにより結腸直腸癌細胞のベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４経路を刺激する（ＷＯ ２００７／１３５５４２を参照のこと）。ベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４シグナル伝達は細胞増殖を起こす。このシグナル伝達の非存在において、それらは分化し、正常な細胞周期（プログラムされた細胞死、又はアポトーシスを含む）を受ける。Hollande et al.は、また、そのような細胞を抗ｈＰＧ抗体に曝露させることで、ベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４誘導性増殖が遮断されること、ＣＲＣ細胞の成長又は増殖が阻害されることを実証している（例、ＷＯ ２００７／１３５５４２を参照のこと）。プロガストリンを用いた処理又はそれへの曝露に応答して増殖する細胞は、内因性に産生される又は外因性であるに関わらず、それにおいて増殖が、抗ＰＧ抗体を用いた処理又はそれへの曝露時に阻害され、本明細書において「プロガストリン感受性」として言及される。
【００３３】
上に記述する通り、原発性及び転移性の両方の腫瘍細胞がプロガストリン感受性であり、抗ＰＧ抗体を用いた処理又はそれへの曝露に応答することが発見されている。操作の任意の理論により拘束されることを意図しないが、抗ＰＧ抗体は、ＰＧに結合し、その推定受容体とのその相互作用を遮断し、順に、増加したＩＣＡＴ発現に起因するベータ−カテニン／Ｔｃｆ−４誘導性増殖を抑止することによりそれらの抗増殖特性を発揮すると考えられる。他の機構（それにより抗ＰＧ抗体が原発性及び／又は転移性癌細胞の生存及び／又は成長に干渉しうる）も可能であり、本明細書に開示する本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００３４】
７．５ 治療的方法
したがって、一局面において、本開示は、膵臓癌に苦しんでいる又はそれと診断された被験者を処置する方法を提供する。この方法は、被験者に、治療的利益を提供するために効果的な１つ又は複数の抗ＰＧ抗体の量を投与することを含む。抗ＰＧ抗体を一般的に、及び方法において有用な特異的抗ＰＧ抗体を、後のセクションにおいて詳細に記載する。
【００３５】
処置される被験者は、任意の動物、例えば、哺乳動物、例えば農場動物（例、ウシ、ブタ、ウマなど）もしくは家畜化したペット（例、イヌ、ネコなど）、又はヒトでありうる。投与される抗ＰＧ抗体は、処置されている動物の種について特異的であるべきである。ヒト被験者の処置のために、抗ＰＧ抗体は、ヒトプロガストリン（本明細書において「抗ｈＰＧ抗体」として言及され、以下により詳細に記載する）に特異的に結合すべきである。
【００３６】
処置される膵臓癌は、発生の任意のステージ、ステージ０からステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はさらにはステージＩＶでありうる。実際に、本明細書に記載する抗ＰＧ治療の有意な利点は、それが、転移性膵臓腫瘍ならびに原発性膵臓腫瘍に対して効果的であると期待されることであり、それにより、発生の後のステージにおいてでさえ膵臓癌を有する患者に利益を提供する。また、膵臓癌の再発を防止することが期待される。
【００３７】
抗ＰＧ治療を単独で、単剤療法として、又は膵臓癌の特定のステージを処置するために一般的に使用される他の治療と組み合わせてもしくはその補助として使用することができる。そのような一般的な処置が上に記述されており、例えば、ゲムシタビン、５ＦＵ、又は他の化学療法剤を用いた化学療法、及び標的治療（例えばベバシズマブを用いた処置など）を含む。特定の実施態様において、抗ＰＧ治療を、腫瘍細胞を標的とする他の抗体（例えばベバシズマブなど）を用いた処置と組み合わせて、又はその補助として適用する。他の処置と組み合わせて使用する場合、抗ＰＧ抗体及び他の治療を同時に、連続的に、又は別々に投与することができる。
【００３８】
本明細書において使用する通り、抗ｈＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤が、それらが患者に同じ日、例えば同じ患者の来診の間に投与される場合、連続的に投与されると言われる。連続投与は、１、２、３、４、５、６、７、８時間又はそれ以上離して生じうる。対照的に、抗ＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤が、それらが異なる日に患者に投与される場合、別々に投与されると言われる。例えば、抗ＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、又は１ヶ月間の間隔で投与することができる。抗ＰＧ抗体の投与は、第２の治療用薬剤の投与に先行する又は続くことができる。
【００３９】
あるいは、抗ＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤を、期間にわたり同時に投与することができ、抗ＰＧ抗体及び第２の治療用薬剤の投与を交代させる第２の期間が続く。
【００４０】
同様に、抗ＰＧ抗体を、可能な場合、腫瘍の外科的除去と組み合わせて、又はその補助として投与することができる。抗ＰＧ抗体を、腫瘍の除去の前、その間、又はその後に投与してもよい。
【００４１】
７．６ 医薬的組成物
抗ＰＧ抗体は、典型的には、医薬的製剤又は組成物の形態で投与されうる。そのような製剤又は組成物は、場合により、追加の活性及び／又は治療用薬剤を含みうる（当技術分野において公知の通り）。製剤は、典型的には、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤を含みうる。使用される特定の担体、賦形剤、及び／又は希釈剤は、所望の投与様式に依存しうる。この組成物は、患者にそれを投与する所望の方法に依存して、任意の適した形態でありうる。
【００４２】
抗ＰＧ抗体は、種々の経路により、典型的には、非経口的に、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、又は筋肉内注射を介して被験者に投与することができる。投与は、１つ又は複数のボーラス注射として、あるいは１つ又は複数の注入としてもたらすことができる。他の投与経路が、また、当業者の知識に従って可能である。任意の所与の場合における最も適した投与経路は、特定の抗体、被験者、及び処置される膵臓癌のステージに依存しうる。
【００４３】
医薬的組成物は、用量当たりに抗ＰＧ抗体の所定量を含む単位用量形態で便利に提示することができる。そのような単位は、限定しないが、５mg〜５g、例えば１０mg〜１g、又は２０〜５０mgを含みうる。
【００４４】
医薬的組成物は、所望の純度を有する抗体を、当技術分野において典型的に用いられる任意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤（それらの全てが本明細書において「担体」として言及される）、即ち、緩衝化薬剤、安定化薬剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、及び他の種々の添加剤を混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての保存のために調製することができる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed.1980)を参照のこと。そのような添加剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であるべきである。
【００４５】
緩衝化薬剤は、生理的条件に近似する範囲内のｐＨを維持するために役立つ。それらは約２mM〜約５０mMの範囲の濃度で存在することができる。本開示を用いた使用のための適した緩衝化薬剤は、有機酸及び無機酸の両方ならびにその塩、例えばクエン酸緩衝剤（例、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝剤（例、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝剤（例、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、及び酢酸緩衝剤（例、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などを含む。加えて、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及びトリメチルアミン塩（例えばＴｒｉｓなど）を使用することができる。
【００４６】
保存剤を加えて、微生物の成長を遅らせることができ、０．２%−１%（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えることができる。本開示を用いた使用のための適した保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例、塩化物、臭化物、及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン（例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３ペンタノールなど）を含む。
【００４７】
等張剤（時折「安定剤」として公知である）を加えて、本開示の液体組成物の等張性を確実にしてもよく、多価糖アルコール、例えば、三価又はそれより高い糖アルコール（例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなど）を含む。安定剤は、機能において、増量剤から添加剤（治療用薬剤を安定化する、又は、変性もしくは容器壁への付着を防止することを助ける）に及びうる広範なカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖又は糖アルコール（例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど）、シクリトール（例えばイノシトールなど）を含む；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；含硫の還元剤（例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、αモノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなど）；低分子量ポリペプチド（例、１０残基又はそれより少ないペプチド）；タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドンなど）単糖類（例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）、及び三糖類（例えばラフィノースなど）；及び多糖類（例えばデキストランなど）でありうる。安定剤は、活性タンパク質重量部当たり０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在することができる。
【００４８】
非イオン性界面活性物質又は界面活性剤（「湿潤剤」としても公知である）を加えて、治療用薬剤を可溶化し、ならびに、撹拌誘導性の凝集に対して治療的タンパク質を保護するのを助けることができ、それは、また、タンパク質の変性を起こすことなく、製剤が剪断面に曝露されることを許す。適した非イオン性界面活性物質は、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（TWEEN（登録商標）20、TWEEN（登録商標）80など）を含む。非イオン性界面活性物質は、約０．０５mg/ml〜約１．０mg/ml、例えば、約０．０７mg/ml〜約０．２mg/mlの範囲で存在しうる。界面活性物質は、しかし、抗体に結合する傾向を有し、それらの立体構造を損ないうる。従って、使用する場合、安定化濃度は低く、実験的に識別しなければならない。
【００４９】
追加の種々の賦形剤は、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒を含むことができる。
【００５０】
７．７ 効果的な投与量
抗ＰＧ抗体を、被験者に、治療的利益を提供するために十分な又は効果的な量で投与する。原発性及び／又は転移性膵臓癌を処置する状況において、治療的利益を、以下の１つ又は複数が達成される場合に推論することができる：腫瘍の成長を停止又は減速すること、患者の腫瘍の数及び／又はサイズを低下させること、手術不可能な腫瘍を、それらを外科的に除去することができるサイズ及び位置に収縮させること、寿命を延長させること、及び／又は患者の生活の質を改善させること。
【００５１】
完治が望ましいが、治療的利益があれば要求されない。実際に、膵臓癌の診断からの生存中央値はわずか３〜６ヶ月間であるため（Stathis & Moore, 2010, Nat Rev Clin Oncol.7(3):163-72）、この中央値を超える追加の３ヶ月間の個人の生存における延長は、大幅な治療的利益を提供する。例えば、Philip et al., 2009, J. Clin.Oncol.24(33):5660-5669を参照のこと。
【００５２】
一部の状況において、治療的利益は、当業者の知識に従い、１つ又は複数のサロゲートエンドポイントと相関しうる。例として、限定しないが、血漿及び／又は血清ＰＧ濃度を被験者において経時的に測定することができ、ＰＧレベルにおける低下、又は閾値レベルを下回るレベル、例えば、約５０pM、４０pM、３０pM、２０pM、１０pM、又は５pM未満は治療的利益を示している。
【００５３】
腫瘍サイズ、数、及び代謝を、種々のスキャン技術（例えば、限定しないが、ＣＴ、ＭＲＩ、機能的ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、及びＰＥＴなど）、ならびに当業者に公知の他の方法を使用して測定することができる。
【００５４】
全ての遊離ＰＧを結合することが、治療的効力を達成するために要求される訳ではないが、それが望まれうる。遊離ＰＧは、抗ＰＧ抗体により結合されるために利用可能であるＰＧを意味する。むしろ、腫瘍内又は周囲の遊離ＰＧの濃度を全身的に、特に体液又は他においてより限定された範囲まで低下させることも効果的でありうる。遊離ＰＧ濃度が抗ＰＧ抗体組成物の投与により低下されうる例示的な組織及び体液は、限定しないが、患者から除去された腫瘍サンプル、腹水、胸水からの液体、脳脊髄液、リンパ、血液、血漿、血清、及びその他を含む。これらの組織又は体液の１つ又は複数におけるＰＧの濃度は、ＥＬＩＳＡ技術又は当業者が精通する他の技術を使用して定量化することができる。
【００５５】
当業者の知識によれば、抗ＰＧ抗体の用量を、患者において滴定し、投与後の所定の時間での目的の組織又は体液中での遊離ＰＧ濃度を低下させるようにすることができる（少なくとも約１０%、２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０、又は１００%、あるいは約５%−１０%、約１０%−１５%、約１５%−２０%、約２０%−２５%、約２５%−３０%、約３０%−３５%、約３５%−４０%、約４０%−４５%、約４５%−５０%、約５０%−５５%、約５５%−６０%、約６０%−６５%、約６５%−７０%、約７０%−７５%、約７５%−８０%、約８０%−８５%、約８５%−９０%、又は約９０%−９５%又は先行する値のいずれかの間の範囲での遊離ＰＧ濃度におけるパーセンテージ低下）。
【００５６】
投与される抗ＰＧ抗体の量は、種々の因子（処置されている膵臓癌のステージ、投与の形態、経路、及び部位、治療レジメン（例、第２の治療用薬剤が使用されるか否か）、処置されている特定の被験者の年齢及び状態、処置されている患者の抗ＰＧ抗体への感受性）に依存しうる。適切な投与量は、当業者により容易に決定されることができる。最終的には、臨床医が、使用される適切な投与量を決定する。この投与量は、しばしば、適宜、反復することができる。副作用が発生した場合、投与量の量及び／又は頻度を、通常の臨床診療に従って、変える又は低下させることができる。適当な投与量及び処置レジメンは、当業者に公知の従来の技術を使用して、治療の進行をモニターすることにより確立することができる。
【００５７】
効果的な投与量を、最初にインビトロアッセイから推定することができる。例えば、動物における使用のための初回用量を製剤化し、特定の抗ＰＧ抗体の結合親和性定数である又はそれを上回る抗ＰＧ抗体の循環血液又は血清濃度を達成してもよい。特定の抗体のバイオアベイラビリティを考慮に入れた、そのような循環血液又は血清中濃度を達成するための投与量の算出は、十分に当業者の能力内にある。ガイダンスについては、読者はパート１を参照のこと：General Principles in "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," 11th Ed., Hardman, J.G., et al., Eds., McGraw-Hill Professional、及びその中で引用される参考文献。
【００５８】
初回投与量は、また、インビボのデータ（例えば動物モデルなど）から推定することができる。膵臓癌を処置するための薬剤の効力をテストするために有用な動物モデルが、当技術分野において周知である。当業者は、そのような情報を定期的に適用して、ヒトへの投与のために適した投与量を決定することができる。
【００５９】
特定の実施態様において、静脈内用量を、処置の数日から数週間前に数回個人の血清又は血漿ＰＧ濃度を測定し、飽和しうる抗ＰＧ抗体の量（即ち、ＰＧの全てに結合するために十分でありうる量）を算出することにより個々の被験者について決定してもよい。当業者により理解される通り、ＰＧの所与の血清又は血漿中濃度について飽和を達成するために必要な任意の特定の抗体の量は、特定の抗体の親和定数に部分的に依存する。目的の特定の抗ＰＧ抗体についての飽和量を算出するための方法は周知である。
【００６０】
飽和を保証するために、算出された飽和量より大きい量を投与してもよく、例えば、算出された飽和量よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又はさらには１０倍大きい量を投与してもよい。静脈内以外の投与様式のために、量を、当技術分野において周知の通りに、薬物動態及びバイオアベイラビリティに基づいて調整することができる。
【００６１】
抗ＰＧ抗体の効果的な用量は、約０．００１mg/kg〜約２５０mg/kg／単回（例、ボーラス）投与、複数投与又は連続（例、注入）投与の範囲である、あるいは、処置されている膵臓癌のステージ、投与経路、ならびに被験者の年齢、体重、及び状態に依存する本明細書における任意の効果的な範囲又は値であることが期待される。特定の実施態様において、各用量は約０．１mg/kg〜約０．５mg/kg；約０．２５mg/kg〜約０．７５mg/kg；約０．５mg/kg〜約１mg/kg；約２mg/kg；約１．５mg/kg〜約２．５mg/kg；約２mg/kg〜約３mg/kg；約２．５mg/kg〜約３．５mg/kg；約３mg/kg〜約４mg/kg；約３．５mg/kg〜約４．５mg/kg；約４mg/kg〜約５mg/kg；約５mg/kg〜約７mg/kg；約６mg/kg〜約８mg/kg；約７mg/kg〜約９mg/kg；約８mg/kg〜約１０mg/kg；約１０mg/kg〜約１５mg/kg；約１２．５mg/kg〜約１７．５mg/kg；約１５mg/kg〜約２０mg/kg；約１７．５mg/kg〜約２２．５mg/kg；約２０mg/kg〜約２５mg/kg；約２２．５mg/kg〜約２７．５mg/kg；約２５mg/kg〜約３０mg/kg；約３０mg/kg〜約４０mg/kg；約３５mg/kg〜約４５mg/kg；約４０mg/kg〜約５０mg/kg；約４５mg/kg〜約５５mg/kg；約５０mg/kg〜約６０mg/kg；約５５mg/kg〜約６５mg/kg；約６０mg/kg〜約７０mg/kg；約６５mg/kg〜約７５mg/kg；約７０mg/kg〜約８０mg/kg；約７５mg/kg〜約８５mg/kg；約８０mg/kg〜約９０mg/kg；約８５mg/kg〜約９５mg/kg；約９０mg/kg〜約１００mg/kg；約９５mg/kg〜約１０５mg/kg；約１００mg/kg〜約１５０mg/kg；約１２５mg/kg〜約１７５mg/kg；約１５０mg/kg〜約２００mg/kg；約１７５mg/kg〜約２２５mg/kg；約２００mg/kg〜約２５０mg/kgの範囲であればよい。他の投与量の範囲も可能である。
【００６２】
投与の量、頻度、及び持続時間は、種々の因子（例えば患者の年齢、体重、及び疾患の状態など）に依存する。このように、非限定的な例において、投与のための治療計画は、１日又はそれ以上、２日又はそれ以上、３日又はそれ以上、４日又はそれ以上、５日又はそれ以上、６日又はそれ以上、１週間又はそれ以上、２週間から無制限にわたり、２週間〜６ヶ月間、３ヶ月間〜５年間、６ヶ月間〜１又は２年間、８ヶ月間〜１８ヶ月間などにわたり継続することができる。場合により、治療レジメンは、反復投与（例、１日１回、１日２回、２日、３日、５日、１週間、２週間、又は１ヶ月毎）を提供する。反復投与は同じ用量で又は異なる用量でありうる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又はそれ以上反復することができる。抗ＰＧ抗体の治療的に効果的な量は、単回用量として又は治療レジメンの経過にわたり（例、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長い経過にわたり）投与することができる。
【００６３】
７．８ 治療的効力を決定するための診断及び患者モニタリングの方法
上に記述する通り、原発性及び／又は転移性膵臓癌と診断された患者は、ＰＧの上昇した血漿及び／又は血清レベルを有する。図４を参照すると、健常個人におけるＰＧのベースラインレベルは無視でき、典型的には、検出の限度である。原発性及び／又は転移性膵臓癌を伴う被験者におけるＰＧ血漿及び／又は血清レベルが測定可能であり、約５０pMである。この観察に基づき、ＰＧの血漿及び／又は血清レベルを使用し、原発性又は転移性膵臓癌の診断を助け、又はその処置の有効性をモニターすることができる。
【００６４】
したがって、本開示は、また、原発性又は転移性膵臓癌を診断する、又はその処置の経過の効力をモニターする方法を提供する。診断を助けるために、診断を受けている個人からの血漿又は血清サンプルのＰＧレベルを測定し、閾値と比較し、閾値よりも高いレベルは膵臓癌を示している（特に、他の診断テストが、個人が膵臓癌に苦しみうることを示す場合）。一部の実施態様において、少なくとも約５０pMの血漿又は血清ＰＧ濃度は、膵臓癌を示している（特に、他のポジティブなテスト結果と組み合わせた場合）。
【００６５】
治療の効力をモニターする目的のために、血液、血漿、又は血清ＰＧレベルを特定の時間点で測定することができる。濃度における経時的な減少、及び／又は特定の時間点での閾値を下回る測定レベルは、効力を示している。閾値は、上で考察されるものでありうる、あるいは、治療の開始前に又は１ラウンドの治療の間の早期の特定の点で処置されている被験者から得られた被験者に特異的な値でありうる。
【００６６】
操作の任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、患者における腫瘍の数及び／又はサイズが、治療のラウンドの結果として低下するにつれて、腫瘍により産生されたＰＧの総量も減退すると考えられる。対照的に、１ラウンドの治療が完了した後でのＰＧレベルにおける実質的な変化又は上昇がないことは、治療が効果的ではなかったことを示しうる。この情報はケア提供者により使用され、新たなラウンドの治療を開始すべきか否かを決めることができる。
【００６７】
ＰＧレベルは、当業者が精通する分析技術（例えば、限定しないが、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡなど）を使用して測定することができる。ヒト被験者のＰＧレベルを測定するために有用な抗ｈＰＧ抗体を、後のセクションに記載する。
【００６８】
特定の実施態様において、ＰＧレベルは、プロガストリンのＮ末端を標的化する１つの抗ＰＧ抗体及びプロガストリンのＣ末端を標的化する第２の抗ＰＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定されうる。そのようなサンドイッチアッセイのために有用な例示的なＮ及びＣ末端抗ＰＧ抗体を、後のセクションに記載する。そのようなアッセイにおいて、表面（例えば９６ウェルプレート中のウェルなど）を調製し、それに、既知量の第１の「捕捉」Ｎ末端又はＣ末端抗ＰＧ抗体を結合させる。テストサンプルを次に表面に適用し、インキュベーション期間が続く。表面を次に洗浄し、第２「検出」抗ＰＧ抗体を含む溶液を適用し、そこで検出抗体がＰＧの異なるエピトープに結合する（例えば、捕捉抗体がＣ末端抗ＰＧ抗体である場合、Ｎ末端抗ＰＧ抗体が検出抗体として使用され、及び逆もまた同様である）。ＰＧレベルを次に直接的（例えば、検出抗体が検出可能な標識に結合している場合）又は間接的（検出抗ＰＧ抗体に結合する標識二次抗体を通じて）のいずれかで測定する。このアッセイのために、抗体を過剰に使用すべきであり、全てのＰＧが結合され、定量化されるようにする。血漿及び／又は血清ＰＧレベルを測定するための特定のサンドイッチアッセイを、実施例１に提供する。
【００６９】
治療の完了後の異なる間隔での複数の測定値を取り、次に、グラフ化し、傾向が存在するか否かを決定しうる。非限定的な例において、ＰＧレベルを、１ラウンドの治療が終わった後、最初の６ヶ月にわたり毎週又は毎月決定することができる。他の間隔も可能である。
【００７０】
抗ＰＧ抗体を使用した１ラウンドの治療を含む実施態様において、１つ又は複数の測定値を、また、治療の経過の間に取ってもよく、ＰＧレベルに対する抗体の効果を推定することができる。他のそのような実施態様において、残留抗ＰＧ抗体がサンプリングの間に患者において存在する場合、データは、抗体によるＰＧの隔離に起因するＰＧレベルにおける低下を示すことがあり、この効果が軽減するにつれて上昇が続き、処置が効果的である場合にはその後の減退が続く。さらに他の実施態様において、治療後の測定値を、抗ＰＧ抗体が患者から取り除かれたことを推定した後に取ることができ、そのような抗体によるＰＧの結合がＰＧ濃度の測定の精度に影響を及ぼさないようにする。
【００７１】
異なるベースラインを使用してもよく、それに対して、患者において検出されたＰＧレベルを比較する。一部の実施態様において、ベースラインを、同じ患者からの以前の測定値（所定の間隔で取られうる）により確立する。非限定的な例において、ＰＧレベルを、処置の終了後、最初の６ヶ月にわたり毎週又は毎月、次に、処置の終了の２周年目まで３ヶ月毎、次に、その後、６ヶ月又は１年毎に決定することができる。他の間隔も可能である。
【００７２】
他の実施態様において、ベースラインは、モニタリングを受けている患者のものと同様の特徴を伴う患者の集団における平均ＰＧレベルから確立することができる。そのような特徴は、しかし、必ずしも限定しないが、性、年齢、原発癌の型、特定の型の処置へ曝露、これらの任意の組み合わせ、及びその他を含みうる。さらなる他の実施態様において、１を上回るベースラインを特定の患者のモニタリングにおいて使用することができる。例えば、患者に特異的なベースライン、ならびに集団に由来するベースラインの両方を使用することができる。
【００７３】
一部の実施態様において、以前に処置された癌患者における平均ＰＧ濃度が、患者が比較されている関連集団についての正常範囲にあり、定常なままである場合、患者は転移を有さないとしてスコア化されうるが、このように、新たな処置を要求しない。対照的に、ＰＧ濃度が、以前に処置された癌患者において期間にわたり上昇するらしく、そして特定の実施態様において、集団データに由来する閾値を超える場合、患者は恐らくは転移を有するとしてスコア化され、このように、転移癌に対する新たな処置のための候補となりうる。
【００７４】
なぜなら、摂食は、通常、ガストリン合成及び分泌を増加させるため、それは血液ＰＧレベルにおける一過性の増加を起こしうるが、それは治療的効力について、及び転移の存在についてモニターされている患者においてＰＧの正確な測定に干渉しうる。この効果を回避するために、特に血液サンプル中のＰＧ濃度を決定すべき場合、サンプルを、絶食後に患者から取ることができる。
【００７５】
７．９ 抗ＰＧ抗体
本明細書に開示する方法において有用な抗体は、ガストリン遺伝子の他の産物を上回りヒトプロガストリンに特異的に結合するものである。図１を参照すると、ガストリン遺伝子は、１０１アミノ酸ポリペプチド（プレプロガストリンと呼ばれる）に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン（８０アミノ酸ポリペプチド）を生じるシグナル配列（下線）を含む。プロガストリンは、順に、切断されて、３４アミノ酸産物（配列において、プロガストリンの残基３８−７１に対応する）を生成し、それは、次に、グリシン残基を用いてそのカルボキシ末端で伸長されて、グリシン伸長Ｇ３４（「Ｇ３４−Ｇｌｙ」）を生成する。この切断の副産物は、６アミノ酸ペプチド（Ｃ末端隣接ペプチド、又はＣＴＦＰと呼ばれる）であり、それは、配列において、プロガストリンの残基７５−８０に対応する。Ｇ３４−Ｇｌｙは、次に、さらに切断されて、配列において、プロガストリンの残基５５−７１に対応し、Ｇ１７−Ｇｌｙとして言及される１７残基ポリペプチドを生成する。Ｇ３４−Ｇｌｙ及びＧ１７−ＧｌｙのＣ末端グリシンの除去、それに続くＣ末端アミド化は、それぞれＧ３４及びＧ１７をもたらし、それらの両方がＣ末端アミド化されている。
【００７６】
本明細書において使用する通り、抗体は、それが全長プロガストリンに結合するが、しかし、ＣＴＦＰ、アミド化ガストリン、又はグリシン伸長ガストリンには全く結合しない場合、ｈＰＧ「について高度に特異的」又はｈＰＧに「高度に特異的に結合する」、及び、それがＣＴＦＰ及びガストリン遺伝子の他の産物よりも少なくとも約５倍大きなｈＰＧの結合を示す場合（標準的な結合アッセイにおいて測定した通り）、ｈＰＧ「について特異的」又はｈＰＧに「特異的に結合する」。特定の抗ｈＰＧ抗体の特異性を評価するために使用することができる特定のＥＬＩＳＡアッセイが、実施例２に提供される。
【００７７】
そのような高度に特異的及び／又は特異的な抗ｈＰＧ抗体（本明細書において「抗ｈＰＧ抗体」として言及される）は、ポリクローナル（「抗ｈＰＧ ＰＡｂ」）又はモノクローナル（「抗ｈＰＧ ＭＡｂ」）であるが、治療的使用、一部の例において、診断又は他のインビトロでの使用のために、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７８】
抗ｈＰＧ抗体により結合されるエピトープは決定的ではない。有用な抗ｈＰＧ抗体は、ｈＰＧのＮ末端領域、ｈＰＧのＣ末端領域、又はｈＰＧの異なる領域に結合しうる。近年、少なくともモノクローナル抗ｈＰＧ抗体について、抗ｈＰＧ抗体を産生するために使用される抗原の選択が重要でありうることが発見されている（国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００６３２９号（２０１０年１０月１５日出願）及び米国出願第１２／９０６，０４１号（２０１０年１０月１５日出願）、その開示及び具体的に開示される抗ｈＰＧ抗体が参照により本明細書において組み入れられる；以下、‘３２９及び‘０４１出願としてそれぞれ言及される）。‘３２９及び‘０４１出願において開示される通り、ｈＰＧに由来する全ての抗原が、生理学的条件下でｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体の産生を刺激するわけではない。実際に、ポリクローナル抗ｈＰＧ抗体を成功裏に産生するために使用されてきた特定の抗原（例えば全長組換えｈＰＧ（例、ＷＯ０８／０７６４５４ Singhを参照のこと）及びｈＰＧのＣ末端の最後の１０アミノ酸に対応するペプチド（ＷＯ０７／１３５５４２ Hollande et al.を参照のこと）など）は、モノクローナル抗体の生成に失敗した。‘３２９及び‘０４１出願において記述される通り、ｈＰＧ配列内の抗原性Ｎ末端及びＣ末端配列が同定されており、ｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するために使用することができる。興味深いことに、抗原性配列は、それに固有であるｈＰＧ配列の領域に限定する必要はない。ガストリン遺伝子の他の産物と共通の配列の領域を有するペプチド抗原（例えば、Ｇ１７、Ｇ３４、及びＣＴＦＰ）は、ｈＰＧに結合するだけでなく、しかし、それに特異的に結合するモノクローナル抗体をもたらす。
【００７９】
ｈＰＧのＮ末端領域に対応する配列を有するペプチド抗原を使用して入手可能であり及び／又はｈＰＧのＮ末端領域に結合する抗ｈＰＧ抗体を、本明細書において「Ｎ末端抗ＰＧ抗体」として言及する。ｈＰＧについて特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を得るために適した免疫原を構築するために使用することができるｈＰＧの特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基１〜１４：ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２５）に対応する。Ｎ末端抗ｈＰＧ抗体を得るために有用な例示的な免疫原、ならびに、これらの例示的な免疫原を用いて得られたＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＣＤＲならびにＶＨ及びＶＬ配列を以下の表１Ａ及び実施例のセクションに提供する：
【表１】
【００８０】
ｈＰＧのＣ末端領域に対応する配列を有するペプチド抗原を使用して入手可能であり及び／又はｈＰＧのＣ末端領域に結合する抗ｈＰＧ抗体を、本明細書において「Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体」として言及する。ポリクローナル及びモノクローナルＣ末端抗ｈＰＧ抗体の両方を得るために有用な免疫原を構築するために使用することができる特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基５５〜８０：ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号２７）に対応する。Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体を得るために有用なこの抗原を含む例示的な免疫原、ならびに、これらの例示的な免疫原を用いて得られたＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＣＤＲならびにＶＨ及びＶＬ配列を以下の表１Ｂ及び実施例のセクションに提供する。
【表２】
【００８１】
表１Ａ及び１Ｂに提供する例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ１−ＭＡｂ２３により結合される特定のエピトープは、ＳＰＯＴ技術及びアラニンスキャンを使用してマッピングされた（Laune et al., 2002, J. Immunol. Methods 267: 53-70及びLaune, 1997, J. Biol. Chem. 272: 30937-30944にそれぞれ記載される通り）（‘３２９出願の実施例６も参照のこと）。
【００８２】
ＳＰＯＴ技術において、推定エピトープに及ぶ１５のアミノ酸ペプチド配列を生成し、ニトロセルロース膜上にスポットし、それを、次に、テスト抗体でプローブし、抗体により認識される最小エピトープ配列を決定する。アラニンスキャンを使用して、抗体結合のために決定的であるエピトープ内の残基を決定する。推定エピトープ内の各残基が、１つずつ、アラニンに変異しており、アラニン含有ペプチドを、次に、テスト抗体を用いてプローブする。
【００８３】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ１−４及び１５−２０について、エピトープは少なくとも以下の配列を含む：ＤＡＰＬＧ（配列番号２８）、ＰＤＡＰＬＧ（配列番号２９）、ＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３０）、ＷＫＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３１）、又はＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号３２）（以下の表２Ａに示す通り）。
【表３】
【００８４】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５−７、９−１２、１４、及び２１−２３について、エピトープは少なくとも以下の配列を含む：ＦＧＲＲ（配列番号３３）、ＭＤＦＧＲ（配列番号３４）、ＡＥＤＥＮ（配列番号３５）、及びＧＷＭＤＦＧＲＲ（配列番号３６）（以下の表２Ｂに示す通り）。
【表４】
【００８５】
エピトープマッピング実験では、抗ｈＰＧ ＭＡｂ２及びＭＡｂ４が同じエピトープに結合することが明らかになる；抗ｈＰＧ ＭＡｂ１及びＭＡｂ３はほぼ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、及びＭＡｂ２０はほぼ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ１５及びＭＡｂ１６はほぼ同じエピトープに結合する；抗ｈＰＧ ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ９、及びＭＡｂ１２は同じエピトープに結合し、抗ｈＰＧ ＭＡｂ１０とほぼ同じエピトープに結合する；ならびに抗ｈＰＧ ＭＡｂ１１及びＭＡｂ１４はほぼ同じエピトープに結合する。
【００８６】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＮ末端抗ＰＧ抗体の特定の実施態様は、ｈＰＧの残基１０〜１４（配列番号２８）、ｈＰＧの残基９〜１４（配列番号２９）、ｈＰＧの残基４〜１０（配列番号３０）、ｈＰＧの残基２〜１０（配列番号３１）、又はｈＰＧの残基２〜１４（配列番号３２）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００８７】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＣ末端抗ＰＧ抗体の特定の実施態様は、ｈＰＧの残基７１〜７４（配列番号３３）、ｈＰＧの残基６９〜７３（配列番号３４）、ｈＰＧの残基７６〜８０（配列番号３５）、又はｈＰＧの残基６７〜７４（配列番号３６）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００８８】
本明細書に開示する方法及びキットにおいて有用なＮ末端及びＣ末端抗ｈＰＧ抗体は、表１Ａ＆１Ｂに提供するものに加えて、例示的なＭＡｂ１−２３を用いた、あるいはＮ又はＣ末端エピトープに結合する他の参照抗体を用いた競合結合アッセイにおいて同定することができる（後のセクションにおいてより詳細に記載する通り）。
【００８９】
‘３２９及び‘０４１出願においても報告される通り、全ての抗ｈＰＧ抗体（ｈＰＧについて高い程度の特異性及び親和性を示すものでさえ）が、ｈＰＧの生物学的活性を中和するわけではないであろう。例えば、抗ｈＰＧ ＭＡｂ１４は約６pMのＫＤでｈＰＧに結合するが、それはインビトロアッセイにおいて結腸直腸癌細胞の成長を阻害しなかったのに対し、他の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は有意な阻害活性を示した（例、‘３２９出願の実施例７を参照のこと）。ｈＰＧに特異的に結合する非中和及び中和抗体の両方が本明細書に記載する種々の診断及びモニタリング方法のために有用であるが、治療方法のために有用な抗ｈＰＧ抗体は中和活性を示すはずである。
【００９０】
本明細書において使用する通り、「中和性抗ｈＰＧ抗体」は、非特異的抗体を用いて処理したコントロールサンプルと比較して、抗ｈＰＧ抗体を用いて処理したテストサンプル中の生きたＢｘＰＣ ３細胞の数における統計的に有意な低下をもたらす抗ｈＰＧ抗体である。任意の特定の抗ｈＰＧ抗体がｈＰＧを中和する能力を評価するための特定のアッセイが、実施例３に記載される。このアッセイにおいて生細胞の数における少なくとも約５０%低下を示すそれらの抗ｈＰＧ抗体は、膵臓癌を処置する際に特に有用であると考えられるが、このアッセイにおける生細胞の数におけるより低いレベルの中和活性、例えば、４０%、３０%、２０%、１５%、又はさらには１０%の統計的に有意な低下を示す抗ｈＰＧ抗体が治療的利益を提供することが期待される。
【００９１】
したがって、一部の実施態様、例えば、治療的な実施態様において、有用な抗ｈＰＧ抗体は中和性である。‘３２９及び‘０４１出願において開示される通り、抗ｈＰＧモノクローナル抗体の能力は、エピトープ依存的ではない。なぜなら、Ｎ末端及びＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体の両方が、膵臓癌細胞を用いたアッセイにおいて中和活性を示したからである。このように、一部の特定の実施態様において、中和性抗ｈＰＧ抗体はＮ末端中和性抗ｈＰＧ抗体である。他の実施態様において、中和性抗ｈＰＧ抗体はＣ末端中和性抗ｈＰＧ抗体である。
【００９２】
任意の特定の抗ｈＰＧ抗体の親和性は決定的ではない。しかし、一部の使用のために、少なくとも約１μMの親和性を示す抗体が好まれうる。治療的使用のために、少なくとも約９０nM、８０nM、７０nM、６０nM、５０nM、４０nM、３０nM、２０nM、１５nM、１０nM、７nM、６nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、０．１nM、０．０１nM又はさらに大きい親和性が望まれうる。表１Ａ＆１Ｂにおいて同定された抗ｈＰＧモノクローナル抗体の測定された親和性は、１０−６〜１０−１２Mの範囲である（以下の表３に記述する通り）：
【表５】
【００９３】
特定の所望の適用のために特に適する親和性を有する抗ＰＧモノクローナル抗体を、これらの間より容易に選択する、あるいは、本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体の種々の免疫原、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）配列を使用して生成又は設計することができる。任意の特定の抗ＰＧモノクローナル抗体の親和性は、当技術分野において周知の又は本明細書に記載する技術（例えばＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は蛍光偏光アッセイなど）を使用して決定することができる。特定のアッセイを実施例４に提供する。
【００９４】
表１Ａ＆１Ｂに記述する通り、いくつかのＮ末端及びＣ末端モノクローナル抗ｈＰＧ抗体が同定されている。これらの抗体の全てがｈＰＧについて特異的であり、ＭＡｂ１４の例外を伴い、全てが結腸直腸癌細胞を用いたテストにおいて中和活性を示した。膵臓癌細胞を用いてテストした抗体の全て（ＭＡｂ ８、１３、１６、及び１９）が、中和活性を示した。抗体を得るための有用なハイブリドーマのいくつかが、２０１０年１０月６日に、ブダペスト条約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganisms（ＣＮＣＭ）に寄託された。抗ｈＰＧ ＭＡｂ１−２３を産生するハイブリドーマの指定名称及び寄託されたそれらのハイブリドーマの寄託登録番号を表１Ａ＆１Ｂに提供する。また、抗体のいくつかについて、それらの可変重鎖（ＶＨ）、可変軽鎖（ＶＬ）、ＶＬ相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列が決定されている。これらのアミノ酸配列、及び開示を通じてそれらを参照するために使用される省略命名法も表１Ａ＆１Ｂに提供する。簡単には、マウス重鎖及び軽鎖可変ドメインは、本明細書においてｍＶＨ及びｍＶＬとして言及され、対応するモノクローナル抗体の番号が続く（例えば、抗ｈＰＧ ＭＡｂ３の可変軽鎖及び可変重鎖についてそれぞれｍＶＨ．３及びｍＶＬ．３）。同様に、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメインは、本明細書においてｈＶＨ及びｈＶＬとして言及され、対応するモノクローナル抗体の番号が続く。３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変軽鎖ＣＤＲは、それぞれＶＨ ＣＤＲ１、２、又は３及びＶＬ ＣＤＲ１、２、又は３として言及され、特定の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の番号が続く。例えば、ＭＡｂ３のＶＨ ＣＤＲ１はＶＨ ＣＤＲ１．３と表示され、及び、ＭＡｂ３のＶＬ ＣＤＲ １はＶＬ ＣＤＲ１．３と表示される。ＭＡｂ３のＶＨ ＣＤＲ２はＶＨ ＣＤＲ２．３と表示され、及び、ＭＡｂ３のＶＬ ＣＤＲ２はＶＬ ＣＤＲ２．３と表示される。
【００９５】
ほぼ同じエピトープに結合する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の対応するＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ鎖を交換して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な新たな抗ｈＰＧモノクローナル抗体をもたらしうることが期待される。例えば、上に記述する通り、例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５及びＭＡｂ６は同じエピトープに結合する。そのＶＬ鎖において、これらの２つの抗体のＶＬ ＣＤＲの種々の組み合わせ、及び／又は、そのＶＨ鎖において、これらの２つの抗体のＶＨ ＣＤＲの種々の組み合わせを含む抗ｈＰＧモノクローナル抗体を設計することができる。可能な種々の組み合わせを例証するための特定の非限定的な例として、そのような抗体は、そのＶＬ鎖において、ＭＡｂ５のＣＤＲ１及び２（それぞれＶＬ ＣＤＲ １．５及びＶＬ ＣＤＲ ２．５）ならびにＭＡｂ６のＣＤＲ３（ＶＬ ＣＤＲ ３．６）、及び、そのＶＨ鎖において、ＭＡｂ６のＣＤＲ１（ＶＨ ＣＤＲ １．６）ならびにＭＡｂ５のＣＤＲ２及び３（それぞれＶＨ ＣＤＲ ２．５及びＶＨ ＣＤＲ ３．５）を含みうる。寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体のＣＤＲのアミノ酸配列（超可変領域としても公知）は、従来の手段を使用して得ることができる。
【００９６】
当技術分野において公知の通り、抗体の超可変領域を描写するアミノ酸位置／境界は、状況及び当技術分野において公知の種々の定義に依存して変動しうる。可変ドメイン内の一部の位置を、ハイブリッド超可変位置として見なしてもよく、それにおいて、これらの位置は、１セットの基準下で超可変領域内と見なすことができ、異なるセットの基準下で超可変領域外と見なす。これらの位置の１つ又は複数は、また、伸長した超可変領域において見出すことができる。本明細書に記載する抗ＰＧ抗体は、これらのハイブリッド超可変位置において改変を含みうる。天然重及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置（３つのＣＤＲにより連結され、それは、βシート構造を連結し、一部の場合において、その一部を形成するループを形成する）を採用することにより、各々、４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域により近接して、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順番で、他の鎖からのＣＤＲと一緒に保持され、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md.1987を参照のこと）。本明細書において使用する通り、免疫グロブリンのアミノ酸残基のナンバリングを、他に示さない場合、Kabat et al.の免疫グロブリンのアミノ酸残基ナンバリングに従って行う。
【００９７】
表１Ａを参照して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＮ末端抗ｈＰＧ抗体の特定の実施態様は、限定しないが、以下を含む：
（ａ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ ＣＤＲに対応するＶＬ ＣＤＲ、及び、配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＨ ＣＤＲに対応するＶＨ ＣＤＲを有する抗体；
（ｂ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ及びＶＨ ＣＤＲに対応するＶＬ ＣＤＲ及びＶＨ ＣＤＲを有する抗体；
（ｃ）抗体、それにおいて：
（ｉ）ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（「ＶＬ ＣＤＲ １．３」；配列番号４）、ＱＳＬＶＨＳＳＧＶＴＹ（「ＶＬ ＣＤＲ １．４」；配列番号１０）、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ ＣＤＲ １．１６」；配列番号５０）、及びＳＱＨＲＴＹＴ（「ＶＬ ＣＤＲ １．１９」；配列番号５１）より選択される；
（ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ２はＫＶＳ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．３」又は「ＶＬ ＣＤＲ ２．４」；配列番号５）、ＬＶＳ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．１６」；配列番号５３）、及びＶＫＫＤＧＳＨ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．１９」；配列番号５４）より選択される；
（ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３はＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．３」；配列番号６）、ＳＱＳＴＨＶＰＰＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．４」；配列番号１１）、ＷＱＧＴＨＳＰＹＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．１６」；配列番号５７）、及びＧＶＧＤＡＩＫＧＱＳＶＦＶ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．１９」；配列番号５８）より選択される；
（ｉｖ）ＶＨ ＣＤＲ１はＧＹＩＦＴＳＹＷ（「ＶＨ ＣＤＲ １．３」；配列番号１）、ＧＹＴＦＳＳＳＷ（「ＶＨ ＣＤＲ １．４」；配列番号７）、ＧＹＴＦＴＳＹＹ（「ＶＨ ＣＤＲ １．１６」；配列番号３９）、及びＧＹＳＩＴＳＤＹＡ（「ＶＨ ＣＤＲ １．１９」；配列番号４０）より選択される；
（ｖ）ＶＨ ＣＤＲ２はＦＹＰＧＮＳＤＳ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．３」；配列番号２）、ＦＬＰＧＳＧＳＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．４」；配列番号８）、ＩＮＰＳＮＧＧＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．１６」；配列番号４３）、及びＩＳＦＳＧＹＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．１９」；配列番号４４）より選択される；及び
（ｖｉ）ＶＨ ＣＤＲ３はＴＲＲＤＳＰＱＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．３」；配列番号３）、ＡＴＤＧＮＹＤＷＦＡＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．４」配列番号９）、ＴＲＧＧＹＹＰＦＤＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．１６」；配列番号４７）、及びＡＲＥＶＮＹＧＤＳＹＨＦＤＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．１９」；配列番号４８）より選択される；
（ｄ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬに対応するＶＬ、及び、配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＨに対応するＶＨを有する抗体；及び
（ｅ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ及びＶＨに対応するＶＬ及びＶＨを有する抗体。
【００９８】
表１Ｂを参照すると、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＣ末端抗ｈＰＧ抗体の特定の実施態様は、限定しないが、以下を含む：
（ｆ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ ＣＤＲに対応するＶＬ ＣＤＲ、及び、配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＨ ＣＤＲに対応するＶＨ ＣＤＲを有する抗体；
（ｇ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ及びＶＨ ＣＤＲに対応するＶＬ ＣＤＲ及びＶＨ ＣＤＲを有する抗体；
（ｈ）抗体、それにおいて：
（ｉ）ＶＬ ＣＤＲ１はＫＳＬＲＨＴＫＧＩＴＦ（「ＶＬ ＣＤＲ １．８」；配列番号４９）及び ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ ＣＤＲ １．１３」；配列番号５０）より選択される；
（ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ２はＱＭＳ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．８」；配列番号５２）及び ＬＶＳ（「ＶＬ ＣＤＲ ２．１３」；配列番号５３）より選択される；
（ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３はＡＱＮＬＥＬＰＬＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．８」；配列番号５５）及び ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ（「ＶＬ ＣＤＲ ３．１３」；配列番号５６）より選択される；
（ｉｖ）ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＴＴＹＡ（「ＶＨ ＣＤＲ １．８」；配列番号３７）及び ＧＦＩＦＳＳＹＧ（「ＶＨ ＣＤＲ １．１３」；配列番号３８）より選択される；
（ｖ）ＶＨ ＣＤＲ２はＩＳＳＧＧＴＹＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．８」；配列番号４１）及び ＩＮＴＦＧＤＲＴ（「ＶＨ ＣＤＲ ２．１３」；配列番号４２）より選択される；及び
（ｖｉ）ＶＨ ＣＤＲ３はＡＴＱＧＮＹＳＬＤＦ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．８」；配列番号４５）及び ＡＲＧＴＧＴＹ（「ＶＨ ＣＤＲ ３．１３」；配列番号４６）より選択される；
（ｉ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬに対応するＶＬ、及び、配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＨに対応するＶＨを有する抗体；及び
（ｊ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ及びＶＨに対応するＶＬ及びＶＨを有する抗体。
【００９９】
当業者により理解される通り、診断方法において有用な抗ｈＰＧ抗体は、任意の起源（例えば、哺乳動物（例、ヒト、霊長類、げっ歯類、ヤギ、又はウサギ）、非哺乳動物、又は自然におけるキメラ（１を上回る種に由来する）を含む）でありうる。動物（ヒトを含む）における治療的使用のために適した抗体は、好ましくは、処置されることが意図される同じ種に由来する、あるいは、改変又は設計され、非免疫原性である、又は処置されている動物において低下した免疫原性を有する。ヒトにおける治療的使用のために有用な抗ｈＰＧ抗体の特定のクラスは、ヒト化抗体のクラスであり、以下により詳細に考察する。本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な抗ｈＰＧ抗体は、また、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ（例、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、又はＩｇＭを含む）でありうる、又はそれに由来しうる。治療的使用のために設計された抗ｈＰＧ抗体は、好ましくは、ＩｇＧアイソタイプである。
【０１００】
一部の実施態様において、本明細書に記載する治療的方法のために有用な抗ｈＰＧ抗体はヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、それにおいて、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであり、「ＣＤＲ移植」として言及することができる。ヒト化抗体は、また、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものを含むことができる。抗体をヒト化するための方法（ヒト化抗体を設計するための方法を含む）は、当技術分野において周知である。例えば、Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77；Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111；Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-7；米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号、Queen et al.；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Padlan, 1991, Mol. Immunol. 28: 489-498;Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7: 805-814；Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973；及び米国特許第５，５６５，３３２号（その開示は、その全体において参照により本明細書により組み入れられる）。
【０１０１】
非ヒト抗ｈＰＧ抗体のＣＤＲに対応するＣＤＲ配列を有する抗体のヒト化バージョン（例として、限定しないが、表１Ａに提供する種々のＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び表１Ｂに提供する種々のＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体を含む）を、これらの周知の方法を使用して得ることができる。選択された抗ｈＰＧ抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨ鎖の予測配列を、表１Ａ及び１Ｂに提供する。ヒト化抗体の特定の例は、以下を含む抗体を含む：
（ｋ）本明細書に開示される任意の３つのＶＬ ＣＤＲ及び任意の３つのＶＨ ＣＤＲ；
（ｌ）配列番号２１に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｍ）配列番号２３に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｎ）配列番号７５、７７、及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７６及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｏ）配列番号８０及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８１及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｐ）配列番号８４、８６、及び８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８５、８７、及び８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；及び
（ｑ）配列番号９０、９２、及び９４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号９１、９３、及び９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【０１０２】
当業者により認識される通り、特定の結合特性（例えば、目的の特定のエピトープに結合する能力など）を有する抗ｈＰＧ抗体は、本明細書に記載する種々の抗原及び免疫原を使用し、目的の参照抗体とｈＰＧ結合について競合するそれらの能力を評価して容易に得ることができる。本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体のいずれかを、そのような競合アッセイにおける参照抗体として利用することができる。目的のビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体を用いてｈＰＧ結合について競合する抗体の能力を評価するために有用な特定のアッセイを、実施例５に提供する。
【０１０３】
参照抗ｈＰＧ抗体と任意のテスト抗体（種又はアイソタイプと無関係）の間での抗体競合試験を行う際、最初に、参照を、直接的（例えばラジオアイソトープ又はフルオロフォアなど）又は間接的（例えばビオチン（蛍光標識ストレプトアビジンとの結合を介して検出可能）又は酵素（酵素反応を介して検出可能）など）のいずれかで検出可能な標識を用いて標識し、その後の同定を可能にしうる。この場合において、標識参照抗ｈＰＧ抗体（固定又は増加濃度で）を、既知量のｈＰＧを用いてインキュベートし、ｈＰＧ：標識抗ｈＰＧ抗体複合体を形成する。非標識テスト抗体を、次に、複合体に加える。複合標識の強度を測定する。テスト抗体が、重複するエピトープに結合することにより、ｈＰＧについて標識参照抗ｈＰＧ抗体と競合する場合、複合標識の強度は、テスト抗体の非存在において行うコントロール実験と比べて減少する。
【０１０４】
結合競合アッセイを行うための多数の方法が公知であり、適応し、上に及び実施例５に記載されるアッセイと同等の結果をもたらすことができる。
【０１０５】
抗体は、それが、競合結合アッセイ、及び、具体的には、実施例５の競合結合アッセイにおいて参照抗ｈＰＧ抗体のｈＰＧへの結合を、少なくとも５０%だけ（より高いレベルの低下、例えば６０%、７０%、８０%、９０%、又はさらには１００%が望まれうる）、テスト抗体濃度の範囲０．０１−１００μg/mL（例、０．０１μg/mL、０．０８μg/mL、０．４μg/mL、２μg/mL、１０μg/mL、５０μg/mL、又は１００μg/mL、あるいは記述する範囲内の他の濃度）で低下させる場合、参照抗ｈＰＧ抗体とｈＰＧ結合について競合すると考えられ、このように、参照抗ｈＰＧ抗体とほぼ同じ又は重複するｈＰＧのエピトープに結合すると考えられる。
【０１０６】
当業者は、一部の状況、例えば、診断及びモニタリングの状況において、抗ＰＧ抗体を標識することが望まれうることを理解するであろう。そのような標識は検出及び定量化のために有用である。適した標識が当技術分野において周知であり、それらが直接的に観察可能又は検出可能である点で「直接的」（例えば、フルオロフォア又はラジオアイソトープ）、あるいは、それらが観察可能又は検出可能なシグナルを産生する何か他のものと相互作用する点で間接的（例えば、基質上で作用し、検出可能なシグナルを産生する酵素、又は、結合分子、例えば、標識したストレプトアビジン分子に結合するビオチンなど）でありうる。多数の標識システム、ならびにそれらを用いて抗体を標識するための手段が、当技術分野において公知であり、本明細書において使用のために熟慮される。
【０１０７】
本明細書に記載する方法において有用な種々の抗ｈＰＧ抗体は、全長抗体を用いて例示されてきたが、当業者は、結合フラグメント、あるいは全長抗体又は結合フラグメントから設計される又はそれに由来するサロゲート抗体も使用してもよいことを理解するであろう。適したフラグメント、サロゲートなどは、限定しないが、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｖＩｇＧ、ｓｃＦｖフラグメント及びサロボディを含む。他に特定しない場合、用語「抗体」は、本明細書において使用する通り、全ての形態の抗体及び「抗体様」サロゲート分子（一本鎖抗体、サロボディ、及び結合フラグメントを含む）を含むことを意図する。自然発生する抗体に典型的な構造を有する抗体は、本明細書において「天然抗体」として言及される。
【０１０８】
７．１０ 抗ＰＧ抗体を産生する方法
本明細書に記載する方法において有用な抗ＰＧ抗体を、標準的な周知の方法を使用して得てもよい。本明細書に記載する方法において有用な抗ＰＧ抗体を発現するために、部分又は全長の軽及び重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、遺伝子が、転写及び翻訳制御配列に操作的に結合されるようにする。この状況において、用語「操作的に結合される」は、抗体遺伝子がベクター中に連結され、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図される機能を果たすようにすることを意味することを意図する。発現ベクター及び発現制御配列を選び、使用する発現宿主細胞と適合させる。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子を別々のベクター中に挿入することができる。又は、より典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入する。
【０１０９】
抗体遺伝子を発現ベクター中に標準的な方法（例、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補的制限部位の連結、又は、制限部位が存在しない場合、平滑末端連結）により挿入する。抗ＰＧ抗体の軽又は重鎖配列の挿入前に、発現ベクターは既に抗体定常領域配列を保有することができる。例えば、抗ＰＧ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を全長抗体遺伝子に変換する１つのアプローチは、それらを、重鎖定常及び軽鎖定常領域をそれぞれ既にコードする発現ベクター中に挿入することであり、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作的に結合され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作的に結合されるようにする。加えて又は代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子をベクター中にクローン化することができ、シグナルペプチドをインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に結合するようにする。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）でありうる。
【０１１０】
抗体鎖遺伝子に加えて、開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)に記載されている。発現ベクターの設計（調節配列の選択を含む）は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存しうることが当業者により理解されうる。哺乳動物宿主細胞発現のための適した調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現に向けるウイルスエレメント、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなどを含む。ウイルス調節エレメント及びその配列のさらなる記載については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号（Stinskiによる）、米国特許第４，５１０，２４５号（Bell et al.による）、及び米国特許第４，９６８，６１５号（Schaffner et al.による）を参照のこと。
【０１１１】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子などを保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進させる（例、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、及び第５，１７９，０１７号（全てAxel et al.による）を参照のこと）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、薬物（例えばＧ４１８、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなど）への耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。適した選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うＤＨＦＲ宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。軽及び重鎖の発現のために、重及び軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技術により宿主細胞中にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核又は真核宿主細胞中への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。
【０１１２】
原核又は真核生物のいずれかの宿主細胞において本明細書に記載する抗体を発現させることが可能である。特定の実施態様において、抗体の発現が、適切に折り畳まれた、免疫学的に活性な抗体の最適な分泌のために、真核細胞（例、哺乳動物宿主細胞）中で実施される。開示の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Urlaub & Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されるＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含み、例えば、Kaufman & Sharp, 1982, Mol. Biol. 159: 601-621に記載される通りにＤＨＦＲ選択可能なマーカーと使用される）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、及びＳＰ２／０細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞が成長する培養培地中への抗体の分泌を許すために十分な期間にわたり宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。宿主細胞は、また、インタクトな抗体の部分（例えばＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖ分子など）を産生するために使用することができる。上の手順のバリエーションは本開示の範囲内であることが理解される。例えば、本明細書中に記載する抗ＰＧ抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（両方ではない）をコードするＤＮＡを用いて宿主細胞をトランスフェクトすることが望まれうる。
【０１１３】
組換えＤＮＡテクノロジーを使用し、ＰＧへの結合のために必要ではない軽及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全てを除去することもできる。そのような切断ＤＮＡ分子から発現される分子は、また、本明細書に記載する方法において有用である。
【０１１４】
抗ＰＧ抗体の組換え発現のために、宿主細胞を、２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１ベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２ベクターを用いてコトランスフェクトすることができる。典型的には、２つのベクターは、各々、別々の選択可能なマーカーを含む。あるいは、重及び軽鎖の両方のポリペプチドをコードする単一のベクターを使用することができる。
【０１１５】
抗ＰＧ抗体を化学合成により産生することもできる（例、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.に記載される方法による）。種々の抗体を、また、無細胞プラットフォームを使用して生成することができる（例、Chu et al., 2001, Biochemia No. 2 (Roche Molecular Biologicals)を参照のこと）。
【０１１６】
一旦、抗ＰＧ抗体が組換え発現又は合成手段により産生されれば、それは、免疫グロブリン分子の精製のための当該分野において公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ又はプロテインＧ選択後のＰＧについての親和性により、及びサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差により、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により精製することができる。さらに、抗ＰＧ抗体又はその結合フラグメントを、本明細書に記載する又は当技術分野において他で公知の異種ポリペプチド配列に融合し、精製を促進することができる。
【０１１７】
８．実施例
８．１ 実施例１：血漿又は血清ＰＧレベルの定量化
ＰＧの血漿及び／又は血清レベルは、以下のアッセイを使用して便利に決定することができる。９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．５〜１０μg/mLのＣ末端抗ｈＰＧ抗体、例えば、ウサギＣ末端抗ｈＰＧポリクローナル抗体、又はＣ末端抗ｈＰＧ抗体（本明細書に記載する）を用いてコーティングし、次に、一晩インキュベートする。プレートを、次に、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中で３回洗浄し、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中の２%（ｗ／ｖ）脱脂乾燥ミルクを用いてブロックする。別々に、テストサンプル、コントロールサンプル（ブランク又はＰＧ陰性血漿又は血清サンプル）、及び約５ｐＭ（０．５×１０−１１M）〜約０．１nM（１×１０−１０M）のｈＰＧ参照基準（ＰＧ陰性血漿又は血清中で希釈した凍結乾燥ｈＰＧ）を適切な希釈剤（例、ＰＢＳ−TWEEN ０．０５%）中で調製する。サンプルを、コーティングしたプレート上で２〜４時間にわたり３７℃で、又は、あるいは、１２〜１６時間２１℃でインキュベートする。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）を用いて３回洗浄し、０．００１〜０．１μg/mLのＮ末端抗ｈＰＧ抗体、例えば、ポリクローナルＮ末端抗ｈＰＧ抗体又はＮ末端モノクローナル抗ｈＰＧ抗体（本明細書に記載する）を用いてインキュベートし、２１℃で３０分間にわたり西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091を参照のこと）に共役させる。プレートを次にＰＢＳ−TWEEN（０．０５%）中で３回洗浄し、ＨＲＰ基質を２１℃で１５分間にわたり加える。反応を、１００μLの０．５M硫酸を加えることにより停止させ、光学密度測定値を４０５nMで取る。テストサンプルｈＰＧレベルを、ｈＰＧ参照基準に由来する測定値から構築された標準曲線との比較により決定する。
【０１１８】
８．２ 実施例２：抗ｈＰＧ抗体の特異性を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイ
抗ｈＰＧ抗体の特異性を、以下の通りにＥＬＩＳＡアッセイを使用して便利に決定することができる。９６ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の適切な濃度のテストポリペプチド（例、２５及び５０ngの組換えヒトＰＧ、ならびに５０及び２５０ngのＣＴＦＰ又は他のガストリン由来の遺伝子産物）を用いて４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルを、洗浄溶液（ＰＢＳ及び０．１%TWEEN−20）を用いて３回洗浄し、次に１ウェル当たり１００μLのブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．１%TWEEN−２０、０．１%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物）を用いて２２℃で２時間にわたりインキュベートした。ブロッキング後、ウェルを３回洗浄し、アッセイする抗体（テスト抗体）を加える。１００μLのＰＢＳ中のテスト抗体（０．３〜１ng/mL）及び０．１%TWEEN−20を各ウェルに加える。プレートを次に２２℃で２時間にわたりインキュベートし、その後、テスト抗体溶液を捨て、洗浄工程（３×１００μLの洗浄溶液、上に記述する通り）後、二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼに共役させたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を含むブロッキング溶液を用いて置換する。二次抗体を用いた１時間のインキュベーション後、１００μLの基質溶液（例、Ｆａｓｔ ＯＰＤ、又はＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigma-Aldrich Co.から入手可能、製造者の指示に従って調製した）を各ウェルに加え、暗所で、２２℃で２０分間にわたりインキュベートした。反応は、５０μLの４N硫酸を加えることにより停止させ、触媒された基質の量を、４９２nmでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定する。基質変換は、抗原に結合した一次（テスト）抗体の量に比例する。実験を２通りに実行し、ＯＤ測定値を抗原濃度の関数としてプロットする。テスト抗体は、測定されたＯＤがｈＰＧについて０．２〜１．５の間であり、ＣＴＦＰ又は他のガストリン遺伝子由来ペプチドのいずれかを用いて、バックグラウンドを上回る統計的に有意なシグナルがない場合、ＰＧについて特異的であるとスコア化される（ここで、バックグラウンドはＰＢＳだけを含むコントロールウェルからの平均シグナルである）。
【０１１９】
８．３ 実施例３：抗ｈＰＧ抗体の中和性抗体を評価するためのアッセイ
特異的な抗ｈＰＧ抗体が中和性であるか否かを評価するための特定のテストを、以下の通りに実行することができる。ＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞を６ウェルプレートの６ウェル中に約１５０，０００個細胞／ウェルで播種する。細胞を、次に、テスト抗ｈＰＧ抗体又はコントロール抗体を用いて、約５μg/mLの抗体濃度で４８時間にわたり１２時間間隔で処理する。テスト抗体は、テスト抗体を用いて処理した細胞の数が、コントロールの非特異的抗体を用いて処理した細胞の数と比較して、生存細胞の数における少なくとも１０%の統計的に有意な低下を示す場合（両側マンホイットニー検定（差は、ｐ＜０．０５の場合に有意と考えられる）を使用する）、アッセイにおいて中和性であるとして定義される。全細胞数は、処理期間の開始時での細胞数について補正され、Ｔ０として言及される。
【０１２０】
８．４ 実施例４：抗ｈＰＧ抗体の親和性を評価するためのアッセイ
抗ｈＰＧ抗体の親和性定数は、Proteon Technique(BioRad)を使用して、Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383: 52-60（その全体において参照により本明細書により組み入れられる）に従って測定することができる。簡単には、マウス抗ＰＧ抗体について、抗マウスＩｇＧ抗体（５０μg/mL）を最初にセンサーチップ上にコーティングし、抗体の注射後にチップにより検出されたシグナルが１０，０００〜１１，５００応答単位（ＲＵ）の間に入ることを確認する。目的のマウス抗ｈＰＧ抗体（テスト抗体）を次に注射する（３０μg/mLの典型的な濃度で）。テスト抗体が十分に結合する場合、少なくとも５００ＲＵの追加シグナルが観察される。テスト抗体とｈＰＧの間での結合の時間経過を、次に、ｈＰＧの変動濃度、例えば、２００nM、１００nM、５０nM、２５nM、及び１２．５nMを注射し、結合のレベルを検出することにより得る。典型的には、いくつかのチャンネルが、単一の実験において並行して複数の抗体をテストするために利用可能であり、ｈＰＧの異なる濃度で並行して単一のテスト抗体の結合をアッセイすることを可能にする。１つのチャネルを、非特異的結合についてのコントロールとして、ｈＰＧに特異的ではないマウスモノクローナル抗体を用いて注射すべきである。別のチャネルを、バックグラウンドシグナルについてのベースラインとして、希釈緩衝液単独を用いて注射すべきである。一般的に、結合は、非特異的マウス抗体を用いて注射したチャネルにおいて検出可能ではない。この設定において高レベルの結合を示す抗体は、ｈＰＧによる捕捉モノクローナル抗体の飽和をもたらしうるが、より低いｈＰＧ濃度（５０nM、２５nM、１２．５nM、６．２５nM、及び３．１２５nM）に対してテストすることができ、より精度のよい測定を可能とする。
【０１２１】
親和性定数（ＫＤ）を、解離定数（ｋｄ）と結合定数（ｋａ）の間の比率として算出する。実験値は、結合測定値に基づく実験曲線及び理論上のプロファイルの間での統計的に関連する類似性を分析することにより検証することができる。
【０１２２】
非マウス抗ｈＰＧ抗体の親和性定数は、抗ｈＰＧテスト抗体の起源の種について特異的なＩｇＧを使用して同様のフォーマットにおいて評価することができる。
【０１２３】
８．５ 実施例５：参照抗ｈＰＧ抗体を用いた競合的結合を評価するためのアッセイ
目的の抗体（テスト抗体）が、ｈＰＧ結合について、ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体と競合するか否かを評価するための特定のアッセイを、以下の通りに実施することができる。９６ウェルプレートを、捕捉抗ｈＰＧ抗体（ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体により認識されるエピトープとは異なるｈＰＧのＮ又はＣ末端領域を認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体）を用いて、１〜１０μg/mLの範囲内で選ばれる濃度で、４℃で一晩コーティングする（０．１〜１μg/ウェル）。２２℃で２時間にわたるブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の０．１% TWEEN−２０、０．１%ＢＳＡ）を用いたブロッキング後、組換えｈＰＧを、１０pM〜１nM（１０〜１０００pg/ウェル）の間の範囲の濃度で加え、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。その後、ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体（又はビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体を含む混合物）を、増加濃度の非標識テスト抗体濃度と共に加え、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。非結合抗体を除去するための洗浄後、結合した標識参照抗ｈＰＧ抗体の検出を、混合物を、５０ng/mLのストレプトアビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰと２２℃で１時間にわたりインキュベーション、西洋ワサビペルオキシダーゼ用の蛍光基質との２２℃で１時間にわたるインキュベーション、及び、次に、ルミノメーターにおける相対的な光単位（ＲＬＵ）の定量化により実施する。アッセイは二重に実施する。
【０１２４】
参照抗ｈＰＧ抗体と競合する抗体は、ｈＰＧへの参照抗体の結合を阻害する。実質的に同一のエピトープに、又は重複するエピトープと参照抗体として結合する抗体は、結合した参照抗ｈＰＧ抗体の量を有意に（例えば、少なくとも５０%）低下させる（観察されたＲＬＵにおける低下により証明される通り）。
【０１２５】
高いコントロール値が、標識した参照抗体を、テスト抗体を伴わず、組換えｈＰＧとインキュベートすることにより行われるコントロール実験から得られる。低いコントロール値は、過剰濃度の非標識参照抗体（非標識参照抗体は、このように、ｈＰＧへの結合について標識抗体と競合する）の存在において、標識された参照抗体を、組換えｈＰＧを用いてインキュベートすることにより行われるコントロール実験から得られる。参照抗ｈＰＧ抗体と競合するテスト抗体の能力は、次に、標識した参照抗体を、増加濃度の非標識テスト抗体の存在下で組換えｈＰＧとインキュベートすることにより決定される。
【０１２６】
テストアッセイにおいて、テスト抗体の存在下で観察されるＲＬＵにおける有意な低下は、テスト抗体が、参照抗ｈＰＧ抗体と実質的に同じエピトープを認識することを示す。
【０１２７】
結合の阻害は阻害定数又はＫｉとして表現することができ、以下の式に従って算出される：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／［１＋（［参照抗ｈＰＧ Ａｂ濃度］／ＫＤ参照抗ｈＰＧ Ａｂ）］
式中、「ＩＣ５０」は、参照抗体の結合における５０%低下をもたらすテスト抗体の濃度であり、ＫＤ参照抗ｈＰＧ Ａｂは参照抗ｈＰＧ抗体の解離定数（ｈＰＧについてのその親和性の測定値）である。参照抗ｈＰＧ抗体（例えば、本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体の１つ）と競合する有用なテスト抗体は、典型的には、本明細書に記載するアッセイ条件下で１０pM〜１００nMの範囲のＫｉｓを有する。
【０１２８】
８．６ 実施例６：原発性及び転移性膵臓癌と診断された患者における血漿又は血清ガストリン濃度
この実施例では、原発性又は転移性のいずれかの膵臓癌と診断された患者がプロガストリンの上昇した血漿又は血清レベルを有することを実証する。
【０１２９】
８．６．１ 方法
血漿又は血清プロガストリン濃度を、健常個人（コントロールとして）において、及び膵臓癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、又は乳癌と診断された患者において測定した。健常コントロールサンプル（ｎ＝１０４）を血液バンクから得た。分析に含まれた患者の内、２５／３２の膵臓癌患者が転移性疾患を有したが、その内の１０人がそれらの原発性腫瘍を除去されていた。
【０１３０】
血漿又は血清プロガストリンレベルの定量化は、以下に予測的に記載するものと同様のプロガストリン特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して実施した。
【０１３１】
Nunc MaxiSORP 96ウェルプレートのウェルを、以下の通りに第１プロガストリン特異的抗体を用いてコーティングする。プロガストリンのカルボキシ末端領域について特異的な抗プロガストリンポリクローナル抗体を、ＭｉｌｌｉＱ水中の５０mM，ｐＨ ９．６炭酸／重炭酸ナトリウム緩衝液の溶液中に、濃度３μg/mLまで希釈する。合計１００μLの抗体溶液を、次に、９６ウェルプレートの各ウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートする。結合後、抗体溶液をウェルから除去し、それらを次に、１００μL洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ／０．１% TWEEN−20）を用いて３回洗浄する。合計１００μLのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ／０．１% TWEEN−20／０．１% ＢＳＡ）を次に各ウェルに加えて、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。ブロッキング緩衝液を次に除去し、ウェルを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄する。患者から単離された血漿又は血清サンプルを、ウェルに、容積１００μL中の希釈系列（典型的には１：１、１：２、１：５、及び１：１０希釈）において加えて、次に、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。血漿又は血清サンプルは、二重に分析する。
【０１３２】
アッセイは、また、２つの標準曲線を含む。第１の標準曲線を、組換えプロガストリンの希釈物を使用して、最終量１ng、０．５ng、０．２５ng、０．１ng、０．０５ng、０．０１ng、及び０ng/ウェルに調製する。第２の標準曲線は、陰性コントロールとしての役割を果たし、テストサンプルと同じ希釈で（即ち、１：１、１：２、１：５及び１：１０）、ブロッキング緩衝液中に希釈したプロガストリン陰性ヒト血清から調製する。あるいは、血漿サンプルをアッセイしている場合、第２の標準曲線は、陰性コントロールとしての役割を果たし、テストサンプルと同じ希釈で（即ち、１：１、１：２、１：５及び１：１０）、ブロッキング緩衝液中に希釈したプロガストリン陰性ヒト血漿から調製する。
【０１３３】
血漿又は血清サンプルを用いたインキュベーションが完了した後、ウェル内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液（１００μL/ウェル）を用いて３回洗浄し、その後、第１抗体に結合したプロガストリンを、プロガストリンについて特異的な第２抗体を使用して、以下の通りに検出する。
【０１３４】
プロガストリンのアミノ末端領域について特異的なビオチン共役抗プロガストリンポリクローナル又はモノクローナル抗体を、ブロッキング緩衝液中で、濃度０．１〜１０μg/mLまで、抗体に依存して希釈する。合計１００μLの抗体溶液を次に各ウェルに加えて、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。
【０１３５】
第２抗体結合が完了した後、プレートを、洗浄緩衝液（１００μL／ウェル）を用いて３回洗浄し、その後、１００μLのストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液（ブロッキング緩衝液中２５ng/mL）を各ウェルに加えて、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液を用いたインキュベーションが完了した後、プレートを、洗浄緩衝液（１００μL/ウェル）を用いて３回洗浄する。その後、Pierce SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Chemiluminescent Substrateキットを使用して調製した１００μLの化学発光基質を１ウェル当たりに加え、暗所に室温で５分間にわたりインキュベートし、ルミノメーターで読み込む。
【０１３６】
ルミノメーターの読み取りに基づき、線形回帰分析を使用して、標準曲線データに対応する線の等式を導く。この等式を使用して、種々の患者サンプル中でのプロガストリンの濃度を次に算出する。
【０１３７】
８．６．２ 結果
図４におけるボックスプロットは、健常コントロールと比較した、アッセイされた癌患者の２５パーセンタイル、中央値、及び７５パーセンタイル血漿又は血清プロガストリン濃度を示す。ウィスカーは、血漿又は血清プロガストリン濃度の５及び９５パーセンタイルを示す。このデータは、原発性及び転移性膵臓癌を伴う患者を含む患者集団が、健常個人と比較して、それらの血漿又は血清中のプロガストリンの上昇レベルを有していたことを実証する。
【０１３８】
８．７ 実施例７：原発性及び転移性膵臓癌細胞株におけるガストリン遺伝子の発現
この実施例では、ＧＡＳＴ遺伝子が原発性及び転移性膵臓癌細胞株において発現されることを示す。
【０１３９】
８．７．１ 方法
テストした細胞は、原発性膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ ３及びＭＩＡ ＰａＣａ ２、ならびに転移性膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ １及びＳＵ．８６．８６からであった。成長の期間後、細胞を再懸濁し、溶解し、全ｍＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってQIAGEN RNeasy Miniキットを使用して抽出した。ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー（Roche Applied Science）の存在においてSuperscript II RT（Invitrogen）を使用して逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、Quantifast SYBR Green PCRキット（Qiagen）及びEppendorf Mastercycler ep realplex（Eppendorf）を使用して実施した。ＧＡＳＴ及びＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用のプライマーをSigma Life Scienceから得た。各ＰＣＲ増幅を、以下の条件を使用して３通りのウェルにおいて実施した：９５℃で５分、合計４５の２温度サイクル（９５℃で１０秒及び６０℃で３０秒）が続く。
【０１４０】
８．７．２ 結果
異なる細胞株中で発現されるガストリンｍＲＮＡの相対レベルを図５６に報告する。レベルを、ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸癌細胞株（ポジティブコントロールとしての役割を果たした）において発現されるＧＡＳＴ ｍＲＮＡの量と比べて標準化し、データをＬＳ１７４Ｔ ＣＲＣ細胞株における発現レベルと比べて表現した。テストした全ての膵臓癌細胞株が、プロガストリンをコードする遺伝子（ＧＡＳＴ）についてのｍＲＮＡを発現する。
【０１４１】
８．８ 実施例８：膵臓癌細胞株によるプロガストリンの分泌
この実施例では、膵臓癌細胞株がプロガストリンを分泌することを実証する。
【０１４２】
８．８．１ 方法
プロガストリンの分泌は、以下のプロトコールを使用して、２Ｄ培養中で成長させた膵臓細胞から得られた条件培地において、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して定量化した。細胞を、それらが６０%コンフルエントに達するまで７５cm2フラスコ中で成長させた。培地を次に除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞を次に２０mlのＭ１１培地（フェノールレッドを伴わない）中で４８時間にわたり成長させた。培地を次に回収し、１，０００gで５分間にわたり遠心し、細胞デブリを除去し、−８０℃で凍結した。細胞を次にトリプシン処理し、カウントした。
【０１４３】
分泌されたプロガストリンを測定するために、凍結した培地をゆっくりと氷上で解凍し、次に、タンパク質コンセントレータ（Icon, Pierce）を使用して、２，５００gで４５分間にわたる遠心により容積５００μLまで４０倍濃縮した。プロガストリン濃度を、次に、サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して測定した。
【０１４４】
８．８．２ 結果
膵臓癌細胞株により条件付けした培地中のプロガストリンの濃度を図６に報告する。データを、プロガストリン濃度（pM）／１００万個細胞／４８時間の成長として表現した。
【０１４５】
８．９ 実施例９：培養中のＣａｐａｎ １転移性膵臓癌細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の効果
この実施例では、抗ｈＰＧ抗体が転移性膵臓腫瘍細胞の増殖を阻害することを実証する。
【０１４６】
８．９．１ 方法
Ｃａｐａｎ １細胞を６ウェルプレート中に播種し（５０，０００個細胞／ウェル）、２０%ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で８時間にわたり成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ（播種後２４時間目に開始する（時間Ｔ０））、細胞を、４８時間にわたり１２時間毎に、０．５% ＰａｎｅｘｉｎＨの存在において、１μg/mLのコントロールモノクローナル抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ１、Calbiochem Ref #411451）を用いて、又は１μg/mLの抗ｈＰＧ ＭＡｂ３を用いて処理した（示す通り）。技術者は、処理溶液の内容物に関して盲検化された。
【０１４７】
８．９．２ 結果
結果（図７に示す）を、実験の終了時での平均細胞数／ウェル−実験の開始時に播種した細胞数として算出した。この実験の結果は、抗ｈＰＧ ＭＡｂ３が、コントロール抗体と比較して、インビトロでＣａｐａｎ １転移性膵臓癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。
【０１４８】
８．１０ 実施例１０：ＢｘＰＣ−３細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた２Ｄ処理の阻害効果
この実施例では、培養中のＢｘＰＣ−３原発性膵臓癌細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の阻害効果を実証する。
【０１４９】
８．１０．１ 方法
各実験について、１５０ ０００個のＢｘＰＣ−３細胞を６ウェルプレート中に播種し、８時間にわたり１０%ウシ胎児血清を含む培地中で成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ（播種後２４時間目に開始する（時間Ｔ０））、細胞を、４８時間にわたり１２時間毎に、０．５% ＰａｎｅｘｉｎＨの存在において、１μg/mLのコントロールモノクローナル抗体（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８、ＡＴＣＣ、Ｒｅｆ ＴＩＢ−９）を用いて、又は１μg/mLの抗ｈＰＧ ＭＡｂ８を用いて処理した（示す通り）。
【０１５０】
コントロールＭＡｂ処理細胞及び抗ｈＰＧ ＭＡｂ処理細胞の両方における生細胞の数を、４８時間目にカウントした。処理の開始時（Ｔ０）での細胞数を、４８時間目に測定したテスト及びコントロール細胞数から引いた。
【０１５１】
８．１０．２ 結果
結果を図８に示す。コントロール及びテストの両方のサンプルについての実際の細胞数、ならびにコントロールと比べたテストサンプルの細胞数を、以下の表４に提供する：
【表６】
【０１５２】
８．１１ 実施例１１：ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた２Ｄ処理の阻害効果
この実施例では、培養中のＭＩＡ ＰａＣａ−２原発性膵臓癌細胞の成長に対する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の阻害効果を実証する。
【０１５３】
８．１１．１ 方法
各実験について、１００ ０００個のＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞を６ウェルプレート中に播種し、１０%ウシ胎児血清＋２．５%ウマ血清を含む培地中で８時間にわたり成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ（播種後２４時間目に開始する（時間Ｔ０））、細胞を、７２時間にわたり１２時間毎に、０．５% ＰａｎｅｘｉｎＨの存在において、１０μg/mLのコントロールモノクローナル抗体（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８、ＡＴＣＣ、Ｒｅｆ ＴＩＢ−９）を用いて、又は１０μg/mLの抗ｈＰＧ ＭＡｂ８を用いて処理した（示す通り）。コントロールＭＡｂ処理細胞及び抗ｈＰＧ ＭＡｂ処理細胞の両方における生細胞の数を、７２時間目にカウントした。処理の開始時（Ｔ０）での細胞数を、７２時間目に測定したテスト及びコントロール細胞数から引いた。
【０１５４】
８．１１．２ 結果
実験の結果を図９に提供する。コントロール及びテストの両方のサンプルについての実際の細胞数、ならびにコントロールと比べたテストサンプルの細胞数を、以下の表５に提供する：
【表７】
【０１５５】
８．１２ 実施例１２：懸濁液中の癌球としての膵臓癌細胞のその後の成長に対する抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた２Ｄ前処理の阻害効果
この実施例では、抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた転移性膵臓癌細胞の前処理が、低接着培養条件下で癌球として成長するこれらの細胞のその後の能力に対して有する阻害効果を実証する。
【０１５６】
８．１２．１ 実験１：方法
１００，０００個のＣａｐａｎ １細胞／ウェルを、最初に６ウェルプレート中へ２０%ＦＣＳを伴うＤＭＥＭ中に播種し、一晩血清飢餓させ、抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ３又はモノクローナルコントロール抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ１；Calbiochem ref #411451）の存在において、０．５%Ｐａｎｅｘｉｎ Ｈを伴うＤＭＥＭ中で４８時間にわたり成長させた。処理の終了時、各処理群について、５００個細胞／ウェルを超低付着２４ウェルプレートの８つのウェル中へ５００μlの無血清Ｍ１１培地（ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含む）中に蒔き、さらに１１日間にわたり処理なしで成長させた。この期間の終了時に、写真を撮り、ウェル当たりの球の数をカウントし、球の表面積を測定した。
【０１５７】
８．１２．２ 実験１：結果
写真を１１日間の「休薬」期間の終了時に撮り、その間に、全ての本来の処理条件からのＣａｐａｎ １細胞を同じＭ１１培地中で成長させた。その後、全てのウェルの同一性について盲検化された操作者が、球をカウントした。
【０１５８】
図１０に示す通り、低接着プレート中でスフェロイドとして成長するＣａｐａｎ １膵臓癌細胞の能力は、プロガストリンに対するモノクローナル抗体を用いた先の４８時間処理により有意に低下した。
【０１５９】
８．１２．３ 実験２：方法
１５０，０００個細胞／ウェル（転移性膵臓癌細胞株ＳＵ．８６．８６）を、最初に６ウェルプレート（従来の付着性カルチャウェア）中へ８時間にわたり１０%ＦＣＳを伴うＲＰＭＩ中に播種し、一晩血清飢餓させ、抗プロガストリンモノクローナル抗体ＭＡｂ８、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１６、又はＭＡｂ１９の非存在又は存在において、０．５%Ｐａｎｅｘｉｎ Ｈを伴うＲＰＭＩ中で４８時間にわたり成長させた。処理の終了時、各処理群について、５０個細胞／ウェルを超低付着９６ウェルプレートの８つのウェル中へ１００μｌの無血清Ｍ１１培地（ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含む）中に蒔き、さらに６日間にわたり処理なしで成長させた。この期間の終了時に、写真を撮り、ウェル当たりの球の数をカウントし、球の表面積を測定した。
【０１６０】
８．１２．４ 実験２：結果
写真を６日間の「休薬」期間の終了時に撮り、その間に、全ての本来の処置条件からのＳＵ．８６．８６細胞を同じＭ１１培地中で成長させた。その後、全てのウェルの同一性について盲検化された操作者が、球をカウントした。
【０１６１】
図１１に示す通り、低接着プレート中でスフェロイドとして成長するＳＵ．８６．８６膵臓癌細胞の能力は、プロガストリンに対するモノクローナル抗体を用いた先の４８時間処理により有意に低下した。
【０１６２】
本願において引用する全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書が、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、又は他の文書が全ての目的のために参照により組み入れられることが個々に示される場合と同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体において参照により本明細書により組み入れられる。
【０１６３】
種々の特定の実施態様が例証及び記載されているが、種々の変化を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく作ることができることが理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的利益を提供するために十分な抗ＰＧ抗体の量を膵臓癌と診断された被験者に投与することを含む、被験体において膵臓癌を処置する方法。
【請求項２】
被験者がヒトであり、そして抗ＰＧ抗体が抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ＤＡＰＬＧ（配列番号２８）、 ＰＤＡＰＬＧ（配列番号２９）、ＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３０）、ＷＫＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３１）及びＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号３２）からなる群より選択される配列を含むエピトープに結合する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２５）を有するペプチドを含む免疫原に対して産生される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列においてＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６又はＭＡｂ１９のＶＨ ＣＤＲに対応する３つのＶＨ ＣＤＲならびに配列においてＭＡｂ３、Ｍａｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６又はＭＡｂ１９のＶＬ ＣＤＲに対応する３つのＶＬ ＣＤＲを含む、請求項４記載の方法。
【請求項８】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列においてＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、又はＭＡｂ１９のＣＤＲに対応するＣＤＲを含む、請求項４記載の方法。
【請求項９】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６及びＭＡｂ１９からなる群より選択される参照抗体とｈＰＧ結合について競合する、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ＦＧＲＲ（配列番号３３）、ＭＤＦＧＲ（配列番号３４）、ＡＥＤＥＮ（配列番号３５）及びＧＷＭＤＦＧＲＲ（配列番号３６）からなる群より選択される配列を含むエピトープに結合する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号２７）を有するペプチドを含む免疫原に対して産生される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列においてＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２又はＭＡｂ１３のＣＤＲに対応する３つのＶＨ ＣＤＲならびに配列においてＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２又はＭＡｂ１３のＣＤＲに対応する３つのＶＬ ＣＤＲを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列においてＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２又はＭＡｂ１３のＣＤＲに対応するＣＤＲを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２及びＭＡｂ１３からなる群より選択される参照抗体とｈＰＧ結合について競合する、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
膵臓癌が、原発性膵臓癌である、請求項２記載の方法。
【請求項１７】
膵臓癌が、転移性膵臓癌である、請求項２記載の方法。
【請求項１８】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、腫瘍の外科的切除の補助として投与される、請求項２記載の方法。
【請求項１９】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、化学療法の補助として投与される、請求項２記載の方法。
【請求項２０】
細胞を、その増殖を阻害するのに十分な抗ＰＧ抗体の量に曝露することを含む膵臓腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２１】
インビトロで実行される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
インビボで実行される請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
抗ＰＧが抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
抗ＰＧ抗体がＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
抗ＰＧ抗体がＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
被験者が約５０pMの又はそれを上回る血漿又は血清プロガストリン濃度を有するか否かを決定することを含み、そこで、そのような濃度は、膵臓癌の少なくとも１つの他の症状と合わせて、被験者が膵臓癌を有する可能性が高いことを示す、膵臓癌の少なくとも１つの症状を示す被験者において膵臓癌を診断する方法。
【請求項２７】
膵臓癌のために処置されている被験者が、約１０pMを下回る血漿又は血清プロガストリン濃度を有するか否かを決定することを含み、そこで、そのような濃度は、処置が効果的であることを示す、膵臓癌処置の有効性をモニターする方法。
【請求項２８】
膵臓癌のために処置されている患者の血漿又は血清プロガストリン濃度を、時間の関数としてモニターすることを含み、そこで、血漿又は血清プロガストリン濃度における経時的な減少は、膵臓癌処置が効果的であることを示す、膵臓癌処置の有効性をモニターする方法。
【請求項１】
治療的利益を提供するために十分な抗ＰＧ抗体の量を膵臓癌と診断された被験者に投与することを含む、被験体において膵臓癌を処置する方法。
【請求項２】
被験者がヒトであり、そして抗ＰＧ抗体が抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ＤＡＰＬＧ（配列番号２８）、 ＰＤＡＰＬＧ（配列番号２９）、ＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３０）、ＷＫＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３１）及びＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号３２）からなる群より選択される配列を含むエピトープに結合する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２５）を有するペプチドを含む免疫原に対して産生される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列においてＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６又はＭＡｂ１９のＶＨ ＣＤＲに対応する３つのＶＨ ＣＤＲならびに配列においてＭＡｂ３、Ｍａｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６又はＭＡｂ１９のＶＬ ＣＤＲに対応する３つのＶＬ ＣＤＲを含む、請求項４記載の方法。
【請求項８】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列においてＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、又はＭＡｂ１９のＣＤＲに対応するＣＤＲを含む、請求項４記載の方法。
【請求項９】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６及びＭＡｂ１９からなる群より選択される参照抗体とｈＰＧ結合について競合する、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ＦＧＲＲ（配列番号３３）、ＭＤＦＧＲ（配列番号３４）、ＡＥＤＥＮ（配列番号３５）及びＧＷＭＤＦＧＲＲ（配列番号３６）からなる群より選択される配列を含むエピトープに結合する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号２７）を有するペプチドを含む免疫原に対して産生される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列においてＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２又はＭＡｂ１３のＣＤＲに対応する３つのＶＨ ＣＤＲならびに配列においてＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２又はＭＡｂ１３のＣＤＲに対応する３つのＶＬ ＣＤＲを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、配列においてＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２又はＭＡｂ１３のＣＤＲに対応するＣＤＲを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２及びＭＡｂ１３からなる群より選択される参照抗体とｈＰＧ結合について競合する、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
膵臓癌が、原発性膵臓癌である、請求項２記載の方法。
【請求項１７】
膵臓癌が、転移性膵臓癌である、請求項２記載の方法。
【請求項１８】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、腫瘍の外科的切除の補助として投与される、請求項２記載の方法。
【請求項１９】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、化学療法の補助として投与される、請求項２記載の方法。
【請求項２０】
細胞を、その増殖を阻害するのに十分な抗ＰＧ抗体の量に曝露することを含む膵臓腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２１】
インビトロで実行される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
インビボで実行される請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
抗ＰＧが抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
抗ＰＧ抗体がＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
抗ＰＧ抗体がＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
被験者が約５０pMの又はそれを上回る血漿又は血清プロガストリン濃度を有するか否かを決定することを含み、そこで、そのような濃度は、膵臓癌の少なくとも１つの他の症状と合わせて、被験者が膵臓癌を有する可能性が高いことを示す、膵臓癌の少なくとも１つの症状を示す被験者において膵臓癌を診断する方法。
【請求項２７】
膵臓癌のために処置されている被験者が、約１０pMを下回る血漿又は血清プロガストリン濃度を有するか否かを決定することを含み、そこで、そのような濃度は、処置が効果的であることを示す、膵臓癌処置の有効性をモニターする方法。
【請求項２８】
膵臓癌のために処置されている患者の血漿又は血清プロガストリン濃度を、時間の関数としてモニターすることを含み、そこで、血漿又は血清プロガストリン濃度における経時的な減少は、膵臓癌処置が効果的であることを示す、膵臓癌処置の有効性をモニターする方法。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図２Ｊ】
【図２Ｋ】
【図２Ｌ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図３Ｍ】
【図３Ｎ】
【図３Ｏ】
【図３Ｐ】
【図３Ｑ】
【図３Ｒ】
【図３Ｓ】
【図３Ｔ】
【図３Ｕ】
【図３Ｖ】
【図３Ｗ】
【図３Ｘ】
【図３Ｙ】
【図３Ｚ】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図２Ｊ】
【図２Ｋ】
【図２Ｌ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図３Ｍ】
【図３Ｎ】
【図３Ｏ】
【図３Ｐ】
【図３Ｑ】
【図３Ｒ】
【図３Ｓ】
【図３Ｔ】
【図３Ｕ】
【図３Ｖ】
【図３Ｗ】
【図３Ｘ】
【図３Ｙ】
【図３Ｚ】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１３−５１６４３９（Ｐ２０１３−５１６４３９Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４７４９５（Ｐ２０１２−５４７４９５）
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／００００４９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８３０９１
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５１２０９７８８０）
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＲＥＡＬＩＴＥＳ
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／００００４９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８３０９１
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５１２０９７８８０）
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＲＥＡＬＩＴＥＳ
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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