色素体ＤＮＡの単離方法および該色素体ＤＮＡを用いたラテックス産生植物の品種判別方法
【課題】ラテックス産生植物の色素体から簡便に、かつ核ＤＮＡの混入を防止しつつ、高純度に色素体ＤＮＡを単離する方法を提供すること。
【解決手段】ラテックス産生植物からの色素体ＤＮＡの単離方法であって、ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する工程と、前記ゴム相から色素体画分を抽出する工程と、抽出した前記色素体画分からＤＮＡを単離する工程とを有することを特徴とする色素体ＤＮＡの単離方法。
【解決手段】ラテックス産生植物からの色素体ＤＮＡの単離方法であって、ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する工程と、前記ゴム相から色素体画分を抽出する工程と、抽出した前記色素体画分からＤＮＡを単離する工程とを有することを特徴とする色素体ＤＮＡの単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラテックス産生植物のラテックスからの色素体ＤＮＡの単離方法に係り、より詳しくは、遠心分離により得られたラテックスのゴム相から色素体画分を抽出し、該色素体画分から色素体ＤＮＡを単離することで、核ＤＮＡの混入を抑制し、純度の高い色素体ＤＮＡを単離することが可能な色素体ＤＮＡの単離方法及び該単離方法で得られた色素体ＤＮＡを用いてラテックス産生植物の品種を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）は、天然ゴムの原料として栽培される代表的なゴムノキであり、パラゴムノキの分泌するラテックスという乳液から天然ゴムは製造される。このパラゴムノキは、品種によって乳管数、ラテックス放出能、ラテックス再生能等が異なるため、パラゴムノキ１本あたりのラテックス収量が異なってくる。したがって、これらの能力に優れたパラゴムノキの品種を判別し、ラテックスの生成を行なうことが、天然ゴムの生産を安定化させる上で極めて重要である。
【０００３】
従来、パラゴムノキの品種は、葉・樹皮・樹形などの形態で判別されていた。しかしながら、形態による品種判別方法においては、パラゴムノキの成長を待つ必要があるため、長期間を要する。その上、このような品種判別方法の習熟・熟練にも時間を要する。また、パラゴムノキの品種によっては外観で判別が困難であり、品種判別において誤判定が生じることがあった。
【０００４】
一方で、近年、植物においていくつかの遺伝子工学を応用した品種判別方法が開発されてきた。これらの方法では、品種間の塩基配列の違い、すなわち多型を検出することで品種判別を行なっている。この品種判別方法は、遺伝子上の客観的な特徴を指標とすることから、精確な品種判定が可能となる。既に多くの商業作物において、ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法、ＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphisms）法、マイクロサテライト法などの遺伝子工学を用いた品種判別法が開発されている。
【０００５】
パラゴムノキにおいては、遺伝子の多型を検出可能なＤＮＡマーカーとして、矮性の変異体のクローンを識別可能なＲＡＰＤマーカーを用いる方法が非特許文献１に、耐乾燥性の変異体のクローンの開発やスクリーニングに有用なＤＮＡマーカーを用いる方法が非特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Venkatachalam,P. et al. Identification,cloning and sequence analysis of a dwarf genome-specific RAPD marker in rubber tree[Hevea brasiliensis(Muell.)Arg.], Plant Cell Reports 2004;23(5):327-332
【非特許文献２】Venkatachalam,P. et al. Molecular cloning and sequencing of a polymorphic band from rubber tree[Hevea brasiliensis(Muell.)Arg.]:the nucleotide sequence revealed partial homology with proline-specific permease genesequence. Current Science 2006;90(11):1510-1515
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した非特許文献１〜２に記載の方法では、パラゴムノキから直接葉や茎などを採取してＤＮＡを単離するため、操作が煩雑であり、また、パラゴムノキに損傷を与えてしまうという問題がある。また、植物には、核ＤＮＡの他に葉緑体等が有する色素体ＤＮＡがあり、これを用いて、遺伝的解析を行なうことも可能であるが、葉や茎から色素体ＤＮＡを単離すると、核ＤＮＡの混入が生じやすい。そのため、色素体ＤＮＡを鋳型としてＲＡＰＤやＰＣＲ等により品種判別を行った際に、核ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片が生じてしまい、品種判別の誤判定や再現性に欠ける等の問題があった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ラテックス産生植物の色素体から簡便に、かつ核ＤＮＡの混入を防止しつつ、高純度に色素体ＤＮＡを単離する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の請求項１に記載の色素体ＤＮＡの単離方法は、ラテックス産生植物からの色素体ＤＮＡの単離方法であって、ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する工程と、前記ゴム相から色素体画分を抽出する工程と、抽出した前記色素体画分からＤＮＡを単離する工程とを有することを特徴とする。
本発明の請求項２に記載の色素体ＤＮＡの単離方法は、請求項１において、前記ラテックス産生植物がパラゴムノキ（Hevea brasiliensis）であることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載のラテックス産生植物の品種判別方法は、請求項１または２に記載の方法で単離された色素体ＤＮＡを用いてラテックス産生植物の品種を判別することを特徴とする。
本発明の請求項４に記載のラテックス産生植物の品種判別方法は、請求項３において、ラテックス産生植物の品種を判別する方法が、前記色素体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行なう工程と、前記ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を用いてラテックス産生植物の品種を判別する工程と、を少なくとも有すること特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の色素体ＤＮＡの単離方法は、ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離して得られた色素体画分から、色素体ＤＮＡを単離する方法である。色素体には核ＤＮＡが含まれていないため、本発明の方法で単離されたＤＮＡは、その大部分が色素体ＤＮＡである。そのため、該色素体ＤＮＡを用いて、例えばＰＣＲ等を行なった場合には、核ＤＮＡの混入による非特異的なバンドの検出を顕著に抑制することができる。ゆえに、本発明の色素体ＤＮＡの単離方法により単離された色素体ＤＮＡを用いることにより、ＰＣＲやＲＡＰＤ法等の周知の解析方法によって、精度よくラテックス産生植物の品種判別を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のラテックス産生植物のラテックスから色素体ＤＮＡを単離する方法を段階的に示したフローチャートである。
【図２】ラテックスを超遠心分離した際の模式図である。
【図３】ＰＣＲによる増幅範囲を示した図である。
【図４】実施例における電気泳動の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜色素体ＤＮＡの単離方法＞
図１は、本発明の色素体ＤＮＡの単離方法を段階的に示したフローチャートである。
本発明の色素体ＤＮＡの単離方法は、ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する工程と、前記ゴム相から色素体画分を抽出する工程と、抽出した前記色素体画分からＤＮＡを単離する工程とを有している。以下、本発明の色素体ＤＮＡの単離方法を詳細に説明する。
【００１３】
まず、ラテックス産生植物のラテックスを用意する。本発明において、ラテックス産生植物とは、乳管を有しており、乳管中にラテックス（主にポリイソプレン）が含まれている植物であれば、特に限定されるものではなく、例えば、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈａｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、セアラゴムノキ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｇｌａｚｉｏｖｉｉ）、クワ科のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、パナゴムノキ（Ｃａｓｔｉｌｌｏａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、マメ科のアラビアゴムノキ（Ａｃｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）、トラガントゴムノキ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｇｕｍｍｉｆｅｒ）、キョウチクトウ科のクワガタノキ（Ｄｙｅｒａ ｃｏｓｔｕｌａｔａ）、ザンジバルツルゴム（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ ｋｉｒｋｉｉ）、フンツミアエラスチカ（Ｆｕｎｔｕｍｉａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ウルセオラ（Ｕｒｃｅｏｌａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、キク科のグアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ−ｓａｇｈｙｚ）、アカテツ科のガタパーチャノキ（ｐａｌａｇｕｉｕｍ ｇａｔｔａ）、バラタゴムノキ（Ｍｉｍｕｓｏｐｓ ｂａｌａｔａ）、サポジラ（Ａｃｈｒａｓ ｚａｐｏｔａ）等が挙げられる。中でも、パラゴムノキ、セアラゴムノキ、インドゴムノキ等であることが好ましく、工業用天然ゴム原料として汎用されているパラゴムノキであることがより好ましい。
【００１４】
ラテックスとしては、ラテックス産生植物から例えばタッピング等の従来公知の方法で採取したフィールドラテックスを用いてもよいし、このフィールドラテックスに保存や腐敗、凝固を防止するためにアンモニアや他の保存剤が添加されたラテックスや、ゴム成分（ポリイソプレン）が濃縮されたラテックスであってもよい。また、市販のラテックスを用いてもよい。
【００１５】
次に、ラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する。
ラテックスは、遠心分離用の遠心管に所定量充填され、遠心分離を行なうことで、図２に示すように、ゴム相１とセラム相２とボトム画分３とに分離することができる。遠心分離に関しては、分離が綺麗で容易に行なえることから、超遠心分離を行なうことが好ましい。この遠心分離に関しては、例えば６０００Ｇ以上９０００Ｇ以下、０℃以上４℃以下にて０．５時間以上１時間以下で行なえばよい。
【００１６】
本発明において、ゴム相１とは、遠心分離を行った際に、白色の容態を示すコロイド状の相であり、主にラテックス粒子からなる。このゴム相１には、色素体が濃縮された色素体画分が存在する。
またセラム相２とは、遠心分離を行なった際に、半透明の容態を示す水相であり、水溶性のタンパク質や粒径の小さいラテックス粒子が溶解している。
【００１７】
次に、ゴム相１から色素体画分４を抽出する。色素体画分４は、主にラテックス粒子からなる画分と構成が異なるため、その色等により目視で簡便に判別することができる。色素体画分４の抽出にあたっては、色素体画分４のみを抽出することができれば特に限定されるものではなく、例えば注射器等を用いて行なえば、簡便に色素体画分４をゴム相１から抽出することができる。
【００１８】
次に、抽出した色素体画分４から、色素体ＤＮＡを単離する。色素体ＤＮＡの単離にあたっては、フェノール法や臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法、市販のキット等を用いて行なうことができる。色素体画分４を抽出する際にゴム相１が含まれると、市販のキットを用いて色素体ＤＮＡの単離を行なった場合、該ゴム相１によってＤＮＡの収量および純度が低減する虞がある。したがって、色素体ＤＮＡを単離する際に、フェノール法を用いた場合には、ゴム相１のラテックス粒子等の混入が生じていた場合でも、精度よく簡便に色素体ＤＮＡを単離することができる。
【００１９】
以上で、ラテックス産生植物のラテックスから、色素体ＤＮＡを単離することが可能である。ラテックスの色素体画分４から色素体ＤＮＡを単離することにより、核ＤＮＡの混入を抑制し、精度よく色素体ＤＮＡを得ることができる。したがって、該色素体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲやＲＡＰＤ法によりラテックス産生植物の品種判別を行った際には、核ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を顕著に抑制することができるため、該ＤＮＡ断片による品種判別の誤判定が抑制され、再現性よくラテックス産生植物の品種判別を行なうことが可能となる。
【００２０】
また、ラテックス産生植物の葉や茎を採取する必要がないため、ラテックス産生植物への負担が少ない。さらに、ラテックス産生植物からすでに回収されたラテックスを用いて色素体ＤＮＡを単離することができるため、流通工程の途中でラテックスが由来する品種を判別することができる。
さらに、本発明で得られた色素体ＤＮＡは、例えば上記で述べた品種判別の他にも、生物由来の他のＤＮＡと同様に、種々の核酸解析に供することができる。例えば、ラテックス産生植物の品種改良や遺伝子組み換えによる新品種の作製等が挙げられる。
【００２１】
＜ラテックス産生植物の品種判別方法＞
本発明の色素体ＤＮＡの単離方法で得られた色素体ＤＮＡを用いて、核ＤＮＡと同様に色素体ＤＮＡにあっても、品種間で塩基配列が異なる部位を検出することにより、ラテックス産生植物の品種判別ができる。パラゴムノキの品種を判別することが好ましい。品種判別可能なパラゴムノキとしては、例えば、ＰＢ２６０、ＰＢ３４０、ＲＲＩＭ６００等が挙げられる。
【００２２】
ラテックス産生植物の品種判別に関しては、核ＤＮＡを用いた品種判別方法と同様な方法で行なうことができ、例えば、単離した色素体ＤＮＡを鋳型とした核酸増幅法やサザンブロッティング等のハイブリダイゼーション法、または単離したＤＮＡを用いた変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis：ＤＧＧＥ）、ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法等により行なうことができる。
【００２３】
核酸増幅法に関しては、ポリメラーゼを用いた塩基の伸長反応を行うものであれば特に限定されるものではなく、通常のＰＣＲに加えて、リアルタイムＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）、ＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphism）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）等が挙げられる。
【００２４】
これら核酸増幅法の中でも、簡便に短時間で精度よく判別できることから、通常のＰＣＲにより行なうことが好ましい。
ＰＣＲに用いるプライマーは、色素体ＤＮＡにおいて、ラテックス産生植物の品種間で塩基配列の異なる領域が、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片中に含まれるように設計される。プライマーの設計としては、色素体ＤＮＡにおいて、ラテックス産生植物の品種間で塩基配列の異なる領域が、プライマーの塩基配列に含まれる、あるいはＰＣＲにより増幅される塩基対数が、ラテックス産生植物の品種間で異なるように設計することが好ましい。なお、各プライマーのＴｍ値を、ほぼ一致させておくことにより、同一のＰＣＲ条件で核酸増幅を行うことができる。このようなプライマーの合成は、当該技術分野で公知の手法を用いて行うことができる。
この品種間で塩基配列が異なる領域としては、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ）、単純反復配列（simple sequence repeat：ＳＳＲ）、挿入／欠失多型（insertion/deletion polymorphism：Ｉｎ／Ｄｅｌ）等が挙げられ、得られたＰＣＲ産物を解析することにより、ラテックス産生植物の品種判別を行なうことができる。
【００２５】
ＰＣＲに用いるポリメラーゼとしては、増幅塩基数や増幅塩基配列、反応温度等を考慮して公知のものを適宜選択可能であり、例えば耐熱性ポリメラーゼや校正活性を有したポリメラーゼ等が挙げられる。
ＰＣＲに用いるバッファーとしては、用いるポリメラーゼを考慮して、公知のものを適宜調整して用いることができる。
ＰＣＲに用いるヌクレオチドに関しては、標識試薬等で標識されたものを用いることもできる。
【００２６】
本発明のラテックス産生植物の品種判別方法における通常のＰＣＲは、目的のＤＮＡ断片が増幅できれば特に限定されるものではないが、例えば以下に示す条件で行なうことができる。反応溶液の組成としては、例えば、反応溶液中の濃度が０．１〜２μＭのフォワードプライマーとリバースプライマー、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５８０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５〜２．２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２〜０．４ｍＭの各ｄＮＴＰｓ、０．５〜２ユニットのＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）、及び１〜１００ｎｇの色素体ＤＮＡである。ＰＣＲの温度サイクルは、例えば約９４℃を約２分の後、約９４℃を約３０秒、約５５℃を約３０秒、約７２℃を約２分の工程を２５〜４５回繰り返す。その後、反応溶液を、約７２℃で約５分間反応させてもよい。
【００２７】
上述したＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、例えばゲル電気泳動やバイオアナライザー２１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）等の検出機器により検出することができる。ゲル電気泳動は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル等を用いて行なうことができる。電気泳動後は、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＥＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ等でＤＮＡ断片を染色し、ＵＶ照射下でＤＮＡ断片の有無、大きさ、パターンを検出する。
得られたＤＮＡ断片のパターンは、写真撮影あるいは直接スキャンして画像データとして記録することができる。
ラテックス産生植物の品種間で得られるＤＮＡ断片のサイズが異なる場合は、ＤＮＡ断片の有無、または得られたＤＮＡ断片の大きさやパターン、配列を比較することにより、品種判別をすることが可能である。ＤＮＡ断片の有無や大きさ、パターンは、上述したゲル電気泳動やバイオアナライザー２１００システム等の検出機器で解析することができ、ＤＮＡ断片の配列は、シークェンシング法により、直接塩基配列を確認することができる。
【００２８】
以上のように、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を検出し、ラテックス産生植物の品種特異的なＤＮＡ断片の有無、あるいは品種特異的なＤＮＡ断片の大きさパターン、塩基配列を比較することで、ラテックス産生植物の品種を判別することが可能である。または、ＲＦＬＰ法のように、ＤＮＡ断片を酵素処理して得られるバンドパターンを比較することで、ラテックス産生植物の品種を判別することも可能である。
【００２９】
＜品種改良、新品種の作製＞
また、単離した色素体ＤＮＡを改変し、この改変色素体ＤＮＡをラテックス産生植物の色素体に導入することで、該改変色素体ＤＮＡを有したラテックス産生植物の形質転換体を作製し、品種改良や新品種を得ることができる。
【００３０】
改変色素体ＤＮＡとしては、従来公知の方法で行うことができ、所定の塩基配列が挿入されたものや欠損されたもの、１塩基以上の塩基配列で置換されたもの等を挙げることができる。ここで、色素体ＤＮＡの改変に用いられる塩基配列の種類は特に限定されるものではなく、作製する改変色素体ＤＮＡの用途など、その目的に応じて適宜選択することができる。また、改変に用いられる塩基配列は、天然のものであってもよいし人工的に合成されたものであってもよい。
本発明の方法で単離された色素体ＤＮＡは、核ＤＮＡの混入がほとんどなく精製効率が高いため、効率よく改変色素体ＤＮＡを作製することができる。
【００３１】
改変色素体ＤＮＡのラテックス産生植物への導入方法としては、パーティクルガン法やアグロバクテリウム法がある。
パーティクルガン法は、パーティクルガンを用いて該改変色素体ＤＮＡをラテックス産生植物の例えば葉の色素体に導入し、該改変色素体ＤＮＡが導入された葉をカルス誘導してカルスを形成させることで、改変色素体ＤＮＡを有した形質転換体のラテックス産生植物を得ることができる。パーティクルガンを用いた色素体ＤＮＡの導入に関しては、直径１〜２μｍの金粒子を改変色素体ＤＮＡでコーティングし、マイクロキャリアーに接着させ、例えば葉やカルス等に２回、パーティクルガンで打ち込むことで、改変色素体ＤＮＡを導入することができる。また、カルスの形成に関しては特に限定されるものではなく、従来公知の方法で行なうことができる。
【００３２】
アグロバクテリウム法は、改変色素体ＤＮＡをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入して、カルス又は幼植物に該アグロバクテリウム・ツメファシエンスを感染させることで、該改変色素体ＤＮＡを有した形質転換体のラテックス産生植物を得ることができる。
【００３３】
または、カルスから調製したプロトプラストを用いて、エレクトロポレーション法やリン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＡＥＡ−デキストラン媒介トランスフェクション法等により、該プロトプラストに改変色素体ＤＮＡを導入し、形質転換体のラテックス産生植物を得ることができる。
【実施例】
【００３４】
＜ラテックス産生植物のラテックスから色素体ＤＮＡの単離＞
ラテックス産生植物である、パラゴムノキからタッピングにより採取したラテックス４０ｇを遠心管に入れ、８０００Ｇ、０℃にて１時間、超遠心分離を行い、ラテックスをゴム相とセラム相とボトム画分とに分離させた。また、遠心管の底部には、沈殿（ボトム画分）が観察された。その後、ゴム相に含まれる、色の付いた色素体画分を注射器で吸い出して、ゴム相から色素体を抽出した。次いで、抽出した色素体からフェノール法、あるいは市販のキットを用いてＤＮＡの単離を行なった。
【００３５】
＜ＰＣＲによる色素体ＤＮＡの確認＞
次に、色素体から単離したＤＮＡが色素体由来のＤＮＡ（色素体ＤＮＡ）か確認を行なった。まず、上記で単離した各ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行なった。プライマーは、図３に示すように、フォワードプライマー、リバースプライマーとして、ｒｂｃＬ遺伝子に対するものを用いた。具体的には、フォワードプライマーとして、ｒｂｃＬ遺伝子の１１０位〜１３４位の塩基配列に相同的な塩基配列を有するＦｄ２プライマー（配列番号１）、と、リバースプライマーとして、ｒｂｃＬ遺伝子の１１４２位〜１１６６位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＦｄＲプライマー（配列番号２）とを用いた。
ＰＣＲの反応溶液は、１×reaction Bufferと、０．２ｍＭのｄＮＴＰmixtureと、０．５ユニットのＥｘＴａｑ ＤＮＡ polymerase（Ｔａｋａｒａ社）と、各１．２５μＭのプライマー（Ｆｄ２及びＦｄＲ）と、１〜２５ｎｇの鋳型ＤＮＡとを含み、反応溶液の合計が２０μｌとなるように、水で調節した。次に、反応溶液を９４℃で４分間反応させた後、９４℃を３０秒、５５℃を３０秒、７２℃を２分で３０サイクル反応させてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、プライマーとしてＦｄ２とＦｄＲを用いた際には、１０６７塩基対のＤＮＡ断片が得られる。その後、反応溶液を７２℃で５分間反応させ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のバイオアナライザー２１００システムを用いた電気泳動によりＰＣＲ産物を分離し、ＤＮＡ断片のバンドパターンを検出した。検出結果を、図４に示す。なお、ポジティブコントロールとして、葉から抽出した全ゲノムを用いた。
【００３６】
ｒｂｃＬ遺伝子は核ＤＮＡにはなく、色素体ＤＮＡにのみ存在するため、図４より、ラテックスの色素体画分から単離されたＤＮＡが色素体ＤＮＡであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、ラテックス産生植物の品種判別に適用することができ、ラテックス産生植物から採取したラテックスを用いて、簡便に精度よく、ラテックス産生植物の品種を判別することができる。
【符号の説明】
【００３８】
１ ゴム相、２ セラム層、３ ボトム画分、４ 色素体画分。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラテックス産生植物のラテックスからの色素体ＤＮＡの単離方法に係り、より詳しくは、遠心分離により得られたラテックスのゴム相から色素体画分を抽出し、該色素体画分から色素体ＤＮＡを単離することで、核ＤＮＡの混入を抑制し、純度の高い色素体ＤＮＡを単離することが可能な色素体ＤＮＡの単離方法及び該単離方法で得られた色素体ＤＮＡを用いてラテックス産生植物の品種を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）は、天然ゴムの原料として栽培される代表的なゴムノキであり、パラゴムノキの分泌するラテックスという乳液から天然ゴムは製造される。このパラゴムノキは、品種によって乳管数、ラテックス放出能、ラテックス再生能等が異なるため、パラゴムノキ１本あたりのラテックス収量が異なってくる。したがって、これらの能力に優れたパラゴムノキの品種を判別し、ラテックスの生成を行なうことが、天然ゴムの生産を安定化させる上で極めて重要である。
【０００３】
従来、パラゴムノキの品種は、葉・樹皮・樹形などの形態で判別されていた。しかしながら、形態による品種判別方法においては、パラゴムノキの成長を待つ必要があるため、長期間を要する。その上、このような品種判別方法の習熟・熟練にも時間を要する。また、パラゴムノキの品種によっては外観で判別が困難であり、品種判別において誤判定が生じることがあった。
【０００４】
一方で、近年、植物においていくつかの遺伝子工学を応用した品種判別方法が開発されてきた。これらの方法では、品種間の塩基配列の違い、すなわち多型を検出することで品種判別を行なっている。この品種判別方法は、遺伝子上の客観的な特徴を指標とすることから、精確な品種判定が可能となる。既に多くの商業作物において、ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法、ＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphisms）法、マイクロサテライト法などの遺伝子工学を用いた品種判別法が開発されている。
【０００５】
パラゴムノキにおいては、遺伝子の多型を検出可能なＤＮＡマーカーとして、矮性の変異体のクローンを識別可能なＲＡＰＤマーカーを用いる方法が非特許文献１に、耐乾燥性の変異体のクローンの開発やスクリーニングに有用なＤＮＡマーカーを用いる方法が非特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Venkatachalam,P. et al. Identification,cloning and sequence analysis of a dwarf genome-specific RAPD marker in rubber tree[Hevea brasiliensis(Muell.)Arg.], Plant Cell Reports 2004;23(5):327-332
【非特許文献２】Venkatachalam,P. et al. Molecular cloning and sequencing of a polymorphic band from rubber tree[Hevea brasiliensis(Muell.)Arg.]:the nucleotide sequence revealed partial homology with proline-specific permease genesequence. Current Science 2006;90(11):1510-1515
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した非特許文献１〜２に記載の方法では、パラゴムノキから直接葉や茎などを採取してＤＮＡを単離するため、操作が煩雑であり、また、パラゴムノキに損傷を与えてしまうという問題がある。また、植物には、核ＤＮＡの他に葉緑体等が有する色素体ＤＮＡがあり、これを用いて、遺伝的解析を行なうことも可能であるが、葉や茎から色素体ＤＮＡを単離すると、核ＤＮＡの混入が生じやすい。そのため、色素体ＤＮＡを鋳型としてＲＡＰＤやＰＣＲ等により品種判別を行った際に、核ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片が生じてしまい、品種判別の誤判定や再現性に欠ける等の問題があった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ラテックス産生植物の色素体から簡便に、かつ核ＤＮＡの混入を防止しつつ、高純度に色素体ＤＮＡを単離する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の請求項１に記載の色素体ＤＮＡの単離方法は、ラテックス産生植物からの色素体ＤＮＡの単離方法であって、ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する工程と、前記ゴム相から色素体画分を抽出する工程と、抽出した前記色素体画分からＤＮＡを単離する工程とを有することを特徴とする。
本発明の請求項２に記載の色素体ＤＮＡの単離方法は、請求項１において、前記ラテックス産生植物がパラゴムノキ（Hevea brasiliensis）であることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載のラテックス産生植物の品種判別方法は、請求項１または２に記載の方法で単離された色素体ＤＮＡを用いてラテックス産生植物の品種を判別することを特徴とする。
本発明の請求項４に記載のラテックス産生植物の品種判別方法は、請求項３において、ラテックス産生植物の品種を判別する方法が、前記色素体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行なう工程と、前記ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を用いてラテックス産生植物の品種を判別する工程と、を少なくとも有すること特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の色素体ＤＮＡの単離方法は、ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離して得られた色素体画分から、色素体ＤＮＡを単離する方法である。色素体には核ＤＮＡが含まれていないため、本発明の方法で単離されたＤＮＡは、その大部分が色素体ＤＮＡである。そのため、該色素体ＤＮＡを用いて、例えばＰＣＲ等を行なった場合には、核ＤＮＡの混入による非特異的なバンドの検出を顕著に抑制することができる。ゆえに、本発明の色素体ＤＮＡの単離方法により単離された色素体ＤＮＡを用いることにより、ＰＣＲやＲＡＰＤ法等の周知の解析方法によって、精度よくラテックス産生植物の品種判別を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のラテックス産生植物のラテックスから色素体ＤＮＡを単離する方法を段階的に示したフローチャートである。
【図２】ラテックスを超遠心分離した際の模式図である。
【図３】ＰＣＲによる増幅範囲を示した図である。
【図４】実施例における電気泳動の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜色素体ＤＮＡの単離方法＞
図１は、本発明の色素体ＤＮＡの単離方法を段階的に示したフローチャートである。
本発明の色素体ＤＮＡの単離方法は、ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する工程と、前記ゴム相から色素体画分を抽出する工程と、抽出した前記色素体画分からＤＮＡを単離する工程とを有している。以下、本発明の色素体ＤＮＡの単離方法を詳細に説明する。
【００１３】
まず、ラテックス産生植物のラテックスを用意する。本発明において、ラテックス産生植物とは、乳管を有しており、乳管中にラテックス（主にポリイソプレン）が含まれている植物であれば、特に限定されるものではなく、例えば、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈａｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、セアラゴムノキ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｇｌａｚｉｏｖｉｉ）、クワ科のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、パナゴムノキ（Ｃａｓｔｉｌｌｏａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、マメ科のアラビアゴムノキ（Ａｃｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）、トラガントゴムノキ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｇｕｍｍｉｆｅｒ）、キョウチクトウ科のクワガタノキ（Ｄｙｅｒａ ｃｏｓｔｕｌａｔａ）、ザンジバルツルゴム（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ ｋｉｒｋｉｉ）、フンツミアエラスチカ（Ｆｕｎｔｕｍｉａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ウルセオラ（Ｕｒｃｅｏｌａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、キク科のグアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ−ｓａｇｈｙｚ）、アカテツ科のガタパーチャノキ（ｐａｌａｇｕｉｕｍ ｇａｔｔａ）、バラタゴムノキ（Ｍｉｍｕｓｏｐｓ ｂａｌａｔａ）、サポジラ（Ａｃｈｒａｓ ｚａｐｏｔａ）等が挙げられる。中でも、パラゴムノキ、セアラゴムノキ、インドゴムノキ等であることが好ましく、工業用天然ゴム原料として汎用されているパラゴムノキであることがより好ましい。
【００１４】
ラテックスとしては、ラテックス産生植物から例えばタッピング等の従来公知の方法で採取したフィールドラテックスを用いてもよいし、このフィールドラテックスに保存や腐敗、凝固を防止するためにアンモニアや他の保存剤が添加されたラテックスや、ゴム成分（ポリイソプレン）が濃縮されたラテックスであってもよい。また、市販のラテックスを用いてもよい。
【００１５】
次に、ラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する。
ラテックスは、遠心分離用の遠心管に所定量充填され、遠心分離を行なうことで、図２に示すように、ゴム相１とセラム相２とボトム画分３とに分離することができる。遠心分離に関しては、分離が綺麗で容易に行なえることから、超遠心分離を行なうことが好ましい。この遠心分離に関しては、例えば６０００Ｇ以上９０００Ｇ以下、０℃以上４℃以下にて０．５時間以上１時間以下で行なえばよい。
【００１６】
本発明において、ゴム相１とは、遠心分離を行った際に、白色の容態を示すコロイド状の相であり、主にラテックス粒子からなる。このゴム相１には、色素体が濃縮された色素体画分が存在する。
またセラム相２とは、遠心分離を行なった際に、半透明の容態を示す水相であり、水溶性のタンパク質や粒径の小さいラテックス粒子が溶解している。
【００１７】
次に、ゴム相１から色素体画分４を抽出する。色素体画分４は、主にラテックス粒子からなる画分と構成が異なるため、その色等により目視で簡便に判別することができる。色素体画分４の抽出にあたっては、色素体画分４のみを抽出することができれば特に限定されるものではなく、例えば注射器等を用いて行なえば、簡便に色素体画分４をゴム相１から抽出することができる。
【００１８】
次に、抽出した色素体画分４から、色素体ＤＮＡを単離する。色素体ＤＮＡの単離にあたっては、フェノール法や臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法、市販のキット等を用いて行なうことができる。色素体画分４を抽出する際にゴム相１が含まれると、市販のキットを用いて色素体ＤＮＡの単離を行なった場合、該ゴム相１によってＤＮＡの収量および純度が低減する虞がある。したがって、色素体ＤＮＡを単離する際に、フェノール法を用いた場合には、ゴム相１のラテックス粒子等の混入が生じていた場合でも、精度よく簡便に色素体ＤＮＡを単離することができる。
【００１９】
以上で、ラテックス産生植物のラテックスから、色素体ＤＮＡを単離することが可能である。ラテックスの色素体画分４から色素体ＤＮＡを単離することにより、核ＤＮＡの混入を抑制し、精度よく色素体ＤＮＡを得ることができる。したがって、該色素体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲやＲＡＰＤ法によりラテックス産生植物の品種判別を行った際には、核ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を顕著に抑制することができるため、該ＤＮＡ断片による品種判別の誤判定が抑制され、再現性よくラテックス産生植物の品種判別を行なうことが可能となる。
【００２０】
また、ラテックス産生植物の葉や茎を採取する必要がないため、ラテックス産生植物への負担が少ない。さらに、ラテックス産生植物からすでに回収されたラテックスを用いて色素体ＤＮＡを単離することができるため、流通工程の途中でラテックスが由来する品種を判別することができる。
さらに、本発明で得られた色素体ＤＮＡは、例えば上記で述べた品種判別の他にも、生物由来の他のＤＮＡと同様に、種々の核酸解析に供することができる。例えば、ラテックス産生植物の品種改良や遺伝子組み換えによる新品種の作製等が挙げられる。
【００２１】
＜ラテックス産生植物の品種判別方法＞
本発明の色素体ＤＮＡの単離方法で得られた色素体ＤＮＡを用いて、核ＤＮＡと同様に色素体ＤＮＡにあっても、品種間で塩基配列が異なる部位を検出することにより、ラテックス産生植物の品種判別ができる。パラゴムノキの品種を判別することが好ましい。品種判別可能なパラゴムノキとしては、例えば、ＰＢ２６０、ＰＢ３４０、ＲＲＩＭ６００等が挙げられる。
【００２２】
ラテックス産生植物の品種判別に関しては、核ＤＮＡを用いた品種判別方法と同様な方法で行なうことができ、例えば、単離した色素体ＤＮＡを鋳型とした核酸増幅法やサザンブロッティング等のハイブリダイゼーション法、または単離したＤＮＡを用いた変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis：ＤＧＧＥ）、ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法等により行なうことができる。
【００２３】
核酸増幅法に関しては、ポリメラーゼを用いた塩基の伸長反応を行うものであれば特に限定されるものではなく、通常のＰＣＲに加えて、リアルタイムＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）、ＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphism）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）等が挙げられる。
【００２４】
これら核酸増幅法の中でも、簡便に短時間で精度よく判別できることから、通常のＰＣＲにより行なうことが好ましい。
ＰＣＲに用いるプライマーは、色素体ＤＮＡにおいて、ラテックス産生植物の品種間で塩基配列の異なる領域が、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片中に含まれるように設計される。プライマーの設計としては、色素体ＤＮＡにおいて、ラテックス産生植物の品種間で塩基配列の異なる領域が、プライマーの塩基配列に含まれる、あるいはＰＣＲにより増幅される塩基対数が、ラテックス産生植物の品種間で異なるように設計することが好ましい。なお、各プライマーのＴｍ値を、ほぼ一致させておくことにより、同一のＰＣＲ条件で核酸増幅を行うことができる。このようなプライマーの合成は、当該技術分野で公知の手法を用いて行うことができる。
この品種間で塩基配列が異なる領域としては、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ）、単純反復配列（simple sequence repeat：ＳＳＲ）、挿入／欠失多型（insertion/deletion polymorphism：Ｉｎ／Ｄｅｌ）等が挙げられ、得られたＰＣＲ産物を解析することにより、ラテックス産生植物の品種判別を行なうことができる。
【００２５】
ＰＣＲに用いるポリメラーゼとしては、増幅塩基数や増幅塩基配列、反応温度等を考慮して公知のものを適宜選択可能であり、例えば耐熱性ポリメラーゼや校正活性を有したポリメラーゼ等が挙げられる。
ＰＣＲに用いるバッファーとしては、用いるポリメラーゼを考慮して、公知のものを適宜調整して用いることができる。
ＰＣＲに用いるヌクレオチドに関しては、標識試薬等で標識されたものを用いることもできる。
【００２６】
本発明のラテックス産生植物の品種判別方法における通常のＰＣＲは、目的のＤＮＡ断片が増幅できれば特に限定されるものではないが、例えば以下に示す条件で行なうことができる。反応溶液の組成としては、例えば、反応溶液中の濃度が０．１〜２μＭのフォワードプライマーとリバースプライマー、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５８０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５〜２．２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２〜０．４ｍＭの各ｄＮＴＰｓ、０．５〜２ユニットのＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）、及び１〜１００ｎｇの色素体ＤＮＡである。ＰＣＲの温度サイクルは、例えば約９４℃を約２分の後、約９４℃を約３０秒、約５５℃を約３０秒、約７２℃を約２分の工程を２５〜４５回繰り返す。その後、反応溶液を、約７２℃で約５分間反応させてもよい。
【００２７】
上述したＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、例えばゲル電気泳動やバイオアナライザー２１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）等の検出機器により検出することができる。ゲル電気泳動は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル等を用いて行なうことができる。電気泳動後は、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＥＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ等でＤＮＡ断片を染色し、ＵＶ照射下でＤＮＡ断片の有無、大きさ、パターンを検出する。
得られたＤＮＡ断片のパターンは、写真撮影あるいは直接スキャンして画像データとして記録することができる。
ラテックス産生植物の品種間で得られるＤＮＡ断片のサイズが異なる場合は、ＤＮＡ断片の有無、または得られたＤＮＡ断片の大きさやパターン、配列を比較することにより、品種判別をすることが可能である。ＤＮＡ断片の有無や大きさ、パターンは、上述したゲル電気泳動やバイオアナライザー２１００システム等の検出機器で解析することができ、ＤＮＡ断片の配列は、シークェンシング法により、直接塩基配列を確認することができる。
【００２８】
以上のように、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を検出し、ラテックス産生植物の品種特異的なＤＮＡ断片の有無、あるいは品種特異的なＤＮＡ断片の大きさパターン、塩基配列を比較することで、ラテックス産生植物の品種を判別することが可能である。または、ＲＦＬＰ法のように、ＤＮＡ断片を酵素処理して得られるバンドパターンを比較することで、ラテックス産生植物の品種を判別することも可能である。
【００２９】
＜品種改良、新品種の作製＞
また、単離した色素体ＤＮＡを改変し、この改変色素体ＤＮＡをラテックス産生植物の色素体に導入することで、該改変色素体ＤＮＡを有したラテックス産生植物の形質転換体を作製し、品種改良や新品種を得ることができる。
【００３０】
改変色素体ＤＮＡとしては、従来公知の方法で行うことができ、所定の塩基配列が挿入されたものや欠損されたもの、１塩基以上の塩基配列で置換されたもの等を挙げることができる。ここで、色素体ＤＮＡの改変に用いられる塩基配列の種類は特に限定されるものではなく、作製する改変色素体ＤＮＡの用途など、その目的に応じて適宜選択することができる。また、改変に用いられる塩基配列は、天然のものであってもよいし人工的に合成されたものであってもよい。
本発明の方法で単離された色素体ＤＮＡは、核ＤＮＡの混入がほとんどなく精製効率が高いため、効率よく改変色素体ＤＮＡを作製することができる。
【００３１】
改変色素体ＤＮＡのラテックス産生植物への導入方法としては、パーティクルガン法やアグロバクテリウム法がある。
パーティクルガン法は、パーティクルガンを用いて該改変色素体ＤＮＡをラテックス産生植物の例えば葉の色素体に導入し、該改変色素体ＤＮＡが導入された葉をカルス誘導してカルスを形成させることで、改変色素体ＤＮＡを有した形質転換体のラテックス産生植物を得ることができる。パーティクルガンを用いた色素体ＤＮＡの導入に関しては、直径１〜２μｍの金粒子を改変色素体ＤＮＡでコーティングし、マイクロキャリアーに接着させ、例えば葉やカルス等に２回、パーティクルガンで打ち込むことで、改変色素体ＤＮＡを導入することができる。また、カルスの形成に関しては特に限定されるものではなく、従来公知の方法で行なうことができる。
【００３２】
アグロバクテリウム法は、改変色素体ＤＮＡをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入して、カルス又は幼植物に該アグロバクテリウム・ツメファシエンスを感染させることで、該改変色素体ＤＮＡを有した形質転換体のラテックス産生植物を得ることができる。
【００３３】
または、カルスから調製したプロトプラストを用いて、エレクトロポレーション法やリン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＡＥＡ−デキストラン媒介トランスフェクション法等により、該プロトプラストに改変色素体ＤＮＡを導入し、形質転換体のラテックス産生植物を得ることができる。
【実施例】
【００３４】
＜ラテックス産生植物のラテックスから色素体ＤＮＡの単離＞
ラテックス産生植物である、パラゴムノキからタッピングにより採取したラテックス４０ｇを遠心管に入れ、８０００Ｇ、０℃にて１時間、超遠心分離を行い、ラテックスをゴム相とセラム相とボトム画分とに分離させた。また、遠心管の底部には、沈殿（ボトム画分）が観察された。その後、ゴム相に含まれる、色の付いた色素体画分を注射器で吸い出して、ゴム相から色素体を抽出した。次いで、抽出した色素体からフェノール法、あるいは市販のキットを用いてＤＮＡの単離を行なった。
【００３５】
＜ＰＣＲによる色素体ＤＮＡの確認＞
次に、色素体から単離したＤＮＡが色素体由来のＤＮＡ（色素体ＤＮＡ）か確認を行なった。まず、上記で単離した各ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行なった。プライマーは、図３に示すように、フォワードプライマー、リバースプライマーとして、ｒｂｃＬ遺伝子に対するものを用いた。具体的には、フォワードプライマーとして、ｒｂｃＬ遺伝子の１１０位〜１３４位の塩基配列に相同的な塩基配列を有するＦｄ２プライマー（配列番号１）、と、リバースプライマーとして、ｒｂｃＬ遺伝子の１１４２位〜１１６６位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＦｄＲプライマー（配列番号２）とを用いた。
ＰＣＲの反応溶液は、１×reaction Bufferと、０．２ｍＭのｄＮＴＰmixtureと、０．５ユニットのＥｘＴａｑ ＤＮＡ polymerase（Ｔａｋａｒａ社）と、各１．２５μＭのプライマー（Ｆｄ２及びＦｄＲ）と、１〜２５ｎｇの鋳型ＤＮＡとを含み、反応溶液の合計が２０μｌとなるように、水で調節した。次に、反応溶液を９４℃で４分間反応させた後、９４℃を３０秒、５５℃を３０秒、７２℃を２分で３０サイクル反応させてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、プライマーとしてＦｄ２とＦｄＲを用いた際には、１０６７塩基対のＤＮＡ断片が得られる。その後、反応溶液を７２℃で５分間反応させ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のバイオアナライザー２１００システムを用いた電気泳動によりＰＣＲ産物を分離し、ＤＮＡ断片のバンドパターンを検出した。検出結果を、図４に示す。なお、ポジティブコントロールとして、葉から抽出した全ゲノムを用いた。
【００３６】
ｒｂｃＬ遺伝子は核ＤＮＡにはなく、色素体ＤＮＡにのみ存在するため、図４より、ラテックスの色素体画分から単離されたＤＮＡが色素体ＤＮＡであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、ラテックス産生植物の品種判別に適用することができ、ラテックス産生植物から採取したラテックスを用いて、簡便に精度よく、ラテックス産生植物の品種を判別することができる。
【符号の説明】
【００３８】
１ ゴム相、２ セラム層、３ ボトム画分、４ 色素体画分。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラテックス産生植物からの色素体ＤＮＡの単離方法であって、
ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する工程と、
前記ゴム相から色素体画分を抽出する工程と、
抽出した前記色素体画分からＤＮＡを単離する工程とを有することを特徴とする色素体ＤＮＡの単離方法。
【請求項２】
前記ラテックス産生植物がパラゴムノキ（Hevea brasiliensis）であることを特徴とする請求項１に記載の色素体ＤＮＡの単離方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法で単離された色素体ＤＮＡを用いてラテックス産生植物の品種を判別することを特徴とするラテックス産生植物の品種判別方法。
【請求項４】
ラテックス産生植物の品種を判別する方法が、
前記色素体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行なう工程と、
前記ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を用いてラテックス産生植物の品種を判別する工程と、
を少なくとも有すること特徴とする請求項３に記載のラテックス産生植物の品種判別方法。
【請求項１】
ラテックス産生植物からの色素体ＤＮＡの単離方法であって、
ラテックス産生植物のラテックスを遠心分離し、ゴム相とセラム相とに分離する工程と、
前記ゴム相から色素体画分を抽出する工程と、
抽出した前記色素体画分からＤＮＡを単離する工程とを有することを特徴とする色素体ＤＮＡの単離方法。
【請求項２】
前記ラテックス産生植物がパラゴムノキ（Hevea brasiliensis）であることを特徴とする請求項１に記載の色素体ＤＮＡの単離方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法で単離された色素体ＤＮＡを用いてラテックス産生植物の品種を判別することを特徴とするラテックス産生植物の品種判別方法。
【請求項４】
ラテックス産生植物の品種を判別する方法が、
前記色素体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行なう工程と、
前記ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を用いてラテックス産生植物の品種を判別する工程と、
を少なくとも有すること特徴とする請求項３に記載のラテックス産生植物の品種判別方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１５８２０４（Ｐ２０１０−１５８２０４Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７５５（Ｐ２００９−２７５５）
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【出願人】（５９４２０１７４４）バダン ペングカジアン ダン ペネラパン テクノロジ (13)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｄａｎ Ｐｅｎｇｋａｊｉａｎ Ｄａｎ Ｐｅｎｅｒａｐａｎ Ｔｅｋｎｏｌｏｇｉ
【住所又は居所原語表記】Ｊｌ． Ｍ． Ｈ． Ｔｈａｍｒｉｎ Ｎｏ．８， Ｊａｋａｒｔａ １０３４０， Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【出願人】（５９４２０１７４４）バダン ペングカジアン ダン ペネラパン テクノロジ (13)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｄａｎ Ｐｅｎｇｋａｊｉａｎ Ｄａｎ Ｐｅｎｅｒａｐａｎ Ｔｅｋｎｏｌｏｇｉ
【住所又は居所原語表記】Ｊｌ． Ｍ． Ｈ． Ｔｈａｍｒｉｎ Ｎｏ．８， Ｊａｋａｒｔａ １０３４０， Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ
【Ｆターム（参考）】
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